JPH07506003A - Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおける抗生物質耐性の迅速検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一イソニアジドに対して感受性の上記細菌の株のｋａｔＧ遺伝子またはそのフラ グメントの対照ＤＮＡ調製物−場合によっては、イソニアシト耐性マイコバクテ リウム株のｋ　ａ　ｔ’Ｇ遺伝子のＤＮＡの対照調製物を含むことを特徴とする キット。

１９、リファンピシンまたはその類縁体に対するマイコバクテリウム属の細菌の 耐性のインビトロ診断のためのキットであって、−上記マイコバクテリウムのＲ ＮＡポリメラーゼのβサブユニットのＤＮＡもしくはニニ立上遺伝子のＤＮＡま たはそのフラグメントの遺伝子を増幅する手段 −そのようにして得られた増幅産物の１つまたはい（っがの突然変異を証明する 手段 一すファンビシンに対して感受性の上記細菌の株のＲＮＡポリメラーゼのβサブ ユニットをコードするＷ遺伝子またはそのフラグメントの対照ＤＮＡ調製物 一場合によっては、イソニアシト耐性マイコバクテリウム株のＵ立上遺伝子のＤ ＮＡの対照調製物 を含むことを特徴とするキット。

２０、ストレプトマイシンに対するＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの耐性のイ ンビトロ診断のためのキットであって、 −小リポソームサブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子ま たはそのフラグメントの遺伝子を増幅する手段−得られた増幅産物の１つまたは いくつかの突然変異を証明する手段 一ストレプトマイシンに対して感受性のＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株のリ ポソーム小サブユニットのＳ１２タンパク質をコードするユニ且工遺伝子のＤＮ Ａ配列の対照調製物 一場合によっては、ストレプトマイシンに対して耐性のＬｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓ株のリポソームの小サブユニットのＳ１２タンパク質をコードするＵ皿上遺 伝子のＤＮＡ配列の対照調製物を含むことを特徴とするキット。

明細書 敗匹展■肛江し％雇匹且社ｎにおける抗生物質耐性の迅速検出性本発明は、抗生 物質、特にイソニアシト、リファンピシンおよびストレプトマイシンに対して耐 性であるＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株の迅速な検出 に関する。より特定的には、本発明は、例えば、適切な遺伝子の突然変異の結果 として、または核酸ハイブリダイゼーションにより、敗組匣匹虹包り勉厘匹旺並 ｎにおける抗生物質耐性を検出する方法に関する０本発明は、核酸ハイブリダイ ゼーションを実施するための核酸プローブおよびキットにも関する。本発明は、 さらに、ｋａｔＧ遺伝子の染色体の位置およびそのヌクレオチド配列にも関する 。

凡豆Ω！１ ０バート・コツホ（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｋｏｃｈ）による結核の原因学的因子である 毀以ルｙ１虹ム徂」α四島旦独」、旦の発見以来、−世紀を越える研究にもかか わらず、この疾患は依然として人間の罹患および死亡の主要原因の一つのままで ある。結核に起因する死亡は年間３００万件と概算されており（Ｓｎｉｄｅｒ、 　１９８９）　、これらの大部分は開発途上国におけるものではあるが、西側諸 国においても、ホームレスの人々の数の増加およびＡＩＤＳの流行の衝撃のため 、この疾患は復活した重要性を握っている（Ｃｈａｉｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９８７；　５ｎｉｄｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｐｅｒ。

１９９２）。

イソニコチン酸ヒドラジド、すなわちインニアシト（ＩＮＨ）は、「結核（菌） 」群のメンバー、すなわち、Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓ％Ｍ、　ｂｏｖｉｓおよびＭ、　ａｆｒｉｃａｎｕｍに対するその絶妙な強 さのため、過去４０年間の間結核の治療に使用されてきた（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏ ｏｋ、　１９５２；　Ｙｏｕａｔｔ、　１９６９）　、この薬物の正確な標的（ ターゲット）も、その作用モードも、どちらも知られておらず、ＩＮＨ治療はい くつかの代謝経路の動揺をもたらす。ＩＮＨはＮＡＤおよびピリドキサールホス フェートの代謝拮抗物質として作用し得ることを示すかなりの証拠があり（Ｂｅ ｋｉｅｒｋｕｎｓｔ　ａｎｄＢｒｉｃｋｅｒ、　１９６７；　５ｒｉｐｒａｋａ ｓｈ　ａｎｄ　Ｒａ＋ｏａｋｒｉｓｈｎａｎ、　１９７０；　Ｗｉｎｄｅｒ　ａ ｎｄＣｏｌｌｉｎｓ、　１９６８．１９６９．１９７０）、また、この薬物が、 マイコバクテリウムの細胞壁の抗酸性（ａｃｉｄ−ｆａｓｔ）特性に関連するミ コール酸の合成を遮断することを示す他のデータも存在する（Ｗｉｎｄｅｒ　ａ ｎｄＣｏｌｌｉｎｓ　１９７０；　Ｑｕｅｍａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１ ）　ｅその導入の少し後に、Ｌ姐匝匹旺蝕り隻匹匹虱匹ｎのＩＮＨ耐性単離株が 出現し、これらは、特性付けによると、カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性を損 失しており、モルモット（ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇｓ）において減少した毒力（ｖ ｉｒｕｌｅｎｃｅ）を示すことがしばしば見出された（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ 　ｅｔａｌ、、　１９５４；　Ｋｕｂｉｃａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９６８；　５ ｒｉｐｒａｋａｓｈ　ａｎｄ　Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ。

１９７０）　。

ご（最近、ＩＮＨ耐性は、Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓの多剤耐性（ＭＤＲ）変異株による米国における結核の流行（ＣＤＣ，１９ ９０；１９９１ａ、　ｂ）と、このような株がＨＩＶ感染者および医療従事者の 広範な院内感染に関連することの証明（Ｓｎｉｄｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｐｅｒ、　 １９９２）とによって、新たな重要性を獲得してきた。この問題の重要性の点か ら見て、当業界には、ＩＮＨ耐性とカタラーゼ−ペルオキシダーゼ産生との間の 関係を決定する必要性が存在する。

より特定的には、当業界には、薬剤感受性に関与する分子メカニズムを理解する 必要性がある。その上、当業界には、ＩＮＨ耐性株を迅速に同定することを可能 にする簡便な試験を開発する必要性がある。さらに、当業界には、このような試 験を実施するための試薬に対する必要性がある。

リファンピシンもまた、マイコバクテリウム、特にＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよび′Ｍｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅ　ｒａｅ による感染の治療のために使用される主要な抗生物質である。マイコバクテリウ ムのあるものは、ゆっくり生育するので、リファンピシンまたはその類縁体に対 する耐性を試験するための迅速で効率的な試験が利用可能にされなければならな い。同様に、本発明は、ストレプトマイシンに対して耐性であるＭ　ｃｏｂａｃ ｔｅｒＬｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのストレインの迅速な検出を目的とす る。ストレプトマイシンに対する耐性の発達のため、後者の抗生物質は他の抗生 物質、例えば、イソニアシトと共に使用されてきた。したがって、結核の適切な 治療の前には、この３種の主要な抗生物質、すなわち、イソニアシト、リファン ピシンおよびストレプトマイシンに対する耐性の迅速で効率的な検出が先行すべ きである。

１肌Ω且鷹 以上のように、本発明は、イソニアシトおよび他の薬剤、例えばりファンビシン またはその類縁体、およびストレプトマイシンに対して耐性の肚姐勤玉肛知り勉 動匹虱匹卦の細胞の存在をインビトロで検出するための方法を提供することによ り、当業界におけるこれらの必要性を充足することを助けるものである。

リファンピシンの類縁体、特に３−ホルミル−リファマイシンの誘導体、特に置 換の結果として、・・・・・・ナフトフラノニル基中またはナフトフラノニル基 の７位の側鎖に存在する置換物・・・・・・、または側鎖中に二重結合の導入も しくは除去により・・・・・・。

本発明によれば、インニアシトに対する耐性の検出は、特にイソニアシトに対し て耐性ではないＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおけ る同じｋａｔＧ遺伝子のヌクレオチド配列に関して、敗坦匝虹江江り紐崩匹虱匹 堕のｋａｔＧ遺伝子内の１つまたハイくつかのミューチージョンの検出を包含す る。

イソニアシトに対して耐性のＬ組匝匹肛旦し辿匣匹虹匹旦の核酸の存在をインビ トロで検出するための別の代替法においては、その方法が、以下の工程ニ ー必要であれば予めプローブに接触可能にした上記核酸を、ハイブリダイゼーシ ョンを可能にする条件下でプローブに接触させる工程、 一上記核酸にハイブリダイズしたプローブを検出する工程上記フラグメントが１ 旦ｍＨＩ切断部位を含み、上記一部分はイソニアシトに対して耐性の肚匹肋旦肛 並り皿厘匹且坦堕のインビトロでの検出の選択性を提供するのに充分長いもので ある。

例えば、この代替的方法は、以下の工程を含む：（Ａ）細胞の核酸を、核酸がプ ローブに接触可能になるように、固体支持体上におき、固定する工程、 （Ｂ）工程（Ａ）からの固定された核酸を、ハイブリダイゼーションを可能にす る条件下でプローブと接触させる工程、（Ｃ）工程（Ｂ）から得られるフィルタ ーを、ハイブリダイズしていないプローブを除去するように洗浄する工程、およ び次に（Ｄ）工程（Ｃ）から得られる洗浄したフィルター上のハイブリダイズし たプローブを検出する工程。

プローブは、プラスミドｐＹＺ５６の２．５ｋｂＥｃｏＲＶ　−に２旦Ｉフラグ メントに存在する核酸配列を含み、上記フラグメントはＢａｍ１（Ｉ切断部位を 含む。このフラグメントは、インニアシト感受性肚姐匣匹肛江り皿匠匹旦匹ｎの 細胞内ＤＮＡと関連していることが見出されており、このような抗生物質感受性 微生物を、以下に記載する条件下でこのフラグメントとハイブリダイズするＤＮ Ａを含有しないインニアシト耐性Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓから区別することができる。

本発明は、さらに、イソニアシト耐性細胞から欠如しているイソニアシト感受性 を与える肛匹匝匹旺止り血匠匹旦匹旦のｋａｔＧ遺伝子の領域をコードしている インニアシト耐性敗坦匝区虹旦り剋匠匹旦匹旦のＲＮＡおよびＤＮＡのようなヌ クレオチド配列を提供する。

本発明は、本発明のヌクレオチドに結合している放射性核種のような標識された プローブをも提供する。

さらに、本発明は、相補的な塩基配列のヌクレオチド配列に水素結合した、実質 的に本発明のヌクレオチド配列からなるハイブリツド二本鎖分子、例えばＤＮＡ またはＲＮＡを提供する。

また、本発明は、Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのカ タラーゼ−ペルオキシダーゼ遺伝子またはこのようなヌクレオチド配列の一部分 をコードするヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列のグループから選択する方 法をも提供する。この方法は、どのヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配 列にパイプリダイズするかを決定する工程を含む、このヌクレオチド配列は、Ｄ ＮＡ配列またはＲＮＡ配列であることができる。この方法は、ヌクレオチド配列 上の標識を検出する工程を含んでいてもよい。

さらに、本発明は、イソニアシトに対して耐性のＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔ ｕｂｅｒｃ罰ｏｓｉｓを検出するためのキットを提供する。キットは、プラスミ ドｐ　Ｙ　Ｚ　５６　（７）　２　、５　ｋｂ　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＶ　−Ｋ！旦１ ７　ラグメントであり、ＢａｍＨＩ切断部位を含むフラグメントである核酸配列 を含むプローブを含有している容器を含む。キットは、また核酸の対照調製物を 含有している容器をも含む。

本発明は、酵素カタラーゼまたは同様の酵素のイソニアシトに対する作用の産物 として得られる化合物をもカバーする。ｋａｔＧ遺伝子、または同様の活性を有 するこの遺伝子の誘導体を、カタラーゼタンパクの供給源として使用することが できる。この新規の化合物は、Ｈ，Ｄａｖｉｄ　ｅｔ　ａｌ、の「臨床マイコバ クテリウム学のための実験室方法（Ｍｅｔｈｏｄｅｓ　ｄｅ　１ａｂｏｒａｔｏ ｉｒｅ　ｐｏｕｒ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅｃｌｉｎｉｑｕｅ）　 Ｊ　、パスツール研究所（Ｐａｓｔｅｕｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）編集、ｌ５Ｂ Ｎ番号０９９５−２４５４に記載されているようなアンチバイオグラム（ａｎｔ ｉｂｉｏｇｒａｍ）方法により、ＩＮＨ耐性耐性マイコバクテリウム対する反応 性によって選択される。

ｌ直立Ｍ単皇韮囲 本発明は、以下のような図面を参照してその詳細の大部分が記載される。

図１は、ＩＮＨ耐性Ｍ、　ｓｍｅ　ｍａｔｉｓ株Ｂ　Ｈｌ　（Ｇａｙａｔｈｒｉ 　ｅｔ　ａｌ、。

１９７５）　（ＭＣ”　−１５５株の誘導体）を、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓ　−Ｈ３７Ｒｖシャトルコスミド（Ｎｅｗ　ＹｏｒｋのＷ、Ｒ，Ｊａｃｏｂ ｓ博士の厚意により提供されたもの）のプールにより形質転換し、個々のクロー ンをＩＮＨ感受性について採点したことを示す。コスミドｐＢＨ４は定常的に薬 剤感受性を付与し、形質転換体はカタラーゼを過剰産生ずる（Ｈｅｙｍ、　１９ ９２のようにアッセイした場合）。

ｐＢＨ４からのＤＮＡインサートの制限地図を、ｐＹＺ５５からのインサートの それと共に示す。ｐＹＺ５５は、Ｅ、　ｃｏｌｉヒドロペルオキシダーゼＩ　（ ＨＰＩ）の保存された領域からのアミノ酸配列と一致するように設計されたオリ ゴヌクレオチドプローブ（５′−ＴＴＣＡＴＣＣＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣ ＧＧＣＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣ−３’　）を用いたハイブリダイゼーシ ョンをもとに単離された、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７Ｒｖのｋａ ｔＧを含有するプラスミドである。以下の酵素に関する制限部位が示されている ：旦、１且二Ｈ１，Ω、Ｃ１ａＩ　；旦。

旦ｃｏＲＶ；旦、ＨｉｎｄＩＩＩ；に、　五ユニＩ　；Ｍ、ＳｍａＩ　；Ｎ１反 立生工；旦、ユニ旦Ｒ１，旦、旦且旦Ｔ、ｐＹＺ５５からの４．５ｋｂインサー トを含有するマイコバクテリウムのシャトルプラスミドｐ　Ｂ　Ａ　Ｋ　１４　 （Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９９１）を用いたＢＨＩの形質転換も、同 様にＩＮＨ感受性を付与した。ｐＹＺ５５に由来し、ｐＢＡＫ１４中にある方向 （＋）または逆の方向（−）に挿入されているサブフラグメントを用いて形質転 換されたＢＨＩについて、ＭＩＣも同様に示す。

図２は、以前記載されたように活性ゲル解析のために調製された種々のプラスミ ド構築物（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１）を用いて形質転換されたＥ 、　ｃｏｌｔおよびＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７Ｒｖ株からの抽出 物を示す。８％ポリアクリルアミドを含有する非変性ゲルは、Ｗａｙｎｅおよび Ｄｉａｚにより記載されているように（Ｗａｙｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６ ）カタラーゼ活性（パネルＡ）およびペルオキシダーゼ活性（パネルＢ）につい て染色した。レーン１、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７Ｒｖ　；　２ 、Ｅ、ｃｏｌｔ　０Ｍ２　（ｋａｔＥ、ｋａｔＧ）；　３、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｕ Ｍ２／ｐＹＺ５５；４、Ｅ、ｃｏｌｔ　ＵＭ２／ｐＹＺ５６　（ｐＵｃｌ　９中 の２．９ｋｂ　立上旦ＲＶ−艮り旦Ｉフラグメント、図１のｐＢＡＫ−ＫＥ＋に 相当する）；５、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＵＭ２／ｐＹＺ５７（且Δ二ＨＩ−Ｊ！ｎ旦工 欠失を有するｐＹＺ５５、図１のｐＢＡＫ−ＫＢ＋に相当する）　、　Ｍ、　ｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓカタラーゼおよびペルオキシダーゼ活性は、これらの条 件下で２つのバンドとして移動した（レーン１）、同じパターンは、ｐＹＺ５５ により発現された組換え酵素についても見られた（レーン３）。ｐＹＺ５６　（ レーン４）は、パネルＣに示すベクターからの１ａｃＺ’およびｋａｔＧの間の 融合により分子量が増加したタンパク質を発現する。パネルＣは、Ｅ、　ｃｏｌ ｔのＨＰＩとの部分的な配列の整列図（アラインメント）をも示す。

図３は、ｐｕｃ１９ベクター単独、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｋ　ａ　 ｔ　Ｇを発現するｐｙｚｓｓ、およびＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｋ　ａ 　ｔ　Ｇの高レベル発現を伴うｐＹＺ５６を用いて形質転換された、ｋａｔＧお よびｋａｔＥの両方に突然変異を有するＥ、　ｃｏｌｉ株（０Ｍ２、Ｍｕｌｖｅ ｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）を示す、適切な抗生物質を添加したＬｕｒｉａ −Ｂｅｒｔａｎｉ培地中の一晩培養を、種々の濃度のＩＮＨの存在下でブレーテ ィングし、コロニー形成単位を評価した６代表的な実験の結果を、３組の試料に ついて観察された標準偏差を示すエラーパーと共に示す。Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓのｋａｔＧの過剰発現は、同様にＥ、　ｃｏｌｉ　ＵＭ２５５　（ｋ ａｔＧ、ｋａｔＥ、　Ｍｕｌｖｅｙｅｔａｌ、。

１９８８　）において高濃度のＩＮＨに対する感受性を付与したが、Ｅ、　ｃｏ ｌｉ　ＴＧ　１のようなカタラーゼ陽性株に対しては何の効果も示さなかった。

いくつかの実験においては、高濃度のＩＮＨは、単独で、０Ｍ２およびＵＭ２５ ５の生育に対して検出可能な阻害効果を有していたが、全ての実験において、ｐ Ｙ２５６形質転換体の阻害は、相当するベクタ一対照において観察されたものよ りも少なくとも１０〜１００倍大きいものであった。

図４は、ＬＬ旦Ｉで消化し、（Ａ）ｋａｔＧ　（４，５ｋｂ　Ｋ！旦Ｉフラグメ ント）および（Ｂ）ＳＯＤ遺伝子（１，ｌｋｂ　立上旦ＲＩ−に２ＢＩフラグメ ント、Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１　）をプローブとして調べた、異 なるＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株からのゲノムＤＮＡを用いて調製したサ ザンプロットを示す、プローブの標識およびプロットの処理は、以前記載された ように実施した（Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

１９９１；　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９）、レーン１．Ｈ３７ Ｒｖ；２、株１２−ＭＩＣ１，６μｇ／ｍｌ　Ｉ　ＮＨ；　３、Ｂ１４５３−Ｍ ＩＣ＞５０μｇ　／ｍｌ　Ｉ　ＮＨ（Ｊａｃｋｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９７８ ）；　４、株２４−ＭＩＣ＞５０μｇ／ｍＩＩＮＨ；５．７９１１２−ＩＮＨ感 受性（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９６３）　；　６．１２６４６ −ＩＮＨ感受性（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９６３）　；　７． ７９６６５−ＩＮＨ感受性（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９６３） 。ＩＮＨ感受性は、異なる濃度のＩＮＨを含有するＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅ ｎｓｅｎスロープ（斜面）の接種により確認した。

図５は、ｋａｔＧ遺伝子座の編成である。上部のバーは、ｋａｔＧ領域にわたる Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ染色体のストレッチに相当し、地図の作製に用 いた個々のコスミドの位置は、もとのシャトルコスミドｐＢＨ４およびｐＹＺ５ ５と共に下部に示されている。いくつかの重要な制限部位の位置（旦、ＢａｍＨ Ｉ　；に、ＫＢ４旦Ｉ）は、公知の遺伝子マーカーのおよその位置と共に示され ている：ｍ、αまたは８５Ｂ抗原（Ｍａｔｓｕｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８） をコードする；　ｋａｔＧ、カタラーゼ−ペルオキシダーゼ、ＬＬ１０５、入Ａ ｎｄｅｒｓｅｎの厚意により供給された無名のんｇｔｌｌクローン；ＭＰＴＲ， 主要冬型タンデムリピート（Ｈｅｒｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２）。

図６のＡは、ｋａｔＧを担持する艮立上Ｉフラグメントのヌクレオチド配列であ る。この配列は、ＥＭＢＬデータライブラリーに受託番号Ｘ６８０８１として寄 託されている。推定タンパク質配列は一文字コードで示されている。Ｂは、同一 性を「＊」で示し、整列を最適にするために導入したパッドを表わす「−」を含 む、７００ｂｐのダイレクトリピートの２コピーの整列図である０番号付けは図 ２Ａでの位置を引用する。

図７は、マイコバクテリウムにおけるｋａｔＧの分布である。

Ａ、は、異なる細菌ＤＮＡ　（１，５μｇ）の試料を且且工■で消化し、アガロ ースゲル電気泳動で分離し、エチジウムプロミドで染色したもの。レーン１およ び７、サイズマーカー；　Ｌ」」二凹；レーン３、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓ　Ｈ３７Ｒｖ　；レーン４、Ｌ」ｙ襲ｍ凹；レーン５．４；レーン６、Ｍ、 　ａｖｉｕｍｅ　Ｂ、は、Ａのゲルを、サザンブロッティングした後、ｋａｔＧ 特異的プローブでハイブリダイゼーションしたもの。

図８は、カタラーゼ−ペルオキシダーゼの一次構造の整列図である。配列は、Ｍ 、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７Ｒｖ、　ｍｔｋａｔｇ　；Ｅ、　ｃｏｌ ｔ　％ｅ　ｃ　ｋ　ａ　ｔ　ｇ　（Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ　ｅｔ　ａｌｌ、 　１９８８）；　Ｓ。

ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ　、ｓｔｋａｔｇＨＢ、　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈ ｉｌｕｓ　。

ｂ　ｓ　ｐ　ｅ　ｒ　ａ　（Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８ｇ） および酵母シトクロムＣペルオキシダーゼ（ｃｃｐ；　Ｆｉｎｚｅｌ　ｅｔ　ａ ｌ、、　１９８４）からのものである、整列図は、ＰＩＬＥＵＰおよびＰＲＥＴ ＴＹを用いて作製した（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４）。「・ 」は、相同性を最大にするように導入したギャップを表わす０本文中で考察して いる活性部位およびペルオキシダーゼモチーフからの重要な残基（Ｗｅｌｉｎｄ ｅｒ、　１９９１）は、コンセンサスの下に示されている。

図９は、異なる細菌において産生されたＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＫａｔ Ｇのウェスタンプロット解析である。タンパク質は、５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で分離し、次いでイムノブロッティングと、Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９９１に記載されているようにＢＣＧに対して生成された抗血清を 用いた検出を行った。

レーン１、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７Ｒｖの可溶性抽出物；レー ン２、ベクターｐＢＡＫ　１４を担持するＭ、　ｓｍｅ　ｍａｔｉｓ　ＭＣ２１ ５５；レーン３、ｐＢＡＫ−ＫＫを担持するＭＣ”１５５（ｋａｔＧ＋）；レー ン４、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＵＭ２　（ｋａｔＥ。

１ｃａｔＧ）：レーン５、ｐＹＺ５５を担持するＵＭ２（ｋａｔＧ’″）；レー ン６、ｐＹＺ５６を担持するＵＭ２（１ａｃＺ　′：：ｋａｔＧ）。

しい熊　の　な雷日 最近の米国における多剤耐性を示すＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの多数の株 の出現は、この生物の非常な伝染性（うつり易さ）の点から、大変警告的な状況 である。この危険は、いくつかの小規模の結核の流行によって際立って示されて おり、これらにおいてはＭＤＲのＬｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染した一人の 患者が、ＨＩＶ陽性者、監獄警備員および健康な看護員を感染させた（ＣＤＣｌ ９９０．１９９１；　Ｄａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、。

１９９２；　５ｎｉｄｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｐｅｒ、　１９９２）　ｅ現在の世界 的なＨＩＶの流行の重大さの点から、西側諸国のＡＩＤＳ患者がアフリカの患者 のように（Ｍ、　ａｖｉｕｍ／Ｍ、　１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅコンプレツ クスのメンバーよりむしろ）ＭＤＲのＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株に感染 するようなら、この疾患の広範な蔓延が起こるであろうということが考えられる 。

インニアシト（ＩＮＨ）は、マイコバクテリウムの結核菌のグループ（鉦勉加空 至吐憇」画悪１」並立、Ｍ、　ｂｏｖｉｓおよヒＭ。

ａｆｒｉｃａｎｕｍ　）に対して特に強力な殺菌性薬剤であり、結果としてそれ は結核の治療において特に効果的であった。標準的な対結核療法は、一般にＩＮ Ｈおよびリファンピシンを、しばしばビラシナミド、エタンブトールまたはスト レプトマイシンのようなより弱い薬剤との組合せで含む、療法におけるその用途 に加えて、ＩＮＨは予防的手段として患者の近接者にも与えられる。

ヒトの疾患の因子であるＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＩＮＨ耐性突然変異 体は、２レベルの耐性を示し、低レベルは１〜１０μｇ　／ｍｌ　、高レベルは １０〜１００μｓ　／ｌｌ１ｌである。ＩＮＨ耐性は、しばしばカタラーゼ活性 の損失および毒力と関連している。近年、ＡＩＤＳの流行、ホームレスの増加お よび社会状態の低下により、先進国、特に米国において、結核は主要な公衆衛生 問題として再出現してきた。

今日のこの疾患の警告的な特徴は、多剤耐性生物の出現と、医療従事者およびＨ ＩＶ感染患者への迅速な院内伝播である。このことは、ＣＤＣによる、多剤耐性 株（少なくともＩＮＨおよびリファンピシン）の治療および伝播の防止のための 新規な推薦の提案を促した。ＩＮＨ耐性の問題の新鮮な洞察を入手し、迅速な診 断試験を開発するために、以下の研究を実施した。

明らかに、主な抗結核剤であるＩＮＨおよびリファンピシンに対する耐性のメカ ニズムを理解することは必須である。これは、そのことが、新規な化学療法的戦 略の開発を可能にし、ＭＤＲ株に対して活性な新規化合物の設計を容易にするか らである。

本発明は、ＩＮＨターゲットがカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素ＨＰＩである こと、およびこの酵素が単独で毒性を媒介することを明らかにする。この結論を 強要する証拠は、Ｅ、　ｃｏｌｔのカタラーゼ陰性突然変異体におけるＭ、　ｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｋ　ａ　ｔ　Ｇ遺伝子の発現が、この細菌をＩＮＨに 対して感受性にするという結果をもたらシタコトニヨッテ得られた。さらに、Ｍ 、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＩＮＨ感受性遺伝子ｋａｔＧの単離は、ハイブ リダイゼーションおよびＰＣＲベースのアプローチによるＩＮＨ耐性株の迅速な 検出を容易にするので、重要である。ここで示されるように、臨床株における高 頻度のｋａｔＧ欠失は、この手順を簡便化するはずである。

工ＮＨ鵬４　に　るＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　’−の６ＩＮＨ感受性に 関与するＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ遺伝子を単離するため、非相同のアプ ローチを用いた。ＢＨＩは、容易に形質転換可能なし」肚■虹ｎ株ＭＣ”１５５ の偶発突然変異体（Ｓｎａｐｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

１９９０）であり、これは５１２μｇ　／ｍｌのＩＮＨに対して耐性で、カタラ ーゼ−ペルオキシダーゼ活性を欠いている（Ｈｅｙａ＋　ｅｔ　ａｌ、。

１９９２）　、　Ｉ　ＮＨ感受性とこれらの酵素活性との間には厳密な相関があ るので、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからの適切な遺伝子を担持するプラス ミドを用いたＢＨＩの形質転換は、それらの回復および付随するＩＮＨ感受性を 導くはずである。

結果として、ＤＮＡを、Ｅｓｃｈｅｒｉ６ｈｉａ　ｃｏｌｉ中のＭ、　ｔｕｂｅ ｒｃｕｌｏｓｉｓシャトルコスミドのプールから調製し、電気的形質転換（エレ クトロトランスフォーメーシ目ン）によりＢＨＩ中に導入した０次いで１０００ を越えるカナマイシン耐性形質転換体をＩＮＨ感受性に関して採点し、ＭＣ”１ ５５野生型株からのＭＩＣである３　２　ｇ　／ｍｌのＩＮＨな含有する培地上 で生育しない４個のクローンを得た。

ＢＨＩの再形質転換の後、これらのうちの１つであるｐＢＨ４のみが一貫してＩ Ｎ）（感受性表現型を与えた。ＢａｍＨｌ、Ｋ！旦Ｉ、比立ｔ１．旦工！■およ び１（ｉｎｄｍを用いた制限酵素消化物は、ｐＢＨ４に担持されているＭ、　ｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ染色体ＤＮＡが約３０ｋｂの大きさであることを示した 。最後の３種の酵素を用いて作製した地図を図１に示す。

ｐＢＨ４をライブラリー中の相同クローンを検出するためのハイブリダイゼーシ ョンプローブとして用いた場合、さらに８個のシャトルコスミドが単離された。

ＢＨＩの形質転換の際に、これらの５種（Ｔ３５、Ｔ６４６、Ｔ６７３、Ｔ７９ 、Ｔ５５６）はＩＮＨ感受性を回復し、ｐＢＨ４と同様の制限プロフィールを示 した。特に、４．５ｋｂの五！旦Ｉフラグメントは、全ての場合に存在した。

個々の且ユニＨＩフラグメントをサブクローニングする試みは、ＢＨＬの傷を相 補することができる形質転換体を与えず、ｌ旦！ＨＩ部位が目的の遺伝子中に位 置している可能性があることが示唆された。これに対して、ｐＢＨ４の誘導体で あるｐＢＨ５を、旦ｃｏＲＩフラグメントの欠失によって構築したところ、これ はＩＮＨ感受性の回復には７ｋｂセグメントが必要ではないことを示した。

ＢＨＩのＩＮＨ耐性突然変異を相補したシャトルコスミドを担持する形質転換体 を注意深（検査し、いくつかの抗生物質に関するＭＩＣを確立した。全ての場合 において、ＩＮＨに関するＭＩＣは５１２μｇ　／ａ＋１から８μｇ　／ｍｌに 減少し、この値は感受性株ＭＣ”１５５の値（３２μｓ　／ｍｌ　）よりも低い 値であった。この高度感受性の表現型は、組喚えクローンがＩＮＨ毒性を強化し 得る酵素を過剰産生している可能性があることを示唆した。酵素学的研究は、こ れらの形質転換体は全て、ＩＮＨ感受性である野生型株ＭＣ”１５５よりも約２ 倍多いペルオキシダーゼおよびカタラーゼを産生ずることを示した。

ＩＮＨに加えて、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの多くのＭＤＲ株は、リファ ンピシン、ストレプトマイシン、エタンブトールおよびビラシナミドに対しても 、もはや感受性ではない。ＩＮＨに対する耐性とこれらの化合物との間に関係が ある可能性を検査するために、種々のＬ」肌茫鮎ｎ株およびそれらのｐＢＨ４形 賀転形体転換体ていくつかの薬剤のＭＩＣを決定したが、差異は見られなかった 。

Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｊ、ｓカタラーゼ−のクローニング４５ｍｅｒのオ リゴヌクレオチドプローブを、Ｅ、　ｃｏｌｔ　（Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９ｇ９）およびＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ ｏ　ｈｉｌｕｓ（Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）のカタラー ゼ−ペルオキシダーゼ酵素ＨＰＩの高度に保存された領域の一次構造に基づいて 設計した。

Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤＮＡのゲノムプロットを、このオリゴヌク レオチドをプローブとして用いて調べると、はとんどの場合に特異的バンドが検 出された。ＫユニＩは強くパイプリダイズする４、５ｋｂの独自の（ユニーク） フラグメントを生成したので、この酵素を。

ｐｕｃ　１９にサイズ選択ライブラリーを作るために用いた。

このオリゴヌクレオチドを用いたスクリーニングを行うと、適切なりローンｐＹ Ｚ５５が得られた。そのインサートＤＮＡの制限地図を図１に示す。図１では、 これがｐＢＨ４の部分に正確に対応することがわかる。独立した確認もまたクロ スハイブリダイゼーションにより得られた。

種々のサブクローニング実験によって、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓカタラ ーゼ−ペルオキシダーゼ活性なＥ、　ｃｏｌｉ中で発現する最小のフラグメント は２．５ｋｂのＥ　ｃ　ｏ　ＲＶ　−五２旦Ｉフラグメントであることが見出さ れ、これは予想されたようにＢａｍＨＩの切断部位を含んでいた１部分的ＤＮＡ 配列解析は、ｐＹＺ５６に担持されているｋａｔＧ遺伝子が、Ｅ、　ｃｏｌｉお よびＢ、　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓの）（ＰＩ酵素に高度に相同 なカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素をコードすることを示した： 、ｂ　ｃｕ　ｓ’ｓ　ＡＰＬＮＳＷＰＤＮＡＳＬＤＫＡＲＲＬＬＷＰ５１ＧＧＱ ’ＧＫＫＬＳＷＡＤＬ工Ｖｍ　”嚢峠峠自礪Ｖ）＋４肴１峠０喚★工六Ｑ喚★★ Ｑ喚Ｉ☆１１貞Ｆ工（）　’　ｕ５＊＊＊峠峠峰☆Ｎ嚢軸＊峠Ｃ両ＧＲ＊＊Ｒ１ ｆＩ’＊Ｔ嚢−☆工Ｐ工Ｃ（図２　：　Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ　ａｔ　ａｌ 、、　１９８８）；　（Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８８）。同一の残基は「本」で示す、ＨＰＩ活性は、染色によりＥ、　ｃｏ ｌｉおよび７の両方において検出された（以下を参照されたい）。

ＩＮＨ感４　におしるカタラーゼ−ペルオキシ　−ゼのＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌ ｏｓｉｓのｋａｔＧ遺伝子をクローニングしたので、カタラーゼ陰性とイソニア シト耐性との間の関連の遺伝的基礎を調べることが、直ちに興味のあることであ った。シャトルベクターｐＢＡＫ１４中に構築物のシリーズを確立し、ＩＮＨ耐 性Ｌ７突然変異体ＢＨＩを形質転換するために用いた。完全なｋａｔＧ遺伝子を 担持するプラスミドのみが、ＨＰＩを産生じ、ＩＮＨ感受性を回復した。これら の中で最小のものであるｐＢＡＫ１４は、２．５ｋｂのＥＣ０ＲＶ−”ｌ旦■フ ラグメントを担持しており、したがって、ｋａｔＧ遺伝子の上流の２ｋｂ領域は 関与していないこと、およびカタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性が単独でマイコ バクテリウムをＩＮＨに感受性にするのに充分であることが明らかになった。

無細胞抽出物を、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ペル オキシダーゼおよびカタラーゼ活性について染色した。これらの条件下で、この Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ酵素は、カタラーゼ活性（）Ｉｅｙｍ　ｅｔ　 ａｔ、、　１９９２）と共に移動するペルオキシダーゼ活性（レーン１）の２本 のバンドを示した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ中に導入すると、ｋａｔＧ遺伝子は同タンパク質の合成を指示し たが、一方、ｐＹ２５６は大きさがやや大きいタンパク質を産生じた。これは、 フレームの合った１ａｃＺ′：：ｋａｔＧ遺伝子融合の構築によるものである。

活性染色は、Ｌ」髭臼鮭旦の細胞抽出物を用いても実施した。ＢＨｌにおけるＭ 、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのｋａｔＧ遺伝子の存在は、カタラーゼ−ペ ルオキシダーゼ酵素の産主に導き、これはＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ中ま たはＥ、　ｃｏｌｉ中で作られた酵素、およびＬ」駐皿虱口のネイティブＨＰＩ と同じ電気泳動移動度を示した。

Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおしるＩＮＨの多年の間、ＩＮＨ耐性株のサ ブセット、特に最も高い薬剤濃度に対して耐性のものが、モルモットにおいて毒 力が低く、カタラーゼ活性を持たないものであることが知られていた。ゲノムＤ Ｎ’ＡをＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのいくつかの臨床単離株から調製し、 プローブとして４．５ｋｂ　３」と刀、Ｉフラグメントを用いてサザンブロッッ ティングにより解析した。２つの高度に耐性の株、Ｂ１４５３および２４におい ては、カタラーゼ遺伝子は染色体から欠失していたが、一方、例えば株１２のよ うに低レベルの耐性を示す他のものにおいては（図３）、それはなお存在するが 発現されていない。さらに研究すると、ｋａｔＧのすぐ前の領域は高度に再配列 を受け易いことが示された。

Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＨＰ　ＩはＥ、　ｃｏｌｉ　Ｉ　ＮＨ感Ｌｆ Ｌｉ工ゑＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＨＰＩ酵素がＥ、　ｃｏｌｔにＩＮ Ｈ感受性を付与することが可能かどうかを決定するために、カタラーゼ突然変異 体のシリーズをｐＹＺ５６を用いて形質転換し、ＭＩＣを決定した。

野生型株はＩＮＨに対して感受性ではなかったが、両方の内在性カタラーゼ活性 を欠くがｐＹＺ５６を有している突然変異体は、高レベルのＩＮＨ（５００μｓ 　／ｍｌ　）が存在する場合、生育阻害を示した。一方、形質転換されていない 株は非感受性であった。

本発明の目的のために、図１に示す制限エンドヌクレアーゼ地図を有するプラス ミドは、対中において、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＣｕｌ ｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　（ＣＮ　ＣＭ　）　、Ｉｎ ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ。

Ｐａｒｉｓ、　Ｆｒａｎｃｅに、受託番号（ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ、）Ｉ　−１２０９として１９９２年５月１８日 付けで寄託された。

このプラスミドは、本発明の核酸配列、すなわち、プラスミドｐＹＺ５６の４． ５ｋｂ　五２！■−腹２旦Ｉフラグメントを含んでおり、そのフラグメントは中 にＢａｍＨＩ切断部位を有している。

一般に、本発明は、インニアシト感受性Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒ ｃｕｌｏｓｉｓＤ　Ｎ　Ａに選択的にハイブリダイズして検出可能な複合体を形 成することができる少なくとも１つのＤＮＡまたはＲＮＡプローブを提供するこ とを含む、試料中のイソニアシト耐性Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒ ｃｕｌｏｓｉｓの存在を検出する方法を備えている。

検出は、試料を用いて、試料中に存在するインニアシト感受性Ｍ　ｃｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＤ　Ｎ　Ａにプローブがハイブリダイズ してハイブリッド複合体を形成することを可能にする条件下で、およびハイブリ ッド複合体を試料中のイソニアシト感受性Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂ ｅｒｃｕｌｏｓｉｓの存在の指標として検出することを可能にする条件下で実施 する。（「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ここで使用される場合 は、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブが、インニアシト感受性敗二肋虱肛圏り剋迎匹 且匹亘のみにハイブリダイズし、インニアシト非感受性■ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにはハイブリダイズしないことを表わす、）試料は 、Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞、またはその細 胞の一部分、またはＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ核 酸、特にＤＮＡを豊富にした細胞内容物からなっていることが可能である。ハイ ブリダイゼーションは、従来のハイブリダイゼーション試薬を用いて実施するこ とができる。特定のハイブリダイゼーション条件は本発明に重要ではないことが 見出されている。

より詳細には、Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからの ＤＮＡ配列は、サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションにより解析 することができる。本発明に用いられた技法はＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８９１に記載されている。ＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル上で分 離し、その場所で（ｉｎ　５ｉｔｕ　）変性させる。フラグメントは、次いでゲ ルから水不溶性固体多孔性支持体、例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイ ロンメンブレン、または活性化セルロースペーパーのようなものにトランスファ ーし、そこでそれらを固定する。例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍにより市販されてい るＨｙｂｏｎｄ　（商標）メンブレンを用いることができる。プローブとの非特 異的ハイブリダイゼーションを減少させるためのブレハイブリダイゼーションの 後、固体支持体を、本発明の核酸プローブとハイブリダイズさせる。固体支持体 を洗浄して、非結合および弱く結合しているプローブを除去し、結果として得ら れるハイブリッド二本鎖分子を検査する。好都合な代替的アプローチは、ゲル中 で変性させたＤＮＡにオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることである。

ハイブリダイゼーション溶液中に存在する標識プローブの量は、標識の性質、フ ィルターに妥当に結合し得る標識プローブの量、およびハイブリダイゼーション の強度（ストリンジエンシー）に依存して大きく変化する。一般に、固定された ＤＮＡに対するプローブの結合率を増強するために、化学量論に対してかなり過 剰を用いる。

種々の程度のハイブリダイゼーションのストリンジエンシーを用いることができ る。条件が厳密になればなる程、二本鎖形成のためにプローブとポリヌクレオチ ドとの間のハイブリダイゼーションのために必要とされる相補性が大きくなる。

厳密さは、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間などによっ て制御することができる。好都合には、ハイブリダイゼーションのストリンジエ ンシーは、反応溶液の極性を変えることにより変化させる。用いるべき温度は、 経験的に決定するか、またはこの目的のために開発された周知の公式から決定す ることができる。

ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから固体支持体にトランスファーするサザ ンブロッティングとは異なって、本発明の方法は、乾燥アガロースゲル中でのオ リゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによっても実施することができる。こ の手順においては、アガロースゲルを乾燥し、本発明のオリゴヌクレオチドプロ ーブを用いてｉｎ　５ｉｔｕでハイブリダイゼーションを実施する。この手順は 、検出の速度および感度が望ましい可能性がある場合に好ましい、この手順はＭ 　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡまたはク ローニングされたＤＮＡを含有するアガロースゲルについて実施することができ る。

さらに、本発明の方法は、エレクトロブロッティングによるポリアクリルアミド ゲルからナイロンフィルターへのＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｏ＋ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓＤ　Ｎ　Ａのトランスファーによっても実施することができる。エレ クトロブロッティングは、典型的にはアガロースゲルからＤＮＡをトランスファ ーするために開発されたキャピラリブロッティングよりも速いので、時間が重要 である場合に望ましい可能性がある。この方法は、ＵＶ架橋と組合せて実施する ことができる。

試験すべき試料を含有するポリアクリルアミドゲルを、適切に準備したナイロン フィルターと接触する状態に置く。これらを次いでエレクトロブロッティング装 置中にサンドイッチにし、電流を用いてＤＮＡをゲルからフィルター上へトラン スファーする。緩衝液ですすいだ後、フィルターは、ブレハイブリダイゼーショ ンおよびハイブリダイゼーションまたはＵＶ架橋に供する準備ができている。

本発明の方法は、イソニアシトに対して耐性のＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋ｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを検出するための本発明の核酸プローブを用いて実施す ることができる。プローブは従来の技法を用いて検出することができる。

本発明の方法は、ｋａｔＧ遺伝子の点突然変異もまた、この遺伝子の部分的欠失 同様に検出することが可能である。

本発明のヌクレオチドは、生物学的試料中のＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの ヌクレオチド配列を検出するためのプローブとして用いることができる。ポリヌ クレオチドプローブは、原子または無機ラジカル、最も普通には放射性核種を用 いて標識することができるが、おそらくは重金属を用いて標識することもできる 。放射活性標識としては。

”Ｐ、”Ｈ１１４Ｃまたは同様のものが挙げられる。適切なシグナルを提供し、 充分な半減期を有する、いかなる放射活性標識を用いることも可能である。他の 標識としては、標識抗体に対する特異的結合メンバーとして役立ち得るリガンド 、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｓ）、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕａ＋１ ｎｅｓｃｅｒｓ）、酵素、標識リガンドに対する特異的結合対メンバーとして役 立ち得る抗体、などが挙げられる。標識の選択は、ハイブリダイゼーション率お よびＤＮＡもしくはＲＮＡに対するプローブの結合に対する標識の効果により支 配される。標識が、ハイブリダイゼーションに利用可能なりＮＡまたはＲＮＡの 量を検出するのに充分な感度を提供することが必要となる。

本発明の好ましい態様においては、プローブは、例えばニックトランスレーショ ンによりプローブ中に取り込まれ得る放射活性同位元素、例えば、ｓａｐまたは １！ｓ工で標識する。

別の好ましい態様においては、プローブは、化学的実体に結合したアビジンと反 応するビオチンで標識する。この化学的実体は、アビジンがビオチンと結合する と、ハイブリッドＤＮＡ複合体を検出され得るようにするものであり、例えば、 ハイブリッドＤＮＡ複合体を蛍光計測的に検出可能にする蛍光団（ｆｌｕｏｒｏ ｐｈｏｒｅ）　；ハイブリッドＤＮＡ複合体を電子顕微鏡により検出可能にし得 る電子密度の高い化合物；ハイブリッドＤＮＡ複合体を免疫学的に検出可能にし 得る抗体；または、ハイブリッドＤＮＡ複合体を酵素的に検出可能にする触媒／ 基質対などがある。細菌をプローブと接触させる前に、　Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓ細菌を溶菌してそのＤＮＡを放出させ、次いでそれを変性させ、ニト ロセルロースメンブレンのような適切な固体のＤＮＡ結合支持体上に固定化する ことができる。

別の検出方法は、プローブの標識を必要としない、いわゆるサンドイッチハイブ リダイゼーション技法である。このアッセイにおいては、一本鎖ベクターに含有 されている標識されていないプローブが、インニアシト感受性Ｍ　ｃｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＤ　Ｎ　Ａにハイブリダイズし、プロー ブを含有していない標識された一本鎖ベクターがプローブを含有するベクターに ハイブリダイズして、ハイブリッド複合体全体が標識される。

本発明の配列はジデオキシヌクレオチド配列決定法（シーフェンシング法）によ り誘導された。ヌクレオチドの塩基配列は、５′−３′方向に書かれている。示 されている各文字は、以下のヌクレオチドについての従来の命名である： 本発明のヌクレオチドは、従来の化学合成技法を用いて、ヌクレオシド単位間の ３′→５′ホスフエート連結の形成により調製することができる。例えば、周知 のホスホジエステル法、ホスホトリエステル法、およびホスファイトトリエステ ル技法を、これらのアプローチの変法と同様に、用いることができる。デオキシ リボヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法に基づ（もののような自動合成機械 を用いて調製することができる。オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレ オチドも、従来の技法を用いるＲＮＡ連結を使って得ることができる。

本発明のヌクレオチドは精製された形態である。例えば、本発明のヌクレオチド は、ヒト血液由来のタンパク質、ヒト血清タンパク質、ウィルスタンパク質、こ れらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ヒト組織、およびヒト組織成 分を含まない。さらに、本発明のヌクレオチドは、他の核酸、外来性タンパク質 および脂質、ならびに細菌およびウィルスのような外来の微生物を含まないこと が好ましい。

本発明は、当然のことながら、本発明のヌクレオチド配列の変異種、またはここ における同一のプローブと同じ選択的ハイブリダイゼーション特性を現す本発明 のプローブの血清型的変異種を包含する。

本発明のヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として知られる ＤＮＡ増幅法において使用することができる。例えば、Ｋｗｏｋ　ｅｔ　ａｌ、 　（１９８７）を参照されたい。ＰＣＲは、迅速な方法であるので、有利である 。

増幅すべきＤＮＡのプラス鎖およびマイナス鎖に相補的な、１０〜３００塩基対 離れて位置する既知の配列のＤＮＡプライマー対は、オリゴヌクレオチドの合成 のための既知の技法により調製することができる。プライマーがＰＢＭＣＤＮＡ にアニーリングする場合、各プライマーの一端を、延長し、改変して、制限エン ドヌクレアーゼ部位を創り出すことができる。このＰＣＲ反応混合物は、ＰＢＭ ＣＤＮＡ、ＤＮＡプライマー対、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、Ｍ ｇＣ１ｘ　、ＤＮＡポリメラーゼおよび従来の緩衝剤を含有することができる。

ＤＮＡは、ある数のサイクルで増幅させ得る。一般に、各サイクルが上昇させた 温度での短時間のＰＢＭＣＤＮＡの変性、反応混合物の冷却、およびＤＮＡポリ メラーゼによる重合からなる複数のサイクルを用いて、検出感度を増加させるこ とが可能である。

増幅された配列は、オリゴマー制限（ＯＲ）と呼ばれる技法を用いることによっ て検出することができる。一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）解析を、 ＤＮＡフラグメント中の種々の位置における点突然変異およびＤＮＡ多型を検出 するために用いることができるｅ　５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　 、　０ｒｉｔａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）を参照されたい。例えば、増幅の 後、ＰＣＲ反応混合物の一部を分離し、末端標識されたヌクレオチドプローブ、 例えば５ａｐ−アデノシン三リン酸で末端標識されたプローブを用いたハイブリ ダイゼーションに供することができる。ＯＲにおいては、末端標識されたオリゴ ヌクレオチドプローブは増幅された配列のある領域に溶液中でハイブリダイズし 、このプロセスにおいて特異的エンドヌクレアーゼ部位を再構成する。したがっ て、増幅されたｋａｔＧ配列との標識プローブのハイブリダイゼーシゴンは、選 択的制限酵素消化に対して感受性の二本鎖ＤＮＡ形態を生じる。エンドヌクレア ーゼによる制限処理の後、結果として生じる試料をポリアクリルアミドゲル上で 解析することができ、診断的標識フラグメントを用いてゲルの一部分のオートラ ジオグラムを得ることができる。オートラジオグラムにおける診断的フラグメン ト（例えば、長さ１０〜１５塩基の）の出現は、ＰＢＭＣ中のｋａｔＧ配列の存 在を示す。

もとのテンプレート（鋳型）として染色体ＤＮＡの代わりにＲＮＡを用いること により検出感度を増加させ得る可能性があるので、本発明は、ここに記載されて いるＤＮＡ配列に対して相補的なＲＮＡ配列を使用することを企図する。このＲ ＮＡは、逆転写酵素によって相補的ＤＮＡに変換することができ、次いでＤＮＡ 増幅に供することができる。

Ｘ狭土朋 およびプラスミド 表１は、本発明において使用した細菌株およびプラスミドの特性を概略的に示す 。

表１．細菌株およびプラスミド し」憇憇鮭ｎＢ）Ｉｆ　ＭＣ”１５５　ｈｅｔ　ｋａｔＧＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓ　Ｈ３７ＲＶゲノムライブラリーは、シャトルコスミドｐ　Ｙ　Ｕ　 ８１８　（Ｓｎａｐｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８８）中に構築され、Ｗ、 　Ｒ。

Ｊａｃｏｂｓ博士の厚意により供給された。用いた他のシャトルベクターは、ｐ 　Ｙ　Ｕ　Ｂ　１２　（Ｓｎａｐｐｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　、　１９８８）および ｐＢＡＫ１４（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１）であった。

４・　゛および　、′ 用いた抗生物質、生育条件、酵素学およびＭＩＣ決定の詳細は、Ｈｅｙｍ　ｅｔ 　ａｌ、　（１９９２）中に見出すことができる。

扱奴弦広 サブクローニング、サザンブロッティング、ＤＮＡシークエンシング、オリゴヌ クレオチド生合成などには、標準的プロトコールを用いた（Ｍａｎｉａｔｉｓ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８９；　ＥｉｇｌｌＩｌｅｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ９１）。

孟ユ歯Ｌ Ｅ、　ｃｏｌｔおよびマイコバクテリウムの無細胞抽出物の調製は記載されてき た（Ｈｅｙｍ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２；　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９９１）　ａネイティブタンパク質試料は、全ての緩衝液からＳＤＳを除外し、 試料を煮沸せず、β−メルカプトエタノールを試料緩衝液中に包含させなかった ことを除き、Ｌａｅｍｍｌｉ　（１９７０）により記載されたようにポリアクリ ルアミドゲル電気泳動によって分離した。７．５％ポリアクリルアミドゲル上で の５０〜１００μｇタンパク質試料の電気泳動の後、ゲルを３ｍＭＨａＯａ中に ２０分間、緩やかに振とうしつつ浸漬することにより、カタラーゼ活性を検出し た。等容量の２％塩化鉄および２％フェリシアン化カリウムを添加し、光で照ら すことによりカタラーゼ活性の明らかなバンドを解明した。ベルオキシダ−ゼ活 性は、０．２〜０　、５　ｓａｇ／ｗ＋１ジアミノベンジジンおよび１．５ｍＭ Ｈｉｏｔを含有する溶液中にゲルを３０〜１２０分間浸漬した後、褐色のバンド として検出した。

高度に毒性の化合物を生成するためには、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨＰ Ｉ酵素がペルオキシダーゼによりＩＮＨを活性化する可能性が最も高いように考 えられる（Ｙｏｕａｔｔ、　１９６９；　Ｇａｙａｔｈｒｉ−Ｄｅｖｉ　ｅｔ　 ａｌ、。

１９７５）　、　ｋａｔＧ遺伝子が単離され、特徴付けられたので、同様にして 活性化され得るＩＮＨの新規な誘導体を作ることが可能なはずである。

Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのイソニアシト　に　゛　るｋａｔＧ゛二△叉 然亙１ 最近の研究において、ｋａｔＧ遺伝子によりコードされるＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒ ｉｕＩＩｌｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのカタラーゼ−ペルオキシダーゼが強力な 抗結核剤のインニアシトまたはＩＮＨの毒性を媒介することに関与していること が示された。臨床レベルのＩＮＨに対して耐性の突然変異体は、減少したカタラ ーゼ−ペルオキシダーゼ活性を示し、ある場合においては、このことは染色体か らのｋａｔＧ遺伝子の欠失によってもたらされている。クローニングされたｋａ ｔＧ遺伝子を用いたＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅ　ｍａｔｉｓおよびＭ 、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＩＮＨ耐性株の形質転換は、薬剤感受性の回復 をもたらす。

Ｅ、　ｃｏｌｔのい（つかの株におけるｋａｔＧの発現は、この天然には耐性の 生物を、高濃度のＩＮＨに対して感受性にする。

Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのいくつかのＩＮＨ耐性臨床単離株はインタク トなｋａｔＧ遺伝子を保持していたので、その耐性の分子的基盤を調べた。この 研究は、染色体のｋａｔＧ領域からの４．７ｋｂＫ工旦Ｉフラグメントのヌクレ オチド配列の利用可能性により容易になった。これは、このことがＰＣＲ解析に 好適なプライマー対の設計を可能にしたためである。１１対のオリゴヌクレオチ ドブライマーを合成しく表２参照）、完全ｋａｔＧ遺伝子およびフランキング配 列のいくらかをカバーする２８０ｂｐ程度のＰＣＲ産物を生成するために用いた 。対照実験においては、全ての実験で１１対のプライマー全てが予想されたサイ ズのＰＣＲ産物を生成し、５ｓｃｐ解析に非常に好適であったので、オランダま たはフランス起源のＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３６のＩＮＨ耐性株のパ ネルを試験した。これらの株の多くが多剤耐性であり、ＨＩＶ血清陽性患者から 単離されたものである。

州＝　； ａｉ　ＮＩＮ　＝　冗 それらのうちの２つは、どのプライマーを用いてもＰＣＲフラグメントを生じず 、ｋａｔＧ遺伝子が欠失してしまっていることが示された。残りの３４株は、全 て予想されたＰＣＲ産物を生じ、存在する可能性がある点突然変異を検出し得る ようにこれらを５ｓｃｐゲルで解析した。２ｏのケースにおいて、薬剤感受性Ｍ 、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｋａｔＧと比較して異常なストランド移動度が 観察され、突然変異的事象が実際に起こっていたことが示唆された。ＰＣＲプラ イマーにより決定したこれらの突然変異のおよその位置を表３に示す。

医λ Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｋａｔＧ゛　の　の亡　およびヌクに土生上 配」 細菌株、プラスミドおよび生育条件、我々の研究室のコレクションから以下の細 菌株をこの研究に使用した：　Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒｖ　； 　Ｌ！慇■ＩｎＭＣ”　１５５　（Ｓｎａｐｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０ ）　；Ｅ、ｃｏｌＬ　Ｋ−１２０Ｍ２　（ｋａｔＥ　ｋａｔＧ；Ｍｕｌｖｅｙｅ ｔａｌ、、　１９８８）。組換えプラスミド、ｐＹＺ５５　（ｐＵｃ１９゜ｋａ ｔＧ”）、ｐＹＺ５６（ｐＵｃ１９．　１　ａ　ｃ　Ｚ　’　：：ｋａｔＧ）お よびシャトルクローン、ｐＢＨ４（ｐＹＵＢ　ｌ　８゜ｋａｔＧ’）およびｐＢ ＡＫ−ＫＫ−（ｐＢＡＫ１４゜ｋａｔＧ゛）は最近記載されており（Ｚｈａｎｇ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２゜Ｎａｔｕｒｅ）　、　Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ ｓｉｓのｋａｔＧ遺伝子座は図５に模式化して示す。マイコバクテリウムは、Ｍ ｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ　７Ｈ９培地で３７℃で生育させ、一方、Ｅ、　ｃｏｌＬ 株は、適切な添加栄養と抗生物質を含むしグロス中で培養した。

核酸技法、ＤＮＡの調製、標識およびハイブリダイゼーションには、標準技法を 用いた（Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１；　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ 　ａｌ、。

１９９２、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、；　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、１９９ ２．　Ｎａｔｕｒｅｌ　。

ｐＹＺ５５のランダムフラグメントのショットガンライブラリーは、以前記載さ れたようにＭ１３ｍｐ１８中に調製しくＧａｒｎｉｅｒ　ｅｔａｌ、、　１９８ ６）、ジデオキシ変法を用いてシーフェンシングした（Ｂｉｇｇｉｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、　１９８３）　ｅ配列は、蓄積し、ＳＡＰを用いてコンティグ（ｃｏｎｔ ｉｇｓ　）に集合させ、Ｖａｘ３１００ワークステーションで作動させてＮＩＰ 、ＳＩＰおよびＰＩＰを用いて解析した（Ｓｔａｄｅｎ、　１９Ｂ？）。ギャッ プ閉鎖（ｇａｐ　ｃｌｏｓｕｒｅ）は、ＡＢＩ　３８１装置上で合成した合成オ リゴヌクレオチドブライマーと、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）を用いて得、ｐＹＺ５５から直接配列を得た。ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ リリース７３．１）中の関連配列を検索するためには、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓ ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８Ｂ）およびＢ　Ｌ、　Ａ　Ｓ　Ｔ　（Ａｌｔｓｃ ｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ、　。

１９９０）プログラムを用いた。タンパク質配列中に存在する可能性のあるモチ ーフを検出するために、Ｐ　ＲＯＳ　Ｉ　Ｔ　Ｅ　（Ｂａｉｒｏｃｈ、　１９９ ２）カタログをスクリーニングし、ＧＣＧ配列解析パッケージのＰＩＬＥＵＰお よびＰＲＥＴＴＹモジュールを用いて整列（アラインメント）を行った（Ｄｅｖ ｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４）　ａウェスタンブロッティングおよび カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性染色。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動により解像されたポリペプチドのイムノブロッティングおよびＭ、　ｂｏｖ ｉｓＢ　ＣＧに対して生成されたポリクローナル抗体（ＤＡＫＯより購入）を用 いた検出は、記載されたとおり行った（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２ ．　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、カタラ ーゼおよびペルオキシダーゼ活性を検出するための手順は、最近概略的に示され ている（Ｈｅｙ＋＋＋　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２；　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９９２．　Ｎａｔｕｒｅ）　＃■ Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｋａｔＧ遺伝子座のヌクレオチド配列。

以前の研究においては、完全ｋａｔＧ遺伝子は、シャトルコスミドｐＢＨＡ上に 、およびｐＹＺ５５を与えるために４．５ｋｂＬＬユＩ制限フラグメント上に、 Ｅ、　ｃｏｌｉにおいて別々にクローニングされた（図５　；　Ｚｈａｎｇ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９９２．　Ｎａｔｕｒｅ）　ｅカタラーゼ−ペルオキシダーゼ の構造遺伝子は、続いてサブクローニングにより２．５ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＫＢ 一旦エフラグメントに位置決定された。この重要な酵素の一次構造を推定し、そ れにより強力な抗結核誘導体へのＩＮＨの変換におけるその推定上の役割につい ての洞察を得るために、ｐＹ２５５からの完全インサートのヌクレオチド配列を 決定した。これは、ジデオキシ−ショットガンクローニング手順の変法（Ｂｉｇ ｇｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９３）により達成し、コンティグ間のギャップは 特異的プライマーを用いて閉鎖した。

結果として得られた図６Ａに示す配列を調べると、この４．５ｋｂフラグメント は、４，７９５ヌクレオチドを含み、総体的ｄＧ＋ｄＣ含鳳が６４．４％である ことが見出された。高コーディング確率値を用いてオーブンリーディングフレー ムの存在に関してこれを解析すると、単一の候補が検出され、その大きさ、組成 および位置から、これを１（ａｔＧとして同定した。五２旦エフラグメントのど ちらのストランドにもそれ以外のオーブンリーディングフレームが存在しないこ とは、ｋａｔＧ以外の遺伝子がＩＮＨ感受性の付与に関与している可能性を除外 した。

この配列をさらに解析すると、ｋａｔＧが、それに先行する２コピーの７００ｂ ｐのダイレクトリピートを有することが示された。これらは６８％同一であり、 同一である最長のストレッチは５８ｂｐであった（図６Ｂ）。この配列を用いて データベースなスクリーニングしたところ、有意な相同性は全く検出されなかっ た。それがＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの新規な反復要素に相当する可能性 を試験するために、５ｓｂｐのリピートを含む３３６ｂｐのプローブを用いて部 分的に整理したコスミドライブラリーを調べた。陽性のハイブリダイゼーション シグナルは、ｋａｔＧを担持することが既知であるクローンからのみ得られた。

同様に、制限酵素１旦ｍＨＩ、五二旦工および且旦工■を用いて消化したＭ、　 ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤＮＡのサザンプロット中には単一の制限フラグメ ントが検出され、それによりこの反復配列が分散していないことが示された。

ｋａｔＧの染色体での位置ｅ　Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノム計画の一 部として、プローブが利用可能であるほとんどの遺伝子をコンティグ地図上で位 置決定した。図５に示す重複するコスミドのシリーズから、ｋａｔＧにリンクし たマーカーは、それぞれ無名の抗原および推定上のフィブロネクチン結合タンパ ク、またはα抗原（Ｍａｔｓｕｏ　ｅｔａｌ、、　１９８８１をコードする、Ｌ Ｌ１０５および１立上旦であることがわかる。既知の挿入配列ｌ５６１１０およ びｌ５１０８１（Ｃｏｆｆｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１；　ＭｃＡｄａａ ＋　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０；　Ｔｈ１ｅｒｒｙ　ｅｔ　ａｌ、。

１９９０、　Ｊ、　（：１ｉｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、；　Ｔｈ１ｅｒｒｙ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）のどれ一 つとして染色体のこの領域にマツプされないが、ｋａｔＧの上流領域には主要冬 型タンデムリピートであるＭ　Ｐ　Ｔ　Ｒ（Ｈｅｒｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　、 　１９９２；　Ｚｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　１９９３）が密に存在する 。

他のマイコバクテリウムにおけるｋａｔＧ相同体（ホモログ）の存在、ＩＮＨは 結核コンプレックスのメンバーに対して絶妙に強力であるが、他のマイコバクテ リウムに対しては、あるとしてもわずかの活性しか示さない。ｋａｔＧに相同な 遺伝子が他のマイコバクテリウムに存在するかどうかを決定するために、Ｒｓｒ ｌｌで消化したＤＮＡのサザンプロットを、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの ｋａｔＧを担持する２、５ｋｂの旦立旦ＲＶ−ｈ旦Ｉ制限フラグメントから調製 したプローブにパイプリダイズさせた。高ストリンジエンシー条件下で、Ｌ」」 工朋およびＭ、　ａｖｉｕｍから良好なシグナルが得られた（図７）が、一方、 Ｌ」ｙ垂ｍ憇およびＭ、　ｓｚｕ江虱については、かろうじて識別できるハイブ リダイゼーションが観察された。最近、ｋａｔＧホモログは７および＋４．　ａ ｕｒｕｍにも存在することが示された（Ｈｅｙｗ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２） 。

＠、　ｊｌｂ２ｒｃｕｌｏｓＬｓのカタラーゼ−ペルオキシダーゼの予測される 特性＊　ｋａｔＧのヌクレオチド配列から推定されるカタラーゼ−ペルオキシダ ーゼの一次構造を図６に示す。この酵素は、７３５アミノ酸を含み、８０．０２ ９ダルトンの分子量を有すると予測される。このサイズのタンパク質は、Ｍ、　 ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　、およびＭ、　ｓｍｅ↓ａｔｉｓとＥ、　ｃｏｌｉ の両方の組換え体において観察された（以下を参照されたい）。

一次構造は、Ｅ、　ｃｏｌｔ　、　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕ ｍおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓを含むいく つかの他の細菌のカタラーゼ−ペルオキシダーゼについても入手可能であり（Ｌ ｏｅｗｅｎｅｔ　ａｌ、、　１９９０；　Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９８８；　Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ　ａｔ　ａｌ、。

１９８ｇ）　、これらは酵母シトクロムＣペルオキシダーゼと遠く関連している ことが示されている（Ｗｅｌｉｎｄｅｒ、　１９９１）。後者の結晶構造は決定 されており（Ｆｉｎｚｅｌ　ａｔ　ａｔ、、　１９８４）　、これを細菌の酵素 の配列を解釈するために使用することができる＊　Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓの酵素はエンテロバクテリアのＨＰＩ酵素と５３．３％の保存を示し、Ｌｓ ｔｅａｒｏｔｈｅ匹」±■凹からのタンパク質と４５．７％の同一性を共有する 。これらの４つの酵素の配列の整列図を、酵母シトクロムＣペルオキシダーゼの それ（Ｗｅｌｉｎｄｅｒ、　１９９１）と共に図８に示す。

ＮＨ，末端は、酵母の酵素には対応物がなく、最も変化の多い部分であることは 明らかであり、タンパク質のこのドメインが広範な変動を許容することができ、 触媒に必要とされないことが示唆される。この解釈の実験的支持は、さらに４０ アミノ酸残基な含有するＬａｃＺ−ＫａｔＧ融合タンパクの形態において提供さ れる（図９、レーン６　；　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２．　Ｎａｔ ｕｒｅ）　、このＮ　Ｈ２末端セグメントの付加は、活性染色による判定から、 ＫａｔＧにより行われるカタラーゼまたはペルオキシダーゼ反応のどちらかに、 認め得る程度に干渉しない（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２．　Ｎａｔ ｕｒｅ）。

細菌のカタラーゼ−ペルオキシダーゼは、遺伝子重複事象により進化したもので あり、両方とも酵母の酵素との相同性を示し、約５０アミノ酸残基のユニークな Ｎ　Ｈｚ末端配列と融合した２つのモジュールからなると考えられている（ｌａ ｕｎｄｅｒ、　１９９１）。

Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの酵素はこのパターンに従っており、ＳＩＰを 用いて内部的相同性について検索したところ（Ｓｔａｄｅｎ、　１９８７）、残 基５５〜４２２の間の領域がアミノ酸４２３〜７３５かうなるカルボキシ末端ド メインと関連していることが明らかであった。

ＰＲＯ５ＩＴＥカタログに存在する、ペルオキシダーゼに典型的な２つの活性部 位モチーフ（Ｂａｉｒｏｃｈ、　１９９２）の一方のみが、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃ ｕｌｏｓｉｓカタラーゼ−ペルオキシダーゼ−次構造をスクリーニングした場合 に見出された。これは、第二のモチーフがあるはずのところである１ｉＳ２１１ １１周辺のコンセンサスから２つの逸脱が存在するためである。（ペルオキシダ ーゼ１についてのコンセンサスパターン：　［ＤＥＴ］　−［ＬＩＶＭＴ］−ｘ 　（２）−［ＬＩＶＭ］−［ＬＩＶＭＳＴＡＧ］　−［ＳＡＧ］　−［ＬＩＶＭ ＳＴＡＧ］　−Ｈ−［ＳＴＡ］　−［ＬＩＶＭＦＹ）；ペルオキシダーゼ２につ いてのコンセンサスパターン：　（ＳＧＡＴＩ　−ｘ　（３）−（ＬＩＶＭＡＩ −Ｒ−［ＬＩｖＭＡ）−ｘ　−［ＦＷ）−Ｈ−ｘ−［ＳＡＣ］；（Ｂａｉｒｏｃ ｈ、　１９９２）　＠さらに、可能性があるＡＴＰ結合モチーフ（Ｇ−ｘ−ｘ− ｘ−ｘ−Ｇ−に−Ｔ）が検出された（Ｂａｌｒｏｃｈ。

１９９２）が、これは活性部位と部分的に重複するため、その存在は純粋に偶然 である可能性がある（図８）。

酵母シトクロムＣペルオキシダーゼとの類似性により（Ｗｅｌｉｎｄｅｒ、　１ ９９１）、全てがＮ　Ｈｚ末端リピート中に位置する、構造的におよび触媒的に 重要な残基の数を予測することが可能であった。Ｉ（ｉｓ″８書はヘム鉄の５番 目のりガンドヒして役立つはずであり、一方、ＡＳｐｌｌｏはその水素結合した 相手であるはずである。活性部位のモジュレーションおよびＨ２Ｏ２結合に関与 すると予測される他の残基は、Ａｒｇ＋０４．７ｒｐ１０７．１ｉｓｔｏｌｌ、 ＡｓｏＩ３８、Ｔｈｒ”）４およびＨｉｓ”フ５である（図４　）　＋Ｉ　Ｗｅ ｌｉｎｄｅｒの予測によれば、７ｒ　ｐ　＊　＊　Ｑは重要な残基であり、タン パク質−ラジカル部位の形成に必要なはずである（Ｓｉｖａｒａｊａ　ｅｔ　ａ ｌｌ、　１９８９）。

Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｋ　ａ　ｔ　Ｇに対する抗体応答。ＫａｔＧ の免疫原としての可能性がある値を評価するために、ウェスタンプロットを、ウ サギにおいてＭ、　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧに対して生成させた抗血清を用いてプロ ーブした０図９に示すように、８０ｋＤカタラーゼ−ペルオキシダーゼは、Ｍ、 　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　、およびクローニングされたｋａｔＧ遺伝子を発 現している７の無細胞抽出物をこおＩ／為で認識される顕著な抗原の一つである （レーン１．３）。同様に、Ｅ、　ｃｏｌｉ中にこの遺伝子を導入すると、有意 なレベルのカタラーゼ−ペルオキシダーゼが産生され、８５ｋＤ融合タンノ（り の合成を指示するｌ　ａｃＺ’　−ｋａｔＧ遺伝子融合から顕著な発現の増力ロ カＳ％られた（図９、レーン６）。

本研究の目的は、ｋａｔＧ遺伝子のヌクレオチド配夕ＩＪを決定すること、得ら れた情報を用いてその産物力Ｓし）力〉にしてＬｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＩ ＮＨ感受性を媒介するかを理解しようとすること、およびおそらくはゲノムのｋ ａｔＧ領域の見カ）け上の不安定性を説明することであった。反復ＤＮＡはしば しば染色体再配夕１１の源であり、ｋａｔＧの上流のＤＮＡ配列の解析力）ら、 ２コピーの７００ｂｐダイレクトリピートが明らかになった。この要素Ｃよ、こ の遺伝子座に限られているように見えるので、このようをこ頻繁番ご観察される この遺伝子の欠失を導き得る、相同組換えのような事象のターゲットとして役立 つ可能性は低い（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２゜Ｎａｔｕｒｅ；　Ｚ ｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　１９９３）。同様に、ｋａｔＧを包含するＭ 、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７Ｒｖの染色体の７０ｋｂストレツｆＬこ １よｌ５６１１０およびｌ５１０８１のコピーが存在しなしｓので、これらの挿 入配列が不安定性の源である可能性は高いように番士見えない、むしろ、ｋａｔ Ｇの上流に位置する主要各型タンデムリピート、ＭＰＴＲ（図５　；　Ｈｅｒａ ＋ａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２）のクラスターの存在は、これが組換えの ホットスポットとして作用する可能性があることを示唆する。これは、ＭＰＴＲ クラスターとｋａｔＧの両方を除去する可能性がある（Ｚｔ＋ａｎｇ　ａｎｄ　 Ｙｏｕｎｇ、　１９９３）　、　ｋ　ａ　ｔ　Ｇ領域の配列の利用可能性は、ポ リメラーゼ連鎖反応に好適なプライマーの設計を可能にし、したがってＩＮＨ耐 性の迅速な検出および染色体不安定性の分子的基礎の理解の両方に向けられた研 究を容易にする。

Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓカタラーゼ−ペルオキシダーゼのおそらく最も 興味深い特徴は、ＩＮＨ感受性を媒介するその能力である。我々の現在の作動仮 説においては、この薬剤はその酵素と相互作用し、ペルオキシダーゼ活性によっ て毒性誘導体に変換され、それが未知の第二の部位に作用する（Ｚｈａｎｇ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９９２．　Ｎａｔｕｒｅ）。西洋ワサビペルオキシダーゼはこ の反応を実行することができ（Ｐｅａｒｓｏｎ　ｅｔａｌ、、　１９８８；　５ ｈｏｅｂ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５）、ヒロドキシルおよび有機を含まないラ ジカルを生成し得るが、他のマイコバクテリウムを含め、ごくわずかの細菌しか ＩＮＨに対して感受性を有さない。それらはｋａｔＧに相同な遺伝子を存するの で、このことは興味深い（図７）。これについての１つの説明は、はとんどの細 菌は２つのカタラーゼを含み、それらの一方はペルオキシダーゼ活性を有する広 いスペクトルの酵素であり、また、第二のカタラーゼはＨ３０□を優先的に除去 することによりこのカタラーゼ−ペルオキシダーゼの能力をＩＮＨを酸化するこ とに制限するという事実によって提供され得るｅ　Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓは後者の活性を欠いているので、そのＫａｔＧ酵素は、電子受容体について の競合なしにＩＮＨをその致死形態に変換することができる。

あるいはそうでなければ、毒性を助長するか、またはその薬剤との相互作用を好 む、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ酵素の何らかの独自の特徴が存在する可能 性がある。細菌のカタラーゼ−ペルオキシダーゼの一次構造を調べることは、こ の点に関して指示を与えるものではない。これは、それらが皆広範な配列の同一 性を共有し、ペルオキシダーゼの活性部位に特徴的な２つのモチーフを含むため である。さらに、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｋａｔＧ遺伝子の発現はＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓの薬剤耐性突然変異体にＩＮＨ感受性を部分的に回復させ得ることが 最近示され、この内在性酵素はいかなる薬剤特異的特性も有さない可能性がある ことが示唆された（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９３）、酵母からのシト クロムＣペルオキシダーゼとの配列の比較は、ＫａｔＧタンパク質の構造的およ び機能的編成についての重要な情報を提供し、推定的に重要な触媒残基の同定に 導いた（図８）。

ｋａｔＧの完全配列が利用可能になったので、位置指定突然変異誘発によりこれ らの仮説のいくつかを試験すること、および酵素的反応およびその生成物の詳細 な解析をインビトロで実施し得るように酵素を過剰産生させることが可能である 。同様に、酵素的活性を保持しているが、ＩＮＨへの結合またはその酸化ができ ない突然変異体を単離することも比較的簡便なことのはずである。特に興味深い のは、この酵素の反復構造、およびＮＨ，末端リピートがペルオキシダーゼの活 性部位を含むという予測である。これは、突然変異を起こした、または３′端で 短縮されたｋａｔＧ遺伝子が生じ得る可能性を提起する。その生成物は、サブユ ニット−サブユニット相互作用に必要であり得る正常なＣ０ＯＨ末端（Ｗｅｌｉ ｎｄｅｒ、　１９９１）を欠いており、不安定ではあるが、低い酵素活性をなお 保持しているであろうということは考えられる。それらは、したがって、臨床的 な場においてしばしば観察されるように、この遺伝子を完全に欠いている突然変 異体とｋａｔＧ”株との間の、中間的レベルのＩＮＨ感受性を付与するであろう 。

本発明は、当然のことながら、上述した２、５ｋｂの立上旦ＲＶ−腹且ｎＩフラ グメントの一部分を使用してもよく、上記一部分はそれでもなおインニアシトに 対して耐性のＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒＬｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのインビト ロ検出の選択性を提供するのに充分に長いものである。

本発明は、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの多剤耐性変異体の検出のためのキ ットにも関し、上記キットは、 （ａ）薬剤耐性をコードしている遺伝子についてのプローブを含有している容器 ；および （ｂ）核酸の対照調製物を含有している容器を含む。

いうまでもなく、その使用は、イソニアシトに対して耐性の７はどの核酸に特異 的なヌクレオチド配列を利用するあらゆる代替的検出方法であってよく、例えば 、増幅技法およびプライマーを用いる方法であって、そのプライマーは、上述の プローブのヌクレオチド配列の少な（とも一部分を含有するフラグメントの増幅 を提供するために上記特異的なヌクレオチド配列内に包含されていてもよ（、そ れにもかかわらずインニアシトに対して耐性の数社ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂ ｅｒｃｕｌｏｓｉｓのインビトロ検出の選択性を提供するのに充分に長いもので あり、最終的に増幅された配列のいずれかの中の可能性がある突然変異を検出す る。

選択した抗生物質に対する耐性の検出のための好ましい代替的方法（オリゴタイ ピング）は、以下の工程を含むニー突然変異を有している可能性が高い適切な遺 伝子またはその一部を、選択した制限酵素により上記適切な遺伝子を消化するな どによって、複数のフラグメントにフラグメント化する工程、−これらのフラグ メントを、好ましくは、ストリンジエンシーの高い条件下で、対応する抗生物質 に対して耐性ではない株の対応する対照ＤＮＡの上記適切な遺伝子の全部または 一部を認識する標識プローブのシリーズである、相補的オリゴヌクレオチドプロ ーブとハイブリダイズさせる工程、 −そして、調べているマイコバクテリウムの上記適切な遺伝子のいずれかのＤＮ Ａフラグメントへの、少なくとも１つの上記オリゴヌクレオチドプローブのハイ ブリダイゼーシジンの欠如を、特に上記抗生物質に対して耐性ではない株から得 られた上記適切な遺伝子上での同じオリゴヌクレオチドを用いた同じ条件下での 試験の結果と比較して、突然変異の存在、そしておそらく対応する抗生物質に対 する耐性の証拠として関連させる工程。

別の代替的方法（ＳＳＣＰ解析、すなわち、一本鎖コンフォメーション多型の解 析）は、以下の工程を含む：−解析すべきＤＮＡ、特に適切な遺伝子のＤＮＡを 消化する工程、 −得られたフラグメントを、例えばＰＣＨにより増幅する工程、 一増幅されたフラグメントを回収する工程、および−例えば、電気泳動ゲルなど でそれらを移動させることによって、サイズにしたがってそれらを互いに分離す る工程、−異なるフラグメントのサイズを、同様のアッセイに供した、抗生物質 に対して耐性ではない１つまたはいくつかの対照株のＤＮＡから得られたものと 比較する工程、および−おそらく検出される多型を、上記適切な遺伝子中の突然 変異の存在と関連させ、したがって調べているＤＮＡを得たもとの株の対応する 抗生物質に対する可能性のある耐性と関連させる工程。

いうまでもなく、古典的なシーフェンシング技法を含め、他のあらゆる方法を、 同じ目的の達成のために行使することができる。

この方法は、多型の検出のための「オリゴタイピング」という表現で知られるも のを含み、０ｒｉｔａ　ｅｔ　ａｌ、　（本明細書中以前に既にこれを参照して いる）により開示された一本鎖のコンフォメーションに基づいた多型の検出のた めの方法を参照するのが有利である。

イソニアシトに対する耐性の場合の適切な遺伝子は、当然のことながらｋａｔＧ 遺伝子またはそのフラグメントである。

リファンピシンに対する耐性の場合には、適切な遺伝子は、上記マイコバクテリ ウムのＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードする二立上旦遺伝子であり 、あるいはその遺伝子の一部のみを使用する場合には、好ましくは二且旦１遺伝 子のコドン４００〜４５０を含む部分である。

最後に、ストレプトマイシンに対する耐性の場合には、企図される適切な遺伝子 は、小リポソームサブユニットのＳ１２タンパク質をコードする二ｍ遺伝子のそ れであり、あるいは上記遺伝子の一部のみを使用する場合には、好ましくは位置 ４３のコドンを含む部分である。

好ましい手順を、特にＰＣＲ増幅法を利用する代替的方法に関して、以下に開示 する。

生物学的試料（例えば、血液または唾液）から、細胞破砕物を除去し、適切な溶 解緩衝液を用いて細菌細胞を溶解した後、ＤＮＡを得る。ＰＣＲ増幅法を、それ ぞれ増幅すべきＤＮＡの各ストランドのフラグメントに相補的な１対のプライマ ーを用いて、古典的な方法により実施する。

この手順は、さらに以下のように実施してもよいニー増幅産物（例えば、１００ 〜３００ヌクレオチドを含む）を、好適なエンドヌクレアーゼにより消化し、− 増幅媒体から得られたＤＮＡストランドを変性処理に付し、−一本鎖にしたＤＮ Ａストランドを中性５％ポリアクリルアミドゲル上に置き、 一上記一本鎖にしたＤＮＡストランドを、電気泳動により上記ゲル上を移動させ 、 一ポリアクリルアミドゲル上を移動したＤＮＡフラグメントを通常のエレクトロ ブロッティング技法に従ってナイロンメンブレンにトランスファーし、例えば、 ｓｉｐ標識したプローブのような標識プローブとハイブリダイズさせ、そして− 解析に供したＤＮＡフラグメントの移動距離を、同じ条件下の増幅、消化、変性 電気泳動およびナイロンメンブレンへのトランスファーで得た対照から得られた ものと比較する。上記ＤＮＡは同一ではあるが調べている抗生物質に対して感受 性の細菌株から得られていたものである。

上記で開示した「オリゴタイピング」手順に用いるオリゴヌクレオチドプローブ 、ならびにＰＣＲプライマーの作製のためには、１９９２年９月１５日にＣＮＣ Ｍに番号ｌ−１２１６７として寄託されているプラスミドに挿入された野生型Ｍ 、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＵ旦１遺伝子に相補的なものを、有利に利用す る。

本発明は、より詳細には、小リポソームサブユニットの３１２タンパク質をコー ドするＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのユニ皿上遺伝 子のフラグメントのヌクレオチド配列、並びにストレプトマイシンに対する耐性 に関連があると認められている突然変異を起こした一Ｌ旦山上遺伝子フラグメン トヌクレオチド配列にも関する。

そのヌクレオチド配列の増幅により、ｍ遺伝子全体のヌクレオチド配列を得るこ とができる。

本発明の詳細な説明は、以下の別の例の記載において提供され、そこで関連する 図面においてはニ ー図１０は、異なるＬ山＝と単離株の研究のために用いたＰＣＲ戦略をダイアグ ラムにより表すものであり、二２旦１のコーディング配列を示す。シーフェンシ ングされた領域は、陰影をつけた部分で示し、用いた増幅プライマーの位置およ び参考は上部の線により示し、シーフェンシングプライマーはその下に示しであ る。

一部１１は、（Ａ）リファンピシンに対する耐性を付与する突然変異を有する二 立上１の短い領域のヌクレオチド配列を、対応する対立遺伝子中の塩基の変化と 共に示すもの、および（Ｂ）Ｅ。

ｃｏｌｉおよびＬ」」工凹のＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットの領域Ｈのド メインＩのアミノ酸配列間の比較であり、ここで、突然変異を起こしたアミノ酸 の差異および残基の番号を示しである。リファンピシン耐性と関連する突然変異 を起こしたアミノ酸残基並びにその出現頻度も示しである。

−図１２は、Ｌ」」工凹のＬ２旦旦遺伝子の完全配列を示す。

−図１３は、Ｍ、′ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの二立上１遺伝子の一部の配列を 表す。

一部１４は、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの−２皿上遺伝子の一部の配列を 表す；Ｌ」シエ憇の完全ユニ旦１遺伝子の配列と、その発現産物であるＳ１２タ ンパク質（その出発アミノ酸は１で記しである）のそれとを両方示しである。Ｍ Ｌ５１８よび　ＭＬ５２Ｌライマーの位置、並びにＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓの二且旦ふ遺伝子の一部の配列は、Ｌ」１ｍ凹のそれらの下に提供しである 。それらの位置のうち異なるものおよび相当するアミノ駿変化のみを示す。

−図１５は、ストレプトマイシンに対する耐性に関連する、小リポソームサブユ ニットのＳＬ２タンパク質をコードする二２旦上遺伝子フラグメントの野生型Ｄ ＮＡ配列、並びにＳ１２タンパク質の対応するアミノ酸配列を示す。

例 リファンピシンに対する感受性を、Ｇｒｏｓｓｅｔ　ｅｔ　ａｌ、　（およびＩ ｎｔ、　Ｊ、　Ｌｅｐｒ、　５７：　６０７−６１４）により開示されているよ うに、マウスにおいて決定した。艶」」工凹の細胞は、古典的手順によってマウ スの足から得た。耐性株は全て、２０　ｍｇ／ｋｇの日用量のりファンビシンを 受けたマウスにおいて生育することができたが、一方、感受性株は２　ｍｇ／ｋ ｇ未満の低いリファンピシン濃度で殺菌された。

抽出したＤＮＡのＵ立上遺伝子の適切な領域を２対のビオチン化したプライマー を用いて開始した。その配列を以下の表に示す。

表 プライマー　配　列 １ｏＢｒｐｏ２２　ＣＡＧ＜；ＡＣ（ＣＧＡＧＧＣＧＡＴＣＡＣｒｐｏ２３　Ａ ＡＣＧＡＣＧＡＣＧＴＧＧＣＣＡＧＣＧＴ１５　Ｂｒｐｏ２４　ＣＡＧＡＣＧＧ ＴＧＴＴｒＡＴＧＧＧＣＧＡｒｐｏ２５　ＴＣＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＧ ＣＴＣ２ｏｒｐ０３２ＴｃｃＴｃＧＴＣＡＧｃＧＧＴｃＡＡＧＴ′Ａｒｐｏ３３ 　ＣＴＴＣＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＣＴＧ２５　１ｐｏ３４　ＧＧＴＧＡＴＣＴＧ ＣＴＣＡＣＴＧＧ卯。３５　ＧＣＣＧＣＡＧＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡ従来の技法を 用いて、３１０ｂｐおよび７１０ｂｐを含む増幅産物を、図１０に示すようにそ れぞれ得た。表に用いた異なるプライマーの配列の局在も、図１０に示す。

得られたＤＮＡを、リファンピシンに対して感受性の単離株の二！立上配列に基 づいてシーフェンシングした。その遺伝子の配列を含むプラスミドは、番号ｌ− １２６６として１９９２年９月１５日にＣＮＣＭに寄託されている。ビオチニル 化したＰＣＲ産物を、攪拌しながらストレプトアビジンでコーティングしたビー ズに接触させることにより、ＰＣＲ反応混合物から濃縮した。ビーズに付着した ビオグーニル化されたストランドを、次いで回収し、シーフェンシングした。得 られた配列を、野生型株の二立上旦遺伝子の配列と比較した。野生型遺伝子（リ ファンピシンに対して感受性のマイコバクテリウムの）、およびリファンピシン に対して耐性の４つの突然変異体のβサブユニットの対応する配列のシーフェン シングの結果として、有為な結果が得られた（図１１）。

Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染した患者から得た１０２ストランドから 始めて、結果が得られた。この１０２ストランドのうち、５３はリファンピシン に対して感受性であり、４９はリファンピシンに対して耐性であった。後者のう ちでは、突然変異は、突然変異体のうち４３において４００〜４５０の領域中に 位置決定され、突然変異は４２！　Ｓｅｒの領域でＬｅｕへ起こっていた。

ストレプトマイシン（こ・するマイコバクテリウムの而・　の　の例 Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株の培養およびストレプトマイシンに対するそ の感受性の試験は、Ｌ６ｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｉｅｒｖａ培地上での比例法により 実施した〔「臨床マイコバクテリウム学の実験室方法（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ ｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ） 　Ｊ−Ｈｕｇｏ　Ｄａｖｉｄ−ＶｅｒｏｎｉｑｕｅＬｅｖｙ　Ｆｒｅｂａｕｌｔ 、　Ｍ、Ｆ、　Ｔｈｏｒｅｌ、　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ刊】。

Ｌ」」ｍ凹のユニ皿上遺伝子のヌクレオチド配列は、配列類似性により、ストレ プトマイシン耐性に関連のあることに責任がある、推定突然変異部位を含む領域 を取り囲む、ＰＣＲ反応に好適なＭ　Ｌ　５１　（ＣＣＣＡＣＣＡＴＴＣＡＧＣ ＡＧＣＴＧＧＴ）およびＭ　Ｌ　５２　（ＧＴＣＧＡＧＣＧＡＡＣＣＧ（：ＧＡ ＡＴＧＡ）の２つのプライマーの構築に導いた。マトリックスとして使用した、 用いたし」重囲１」匹ｎのＤＮＡは、３０６ｂｐの一！旦玉フラグメントを得る ことを可能にした。配列決定したフラグメントのヌクレオチド配列は、Ｌ」」ｍ 凹のそれと２８か所の差異を呈していた。

二ｍ遺伝子またはＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの４３ストランド（そのうち ２８は耐性であった）を、ＰＣＲおよび５ｓｃｐ技法の両方で増幅した。

凍結−解凍（ｃｏｎｇｅｌａｔｉｏｎ−ｄｅｃｏｎｇｅｌａｔｉｏｎ）技法によ り、１００μｌの鉱物油でカバーされたＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ試料の ２００μｍアリコートからＤＮＡを抽出した（Ｗｏｏｄｓ　ａｎｄ　Ｃａｆｅ、 　１９８９．　ＦＥＢＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、、　６５：３０５− ３０８）。

試験したＤＮＡストランドの電気泳動後、突然変異体のうち１６に突然変異が示 された。考慮中の１６ストランドにおける突然変異の性質を確立するために、Ｍ Ｌ５１およびＭＬ５２プライマーを用いてＰＣＨにより相当するＬｌｉｌ運上子 フラグメントを増幅し、それらの各々のヌクレオチド配列を決定した。

得られた配列を野生型ｄ遺伝子の配列と比較した。野生型に関して単一の差異が 見出された。コドン４３のＡＡＧが突然変異によりＡＧＧとなり、結果として、 Ｌｙｓ−４２アミノ酸がＡｒｇに置き換わっていた。

本発明は、「突然変異を起こした」ＤＮＡフラグメントにも関する。それらは、 次に、好適なハイブリダイゼーション手順における検出のための、および上記で 説明したいずれがの抗生物質に対して耐性を有する疑いのあるＭ、　ｔｕｂｅｒ ｃｕｌｏｓｉｓ株から抽出したＤＮＡにおける同様の突然変異の検出のための、 ハイブリダイゼーションブローブとして使用することができる。

本発明は、さらに、インニアシト、リファンピシンまたはその類似体、およびス トレプトマイシンに対するマイコバクテリウム科の耐性についてのキットにも関 する。

本発明は、さらに、イソニアシトに対するマイコバクテリウム属細菌の耐性のイ ンビトロ診断のためのキットであって、−ｋａｔＧ遺伝子またはそのフラグメン トのＤＮ’Ａの遺伝子を増幅する手段、 −そのようにして得られた増幅産物の１つまたはいくっがの突然変異を証明する 手段、 一イソニアシトに対して感受性の上記細菌の株のｋａｔＧ遺伝子またはそのフラ グメントの対照ＤＮＡの調製物、−場合によっては、イソニアシト耐性マイコバ クテリウム株のｋａｔＧ遺伝子のＤＮＡの対照調製物 を含むことを特徴とするキットにも関する。

本発明は、さらに、リファンピシンまたはその類似体に対するマイコバクテリウ ム属細菌の耐性のインビトロ診断のためのキットであって、 一上記マイコバクテリウムのＬ２立旦遺伝子もしくはＲＮＡポリメラーゼのβサ ブユニットのＤＮＡまたはそのフラグメントの遺伝子を増幅する手段、 −そのようにして得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する 手段、 一リファンピシンに対して感受性の上記細菌の株のＲＮＡポリメラーゼのβサブ ユニットをコードする二２旦旦遺伝子またはそのフラグメントの対照ＤＮＡの調 製物、 −場合によっては、イソニアシト耐性マイコバクテリウム株の二り旦１遺伝子の ＤＮＡの対照調製物 を含むことを特徴とするキットにも関する。

同様に、本発明はストレプトマイシンに対するＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ の耐性のインビトロ診断のためのキットであって、−小リポソームサブユニット のＳＬ２タンパク質をコードする一ＬＪ」Ｌ１遺伝子またはそのフラグメントの 遺伝子を増幅する手段、 −得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する手段、 一ストレプトマイシンに対して感受性のＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株のリ ポソームの小サブユニットのＳＬ２タンパク質をコードする一２旦上遺伝子のＤ ＮＡ配列の対照調製物、および−場合によっては、ストレプトマイシンに対して 耐性のＬｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株のリポソームの小サブユニットの３１２タ ンパク質をコードするＵ山上遺伝子のＤＮＡ配列の対照調製物を含むことを特徴 とするキットにも関する。

日　に　されてし）る参 Ａｌｔｓｃｈｕｌ、　Ｓ、、　Ｇ１５ｈ、　Ｗ、、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｗ、、　 Ｍｙｅｒｓ、　Ｅ、、　ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ。

Ｄ、　（１９９０１，ｒ基本的な局所的整列検索（アラインメントサーチ）の道 具Ｊ　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　２１５：４ ０３−４１０゜Ｂｅｋｉｅｒｋｕｎｓｔ、　Ａ、　＆　Ｂｒ１ｃｋｅｒ、　Ａ、 　（１９６７）、ｒマイコバクテリウムに対するイソニアシトの作用モードの研 究Ｊ　、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ。

Ｕシ１２２：３８５−３９２゜ Ｂｉｇｇｉｎ、　Ｍ、　Ｄ、、　Ｇｉｂｓｏｎ　Ｔ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｈｏｎ ｇ　Ｇ、　Ｆ、　（１９８３）、ｒ迅速なりＮＡ配列決定の補佐としての緩衝グ ラジェントゲルおよび１Ｓ−標識Ｊ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：３９６３−３９６５゜Ｂａ１ｒｏｃｈ、　Ａ、、　 （１９９２）、ｒプロサイト（Ｐｒｏｓｉｔｅ）　：タンパク質におけるパター ンおよび部位の辞典Ｊ　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　２０：２０ １３−２０１８゜ Ｃ，Ｄ、　Ｃ，ｒ多剤耐性結核の突発−テキサス、カリフォルニア、およびペン シルバニアＪ　、　ＭＭＷＲ１９９０，３９：３６９−３７２゜Ｃ，Ｄ、Ｃ，ｒ ＨＩＶ感染者間での多剤耐性結核の院内伝播−フロリダおよびニューヨーク　１ ９８８−１９９１Ｊ、ＭＭＷＲ１９９１（ａ）　４０：５８５−５９１゜ Ｃ，Ｄ、　Ｃ，ｒ宿泊設備付き薬物乱用治療施設におけるＨＩＶ陽性顧客からの 多剤耐性結核の伝播：ミシガンＪ　、　ＭＭＷＲ１９９１（ｂ）、　４０：１２ ９−１３１゜ Ｃｈａｉｓｓｏｎ、　Ｒ，Ｅ、、　５ｃｈｅｃｔｅｒ、　Ｇ、　Ｆ、、　Ｔｈｅ ｕｅｒ、　Ｃ，Ｐ、、　Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、　Ｇ、　Ｗ、、　Ｅｃｈｅｎｂ ｅｒｇ、　Ｄ、　Ｆ、、　）ｌｏｐｅｗｅＬｌ、　Ｐ、　Ｃ，（１９ｇ？）、ｒ 後天性免疫不全症候群患者における結核Ｊ　、Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅｓ　ｉｒ 、　Ｄｉｓ、、　２３：５Ｂ−７４゜ Ｃｏ１１ｉｎｓ、　Ｄ、　Ｍ、、　ａｎｄ　５ｔｅｐｈｅｎｓ、　Ｄ、　Ｍ、　 （１９９１）、　ｒＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓにおける挿入配列ｌ ５１０８１の同定Ｊ　、　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

堕旦ｔ、８３：１１−１６゜ Ｄａｌｅｙ、Ｃ，Ｌ、、Ｓｍａｌｌ、Ｐ、Ｍ、、５ｃｈｅｃｔｅｒ、Ｇ、Ｆ、、 ５ｃｈｏｏｌｎｉｋ。

Ｇ、に、、ＭｃＡｄａｍ、Ｒ，Ａ、、Ｊａｃｏｂｓ、Ｗ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｈｏｐ ｅｗｅｌｌ、Ｐ、Ｃ。

（１９９２）、　「ヒト免疫不全症ウィルス感染者間での進行が加速された結核 の突発：制限酵素断片長子型を用いる解析Ｊ、Ｌｊ」山−ム畦、　３２６：２３ １−２３５゜ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、　Ｊ、、　Ｈａｅｂｅｒｌｉ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ ｉｅｓ、　０．　（１９８４）。

ｒＶＡＸのための配列解析プログラムの包括的セットＪ　、Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２：３８７−３９５゜Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ、　Ｋ、、　 Ｈｏｎｏｒｅ、　Ｎ、、　ａｎｄ　（：ｏｌｅ、　Ｓ、　Ｔ、（１９９１）。

ｒＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅ　ｒａｅの染色体中への外来性ＤＮＡのイ ンテグレーションに向かってＪ　、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏ　、　１４２：６１７−６２２゜ Ｆｉｎｚｅｌ、　Ｂ、　Ｃ，、Ｐｏｕｌｏｓ、　Ｔ、　Ｌ、　ａｎｄ　Ｋｒａｕ ｔ、　Ｊ、（１９８４）。

「１．７人解像度での酵母シトクロムＣペルオキシダーゼの結晶構造Ｊ　、　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５９：１３０２７−１３０３６゜Ｇａｒｎｉｅ ｒ、　Ｔ、、　ａｎｄ　Ｃｏ１ｅ、　Ｓ、　Ｔ、、（１９８６）、ｒｃ１ｏｓｔ ｒｉｄｉｕｍ６からのバクテリオシン生成性プラスミドの特徴付けおよびそのバ クテリオシンをコードする遺伝子の分子遺伝学的解析Ｊ　、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ、、　１６８：１１８９−１１９６゜Ｇａｙａｔｈｒｉ　Ｄｅｖｉ、　 Ｂ、、　５ｈａｉｌａ、　Ｍ、　Ｓ、、　Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ、　Ｔ、、 　ａｎｄＧｏｐｉｎａｔｈａｎ、に、　Ｐ、（１９７５）、ｒＭ　ｃｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒｖにおけるペルオキシダーゼの 精製および特性、ならびにイソニコチン酸ヒドラジドの作用機序におけるその可 能な役割」、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、１４９：１８７−１９７゜Ｈｅｌ＋ａｎｓ 、　Ｐ、　Ｗ、　Ｍ、、　ｖａｎ　Ｓｏｏｌｉｎｇｅｎ、　Ｄ、　ａｎｄ　ｖａ ｎ　Ｅｍｂｄｅｎ、　Ｊ。

Ｄ、　Ａ、　（１９９２）、ｒＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌ ｏｓｉｓにおける主要冬型タシデムリビートの特徴付けおよびＭ　ｃｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｋａｎｓａｓｉｉとＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａ　ｏｒｄｏｎ ａｅの疫病学におけるその可能な用途」、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７４ ：４１５７−４１６５゜Ｈｅｙｍ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｃｏ１ｅ、　Ｓ、　Ｔ、　 （１９９２）、　ｒＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅ　ｍａｔｉｓおよびＭ 、　ａｕｒｕｏ＋のイソニアシト耐性突然変異体の単離および特徴付けＪ　、Ｒ ｅｓ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、提出済（ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）　＊Ｊａｃｋｅ ｔｔ、　Ｐ、　Ｓ、、＾ｂｅｒ、　Ｖ、　ａｎｄ　Ｌｏｗｒｉｅ、　Ｄ、（１９ ７８）、　Ｊ、　ＧｅｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１０４：３７−４５゜Ｋｕｂ ｉｃａ、　Ｇ、　Ｐ、、　Ｊｏｎｅｓ　Ｊｒ、、　Ｗ、　Ｄ、、　Ａｂｂｏｔｔ 、　Ｖ、　Ｄ、、　Ｂｅａｍ。

Ｒ，Ｅ、、　Ｋ１１ｂｕｒｎ、　Ｊ、　Ｏ，、ａｎｄ　Ｃａｔｅｒ　Ｊｒ、、　 Ｊ、　Ｃｒ、　（１９６６）、ｒマイコバクテリウムの差次的同定　■、カラタ ーゼ活性の試験」、劾よＲｅｖ、Ｒｅｓ　、Ｄｉｓ、、９４：４ＱＱ−４０５゜ Ｋｗｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｓ、、　Ｊ、　Ｖｔｒｏｌ、　６１：１６９０−１ ６９４　（１９８７）、ｒ多剤耐性は異なる薬剤ターゲットに関する遺伝子中の 突然変異の蓄積により生じる」。

Ｌａｅｍｏ＋ｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、、　（１９７０）、ｒバクテリオファージＴ４ の頭部のアセンブリー中の構造タンパク質の切断Ｊ　、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎ ｄｏｎ）　２２７：６８０−６８５゜ Ｌｏｅｗｅｎ、Ｐ、Ｃ，、ａｎｄ　５ｔａｕｆｆｅｒ、Ｇ、Ｖ、（１９９０）、 　ｒｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ堕助江凹１凹Ｌ　Ｔ　２のｋａｔＧのヌクレオチド配 列およびその産物、ヒドロベルオキシダーゼエの特徴付けＪ　、　Ｍｏ１．　Ｇ ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

２２４：１４７−１５１゜ Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ、　Ｓ、、　Ｎｅｇｏｒｏ、　Ｓ、　ａｎｄ　０ｋａｄａ、 　Ｈ，（１９８８１，ｒＢａｃｉｌｌｕｓ匹胆些止肛匹肋旦凹からの熱安定性ペ ルオキシダーゼＪ　、　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１３４：１９７１−１９７６゜Ｌｏｐｒａｓｅｒｔ、　 Ｓ、、　Ｎｅｇｏｒｏ、　Ｓ、、　ａｎｄ　０ｋａｄａ、　Ｈ，（１９８９）、 　ｒＢａｃｉｌｌｕｓ扛ヨユ旦ユコ□吐旦ヨペルオキシダーゼ遺伝子（且旦工五 ）のクローニング、ヌクレオチド配列、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ ｔにおける発現Ｊ　、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１７１：４８７１−４ ８７５゜Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　ａｎｄ　 Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、（１９８９）。

「分子クローニング：実験室マニュアル（第２版）」、１９８９゜Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｍａｔｓｕｏ、に、、　Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、　Ｒ，、Ｙａｍａｚａｋｉ、　Ｒ ，Ａ、、　Ｔａ５ａｋａ、　Ｈ。

ａｎｄ　Ｙａｍａｄａ、　Ｔ、　（１９８８）、　ｒ細胞外の抗原のためのＭ　 ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ　Ｂ　ＣＧ遺伝子のクローニングおよび発現 」、ムＢａｃｔｅｒｉｏ１．，１７０：３８４７−３８５４゜Ｍｉｄｄｌｅｂｒ ｏｏｋ、　Ｇ、　（１９５４）、ｒイソニアシト耐性と結節桿菌（ｔｕｂｅｒｃ ｌｅ　ｂａｃｉｌｌｉ）のカラターゼ活性Ｊ　、Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｔｕｂｅｒ ｃ、。

６９：４７１−４７２゜ Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ、　Ｇ、、　Ｃｏｈｎ、　Ｍ、　Ｌ、、　ａｎｄ　５ｃ ｈａｅｆｅｒ、　Ｗ、　Ｂ、　（１９５４）。

「結節桿菌とイソニアシトの研究　■、イソニアシト治療患者からＲｅｖ、Ｔｕ ｂｅｒｃ、、７０：８５２−８７２゜Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ、Ｄ、　Ａ、、５ｅｌ ｋｏｎ、　Ｊ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｌｌｏｙｄ、Ｓ、（１９６３）。

Ｊ、Ｐａｔｈ、Ｂａｃｔ、８６：３７７−３８６゜Ｍｕｌｖｅｙ、　Ｍ、Ｒ，、 ５ｏｒｂｙ　ＰＡ、　Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ　ＢＬ　ａｎｄ　Ｌｏｅｗｅｎ 　ＰＣ。

Ｇｅｎｅ　７３：３３７−３４５　（１９８ｇ）。

０ｒｉｔａ、　Ｍ、、ｆｗａｈａｎａ、１．、　Ｋａｎａｚａｗａ、　Ｈ，、Ｉ ｔａｙａｓｈｉ、　Ｋ、、　ａｎｄＳｅｋｉｙａ、　Ｊ、（１９８９）、　ＰＮ ＡＳ　８６：２７６６−２７７０゜Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｗ、、　ａｎｄ　Ｌｉｐ ｍａｎ、　Ｄ、　（１９８８）、ｒ生物学的配列比較のための改良された道具Ｊ 　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５：２４ ４４−２４４８゜ Ｑｕｅｍａｒｄ、Ａ、、Ｌａｃａｖｅ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｌａｎｅｅｌｌｅ、Ｇ、 （１９９１）。

「Ｌ並動」μｍｉｕｍユｕｒｕｍの感受性株および耐性株の細胞抽出物によるミ コール酸合成のインジアジド阻害Ｊ　、Ａｎｔｉａ＋１ｃｒｏｂ、　Ａ　。

山＝ｍ、、　３５：１０３５−１０３９゜５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｒ，Ｋ 、、　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　３：１００８−１０１２　（１９８５）。

５ｈｏｅｂ、　Ｈ，Ａ、、　Ｂｏｗｏ＋ａｎ　Ｂ、　Ｕ、　Ｊ、、　Ｏｔｔｏｌ ｅｎｇｈｉ、　Ａ、　Ｃ，、ａｎｄＭｅｒｏｌａ、　Ａ、　Ｊ、　（１９８５） 、ｒイソニアシトのペルオキシダーゼ媒介酸化Ｊ　、　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉ ａｌ　Ａ　ｅｎｔｓ　ａｎｄ旦旦立上ユｕ、　２７：３９９−４０３゜５ｈｏｅ ｂ、　Ｈ，Ａ、、　Ｂｏｗｍａｎ、　Ｂ、　Ｕ、　Ｊ、、　Ｏｔｔｏｌｅｎｇｈ ｉ、　Ａ、　Ｃ，、ａｎｄＭｅｒｏｌａ、　Ａ、　Ｓ、　（１９８５）、ｒＭ　 ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａの抽出物のイソ ニアシト処理による活性酸素の生成の証拠」、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａ 　ｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ　、　２７：４０４−４０７゜５Ｌ ｖａｒａｊａ、　Ｍ、、　ＧｏｏｄＬｎ、　Ｄ、　Ｂ、、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍ、 、　ａｎｄ　Ｈｏｆｆ＋ｎａｎ、　Ｂ。

Ｍ、、　（１９８９）、ｒシトクロムＣペルオキシダーゼ複合体Ｅｓにおける遊 離ラジカル部位としてのＥＮＤＯＲによるＴ　ｒ　ｐ　”’の同定Ｊ　、　５ｃ ｉｅｎｃｅ、　２４５＋７３８−７４０゜５ｎａｐｐｅｒ、　Ｓ、　Ｂ、、　Ｌ ｕｇｏｓｉ、　Ｌ、、　Ｊｅｋｋｅｌ、　Ａ、、　Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｒ，Ｅ、。

Ｋｉｅｓｅｒ、　Ｔ、、　Ｂｌｏｏ＋＊、　Ｂ、　Ｒ，、ａｎｄ　Ｊａｃｏｂｓ 、　Ｗ、　Ｒ，（１９８８）、ｒｖイコバクテリウムにおける溶原性および形質 転換：外来性遺伝子の安定な発現Ｊ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５：６９８７−６９９１゜５ｎａｐｐｅｒ、　Ｓ、　 Ｂ、、　Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｒ，Ｅ、、　Ｍｕｓｔａｆａ、　Ｓ、、　Ｋｉｅｓｅ ｒ、　Ｔ、。

ａｎｄ　Ｊａｃｏｂｓ、　Ｗ、　Ｒ，（１９９０）、ｒＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｓｍｅ　ｍａｔｉｓの効率的なプラスミド形質転換突然変異体の単離およ び特徴付け」。

Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　４：１９１１−１９１９゜５ｎｉｄｅｒ、 　Ｄ、　（１９８９）、　Ｒｅｖ、　Ｉｎｆ、　Ｄｉｓ、、　５３３５゜５ｎｉ ｄｅｒ　Ｊｒ、、　Ｄ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｒｏｐｅｒ、　Ｗ、　Ｌ、　（１９９ ２）、　ｒ新しい結核」、Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎ　１ａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３２６：７０３−７０５゜５ｒｉｐｒａｋａｓｈ、　 Ｋ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ、　Ｔ、（１９７０）。

ｒＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒｖのインニ アシト耐性突然変異体；イソニアシトの取込みとＮＡＤａｓｅ阻害剤の特性」、 Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　６０：１２５−１３２゜５ｔａｄｅ ｎ、　Ｒ，（１９８７）、　ｒ配列プロジェクトのコンピューターハンドリング Ｊ　、　Ｂ１５ｈｏｐ、　Ｍ、　Ｊ、およびＲａｗｌｉｎｇｓ、　Ｃ，Ｊ、編「 核酸およびタンパク質配列解析：実際的アプローチＪ　、　０ｘｆｏｒｄ：　Ｉ ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ中、ｐｐ、　１７３−２１７゜ Ｔｈ１ｅｒｒｙ、　Ｄ、、　Ｂｒ１ｓｓｏｎ−Ｎｏｅｌ、　Ａ、、　Ｖｉｎｃｅ ｎｔ−Ｌｅｖｙ−Ｆｒｅｂａｕｌｔ。

Ｖ、、　Ｎｇｕｙｅｎ、　Ｓ、、　Ｇｕｅｓｄｏｎ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｇｉｃ ｑｕｅｌ、　Ｂ、（１９９０）。

ｒＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ挿入配列　ｌ５６１ １０の特徴付けおよび診断におけるその応用Ｊ　、　Ｓ、　ＣＨｎ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、、　２８：２６６ｇ−２６７３゜ Ｔｈ１ｅｒｒｙ、Ｄ、、Ｃａｖｅ、Ｍ、Ｄ、、Ｅｉｓｅｎａｃｈ、Ｋ、Ｄ、、Ｃ ｒａｗｆｏｒｄ、Ｓ。

Ｔ、、Ｂａｔｅｓ、Ｓ、　Ｈ，、Ｇｉｃｑｕｅｌ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｇｕｅｓｄｏ ｎ、　Ｊ、Ｌ、（１９９０）。

ｒＩｓ６１１０：ＩＱ匹あ巨１吐凹」型開１ル凹江コンプレックスのＩＳ様要素 Ｊ　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１８：１８８゜Ｔｒｉｇｇ ｓ−Ｒａｉｎｓ、　Ｂ、　Ｌ、、　Ｄｏｂｌｅ、　Ｂ、　’Ｉ１．．　Ｍｕｌｖ ｅｙ、　Ｍ、　Ｒ，、５ｏｒｂｙ。

Ｐ、　Ａ、、　ａｎｄ　Ｌｏｅｗｅｎ、　Ｐ、　Ｃ，（１９８８）、　ｒＥｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔのカタラーゼＨＰＩをコードするｋａ工玉のヌクレ オチド配列」、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１７０：４４１５−４４１９゜ Ｗａｙｎｅ、　Ｌ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｄｉａｚ、　Ｇ、　Ａ、　（１９８６）、 ＾ｎａｌ　ｔ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　１５７：８９−９２゜ Ｗｅｌｉｎｄｅｒ、　Ｋ、　Ｇ、　（１９９１）、ｒ細菌のカタラーゼ−ペルオ キシダーゼは植物ペルオキシダーゼスーパーファミリーの重複された遺伝子のメ ンバーであるＪ　、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｃｔａ　１０８ ０：２１５−２２０゜ＷＬｎｄｅｒ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｃｏｆｆ１ｎｓ、　Ｐ、 （１９６８）、　ｒＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓＢＣＧ株における ニコチンアミドヌクレオチドレベルに対するインニアシトの効果Ｊ　、　Ａｍｅ ｒ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅｓ　ｉｒ、　Ｄｉｓ、、　９７：７１９−７２０゜Ｗｉｎ ｄｅｒ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｃｏｆｆ１ｎｓ、　Ｐ、　（１９６９）、　ｒ結節桿 菌におけるニコチンアミドヌクレオチド濃度に対するイソニアシトの効果」、醜 肛工Ｒｅｖ、　Ｒｅｓ　ｉｒ、　Ｄｉｓ、、　１００：１０１−１０３゜Ｗｉｎ ｄｅｒ、Ｆ、ａｎｄ　Ｃｏ１１ｉｎｓ、Ｐ、（１９６８）、　ｒＭ　ｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおけるミコール酸の合成のイソニアシ トによる阻害Ｊ　、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　６３：４１− ４８゜Ｙｏｕａｔｔ、　Ｊ、　（１９６９）、　ｒイソニアシトの作用の総説Ｊ 　、Ａｍ、　Ｒｅｖ。

む互已二工旦堕工、　９９ニア２９−７４９゜Ｚｈａｎｇ、　Ｙ、、　Ｇａｒｂ ｅ、　Ｔ、、　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　Ｄ、（１９９３）、ｒ　ｋ　ａ　ｔ　Ｇ による形質転換はある範囲の薬剤濃度に耐性のＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＺｈ ａｎｇ、　Ｙ、、　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　Ｄ、　Ｂ、（１９９３）、ｒＭ　ｃ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｋａｔＧ領域からの可変的遺 伝要素の特徴付け」（準備中）。

Ｚｈａｎｇ、　Ｙ、、　Ｌａｔｈｉｇｒａ、　Ｒ，、Ｇａｒｂｓ、　Ｔ、、　Ｃ ａｔｔｙ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ。

Ｄ、　（１９９１）、　ｒスーパーオキシドジスムターゼ、Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの２３キロダルトン抗原の遺伝的解析」、町 すエＭｉｃｒｏｂｉｏ１．．５：３８１−３９１゜Ｚｈａｎｇ、　Ｙ、、　Ｈｅ ｙｍ、　Ｂ、、　Ａ１１ｅｎ、　Ｂ、、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ｃｏ １ｅ、　Ｓ、　Ｔ。

（１９９２）、　ｒ敗匹匝匹肛江り剋雇匹虱郊立のイソニアシト耐性およびカタ ラーゼ−ペルオキシダーゼ遺伝子」、匣辿匹３５８：５９１−５９３゜Ｚｈａｎ ｇ、　Ｙ、、　Ｇａｒｃｉａ、　Ｍ、　Ｊ、、　Ｌａｔｈｉｇｒａ、　Ｒ，、Ａ １１ｅｎ、　Ｂ、、　Ｍｏｒｅｎｏ。

Ｃ，、ｖａｎ　Ｅｍｂｄｅｎ、　Ｄ、　Ａ、、　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　Ｄ、　 （１９９２）、　ｒ敗四厘匹ｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのイソニアシ ト耐性株のスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子における変化Ｊ　、　Ｉｎｆｅ ｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、　６０：２１６０−２１６５゜ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　２Ａ ＦＩＧ、２Ｂ ＦＩＧ、　２Ｃ（１） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４Ａ ＦＩＧ、４８ ＦＩＧＵＲＥ　６Ａ（１） ＦＩＧＵＲＥ　６Ａ（２） ＦＩＧＵＲＥ　６Ａ（３） ＦＩＧＵＲε６Ａ（４） ＦＩＧＵＲＥ　６Ｂ（１） ＦＩＧＵＲＥ　６Ｂ（２） ＦＩＧ、７ ＦＩＧＵＲＥ　８（２） ＦＩＧ、９ ｕ）　ｖ ＦＩＧｔｌＲＥ　１２（１） ＦＩＧＵＲＥ　１２（５） ＦＩＧＵＲＥ　１４（１） ＲＫＧ　ＲＲＤＫ　ＸＧＫ　ＶＫＴ　ＡＡＬＫＣＧＣＭＧＧＧＴＣＧＴＣＧＡＧ ＡＣＭ　ＧＡＴＴＧＧＣＭＧ　ＧＴＣＡＡＧＡＣＣＧ　ＣＧＧＣＴＣＴＧ入Ａ１ ０　１５　２０　δ Ｇ　ＮＰ　ＱＲＲＧ　ＶＣＴＲＶＹ　ＴＳＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧ　ＣＡＧＣＧ ＴＣＧＴＧ　ＧＴＧＴＡＴＧＣＡＣＣＣＧＣＧＴＧＴＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＣ 艙 ＰＫＫＰ　Ｎ　ＳＡ　ＬＲＫ　ＶＡＲＶＫＬＴＣＧＭＧＡＡＧＣＣＧＡＡＣＴＣ ＧＧＣＧ　ＣＴＴＣＧＧＭＧＧ　ＴＴＧＣＣＣＧＣＧ’ｌ’　ＧＡＡＧＴＴＧＡ ＣＧＳ　Ｑ　Ｖ　Ｅ　Ｖ　Ｔ　Ａ　Ｙ　工　ＰＧＥＧＨＮＬＱＡＧＴＣＡＧＧＴ ＣＧ　ＡＧＧＴＣＡＣＧＧＣＧＴＡＣＡＴＴＣＣＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＣＡＣＡ ＡＣＣＴＧＣＡＥＨ５ＭＶＬ　ＶＲＧ　ＧＲＶＫＤＬＰＧＧＡＧＣＡＣＴＣＧ　 ＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧ　ＴＧＣＧＣＧＧＣＧＧ　ＣＣＧＧＧＴＧＡＡＧ　ＧＡＣ ＣＴＧＣＣＴＧａ）　８５　９Ｑ ＧＶＲＹ　Ｋ ＦＩＧ、１５ 国際調査報告 、−□５．　−　ＰＣＴ／ＥＰ　９３１０１０６３フロントページの続き （３１）優先権主張番号　９２／１１０９８（３２）優先臼　１９９２年９月１ ７日（３３）優先権主張国　フランス（ＦＲ）（３１）優先権主張番号　９３１ ０４５４５（３２）優先臼　１９９３年４月１６日（３３）優先権主張国　フラ ンス（ＰＲ）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、　ＣＡ、ＪＰ、　ＵＳ（７１）出願人　ユニベルシテ・ビニール・工・マ リ・キュリー（パリザシックスス） フランス国、７５２５２　パリ・セデュ・０５、プラス・ジュラシュ−４ （７１）出願人　ユニベルシテ・ドウ・ベルンスイス国、３０１０　ベルン、フ リートビュールシュトラーセ　５１ （７２）発明者　ヘイム、ベアーテ フランス国、７５０１０　パ唄すュ・ドウ・う・フィデリテ　１６ （７２）発明者　コール、スチュワードフランス国、９２１４０　クラマール、 リス・セシル・ディナン、２３　ビス （７２）発明者　ヤング、ダグラス イギリス国、ミドルセックス　エイチ・ニー・４６・イー・ディー、ルイスリッ プ、ローン・クロース　躬 （７２）発明者　ツァン、イン イギリス国、ロンドン　ダブリス・１２０・ニー・イー、デュケイン・ロード、 オドリスコール・ハウス、１３７エー （７２）発明者　オノール、ナディン フランス国、９２７００　コロンブ、リス・デ・グリシン　１１ （７２）発明者　テレンティ、アマリオスイス国、３０１６−ベルン、ゼンヴエ ーク（７２）発明者　ボードマー、トーマススイス国、３４２３　エアズイゲン 、ザントルーテヴエーク　９

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．マイコバクテリウムにおける抗生物質に対する耐性の検出方法であって、ｋ ａｔＧ遺伝子またはそのフラグメント、ｒｐｏＢ遺伝子またはそのフラグメント 、およびｒｐｓＬ遺伝子またはそのフラグメントよりなる群から選択される遺伝 子中の突然変異を検出することを特徴とする方法。
2. ２．イソニアジドに対して耐性のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓの核酸の存在をインビトロで検出するための請求項１記載の方法にお いて、以下の工程； −必要であれば予めプローブに接触可能にした上記核酸を、ハイブリダイゼーシ ョンを可能にする条件下でプローブに接触させる工程、 −上記核酸にハイブリダイズしたプローブを検出する工程を含み、 上記プローブが、プラスミドＰＹＺ５６の２．５ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフ ラグメントまたはその一部分である核酸配列を含み、上記フラグメントはＢａｍ ＨＩ切断部位を含み、上記一部分はイソニアジドに対して耐性のＭｙｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのインビトロでの検出の選択性を提供 するのに充分に長いものである、方法。
3. ３．請求項２記載の方法において、以下の工程；（Ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの核酸を、プローブに接触可能になるように、 固体支持体上におき、固定する工程；（Ｂ）工程（Ａ）からの固定化された核酸 を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブと接触させる工程； （Ｃ）工程（Ｂ）から得られるフィルターを、ハイブリダイズしていないプロー ブを除去するように洗浄する工程；および次に、 （Ｄ）工程（Ｃ）から得られた洗浄したフィルター上のハイブリダイズしたプロ ーブを検出する工程 を含むことを特徴とする方法。
4. ４．上記プローブが、式： ＡＰＬＮＳＷＰＤＮＡＳＬＤＫＡＲ−ＲＬＬＷＰＳＫＫＫＹＧＫＫＬＳＷＡＤＬ ＩＶ で示されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項２または３記載の 方法。
5. ５．プローブが、放射活性標識、酵素標識、蛍光標識および発光標識よりなる群 から選択される標識を有する、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
6. ６．イソニアジドに対して耐性のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓを含有する疑いのある細菌含有試料中の、イソニアジドに対して耐性 のＭｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの存在を検出するため の、請求項２〜５のいずれか１項記載の方法において、特に上記試料中に初めに 存在していたＤＮＡと形成されるまたは形成されたハイブリッドＤＮＡ複合体の 形態の、ハイブリダイズしたプローブの検出を、イソニアジドに対して耐性のＭ ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの上記試料中の存在の指 標として用いる方法。
7. ７．上記プローブとの上記ＤＮＡの接触に先立って、上記細菌を、上記試料から 分離して、ニトロセルロースメンブレンのようなＤＮＡ結合性支持体上に固定化 しておく、請求項６記載の方法。
8. ８．イソニアジドに対して耐性のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕ １ｏｓｉｓの検出のためのキットであって、 （Ａ）プローブは、好ましくは放射活性標識、酵素標識、蛍光標識および発光標 識よりなる群から選択される標識により標識した、プラスミドＰＹＺ５６の２． ５ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントまたはその一部分である核酸配列を 含み、上記フラグメントはＢａｍＨＩ切断部位を含み、イソニアヅドに対して耐 性のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのインビトロでの 検出の選択性を提供するのに充分に長いものである、プローブを含んでいる容器 ； （Ｂ）核酸の対照調製物を含んでし、る容器を含むことを特徴とするキット。
9. ９．イソニアジドに対して耐性のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓを検出するための核酸プローブであって、上記プローブが、プラスミ ドＰＹＺ５６の２．５ｋｂのＢａｍＨＩ切断部位を含むＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフ ラグメント、またはイソニアジドに対して耐性のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　 ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのインビトロでの検出の選択性を提供するのに充分に 長いものである上記フラグメントの一部分よりなる、プローブ。
10. １０．ヒト血清タンパク質もしくはヒト組織またはその両方、ウイルスタンパク 質、細菌タンパク質、および上記タンパク質をコードする核酸配列を含まないＤ ＮＡである、請求項９記載のプローブ。
11. １１．相補的な塩基配列のヌクレオチド配列に水素結合した、実質的に請求項９ 記載のプローブからなるハイブリッド二本鎖分子。
12. １２．どのヌクレオチド配列が、請求項９または１０に記載されたプローブにハ イブリダイズするかを決定する工程を含むことを特徴とする、ヌクレオチド配列 の群からイソニアジドに対して耐性のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒ ｃｕｌｏｓｉｓのヌクレオチド配列を選択するための方法。
13. １３．ＩＮＨ耐性マイコバクテリウム株に対する化合物の反応性を決定する工程 を含むことを特徴とする、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓに対して活性がある化合物を選択するための方法。
14. １４．図２に記載された３５０塩基配列またはその一部分を含むヌクレオチド配 列。
15. １５．ＫａｔＧ遺伝子の点突然変異または部分的欠失を検出するための方法であ って、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの試料を請求項 ９または１０記載のプローブと接触させることを特徴とする方法。
16. １６．選択した抗生物質に対する耐性を検出するための請求項１記載の方法であ って、 −突然変異を有する可能性が高い適切な遺伝子またはその一部分を、選択した制 限酵素により上記適切な遺伝子を消化することなどによって、複数のフラグメン トにフラグメント化し、−これらのフラグメントを、相補的なオリゴヌクレオチ ドプローブ、好ましくは、ストリンジェンシーの高い条件下で、対応する抗生物 質に対して非耐性の株の対応する対照ＤＮＡの上記適切な遺伝子の全ての部分を 認識する、標識したプローブのシリーズにハイブリダイズさせ、 −調べているマイコバクテリウムの上記適切な遺伝子のＤＮＡフラグメントのい ずれかに対する上記オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つのハイブリダ イゼーションの欠如を、特に、上記抗生物質に対して耐性ではない株から得られ た上記適切な遺伝子について同じオリゴヌクレオチドを用いて同じ条件下で試験 を実施して得られた結果と比較して、突然変異の存在、およびおそらくは相当す る抗生物質に対する耐性の存在の証拠として関連させること、 を含み、 上記適切な遺伝子は、ｋａｔＧまたはそのフラグメント、ｒｂｏＢ遺伝子または そのフラグメント、ｒｐｓＬ遺伝子またはそのフラグメントのいずれかであるこ と、を特徴とする方法。
17. １７．請求項１記載の方法において、 −解析すべきＤＮＡ、特に適切な遺伝子のＤＮＡを消化し、−得られたフラグメ ントを、例えばＰＣＲ法により増幅し、−増幅されたフラグメントを回収し、 −例えば電気泳動ゲル上で、それらを移動させることなどにより、それらをサイ ズにしたがって互いに分離し、−異なるフラグメントのサイズを、同様のアッセ イに供した抗生物質に対して耐性ではない１つまたはいくつかの対照株のＤＮＡ から得られたものと比較し、そして −おそらくは検出された多型を、上記適切な遺伝子中の突然変異の存在と関連さ せ、したがって、調べているＤＮＡを得たもとの株の対応する抗生物質に対する 可能性のある目性と関連させること、 を含み、 上記適切な遺伝子は、ｋａｔＧ遺伝子またはそのフラグメント、ｒｂｏＢ遺伝子 またはそのフラグメント、ｒｐｓＬ遺伝子またはそのフラグメントのいずれかで あることを特徴とする方法。
18. １８．イソニアジドに対するマイコバクテリウム属の細菌の耐性のインビトロ診 断のためのキットであって、−ｋａｔＧ遺伝子またはそのフラグメントのＤＮＡ の遺伝子を増幅する手段 −そのようにして得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する 手段 −イソニアジドに対して感受性の上記細菌の株のｋａｔＧ遺伝子またはそのフラ グメントの対照ＤＮＡ調製物−場合によっては、イソニアジド耐性マイコバクテ リウム株のｋａｔＧ遺伝子のＤＮＡの対照調製物 を含むことを特徴とするキット。
19. １９．リファンピシンまたはその類縁体に対するマイコバクテリウム属の細菌の 耐性のインビトロ診断のためのキットであって、−上記マイコバクテリウムのＲ ＮＡポリメラーゼのβサブユニットのＤＮＡもしくはｒｏｐＢ遺伝子のＤＮＡま たはそのフラグメントの遺伝子を増幅する手段 −そのようにして得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する 手段 −リファンピシンに対して感受性の上記細菌の株のＲＮＡポリメラーゼのβサブ ユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子またはそのフラグメントの対照ＤＮＡ調製 物 −場合によっては、イソニアジド耐性マイコバクテリウム株のｒｐｏＢ遺伝子の ＤＮＡの対照調製物 を含むことを特徴とするキット。
20. ２０．ストレプトマイシンに対するＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの耐性のイン ビトロ診断のためのキットであって、 −小リボソームサブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子ま たはそのフラグメントの遺伝子を増幅する手段−得られた増幅産物の１つまたは いくつかの突然変異を証明する手段 −ストレプトマイシンに対して感受性のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株のリボ ソーム小サブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子のＤＮＡ 配列の対照調製物 −場合によっては、ストレプトマイシンに対して耐性のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ ｓｉｓ株のリボソームの小サブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓ Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列の対照調製物を含むことを特徴とするキット。