FR2815347A1 - METHODE D'OBTENTION DE LA PHOSPHATASE Cdc25C HUMAINE ET METHODE D'IDENTIFICATION DE MODULATEURS DE LA PHOSPHATASE Cdc25C HUMAINE - Google Patents
METHODE D'OBTENTION DE LA PHOSPHATASE Cdc25C HUMAINE ET METHODE D'IDENTIFICATION DE MODULATEURS DE LA PHOSPHATASE Cdc25C HUMAINE Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne une méthode d'obtention de la phosphatase cdc25C humaine. L'invention a en particulier pour objet une protéine de fusion entre la phosphatase cdc25C humaine et la protéine liant le maltose (Maltose Binding Protein ou MBP) d'Escherichia coli, la séquence d'ADN codant pour ladite protéine de fusion, un procédé de préparation de ladite protéine de fusion ainsi qu'une méthode d'identification de modulateurs de la protéine cdc25C humaine.
Description
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Méthode d'obtention de la phosphatase Cdc25C humaine et méthode d'identification de modulateurs de la phosphatase Cdc25C humaine La présente invention concerne une méthode d'obtention de la phosphatase Cdc25C humaine. Elle concerne également une méthode d'identification de modulateurs de la phosphatase Cdc25C humaine.
L'entrée de la cellule dans le processus de la division cellulaire est régulée par un ensemble de kinases et de phosphatases utiles pour synchroniser les différentes phases du cycle cellulaire et permettre la réorganisation de l'architecture cellulaire.
Les kinases dépendantes des cyclines (CDKs) jouent un rôle majeur dans ce contrôle et déjà plusieurs inhibiteurs de cette famille de kinases sont identifiés. Un de ces composés (Flavopiridol) est déjà en Phase II clinique (Senderowicz, A. M. et coll., J. Clin. Oncol.
(1998), 16 : 2986-2999).
Ces CDKs sont activées par une déphosphorylation effectuée par les phosphatases Cdc25, sur des résidus tyrosine et thréonine. Dans les cellules humaines, les protéines Cdc25 sont codées par une famille : Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C (Cans, C., et coll.
Medicine Sciences (1998), 3 : 269-274).
Quelques inhibiteurs de Cdc25 sont identifiés, mais ils possèdent seulement une faible activité (cf. Baratte, B., Meijer, L., Galaktionov, K., et Beach, D., Anticancer Reis. (1992), 12 : 873-880 ; Rice, R. L. et coll., Biochemistry (1997), 36 : 15965-15974 ; et Ham, S. W., Park, J., Lee, S. J., Kim, W., Kang, K., et Choi, K. H., [In Process Citation], Bioorg. Med. Chem Lett. (1998), 8 : 2507-2510).
La phosphatase Cdc25C est elle même régulée par phosphorylation sur la sérine-216 par d'autres enzymes Cdsl ou Chkl et se lie à des membres très conservés de la famille des protéines 14-3-3 (Zeng, Y. et coll., Nature (1998), 395 : 507-510).
La recherche d'inhibiteurs plus efficaces des phosphatases passe par la nécessité d'avoir une protéine qui conserve son activité phosphatase, en quantité non limitante pour autoriser des criblages à grande échelle.
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L'étude d'une protéine nécessite de grandes quantités de cette dernière pour satisfaire à toutes les caractéristiques qui peuvent être analysées notamment dans les domaines tels que la biophysique (taille, séquence, structure...), de la biochimie (activité, stabilité, régulation...) ou de la pharmacologie (activateurs, inhibiteurs,...).
La production et la purification de cette protéine purifiée en grande quantité se heurte à plusieurs obstacles qui peuvent être : - expression absente ou trop faible de la protéine ;
expression d'une protéine tronquée ; obtention d'une protéine sans activité biologique ; - perte de l'activité biologique de la protéine durant la purification ; - rendement de purification très faible ; perte de l'activité biologique de la protéine durant la conservation ; perte de la source de production.
expression d'une protéine tronquée ; obtention d'une protéine sans activité biologique ; - perte de l'activité biologique de la protéine durant la purification ; - rendement de purification très faible ; perte de l'activité biologique de la protéine durant la conservation ; perte de la source de production.
Seul le succès à chacune de ces étapes permet finalement de produire à long terme une protéine biologiquement active en quantité illimitée. Face à de telles exigences, la purification de nombreuses protéines reste un processus très délicat voire même impossible dans certains cas.
Cependant, de nombreux efforts sont faits pour développer de nouvelles stratégies de production et de purification telles que : - culture de cellules (animales ou végétales) à grande échelle ; culture de microorganismes (bactéries, levures) à grande échelle ; - immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps spécifique à partir d'un mélange de protéine ; - chromatographie d'affinité, à l'aide d'un ligand spécifique (effecteurs, répresseurs, activateurs) ; - électrophorèse bidimensionnelle, en fonction de la masse moléculaire et du point isoelectrique de la protéine ; - électrophorèse capillaire ; - enrichissement par précipitation différentielle avec différents sels - etc.
Par ailleurs, de nouveaux systèmes essaient maintenant de combiner la production et la purification de la protéine. Ces systèmes permettent une expression souvent inductible de la production d'une protéine recombinante fusionnée avec une protéine permettant une chromatographie d'affinité (appelée tag). Cette dernière partie peut être éliminée par
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l'addition d'une protéase qui reconnaît spécifiquement l'endroit de la fusion (Sheibani, N., Prep. Biochem. Biotechnol. (1999), 29 : 77-90). Le nombre de systèmes proposés augmentent mais le succès de ces différentes approches reste très variable en fonction des protéines à purifier. La conformation et la solubilité des protéines restent des paramètres
impossibles à contrôler dans ces nouveaux systèmes (voir Guise, A. D., West, S. M. et Chaudhuri, J. B., Mol. Biotechnol. (1996), 6 : 53-64 ; Kelley, R. F. et Winkler, M. E., Genet. Eng. (N. Y., 1990), 12 : 1-19).
impossibles à contrôler dans ces nouveaux systèmes (voir Guise, A. D., West, S. M. et Chaudhuri, J. B., Mol. Biotechnol. (1996), 6 : 53-64 ; Kelley, R. F. et Winkler, M. E., Genet. Eng. (N. Y., 1990), 12 : 1-19).
La protéine Cdc25C pourrait être fusionnée avec des systèmes aussi variés que : 1. Le résidu de six histidines reconnu par l'anticorps anti-motif six histidine (Katsafanas, G. C. et Moss, B., Virology (1999), 258 : 469-479) ; 2. Le résidu de neuf acides aminés de Hemagglutinine d'Influenza reconnu par l'anticorps 3F10 (Robert, I. et Quirin-Stricker, C., J. Mol. Neurosci. (1998),
11 : 243-251) ; 3. Le résidu de 11 acides aminés du virus de stomatite vésiculaire reconnu par l'anticorps P5D4 (Le Maout, S., et coll., Proc. Natl. Acad. Sei. US. A. (1997), 94 :
13329-13334) ; 4. Le résidu de 6 acides aminés de la protéine de capside du virus bovin papilloma (AU1) reconnu par l'anticorps anti-AUl (Le Maout, S., et coll., Proc. Natl. Acad Sei. US. A. (1997), 94 : 13329-13334) ; 5. Le résidu de 12 acides aminés de la chaîne lourde de la protéine C reconnu par l'anticorps HPC4 (Rezaie, A. R., et coll., Protein Expr. Purif. (1992), 3 : 453-460) ; 6. La protéine C-myc reconnue par l'anticorps 9E10 (Bae, S. H., et coll., J. Biol.
11 : 243-251) ; 3. Le résidu de 11 acides aminés du virus de stomatite vésiculaire reconnu par l'anticorps P5D4 (Le Maout, S., et coll., Proc. Natl. Acad. Sei. US. A. (1997), 94 :
13329-13334) ; 4. Le résidu de 6 acides aminés de la protéine de capside du virus bovin papilloma (AU1) reconnu par l'anticorps anti-AUl (Le Maout, S., et coll., Proc. Natl. Acad Sei. US. A. (1997), 94 : 13329-13334) ; 5. Le résidu de 12 acides aminés de la chaîne lourde de la protéine C reconnu par l'anticorps HPC4 (Rezaie, A. R., et coll., Protein Expr. Purif. (1992), 3 : 453-460) ; 6. La protéine C-myc reconnue par l'anticorps 9E10 (Bae, S. H., et coll., J. Biol.
Chem. (1999), 274 : 14624-14631) ; 7. La protéine bêta galactosidase affine pour l'amino-phényl bêta D thiogalactopyranoside (Germino, J. et Bastia, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
(1984), 81 : 4692-4696) ; 8. La protéine Gluthation S transférase reconnue par l'anticorps anti-GST (Carr, S., et coll., Vaccine (1999), 18 : 153-159), 9. La biotin-carboxylase carrier affine pour l'avidine (Germino, F. J. et Moskowitz,
N. K., Methodç Enzymol. (1999), 303 : 422-450) ; 10. La protéine Intein affine pour la chitine (voir Chong, S., et coll., Gene (1997),
192 : 271-281 ; Carr, S., et coll., Vaccine (1999), 18 : 153-159) ; 11. La protéine liant le maltose affine pour l'amylose (Ahaded, A., et coll., Prep.
N. K., Methodç Enzymol. (1999), 303 : 422-450) ; 10. La protéine Intein affine pour la chitine (voir Chong, S., et coll., Gene (1997),
192 : 271-281 ; Carr, S., et coll., Vaccine (1999), 18 : 153-159) ; 11. La protéine liant le maltose affine pour l'amylose (Ahaded, A., et coll., Prep.
Biochem. Biotechnol. (1999), 29 : 163-176,1999).
Pour autant, rien ne permet de prédire si l'opération sera effectivement couronnée de succès.
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La demanderesse vient cependant de mettre au point une méthode qui permet l'obtention de l'enzyme Cdc25C humaine sous une forme active et en quantité illimitée.
La présente invention facilite d'une part la recherche et l'étude des activités physiologiques ou/et physio-pathologiques de cette protéine et d'autre part facilite la recherche d'agents modulateurs de ces activités.
L'invention permet d'obtenir une protéine humaine Cdc25C recombinéc avec la protéine liant le maltose (MBP) qui conserve son activité phosphatase sans nécessiter la séparation avec la partie MBP, prévenant ainsi toute contamination avec des protéases.
Le haut niveau du taux d'expression de la protéine après induction permet un rendement de purification excellent et la préparation en quantité illimitée de l'enzyme.
La présente invention a tout d'abord pour objet une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25C humaine et la protéine liant le maltose (Maltose Binding Protein ou MBP), laquelle est caractérisée en ce qu'elle consiste en la séquence SEQ. ID no 1 (représentée plus loin).
Elle a également pour objet l'ADN codant pour ladite protéine de fusion, ainsi que l'ADN complémentaire à l'ADN codant pour ladite protéine de fusion.
L'invention a de plus pour objet la souche bactérienne JM 109 transfectée par le plasmide de séquence SEQ. ID no 5 (représentée plus loin). Ladite souche est utile à la préparation de la protéine Cdc25C.
L'invention concerne de plus un procédé de préparation de ladite protéine de fusion, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes : - culture de la souche bactérienne JM 109 transfectée par le plasmide de séquence SEQ. ID no 5 dans un milieu LB additionné d'ampicilline ; - induction de la synthèse de la protéine de fusion par ajout d'isopropylthiogalactoside ; - lyse des bactéries ; - purification de la protéine de fusion obtenue par chromatographie sur résine d'amylose-agarose et récupération des fractions contenant la protéine purifiée.
L'invention concerne enfin une application de ladite protéine de fusion à une méthode d'identification de modulateurs de la protéine Cdc25C, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes successives suivantes :
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- ajout, à une solution de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine, de la protéine de fusion telle qu'obtenue par le procédé de préparation décrit précédemment et d'un composé présumé être un modulateur de la protéine Cdc25C ; - détermination de la quantité de 3-0-méthylfluorescéine produite rapportée à la quantité
initiale de phosphate de 3-0-méthylfluorescéine.
initiale de phosphate de 3-0-méthylfluorescéine.
La détermination de la quantité de 3-0-méthylfluorescéine produite peut être réalisée, par exemple, par mesure de la densité optique de la solution, de l'absorbance liée à la 3-0-méthylfluorescéine à la longueur d'onde de 477 nm, ou bien encore par tluorimétrie en utilisant une excitation à la longueur d'onde de 475 nm et une lecture à la longueur d'onde de 510 nm.
A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevets, tous les brevets et toutes autres références mentionnées ici sont incorporées par référence. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Matériels et méthodes : 1-Construction du vecteur d'expression pour MBP-Cdc25C. 1. 1-Principe du système utilisé. Le système utilisé (New England Biolabs #800-pMALTM protein fusion et système de purification) est basé sur la production d'une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt, ici la protéine Cdc25C humaine, et la protéine bactérienne MBP (Maltose-Binding Protein) d'Escherichta coli. Cette méthode permet de purifier en une étape la protéine de fusion grâce à l'affinité de la MBP pour le maltose.
Matériels et méthodes : 1-Construction du vecteur d'expression pour MBP-Cdc25C. 1. 1-Principe du système utilisé. Le système utilisé (New England Biolabs #800-pMALTM protein fusion et système de purification) est basé sur la production d'une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt, ici la protéine Cdc25C humaine, et la protéine bactérienne MBP (Maltose-Binding Protein) d'Escherichta coli. Cette méthode permet de purifier en une étape la protéine de fusion grâce à l'affinité de la MBP pour le maltose.
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1. 2-Origine de l'ADNc de Cdc25C L'ADN codant pour la phosphatase Cdc25C humaine correspond à l'Accession number 4502706.
A partir de ce plasmide, l'ADN codant pour Cdc25C a été amplifié par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant les amorces C-XBAI SENS et C-XBAI ANTI-SENS (de séquences SEQ. ID. n,-,-3 et 4 respectivement) et introduit dans le vecteur pCDNA3-HA au site Xbal pour donner le vecteur pcDNA3-HA Cdc25C.
L'insert Cdc25C/Xbal a été, à ce stade, séquençé dans son intégralité.
L'amorce C-XBAI SENS a pour séquence la séquence SEQ. ID. no 3 représentée ci-après : 5'-GTTCTAGAAT GTCTAGAA CTCTTC-3' L'amorce C-XBAI ANTI-SENS a pour séquence la séquence SEQ. ID. no 4 représentée
ci-après :
5'-GGCTCTGA GTTGCGC CGG-3'
1. 3-Construction du vecteur pMAL-Hs Cdc25C
Le vecteur pcDNA3-HA Cdc25C a été digéré par Xbal, l'insert Cdc25C/Xbal (1456 paires de bases) purifié et introduit dans le vecteur pMALTM-c2X (New England Biolabs, #800-76) au site Xbal, pour donner le vecteur pMAL-Hs Cdc25C (de séquence
SEQ. ID no 2). Ce vecteur permet la production d'une protéine de fusion MBP-Cdc25C de 868 acides aminés, à partir du promoteur bactérien Ptac inductible par l'isopropylthiogalactoside (IPTG).
ci-après :
5'-GGCTCTGA GTTGCGC CGG-3'
1. 3-Construction du vecteur pMAL-Hs Cdc25C
Le vecteur pcDNA3-HA Cdc25C a été digéré par Xbal, l'insert Cdc25C/Xbal (1456 paires de bases) purifié et introduit dans le vecteur pMALTM-c2X (New England Biolabs, #800-76) au site Xbal, pour donner le vecteur pMAL-Hs Cdc25C (de séquence
SEQ. ID no 2). Ce vecteur permet la production d'une protéine de fusion MBP-Cdc25C de 868 acides aminés, à partir du promoteur bactérien Ptac inductible par l'isopropylthiogalactoside (IPTG).
La séquence SEQ. ID. no 2 de la protéine Hs Cdc25C avec ses extrémités de restriction XBAI est la suivante : TCTAGAATGT... CTACGGAACT... CTT. CT. CAT. CC.... AÇ. AAGAGAGG.... AAGGAAGC TC.... TGGCTCAGGA CCCAG. TTTTA... GGTCTAA. TCA.... AAGGAAAA. TG..... TAAAÇCTGÇ.... TCC TGGAGAG.... AGAÇACTTCC Ç 9A . AACCT. AAGCA.... TTTTGTÇTGG... AGGAACCCCA... AAATGTTGCÇ.... TCGATCTTTC.... GAATÇTTAGÇ . AAC. C. T. AAGCA.... TT...
CTGGATTÇTT.... CAGGAÇTTCA... GGAAGTGÇAT.... T1 ; AGÇ. TGGGA.... TGAATÇATGA.... CÇAGCACÇTA AÇÇTTPA7PA..... A. A s. W.
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qÇ ! ? ÇAgçAÇA .. p (. T7ç7TTQ7....... ATggTTTGGA CCGTGGCCAT AGAAAGAGAG... A. TGÇAATGTG.... TAGTTCATÇT.... GCAAATAAAG.... AAAATGACAA.... TGGAAACTTG TC-. T. TG G. TGGACAG. TG.... AAA. TGAAATA,.... TTTGGGÇAG.... CCCATTAÇ. TA.... CTGTTCCAAA.... ATTGGATAAA A PçAqQÇAÇAN.... GAGATT ggAÇM=Ç T.... TÇAAggACAA CACAATACCA AA. T. ÇCAAA. CC.... TAGGAGAAGA.... CCAGGÇAGAA... GAGATTEÇ. AG.... ATGAATTAAT.... GGAGTTTTCC TGCTGGAGGA,... AG TAA. Ç .... T ! : 7QTÇ. T. Ç ............................ uç CTGAAAGAT. Ç.. AAGAAG.A A.... GGT AG. ÇAGA.... AGTGGÇÇ. TAT.... ATCGCTCCCC.... GTÇGATGCCA . A.... ÇTTCTTTCTG hAQAAgÇÇÇA TCGTCCCTTT GGACACCCAG AAGAQAA . ÇAT. AAA < 3. TT. A... AAAAAAAGA..... TT. TT. T. CTGC.... CAAGGAAAGÇ..... TC AGGAAGGG.... CTTATGTTTA AAGAAGAÇAG.... TC. TÇTCTGTG..... TGAÇATTAÇT..... ATÇ. ACTÇAGA.... TGCTGGAGGA.... AGA'tTCTAAC .... ÇQÇ. TG T CAGGGGCAÇ. Ç.... TGATTGGTGA... 1TT. TTC. ÇAAG.... GT ; ATGTGÇGC.... TGCCAACCGT.... GTÇAGGÇAAA .......................................
AÇ ! qM ! -2A.... CCACAGAGCT.... AC CCCTAT . ÇAGGGCG. A... TTGAGAAG. TT.... '. TATGT. ÇA. T'..... ATTGTCGÇT.... ATCGATATGA..... GTATCJGGGA GGACACATCC... AGGGAGC. Ç. TT.... AAACT.ATA..T.... AGTÇAGGAAG.... AACTGTTTAA......CTTCTTTCTG AAGAAGCC. Ç. A... T. ÇGTCCCTTT.... GGAÇAÇC. CAG.... AAGAGAAT : AA.... TCATCGTG1T.... CCAC. TGTGAA TTCT. ÇCTÇAS.... A ( ? AGGG ( ?. ÇC. C... CCGAA.
AAC. ÇAGTA. T. C... CTG. ÇATGTA.... ÇTACÇCAGAG... C. TATATATÇÇ..... TTAAAGGCGG.... CTACAGAGAC CACTGGCTGC TAACATCTAG A GAC. ÇACAAGA..... CTG. AG. TTGC. T.... GAGGTGT. ÇGA..... AGÇÇAGAGCA.... AAGTGCAGGA.... AGCCGAGCGG CAGCGCGGG... AGCAGATTGÇ..... CCTTCTGGT. G..... AAGGAÇATGA.... GCCCATGATA ACATTCCAGC CACTGGCTGC TAACATCTAG A
(les sites XBAI sont soulignés en continu, l'ORF de Cdc25C est souligné en pointillé)
1. 4-Création de la souche JM109/pMAL-Hs Cdc25C
Le vecteur pMAL-Hs Cdc25C a été introduit dans la souche d'Escherichia coli (E. coli) JM109 (Stratagène #200271). Une colonie isolée a été sélectionnée et la production d'une protéine de poids moléculaire apparent théorique de 97 kDa après culture en présence d'IPTG a été observée par l'analyse des protéines bactériennes totales sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration au bleu de Coomassie. L'identité de la protéine de fusion a été ensuite confirmée par western blot et immunodétection avec un anticorps antiCdc25C (référence).
(les sites XBAI sont soulignés en continu, l'ORF de Cdc25C est souligné en pointillé)
1. 4-Création de la souche JM109/pMAL-Hs Cdc25C
Le vecteur pMAL-Hs Cdc25C a été introduit dans la souche d'Escherichia coli (E. coli) JM109 (Stratagène #200271). Une colonie isolée a été sélectionnée et la production d'une protéine de poids moléculaire apparent théorique de 97 kDa après culture en présence d'IPTG a été observée par l'analyse des protéines bactériennes totales sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration au bleu de Coomassie. L'identité de la protéine de fusion a été ensuite confirmée par western blot et immunodétection avec un anticorps antiCdc25C (référence).
Finalement, l'ADN plasmidique isolé de ce clone a été séquence dans la région correspondant à Cdc25C pour vérifier l'absence de mutations ou de modifications de la séquence qui auraient pu être générées au cours des processus de sous-clonage et/ou de transformation de l'ADN.
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La séquence suivante (désignée par SEQ. ID. no 5) a été obtenue pour la souche Jim109/ pMAL-Hs Cdc25C : CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC GCGACTGGGC GTGGAGCATC TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTCGG CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATCAAATT CAGCCGATAG CGGAACGGGA AGGCGACTGG AGTGCCATGT CCGGTTTTCA ACAAACCATG CAAATGCTGA ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATCTCGGTA GTGGGATACG ACGATACCGA AGACAGCTCA TGTTATATCC CGCCGTTAAC CACCATCAAA CAGGATTTTC GCCTGCTGGG GCAAACCAGC GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA AGGGCAATCA GCTGTTGCCC GTCTCACTGG TGAAAAGAAA AACCACCCTG GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACAATTCT CATGTTTGAC AGCTTATCAT CGACTGCACG GTGCACCAAT GCTTCTGGCG TCAGGCAGCC ATCGGAAGCT GTGGTATGGC TGTGCAGGTC GTAAATCACT GCATAATTCG TGTCGCTCAA GGCGCACTCC CGTTCTGGAT AATGTTTTTT GCGCCGACAT CATAACGGTT CTGGCAAATA TTCTGAAATG AGCTGTTGAC AATTAATCAT CGGCTCGTAT AATGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCCAGT CCGTTTAGGT GTTTTCACGA GCACTTCACC AACAAGGACC ATAGATTATG AAAATCGAAG AAGGTAAACT GGTAATCTGG ATTAACGGCG ATAAAGGCTA TAACGGTCTC GCTGAAGTCG GTAAGAAATT CGAGAAAGAT ACCGGAATTA AAGTCACCGT TGAGCATCCG GATAAACTGG AAGAGAAATT CCCACAGGTT GCGGCAACTG GCGATGGCCC TGACATTATC TTCTGGGCAC ACGACCGCTT TGGTGGCTAC GCTCAATCTG GCCTGTTGGC TGAAATCACC CCGGACAAAG CGTTCCAGGA CAAGCTGTAT CCGTTTACCT GGGATGCCGT ACGTTACAAC GGCAAGCTGA TTGCTTACCC GATCGCTGTT GAAGCGTTAT CGCTGATTTA TAACAAAGAT CTGCTGCCGA ACCCGCCAAA AACCTGGGAA GAGATCCCGG CGCTGGATAA AGAACTGAAA GCGAAAGGTA AGAGCGCGCT GATGTTCAAC CTGCAAGAAC CGTACTTCAC CTGGCCGCTG ATTGCTGCTG ACGGGGGTTA TGCGTTCAAG TATGAAAACG GCAAGTACGA CATTAAAGAC GTGGGCGTGG ATAACGCTGG CGCGAAAGCG
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GGTCTGACCT TCCTGGTTGA CCTGATTAAA AACAAACACA TGAATGCAGA CACCGATTAC TCCATCGCAG AAGCTGCCTT TAATAAAGGC GAAACAGCGA TGACCATCAA CGGCCCGTGG GCATGGTCCA ACATCGACAC CAGCAAAGTG AATTATGGTG TAACGGTACT GCCGACCTTC AAGGGTCAAC CATCCAAACC GTTCGTTGGC GTGCTGAGCG CAGGTATTAA CGCCGCCAGT CCGAACAAAG AGCTGGCAAA AGAGTTCCTC GAAAACTATC TGCTGACTGA TGAAGGTCTG GAAGCGGTTA ATAAAGACAA ACCGCTGGGT GCCGTAGCGC TGAAGTCTTA CGAGGAAGAG TTGGCGAAAG ATCCACGTAT TGCCGCCACC ATGGAAAACG CCCAGAAAGG TGAAATCATG CCGAACATCC CGCAGATGTC CGCTTTCTGG TATGCCGTGC GTACTGCGGT GATCAACGCC GCCAGCGGTC GTCAGACTGT CGATGAAGCC CTGAAAGACG CGCAGACTAA TTCGAGCTCG AACAACAACA ACAATAACAA TAACAACAAC CTCGGGATCG AGGGAAGGAT TTCAGAATTC GGATCCTCTA AAGC. TCJ. GG < ;....... TCA. GGA. C. CCA...... GT. TT. AGG. TC....... T. AAT. C. AA. AGG....... AAAAT. GT' !'. AA A, Ç. CT. GC ;. T. Ç ; C'P....... GGA. GAG. AGAÇ....... AC. TTC. CTT.'KA....... Ç. Ç. Gt'. Ç. T. G. TQ Ç....... AGATG.'EQC. Ç. T ...... Ç. Ç. 9. T. Q T. Ç. T Ç. Ç.
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TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA GGATCTTCTT GAGATCCTTT TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC AAAAAAACCA CCGCTACCAG CGGTGGTTTG TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC CAACTCTTTT TCCGAAGGTA ACTGGCTTCA GCAGAGCGCA GATACCAAAT ACTGTCCTTC TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA AGAACTCTGT AGCACCGCCT ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG CCAGTGGCGA TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA CCGGATAAGG CGCAGCGGTC GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG CGAACGACCT ACACCGAACT GAGATACCTA CAGCGTGAGC TATGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA CAGGTATCCG GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC TTCCAGGGGG AAACGCCTGG TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG AGCGTCGATT TTTGTGATGC TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC GCCAGCAACG CGGCCTTTTT ACGGTTCCTG GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC TCACATGTTC TTTCCTGCGT TATCCCCTGA TTCTGTGGAT AACCGTATTA CCGCCTTTGA GTGAGCTGAT ACCGCTCGCC GCAGCCGAAC GACCGAGCGC AGCGAGTCAG TGAGCGAGGA AGCGGAAGAG CGCCTGATGC GGTATTTTCT CCTTACGCAT CTGTGCGGTA TTTCACACCG CATATGGTGC ACTCTCAGTA CAATCTGCTC TGATGCCGCA TAGTTAAGCC AGTATACACT CCGCTATCGC TACGTGACTG GGTCATGGCT GCGCCCCGAC ACCCGCCAAC ACCCGCTGAC GCGCCCTGAC GGGCTTGTCT GCTCCCGGCA TCCGCTTACA GACAAGCTGT GACCGTCTCC GGGAGCTGCA TGTGTCAGAG GTTTTCACCG TCATCACCGA AACGCGCGAG GCAGCTGCGG TAAAGCTCAT CAGCGTGGTC GTGCAGCGAT TCACAGATGT CTGCCTGTTC ATCCGCGTCC AGCTCGTTGA GTTTCTCCAG AAGCGTTAAT GTCTGGCTTC TGATAAAGCG GGCCATGTTA AGGGCGGTTT TTTCCTGTTT GGTCACTTGA TGCCTCCGTG TAAGGGGGAA TTTCTGTTCA TGGGGGTAAT GATACCGATG AAACGAGAGA GGATGCTCAC GATACGGGTT ACTGATGATG AACATGCCCG GTTACTGGAA CGTTGTGAGG GTAAACAACT GGCGGTATGG ATGCGGCGGG ACCAGAGAAA AATCACTCAG GGTCAATGCC AGCGCTTCGT TAATACAGAT GTAGGTGTTC CACAGGGTAG CCAGCAGCAT CCTGCGATGC AGATCCGGAA CATAATGGTG CAGGGCGCTG ACTTCCGCGT TTCCAGACTT TACGAAACAC GGAAACCGAA GACCATTCAT GTTGTTGCTC AGGTCGCAGA CGTTTTGCAG CAGCAGTCGC TTCACGTTCG CTCGCGTATC GGTGATTCAT TCTGCTAACC AGTAAGGCAA CCCCGCCAGC CTAGCCGGGT CCTCAACGAC AGGAGCACGA TCATGCGCAC CCGTGGCCAG GACCCAACGC TGCCCGAAAT T (les sites XBAI sont soulignés par une simple ligne continue, l'ORF de Cdc25C est souligné en pointillé, la séquence de la protéine liant le maltose (MBP) est soulignée par une double ligne continue et la séquence en gras correspond à la région de l'ADN plasmidique isolé à partir de la souche JM 109 et séquencée).
Ce clone peut être conservé à -80 oC sous forme de culture saturée additionnée de glycérol (concentration finale 25%) ou"stock glycérol". Cette souche sera utilisée pour toutes les étapes de production ultérieures.
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2-Production et purification de la protéine recombinante MBP-Cdc25C NB : sauf indication contraire, tous tes réactifs chimiques proviennent de SIGMA-ALDRICH. 2. 1-Culture bactérienne et induction d'expression de la protéine de fusion 50 ml de milieu LB + ampicilline 100 g/ml (LB amp. ) sont inoculés avec 100 sil de stock glycérol du clone JM109/pMAL-Cdc25C et cultivés 14 à 16 heures à 37 oC sous agitation (180 à 220 rpm). Cette pré-culture est ensuite diluée cinquante fois (20 ml par litre de milieu) dans un milieu LB amp. + 2 g/1 de glucose et cultivée à 37 oC/180 rpm pour atteindre une densité optique à 600 nm comprise entre 0,55 et 0,60. La synthèse de la protéine de fusion est alors induite par ajout IPTG (0,3 mM) à 37 oC pendant 3 heuresLes bactéries sont récoltées par centrifugation, lavées une fois dans 40 ml de PBS froid par litre de culture, et le culot bactérien est ensuite congelé dans l'azote liquide et conservé à-80 OC.
L'induction est analysée immédiatement par dépôt de 2,5. 107 cellules, prélevées avant et après induction, sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration des protéines au bleu de Coomassie (Figure 1, lignes 1 et 2 respectivement). 2. 2-Lyse et extraction. Un culot bactérien correspondant à 1 litre de culture induite est décongelé dans la glace, re-suspendu dans 35 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-cl pH 7,4, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 g/ml lysozyme, 1 gg/ml leupeptine, 2 gg/ml aprotinine, 1 mM PMSF) et incubé 45 min dans la glace. La suspension bactérienne est ensuite soniquée (4 cycles de 1 min en mode discontinu 50%, alternés avec 1 min de pause), puis centrifugée pendant 35 min. à 110 000 g. Le surnageant ou extrait soluble est conservé pour la purification de la protéine MBP-Cdc25C (Figure 1, ligne 3). 2. 3-Purification par affinité sur résine d'amylose-agarose. Pour un extrait soluble correspondant à 1 litre de culture bactérienne induite, 2 ml de résine d'amylose-agarose (New England Biolabs #800-21) sont déposés sur une colonne chromatographique HR 5/10 (Pharmacia) et lavés par 20 ml (10 volumes) de tampon de colonne (20 mM Tris-HCl pH 7,4 ; 250 mM NaCl ; 1 mM EDTA ; 1 mM DTT ;
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1 gg/ml leupeptine ; 2 (ig/ml aprotinine). L'extrait soluble est passé sur la colonne d'affinité à un débit de 0,15 ml/min ; l'éluat (c'est-à-dire la fraction non retenue sur l'amylose-agarose) est récolté pour analyse (Figure 1, ligne 4). La colonne est lavée par 20 ml (10 volumes) de tampon de colonne. Un échantillon de la matrice d'affinité après passage de l'extrait soluble peut être éventuellement analysé (Figure 1, ligne 5).
L élution de la protéine de la matrice d'affinité est effectuée avec un tampon maltose (20 mM Tris-HCl pH 7,4 ; 250 mM NaCl ; 1 mM EDTA ; 1 mM DIT ; 10 mM maltose). 20 fractions d'élution de 0,5 ml sont recueillies. Pour chaque fraction, la concentration protéique totale est évaluée par un essai de type Bradford et la fraction est analysée par dépôt sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration au bleu de Coomassie (Figure 1, ligne 6). Les fractions dans lesquelles la protéine de fusion MBP-Cdc25C complète représente au moins 90 % des protéines totales sont rassemblées pour former un lot dont l'activité est ensuite testée. Les lots sont conservés à -80oc.
La séquence de cette protéine de fusion MBP-Cdc25C correspond à la séquence SEQ. ID no 1 représentée ci-dessous : ATGAAAATCG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC ACCCCGGACA AAGCCTTCCA GGACAAGCTG TA TCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG
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3-Détermination de l'activité de la protéine de fusion MBP-Cdc25C.
3-Détermination de l'activité de la protéine de fusion MBP-Cdc25C.
L'activité phosphatase de la protéine MBP-Cdc25C est évaluée par un essai de déphosphorylation du phosphate de 3-0-méthyltluorescéine (OMFP) avec détermination de l'absorbance à 477 nm (DO 477 nm) du produit de la réaction (OMF).
La protéine MBP-Cdc25C, conservée dans le tampon d'élution (le même que celui décrit au paragraphe 2. 3), est diluée à la concentration de 20 M dans le tampon de réaction
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phosphatase (50 mM Tris-HCl pH 8,2 ; 50 mM NaCl ; 1 mM DIT ; 20% glycérol), à température ambiante, dans un volume réactionnel total de 1 ml. La réaction est initiée par l'ajout d'une solution 0,3 mM de OMFP (préparée extemporanément à partir d'une solution stock 7,5 mM dans du DMSO 100% (Sigma #M2629)) et se déroule à 25 C dans une cuve pour spectrophotométrie à usage unique en polystyrène (Fisher Scientific #A12-103-056). La DO 477 nm est mesurée après 90 min. La référence pour la mesure d'absorbance est constituée par le tampon de réaction contenant 0, 3 mM d'OMFP, sans protéine MBP-Cdc25C, au temps to de la réaction. Un exemple représentatif des résultats d'une telle détermination d'activité est illustré par la Figure 2.
LEGENDE DES FIGURES La figure 1 (FIG. 1) représente la chromatographie d'analyse relative à l'induction d'expression de la protéine de fusion MBP-Cdc25C. Les lignes 1 et 2 de la figure 1 correspondent respectivement à l'extrait total de JM109/pMAL-Cdc25C avec ou sans ajout d'IPTG. La ligne 3 correspond à l'extrait soluble. Les lignes 4 et 5 correspondent respectivement aux fractions non retenue et retenue sur amylose-agarose. Enfin, la ligne 6 de la figure 1 correspond à la fraction d'élution no 12 qui ne contient pratiquement que la protéine de fusion.
La figure 2 (FIG. 2) représente les résultats de la mesure de l'activité de la protéine recombinante (un"+"signifiant que de la ménadione a été ajoutée à l'échantillon, un"-" que l'échantillon n'a pas été traité par de la ménadione).
Claims (8)
- Revendications 1. Protéine caractérisée en ce qu'il s'agit d'une protéine de fusion entre une protéine Cdc25C et la protéine liant le maltose (MBP).
- 2. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste en la séquence SEQ ID no 1.
- 3. ADN caractérisé en ce qu'il code pour une protéine selon l'une des revendications 1 ou 2.
- 4. Souche bactérienne caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche bactérienne JM 109 transfectée par le plasmide de séquence SEQ. ID nO 5.
- 5. Procédé de préparation d'une protéine selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes : - culture de la souche bactérienne JM 109 transfectée par le plasmide de séquence SEQ. ID n 5 dans un milieu LB additionné d'ampicilline ; - induction de la synthèse de la protéine de fusion par ajout d'isopropylthiogalactoside ; - lyse des bactéries ; - purification de la protéine de fusion obtenue par chromatographie sur résine d'amylose-agarose et récupération des fractions contenant la protéine purifiée.
- 6. Application d'une protéine selon la revendication 1 à une méthode d'identification de modulateurs de la protéine Cdc25C, caractérisée en ce que ladite méthode comporte les étapes successives suivantes : - ajout, à une solution de phosphate de 3-0-méthylfluorescéine, de la protéine de fusion telle qu'obtenue par un procédé de préparation selon la revendication 5 et d'un composé présumé être un modulateur de la protéine Cdc25C ;
- détermination de la quantité de 3-0-méthylfluorescéine produite rapportée à la quantité initiale de phosphate de 3-0-méthylfluorescéine.<Desc/Clms Page number 17> - 7. Application selon la revendication 6, caractérisée en ce que la détermination de la quantité de 3-0-méthylfluorescéine produite rapportée à la quantité initiale de phosphate de 3-0-méthylfluorescéine est effectuée par mesure de l'absorbance liée à la 3-0-méthylfluorescéine à la longueur d'onde de 477 nm.
- 8. Application selon la revendication 6, caractérisée en ce que la détermination de la quantité de 3-0-méthylfluorescéine produite rapportée à la quantité initiale de phosphate
de 3-0-méthylfluorescéine est effectuée par par tluorimétrie en utilisant une excitation à la longueur d'onde de 475 nm et une lecture à la longueur d'onde de 510 nm.
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