EP1242599A2 - Methode d'obtention de phosphatases humaines cdc25 et methode d'identification de modulateurs de phosphatases humaines cdc25 - Google Patents

Methode d'obtention de phosphatases humaines cdc25 et methode d'identification de modulateurs de phosphatases humaines cdc25

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EP1242599A2
EP1242599A2 EP00993418A EP00993418A EP1242599A2 EP 1242599 A2 EP1242599 A2 EP 1242599A2 EP 00993418 A EP00993418 A EP 00993418A EP 00993418 A EP00993418 A EP 00993418A EP 1242599 A2 EP1242599 A2 EP 1242599A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
sequence seq
mbp
cdc25c
plasmid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00993418A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Françoise GOUBIN-GRAMATICA
Bernard Ducommun
Grégoire Prevost
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Ipsen Pharma SAS
Original Assignee
Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining human phosphatases Cdc25. It also relates to a method of identifying modulators of human phosphatases Cdc25.
  • the entry of the cell into the process of cell division is regulated by a set of kinases and phosphatases useful for synchronizing the different phases of the cell cycle and allowing the reorganization of the cell architecture.
  • Cyclin-dependent kinases play a major role in this control and already several inhibitors of this family of kinases have been identified.
  • One of these compounds (flavopiridol) is already in Phase II clinical (Senderowicz and Sausville, J. Natl. Cancer Inst. (2000), 92, 376-387).
  • CDKs are activated by a dephosphorylation carried out by the phosphatases Cdc25, on tyrosine and threonine residues.
  • Cdc25 proteins are coded by a family: Cdc25A, Cdc25B and Cdc25C (Cans et al., Medicine Sciences (1998), 3, 269-274).
  • Cdc25 Some inhibitors of Cdc25 are identified, but they have only a weak activity (cf. Baratte, B., Meijer, L., Gal forcingov, K., and Beach, D., Anticancer Res. (1992), 12, 873-880 ; Rice, RL et al., Biochemistry (1997), 36, 15965-15974; and Ham, SW, Park,., Lee, SJ, Kim, W., Kang, K., and Choi, KH, Bioorg. Med Chem. Lett. (1998), 8, 2507-2510).
  • Cdc25B2 is a tyrosine phosphatase protein close to the Cdc25B phosphatase (now called Cdc25Bl). It has been identified in a DNA library encoding Burkitt's lymphoma. Cdc25B2 differs from Cdc25Bl by an insertion of 14 amino acids and a deletion of 41 amino acids upstream of the catalytic domain. Cdc25Bl and Cdc25B2 are splicing variants of the same gene. A third variant, Cdc25B3, carrying the two sequences of 14 and 41 amino acids, was identified from from the same bank (Baldin et al., Oncogene (1997), 14, 2485-2495).
  • the three variants are detected in primocultures and cell lines. Analysis of the variants shows that Cdc25B2 is more weakly expressed than Cdc25B3 in all of the lines tested, but that the expression of the two variants increases during the G2 phase and mitosis (Forrest et al., Biochem. Biophys. Res. Commun . (1999), 260, 510-515). Hernandez et al. report that Cdc25A and -B2 but not Cdc25Bl, -B3 and -C, are over-expressed in a large number of lymphomas (35% and 39%) (Hernandez et al., Int. J. Cancer (2000), 89 ( 2), 148-52). Normal lymphocytes express the messengers of Cdc25Bl and -B3 and very weakly those of Cdc 25 A, -B2 and -C.
  • the Cdc25C phosphatase is itself regulated by phosphorylation on serine-216 by other enzymes Cdsl or Chkl and binds to very conserved members of the protein family 14-3-3 (Zeng, Y. et al. , Nature (1998), 395, 507-510).
  • microorganisms bacteria, yeasts
  • immunoprecipitation using a specific antibody from a mixture of proteins affinity chromatography, using a specific ligand (effectors, repressors, activators); two-dimensional electrophoresis, as a function of the molecular mass and the isoelectric point of the protein; capillary electrophoresis; enrichment by differential precipitation with different salts; "- etc.
  • the proteins Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 or Cdc25C could be fused with systems as varied as:
  • beta galactosidase protein affine for the amino-phenyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (Germino, J. and Bastia, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1984), 81, 4692-4696);
  • biotin-carboxylase carrier affine for avidin (Germino, F.j. and Moskowitz, N.K., Methods Enzymol. (1999), 303, 422-450);
  • the protein intein refines for chitin (see Chong, S., et al., Gene (1997), 192, 271-281; Carr, S., et al., Vaccine (1999), 18, 153-159 ); 11.
  • the maltose-binding protein refines for amylose (Ahaded, A., et al., Prep. Biochem. Biotechnol. (1999), 29, 163-176).
  • the Applicant has however just developed a method which makes it possible to obtain the enzymes Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 and Cdc25C human in an active form and in unlimited quantity.
  • the present invention facilitates on the one hand the research and the study of the physiological or / and physiopathological activities of this protein and on the other hand facilitates the research of agents modulating these activities.
  • the invention makes it possible to obtain a human protein Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 or Cdc25C recombined with the maltose-binding protein (MBP) which retains its phosphatase activity without requiring separation with the MBP part, thus preventing any contamination with proteases.
  • MBP maltose-binding protein
  • the high level of expression of the protein after induction allows an excellent purification yield and the preparation in unlimited quantity of the enzyme.
  • the invention therefore firstly relates to a fusion protein between the maltose-binding protein (MBP) and a protein chosen from the proteins Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 and Cdc25C.
  • the present invention relates in particular to a protein chosen from the following proteins:
  • a fusion protein between human Cdc25B3 phosphatase and MBP which is characterized in that it is coded by the sequence SEQ. ID No. 14 (shown below); or - a fusion protein between human Cdc25C phosphatase and MBP, which is characterized in that it is coded by the sequence SEQ. ID # 1 (shown below).
  • the subject of the invention is also the bacterial strain JM 109 transfected: - with the plasmid of sequence SEQ. ID No. 9 (shown below), said strain being useful for the preparation of the protein Cdc25Bl;
  • the invention further relates to a process for preparing said fusion proteins, characterized in that it comprises the following successive stages: - culture of the bacterial strain JM 109 transfected with the plasmid of sequence SEQ. ID No. 9, the plasmid with sequence SEQ. ID No. 10, the plasmid with sequence SEQ. ID No. 11 or the plasmid with sequence SEQ. ID No. 5, in LB medium supplemented with ampicillin;
  • the invention relates to an application of said fusion protein to a method of identifying modulators of the protein Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 or Cdc25C, characterized in that it comprises the following successive steps:
  • the determination of the quantity of 3-O-methylfluorescein produced can be carried out, for example, by measuring the optical density of the solution, the absorbance linked to 3-O-methylfluorescein at the wavelength of 477 nm , or alternatively by fluorimetry using excitation at the wavelength of 475 nm and a reading at the wavelength of 510 nm.
  • the system used (New England Biolabs # 800 - pMAL TM protein fusion and purification system) is based on the production of a fusion protein between the protein of interest, here the human Cdc25C protein, and the bacterial protein MBP (Maltose - Binding Protein) X! Escherichia coli.
  • MBP Maltose - Binding Protein
  • the DNA coding for human Cdc25C phosphatase corresponds to accession number 4502706.
  • the DNA encoding Cdc25C was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the primers C-XBAI SENS and C-XBAI ANTI-SENS (of sequences SEQ. ID. Nos . 3 and 4 respectively) and introduced into the vector pCDNA3-HA at the Xbal site to give the vector pcDNA3-HA Cdc25C.
  • the Cdc25C / Xbal insert has been sequenced in its entirety at this stage.
  • the primer C-XBAI SENS has the sequence SEQ. ID. n ° 3 represented below:
  • the primer C-XBAI ANTI-SENS has the sequence SEQ. ID. n ° 4 represented below:
  • the vector pcDNA3-HA Cdc25C was digested with Xbal, the insert Cdc25C / Xbal (1456 base pairs) purified and introduced into the vector pMAL TM -c2X (New England Biolabs, # 800-76) at the site Xbal, to give the vector pMAL - Hs Cdc25C (of sequence SEQ. ID No. 2).
  • This vector allows the production of a fusion protein MBP-Cdc25C of 868 amino acids, from the bacterial promoter Ptac inducible by isopropylthiogalactoside (IPTG).
  • sequence SEQ. ID. n ° 2 of the protein Hs Cdc25C with its XBAI restriction ends is as follows:
  • the vector pMAL - Hs Cdc25C was introduced into the strain of Escherichia coli (E. coli) JM109 (Stratagene # 200271). An isolated colony was selected and the production of a protein of theoretical apparent molecular weight of 97 kDa after culture in the presence of IPTG was observed by the analysis of total bacterial proteins on denaturing polyacrylamide gel and staining with Coomassie blue. . The identity of the fusion protein was then confirmed by western blot and immunodetection with an anti-Cdc25C antibody.
  • the plasmid DNA isolated from this clone was sequenced in the region corresponding to Cdc25C to verify the absence of mutations or modifications of the sequence which could have been generated during the subcloning and / or transformation processes. DNA.
  • TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATCTCGGTA GTGGGATACG
  • GCATGGTCCA ACATCGACAC CAGCAAAGTG AATTATGGTG TAACGGTACT GCCGACCTTC
  • GGT ⁇ A ⁇ CTGG ATTCTT ⁇ AGG ACTT ⁇ .
  • GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT CATTGCAGCA CTGGGGCCCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC GTAGTTATCT ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT
  • AATAGCCCGA GATAGGGTTG AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA
  • AACCATCACC CAAATCAAGT TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA AATCGGAACC
  • GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG CGAACGACCT ACACCGAACT GAGATACCTA CAGCGTGAGC TATGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA CAGGTATCCG
  • CTGCCTGTTC ATCCGCGTCC AGCTCGTTGA GTTTCTCCAG AAGCGTTAAT GTCTGGCTTC
  • the XBAI sites are underlined by a single solid line
  • the ORF of Cdc25C is underlined in dotted lines
  • the maltose-binding protein sequence (MBP) is underlined by a solid double line and the bold sequence corresponds to the region plasmid DNA isolated from the JM 109 strain and sequenced).
  • This clone can be stored at -80 ° C. in the form of a saturated culture added with glycerol (final concentration 25%) or "glycerol stock". This strain will be used for all subsequent production stages.
  • LB + ampicillin medium 100 ⁇ g / ml (LB amp.) are inoculated with 100 ⁇ l of glycerol stock from the clone JM109 / pMAL-Cdc25C and cultured for 14 to 16 hours at 37 ° C. with stirring (180 to 220 rpm).
  • This preculture is then diluted fifty times (20 ml per liter of medium) in an LB amp medium. + 2 g / 1 of glucose and cultured at 37 ° C / 180 rpm to reach an optical density at 600 nm of between 0.55 and 0.60.
  • the synthesis of the fusion protein is then induced by adding IPTG (0.3 mM) at 37 ° C for 3 hours.
  • the bacteria are harvested by centrifugation, washed once in 40 ml of cold PB S per liter of culture, and the bacterial pellet is then frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
  • Induction is analyzed immediately by depositing 2.5 ⁇ 10 7 cells, taken before and after induction, on denaturing polyacrylamide gel and staining of proteins with Coomassie blue (FIG. 1, lines 1 and 2 respectively). 2.2 - Lysis and extraction.
  • a bacterial pellet corresponding to 1 liter of induced culture is thawed in ice, resuspended in 35 ml of lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 ⁇ g / ml lysozyme, 1 ⁇ g / ml leupeptine, 2 ⁇ g / ml aprotinin, 1 mM PMSF) and incubated 45 min in ice.
  • the bacterial suspension is then sonicated (4 cycles of 1 min in 50% discontinuous mode, alternated with 1 min of pause), then centrifuged for 35 min. at 110,000 g.
  • the supernatant or soluble extract is kept for the purification of the protein MBP-Cdc25C ( Figure 1, line 3).
  • the soluble extract is passed through the affinity column at a flow rate of 0.15 ml / min; the eluate (that is to say the fraction not retained on the amylose-agarose) is collected for analysis (FIG. 1, line 4).
  • the column is washed with 20 ml (10 volumes) of column buffer.
  • a sample of the affinity matrix after passage of the soluble extract can optionally be analyzed (Figure 1, line 5).
  • the elution of the protein from the affinity matrix is carried out with a maltose buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4; 250 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM DTT; 10 mM maltose). 20 elution fractions of 0.5 ml are collected. For each fraction, the total protein concentration is evaluated by a Bradford type test and the fraction is analyzed by deposition on denaturing polyacrylamide gel and staining with Coomassie blue ( Figure 1, line 6). The fractions in which the complete MBP-Cdc25C fusion protein represents at least 90% of the total proteins are combined to form a batch, the activity of which is then tested. The batches are stored at -80 ° C.
  • CTGTCTGCGT .. GAAGAGGA ⁇ A GGTCTCTGAA C ⁇ AGTATCCT GCATTGTA ⁇ .T A ⁇ CCAGAGCT ATATATCCTT ... .AAAGGCG.GCT ACAGAGACTT CTTTCCAGAA. TATATGGAAC TGTGTGAACC ACAGAGCTAC TGCCCTATGC ATCATCAGGA CCACAAGACT GAGTTGCTGA GGTGTCGAAG ... CCAGAG ⁇ AAA GTG ⁇ AGGAAG ... . GGGAGC GC A. .. GC.TGCGGGAG .... CAGATTGC ⁇ C
  • sequence of the MBP-Cdc25C fusion protein obtained therefore corresponds to the sequence SEQ. ID # 1 shown below:
  • TCTCATCCAC AAGAGAGGAA GGAAGCTCTG GCTCAGGACC CAGTTTTAGG TCTAATCAAA
  • the phosphatase activity of. MBP-Cdc25C protein is evaluated by a 3-O-methylfluorescein phosphate dephosphorylation test (OMFP) with determination of the absorbance at 477 nm (OD 477 nm) of the reaction product (OMF).
  • OMFP 3-O-methylfluorescein phosphate dephosphorylation test
  • the MBP-Cdc25C protein stored in the elution buffer (the same as that described in paragraph 2.3), is diluted to the concentration of 20 nM in the phosphatase reaction buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT; 20% glycerol), at room temperature, in a total reaction volume of 1 ml.
  • the reaction is initiated by the addition of a 0.3 mM solution of OMFP (prepared extemporaneously from a 7.5 mM stock solution in 100% DMSO (Sigma # M2629)) and takes place at 25 ° C.
  • the system used (New England Biolabs # 800 - pMAL TM protein fusion and purification system) is based on the production of a fusion protein between the protein of interest, here the human Cdc25B protein, and the bacterial protein MBP (Maltose - Binding Protein) to 'Escherichia coli.
  • MBP Maltose - Binding Protein
  • the DNA encoding the three splicing variants of human CDC25B phosphatase corresponds to the accession numbers: M81934 and Z68092.
  • the Cdc25B cDNAs in the form of Nde ⁇ (Klenow) / BamHI inserts were introduced into the vector pMAL TM -C2X (New England Biolabs, # 800-76) at the EcoRl (Klenow) / BamHI site to respectively give the pMAL vectors.
  • pMAL TM -C2X New England Biolabs, # 800-76
  • EcoRl EcoRl
  • CACGACCTCG CCGGGCTCGG CAGCCGCAGC CGCCTGACGC ACCTATCCCT GTCTCGACGG
  • CTGGCAGAGT GGGCCAGCCG CAGGGAAGCC TTTGCCCAGA GACCCAGCTC GGCCCCCGAC
  • AAGTTTGTGA TTGTAGACTG CAGATACCCC TATGAATATG AAGGCGGGCA CATCAAGACT GCGGTGAACT TGCCCCTGGA ACGCGACGCC GAGAGCTTCC TACTGAAGAG CCCCATCGCG
  • CTCTACTACC CTGAGATGTA TATCCTGAAA GGCGGCTACA AGGAGTTCTT CCCTCAGCAC
  • CTGTGTCATC CCATCATTTT CCATATCCTG GTGCCCCCCA CCCCTGGAAG AGCCCAGTCT GTTGAGTTAG TTAAGTTGGG TTAATACCAG CTTAAAGGCA GTATTTTGTG TCCTCCAGGA
  • sequence SEQ. ID. n ° 7 of the protein Hs Cdc25B2 with its Ndel and BamHI restriction ends is as follows:
  • CACGACCTCG CCGGGCTCGG CAGCGAAACC CCAAAGAGTC AGGTAGGGAC CCTGCTCTTC
  • GTCATCCTCA TTTTCCACTG TGAATTCTCA TCTGAGCGTG GGCCCCGCAT GTGCCGTTTC
  • sequence SEQ. ID. n ° 8 of the protein Hs Cdc25B3 with its Ndel and BamHI restriction ends is as follows:
  • CACGACCTCG CCGGGCTCGG CAGCGAAACC CCAAAGAGTC AGGTAGGGAC CCTGCTCTTC
  • TTCCTCCTAC AGACAGTAGA CGGAAAGCAC
  • CAAGACCTCA AGTACATCTC ACCAGAAACG ATGGTGGCCC TATTGACGGG CAAGTTCAGC
  • GGTTAATACC AGCTTAAAGG CAGTATTTTG TGTCCTCCAG GAGCTTCTTG TTTCCTTGTT AGGGTTAACC CTTCATCTTC CTGTGTCCTG AAACGCTCCT TTGTGTGTGT GTCAGCTGAG GATCC
  • the pMAL-Cdc25Bl-3 vectors were each introduced into the Escherichia coli JM109 strain (Stratagene # 200271). Colonies were selected based on their ability to produce a fusion protein after culture in the presence of IPTG. The identity of the proteins was verified by immunodetection with polyclonal antibodies directed against Cdc25B.
  • the plasmid DNAs isolated from these three clones were sequenced in the region corresponding to Cdc25B.
  • the following sequences were obtained (the doubly underlined part corresponds to the ORF of MBP and the underlined part in dotted lines corresponds to the ORF of Cdc25Bl, Cdc25B2 or Cdc25B3):
  • GACTACCCCA GCCTCTACTA CCCTGAGATG TATATCCTGA AAGGCGGCTA CAAGGAGTTC
  • CTGGAGGCCT CAGGTGCTGT CCATGGGAAA GATGGTGTGG TGTCCTGCCT GTCTGCCCCA GCCCAGATTC CCCTGTGTCA TCCCATCATT TTCCATATCC TGGTGCCCCC CACCCCTGGA
  • TTGTGTCCTC CAGGAGCTTC TTGTTTCCTT GTTAGGGTTA ACCCTTCATC TTCCTGTGTC
  • the recombinant proteins MBP-Cdc25Bl, B2 and B3 are produced exactly as described for MBP-Cdc25C.
  • SEQ sequences. ID No. 12, SEQ. ID # 13 and SEQ. ID No. 14 are obtained respectively for the fusion proteins MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 and MBP-Cdc25B3:
  • GCCTTTGCCC AGAGACCCAG CTCGGCCCCC GACCTGATGT GTCTCAGTCC TGACCGGAAG ATGGAAGTGG AGGAGCTCAG CCCCCTGGCC CTAGGTCGCT TCTCTCTGAC CCCTGCAGAG
  • CTATTGACGG GCAAGTTCAG CAACATCGTG GATAAGTTTG TGATTGTAGA CTGCAGATAC CCCTATGAAT ATGAAGGCGG GCACATCAAG ACTGCGGTGA ACTTGCCCCT GGAACGCGAC GCCGAGAGCT TCCTACTGAA GAGCCCCATC GCGCCCTGTA GCC
  • FIG. 1 (FIG 1) represents the analysis chromatography relating to the expression induction of the fusion protein MBP-Cdc25C
  • the lines 1 and 2 of FIG. 1 correspond respectively to the total extract of JM109 / pMAL- Cdc25C with or without addition of IPTG.
  • Line 3 corresponds to the soluble extract.
  • Lines 4 and 5 correspond respectively to the fractions not retained and retained on amylose-agarose.
  • line 6 of FIG. 1 corresponds to the elution fraction No. 12 which contains practically only fusion protein
  • FIG. 2 represents the results of the measurement of the activity of the recombinant protein MBP-Cdc25C (a "+” signifying that menadione was added to the sample, a "-" that the sample was not treated with menadione)
  • FIG. 3 represents the results of the measurement of the activity of the recombinant proteins MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 and MBP-Cdc25B3.
  • the reaction is carried out with 300 ng of enzyme per test. MBP at the same concentration is used in the control.
  • the measured fluorescence values allow the slopes to be calculated: 0.0025 ⁇ fluo / sec for the control, 0.0361 ⁇ fluo / sec for Cdc25Bl, 0.0350 ⁇ fluo / sec for Cdc25B2 and 0.0372 ⁇ fluo / sec for Cdc25B3.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode d'obtention de phosphatases humaines cdc25B1, cdc25B2, cdcB3 et cdc25C. L'invention a en particulier pour objet une protéine de fusion entre la phosphatase humaine cdc25B1, cdc25B2, cdcB3 ou cdc25C et la protéine liant le maltose (Maltose Binding Protein ou MBP) d'Escherichia coli, la séquence d'ADN codant pour ladite protéine de fusion, un procédé de préparation de ladite protéine de fusion ainsi qu'une méthode d'identification de modulateurs de la protéine cdc25B1, cdc25B2, cdcB3 ou cdc25C humaine.

Description

Méthode d'obtention de phosphatases humaines Cdc25 et méthode d'identification de modulateurs de phosphatases humaines Cdc25
La présente invention concerne une méthode d'obtention de phosphatases humaines Cdc25. Elle concerne également une méthode d'identification de modulateurs de phosphatases humaines Cdc25.
L'entrée de la cellule dans le processus de la division cellulaire est régulée par un ensemble de kinases et de phosphatases utiles pour synchroniser les différentes phases du cycle cellulaire et permettre la réorganisation de l'architecture cellulaire.
Les kinases dépendantes des cyclines (CDKs) jouent un rôle majeur dans ce contrôle et déjà plusieurs inhibiteurs de cette famille de kinases sont identifiés. Un de ces composés (flavopiridol) est déjà en Phase II clinique (Senderowicz et Sausville, J. Natl. Cancer Inst. (2000), 92, 376-387).
Ces CDKs sont activées par une déphosphorylation effectuée par les phosphatases Cdc25, sur des résidus tyrosine et thréonine. Dans les cellules humaines, les protéines Cdc25 sont codées par une famille : Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C (Cans et coll., Medicine Sciences (1998), 3, 269-274).
Quelques inhibiteurs de Cdc25 sont identifiés, mais ils possèdent seulement une faible activité (cf. Baratte, B., Meijer, L., Galaktionov, K., et Beach, D., Anticancer Res. (1992), 12, 873-880 ; Rice, R.L. et coll., Biochemistry (1997), 36, 15965-15974 ; et Ham, S.W., Park, ., Lee, S.J., Kim, W., Kang, K., et Choi, K.H., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1998), 8, 2507-2510).
Cdc25B2 est une protéine tyrosine phosphatase proche de la phosphatase Cdc25B (appelée maintenant Cdc25Bl). Elle a été identifiée dans une banque d'ADN codant de lymphome de Burkitt. Cdc25B2 diffère de Cdc25Bl par une insertion de 14 acides aminés et une délétion de 41 acides aminés en amont du domaine catalytique. Cdc25Bl et Cdc25B2 sont des variants d'épissage d'un même gêne. Un troisième variant, Cdc25B3, portant les deux séquences de 14 et 41 acides aminés, a été identifié à partir de la même banque (Baldin et coll., Oncogene (1997), 14, 2485-2495). Les trois variants sont détectés dans les primocultures et les lignées cellulaires. L'analyse des variants montre que Cdc25B2 est plus faiblement exprimé que Cdc25B3 dans l'ensemble des lignées testées mais que l'expression des deux variants augmente durant la phase G2 et la mitose (Forrest et coll., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1999), 260, 510-515). Hernandez et coll. rapportent que Cdc25A et -B2 mais pas Cdc25Bl, -B3 et -C, sont sur-exprimés dans un grand nombre de lymphomes (35% et 39%) (Hernandez et coll., Int. J. Cancer (2000), 89(2), 148-52). Les lymphocytes normaux expriment les messagers de Cdc25Bl et -B3 et très faiblement ceux de Cdc 25 A, -B2 et -C.
La surexpression des trois Cdc25B variants dans la levure montre que Cdc25B2 semble plus active que Bl ou B3 (B2>B3>B1). L'épissage alternatif de Cdc25B peut donc jouer un rôle dans le contrôle de la prolifération cellulaire.
La phosphatase Cdc25C est par ailleurs elle même régulée par phosphorylation sur la sérine-216 par d'autres enzymes Cdsl ou Chkl et se lie à des membres très conservés de la famille des protéines 14-3-3 (Zeng, Y. et coll., Nature (1998), 395, 507-510).
La recherche d'inhibiteurs plus efficaces des phosphatases passe par la nécessité d'avoir une protéine qui conserve son activité phosphatase, en quantité non limitante pour autoriser des criblages à grande échelle.
L'étude d'une protéine nécessite de grandes quantités de cette dernière pour satisfaire à toutes les caractéristiques qui peuvent être analysées notamment dans les domaines tels que la biophysique (taille, séquence, structure...), de la biochimie (activité, stabilité, régulation...) ou de la pharmacologie (activateurs, inhibiteurs,...).
La production et la purification de cette protéine en grande quantité se heurte à plusieurs obstacles qui peuvent être :
- expression absente ou trop faible de la protéine ;
- expression d'une protéine tronquée ; obtention d'une protéine sans activité biologique ;
- perte de l'activité biologique de la protéine durant la purification ;
- rendement de purification très faible ; - perte de l'activité biologique de la protéine durant la conservation ;
- perte de la source de production.
Seul le succès à chacune de ces étapes permet finalement de produire à long terme une protéine biologiquement active en quantité illimitée. Face à de telles exigences, la purification de nombreuses protéines reste un processus très délicat voire même impossible dans certains cas.
Cependant, de nombreux efforts sont faits pour développer de nouvelles stratégies de production et de purification telles que :
- culture de cellules (animales ou végétales) à grande échelle ;
- culture de microorganismes (bactéries, levures) à grande échelle ; immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps spécifique à partir d'un mélange de protéines ; chromatographie d'affinité, à l'aide d'un ligand spécifique (effecteurs, répresseurs, activateurs) ; électrophorèse bidimensionnelle, en fonction de la masse moléculaire et du point isoélectrique de la protéine ; électrophorèse capillaire ; enrichissement par précipitation différentielle avec différents sels ;" - etc.
Par ailleurs, de nouveaux systèmes essaient maintenant de combiner la production et la purification des protéines. Ces systèmes permettent une expression souvent inductible de la production d'une protéine recombinante fusionnée avec une protéine permettant une chromatographie d'affinité (appelée tag). Cette dernière partie peut être éliminée par l'addition d'une protease qui reconnaît spécifiquement l'endroit de la fusion (Sheibani, N., Prep. Biochem. Biotechnol. (1999), 29, 77-90). Le nombre de systèmes proposés augmentent mais le succès de ces différentes approches reste très variable en fonction des protéines à purifier. La conformation et la solubilité des protéines restent des paramètres impossibles à contrôler dans ces nouveaux systèmes (voir Guise, A.D., West, S.M. et Chaudhuri, J.B., Mol. Biotechnol. (1996), 6, 53-64 ; Kelley, R.F. et Winkler, M.E., Genêt. Eng. (N.Y., 1990), 12, 1-19).
Les protéines Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C pourraient être fusionnées avec des systèmes aussi variés que :
1. Le résidu de six histidines reconnu par l'anticorps anti-motif six histidine (Katsafanas, G.C. et Moss, B., Virology (1999), 258, 469-479) ;
2. Le résidu de neuf acides aminés de Hemagglutinine d'Influenza reconnu par l'anticorps 3F10 (Robert, I. et Quirin-Stricker, C, J. Mol. Neurosci. (1998), 11, 243-251) ; 3. Le résidu de 11 acides aminés du virus de stomatite vésiculaire reconnu par l'anticorps P5D4 (Le Maout, S., et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1997), 94, 13329-13334) ;
4. Le résidu de 6 acides aminés de la protéine de capside du virus bovin papilloma (AU1) reconnu par l'anticorps anti-AUl (Le Maout, S., et coll., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. (1997), 94, 13329-13334) ;
5. Le résidu de 12 acides aminés de la chaîne lourde de la protéine C reconnu par l'anticorps HPC4 (Rezaie, A.R., et coll., Protein Expr. Purif. (1992), 3, 453-460) ;
6. La protéine C-myc reconnue par l'anticorps 9E10 (Bae, S.H., et coll., J. Biol. Chem. (1999), 274, 14624-14631) ;
7. La protéine bêta galactosidase affine pour l'amino-phényl- β-D-thiogalactopyranoside (Germino, J. et Bastia, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1984), 81, 4692-4696) ;
8. La protéine gluthation S-transférase reconnue par l'anticorps anti-GST (Carr, S., et coll., Vaccine (1999), 18, 153-159) ;
9. La biotin-carboxylase carrier affine pour l'avidine (Germino, F.j. et Moskowitz, N.K., Methods Enzymol. (1999), 303, 422-450) ;
10. La protéine intéine affine pour la chitine (voir Chong, S., et coll., Gène (1997), 192, 271-281 ; Carr, S., et coll., Vaccine (1999), 18, 153-159) ; 11. La protéine liant le maltose affine pour l'amylose (Ahaded, A., et coll., Prep. Biochem. Biotechnol. (1999), 29, 163-176).
Pour autant, rien ne permet de prédire si l'opération sera effectivement couronnée de succès.
La demanderesse vient cependant de mettre au point une méthode qui permet l'obtention des enzymes Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 et Cdc25C humaines sous une forme active et en quantité illimitée. La présente invention facilite d'une part la recherche et l'étude des activités physiologiques ou/et physio-pathologiques de cette protéine et d'autre part facilite la recherche d'agents modulateurs de ces activités.
L'invention permet d'obtenir une protéine humaine Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C recombmée avec la protéine liant le maltose (MBP) qui conserve son activité phosphatase sans nécessiter la séparation avec la partie MBP, prévenant ainsi toute contamination avec des protéases. Le haut niveau du taux d'expression de la protéine après induction permet un rendement de purification excellent et la préparation en quantité illimitée de l'enzyme. L'invention a donc tout d'abord pour objet une protéine de fusion entre la protéine liant le maltose (MBP) et une protéine choisie parmi les protéines Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 et Cdc25C.
La présente invention concerne en particulier une protéine choisie parmi les protéines suivantes :
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25Bl humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 12 (représentée plus loin) ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B2 humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 13 (représentée plus loin) ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B3 humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 14 (représentée plus loin) ; ou - une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25C humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 1 (représentée plus loin).
Elle a également pour objet l'ADN codant pour lesdites protéines de fusion, ainsi que l'ADN complémentaire à l'ADN codant pour lesdites protéine de fusion.
L'invention a de plus pour objet la souche bactérienne JM 109 transfectée : - par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 9 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25Bl ;
- par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 10 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25B2 ;
- par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 11 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25B3 ; ou
- par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 5 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25C.
L'invention concerne de plus un procédé de préparation desdites protéines de fusion, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes : - culture de la souche bactérienne JM 109 transfectée par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 9, le plasmide de séquence SEQ. ID n° 10, le plasmide de séquence SEQ. ID n° 11 ou le plasmide de séquence SEQ. ID n° 5, dans un milieu LB additionné d'ampicilline ;
- induction de la synthèse de la protéine de fusion par ajout d'isopropylthiogalactoside ;
- lyse des bactéries ; - purification de la protéine de fusion obtenue par chromatographie sur résine d'amylose-agarose et récupération des fractions contenant la protéine purifiée.
L'invention concerne enfin une application de ladite protéine de fusion à une méthode d'identification de modulateurs de la protéine Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes successives suivantes :
- ajout, à une solution de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine, de la protéine de fusion telle qu'obtenue par le procédé de préparation décrit précédemment et d'un composé présumé être un modulateur de la protéine Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C ;
- détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite rapportée à la quantité initiale de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine.
La détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite peut être réalisée, par exemple, par mesure de la densité optique de la solution, de l'absorbance liée à la 3-O-méthylfluorescéine à la longueur d'onde de 477 nm, ou bien encore par fluorimétrie en utilisant une excitation à la longueur d'onde de 475 nm et une lecture à la longueur d'onde de 510 nm.
A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevets, tous les brevets et toutes autres références mentionnées ici sont incorporées par référence.
PARTIE EXPERIMENTALE
A / Protéine de fusion ..MBP-Cdç25Ç.:
1 - Construction du vecteur d'expression pour MBP-Cdc25 C.
1. 1 - Principe du système utilisé.
Le système utilisé (New England Biolabs #800 - pMAL™ protein fusion et système de purification) est basé sur la production d'une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt, ici la protéine Cdc25C humaine, et la protéine bactérienne MBP (Maltose- Binding Protein) X! Escherichia coli. Cette méthode permet de purifier en une étape la protéine de fusion grâce à l'affinité de la MBP pour le maltose.
1.2 - Origine de l'ADNc de Cdc25C
L'ADN codant pour la phosphatase Cdc25C humaine correspond au numéro d'accession 4502706.
A partir de ce plasmide, l'ADN codant pour Cdc25C a été amplifié par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant les amorces C-XBAI SENS et C-XBAI ANTI-SENS (de séquences SEQ. ID. nos 3 et 4 respectivement) et introduit dans le vecteur pCDNA3-HA au site Xbal pour donner le vecteur pcDNA3-HA Cdc25C. L'insert Cdc25C / Xbal a été, à ce stade, séquence dans son intégralité.
L'amorce C-XBAI SENS a pour séquence la séquence SEQ. ID. n° 3 représentée ci-après :
5 ' - GTTCTAGAAT GTCTAGAA CTCTTC - 3 '
L'amorce C-XBAI ANTI-SENS a pour séquence la séquence SEQ. ID. n° 4 représentée ci-après :
5' -GGCTCTGA GTTGCGC CGG - 3' 1.3 - Construction du vecteur pMAL - Hs Cdc25C
Le vecteur pcDNA3-HA Cdc25C a été digéré par Xbal, l'insert Cdc25C / Xbal (1456 paires de bases) purifié et introduit dans le vecteur pMAL™-c2X (New England Biolabs, #800-76) au site Xbal, pour donner le vecteur pMAL - Hs Cdc25C (de séquence SEQ. ID n° 2). Ce vecteur permet la production d'une protéine de fusion MBP-Cdc25C de 868 acides aminés, à partir du promoteur bactérien Ptac inductible par l'isopropylthiogalactoside (IPTG).
La séquence SEQ. ID. n° 2 de la protéine Hs Cdc25C avec ses extrémités de restriction XBAI est la suivante :
TCTAGAATGT CTACGGAACT CTTCTCATCC ACAAGAGAGG AAGGAAGCTC TGGCTCAGGA
CCCAGTTTTA GGTCTAATCA AAGGAAAATG TTAAACCTGC TCCTGGAGAG AGACACTTCC
TTTACCGTCT GTCCAGATGT CCCTAGAACT CCAGTGGGC AATTTCTTGG TGATTCTGCA
AACCTAAGCA TTTTGTCTGG AGGAACCCCA AAATGTTGCC TCGATCTTTC GAATCTTAGC
AGTGGGGAGA TAACTGCCAC TCAGCTTACC ACTTCTGCAG ACCTTGATGA AACTGGTCAC
CTGGATTCTT CAGGACTTCA GGAAGTGCAT TTAGCTGGGA TGAATCATGA CCAGCACCTA
ATGAAATGTA GCCCAGCACA GCTTCTTTGT AGCACTCCGA ATGGTTTGGA CCGTGGCCAT
AGAAAGAGAG ATGCAATGTG TAGTTCATCT GCAAATAAAG AAAATGACAA TGGAAACTTG
GTGGACAGTG AAATGAAATA TTTGGGCAGT CCCATTACTA CTGTTCCAAA ATTGGATAAA
AATCCAAACC TAGGAGAAGA CCAGGCAGAA GAGATTTCAG ATGAATTAAT GGAGTTTTCC
CTGAAAGATC AAGAAGCAAA GGTGAGCAGA AGTGGCCTAT ATCGCTCCCC GTCGATGCCA
GAGAACTTGA ACAGGCCAAG ACTGAAGCAG GTGGAAAAAT TCAAGGACAA CACAATACCA
GATAAAGTTA AAAAAAAGTA TTTTTCTGGC CAAGGAAAGC TCAGGAAGGG CTTATGTTTA
AAGAAGACAG TCTCTCTGTG TGACATTACT ATCACTCAGA TGCTGGAGGA AGATTCTAAC
CAGGGGCACC TGATTGGTGA TTTTTCCAAG GTATGTGCGC TGCCAACCGT GTCAGGGAAA
CACCAAGATC TGAAGTATGT CAACCCAGAA ACAGTGGCTG CCTTACTGTC GGGGAAGTTC
CAGGGTCTGA TTGAGAAGTT TTATGTCATT GATTGTCGCT ATCCATATGA GTATCTGGGA
GGACACATCC AGGGAGCCTT AAACTTATAT AGTCAGGAAG AACTGTTTAA CTTCTTTCTG
AAGAAGCCCA TCGTCCCTTT GGACACCCAG AAGAGAATAA TCATCGTGTT CCACTGTGAA
TTCTCCTCAG AGAGGGGCCC CCGAATGTGC CGCTGTCTGC GTGAAGAGGA CAGGTCTCTG
AACCAGTATC CTGCATTGTA CTACCCAGAG CTATATATCC TTAAAGGCGG CTACAGAGAC
TTCTTTCCAG AATATATGGA ACTGTGTGAA CCACAGAGCT ACTGCCCTAT GCATCATCAG
GACCACAAGA CTGAGTTGCT GAGGTGTCGA AGCCAGAGCA AAGTGCAGGA AGGGGAGCGG
.ÇAGÇTGÇGGG ... AGCAGATTGC ..ÇÇTTÇTGGTG....AAGGAÇATGA ... GCCÇATGATA ACATTCCAGC CACTGGCTGC TAACATCTAG A (les sites XBAI sont soulignés en continu, le cadre de lecture ouverte (ou ORF pour Open Reading Frame) de Cdc25C est souligné en pointillé)
1.4 - Création de la souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25C
Le vecteur pMAL - Hs Cdc25C a été introduit dans la souche d 'Escherichia coli (E. coli) JM109 (Stratagene #200271). Une colonie isolée a été sélectionnée et la production d'une protéine de poids moléculaire apparent théorique de 97 kDa après culture en présence d'IPTG a été observée par l'analyse des protéines bactériennes totales sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration au bleu de Coomassie. L'identité de la protéine de fusion a été ensuite confirmée par western blot et immunodétection avec un anticorps anti-Cdc25C.
Finalement, l'ADN plasmidique isolé de ce clone a été séquence dans la région correspondant à Cdc25C pour vérifier l'absence de mutations ou de modifications de la séquence qui auraient pu être générées au cours des processus de sous-clonage et/ou de transformation de l'ADN.
La séquence suivante (désignée par SΕQ. ID. n° 5) a été obtenue pour la souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25C :
CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA
GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG
GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC
AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC
ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG
TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC
TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA
CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC GCGACTGGGC GTGGAGCATC
TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTCGG
CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATCAAATT CAGCCGATAG
CGGAACGGGA AGGCGACTGG AGTGCCATGT CCGGTTTTCA ACAAACCATG CAAATGCTGA ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA
TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATCTCGGTA GTGGGATACG
ACGATACCGA AGACAGCTCA TGTTATATCC CGCCGTTAAC CACCATCAAA CAGGATTTTC
GCCTGCTGGG GCAAACCAGC GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA
AGGGCAATCA GCTGTTGCCC GTCTCACTGG TGAAAAGAAA AACCACCCTG GCGCCCAATA WO 01/44467 . ιo - PCTFR00/03496
CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT
CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT CACTCATTAG
GCACAATTCT CATGTTTGAC AGCTTATCAT CGACTGCACG GTGCACCAAT GCTTCTGGCG
TCAGGCAGCC ATCGGAAGCT GTGGTATGGC TGTGCAGGTC GTAAATCACT GCATAATTCG
TGTCGCTCAA GGCGCACTCC CGTTCTGGAT AATGTTTTTT GCGCCGACAT CATAACGGTT
CTGGCAAATA TTCTGAAATG AGCTGTTGAC AATTAATCAT CGGCTCGTAT AATGTGTGGA
ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCCAGT CCGTTTAGGT GTTTTCACGA
GCACTTCACC AACAAGGACC ATAGATTATG AAAATCGAAG AAGGTAAACT GGTAATCTGG
ATTAACGGCG ATAAAGGCTA TAACGGTCTC GCTGAAGTCG GTAAGAAATT CGAGAAAGAT
ACCGGAATTA AAGTCACCGT TGAGCATCCG GATAAACTGG AAGAGAAATT CCCACAGGTT
GCGGCAACTG GCGATGGCCC TGACATTATC TTCTGGGCAC ACGACCGCTT TGGTGGCTAC
GCTCAATCTG GCCTGTTGGC TGAAATCACC CCGGACAAAG CGTTCCAGGA CAAGCTGTAT
CCGTTTACCT GGGATGCCGT ACGTTACAAC GGCAAGCTGA TTGCTTACCC GATCGCTGTT
GAAGCGTTAT CGCTGATTTA TAACAAAGAT CTGCTGCCGA ACCCGCCAAA AACCTGGGAA
GAGATCCCGG CGCTGGATAA AGAACTGAAA GCGAAAGGTA AGAGCGCGCT GATGTTCAAC
CTGCAAGAAC CGTACTTCAC CTGGCCGCTG ATTGCTGCTG ACGGGGGTTA TGCGTTCAAG
TATGAAAACG GCAAGTACGA CATTAAAGAC GTGGGCGTGG ATAACGCTGG CGCGAAAGCG
GGTCTGACCT TCCTGGTTGA CCTGATTAAA AACAAACACA TGAATGCAGA CACCGATTAC
TCCATCGCAG AAGCTGCCTT TAATAAAGGC GAAACAGCGA TGACCATCAA CGGCCCGTGG
GCATGGTCCA ACATCGACAC CAGCAAAGTG AATTATGGTG TAACGGTACT GCCGACCTTC
AAGGGTCAAC CATCCAAACC GTTCGTTGGC GTGCTGAGCG CAGGTATTAA CGCCGCCAGT
CCGAACAAAG AGCTGGCAAA AGAGTTCCTC GAAAACTATC TGCTGACTGA TGAAGGTCTG
GAAGCGGTTA ATAAAGACAA ACCGCTGGGT GCCGTAGCGC TGAAGTCTTA CGAGGAAGAG
TTGGCGAAAG ATCCACGTAT TGCCGCCACC ATGGAAAACG CCCAGAAAGG TGAAATCATG
CCGAACATCC CGCAGATGTC CGCTTTCTGG TATGCCGTGC GTACTGCGGT GATCAACGCC
GCCAGCGGTC GTCAGACTGT CGATGAAGCC CTGAAAGACG CGCAGACTAA TTCGAGCTCG
AACAACAACA ACAATAACAA TAACAACAAC CTCGGGATCG AGGGAAGGAT TTCAGAATTC
GGATCCTCTA GAATGTCTAC GGAAÇTÇTTC TCATÇÇACA .. GAGAGGAAGG ... AAGCTCTGGC
TÇAGGAÇCCA.. GTTTTAGGTÇ TAATÇAAAGG AAAATGTTAA... ACCTGÇTÇÇT ... GGAGAGAG.AC ACT ÇCTTT . ÇÇGTÇTGTÇÇ AGATGTÇÇÇT AGAACTCCAG... TGGGCAAATT.... TCTTGGTG T CTGCAAACC TAAGCATTTT. GTÇ.TGGAGGA AÇCÇÇ AAAT . GTTGÇÇTCGA ... ÇTTTCGAAT
ÇTTAGÇAGTG ... GGGAGATAAÇ....TGCCACTÇAG CTTAÇÇAÇTT ÇTGCAGAÇCT . TGATGAAAÇT
GGTÇAÇCTGG . ATTCTTÇAGG ACTTÇ.AGGAA GTGÇATTTAG... CTGGGATGAA . TCATGAÇCAG
ÇAÇCTAATG AATGTAGÇ Ç... AGCACAGCTT.. CTTTGTAGÇA .. ÇTCÇGAATGG .. TTTGGACCGT GGÇÇATAGAA AGAGAGATGÇ ... AATGTG.TAG TCATCTGCAA .. AT AAGA^_AA.....TGACAATGGA
AAÇTTGGTGG ACAGTGAAAT . GAAATATTTG GGCAGTCCCA .. T.TACTAÇTGT..... CCAAAAT.TG
GATAAAAATC CAAAC.CTAGG AGAAGAÇÇAG GCAGAAGAGA... .TTCAGATGA....ATTAATGGAG
TTTTCCCTGA AAGATCAAGA AGCAAAGGTG AGCAGAAGTG GCCTATATCG CTCCCCGTCG ATGCCAGAGA ACTTGAACAG GCCAAGACTG AAGCAGGTGG AAAAATTCAA GGACAACACA
ATACCAGATA AAGTTAAAAA AAAGTATTTT TCTGGCCAAG GAAAGCTCAG GAAGGGCTTA
TGTTTAAAGA AGACAGTCTC TCTGTGTGAC ATTACTATCA CTCAGATGCT GGAGGAAGAT
TCTAACCAGG GGCACCTGAT TGGTGATTTT TCCAAGGTAT GTGCGCTGCC AACCGTGTCA GGGAAACACC AAGATCTGAA GTATGTCAAC CCAGAAACAG TGGCTGCCTT ACTGTCGGGG
AAGTTCCAGG GTCTGATTGA GAAGTTTTAT GTCATTGATT GTCGCTATCC ATATGAGTAT
CTGGGAGGAC ACATCCAGGG AGCCTTAAAC TTATATAGTC AGGAAGAACT GTTTAACTTC
TTTCTGAAGA AGCCCATCGT CCCTTTGGAC ACCCAGAAGA GAATAATCAT CGTGTTCCAC
TGTGAATTCT CCTCAGAGAG GGGCCCCCGA ATGTGCCGCT GTCTGCGTGA AGAGGACAGG TCTCTGAACC AGTATCCTGC ATTGTACTAC CCAGAGCTAT ATATCCTTAA AGGCGGCTAC
AGAGACTTCT TTCCAGAATA TATGGAACTG TGTGAACCAC AGAGCTACTG CCCTATGCAT
CATCAGGACC ACAAGACTGA GTTGCTGAGG TGTCGAAGCC AGAGCAAAGT GCAGGAAGGG
GAGCGGCAGC TGCGGGAGCA GATTGCCCTT CTGGTGAAGG ACATGAGCCC ATGATAACAT
TCCAGCCACT GGCTGCTAAC ATCTAGAGTC GACCTGCAGG CAAGCTTGGC ACTGGCCGTC GTTTTACAAC GTCGTGACTG GGAAAACCCT GGCGTTACCC AACTTAATCG CCTTGCAGCA
CATCCCCCTT TCGCCAGCTG GCGTAATAGC GAAGAGGCCC GCACCGATCG CCCTTCCCAA
CAGTTGCGCA GCCTGAATGG CGAATGGCAG CTTGGCTGTT TTGGCGGATG AGATAAGATT
TTCAGCCTGA TACAGATTAA ATCAGAACGC AGAAGCGGTC TGATAAAACA GAATTTGCCT
GGCGGCAGTA GCGCGGTGGT CCCACCTGAC CCCATGCCGA ACTCAGAAGT GAAACGCCGT AGCGCCGATG GTAGTGTGGG GTCTCCCCAT GCGAGAGTAG GGAACTGCCA GGCATCAAAT
AAAACGAAAG GCTCAGTCGA AAGACTGGGC CTTTCGTTTT ATCTGTTGTT TGTCGGTGAA
CGCTCTCCTG AGTAGGACAA ATCCGCCGGG AGCGGATTTG AACGTTGCGA AGCAACGGCC
CGGAGGGTGG CGGGCAGGAC GCCCGCCATA AACTGCCAGG CATCAAATTA AGCAGAAGGC
CATCCTGACG GATGGCCTTT TTGCGTTTCT ACAAACTCTT TTTGTTTATT TTTCTAAATA CATTCAAATA TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA ATAATATTGA
AAAAGGAAGA GTATGAGTAT TCAACATTTC CGTGTCGCCC TTATTCCCTT TTTTGCGGCA
TTTTGCCTTC CTGTTTTTGC TCACCCAGAA ACGCTGGTGA AAGTAAAAGA TGCTGAAGAT
CAGTTGGGTG CACGAGTGGG TTACATCGAA CTGGATCTCA ACAGCGGTAA GATCCTTGAG
AGTTTTCGCC CCGAAGAACG TTCTCCAATG ATGAGCACTT TTAAAGTTCT GCTATGTGGC GCGGTATTAT CCCGTGTTGA CGCCGGGCAA GAGCAACTCG GTCGCCGCAT ACACTATTCT
CAGAATGACT TGGTTGAGTA CTCACCAGTC ACAGAAAAGC ATCTTACGGA TGGCATGACA
GTAAGAGAAT TATGCAGTGC TGCCATAACC ATGAGTGATA ACACTGCGGC CAACTTACTT
CTGACAACGA TCGGAGGACC GAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT
GTAACTCGCC TTGATCGTTG GGAACCGGAG CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT GACACCACGA TGCCTGTAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC TGGCGAACTA
CTTACTCTAG CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG AGGCGGATAA AGTTGCAGGA
CCACTTCTGC GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT
GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC GTAGTTATCT ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT
GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTCATATATA
CTTTAGATTG ATTTACCCCG GTTGATAATC AGAAAAGCCC CAAAAACAGG AAGATTGTAT
AAGCAAATAT TTAAATTGTA AACGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC ATTTTTTAAC CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG
AATAGCCCGA GATAGGGTTG AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA
ACGTGGACTC CAACGTCAAA GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCGATGGC CCACTACGTG
AACCATCACC CAAATCAAGT TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA AATCGGAACC
CTAAAGGGAG CCCCCGATTT AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC
GCGTAACCAC CACACCCGCC GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTAA AAGGATCTAG
GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC AAAATCCCTT AACGTGAGTT TTCGTTCCAC
TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA GGATCTTCTT GAGATCCTTT TTTTCTGCGC
GTAATCTGCT GCTTGCAAAC AAAAAAACCA CCGCTACCAG CGGTGGTTTG TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC CAACTCTTTT TCCGAAGGTA ACTGGCTTCA GCAGAGCGCA GATACCAAAT
ACTGTCCTTC TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA AGAACTCTGT AGCACCGCCT
ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG CCAGTGGCGA TAAGTCGTGT
CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA CCGGATAAGG CGCAGCGGTC GGGCTGAACG
GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG CGAACGACCT ACACCGAACT GAGATACCTA CAGCGTGAGC TATGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA CAGGTATCCG
GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC TTCCAGGGGG AAACGCCTGG
TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG AGCGTCGATT TTTGTGATGC
TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC GCCAGCAACG CGGCCTTTTT ACGGTTCCTG
GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC TCACATGTTC TTTCCTGCGT TATCCCCTGA TTCTGTGGAT AACCGTATTA CCGCCTTTGA GTGAGCTGAT ACCGCTCGCC GCAGCCGAAC GACCGAGCGC
AGCGAGTCAG TGAGCGAGGA AGCGGAAGAG CGCCTGATGC GGTATTTTCT CCTTACGCAT
CTGTGCGGTA TTTCACACCG CATATGGTGC ACTCTCAGTA CAATCTGCTC TGATGCCGCA
TAGTTAAGCC AGTATACACT CCGCTATCGC TACGTGACTG GGTCATGGCT GCGCCCCGAC
ACCCGCCAAC ACCCGCTGAC GCGCCCTGAC GGGCTTGTCT GCTCCCGGCA TCCGCTTACA GACAAGCTGT GACCGTCTCC GGGAGCTGCA TGTGTCAGAG GTTTTCACCG TCATCACCGA
AACGCGCGAG GCAGCTGCGG TAAAGCTCAT CAGCGTGGTC GTGCAGCGAT TCACAGATGT
CTGCCTGTTC ATCCGCGTCC AGCTCGTTGA GTTTCTCCAG AAGCGTTAAT GTCTGGCTTC
TGATAAAGCG GGCCATGTTA AGGGCGGTTT TTTCCTGTTT GGTCACTTGA TGCCTCCGTG
TAAGGGGGAA TTTCTGTTCA TGGGGGTAAT GATACCGATG AAACGAGAGA GGATGCTCAC GATACGGGTT ACTGATGATG AACATGCCCG GTTACTGGAA CGTTGTGAGG GTAAACAACT
GGCGGTATGG ATGCGGCGGG ACCAGAGAAA AATCACTCAG GGTCAATGCC AGCGCTTCGT
TAATACAGAT GTAGGTGTTC CACAGGGTAG CCAGCAGCAT CCTGCGATGC AGATCCGGAA
CATAATGGTG CAGGGCGCTG ACTTCCGCGT TTCCAGACTT TACGAAACAC GGAAACCGAA GACCATTCAT GTTGTTGCTC AGGTCGCAGA CGTTTTGCAG CAGCAGTCGC TTCACGTTCG
CTCGCGTATC GGTGATTCAT TCTGCTAACC AGTAAGGCAA CCCCGCCAGC CTAGCCGGGT
CCTCAACGAC AGGAGCACGA TCATGCGCAC CCGTGGCCAG GACCCAACGC TGCCCGAAAT T
(les sites XBAI sont soulignés par une simple ligne continue, l'ORF de Cdc25C est souligné en pointillé, la séquence de la protéine liant le maltose (MBP) est soulignée par une double ligne continue et la séquence en gras correspond à la région de l'ADN plasmidique isolé à partir de la souche JM 109 et séquencée).
Ce clone peut être conservé à -80 °C sous forme de culture saturée additionnée de glycérol (concentration finale 25%) ou " stock glycérol " . Cette souche sera utilisée pour toutes les étapes de production ultérieures.
2 - Production et purification de la protéine recombinante MBP-Cdc25C :
NB : sauf indication contraire, tous les réactifs chimiques proviennent de SIGMA-ALDRICH.
2.1 - Culture bactérienne et induction d'expression de la protéine de fusion
50 ml de milieu LB + ampicilline 100 μg/ml (LB amp.) sont inoculés avec 100 μl de stock glycérol du clone JM109/pMAL-Cdc25C et cultivés 14 à 16 heures à 37 °C sous agitation (180 à 220 rpm). Cette pré-culture est ensuite diluée cinquante fois (20 ml par litre de milieu) dans un milieu LB amp. + 2 g/1 de glucose et cultivée à 37 °C / 180 rpm pour atteindre une densité optique à 600 nm comprise entre 0,55 et 0,60. La synthèse de la protéine de fusion est alors induite par ajout IPTG (0,3 mM) à 37 °C pendant 3 heures. Les bactéries sont récoltées par centrifugation, lavées une fois dans 40 ml de PB S froid par litre de culture, et le culot bactérien est ensuite congelé dans l'azote liquide et conservé à -80 °C.
L'induction est analysée immédiatement par dépôt de 2,5.107 cellules, prélevées avant et après induction, sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration des protéines au bleu de Coomassie (Figure 1, lignes 1 et 2 respectivement). 2.2 - Lyse et extraction.
Un culot bactérien correspondant à 1 litre de culture induite est décongelé dans la glace, re-suspendu dans 35 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 μg/ml lysozyme, 1 μg/ml leupeptine, 2 μg/ml aprotinine, 1 mM PMSF) et incubé 45 min dans la glace. La suspension bactérienne est ensuite soniquée (4 cycles de 1 min en mode discontinu 50%, alternés avec 1 min de pause), puis centrifugée pendant 35 min. à 110 000 g. Le surnageant ou extrait soluble est conservé pour la purification de la protéine MBP-Cdc25C (Figure 1, ligne 3).
2.3 - Purification par affinité sur résine d'amylose-agarose.
Pour un extrait soluble correspondant à 1 litre de culture bactérienne induite, 2 ml de résine d'amylose-agarose (New England Biolabs #800-21) sont déposés sur une colonne chromatographique HR 5/10 (Pharmacia) et lavés par 20 ml (10 volumes) de tampon de colonne (20 mM Tris-HCl pH 7,4 ; 250 mM NaCl ; 1 mM EDTA ; 1 mM DTT ; 1 μg/ml leupeptine ; 2 μg/ml aprotinine). L'extrait soluble est passé sur la colonne d'affinité à un débit de 0,15 ml/min ; l'éluat (c'est-à-dire la fraction non retenue sur l'amylose-agarose) est récolté pour analyse (Figure 1, ligne 4). La colonne est lavée par 20 ml (10 volumes) de tampon de colonne. Un échantillon de la matrice d'affinité après passage de l'extrait soluble peut être éventuellement analysé (Figure 1, ligne 5).
L'élution de la protéine de la matrice d'affinité est effectuée avec un tampon maltose (20 mM Tris-HCl pH 7,4 ; 250 mM NaCl ; 1 mM EDTA ; 1 mM DTT ; 10 mM maltose). 20 fractions d'élution de 0,5 ml sont recueillies. Pour chaque fraction, la concentration protéique totale est évaluée par un essai de type Bradford et la fraction est analysée par dépôt sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration au bleu de Coomassie (Figure 1, ligne 6). Les fractions dans lesquelles la protéine de fusion MBP-Cdc25C complète représente au moins 90 % des protéines totales sont rassemblées pour former un lot dont l'activité est ensuite testée. Les lots sont conservés à -80°C.
Le séquençage de l'insert compris entre les sites Xbal donne le résultat suivant :
ATGAAAATCG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC WO 01/44467 . 15 . PCT/FRO0/O3496
ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC AACCTCGGGA TCGAGGGAAGG ATTTCAGAAT TCGGATCCTC TAGAATGTCT ACGGAACTCT TÇTCATÇCAÇ AAGAGAGGAA _ .GGAAGCTCTG. ..GCTÇAGGAÇC .. CAGTTTTAGG... TÇTAATCAAA GGAAAATGTT AAACCTGÇTC .. CTGGAGAGAG ACAÇTTCCTT. .. TACÇGTCTGT.... CC AG ATGTCÇ ÇTAGAACTCÇ.. AGTGGGÇAAA TTTÇTTGGTG... ATTCTGCAAA... ÇCTAAGCATT.....TTGTC.TGGAG GAACCCÇAAA .... ATGTTGÇCTC ... GATCTTTÇGA... ATCTTAGCAG.. TGGGGAGATA... AÇTGCCAÇTC AGCTTACÇAÇ ... TTÇTGC-^ . GGAÇTTCAGG
AAGTGÇATTT . _ AGÇTGGGATG .... AATÇ. AT.GAÇ C .... AGÇ AÇCTAAT.... GAAATGTAGC C C AGÇAÇAGÇ TTCTTTGTAG C ACTCÇGAAT ... GG^TT.GGACÇ ... GT.GGÇÇ ATAG... AAAGAG AGAT.... GÇ AATGTGTA GTTCATÇTGÇ ..AAAT^^GAA..._AAT.GAÇ.AATG ..GAAACTTGGT.... GGAC.AGTGAA. ...ATGAAATATT TGGGCAGTÇC CATTACTACT ....GTTCCA^_AAT....TGGATAA^^ GGAGAAGACC
AGGC AGAAGA. . GATTTCAG AT ....G^TTAATGG .... AGTTTTCÇÇT.... GAAAGATÇAA ... GAAGC AAAGG TGAGCAGAAG ....TGGCÇTAT.AT ....ÇGCT .GAAÇTTGAAC. . .AGG^CAAGAÇ
TGi^GÇAG^T.....GG; ^AAAT.TC ....^GGACAACA CAA ACCAGA . TAAAGTTAAA AAAAA.σTATT TT.TCTGGÇCA.....AGGAAA.GÇT.C AGGAAG.GGCT TATGT.TTAAA ... GAAGAÇAGTC ... TCTÇTGTGTG AÇATTACTAT. .. CAÇTÇAGATG ... CTGGAGGAAG....ATTCTAACCA GGGGCAC.CT.G ATTGGT.GATT TTTÇCAAGG.T _ ATGTGCGCTG ....CCAACCGTGT..... CAGGGAAAÇA CCAAGATCTG. AAGTATG.TÇA AÇ.ÇCAGAAAC _AGTGG^TGCÇ....TTACTGTCGG.... GGAAGTTCCA.. GGGTÇTGATT. ...G GAAGTTTT ATGTÇATTGA.....TTGTCGÇ.TAT CCATATGAGT ATC.TGGGAGG ... AÇAC TCCAG. ...GGAGÇÇTTAA ACTTATATAG ....TCAGGAAGAA CTGTTTAACT TCTTTÇTGAA ... GAAGCCÇATC GTÇCCTTTGG ACACCCAGAA GAGAATAATÇ. . .ATCGTGTTCC . ACTGTGAATT CTCCTCAGAG AGGGGÇCÇ.C.C GAATGTGCCG. CTGTCTGCGT .. GAAGAGGAÇA GGTCTCTGAA CÇAGTATCCT GCATTGTAÇ.T AÇCCAGAGCT ATATATCCTT... .AAAGGCG.GCT ACAGAGACTT CTTTCCAGAA . TATATGGAAC TGTGTGAACC ACAGAGCTAC TGCCCTATGC ATCATCAGGA CCACAAGACT GAGTTGCTGA GGTGTCGAAG ... CCAGAGÇAAA GTGÇAGGAAG .... GGGAGC GC A. .. GC.TGCGGGAG ....CAGATTGCÇ C
T.T_ÇTGGTGAA.._ ^ ATTCCAGCCA CTGGCTGCTA ACATCTAGA
(les sites XBAI sont soulignés par une simple ligne continue, l'ORF de Cdc25C est souligné en pointillé et la séquence en italique correspond à l'ORF de la protéine liant le maltose (MBP))
La séquence de la protéine de fusion MBP-Cdc25C obtenue correspond donc à la séquence SEQ. ID n° 1 représentée ci-dessous :
ATGAAAATCG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT
CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG
CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA
GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC
CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC
ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA
GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC
AACCTCGGGA TCGAGGGAAGG ATTTCAGAAT TCGGATCCTC TAGAATGTCT ACGGAACTCT
TCTCATCCAC AAGAGAGGAA GGAAGCTCTG GCTCAGGACC CAGTTTTAGG TCTAATCAAA
GGAAAATGTT AAACCTGCTC CTGGAGAGAG ACACTTCCTT TACCGTCTGT CCAGATGTCC CTAGAACTCC AGTGGGCAAA TTTCTTGGTG ATTCTGCAAA CCTAAGCATT TTGTCTGGAG
GAACCCCAAA ATGTTGCCTC GATCTTTCGA ATCTTAGCAG TGGGGAGATA ACTGCCACTC
AGCTTACCAC TTCTGCAGAC CTTGATGAAA CTGGTCACCT GGATTCTTCA GGACTTCAGG
AAGTGCATTT AGCTGGGATG AATCATGACC AGCACCTAAT GAAATGTAGC CCAGCACAGC
TTCTTTGTAG CACTCCGAAT GGTTTGGACC GTGGCCATAG AAAGAGAGAT GCAATGTGTA GTTCATCTGC AAATAAAGAA AATGACAATG GAAACTTGGT GGACAGTGAA ATGAAATATT
TGGGCAGTCC CATTACTACT GTTCCAAAAT TGGATAAAAA TCCAAACCTA GGAGAAGACC AGGCAGAAGA GATTTCAGAT GAATTAATGG AGTTTTCCCT GAAAGATCAA GAAGCAAAGG
TGAGCAGAAG TGGCCTATAT CGCTCCCCGT CGATGCCAGA GAACTTGAAC AGGCCAAGAC
TGAAGCAGGT GGAAAAATTC AAGGACAACA CAATACCAGA TAAAGTTAAA AAAAAGTATT
TTTCTGGCCA AGGAAAGCTC AGGAAGGGCT TATGTTTAAA GAAGACAGTC TCTCTGTGTG ACATTACTAT CACTCAGATG CTGGAGGAAG ATTCTAACCA GGGGCACCTG ATTGGTGATT
TTTCCAAGGT ATGTGCGCTG CCAACCGTGT CAGGGAAACA CCAAGATCTG AAGTATGTCA
ACCCAGAAAC AGTGGCTGCC TTACTGTCGG GGAAGTTCCA GGGTCTGATT GAGAAGTTTT
ATGTCATTGA TTGTCGCTAT CCATATGAGT ATCTGGGAGG ACACATCCAG GGAGCCTTAA
ACTTATATAG TCAGGAAGAA CTGTTTAACT TCTTTCTGAA GAAGCCCATC GTCCCTTTGG ACACCCAGAA GAGAATAATC ATCGTGTTCC ACTGTGAATT CTCCTCAGAG AGGGGCCCCC
GAATGTGCCG CTGTCTGCGT GAAGAGGACA GGTCTCTGAA CCAGTATCCT GCATTGTACT
ACCCAGAGCT ATATATCCTT AAAGGCGGCT ACAGAGACTT CTTTCCAGAA TATATGGAAC
TGTGTGAACC ACAGAGCTAC TGCCCTATGC ATCATCAGGA CCACAAGACT GAGTTGCTGA
GGTGTCGAAG CCAGAGCAAA GTGCAGGAAG GGGAGCGGCA GCTGCGGGAG CAGATTGCCC TTCTGGTGAA GGACATGAGC CCATGA
3 - Détermination de l'activité de la protéine de fusion MBP-Cdc25C :
L'activité phosphatase de la. protéine MBP-Cdc25C est évaluée par un essai de déphosphorylation du phosphate de 3-O-méthylfluorescéine (OMFP) avec détermination de l'absorbance à 477 nm (DO 477 nm) du produit de la réaction (OMF).
La protéine MBP-Cdc25C, conservée dans le tampon d'élution (le même que celui décrit au paragraphe 2.3), est diluée à la concentration de 20 nM dans le tampon de réaction phosphatase (50 mM Tris-HCl pH 8,2 ; 50 mM NaCl ; 1 mM DTT ; 20% glycérol), à température ambiante, dans un volume réactionnel total de 1 ml. La réaction est initiée par l'ajout d'une solution 0,3 mM de OMFP (préparée extemporanément à partir d'une solution stock 7,5 mM dans du DMSO 100% (Sigma #M2629)) et se déroule à 25 °C dans une cuve pour spectrophotométrie à usage unique en polystyrène (Fisher Scientific #A12- 103-056). La DO 477 nm est mesurée après 90 min. La référence pour la mesure d'absorbance est constituée par le tampon de réaction contenant 0,3 mM d'OMFP, sans protéine MBP-Cdc25C, au temps to de la réaction. Un exemple représentatif des résultats d'une telle détermination d'activité est illustré par la Figure 2. WO 01/44467 - 18 - PCT/FRO0/O3496
B / .Protéines ; de ... fusion....MBP-Çdç25B.lJ MBP-Çdc25B2 et
MBP-Cdç25B3 :
1 - Construction du vecteur d'expression pour MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3
1. 1 - Principe du système utilisé.
Le système utilisé (New England Biolabs #800 - pMAL™ protein fusion et système de purification) est basé sur la production d'une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt, ici la protéine Cdc25B humaine, et la protéine bactérienne MBP (Maltose- Binding Protein) à' Escherichia coli. Cette méthode permet de purifier en une étape la protéine de fusion grâce à l'affinité de la MBP pour le maltose.
1.2 - Origine de l'ADNc de Cdc25B
L'ADN codant pour les trois variants d'épissage de la phosphatase CDC25B humaine correspond aux numéros d'accession : M81934 et Z68092.
1.3 - Construction des vecteurs pMAL - Hs Cdc25B
Les différences entre les ADN des 3 variants de Cdc25B concernent deux exons codant des domaines de 14 et 42 acides aminés localisés dans la région régulatrice de la molécule (Baldin et coll., Oncogene (1997), 14, 2485-2490) et n'affectant pas ses régions 5' et 3'. La stratégie de clonage utilisée pour ces trois variants est donc identique.
Les ADNc de Cdc25B sous la forme d'inserts NdeΙ(Klenow) / BamHl ont été introduits dans le vecteur pMAL™-C2X (New England Biolabs, #800-76) au site EcoRl (Klenow) / BamHl pour donner respectivement les vecteurs pMAL-Hs Cdc25Bl, pMAL-Hs Cdc25B2 et pMAL-Hs Cdc25B3. Ces vecteurs permettent la production des protéines de fusion MBP-Cdc25Bl (962 acides aminés), MPB-Cdc25B2 (933 acides aminés) et MBP-Cdc25B3 (974 acides aminés) à partir du promoteur bactérien Ptac inductible par l'isopropylthiogalactoside (IPTG). La séquence SEQ. ID. n° 6 de la protéine Hs Cdc25Bl avec ses extrémités de restriction Ndel et BamHl est la suivante :
CATATGGAGG TGCCCCAGCC GGAGCCCGCG CCAGGCTCGG CTCTCAGTCC AGCAGGCGTG
TGCGGTGGCG CCCAGCGTCC GGGCCACCTC CCGGGCCTCC TGCTGGGATC TCATGGCCTC CTGGGGTCCC CGGTGCGGGC GGCCGCTTCC TCGCCGGTCA CCACCCTCAC CCAGACCATG
CACGACCTCG CCGGGCTCGG CAGCCGCAGC CGCCTGACGC ACCTATCCCT GTCTCGACGG
GCATCCGAAT CCTCCCTGTC GTCTGAATCC TCCGAATCTT CTGATGCAGG TCTCTGCATG
GATTCCCCCA GCCCTATGGA CCCCCACATG GCGGAGCAGA CGTTTGAACA GGCCATCCAG
GCAGCCAGCC GGATCATTCG AAACGAGCAG TTTGCCATCA GACGCTTCCA GTCTATGCCG GTGAGGCTGC TGGGCCACAG CCCCGTGCTT CGGAACATCA CCAACTCCCA GGCGCCCGAC
GGCCGGAGGA AGAGCGAGGC GGGCAGTGGA GCTGCCAGCA GCTCTGGGGA AGACAAGGAG
AATGATGGAT TTGTCTTCAA GATGCCATGG AAGCCCACAC ATCCCAGCTC CACCCATGCT
CTGGCAGAGT GGGCCAGCCG CAGGGAAGCC TTTGCCCAGA GACCCAGCTC GGCCCCCGAC
CTGATGTGTC TCAGTCCTGA CCGGAAGATG GAAGTGGAGG AGCTCAGCCC CCTGGCCCTA GGTCGCTTCT CTCTGACCCC TGCAGAGGGG GATACTGAGG AAGATGATGG ATTTGTGGAC
ATCCTAGAGA GTGACTTAAA GGATGATGAT GCAGTTCCCC CAGGCATGGA GAGTCTCATT
AGTGCCCCAC TGGTCAAGAC CTTGGAAAAG GAAGAGGAAA AGGACCTCGT CATGTACAGC
AAGTGCCAGC GGCTCTTCCG CTCTCCGTCC ATGCCCTGCA GCGTGATCCG GCCCATCCTC
AAGAGGCTGG AGCGGCCCCA GGACAGGGAC ACGCCCGTGC AGAATAAGCG GAGGCGGAGC GTGACCCCTC CTGAGGAGCA GCAGGAGGCT GAGGAACCTA AAGCCCGCGT CCTCCGCTCA
AAATCACTGT GTCACGATGA GATCGAGAAC CTCCTGGACA GTGACCACCG AGAGCTGATT
GGAGATTACT CTAAGGCCTT CCTCCTACAG ACAGTAGACG GAAAGCACCA AGACCTCAAG
TACATCTCAC CAGAAACGAT GGTGGCCCTA TTGACGGGCA AGTTCAGCAA CATCGTGGAT
AAGTTTGTGA TTGTAGACTG CAGATACCCC TATGAATATG AAGGCGGGCA CATCAAGACT GCGGTGAACT TGCCCCTGGA ACGCGACGCC GAGAGCTTCC TACTGAAGAG CCCCATCGCG
CCCTGTAGCC TGGACAAGAG AGTCATCCTC ATTTTCCACT GTGAATTCTC ATCTGAGCGT
GGGCCCCGCA TGTGCCGTTT CATCAGGGAA CGAGACCGTG CTGTCAACGA CTACCCCAGC
CTCTACTACC CTGAGATGTA TATCCTGAAA GGCGGCTACA AGGAGTTCTT CCCTCAGCAC
CCGAACTTCT GTGAACCCCA GGACTACCGG CCCATGAACC ACGAGGCCTT CAAGGATGAG CTAAAGACCT TCCGCCTCAA GACTCGCAGC TGGGCTGGGG AGCGGAGCCG GCGGGAGCTC
TGTAGCCGGC TGCAGGACCA GTGAGGGGCC TGCGCCAGTC CTGCTACCTC CCTTGCCTTT
CGAGGCCTGA AGCCAGCTGC CCTATGGGCC TGCCGGGCTG AGGGCCTGCT GGAGGCCTCA
GGTGCTGTCC ATGGGAAAGA TGGTGTGGTG TCCTGCCTGT CTGCCCCAGC CCAGATTCCC
CTGTGTCATC CCATCATTTT CCATATCCTG GTGCCCCCCA CCCCTGGAAG AGCCCAGTCT GTTGAGTTAG TTAAGTTGGG TTAATACCAG CTTAAAGGCA GTATTTTGTG TCCTCCAGGA
GCTTCTTGTT TCCTTGTTAG GGTTAACCCT TCATCTTCCT GTGTCCTGAA ACGCTCCTTT
GTGTGTGTGT CAGCTGAGGA TCC (les sites Ndel et BamHl sont soulignés en continu)
La séquence SEQ. ID. n° 7 de la protéine Hs Cdc25B2 avec ses extrémités de restriction Ndel et BamHl est la suivante :
CATATGGAGG TGCCCCAGCC GGAGCCCGCG CCAGGCTCGG CTCTCAGTCC AGCAGGCGTG TGCGGTGGCG CCCAGCGTCC GGGCCACCTC CCGGGCCTCC TGCTGGGATC TCATGGCCTC
CTGGGGTCCC CGGTGCGGGC GGCCGCTTCC TCGCCGGTCA CCACCCTCAC CCAGACCATG
CACGACCTCG CCGGGCTCGG CAGCGAAACC CCAAAGAGTC AGGTAGGGAC CCTGCTCTTC
CGCAGCCGCA GCCGCCTGAC GCACCTATCC CTGTCTCGAC GGGCATCCGA ATCCTCCCTG
TCGTCTGAAT CCTCCGAATC TTCTGATGCA GGTCTCTGCA TGGATTCCCC CAGCCCTATG GACCCCCACA TGGCGGAGCA GACGTTTGAA CAGGCCATCC AGGCAGCCAG CCGGATCATT
CGAAACGAGC AGTTTGCCAT CAGACGCTTC CAGTCTATGC CGGATGGATT TGTCTTCAAG
ATGCCATGGA AGCCCACACA TCCCAGCTCC ACCCATGCTC TGGCAGAGTG GGCCAGCCGC
AGGGAAGCCT TTGCCCAGAG ACCCAGCTCG GCCCCCGACC TGATGTGTCT CAGTCCTGAC
CGGAAGATGG AAGTGGAGGA GCTCAGCCCC CTGGCCCTAG GTCGCTTCTC TCTGACCCCT GCAGAGGGGG ATACTGAGGA AGATGATGGA TTTGTGGACA TCCTAGAGAG TGACTTAAAG
GATGATGATG CAGTTCCCCC AGGCATGGAG AGTCTCATTA GTGCCCCACT GGTCAAGACC
TTGGAAAAGG AAGAGGAAAA GGACCTCGTC ATGTACAGCA AGTGCCAGCG GCTCTTCCGC
TCTCCGTCCA TGCCCTGCAG CGTGATCCGG CCCATCCTCA AGAGGCTGGA GCGGCCCCAG
GACAGGGACA CGCCCGTGCA GAATAAGCGG AGGCGGAGCG TGACCCCTCC TGAGGAGCAG CAGGAGGCTG AGGAACCTAA AGCCCGCGTC CTCCGCTCAA AATCACTGTG TCACGATGAG
ATCGAGAACC TCCTGGACAG TGACCACCGA GAGCTGATTG GAGATTACTC TAAGGCCTTC
CTCCTACAGA CAGTAGACGG AAAGCACCAA GACCTCAAGT ACATCTCACC AGAAACGATG
GTGGCCCTAT TGACGGGCAA GTTCAGCAAC ATCGTGGATA AGTTTGTGAT TGTAGACTGC
AGATACCCCT ATGAATATGA AGGCGGGCAC ATCAAGACTG CGGTGAACTT GCCCCTGGAA CGCGACGCCG AGAGCTTCCT ACTGAAGAGC CCCATCGCGC CCTGTAGCCT GGACAAGAGA
GTCATCCTCA TTTTCCACTG TGAATTCTCA TCTGAGCGTG GGCCCCGCAT GTGCCGTTTC
ATCAGGGAAC GAGACCGTGC TGTCAACGAC TACCCCAGCC TCTACTACCC TGAGATGTAT
ATCCTGAAAG GCGGCTACAA GGAGTTCTTC CCTCAGCACC CGAACTTCTG TGAACCCCAG
GACTACCGGC CCATGAACCA CGAGGCCTTC AAGGATGAGC TAAAGACCTT CCGCCTCAAG ACTCGCAGCT GGGCTGGGGA GCGGAGCCGG CGGGAGCTCT GTAGCCGGCT GCAGGACCAG
TGAGGGGCCT GCGCCAGTCC TGCTACCTCC CTTGCCTTTC GAGGCCTGAA GCCAGCTGCC
CTATGGGCCT GCCGGGCTGA GGGCCTGCTG GAGGCCTCAG GTGCTGTCCA TGGGAAAGAT
GGTGTGGTGT CCTGCCTGTC TGCCCCAGCC CAGATTCCCC TGTGTCATCC CATCATTTTC
CATATCCTGG TGCCCCCCAC CCCTGGAAGA GCCCAGTCTG TTGAGTTAGT TAAGTTGGGT TAATACCAGC TTAAAGGCAG TATTTTGTGT CCTCCAGGAG CTTCTTGTTT CCTTGTTAGG
GTTAACCCTT CATCTTCCTG TGTCCTGAAA CGCTCCTTTG TGTGTGTGTC AGCTGAGGAT CC WO 01/44467 - 21 - PCT/FROO/03496
(les sites Ndel et BamHl sont soulignés en continu)
La séquence SEQ. ID. n° 8 de la protéine Hs Cdc25B3 avec ses extrémités de restriction Ndel et BamHl est la suivante :
CATATGGAGG TGCCCCAGCC GGAGCCCGCG CCAGGCTCGG CTCTCAGTCC AGCAGGCGTG TGCGGTGGCG CCCAGCGTCC GGGCCACCTC CCGGGCCTCC TGCTGGGATC TCATGGCCTC
CTGGGGTCCC CGGTGCGGGC GGCCGCTTCC TCGCCGGTCA CCACCCTCAC CCAGACCATG
CACGACCTCG CCGGGCTCGG CAGCGAAACC CCAAAGAGTC AGGTAGGGAC CCTGCTCTTC
CGCAGCCGCA GCCGCCTGAC GCACCTATCC CTGTCTCGAC GGGCATCCGA ATCCTCCCTG
TCGTCTGAAT CCTCCGAATC TTCTGATGCA GGTCTCTGCA TGGATTCCCC CAGCCCTATG GACCCCCACA TGGCGGAGCA GACGTTTGAA CAGGCCATCC AGGCAGCCAG CCGGATCATT
CGAAACGAGC AGTTTGCCAT CAGACGCTTC CAGTCTATGC CGGTGAGGCT GCTGGGCCAC
AGCCCCGTGC TTCGGAACAT CACCAACTCC CAGGCGCCCG ACGGCCGGAG GAAGAGCGAG
GCGGGCAGTG GAGCTGCCAG CAGCTCTGGG GAAGACAAGG AGAATGATGG ATTTGTCTTC
AAGATGCCAT GGAAGCCCAC ACATCCCAGC TCCACCCATG CTCTGGCAGA GTGGGCCAGC CGCAGGGAAG CCTTTGCCCA GAGACCCAGC TCGGCCCCCG ACCTGATGTG TCTCAGTCCT
GACCGGAAGA TGGAAGTGGA GGAGCTCAGC CCCCTGGCCC TAGGTCGCTT CTCTCTGACC
CCTGCAGAGG GGGATACTGA GGAAGATGAT GGATTTGTGG ACATCCTAGA GAGTGACTTA
AAGGATGATG ATGCAGTTCC CCCAGGCATG GAGAGTCTCA TTAGTGCCCC ACTGGTCAAG
ACCTTGGAAA AGGAAGAGGA AAAGGACCTC GTCATGTACA GCAAGTGCCA GCGGCTCTTC CGCTCTCCGT CCATGCCCTG CAGCGTGATC CGGCCCATCC TCAAGAGGCT GGAGCGGCCC
CAGGACAGGG ACACGCCCGT GCAGAATAAG CGGAGGCGGA GCGTGACCCC TCCTGAGGAG
CAGCAGGAGG CTGAGGAACC TAAAGCCCGC GTCCTCCGCT CAAAATCACT GTGTCACGAT
GAGATCGAGA ACCTCCTGGA CAGTGACCAC CGAGAGCTGA TTGGAGATTA CTCTAAGGCC
TTCCTCCTAC AGACAGTAGA CGGAAAGCAC CAAGACCTCA AGTACATCTC ACCAGAAACG ATGGTGGCCC TATTGACGGG CAAGTTCAGC AACATCGTGG ATAAGTTTGT GATTGTAGAC
TGCAGATACC CCTATGAATA TGAAGGCGGG CACATCAAGA CTGCGGTGAA CTTGCCCCTG
GAACGCGACG CCGAGAGCTT CCTACTGAAG AGCCCCATCG CGCCCTGTAG CCTGGACAAG
AGAGTCATCC TCATTTTCCA CTGTGAATTC TCATCTGAGC GTGGGCCCCG CATGTGCCGT
TTCATCAGGG AACGAGACCG TGCTGTCAAC GACTACCCCA GCCTCTACTA CCCTGAGATG TATATCCTGA AAGGCGGCTA CAAGGAGTTC TTCCCTCAGC ACCCGAACTT CTGTGAACCC
CAGGACTACC GGCCCATGAA CCACGAGGCC TTCAAGGATG AGCTAAAGAC CTTCCGCCTC
AAGACTCGCA GCTGGGCTGG GGAGCGGAGC CGGCGGGAGC TCTGTAGCCG GCTGCAGGAC
CAGTGAGGGG CCTGCGCCAG TCCTGCTACC TCCCTTGCCT TTCGAGGCCT GAAGCCAGCT
GCCCTATGGG CCTGCCGGGC TGAGGGCCTG CTGGAGGCCT CAGGTGCTGT CCATGGGAAA GATGGTGTGG TGTCCTGCCT GTCTGCCCCA GCCCAGATTC CCCTGTGTCA TCCCATCATT
TTCCATATCC TGGTGCCCCC CACCCCTGGA AGAGCCCAGT CTGTTGAGTT AGTTAAGTTG
GGTTAATACC AGCTTAAAGG CAGTATTTTG TGTCCTCCAG GAGCTTCTTG TTTCCTTGTT AGGGTTAACC CTTCATCTTC CTGTGTCCTG AAACGCTCCT TTGTGTGTGT GTCAGCTGAG GATCC
(les sites Ndel et BamHl sont soulignés en continu)
1.4 - Création des souches JM109/pMAL-Cdc25Bl, B2 et B3
Les vecteurs pMAL-Cdc25Bl-3 ont chacun été introduits dans la souche à' Escherichia coli JM109 (Stratagene #200271). Les colonies ont été sélectionnées sur la base de leur capacité à produire une protéine de fusion après culture en présence d'IPTG. L'identité des protéines a été vérifiée par immunodétection avec des anticorps polyclonaux dirigés contre Cdc25B.
Les ADN plasmidiques isolés de ces trois clones ont été séquences dans la région correspondant à Cdc25B. Les séquences suivantes ont été obtenues (la partie doublement soulignée correspond à l'ORF de MBP et la partie soulignée en pointillés à l'ORF de Cdc25Bl, Cdc25B2 ou Cdc25B3) :
• SEQ. ID n° 9 (pMAL-HsCdc25Bl) :
ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT
CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG
CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC
ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC
TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA
GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC WO 01/44467 .23 - PCTFROO/03496
AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC GCGCCAGGCT CGGCTCTCAG TCCAGCAGGC GTGTGCGGTG GCGCCCAGCG TCCGGGCCAC CTCCCGGGCC TCCTGCTGGG ATCTCATGGC CTCCTGGGGT CCCCGGTGCG GGCGGCCGCT TCCTCGCCGG TCACCACCCT CACCCAGACC ATGCACGACC TCGCCGGGCT CGGCAGCCGC AGCCGCCTGA CGCACCTATC CCTGTCTCGA CGGGCATCCG AATCCTCCCT GTCGTCTGAA TCCTCCGAAT CTTCTGATGC AGGTCTCTGC ATGGATTCCC CCAGCCCTAT GGACCCCCAC ATGGCGGAGC AGACGTTTGA ACAGGCCATC CAGGCAGCCA GCCGGATCAT TCGAAACGAG CAGTTTGCCA TCAGACGCTT CCAGTCTATG CCGGTGAGGC TGCTGGGCCA CAGCCCCGTG CTTCGGAACA TCACCAACTC CCAGGCGCCC GACGGCCGGA GGAAGAGCGA GGCGGGCAGT GGAGCTGCCA GCAGCTCTGG GGAAGACAAG GAGAATGATG GATTTGTCTT CAAGATGCCA TGGAAGCCCA CACATCCCAG CTCCACCCAT GCTCTGGCAG AGTGGGCCAG CCGCAGGGAA GCCTTTGCCC AGAGACCCAG CTCGGCCCCC GACCTGATGT GTCTCAGTCC TGACCGGAAG ATGGAAGTGG AGGAGCTCAG CCCCCTGGCC CTAGGTCGCT TCTCTCTGAC CCCTGCAGAG GGGGATACTG AGGAAGATGA TGGATTTGTG GACATCCTAG AGAGTGACTT AAAGGATGAT GATGCAGTTC CCCCAGGCAT GGAGAGTCTC ATTAGTGCCC CACTGGTCAA GACCTTGGAA AAGGAAGAGG AAAAGGACCT CGTCATGTAC AGCAAGTGCC AGCGGCTCTT CCGCTCTCCG TCCATGCCCT GCAGCGTGAT CCGGCCCATC CTCAAGAGGC TGGAGCGGCC CCAGGACAGG GACACGCCCG TGCAGAATAA GCGGAGGCGG AGCGTGACCC CTCCTGAGGA GCAGCAGGAG GCTGAGGAAC CTAAAGCCCG CGTCCTCCGC TCAAAATCAC TGTGTCACGA TGAGATCGAG AACCTCCTGG ACAGTGACCA CCGAGAGCTG ATTGGAGATT ACTCTAAGGC CTTCCTCCTA CAGACAGTAG ACGGAAAGCA CCAAGACCTC AAGTACATCT CACCAGAAAC GATGGTGGCC CTATTGACGG GCAAGTTCAG CAACATCGTG GATAAGTTTG TGATTGTAGA CTGCAGATAC CCCTATGAAT ATGAAGGCGG GCACATCAAG ACTGCGGTGA ACTTGCCCCT GGAACGCGAC GCCGAGAGCT TCCTACTGAA GAGCCCCATC GCGCCCTGTA GCCTGGACAA GAGAGTCATC CTCATTTTCC ACTGTGAATT CTCATCTGAG CGTGGGCCCC GCATGTGCCG TTTCATCAGG GAACGAGACC GTGCTGTCAA CGACTACCCC AGCCTCTACT ACCCTGAGAT GTATATCCTG AAAGGCGGCT ACAAGGAGTT CTTCCCTCAG CACCCGAACT TCTGTGAACC CCAGGACTAC CGGCCCATGA ACCACGAGGC CTTCAAGGAT GAGCTAAAGA CCTTCCGCCT CAAGACTCGC AGCTGGGCTG GGGAGCGGAG CCGGCGGGAG CTCTGTAGCC GGCTGCAGGA CCAGTGAGGG GCCTGCGCCA GTCCTGCTAC CTCCCTTGCC TTTCGAGGCC TGAAGCCAGC TGCCCTATGG GCCTGCCGGG CTGAGGGCCT GCTGGAGGCC TCAGGTGCTG TCCATGGGAA AGATGGTGTG GTGTCCTGCC TGTCTGCCCC AGCCCAGATT CCCCTGTGTC ATCCCATCAT TTTCCATATC CTGGTGCCCC CCACCCCTGG AAGAGCCCAG TCTGTTGAGT TAGTTAAGTT GGGTTAATAC CAGCTTAAAG GCAGTATTTT GTGTCCTCCA GGAGCTTCTT GTTTCCTTGT TAGGGTTAAC CCTTCATCTT CCTGTGTCCT GAAACGCTCC TTTGTGTGTG TGTCAGCTGA GGATCC SEQ. ID n° 10 (PMAL-HsCdc25B2) :
ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG
CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA
GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA
GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC
CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC
ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC
TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA
GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC
AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC GCG CAGGCT. CGGCTCTCAG.TCCAGCAGGC..GTGTGCGGTG..GCGCCCAGCG .TCCGGGCCAC CTCCCGGGCC .TC.CTGCTGGG .ATCTCATGGC...CTÇCTGGGCT ^ TCCTCGCCGG.TCACCACCCT...CACCCAGACC..ATGCA∞ ACC CAAAGA.GTCAGGTAGG...GACCÇ.TGÇTC..TTCCGÇAGÇÇ GÇAGÇCGÇÇT GACGCAÇÇTA TÇÇÇTGTÇT.C.GACGGGCATC. CG-^.TCCTÇ^..CTGTÇGTÇTG AAT.CCTCCGA ATCTT.CTGAT GÇAGGTCTCT GCATGGATTC ÇCÇÇAGCÇCT ATGG.ACCCCC..AÇATGGÇGGA. GCAGACGTTT G A.CAGGCÇA TÇCAGGCAGC CAGCCGGATC ATTÇG.AAACG..AGCAGTTTGC..ÇATCAGAÇGC TTCÇ.AGTCTA..TGCÇGGATGG..ATTTGTÇTTÇ. AAGATGÇC T GGAAGCCCAC AÇATCCCAGÇ TÇ.CACÇCATG.CTC.TGGCAGA..GTGGGÇCAGC. CGCAGGGAAG CÇT.TTGCCCA GAGACCCAGÇ TCGGCCÇÇCG..AÇCTGATGTG .T.ÇTCAGTCCT..GACCGGAAGA TGGAAGTGGA. GGAGCTCAGC CCCCTGGCCC TAGGTCGÇTT CT.TCTGACC CCTGCAGAGG..GGGATA.CTGA..G^AAGATGAT GGA.TTTGTGG AÇATCCTAG GAGTGACTTA AAGGATGATG .A.TGCAGTTCC..CCCAGGÇATG GAGAGTCTÇA TTAGTGCCCC ACTGGTCAAG ACÇT.TGGAAA.. .GGAAGAGGA. AAAGGACCTC GTCATGTAÇA GÇAAGTGCCA GCGGCTCTTC CGÇTCTCCGT. ÇCATGCCCTG .CAGCGTGATC CGGCCCATCC TCAAGAGGCT GGAGCGGCCC CAGGACAGGG ACACGCCCGT GCAGAATAAG CGGAGGCGGA GCGTGACCCC TCCTGAGGAG CAGCAGGAGG CTGAGGAACC TAAAGCCCGC
GTCCTCCGCT CAAAATCACT GTGTCACGAT GAGATCGAGA ACCTCCTGGA CAGTGACCAC
CGAGAGCTGA TTGGAGATTA CTCTAAGGCC TTCCTCCTAC AGACAGTAGA CGGAAAGCAC
CAAGACCTCA AGTACATCTC ACCAGAAACG ATGGTGGCCC TATTGACGGG CAAGTTCAGC
AACATCGTGG ATAAGTTTGT GATTGTAGAC TGCAGATACC CCTATGAATA TGAAGGCGGG
CACATCAAGA CTGCGGTGAA CTTGCCCCTG GAACGCGACG CCGAGAGCTT CCTACTGAAG
AGCCCCATCG CGCCCTGTAG CCTGGACAAG AGAGTCATCC TCATTTTCCA CTGTGAATTC
TCATCTGAGC GTGGGCCCCG CATGTGCCGT TTCATCAGGG AACGAGACCG TGCTGTCAAC
GACTACCCCA GCCTCTACTA CCCTGAGATG TATATCCTGA AAGGCGGCTA CAAGGAGTTC
TTCCCTCAGC ACCCGAACTT CTGTGAACCC CAGGACTACC GGCCCATGAA CCACGAGGCC
TTCAAGGATG AGCTAAAGAC CTTCCGCCTC AAGACTCGCA GCTGGGCTGG GGAGCGGAGC
ÇGGÇGGGAGC.TCTGTAGÇCG.GCT CCTGCGCCAG TCCTGCTACC
TCCCTTGCCT TTCGAGGCCT GAAGCCAGCT GCCCTATGGG CCTGCCGGGC TGAGGGCCTG
CTGGAGGCCT CAGGTGCTGT CCATGGGAAA GATGGTGTGG TGTCCTGCCT GTCTGCCCCA GCCCAGATTC CCCTGTGTCA TCCCATCATT TTCCATATCC TGGTGCCCCC CACCCCTGGA
AGAGCCCAGT CTGTTGAGTT AGTTAAGTTG GGTTAATACC AGCTTAAAGG CAGTATTTTG
TGTCCTCCAG GAGCTTCTTG TTTCCTTGTT AGGGTTAACC CTTCATCTTC CTGTGTCCTG AAACGCTCCT TTGTGTGTGT GTCAGCTGAG GATCC
• SEQ. ID n° 11 (pMAL-HsCdc25B3) :
ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT
CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA
GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC
AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC
GCGCCAGGCT CGGCTCTCAG TCCAGCAGGC GTGTGCGGTG GCGCCCAGCG TCCGGGCCAC CTCCCGGGCC TCCTGCTGGG ATCTCATGGC CTCCTGGGGT CCCCGGTGCG GGCGGCCGCT
TCCTCGCCGG TCACCACCCT CACCCAGACC ATGCACGACC TCGCCGGGCT CGGCAGCGAA
ACCCCAAAGA GTCAGGTAGG GACCCTGCTC TTCCGCAGCC GCAGCCGCCT GACGCACCTA
TCCCTGTCTC GACGGGCATC CGAATCCTCC CTGTCGTCTG AATCCTCCGA ATCTTCTGAT
GCAGGTCTCT GCATGGATTC CCCCAGCCCT ATGGACCCCC ACATGGCGGA GCAGACGTTT GAACAGGCCA TCCAGGCAGC CAGCCGGATC ATTCGAAACG AGCAGTTTGC CATCAGACGC
TTCCAGTCTA TGCCGGTGAG GCTGCTGGGC CACAGCCCCG TGCTTCGGAA CATCACCAAC
TCCCAGGCGC CCGACGGCCG GAGGAAGAGC GAGGCGGGCA GTGGAGCTGC CAGCAGCTCT
GGGGAAGACA AGGAGAATGA TGGATTTGTC TTCAAGATGC CATGGAAGCC CACACATCCC
AGCTCCACCC ATGCTCTGGC AGAGTGGGCC AGCCGCAGGG AAGCCTTTGC CCAGAGACCC AGCTCGGCCC CCGACCTGAT GTGTCTCAGT CCTGACCGGA AGATGGAAGT GGAGGAGCTC
AGCCCCCTGG CCCTAGGTCG CTTCTCTCTG ACCCCTGCAG AGGGGGATAC TGAGGAAGAT
GATGGATTTG TGGACATCCT AGAGAGTGAC TTAAAGGATG ATGATGCAGT TCCCCCAGGC
ATGGAGAGTC TCATTAGTGC CCCACTGGTC AAGACCTTGG AAAAGGAAGA GGAAAAGGAC
CTCGTCATGT ACAGCAAGTG CCAGCGGCTC TTCCGCTCTC CGTCCATGCC CTGCAGCGTG ATCCGGCCCA TCCTCAAGAG GCTGGAGCGG CCCCAGGACA GGGACACGCC CGTGCAGAAT
AAGCGGAGGC GGAGCGTGAC CCCTCCTGAG GAGCAGCAGG AGGCTGAGGA ACCTAAAGCC
CGCGTCCTCC GCTCAAAATC ACTGTGTCAC GATGAGATCG AGAACCTCCT GGACAGTGAC
CACCGAGAGC TGATTGGAGA TTACTCTAAG GCCTTCCTCC TACAGACAGT AGACGGAAAG
CACCAAGACC TCAAGTACAT CTCACCAGAA ACGATGGTGG CCCTATTGAC GGGCAAGTTC AGCAACATCG TGGATAAGTT TGTGATTGTA GACTGCAGAT ACCCCTATGA ATATGAAGGC
GGGCACATCA AGACTGCGGT GAACTTGCCC CTGGAACGCG ACGCCGAGAG CTTCCTACTG
AAGAGCCCCA TCGCGCCCTG TAGCCTGGAC AAGAGAGTCA TCCTCATTTT CCACTGTGAA
TTCTCATCTG AGCGTGGGCC CCGCATGTGC CGTTTCATCA GGGAACGAGA CCGTGCTGTC
AACGACTACC CCAGCCTCTA CTACCCTGAG ATGTATATCC TGAAAGGCGG CTACAAGGAG TTCTTCCCTC AGCACCCGAA CTTCTGTGAA CCCCAGGACT ACCGGCCCAT GAACCACGAG
GCCTTCAAGG ATGAGCTAAA GACCTTCCGC CTCAAGACTC GCAGCTGGGC TGGGGAGCGG
AGCCGGCGGG AGCTCTGTAG CCGGCTGCAG GACCAGTGAG GGGCCTGCGC CAGTCCTGCT
ACCTCCCTTG CCTTTCGAGG CCTGAAGCCA GCTGCCCTAT GGGCCTGCCG GGCTGAGGGC
CTGCTGGAGG CCTCAGGTGC TGTCCATGGG AAAGATGGTG TGGTGTCCTG CCTGTCTGCC CCAGCCCAGA TTCCCCTGTG TCATCCCATC ATTTTCCATA TCCTGGTGCC CCCCACCCCT
GGAAGAGCCC AGTCTGTTGA GTTAGTTAAG TTGGGTTAAT ACCAGCTTAA AGGCAGTATT
TTGTGTCCTC CAGGAGCTTC TTGTTTCCTT GTTAGGGTTA ACCCTTCATC TTCCTGTGTC
CTGAAACGCT CCTTTGTGTG TGTGTCAGCT GAGGATCC Ces clones sont conservés à - 80 °C sous forme de culture saturée additionnée de glycérol (concentration finale 25%). Ces souches sont ensuite utilisées pour toutes les étapes de production ultérieures.
2 - Production et purification des protéines recombinantes MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 :
Les protéines recombinantes MBP-Cdc25Bl, B2 et B3 sont produites exactement comme cela est décrit pour MBP-Cdc25C.
Les séquences SEQ. ID n° 12, SEQ. ID n° 13 et SEQ. ID n° 14 sont obtenues respectivement pour les protéines de fusion MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 :
• SEQ. ID n° 12 (MBP-Cdc25Bl) :
ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT
CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC GCGCCAGGCT CGGCTCTCAG TCCAGCAGGC GTGTGCGGTG GCGCCCAGCG TCCGGGCCAC CTCCCGGGCC TCCTGCTGGG ATCTCATGGC CTCCTGGGGT CCCCGGTGCG GGCGGCCGCT TCCTCGCCGG TCACCACCCT CACCCAGACC ATGCACGACC TCGCCGGGCT CGGCAGCCGC
AGCCGCCTGA CGCACCTATC CCTGTCTCGA CGGGCATCCG AATCCTCCCT GTCGTCTGAA
TCCTCCGAAT CTTCTGATGC AGGTCTCTGC ATGGATTCCC CCAGCCCTAT GGACCCCCAC
ATGGCGGAGC AGACGTTTGA ACAGGCCATC CAGGCAGCCA GCCGGATCAT TCGAAACGAG CAGTTTGCCA TCAGACGCTT CCAGTCTATG CCGGTGAGGC TGCTGGGCCA CAGCCCCGTG
CTTCGGAACA TCACCAACTC CCAGGCGCCC GACGGCCGGA GGAAGAGCGA GGCGGGCAGT
GGAGCTGCCA GCAGCTCTGG GGAAGACAAG GAGAATGATG GATTTGTCTT CAAGATGCCA
TGGAAGCCCA CACATCCCAG CTCCACCCAT GCTCTGGCAG AGTGGGCCAG CCGCAGGGAA
GCCTTTGCCC AGAGACCCAG CTCGGCCCCC GACCTGATGT GTCTCAGTCC TGACCGGAAG ATGGAAGTGG AGGAGCTCAG CCCCCTGGCC CTAGGTCGCT TCTCTCTGAC CCCTGCAGAG
GGGGATACTG AGGAAGATGA TGGATTTGTG GACATCCTAG AGAGTGACTT AAAGGATGAT
GATGCAGTTC CCCCAGGCAT GGAGAGTCTC ATTAGTGCCC CACTGGTCAA GACCTTGGAA
AAGGAAGAGG AAAAGGACCT CGTCATGTAC AGCAAGTGCC AGCGGCTCTT CCGCTCTCCG
TCCATGCCCT GCAGCGTGAT CCGGCCCATC CTCAAGAGGC TGGAGCGGCC CCAGGACAGG GACACGCCCG TGCAGAATAA GCGGAGGCGG AGCGTGACCC CTCCTGAGGA GCAGCAGGAG
GCTGAGGAAC CTAAAGCCCG CGTCCTCCGC TCAAAATCAC TGTGTCACGA TGAGATCGAG
AACCTCCTGG ACAGTGACCA CCGAGAGCTG ATTGGAGATT ACTCTAAGGC CTTCCTCCTA
CAGACAGTAG ACGGAAAGCA CCAAGACCTC AAGTACATCT CACCAGAAAC GATGGTGGCC
CTATTGACGG GCAAGTTCAG CAACATCGTG GATAAGTTTG TGATTGTAGA CTGCAGATAC CCCTATGAAT ATGAAGGCGG GCACATCAAG ACTGCGGTGA ACTTGCCCCT GGAACGCGAC GCCGAGAGCT TCCTACTGAA GAGCCCCATC GCGCCCTGTA GCCTGGACAA GAGAGTCATC
CTCATTTTCC ACTGTGAATT CTCATCTGAG CGTGGGCCCC GCATGTGCCG TTTCATCAGG
GAACGAGACC GTGCTGTCAA CGACTACCCC AGCCTCTACT ACCCTGAGAT GTATATCCTG AAAGGCGGCT ACAAGGAGTT CTTCCCTCAG CACCCGAACT TCTGTGAACC CCAGGACTAC CGGCCCATGA ACCACGAGGC CTTCAAGGAT GAGCTAAAGA CCTTCCGCCT CAAGACTCGC
AGCTGGGCTG GGGAGCGGAG CCGGCGGGAG CTCTGTAGCC GGCTGCAGGA CCAGTGA
SEQ ID n° 13 (MBP-Cdc25B2)
ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA WO 01/44467 . 29 - PCT/FROO/03496
GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA
GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC
CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC
ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC
TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA
GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC
AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC GCGCCAGGCT CGGCTCTCAG TCCAGCAGGC GTGTGCGGTG GCGCCCAGCG TCCGGGCCAC CTCCCGGGCC TCCTGCTGGG ATCTCATGGC CTCCTGGGGT CCCCGGTGCG GGCGGCCGCT TCCTCGCCGG TCACCACCCT CACCCAGACC ATGCACGACC TCGCCGGGCT CGGCAGCGAA ACCCCAAAGA GTCAGGTAGG GACCCTGCTC TTCCGCAGCC GCAGCCGCCT GACGCACCTA TCCCTGTCTC GACGGGCATC CGAATCCTCC CTGTCGTCTG AATCCTCCGA ATCTTCTGAT GCAGGTCTCT GCATGGATTC CCCCAGCCCT ATGGACCCCC ACATGGCGGA GCAGACGTTT GAACAGGCCA TCCAGGCAGC CAGCCGGATC ATTCGAAACG AGCAGTTTGC CATCAGACGC TTCCAGTCTA TGCCGGATGG ATTTGTCTTC AAGATGCCAT GGAAGCCCAC ACATCCCAGC TCCACCCATG CTCTGGCAGA GTGGGCCAGC CGCAGGGAAG CCTTTGCCCA GAGACCCAGC TCGGCCCCCG ACCTGATGTG TCTCAGTCCT GACCGGAAGA TGGAAGTGGA GGAGCTCAGC CCCCTGGCCC TAGGTCGCTT CTCTCTGACC CCTGCAGAGG GGGATACTGA GGAAGATGAT GGATTTGTGG ACATCCTAGA GAGTGACTTA AAGGATGATG ATGCAGTTCC CCCAGGCATG GAGAGTCTCA TTAGTGCCCC ACTGGTCAAG ACCTTGGAAA AGGAAGAGGA AAAGGACCTC GTCATGTACA GCAAGTGCCA GCGGCTCTTC CGCTCTCCGT CCATGCCCTG CAGCGTGATC CGGCCCATCC TCAAGAGGCT GGAGCGGCCC CAGGACAGGG ACACGCCCGT GCAGAATAAG CGGAGGCGGA GCGTGACCCC TCCTGAGGAG CAGCAGGAGG CTGAGGAACC TAAAGCCCGC GTCCTCCGCT CAAAATCACT GTGTCACGAT GAGATCGAGA ACCTCCTGGA CAGTGACCAC CGAGAGCTGA TTGGAGATTA CTCTAAGGCC TTCCTCCTAC AGACAGTAGA CGGAAAGCAC CAAGACCTCA AGTACATCTC ACCAGAAACG ATGGTGGCCC TATTGACGGG CAAGTTCΛGC AACATCGTGG ATAAGTTTGT GATTGTAGAC TGCAGATACC CCTATGAATA TGAAGGCGGG CACATCAAGA CTGCGGTGAA CTTGCCCCTG GAACGCGACG CCGAGAGCTT CCTACTGAAG AGCCCCATCG CGCCCTGTAG CCTGGACAAG AGAGTCATCC TCATTTTCCA CTGTGAATTC TCATCTGAGC GTGGGCCCCG CATGTGCCGT TTCATCAGGG AACGAGACCG TGCTGTCAAC GACTACCCCA GCCTCTACTA CCCTGAGATG TATATCCTGA AAGGCGGCTA CAAGGAGTTC TTCCCTCAGC ACCCGAACTT CTGTGAACCC CAGGACTACC GGCCCATGAA CCACGAGGCC TTCAAGGATG AGCTAAAGAC CTTCCGCCTC AAGACTCGCA GCTGGGCTGG GGAGCGGAGC CGGCGGGAGC TCTGTAGCCG GCTGCAGGAC CAGTGA • SEQ ID n° 14 (MBP-Cdc25B3)
ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT
CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG
CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA
GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA
GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC
CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC
ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC
TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA
GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC
AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG AGGTGCCCCA GCCGGAGCCC GCGCCAGGCT CGGCTCTCAG TCCAGCAGGC GTGTGCGGTG GCGCCCAGCG TCCGGGCCAC CTCCCGGGCC TCCTGCTGGG ATCTCATGGC CTCCTGGGGT CCCCGGTGCG GGCGGCCGCT TCCTCGCCGG TCACCACCCT CACCCAGACC ATGCACGACC TCGCCGGGCT CGGCAGCGAA ACCCCAAAGA GTCAGGTAGG GACCCTGCTC TTCCGCAGCC GCAGCCGCCT GACGCACCTA TCCCTGTCTC GACGGGCATC CGAATCCTCC CTGTCGTCTG AATCCTCCGA ATCTTCTGAT GCAGGTCTCT GCATGGATTC CCCCAGCCCT ATGGACCCCC ACATGGCGGA GCAGACGTTT GAACAGGCCA TCCAGGCAGC CAGCCGGATC ATTCGAAACG AGCAGTTTGC CATCAGACGC TTCCAGTCTA TGCCGGTGAG GCTGCTGGGC CACAGCCCCG TGCTTCGGAA CATCACCAAC TCCCAGGCGC CCGACGGCCG GAGGAAGAGC GAGGCGGGCA GTGGAGCTGC CAGCAGCTCT GGGGAAGACA AGGAGAATGA TGGATTTGTC TTCAAGATGC CATGGAAGCC CACACATCCC AGCTCCACCC ATGCTCTGGC AGAGTGGGCC AGCCGCAGGG AAGCCTTTGC CCAGAGACCC AGCTCGGCCC CCGACCTGAT GTGTCTCAGT CCTGACCGGA AGATGGAAGT GGAGGAGCTC AGCCCCCTGG CCCTAGGTCG CTTCTCTCTG ACCCCTGCAG AGGGGGATAC TGAGGAAGAT GATGGATTTG TGGACATCCT AGAGAGTGAC TTAAAGGATG ATGATGCAGT TCCCCCAGGC ATGGAGAGTC TCATTAGTGC CCCACTGGTC AAGACCTTGG AAAAGGAAGA GGAAAAGGAC CTCGTCATGT ACAGCAAGTG CCAGCGGCTC TTCCGCTCTC CGTCCATGCC CTGCAGCGTG ATCCGGCCCA TCCTCAAGAG GCTGGAGCGG CCCCAGGACA GGGACACGCC CGTGCAGAAT AAGCGGAGGC GGAGCGTGAC CCCTCCTGAG GAGCAGCAGG AGGCTGAGGA ACCTAAAGCC CGCGTCCTCC GCTCAAAATC ACTGTGTCAC GATGAGATCG AGAACCTCCT GGACAGTGAC CACCGAGAGC TGATTGGAGA TTACTCTAAG GCCTTCCTCC TACAGACAGT AGACGGAAAG CACCAAGACC TCAAGTACAT CTCACCAGAA ACGATGGTGG CCCTATTGAC GGGCAAGTTC AGCAACATCG TGGATAAGTT TGTGATTGTA GACTGCAGAT ACCCCTATGA ATATGAAGGC GGGCACATCA AGACTGCGGT GAACTTGCCC CTGGAACGCG ACGCCGAGAG CTTCCTACTG AAGAGCCCCA TCGCGCCCTG TAGCCTGGAC AAGAGAGTCA TCCTCATTTT CCACTGTGAA TTCTCATCTG AGCGTGGGCC CCGCATGTGC CGTTTCATCA GGGAACGAGA CCGTGCTGTC AACGACTACC CCAGCCTCTA CTACCCTGAG ATGTATATCC TGAAAGGCGG CTACAAGGAG TTCTTCCCTC AGCACCCGAA CTTCTGTGAA CCCCAGGACT ACCGGCCCAT GAACCACGAG GCCTTCAAGG ATGAGCTAAA GACCTTCCGC CTCAAGACTC GCAGCTGGGC TGGGGAGCGG AGCCGGCGGG AGCTCTGTAG CCGGCTGCAG GACCAGTGA
3 - Détermination de l'activité des protéines de fusion MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 :
Les activités des protéines de fusion MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 sont mesurées dans les mêmes conditions que celles décπtes pour la protéine de fusion MBP-Cdc25C. Les résultats obtenus sont reportés en figure 3
LEGENDE DES FIGURES
La figure 1 (FIG 1) représente la chromatographie d'analyse relative à l'induction d'expression de la protéine de fusion MBP-Cdc25C Les lignes 1 et 2 de la figure 1 correspondent respectivement à l'extrait total de JM109/pMAL-Cdc25C avec ou sans ajout d'IPTG. La ligne 3 correspond à l'extrait soluble Les lignes 4 et 5 correspondent respectivement aux fractions non retenue et retenue sur amylose-agarose Enfin, la ligne 6 de la figure 1 correspond a la fraction d'elution n° 12 qui ne contient pratiquement que la protéine de fusion
La figure 2 (FIG. 2) représente les résultats de la mesure de l'activité de la protéine recombinante MBP-Cdc25C (un "+" signifiant que de la ménadione a été ajoutée à l'échantillon, un "-" que l'échantillon n'a pas été traité par de la ménadione) La figure 3 (FIG. 3) représente les résultats de la mesure de l'activité des protéines recombinantes MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3. La réaction est réalisée avec 300 ng d'enzyme par essai. La MBP à la même concentration est utilisée dans le contrôle. Les valeurs de fluorescence mesurées permettent le calcul des pentes : 0,0025 Δfluo/sec pour le contrôle, 0,0361 Δfluo/sec pour Cdc25Bl, 0,0350 Δfluo/sec pour Cdc25B2 et 0,0372 Δfluo/sec pour Cdc25B3.

Claims

Revendications
1. Protéine caractérisée en ce qu'il s'agit d'une protéine de fusion entre la protéine liant le maltose (MBP) et une protéine choisie parmi les protéines Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 et Cdc25C.
2. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les protéines suivantes : - une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25Bl humaine et la MBP, laquelle est codée par la séquence SEQ. ID n° 12 ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B2 humaine et la MBP, laquelle est codée par la séquence SEQ. ID n° 13 ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B3 humaine et la MBP, laquelle est codée par la séquence SEQ. ID n° 14 ; et
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25C humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 1.
3. Protéine selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° l.
4. ADN caractérisé en ce qu'il code pour une protéine selon l'une des revendications 1 à 3.
5. ADN complémentaire à l'ADN selon la revendication 4.
6. Souche bactérienne caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche bactérienne JM 109 transfectée par un plasmide choisi parmi le plasmide de séquence SEQ. ID n° 9, le plasmide de séquence SEQ. ID n° 10, le plasmide de séquence SEQ. ID n° 11 et le plasmide de séquence SEQ. ID n° 5.
7. Procédé de préparation d'une protéine selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes :
- culture de la souche bactérienne JM 109 transfectée par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 9, le plasmide de séquence SEQ. ID n° 10, le plasmide de séquence
SEQ. ID n° 11 ou le plasmide de séquence SEQ. ID n° 5, dans un milieu LB additionné d'ampicilline ; - induction de la synthèse de la protéine de fusion par ajout d'isopropylthiogalactoside ;
- lyse des bactéries ;
- purification de la protéine de fusion obtenue par chromatographie sur résine d'amylose-agarose et récupération des fractions contenant la protéine purifiée.
8. Application d'une protéine selon la revendication 1 à une méthode d'identification de modulateurs de la protéine Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C, caractérisée en ce que ladite méthode comporte les étapes successives suivantes :
- ajout, à une solution de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine, de la protéine de fusion telle qu'obtenue par un procédé de préparation selon la revendication 7 et d'un composé présumé être un modulateur de la protéine Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C ;
- détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite rapportée à la quantité initiale de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine.
9. Application selon la revendication 8, caractérisée en ce que la détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite rapportée à la quantité initiale de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine est effectuée par mesure de l'absorbance liée à la 3-O-méthylfluorescéine à la longueur d'onde de 477 nm.
10. Application selon la revendication 8, caractérisée en ce que la détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite rapportée à la quantité initiale de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine est effectuée par fluorimétrie en utilisant une excitation à la longueur d'onde de 475 nm et une lecture à la longueur d'onde de 510 nm.
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