JPH08508640A

JPH08508640A - ヒト脳ホスホジエステラーゼ

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Publication number: JPH08508640A
Application number: JP6520314A
Authority: JP
Inventors: リヴィ，ジョージ・ピー; マクラフリン，メーガン・エム; トーフィー，シーアドール・ジェイ
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1993-03-10
Filing date: 1994-03-10
Publication date: 1996-09-17
Also published as: US6150150A; DE69434492D1; EP0752853A1; EP0752853A4; US5932477A; EP1281770B1; WO1994020079A1; DE69434492T2; EP0752853B1; EP1281770A3; DE69435280D1; EP1281770A2; US6306583B1

Abstract

(57)【要約】低いＫ_m、cＡＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ IV_B）の固有のサブタイプをコードするヒト脳（前頭皮質）cＤＮＡライブラリーから単離されたcＤＮＡクローンが記載されている。プローブとしてcＤＮＡの非保存フラグメントを使用して種々のヒト組織におけるhＰＤＥ IV_B mＲＮＡ発現の分布の分析は、脳、心臓、肺および骨格筋において検出されたが、胎盤、肝臓、腎臓または膵臓においては検出されなかった〜４-kb mＲＮＡによる発現の制限パターンを明らかにした。さらにまた、別の〜５-kb hＰＤＥ IV_B関連mＲＮＡ種は、脳組織において検出された。酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の遺伝子工学的に処理されたＰＤＥ欠失菌株におけるhＰＤＥ IV_Bの発現により、ＰＤＥ IVについての予想された動態学的特徴：１）cＡＭＰについての低いＫ_m（４.３μＭ）、２）cＧＭＰについての高いＫ_m（＞３mＭ）および３）ＰＤＥ IVの選択的阻害薬であるロリプラムに対する感受性（Ｋ_i＝０.０８５μＭ）を示すcＡＭＰＰＤＥ活性の過剰産生を生じた。組換えhＰＤＥ IV_Bは、また、［³Ｈ］Ｒ−ロリプラムを、飽和可能にかつ高親和性をもって結合した。［³Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合データの分析により、２つの非相互作用性の高親和性ロリプラム結合部位（Ｋ_d＝０.４および６nＭ）の存在または複数の結合部位の間の負の協働的相互作用を示す曲線スキャチャード（Scatchard）プロットが明らかになった。この新規酵素は、有効な抗鬱薬、抗喘息薬または抗炎症薬として供する能力について候補化合物をスクリーニングするのに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト脳ホスホジエステラーゼ発明の分野本発明は、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）をコードするcＤＮＡ、酵素の組換え産生におけるそれらの使用および薬物スクリーニングにおけるＰＤＥの使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトの低Ｋ_m、ｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ IV）の固有のサブタイプおよび医薬的に有用な物質のスクリーニングにおけるその使用に関する。発明の背景最近の、いくつかの異なる哺乳動物のＰＤＥをコードするcＤＮＡクローンの同定および特徴付けは、マルチプルイソザイムファミリーの存在ならびに特定のサブタイプの下図および組織分布についての累積的生化学的証拠を支持した［リヴィ,ジー・ピー（Livi,G.P.）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオケミストリー（Mo1.Cell.Bio.）１０：２６７８−８６（１９９０）；コリセリ,ジェイ（Colicelli,J.）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（ユー・エス・エイ）（Proc.Natl.Acad.Sci．（ＵＳＡ））８６：３５９９−３６０３（１９８９）およびデイヴィス（Davis）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（ユー・エス・エイ）（Proc.Natl.Acad.Sci．（ＵＳＡ））８６：３６０４−０８（１９８９）］。薬物発見に関する特に重要なイソザイムファミリーは、ＰＤＥ IVファミリーである。このイソザイムファミリーが抗鬱薬［ニコルソン,シー・ディ（Nicholson,C.D.）ら、トレンズ・イン・ファーマコロジカル・サイエンシズ（ Trends in Pharm.Sci.）１２：１４−２７（１９９１）］から抗喘息薬および抗炎症薬［トルフィ,ティ・ジェイ（Torphy,T．J.）およびビー・ジェイ・アンデム（B.J.Undem）、ソーラクス（Thorax）４６：５１２−２３（１９９１）］までの範囲にある種々の治療薬についての分子標的を示すことを示す相当な証拠がある。ヒト単球ライブラリーから得られたcＤＮＡによってコードされている酵素であるhＰＤＥ IV_Aのクローニング、発現および生化学的特徴が開示された［リヴィ,ジー・ピーら、前記文献（１９９０）およびトルフィ,ティ・ジェイ（Torphy,T.Ｊ.）らジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）２６７：１７９８−１８０４（１９９２）］。本発明の目的は、ヒト脳において発現された、クローン化され、特徴付けられたＰＤＥ IVサブタイプを提供することである。環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、３',５'−環状ヌクレオチドの加水分解を触媒して、その結果、５'−ヌクレオチド代謝を形成させる酵素のファミリーからなる。少なくとも５つの異なる哺乳動物のＰＤＥイソザイムファミリーが存在し、各々、１）酵素動力学、２）基質選択性および３）種々の化合物による選択的な阻害を含む多くの生化学的特性に基づいて区別される。これらのイソザイムファミリーは、Ｉ）Ca²⁺／カルモジュリン依存性ＰＤＥ；II ）ｃＧＭＰ誘発ＰＤＥ；III）ｃＧＭＰ阻害ＰＤＥ；IV）ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥおよびＶ）ｃＧＭＰ特異的ｐＤＥと定義される［ビーボ,ジェイ・エイ（Beavo,J .A.）ら、トレンズ・イン・ファーマコロジカル・サイエンシズ（Trends Pharma col.Sci.）１１：１５０−１５５（１９９０）およびコンチ,エム（Conti,M.）ら、エンドクライン・レビュー（Endocrine Rev.）１２：２１８−２３４（１９９１）］。有効な抗炎症薬および抗喘息薬として低Ｋ_m、ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥ（ＰＤＥI V）の阻害薬を評価することに相当重要である。前記のように、単球において発現されるヒトＰＤＥ IVサブタイプ（hＰＤＥ IV_A）をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび発現が開示された。この酵素は、ラットの脳［コリセリ（Colice lli）、前記文献（１９８９）］およびショウジョウバエ（Drosophila）［チェン，シー−エヌ（Chen,C−N.）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA ）８３：９３１３−１７（１９８６）］からのＰＤＥ IVとの有意なアミノ酸配列ホモロジーを示した。さらにまた、組換え酵素は、酵母および哺乳動物細胞の両方において過剰発現され、その動力学的特徴および酵素選択的阻害薬に対する感度に基づいてＰＤＥ IVとして定義される。組換えhＰＤＥ IV_Aは、ｃＡＭＰについての低Ｋ_m（Ｋ_m＝３．２μＭ）、ｃＧＭＰについての高Ｋ_mを有し、他のＰＤＥイソザイムの選択的阻害薬によってではなく、ロリプラム（roli pram）（Ｋ_i＝０．０６μＭ）によって阻害される。ＰＤＥ IV選択的阻害薬ロリプラムの抗欝活性は、中枢神経系においてＰＤＥI Vの阻害と関連している。ロリプラムは、ラット脳のホモジネートに親和性をもって結合し、結合部位は、ＰＤＥ IV分子自体内に触媒的またはアロステリック部位のいずれかを意味すると思われる。したがって、最近、組換えhＰＤＥ IV_A は、触媒活性および高親和性（Ｋ_d=２ｎＭ）［³Ｈ］−ロリプラム結合部位の両方を有することが確立された［トルフィ,ティ・ジェイ（TorphyT.J.）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）２６７：１７９８−１８０４（１９９２）］。hＰＤＥ IV_Aのこの高い親和性結合部位と触媒活性との間の関係は、明らかではないが、この部位が酵素の２つの異なる触媒形態のうちの１つの上のアロステリック部位または触媒部位を意味することが提案された。さらなるＰＤＥ IVサブタイプがヒト脳において発現されるか、および、そのような場合、このサブタイプがhＰＤＥ IV_Aと同様の生化学的特徴を有するかを知ることは、相当重要なことである。高親和性ロリプラム結合部位がhＰＤＥ IV_Aに加えてＰＤＥ IVサブタイプ上に存在するかの決定が特に重要である。ロリプラムの作用のメカニズムは、ヒトの単球およびラットの脳から誘導された利用可能な組換えＰＤＥ IV酵素を使用して生化学的に評価することができるが、ＰＤＥ IV活性（および細胞ｃＡＭＰ含量）が神経生化学的プロセスを如何に調節するかの真の薬理学的理解は、たとえあるとしてもヒト脳において発現されたＰＤＥ IVサブタイプに関する知識の欠如によって制限される。したがって、本発明の目的は、ヒト脳からのＰＤＥ IVをコードする単離されたｃＤＮＡクローンを提供し、サブタイプ特異的ＰＤＥ IV阻害薬の発見のためのスクリーニングプロトコールにおいてこの有用な試薬を使用することである。本明細書には、固有のＰＤＥ IVサブタイプをコードするヒト前頭皮質ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡのクローニングが記載されている。この酵素は、ビーボおよびライフシュナイダー（前記文献）（１９９０）の命名法に従って、hＰＤＥＩＶ_Bと称される。ｃＤＮＡ生成物は、その比較アミノ酸配列およびＰＤＥ IV選択的阻害薬、組換え酵素の動力学的特徴および［³Ｈ］ロリプラム結合能に基づいてIV型ＰＤＥと定義される。驚くべきことに、このＰＤＥ IV_Bサブタイプは、発現の制限組織タイプパターンを示す。発明の簡単な説明本発明は、ヒトＰＤＥ IV_Bをコードする単離された核酸分子を提供するものである。本発明は、実質的にヒト起源の他のタンパクを含まないヒトＰＤＥ IV_Bを提供するものでもある。本発明は、ＰＤＥ IV_B酵素の組換え体産生のためのクローニングおよび発現ベクターなどの分子試薬を提供するものでもある。本発明は、酵素の発現能を有する組換え宿主細胞を提供するものでもある。本発明は、さらに、標識リガンド／酵素複合物の存在を検出することによって酵素結合能を有するこれらのリガンド候補を同定することからなるＰＤＥ IV_B酵素への結合能を有するリガンドを同定するための方法を含む。本発明は、また、（ａ）複数の薬物候補および（ｂ）酵素に結合することが知られている分析的に検出可能なリガンドを酵素に結合させる条件下で、（ｂ）酵素に結合することが知られている分析的に検出可能なリガンドの存在下、酵素を（ａ）複数の薬物候補と接触させ、公知のリガンドの酵素との結合または相互作用の増強能または阻害能を有するこれらの候補化合物を同定することからなるヒトＰＤＥ IV_B酵素に結合するこれらの化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供するものでもある。本発明は、酵素の基質（例えば、ｃＡＭＰ）加水分解能についての該化合物の効果をモニターすることによって酵素の触媒活性の阻害能を有する候補化合物を検出するための方法を提供するものでもある。本発明は、（ａ）上昇したc ＡＭＰレベルに関連する特異的成長停止表現型を示すＰＤＥ不完全宿主細胞を準備し；（ｂ）宿主細胞を、ＰＤＥ IV_B酵素の発現の指向能を有するプラスミドを用いて形質転換または形質移入させ、得られた組換え宿主細胞をＰＤＥ IV_B酵素の発現のために充分な、かつ、発現ＰＤＥ IV_B酵素を阻害する成長停止反応を生じるのに充分な条件下で培養し；（ｃ）該組換え宿主細胞を複数の候補化合物と接触させ、（ｄ）酵素阻害能を有するこれらの化合物を同定し、これにより、成長停止表現型を暴露することからなるＰＤＥ IV_B選択的リガンドの検出のための生物学的スクリーニングを提供するものでもある。本発明は、３つの前記方法のいずれによっても同定される化合物および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を提供するものでもある。さらに、本発明は、翻訳を防止するためにヒトＰＤＥ IV_BをコードするmＲＮＡ分子の配列との特異的結合能を有する配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明は、ＰＤＥ IV_Bドメインおよびドメインを配置する細胞表面からなる縮合タンパク、ならびに、ＰＤＥ IV_Bドメインに結合させる条件下で表面上で縮合タンパクを発現する組換え宿主細胞を複数の薬物候補と接触させ、酵素の触媒活性を増強または阻害する能力を有するこれらの候補薬物を同定することからなるヒトＰＤＥ IV_B酵素に結合するこれらの化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供するものでもある。図面の簡単な説明第１図は、hb-ＰＤＥ１aおよびhb-ＰＤＥ１ cＤＮＡクローンの、予想されるh ＰＤＥ IV_Bアミノ酸配列との複合ヌクレオチド配列を示す。全暗号配列および完全な５'および３'−ＵＴＲを示す。右側の座標は、ヌクレオチドおよびアミノ酸位置を示す。アミノ酸配列は、推定の翻訳開始部位（＋１）から出発することを示し、星印は、推定の停止コドンを示す。大文字は、クローンhb-ＰＤＥ１に対応しており、小文字は、クローンhb-ＰＤＥ１aに固有のヌクレオチドに対応する（実施例を参照）。下線を付した領域は、第５図Ａに示されたノーザン分析法についてプローブとして使用された維持されなかった領域（第２図を参照）を示す。hb-ＰＤＥ１ cＤＮＡは、位置２８３から２３６３まで伸長し、hb-ＰＤＥ１a は、位置１００８から３６０９まで伸長する。推定のポリアデニル化シグナル（５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'）およびポリ（Ａ）トラクトは、肉太活字とする。ジーンバンク（GenBank）受託番号は、Ｍ９７５１５である。第２図は、代表的な哺乳動物の低Ｋ_mcＡＭＰ特異的ＰＤＥ（ＰＤＥ IV）の推測されたアミノ酸配列を示す。hＰＤＥ IV_Bは、ここに報告されたヒト脳ＰＤＥI Vサブタイプであり；hＰＤＥ IV_Aは、ヒト単球ＰＤＥ IVであり；rＰＤＥ IV_AおよびrＰＤＥ IV_Bは、各々、cＤＮＡクローンＲＤＩおよびＤＰＤから誘導された２種類のラット脳ＰＤＥ IVを示す。ダッシュは、同一のアミノ酸配列を示し；ピリオドは、配列を最大限するために含まれる配列ギャップを示す。第３図は、ロリプラムによるhＰＤＥ IV_B cＡＭＰ加水分解および阻害の速度を示す。ＰＤＥ活性は、hＰＤＥ IV_B発現が誘発されてから６時間後の酵母溶解産物において評価した。データは、２種類の調製物からの結果の代表である。パネルＡは、cＡＭＰ加水分解の二重逆数プロットである。使用したcＡＭＰの濃度は、０．０３〜５０μＭの範囲であった。cＡＭＰについてのＫ_mは、計算して、４.３±０．２μＭであり、Ｖ_maxは、１１.３nmol／mgタンパク／分であった。c ＡＭＰの１０個の最も高い濃度を用いて得られたデータは、挿入図において拡大スケールで示される。パネルＢは、hＰＤＥ IV_BによるcＡＭＰ加水分解に対するＲ−ロリプラムの阻害薬効果の分析である。記号は、実際の実験データを示し、線は、ＫＩＮＰＡＣ速度分析プログラムにより作成され、Ｋ_i＝０.０８５μＭを有する競合的阻害薬についてのデータポイントの理論的位置を示す。第４図は、［³Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合のスキャッチャード分析を示す。hＰＤＥ IV_B発現の誘導から６時間後に調製された酵母細胞溶解産物の上清フラクションを種々の濃度の［³Ｈ］−Ｒ−ロリプラム（０.０２〜２４ｎＭ）と一緒にインキュベートした。アッセイは、飽和できる結合を定義するために１μＭの非標識ロリプラムの存在下または不在下で行った。示された結果は、全結合の９５％以上に相当する、飽和可能な［³Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合のスキャッチャード分析を示す。Ａcufitコンピュータープログラムによって分析したとおり、最も良いデータは、二部位モデル（Ｆ＜０．０１）をロリプラムＫ_d＝０.４および６nＭと適合させた。データは、２つの調製物を用いて得られた結果の代表である。第５図は、hb-ＰＤＥ１特異的mＲＮＡのヒト組織分布を示す。種々のヒト組織から抽出されたポリ（Ａ）⁺mＲＮＡを含有するノーザンブロットは、パネルＡにおいて非維持３'領域（第１図を参照）に対応するhb-ＰＤＥ１の³²Ｐ標識ＰＣＲフラグメントを用いてプローブされ、ストリップされ、パネルＢにおける³²Ｐ標識ベータアクチンcＤＮＡを用いて再プローブされた。各レーンは、所定のヒト組織からのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ２μgを含有した。サイズマーカーは、kbである。発明の詳細な説明本発明の説明において、以下の用語を使用し、これは、以下に示されるように定義される。「抗原」は、ヒトの免疫系を刺激して、体液性および／または細胞性抗原特異的反応を作成する宿主免疫系を刺激する１つ以上のエピトープを含有する分子を意味する。該用語は、「免疫原」と相互交換可能に使用される。用語「エピトープ」は、特異的抗体分子が結合する抗原またはハプテン上の部位を示す。該用語は、「抗原性決定因子」または「抗原性決定因子部位」と相互交換可能に使用される。「縮合タンパク」は、少なくとも２つの操作的に連結された非相同性暗号配列の発現から得られるタンパクである。ＰＤＥ IV_Bペプチドおよび第２の無関係なペプチド配列からなる該タンパクは、縮合タンパクの例である。暗号配列は、ＲＮＡポリメラーゼが２つの暗号配列を一本鎖mＲＮＡ中に転写し、次いで、両方の暗号配列から誘導されたアミノ酸を有する一本鎖ポリペプチド中に翻訳される場合のもう１つの暗号配列に「操作可能に連結」される。暗号配列は、発現配列が最終的に処理されて所望のタンパクを産生する限り、お互いに隣接する必要はない。「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ法によって産生された、例えば、所望のポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構築によって形質転換された細胞から産生されたポリペプチドを意味する。「合成」ポリペプチドは、化学合成によって製造されたものである。「レプリコン」は、in vivoでＤＮＡ複製の自律性単位として機能する；すなわち、同一対照下で複製脳を有する遺伝的素子（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントが結合したセグメントの複製を引き起こすように結合されるプラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。「二本鎖ＤＮＡ分子」は、弛緩され、かつ、スーパーコイル化された二本鎖らせん状態のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン塩基）の重合形態を意味する。この用語は、分子の一次および二次構造を意味するだけであり、特定の三次形態にそれを限定しない。かくして、この用語は、とりわけ、直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プスミドおよび染色体において見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特別の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を検討する際に、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（mＲＮＡと相同性の配列を有する鎖）に沿って５'から３'への方向で該配列だけを与える常法に従ってここで説明する。特定のタンパクのＤＮＡ「暗号配列」または該タンパクを「コードするヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下においた場合、ポリペプチド中に転写され、かつ、翻訳されるＤＮＡ配列である。「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼ結合能を有し、暗号配列の転写開始能を有するＤＮＡ調節領域である。本発明を定義するために、プロモーター配列は、暗号配列の翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ）によって３'末端で結合され、バックグランド以上の検出可能なレベルで転写を開始することが必要な最少量の塩基または素子を含むように上流（５'方向）に伸長する。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いてマッピングすることによって便宜的に定義された）、および、ＲＮＡポリメラーゼの結合の原因となるタンパク結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。真核プロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有することがしばしばあるが、常にではない。原核プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャイン・ダルガーノ配列を含有する。ＤＮＡ「制御配列」は、集合的に宿主細胞における暗号配列の発現（例えば、転写および翻訳）の準備をするプロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写停止配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどを集合的に意味する。制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列を結合し、暗号配列をｍＲＮＡ中に転写する場合に細胞中の暗号配列の「発現を指向し」、次いで、暗号配列によってコードされたポリペプチド中に転写される。「宿主細胞」は、形質転換もしくは形質移入された細胞であるか、または、外因性ＤＮＡ配列による形質転換能もしくは形質移入能を有する。細胞は、かかる外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入された場合に外因性ＤＮＡによって「形質転換」された。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを作成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合され）ていてもいなくてもよい。原核細胞および酵母において、例えば、外因性ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソーム素子上に維持される。真核細胞に関して、安定に形質転換または形質移入された細胞は、外因性ＤＮＡが染色体中に取り込まれたものであり、その結果、染色体複製を介して娘細胞によって遺伝される。この安定性は、原核細胞の、外因性ＤＮＡを含有する娘細胞の個体群からなる細胞系またはクローンを確立する能力によって示される。「クローン」は、１個の細胞または有糸分裂による共通の祖先から誘導された細胞の個体群である。「細胞系」は、多くの世代についてin vitroで安定な成長能を有する一次細胞のクローンである。２つのＤＮＡまたはポリペプチド配列は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約９３％（好ましくは、少なくとも約９５％、最も好ましくは、少なくとも約９８％）が分子の定義された長さ、通常、分子の全長について適合している場合、「実質的に相同」または「実質的に同一」である。本明細書で使用する場合、実質的に相同とは、詳述されたＤＮＡまたはポリペプチド配列との同一性を示す配列を意味する。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、特別な系について定義したようなストリジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」（Current Protocols in Mol.Biol.）第Ｉ巻および第II巻、ウイリィ・インターサイエンス（WiLey Inter science）、オースベル（Ausubel）ら編（１９９２）を参照。実質的に同一であるタンパク配列は、タンパク分解性消化、ゲル電気泳動およびマイクロシーケンシング（microsequencing）によって同定することができる。「機能的に同等な」なる語は、被験タンパクのアミノ酸配列が詳述されたＰＤＥ IV_Bペプチドと実質的に同等な触媒反応を誘発するものであることを示す。ＤＮＡ構築物の「非相同」領域は、自然には他の分子に関連して見られないもう１つのＤＮＡ分子内の、または該ＤＮＡに結合したＤＮＡの同定可能なセグメントである。かくして、非相同領域がレセプター遺伝子をコードする場合、遺伝子は、通常、供給動物のゲノムにおいて該遺伝子をフランクしないＤＮＡによってフランクされる。非相同暗号配列のもう１つの例は、暗号配列自体が自然には見られない構築物である（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立変異（allelic variation）または天然の突然変異は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡの非相同領域を生じさせない。「高親和性」ロリプラム結合部位は、約１０nＭ以下のロリプラムについてのＫ_iによって特徴付けられ、一方、「低親和性」ロリプラム結合部位は、約１００nＭ以上のロリプラムのＫ_iによって特徴付けられる。本明細書で使用する場合、リガンドなる語は、ＰＤＥ IV_B酵素と結合または相互作用することができる分子を意味する。リガンドが酵素の活性部位に結合し、触媒的に作用される場合、リガンドは、基質として知られている。阻害薬は、酵素の活性部位で結合されてもされなくてもよいリガンドである。本発明は、ヒトＰＤＥ IV_Bをコードする、単離された核酸分子を提供するものである。かかる酵素は、この固有のサブタイプのメンバーについて上述した特徴によって定義される。ヒトＰＤＥ IV_Bをコードする核酸を単離するための１つの手段は、ヒトゲノムまたはcＤＮＡライブラリーをプローブすることである［「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」（Current Pr otocols in Molecular Biology）、オースベル,エフ・エム（Ausubel,F.M.）ら編、グリーン・パブリッシング・アソシエイション・アンド・ジョン・ウイリィ・インターサイエンス（Greene Publishing Assoc．and John Wiley In terscience）、ニューヨーク、１９８９、１９９２］。この目的のための１つの特定の有用なプローブは、配列番号１として本明細書に記載する配列のＤＮＡのすべてを取り込んだプローブまたはハイブリダイズ可能なフラグメントである。別法としては、以下に説明するとおり、ＰＤＥ IV_Aからのプローブを使用することもできる。これによって得られた単離された核酸分子を使用して、ヒト、哺乳動物または他の動物源由来のゲノムＤＮＡ、cＤＮＡまたはＲＮＡの相補的コピーを得ることができるか、または、前記で定義された転写調節および制御素子ならびに本明細書に記載された暗号配列に関する５'および／または３'領域由来の他の安定性、プロセシング、翻訳および組織特異性を決定する領域を含む関連配列についてかかる供給源をスクリーニングすることができる。本明細書に記載された方法によって単離されたさらなる暗号配列は、このさらなる配列が配列番号１の配列と約９３％相同性を有する場合、配列番号１に示された暗号配列と実質的に同一であると思われる。本発明は、ヒトＰＤＥ IV_Bである単離されたタンパクを提供するものでもある。この酵素は、配列番号２に挙げられたアミノ酸配列に関して定義され、実質的に相同なアミノ酸配列を有するが、ここに定義されたＰＤＥ IV_B酵素の特徴を維持する突然変異体を含む。本発明のタンパクは、好ましくは、組換え遺伝子工学技術によって調製される。単離された核酸、特にＤＮＡは、遺伝子発現のために必要とされる必要な発現制御領域（例えば、調節領域）にＤＮＡを操作的に結合させることによって発現ベクター中に導入することができる。該ベクターは、当該技術分野でよく知られている方法［オースベルら、前記文献］によって原核（例えば、細菌の）または真核（例えば、酵母または哺乳動物の）細胞などの適切な宿主細胞中に導入することができる。調製または単離されている所望のタンパクについての暗号配列は、好適なベクターまたはレプリコンにクローン化されることができる。多くのクローニングベクターは、当業者に知られており、適切なクローニングベクターの選択は、選択の問題である。クローニングのための組換えＤＮＡベクターおよびそれらが形質転換することができる宿主細胞の例としては、バクテリオファージλ（イー・コリ（E.coli)）、pＢＲ３２２（イー・コリ）、 pＡＣＹＣ１７７（イー・コリ）、pＫＴ２３０（グラム陰性細菌）、pＧＶ１１０６（グラム陰性細菌）、pＬＡＦＲ１（グラム陰性細菌）、pＭＥ２９０（非イー・コリ・グラム陰性細菌）、pＨＶ１４（イー・コリおよびバシラス・サチリス（Bacillus subtilis））、pＢＤ９（バシラス（Bacillus））、ｐＩＪ６１（ストレプトマイセス（Streptomyces））、pＵＣ６（ストレプトマイセス）、ＹＩｐ５（サッカロマイセス（Saccharomyces））、バキュロウイルス（baculovir us）昆虫細胞系、ＹＣp１９（サッカロマイセス）が挙げられる。一般に、「ディエヌエイ・クローニング」（DNA Cloning）：第Ｉ巻および第II巻、グラバー（Glover）ら編、アイアールエル・プレス・オックスフォード（IRL Press Oxfo rd）（１９８５）（１９８７）および；ティ・マニアティス（T.Maniatis）ら、「モレキュラー・クローニング」（Molecular Cloning）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８２）を参照。遺伝子は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現のため）、および、所望により、オペレーター（本明細書において、集合的に、「制御」素子と記す）の制御下に置くことができ、その結果、所望のタンパクをコードするＤＮＡ配列は、この発現構築を含有するベクターによって形質転換された宿主細胞においてＲＮＡに転写される。該暗号配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含有してもしなくてもよい。本発明のサブユニット抗原は、例えば、イー・コリ（E.coli）tacプロモーターまたはタンパクＡ遺伝子（spa）プロモーターおよびシグナル配列を使用して発現され得る。リーダー配列は、翻訳後プロセシングにおいて細菌宿主によって除去され得る。例えば、Ｕ.Ｓ.Ｐ４,４３１,７３９、４ ,４２５,４３７、４,３３８,３９７を参照。制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に関するタンパク配列の発現を調節する調節配列を付加するのが望ましい。調節配列は、当業者に知られており、例としては、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて遺伝子を発現させたり発現させなかったりするものが挙げられる。調節素子の別のタイプは、ベクター、例えば、エンハンサー配列においても存在する。発現ベクターは、特定の暗号配列が適切な調節配列を有するベクター中にあるように構築され、制御配列に関する暗号配列のポジショニングおよびオリエンテイションは、暗号配列が制御配列の「制御」下で転写されるようなものである（すなわち、制御配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼは、暗号配列を転写する）。重要な特定の抗原をコードする配列の修飾は、この結果を達成するのが望ましい。例えば、適切なオリエンテイションを有する制御配列に結合するように配列を修飾すること、すなわち、リーディングフレームを維持することが必要な場合がある。制御配列および他の調節配列は、前記クローニングベクターなどのベクター中に挿入する前に暗号配列に連結される。別法としては、暗号配列は、制御配列および適切な制限部位をすでに含有している発現ベクター中に直接クローン化することができる。分泌シグナルの次なる切断で宿主微生物からポリペプチドを分泌させる配列を付加することが望ましい場合がある。重要なレセプターの突然変異体または類似体を嗅声するのも望ましい。突然変異体または類似体は、タンパクをコードする配列の部分の欠失によって、配列の挿入によって、および／または、配列内の１個以上のヌクレオチドの置換によって調製される。部位特異的突然変異誘発などのヌクレオチド配列を修飾するための技術は、当業者によく知られている。例えば、ティ・マニアティスら（前記文献）；ディエヌエイ・クローニング第Ｉ巻および第II巻（前記文献）；ニュークリイック・アシッド・ハイブリダイゼーション（前記文献）を参照。多くの原核発現ベクターは、当該技術分野で知られている。例えば、Ｕ.Ｓ.Ｐ .４,５７８,３５５、４,４４０,８５９、４,４３６,８１５、４,４３１,７４０、４,４３１,７３９、４,４２８,９４１、４,４２５,４３７、４,４１８,１４９、４,４１１,９９４、４,３６６,２４６、４,３４２,８３２を参照；Ｕ.Ｋ.特許出願ＧＢ２,１２１,０５４、ＧＢ２,００８,１２３、ＧＢ２,００７,６７５；および欧州特許出願１０３,３９５も参照。酵母発現ベクターも当該技術分野で知られている。例えば、Ｕ.Ｓ.Ｐ.４,４４６,２３５、４,４４３,５３９、４.４３０,４２８を参照；欧州特許出願１０３,４０９、１００,５６１、９６,４９１も参照。ＳＶ４０後期プロモーターを使用して哺乳動物細胞において発現を駆動するpＳＶ２neo［ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネティクス（J.Mol.Appl.Genet.）、１：３２７−３４１に開示されている］、または、ＤＭＶプロモーターを使用して発現を駆動するpＣＤＮＡ１から誘導されたベクターであるpＣＤＮＡ１neo［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオケミストリー（Mol.Cell Biol.）７：４１２５−２９］。これらの後者の２つのベクターは、共に、哺乳動物細胞において一過性または安定な（Ｇ４１８耐性を使用する）発現のための使用され得る。昆虫細胞発現系、例えば、ドロソフィラ（Drosophilla）も有用である［ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５１５５およびＵＳ９１／０６８３８ならびにＥＰ出願８８／３０４０９３.３を参照］。選択された発現系および宿主に依存して、本発明のタンパクは、重要なタンパクが発現される条件下で前記発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を増殖させることによって産生される。組換え体の同定および回収を容易にするために、内在性ＰＤＥ IVをあまり産生しなかった細胞タイプを宿主として使用するのが好ましい。次いで、該タンパクを宿主細胞から単離し、精製する。発現系が増殖培地中に該タンパクを分泌すると、該タンパクを、該培地から直接精製することができる。該タンパクが分泌されない場合、細胞溶解物から単離されるか、または、細胞膜フラクションから回収される。タンパクが細胞表面に局在する場合、全細胞または単離された膜は、所望の遺伝子産生物のアッセイ可能な供給源として使用され得る。適切な増殖条件および回収方法の選択は、当該技術の範囲内である。本発明のタンパクは、公知のアミノ酸配列または重要な遺伝子のＤＮＡ配列から誘導されたアミノ酸配列を使用して、固相ペプチド合成法などの化学合成によっても製造される。かかる方法は、当業者に知れている。ペプチドの化学合成は、特には好ましくはない。本発明のタンパクまたは少なくとも１つのエピトープからなるそれらのフラグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体を産生するために使用することができる。ポリクローナル抗体が望ましい場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマなど）は、本発明のレセプターもしくはそのフラグメントまたは突然変異レセプターで免疫される。免疫された動物由来の血清を、公知の方法に従って、回収し、処理する。ポリクローナル抗体を含有する血清を使用する場合、ポリクローナル抗体は、イムノアフィニティクロマトグラフィーまたは他の公知の方法によって精製することができる。本発明のタンパクおよびそのフラグメントに対するモノクローナル抗体も、当業者によって容易に産生することができる。ハイブリドーマ技術を使用することによってモノクローナル抗体を製造するための一般的な方法は、よく知られている。不死化抗体産生性細胞系は、細胞融合によって、および、オンコジーンＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタインーバーウイルスによる形質移入などの他の技術によって生産することができる。例えば、エム・シュライヤー（M.Schreier）ら、「ハイブリドーマ・テクニクス」（Hybridoma Techniqu es）（１９８０）；ハマーリング（Hammerling）ら、「モノクローナル・アンチボディズ・アンド・ティーセル・ハイブリドーマズ」（Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas）（１９８１）；ケネット（Kennett）ら、「モノクローナル・アンチボディズ」（Monoclonal Antibodies）（１９８０）を参照；Ｕ.Ｓ .Ｐ.4,３４１,７６１、４,３９９,１２１、４,４２７,７８３、４,４４４,８８７、４,４５２,５７０、４,４６６,９１７、４,４７２,５００、４,４９１,６３２および４,４９３,８９０も参照。重要な抗原またはそのフラグメントに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性、すなわち、イソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーンされ得る。モノクローナル抗体は、それらが指向される個々の抗体の、イムノアフィニティ法を使用する精製において有用である。別法としては、重要なモノクローナルをコードする遺伝子は、当該技術分野で知られているＰＣＲ法によってハイブリドーマから単離され、適切なベクター中でクローンされ、発現される。本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれであっても、イムノアッセイ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡなどにおいて使用される試薬であるという点で付加的有用性を有する。別の具体例において、酵素からなる細胞膜フラクション、遊離状態であるかまたは固体支持体上に固定化された酵素または単離された酵素を含有する部分的に精製された上清は、試験されるべき化合物の結合を測定するために使用される。組換え細胞が酵素の発現のために使用される場合、あまり内在性酵素活性を有しない細胞を使用するのが好ましく、その結果、結合は、たとえあるとしても、重要な発現された酵素の存在のためである。好ましい細胞としては、酵母細胞、特に、内在性ＰＤＥ活性を欠失するように処理されたサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のものが挙げられる。別の具体例では、ＰＤＥ IV_Bの特異的局在化を行うことができる。例えば、融合タンパクは、本発明の酵素を、宿主細胞の細胞壁または細胞膜中へのかかる融合の取込みを指向するタンパクドメインと融合させることによって製造することができる。細胞表面局在ドメインと称されるかかるドメインは、それ自体、または、当該技術分野で知られているアクセサリーシグナル配列に関連して、融合タンパクの発現および宿主細胞膜または細胞壁中への一体化を指向する能力がある。融合タンパクを一体化するのが最も好ましく、その結果、ＰＤＥ IV_Bドメインは、宿主細胞の外面上に表される。本発明の化合物スクリーニング具体例において、酵素一部精製、または、単離、固定化または細胞結合形態は、複数の候補分子と接触させられ、酵素に結合し、相互作用するこれらの候補が選択される（酵素阻害薬など）。結合または相互作用は、重要な放射性標識候補を使用することによって直接測定することができる。別法としては、候補化合物は、公知の、好ましくは分析的に検出可能な試薬、最も好ましくは放射能で標識されたリガンド（例えば、ロリプラム）が試験されるべき化合物と一緒に導入される競合スクリーニングアッセイに付すことができ、該化合物の、標識リカンドの結合を阻害または増強する能力が測定される。化合物は、重要な酵素クラスへの増加した親和性および選択性ついてスクリーンされる。別のアプローチにおいて、優れている点は、ＰＤＥ IV_Bの触媒活性を有する点である。特に、ＰＤＥ IV_Bは、環状ヌクレオチド（例えば、環状ＡＭＰ）の３'−ホスホエステル結合を加水分解して、５'−モノホスフェート生成物を形成するので、候補分子は、適切な分析的に検出可能な試薬（例えば、放射性試薬、蛍光試薬または比色試薬）で標識された環状ヌクレオチドの加水分解を阻害する能力についてスクリーンすることができる。別の具体例では、宿主細胞、特に酵母中で機能的に発現されたヒトＰＤＥ IV_B は、高速高流量スクリーンにおいて使用されて、天然産生物などの供給源からの酵素選択的阻害薬を同定され得る。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomy ces cerevisiae）の細胞は、内在性cＡＭＰＰＤＥをコードする２つの遺伝子を含有する［サス,ピー（Sass,P.）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Proc.Nat'l.Acad.Sci.US A）、８３：９３０３−０７（１９８６）；ウイルソン，アール・ビー（Wilson, R.B.）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオケミストリー（Mol.Cell.B iol.）８：５０５−５１０（１９８８）およびニカワ,ジェイ・アイ（Nikawa,J. I.）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオケミストリー（Mol.Cell.Bio l.）７：３６２９−３６（１９８７）］。ＰＤＥ欠失突然変異体は、ロスシュタイン（Rothstein）らの方法［クローニング・イン・イースト（Cloning in Yeas t）「ディエヌエイ・クローニングII：ア・プラクティカル・アプローチ」（DNA Cloning II：a practical approach）、デイ・エム・グラバー（D.M.Glover）編、アイアールエル・プレス（IRL Press）、ワシントン・ディ・シー、第４５頁〜第６６頁（１９９０）］に従って逆方向の遺伝的技術（遺伝子破壊）によって構築され、上昇したｃＡＭＰ含量に関連した特異的な成長停止表現型を示すが生存可能であることが判明した。これらの表現型としては、熱ショック感受性、窒素欠乏に対する感受性および酢酸塩などの最適下限炭素供給源を含有する培地上での増殖不能性が挙げられる。寒天プレートアッセイについての詳細（すなわち、培地組成および成長停止表現型をアッセイするための条件）は、サス（Sass ）ら、前記文献；ウイルソン（Wilson）ら、前記文献；ニカワ（Nikawa）ら、前記文献およびマッケイル，エム・エム（McHale,M.M.）ら、モレキュラー・ファーマコロジー（Mol. Pharm.）３９：１０９−１１３（１９９１）に開示されている。すなわち、細胞は、３０℃で２日間ＳＣ−Ｔｒｐ液体培地中で増殖され、５mＭｃＡＭＰおよび１５０μＭＣuＳＯ₄を含有するＳＣ−Ｔｒｐ寒天培地上にスポットされ、３０ ℃で２日間インキュベートされる。熱ショックのために、細胞をマスタープレートから前記と同一の培地を含有する２つのプレート上に複製し、一方を５５℃に１時間予熱する。予熱されたプレートに移された細胞を５５℃で５分間インキュベートし、次いで、３０℃にシフトした。酢酸塩上での増殖をモニターするために、マスタープレートを、グルコースの代わりの２％酢酸カリウム以外は同一の培地を含有するプレートに複製する。増殖は、３０℃で５日目にスコア評価した。ストレプトマイセス・セレビシエ（S.cerevisiae）の遺伝子工学処理されたＰＤＥ欠失菌株におけるヒトＰＤＥ IV_AまたはＰＤＥ IV_Bの機能的発現は、前記異常表現型を逆転する。さらにまた、成長停止についての条件下、ロリプラムおよび他の選択的な哺乳動物ＰＤＥ IV阻害薬は、成長停止条件下でヒトＰＤＥ IVを発現するＰＤＥ欠失突然変異細胞に対して細胞毒性である。同時に、ロリプラムは、野生型酵母細胞またはヒトＰＤＥ IVを発現するＰＤＥ欠失細胞に対する死滅効果を持っていない。これらの制御は、ロリプラムが単に抗真菌薬として作用するわけではないことを示す。そのかわりとして、酵母細胞を入れ、細胞におけるヒト組換え酵素の活性を示す；次いで、この結果、ｃＡＭＰ含量を上昇させ、並行成長停止表現型を暴露させる。かかる系は、ＰＤＥ IVサブタイプ特異的阻害薬についての高流量スクリーンについての基礎を提供する。スクリーニングのための化合物源としては、純粋な化学物質および天然生成物（例えば、土壌微生物由来の発酵ブロス、植物、動物および海洋微生物由来の抽出物）が挙げられる。かかるスクリーンにおいて、化合物は、成長停止のための前記条件下（細胞生存率がヒト組換えＰＤＥ IVの機能的発現（生物学的活性）に依存する）でインキュベートされた細胞を死滅させるが、同時に野生型細胞に影響を及ぼさない能力によって同定される。酵母細胞は、小さな分子に対して哺乳動物細胞よりも感度を低くさせる障壁（すなわち、細胞壁）を有するが、かかる欠点は、例えば、細胞膜成分（例えば、エルゴステロール）の合成に影響を及ぼす遺伝子を突然変異させることによって、酵母細胞の透過性を増大させることによって容易に克服される。例えば、ガバー,アール・エフ（Gaber,R.F.）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオケミストリー（Mol.Cell.Biol.）９：３４４７−３４５６（１９８９）を参照。この系は、細胞における機能的触媒活性についてヒトＰＤＥ IV_Bの遺伝子工学的に処理された部位特異的突然変異を迅速にアッセイするための優れた方法を提供する。さらにまた、この系は、ＤＮＡ配列に関して特徴付ける場合、結合する化合物に含まれるアミノ酸残基を暴露するＰＤＥ IVの耐ロリプラム性のおよび触媒的に活性な突然変異体を直接選択させる。次いで、in vitroで組換え酵素を特異的に阻害することが判明した新規化合物（前記参照）をロリプラムまたは他の参照化合物と、適切な培養条件下で、それらの、酵母スクリーニング菌株中に存在する固有の成長停止表現型を暴露する能力に関して比較する。さらに、天然産生物において同定されたＰＤＥ IV阻害薬を化学的に精製し、in vitroで組換え酵素を阻害する能力をアッセイすることができる。本発明の別の態様では、これまで知られていなかったヒトＰＤＥ IV_Bサブタイプの発見により、サブタイプ特異的阻害薬を迅速にスクリーニングする新しい方法を提供する。したがって、ＰＤＥ IV ＡおよびＢサブタイプは、異なるＰＤＥ欠失酵母菌株において発現され、候補化合物は、それらの、酵素サブタイプの両方ではなく１つを阻害する能力についてスクリーンされる。かくして、ＰＤＥ I Vの脳Ｂ形態ではなく単球Ａ形態を阻害する化合物が同定される。本発明は、前記方法によって同定された化合物および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を提供するものである。本発明のタンパク様薬物の医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内または静脈内投与に特に有用である。非経口投与用組成物は、一般に、許容される担体、好ましくは、水性担体に溶解された本発明化合物の溶液またはそのカクテルからなる。種々の水性担体としては、例えば、水、緩衝水、０.４％生理食塩水、０.３％グリシンが使用される。これらの溶液は、無菌であり、かつ、概して粒子を含まない。これらの溶液は、慣用のよく知られている滅菌技術によって滅菌される。該組成物は、pＨ調節剤および緩衝化剤などの生理学的条件に近づけることが必要な場合に医薬的に許容される補助剤を含有する。かかる医薬組成物中の本発明化合物の濃度は、幅広く、すなわち、約０.５重量％未満から、通常、約１重量％または少なくとも約１重量％から、１５または２０重量％程度まで変化することができ、選択された投与の特定モードに従って、主に、流体体積、粘性などに基づいて選択される。かくして、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、無菌緩衝水１mlおよび本発明化合物５０mgを含有するように調製された。同様に、静脈内輸液用の本発明の医薬組成物は、無菌リンゲル溶液２５０mlおよび本発明化合物１５０mgを含有するように調製される。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、よく知られているか、または、当業者に明らかであり、例えば、レミントンズ・ファーマシューテイカル・サイエンス（Remington's Pharmaceutical Science）、第１５版［マック・パブリシング・カンパニー（Mack Publishing Company）、ペンシルベニア州イーストン］に、より詳細に記載されている。本明細書に記載の化合物は、貯蔵のために凍結乾燥させ、使用前に好適な担体中に再構成させることができる。この技術は、慣用のタンパクについて有効であることが判明しており、技術公知の凍結乾燥および再構成技術を使用することができる。同定された化合物が非タンパク様である場合、それは、単独で、または、医薬的に許容される担体と組み合わせて投与されてもよい。その割合は、該化合物の溶解性および化学的性質、選択された投与経路および標準的な製薬業務によって決定される。例えば、それらは、デンプン、乳糖、ある種の粘土などの賦形剤を含有する錠剤またはカプセル剤の形態で経口投与される。それらは、活性成分がシュガーおよびコーンシロップ、フレーバーリング剤、および色素と混合され、次いで、固体に加圧するために好適ならしめるのに充分に脱水されるトローチ剤またはロゼンジ剤の形態で舌下投与される。非経口投与のために、それらは、他の溶質、例えば、溶液を等張性にするのに充分な生理食塩水またはグルコースを含有する無菌溶液の形態で使用される。医師は、最も好適な存在する治療薬の投与量を決定し、それは、投与の形態および選択された特定化合物について変化し、さらにまた、治療下の特定患者について変化する。医師は、一般に、化合物の最適な投与量よりも実質的に少ない投与量で治療を開始し、該環境下で最適な効果が達成されるまで僅かな増加量によって投与量を増加させることを望む。一般に、該組成物が経口投与される場合、非経口投与された少量の投与量と同様の効果を得るためには多量の活性薬物が必要とされることが判明する。該化合物は、他のＰＤＥ IV_Bに効果を与える薬物と同様に有用であり、投与量は、これらの他の治療薬と一緒に使用される場合と同一のオーダーを有する。該治療的投与量は、一般に、１日当たり１〜１０mg以上であるが、多くの異なる投与単位で投与される。活性薬物０.５〜１０mgを含有する錠剤は、特に有用である。患者の状態に依存して、本発明の医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療用途においては、該組成物を、疾患およびその合併症を治療するか、または、少なくとも部分的に停止させるのに充分な量で、すでに疾患に罹っている患者に投与する。予防用途においては、存在する化合物またはそのカクテルを含有する組成物を、まだ疾患状態ではない患者に投与して、該患者の抵抗を増強させる。処置する医師による投与量および投与パターンの選択により、該医薬組成物の一回または複数回投与を行うことができる。少なくとも、本発明の医薬組成物は、患者を有効に治療するのに充分な量の本発明化合物を提供すべきである。本発明の核酸は、ヒトＰＤＥ IV_B配列との特異的ハイブリダイゼーション能を有するプローブを提供するのに特に有用である。プローブ技術は、当該技術分野でよく知られており、プローブの大きさは、幅広く変化するが、該プローブは、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド長さである。かかるプローブは、プローブの同定を容易にするために分析的に検出可能な試薬で標識することができ、好ましくは、該試薬で標識される。有用な試薬としては、限定されないが、放射能、蛍光色素または検出可能な生成物の形成の触媒能を有する酵素が挙げられる。本発明は、例えば、異常な、すなわち、増加した量または減少した量のＰＤＥ IV_B遺伝子発現によって特徴付けられる病状の診断評価においてＰＤＥ IV_Bをコードするプローブを使用することを提供するものである。別法としては、該プローブを使用して、該遺伝子をコードする酵素において染色体または分子突然変異を有する個体を同定することができる。当業者によって使用される条件に依存して、該プローブを使用して、他の細胞タイプおよび個体由来の別のＰＤＥ IV_B酵素の例を同定し、回収することができる。一般的な規則として、ハイブリダイゼーション条件がストリンジェントであるほど、より緊密な関係の遺伝子が回収される。ＰＤＥ IV_B酵素についてここで記載した配列について予想されるアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた本発明の範囲内である。合成オリゴヌクレオチドまたは関連するアンチセンス化学的構造類似体は、レセプター遺伝子をコードする標的核酸を認識し、該標的核酸に特異的に結合し、遺伝子発現、例えば、標的核酸がmＲＮＡである場合の遺伝子の翻訳を阻害するように設計される。アンチセンス薬物の作用のメカニズムについての特定の理論に結び付けられるのは望まないが、かかる薬物は、以下のメカニズムのうちの１つ以上によって作用することができる：mＲＮＡに結合し、ＲＮase Ｉなどの内在性ヌクレアーゼによる分解を誘導することによるか、または、増殖性タンパク合成に必要な調節因子もしくはリボソーム成分に結合することによってmＲＮＡの翻訳を阻害することによる。さらに、配列をリボザイム配列または反応性化学基と組み合わせ、それを使用して重要なmＲＮＡを特異的に標的とし、mＲＮＡを分解するかまたは化学的に修飾する複合巨大分子配列の成分としてアンチセンス配列を使用することができる。アンチセンス技術の一般的な分野は、バックグラウンドのために出典明示により本明細書の記載の一部とする以下の記載によって説明される［コーエン,ジェイ・エス（Cohen,H.S.）、トレンズ・イン・ファーマコロジカル・サイエンシズ（ Trens in Pharm.Sci.）、１０：４３５（１９８９）およびワイントラウ,エイチ・エム、Scientific American Jan．（１９９０）（４０頁）］。本発明は、ＰＤＥ IV_B酵素からの本明細書に記載されたアミノ酸配列に従ってエピトープに指向されるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を提供するものでもある。免疫学的目的のための酵素の特に重要な領域は、これらの領域に指向される抗体またはそのフラグメントは、酵素−リガンド相互作用に対するこれらの効果のために、診断または治療用途において特に有用である。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生産方法は、よく知られている。例えば、オースベル（Ausubel）ら（前記文献）の第１１章を参照。本発明は、不適切な酵素活性化に関連する病状を治療または改善するために天然リガンドの酵素への結合を遮断するためのＰＤＥ IV_B酵素に対して指向される抗体またはそのフラグメントを結合する抗原の有効量からなる医薬組成物を提供するものでもある。その診断具体例において、ＰＤＥ IV_B酵素は、それを本発明の抗体と接触させ、抗体／酵素複合物を測定することによって検出することができる。該抗体を放射性、蛍光性または酵素などの分析的に検出可能な試薬で標識すると、該抗体を使用して、酵素の存在または不在および／またはその定量的レベルを検出することができる。以下に説明するように、ヒト前頭皮質ライブラリーをスクリーニングすることは、hＰＤＥ IV_Aに対して７６％アミノ酸配列同一性を有するタンパクをコードする固有のcＤＮＡの存在を明らかにした。ＰＤＥ欠失酵母細胞におけるこのcＤＮＡの発現は、遺伝子産生物がＰＤＥ IV酵素ファミリーのものと一致した特徴を有することを示す。特に、hＰＤＥ IV_Bと称される組換え酵素は、cＡＭＰＫ_m ＝４μＭを有しており、基質としてのｃＧＭＰと非常に乏しい活性を示す。さらにまた、この酵素の活性は、他のＰＤＥイソザイムを選択的に阻害する化合物によってではなく、ロリプラム（Ｋ_i＝０.０８５μＭ）および他のＰＤＥ IV選択的阻害薬によって阻害される。hＰＤＥ IV_Aを用いて得られた結果と同様に、ロリプラムは、純粋に競合的なファッションでhＰＤＥ IV_B活性を阻害しない。特定の説明によって結び付けられるのを望まないが、これは、ロリプラムによる阻害の動態学的に複雑なメカニズムを反映するか（アロステリック相互作用）、または、組換えhＰＤＥ IV_Bが、有意に異なるＫ_iを有するが共にロリプラムによって競合的に阻害され得る２種類の触媒活性な非相互転換性形態で存在することを示す。これまで行われたhＰＤＥ IV_Bの制限された評価に基づいて、このサブタイプの動態学的特性は、hＰＤＥ IV_Aと同様である。 hＰＤＥ IV_Aについて見られるとおり、hＰＤＥ IV_B触媒活性および高親和性ロリプラム結合が共発現される（coexpressed）。かくして、高親和性ロリプラム結合は、hＰＤＥ IV_AおよびhＰＤＥ IV_Bの両方の特性である。おもしろいことには、動態学的に異なる高親和性ロリプラム結合部位の少なくとも２つのクラスは、hＰＤＥ IV_B（Ｋ_d＝０.４および６ｎＭ）上に存在するが、１つのクラスだけは、hＰＤＥ IV_A上に存在する。酵素構造および機能に関する価値ある情報は、異なるＰＤＥの予想される主要なアミノ酸の比較により得ることができる。よく研究された哺乳動物ＰＤＥの全ては、可変Ｎ末端およびＣ末端伸長によってフランクされた、触媒ドメインに対応する分子の中心核内の高度に保存された２７０〜３００アミノ酸配列からなる共通構造を示す。相当な量の生化学的データに基づいて、保存された領域は、触媒活性についての情報を含有しており、一方、非保存領域は、酵素活性の調節、細胞分布または亜細胞局在に関してサブタイプ特異性を命ずる。hＰＤＥ IV_Bの主要なアミノ酸配列のラット脳酵素のうちの１つのもの（第２図におけるｒＰＤＥ IV_B）との整列により、それらがほぼ同一であることが示される（残基３８〜５６４）；配列のこの保存は、各分子のＣ末端を含む。対照的に、hＰＤＥ IV_A およびhＰＤＥ IV_Bサブタイプの比較は、特にＮ末端およびＣ末端で、著しい配列逸脱を明らかにする。これは、同一種由来の「異なる」サブタイプの間よりも、異なる種由来の「同一の」イソザイムサブタイプの間の方が高度の配列の保存があることを示す。保存された領域における有意な構造類似性は、（ヒト単球において発現されることが知られている）hＰＤＥ IV_Aと、ラット脳cＤＮＡライブラリーからクローンされた酵素のうちの１つ（第２図におけるｒＰＤＥ IV_A）との間で見られたが、それらのＮ末端およびＣ末端で存在する広範囲な配列逸脱を考慮すると、これらの２つのサブタイプ間の機能的関係に関する結論を引き出すことは不可能である。しかしながら、他のものからのこれらの２つのサブタイプを分離する顕著な特徴は、長いＣ末端ドメインである。２つのサブタイプが機能的に同等であること、および、ラット脳酵素が実際は脳特異的ではないことは、確かにありうることである。すなわち、ラット脳cＤＮＡについてのmＲＮＡ鋳型は、実際に、汚染する血液単球から生じる。残念なことに、試験された全ての組織において発現を示したラットＰＤＥ IV転写体の組織分布の分析は、プローブとして全長cＤＮＡを使用し、したがって、種々のサブタイプの発現を区別しなかった［スウィネン,ジェイ・ブイ（Swinnen,J.V.）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ）８６：５３２５−５３２９（１９８９）］。非保存配列からなるＤＮＡプローブを使用すると、hＰＤＥ IV_B mＲＮＡのヒト組織分布がここで分析され、発現の制限パターンを示すことが判明した。〜４ -kbメッセージは、脳および３つの他の組織において容易に検出されたが、胎盤、肝臓、腎臓および膵臓においては検出されなかった。脳において、本発明者らは、未処理mＲＮＡを表すさらなる〜５-kbm ＲＮＡ種を観察した。別に、脳組織における２つのhＰＤＥ IV_B関連mＲＮＡの同定は、同一遺伝子から発現された別々にスプライスされた転写体と一致するか、または、それよりも、まだ同定されていない遺伝子として別のものの存在を示す。 hＰＤＥ IV_AおよびhＰＤＥ IV_Bの、阻害薬への異なる応答は、さらに重要である。かかる応答により予想すると、サブタイプ特異的薬物スクリーニングを開発することができる。本発明の１つの具体例では、スクリーニングプロトコールは、前記に概略記載したように導かれる。実施例１この実施例は、本発明のＰＤＥ IV_Bのクローニング、発現および特徴付けの詳細を与える。実験方法 cＤＮＡの単離−市販の調製された、λＺＡＰにおいて構築されたヒト前頭皮質cＤＮＡライブラリー（ストラータジーン；平均挿入サイズ−１．５kb）を、³ ² Ｐ標識（ランダム−プライムした；ファルマシア（Pharmacia））したヒト単球 cＤＮＡクローンhm-ＰＤＥ１（前記ｈＰＤＥ−１）の１.８-kbSmaＩフラグメントでスクリーニングした。６ＸＳＣＰ（０.６ＭＮaＣl、０.８１ＭＮa₂ＨＰＯ₄、６mＭＥＤＴＡ、pＨ６.２）、１０％硫酸デキストラン、５Ｘデンハート（Denhardt）（０.０１％フィコール、０.０１％ポリビニルピロリドン、０.０１％ウシ血清アルブミン）、０.１％ＳＤＳおよび１００mg／mlサケ精子ＤＮＡ中、６５℃でハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、６５℃で２ＸＳＣＰ、０.１％ＳＤＳ中で洗浄し、オートラジオグラフィーに付した。多くのクローンを単離し、制限地図によって部分的に特徴付けした。サンガー,エフ（S anger,F.）ら［プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）７４：５４６３−６７（１９７７）］の方法による１つの２.７-kbクローン（hb-ＰＤＥ１a）のＤＮＡ配列決定により、hm−ＰＤＥ１によってコードされたＰＤＥタンパクの３'半分だけと相同性を有するタンパクを予想する、平滑末端ＯＲＦを含有することが明らかになった。次いで、クローンhb−ＰＤＥ１aのＯＲＦの大部分を含有する０.６９-kb NdeＩ−SphＩフラグメントを使用して、（λＺＡＰ中でも）ヒト前頭皮質組織由来のストラータジーンで調製された慣用のcＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。このライブラリーは、大きな挿入サイズを確実にするための方法を使用して調製した。すなわち、該ＲＮＡを水銀メチルの存在下で変性させ、８０％オリゴdＴおよび２０％ランダケプライミングを使用してcＤＮＡに転換させた。次いで、cＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動によって１.５-kb以上の挿入物についてサイズ選択した。標識化、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、前記のものと同一であった。このスクリーンによって、制限地図作製によって分析された１１個のクローンが得られた。最も大きなクローンhb−ＰＤＥ１のＤＮＡ配列が決定され、これが１.３５kbだけhb−ＰＤＥ１aの配列と重複し、さらに１.２８kb上流（５'）に伸長していることが判明した；hb−ＰＤＥ１の全サイズは、２.６３kbである。かくして、hb−ＰＤＥ１aおよびhb−ＰＤＥ１の複合物は、５'および３'の両方のＵＴＲを含有するcＤＮＡを表す。hb-ＰＤＥ１単独は、その主要なアミノ酸配列を他のＰＤＥ IVサブタイプのものと整列させることによって判断されるように（第２図を参照のこと）、全長ＰＤＥ IV関連タンパク（いわゆる、ｈＰＤＥ IV_B）をコードする。ノーザン分析−以下のオリゴヌクレオチドプライマー：５'−GGGGCTCGAGGAGGG ACACACGTATTTCAGCAGCACAAAG-３'（配列番号３）および３'−CTCACTTGAGTGACTGAT TATTGAAGTAAAGAGCTCGGGG-５'（配列番号４）を使用して、ＰＣＲ［マリス,ケイ・ビー（Mullis,K.B.）およびエフ・エイ・ファルーナ（F.A.Faloona）、Meth o f Enz．１５５：３３５−５０（１９８７）］によって、「hb-ＰＤＥ１特異的」ＤＮＡプローブを得た。このフラグメントを、固有のXhoＩ部位（下線部）を使用してpＧＥＭ７（プロメガ（Promega））中にサブクローン化した。このＸhoＩフラグメントをゲル精製し、³²Ｐ標識化し（ランダム−プライムした；ファルマシア（Pharmacia））、多数のヒト組織（クローンテク（Clonetech））から抽出したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを含有するノーザンブロットにハイブリダイズさせた：ハイブリダイゼーション条件は、５ＸＳＳＰＥ（０.７５ＭＮaＣl、０.２ＭＮ aＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ、５mＭＮa₂ＥＤＴＡ、pＨ７.４）、１０Ｘデンハート（Denh ardt）、１００mg／mlサケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミドおよび２％ＳＤＳ中、４２℃であった。該ブロットを、０.１ＸＳＳＣ（１５mＭＮaＣl、１.５mＭクエン酸ナトリウム、pＨ７.０）、０.１％ＳＤＳ中、５０℃で洗浄し、オートラジオグラフィーに付した。同一ブロットを沸騰水でストリップさせ、２-kbヒトβ−アクチンをコードするcＤＮＡで再プローブした［クリーヴランド，ディ・ダブリュ（Cleveland,D.W.）ら、セル（Cell）２０：９５−１０５（１９８０）］。標識化、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、前記と同一であった。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるhＰＤＥ IV_Bの発現−以下のとおり、酵母中での発現のためにhb-ＰＤＥ１ cＤＮＡを処理した：pBluescript／hb-ＰＤＥ１の２.０８-kb ＸhoＩ（５'ポリリンカー） −ＮcoＩフラグメントを、酵母発現プラスミドp１３８ＮＢ［マックホール，エム・エム（McHale,M.M.）ら、モレキュラー・ファーマコロジー（Mol.Pharmacol .）３９：１０９−１１３（１９９１）］の固有のＸhoＩおよびＮcoＩポリリンカ−部位中にサブクローン化した。次いで、hb−ＰＤＥ１の５'ＵＴＲを、１.１-kb ＸhoＩ−ＰvuIIフラグメントを除去し、それを開始メチオニンコドンのすぐ上流でＸhoＩ部位を処理したＰＣＲによって得られた０.７９-kb Ｘh o Ｉ−ＰvuIIhb−ＰＤＥ１フラグメントで置換することによって欠失させた。ＰＣＲのために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、５'−GGGGGCTCGAGAATG AAGGAGCACGGGGGCACCTTCAGTAGC-３'（配列番号５）および３'−GACGGTAAAAACGTCG AC GGTAGGTACTGC-５'（配列番号６）であった。このプラスミドのＰＣＲ生成部分（p１３８ＮＢ／hb−ＰＤＥ１）を配列決定し、アミノ酸配列に影響を及ぼさなかった１つの塩基対変化を含むことが判明した。 p１３８ＮＢ／hb−ＰＤＥ１は、銅誘導可能なＣＵＰ１遺伝子プロモーターによって駆動されたhb-ＰＤＥ１発現により、ＴＲＰ１選択可能なマーカーおよび高いコピー数で維持のための部分２μ配列を含有している。該プラスミドを、酢酸リチウム法［イト,エイチ（Ito,H.）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）１５３：１６３−１６８（１９８３）］を使用して、ＰＤＥ欠失サッカロマイセス・セレビシエ（S.cerevisiae）菌株ＧＬ６２（菌株ＧＬに対して同質遺伝子的；マックホールら（前記文献）（１９９１））中に導入した。Ｔrp⁺プロトトロフを単離し、３０℃で好気性で、トリプトファンを欠いている合成完全培地中でＡ₅₄₀＝１.０に増殖させた。１５０μＭＣuＳＯ₄の添加によって、ＰＤＥ発現を誘導した。細胞を６時間目に収穫し、マックホールら（前記文献）によって従前に開示されたように、１００,０００×ｇ上清を調製した。ＰＤＥアッセイおよび阻害薬研究−酵母細胞溶解物の１００,０００×ｇ上清フラクション中でＰＤＥ活性を測定した。すなわち、（最終濃度）５０mＭトリス−ＨＣl（pＨ７.５）、５mＭＭgＣl₂、１μＭ［³Ｈ］cＡＭＰ（２０００dpm ／pmol）および０.０５％ＢＳＡを含有する反応混合物０.１ml（最終容量）に酵母上清フラクションのアリコットを添加することによって、該反応を開始した。該反応を停止した後、各アッセイに５０μＭ５'−［¹⁴Ｃ］ＡＭＰ（４００dpm／ nmol）を添加して、回収率を測定した。種々の阻害薬のＩＣ₅₀を測定した研究については、化合物は、大きさが３桁を超えて変化した濃度で、反応混合物中に存在した。該反応を３０℃で３０分間行った。該反応を停止し、５'−アデノシン一リン酸を単離し、従前に開示されたとおり［トルフィ,ティ・ジェイ（Torphy, T.J.）およびエル・ビー・シースリンスキー（L.B.Cieslinski）、モレキュラー・ファーマコロジー（Mol.Pharmacol.）３７：２０６−２１４（１９９０）］、ＰＤＥ活性を測定した。全てのアッセイは、開始基質の１０％以下が加水分解する反応の直線範囲で行った。cＧＭＰ加水分解もまた、トルフィ,ティ・ジェイおよびシースリンスキー（前記文献）によって開示されたとおりアッセイした。従前に開示されたとおり［ロウリィ,オー・エイチ（Lowry,O.H.）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）１９３：２６５−７５（１９５１）］、タンパク濃度を測定した。ロリプラム結合アッセイ−シュナイダー（Schneider）および共同研究者の方法［ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（Eur.J.Pharmacol.）１２７：１０５−１１５（１９８６）］の変形によって［³Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合を評価した。結合実験を競争させるために、該反応を、（最終濃度）５０mＭトリス−ＨＣl（pＨ７.５）、５mＭＭgＣl₂、５０μＭ５'−ＡＭＰ、２nＭ［³Ｈ］Ｒ−ロリプラム（５.７×１０⁴dpm／pmol）および０.０５％ＢＳＡを含有する標準的な反応混合物０.５ml中、３０℃で行った。飽和結合実験のために、［³Ｈ］Ｒ−ロリプラムの濃度を０.０２から２４nＭまで変化させた。非特異的結合は、１μＭ非標識ロリプラムの存在下で定義され、一貫して全結合の５％未満であった。氷冷反応緩衝液（［³Ｈ］Ｒ−ロリプラムを含まない）１mlを添加し、０.３％ポリエチレンイミン中に浸漬しておいたワットマン（Whatman）ＧＦ／Ｂフィルターを介して高速真空濾過（ブランデル・セル・ハーベスター（Brandel Cell Harvester）することによって、１時間後に該反応を停止させた。該フィルターをさらなる冷たい緩衝液５mlで洗浄し、乾燥し、液体シンチレーション分光測定によって計数した。動態学的および結合パラメーターの測定−Ｖ_max、Ｋ_mおよびＫ_iの測定のために、アッセイ当たりの³Ｈ標識環状ヌクレオチドの量を一定に維持しつつ、 cＡＭＰまたはcＧＭＰの濃度を変化させた。基質の比活性の変化について、適切な修正を行った。動態は、非線形最小２乗回帰分析を使用して、ダブリュ・ダブリュ・クレランド（W.W.Cleland）［Meth．of Enzymol．６３：１０３−３８（１９７９）］によって開示されたＫＩＮＰＡＣコンピュータープログラムを用いて分析した。Acufitコンピュータープログラム［ベックマン・インストゥルメンツ（Beckman Instruments）、カリフォルニア州フラートン］を使用して、多数のＫ_dおよびＶ_max値の測定を含む［³Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合実験の分析を行った。Ｆ検定によって、１−サイト（site）および２−サイトフィット間の統計学的比較を行った。阻害薬および放射性リガンド−Ｒおよび（Ｓ）−ロリプラムは、ドクター・シグフライド・クリステンセン（Dr.Sigfried Christensen）および同僚によってを合成され［スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ（SmithK line Beecham Pharmaceuticals）、ペンシルベニア州キング・オブ・プルシア］；［³Ｈ］Ｒ−ロリプラム（５×１０⁴dpm／pmol）は、ドクター・リチャード・ヘイズ（Dr.Richard Heys）および同僚によって製造され［スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ、ペンシルベニア州キング・オブ・プルシア］；デンバフィリン（denbufylline）は、スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ（SmithKline Beecham Pharmaceuticals）［英国エプソム］から入手され；Ｒo２０−１７２４は、バイオモル（BioMol）［ペンシルベニア州プリマス・ミーティング］から購入され；ザプリナスト（zaprinast）およびシグアゾダン（siguazodan）（ＳＫ＆Ｆ９４８３６）は、ドクター・ウイリアム・コースト（Dr.William Coast）および同僚によって合成された［スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ（SmithKline Beecham Pharmac euticals）［英国ウエルウィン］。結果ヒト脳ＰＤＥ IV cＤＮＡのクローニングおよびヌクレオチド配列−低Ｋ_m cＡＭＰ特異的ＰＤＥをコードすることが判明したヒト単球cＤＮＡの保存領域由来のＤＮＡフラグメントを使用して、ヒト前頭皮質cＤＮＡライブラリーをプローブした。多くのクローンが得られ、これらを制限地図作製によって特徴付けし、１つの２.７-kbクローンのＤＮＡ配列を決定した。このクローン（hb−ＰＤＥ１a）は、hＰＤＥ IV_A cＤＮＡの大きな３'部分と相同性であった配列情報を含有した。次いで、hＰＤＥ１aを使用して、ヒト前頭皮質から慣用的に合成された第２cＤＮＡライブラリーをプローブした。再度、多くのクローンが得られ、制限分析に基づいて、本発明者らは、最も長い５'伸長を含有する１つのクローンのＤＮＡ配列を決定した。第１図は、これらの２つのcＤＮＡの複合ヌクレオチド配列を示す。hb−ＰＤＥ１は、−２８３位から２３６３位まで伸長するが、一方、hb−ＰＤＥ１aは、１００８位から３６０９位まで伸長する。該配列は、長さ１６９２bpのＯＲＦを含有し、これは、算出された分子量６４,２０２（Ｎ末端メチオニンを引いた）を有する５６４アミノ酸タンパクを予想する。ＯＲＦを２８３および１９０７bpの各々５'および３'未翻訳配列によってフランクする。３'ＵＴＲは、３５７２位の推定のポリアデニル化シグナル（５'−ＡＡＴＡＡＡ −３'）を、次いで、ポリ（Ａ）トラクトを含有する。予想されたhb−ＰＤＥ１タンパク配列の分析−第２図は、hＰＤＥ IV_B主要アミノ酸配列の、ヒト単球由来の１つ（hＰＤＥ IV_A）およびラット脳由来の２つ（rＰＤＥ IV_A；rＰＤＥ IV_B）の３つの他のクローンされた哺乳動物ＰＤＥ IV の配列との整列を示す。これらの他の酵素の全ての組換え形態は、IV ＰＤＥ型の示す生化学的性質を示すことが判明した。特に触媒ドメインを含有することが提案された分子の中心核内の、hＰＤＥ IV_Bタンパクと他のＰＤＥ IVの全ての間の著しい相同性がある。おもしろいことに、hＰＤＥ IV_Bの配列は、ヒト単球由来のＰＤＥ IV（hＰＤＥ IV_A；５３８アミノ酸に対して７６％同一）とよりもラット脳タンパクのうちの１つの配列（rＰＤＥ IV_B；５６２アミノ酸に対して９２％同一；hＰＤＥ IV_Bの残基３８で５２６アミノ酸に対して９％同一）との方がより相同性である（第２図）。実際に、hＰＤＥ IV_BおよびrＰＤＥ IV_Bのタンパク配列は、それらのＣ末端で正確に整列する。これらの２つのタンパク間の関係は、全ての４つのタンパクを正確に比較するために挿入した配列ギャップの完全な整列によってより明らかにされる（第２図）。hＰＤＥ IV_BおよびrＰＤＥ IV_Bは、お互いに非常に相同であり、hＰＤＥ IV_Aタンパクの配列は、他のラット脳タンパクrＰＤＥ IV_Aのものと非常に類似している（５０４アミノ酸に対して８３％同一）。hＰＤＥ IV_AおよびhＰＤＥ IV_Aの両方は、他の２つのタンパクでは見られなかったＮ末端付近の（hＰＤＥ IV_Bの残基１３１と隣接している）挿入および長いＣ末端伸長を含有する。第２図は、hＰＤＥ IV_BとhＰＤＥ IV_AおよびrＰＤＥ IV_Aの両方との間での多くの差異が後者の２つのタンパク間で保存される残基を含むことも示す。かくして、異なる種由来の脳組織から誘導された２つのＰＤＥ IV間よりも２つのヒトＰＤＥ IV間のタンパク配列保存の方がより小さい。酵母におけるhＰＤＥ IV_Bの発現およびその触媒活性の評価−組換えhＰＤＥ I V_B酵素を生化学的に特徴付けるために、hb−ＰＤＥ１ cＤＮＡを酵母サッカロマイセス・セレビシエ（S.cerevisiae）における過剰発現のために処理した。これは、内在性cＡＭＰ特異的ＰＤＥをコードする２つの遺伝子のゲノム分裂を含有する酵母の遺伝子工学的処理したＰＤＥ欠失菌株を使用して行った。誘導後のcＡＭＰ加水分解活性の測定できる量を蓄積したhＰＤＥ IV_Bのための発現プラスミド（p１３８ＮＢ／hb−ＰＤＥ１）を含有する酵母細胞の可溶性フラクション（１μＭ［³Ｈ］cＡＭＰの存在下、タンパク１mg当たり２.０nmol／分）を、cＤＮＡ挿入を欠失しているプラスミド（p１３８ＮＢ）を含有する細胞由来の試料中で見られるごく僅かな活性と比較した。酵母中で発現したhＰＤＥ IV活性は、Ｋ_m４.３μＭおよびＶ_max＝１１.３nmol／mgタンパク／分を有するc ＡＭＰについての触媒活性および高親和性に関して標準的なミカエリス−メントン行動を示した（第３図Ａ）。さらにまた、Ｒ−ロリプラムは、触媒活性（Ｋ_i ＝０.０８５μＭ）を有効に阻害するが、観察された阻害が厳密に競合的であることは、明らかではなかった（第３図Ｂ）。組換え酵素は、２つの他のＰＤＥ I V阻害薬、Ｒｏ２０−１７２４（ＩＣ₅₀＝２.２μＭ）およびデンブフィリン（ＩＣ₅₀＝０.５μＭ）によっても阻害されるが、各々ＰＤＥ IIIおよびＰＤＥＶの阻害薬であるシクアゾダン（siquazodan）およびザプリナスト（zaprinast）（ＩＣ₅₀＞３０μＭ）によっては阻害されなかった。１０mＭ程度の大きな基質濃度でさえ、c ＧＭＰの検出可能な加水分解は、示されなかった。［³Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合−［³Ｈ］Ｒ−ロリプラムとの飽和結合実験の典型的なスキャッチャード分析を第４図に示す。スキャッチャードプロットは、一貫して曲線であり、１つの部位モデルよりも２つの部位モデルの方が最良に適合した（Ｆ＜０.０１）。曲線スキャッチャードプロットが負の協働的相互作用よりも２種類の結合部位を反映したと仮定すると、Ｋ_d０.４nＭおよび６nＭは、全部位のほぼ３分の１を示す高親和性で算出された。 hＰＤＥ IV_AおよびhＰＤＥ IV_Bの動態学的行動および［³Ｈ］ロリプラム結合特徴を第１表に示す。これらのサブタイプの動態学的特徴は、cＡＭＰおよびcＧＭＰに対するそれらの触媒活性およびそれらのＲ−ロリプラムに対する感受性に関して事実上同一である。しかしながら、１つを超える高親和性ロリプラム結合部位含有することが明らかであるhＰＤＥ IV_Bとは異なり、hＰＤＥ TV_Aは、非相互作用性高親和性結合部位の１つのクラスだけを有する。 mＲＮＡ組織分布−測定されたヒト組織の半分だけにおいてhb−ＰＤＥ１に対応するmＲＮＡ転写体を検出した（第５図Ａ）。種々のヒト組織から誘導されたポリ（Ａ）⁺ＲＮＡのノーザンブロット分析により、脳、心臓、肺および骨格筋において〜４-kb mＲＮＡが存在し、胎盤、肝臓、腎臓および膵臓においてmＲＮＡが検出されなかったことが明らかになった。さらに〜５-kb mＲＮＡが脳中で検出され、〜４-kb mＲＮＡに対してほぼ等しく豊富に存在した。これらの研究のために、暗号領域の非保存部分＋３'ＵＴＲを表すhb−ＰＤＥ１フラグメントからなるプローブ（第１図において下線を引いた配列）を使用した。該ブロットをストリップし、各レーンにおいてＲＮＡの存在について、対照として２-kbヒト β−アクチンcＤＮＡを用いて再プローブした。第５図Ｂは、各組織に負荷されたポリ（Ａ）⁺ＲＮＡの量が、明らかに過負荷された肺以外は、おおよそ同等であり、心臓および骨格筋において観察された、より低い〜１.８-kb β−アクチンバンドは、タンパクの第２筋肉特異的形態を表す。配列表（１）一般的な情報（i）出願人：リビ，ジョージ・ピーマクローリン，メガン・エムトルフィ，テオドア・ジェイ（ii）発明の名称：ヒト脳ホスホジエステラーゼ（iii）配列の数：６（iv）通信住所：（Ａ）宛て先：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション（Ｂ）通り：コーポレート・パテンツ／ピー・オー・ボックス１５３９（Ｃ）都市：キング・オブ・プルシア（Ｄ）州：ペンシルベニア（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−０９３９（v）コンピューター判読形式：（Ａ）媒介タイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ Compatible （Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウエア：Patent In Release ＃1.0，Version ＃1.25 （vi）本願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（viii）代理人情報：（Ａ）氏名：ジャービス，ハーバート・エイチ（Ｂ）登録番号：３１,１７１（Ｃ）リファレンス／ドケット番号：Ｐ５０２００（ix）遠距離通信情報：（Ａ）電話：（２１５）２７０−５０１９（Ｂ）テレファックス：（２１５）２７０−５０９０（２）配列番号１の情報：（i）配列特徴：（Ａ）長さ：３８９０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cＤＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ（iv）アンチセンス：ＮＯ（vi）起源：（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（Ｆ）組織の種類：脳（ix）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：２８２..１９７３（xi）配列：配列番号１（２）配列番号２の情報：（i）配列特徴：（Ａ）長さ：５６４塩基対（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク（xi）配列：配列番号２（２）配列番号３の情報：（i）配列特徴：（Ａ）長さ：４０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cＤＮＡ（vi）起源：（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（Ｆ）組織の種類：脳（ix）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature （Ｂ）存在位置：１..４０（Ｄ）他の情報：／機能＝５'ＰＣＲプローブ（xi）配列：配列番号３（２）配列番号４の情報：（i）配列特徴：（Ａ）長さ：４０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cＤＮＡ（vi）起源：（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（Ｆ）組織の種類：脳（ix）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature （Ｂ）存在位置：１..４０（Ｄ）他の情報：／機能＝３'ＰＣＲプローブ（xi）配列：配列番号４（２）配列番号５の情報：（i）配列特徴：（Ａ）長さ：４２塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cＤＮＡ（vi）起源：（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（Ｆ）組織の種類：脳（ix）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature （Ｂ）存在位置：１..４２（Ｄ）他の情報：／機能＝５'ＰＣＲプローブ（xi）配列：配列番号５（２）配列番号６の情報：（i）配列特徴：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cＤＮＡ（vi）起源：（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（Ｆ）組織の種類：脳（ix）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：misc_feature （Ｂ）存在位置：１..３０（Ｄ）他の情報：／機能＝３'ＰＣＲプローブ（xi）配列：配列番号６

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 6807−4ＢＣ１２Ｑ 1/02 1/44 6807−4Ｂ 1/44 // Ｃ０７Ｋ 14/47 8517−4ＨＣ０７Ｋ 14/47 16/40 8517−4Ｈ 16/40 19/00 8517−4Ｈ 19/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/573 8310−2Ｊ 33/573 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者マクラフリン，メーガン・エムアメリカ合衆国ペンシルベニア州19026、ドレクセル・ヒル、マンスフィールド・アベニュー2505番 (72)発明者トーフィー，シーアドール・ジェイアメリカ合衆国ペンシルベニア州19096、ウィンウッド、ショートリッジ・ドライブ 421番

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＰＤＥ IV_Bをコードする、単離された核酸分子。２．核酸がＤＮＡである請求項１記載の分子。３．配列番号１と同一の配列を実質的に有する請求項２記載の分子。４．ヒト起源の他のタンパクを実質的に含まないヒトＰＤＥ IV_B。５．配列番号２と同一のアミノ酸配列を実質的に有する請求項４記載のタンパク。６．請求項１記載の核酸からなるベクター。７．プラスミドである請求項６記載のベクター。８．クローニングプラスミドである請求項７記載のプラスミド。９．発現プラスミドである請求項７記載のプラスミド。１０．p１３８ＮＢ／hb-ＰＤＥ１と同定される請求項９記載のプラスミド。１１．請求項６記載のベクターからなる組換え宿主細胞。１２．原核細胞である請求項１１記載の宿主細胞。１３．真核細胞である請求項１１記載の宿主細胞。１４．酵母である請求項１３記載の真核宿主細胞。１５．リガンド結合のために充分な条件下でＰＤＥ IVB酵素を分析的に検出可能な試薬で標識された複数の候補リガンドと接触させ、標識リガンド／酵素複合体の存在を検出することによって酵素結合能を有するこれらのリガンド候補を同定することを特徴とする、ＰＤＥ IV_B酵素への結合能を有するリガンドの同定方法。１６．リガンドが放射能で標識される請求項１５記載の方法。１７．複数の薬物候補（ａ）およびヒトＰＤＥ IV_B酵素に結合することが知られている分析的に検出可能なリガンド（ｂ）を該酵素に結合させる条件下、該リガンド（ｂ）の存在下で酵素を該複数の薬物候補（ａ）と接触させ、公知のリガンドと酵素との結合または相互作用増強能または阻害能を有するこれらの候補化合物を同定することを特徴とする、ヒトＰＤＥ IV_B酵素に結合するこれらの化合物を同定するための化合物スクリーニング方法。１８．公知の標識リガンドがロリプラムおよびcＡＭＰからなる群から選択される請求項１７記載の方法。１９．標識が放射性標識である請求項１８記載の方法。２０．公知の標識リガンドが³Ｈ−cＡＭＰであり、検出された相互作用がリガンドの触媒性転換である請求項１９記載の方法。２１．（ａ）上昇したcＡＭＰレベルに関連する特異的な増殖停止表現型を示すＰＤＥ欠失宿主細胞を準備し；（ｂ）該宿主細胞を請求項９記載のプラスミドで形質転換または形質移入し、得られた組換え宿主細胞をＰＤＥ IV_B酵素の発現のために充分でかつ発現されたＰＤＥ IV_B酵素を阻害する増殖停止反応を生じさせるために充分な条件下で培養し；（ｃ）該組換え宿主細胞を複数の候補化合物と接触させ；次いで、（ｄ）該酵素を阻害し、これにより、増殖停止表現型を明らかにする能力を有するこれらの化合物を同定することを特徴とする、ＰＤＥ IV_B選択的リガンドの検出のための生物学的スクリーニングアッセイ。２２．宿主細胞が酵母細胞であり、プラスミドがp１３８ＮＢ／hb−ＰＤＥ１である請求項２１記載の方法。２３．特異的増殖停止表現型が窒素欠乏に対する感受性、熱ショック感受性および最適以下の炭素供給源上での増殖不能性からなる群から選択される請求項２２記載の方法。２４．請求項２１記載の方法によって同定された化合物および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物。２５．翻訳を防止するために配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＰＤＥIV_B をコードするmＲＮＡ分子の配列との特異的結合能を有する配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。２６．請求項５記載のヒトＰＤＥ IV_Bに指向される抗体。２７．モノクローナル抗体である請求項２６記載の抗体。２８．ＰＤＥ IV_Bドメインおよび細胞表面局在化ドメインからなる融合タンパク。２９．ＰＤＥ IV_Bドメインに結合させる条件下で、請求項２９記載の融合タンパクを表面上で発現させる組換え宿主細胞を複数の薬物候補と接触させ、酵素の触媒活性を増強または阻害する能力を有するこれらの候補薬物を同定することを特徴とする、ヒトＰＤＥ IV_B酵素に結合するこれらの化合物を同定するための化合物スクリーニング方法。