JPH07503131A - 新規ヒトｃｄｃ２５遺伝子、コード産物及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ヒトｃｄｃ２５遺伝子、コード産物及びその利用発明の背景 真核細胞において有糸分裂は、“Ｍ−相促進因子（Ｍ−ｐｈａｓｅｐｒｏｍｏｔ ｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）”’として知られる（ＭＰＦ；Ｈ−相持異的ヒストンキ ナーゼ又はより簡単にＨ−相キナーゼとしても知られる）プロティンキナーゼの 活性化に続いて開始される。このキナーゼは少なくとも３つのサブユニット：触 媒サブユニット（ｃｄｃ２）、調節サブユニット（サイクリンＢ）及び低分子量 サブユニット（ｐ１３−ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５４＋４２３−４３１　（１９８８ ）：Ｇａｕｔｉｅｒ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１　５４：４３３−４３９（１ ９８８）；Ａｒ１ｏｎ、Ｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１　５５：３７１−３７８（ １９８８）；Ｄｒａｅｔｔａ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５６：ａｌ、、Ｅ ＭＢＯＪ、８：３０５３−３０５８　（１９８９）：Ｍｅｉｊｅｒ、Ｌ、ｅｔ　 ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、８：２２７５−２２８２（１９８９）；Ｇａｕｔｉｅｒ、 Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６０：４８７−４９４　（１９９０）；Ｇａｕｔ ｉｅｒ、Ｊ、ａｎｄ　Ｊ、Ｍａｌｌｅｒ、ＥＭＢＯＪ、１０　：１７７−１８２ 　（１９９１））、ｃｄｃ２及び関連キナーゼは他のサイクリンとも一緒になっ て（Ｇｉｏｒｄａｎａ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５８：９８１−９９０（ １９８９）；Ｄｒａｅｔｔａ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５６：８２９−８ ３８　（１９８９）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｈ，Ｅ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ　５９：１１２７−１１３３（１９８９））、分裂周期の種々３９−１ ０４３　（１９９０）；Ｅｌｌｅｄｇｅ、Ｓ、Ｊ、ａｎｄ　Ｍ。

Ｒ，Ｓｐｏｔｔｓｗｏｏｄ、　ＥＭＢＯＪ、旦：　２６５３−２６５９（１９９ １）；Ｔｓａｉ、Ｌ−Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３５３　：１７４−１ ７７　（１９９１）’）。

ｃｄｃ２／サイクリンＢ酵素は多数のレベルの制御を受ける。これらの中でチロ シンリン酸化による触媒サブユニットの調節が最も理解されている。多様な真核 細胞型においてｃｄｃ２は最も重度にチロシンリン酸化されるタンパク質の１つ である（Ｄｒａｅｔｔａ、Ｇ、ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：７３８−７ ４４　（１９８８）：ＤｕｎＣｅ　］　ｌ　５８　：１９３−２０３　（１９８ ９））、ｃｄｃ２のチロシン１５及び又トレオニン１４残基のリン酸化は、ｃｄ ｃ２との会合が起こるしきい値以上のサイクリンの堆積により部分的に調節され る（Ｓｏｌｏｍｏｎ、Ｍ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６３：１０１３−１０ ２４　（１９９０））。チロシンリン酸化はｃｄｃ２／サイクリンＢ酵素を阻害 し、有糸分裂の開始時に起こるチロシン脱リン酸化はプレーＭＰＦ複合体を直接 活性化する（Ｇａｕｔｉｅｒ　Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔユｅｔ　ａｌ、、ＥＭ ＢＯＪ、８：３０５３−３０５８　（１９８９）；Ｍｏｒｌａ、Ａ、Ｏ，ｅｔ　 ａｌ、、Ｃｅｌ　ｌ　５８：１９３−２０３（１９８９）；Ｄｕｎｐｈｙ、Ｗ、 Ｇ、ａｎｄ　Ｊ、Ｗ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｃｅ１ｌ　５８：１８１−４３１　（１ ９８９）；Ｍｏｒｌａ、Ａ。

０、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５８：１９３−２０３（１９８９）；ＭＰＦの活 性化におけるｃｄｃ２脱リン酸化の役割を知り、ｃｄｃ２ホスファターゼの調節 に非常な興味が持たれる。分裂酵母における遺伝研究は、ｃｄｃ２５遺伝子機能 が有糸分裂の開始に必須であることを確立した（Ｎｕｒｓｅ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、 、Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

１４６　：１６７−１７８　（１９７６）　）。ｃｄｃ２５遺伝子産物はｃｄＣ ２プロティンキナーゼの律速アクチベータとして働＜（ＲｕｓｓｅｌＢｉｏｐｈ ｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｏｎ、１旦ユニ３０１−３０９　（１９９０）；Ｍｏｒ ｅｎｏ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３４４：５４９−５５２　（１９９ ０））。さらにその産物がチロシン上でリン酸化されることができない突然変異 ｃｄｃ２−Ｆ１５はｃｄｃ２５タンパク質機能の必要性を回避する（Ｇｏｕｌｄ 、に、ａｎｄ　Ｐ、Ｎｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：３９−４５　（１９８ ９））、別の研究はＣｄｃ２５がｃｄｃ２ホスファターゼであること（Ｋｕｍａ ｇａｉ、Ａ。

１旦１　：　２４２−２４５　（１９９１））　、及びｃｄｃ２５がｐ３４°１ ２上のチロシン及びおそら（トレオニン残基を脱リン酸化し、ＭＰＦ活性化を調 節するｃｄｃ２ホスファターゼであることを示唆した。（Ｄｕｎ普遍的分子内因 子であるＭＰＦはすべての生物における細胞周期の０２／Ｍ転移の引金を引く。

Ｇ２後期において、それはチロシン−リン酸化ｐ　３４　ｃ″”及び非リン酸化 サイクリンＢ　ｃｎｃ＋３の不活性複合体として存在する。Ｍ相において、ヒス トンＨ１キナーゼ活性を示す活性ＭＰＦとしてのその活性化が、チロシンホスフ ァターゼｐ８Ｑ　ｅｄｃ２５にょるｐ３４ｃｄｃ２サブユニツトの特異的チロシ ン脱リン酸化から起こる。ＭＰＦ活性化及び有糸分裂への突入のタイミングを制 御又は決定するシグナル、あるいはそのようなシグナルを阻害又は促進して有糸 分裂への突入を阻害あるいは促進する方法についてほとんど知られていない。

チロシン及びトレオニン上のｃｄｃ２の脱リン酸化を制御するシグナルがＭＰＦ 活性化及び有糸分裂への突入のタイミングの制御における重要な役割を果すので 、ｃｄｃ２脱リン酸化を制御するタンパク質に大きな興味が持たれる。さらにこ れらのタンパク質及びそれらの調節機能に関する知識は、それが細胞分裂をより 良く理解するための基礎及びおそらく細胞分裂の起こり方を変更する方法を与え るので有用である。

発明の概略 ＭＰＦ活性化、及びかくして有糸分裂への突入の制御の重要な様相が初めて示さ れた。すなわちＢ−型サイクリンがｃｄｃ２５　ＰＴＰアーゼ（ＰＴＰａｓｅ） を活性化することが示され、ｃｄｃ２５タンパク質がプレーＭＰＦのキナーゼ活 性を直接刺激してＭ−相キナーゼを活性化することができることが示された。そ の結果、ここで有糸分裂への突入を調節し、か（して細胞周期を調節するための 方法を設計することが可能である。

本明細書に記載する通り、出願人は以前には記載のないｃｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ ２５Ｂと名付けられる２個のヒトｃｄｃ２５遺伝子を単離し、ヒトｃｄｃ２５が 少な（とも３つのメンバーを含む多重遺伝子族であることを確立した。さらに本 明細書に記載する通り、ｃｄｃ２５Ａ及びＣｄｃ２５Ｂは内在性チロシンホスフ ァターゼ活性を有し、ｃｄｃ２の不在下でＢ−型サイクリンにより特異的に活性 化されることができることが示された。ｃｄｃ２５ホスファターゼ及びＢ−型サ イクリンが直接相互作用すること、及びサイクリンＢが多機能タンパク質の種類 であり、Ｍ−相ｃｄｃ２のための調節サブユニットとしての認められた役割の他 に、ｃｄｃ２５ホスファターゼのアクチベータとしての以前に知られていない驚 くべき役割を果すことも初めて示された。さらに出願人は、クセノブス（Ｘｅｎ ｏｐｕｓ）の場合減数分裂成熟（ｍｅｉｏｔｉｃ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）又は 初期胚分裂周期（ｅａｒｌｙ　ｅｍｂｒｙ。

ｎｉｃ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｃｙｃｌｅ）の間にｃｄｃ２５の量が変化しないこ と、ｃｄｃ２５が細胞周期依存的方法でｃｄｃ２／サイクリンＢ複合体と物理的 に会合すること、ｃｄｃ２５とｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢ複合体の間の最大 会合が（ｃｄｃ２の）最大キナーゼ活性の直前あるいはその時点に起こること、 及びｃｄｃ２５と会合したｃｄｃ２がチロシン脱リン酸化され、キナーゼを活性 化することを示した。さらに本明細書に記載の研究の結果、クセノブスの場合、 サイクリンがＭＰＦの活性化及び不活性化の各回で合成されねばならない唯一の タンパク質であることが現在明らかである。プレーＭＰＦが活性化される前にサ イクリンが臨界しきい値まで堆積しなければならないことが以前に提示された。

しかし本明細書に記載の研究に基づき、このしきい値は継続的に存在するｃｄｃ ２５ホスファターゼの活性化（それが今度はプレーＭＰＦのキナーゼ活性を賦活 する）に十分なサイクリンＢが堆積した点を示していると示唆するのは合理的な ことである。

又、本明細書に記載の通り新規に発見されたｃｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ２５Ｂ遺伝 子産物のアミノ酸配列と既知のチロシンタンパク質ホスファ９−ゼ（ＰＴＰアー ゼ）及び細胞周期に含まれる他のタンパク質のアミノ酸配列の比較の結果、驚く べき観察が成された。すなわちｃｄｃ２５の推定触媒ドメインの直Ｃ−末端（ｉ ｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ　Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）の領域は他の既知のＰＴＰアー ゼのそれと関連性が高くないことが示された。特に興味深いのは、ＰＴＰアーゼ 内のこの領域はサイクリン、特にＢ−型サイクリンと類似の配列を含み、ｃｄｃ ２５タンパク質は同等の“サイクリン領域”を持たないという事実である。新規 に見いだされたサイクリン領域はＰＴＰアーゼ及びｃｄｃ２５タンパク質の触媒 機能に含まれるドメインとほとんど直接隣接している。これらの発見、特にｃｄ ｃ２５タンパク質がサイクリン及び他のＰＴＰアーゼが共有する活性化ドメイン であり得るモチーフを持たないという観察の結果として、ｃｄｃ２５の場合は活 性化ドメインがサイクリンとの分子間相互作用により“インドランスで（ｉｎ　 ｔｒａｎｓ）”与えられることを示唆するのは合理的である。

本明細書に記載の研究の結果、真核細胞の細胞周期を調節する、特に細胞周期で 重要な役割を果すチロシン特異的ホスファターゼの活性を調節する新規な方法を 利用することができる。出願人の発明は、チロシンホスファターゼ、特にｃｄｃ ２５ホスファターゼ及びＢ−型サイクリンの活性及び／又は量の変更による、又 はＭＰＦの成分の相互作用、特にｃｄｃ２５とサイクリン、ｃｄｃ２又はｃ　ｄ 　ｃ　２／サイクリンＢ複合体の会合の変更による細胞周期の調節、及び特にｃ ｄｃ２−キナーゼの活性化の調節の方法に関する。本発明は又、細胞周期を調節 する（阻害又は促進）方法で有用な薬剤又は組成物に関する。そのような薬剤又 は組成物は、例えばチロシン特異的ＰＴＰアーゼ（特にｃ　ｄ　ｃ　２５）の触 媒活性の阻害剤（低分子量ペプチド又は有機又は無機化合物）、チロシン特異的 ＰＴＰアーゼとサイクリン又はサイクリン／　ｃ　ｄ　ｃ　２複合体の相互作用 あるいは結合を妨げる阻害剤、又はＰＴＰアーゼの触媒活性を直接妨げる薬剤で ある。

出願人の発明は又、ｃｄｃ２５ＡＳｃｄｃ２５Ｂ及びｃｄｃ２５多重遺伝子族の 他のメンバー、ならびに特に哺乳類（例えばヒト）起源のＣｄｃ２５族の他のメ ンバーの同定に有用な方法及び薬剤（例えば核酸プローブ、抗体）に関する。

出願人の発明は、プレーＭＰＦのキナーゼ活性の賦活を変更する（促進又は阻害 ）、及びかくしてＭＰＦの活性化ならびに有糸分裂への突入を変更する（促進又 は阻害）化合物あるいは分子を同定する方法も含む。

か（して本方法は細胞周期の調節のために投与することができる薬剤の同定を可 能にし、そのような薬剤も本発明の主題である。

本方法は細胞周期−特異的標的を利用し、か（して有糸分裂を変更する薬剤（化 合物又は分子）、特に抗分裂剤に関する特異性の高い機構に基づ（スクリーニン グを可能にする。本方法に場合、必須の細胞周期−調節成分であるＣｄＣ２５（ 例えばＣｄＣ２５Ａ、ＣｄＣ２５Ｂさらに特定すると、ＣｄＣ２５チロシンホス フアターゼ活性を阻害するその能力に関して評価される薬剤を、ＣｄＣ２５及び ＣｄＣ２５チロシンホスフアターゼ活性の基質と組み合わせる。得られた組み合 わせをＣｄＣ２５が基質に作用するのに適した条件下に保つ。その後評価される 化合物が存在する場合にＣｄＣ２５が基質に作用したかどうかを決定し、化合物 の存在下でＣｄＣ２５が基質に作用する程度を化合物の不在下でＣｄＣ２５が基 質に作用する程度と比較する（参照標準との比較で）。化合物の存在下でＣｄＣ ２５の活性が低かったら、化合物はＣｄＣ２５の阻害剤である。

さらに、抗分裂剤の可能性のある薬剤（すなわち抗分裂効果に関して評価するべ き薬剤）を、ＣｄＣ２５タンパク質又は融合タンパク質（例えばＣｄＣ２５がグ ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの第２成分と結合している２成分融合 タンパク質中に存在する組み換えｐ８０ｅ′″′）のいずれかであるＣｄＣ２５ と組み合わせる。その後抗分裂剤の可能性のある薬剤のＣｄＣ２５のホスファタ ーゼ活性への影響を決定する。本明細書に記載の通り　ｓ　□　ｃｄｔ２ｓタン パク質はｐ−二トロフェニルホスフエートホスファターゼ活性を有することが示 されている。かくして試験中の薬剤のＣｄＣ２５への阻害効果を、基質としてｐ −ニトロフェニルホスフェート又は不活性サイクリン／　ｃ　ｄ　ｃ　２を用い て評価することができる。得られた結果（例えばＣｄＣ２５ホスフアターゼ活性 の阻害の程度）は、細胞のＭ相への突入の制御におけるその直接的な役割の故に 抗分裂剤の検出に特に適している標的への試験中の薬剤の効果を示すので、特に 有用である。

図面の簡単な説明 図１はＣｄＣ２５Ａのヌクレオチド配列及びＣｄＣ２５Ｂのヌクレオチド配列で ある。左パネル、ＣｄＣ２５Ａ　ｃＤＮＡの配列（配列番号：１）。右パネル、 ＣｄＣ２５Ｂの配列（配列番号＝３）。ヌクレオチド配列の下は標準的１文字ア ミノ酸コードにおける翻訳である。各配列において推定開始メチオニンに下線を 引いである。ＣｄＣ２５Ａ配の開始ＡＵＧコドンの上流の枠内（ｉｎ−ｆｒａｍ ｅ）停止コドンは太字体であり、各配列において停止コドンは星印で示す。

図２はＣｄＣ２５タンパク質の相同性を示す。ＣｄＣ２５Ａ及びＣｄＣ２５Ｂの アミノ酸配列をＦＡＳＴＡプログラムを用いてヒトｃｄｃ２５Ｃ（正式にはＣＤ Ｃ２５Ｈｓ）、ｓｔｒｉｎｇ　（Ｓｔｇ）及びＳ．ボンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）Ｃ ｄＣ２５　（２５Ｓｐ）と並べた。同一のアミノ酸を四角で囲む。特定の部位に おいて２つのアミノ酸が交替している場合も四角を用いた。配列内のダッシュ記 号は最適整列を形成するためにコンピューターにより作られた各アミノ酸のギャ ップを示す。

図３はヒトｃｄｃ２５Ａが有糸分裂に必須であることの証明を与える。

図３Ａは、時間０においてアフィニティー精製抗−ｃｄｃ２５Ａ抗体を微量注射 したＨｅＬａ細胞の集団の分裂指数のグラフ図である。参照標準細胞には、前免 疫血清のＩｇＧ画分を微量注射した。図３Ｂは、時間０において参照標準又は実 験抗ｃｄｃ２５Ａアフィニティー精製抗体を注射したＨｅＬａ細胞の島中の細胞 の概数のグラフ図である。

図４は有糸分裂サイクリンによるＣｄＣ２５Ａホスフアテーゼの活性化を示す。

ヒトＧＳＴーｃｄｃ２５Ａ融合タンパク質を３２ｐの遊離のアッセイに用い、基 質はチロシンリン酸化、還元カルボキシアミドメチル化、マレイル化（ｍａｌｅ ｙｌａｔｅｄ）リゾチーム（ＲＣＭＬ）（Ａ）、ＣｄＣ２−由来ペプチド（Ｂ） 、又はＰＮＰＰ　（Ｃ）であった。

Ａ４１０は４１０ｎｍにおける吸収を示す。

図５はサイクリンＢ１によるＣｄＣ２５Ａの投薬量依存性活性化のグラフ図であ る。棒は３回の実験における標準偏差を示す。

図６はｐ１３　（Ｓｕｃｌ）によるＣｄＣ２５ホスフアターゼ活性の阻害を示す 。左パネルにおいてＣｄＣ２５Ａ（１０ピコモル）及び右パネルにおいてＣｄＣ ２５Ｂ　（１０ピコモル）を用いた。棒は３回の独立した実験における標準偏差 を示す。

図７はＣｄＣ２５タンパク質、ＰＴＰアーゼ及びサイクリンの整列、ならびにＰ ＴＰアーゼ及びＭ−相キナーゼならびにＣｄＣ２５ホスフアターゼの間に提案さ れた関連性のモデルを示す。パネルＡは整列を示し、そこにおいてＣＡはＣｄＣ ２５及び細胞質チロシンホスファターゼの推定触媒ドメインを示し、ＣＲはチロ ノンホスファターゼに存在するがＣｄＣ２５タンパク質に存在しないサイタリン 関連ドメインを示す。パネルＢはＰＴＰアーゼならびにＭ−相キナーゼ及びＣｄ Ｃ２５ホスフアターゼの間の仮定的関連性の略図を示す。

図８はクセノブスｃｄｃ２５がＭ−相キナーゼの活性化に必要であることを示す グラフ図である。前期卵母細胞抽出物の硫酸アンモニウム画分をＰＢＳ−２％Ｂ ＳＡ　（黒菱形）、前免疫抗−ｃｄｃ２５血清（白丸、白菱形）又は精製抗−ｃ ｄｃ２５抗体（黒四角、白四角）の存在下でインキュベートした。２つの場合（ 白菱形、白四角）、バクテリア発現可溶性酵母ＣｄＣ２５タンパク質（１００ｍ ｇ／ｍ１）を加えた（矢印で示す）。

図９はＣｄＣ２５とｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢの周期的な物理的会合を証明 するグラフ図である。黒四角はｐ１３−セファロース沈澱物のヒストンＨ１キナ ーゼ活性を示し、白四角は抗−ＣｄＣ２抗体を用いたプロットにより抗−ＣｄＣ ２５免疫複 す。

図１０は不活性プレーＭＰＦ　（Ｇ２）の活性ＭＰＦ（Ｍ相）への活性化のｐ　 ８　０　””による制御の略図である。

図１１はＧＳＴ−ＣｄＣ２５ａ融 酸化し、Ｍ相−特異的Ｈ１キナーゼ（ＭＰＦ）を活性する証拠である。

図１２はＧＳＴ−ＣｄＣ２５Ａ濃 アッセイの持続時間の関数として（図１２Ｂ）のＧＳＴ−ＣｄＣ２５−ｐＮＰＰ ホスファターゼ活性のグラフ図である。

図１３ｔＪＤＴＴｆｉ度（図１３Ａ）　及びｐ−ＮＰＰ濃度（（Ｎ１３Ｂ）の関 数としてのＧＳＴ−ＣｄＣ２５ａ活性のグラフ図である。

図１４はＧＳＴ−ＣｄＣ２５Ａチロシンホスフアターゼへのナトリウムオルトバ ナデートの阻害効果のグラフ図であり、ホスファターゼ活性をバナデートの不在 下における活性の％として表す（平均±ＳＤ）。

本発明は細胞骨 裂の調節（阻害又は促進）の方法及び細胞周期の調節に有用な薬剤又は組成物に 関する。さらに本発明はチロシン−特異的ホスファターゼをコードするｃｄｃ２ ５Ａ及びｃｄｃ２５Ｂと呼ばれる２つのヒト遺伝子、コードされるチロシン−特 異的ホスファターゼ、及びｃｄｃ２５多重遺伝子族の別のメンバー、特に別のヒ トｃｄｃ２５遺伝子、ならびにそれらのコード産物に関する。さらに本発明はキ ナーゼ活性の賦活を変更し、か（して細胞の有糸分裂への突入を変更する薬剤の 同定の方法に関する。

本発明はｃｄｃ２５タンパク質又は組み換えヒトｃｄｃ２５チロシンホスファタ ーゼなどのｃｄｃ２５チロシンホスファターゼを細胞周期−特異的標的として用 い、有糸分裂への突入（後期Ｇ２からＭ相への経過）を変更する化合物をスクリ ーニングするためのアッセイにも関する。出願人の発明は新規なｃｄｃ２５遺伝 子の同定、及びｃｄｃ２５タンパク質がＢ−型サイクリンと直接相互作用し、特 異的に活性化され、ｃｄｃ２キナーゼを活性化するという発見に基づいている。

　出願人はｃｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ２５Ｂと名付けられる２つのヒトｃｄｃ２５ 遺伝子を単離し、ヒトｃｄｃ２５が少なくとも３つのメンバーの多重遺伝子族で あることを確立した。３つのヒトｃｄｃ２５タンパク質（ｃｄｃ２５Ａ。

ｃｄｃ２５Ｂ及び以前に同定されたｃｄｃ２５タンパク質）は最も保存されてい るＣ−・末端領域に約４０％の同一性を有することが示された。

ｃｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ２５Ｂタンパク質は多様な独立した基準によりｃｄｃ２ ５タンパク質として分類することができる。　本明細書に示す通り、ｃｄｃ２５ Ａ遺伝子産物及びｃｄｃ２５Ｂ遺伝子産物は試験管内で内在性チロシンホスファ ターゼ活性を有し、それはｃｄｃ２の不在下でサイクリンＢ１又はサイクリンＢ ２により数倍に賦活される。やはり本明細書に示す通りヒト細胞、特にＨｅＬａ 細胞においてｃｄｃ２５Ａ及びサイクリンＢｌ／ｃｄｃ２の間に安定な会合が起 こる。これらの発見はＢ−型サイクリンが多機能タンパク質であり、Ｍ−相調節 サブユニットであるのみでなく　ｃｄｃ２５チロシンホスファターゼも活性化し 、それが今度はｃｄｃ２に作用することを示している。　サイクリン及び細胞質 チロシンホスファターゼの間のアミノ酸類似性の領域を同定し、Ｃｄｃ２５ホス ファターゼに存在しないことを示し、共通のモチーフが活性化ドメインを与えて おり、それはｃｄｃ２５−サイクリンＢ分子内相互作用によりｃｄｃ２５に与え られねばならないことを示唆した。特にｃｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ２５Ｂを既知の チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）及び細胞周期制御に含まれる他のタン パク質と視覚により比較し、ｃｄｃ２５の推定ｃｄｃ２５触媒ドメインの直Ｃ− 末端の領域が他の既知のＰＴＰアーゼと関連性が高くなく、ＰＴＰアーゼ内のこ の新規に見いだされたモチーフは特にＢ−型のサイクリンと配列類似性を含むと いう予想に反した観察を得た。ｃｄｃ２５同族体及び多様な群のタンパク質チロ シンホスファターゼ（ＦＴＰ）のアミノ酸配列の整列は、約２００アミノ酸残基 のＣ−末端フラグメントが保存タンパク質モチーフであり、提案されたウィルス 及び哺乳類ＰＴＰアーゼの触媒中心と類似していることを示した（実施例１及び 図２を参照）。

出願人は、２つの新規なヒトｃｄｃ２５遺伝子が分裂酵母ｃｄｃ２５によりコー ドされるタンパク質と機能的に関連するタンパク質をコードすることを示した（ 実施例２）。ヒト細胞は抗−ｃｄｃ２５Ａの微量注射の後、“ラウンデドアップ （ｒｏｕｎｄｅｄ　ｕｐ）”有糸分裂状態で休止し、ヒトｃｄｃ２５遺伝子の１ つ（ｃｄｃ２５Ａ）はヒト細胞における有糸分裂で働くことが示された（実施例 ３）。かくして出願人は、ＰＴＰアーゼが細胞分裂に必要であることを初めて示 し、又出願人は細胞分裂が抗−ｃｄｃ２５Ａ抗体により阻害され、これは従って 細胞毒性５Ａ及びｃｄｃ２５Ｂタンパク質の内在性ホスファターゼ活性はｃｄｃ ２の不在下でＢ−型サイクリンを化学量論的に加えることにより直接活性化され ることも示され（実施例４及び５）、Ｂ−型サイクリンが細胞分裂のこの段階で 多機能的役割を有することが示された。これは、ｃｄｃ２５のアクチベータとし てのその役割におけるサイクリンの間の特異性を明白に示している。この発見ま で多様な系列の証拠により、異なる種類のサイクリンが細胞分裂の特定の段階で 特異的役割を有することが示唆されていたが、ｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリン族の メンバーの間の基質特異性の差を示すことが困難であることがわかっていた。ｃ ｄｃ２５Ａタンパク質はサイクリンＢ１及びｃｄｃ２の両者との複合体中に存在 することが示された（実施例５）。

出願人はクセノプス卵母細胞がｐ７２と名付けられたｃｄｃ２５の関連物を含み 、それは試験管内でＭ−相キナーゼを直接賦活することができ、無細胞ライセー ドにおけるＭ−相キナーゼの活性化に必須であることも決定した。本明細書に記 載の通り、ｐ７２の存在量は細胞周期の間のクセノブス胚において変化しない。

ｐ７２は細胞周期依存的方法でＣｄｃ２／サイクリンＢと直接会合し、Ｍ−相で ピークに達することが示された。ｐ７２と会合したＭ−相キナーゼはチロシン脱 リン酸化されており、触媒活性であることが示された。結果として、ｃｄｃ２５ とサイクリンＢ／ｃｄｃ２複合体の間の周期的物理的会合を含む機構によりＣｄ ｃ２５がｃｄｃ２の活性化の引金を引くこと、及び必要なのはｃｄｃ２／サイク リンＢとｃｄｃ２５の間の会合であることを結論するのは合理的なことである。

有糸分裂制御はｃｄｃ２５遺伝子の転写調節以外の機構により行うことができる と結論するのも合理的である。

細胞分裂におけるｃｄｃ２５の役割に関する出願人の発見の結果としてここでｃ ｄｃ２５を細胞周期特異的標的として用い、細胞が細胞成長の有糸分裂相に突入 するのを変更する化合物に関してスクリーニングするアッセイを利用することが できる。アッセイの結果（すなわち試験中の化合物がｃｄｃ２５を阻害する能力 ）は、比色測定などの既知の方法で、イムノアッセイ法で、又は酵素活性の検出 により（例えばヒストンキナーゼ活性）決定する。

以下は出願人による１つの新規なヒトｃｄｃ２５遺伝子の単離及び特性化：有糸 分裂におけるＢ−型サイクリンの多機能的役割の証明：ＰＴＰアーゼ及びサイク リンに存在するがｃｄｃ２５に存在しない共通のアミノ酸配列又はモチーフの予 期せぬ観察、及び提案されたウィルス及び哺乳類ＦＴＰの触媒中心にモチーフが 類似していることの決定；　ｃｄｃ２５ホスファターゼとＢ−型サイクリンの間 の特異的相互作用の証明。

及びクセラプス卵母細胞中のｃｄｃ２５の量が細胞周期の間に変化しないことの 証明につき記載する。記載の研究の結果、細胞周期調節のための新規な方法及び 組成物、ならびに細胞周期調節を変更する化合物に関するアッセイが利用できる 。これらの方法、組成物、アッセイも下記に記載する。

多重遺伝子族のメンバーである２つの新規なヒトｃｄｃ２５遺伝子の単離及び特 性化 ２つの新規なヒトｃｄｃ２５遺伝子を単離し、ヒトにおいてｃｄｃ２５が少な（ とも３つのメンバーを含む多重遺伝子族である事実を確立した。３つのヒトｃｄ ｃ２５タンパク質は最も保存されたＣ−末端領域に約４０％の同一性を共有する 。２つの新規に見いだされたｃｄｃ２５遺伝子であるｃｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ２ ５Ｂは、全く独立した多様な基準によりｃｄｃ２５タンパク質として分類するこ とができる。第１にこれらは族の他のメンバーとの配列類似性を共有している。

第２にｃｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ２５Ｂはそれぞれ分裂酵母の突然変異ｃｄｃ２５ −２２株を救済することができる。第３に、ｃｄｃ２５Ａタンパク質の一部を含 むペプチドに対して調製された抗体を増殖ＨｅＬａ細胞に注射すると、有糸分裂 中に休止を起こす。第４に、免疫複合体から溶離したｃｄｃ２５Ａタンパク質は ｃｄｃ２の潜在ヒストンキナーゼ活性を活性化することができる。第５に、Ｅ、 コリから精製したｃｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ２５Ｂの両者は内在性チロシンホスフ ァターゼ活性を示す。

ｃｄｃ２５多重遺伝多重 遺伝子連り、ここでヒトの場合少なくとも３つ、おそらくそれ以上のｃｄｃ２５ 遺伝子があることが示された。分裂酵母の場合、現在までに必須のｃｄｃ２５遺 伝子が１つだけ同定されている（Ｒｕｓｓｅｌｌ。

Ｐ、ａｎｄ　Ｐ、Ｎｙｒｓｅ、Ｃｅ１ｌ　４５：１４５−１５３　（１９８６） ）。同様にこの酵母において１つの必須の有糸分裂Ｂ−型サイクリンが記載され ている（Ｂｏｏｈｅｒ、Ｒ，ａｎｄ　Ｄ、Ｂｅａｃｈ。

ＥＭＢＯＪ、ユニ　２３２１−２３２７　（１９８８）’）。カエル及びヒトの 両者の場合、２つの有糸分裂Ｂ−型サイクリンが見いだされている（Ｍｉｎｓｈ ｕｌｌ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　旦６：９４７−９５６　（１９８９）） 。おそら（ｃｄｃ２５及びＢ−型サイクリン族の別のメンバーには生体内での機 能にい（らがの分化がある。多重Ｂ−型サイクリンが見いだされた発芽酵母にお ける遺伝研究は、これが真実であるといういくつかの一般的暗示を与える（Ｓｕ ｒａｎａ、Ｕ、ｅｔ　ａ±、、Ｃｅ１１　６５＋１４５−１６１　（１９９１） ；Ｇｈｉａｒａ。

Ｊ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６５：１６３−１７４（１９９１））。

しかしサイクリンＢ１及びＢ２は両方弁試験管内でｃｄｃ２５Ａを活性化するこ とができた。異なるヒトｃｄｃ２５遺伝子は異なるサイクリンＢ／ｃｄｃ２複合 体を生体内で活性化すると仮定することができ、これにより抗−ｃｄｃ２５Ａ血 清をＨｅＬａ細胞に注射すると開期ではなく中期−有糸分裂（ｍｉｄ−ｍｉ　ｔ ｏｓ　ｉｓ）における休止を起こす理由を説明することができる。

チロシンリン酸化によるｃｄｃ２の調節は現在ｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢ酵 素に関して記載されているのみであることに注意しなければならない。しかしあ る意味で、サイクリンＢをサイクリンＡで置換することが可能であり（Ｓｗｅｎ ｓｏｎ、に、１．、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ戟ユニ８６１−８７０　（１９８６ ）　；Ｐｉｎｅｓ、Ｊ、ａｎｄ　Ｔ、Ｈｕｎｔ、ＥＭＢＯＪ、旦：　２９８７− ２９９５　（１９８７））　、実際にヒトサイクリンＢ２が発芽酵母のｃｎ−欠 失株を救済するその能力の故に単離された（Ｘｉｏｎｇ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃ ｅ１ｌ　６５：６９１−６９９　（１９９１））。本明細書に記載の研究ではサ イクリンＡはｃｄｃ２５Ａ又はｃｄｃ２５Ｂを活性化することはできなかった（ 示していない）。しかしこれはサイクリンＡにより特異的に活性化されることが できる未発見のｃｄｃ２５−関連ホスファターゼの存在を排除するものではない 。サイクリンＡと結合することができる（Ｔｓａｉ、Ｌ−Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎ ａｔｕｒｅ　３５３：１７４−１７７　（１９９０４３（１９９１）；Ｅｌｌｅ ｄｇｅ、Ｓ、Ｊ、ａｎｄ　Ｍ、Ｒ，Ｓｃｏｔｔｓｗｏｏｄ、ＥＭＢＯＪ、よＯ： 　２６５３−２６５９　（１９９１））などのｃｄｃ２の関連物がチロシンリン 酸化による調節を受け、従って活性化にｃｄｃ２５関連物が必要であるのかどう がも現在未知である。

有糸分裂におけるＢ−型サイクリンの多機能的役割本明細書に記載する特に衝撃 的な観察は、Ｅ、コリがら精製されたＣｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ２５Ｂタンパク質 の内在性ホスファターゼ活性をＢ型サイクリンの化学量論的添加により直接活性 化することができるという証明である。この効果の特異性は、サイクリンＡ又は サイクリンＤ１のいずれもそのような賦活を示すことができないということによ り示される。多様な系列の証拠が、異なる種類のサイクリンは分裂周期の特定の 段階で特異的役割を有することを示唆している（Ｂｏｏｈｅｒ、Ｒａｎｄ　Ｄ、 Ｂｅａｃｈ、ＥＭＢＯＪ　旦：３４４１−３４４７　（１９８７）；Ｂｏｏｈｅ ｒ、Ｒ，ａｎｄ　Ｄ、Ｂｅａｃｈ、ＥＭＢＯＪ７：２３２１−２３２７　（１９ ８８）：Ｎａ５ｈ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、。

ＥＭＢＯＪ、７：４３３５−４３４６　（１９８８）；Ｈａｄｗｉｇｅｒ、Ｊ、 Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ　Ｓｃｉ。

ＵＳΔ　８６：６２５５−６２５９　（１９８９）；Ｒｉｃｈａｒｄｓ。

ｎ、Ｈ，Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５９：１１２７　１１３３１±、、Ｃｅ １ｌ　６１：２２５−２３７　（１９９０）；Ｄｒａｅｔｔａ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ 、、Ｃｅ１ｌ　５旦：８２９−８３８　（１９８９）ｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１　６ ５：６９１−６９９（１９９１）；Ｌｅｗ。

Ｄ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌｌ、Ｃｅ１ｌ　６６：１−１０（１９９１）；Ｋ。

ｆｆ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　８８：１−２０（１９９１））。

しかし試験管内でｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリン族のメンバー間の基質特異性の差 を示すのは困難であり、すべての既知のサイクリンは発芽酵母のＣＬＮ−欠失株 を救済することができることが証明された。本実験はｃｄｃ２５のアクチベータ としてのその役割における異なるサイクリン間の特異性を鮮明に示す。

遺伝的及び生化学的両方のある種の証拠がｃｄｃ２がｃｄｃ２５ボスファターゼ の生理学的基質であることを示唆している（Ｇｏｕｌｄ、Ｋ。

ａｎｄ　Ｐ、Ｎｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：３９−４５　（１９８９）； Ｋｕｍａｇａｉ、Ａ、ａｎｄ　Ｗ、Ｇ、Ｄｕｎｐｈｙ、Ｃｅｌ　ｌ旦４：９０３ −９１４　（１９９１）：５ｔｒａｕｓｆｅｌｄ、Ｕ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３５１：２４２−２４５　（１９９１）；Ｇａｕ ｔｉｅｒ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６７：１９７−２１１（１９９１）） 。ｃｄｃ２はサイクリンと結合し、かくしておそらくホスファターゼ基質として 改変されるので、本研究の場合ｃｄｃ２を基質として用いず、従ってｃｄｃ２５ の基質特異性の結果に直接は踏み込まなかった。しかし特にＢ−型サイクリンに よるｃｄｃ２５の活性化の発見は、ｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢが生体内にお ける関連基質であるという結論を強めた。人工のＰＴＰアーゼ基質を用いた時の ｃｄｃ２５の活性化の証明は、サイクリンがｃｄｃタンパク質の全体的不在下で ｃｄｃ２５と相互作用することができるという結論に導く。試験管内では、この 相互作用がｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢ　ブレーＭＰＦ複合体と関連して起こ ることが予想される。上記の研究は、Ｂ−型サイクリンが少なくとも２つの役割 を有することを示す。第１にこれはｃｄｃ２と化学量論的に４３６２−４３６６ 　（１９８９））及び触媒サブユニットの細胞内局在（Ｂｏｏｈｅｒ、Ｒ，Ｎ、 ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５８：４８５−４９７　（１９８９））を調節する。

第２にこれはｃｄｃ２５　ＰＴＰアーゼの活性化という独立した機能を有すると 思われる。

分裂酵母及びドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌ　ａ）における遺伝研究は 、ｃｄｃ１３コードＢ−型サイクリンがＭ−相に必須であるが投薬量依存性アク チベータとして作用しないのに、ｃｄｃ２５は有糸分裂の投薬量依存性アクチベ ータであることを示している（Ｒｕｓｓｅｌｌ。

Ｐ、ａｎｄ　Ｐ、Ｎｕｒｓｅ、Ｃｅ１ｌ　４５：１４５−１５３（１９８６）＋ Ｅｄｇａｒ、Ｂ、Ａ、ａｎｄ　Ｐ、Ｈ，Ｏ’　Ｆａｒｒｅｌｌ。

Ｃｅ１ｌ　５７：１７７−１８７（１９８９））、実際に分裂酵母を含む多くの 細胞型においてＢ−型サイクリンはＭ−相の開始時のチロシン脱リン酸化の現象 のずっと前に堆積し、ｃｄｃ２と会合する（ｂｏｏｈｅｒ、Ｒ，Ｎ、ｅｔ　ａｌ 、、Ｃｅ１ｌ　５旦：４８５−４９７　（１９８９））。い（つかの体細胞型に おいてｃｄｃ２５遺伝子は転写調節下にあり、ｃｄｃ２５タンパク質自身が現在 は理解されていない多様な方法で調節されている可能性が高い。クセノブスの初 期の胚の場合、いくらか異なる状況が占めている。本明細書に示す通り、ｃｄｃ ２５の存在量は細胞周期の間に不変である。サククリンがＭＰＦの活性化及び不 活性化の各回で合成しなければならない唯一のタンパク質である（Ｍｕｒｒａｙ 、　Ｗ、　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９：２８０２８６（１ ９８９））。これに関連して、プレーＭＰＦが活性化される前にサイクリンが臨 界しきい値まで堆積しなければならないことが提唱された（Ｅｖａｎｓ、　Ｔ、 　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｃｅ１ｌ　３３＋３８９−３９６且工、、Ｃｅｌ　Ｉ　５ ６＋９４７−９５６　（１９８９）；Ｍｕｒｒａｙ。

Ａ、　Ｗ、　ａｎｄ　Ｍ、　Ｗ、　Ｋｉｒｓｈｎｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９ ：２８０−２８６　（１９８９）　）。本明細書に記載の研究に基づき、このし きい値は継続的に存在するｃｄｃ２５ホスファターゼの活性化に十分なサイクリ ンが堆積した点を示すと思われる。

本発見はＭＰＦの自己活性化に関する長い間不明瞭であった現象に光を投するこ とができる。少量のＭＰＦをカエルの卵母細胞に注射すると、その後ずっと大量 を回収することができる（Ｍａｓｕｉ、Ｙ、ａｎｄＣ，Ｌ、Ｍａｒｋｅｒｔ、Ｊ 、Ｅｘｐ、Ｚｏｏｌ、上７１　：１２９−１４６　（１９７１）＋３ｍ１ｔｈ、 Ｌ、Ｄ、ａｎｄ　Ｒ，Ｅ、Ｅｃｋｅｒ。

Ｄｃｖ、Ｂｉｏｌ、２５：２３２−２４７　（１９７１））。本研究は、この状 況においてｃｄｃ２、サイクリンＢ及びｃｄｃ２５の存在量が変わらないことを 示す（Ｇａｕｔｉｅｒ、Ｊ、ａｎｄ　Ｊ、Ｍａｉｌｅｒ。

ＥＭＢＯＪ、１０：１７７−１８２（１９９１）：実施例１１も参照）。

活性ｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢはあるタンパク質をリン酸化しくおそらくｃ ｄｃ２５自身）、ｃｄｃ２５の活性化を起こし、かくしてブレーＭＰＦをさらに 活性化することが絶対的に仮定されてきた。これは正しいかも知れないが、本明 細書に示す通りサイクリンＢがｃｄｃ２の不在下でｃｄｃ２５を直接活性化する 場合、自己活性化ループに必要な要素のすべてがｃｄｃ２、サイクリンＢ及びｃ ｄｃ２５タンパク質自身の間に存在する。

ＰＴＰアーゼ及びサイクリンにおける共通のモチーフｃｄｃ２５タンパク質、Ｐ ＴＰアーゼ及びサイクリンを図７Ａに示す通り整列させた。チロシンホスファタ ーゼは互いにＧｕａｎ、に、ｅｔ」四、　（Ｎａｔｕｒｅ　３５０：３５９−３ ６２　（１９９１））に記載の通りに、及びｃｄｃ２５タンパク質はＧａｕｔｉ ｅｒ、Ｊ、ｅｔ−見上、、（Ｃｅｌｌ　６ユ：１９７−２１１　（１９９１）） に記載の通りに整列させた。サイクリンの整列は視覚検分により行った。１つの 遺伝子族の少なくとも３つのメンバー内、及び他の族の最低２つのメンバー内の 同−性又は類似性（Ｖ又はＩ）のみを四角で囲んである。ｃｄｃ２５Ａ及びＢと 既知のチロシンＰＴＰアーゼ、ならびに細胞周期の制御に含まれる他のタンパク 質の視覚による比較は、以下の予想に反した観察を与えた。第１に、ｃｄｃ２５ の推定触媒ドメイン（ＣＡ）の直Ｃ−末端である領域は、高級真核生物からの細 胞質ＰＴＰアーゼ及びワクシニアウィルスセリン−チロシンホスファターゼなど の他の既知のＰＴより興味深いことに、ＰＴＰアーゼ内のこの領域はサイクリン 、特にＢ−型への配列類似性を含むことが見いだされた（図７Ａ）。類似性はま さにいわゆるサイクリン−ボックス（ｃｙｃ　１１ｎ−ｂｏｘ）の連結部で検出 され、サイクリンの間のいくつかのほとんど不可変の残基を含んだ。図７への整 列はｃｄｃ２５タンパク質とＰＴＰアーゼ、ならびにＰＴＰアーゼとサイクリン の類似性を最適化しているが、３つの群のタンパク質のそれぞれの中のより大き な相同性を無視している。サイクリン領域（ＣＲ）と呼ばれるＰＴＰアーゼとサ イクリンの間の類似性の領域において、’ｃｄｃ２５タンパク質に同等領域はな い。

新規に見いだされたモチーフは、ＰＴＰアーゼ及びｃｄｃ２５タンパク質の触媒 機能に直接関連するとされてきた（Ｋｒｕｅｇｅｒ、Ｎ、Ｓ。

ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、９：３２４１−３２５２　（１９９０）：１、Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　↓９２　：　２６２−２６７　（１９９１）；Ｇａｕｔ ｅｒ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６７：１９７　２１１（１９９１））　ド メインｆｆ／ＩＸＨＣＸＸＸＸＲ）にほとんど直接隣接して存在する。この発見 により以下が推測できる。少なくとも本研究で決定して、他のＰＴＰアーゼの触 媒活性はｃｄｃ２５の活性よりかなり大きい。ｃｄｃ２５はサイクリン及び他の ＰＴＰアーゼが共有するモチーフを持たない。このモチーフは活性化ドメインで あることができ、ｃｄｃ２５の場合それはサイクリンとの分子間相互作用により “トランス“で与えられるがほとんどのＰＴＰアーゼの場合それは“シス（ｃｉ Ｓ）”で機能する。

ＰＴＰアーゼとすべての種類のサイクリンの間にはい（らかの類似性があるが、 Ｂ−型サイクリンのみがｃｄｃ２５を活性化することができる。しかしＰＴＰア ーゼとＢ型のサイクリンの間で類似性が最大であることは明らかである。種々の サイクリンの種類の間のこの領域内の差は、Ｂがｃｄｃ２５Ａを活性化できるが Ａ又はＤ−型が活性化できない特異的な能力と関連する。

ｃｄｃ２５のサイクリンＢとの特異的相互作用実施例１３に示す通り、ｃｄｃ２ ５はｃｄｃ２複合体と安定に会合し、この相互作用はクセノブスの胚の分裂周期 の間、周期的である。ヒトサイクリンＢ１が実施例５に記載の通りｃｄｃ２５Ａ との複合体において見いだされた。ｃｄｃ２５とｃｄｃ２の間の相互作用の周期 性は少なくとも一部が細胞周期の間のサイクリンの周期的堆積及び分解により媒 介されると思われる。

本明細書に記載の通り、ｃｄｃ２５はＲＣＭＬＳＰＮＰＰ及びｃｄｃ２由来ペプ チド基質に関する酵素として機能できることが確立された。

観察された低い触媒反応速度は明らかであり、人工の基質としてＲＣＭＬ又はペ プチドの利用を反映しているかも知れない。しかし生体内でどれだけの触媒反応 速度が必要かは明白でない。本明細書に示されている通りｃｄｃ２５が実際にｃ ｄｃ２／サイクリンＢと会合するならば（実施例９及び図７）　、ＰＴＰアーゼ は従来の触媒反応で機能することはできず、ｃｄｃ２５／サイクリンＢ／ｃｄｃ ２複合体の形成後に初めて機能する。そのような条件下で触媒反応は基本的に分 子内反応であり、Ｍｉ　ｃｈａｅ　ｌ　ｉ　ｓ／Ｍｅｎ　ｔ　ｅｎの速度論は関 与しない。

ｐ１３によるヒトｃｄｃ２５ホスファターゼ活性の阻害５ｕｃｌ遺伝子によりコ ードされるｐ１３タンパク質はｃｄｃ２タンパク質キナーゼの必須サブユニット である。遺伝子は、マルチコピープラスミド上の分裂酵母ｃｄｃ２−３３対立遺 伝子を救済するその能力により単離された（Ｈａｙｌｅｓ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、 ＥＭＢＯＪ、５３３７３−３３７９　（１９８６）’）。しかし遺伝子の過剰発 現は有余９３　（１９８６））。試験管内でｐ１３はプレーＭＰＦの活性化を阻 害することができる（Ｄｕｎｐｈｙ、Ｗ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５４：４２ ３−４３１　（１９８８）：Ｄｕｎｐｈｙ、Ｗ、ａｎｄ　Ｊ、Ｗ。

Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｃｅ１ｌ　５８：１８１−４３１（１９８９））。

本研究は以前に不明瞭であったこれらの研究に関連する２つの論点を明らかにす ることができる。第１に、ｐ１３はサイクリンの不在下でＣｄｃ２と結合するこ とができる（Ｂｒｉｚｕｅｌａ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、。

ＥＭＢＯＪ、６：３５０７−３５１４　（１９８７）：実施例６も参照）が、Ｉ ）１３−セファロースに予備結合したｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢの活性化は 過剰の外因性ｐ１３により阻害され得る（Ｊｅｓｓｕｓ、Ｃ。

０））。対照的に、完全に活性化されたサイクリンＢ／ｃｄｃ２は過剰量する少 なくとも２つの結合部位があることを示唆している。１つはおそら（ｃｄｃ２自 身上の高親和性結合部位であり、ｐ１３−セファロースクロマトグラフィーの非 常に高い効率を説明している。２０μモルの範囲でｐ１３を必要とする低親和性 の他の部位は、完全に活性化されたｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢに影響を与え ないがプレーＭＰＦの活性化を阻害することができる。ｃｄｃ２の全体的不在下 におけるｐ１３によるＣｄｃ２５Ａ内在性ホスファターゼ活性の直接阻害が観察 されたので（実施例６）、第２の結合部位をｃｄｃ２ではなくｃｄｃ２５に帰す ることは合理的である。これはおそらくｐ１３とｃｄｃ２の間の相互作用と全く 異なり不安定な相互作用である。ＰＴＰアーゼ、Ｍ−相キナーゼ及びｃｄｃ２５ ホスファターゼの間の仮定的関係の略図を図７Ｂに示す。Ｃｄｃ２とｐ１３、及 びサイクリンとｃｄｃ２の間の会合は十分に実証されている。ｃｄｃ２５とサイ クリンの相互作用もここで提唱され、ｐ］３はｃｄｃ２５と低親和性相互作用を 有することが提唱される。ＣＡはＰＴＰアーゼの触媒ドメインであり、ＣＲはＰ ＴＰアーゼとサイクリンの類似性の領域である。

第２に、異なる実験に関してｐ１３によるｃｄｃ２５の阻害についての論争がい くつかあった。いくつかの場合にｐ１３は阻害性であり（Ｇａｕｔｉｅｒ、Ｊ、 ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６７：１９７−２１１（１９９１）　）、他の場合に 阻害性でなかった（ｋｕｍａｇａｉ、Ａ。

ａｎｄ　Ｗ、Ｇ、Ｄｕｎｐｂｙ、Ｃｅ１ｌ　６４：９０３−９１４　（１９９１ ））。本明細書に記載の通り、用いられた条件下でｃｄｃ２５Ａはｐ１３により 阻害され、ｃｄｃ２５Ｂは阻害されない。２つのタンパク質は多くの構造的非類 似性の領域を有し、それがこの効果を容易に説驚くべきことに、クセノブスｃｄ ｃ２５は減数分裂成熟の間も初期胚分裂周期の間もその存在量が変動しない。し かしタンパク質は細胞周期依存的方法でＣｄ　ｃ　２／サイクリンＢ複合体と物 理的に会合する（実施例５及び１０を参照）。最大会合は最大キナーゼ活性の直 前又はその時点に見いだされる（実施例１１及び１３、ならびに図９を参照）。

ｃｄｃ２５と会合しているｃｄｃ２はチロシン脱リン酸化されており、ヒストン Ｈ２キナーゼとして活性である。ｃｄｃ２５とｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢ複 合体の間の会合はｃｄｃ２又はサイクリンＢのいずれかにより媒介され得た。本 明細書に記載の通り、Ｂ−型サイクリンはｃｄｃ２の不在下でｃｄｃ２５タンパ ク質の固有のＰＴＰアーゼ活性を直接活性化できることが示された。これは、ｃ ｄｃ２５とｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢ複合体の間の相互作用がおそらくサイ クリンにより媒介されるであろうことを示唆している。

これらの結果は、ｃｄｃ２がＭ−相で活性化される機構に関係がある。

ｃｄｃ２５は本明細書に記載の通り有糸分裂において、ｃｄｃ２のチロシン脱リ ン酸化を起こすように作用する。ＣｄＣ２５とｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢ複 合体の間の物理的直接会合の証明は、この仮定と完全に一致する。Ｍ−相におい てＣｄＣ２の約５％がＣｄＣ２５と会合するという発見は、ある疑問を誘起する 。従来の触媒機構により１分子のＣｄＣ２５がｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢと 結合し、キナーゼを活性化し、その後解離して過程を繰り返すことが可能である 。別の場合１分子のＣｄＣ２５が化学量論的機構で１分子のブレーＭＰＦのみを 活性化することができる。クセノブスの卵の場合、ＣｄＣ２の全体量の一部のみ （Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ａ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ！、１１ ４ニア５５−７６５　（１９９１）に記載の通り細胞のＣｄＣ２含有量の１０％ ）がＭ−相でサイクリンＢと結合し、活性化される。ＣｄＣ２の全体のわずか５ ％が有糸分裂でＣｄＣ２５と会合するという発見は、相互作用がサイクリンＢに より媒介されるとしたらＣｄＣ２と比較してサイクリンＢの存在量が比較的低い ことを反映しているかも知れない。これは、５％というＣｄＣ２５−会合ｃｄｃ ２と比較して、より多量のサイクリンＢ２がＣｄＣ２５と会合して見いだされる （サイクリンＢ２の細胞量全体の１７％）という事実により確証される。さらに ＣｄＣ２５のかなりの部分がこの会合に含まれる（細胞含有量の２０％）。

本発明による他のＣｄＣ２５遺伝子の同定及び細胞周期の調節実施例１及び７の ような本明細書に記載の方法を用い、ヒトＣｄＣ２５遺伝子族の他のメンバー、 及び他の生物のＣｄＣ２５遺伝子を同定し、単離することができ、コード産物も 同様に同定することができる。例えばＣｄＣ２５Ａ遺伝子又はＣｄＣ２５Ｂ遺伝 子のヌクレオチド配列（図１を参照）の全体又は一部を当該技術分野において既 知のハイブリッド形成法又は増幅法で用いることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 ｅｔ　ａｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ、ＮＹ　（１９８９））、例えばＣｄＣ２５Ａ遺伝子又はＣｄＣ２ ５Ｂ遺伝子の全体又は一部であるヌクレオチド配列を用い、ヒト又は非ヒト起源 のＤＮＡライブラリを別のＣｄＣ２５遺伝子に関してスクリーニングすることが できる。この方法で同定されたＤＮＡ配列を発現し、本明細書に記載の方法など により（実験法及び実施例２を参照）その産物をチロシン特異的ホスファターゼ 活性に関して分析することができる。ハイブリッド形成条件は所望通りに変える ことができる。用いられたプローブと正確に相補的なヌクレオチド配列を単離す るべき場合、高又は低緊縮の条件を用いることができ、プローブの配列と関連性 のより低いヌクレオチド配列を単離するべき場合、より低緊縮の条件を用いる。

本発明はＣｄＣ２５Ａ及びＣｄＣ２５Ｂ遺伝子、ならびにｃｄｃ遺伝子の同等遺 伝子を含み、本明細書で用いる同等遺伝子はＣｄＣ２５Ａ又はＣｄＣ２５Ｂ遺伝 子、あるいはいずれかの遺伝子の相補配列の全体又は一部とハイブリッド形成し 、ＣｄＣ２５Ａ又はＣｄＣ２５Ｂ遺伝子産物と実質的に同一の触媒機能を有する チロシンＰＴＰアーゼをコードする核酸配列である。ポリメラーゼ連鎖反応及び 適するように設計されたプライマーを用いて他のｃｄｃ遺伝子を同定することも できる。別の場合抗−ｃｄｃ２５Ａ又は抗−ＣｄＣ２５Ｂ抗物をコードすると思 われるベクター又はＤＮＡ構築物を用いて形質転換した適した宿主細胞で発現さ れた他の（組み換え）ＣｄＣ２５遺伝子産物を検出することができる。本発明の 主題であるＣｄＣ２５Ａ遺伝子、ＣｄＣ２５Ｂ遺伝子及び同等ｃｄｃ遺伝子は、 天然に存在する供給源から得た遺伝子、及び遺伝子工学（クローニング）法によ り、あるいは合成法により生産された遺伝子を含む。下記に記載の通りこれらの 遺伝子を用いてコードされるＣｄＣ２５Ａ，ＣｄＣ２５Ｂ又は他のｃｄｃ遺伝子 産物を生産することができ、今度はそれを用いて産物に特異的な抗体を生産する 、あるいは細胞周期活性化（ＣｄＣ２キナーゼ活性化）を調節することができる 。

本発明はＣｄＣ２５ＰＴＰアーゼに関連しているが非−Ｂ型サイクリン（例えば サイクリンＡ，サイクリンＤにより）により特異的に活性化されるＰＴＰアーゼ をコードするＰＴＰアーゼ遺伝子も含む。これらのＰＴＰアーゼは本明細書でＣ ｄＣ２５−関連ＰＴＰアーゼと呼ばれ、サイクリンによるその活性化、ＣｄＣ２ 又は他の分子を活性化するその能力、及び細胞周期の調節におけるその役割を、 ＣｄＣ２５の役割の決定に関して記載されている方法を用いて評価することがで きる。

本発明は細胞におけるＣｄＣ２５ＰＴＰアーゼの発現又は活性の程度を決定し、 評価することができる（すなわちそれらが増加するか、減少するか、又は正常な 限度内に留まるかどうかを決定する）方法も与える。

ある種の腫瘍の型の場合、ＣｄＣ２５遺伝子が増加する（過剰発現）ので、本発 明はこれらの腫瘍細胞型に関連する過剰発現を診断又は検出する方法も与える。

その方法で、細胞中のＣｄＣ２５遺伝子を検出し、定量するための遺伝子プロー ブ、又はＣｄＣ２５ＰＴＰアーゼに特異的な抗体を用いることができる。

ｃｄｃ２５機能／有糸分裂有余突入を変更する化合物に関するアッセイＣｄＣ２ ５ＰＴＰアーゼの活性化、ＣｄＣ２キナーゼの活性化、かくして有糸分裂（細胞 分裂）の開始の阻害の方法も可能である。例えばＣｄＣ２５とサイクリンＢ又は サイクリンＢ／ｃｄｃ２複合体の複合化を直接又は間接的に阻害し、か（してＣ ｄＣ２５の活性化を直接阻害し、ＣｄＣ２キナーゼの活性化を間接的に阻害する ことができる薬物又は他の薬剤を細胞中に導入することにより、ＣｄＣ２５ＰＴ Ｐアーゼの活性化を阻害する（減少又は防止）。１つの実施態様の場合、ＣｄＣ ２５ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳を防止することなどにより複 合体形成を間接的方法で防止する。これはＣｄＣ２５−コード核酸配列とハイブ リッド形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞中に導入し、かくしてそ れがさらにプロセシングされるのを防止することにより行うことができる。必須 ＣｄＣ２５転写因子を妨害することによりＣｄＣ２５産物の発現を阻害すること も可能である。別の場合、プロテアーゼ又はｃｄｃ’２５遺伝子産物の分解を増 す物質を細胞中に導入してＣｄＣ２５遺伝子産物を分解することにより複合体形 成を防止することができる。どちらの場合も利用できるＣｄＣ２５の量がその他 の場合より減少するという点で効果は間接的である。他の実施態様の場合、他の ＰＴＰアーゼに存在するがＣｄＣ２５に存在しない領域との配列類似性を共有す ることが示され、サイクリンとの分子間相互作用によりＣｄＣ２５にインドラン スで与えられると思われるサイクリンの新規に同定された領域を妨害することに よりＣｄＣ２５ＰＴＰアーゼの活性化を阻害する。

別の実施態様の場合、例えばＰＴＰアーゼと結合してサイクリンとの複合体形成 を防止する（か（してＰＴＰアーゼ活性化を防止する）薬物又は他の薬剤を細胞 中に導入することにより、もっと直接的な方法でＣｄｃ２５ＰＴＰアーゼの活性 化を阻害する。別の場合、他の方法でサイクリンとＰＴＰアーゼの間の物理的会 合を妨害する（例えば挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）により）、あるいは 酵素の触媒活性を崩壊させる薬物又は他の薬剤を細胞中に導入することができる 。これは例えばＰＴＰアーゼ又はサイクリンと結合する抗体の使用により、ある いは内在性Ｂ型サイクリンのようにｃｄｃ２５ＰＴＰアーゼと結合するがＢ型サ イクリンと異なって酵素の活性化を起こさない、又はそれを無能化あるいは分解 させるペプチド又は低分子量有機あるいは無機化合物により行うことができる。

この目的で用いることができるペプチド又は小有機化合物は、Ｂ型サイクリンの アミノ酸配列又は含まれるｃｄｃ　ＰＴＰアーゼのアミノ酸配列の分析に基づく ことができる。それらは例えば結合に必要な残基を含み、その存在が活性化を起 こす残基を排除するように設計することができる。これは例えば結合部位を系統 的にマツピングし、活性化に必要な部位を認識するか又はそれと会合するが活性 化を起こさない分子を設計することにより行うことができる。この目的に関して 特に興味深い１つの部位は、上記の通りｃｄｃ２５ＰＴＰアーゼになく、ｃｄｃ ２５産物とＢ型サイクリンの分子間結合によりインドランスに与えられると思わ れる領域である。この場合少なくとも３つの方法が可能である。第１に、分子（ 例えばＢ型すイクリン上のｃｄｃ２５に関する結合部位を模したペプチド）を細 胞中に導入し、その後分子をｃｄｃ２５と結合させ、そのサイクリンとの相互作 用を阻害することができる。第２に、Ｂ型サイクリン分子と結合するｃｄｃ２５ の領域を模した分子を細胞中に導入し、その後分子をサイクリンと結合させ、ｃ ｄｃ２５−サイクリン複合体形成を阻害することができる。第３に、Ｂ型すイタ リン上の推定活性化ドメインを阻害又は不活性化する分子を細胞中に導入し、か くしてｃ　ｄ　ｃ　ＰＴＰアーゼの活性化を防止することができる。

他の実施態様の場合、ｃｄｃ２５ＰＴＰアーゼの触媒活性の阻害剤を細胞中に導 入する。そのような阻害剤は、ペプチド及び無機又は有機化合物などの低分子量 薬剤である。

本発明は、ｃｄｃ２５タンパク質の機能、又はｃｄｃ２５タンノくり質とサイク リン／　ｃ　ｄ　ｃ　２複合体の結合を阻害する能力に関して化合物あるいは分 子をスクリーニングする方法も含む。例えばｃｄｃ２５遺伝子が発現される本明 細書に記載のような細胞を用いることができる。ｃｄｃ２５タンパク質の機能、 又はサイクリン／　ｃ　ｄ　ｃ　２複合体への結合を阻害する能力に関して評価 される化合物又は分子を、化合物又は分子が細胞中に入るのに適した条件下で細 胞と接触させる。ｃｄｃ２５タンノくり質の阻害、又は複合体形成の阻害は、細 胞の休止あるいは細胞分裂の速度の低下を生ずる。適した参照標準（例えば試験 薬物を加えない同一の型の細胞）の細胞分裂との比較により、化合物又は分子が サイクリンを阻害できるか又はできないことが示される。別の場合、試験管内ア ・ンセイを用いてｃｄｃ２５ＰＴＰアーゼ又はそのサイクリン／　ｃ　ｄ　ｃ　 ２５複合体への結合を阻害することができる化合物又は分子を調べることができ る。この試験管内アッセイの場合、３つの成分（ｃｄｃ２５ＰＴＰアーゼ、サイ クリン及びｃｄｃ２　（後者の２つは個別に、又は開期細胞からの不活性サイク リン／　ｃ　ｄ　ｃ　２複合体などのサイクリン／　ｃ　ｄ　ｃ　２複合体とし て））をｃｄｃ２５阻害剤の可能性のあるものと合わせる。

阻害剤の可能性のあるものの活性は、ｃｄｃ２５がサイクリン又はサイクリン／ 　ｃ　ｄ　ｃ　２複合体と結合するかどうか、あるいはヒストンキナーゼ活性に より証明されるようにｃｄｃ２が活性化されるかどうかを決定することにより評 価する。この方法はＪｅｓｓｕｓ　ｅｔ　ａｌ、（Ｆ４−９７　（１９９０）） の記載を利用しており、その記載事項は引用することにより本明細書の内容とな る。例えばｃｄｃ２５阻害剤に関するアッセイの場合、不活性サイクリン／　ｃ 　ｄ　ｃ　２複合体をウェルに入れ、ｃｄｃ２５及び試験化合物又は分子をウェ ルに加え、ｃｄｃ２の活性化を評価する。ｃｄｃ２５の阻害剤の存在下でｃｄｃ ２の活性化は防止されるか、あるいは低下する（試験化合物又は分子の不在下で 起こるより低く）。

現存する化合物又は分子（例えば発酵ブロス又は化学的”ライブラリ”に存在す るもの）、あるいはそのタンパク質キナーゼのサイクリン活性化を阻害するため に開発された化合物又は分子を、この方法を用いてその有効性に関してスクリー ニングすることができる。ｃｄｃ２５タンパク質触媒活性を阻害する、複合体形 成を阻害する、又はｃｄｃ２５を分解するかあるいは不活性化する薬物も本発明 の主題である。

本発明は、ｃｄｃ２５タンパク質又は組み換えヒトｃｄｃ２５チロシンホスファ ターゼなどのｃｄｃ２５チロシンホスファターゼを用い、有糸分裂への突入（細 胞周期の後期Ｇ２からＭ相への経過）を変更する化合物に関してスクリーニング するアッセイも含む。アッセイの１つの実施態様の場合、比色測定アッセイを用 い、タンパク質キナーゼＭＰＦのアクチベータであるｃｄｃ２５チロシンホスフ ァターゼを阻害する化合物の能力を決定することができる。本明細書に記載の通 り、エンエリキァ　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ）で生産され、 精製されたグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ／ｃｄｃ２５Ａチロシンホス ファターゼ融合タンパク質は、ｐ−ニトロフェニルホスフェートに対してホスフ ァターゼ活性を示す。ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａと名付けられたこの融合タンパク質 を、ｃｄｃ２５ホスファターゼ活性への化合物の阻害効果を評価するために用い た。やはり本明細書に記載の通り、類似の方法で他の融合タンパク質を生産し、 同−又は類似のアッセイ方式で用いることができる。これらの融合タンパク質は その成分のいずれか又は両方がＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａと異なることができる。例 えばＧＳＴ以外の成分（例えばマルトース結合タンパク質）をｃｄｃ２５Ａとの 融合タンパク質に含むことができる。別の場合ｃｄｃ２５族の他のメンバー（例 えばｃｄｃ２５ＢＳｃｄｃ２５ｃ）がチロシンホスファターゼ成分であることが できる。別の実施態様の場合、ｃｄｃ２５タンパク質を用いる。

本方法は簡単で迅速なスクリーニング試験であり、その１つの実施態様において 、抗分裂化合物の可能性のある化合物に関する試験のための標的として組み換え ｐ８０°ｄｃ２５などの融合タンパク質を用い、そのｐ−二トロフェニルホスフ ェートホスファターゼ活性を介して分析する。

方法を、癌の治療で現在用いられている化合物、及びチロシンホスファターゼ阻 害剤として認識される化合物の試験のための迅速な比色測定微量滴定プレートア ッセイとして行った。試験された治療化合物は、上記のアッセイにおいてｃｄｃ ２５を阻害する能力を示さなかったが、報告されたチロノンホスファターゼ阻害 剤（バナデート）は全体的にｃｄｃ２５を阻害することが示された。かくして本 方法は必須の細胞周期−調節成分を阻害する化合物の同定に有用であることが示 され、抗分裂剤に関する高度に特異的なスクリーニングを与える。

本発明の１つの実施態様において、ｃｄｃ２５を含む融合タンパク質を適した条 件下で：　１）ｃｄｃ２５に対する、か（して後期Ｇ２からＭ相への経過に対す るその効果に関して評価するべき薬剤；２）ｐ−ニトロフェニルホスフェート又 は不活性ｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢなどの適したｃｄｃ２５基質と合わせる 。得られた組み合わせをｃｄｃ２５がｃｄＣ２５の基質に作用するのに十分な時 間保持し、反応を停止させる（例えば組み合わせのｐＨの大きな変更により）。

組み合わせの光学濃度を測定し、それをあらかじめ決められた標準又は参照標準 （例えばあらかじめ決定された光学濃度とｃｄｃ２５阻害の程度の関係、又は評 価するべき薬剤に関する以外は“試験”組み合わせと同一の成分を含む組み合わ せ）と比較するなどの既知の方法を用いて組み合わせのホスファターゼ活性を決 定する。

本方法で用いる融合タンパク質は実施例１４に記載されているような既知の遺伝 工学法により生産することができる。すなわち融合タンパク質をコードするＤＮ Ａ又はＲＮＡ構築物を適した宿生細胞に導入し、そこで構築物を発現し、かくし て融合タンパク質を生産する。融合タンパク質を宿主細胞から分離し、（好まし くは精製し）、アッセイで用いる。

別の場合２つの別々に生産された成分を結合させることにより融合タンパク質を 生産することができる。実施例１５に記載の通り、２つの成分がグルタチオン− ８−トランスフェラーゼとヒトｃｄｃ２５Ａである融合タンパク質が生産され、 本方法で用いられた。

第２の実施態様において、ｃｄｃ２５Ａ、ｃｄｃ２５Ｂ又はｃｄｃ２５Ｃタンパ ク質などのｃｄｃ２５タンパク質を本方法で用いることができる。この実施態様 の場合、サイクリン／　ｃ　ｄ　ｃ　２をｃｄｃ２５の基質として用いることが でき、試験するべき薬剤をｃｄｃ２５タンパク質及びサイクリン／　ｃ　ｄ　ｃ 　２と合わせ、上記の通りｃｄｃ２５のチロシンホスファターゼ活性を評価する 。結果をあらかじめ決められた標準又は参照標準と比較する（実施例１４を参照 ）。

用いられるｃｄｃ２５の基質は、ｃｄｃ２５がホスファターゼ活性を示すいずれ の合成又は天然に存在する物質であることもできる。本明細書に記載の実施態様 の場合、用いられるｃｄｃ２５Ａの基質はｐ−ニトロフェニルホスフェートであ る。用いることができる他の基質にはｃｄｃ２リン酸化の部位を模したペプチド 、又は完全に不活性なｃｄｃ２／サイクリンＢ前駆酵素複合体が含まれる。他は ホスファターゼ活性の決定の既知の方法を用いて同定することができる。

ｃｄｃ２５チロシンホスファターゼ活性を変更するその能力に関して試験する薬 剤は、バクテリア、酵母又は他の生物により生産された薬剤、あるいは化学的に 製造された薬剤であることができる。実施例１８に記載の通り本明細書で試験す る化合物は、癌の治療で現在用いられている１５の薬物及びチロシンホスファタ ーゼ阻害剤として認識されているバナデートを含む。１５の治療薬は阻害活性を 示さなかった。対照的にバナデートは全体的にＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａホスファタ ーゼを阻害することが示された。本方法は抗増殖剤として有効である可能性のあ る薬剤、及び炎症又は乾癖あるいは細胞増殖と関連のある他の疾患の処置又は予 防に有用な薬剤の同定に有用である。

ここで本発明を以下の実施例により示すが、実施例はいかようにも制限を目的と するものではない。

実験手順 実施例１−６に記載の研究を行う場合、以下の実験手順を用いた。

Ｓ、ポンベｃｄｃ２５、ドロソフィラ　ｓｔｒｉｎｇ及びＳ、セレビシアエ（Ｓ 、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｍｉｈｌ遺伝子産物の間の相同性を考慮し、共通ｃｄ ｃ２５タンパク質配列に対応する高縮重プライマーを設計した。アミノ酸配列Ｉ 　ＩＤＣＲＴ／ＦＰ　（又はＥ）ＹＥ（ＳＩＣ−１：ＡＴＩＡＴＩＧＡＴＴＧＣ ＣＧＩＴＡ／ＴＣＣＣＩＴＡＣ／ＴＧＡ及びｓ　ｉ　ｃ−２：ＡＴＩＡＴＩＧＡ ＴＴＧＣＣＧＩＴＡ／ＴＣＧＡＩＴＡＣ／ＴＧＡ）（配列番号：５）に対応する ５°縮重プライマー、及びアミノ酸配列１／Ｖ　Ｆ　ＨＣＥ　Ｆ（ＳＴ−Ｃ：Ａ ／ＴＡ／ＧＡＡＣ／ＴＴＣＡ／ＧＣＡＡ／ＧＴＧＡ／ＧＡＡＡ／Ｇ／ＴＡ）（配 列番号、６）に対応する３゛プライマーを調製した。ここで１はイノシシに対応 する。５０ｍ１のＰＣＲ反応混合物は５０ｍＭ　ＫＣＩ；１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨ Ｃ］　（ｐＨ８，３）：１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２；０゜０１％ゼラチン：各０． ２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；０．５単位のＴｈｅｒｍ ｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ（ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅ　ｒ ｋ　ｉ　ｎ−Ｅ　Ｉｍｅ　ｒ／Ｃｅ　ｔ　ｕＳ））、各５ｍＭの５゛ブライ７− （ＳＩＣ−１及び５ＩＣ−２）、５ｍＭの３′プライ７−（ＳＴ−Ｃ）及び１０ ０ｍｇのＪａｃｅｋ　Ｓｋｏｗｒｏｎｓｋｉ　（Ｃｏ！ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ）によりｇｇｔｌＯに形成したヒトＮ−Ｔｅｒａ細胞ｃＤＮＡライ ブラリを含んだ。９４℃で１分間、４０°Ｃで３分間及び７２°Ｃで１分間の４ サイクルをＤＮＡ熱サイクラ−（ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉ ｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）で行った。反応生成物を２％アガロースゲル上で 分離し、予想された大きさの（約１６０ｂｐ）フラグメントをＳｍａ　ｌ−消化 ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ（−）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　 Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にサブクローニングした。９つのクローンを配列決定し、 配列はｃｄｃ２５同族体のクローニングを明白に示した。２つの異なるＰＣＲ生 成物が検出された。その１つは以前にクローニングされたヒトｃｄｃ２５同族体 （ＣＤＣ２５Ｈｓ、５ａｄｈｕ、に、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　八ｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７：５１３９　５１４３（１９９０））とほとんど同 一であり、他は以前に特性化されておらず、ここでｃｄｃ２５Ａと呼ばれるｃＤ ＮＡに相当した。Ｎ−Ｔｅｒａ　ｃｄｃ２５Ａ　ＰＣＲ−由来クローン（ｐ５ｗ ｌ）を用い、低緊縮においてヒトＮ−Ｔｅｒａ細胞ライブラリをスクリーニング した。プラークの精製の後、９つの陽性のクローンの挿入片をｐＢ］ｕｅｓｃｒ ｉｐｔ　５Ｋ（−）プラスミドのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。ｃｄ ｃ２５Ａ　ｃＤＮＡの完全読み取り枠を含む２つのファージからの挿入片を制限 マツピングにより分析した（２．４及び３．９ｋｂの挿入片を含むプラスミド４ ｇ１．３及び２１１．１）、プラスミド４ｇ１３はｃＤＮＡの３゛非翻訳領域に １．４ｋｂの欠失を含み、完全な配列決定のために選ばれた。自動配列決定シス テム（Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７３Ａ）上の連鎖停止法を 用いて両鏡につき配列決定分析を行った。

さらに分析すると、最初の９つのファージクローンの１つは異なるＣｄｃ２５同 族体に相当することが示され、それをｃｄｃ２５Ｂと名付ける。このファージは ２つのＥｃｏＲＩフラグメント（０，９及び１．５ｋｂ）を生ずるが完全読み取 り枠を与えない。完全ｃＤＮＡを得るために、同ライブラリを０．９ｋｂのＥｃ ｏＲＩフラグメントを用いてスクリーニングし、完全ｃＤＮＡ　（３，０ｋｂ） を与える挿入片をＥｃｏＲＩを用いた部分的消化を介してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ　５Ｋ（−）ベクター中にサブクローニングした。これを配列決定に用いた。

ＮＨｚ　（＃１４４）（ｃｄｃ２５Ａ）に対応するペプチドをＣｏｌｄＳｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｒｅ　ｆａｃ ｉｌｉｔｙで合成し、ＨＰＬＣ−精製し、基本的に記載の通りにキーホールリン ペットヘモシアニン（ＫＬＨ）　及びウシ血清アルブミンにカップリングさせた （Ｄｒａｅｔｔａ、Ｇ、ｅｔａ±、、Ｎａｔｕｒｅ　３３旦：　７３８−７４４ 　（１９８８））、ウサギに２００ｍｇのＫＬＨ−ペプチド共役体を３週間毎に 注射した。３回のブースター注射の後、陽性の血清を得た。抗体（Ｋ　１４３及 びに１４４）をＣＮＢｒ−セファ０−ス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ） にカップリングさせたＢＳＡ−ペプチド共役体上で製造者の指示に従ってアフィ ニティー精製した。ペプチド＃１３４及びに１４４抗血清と他のペプチドの間の 交差反応性は検出されなかった。

分裂酵母ｃｄｃ２５温度感受性突然変異株の救済ｐ４ｇ１．３プラスミドからの ヒトｃｄｃ２５Ａのアミノ酸１−５２６をコードする２、０ｋｂのＮｃｏＩ−Ｂ ａｍＨＩフラグメントをＮ。

基プロモーターに対してセンス配向でヒトｃｄｃ２５Ａ　ｃＤＮＡを潜在させる ｐＡＲＴＮ−ｃｄｃ２５Ａ構築物を得た。ｐＡＲＴＮは、Ｓｍａ１部位にＮｃｏ Ｉリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏｉａｂＳ）を連結することにより ｐＡＲＴ３　（ＭｃＬｅｏｄ、ｅｔ　ａｌ、。

１９８７）から誘導する。アミノ酸３２−５６６をコードするｐ４ｘ１゜２プラ スミドからの２．４ｋｂのＳｍａｌフラグメントをＳｍａ　１消化ｐＡＲＴ３ベ クター（ＬＥＵ２マーカーを含む）中にサブクローニングし、ｐＡＲＴＮ−ｃｄ ｃ２５Ｂ　ｃＤＮＡを得た。両プラスミドをＳ。

ポンベｈ＋ｃｄｃ２５−２２］ｅｕｌ−３２（ＳＰ　５３２）株に形質転換した 。Ｌｅｕ十形質転換株を２６℃で得た。

細胞培養、免疫沈降 ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから入手）は１０％のウシ胎児血清を補足したＤｕｌｂ ｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＤＭ）中で３７℃で増殖させた。標識のた めに細胞をメチオニンマイナス培地（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、１ｍｃｉ／ｍｌの ３５８−メチオニン（Ｔｒａｎｓｌａｂｅｌ。

ＩＣＮ）を６−８時間補足した。細胞を基本的に記載の通りに（Ｄｒａｅｔｔａ 、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：７３８−７４４（１９８８））　 、又はプロテアーゼ阻害剤（０，５ｍＭ　ＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｒｒ＋］のアプロ チニン、ペプスタチン、キモスタチン、ロイペプチン、３０ｍｇ／ｍｌのＴＰＣ Ｋ、１５ｍｇ／ｍｌのベンズイミジン）を補足したＥＢ緩衝液（８０ｍＭ　グリ セロホスフェート、１５ｍＭＭｇＣ１２，２０ｍＭ　ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ ）中で溶解した。ライセードをプロティンＡ−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）（２０ｍｌの１＝１スラリ）で予備清浄化し；抗−ヒトｃｄｃ２５Ａ 抗血清（Ｋ　１４４）を加え（１−５ｍｌ）；　８−１０時間後に免疫複合体を プロティンＡビーズ（２０ｍｌの１：１スラリ）を用いて沈降させた。

ビーズを溶解緩衝液で４回洗浄し、２０ｍ１の２ｘ試料緩衝液（Ｌａｅｍｍｌ　 ｉ、Ｕ、に、Ｎａｔｕｒｅ　２２ユニ６８０−６８５　（１９７０））中に再懸 濁させた。免疫沈降タンパク質をＳＤＳを含む１０％のポリアクリルアミドゲル 上で分離し、乾燥ゲルスラブのオートラジオグを調製し、以前に記載の通りにＨ ｅＬｄからＩ）　３４”°２を沈降させるために用いた（Ｂｒｉｚｕｅｌａ、Ｌ 、ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、６３５０７−３５１４　（１９８７）’Ｉ。

ヒトｃｄｃ２５Ａの完全読み取り枠を含むプラスミドをＮｃｏｌで消化しくアミ ノ酸１において）、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、熱不活化し、フ ェノールクロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させ、ＥｃｏＲＩで消化した。

得られた２、０ｋｂのフラグメントをゲル−精製し、ｐＧＥＸ−２Ｔ　Ｓｍａｌ ／ＥｃｏＲＩ消化ベクター中に連結した。得られたプラスミドはバクテリア中に 形質転換すると９０ｋｄのＩ　ＰＴＧ−誘導可能なタンパク質を生じた。発現さ れた融合タンパク質をグルタチオン−セファ０−スビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）上で記載の通りに（Ｓｍｉｔｈ、Ｄ、Ｂ、ａｎｄ　Ｋ、Ｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎ。

Ｇｅｎｅ　６ヱ：３１−４０　（１９８８））回収し、新しく調製した５０ｍＭ 　ＴｒｉｓＨＣＩ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、領１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ 中のグルタチオン５ｍＭを用いてｐＨ８，０で溶離した。

ｃｄｃ２５Ｂの発現のためにプラスミドｐ４ｘ１．２をＸｂａｌ、その後Ｓｍａ 　１で切断しく部分的）、２．４ｋｂのフラグメントをＳｍａ　１／Ｘｂａｌ切 断ｐＧＥＸ−ＫＧベクター（Ｇｕａｎ、に、ａｎｄ　Ｊ。

Ｅ、Ｄｉｘｏｎ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：５５３−５５６　（１９９１））中 にサブクローニングした。この構築物を発現させると８８ｋＤのＧＳＴ−ｃｄｃ ２５Ｂ融合タンパク質がＩＰＴＧ−依存的に合成された。精製ｃｄｃ２５Ａタン パク質（４，５ｍｇ又は５０ピコモル）のホスファターゼ活性をＱ、５ｍｌの２ ０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８゜０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％　ｂ−メル カプトエタノール、２０ｍＭｐ−二トロフェニルホスフエ−１−（ＰＮＰＰ）中 で分析した。１゜７８　ｘ　１０’Ｍ−ｃｍ−のモル吸光率を用いて４１０ｎｍ における吸収を決定し、アッセイにおいて生成されたｐ−ニトロフェル−トイオ ンの濃度を算出した。ｃｄｃ２５Ｂの場合、ｐＨが８．８である以外は同一の緩 衝液においてアッセイを行った。

還元カルボキシアミドメチル化及びマレイル化リゾチーム（ＲＣＭＬ）をＮ　ト ンツス（Ｎ、Ｔｏｎｋｓ）から３２ｐ−チロシンリン酸化形態で得た。タンパク 質の約５０％がリン酸化されていた。３２ｐ−標識ＲＣＭＬを５０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓＨＣＩ、ｐＨ８，０，５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０゜１ｍｍ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　 ＤＴＴ中で１０−３０ｍＭの最終ホスフェート濃度におけるホスファターゼアッ セイに用いた。反応（３０−５０ｍｌ）は３０℃で１０又は２０分行い、脂肪酸 非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡＳＳ　ｉ　ｇｍａ）を２ｍｇ／ｍｌまで加え た後、２００ｍ１の２０％三塩化酢酸を用いてタンパク質沈降させ、渦動させ、 −７０°Ｃで５分間インキュベートし、解凍し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機で５ −１０分間最大速度で回転させ、２００ｍ１の上澄み液を２ｍｌのＡｑｕａｓｏ ｌ（ＮＥＮ）中で１０分間カウントした。

阻害性チロシンリン酸化を行うｐ３４　ｃｄｃｆｉの領域に対応するペプチド（ ＮＨ２−皇に五ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ）（配列番号ニア）（ｃｄｃ２ への追加であり、ペプチドをビーズ及び／又はタンパク質にカップリングさせる ために加えられたペプチド配列に下線をひいである）を、バクテリアにより生産 されたｖ−Ａｂｌ　（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）を用い、製造者記載 の条件下で試験管内でリン酸化し、５ｅｐｐａｋカラム（Ｍｉ　ｌ　］　１ｐｏ ｒｅ）上で精製した。ペプチド中に挿入された最終的活性は０．７ｘｌＯ’ｃｐ ｍ／ｍｇであった。ペプチドに対するｃｄｃ２５Ａタンパク質のホスファターゼ 活性（各試料において１ｍｇのペプチドを用いた）をＲＣＭＬの場合と同条件で 分析した。

記載の通りに（Ｓｔｒｅｕｌｉ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ　８６：８６９８−８７０２　（１９８９））反応混合物を酸性活性 炭と共にインキュベートし、７００ｍ１の全上澄み液から２００ｍ１を上記の通 りにカウントした。

サイクリンタンパク質の発現 バクテリア中でヒトサイクリンを発現するために、ｐＣ；ＥＸ−３Ｘベクターを Ｓｍａ　ｌで消化し、Ｎｃｏｌリンカ−（前に実験法で記載）を連結することに より修正ｐＧＥＸ−３Ｘベクター（ｐＧＥＸ−Ｎｃｏ）を調製し、これはＮｃｏ １部位へのクローニングにより異種ｃＤＮＡが正しく発現できるベクターを与え た。ヒトサイクリンＢｌ及びＡをＰＣＲにより合成し、その配列を完全に確認し た。ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）中のサイクリンＢｌ　ｃＤＮＡをＮｃｏ ｌ／Ｓｍａｌで切断し、得られた１、３ｋｂのフラグメントをｐＧＥＸ−Ｎｃｏ 中に連結し、ＥｃｏＲＩで消化し、フレノウフラグメントで充填し、Ｎｅｏｌで 切断した。第１のＡＴＧコドンを含むサイクリンＡの配列はＰＣＲによりｎｃｏ １部位に変化した。サイクリンＡの発現のために、サイクリンＡのための完全読 み取り枠を含むプラスミド（ｐ４ｆ１．１）をＮｃ。

ｌ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られた１、４ｋｂの挿入片をＮｃｏ　］／Ｅｃｏ ＲＩで切断したｐＧＥＸ−Ｎｃｏ中にサブクローニングした。ヒトサイクリンＢ ２をコードするヒトｃＤＮＡをＹ、Ｘｉｏｎｇから得（未公開）、第１のＡＴＧ コドンをＰＣＲによりＮｃｏ１部位に変化させ、このｃＤＮＡをＢａｍＨＩで消 化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化し、Ｎｃｏｌで消化し、得 られた１、３ｋｂのフラグメントを、サイクリンＢｌ　ｃＤＮＡの連結のために 上記の通りに調製したｐＧＥＸ３Ｘ−Ｎｃｏベクター中に連結した。ｐＧＥＸ− ３Ｘベクター中ツマウスｃＹＬ１　（サイクリンＤ１）　ｃＤＮＡはＤｒ、Ｃ， ５ｈｅｒｒから寄贈された。発現サイクリンの精製は、最初の抽出の後に細胞ベ レットを５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８，０，５０ｍＭＮａｃＩ、１ｍＭ　 ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１％　グリセロール、２Ｍ　ウレア中に再懸濁し、 水上で１ｏ分間抽出する以外は基本的に記載ノ通りに行った（Ｓｍｉｔｈ、Ｄ、 Ｂ、ａｎｄ　Ｋ、Ｓ、Ｊｏｈｎｓ。

ｎ、Ｇｅｎｅ６ユ：３１−４０　（１９８８）；Ｓｏｌｏｍｏｎ、Ｍ。

Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６３：１０１３−１０２４（１９９１））。

ＲＣ−５Ｂ遠心機（Ｂ　ｅ　ｃ　ｋｍａ　ｎ）上の１５０００ｒｐｍで３０−６ ０分間遠心した後、上澄み液を０．２２ｍｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ）を通して濾過し、抽出緩衝液で平衡化した２ｍｌのグルタチオン−セファロー スカラム（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）上に適用した。続いてカラムを抽出 緩衝液（１０ｍｌ）　、その後ウレアを含まない同緩衝液（１０ｍｌ）で洗浄し 、１０ｍＭのグルタチオンを補足した同緩衝液で融合タンパク質を溶離した。溶 離タンパク質をホスファターゼアッセイ緩衝液中に透析し、Ａｍ１ｃｏｎ微量濃 縮器上で希釈−濃縮を繰り返すことにより濃縮した。その後プロテアーゼ阻害剤 （ＦＭＳＦ及びペンズイミノン）を領　５及び５ｍＭまで加え、タンパク質を４ ℃で２−３日間保存するか、あるいは同日すぐに使用した。タンパク質濃度の決 定にプラトフォードアッセイを用いた。

抗体の微量注射 微量注射実験のためにＨｅＬａ細胞を“島”において２０−３０細胞まで増殖さ せ、アフィニティー精製し、さらに＃１４３ペプチド共役ＢＳＡセファロース上 で枯渇させたに１４４　（１ｍｇ／ｍｌ）を時間０にて注射した。注射は緩衝液 Ｆ　（２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５ＨＣｌ、ｐＨ７，６，２０ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ ｍＭ　ＫＣＩ、０．５ｍＭ　ｂ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ　ＡＴＰ） 中で行った。特定の“島”のすべての細胞に微量注射し、微量注射後８．１８． ２４及び３６時間で写真を撮った。別の組の実験で、注射後８．１２．１８及び ２４時間後に細胞の写真を撮った。前免疫血清からのプロティンＡ−セファロー ス精製ウサギＩｇＧの微量注射を参照標準とした。

タンパク質キナーゼアッセイ タンパク質キナーゼアッセイのために、Ｈｅ　Ｌ　ａ細胞がら単離したｐ３４　 ｃ′’２キナーゼを結合させたｐ１３ビーズ（ヒドロキシウレア（１０ｍＭ）の 存在下で２２時間インキュベートし、続いて４時間遊離させた）を５０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓＨｃｌ、、ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴを含む緩衝液中 で２回洗浄し、添加剤と共に３０℃で５分間インキュベートした。添加剤は緩衝 液のみ、あるいは１ｍｇの抗原性ペプチドの存在下又は不在下で行ったｃｄｃ２ ５Ａ免疫沈降から０．１Ｍグリシン／ＨＣＬ　ｐＨ２，５を用いて溶離させた材 料を含んだ（添加の前に材料はＩＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８，０を用いて中和 した）。

沈降物は５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８，０，１０ｍＭ　ＭｇＣ１□、１ｍ Ｍ　ＤＴＴ　（ＰＫ−緩衝液）で２回洗浄し、最後に５ｍＭＡＴＰ、１０ｍＣ１ ［ｑ−３２Ｐ］　ＡＴＰ　（３０００Ｃｊ／ミ！Ｊモ／ｌｚ）、及び５０ｍｇ／ ｍｌのヒストンＨ１を補足した２体積のＰＫ緩衝液に再懸濁した。３０℃で１５ 分間インキュベートした後、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル試料緩衝液に より反応を停止した。標識タンパク質を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離 し、オートラジオグラフィーにより検出した。

−５１４３（１９９０））。ここでヒトｃｄｃ２５族であることが示される別の メンバーをＰＣＲに基づく戦略を用いて単離した。この戦略は、ドロソフィラ　 メラノガステル　ｓｔｒｉｎｇ　（Ｅｄｇａｒ、Ｂ、Ａ。

ａｎｄ　Ｐ、　Ｈ，Ｏｏ　Ｆａｒｒｅｌｌ、Ｃｅ１ｌ　５ユニ１７７−１８７　 （１９８９））　、Ｓ、ポンベ　ｃｄｃ２５　（Ｒｕｓｓｅｌ　Ｉ、Ｐ、ａｎｄ 　Ｐ、Ｎｕｒｓｅ、Ｃｅ１ｌ　４５：１４５−１５３（１９８６））及びＳ、セ レビンアエ　ｍ１ｈｌ　（Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ　ｌ　ｌ　５７　：　２９５−３０３　（１９８９））の間に共通のアミノ 酸領域に対応するように設計された３つの縮重オリゴヌクレオチドブライマーを 用いた。ヒトＮ−Ｔｅｒａ奇形癌ライブラリからのｃＤＮＡの増幅、その後ファ ージミドベクターへのＰＣＲ産物のクローニングを行い、フラグメントのヌクレ オチド配列決定が可能になった。これにより、Ｃｄｃ２５−関連フラグメントが 以前にクローニングされたと記載されているフラグメントと異なることが確立さ れた。

１つのＰＣＲ−由来クローンからの挿入片（ｐ５ｗｌ）を用い、ｇｇｔｌＯベク ターにおいてヒトｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。

スクリーニングした約１０６のプラークから９つの陽性のクローンが得られた。

８つはハイブリッド形成プローブとして用いた最初にクローニングされたＰＣＲ 産物に対応した。これをｃｄｃ２５Ａと呼ぶ。ｐＳｗｌとの低緊縮ハイブリッド 形成を用いて単離された第２のｃ　ｄ、　ｃ　２５クローンはｃｄｃ２５Ｂと呼 ばれた。ｃｄｃ２５Ａ及びＢの最長のｃＤＮＡクローンをヌクレオチド配列決定 した。読み取り枠を含むそれぞれの領域を図１に示す。ｃｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ ２５Ｂはそれぞれ５２６及び５６６アミノ酸のタンパク質をコードすると推定さ れる。算出されたｃｄｃ２５Ａの等電点は６．３であり、ｃｄｃ２５Ｂの場合は ５．９である。両遺伝子はＫｏｚａｋ共通配列（ＰｕＣＣ／ＧＡＴＧＧ）（Ｋ。

ｚａｋ、　Ｍ、Ｃｅ　］　ｌ　旦：　２８３−２９２　（１９８６）’）がフラ ンキングする開始コドンを有する。

ｃｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ２５Ｂ、ならびにＧｅｎＢａｎｋデータベース（リリー ス６７）のアミノ酸配列の比較により、本明細書でｃｄｃ２５Ｃと呼ぶ以前に記 載されたヒトｃｄｃ２５　（Ｓａｄｈｕ、に、ｅｔ３９−５１４３　（１９９’ ０）　）に対する相同性が明らかになった。この比較により、２７３Ｃ−末端領 域においてｃｄｃ２５ＣとＡの間に４８％の同一性があり、ＣとＢの間に４３％ の同一性があることが示された（図２）。ドロソフィラ　３ｔｒｉｎｇは３６２ アミノ酸領域においてｃｄｃ２５Ａと３４．５％の同一性を共有し、２６９アミ ノ酸領域においてｃｄｃ２５Ｂと４３．９％の同一性を共有する（図２）。Ｓ、 ポンベｃｄｃ２５＋もｃｄｃ２５Ａ及びＢと関連しているが程度は低い（図２） 。ヒトｃｄｃ２５Ａ及びｃｄｃ２５Ｂも、特におそら（ｃｄｃ２５触媒活性に含 まれる領域において“ｃｄｃ２５−ボックス”を特徴づける保存アミノ酸を含む （Ｌ／ＶＦＨＣＥＸＸＸＸＲ）（配列番号＝８）（Ｍｏｒｅｎｏ、Ｓ、ａｎｄ　 Ｐ、Ｎｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ　３５１：１９４　（１９９１）；Ｇａｕｔｉｅ ｒ、Ｊ、ａｎｄ　Ｊ、Ｍａｐｌｅｒ、　ＥＭＢＯＪ　よＯ：１７７−１８２　（ １９９１））、すべての既知のヒ１−ｃｄｃ２５同族体はこの領域に高度の保存 領域と呼ばれる１５の同一アミノ酸の範囲を含む（配列番号：９）（図２）。興 味深いことに、異なるヒトｃｄｃ２５タンパク質の間の全類似性は、ヒトとドロ ソフィラなどの進化的に異なる種の間の類似性を大きく上回ってはいない。

実施例２　ヒトｃｄｃ２５ＡＳｃｄｃ２５Ｂ及び分裂酵母ｃｄｃ２５によりコー ドされるタンパク質の間の機能的関連性の評価ヒトｃｄｃ２５Ａ及びＢ遺伝子が 実際に分裂酵母ｃｄｃ２５に機能的に関連するタンパク質をコードするかどうか を調べるために、ヒト遺伝子をＳ、ボンベ自律複製発現ベクター、ｐＡＲＴＮ　 （実験手順で記載の通り構成的アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターの制御 下でＬＥＵ２マーカーを有する）中にサブクローニングした。Ｈ＋ｃｄｃ２５− ２２］ｅｕｌ−３２株中にプラスミドを導入した後、形質転換株を許容（２６℃ ）又は制限温度（３６°Ｃ）でロイシンを含まないか、あるいは含む培地上で平 板培養した。両方のヒトｃＤＮＡはｃｄｃ２５遺伝子の温度感受性突然変異を有 効に救済することができた。ヒトｃＤＮＡを有する細胞は野生型細胞と同様の増 殖速度でシングルコロニーを形成することができた。顕微鏡試験により、いずれ の遺伝子を用いて形質転換した細胞もわずかに“ｗｅｅ”であり、これは同型の ベクター上の野生型ｃｄｃ２５＋遺伝子を用いて形質転換した分裂酵母で以前に 観察された表現型である（Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｐ、ａｎｄ　Ｐ、Ｎｕｒｓｅ、Ｃｅ １１　４５　：１４５−１５３　（１９８６））。

実施例３　ｃｄｃ２５Ａが有糸分裂において作用することの証明ｃｄｃ２５Ａの 役割を調べるために、我々はｃｄｃ２５Ａタンパク質の内部領域に対応するペプ チドに対するポリクローナル抗体を調製した（実験手順を参照）。この血清を用 いて３５ｓ−メチオニン標識ＨｅＬａタンパク質を沈降させた。７５ｋＤのタン パク質が競争抗原性ペプチドの不在下で特異的に沈降したが、競争抗原性ペプチ ドの存在下では沈降しなかった（データは示していない）。ｃｄｃ２とサイクリ ンの相互作用を避ける緊縮デターシエント条件を用いた。この分子量は遺伝子の アミノ酸配列から推定されるより高いが、ｃｄｃ２５Ａクローンの試験管内翻訳 も７５ｋＤのタンパク質を与えた（示していない）。このタンパク質がドロソフ ィラ　ｓｔｒｉｎｇタンパク質の場合（Ｋｕｍａｇａｉ。

Ａ、ａｎｄ　Ｗ、Ｇ、Ｄｕｎｐｈｙ、Ｃｅｌ　Ｉ　６４：９０３−９１４（１９ ９１））ならびにヒトＣｄＣ２５Ｃの場合（Ｓｔｒａｕｓｆｅｌｄ、Ｕ、ｅｔ　 ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３５１：２４２−２４５　（１９９１））に記載されて いるように不活性サイクリンＢ／ｃｄｃ２を活性化することができるかどうかを 調べるために、ＨｅＬａ細胞ｃｄｃ２５Ａを低ｐＨの条件下で免疫複合体から溶 離した（実験手順を参照）。溶離されたタンパク質はヒストンキナーゼ活性を有 していなかった（データは示していない）。このタンパク質を、ヒドロキシウレ ア中で休止させ、４時間遊離させたＨｅＬａ細胞の抽出物のｐ１３−セファロー ス沈降により調製したｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢと混合した（実験手順を参 照）。これらの条件下で、溶離ｃｄｃ２５Ａタンパク質を加えないとＣｄｃ２／ サイクリンＢはヒストンキナーゼとして比較的不活性である（データは示してい ない）。

ヒト細胞におけるｃｄｃ２５Ａタンパク質の機能を解明するために、アフィニテ ィー精製抗−ベブチド抗体を活発に増殖するＨｅＬａ細胞に微量注射した（実験 手順を参照）。注射された細胞の島を８．１２．１８及び２４時間で写真に撮り 、別の組の実験で８．１２．１８．２４及び３６時間で写真に撮った。い（つか の場合に細胞を抗−ウサギＩｇＧで染色し、抗−ｃｄｃ２５抗体微量注射の成功 を確認した。３つのそのような独立した実験の写真を分析し、抗体が細胞の分裂 を防止するという結論を導いた（図３Ａ、３Ｂ）。有糸分裂中の細胞（ラウンデ ドアップ有余分裂形として定義）のパーセンテージは抗−ｃｄｃ２５Ａの微量注 射の後に益々増加したが、標準血清の微量注射後は増加しなかった（図３Ａ）。

注射された６島の細胞数は標準血清の場合に増加したが、実験血清の場合は徐々 に減少した。これは、偶発的な死亡（しぼんだ丸い細胞として見える）及び培養 平板の表面からのそれらの分離と組合わされた細胞の分裂の欠如に帰せられる。

分裂酵母の場合、ｃｄｃ２５機能の損失が細胞を本実験のような中期有糸分裂で はなく０２に休止させる。配列の相同性、分裂酵母における機能、及びｃｄｃ２ ５Ａの場合のヒト細胞における機能の研究に基づき、この新規に同定されたヒト タンパク質はｃｄｃ２５の関連物質として分類することができる。

実施例４　Ｂ−型サイクリンによるｃｄｃ２５の活性化試験管内のｃｄｃ２５ホ スファターゼ活性の調節の研究のために、ヒトｃｄｃ２５Ａ及びＢをグルタチオ ン−３−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ、Ｓｍｉ　ｔｈ、Ｄ、Ｂ、ａｎｄ　Ｋ、Ｓ 、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ６７　：　３１−４０　（１９８８）　）との融合 タンパク質としてバクテリア中で発現した。相対分子量が９０ｋＤ　（ｃｄｃ２ ５Ａ）及び８８ｋＤ（ｃ　ｄ　ｃ　２５　Ｂ）の融合タンパク質を記載のグルタ チオン−セファ０−スビーズ（Ｓｍｉｔｈ、Ｄ、Ｂ、ａｎｄ　Ｋ、Ｓ、Ｊｏｈｎ ｓｏｎ、Ｇ且旦至　６７　：　３１−４０　（１９８８））上のアフィニティー クロマトグラフィーにより単離した。ヒトサイクリンＡＳＢｌ、Ｂ２及びネズミ ＤＩ（ＣＹＬＩ、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅｌ　１６５　 ニア０１−７１３　（１９９１）　）を開方法ニョリＧＳＴとの融合タンパク質 として発現し、精製タンパク質を得た。

サイクリンによるｃｄｃ２５活性の調節の可能性を調べるために、Ｃｄｃ２に考 えられる関連性を持たない基質、ホスファターゼの推定生理学的基質を見いだす 必要があった。ｃｄｃ２はサイクリンに結合しくＤｒａｅｔｔａ、Ｇ、ｅｔ　ａ ｌ、、Ｃｅ１ｌ　５６：８２９−８３８（１９８９）Ｌかくしてｃｄｃ２を基質 として含む反応にサイクリンを加えるとおそらく標的基質が変化し、観察された 結果の説明を混乱させる。この理由から、チロシンホスファターゼ研究で多くの 場合に用いられる基質、すなわち還元カルボキシアミドメチル化及びマレイル化 リゾチーム（ＲＣＭＬ）を用いた。（Ｔｏｎｋｓ、Ｎ、に、ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３：６７３１−６７３７　（１９８８））。

この基質は３２ｐによりチロシン残基を標識してＮ、Ｔｏｎｋｓがら親切に提供 された。

バクテリアから精製されたサイクリンはＲＣＭＬに対してホスファターゼ活性を 示さなかった（図４Ａ）。しかしｃｄｃ２５Ａは内在性チロシンホスファターゼ 活性を有しく図４Ａ；実験手順も参照）、すなわち少なくとも３０分間直線状で あった（データは示していない）。すべてのバクテリア性ｃｄｃ２５タンパク質 が触媒的に活性であると仮定した場合、ｃｄｃ２５の各分子が１ｏ分当たりに約 １つのホスフェートを遊離させると算出することができる。反応混合物へのサイ クリンＡ又はＤの添加は、調べたいずれの濃度でもｃｄｃ２５Ａの内在性活性に 対して賦活効果も阻害効果も持たなかった（図４Ａ）。しかしサイクリンＢ１又 はＢ２の同様の添加は約４倍の賦活効果を有した（図４Ａ）。前実験の場合、１ ０ピコモルのサイクリン及びｃｄｃ２５タンパク質を反応混合物で用いた。サイ クリンＢ１の添加量へのｃｄｃ２５の活性化の依存性も研究した。アッセイはサ イクリンを添加せずに、あるいは１．２．５．１０又は２０ピコモルのサイクリ ンＢ１を添加して行った。反応は２０分間行い、三塩化酢酸（ＴＣＡ）の添加に より停止した。活性化は１０ピコモルのサイクリンＢ１添加においてプラトーに 達するのが観察され、さらに高濃度でさらに大きな効果は検出されなかった（図 ５）・かくしてこれらの実験条件下でｃｄｃ２５の最大活性化はサイクリンＢの 化学量論的添加により達成される。

ｃｄｃ２５Ａの触媒活性に対するＢ−型サイクリンの同様の賦活効果を検出でき るかどうかを、多くの場合に用いられる他のＰＴＰアーゼ基質であるｐ−ニトロ フェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）（Ｔｏｎｋｓ。

３５０　：３５９−３６２　（１９９１）；Ｄｕｎｐｈｙ、Ｗ、Ｇ、ａｎｄＡ、 Ｋｕｍａｇａ　ｉ、Ｃｅ　］　ｌ　旦７　：　１８９−１９６（１９９１））、 及びｃｄｃ２タンパク質のＴｙ　ｒ　１５の回りのＮ−末端領域に対応する１８ 量体（１８−ｍａｒ）ペプチドを含む他の基質を用いて調べた（実験手順を参照 ）。最初の場合、サイクリンＢの存在下で特異的にｃｄｃ２５Ａの触媒速度が４ −５倍に活性化された（図４Ｃ）。このＰＮＰＰアッセイでは５０ピコモルのサ イクリン及びｃｄｃ２５タンパク質を用いた。１８量体ペプチドを用いた場合、 Ｂサイクリンによる同程度のＣｄｃ２５Ａ活性化が検出された（図４Ｂ）。この 実験では１０ピコモルのｃｄｃ２５タンパク質及びサイクリンを用いた。

実施例５　サイクリンＢ　１　／　ｃ　ｄ　ｃ　２はｃｄｃ２５Ａと相互作用す るｃｄｃ２５Ａホスファターゼ活性の活性化に関するデータ及び実施例４に記載 の別の研究から予測されるｃｄｃ２５とサイクリンの間の安定な相互作用の可能 性を研究するために、上記のｃｄｃ２５Ａ抗−ペプチド抗体を用いた免疫沈降物 を調製した。この場合、ｃｄｃ２５タンパク質複合体の保持に好ましい条件下で 免疫沈降を行った（実験手順を参照）。免疫沈降物を抗−サイクリンＢ１抗体（ Ｊ、Ｐｉｎｅｓにより親切に提供）又はｃｄｃ２のＣ−末端ペプチドに対して調 製された抗−Ｃｄｃ２抗体（Ｇ６）（Ｄｒａｅｔｔａ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａ ｔｕｒｅ　３３６　：　７３８−７４４　（１９８８））を用いて精査した。両 方の場合に明確なシグナルが検出され、ヒトｃｄｃ２５タンパク質がサイクリン Ｂ１及びｃｄｃ２の両方との複合体に存在することを示した（データは示してい ない）。

実施例６　ｐ１３による選択的阻害 ｐ１３はｃｄｃ２タンパク質キナーゼの必須サブニットである。しかし過剰のｐ １３はプレーＭＰＦの活性化を阻害することができる。ｐ１３がどちらかのヒト （ｄｃ２５タンパク質のホスファターゼ活性に直接影響することができるかどう かを調べるために、サイクリンＢ１を含まずに、又は０．５ｍＭ（１０ピコモル ）含んで、最終濃度２５ｍＭまで加えて実施例４及び５に記載のホスファターゼ アッセイを行った。ｃｄｃ２５Ａの場合、ｐ１３を２５ｍＭ加えることにより内 在性ホスファターゼ活性の２−３倍の阻害が観察された（図６）。この濃度はｃ ｄｃ２５タンパク質自身の濃度（０，３ｍＭ）よりずっと高いが、生体内又は試 験管内でブレーＭＰＦ活性の防止に必要な濃度と類似である（ＤｕｎイクリンＢ １を加えると、ｐ１３の阻害効果を実質的に無効にすることができ、８倍の活性 化を起こす（図６）。ｃｄｃ２５Ｂの挙動は全（異なっていた。予備実験におい てこのホスファターゼに最適のｐＨは８゜８であることが見いだされた（ｃｄｃ ２５Ａの場合の８０と対立）。

このｐＨでサイクリンＢ１はｃｄｃ２５Ａと同程度にｃｄｃ２５Ｂを活性化する ことができた。しかしサイクリンＢの存在下でも不在下でもＣｄｃ２５Ｂの活性 に対するｐ１３の影響は観察されなかった（図６）。

実験手順 以下の実験手順は実施例７−１３に記載の研究で用いた。

ＬＥＴＴＥＲ８２６６：　４−８　（１９８７））　、１ｍＭのプロゲステロン により成熟に誘導した。クセノブス中期非受精卵を１ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７ ，４，８，８ｍＨＮａＣｌ、１０ｍｇ　ＣａＣ＋２．３３ｍｇ　Ｃａ　（ＮＯり ２．０．１ｍＨＫＣＩ、８２ｍＭ　ＭｇＳＯ４，５ｍｇ／ｍｌ　Ｃａ”−イオノ ７ｔ７Ａ−２３１８７（Ｓｉｇｍａ）及び１００ｍｇ／ｍｌ　シクロへキシミド （Ｓ　ｉ　ｇｍａ）中で活性化した。４０分後、卵をホモジナイズして“活性化 卵“と呼ぶが、あるいは洗浄し、インキュベーション緩衝液（Ｊｅｓｓｕｓ、Ｃ ，ｅｔ　ａｌ、、ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ８λ旦６　：　４−８　（１９８７） ）ｌ：移し、異なる時間でホモジナイズした。抽出物の調製のために、卵母細胞 を抽出緩衝液ＥＢ　（Ｃｙｅｒｔ、Ｈ，Ｓ、ａｎｄ　Ｍ、Ｗ、Ｋｉｒｓｃｈｎｅ ｒ、ｃｅｌｌ　旦旦：１８５−１９５　（１９８８）　、８０ｍＭｂ−グリセロ ホスフェート　ｐＨ７，３，２０ｍＭ　ＥＧＴＡ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ、、１ｍ Ｍ　ＤＴＴ）中で広範囲に洗浄し、その後プロテアーゼ明害剤（２５ｍｇ／ｍｌ 　ロイペプチン、２５ｍｇ／ｍｌ　アプロチニン、１ｍＭ　ベンズアミジン、１ ０ｍｇ／ｍｌ　ペプスタチン、１０ｍｇ／ｍ１　大豆トリプシン阻害剤及び１ｍ Ｍ　ＰＭＳＦ）を用いて１体積のＥＢ中、４°Ｃで溶解し、４℃で１００．００ ０ｘｇにおいて１時間遠心した。その後上澄み液を０．２２ｍｍのＭｉｌｌｅｘ −ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて使用前に濾過した。

−！±、、ＥＭＢＯＪ、旦：　３５０７−３５１４　（１９８７））精製し、セ ファロースに共役させた。セファロースＣＬ−６Ｂと共に１時間予備インキュベ ートし、遠心して非特異的結合を除去した後、１００ｍ１の卵母細胞抽出物を４ ００ｍ１のＥＢとプロテアーゼ阻害剤及び２０ｍ１のｐ１３−セファロースビー ズと共に一定の回転下で４℃において９０分間インキュベートした。ｐ１３−セ ファロースビーズをＥＢ中で３回さらに洗浄し、８０ｍ１のＬａｅｍｍｌｉ試料 緩衝液（Ｌａｅｍｍ］　ｉ、Ｕ、に、、Ｎａｔｕｒｅ　λλユニ６８０−６８５ 　（１９７０））に再懸濁して３分間煮沸するか、あるいはヒストンＨｌキナー ゼアッセイに直接使用した。

０−３３％硫酸アンモニウム抽出物の調製前期卵母細胞をＥＢ中で広範囲に濯ぎ 、その後プロテアーゼ阻害剤を含む１体積のＥＢ中の４℃で溶解し、Ｔｉ、４１ ０−夕−（Ｂ　ｅ　ｃ　ｋｍａｎ）中の４℃で９０分間、４１．ＯＯＯｒｐｍで 遠心した。上澄み液を取り出し、０．２２ｍｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルター （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。ＥＢ中の硫酸アンモニウム飽和溶液 ０゜５体積を抽出物に加え、氷上で４５分間インキュベートし、４℃で９０分間 、４１．ＯＯＯｒｐｍで遠心し、最初の体積の１０分の１に、ｑ−グロブリンを 標準として用いたＢｉｏＲａｄのタンパク質アッセイキットで決定して１５ｍｇ ／ｍ］の最終的タンパク質濃度までベレットを再懸濁することにより、硫酸アン モニウム分別を行った。この抽出物（０−３３％画分と名付ける）を４℃のプロ テアーゼ阻害剤の存在下でＥＢに対して２時間透析し、使用まで一７０℃で保存 した。活性化の場合は、抽出物を１ｍＭ　ＡＴＰ、５０ｍｇ／ｍ！　クレアチン ホスホキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及び１０ｍＭ　ク レアチンホスフェート（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共に室温 でインキュベートした。

抗体 分裂酵母ｃｄｃ２５タンパク質を全長タンパク質を発現するニジエリ０９　（］ 　９９０））。バクテリアにより生産されたｃｄｃ２５タンパク質をＫｕｍａｇ ａｉ及びＤｕｎｐｈｙ　（Ｋｕｍａｇａ　ｉ、Ａ、　ａｎｄＷ、Ｇ、Ｄｕｎｐｈ ｙ、Ｃｅ　Ｉ　ｌ　６４　：９０３−９１４　（１９９１））により記載された 通りに精製し、可溶化した。Ｂ１抗−ｃｄｃ２９　（１９９０））　、バクテリ アにより発現されたｃｄｃ２５タンパク質に５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳 動を行い、切り出したゲル片をＰＢＳ（ホスフェート食塩水緩衝液）　（０，１ ％　ＳＤＳ、０．５％　ｂ−メルカプトエタノール）中の３７°Ｃで１６時間イ ンキュベートすることにより抽出した。遠心の後、タンパク質をＣｅｎ　ｔ　ｒ 　ｉ　ｃｏｎ−１０微量濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）上で濃縮し、ニトロセルロース （０，４５ｍＭ；５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）と共に室温 で３時間インキュベートした。ＰＢＳ　（０，１％　５ＤＳ）中で１０分間の洗 浄を３回行った後、０．　５％　ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン、Ｂ。

ｅｂｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及び０．　５％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含 むＰ’ＢＳを用いて室温で４時間フィルターを阻害（Ｂｌｏｃｋｅｄ）した。Ｐ ＢＳ　（０，１％　５ＤＳ）中で１０分間の洗浄を３回行った後、フィルターを Ｂ１抗−ｃｄｃ２５血清（Ｄｕｃｏｍｍｕｎ、Ｂ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１５ユニ３０１−３０９　 （１９９０））と共に室温で１６時間インキュベートし、ＰＢＳｌ、５％　ＳＤ Ｓ中で４倍に希釈した。その後フィルターをＰＢＳ（０，１％　Ｔｗｅｅｎ−２ ０）を用いて１０分間で３回、及びＰＢＳを用いて１０分間で１回洗浄した。精 製された抗−ｃｄｃ２５抗体を１ｍｌの１００ｍＭ　グリシン　ｐＨ２，５を用 いて溶離し、１分後に２ＱＱｍｌのＩＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０を加えた。３０ ０ｍ１のＰＢＳ（１０％　ＢＳＡ、０．５％　ＮａＮ５）を加えた後、精製され た抗体を使用まで４°Ｃで保存した。いくつかの参照標準実験の場合、ウェスタ ンプロットの前に１０ｍｇ／ｍｌの精製されたバクテリア発現酵母ｃｄｃ２５タ ンパク質を精製抗体に４℃で終夜予備吸着させた。

抗−Ｂ２サイクリン抗体はＪ、Ｇａｕｔｉｅｒからの寄贈であった（クセノブス サイクリンＢ２に対するウサギポリクローナル精製抗体；Ｇａｕｔｉｅｒ、Ｊ、 ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６０：４８７−４９４（１９９０）；Ｇａｕｔｉｅｒ 、Ｊ、ａｎｄ　Ｊ、Ｍａｌｌｅｒ、ＥＭＢＯＪ　よＯ：１７７−１８２　（１９ ９１））、抗−ｃｄｃ２抗体は、全長シゾサツカロミセス　ボンベ（Ｓｃｈｉｚ ｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ｃｄｃ２に対するウサギポリクロ ーナル精製抗体であった（Ｄｒａｅｔｔａ　Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５Ｑ ：３１９−３２５　（１９８７）　）。抗−ホスホチロシン抗体はマウスＩｇＧ モノクローナル抗体（Ａｂ−１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）であった 。この抗−ホスホチロシン抗体の感受性は、匹敵する量の前期Ｃｄｃ２が容易に 認識されるので、ｃｄｃ２５−会合ｃｄｃ２中のホスホチロシンが検出できるの に十分な感受性なはずであった。従ってｃｄｃ２５に結合した中期ｃｄｃ２にお いてシグナルが観察されないことは、この集団のｃｄｃ２がチロシン上でリン酸 化されないことを示した。

免疫沈降及びウェスタンプロット分析 ＥＢ中の卵母細胞１００ｍ１を４００ｍ１のＥｂと混合し、３０ｍ１のプロティ ンＡ−アガロースビーズ（Ｐ　ｉ　ｅ　ｒ　ｃ　ｅ）と共に４℃で１時間インキ ュベートした。抗−ｃｄｃ２５抗体（希釈１：１００）、抗−サイクリンＢ２抗 体（希釈１・５０）又は抗−ｃｄｃ２抗体（希釈１：５００）をその後上澄み液 に加え、４°Ｃて５時間インキュベートした後、３０ｍ１のプロティンＡ−アガ ロースビーズを加えた。４℃でさらに１時間インキュベートした後、ビーズをＥ Ｂ中で４回洗浄してから８０ｍ１のＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で３０分間煮沸 することにより溶離するか、あるいはその後のヒストンＨＴキナ−ゼア・ンセイ のためにキナーゼ緩衝液（５０ｍＭ　ＴＲｌ５　ｐＨ７，４，１０ｍＭ　ＭｇＣ ｌ□、５ｍＭ　ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ）中に再懸濁した。

免疫沈降物からクセノブスｃｄｃ２５タンパク質を溶離するために、免疫複合体 を２５０ｍ１の１００ｍＭ　グリシン　ｐＨ２，５中に再懸濁した。２分間撹拌 した後、５０ｍ１のＬＭ　ＴＲｌ５　ｐＨ８，０を加えた。上澄み液を回収し、 Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０微量濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）上で濃縮し、ウシ血清ア ルブミンを０．１％の最終濃度まで加えた。

抗−ｃｄｃ２５抗体（希釈１：５００）、抗−サイクリンＢ２抗体（希釈１：１ ００）又は抗−ｃｄｃ２抗体（希釈１：１０００）を用いた電気泳動及びウェス タンプロット分析は、以前に記載された通りに行った（Ｂｏｏｈｅｒ、　Ｒ，Ｎ 、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｃｅ１ｌ　５８：５８４−４９７　（１９８９）’）。

抗−ｃｄｃ２５免疫沈降前の初期の抽出物、抗−ｃｄｃ２５免疫沈降後の抽出物 及び抗−ｃｄｃ２５免疫沈降物のイムノプロット走査により（Ｆｕｊｉｘ　Ｂａ ｓ　２０００　ＩｍａｇｅＡｎａｌｙｚｅｒ）、ｃｄｃ２５の全細胞量の７０％ が抗−Ｃｄｃ２５抗体により免疫沈降したと見積もられた。同様の方法で免疫沈 降物中のｃｄｃ２又はサイクリンＢ２と会合しているｐ７２の量を、ｃｄｃ２５ の全細胞量の参照標準として粗抽出物の抗−Ｃｄｃ２５免疫プロットを用いるこ とによりＩｍａｇｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｆｕｊｉｘ　Ｂａ５２０００）で定量 した。抗−ｃｄｃ２免疫沈降物又は抗−サイクリンＢ２免疫沈降物のいずれにお いてもｃｄｃ２５の全細胞量の２０％が見いだされた。ｃｄｃ２５と会合してい るｃｄｃ２又はサイクリンＢ２の量を定量するために、等量の卵母細胞抽出物（ １０の卵母細胞から、２００ｍｇのタンパク質と等しい）をｐ１３−セファロー ス上で沈降させるか、あるいは抗−ｃｄｃ２５抗体を用いて免疫沈降させた。ｐ １３−セファロースビーズはｃｄｃ２及びサイクリンＢ２の抽出物を完全に取り 除くことがウェスタンプロットにより確認され（データは示していない）、従っ てｐ１３−沈降物はｃｄｃ２及びサイクリンＢ２の全細胞量を示す。他方、抗− ｃｄｃ２５免疫沈降物はｐ７２と会合しているｃｄｃ２及びサイクリンＢ２のみ を含む。ｐ１３−沈降物及び抗−ｃｄｃ２５免疫沈降物の両方（それぞれ１０卵 母細胞と等しい）を同一の電気泳動ゲル上に負荷し、抗−ｃｄｃ２抗体又は抗− サイクリンＢ２抗体を用いてプロットした。両袖出物中に検出されたｃｄｃ２及 びサイクリンＢ２の相対的量をＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ　（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）又はＩｍａｇｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（ＦｉｊｉｘＢ ａｓ　２０００）により決定した。ｐ１３−セファロース沈降物中に存在するｃ ｄｃ２の量は抗−ｃｄｃ２５免疫沈降物中で検出される量より２０倍高い。かく して全ｃｄｃ２の５％がｐ７２と会合する。ｐ１３−セファロース沈降物中のサ イクリンＢ２の存在量は、抗−ｃｄｃ２５免疫沈降物中で検出される量より６倍 高い。かくして全サイクリンＢ２の１７％がｐ７２と会合する。

ヒストンＨ１キナーゼアッセイ ｐ１３−沈降物又は免疫複合体をキナーゼ緩衝液中で３回洗浄し、０２ｍｇ／ｍ ｌ　ヒストンＨ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　、５０ｍＭ　 ＡＴＰ及び１ｍＣ４［ｑ３２Ｐ］　ＡＴＰ　（ＰＢ、１０１６８、Ａｍｅｒｓｈ ａｍ）を含む５０ｍ１のキナーゼ緩衝液に再懸濁した。３００Ｃで３０分間イン キュベートした後、３０ｍｌｃ）Ｌａｅｍｍ１１試料緩衝液（Ｌａｅｍｍｌ　１ ．Ｕ、に、、Ｎａｔｕｒｅ　２２ユニ６８０−６８５　（１９７０））を加える ことにより反応を停止した。試料を１２％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動 させた。クーマン−ブルーを用いた染色及びオートラジオグラフィーの後、ヒス トンＨ１中への３２Ｐ挿入を切り出したゲル片のシンチレーションカウントによ り定量した。

０−３３％画分（１０ｍｌのＥＢ中）からのタンパク質試料を、０゜２ｍｇ／ｍ ｌ　ヒストンＨ１，２５ｍＭ　ＡＴＰ、２ｍＣ１［ｑ”ＰｌＡＴＰ及び１０ｍＭ 　ＣＡＭＰ依存性プロティンキナーゼ阻害剤ペプチド（Ｐ３２９４、Ｓｉｇｍａ ）を含む４０ｍ１のキナーゼ緩衝液と氷上で混合した。３０℃で１０分間インキ ュベートした後、試料を前記の通りに処理した。

実施例７　クセノブス卵母細胞中のｃｄｃ２５タンパク質分裂酵母ｃｄｃ２５に 対する抗−ｃｄｃ２５血清を用い、ｃｄｃ２５タンパク質がクセノブス卵母細胞 中に存在するかどうかを決定した。以前にＢ１と呼ばれた（Ｄｕｃｏｍｍｕｎ、 Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１６ ヱ：３０１−３０９（１９９０））この血清を実験手順に記載の通りにアフィニ ティー精製した。これはＥ、コリ中で発現された全長酵母ｃｄｃ２５産物を認識 するが、ｃｄｃ２５の転写ｃｄｃ２５誘導の前にＥ、コリのライセード中：　３ ０１−３０９　（１９９０））。

抽出物は以下の細胞から調製した二減数分裂前期−阻害（ｂｌｏｃｋｅｄ）卵母 細胞−減数分裂中期非受精卵、ンクロへキシミドの存在下で活性化され、従って サイクリンを含まず、開期段階で阻害された卵（Ｍｕｒｒａｙ、Ａ、Ｗ、ａｎｄ 　Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ、Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ３３９　：　２７５−２８０　（１９ ８９））；及び活性化後１２０分の卵（最初のＭＰＦサイクルの完了後）。これ らの抽出物をイムノプロットにおいてアフィニティー精製血清を用いて精査した 。各試料において７２ｋＤのポリペプチドが検出された。アフィニティー精製血 清を前免疫血清又は可溶性バクテリア−発現酵母ｃｄｃ２５タンパク質を予備吸 着させた精製抗体に置換する以外は同一の方法を用い、シグナルは検出されなか った（データは示していない）。さらに酵母ｃｄｃ２５タンパク質に対する他の ２つの精製ポリクローナル抗体はクセノブス抽出物からの同一の７２ｋＤタンパ ク質を認識することができた。（Ｄｕｃｏｍｍｕｎ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、ＲｅｓＣｏｍｍ、１６ユ：　３０１−３０９　（１ ９９０））。

７２ｋＤの片を抗−ｃｄｃ２５抗体により免疫沈降させることができるかどうか を調べるために、前期卵母細胞からの抽出物、中期非受精卵及びシクロへキンミ ドの存在下で活性化した間期卵を精製抗−ｃｄｃ２５抗体を用いて沈降させ、イ ムノプロットにおいて同一の精製血清を用いて精査した。この場合も７２ｋＤの タンパク質はｃｄｃ２５抗体により特異的に検出された（データは示していない ）。対照的にクセノブス抽出物の不在下で同方法を用いた場合はシグナルが検出 されず、免疫沈降物中に観察された７２ｋＤタンパク質が抗体調剤中のｃｄｃ２ ５タンパク質（抗体のイムノ−アフィニティー精製の間に起こり得る汚染）の存 在によるものではないことを正式に示した。

可溶性７２ｋＤポリペプチドを得るために、タンパク質を低ｐＨで抗−ｃｄｃ２ ５免疫沈降物から溶離しく実験手順を参照）、ｃｄｃ２５抗体を用いたイムノプ ロットにより７２ｋＤタンパク質の量を決定した。

この場合も前期卵母細胞、中期非受精卵、間期−阻害活性化卵、及び最初のＭＰ Ｆサイクルの完了後の卵において同量の７２ｋＤタンパク質が見いだされた（デ ータは示していない）。

実施例８　ｃｄｃ２５がＭ−相キナーゼを活性化する証明ヒト及びドロソフィラ ｃｄｃ２５タンパク質はｃｄｃ２を脱リン酸化することにより（Ｄｕｎｐｈｙ、 Ｗ、Ｇ、ａｎｄ　Ａ、Ｋｕｍａｇａｉ。

Ｃｅ１ｌ　６７：１８９−１９６　（１９９１）；Ｇａｕｔｉｅｒ、Ｊ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６７：１９７−２１１　（１９９１））試験管内でｃ 　ｄ　ｃ　２／サイクリンＢの活性化の引金を引（ことができる（ＫｕＮａｔｕ ｒｅ　３５：Ｌ：２４２−２４５　（１９９１））。抗−ＣｄＣ２５抗体がクセ ノブスｃｄｃ２５を認識することをさらに調べる試験として、免疫複合体から溶 離した７２ｋＤタンパク質が不活性ｃｄｃを賦活できるかどうかを研究した。前 期卵母細胞から不活性酵素を調製するためにｐ１３−セファロースビーズを用い た。クセノプスｃｄｃ２クンバク賃は分裂酵母ｐ１３に強く、及び定量的に結合 する（Ｄｕｎｐｈｙ。

Ｗ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１　５４＋４２３−４３１　（１９８８））。

前期卵母細胞からのｐ１３−セファロース結合サイクリンＢ／ｃｄｃ２複合体は 低いヒストンＨ１キナーゼ活性を有する。前期卵母細胞又は中期非受精卵からの 抗−ｃｄｃ２５免疫沈降物から溶離したタンパク質を不活性前期ｐ１３−結合ｃ ｄｃ２に加えた。ｃｄｃ２５−免疫複合体溶離物の存在下の３０°Ｃで３０分間 予備インキュベートした後、ｐ１３−沈降物を広範囲に洗浄し、その後ヒストン Ｈ１キナーゼ活性に関して分析した。前期及び中期の両方のｃｄｃ２５はヒスト ンＨ１キナーゼ活性を１２倍賦活した。抗−ｃｄｃ２５免疫複合体中に存在する ヒストンＨ１キナーゼ活性（下記参照）のいくらかがこのキナーゼ活性の向上を 担っている可能性は除去された。第１．にｐ１３−セファロース沈降物は免疫溶 離材料と共に予備インキュベートした後及びキナーゼ活性のアッセイの前に広範 囲に洗浄した。第２に溶離された中期タンパク質に伴うヒストンＨ１キナーゼ活 性は、観察されたｐ１３−結合酵素の１２倍の賦活の説明には不十分であった（ 約５００単位の最終的活性）。第３に前期免疫溶離材料もｃｄｃ２を活性化する ことができるが、それはキナーゼ活性は含まなかった（データは示していない） 。従って活性クセノブスｃｄｃ２５タンパク質は前期卵母細胞及び中期弁の両方 からアフィニティー精製抗−ｃｄｃ２５抗体により沈降したと結論された。ｃ　 ｄ　ｃ　２／サイクリンＢが不活性であり、チロシンリン酸化されているクセノ ブス卵母細胞から活性ｐ７２が抽出できたことは驚（べきことである。

前期卵母細胞又１ｊ中期非受精卵からのｐ７２が中期非受精卵からの完全に活性 化されたｃ　ｄ　ｃ　２／サイクリン、あるいはサイクリンの不在下で不活性な ｃｄｃ２＜゛シクロへキシミドの存在下で活性化された卵から抽出された材料） の活性に影響することができるかどうかも調べた０どちらの場合もｐ７２はｃｄ ｃ２のヒストンＨ１キナーゼ活性に影響を持たなかった（データは示していない ）。活性化卵からの１つの試料で見いだされた１３５単位の活性はおそらく中期 ｃｄｃ２５に伴うキナーゼ活性と組合わされた活性化卵からのｃｄｃ２の基礎活 性（６６単位）のためであり、従ってｃｄｃ２の真の賦活を示していない。ｐ７ ２のみがチロシンリン酸化酵素に作用することが結論された。

実施例９　ブレーＭＰＦの活性化がｃｄｃ２５を必要とする証明クセノブス前期 卵母細胞はＭＰＦの不活性な形態を含み、それは生体Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃ ｅ１１．Ｂｉｏｌ、９８：１２４７−１２５５　（１９８４））及び試験管内（ Ｃｙｅｒｔ、　Ｍ、Ｓ、ａｎｄ　Ｍ、　Ｗ。

５８・１８１−１９１　（１９８９）　）の両方で転写後機構により活性化する ことができる。前期卵母細胞抽出物（３３％硫酸アンモニウム沈降画分）へのＡ ＴＰ再生系の添加は、ｃｄｃ２のチロシン脱リン酸化の誘導及びその潜在活性の 賦活に十分である（Ｃｙｅｒｔ、Ｍ、Ｓ、ａｎｄＭ、Ｗ、Ｋｉ　ｒｓｃｈｂｅｒ 、Ｃｅ　１１　５３　：１８５−１９５　（１９８３）；Ｄｕｎｐｈｙ、Ｗ、Ｇ 、ａｎｄ　Ｊ、Ｗ、Ｎｅｗｐｏｒｔ。

Ｃｅ１ｌ　５８：１８１−１９１（１９８９））、この活性化過程に内在性ｐ７ ２が必要かどうかを決定するために、前期卵母細胞からの〇−３３％硫酸ウンモ ニウム画分に抗−ｃｄｃ２５抗体を加えた効果を調べた。前期卵母細胞の高速抽 出物の０−３３％硫酸アンモニウム画分２０Ｑｍｌを４０℃で１５分間インキュ ベートした。０分で試料を室温に移し、１ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭ　クレアチン ホスフェート及び５０ｍｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼを加えた。この抽出 物へのＡＴＰ再生系の添加に続いてヒストンＨ１キナーゼが急速に活性化された （図８）。

対照的に抗−ｃｄｃ２５抗体と共に抽出物を１５分間予備インキュベートすると 活性化過程の阻害が延長された。前免疫抗−ｃｄｃ２５血清の添加は効果がなか った（図８）。この結果は、ヒストンＨ１キナーゼの活性化に内在性ｐ７２が必 要であり、それは抗体を用いた免疫複合化の後に不活性化されることを示す。バ クテリア−発現ｃｄｃ２５タンパク質を６０分において１００ｍｇ／ｍ＋で加え ると、抗−ｃｄｃ２５抗体によって起こった阻害に打ち勝つことができることも さらに見いだされ（図８）、抗体が内在性ｃｄｃタンパク質に特異的に作用する ことを示した。

実施例１０　Ｍ−相におけるｃｄｃ２５とｃｄｃ２の間の会合の証明ｃｄｃ２５ によるｃｄｃ２活性化の機構をさらに研究するために、Ｃｄｃ２５がＭ−相酵素 と直接会合する可能性を調べた。前期卵母細胞、中期非受精卵又は活性化卵の抽 出物を抗−ｃｄｃ２抗体を用いて免疫沈降させ、同抗−ｃｄｃ２抗体を用いて精 査した。予測通り強いシグナルが得られた（データは示していない）。抗−ｃｄ ｃ２抗体は１本の３４ｋＤバンドを認識したので、この抗体がクセノプス　Ｅｇ ｌ遺伝子によりコードされる３２ｋＤのｃｄｃ２一様タンパク質であるｃｄｋ２ と反応しなイコとが推定された（Ｐａｒｉｓ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８：１０３９−１０４３　（１９９１ ））。同様の抗−ｃｄｃ２免疫沈降物を精製抗−ｃｄｃ２５抗体を用いて精査し た。中期非受精卵で７２ｋｄのバンドが観察されたが、休止前期卵母細胞又はシ クロへキシミドの存在下で活性化された卵では観察されなかった。イムノプロッ トの前に精製抗−ｃｄｃ２５抗体にバクテリア発現ｃｄｃ２５を予備吸着させた 参照標準実験の場合、シグナルは検出されなかった。これらの結果はｃｄｃ２５ がＭ−相でｃｄｃ２と安定して会合することを示す。

ｃｄｃ２とｃｄｃ２５の会合の存在をさらに調べるために、逆実験も行った。精 製抗−ｃｄｃ２５抗体を用いて前期卵母細胞、中期非受精卵及び活性化卵からｃ ｄｃ２５を免疫沈降させた。それぞれの場合に等量のｃｄｃ２５が沈降した（デ ータは示していない）。その後抗−ｃｄｃ２５免疫沈降物を抗−ｃｄｃ２抗体を 用いて精査した。中期非受精卵の場合に３４ｋＤタンパク質が検出されたが、前 期卵母細胞又は活性化卵の場合は検出されなかった（データは示していない）。

この実験で検出された３４ｋＤタンパク質が実際にｃｄｃ２であるかどうかを確 認するために、前期卵母細胞、中期非受精卵及び活性化卵の抽出物を最初にｐ１ ３−セファロースと共に予備インキュベートすることによりｃｄｃ２／サイクリ ンＢ複合体を枯渇させ、その後精製抗−ｃｄｃ２５抗体を用いて免疫沈降させた 。これらの免疫複合体を抗−ｃｄｃ２抗体を用いてイムノプロットすると２４ｋ Ｄタンパク質の完全な枯渇が明らかになった（データは示していない）。従って ３４ｋＤタンパク質がｃｄｃ２であったことが結論された。さらに前期卵母細胞 、中期非受精卵及び間期卵において同量で存在するｃｄｃ２は精製抗−ｃｄｃ２ ５抗体にょるイムノプロットで認識されず、ｃｄｃ２と抗−ｃｄｃ２５抗体の間 に交差反応性がなかったことを示した。イムノプロットにおけるシグナルの定量 により（実験手順を参照）、抗−ｃｄｃ２５免疫沈降物中のｃｄｃ２の存在量は 中期の全細胞ｃｄｃ２の約５％であり、抗−ｃｄｃ２免疫沈降物中のｃｄｃ２５ の存在量はｃｄｃ２５の細胞含有量の２０％であることが算出された。

Ｍ−相からの活性ｃｄｃ２はサイクリンと会合しているので（Ｂｒｉｚｕｅｌａ 、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６： ４３６２−４３６６　（１９８９）；Ｄｒａｅｔｔａ。

Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５６：８２９−８３８　（１９８９）；Ｇａｕｔ ｉｅｒ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６０：４８７−４９４（１９９０））、 Ｍ−相でサイクリンＢがｃｄｃ２及びｃｄｃ２５と会合して存在するかどうかを さらに研究した。前期卵母細胞、中期非受精卵又は活性化卵の抽出物をｐ１３− セファロースを用いて沈降させ、抗−サイクリンＢ２抗体で精査した。サイクリ ンＢ２は前期卵母細胞及び中期非受精卵の両方に存在した（データは示していな い）。すでに記載の通ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１１４ニア５５− ７６５（１９９１））、サイクリンＢ２の２つの免疫反応性バンドが検出でき、 その中の上のバンドが減数分裂成熟の間に現れるリン酸化形態であった。対照的 にシクロへキシミドの存在下で活性化された卵ではサイクリンＢ２が検出できな かった（データは示していない）。同抽出物を抗−サイクリンＢ２抗体を用いて 免疫沈降させ、その後精製抗−ｃｄｃ２５抗体を用いて精査した。中期弁におい て７２ｋＤタンパク質がサイクリンＢ２と会合して検出されたが前期卵母細胞又 は間期卵では検出されなかった（データは示していない）。その後進実験を行っ た。３種類の細胞抽出物を精製抗−ｃｄｃ２５抗体を用いて免疫沈降させ、抗− サイクリンＢ２抗体を用いて精査した。サイクリンＢ２は中期非受精卵でｃｄｃ ２５と会合していたが、休止前期卵母細胞又は活性化卵では会合していなかった （データは示していない）。サイクリンＢ２のリン酸化形態が生にＣｄｃ２５と 会合していた。参照標準実験として、前期卵母細胞、中期弁及び活性化卵の抽出 物をｐ１３−セファロースと共にインキュベートすることにより最初にｃ　ｄ　 ｃ　２／サイクリンＢを枯渇させ、その後抗−Ｃｄｃ２５抗体を用いて免疫沈降 させた。°これらの抽出物を抗−サイクリンＢ２抗体で精査した後、シグナルは 検出されず、以前に検出された５１ｋＤバンドが実際にサイクリンであったこと を示した（データは示していない）。従ってｃｄｃ２５が中期にサイクリンＢ／ ｃｄｃ２複合体と結合することが結論された。抗−サイクリンＢ２免疫沈降物中 のｃｄｃ２５の存在量は、ｃｄｃ２との会合において以前に見いだされたｃｄｃ ２５の割合と同一であると算出された（ｃｄｃ２５の全細胞含有量の２０％）。

対照的にｃｄｃ２５＝会合サイクリンＢ２はサイクリンＢ２の全数の１７％であ り、これはｃｄｃ２５−会合ｃｄｃ２の量（５％）より高いパーセンテージであ る。

実施例１２　ｃｄｃ２５と会合したＭ−相キナーゼは活性である中期にｃｄｃ２ は主にチロシン脱リン酸化されており、ヒストンＨ１キナーゼとして活性である 。ｃｄｃ２は中期のみにｃｄｃ２５と会合するので、複合化ｃｄｃ２のチロシン リン酸化状態及びキナーゼ活性を研究した。抗−ホスホチロシン抗体を用いたｐ １３−セファロース沈降物のイムノプロットにより、前期卵母細胞においてｃｄ ｃ２が重度にチロシンリン酸化されており、中期非受精卵において実質的に脱リ ン酸化されているが、以前に示された通り異なるバッチの中期弁はｃｄｃ２チロ シン脱リン酸化の程度がいくらか異なることが確認された（ＤｕｎｐｈＬＥＴＴ ＥＲ３２６６：４−８（１９９０））。シクロへキシミドの存在下で活性化され 、従ってサイクリンＢを含まない卵においてｃｄｃ２のチロシンリン酸化は検出 できなかった。（Ｓｏ、ｌｏｍｏｎ、Ｍ。

Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６３：１０１３−１０２４（１９９１）も参照） 。前期卵母細胞、中期非受精卵又は活性化卵からの抗−ｃｄｃ２５免疫複合体を 、同一の抗−ホスホチロシン抗体で精査すると、中期非受精卵からの免疫複合体 中に豊富なｃｄｃ２が存在するにもかかわらずホスホチロシン−含有タンパク質 は検出されなかった（データは示していない）。ｃｄｃ２５−会合ｃｄｃ２が実 質的にチロシンリン酸化された場合、イムノプロットにおいて十分な強さのシグ ナルが現れる。この結果は、中期非受精卵中のｃｄｃ２５と会合したｃｄｃ２の 画分がヒストンＨ１キナーゼとして活性であると思われることを示唆した。これ は真実であることが見いだされた：ｐ１３−セファロース沈降物におけるキナー ゼ活性は前期卵母細胞において非常に低く、中期非受精卵において３１倍に向上 し、シクロへキシミドの存在下における活性化の間に減少する。中期卵からの抗 −ｃｄｃ２５免疫沈降物においてヒストン上１キナーゼ活性が検出された。前期 卵母細胞及び活性化卵からの抗−Ｃｄｃ２５免疫沈降物において検出された活性 はバックグラウンドレベルに匹敵しくデータは示していない）、これらの抽出物 にｃｄｃ２キナーゼが存在しないことを示した。ｐ１３−セファロース沈降物及 び抗−Ｃｄｃ２５免疫沈降物における相対的中期キナーゼ活性の比較により（約 ２０倍の差）、ｃｄｃ２の特異的活性は各試料において基本的に同一であること が見いだされた。

的である クセノブスｃｄｃ２５タンパク質の存在量は減数分裂成熟の間、又は最初の胚周 期（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｃｙｃｌｅ）において変化しないように思われる（デ ータは示していない）。しかしタンパク質は中期非受精卵においてｃｄｃ２及び サイクリンＢと会合して見いだされるのみであった。これをもっと厳密に調べる ために、中期非受精卵をＣＡ２”−イオノフオア及びカルシウムの存在下で単為 発生的に活性化し、ｐ１３−セファロース沈降物において最初の１５０分間ヒス トンＨ１キナーゼ活性を評価した。種々の間隔で１００の卵をホモジナイズし、 遠心し、沈降させた。ヒストン上１キナーゼ活性は活性化の約２０分後に消失し 、６０−９０分の第１分裂の時に再出現し、再度低下して第２有糸分裂の時に最 後にピークに達する（図９）。同細胞抽出物から採取した試料を抗−ｃｄｃ２５ 抗体を用いて免疫沈降させ、抗−ｃｄｃ２血清を用いてイムノプロットし、会合 の程度を算出した。抗−ｃｄｃ２５免疫沈降物中に存在するｃｄｃ２の相対的量 をＰｈｏｓｐｈｏｒ−１ｍａｇｅｒにより定量した。ｃｄｃ２／サイクリンＢ複 合体とｃｄｃ２５の会合の周期的間隔は、ｐ１３−結合酵素活性の周期性と同一 であった（図９）。

しかしわずかな相の移動が記録された。会合は全ヒストンＨ１キナーゼの少し前 にピークに達した。繰り返し実験において（データは示していない）、会合のパ ターンは常に同一であった。しかしいくつかの場合にヒストン上１キナーゼ活性 及びｃｄｃ／サイクリンＢとｃｄｃ２５の会合の間の相の移動があまり明白でな かった。

実験手順 以下の材料、方法及び手順は実施例１４−１８に記載の研究を行う時に用いた。

フッ化ナトリウム、ナトリウムオルトバナデート、ニトロフェノール、シスプラ チン（ｃ　ｉ　ｓ−ｐ　Ｉ　ａ　ｔ　ｉｎｕｍ）　、イソプロピル　β−Ｄ−チ オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ｌ−メチルアデニン、ジチオトレイトール （ＤＤＴ）　、ＥＧＴＡＳＥＤＴＡＳＭＯＰＳ、β−グリセロホスフェート、ロ イペプチン、アプロチニン、大豆トリプシン阻害剤、ベンズアミジン、ヒストン Ｈ１（Ｉ　Ｉ　Ｉ−３型）、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ、グルタチオン −アガロース（Ｇ　４５１０Ｌグルタチオン（Ｇ　４２５１）、ノニデット　Ｐ ２Ｏ（ＮＰ４０）　、Ｔｒ　ｉ　ｓ。

ＬＢブロスペースなどの化学品は、Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅ　ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ ｍから得、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）にナトリウム塩六水 和物、参照番号１２，８８６．８２）はＪａｎｓｓｅｎＣｈｉｍｉｃａから得た 。

［γ−３２Ｐ］　−ＡＴＰ　（ＰＢ　１．６８）及び１２５１］−プロティンＡ （ＩＭ　１４４）はＡｍ　ｅ　ｒ　Ｓ　）１　＋ｌ　ｍから得た。

Ｇ１抗−ｐ３４°６″抗体及び抗−ｐ８０°６°２５抗体（ｃｄｃ２５Ｃホスフ ァターゼペプチドＨ２Ｎ−ＱＥＧＥＲＱＬＲＥＱＩＡＬＬＶＫＤＭＳ−ＣＯＯＨ に対する）は、Ｄｒ、Ｇ、Ｄｒａｅｔｔａ　（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）により親 切に提供され、抗−サイクリンＢｃｄｃ１３（ヒトデ）抗体はＤｒ、Ｔ、Ｋｉｓ ｈｉｍｏｔｏ　（Ｔｏｋｙｏ）により寛大な供与を受け、抗−ホスホチロシン抗 体はＤｒ、Ｊ、　Ｙ、Ｊ、　Ｗａｎｇ　（ＬａＪｏｌｌａ）の親切により送られ 、Ｈ２Ｎ−ＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫＡＲＨＫＬＳ−ＣＯＯＨ（調節トレオ ニン−１４及びチロノン−１５残基を含むｐ３４′＋ｌｃ２ペプチド）に対する 抗体はＤｒ、Ｌ、　Ｔｕｎｇ　（Ｐｈｉ　１ａｄｅｌｐｈｉａ）の親切により提 供された。この最後の抗体はチロシン−リン酸化ｐ３４　ｅｄｔＱを認識せず、 チロシン脱リン酸化ｐ３４　ｔｄｔｌのみを認識する。

緩衝液 卵母細胞ホモジナイズ緩衝液は６０ｍＭ　β−グリセロホスフェート、１５ｍＭ 　ｐ−ＮＰＰ、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ　ｐＨ７，２，１５ｍＭＥＧＴＡ、１５ｍＭ 　ＭｇＣＩ　２．１ｍＭ　ＤＴＴ、０８１ｍＭ　ナトリウムバナデート、０．１ ｍＭ　フッ化ナトリウム、１０μｇロイペプチン／ｍｌ、１０μｇアプロチニン ／ｍｌ、１０μｇ大豆トリプシン阻害剤／ｍｌ、１００μＭ　ベンズアミジンを 含んだ。この緩衝液はヒトデ減数分裂卵母細胞Ｍ相−特異的ヒストンＨ１キナー ゼを安定化することが以前に示された（Ｐｅｌｅｃｈ、Ｓ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、 Ｂｉｏｃ２５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＥＧＴＡ、０．１ ％　ＮＰ４０．１０μｇＯイペブチン／ｍｌ、１０μｇ７ブロチニン／ｍ１．１ ０μｇ大豆トリプシン阻害剤／ｍｌ及び１００μＭ　ベンズア１５０ｍＭ　Ｎａ Ｃｌを含んだ。

リン酸塩−緩衝食塩水（ＰＢＳ）は９．６ｍＭ　リン酸塩、２．７ｍＭ　ＮａＣ ｌを含んだ。

ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０μｇロイペプチン／ｍｌ、１０μｇアプロチニ ン／ｍｌ、１０μｇ大豆トリプシン阻害剤／ｍｌ及び１００μｇベンズアミジン ／ｍｌを含んだ。

Ｔｒｉｓ緩衝液緩衝液台ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，Ｏ１５ＱｍＭＮａＣ］、１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴを含んだ。

溶離緩衝液はＴｒｉｓ緩衝液緩衝液的中ｍＭ　グルタチオンを含んだ。

Ｇ２及びＭ相開母細胞の調製 Ｇ２及びＭ相開母細胞は以下の通りに調製したニスコツトランド（Ｎｏｒｔｈｅ ｒｎ　Ｂｒ１ｔｔａｎｙ）で集めた成熟ヒトデ（マルクステリアス　グラシアリ ス（Ｍａｒｔｈａｓｔｅｒｉａｓ　ｇｌａｃｉａｌｉｓ））から性腺を取り出し た。それらを液体窒素中で直接凍結して一８０℃に保つ（Ｇ２卵母細胞）か、あ るいは天然の海水中で１０μＭ１−メチルアデニンと共に１０分間インキュベー ト（Ｍ、卵母細胞）した。その時点までにすべての卵母細胞はＭ相に入るがまだ 性腺中にあった。その後これらをインキュベーション培地から取り出し、迅速に 濾紙上にプロットし、液体窒素中で直接凍結して一８０°Ｃに保った。

転移緩衝液は３９ｍＭ　グリツツ、４８ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　３Ｎ　ｏ、３７％ＳＤ Ｓ、２０％　メタノールを含んだ。

バクテリア増殖及びｃｄｃ２５Ａ誘導 ＩＰＴＧの制御下でグルタチオン−８−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びヒト ｃｄｃ２５Ａの遺伝子融合構築物をコードするプラスミドを含むＥ　コリ株（Ｂ Ｌ　２１（ＤＥ３））を用いた（Ｇａｌａｋｔｉｎ。

ｎｏｖ、に、ａｎｄ　Ｄ、Ｂｅａｃｈ、Ｃｅ１ｌ　６７：１１８１−１１９４　 （１９９１））　。最初にＥ、　コリを１００μｇアンピシリン／ｍ１　ＬＢ培 地の存在下の３７℃で終夜増殖させた。１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含む ＬＢに１リツトル当たり４ｍｌのこの予備培養物を接種した。培養物の５００ｎ ｍにおけるＯ、　Ｄ、が０．　８−１．００に達するまで（約４−５時間）３０ ℃でインキュベーションを続けた。この時点で０．４ｍＭのＩＰＴＧを加え、培 養物を２５℃で少な（とも７時間インキュベートした。その後４℃で１５分間、 ３０００ｇの遠心を行うことにより細胞を収穫した。抽出までベレットを一８０ ℃で凍結して保存した。

不活性プレーＭＰＦ　（Ｇ２）は、サイクリンＢ及びそのトレオニン−１４及び チロシン−１５残基上でリン酸化されたｐ３４　ｃｄｃｌから構成されている。

ｐ８Ｑ　ｃｄｃｌ５はチロシン−１５残基及びおそらくトレオニン−１４を脱リ ン酸化するホスファターゼである。その作用はＧ２／Ｍ転移の誘導を担うｐ３４ °１゛２／サイリクンＢ　ｃ″ｃ１３ｃ１３キナーゼに導く。これらの成分の相 互作用及び不活性プレーＭＰＦ　（Ｇ２）の活性化を図１０に示す。キナーゼ活 性の賦活を変化させるその能力に関して調べるべき薬剤を不活性プレーＭＰＦ　 （Ｇ２）と合わせ、もし効果があるならそれを測定する。調べた薬剤が阻害剤で あれば不活性プレーＭＰＦは活性化されないであろう。

実施例１５　ＧＳＴ　Ｃｄｃ２５Ａホスファターゼの生産及び精製グルタチオン −８−トランスフェラーゼ（Ｇ　Ｓ　Ｔ）及びヒトｃｄｃ２５Ａの間の融合構築 物をプラスミドベクター中に構築した（Ｇａｌａｋｔｉｏｎｏｖ、に、ａｎｄ　 Ｄ、Ｂｅａｃｈ、Ｃｅ１ｌ　６７：１１８１−１１９４　（１９９１））。それ はＥ、コリにトランスフェクトされ、発現され、大量の対応する融合タンパク質 を生産し、それをグルタチオン−アガロースビーズ上のアフィニティークロマト グラフィーにより精製した。ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａホスファターゼの生産、精製 及びアッセイの案を下記に詳細に記載する。生産は、組み換えＥ、コリの培養、 及びＩＰＴＧによるＧＳＴ−ｃ　ｄ　ｃ　２５Ａ発現の古典的誘導を含んだ。グ ルタチオン−アガロース上の１段階アフィニティー−クロマトグラフィーにより ＧＳＴ−ＣｄＣ２５Ａホスフアターゼを精製することができた。

バクテリア抽出物体積／グルタチオン−アガロース体積の最適比は６−１０対１ であることが見いだされた。ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａはバクテリアベレ、ト（非常 に安定）、遠心バクテリア抽出物の上澄み液として保存するか、あるいはアフィ ニティー精製後に４０％のグリセロール（最終体積）の存在下で保存する。

バクテアリペレットは４℃の細胞溶解緩衝液中で音波処理により破壊した。ホモ ン不−トを４°Ｃで１００．０００ｇにおいて３０分間遠心し、上澄み液を同様 の条件下で再度遠心し、その直後に最終的上澄み液をグルタチオン−アガロース ビーズ（細胞溶解緩衝液で平衡化）と混合し、４°Ｃで３０分間回転させた（６ −１０体積の上澄み液７１体積の充填ビーズ）。グルタチオン−アガロースビー ズを１０体積の細胞溶解緩衝液で３回、その後１０体積のＴｒｉｓ緩衝液緩衝液 台洗浄した。融合タンパク質の溶離は、Ｔｒｉｓ緩衝液緩衝液的中ｍＭ　グルタ チオンで３−４回連続的に洗浄することにより誘導した。溶離の効率をホスファ ターゼアッセイにより監視した。活性の両分を集め、直接用いるか、あるいは４ ０％のグリセロースを補足してから一８０℃で保存した。

グルタチオン−アガロースビーズはＩＭ　ＮａＣ１で洗浄し、その後細胞溶解緩 衝液で平衡化することにより容易にリサイクルした。

ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａホスファターゼ活性は、色素原性基質ｐ−ニトロフェニル ホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）を用いて非常に簡単に分析することができる。数個 のパラメーターに関する最適条件は、下記の通引こ１ｍｌアッセイにより決定し た。結果は図においてグラフにより示す：ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａホスファターゼ の量（図１２Ａ）、アッセイの持続時間（図１２Ｂ）　、ＤＴＴ濃度（図１３Ａ ）　、ｐ−ＮＰＰ濃度（図１３Ｂ）。

１ｍｌアッセイ＋１００μｌのＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａタンパク質（δＯＤ４１０ ｎｍ＝０．３／１０分の活性まで希釈）を１００μｌのｍＭＤＴＴ　（Ｔｒ　ｉ 　ｓ緩衝液Ａ中）及び７００μｍのＴｒｉｓ緩衝液緩衝液台した。１００μｍの ５００ｍＭ　ｐ−ＮＰＰ　（ｔ　ｒ　ｉ　ｓ緩衝液Ａ中）を加えることによりア ッセイを開始した。３７℃で１０分間インキュベートした後、４０μｌの５Ｎ　 ＮａＯＨを加え、管を４℃とすることによりアッセイを停止した。その後４１０ ｎｍにおける吸収を測定し、ブランク値（ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａタンパク質を含 まずに１０分間インキュベート）を引き去った。

このアッセイをその後２００μｌに規模縮小し、下記に詳細に記載する通り９６ −ウェルの微量滴定プレート中で半自動的に行った。各ウェルに２０μｍのＧＳ Ｔ−ｃｄｃ２５Ａホスファターゼ、１４０μｍのＴｒｉｓ緩衝液Ａｌ２Ｏμｌの １００ｍＭ　ＤＴＴ（Ｔｒｉｓ緩衝液緩衝液を満たし、３７℃で１５分間平衡化 した後、２０μｌの５００ｍＭ　ｐ−ＮＰＰ　（Ｔｒ　ｉ　ｓ緩衝液Ａ中）を加 えることにより反応を開始した。

６０分間インキュベートした後、４０５ｎｍにおける吸収を微量プレートリーダ ーで監視し、ブランク値（ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａを加えない）を引き去った。

り質（δＯＤ４０５ｎｍ＝０．２−０．３／６０分まで希釈）を９６−ウエルノ 微量滴定プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で２０μｍの１００ｍＭ　ＤＴＴ（Ｔｒ ｉｓ緩衝液Ａ中）及び１４０μｌのＴｒｉｓ緩衝液Ａト混合した。プレートをＤ ｅｎｌｅｙ　Ｗｅｌｌｗａｒｍ　１　微量プレートインキュベーターにおいて３ ７℃で１５分間予備インキュベートした。２０μｌの５００ｍＭ　ｐ−ＮＰＰ　 （Ｔｒ　ｉ　ｓ緩衝液Ａ中）を加えることによりアッセイを開始した。３７℃で ６０分間インキュベートした後、４０５ｎｍにおける吸収をｂｉｏＲａｄ微量プ レートリーダーで測定した。ブランク値（ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａタンパク質を加 えない）は自動的に引き去った。

ｐ３４°６゛２／サイクリンＢ　ｅｄｃ′３キナーゼを脱リン酸化及び活性化す るＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａ融合タンパク質の能力を示した。Ｇ２一体止ヒ）−テ卵 母細胞カラ１７１り　３４　””／”ｊイク’Ｊ　ンＢ”°１３重合体ヲｐ９ｃ ＫＳｈ１アガロース上に固定した。これはチロノン−リン酸化ｐ３４　＋ｄｃｉ 及びサイクリン１３ｅｄｅ１３から構成されている（Ａｒｉｏｎ、Ｌ、ｅｔ　ａ ｌ、。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　：　（１９９２）　；Ｐｏｎｄａｖｅｎ、 　Ｐ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　４：９−１７　 （１９９０）　）。

精製ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａタンパク質で処理すると、ｐ３４　ｃｄｃ３の移動度 の移動、抗−ホスホチロシン抗体との交差反応性の損失、及びチロシン−１５残 基を含むｐ３４　ＣｄｔＱペプチドに対する抗体との交差反応性の出現によりほ とんど完全なチロシン脱リン酸化が誘導された（データは示していない）。さら にこのチロシン脱リン酸化は、Ｍ相即母細胞において見いだされる程度に近い程 度までのヒストンＨ１キナーゼ活性化に導いた（図１１）。これらの基準により 、ＧＳＴ−ｃｄｃ２Ａ融合タン融合タンパ線質ｐＢ　Ｏｃｄｅ２ｇの生理学的酵 素活性のすべてを示すと思われる。

ｐ　３４　””／サイクリンＢ″１゛１３キナーゼ活性のアッセイ２ｍｌのホモ ジネート緩衝液当たり１ｇの６２又はＭ相性腺をホモジナイズすることにより卵 母細胞抽出物を調製した。４℃において１４゜０００ｇで１０分間遠心した後、 Ａｚｚｉ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、（Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、：印刷中（１９９２））に記載の通りにして調製したｐｇ ｃｘｓｈ“１−アガロースビーズに上澄み液を負荷した（４００μｌ上澄み液／ １０μｍ　ｐＣＫＳｈ＋１−ビーズ）。管を４℃で３０分間、一定の回転下に保 った。１０，０００ｇで短時間の遠心及び上澄み液の除去の後、ビーズをビーズ 緩衝液で３回洗浄し、最後に精製ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａホスファターゼに暴露し てからＨ１キナーゼアッセイ又はイムノプロット分析を行った。

ヒストンＨ１キナーゼアッセイは、１０μｌの充填ｐ９ｃＫＳｌ′”−ビーズ（ Ｇ２又はＭ相捕出物を負荷した）を、４０μｍの最終体積中１ｍｇのヒストン１ １１／ｍｌの存在下で１５μＭの［７−３２Ｐ］　ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ミ リモル；　１ｍＣ１／ｍｌ）と共に３０℃で１０分間インキュベートすることに より行った。管を氷上に移すことによりアッセイを停止した。１０，０００ｇで 短時間遠心した後、上澄み液の３０μｍのアリコートをＷｈａｔｍａｎ　Ｐ８１ ホスホセルロース紙の２゜５ｘ３ｃｍの片にスポットし、２０秒後に１０ｍ１　 リン酸／１１　水の溶液中で５回（各ロウなくとも５分）フィルターを洗浄した 。湿ったフィルターを６ｍｌのプラスチックのシンチレーションびんに移し、５ ｍｌのＡＣ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）シンチレーション液を加え、試料の放射性を Ｐａｃｋａｒｄカウンターで測定した。

電気泳動及びウェスターンプロット ｐｇｌＪｓｈ′ｌ−セファロースビーズに結合したタンパク質を５０μｍの２Ｘ 　Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を用いて回収した。試料を１０％　ＳＤＳ／ポリア クリルアミドゲルにおいて移動させた。タンパク質をクーマン−ブルーで染色す るか、あるいは転移緩衝液中で、Ｍｉｌｌｉｂｌｏｔ／ＳＤＥ系（Ｍｉ　１１１ ｐｏｒｅ）中の０．１μｍのニトロセルロースンー１−　（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ ｒ　＆　５ｃｈｕ１１）に２．５ｍＡ／ｃｍ２において３０分間転移させた。そ の後フィルターを３％のウシ血清アルブミンを含むＴＢＳを用いて室温で１時間 阻害（ｂｌｏｃｋｅｄ）した。その後フィルターを、ｇｌ　抗−ｐ３４ｃｄｃ２ 抗体（１゜１０００希釈）、抗−ｐ　３４　””ペプチド抗体（１：５００希釈 ）又は抗−ホスホチロシン抗体（１μｇ／ｍｌ）と共に４℃で終夜インキュベー トした。鉤　２％のＮＰ４０を含むＴＢＳで各回１５分づつ４回洗浄した後、フ ィルターをＴＢＳ中３％のウシ血清アルブミン中で１μＣｉのＩｚｓｌ−プロテ ィンＡ　（３０ｍＣｉ　／ｍｇ）を用い、室温で２時間処理した。ＴＢＳ中の０ ．２％のＮＰ４０で１５分間４回洗浄した後、フィルターをハイパーフィルムＭ Ｐ　（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）に終夜暴露した。

実施例１８　精製ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａホスファターゼの阻害剤の検出１系列の 実験において、癌治療で現在用いられている種々の抗分裂性化合物をホスファタ ーゼの阻害剤の可能性のある薬剤として調べた（表を参照）。それらのほとんど はＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ挿入剤、トポイソメラーゼ２阻害剤又は紡錘体微小管と 抵触する化合物として作用すると報告されている。それらのいずれもＧＳＴ−ｃ ｄｃ２５Ａホスファターゼ活性を示さなかった。正の標準としてチロシンホスフ ァターゼの阻害剤として報告されているバナデートも調べた（Ｇｏｒｄｏｎ、Ｊ 、Ａ、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｐｐ、４４７−４８２（１９９ １））。この化合物は５００ｇＭより高濃度においてＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ａホス ファターゼを全体的に阻害する（図１４：Ｉｓ。：２０μＭ）。

Ｐ２Ｏ”°２５Ａの阻害剤の可能性のある薬剤として調べた抗分裂性化合物 化合物　調べた濃度範囲 一アクチンマイシンＤ　０．１１−１Ｏ（ｂｚ／ｍ１−ＢＣＮＵ　０．１−１０ ０μｇ／ｍｌ−カーポプラチン　０．１−１００μｇ／ｍｌ−クロルメチン　０ ．１１−１Ｏ（ｂｚ／ｍｌ−ンスブラチン　０．１−１００μｇ／ｍｌ−シクロ ホスファミド　０．１−１００μｇ／ｍｌ−ダカルバジン　０．１−１００μｇ ／ｍｌ−ドクソルビシン　０．１−１００μｇ／ｍ１−エトポシド　０．１−１ ００μｇ／ｍｌ−フルオロウラシル　０．１−１００μｇ／ｍｌ−ギロリン　０ ．３６−３６０μｇ　／　ｍ　］−メトトレキセート　鉤　１−１００μｇ／ｍ ｌ−ノポビオノン　０．１−１００μｇ／ｍｌ−ビンブラスチン　０．１−１０ ０μｇ／ｍｌ−ピンクリスチン　領　１−１００μｇ／ｍｌ化合物のいずれも示 された濃度範囲にわたって、酵素に対する５−１０％以上の阻害活性を示さなか った。

同等事項 当該技術分野における熟練者は日常的実験のみを用い、本明細書に記載の発明の 特定の実施態様に対する同等事項を確かめることができる。

そのような同等事項は以下の請求の範囲に含まれるものとする。

ＣＣ入へ人ＧＣＣＣＣＣｅＣ？ＣｅＣ入Ｃ＾ＧＣＣＴＧ　（Ａ丁λ＾Ｇ＾ｃｃ丁 　Ｇ丁入ＣＣ丁ｇ　丁ＴＧＣｅ　６０Ｆｉｇｕｒｅ　１（ａ）−パネルΔ Ｆｉｇｕｒｅ　１（ｂ）　−バーｔルＡＦｉｇｕｒｅ　１（ｃ）−パネル△ ｅ？ｃｃｅｃ’ｒｃｃｃ　ｃｃｃｃｃｃｃｃ’ｒｅ　ｃｘｃｃｃｘｃαゴｃｃｃ ｘｃｃｗπαｙｗｃＸ；ＴｎＣ，ＴＴＱＧＴＣＴＧＣＣ６゜ｃＴＣｃｃｃ　ｃｃ ｅ　ｃｔｃ　ｅｒａ　ｅｒａ　ｃａ＾？（ゴＣＪ？　ＣＴＣＣＴＣＣ”ｍ　０５ Ｇ　？ｅｅ　ＣＯＳ　Ｃ丁Ｇ　２０４Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｙ　シｍｕ　Ｌ＠ｕ 　ＸＡｕ　Ｇｌｙ　Ｉ＊ｒ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ｘｘｕ　ｔａｕ　ｃｌｙ　！ｓｒ 　Ｐｒｏ　Ｖａ１３０　コ５　４０ Ｆｉｇｕｒｅ　１（ｄ）−パネルＢ Ｆｉｇｕｒｅ　１（ｅ）　−ハネ／ｌ／ＢＦｉｇｕｒｅ　１（ｆ）　−／＜＊ル ＢＦｉｇｕｒｅ　３（ａ） 時間（時） Ｆｉｇｕｒｅ　３（ｂ） 時間（時） 時間（分） Ｆｉｇｕｒｅ　４（ａ） Ｆｉｇｕｒｅ　４（ｂ） Ｃ ○　２０　４０　６０　８０　ｔｏ。

時間（分） Ｆｉｇｕｒｅ　４（ｃ） サイクリンＢｌ（ピコモル） Ｆｉｇｕｒｅ　５ Ｆｉｇｕｒｅ　７（ｂ） Ｆｉｇｕｒｅ　８ ｐ３４ＣｄＣ２−ｐ７２ＣｄＣ２５ｏア（−）（任意単位） Ｐ 不活性　（Ｇ２）　活性　ＣＭ） Ｇ２　Ｍ　Ｇ２　Ｇ２ ０　２０　４０　６０　８０　１００　＋２０ＧＳＴ−ＣｄＣ２５Ａ濃度（μｇ ） Ｆｉｇｕｒｅ　１２（ａ） 時間（分） Ｆｉｇｕｒｅ　１２（ｂ） ＤＴＴ＋濃度（ｍＭ） Ｆｉｇｕｒｅ　１３（ａ） ｐ−ＮＰＰ濃度（ｍＭ） Ｆｉｇｕｒｅ　１３（ｂ） Ｆｉｇｕｒｅ　１４ 補正書の写しく翻訳文）提出口　（特許法第１８４条の８）平成６年５月１３日

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）図１、パネルＡ（配列番号：１）に記載のヌクレオチド配列を有する単 離ｃｄｃ２５ＡＤＮＡ、 ｂ）図１、パネルＢ（配列番号：３）に記載のヌクレオチド配列を有する単籠ｃ ｄｃ２５ＢＤＮＡ、 ｃ）図１、パネルＡのｃｄｃ２５ＡＤＮＡの全体又はその一部、あるいはそれら の相補配列全体又はその一部とハイブリッド形成する核酸配列を有する同等ｃｄ ｃ２５遺伝子、ｄ）図１、パネルＢのｃｄｃ２５ＢＤＮＡの全体又はその一部、 あるいはそれらの相補配列全体又はその一部とハイブリッド形成する核酸配列を 有する同等ｃｄｃ２５遺伝子、ｅ）高度に保存された領域とハイブリッド形成す る核酸配列を有する同等ｃｄｃ２５遺伝子（配列番号：９）から成る群より選ば れるｃｄｃ２５ホスファターゼをコードする単離ＤＮＡ。
2. ２．哺乳類起源である、請求の範囲１に記載の単離ＤＮＡ。
3. ３．ヒト起源である、請求の範囲２に記載の単離ＤＮＡ。
4. ４．ａ）ｃｄｃ２５Ａ遺伝子によりコードされる組み換えｃｄｃ２５タンパク質 、 ｂ）ｃｄｃ２５Ｂ遺伝子によりコードされる組み換えｃｄｃ２５タンパク質、 ｃ）ｃｄｃ２５Ａ遺伝子の全体又は一部とハイブリッド形成する核酸配列を有す る同等ｃｄｃ遺伝子によりコードされる組み換えｃｄｃ２５タンパク質、 ｄ）ｃｄｃ２５Ｂ遺伝子の全体又は一部とハイブリッド形成する核酸配列を有す る同等ｃｄｃ遺伝子によりコードされる組み換えｃｄｃ２５タンパク質、 ｅ）高度に保存された領域とハイブリッド形成する核酸配列（配列番号：９）を 有する同等ｃｄｃ遺伝子によりコードされる組み換えｃｄｃ２５タンパク質から 成る群より選ばれる組み換えｃｄｃ２５タンパク質。
5. ５．タンパク質が融合タンパク質ｃｄｃ２５−グルタチオン−Ｓ−トランスフェ ラーゼである、請求の範囲４に記載の組み換えｃｄｃ２５タンパク質。
6. ６．ヒト起源である、請求の範囲４に記載の組み換えｃｄｃ２５タンパク質。
7. ７．精製ｃｄｃ２５Ａタンパク質。
8. ８．哺乳類起源である、請求の範囲６に記載の精製ｃｄｃ２５Ａタンパク質。
9. ９．図１、パネルＡのアミノ酸配列を有する、請求の範囲７に記載の精製ｃｄｃ ２５Ａタンパク質。
10. １０．精製ｃｄｃ２５Ｂタンパク質。
11. １１．哺乳類起源である、請求の範囲９に記載の精製ｃｄｃ２５Ｂタンパク質。
12. １２．図１、パネルＢのアミノ酸配列を有する、請求の範囲１０に記載の精製ｃ ｄｃ２５Ｂタンパク質。
13. １３．ｃｄｃ２５Ａタンパク質に特異的に結合する抗体。
14. １４．ｃｄｃ２５Ｂタンパク質に特異的に結合する抗体。
15. １５．ａ）ヒト起源のＤＮＡライブラリを準備し、ｂ）それぞれが２つの既知の ｃｄｃ２５遺伝子に関して共通のアミノ酸領域に対応する少なくとも２つの縮重 オリゴヌクレオチドプライマーを用いてｃＤＮＡライブラリを精査し、プライマ ーとハイブリッド形成するｃＤＮＡを増幅し、それによりプライマーにハイブリ ッド形成する増幅ｃＤＮＡを生産し、 ｃ）（ｂ）で生産された増幅ｃＤＮＡをクローニングし、それにより増幅−誘導 クローンを生産し、 ｄ）（ｃ）で生産された増幅−誘導クローンを用いてヒトｃＤＮＡライブラリを スクリーニングし、それにより増幅−誘導クローンとハイブリッド形成するｃＤ ＮＡを含むクローンを同定する段階を含む、ヒト起源のｃｄｃ２５遺伝子の同定 法。
16. １６．（ｂ）の縮重オリゴヌクレオチドプライマーがそれぞれドロソフィラメラ ノガステルｓｔｒｉｎｇ及びＳ．セレビシアエｍｉｈ１の共通のアミノ酸領域に 対応する、請求の範囲１５に記載の方法。
17. １７．ａ）真核生物起源のｃＤＮＡフラグメントのライブラリを準備し、 ｂ）（ａ）で準備したライブラリを、ｃｄｃ２５ＡＤＮＡ挿入片を含むクローン を用い、ｃｄｃ２５ＡＤＮＡ挿入片のライブラリのｃＤＮＡフラグメントとのハ イブリッド形成に適した条件下でスクリーニングし、 ｃ）段階（ｂ）でｃｄｃ２５Ａ挿入片とハイブリッド形成するｃＤＮＡフラグメ ントを同定する段階を含む、真核生物起源のｃｄｃ２５遺伝子の同定法。
18. １８．真核生物が哺乳類である、請求の範囲１７に記載の方法。
19. １９．ｃｄｃ２５ホスファターゼとサイクリンＢの複合化を阻害する薬物を細胞 中に導入することを含む、細胞においてｃｄｃ２５ホスファターゼの活性化を阻 害する方法。
20. ２０．ｃｄｃ２５ホスファターゼがヒト起源である、請求の範囲１９に記載の方 法。
21. ２１．ｃｄｃ２５ホスファターゼがｃｄｃ２５Ａホスファターゼ又はｃｄｃ２５ Ｂホスファターゼである、請求の範囲２０に記載の方法。
22. ２２．薬物が、 ａ）ｃｄｃ２５ホスファターゼをコードするＤＮＡと結合するオリゴヌクレオチ ド、 ｂ）ｃｄｃ２５ホスファターゼと特異的に結合する抗体、ｃ）ｃｄｃ２５ホスフ ァターゼと結合するペプチド又は小有機化合物、 ｄ）ｃｄｃ２５及びサイクリンＢの結合が阻害されるような方法でサイクリンＢ と結合するペプチド又は小有機化合物、ｅ）サイクリンＢの推定ｃｄｃ２５活性 化ドメインを阻害するペプチド又は小有機化合物、 ｆ）サイクリンＢを分解する薬剤、及びｇ）ｃｄｃ２５ホスファターゼを分解す る薬剤から成る群より選ばれる、請求の範囲２０に記載の方法。
23. ２３．ｃｄｃ２５ホスファターゼによるｃｄｃ２キナーゼの活性化を阻害する薬 物を細胞中に導入することを含む、真核細胞におけるｃｄｃ２キナーゼの活性化 を阻害する方法。
24. ２４．ｃｄｃ２５ホスファターゼがヒト起源である、請求の範囲２３に記載の方 法。
25. ２５．ｃｄｃ２５ホスファターゼがｃｄｃ２５Ａホスファターゼ又はｃｄｃ２５ Ｂホスファターゼである、請求の範囲２４に記載の方法。
26. ２６．薬物が、 ａ）ｃｄｃ２５ホスファターゼをコードするＤＮＡと結合するオリゴヌクレオチ ド、 ｂ）ｃｄｃ２５ホスファターゼと特異的に結合する抗体、ｃ）ｃｄｃ２５ホスフ ァターゼと結合するペプチド又は小有機化合物、 ｄ）ｃｄｃ２５及びサイクリンＢの結合が阻害されるような方法でサイクリンＢ と結合するペプチド又は小有機化合物、ｅ）サイクリンＢの推定ｃｄｃ２５活性 化ドメインを阻害するペプチド又は小有機化合物、 ｆ）ｃｄｃ２５ホスファターゼの触媒活性を阻害するペプチド又は小有機化合物 、 ｇ）サイタリンＢを分解する薬剤、 ｈ）ｃｄｃ２５ホスファターゼを分解する薬剤、及びｉ）ｃｄｃ２５遺伝子によ りコードされるｍＲＮＡと結合する薬剤から成る群より選ばれる、請求の範囲２ ３に記載の方法。
27. ２７．ｃｄｃ２５ホスファターゼの触媒活性を阻害する薬剤を細胞中に導入する ことを含む、真核細胞におけるｃｄｃ２キナーゼの活性化を阻害する方法。
28. ２８．ｃｄｃ２５ホスファターゼの触媒活性を阻害する薬物を細胞中に導入する ことを含む、真核細胞における細胞分裂を阻害する方法。
29. ２９．ａ）１）評価するべき化合物、 ２）ｃｄｃ２５、 ３）ｃｄｃ２５チロシンホスファターゼ活性の基質を合わせ、ｂ）（ａ）で形成 した組み合わせを、ｃｄｃ２５が（ａ）（２）の基質に作用するのに適した条件 下に保ち、ｃ）（ａ）で形成した組み合わせ中に存在するｃｄｃ２５が（ａ）（ ３）の基質に作用する程度を、ｃｄｃ２５及び（ａ）（３）の基質を含む参照標 準に対して決定する段階を含み、（ａ）で形成した組み合わせ中に存在するｃｄ ｃ２５が参照標準中に存在するｃｄｃ２５より低い程度でｃｄｃ２５チロシンホ スファターゼ活性の基質に作用する場合に、化合物がｃｄｃ２５チロシンホスフ ァターゼ活性の阻害剤であることを特徴とする、ｃｄｃ２５チロシンホスファタ ーゼ活性の阻害剤である化合物の同定法。
30. ３０．ｃｄｃ２５チロシンホスファターゼ活性の基質が不活性ｃｄｃ２／サイク リンである、請求の範囲２９に記載の方法。
31. ３１．ｃｄｃ２５が融合タンパク質の成分であり、ｃｄｃ２５チロシンホスファ ターゼ活性の基質がｐ−ニトロフェニルホスフェートである、請求の範囲２９に 記載の方法。
32. ３２．ｃｄｃ２５がｃｄｃ２５Ａ、ｃｄｃ２５Ｂ及びｃｄｃ２５Ｃから成る群よ り選ばれる、請求の範囲２９に記載の方法。
33. ３３．ａ）１）ｃｄｃ２５融合タンパク質、２）ｃｄｃ２５のチロシンホスファ ターゼ活性の基質、及び３）真核細胞の後期Ｇ２からＭ相への転移を阻害する能 力に関して評価するべき化合物を合わせ、それにより組み合わせを形成し、ｂ） （ａ）で形成した組み合わせをｃｄｃ２５が（ａ）（２）の基質に作用するのに 適した条件下に保ち、ｃ）（ａ）で形成した組み合わせ中に存在するｃｄｃ２５ が（ａ）（２）の基質に作用する程度を、ｃｄｃ２５及び（ａ）（２）の基質を 含む適した参照標準に対して決定する段階を含み、（ａ）で形成した組み合わせ 中に存在するｃｄｃ２５が参照標準中に存在するｃｄｃ２５より低い程度で（ａ ）（２）の基質に作用する場合に、化合物が阻害剤であることを特徴とする、真 核細胞の後期Ｇ２からＭ相への転移の阻害剤である化合物の同定法。
34. ３４．ｃｄｃ２５がｃｄｃ２５Ａ、ｃｄｃ２５Ｂ及びｃｄｃ２５Ｃから成る群よ り選ばれる、請求の範囲３２に記載の方法。
35. ３５．ｃｄｃ２５融合タンパク質がｃｄｃ２５−グルタチオン−Ｓ−トランスフ ェラーゼである、請求の範囲３４に記載の方法。
36. ３６．融合タンパク質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ｃｄｃ２５チ ロシンホスファターゼ融合タンパク質であり、ｃｄｃ２５のチロシンホスファタ ーゼ活性の基質がｐ−ニトロフェニルホスフェートである、請求の範囲３５に記 載の方法。
37. ３７．ａ）１）ｃｄｃ２５チロシンホスファターゼを含む融合タンパク質、 ２）ｃｄｃ２５チロシンホスファターゼ基質、及び３）ｃｄｃ２５チロシンホス ファターゼ活性の阻害剤の可能性のある薬剤を合わせ、それにより組み合わせを 形成し、ｂ）（ａ）で形成した組み合わせを、ｃｄｃ２５チロシンホスファター ゼがｃｄｃ２５チロシンホスファターゼ基質に作用するのに適した条件下に保ち 、 ｃ）（ａ）（１）の融合タンパク質中のｃｄｃ２５チロシンホスファターゼが（ ａ）で形成した組み合わせ中のｃｄｃ２５チロシンホスファターゼ基質に作用す る程度を決定し、ｄ）（ｃ）の結果を、（ａ）（３）のｃｄｃ２５チロシンホス ファターゼ活性の阻害剤の可能性のある薬剤の不在下で（ａ）（１）の融合タン パク質中のｃｄｃ２５チロシンホスファターゼが（ａ）（２）のｃｄｃ２５チロ シンホスファターゼ基質に作用する程度と比較する段階を含み、阻害剤の可能性 のある薬剤の存在下でｃｄｃ２５チロシンホスファターゼがｃｄｃ２５チロシン ホスファターゼ基質に作用する程度が阻害剤の可能性のある薬剤の不在下でｃｄ ｃ２５チロシンホスファターゼがｃｄｃ２５チロシンホスファターゼ基質に作用 する程度より低い場合に、薬剤が阻害剤であることを特徴とする、真核細胞の有 糸分裂の阻害剤を同定する方法。