CA2394152A1 - Methode d'obtention de phosphatases humaines cdc25 et methode d'identification de modulateurs de phosphatases humaines cdc25 - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une méthode d'obtention de phosphatases humaines cdc25B1, cdc25B2, cdcB3 et cdc25C. L'invention a en particulier pou r objet une protéine de fusion entre la phosphatase humaine cdc25B1, cdc25B2, cdcB3 ou cdc25C et la protéine liant le maltose (Maltose Binding Protein ou MBP) d'Escherichia coli, la séquence d'ADN codant pour ladite protéine de fusion, un procédé de préparation de ladite protéine de fusion ainsi qu'une méthode d'identification de modulateurs de la protéine cdc25B1, cdc25B2, cdc B3 ou cdc25C humaine.
Description
Méthode d'obtention de phosphatases humaines Cdc25 et méthode d'identification de modulateurs de phosphatases humaines Cdc25 La présente invention concerne une méthode d'obtention de phosphatases humaines Cdc25. Elle concerne également une méthode d'identification de modulateurs de phosphatases humaines Cdc25.
L'entrée de la cellule dans le processus de la division cellulaire est régulée par un ensemble de kinases et de phosphatases utiles pour synchroniser les différentes phases du cycle cellulaire et permettre la réorganisation de l'architecture cellulaire.
Les kinases dépendantes des cyclines (CDKs) jouent un rôle majeur dans ce contrôle et déjà plusieurs inhibiteurs de cette famille de kinases sont identifiés. Un de ces composés (flavopiridol) est déjà en Phase II clinique (Senderowicz et Sausville, J. Natl.
Cancer Inst. (2000), 92, 376-387).
Ces CDKs sont activées par une déphosphorylation effectuée par les phosphatases Cdc25, sur des résidus tyrosine et thréonine. Dans les cellules humaines, les protéines Cdc25 sont codées par une famille : Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C (fans et coll., Medicine Sciences (1998), 3, 269-274).
Quelques inhibiteurs de Cdc25 sont identifiés, mais ils possèdent seulement une faible activité (cf. Baratte, B., Meijer, L., Galaktionov, K., et Beach, D., Anticancer Res.
(1992), 12, 873-880 ; Rice, R.L. et coll., Biochemistry (1997), 36, 15965-15974 ; et Ham, S.W., Park, J., Lee, S.J., Kim, W., Kang, K., et Choi, K.H., Bioorg. Med.
Chem.
Lett. (1998), 8, 2507-2510).
Cdc25B2 est une protéine tyrosine phosphatase proche de la phosphatase Cdc25B
(appelée maintenant Cdc25B1). Elle a été identifiée dans une banque d'ADN
codant de lymphome de Burkitt. Cdc25B2 differe de Cdc25B 1 par une insertion de 14 acides aminés et une délétion de 41 acides aminés en amont du domaine catalytique.
Cdc25B 1 et Cdc25B2 sont des variants d'épissage d'un même gêne. Un troisième variant, Cdc25B3, portant les deux séquences de 14 et 41 acides aminés, a été identifié
à partir WO 01/44467 _ 2 _ PCT/FR00/03496 de la même banque (Baldin et coll., Oncogene (1997), 14, 2485-2495). Les trois variants sont détectés dans les primocultures et les lignées cellulaires.
L'analyse des variants montre que Cdc25B2 est plus faiblement exprimé que Cdc25B3 dans l'ensemble des lignées testées mais que l'expression des deux variants augmente durant la phase G2 et la mitose (Forrest et coll., Biochem. Biophys. Res. Commun.
(1999), 260, 510-S 15). Hernandez et coll. rapportent que Cdc25A et -B2 mais pas Cdc25B 1, -B3 et -C, sont sur-exprimés dans un grand nombre de lymphomes (35% et 39%) (Hernandez et coll., Int. J. Cancer (2000), 89(2), 148-52). Les lymphocytes normaux expriment les messagers de Cdc25B 1 et -B3 et très faiblement ceux de Cdc 25A, -B2 et -C.
1o La surexpression des trois Cdc25B variants dans la levure montre que Cdc25B2 semble plus active que B1 ou B3 (B2>B3>B1). L'épissage alternatif de Cdc25B peut donc jouer un rôle dans le contrôle de la prolifération cellulaire.
La phosphatase Cdc25C est par ailleurs elle même régulée par phosphorylation sur la sérine-216 par d'autres enzymes Cdsl ou Chkl et se lie à des membres très conservés de la famille des protéines 14-3-3 (Zeng, Y. et coll., Nature (1998), 395, 507-510).
La recherche d'inhibiteurs plus efficaces des phosphatases passe par la nécessité d'avoir une protéine qui conserve son activité phosphatase, en quantité non limitante pour autoriser des criblages à grande échelle.
L'étude d'une protéine nécessite de grandes quantités de cette dernière pour satisfaire à
2o toutes les caractéristiques qui peuvent être analysées notamment dans les domaines tels que la biophysique (taille, séquence, structure...), de la biochimie (activité, stabilité, régulation...) ou de la pharmacologie (activateurs, inhibiteurs,...).
La production et la purification de cette protéine en grande quantité se heurte à plusieurs obstacles qui peuvent être - expression absente ou trop faible de la protéine ;
- expression d'une protéine tronquée ;
- obtention d'une protéine sans activité biologique ;
- perte de l'activité biologique de la protéine durant la purification ;
- rendement de purification très faible ;
- perte de l'activité biologique de la protéine durant la conservation ;
perte de la source de production.
Seul le succès à chacune de ces étapes permet finalement de produire à long terme une protéine biologiquement active en quantité illimitée. Face à de telles exigences, la purification de nombreuses protéines reste un processus très délicat voire même impossible dans certains cas.
Cependant, de nombreux efforts sont faits pour développer de nouvelles stratégies de production et de purification telles que - culture de cellules (animales ou végétales) à grande échelle ;
- culture de microorganismes (bactéries, levures) à grande échelle ;
- immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps spécifique à partir d'un mélange de protéines ;
- chromatographie d'affinité, à l'aide d'un ligand spécifique (effecteurs, répresseurs, 1 o activateurs) ;
- électrophorèse bidimensionnelle, en fonction de la masse moléculaire et du point isoélectrique de la protéine ;
- électrophorèse capillaire ;
- enrichissement par précipitation différentielle avec différents sels ;' - etc.
Par ailleurs, de nouveaux systèmes essaient maintenant de combiner la production et la purification des protéines. Ces systèmes permettent une expression souvent inductible de la production d'une protéine recombinante fusionnée avec une protéine permettant une chromatographie d'affinité (appelée tag). Cette dernière partie peut être éliminée 2o par l'addition d'une protéase qui reconnaît spécifiquement l'endroit de la fusion (Sheibani, N., Prep. Biochem. Biotechnol. (1999), 29, 77-90). Le nombre de systèmes proposés augmentent mais le succès de ces différentes approches reste très variable en fonction des protéines à purifier. La conformation et la solubilité des protéines restent des paramètres impossibles à contrôler dans ces nouveaux systèmes (voir Guise, A.D., West, S.M. et Chaudhuri, J.B., Mol. Biotechnol. (1996), 6, 53-64 ; Kelley, R.F. et Winkler, M.E., Genet. Eng. (N.Y., 1990), 12, 1-19).
Les protéines Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C pourraient être fusionnées avec des systèmes aussi variés que 1. Le résidu de six histidines reconnu par l'anticorps anti-motif six histidine (Katsafanas, G.C. et Moss, B., Virology (1999), 258, 469-479) ;
L'entrée de la cellule dans le processus de la division cellulaire est régulée par un ensemble de kinases et de phosphatases utiles pour synchroniser les différentes phases du cycle cellulaire et permettre la réorganisation de l'architecture cellulaire.
Les kinases dépendantes des cyclines (CDKs) jouent un rôle majeur dans ce contrôle et déjà plusieurs inhibiteurs de cette famille de kinases sont identifiés. Un de ces composés (flavopiridol) est déjà en Phase II clinique (Senderowicz et Sausville, J. Natl.
Cancer Inst. (2000), 92, 376-387).
Ces CDKs sont activées par une déphosphorylation effectuée par les phosphatases Cdc25, sur des résidus tyrosine et thréonine. Dans les cellules humaines, les protéines Cdc25 sont codées par une famille : Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C (fans et coll., Medicine Sciences (1998), 3, 269-274).
Quelques inhibiteurs de Cdc25 sont identifiés, mais ils possèdent seulement une faible activité (cf. Baratte, B., Meijer, L., Galaktionov, K., et Beach, D., Anticancer Res.
(1992), 12, 873-880 ; Rice, R.L. et coll., Biochemistry (1997), 36, 15965-15974 ; et Ham, S.W., Park, J., Lee, S.J., Kim, W., Kang, K., et Choi, K.H., Bioorg. Med.
Chem.
Lett. (1998), 8, 2507-2510).
Cdc25B2 est une protéine tyrosine phosphatase proche de la phosphatase Cdc25B
(appelée maintenant Cdc25B1). Elle a été identifiée dans une banque d'ADN
codant de lymphome de Burkitt. Cdc25B2 differe de Cdc25B 1 par une insertion de 14 acides aminés et une délétion de 41 acides aminés en amont du domaine catalytique.
Cdc25B 1 et Cdc25B2 sont des variants d'épissage d'un même gêne. Un troisième variant, Cdc25B3, portant les deux séquences de 14 et 41 acides aminés, a été identifié
à partir WO 01/44467 _ 2 _ PCT/FR00/03496 de la même banque (Baldin et coll., Oncogene (1997), 14, 2485-2495). Les trois variants sont détectés dans les primocultures et les lignées cellulaires.
L'analyse des variants montre que Cdc25B2 est plus faiblement exprimé que Cdc25B3 dans l'ensemble des lignées testées mais que l'expression des deux variants augmente durant la phase G2 et la mitose (Forrest et coll., Biochem. Biophys. Res. Commun.
(1999), 260, 510-S 15). Hernandez et coll. rapportent que Cdc25A et -B2 mais pas Cdc25B 1, -B3 et -C, sont sur-exprimés dans un grand nombre de lymphomes (35% et 39%) (Hernandez et coll., Int. J. Cancer (2000), 89(2), 148-52). Les lymphocytes normaux expriment les messagers de Cdc25B 1 et -B3 et très faiblement ceux de Cdc 25A, -B2 et -C.
1o La surexpression des trois Cdc25B variants dans la levure montre que Cdc25B2 semble plus active que B1 ou B3 (B2>B3>B1). L'épissage alternatif de Cdc25B peut donc jouer un rôle dans le contrôle de la prolifération cellulaire.
La phosphatase Cdc25C est par ailleurs elle même régulée par phosphorylation sur la sérine-216 par d'autres enzymes Cdsl ou Chkl et se lie à des membres très conservés de la famille des protéines 14-3-3 (Zeng, Y. et coll., Nature (1998), 395, 507-510).
La recherche d'inhibiteurs plus efficaces des phosphatases passe par la nécessité d'avoir une protéine qui conserve son activité phosphatase, en quantité non limitante pour autoriser des criblages à grande échelle.
L'étude d'une protéine nécessite de grandes quantités de cette dernière pour satisfaire à
2o toutes les caractéristiques qui peuvent être analysées notamment dans les domaines tels que la biophysique (taille, séquence, structure...), de la biochimie (activité, stabilité, régulation...) ou de la pharmacologie (activateurs, inhibiteurs,...).
La production et la purification de cette protéine en grande quantité se heurte à plusieurs obstacles qui peuvent être - expression absente ou trop faible de la protéine ;
- expression d'une protéine tronquée ;
- obtention d'une protéine sans activité biologique ;
- perte de l'activité biologique de la protéine durant la purification ;
- rendement de purification très faible ;
- perte de l'activité biologique de la protéine durant la conservation ;
perte de la source de production.
Seul le succès à chacune de ces étapes permet finalement de produire à long terme une protéine biologiquement active en quantité illimitée. Face à de telles exigences, la purification de nombreuses protéines reste un processus très délicat voire même impossible dans certains cas.
Cependant, de nombreux efforts sont faits pour développer de nouvelles stratégies de production et de purification telles que - culture de cellules (animales ou végétales) à grande échelle ;
- culture de microorganismes (bactéries, levures) à grande échelle ;
- immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps spécifique à partir d'un mélange de protéines ;
- chromatographie d'affinité, à l'aide d'un ligand spécifique (effecteurs, répresseurs, 1 o activateurs) ;
- électrophorèse bidimensionnelle, en fonction de la masse moléculaire et du point isoélectrique de la protéine ;
- électrophorèse capillaire ;
- enrichissement par précipitation différentielle avec différents sels ;' - etc.
Par ailleurs, de nouveaux systèmes essaient maintenant de combiner la production et la purification des protéines. Ces systèmes permettent une expression souvent inductible de la production d'une protéine recombinante fusionnée avec une protéine permettant une chromatographie d'affinité (appelée tag). Cette dernière partie peut être éliminée 2o par l'addition d'une protéase qui reconnaît spécifiquement l'endroit de la fusion (Sheibani, N., Prep. Biochem. Biotechnol. (1999), 29, 77-90). Le nombre de systèmes proposés augmentent mais le succès de ces différentes approches reste très variable en fonction des protéines à purifier. La conformation et la solubilité des protéines restent des paramètres impossibles à contrôler dans ces nouveaux systèmes (voir Guise, A.D., West, S.M. et Chaudhuri, J.B., Mol. Biotechnol. (1996), 6, 53-64 ; Kelley, R.F. et Winkler, M.E., Genet. Eng. (N.Y., 1990), 12, 1-19).
Les protéines Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C pourraient être fusionnées avec des systèmes aussi variés que 1. Le résidu de six histidines reconnu par l'anticorps anti-motif six histidine (Katsafanas, G.C. et Moss, B., Virology (1999), 258, 469-479) ;
2. Le résidu de neuf acides aminés de Hemagglutinine d'Influenza reconnu par l'anticorps 3F10 (Robert, I. et Quirin-Stricker, C., J. Mol. Neurosci. (1998), 11, 243-251) ;
3. Le résidu de 11 acides aminés du virus de stomatite vésiculaire reconnu par l'anticorps PSD4 (Le Maout, S., et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
(1997), 94, 13329-13334) ;
(1997), 94, 13329-13334) ;
4. Le résidu de 6 acides aminés de la protéine de capside du virus bovin papilloma (AU1) reconnu par l'anticorps anti-AU1 (Le Maout, S., et coll., Proc. Natl.
Acad.
Sci. U.S.A. (1997), 94, 13329-13334) ;
Acad.
Sci. U.S.A. (1997), 94, 13329-13334) ;
5. Le résidu de 12 acides aminés de la chaîne lourde de la protéine C reconnu par l'anticorps HPC4 (Rezaie, A.R., et coll., Protein Expr. Purif. (1992), 3, 453-460) ;
6. La protéine C-myc reconnue par l'anticorps 9E10 (Bae, S.H., et coll., J.
Biol. Chem.
(1999), 274, 14624-14631) ;
Biol. Chem.
(1999), 274, 14624-14631) ;
7. La protéine bêta galactosidase affine pour l'amino-phényl-(3-D-thiogalactopyranoside (Germino, J. et Bastia, D., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A.
(1984), 81, 4692-4696) ;
U.S.A.
(1984), 81, 4692-4696) ;
8. La protéine gluthation S-transférase reconnue par l'anticorps anti-GST
(Carr, S., et coll., Vaccine (1999), 18, 153-159) ;
(Carr, S., et coll., Vaccine (1999), 18, 153-159) ;
9. La biotin-carboxylase carrier affine pour l'avidine (Germino, F.J. et Moskowitz, N.K., Methods Enzymol. (1999), 303, 422-450) ;
10. La protéine intéine affine pour la chitine (voir Chong, S., et coll., Gene (1997), 192, 271-281 ; Carr, S., et coll., Vaccine (1999), 18, 153-159) ;
11. La protéine liant le maltose affine pour l'amylose (Ahaded, A., et coll., Prep.
Biochem. Biotechnol. (1999), 29, 163-176).
Pour autant, rien ne permet de prédire si l'opération sera effectivement couronnée de succès.
La demanderesse vient cependant de mettre au point une méthode qui permet l'obtention des enzymes Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 et Cdc25C humaines sous une forme active et en quantité illimitée. La présente invention facilite d'une part la recherche et l'étude des activités physiologiques ou/et physio-pathologiques de cette protéine et d'autre part facilite la recherche d'agents modulateurs de ces activités.
L'invention permet d'obtenir une protéine humaine Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou 3o Cdc25C recombinée avec la protéine liant le maltose (MBP) qui conserve son activité
phosphatase sans nécessiter la séparation avec la partie MBP, prévenant ainsi toute contamination avec des protéases. Le haut niveau du taux d'expression de la protéine après induction permet un rendement de purification excellent et la préparation en quantité illimitée de l'enzyme.
WO 01/44467 _ 5 _ PCT/FR00/03496 L' invention a donc tout d' abord pour obj et une protéine de fusion entre la protéine liant le maltose (MBP) et une protéine choisie parmi les protéines Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 et Cdc25C.
La présente invention concerne en particulier une protéine choisie parmi les protéines suivantes - une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B 1 humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 12 (représentée plus loin) ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B2 humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 13 (représentée plus loin) ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B3 humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 14 (représentée plus loin) ; ou - une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25C humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 1 (représentée plus loin).
Elle a également pour objet l'ADN codant pour lesdites protéines de fusion, ainsi que fADN complémentaire à l'ADN codant pour lesdites protéine de fusion.
L'invention a de plus pour objet la souche bactérienne JM 109 transfectée - par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 9 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25B 1 ;
- par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 10 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25B2 ;
- par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 11 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25B3 ; ou - par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 5 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25C.
L'invention concerne de plus un procédé de préparation desdites protéines de fusion, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes - culture de la souche bactérienne JM 109 transfectée par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 9, le plasmide de séquence SEQ. ID n° 10, le plasmide de séquence SEQ. ID n° 11 ou le plasmide de séquence SEQ. ID n° 5, dans un milieu LB additionné
d'ampicilline ;
- induction de la synthèse de la protéine de fusion par ajout d'isopropylthiogalactoside ;
- lyse des bactéries ;
- purification de la protéine de fusion obtenue par chromatographie sur résine d'amylose-agarose et récupération des fractions contenant la protéine purifiée.
L'invention concerne enfin une application de ladite protéine de fusion à une méthode d'identification de modulateurs de la protéine Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes successives suivantes - ajout, à une solution de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine, de la protéine de fusion telle qu'obtenue par le procédé de préparation décrit précédemment et d'un composé
présumé être un modulateur de la protéine Cdc25B 1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C
;
- détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite rapportée à
la quantité initiale de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine.
La détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite peut être réalisée, par exemple, par mesure de la densité optique de la solution, de fabsorbance liée à la 3-O-méthylfluorescéine à la longueur d'onde de 477 nm, ou bien encore par fluorimétrie en utilisant une excitation à la longueur d'onde de 475 nm et une lecture à la longueur d'onde de 510 nm.
2o A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevets, tous les brevets et toutes autres références mentionnées ici sont incorporées par référence.
PARTIE EXPERIMENTALE
A / Protéine de fusion MBP-Cdc25C
1 - Construction du vecteur d'expression pour MBP-Cdc25C.
1. 1 - Principe du système utilisé.
Le système utilisé (New England Biolabs #800 - pMALT~'' protein fusion et système de purification) est basé sur la production d'une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt, ici la protéine Cdc25C humaine, et la protéine bactérienne MBP
(Maltose-Binding Protein) d'Escherichia coli. Cette méthode permet de purifier en une étape la 1o protéine de fusion grâce à l'affinité de la MBP pour le maltose.
1.2 - Origine de l'ADNc de Cdc25C
L'ADN codant pour la phosphatase Cdc25C humaine correspond au numéro d'accession 4502706.
A partir de ce plasmide, l'ADN codant pour Cdc25C a été amplifié par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant les amorces C-XBAI SENS et C-XBAI
ANTI-SENS (de séquences SEQ. ID. n°5 3 et 4 respectivement) et introduit dans le vecteur pCDNA3-HA au site XbaI pour donner le vecteur pcDNA3-HA Cdc25C.
L'insert Cdc25C / XbaI a été, à ce stade, séquençé dans son intégralité.
L'amorce C-XBAI SENS a pour séquence la séquence SEQ. ID. n° 3 représentée ci-après 5' - GTTCTAGAAT GTCTAGAA CTCTTC - 3' L'amorce C-XBAI ANTI-SENS a pour séquence la séquence SEQ. ID. n° 4 représentée ci-après 5' -GGCTCTGA GTTGCGC CGG - 3' 1.3 - Construction du vecteur pMAL - Hs Cdc25C
Le vecteur pcDNA3-HA Cdc25C a été digéré par XbaI, l'insert Cdc25C / XbaI
(1456 paires de bases) purifié et introduit dans le vecteur pMALTM-c2X (New England Biolabs, #800-76) au site XbaI, pour donner le vecteur pMAL - Hs Cdc25C (de séquence SEQ. ID n° 2). Ce vecteur permet la production d'une protéine de fusion MBP-Cdc25C de 868 acides aminés, à partir du promoteur bactérien Ptac inductible par l'isopropylthiogalactoside (IPTG).
La séquence SEQ. ID. n° 2 de la protéine Hs Cdc25C avec ses extrémités de restriction XBAI est la suivante TCTAGAATGT____ TACGGAAT____CTTCTCAT____A~AAGAGAGG____AAGGAAGTC____ TGGTAGGA
CCCAGTTTTA _ GGTCTAATA___AAGGAAAATG____TTAAACCTG____ TTGGAGAG____ AGAATT~~
__ TTTACCGTCT____ GTCCAGATGT____CCCTAGAAT____CCAGTGGGA____AATTTTTGG____ TGATTTGA
AA~~TAAGCA _ TTTTGT~TGGAGGAA~A__ __AAATGTTG~____ TGATTTTC____ GAATTTAG
__ ___ AGTGGGGAGA _ TAACTG~CAC_TCAGTTA~C__ACTTCTGAG____ ATTGATGA_ AA~TGGTA
__ ___ __ __ TGGATTTT____AGGACTTCA____GGAAGTG~AT____TTAG~TGGGA____TGAATATGA____~~AG~ATA
ATGAAATGTA _ GCAGCAA _GCTTCTTTGT_ _ AGCACTGA__ ATGGTTTGGA_ _~GTGG~AT
_ _ _ _ _ _. _ _ _ _ AGAAAGAGAG__ _ ATGCAATGTG_TAGTTCAT~T_ _ GAAATAAAG__ AAAATGA~AA_ TGGAAATTG
_ _ _ _ _. _ _ _ _ GTGGACAGTG____ AAATGAAATA.___TTTGGGCAGT____C~ATTATA____ TGTT~AAA_ ATTGGATAAA
__ AATCCAAACC__._ TAGGAGAAGA____CCAGG~AGAA____GAGATTTCAG____ATGAATTAAT____ GGAGTTTT~
~TGAAAGATC____ AAGAAG~AAA____GGTGAG~AGA____AGTGG~~TAT_.._AT~GT~C____ GT~GATG~A
GAGAACTTGA __ AAGG~AAGACTGAAGCAG____GTGGAAAAAT____ TAAGGAAA__AAATA~A
_ ___ __ GATAAAGTTA__ _ AAAAAAAGTA_TTTTTCTGGC_ _ CAAGGAAAG__ _ TAGGAAGGG__ _TTATGTTTA
_ _ _ _ _ _ _ _ _ AAGAAGACAG____ TCTCT~TGTG_TGAATTACT____AT~ACTCAGA____ TGTGGAGGA_ AGATT~TAA~
___ __ CAGGGGACC____ TGATTGGTGA____TTTTT~AAG____GTATGTGCGC____TG~~AA~GT____ GTAGGGAAA
ACAAGATC__ TGAAGTATGT_CAACCCAGAA____AAGTGGCTG____ ~~TTATGTC____ GGGGAAGTT
___ _ _ AGGGTCTGA _ _ TTGAGAAGTT_TTATGTCATT_ _ GATTGTCGT._ _ ATATATGA_ GTATTGGGA
_ _ _ _ _ _ _ _ _ GGACACATCC.___ AGGGAGCCTTAAACTTATAT____AGTCAGGAAG____ AATGTTTAA___TTTTTTG
___ _ AAGAAGCCCA __ TCGTCCTTT_GGACACCCAG____AAGAGIyATAA____ TCATGTGTT___._~~A~TGTGAA
_ ___ TTTCTCAG__ __ AGAGGGGCCC_CGAATGTGC.___CGTGTCTGC____ GTGAAGAGGA.__AGGT~TTG
___ _ AACCAGTATC____TGCATTGTA____CTACCAGAG____CTATATAT____TTAAAGGGG_____~TA~AGAGA~
TTCTTTCCAG____ AATATATGGA___ ACTGTGTGAA____CCACAGAGCT____ACTG~~~TAT____ G~ATATCAG
GACCACAAGA ___ TGAGTTGCT__GAGGTGTCGA____AGCCAGAGCA____AAGTGAGGA__ AGGGGAG~GG
__ _ AGCTGCGGG_ ___ AGCAGATTGC__CCTTCTGGTG____AAGGACATGA____ G~ATGATAACATTCCAGC
__ CACTGGCTGC TAACATCTAG
A
(les sites XBAI sont soulignés en continu, le cadre de lecture ouverte (ou ORF
pour Open Reading Frame) de Cdc25C est souligné en pointillé) 1.4 - Création de la souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25C
Le vecteur pMAL - Hs Cdc25C a été introduit dans la souche d'Escherichia coli (E.
coli) JM109 (Stratagème #200271). Une colonie isolée a été sélectionnée et la production d'une protéine de poids moléculaire apparent théorique de 97 kDa après culture en présence d'IPTG a été observée par l'analyse des protéines bactériennes totales sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration au bleu de Coomassie.
L'identité de la protéine de fusion a été ensuite confirmée par western blot et 1o immunodétection avec un anticorps anti-Cdc25C.
Finalement, l'ADN plasmidique isolé de ce clone a été séquencé dans la région correspondant à Cdc25C pour vérifier l'absence de mutations ou de modifications de la séquence qui auraient pu être générées au cours des processus de sous-clonage et/ou de transformation de l'ADN.
La séquence suivante (désignée par SEQ. ID. n° S) a été obtenue pour la souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25C
CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA
GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG
GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA
CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC
AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC
ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG
TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC
TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA
TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA
CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC GCGACTGGGC GTGGAGCATC
TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTCGG
CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATCAAATT CAGCCGATAG
CGGAACGGGA AGGCGACTGG AGTGCCATGT CCGGTTTTCA ACAAACCATG CAAATGCTGA
ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA
TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATCTCGGTA GTGGGATACG
ACGATACCGA AGACAGCTCA TGTTATATCC CGCCGTTAAC CACCATCAAA CAGGATTTTC
GCCTGCTGGG GCAAACCAGC GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA
AGGGCAATCA GCTGTTGCCC GTCTCACTGG TGAAAAGAAA AACCACCCTG GCGCCCAATA
CGCAAACCGC CTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCA CGACAGGTTT
CCCGACTGGA AAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCT CACTCATTAG
GCACAATTCT CATGTTTGACAGCTTATCATCGACTGCACGGTGCACCAAT GCTTCTGGCG
TCAGGCAGCC ATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACT GCATAATTCG
TGTCGCTCAA GGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACAT CATAACGGTT
CTGGCAAATA TTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTAT AATGTGTGGA
ATTGTGAGCG GATAACAATTTCACACAGGAAACAGCCAGTCCGTTTAGGT GTTTTCACGA
GCACTTCACC AACAAGGACCATAGATTATGAAAATCGAAGAAGGTAAACT GGTAATCTGG
ATTAACGGCG ATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATT CGAGAAAGAT
GCGGCAACTG GCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTT TGGTGGCTAC
GCTCAATCTG GCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGA CAAGCTGTAT
CCGTTTACCT GGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCC GATCGCTGTT
GAAGCGTTAT CGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAA AACCTGGGAA
CTGCAAGAAC CGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTA TGCGTTCAAG
TATGAAAACG GCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGG CGCGAAAGCG
GGTCTGACCT TCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGA CACCGATTAC
TCCATCGCAG AAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAA CGGCCCGTGG
AAGGGTCAAC CATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAA CGCCGCCAGT
CCGAACAAAG AGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGA TGAAGGTCTG
GAAGCGGTTA ATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTA CGAGGAAGAG
TTGGCGAAAG ATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGG TGAAATCATG
GCCAGCGGTC GTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAA TTCGAGCTCG
AACAACAACA ACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGAT TTCAGAATTC
GGATCCTCT GAATGTCTAC___GGAACTCTTC____TCATCCACAA____ GAGAGGAAGG____ AAGT~TGG
_ A
TAGGACCCA____ GTTTTAGGTC___TAATCAAAGG____AAAATGTTAA____ ATGTT__ ___GGAGAGAGAC
_ 30ATTCCT~_'TA____ CGTCTGTCC__ AGATGTCCT____AGAACTCAG____ TGGGAAATT____ TTTGGTGAT
_ _ TCTGCAAACC____ TAAGCATTTT___GTCTGGAGGA____ACCCCAAAAT____ GTTGTGA __ TTTTGAAT
_ _ CTTAGCAGTG____ GGGAGATAAC___TGCCACTCAG____CTTACCACTT__._ ~TGAGAT____ TGATGAAAT
_ GGTCACCTGG____ ATTCTTCAGG___ACTTCAGGAA____GTGCATTTAG____ CTGGGATGAA____ TATGAAG
_ CACCTAATG ___ AATGTAGCCC__ AGCACAGCTT____CTTTGTAGA____ TGAATGG____ TTTGGAGT
_ A
35GGCCATAGAA ___ AGAGAGATGC___AATGTGTAGT.___TCATCTGCAA____ ATAAAGAAAA____ TGAAATGGA
_ _ ______ ____ AACTTGGTGG____ ACAGTGAAAT___GAAATATTTG____GGCAGTCCA____ TTATATGT____ TAAAATTG
_ GATAAAAATC____ AAACCTAGG____AGAAGACCAG____GCAGAAGAGA____ TTTAGATGA__ ATTAATGGAG
_ TTTTCCCTGA____ AAGATCAAGA____AGCAAAGGTG____AGCAGAAGTG____ GCCTATATCG_____TCCCGT~G
ATGCCAGAGA ACTTGAACAG_GCCAAGACTG____AAGCAGGTGG____ AAAAATTAA_ GGAAAAA
___ ___ __ _ _.
ATAAGATA_.__AAGTTAAAAA____AAAGTATTTT____TCTGGCAAG____ GAAAGTAG____ GAAGGGTTA
TGTTTAAAGA AGACAGTTC _TCTGTGTGAC____ATTACTATCA____ CTCAGATGT____ GGAGGAAGAT
___ ___ TCTAACCAGG..__GGACCTGAT.___TGGTGATTTT____TCCAAGGTAT_.__ GTGGTG~C____ AAGTGTA
GGGAAAACC____AAGATTGAA____GTATGTAAC____CAGAAAAG____ TGGTG~TT____ ATGTGGGG
AAGTTCCAGG____GTTGATTGA..__GAAGTTTTAT____GTCATTGATT____ GTGTATC____ ATATGAGTAT
TGGGAGGAC____ACATAGGG AGCTTAAAC____TTATATAGT_.__ AGGAAGAAT____ GTTTAATT
___ TTTCTGAAGA _ AGCCCATCGT.___CCCTTTGGAC____ACAGAAGA____ GAATAATAT_____GTGTTA
__ TGTGAATTCT____ CTAGAGAG____GGGCC~GA____ATGTGGT____ GTTGGTGA_ AGAGGAAGG
__ TCTTGAACC____ AGTATCCTGCATTGTATAC____CAGAGTAT____ ATAT~TTAA_ AGGGGTA
___ __ AGAGATTCT_ _ TTCCAGAATA_TATGGAATG_ TGTGAACA__ AGAGCTATG__ _TATGAT
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ CATCAGGACC__ ACAAGACTGA_GTTGCTGAGG_ TGTCGAAG__ AGAGAAAGT__ GAGGAAGGG
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ GAGCGGCAGC____ TGCGGGAGCA.___GATTGCTT____CTGGTGAAGG____ AATGAG~C____ ATGATAACAT
TCCAGCCACT GGCTGCTAACATCTAGAGTCGACCTGCAGGCAAGCTTGGCACTGGCCGTC
GTTTTACAAC GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCA
CATCCCCCTT TCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAA
CAGTTGCGCA GCCTGAATGGCGAATGGCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGATAAGATT
TTCAGCCTGA TACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCT
GGCGGCAGTA GCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGT
AGCGCCGATG GTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAAT
AAAACGAAAG GCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAA
CGCTCTCCTG AGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCC
CGGAGGGTGG CGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGC
CATCCTGACG GATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATA
CATTCAAATA TGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGA
AAAAGGAAGA GTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCA
TTTTGCCTTC CTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGAT
CAGTTGGGTG CACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAG
AGTTTTCGCC CCGAAGAACGTTCTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGC
GCGGTATTAT CCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCT
CAGAATGACT TGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACA
GTAAGAGAAT TATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTT
CTGACAACGA TCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCAT
GTAACTCGCC TTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGT
GACACCACGA TGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTA
CTTACTCTAG CTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGA
CCACTTCTGC GCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGT
GAGCGTGGGT CTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATC
Biochem. Biotechnol. (1999), 29, 163-176).
Pour autant, rien ne permet de prédire si l'opération sera effectivement couronnée de succès.
La demanderesse vient cependant de mettre au point une méthode qui permet l'obtention des enzymes Cdc25Bl, Cdc25B2, Cdc25B3 et Cdc25C humaines sous une forme active et en quantité illimitée. La présente invention facilite d'une part la recherche et l'étude des activités physiologiques ou/et physio-pathologiques de cette protéine et d'autre part facilite la recherche d'agents modulateurs de ces activités.
L'invention permet d'obtenir une protéine humaine Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou 3o Cdc25C recombinée avec la protéine liant le maltose (MBP) qui conserve son activité
phosphatase sans nécessiter la séparation avec la partie MBP, prévenant ainsi toute contamination avec des protéases. Le haut niveau du taux d'expression de la protéine après induction permet un rendement de purification excellent et la préparation en quantité illimitée de l'enzyme.
WO 01/44467 _ 5 _ PCT/FR00/03496 L' invention a donc tout d' abord pour obj et une protéine de fusion entre la protéine liant le maltose (MBP) et une protéine choisie parmi les protéines Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 et Cdc25C.
La présente invention concerne en particulier une protéine choisie parmi les protéines suivantes - une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B 1 humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 12 (représentée plus loin) ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B2 humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 13 (représentée plus loin) ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B3 humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 14 (représentée plus loin) ; ou - une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25C humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n° 1 (représentée plus loin).
Elle a également pour objet l'ADN codant pour lesdites protéines de fusion, ainsi que fADN complémentaire à l'ADN codant pour lesdites protéine de fusion.
L'invention a de plus pour objet la souche bactérienne JM 109 transfectée - par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 9 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25B 1 ;
- par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 10 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25B2 ;
- par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 11 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25B3 ; ou - par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 5 (représentée plus loin), ladite souche étant utile à la préparation de la protéine Cdc25C.
L'invention concerne de plus un procédé de préparation desdites protéines de fusion, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes - culture de la souche bactérienne JM 109 transfectée par le plasmide de séquence SEQ. ID n° 9, le plasmide de séquence SEQ. ID n° 10, le plasmide de séquence SEQ. ID n° 11 ou le plasmide de séquence SEQ. ID n° 5, dans un milieu LB additionné
d'ampicilline ;
- induction de la synthèse de la protéine de fusion par ajout d'isopropylthiogalactoside ;
- lyse des bactéries ;
- purification de la protéine de fusion obtenue par chromatographie sur résine d'amylose-agarose et récupération des fractions contenant la protéine purifiée.
L'invention concerne enfin une application de ladite protéine de fusion à une méthode d'identification de modulateurs de la protéine Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes successives suivantes - ajout, à une solution de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine, de la protéine de fusion telle qu'obtenue par le procédé de préparation décrit précédemment et d'un composé
présumé être un modulateur de la protéine Cdc25B 1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C
;
- détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite rapportée à
la quantité initiale de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine.
La détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite peut être réalisée, par exemple, par mesure de la densité optique de la solution, de fabsorbance liée à la 3-O-méthylfluorescéine à la longueur d'onde de 477 nm, ou bien encore par fluorimétrie en utilisant une excitation à la longueur d'onde de 475 nm et une lecture à la longueur d'onde de 510 nm.
2o A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevets, tous les brevets et toutes autres références mentionnées ici sont incorporées par référence.
PARTIE EXPERIMENTALE
A / Protéine de fusion MBP-Cdc25C
1 - Construction du vecteur d'expression pour MBP-Cdc25C.
1. 1 - Principe du système utilisé.
Le système utilisé (New England Biolabs #800 - pMALT~'' protein fusion et système de purification) est basé sur la production d'une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt, ici la protéine Cdc25C humaine, et la protéine bactérienne MBP
(Maltose-Binding Protein) d'Escherichia coli. Cette méthode permet de purifier en une étape la 1o protéine de fusion grâce à l'affinité de la MBP pour le maltose.
1.2 - Origine de l'ADNc de Cdc25C
L'ADN codant pour la phosphatase Cdc25C humaine correspond au numéro d'accession 4502706.
A partir de ce plasmide, l'ADN codant pour Cdc25C a été amplifié par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant les amorces C-XBAI SENS et C-XBAI
ANTI-SENS (de séquences SEQ. ID. n°5 3 et 4 respectivement) et introduit dans le vecteur pCDNA3-HA au site XbaI pour donner le vecteur pcDNA3-HA Cdc25C.
L'insert Cdc25C / XbaI a été, à ce stade, séquençé dans son intégralité.
L'amorce C-XBAI SENS a pour séquence la séquence SEQ. ID. n° 3 représentée ci-après 5' - GTTCTAGAAT GTCTAGAA CTCTTC - 3' L'amorce C-XBAI ANTI-SENS a pour séquence la séquence SEQ. ID. n° 4 représentée ci-après 5' -GGCTCTGA GTTGCGC CGG - 3' 1.3 - Construction du vecteur pMAL - Hs Cdc25C
Le vecteur pcDNA3-HA Cdc25C a été digéré par XbaI, l'insert Cdc25C / XbaI
(1456 paires de bases) purifié et introduit dans le vecteur pMALTM-c2X (New England Biolabs, #800-76) au site XbaI, pour donner le vecteur pMAL - Hs Cdc25C (de séquence SEQ. ID n° 2). Ce vecteur permet la production d'une protéine de fusion MBP-Cdc25C de 868 acides aminés, à partir du promoteur bactérien Ptac inductible par l'isopropylthiogalactoside (IPTG).
La séquence SEQ. ID. n° 2 de la protéine Hs Cdc25C avec ses extrémités de restriction XBAI est la suivante TCTAGAATGT____ TACGGAAT____CTTCTCAT____A~AAGAGAGG____AAGGAAGTC____ TGGTAGGA
CCCAGTTTTA _ GGTCTAATA___AAGGAAAATG____TTAAACCTG____ TTGGAGAG____ AGAATT~~
__ TTTACCGTCT____ GTCCAGATGT____CCCTAGAAT____CCAGTGGGA____AATTTTTGG____ TGATTTGA
AA~~TAAGCA _ TTTTGT~TGGAGGAA~A__ __AAATGTTG~____ TGATTTTC____ GAATTTAG
__ ___ AGTGGGGAGA _ TAACTG~CAC_TCAGTTA~C__ACTTCTGAG____ ATTGATGA_ AA~TGGTA
__ ___ __ __ TGGATTTT____AGGACTTCA____GGAAGTG~AT____TTAG~TGGGA____TGAATATGA____~~AG~ATA
ATGAAATGTA _ GCAGCAA _GCTTCTTTGT_ _ AGCACTGA__ ATGGTTTGGA_ _~GTGG~AT
_ _ _ _ _ _. _ _ _ _ AGAAAGAGAG__ _ ATGCAATGTG_TAGTTCAT~T_ _ GAAATAAAG__ AAAATGA~AA_ TGGAAATTG
_ _ _ _ _. _ _ _ _ GTGGACAGTG____ AAATGAAATA.___TTTGGGCAGT____C~ATTATA____ TGTT~AAA_ ATTGGATAAA
__ AATCCAAACC__._ TAGGAGAAGA____CCAGG~AGAA____GAGATTTCAG____ATGAATTAAT____ GGAGTTTT~
~TGAAAGATC____ AAGAAG~AAA____GGTGAG~AGA____AGTGG~~TAT_.._AT~GT~C____ GT~GATG~A
GAGAACTTGA __ AAGG~AAGACTGAAGCAG____GTGGAAAAAT____ TAAGGAAA__AAATA~A
_ ___ __ GATAAAGTTA__ _ AAAAAAAGTA_TTTTTCTGGC_ _ CAAGGAAAG__ _ TAGGAAGGG__ _TTATGTTTA
_ _ _ _ _ _ _ _ _ AAGAAGACAG____ TCTCT~TGTG_TGAATTACT____AT~ACTCAGA____ TGTGGAGGA_ AGATT~TAA~
___ __ CAGGGGACC____ TGATTGGTGA____TTTTT~AAG____GTATGTGCGC____TG~~AA~GT____ GTAGGGAAA
ACAAGATC__ TGAAGTATGT_CAACCCAGAA____AAGTGGCTG____ ~~TTATGTC____ GGGGAAGTT
___ _ _ AGGGTCTGA _ _ TTGAGAAGTT_TTATGTCATT_ _ GATTGTCGT._ _ ATATATGA_ GTATTGGGA
_ _ _ _ _ _ _ _ _ GGACACATCC.___ AGGGAGCCTTAAACTTATAT____AGTCAGGAAG____ AATGTTTAA___TTTTTTG
___ _ AAGAAGCCCA __ TCGTCCTTT_GGACACCCAG____AAGAGIyATAA____ TCATGTGTT___._~~A~TGTGAA
_ ___ TTTCTCAG__ __ AGAGGGGCCC_CGAATGTGC.___CGTGTCTGC____ GTGAAGAGGA.__AGGT~TTG
___ _ AACCAGTATC____TGCATTGTA____CTACCAGAG____CTATATAT____TTAAAGGGG_____~TA~AGAGA~
TTCTTTCCAG____ AATATATGGA___ ACTGTGTGAA____CCACAGAGCT____ACTG~~~TAT____ G~ATATCAG
GACCACAAGA ___ TGAGTTGCT__GAGGTGTCGA____AGCCAGAGCA____AAGTGAGGA__ AGGGGAG~GG
__ _ AGCTGCGGG_ ___ AGCAGATTGC__CCTTCTGGTG____AAGGACATGA____ G~ATGATAACATTCCAGC
__ CACTGGCTGC TAACATCTAG
A
(les sites XBAI sont soulignés en continu, le cadre de lecture ouverte (ou ORF
pour Open Reading Frame) de Cdc25C est souligné en pointillé) 1.4 - Création de la souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25C
Le vecteur pMAL - Hs Cdc25C a été introduit dans la souche d'Escherichia coli (E.
coli) JM109 (Stratagème #200271). Une colonie isolée a été sélectionnée et la production d'une protéine de poids moléculaire apparent théorique de 97 kDa après culture en présence d'IPTG a été observée par l'analyse des protéines bactériennes totales sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration au bleu de Coomassie.
L'identité de la protéine de fusion a été ensuite confirmée par western blot et 1o immunodétection avec un anticorps anti-Cdc25C.
Finalement, l'ADN plasmidique isolé de ce clone a été séquencé dans la région correspondant à Cdc25C pour vérifier l'absence de mutations ou de modifications de la séquence qui auraient pu être générées au cours des processus de sous-clonage et/ou de transformation de l'ADN.
La séquence suivante (désignée par SEQ. ID. n° S) a été obtenue pour la souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25C
CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA
GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG
GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA
CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC
AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC
ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG
TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC
TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA
TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA
CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC GCGACTGGGC GTGGAGCATC
TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTCGG
CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATCAAATT CAGCCGATAG
CGGAACGGGA AGGCGACTGG AGTGCCATGT CCGGTTTTCA ACAAACCATG CAAATGCTGA
ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA
TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATCTCGGTA GTGGGATACG
ACGATACCGA AGACAGCTCA TGTTATATCC CGCCGTTAAC CACCATCAAA CAGGATTTTC
GCCTGCTGGG GCAAACCAGC GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA
AGGGCAATCA GCTGTTGCCC GTCTCACTGG TGAAAAGAAA AACCACCCTG GCGCCCAATA
CGCAAACCGC CTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCA CGACAGGTTT
CCCGACTGGA AAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCT CACTCATTAG
GCACAATTCT CATGTTTGACAGCTTATCATCGACTGCACGGTGCACCAAT GCTTCTGGCG
TCAGGCAGCC ATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACT GCATAATTCG
TGTCGCTCAA GGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACAT CATAACGGTT
CTGGCAAATA TTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTAT AATGTGTGGA
ATTGTGAGCG GATAACAATTTCACACAGGAAACAGCCAGTCCGTTTAGGT GTTTTCACGA
GCACTTCACC AACAAGGACCATAGATTATGAAAATCGAAGAAGGTAAACT GGTAATCTGG
ATTAACGGCG ATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATT CGAGAAAGAT
GCGGCAACTG GCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTT TGGTGGCTAC
GCTCAATCTG GCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGA CAAGCTGTAT
CCGTTTACCT GGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCC GATCGCTGTT
GAAGCGTTAT CGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAA AACCTGGGAA
CTGCAAGAAC CGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTA TGCGTTCAAG
TATGAAAACG GCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGG CGCGAAAGCG
GGTCTGACCT TCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGA CACCGATTAC
TCCATCGCAG AAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAA CGGCCCGTGG
AAGGGTCAAC CATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAA CGCCGCCAGT
CCGAACAAAG AGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGA TGAAGGTCTG
GAAGCGGTTA ATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTA CGAGGAAGAG
TTGGCGAAAG ATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGG TGAAATCATG
GCCAGCGGTC GTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAA TTCGAGCTCG
AACAACAACA ACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGAT TTCAGAATTC
GGATCCTCT GAATGTCTAC___GGAACTCTTC____TCATCCACAA____ GAGAGGAAGG____ AAGT~TGG
_ A
TAGGACCCA____ GTTTTAGGTC___TAATCAAAGG____AAAATGTTAA____ ATGTT__ ___GGAGAGAGAC
_ 30ATTCCT~_'TA____ CGTCTGTCC__ AGATGTCCT____AGAACTCAG____ TGGGAAATT____ TTTGGTGAT
_ _ TCTGCAAACC____ TAAGCATTTT___GTCTGGAGGA____ACCCCAAAAT____ GTTGTGA __ TTTTGAAT
_ _ CTTAGCAGTG____ GGGAGATAAC___TGCCACTCAG____CTTACCACTT__._ ~TGAGAT____ TGATGAAAT
_ GGTCACCTGG____ ATTCTTCAGG___ACTTCAGGAA____GTGCATTTAG____ CTGGGATGAA____ TATGAAG
_ CACCTAATG ___ AATGTAGCCC__ AGCACAGCTT____CTTTGTAGA____ TGAATGG____ TTTGGAGT
_ A
35GGCCATAGAA ___ AGAGAGATGC___AATGTGTAGT.___TCATCTGCAA____ ATAAAGAAAA____ TGAAATGGA
_ _ ______ ____ AACTTGGTGG____ ACAGTGAAAT___GAAATATTTG____GGCAGTCCA____ TTATATGT____ TAAAATTG
_ GATAAAAATC____ AAACCTAGG____AGAAGACCAG____GCAGAAGAGA____ TTTAGATGA__ ATTAATGGAG
_ TTTTCCCTGA____ AAGATCAAGA____AGCAAAGGTG____AGCAGAAGTG____ GCCTATATCG_____TCCCGT~G
ATGCCAGAGA ACTTGAACAG_GCCAAGACTG____AAGCAGGTGG____ AAAAATTAA_ GGAAAAA
___ ___ __ _ _.
ATAAGATA_.__AAGTTAAAAA____AAAGTATTTT____TCTGGCAAG____ GAAAGTAG____ GAAGGGTTA
TGTTTAAAGA AGACAGTTC _TCTGTGTGAC____ATTACTATCA____ CTCAGATGT____ GGAGGAAGAT
___ ___ TCTAACCAGG..__GGACCTGAT.___TGGTGATTTT____TCCAAGGTAT_.__ GTGGTG~C____ AAGTGTA
GGGAAAACC____AAGATTGAA____GTATGTAAC____CAGAAAAG____ TGGTG~TT____ ATGTGGGG
AAGTTCCAGG____GTTGATTGA..__GAAGTTTTAT____GTCATTGATT____ GTGTATC____ ATATGAGTAT
TGGGAGGAC____ACATAGGG AGCTTAAAC____TTATATAGT_.__ AGGAAGAAT____ GTTTAATT
___ TTTCTGAAGA _ AGCCCATCGT.___CCCTTTGGAC____ACAGAAGA____ GAATAATAT_____GTGTTA
__ TGTGAATTCT____ CTAGAGAG____GGGCC~GA____ATGTGGT____ GTTGGTGA_ AGAGGAAGG
__ TCTTGAACC____ AGTATCCTGCATTGTATAC____CAGAGTAT____ ATAT~TTAA_ AGGGGTA
___ __ AGAGATTCT_ _ TTCCAGAATA_TATGGAATG_ TGTGAACA__ AGAGCTATG__ _TATGAT
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ CATCAGGACC__ ACAAGACTGA_GTTGCTGAGG_ TGTCGAAG__ AGAGAAAGT__ GAGGAAGGG
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ GAGCGGCAGC____ TGCGGGAGCA.___GATTGCTT____CTGGTGAAGG____ AATGAG~C____ ATGATAACAT
TCCAGCCACT GGCTGCTAACATCTAGAGTCGACCTGCAGGCAAGCTTGGCACTGGCCGTC
GTTTTACAAC GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCA
CATCCCCCTT TCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAA
CAGTTGCGCA GCCTGAATGGCGAATGGCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGATAAGATT
TTCAGCCTGA TACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCT
GGCGGCAGTA GCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGT
AGCGCCGATG GTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAAT
AAAACGAAAG GCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAA
CGCTCTCCTG AGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCC
CGGAGGGTGG CGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGC
CATCCTGACG GATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATA
CATTCAAATA TGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGA
AAAAGGAAGA GTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCA
TTTTGCCTTC CTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGAT
CAGTTGGGTG CACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAG
AGTTTTCGCC CCGAAGAACGTTCTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGC
GCGGTATTAT CCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCT
CAGAATGACT TGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACA
GTAAGAGAAT TATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTT
CTGACAACGA TCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCAT
GTAACTCGCC TTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGT
GACACCACGA TGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTA
CTTACTCTAG CTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGA
CCACTTCTGC GCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGT
GAGCGTGGGT CTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATC
- 12 - PCT/FR00/03496 GTAGTTATCTACACGACGGG GAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCT
GAGATAGGTGCCTCACTGAT TAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATA
CTTTAGATTGATTTACCCCG GTTGATAATCAGAAAAGCCCCAAAAACAGGAAGATTGTAT
AAGCAAATATTTAAATTGTA AACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTT
AAATCAGCTCATTTTTTAAC CAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAG
AATAGCCCGAGATAGGGTTG AGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGA
ACGTGGACTCCAACGTCAAA GGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTG
AACCATCACCCAAATCAAGT TTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACC
CTAAAGGGAGCCCCCGATTT AGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGG
AAGGGAAGAAAGCGAAAGGA GCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGC
GCGTAACCACCACACCCGCC GCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTAAAAGGATCTAG
GTGAAGATCCTTTTTGATAA TCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCAC
TGAGCGTCAGACCCCGTAGA AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGC
GTAATCTGCTGCTTGCAAAC AAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGAT
CAAGAGCTACCAACTCTTTT TCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAAT
ACTGTCCTTCTAGTGTAGCC GTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCT
ACATACCTCGCTCTGCTAAT CCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGT
CTTACCGGGTTGGACTCAAG ACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACG
GGGGGTTCGTGCACACAGCC CAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTA
CAGCGTGAGCTATGAGAAAG CGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCG
GTAAGCGGCAGGGTCGGAAC AGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGG
TATCTTTATAGTCCTGTCGG GTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGC
TCGTCAGGGGGGCGGAGCCT ATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTG
GCCTTTTGCTGGCCTTTTGC TCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGAT
AACCGTATTACCGCCTTTGA GTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGC
AGCGAGTCAGTGAGCGAGGA AGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCAT
CTGTGCGGTATTTCACACCG CATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCA
TAGTTAAGCCAGTATACACT CCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGAC
ACCCGCCAACACCCGCTGAC GCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACA
GACAAGCTGTGACCGTCTCC GGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGA
AACGCGCGAGGCAGCTGCGG TAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGCAGCGATTCACAGATGT
CTGCCTGTTCATCCGCGTCC AGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTC
TGATAAAGCGGGCCATGTTA AGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTTGATGCCTCCGTG
TAAGGGGGAATTTCTGTTCA TGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCAC
GATACGGGTTACTGATGATG AACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACT
GGCGGTATGGATGCGGCGGG ACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGT
TAATACAGATGTAGGTGTTC CACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAA
CATAATGGTGCAGGGCGCTG ACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAA
WO 01/44467 _ 13 _ PCT/FR00/03496 GACCATTCAT GTTGTTGCTC AGGTCGCAGA CGTTTTGCAG CAGCAGTCGC TTCACGTTCG
CTCGCGTATC GGTGATTCAT TCTGCTAACC AGTAAGGCAA CCCCGCCAGC CTAGCCGGGT
CCTCAACGAC AGGAGCACGA TCATGCGCAC CCGTGGCCAG GACCCAACGC TGCCCGAAAT
T
(les sites XBAI sont soulignés par une simple ligne continue, fORF de Cdc25C
est souligné en pointillé, la séquence de la protéine liant le maltose (MBP) est soulignée par une double ligne continue et la séquence en gras correspond à la région de l'ADN
plasmidique isolé à partir de la souche JM 109 et séquencée).
Ce clone peut être conservé à -80 °C sous forme de culture saturée additionnée de 1o glycérol (concentration finale 25%) ou " stock glycérol ". Cette souche sera utilisée pour toutes les étapes de production ultérieures.
2 - Production et purification de la protéine recombinante MBP-Cdc25C
NB : sauf indication contraire, tous les réactifs chimiques proviennent de SIGMA-ALDRICH.
i5 2.1 - Culture bactérienne et induction d'expression de la protéine de fusion 50 ml de milieu LB + ampicilline 100 ~g/ml (LB amp.) sont inoculés avec 100 ~1 de stock glycérol du clone JM109/pMAL-Cdc25C et cultivés 14 à 16 heures à 37 °C sous agitation (180 à 220 rpm). Cette pré-culture est ensuite diluée cinquante fois (20 ml par litre de milieu) dans un milieu LB amp. + 2 g/1 de glucose et cultivée à 37 °C / 180 rpm 2o pour atteindre une densité optique à 600 nm comprise entre 0,55 et 0,60. La synthèse de la protéine de fusion est alors induite par ajout IPTG (0,3 mM) à 37 °C
pendant 3 heures. Les bactéries sont récoltées par centrifugation, lavées une fois dans 40 ml de PBS froid par litre de culture, et le culot bactérien est ensuite congelé dans l'azote liquide et conservé à -80 °C. .
25 L'induction est analysée immédiatement par dépôt de 2,5.10 cellules, prélevées avant et après induction, sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration des protéines au bleu de Coomassie (Figure 1, lignes 1 et 2 respectivement).
WO 01/44467 _ 14 _ PCT/FR00/03496 2.2 - Lyse et extraction.
Un culot bactérien correspondant à 1 litre de culture induite est décongelé
dans la glace, re-suspendu dans 35 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 250 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 ~g/ml lysozyme, 1 ~g/ml leupeptine, 2 ~g/ml aprotinine, 1 mM PMSF) et incubé 45 min dans la glace. La suspension bactérienne est ensuite soniquée (4 cycles de 1 min en mode discontinu 50%, alternés avec 1 min de pause), puis centrifugée pendant 35 min. à 110 000 g. Le surnageant ou extrait soluble est conservé pour la purification de la protéine MBP-Cdc25C (Figure l, ligne 3).
2.3 - Purification par affinité sur résine d'amylose-agarose.
1o Pour un extrait soluble correspondant à 1 litre de culture bactérienne induite, 2 ml de résine d'amylose-agarose (New England Biolabs #800-21) sont déposés sur une colonne chromatographique HR 5/10 (Pharmacia) et lavés par 20 ml (10 volumes) de tampon de colonne (20 mM Tris-HCl pH 7,4 ; 250 mM NaCI ; 1 mM EDTA ; 1 mM DTT ;
1 ~.g/ml leupeptine ; 2 ~g/ml aprotinine). L'extrait soluble est passé sur la colonne d'affinité à un débit de 0,15 ml/min ; l'éluat (c'est-à-dire la fraction non retenue sur l'amylose-agarose) est récolté pour analyse (Figure 1, ligne 4). La colonne est lavée par ml (10 volumes) de tampon de colonne. Un échantillon de la matrice d'affinité
après passage de l'extrait soluble peut être éventuellement analysé (Figure 1, ligne 5).
L'élution de la protéine de la matrice d'affinité est effectuée avec un tampon maltose 20 (20 mM Tris-HCl pH 7,4 ; 250 mM NaCI ; 1 mM EDTA ; 1 mM DTT ; 10 mM
maltose). 20 fractions d'élution de 0,5 ml sont recueillies. Pour chaque fraction, la concentration protéique totale est évaluée par un essai de type Bradford et la fraction est analysée par dépôt sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration au bleu de Coomassie (Figure 1, ligne 6). Les fractions dans lesquelles la protéine de fusion MBP-Cdc25C complète représente au moins 90 % des protéines totales sont rassemblées pour former un lot dont l'activité est ensuite testée. Les lots sont conservés à -80°C.
Le séquençage de l'insert compris entre les sites XbaI donne le résultat suivant ATGAAAATCG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT
CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
WO 01/44467 _ 15 _ PCT/FR00/03496 ACCCCGGACA AAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTA CCTGGGATGCCGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGT TATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCC CGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAG AACCGTACTTCACCTGGCCG
CTGATTGCTG CTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAA ACGGCAAGTACGACATTAAA
GACGTGGGCG TGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGA CCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCG CAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGT CCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATG GTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTC AACCATCCAAACCGTTCGTT
CTCGAAAACT ATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGG TTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGA AAGATCCACGTATTGCCGCC
ACCATGGAAA ACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACA TCCCGCAGATGTCCGCTTTC
TGGTATGCCG TGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCG GTCGTCAGACTGTCGATGAA
AACCTCGGGA TCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGATCCTC TAGAATGT~T___AGGAAT~T
TCT~ATCCAC____ AAGAGAGGAA____GGAAGCTCTG____GCTCAGGAC____ CAGTTTTAGG____ TTAATAAA
GGAAAATGTT____ AAACCTGT,_TGGAGAGAG,_A~ACTTCCTT__._ TACCGTCTGT_____~AGATGT
._ __ TAGAA~TCC____ AGTGGGCAAA___.TTTTTGGTG____ATTTGCAAA____ TAAGATT_____TTGTTGGAG
20GAACC~AAA _ ATGTTGCCT._GATCTTTCGA____AT~TTAGCAG____ TGGGGAGATA_ ATGAT
__ _. __ AGCTTACCAC____ TTCTGCAGAC__CTTGATGAAA____CTGGTCA~~T____ GGATTCTTCA____ GGA~TT~AGG
__ AAGTGCATTT____ AGCTGGGATG_ AATCATGACC____AGCACTAAT____ GAAATGTAG___._~AGAAG~
__ TTTTTGTAG.___ CACTCCGAAT__GGTTTGGAC____GTGGCCATAG____ AAAGAGAGAT____ G~AATGTGTA
__ GTTATCTGC____ AAATAAAGAA___ AATGACAATG_.._GAAACTTGGT____ GGAAGTGAA_ ATGAAATATT
__ 25TGGGCAGTCC___, ATTACTACT__GTTCCAAAAT____TGGATAAAA.A____ T~AAACTA_ GGAGAAGA
__ __ AGGCAGAAGA __ GATTTCAGAT__GAATTAATGG____AGTTTTCCT____ GAAAGAT~AA_ GAAG~AAAGG
_ __ __ TGAGCAGAAG____ TGGCCTATAT__CGCTCCGT____ CGATGCCAGA____ GAACTTGAAC__._ AGGAAGA~
__ TGAAGCAGGT____ GGAAAA~1TTC_ AAGGAAACA____CAATACCAGA.___ TAAAGTTAAA.__ AAAAAGTATT
__ TTTCTGGCCA __ AGGAAAGCTC_ AGGAAGGGCT____TATGTTTAA~1____ GAAGACAGTC_____T~TTGTGTG
_ __ 30ACATTATAT____ ACTCAGATG___CTGGAGGAAG____ATTCTAACCA____ GGGGA~~TG____ ATTGGTGATT
_ TTTCCAAGGT____ ATGTGCGCTG____CCAACCGTGT____CAGGGAAACA_.._ ~CAAGAT~TG____ AAGTATGTA
ACCCAGAAAC__._ AGTGGCTGCC___TTACTGTCGG____GGAAGTTCCA___. GGGTCTGATT____ GAGAAGTTTT
_ ATGTCATTGA __ TTGTGCTAT____CCATATGAGT____ATCTGGGAGG____ACACATCCAG____ GGAGTTAA
_ ACTTATATAG____ TCAGGAAGAA___CTGTTTAACT__ TCTTTCTGAA____ GAAGCCCATC_____GT~~TTTGG
_ __ 35ACACCCAGAA __ GAGAATAATC__ ATCGTGTTCC____ACTGTGAATT____ CTCCTAGAG____ AGGGG~~~~~
_ _ GAATGTGCCG____ TGTCTGCGT_._GAAGAGGACA____GGTCTCTGAA__,_ CAGTAT~~T_____GATTGTAT
_ ACCCAGAGT_ ___ ATATATCCTT__ AAAGGCGGCT____ACAGAGACTT____ CTTTCAGAA_._TATATGGAA
_ _ TGTGTGAACC____ ACAGAGCTAC___TGCCCTATGC____ATCATCAGGA____ CCACAAGACT____ GAGTTGCTGA
_ GGTGTCGAAG____ ÇÇAGAGCAAA_.__GTGCAGGAAG____GGGAG~GG~A____G~TGëGGGAG_____ëAGATTG~~~
TTCTGGTGAA GGACATGAGC CCATGATAAC ATTCCAGCCA CTGGCTGCTA ACATCTAGA
(les sites XBAI sont soulignés par une simple ligne continue, fORF de Cdc25C
est souligné en pointillé et la séquence en italique correspond à l'ORF de la protéine liant le maltose (MBP)) La séquence de la protéine de fusion MBP-Cdc25C obtenue correspond donc à la séquence SEQ. ID n° 1 représentée ci-dessous ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATC TGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGT
CTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAA GATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCAT
CCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAG GTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATT
ATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGC TACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATC
ACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTG TATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTAC
AACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCT GTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGG GAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTC AACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCG
CTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTC AAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAA
GACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAA GCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGAT TACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCG TGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACC TTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTT
GGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCC AGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTC
CTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGT CTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAA GAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCC
ACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATC ATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTC
TGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAAC GCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAA
GCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGC TCGAACAACAACAACAATAACAATAACAAC
AACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAAT TCGGATCCTCTAGAATGTCTACGGAACTCT
TCTCATCCACAAGAGAGGAAGGAAGCTCTG GC'T_'CAGGACCCAGTTTTAGGTCTAATCAAA
GGAAAATGTTAAACCTGCTCCTGGAGAGAG ACACTTCCTTTACCGTCTGTCCAGATGTCC
CTAGAACTCCAGTGGGCAAATTTCTTGGTG ATTCTGCAAACCTAAGCATTTTGTCTGGAG
GAACCCCAAAATGTTGCCTCGATCTTTCGA A'rCTTAGCAGTGGGGAGATAACTGCCACTC
AGCTTACCACTTCTGCAGACCTTGATGAAA CTGGTCACCTGGATTCTTCAGGACTTCAGG
AAGTGCATTTAGCTGGGATGAATCATGACC AGCACCTAATGAAATGTAGCCCAGCACAGC
TTCTTTGTAGCACTCCGAATGGTTTGGACC GTGGCCATAGAAAGAGAGATGCAATGTGTA
GTTCATCTGCAAATAAAGAAAATGACAATG GAAACTTGGTGGACAGTGAAATGAAATATT
TGGGCAGTCCCATTACTACTGTTCCAAAAT TGGATAAAAATCCAAACCTAGGAGAAGACC
AGGCAGAAGA GATTTCAGAT GAATTAATGG AGTTTTCCCT GAAAGATCAA GAAGCAAAGG
TGAGCAGAAG TGGCCTATAT CGCTCCCCGT CGATGCCAGA GAACTTGAAC AGGCCAAGAC
TGAAGCAGGT GGAAAAATTC AAGGACAACA CAATACCAGA TAAAGTTAAA AAAAAGTATT
TTTCTGGCCA AGGAAAGCTC AGGAAGGGCT TATGTTTAAA GAAGACAGTC TCTCTGTGTG
ACATTACTAT CACTCAGATG CTGGAGGAAG ATTCTAACCA GGGGCACCTG ATTGGTGATT
TTTCCAAGGT ATGTGCGCTG CCAACCGTGT CAGGGAAACA CCAAGATCTG AAGTATGTCA
ACCCAGAAAC AGTGGCTGCC TTACTGTCGG GGAAGTTCCA GGGTCTGATT GAGAAGTTTT
ATGTCATTGA TTGTCGCTAT CCATATGAGT ATCTGGGAGG ACACATCCAG GGAGCCTTAA
ACTTATATAG TCAGGAAGAA CTGTTTAACT TCTTTCTGAA GAAGCCCATC GTCCCTTTGG
ACACCCAGAA GAGAATAATC ATCGTGTTCC ACTGTGAATT CTCCTCAGAG AGGGGCCCCC
GAATGTGCCG CTGTCTGCGT GAAGAGGACA GGTCTCTGAA CCAGTATCCT GCATTGTACT
ACCCAGAGCT ATATATCCTT AAAGGCGGCT ACAGAGACTT CTTTCCAGAA TATATGGAAC
TGTGTGAACC ACAGAGCTAC TGCCCTATGC ATCATCAGGA CCACAAGACT GAGTTGCTGA
GGTGTCGAAG CCAGAGCAAA GTGCAGGAAG GGGAGCGGCA GCTGCGGGAG CAGATTGCCC
TTCTGGTGAA GGACATGAGC CCATGA
3 - Détermination de l'activité de la protéine de fusion MBP-Cdc25C
L'activité phosphatase de la. protéine MBP-Cdc25C est évaluée par un essai de déphosphorylation du phosphate de 3-O-méthylfluorescéine (OMFP) avec 2o détermination de l'absorbance à 477 nm (DO 477 nm) du produit de la réaction (OMF).
La protéine MBP-Cdc25C, conservée dans le tampon d'élution (le même que celui décrit au paragraphe 2.3), est diluée à la concentration de 20 nM dans le tampon de réaction phosphatase (50 mM Tris-HCl pH 8,2 ; 50 mM NaCI ; 1 mM DTT ; 20%
glycérol), à température ambiante, dans un volume réactionnel total de 1 ml.
La réaction est initiée par l'ajout d'une solution 0,3 mM de OMFP (préparée extemporanément à
partir d'une solution stock 7,5 mM dans du DMSO 100% (Sigma #M2629)) et se déroule à 25 °C dans une cuve pour spectrophotométrie à usage unique en polystyrène (Fisher Scientific #A12-103-056). La DO 477 nm est mesurée après 90 min. La référence pour la mesure d'absorbance est constituée par le tampon de réaction contenant 0,3 mM d'OMFP, sans protéine MBP-Cdc25C, au temps t0 de la réaction.
Un exemple représentatif des résultats d'une telle détermination d'activité est illustré par la Figure 2.
B / Protéines____de_____fusion____MBP-~dç25B1_,____MBP-Çdç25B2_____et MBP-Cdc25B3 1 - Construction du vecteur d'expression pour MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 1. 1 - Principe du système utilisé.
Le système utilisé (New England Biolabs #800 - pMALTM protein fusion et système de purification) est basé sur la production d'une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt, ici la protéine Cdc25B humaine, et la protéine bactérienne MBP
(Maltose-Binding Protein) d'Escherichia coli. Cette méthode permet de purifier en une étape la l0 protéine de fusion grâce à l'affinité de la MBP pour le maltose.
1.2 - Origine de l'ADNc de Cdc25B
L'ADN codant pour les trois variants d'épissage de la phosphatase CDC25B
humaine correspond aux numéros d'accession : M81934 et 268092.
1.3 - Construction des vecteurs pMAL - Hs Cdc25B
Les différences entre les ADN des 3 variants de Cdc25B concernent deux exons codant des domaines de 14 et 42 acides aminés localisés dans la région régulatrice de la molécule (Baldin et coll., Oncogene (1997), 14, 2485-2490) et n'affectant pas ses régions 5' et 3'. La stratégie de clonage utilisée pour ces trois variants est donc identique.
Les ADNc de Cdc25B sous la forme d'inserts NdeI(Klenow) / BamHl ont été
introduits dans le vecteur pMALTM-C2X (New England Biolabs, ;#800-76) au site EcoRl (Klenow) / BamHl pour donner respectivement les vecteurs pMAL-Hs Cdc25B1, pMAL-Hs Cdc25B2 et pMAL-Hs Cdc25B3. Ces vecteurs permettent la production des protéines de fusion MBP-Cdc25B1 (962 acides aminés), MPB-Cdc25B2 (933 acides aminés) et MBP-Cdc25B3 (974 acides aminés) à partir du promoteur bactérien Ptac inductible par l'isopropylthiogalactoside (IPTG).
La séquence SEQ. ID. n° 6 de la protéine Hs Cdc25B 1 avec ses extrémités de restriction NdeI et BamHl est la suivante CATATGGAGG TGCCCCAGCCGGAGCCCGCGCCAGGCTCGGCTCTCAGTCC AGCAGGCGTG
TGCGGTGGCG CCCAGCGTCCGGGCCACCTCCCGGGCCTCCTGCTGGGATC TCATGGCCTC
S CTGGGGTCCC CGGTGCGGGCGGCCGCTTCCTCGCCGGTCACCACCCTCAC CCAGACCATG
CACGACCTCG CCGGGCTCGGCAGCCGCAGCCGCCTGACGCACCTATCCCT GTCTCGACGG
GCATCCGAAT CCTCCCTGTCGTCTGAATCCTCCGAATCTTCTGATGCAGG TCTCTGCATG
GATTCCCCCA GCCCTATGGACCCCCACATGGCGGAGCAGACGTTTGAACA GGCCATCCAG
GCAGCCAGCC GGATCATTCGAAACGAGCAGTTTGCCATCAGACGCTTCCA GTCTATGCCG
GGCCGGAGGA AGAGCGAGGCGGGCAGTGGAGCTGCCAGCAGCTCTGGGGA AGACAAGGAG
AATGATGGAT TTGTCTTCAAGATGCCATGGAAGCCCACACATCCCAGCTC CACCCATGCT
CTGGCAGAGT GGGCCAGCCGCAGGGAAGCCTTTGCCCAGAGACCCAGCTC GGCCCCCGAC
CTGATGTGTC TCAGTCCTGACCGGAAGATGGAAGTGGAGGAGCTCAGCCC CCTGGCCCTA
ATCCTAGAGA GTGACTTAAAGGATGATGATGCAGTTCCCCCAGGCATGGA GAGTCTCATT
AGTGCCCCAC TGGTCAAGACCTTGGAAAAGGAAGAGGAAAAGGACCTCGT CATGTACAGC
AAGTGCCAGC GGCTCTTCCGCTCTCCGTCCATGCCCTGCAGCGTGATCCG GCCCATCCTC
AAGAGGCTGG AGCGGCCCCAGGACAGGGACACGCCCGTGCAGAATAAGCG GAGGCGGAGC
AAATCACTGT GTCACGATGAGATCGAGAACCTCCTGGACAGTGACCACCG AGAGCTGATT
GGAGATTACT CTAAGGCCTTCCTCCTACAGACAGTAGACGGAAAGCACCA AGACCTCAAG
TACATCTCAC CAGAAACGATGGTGGCCCTATTGACGGGCAAGTTCAGCAA CATCGTGGAT
AAGTTTGTGA TTGTAGACTGCAGATACCCCTATGAATATGAAGGCGGGCA CATCAAGACT
CCCTGTAGCC TGGACAAGAGAGTCATCCTCATTTTCCACTGTGAATTCTC ATCTGAGCGT
GGGCCCCGCA TGTGCCGTTTCATCAGGGAACGAGACCGTGCTGTCAACGA CTACCCCAGC
CTCTACTACC CTGAGATGTATATCCTGAAAGGCGGCTACAAGGAGTTCTT CCCTCAGCAC
CCGAACTTCT GTGAACCCCAGGACTACCGGCCCATGAACCACGAGGCCTT CAAGGATGAG
TGTAGCCGGC TGCAGGACCAGTGAGGGGCCTGCGCCAGTCCTGCTACCTC CCTTGCCTTT
CGAGGCCTGA AGCCAGCTGCCCTATGGGCCTGCCGGGCTGAGGGCCTGCT GGAGGCCTCA
GGTGCTGTCC ATGGGAAAGATGGTGTGGTGTCCTGCCTGTCTGCCCCAGC CCAGATTCCC
CTGTGTCATC CCATCATTTTCCATATCCTGGTGCCCCCCACCCCTGGAAG AGCCCAGTCT
GCTTCTTGTT TCCTTGTTAGGGTTAACCCTTCATCTTCCTGTGTCCTGAA ACGCTCCTTT
GTGTGTGTGT CAGCTGAGGATCC
(les sites NdeI et BamHl sont soulignés en continu) La séquence SEQ. ID. n° 7 de la protéine Hs Cdc25B2 avec ses extrémités de restriction NdeI et BamHl est la suivante CATATGGAGG TGCCCCAGCCGGAGCCCGCGCCAGGCTCGGCTCTCAGTCC AGCAGGCGTG
TGCGGTGGCG CCCAGCGTCCGGGCCACCTCCCGGGCCTCCTGCTGGGATC TCATGGCCTC
CTGGGGTCCC CGGTGCGGGCGGCCGCTTCCTCGCCGGTCACCACCCTCAC CCAGACCATG
CACGACCTCG CCGGGCTCGGCAGCGAAACCCCAAAGAGTCAGGTAGGGAC CCTGCTCTTC
CGCAGCCGCA GCCGCCTGACGCACCTATCCCTGTCTCGACGGGCATCCGA ATCCTCCCTG
TCGTCTGAAT CCTCCGAATCTTCTGATGCAGGTCTCTGCATGGATTCCCC CAGCCCTATG
CGAAACGAGC AGTTTGCCATCAGACGCTTCCAGTCTATGCCGGATGGATT TGTCTTCAAG
ATGCCATGGA AGCCCACACATCCCAGCTCCACCCATGCTCTGGCAGAGTG GGCCAGCCGC
AGGGAAGCCT TTGCCCAGAGACCCAGCTCGGCCCCCGACCTGATGTGTCT CAGTCCTGAC
CGGAAGATGG AAGTGGAGGAGCTCAGCCCCCTGGCCCTAGGTCGCTTCTC TCTGACCCCT
GATGATGATG CAGTTCCCCCAGGCATGGAGAGTCTCATTAGTGCCCCACT GGTCAAGACC
TTGGAAAAGG AAGAGGAAAAGGACCTCGTCATGTACAGCAAGTGCCAGCG GCTCTTCCGC
TCTCCGTCCA TGCCCTGCAGCGTGATCCGGCCCATCCTCAAGAGGCTGGA GCGGCCCCAG
GACAGGGACA CGCCCGTGCAGAATAAGCGGAGGCGGAGCGTGACCCCTCC TGAGGAGCAG
ATCGAGAACC TCCTGGACAGTGACCACCGAGAGCTGATTGGAGATTACTC TAAGGCCTTC
CTCCTACAGA CAGTAGACGGAAAGCACCAAGACCTCAAGTACATCTCACC AGAAACGATG
GTGGCCCTAT TGACGGGCAAGTTCAGCAACATCGTGGATAAGTTTGTGAT TGTAGACTGC
AGATACCCCT ATGAATATGAAGGCGGGCACATCAAGACTGCGGTGAACTT GCCCCTGGAA
GTCATCCTCA TTTTCCACTGTGAATTCTCATCTGAGCGTGGGCCCCGCAT GTGCCGTTTC
ATCAGGGAAC GAGACCGTGCTGTCAACGACTACCCCAGCCTCTACTACCC TGAGATGTAT
ATCCTGAAAG GCGGCTACAAGGAGTTCTTCCCTCAGCACCCGAACTTCTG TGAACCCCAG
GACTACCGGC CCATGAACCACGAGGCCTTCAAGGATGAGCTAAAGACCTT CCGCCTCAAG
TGAGGGGCCT GCGCCAGTCC'TGCTACCTCCCTTGCCTTTCGAGGCCTGAA GCCAGCTGCC
CTATGGGCCT GCCGGGCTGAGGGCCTGCTGGAGGCCTCAGGTGCTGTCCA TGGGAAAGAT
GGTGTGGTGT CCTGCCTGTCTGCCCCAGCCCAGATTCCCCTGTGTCATCC CATCATTTTC
CATATCCTGG TGCCCCCCACCCCTGGAAGAGCCCAGTCTGTTGAGTTAGT TAAGTTGGGT
GTTAACCCTT CATCTTCCTGTGTCCTGAAACGCTCCTTTGTGTGTGTGTC AGCTGAGGAT
CC
(les sites NdeI et BamHl sont soulignés en continu) La séquence SEQ. ID. n° 8 de la protéine Hs Cdc25B3 avec ses extrémités de restriction NdeI et BamHl est la suivante CATATGGAGG TGCCCCAGCCGGAGCCCGCGCCAGGCTCGGCTCTCAGTCC AGCAGGCGTG
TGCGGTGGCG CCCAGCGTCCGGGCCACCTCCCGGGCCTCCTGCTGGGATC TCATGGCCTC
CTGGGGTCCC CGGTGCGGGCGGCCGCTTCCTCGCCGGTCACCACCCTCAC CCAGACCATG
CACGACCTCG CCGGGCTCGGCAGCGAAACCCCAAAGAGTCAGGTAGGGAC CCTGCTCTTC
CGCAGCCGCA GCCGCCTGACGCACCTATCCCTGTCTCGACGGGCATCCGA ATCCTCCCTG
TCGTCTGAAT CCTCCGAATCTTCTGATGCAGGTCTCTGCATGGATTCCCC CAGCCCTATG
CGAAACGAGC AGTTTGCCATCAGACGCTTCCAGTCTATGCCGGTGAGGCT GCTGGGCCAC
AGCCCCGTGC TTCGGAACATCACCAACTCCCAGGCGCCCGACGGCCGGAG GAAGAGCGAG
GCGGGCAGTG GAGCTGCCAGCAGCTCTGGGGAAGACAAGGAGAATGATGG ATTTGTCTTC
AAGATGCCAT GGAAGCCCACACATCCCAGCTCCACCCATGCTCTGGCAGA GTGGGCCAGC
GACCGGAAGA TGGAAGTGGAGGAGCTCAGCCCCCTGGCCCTAGGTCGCTT CTCTCTGACC
CCTGCAGAGG GGGATACTGAGGAAGATGATGGATTTGTGGACATCCTAGA GAGTGACTTA
AAGGATGATG ATGCAGTTCCCCCAGGCATGGAGAGTCTCATTAGTGCCCC ACTGGTCAAG
ACCTTGGAAA AGGAAGAGGAAAAGGACCTCGTCATGTACAGCAAGTGCCA GCGGCTCTTC
CAGGACAGGG ACACGCCCGTGCAGAATAAGCGGAGGCGGAGCGTGACCCC TCCTGAGGAG
CAGCAGGAGG CTGAGGAACCTAAAGCCCGCGTCCTCCGCTCAAAATCACT GTGTCACGAT
GAGATCGAGA ACCTCCTGGACAGTGACCACCGAGAGCTGATTGGAGATTA CTCTAAGGCC
TTCCTCCTAC AGACAGTAGACGGAAAGCACCAAGACCTCAAGTACATCTC ACCAGAAACG
TGCAGATACC CCTATGAATATGAAGGCGGGCACATCAAGACTGCGGTGAA CTTGCCCCTG
GAACGCGACG CCGAGAGCTTCCTACTGAAGAGCCCCATCGCGCCCTGTAG CCTGGACAAG
AGAGTCATCC TCATTTTCCACTGTGAATTCTCATCTGAGCGTGGGCCCCG CATGTGCCGT
TTCATCAGGG AACGAGACCGTGCTGTCAACGACTACCCCAGCCTCTACTA CCCTGAGATG
CAGGACTACC GGCCCATGAACCACGAGGCCTTCAAGGATGAGCTAAAGAC CTTCCGCCTC
AAGACTCGCA GCTGGGCTGGGGAGCGGAGCCGGCGGGAGCTCTGTAGCCG GCTGCAGGAC
CAGTGAGGGG CCTGCGCCAGTCCTGCTACCTCCCTTGCCTTTCGAGGCCT GAAGCCAGCT
GCCCTATGGG CCTGCCGGGCTGAGGGCCTGCTGGAGGCCTCAGGTGCTGT CCATGGGAAA
TTCCATATCC TGGTGCCCCCCACCCCTGGAAGAGCCCAGTCTGTTGAGTT AGTTAAGTTG
GGTTAATACC AGCTTAAAGGCAGTATTTTGTGTCCTCCAGGAGCTTCTTG TTTCCTTGTT
AGGGTTAACC -CTTCATCTTC CTGTGTCCTG AAACGCTCCT TTGTGTGTGT GTCAGCTGAG
GATCC
(les sites NdeI et BamHl sont soulignés en continu) 1.4 - Création des souches JM109/pMAL-Cdc25B1, B2 et B3 Les vecteurs pMAL-Cdc25B1-3 ont chacun été introduits dans la souche d'Escherichia coli JM109 (Stratagene #200271). Les colonies ont été sélectionnées sur la base de leur capacité à produire une protéine de fusion après culture en présence d'IPTG.
L'identité
des protéines a été vérifiée par immunodétection avec des anticorps polyclonaux dirigés contre Cdc25B.
1o Les ADN plasmidiques isolés de ces trois clones ont été séquencés dans la région correspondant à Cdc25B. Les séquences suivantes ont été obtenues (la partie doublement soulignée correspond à l'ORF de MBP et la partie soulignée en pointillés à
l'ORF de Cdc25B1, Cdc25B2 ou Cdc25B3) ~ SEQ. ID n° 9 (pMAL-MsCdc25Bl) ATGAAAACTGAAGAAGGTAA TGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGT
ACTGGTAATC
CTCGCTGAAGTCGGTAAGAA GATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCAT
ATTCGAGAAA
CCGGATAAACTGGAAGAGAA GTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATT
ATTCCCACAG
ATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATC
ACCCCGGACA GGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTAC
AAGCGTTCCA
AACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCG
CTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAA CGACATTAAA
ACGGCAAGTA
GACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAA
ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACA AAAAGAGTTC
AAGAGCTGGC
CTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGA TATTGCCGCC
AAGATCCACG
ACCATGGAAA ATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTC
ACGCCCAGAA
AGGTGAAATC
TGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAA
GCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAAC
AACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCCATATGG__AGGTGCCA__GGGAG~~
GGCAGGCT..GGCTCTAG__TCAGAGGC__GTGTGGGTG__ GGCAGCG__TCGGG~A
CT~CCGGGCC__T~CTGCTGGG__ATCTCATGG~__CTCCTGGGGT__CCCCGGTGCG__GGCGGGT
TCCTCGGG__TCAA~CCT__CA~AGACC__ATGA~GACC__TGGGGCT_ _CGGAGCCGC
AGCCGCCTGA_CGCATATC__CCTGTCTGA__CGGGCATG__AAT~T~CCT__GTCGTCTGAA
T~CT~GAAT__CTTCTGATGC__AGGT~TCTGC__ATGGATTCCC__~AGCCCTAT__GGA~~CAC
ATGGCGGAGC__AGAGTTTGAACAGGAT__CAGGCAGA__GCCGGATCAT__TCGAAAGAG
_ CAGTTTGCA TAGACGCTT__~~AGTCTATG__CCGGTGAGGC__TGCTGGGCCA__CAGCCCCGTG
_ ~TTCGGAA~ATCA~AACTC__CCAGGGCCC__GACGG~CGGA__GGAAGAGCGA__GGGGGAGT
_ GGAGCTGA_ GCAG~T~TGG__GGAAGA~AAG__GAGAATGATG__GATTTGTCTT__CAAGATGA
TGGAAGCCCACACAT~AG__CTCCAAT__GCTCTGGAG__AGTGGG~CAG__CCGCAGGGAA
_ GCCTTTGCC__AGAGACCCAG__ CTGG~CC__GACCTGATGT__GTTCAGTCC__TGAGGAAG
ATGGAAGTGG__AGGAGTCAG__ CCCCTGGCC__CTAGGT~GCT__TCT~TCTGAC__CCTGCAGAG
GGGGATACTG_AGGAAGATGA__ TGGATTTGTG__ GAC_AT _ AGAGTGACTT_AAAGGATGAT
_ ~ CTAG_ _ GATGAGTTC__CCAGGCAT__GGAGAGTCTC__ATTAGTGCCC__~ACTGGTCAA__GA~TTGGAA
AAGGAAGAGG__AAAAGGACCT.. ~GTCATGTAC__AG~AAGTGC__AGCGGCTTT__CCGCTCT~~G
TCCATGCCT__ GCAGCGTGAT__ GG~C~ATC__ CTAAGAGGC__TGGAGCGG__CCAGGAAGG
GACACGC~CG__ TGCAGAATAA__GGGAGGCGG__AGGTGACCC__CTCCTGAGGA__GCAGCAGGAG
GCTGAGGAAC__ CTAAAGCCG__ CGTTGC__ TCAAAATCAC__ TGTGTCACGA__ TGAGATCGAG
AACCTCCTGG__ACAGTGA~CA__CCGAGAG~TG__ATTGGAGATT__ACTCTAAGG__~TT~TTA
~AGACAGTAG__ACGGAAAGCA_~CAAGACCT__AAGTACAT~T__CACAGAAAC__GATGGTGG~
TATTGACGG__ GCAAGTTCAG__ CAACATCGTG__ GATAAGTTTG__ TGATTGTAGA__ CTGAGATA~
~TATGAAT_ _ ATGAAGGCGG__ GCACATCAAG__A~TGCGGTGA__ACTTGCCCCT__GGAAGGA
GGAGAGCT_ _ TCCTA~TGAA__ GAGCCCCATC__GGCCTGTA__GCCTGGACAA__GAGAGT~AT
CTCATTTTCC__ACTGTGAATT__CTCATCTGAG__GTGGGCCC__GCATGTGCCG__TTT~ATAGG
GAACGAGACC__ GTGCTGTCAA__ CGACTACCCC__AGCCTCTACT__AC~TGAGAT._GTATAT~TG
AAAGGCGGCT__ ACAAGGAGTT._ CTTCCCTCAG__ CACC _ TTGTGAACC_ CCAGGA~TA~
CGAACT_ _ CGGCCCATGA_AACGAGGC__CTTCAAGGAT__GAGCTAAAGA__CTTCCGCT__CAAGAT~G~
AGCTGGGCTG__ GGGAGCGGAG__ CCGGCGGGAG__ CTCTGTAGC__ GGCTGAGGA__ CCAGTGAGGG
GCCTGCGCCAGTCCTGCTACCTCCCTTGCCTTTCGAGGCCTGAAGCCAGCTGCCCTATGG
GCCTGCCGGGCTGAGGGCCTGCTGGAGGCCTCAGGTGCTGTCCATGGGAAAGATGGTGTG
GTGTCCTGCCTGTCTGCCCCAGCCCAGATTCCCCTGTGTCATCCCATCATTTTCCATATC
CTGGTGCCCCCCACCCCTGGAAGAGCCCAGTCTGTTGAGTTAGTTAAGTTGGGTTAATAC
CAGCTTAAAGGCAGTATTTTGTGTCCTCCAGGAGCTTCTTGTTTCCTTGTTAGGGTTAAC
CCTTCATCTTCCTGTGTCCTGAAACGCTCCTTTGTGTGTGTGTCAGCTGAGGATCC
~ SEQ. ID n ° 10 (pMAL-HsCdc25B2) ATGAAAACTGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGT
CTCGCTGAAGTCGGTAAGAA GATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCAT
ATTCGAGAAA
CCGGATAAACTGGAAGAGAA GTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATT
ATTCCCACAG
ATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATC
ACCCCGGACA GGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTAC
AAGCGTTCCA
AACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCG
CTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAA CGACATTAAA
ACGGCAAGTA
GACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAA
ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACA AAAAGAGTTC
AAGAGCTGGC
CTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGA TATTGCCGCC
AAGATCCACG
ACCATGGAAA ATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTC
ACGCCCAGAA
AGGTGAAATC
TGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAA
GCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAAC
AACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCCATATGG__AGGTG~~A__GGGAG~~
GCGCCAGGCT__ CGGCTCTCAG__TCCAGCAGG__GTGTGGGTG__GCG~~AGG__TGGG~A~
CTC~GGGC_ _ TCTGCTGGG__ATCTATGGC__ CTCCTGGGGT__CC~GGTGG__GGGG~~GT
TÇCTëGCÇGG__ TCACCACCCT__ CACÇëAGACC__ATGÇA~GACC__TÇG~~GGG~T__ëGG~AG~GAA
AëCCCAAAGA_GTëAGGTAGG__GAÇëCTGCTC__TTCÇGCAGCC__GCAGCCGëëT__GA~G~AëëTA
TCCCTGTCTC__ GACGGGÇATC__ CGAATCCTCC__CTGTCGTCTG__AATCCT~~GA_.ATëTT~TGAT
GCAGGTCTCT__ GCATGGATTC__ CCCCAGCCCT__ATGGACCÇCë__ACATGG~GGA__G~AGA~GTTT
GAACAGGCCA TCCAGGCAGC__CAGCCGGATC__ATTCGAAACG__AGCAGTTTGë__~ATëAGAëG~
TTCCAGTCTA _ TGCCGGATGG__ATTTGTCTTC__AAGATGCCAT__GGAAGC~~A~__A~ATëë~AG~
TCCACCCATG__CTCTGGCAGA__GTGGGCCAGC__CGÇAGGGAAG__CCTTTGC~~A__GAGAë~ëAG~
TCGGCCCCCG__ ACCTGATGTG__ TCTCAGTCCT__GACCGGAAGA__TGGAAGTGGA__GGAG~T~AG~
CCCCTGGCCC TAGGTCGCTT__CTCTCTGACC__CCTGCAGAGG__GGGATA~TGA__GGAAGATGAT
GGATTTGTGG _ACATCCTAGA_ _ GAGTGACTTA_ _ AAGGATGATG_ _ATGCAGTT~ Ç _ _ ëë
~AGG~ATG
GAGAGTCTCA TTAGTGCCCC__ACTGGTCAAG__ACCTTGGAAA__AGGAAGAGGA__AAAGGA~~T~
GTCATGTACA GCAAGTGCCA__GCGGCTCTTC__CGCTCTCCGT__CCATGCCCTG__~AGCGTGATë
CGGCCCATCC __TCAAGAGGCT__ GGAGCGGCCC__ CAGGACAGGG__ACACGëë~GT__G~AGAATAAG
CGGAGG~GGA_ _ GCGTGACë ëë_ _ TëëTGAGGAG_ _ CAGCAGGAGG_ _ ~TGAGGAA~~ _ _ TAAAGCCÇGC
GTëCTCCGÇT__ ëAAAATCAëT..GTGTÇAëGAT__GAGATCGAGA__AëëT~ëTGGA__~AGTGAÇëA~
CGAGAGCTGA _ TTGGAGATTA__ CTCTAAGGCë__TTëëT~~TAC__AGAÇAGTAGA._ÇGGAAAGCAC
~AAGACCTÇA _AGTA~ATCTC__ACCAGAAA~G__ATGGTGGCCÇ__TATTGA~GGG__ëAAGTTCAGC
AACATCGTGG ATAAGTTTGT GATTGTAGAC TGCAGATACC CCTATGAATA TGAAGGCGGG
CACATCAAGA CTGCGGTGAA CTTGCCCCTG GAACGCGACG CCGAGAGCTT CCTACTGAAG
AGCCCCATCG CGCCCTGTAG CCTGGACAAG AGAGTCATCC TCATTTTCCA CTGTGAATTC
TëATCTGAGC__ GTGGGCÇëCG__ ÇATGTGë~GT__TTCATCAGGG__AAëGAGA~CG__TGCTGTCAAÇ
GACTACCCCA_GC~TCTACTA_CCCTGAGATG__TATATCCTGA__AAGG~GG~TA._~AAGGAGTTC
TTCCCTCAGC ACCCGAACTT CTGTGAACCC CAGGACTACC GGCCCATGAA CCACGAGGCC
TTCAAGGATG AGCTAAAGAC CTTCCGCCTC AAGACTCGCA GCTGGGCTGG GGAGCGGAGC
CGGCGGGAGC TCTGTAGCCG GCTGCAGGAC CAGTGAGGGG CCTGCGCCAG TCCTGCTACC
TCCCTTGCCT TTCGAGGCCT GAAGCCAGCT GCCCTATGGG CCTGCCGGGC TGAGGGCCTG
CTGGAGGCCT CAGGTGCTGT CCATGGGAAA GATGGTGTGG TGTCCTGCCT GTCTGCCCCA
GCCCAGATTC CCCTGTGTCA TCCCATCATT TTCCATATCC TGGTGCCCCC CACCCCTGGA
AGAGCCCAGT CTGTTGAGTT AGTTAAGTTG GGTTAATACC AGCTTAAAGG CAGTATTTTG
TGTCCTCCAG GAGCTTCTTG TTTCCTTGTT AGGGTTAACC CTTCATCTTC CTGTGTCCTG
AAACGCTCCT TTGTGTGTGT GTCAGCTGAG GATCC
~ SEQ. ID n° 1l (pMAL-HsCdc25B3) ATGAAAACTGAAGAAGGTAA TGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGT
ACTGGTAATC
CTCGCTGAAGTCGGTAAGAA TTAAAGTCACCGTTGAGCAT
ATTCGAGAAA
GATACCGGAA
CCGGATAAACTGGAAGAGAA GTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATT
ATTCCCACAG
ATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATC
ACCCCGGACA GGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTAC
AAGCGTTCCA
AACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCG
CTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAA CGACATTAAA
ACGGCAAGTA
GACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAA
ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACA AAAAGAGTTC
AAGAGCTGGC
CTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGA TATTGCCGCC
AAGATCCACG
ACCATGGAAA ATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTC
ACGCCCAGAA
AGGTGAAATC
TGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAA
GCCCTGAAAG TAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAAC
ACGCGCAGAC
AACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCCATATGGAGGTGCCCCAGCCGGAGCCC
GCGCCAGGCTCGGCTCTCAGTCCAGCAGGCGTGTGCGGTGGCGCCCAGCGTCCGGGCCAC
CT~GGGCC__T~CTGCTGGG__ATTCATGG__TTGGGGT_ _~CCGGTGCG__GGGGGCT
T~TCGCGG__TCAACCT__CACCCAGA~__ATGA~GACC__TCGCGGG~T._~GGAGCGAA
ACCCCAAAGAGTCAGGTAGGGACCCTGCTCTTCCGCAGCCGCAGCCGCCTGACGCACCTA
T~CCTGT~TC_GACGGGCATC__CGAATCT~~__CTGTCGTCTG__AATT~~GA__ATTTCTGAT
_ GCAGGTCTCTGCATGGATTCCCCCAGCCCTATGGACCCCCACATGGCGGAGCAGACGTTT
TTCCAGTCTATGCCGGTGAGGCTGCTGGGCCACAGCCCCGTGCTTCGGAACATCACCAAC
TCCCAGGCGCCCGACGGCCGGAGGAAGAGCGAGGCGGGCAGTGGAGCTGCCAGCAGCTCT
GGGGAAGACAAGGAGAATGATGGATTTGTCTTCAAGATGCCATGGAAGCCCACACATCCC
AGCTCCACC__ATGCT~TGGC__AGAGTGGG~__AGCGCAGGG__AAGCTTTG__CCAGAGACC
15AGCTCGGC__CCGA~TGAT__GTGTCTAGT__~CTGACCGGA_.AGATGGAAGT__GGAGGAGT
AGCCCCCTGGCCCTAGGTCGCTTCTCTCTGACCCCTGCAGAGGGGGATACTGAGGAAGAT
GATGGATTTG__TGGACAT~CT__AGAGAGTGA__TTAAAGGATG__ATGATGCAGT__TCCCAGGC
ATGGAGAGTC__TATTAGTGC__ CCCACTGGT~__AAGACCTTGG__AAAAGGAAGA__GGAAAAGGAC
TGTCATGT__A~AGCAAGTG__ CCAGCGGCTC__TT~GTCTC__CGTCATG__CTGCAGGTG
20AT~GGCCCA_TT~AAGAG__GCTGGAGCGG__~CAGGACA__GGGAAGCC__CGTGCAGAAT
AAGCGGAGGCGGAGCGTGACCCCTCCTGAGGAGCAGCAGGAGGCTGAGGAACCTAAAGCC
CGCGTCCTC__ GCTCAAAATC__ACTGTGTAC__GATGAGATG__AGAACCTCT__GGACAGTGA~
CACCGAGAGC__ TGATTGGAGA__ TTACTCTAAG__ GCCTTCT_ TACAGACAGT_AGACGGAAAG
C_ _ ACCAAGA_ _ TAAGTAAT__ CTCACCAGAA__ ACGATGGTGG__ ~~TATTGAC_GGGCAAGTTC
_ 25AGCAACATCG__TGGATAAGTT__TGTGATTGTA__GACTGCAGAT__ACCCCTATGA__ATATGAAGG~
GGGCAATA _AGACTG~GGT__ GAACTTGC~__ CTGGAAGCG__ACGCCGAGAG__CTTCCTA~TG
AAGAG~CA _TCGCG~CTG__TAGCTGGAC__AAGAGAGTCA__TCCTCATTTT__CCACTGTGAA
TTT~ATTG_ _ AGCGTGGGCC__ GATGTGC__ CGTTTCATCA__GGGAAGAGA__CCGTGTGTC
AACGACTACCCCAGCCTCTACTACCCTGAGATGTATATCCTGAAAGGCGGCTACAAGGAG
30TTCTTCCCTC__AGCACCGAA__TTTGTGAA__CCAGGACT__ACCGG~CCAT__GAACACGAG
GCCTTCAAGGATGAGCTAAAGACCTTCCGCCTCAAGACTCGCAGCTGGGCTGGGGAGCGG
AGCCGGCGGGAGCTCTGTAGCCGGCTGCAGGACCAGTGAGGGGCCTGCGCCAGTCCTGCT
ACCTCCCTTGCCTTTCGAGGCCTGAAGCCAGCTGCCCTATGGGCCTGCCGGGCTGAGGGC
CTGCTGGAGGCCTCAGGTGCTGTCCATGGGAAAGATGGTGTGGTGTCCTGCCTGTCTGCC
GGAAGAGCCCAGTCTGTTGAGTTAGTTAAGTTGGGTTAATACCAGCTTAAAGGCAGTATT
TTGTGTCCTCCAGGAGCTTCTTGTTTCCTTGTTAGGGTTAACCCTTCATCTTCCTGTGTC
CTGAAACGCTCCTTTGTGTGTGTGTCAGCTGAGGATCC
Ces clones sont conservés à - 80 °C sous forme de culture saturée additionnée de glycérol (concentration imale 25%). Ces souches sont ensuite utilisées pour toutes les étapes de production ultérieures.
2 - Production et purification des protéines recombinantes s MBP-Cdc25B1, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 Les protéines recombinantes MBP-Cdc25B1, B2 et B3 sont produites exactement comme cela est décrit pour MBP-Cdc25C.
Les séquences SEQ. ID n° 12, SEQ. ID n° 13 et SEQ. ID
n° 14 sont obtenues respectivement pour les protéines de fusion MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et l0 MBP-Cdc25B3:
~ SEQ. ID n ° 12 (MBP-Cdc25Bl) ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT
CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
1s ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG
GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA
GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT
CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC
ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC
TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA
AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG_.AGGTGCCCCA__GCCGGAGCCC
GCGCCAGGCT._ CGGCTCTCAG_.TÇCAGCAGGC__GTGTGCGGTG__GCGCCCAGCG__TCCGGG~~A~
CTCCCGGGCC TCCTGCTGGG__ATCTCATGGC__CTCCTGGGGT__CCCCGGTGCG__GGCGGCÇGëT
WO 01/44467 _ 2g _ PCT/FR00/03496 T~CTÇG~~GG__ T~AÇ~ACÇëT.. ëAëëCAGA~C__ATG~ACGAÇ~__T~GëëGGGëT._ëGG~AGë~G~
AGCÇGëCTGA . ÇGCAë~TATë__ ÇëTGTCTÇGA__ CGGGëATC~G_ _AATëëT~ë~T_.GT~GT~TGAA
TCCTë~GAAT_. ÇTTCTGATGC__AGGTëTCTGC__ATGGATTCCC._~ëAG~~~TAT__GGAëëë~~Aë
ATGGCGGAGÇ _AGAÇGTTTGA._AëAGGCCATC._CAGGÇAGCÇA__GëëGGATëAT__TëGAAA~GAG
CAGTTTGCCA_TCAGA~G~TT__CCAGT~TATG__C~GGTGAGGC_.TGëTGGG~ëA__ëAGëëë~GTG
ëTTCGGAAëA _TÇACCAACTÇ__CëAGGCGCÇë__GACGGCCGGA__GGAAGAG~GA._GGëGGG~AGT
GGAGCTGCCA _GCAGëTëTGG__GGAAGA~AAG_.GAGAATGATG__GATTTGT~TT__~AAGATG~ëA
TGGAAGÇÇ~A _ CAëATCCCAG__ ÇT~ëACCÇAT__GCTëTGGCAG__AGTGGGCCAG__ëëG~AGGGAA
GÇ~TTTGCÇC._ AGAGA~CCAG__ CT~GGCCCCë._ GACCTGATGT__GTëTëAGT~ë_ _TGA~~GGAAG
ATGGAAGTGG._AGGAG~T~AG__CCÇëCTGGCC__CTAGGT~GCT._T~TëTëTGA~__ëëëTG~AGAG
GGGGATACTG_. AGGAAGATGA__ TGGATTTGTG__ GACATCÇTAG_ _AGAGTGA~TT__AAAGGATGAT
GATGCAGTTC_, CCCÇAGG~AT__GGAGAGTCTC_.ATTAGTGCCë__ëA~TGGTëAA__GAëëTTGGAA
AAGGAAGAGG__ AAAAGGACCT__ CGTÇATGTAC_.AGCAAGTGCC__AG~GG~TëTT_.ëëGëTëTëëG
TëCATGÇCÇT__ GCAGëGTGAT__ CCGGCCCATÇ__ CTCAAGAGGë__TGGAGCGGÇC__ÇëAGGAëAGG
GACACGCëëG__TGCAGAATAA__GëGGAGGCGG__AGCGTGAC~C__CTCCTGAGGA__GëAG~AGGAG
GCTGAGGAAC_ _ CTAAAGCCCG_ _ CGT~CTCÇG~_ _ TCAAAATCAC_ _ TGTGTÇAëGA_ _TGAGATëGAG
AACCTCCTGG__ ACAGTGAëCA__ CCGAGAGCTG__ATTGGAGATT__ACTCTAAGGë__ëTTëëTëëTA
~AGACAGTAG_ _ ACGGAAAGëA_ _ C CAAGAC CT~.. AAGTAëATC T. _ ëAë ëAGAAA~ _ _ GATGGTGGë
ëTATTGACGG=_ GëAAGTTÇAG_ _ CAACAT~GTG_ _ GATAAGTTTG. _ TGATTGTAGA_. ~TG~AGATAë
Çë~TATGAAT__ATGAAGGÇGG__GCACATCAAG_.AëTGCGGTGA__ACTTGCCCCT__GGAA~GëGAë
GCCGAGAGÇT__ TCCTACTGAA__GAGCCCCATC__GCGëCCTGTA__GCÇTGGA~AA__GAGAGTëATë
CTCATTTTCë__ ACTGTGAATT__ CTCATCTGAG__ CGTGGGCCCC__GCATGTG~ëG__TTTëATëAGG
GAACGAGACC__ GTGCTGTCAA__ ÇGAëTACCCC__AGC~TCTACT__ACCÇTGAGAT__GTATATëëTG
AAAGGCGGCT_. ACAAGGAGTT__ CTTÇCCTCAG__ CACCëGAAÇT__TCTGTGAA~ë__ëëAGGAëTA~
CGGCCCATGA_ACCAÇGAGGC__CTTëAAGGAT__GAGëTAAAGA__CÇTTëëG~~T__~AAGA~TëGë
AGCTGGGÇTG__ GGGAGÇGGAG__ ÇCGGCGGGAG__ CTCTGTAGCC__GGÇTGëAGGA__~ëAGTGA
~ SEQ. ID n° 13 (MBP-Cdc25B2) ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT
CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
ATCTTCTGGG CACACGACCG CT.TTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG
CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA
GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA
GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC
CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC
ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC
TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA
GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC
AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG__AGGTGCÇCÇA__G~ëGGAGë~~
GCGCëAGGÇT__ CGGëT~TCAG__TÇCAGÇAGGC__GTGTGCGGTG__GCGCCÇAGÇG__Të~GGG~ëAë
CTCCCGGGÇ~__ TCCTG~TGGG__ATCTÇATGGC__ CT~~TGGGGT__ CCCCGGTG~G__GG~GGëëGëT
TÇCTCGCÇGG__ TCAëCACCCT__ ÇAëCCAGACC__ATGCAëGACC__TCGÇëGGGëT__~GGëAGëGAA
AÇëCCAAAGA_GTÇAGGTAGG__GA~~CTGCTC__TTCCG~AGCC__GCAGëëGëëT__GAÇGëAëëTA
TÇ~CTGT~TC__ GAÇGGGCATC__ ÇGAATëCTCÇ__ ëTGTÇGTCTG__AATëëTëëGA__ATëTT~TGAT
GÇAGGTCTëT__ GCATGGATTC__ C~ëëAGëCCT__ATGGAëCCCC__AÇATGGëGGA__GëAGAëGTTT
GAAÇAGGCCA_TCCAGGëAGC__CAG~~GGATC__ATTCGAAACG__AGCAGTTTGë__ëATÇAGA~Gë
TTÇCAGTCTA_TGëCGGATGG__ATTTGT~TTC__AAGATGC~AT__GGAAG~ë~Aë__AëATë~ëAGë
TCCA~~CATG__CTCTGG~AGA__GTGGG~ÇAGC__ÇG~AGGGAAG__CCTTTG~~ëA__GAGAë~ëAG~
T~GGCÇ~CCG_ _ ACÇTGATGTG_ _ TCTCAGTCCT_ _ GACÇGGAAGA_ _ TGGAAGTGGA_ _ GGAGëTëAGë
ë~ëCTGG~~C_ _ TAGGTCGCTT_. ÇTCTCTGACC_ _ CCTGCAGAGG_ _ GGGATAëTGA_ _GGAAGATGAT
GGATTTGTGG_ _ ACATëCTAGA_ _ GAGTGACTTA_ _ AAGGATGATG_ _ATG~AGTTë~_ _ ë~ëAGG~ATG
GAGAGTCTëA_TTAGTGCCCC__A~TGGTCAAG__ACCTTGGAAA__AGGAAGAGGA._AAAGGAëëT~
GTCATGTACA_GCAAGTGCCA_GCGGCTCTTC__CGCTCTCCGT__CCATGCÇëTG__~AGëGTGATë
ëGGCCCATCC__ TCAAGAGGCT__ GGAGCGGCCÇ__ CAGGACAGGG__A~AÇGëë~GT__GëAGAATAAG
CGGAGG~GGA_GCGTGACCÇ~__TCCTGAGGAG__CAG~AGGAGG__CTGAGGAA~~__TAAAGëëëG~
GTCÇTÇ~GCT__ CAAAATCAÇT__GTGTÇACGAT__GAGATCGAGA__ACCTÇëTGGA__ëAGTGAëëAë
CGAGAGCTGA_TTGGAGATTA__CTCTAAGGCC__TTCCTëëTAC__AGAÇAGTAGA__ëGGAAAG~Aë
CAAGA~CTCA__AGTACA'T_'CTC__ACCAGAAACG__ATGGTGGëCC__TATTGA_C'_GGG__ëAAGTT~11G~
AACATCGTGG_ _ ATAAGTTTGT_ _ GATTGTAGAC_ _ TGCAGATACC_ _ CCTATGAATA_ _ TGAAGGëGGG
CACATCAAGA _ CTGCGGTGAA__ CTTGCCCCTG__GAACGCGACG__CCGAGAG~TT__ëëTAÇTGAAG
AGCCCCATCG__ ~GCCCTGTAG__ CCTGGACAAG__AGAGTCATCC__TCATTTTCCA__~TGTGAATT~
TCATCTGAGC__ GTGGGCCCCG__ CATGTGëëGT__ TTCATCAGGG__AACGAGA~~G__TG~TGTëAAÇ
GACTACCCCA_GCCTCTACTA__CCCTGAGATG__TATATCCTGA__AAGGCGG~TA__ëAAGGAGTT~
TTëCCTCAGC__ACCCGAACTT__ CTGTGAA~CC__CAGGAÇTACC__GGCCCATGAA__ÇëA~GAGG~~
TTCAAGGATG__AGCTAAAGAC__ CTTCCGCCTC__AAGACTÇGCA__GCTGGG~TGG__GGAG~GGAG~
CGGCGGGAGC TCTGTAGCCG GCTGCAGGAC CAGTGA
WO 01/44467 _ 3p _ PCT/FR00/03496 ~ SEQ. ID n° 14 (MBP-Cdc25B3) ATGAAAACTG TGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGT
AAGAAGGTAA
ACTGGTAATC
CTCGCTGAAG GATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCAT
TCGGTAAGAA
ATTCGAGAAA
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA GTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATT
ATTCCCACAG
ATCTTCTGGG CACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATC
ACCCCGGACA GGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTAC
AAGCGTTCCA
AACGGCAAGC TGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCG
ACGGCAAGTA
GACGTGGGCG TGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATG GTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAA
ACCGTTCGTT
AAGAGCTGGC
CTCGAAAACT ATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTCTTACGAGGAA TATTGCCGCC
GAGTTGGCGA
AAGATCCACG
ACCATGGAAA ATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTC
ACGCCCAGAA
AGGTGAAATC
TGGTATGCCG TGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAA
AACCTCGGGA TCGAGGGAAGGATTTCAGAA _AGGTGCA__GGGAGCCC
TTCCATATGG_ GCGAGGCT_ _ CGGTT~AG__TAG~AGGC__GTGTGCGGTG__G~GCCCAGCG__T~CGGGCA
CTCGGGCC_ _ TCCTG~TGGG__ATTATGGC__ CT~CTGGGGT__ CCCGGTGG__GG~GGCCGCT
T~T~GCCGG_ _ TCA~A~~CT__ CAAGACC__ATGCACGAC__TCGCCGGGT__CGGCAGCGAA
25A~AAAGA _GTAGGTAGG__GA~~TGCTC__TTGCAGCC__GCAGCG~CT__GACGCATA
TCTGTCTC_ _ GAGGGCATC_. GAATCCTCC__ TGTCGT~TG__AATCCTCGA__ATCTTTGAT
GAGGTCTCT_ _ G~ATGGATTC__ ~CCCAGCCCT__ATGGACCCC__ACATGGCGGA__GCAGAGTTT
GAACAGG~A _ TCAGGCAG__ CAGCCGGAT__ATTCGAAACG__AGCAGTTTGC__CATAGACGC
TTCCAGTTA _ TGCCGGTGAG__ GCTGCTGGG._ CACAGCCCCG__TGTTCGGAA__CATACCAAC
30T~CCAGGCG_ _CGACGGCCG__GAGGAAGAGC__GAGGCGGGCA__GTGGAG~TGC__CAGCAG~TT
GGGGAAGACA _AGGAGAATGA_TGGATTTGTC__TTAAGATGC__CATGGAAG~C__CACACATC
AGCTCCACCC ATGCTCTGGCAGAGTGGGCCAGCCGCAGGGAAGCCTTTGCCCAGAGACCC
AGCTCGGCC. _ ~GACCTGAT__ GTGTCTCAGT._ CCTGACCGGA__AGATGGAAGT__GGAGGAGCTC
AGCCCCCTGG__ CTAGGTCG_. CTTCTCTCTG__ACCCCTGCAG__AGGGGGATAC__TGAGGAAGAT
35GATGGATTTG__TGGACATCCT__AGAGAGTGAC__TTAAAGGATG__ATGATGCAGT__TCCCCAGG
ATGGAGAGTC __ TATTAGTGC_. CCCACTGGTC_.AAGACCTTGG__AAAAGGAAGA__GGAAAAGGA~
CTCGTCATGT __ ACAGCAAGTG__ CCAGCGGCTC__ TTCCGCTCTC__ CGTCCATGCC__CTGCAG~GTG
AT~~GGCÇëA _ TCÇTCAAGAG_ _ GCTGGAGCGG_ _ ëëÇëAGGACA_ _ GGGACACGëC _ _ CGTGCAGAAT
AAGCGGAGGC__ GGAGCGTGAÇ__ ~ÇCTCÇTGAG__GAG~AGëAGG__AGGCTGAGGA__ACCTAAAGCÇ
~GCGTÇ~TCC__ GCTÇAAAATC__ACTGTGTÇAC__GATGAGATCG__AGAACCTCCT_.GGACAGTGAC
CAÇ~GAGAGC_ _ TGATTGGAGA_ _ TTACTCTAAG_ _ GÇ~TT~~TCC_ _ TACAGAëAGT _ _AGACGGAAAG
ëACCAAGACC__T~AAGTACAT__CTCACCAGAA__ACGATGGTGG__CCCTATTGAC__GGGëAAGTTC
AGÇAACATCG_ _ TGGATAAGTT_ _ TGTGATTGTA_ _ GAëTG~AGAT_ _ACC~~TATGA_ _ATATGAAGG~
GGGÇA~ATCA_AGACTGCGGT__GAACTTGë~C__CTGGAAëGCG__ACGCCGAGAG__ëTT~ÇTACTG
AAGAGCCCëA _ TCGÇGÇëÇTG__TAG~~TGGAë__AAGAGAGTCA__TCÇT~ATTTT__CCAÇTGTGAA
TTëTCATCTG__ AGCGTGGGCC__ CCGÇATGTGC__ ÇGTTTëATCA__GGGAACGAGA__CCGTGCTGTÇ
AACGA~TACC__ëÇAGCCTCTA_CTACÇÇTGAG__ATGTATATCC__TGAAAGGëGG__ëTACAAGGAG
TTCTTCCCTC AGCACCCGAA CTTCTGTGAA CCCCAGGACT ACCGGCCCAT GAACCACGAG
GCÇTTCAAGG__ATGAGCTAAA__GACCTTëCGC__CTCAAGACTC__GCAGCTGGGC__TGGGGAGCGG
AGCCGGCGGG AGCTCTGTAG CCGGCTGCAG GACCAGTGA
3 - Détermination de l'activité des protéines de fusion MBP-Cdc25B1, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 Les activités des protéines de fusion MBP-Cdc25B1, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 sont mesurées dans les mêmes conditions que celles décrites pour la protéine de fusion MBP-Cdc25C. Les résultats obtenus sont reportés en figure 3.
LEGENDE DES FIGURES
La figure 1 (FIG. 1) représente la chromatographie d'analyse relative à
l'induction d'expression de la protéine de fusion MBP-Cdc25C. Les lignes 1 et 2 de la figure 1 correspondent respectivement à l'extrait total de JM109/pMAL-Cdc25C avec ou sans ajout d'IPTG. La ligne 3 correspond à l'extrait soluble. Les lignes 4 et 5 correspondent respectivement aux fractions non retenue et retenue sur amylose-agarose.
Enfin, la ligne 6 de la figure 1 correspond à la fraction d'élution n° 12 qui ne contient pratiquement que la protéine de fusion.
La figure 2 (FIG. 2) représente les résultats de la mesure de l'activité de la protéine recombinante MBP-Cdc25C (un "+" signifiant que de la ménadione a été ajoutée à
l'échantillon, un "-" que l'échantillon n'a pas été traité par de la ménadione).
La figure 3 (FIG. 3) représente les résultats de la mesure de l'activité des protéines recombinantes MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3. La réaction est réalisée avec 300 ng d'enzyme par essai. La MBP à la même concentration est utilisée dans le contrôle. Les valeurs de fluorescence mesurées permettent le calcul des pentes : 0,0025 Ofluo/sec pour le contrôle, 0,0361 Ofluo/sec pour Cdc25B l, 0,0350 Ofluo/sec pour Cdc25B2 et 0,0372 Ofluo/sec pour Cdc25B3.
LISTE DE SÉQUENCES
<110> Société de Conseils de Recherches et d'Application <120> Méthode d'obtention de phosphatases humaines Cdc25 et méthode d'identification de modulateurs de phosphatases humaines Cdc25 <130> RS 296 - listing dépôt PCT
<140>
<141>
<150> FR 99/15722 <151> 1999-12-14 <150> FR 00/06683 <151> 2000-05-30 <150> FR 00/12008 <151> 2000-09-21 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2607 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine de fusion MBP-Cdc25C
<400> 1 atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatcct ctagaatgtc tacggaactc 1200 ttctcatcca caagagagga aggaagctct ggctcaggac ccagttttag gtctaatcaa 1260 aggaaaatgt taaacctgct cctggagaga gacacttcct ttaccgtctg tccagatgtc 1320 cctagaactc cagtgggcaa atttcttggt gattctgcaa acctaagcat tttgtctgga 1380 ggaaccccaa aatgttgcct cgatctttcg aatcttagca gtggggagat aactgccact 1440 cagcttacca cttctgcaga ccttgatgaa actggtcacc tggattcttc aggacttcag 1500 gaagtgcatt tagctgggat gaatcatgac cagcacctaa tgaaatgtag cccagcacag 1560 cttctttgta gcactccgaa tggtttggac cgtggccata gaaagagaga tgcaatgtgt 1620 agttcatctg caaataaaga aaatgacaat ggaaacttgg tggacagtga aatgaaatat 1680 ttgggcagtc ccattactac tgttccaaaa ttggataaaa atccaaacct aggagaagac 1740 caggcagaag agatttcaga tgaattaatg gagttttccc tgaaagatca agaagcaaag 1800 gtgagcagaa gtggcctata tcgctccccg tcgatgccag agaacttgaa caggccaaga 1860 ctgaagcagg tggaaaaatt caaggacaac acaataccag ataaagttaa aaaaaagtat 1920 ttttctggcc aaggaaagct caggaagggc ttatgtttaa agaagacagt ctctctgtgt 1980 gacattacta tcactcagat gctggaggaa gattctaacc aggggcacct gattggtgat 2040 ttttccaagg tatgtgcgct gccaaccgtg tcagggaaac accaagatct gaagtatgtc 2100 aacccagaaa cagtggctgc cttactgtcg gggaagttcc agggtctgat tgagaagttt 2160 tatgtcattg attgtcgcta tccatatgag tatctgggag gacacatcca gggagcctta 2220 aacttatata gtcaggaaga actgtttaac ttctttctga agaagcccat cgtccctttg 2280 gacacccaga agagaataat catcgtgttc cactgtgaat tctcctcaga gaggggcccc 2340 cgaatgtgcc gctgtctgcg tgaagaggac aggtctctga accagtatcc tgcattgtac 2400 tacccagagc tatatatcct taaaggcggc tacagagact tctttccaga atatatggaa 2460 ctgtgtgaac cacagagcta ctgccctatg catcatcagg accacaagac tgagttgctg 2520 aggtgtcgaa gccagagcaa agtgcaggaa ggggagcggc agctgcggga gcagattgcc 2580 cttctggtga aggacatgag cccatga 2607 <210> 2 <211> 1461 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine Hs Cdc25C avec ses extrémités de restriction XbaI
<400> 2 tctagaatgt ctacggaact cttctcatcc acaagagagg aaggaagctc tggctcagga 60 cccagtttta ggtctaatca aaggaaaatg ttaaacctgc tcctggagag agacacttcc 120 tttaccgtct gtccagatgt ccctagaact ccagtgggca aatttcttgg tgattctgca 180 aacctaagca ttttgtctgg aggaacccca aaatgttgcc tcgatctttc gaatcttagc 240 agtggggaga taactgccac tcagcttacc acttctgcag accttgatga aactggtcac 300 ctggattctt caggacttca ggaagtgcat ttagctggga tgaatcatga ccagcaccta 360 atgaaatgta gcccagcaca gcttctttgt agcactccga atggtttgga ccgtggccat 420 agaaagagag atgcaatgtg tagttcatct gcaaataaag aaaatgacaa tggaaacttg 480 gtggacagtg aaatgaaata tttgggcagt cccattacta ctgttccaaa attggataaa 540 aatccaaacc taggagaaga ccaggcagaa gagatttcag atgaattaat ggagttttcc 600 ctgaaagatc aagaagcaaa ggtgagcaga agtggcctat atcgctcccc gtcgatgcca 660 gagaacttga acaggccaag actgaagcag gtggaaaaat tcaaggacaa cacaatacca 720 gataaagtta aaaaaaagta tttttctggc caaggaaagc tcaggaaggg cttatgttta 780 aagaagacag tctctctgtg tgacattact atcactcaga tgctggagga agattctaac 840 caggggcacc tgattggtga tttttccaag gtatgtgcgc tgccaaccgt gtcagggaaa 900 caccaagatc tgaagtatgt caacccagaa acagtggctg ccttactgtc ggggaagttc 960 cagggtctga ttgagaagtt ttatgtcatt gattgtcgct atccatatga gtatctggga 1020 ggacacatcc agggagcctt aaacttatat agtcaggaag aactgtttaa cttctttctg 1080 aagaagccca tcgtcccttt ggacacccag aagagaataa tcatcgtgtt ccactgtgaa 1140 ttctcctcag agaggggccc ccgaatgtgc cgctgtctgc gtgaagagga caggtctctg 1200 aaccagtatc ctgcattgta ctacccagag ctatatatcc ttaaaggcgg ctacagagac 1260 ttctttccag aatatatgga actgtgtgaa ccacagagct actgccctat gcatcatcag 1320 gaccacaaga ctgagttgct gaggtgtcga agccagagca aagtgcagga aggggagcgg 1380 cagctgcggg agcagattgc ccttctggtg aaggacatga gcccatgata acattccagc 1440 cactggctgc taacatctag a 1461 <210> 3 <211> 24 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce XbaI SENS
<400> 3 gttctagaat gtctagaact cttc 24 <210> 4 <211> 18 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce XbaI ANTI-SENS
<400> 4 ggctctgagt tgcgccgg 18 <210> 5 <211> 8101 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25C
<900> 5 ccgacaccat cgaatggtgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga 60 gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg 120 gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa 180 cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac 240 aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc 300 acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg 360 tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc 420 ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca 480 ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga 540 cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc 600 tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg 660 cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag 720 cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga 780 atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa 840 tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg 900 acgataccga agacagctca tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc 960 gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga 1020 agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata 1080 cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 1140 cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 1200 gcacaattct catgtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg 1260 tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg 1320 tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt 1380 ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga 1440 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagccagt ccgtttaggt gttttcacga 1500 gcacttcacc aacaaggacc atagattatg aaaatcgaag aaggtaaact ggtaatctgg 1560 attaacggcg ataaaggcta taacggtctc gctgaagtcg gtaagaaatt cgagaaagat 1620 accggaatta aagtcaccgt tgagcatccg .gataaactgg aagagaaatt cccacaggtt 1680 gcggcaactg gcgatggccc tgacattatc ttctgggcac acgaccgctt tggtggctac 1740 gctcaatctg gcctgttggc tgaaatcacc ccggacaaag cgttccagga caagctgtat 1800 ccgtttacct gggatgccgt acgttacaac ggcaagctga ttgcttaccc gatcgctgtt 1860 gaagcgttat cgctgattta taacaaagat ctgctgccga acccgccaaa aacctgggaa 1920 gagatcccgg cgctggataa agaactgaaa gcgaaaggta agagcgcgct gatgttcaac 1980 ctgcaagaac cgtacttcac ctggccgctg attgctgctg acgggggtta tgcgttcaag 2040 tatgaaaacg gcaagtacga cattaaagac gtgggcgtgg ataacgctgg cgcgaaagcg 2100 ggtctgacct tcctggttga cctgattaaa aacaaacaca tgaatgcaga caccgattac 2160 tccatcgcag aagctgcctt taataaaggc gaaacagcga tgaccatcaa cggcccgtgg 2220 gcatggtcca acatcgacac cagcaaagtg aattatggtg taacggtact gccgaccttc 2280 aagggtcaac catccaaacc gttcgttggc gtgctgagcg caggtattaa cgccgccagt 2340 ccgaacaaag agctggcaaa agagttcctc gaaaactatc tgctgactga tgaaggtctg 2400 gaagcggtta ataaagacaa accgctgggt gccgtagcgc tgaagtctta cgaggaagag 2460 ttggcgaaag atccacgtat tgccgccacc atggaaaacg cccagaaagg tgaaatcatg 2520 ccgaacatcc cgcagatgtc cgctttctgg tatgccgtgc gtactgcggt gatcaacgcc 2580 gccagcggtc gtcagactgt cgatgaagcc ctgaaagacg cgcagactaa ttcgagctcg 2640 aacaacaaca acaataacaa taacaacaac ctcgggatcg agggaaggat ttcagaattc 2700 ggatcctcta gaatgtctac ggaactcttc tcatccacaa gagaggaagg aagctctggc 2760 tcaggaccca gttttaggtc taatcaaagg aaaatgttaa acctgctcct ggagagagac 2820 acttccttta ccgtctgtcc agatgtccct agaactccag tgggcaaatt tcttggtgat 2880 tctgcaaacc taagcatttt gtctggagga accccaaaat gttgcctcga tctttcgaat 2940 cttagcagtg gggagataac tgccactcag cttaccactt ctgcagacct tgatgaaact 3000 ggtcacctgg attcttcagg acttcaggaa gtgcatttag ctgggatgaa tcatgaccag 3060 cacctaatga aatgtagccc agcacagctt ctttgtagca ctccgaatgg tttggaccgt 3120 ggccatagaa agagagatgc aatgtgtagt tcatctgcaa ataaagaaaa tgacaatgga 3180 aacttggtgg acagtgaaat gaaatatttg ggcagtccca ttactactgt tccaaaattg 3240 gataaaaatc caaacctagg agaagaccag gcagaagaga tttcagatga attaatggag 3300 ttttccctga aagatcaaga agcaaaggtg agcagaagtg gcctatatcg ctccccgtcg 3360 atgccagaga acttgaacag gccaagactg aagcaggtgg aaaaattcaa ggacaacaca 3420 ataccagata aagttaaaaa aaagtatttt tctggccaag gaaagctcag gaagggctta 3480 tgtttaaaga agacagtctc tctgtgtgac attactatca ctcagatgct ggaggaagat 3540 tctaaccagg ggcacctgat tggtgatttt tccaaggtat gtgcgctgcc aaccgtgtca 3600 gggaaacacc aagatctgaa gtatgtcaac ccagaaacag tggctgcctt actgtcgggg 3660 aagttccagg gtctgattga gaagttttat gtcattgatt gtcgctatcc atatgagtat 3720 ctgggaggac acatccaggg agccttaaac ttatatagtc aggaagaact gtttaacttc 3780 tttctgaaga agcccatcgt ccctttggac acccagaaga gaataatcat cgtgttccac 3840 tgtgaattct cctcagagag gggcccccga atgtgccgct gtctgcgtga agaggacagg 3900 tctctgaacc agtatcctgc attgtactac ccagagctat atatccttaa aggcggctac 3960 agagacttct ttccagaata tatggaactg tgtgaaccac agagctactg ccctatgcat 4020 catcaggacc acaagactga gttgctgagg tgtcgaagcc agagcaaagt gcaggaaggg 4080 gagcggcagc tgcgggagca gattgccctt ctggtgaagg acatgagccc atgataacat 4140 tccagccact ggctgctaac atctagagtc gacctgcagg caagcttggc actggccgtc 4200 gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca 4260 catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa 4320 cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcag cttggctgtt ttggcggatg agataagatt 4380 ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct 4440 ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt 4500 agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat 4560 aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa 4620 cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc 4680 cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc 4740 catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt tttctaaata 4800 cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 4860 aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 4920 ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 4980 cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 5040 agttttcgcc ccgaagaacg ttctccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 5100 gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 5160 cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 5220 gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 5280 ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 5340 gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 5400 gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 5460 cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 5520 ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 5580 gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 5640 gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 5700 gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 5760 ctttagattg atttaccccg gttgataatc agaaaagccc caaaaacagg aagattgtat 5820 aagcaaatat ttaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt 5880 aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag 5940 aatagcccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga 6000 acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg 6060 aaccatcacc caaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc 6120 ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg 6180 aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc 6240 gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtaa aaggatctag 6300 gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac 6360 tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc 6420 gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 6480 caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 6540 actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc ~caccacttca agaactctgt agcaccgcct 6600 acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 6660 cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 6720 gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta 6780 cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 6840 gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 6900 tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc 6960 tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac .gccagcaacg cggccttttt acggttcctg 7020 gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat 7080 aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc 7140 agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 7200 ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 7260 tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct gcgccccgac 7320 acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 7380 gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 7440 aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc gtgcagcgat tcacagatgt 7500 ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag aagcgttaat gtctggcttc 7560 tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt ggtcacttga tgcctccgtg 7620 taagggggaa tttctgttca tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac 7680 gatacgggtt actgatgatg aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact 7740 ggcggtatgg atgcggcggg accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc agcgcttcgt 7800 taatacagat gtaggtgttc cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa 7860 cataatggtg cagggcgctg acttccgcgt .ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa 7920 gaccattcat gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg 7980 ctcgcgtatc ggtgattcat tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggt 8040 cctcaacgac aggagcacga tcatgcgcac ccgtggccag gacccaacgc tgcccgaaat 8100 t 8101 <210> 6 <211> 2063 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine Hs Cdc25B1 avec ses extrémités de restriction NdeI
et BamHl <400> 6 catatggagg tgccccagcc ggagcccgcg ccaggctcgg ctctcagtcc agcaggcgtg 60 tgcggtggcg cccagcgtcc gggccacctc ccgggcctcc tgctgggatc tcatggcctc 120 ctggggtccc cggtgcgggc ggccgcttcc tcgccggtca ccaccctcac ccagaccatg 180 cacgacctcg ccgggctcgg cagccgcagc cgcctgacgc acctatccct gtctcgacgg 240 gcatccgaat cctccctgtc gtctgaatcc tccgaatctt ctgatgcagg tctctgcatg 300 gattccccca gccctatgga cccccacatg gcggagcaga cgtttgaaca ggccatccag 360 gcagccagcc ggatcattcg aaacgagcag tttgccatca gacgcttcca gtctatgccg 420 gtgaggctgc tgggccacag ccccgtgctt cggaacatca ccaactccca ggcgcccgac 480 ggccggagga agagcgaggc gggcagtgga gctgccagca gctctgggga agacaaggag 540 aatgatggat ttgtcttcaa gatgccatgg aagcccacac atcccagctc cacccatgct 600 ctggcagagt gggccagccg cagggaagcc tttgcccaga gacccagctc ggcccccgac 660 ctgatgtgtc tcagtcctga ccggaagatg gaagtggagg agctcagccc cctggcccta 720 ggtcgcttct ctctgacccc tgcagagggg gatactgagg aagatgatgg atttgtggac 780 atcctagaga gtgacttaaa ggatgatgat gcagttcccc caggcatgga gagtctcatt 840 agtgccccac tggtcaagac cttggaaaag gaagaggaaa aggacctcgt catgtacagc 900 aagtgccagc ggctcttccg ctctccgtcc atgccctgca gcgtgatccg gcccatcctc 960 aagaggctgg agcggcccca ggacagggac acgcccgtgc agaataagcg gaggcggagc 1020 gtgacccctc ctgaggagca gcaggaggct gaggaaccta aagcccgcgt cctccgctca 1080 aaatcactgt gtcacgatga gatcgagaac ctcctggaca gtgaccaccg agagctgatt 1140 ggagattact ctaaggcctt cctcctacag acagtagacg gaaagcacca agacctcaag 1200 tacatctcac cagaaacgat ggtggcccta ttgacgggca agttcagcaa catcgtggat 1260 aagtttgtga ttgtagactg cagatacccc tatgaatatg aaggcgggca catcaagact 1320 gcggtgaact tgcccctgga acgcgacgcc gagagcttcc tactgaagag ccccatcgcg 1380 ccctgtagcc tggacaagag agtcatcctc attttccact gtgaattctc atctgagcgt 1440 gggccccgca tgtgccgttt catcagggaa cgagaccgtg ctgtcaacga ctaccccagc 1500 ctctactacc ctgagatgta tatcctgaaa ggcggctaca aggagttctt ccctcagcac 1560 ccgaacttct gtgaacccca ggactaccgg cccatgaacc acgaggcctt caaggatgag 1620 ctaaagacct tccgcctcaa gactcgcagc tgggctgggg agcggagccg gcgggagctc 1680 tgtagccggc tgcaggacca gtgaggggcc tgcgccagtc ctgctacctc ccttgccttt 1740 cgaggcctga agccagctgc cctatgggcc tgccgggctg agggcctgct ggaggcctca 1800 ggtgctgtcc atgggaaaga tggtgtggtg tcctgcctgt ctgccccagc ccagattccc 1860 ctgtgtcatc ccatcatttt ccatatcctg gtgcccccca cccctggaag agcccagtct 1920 gttgagttag ttaagttggg ttaataccag cttaaaggca gtattttgtg tcctccagga 1980 gcttcttgtt tccttgttag ggttaaccct tcatcttcct gtgtcctgaa acgctccttt 2040 gtgtgtgtgt cagctgagga tcc 2063 <210> 7 <211> 1982 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine Hs Cdc25B2 avec ses extrémités de restriction NdeI
et BamHl <400> 7 catatggagg tgccccagcc ggagcccgcg ccaggctcgg ctctcagtcc agcaggcgtg 60 tgcggtggcg cccagcgtcc gggccacctc ccgggcctcc tgctgggatc tcatggcctc 120 ctggggtccc cggtgcgggc ggccgcttcc tcgccggtca ccaccctcac ccagaccatg 180 cacgacctcg ccgggctcgg cagcgaaacc ccaaagagtc aggtagggac cctgctcttc 240 cgcagccgca gccgcctgac gcacctatcc ctgtctcgac gggcatccga atcctccctg 300 tcgtctgaat cctccgaatc ttctgatgca ggtctctgca tggattcccc cagccctatg 360 gacccccaca tggcggagca gacgtttgaa caggccatcc aggcagccag ccggatcatt 420 cgaaacgagc agtttgccat cagacgcttc cagtctatgc cggatggatt tgtcttcaag 480 atgccatgga agcccacaca tcccagctcc acccatgctc tggcagagtg ggccagccgc 540 agggaagcct ttgcccagag acccagctcg gcccccgacc tgatgtgtct cagtcctgac 600 cggaagatgg aagtggagga gctcagcccc ctggccctag gtcgcttctc tctgacccct 660 gcagaggggg atactgagga agatgatgga tttgtggaca tcctagagag tgacttaaag 720 gatgatgatg cagttccccc aggcatggag agtctcatta gtgccccact ggtcaagacc 780 ttggaaaagg aagaggaaaa ggacctcgtc atgtacagca agtgccagcg gctcttccgc 840 tctccgtcca tgccctgcag cgtgatccgg cccatcctca agaggctgga gcggccccag 900 gacagggaca cgcccgtgca gaataagcgg aggcggagcg tgacccctcc tgaggagcag 960 caggaggctg aggaacctaa agcccgcgtc ctccgctcaa aatcactgtg tcacgatgag 1020 atcgagaacc tcctggacag tgaccaccga gagctgattg gagattactc taaggccttc 1080 ctcctacaga cagtagacgg aaagcaccaa gacctcaagt acatctcacc agaaacgatg 1140 gtggccctat tgacgggcaa gttcagcaac atcgtggata agtttgtgat tgtagactgc 1200 agatacccct atgaatatga aggcgggcac atcaagactg cggtgaactt gcccctggaa 1260 cgcgacgccg agagcttcct actgaagagc cccatcgcgc cctgtagcct ggacaagaga 1320 gtcatcctca ttttccactg tgaattctca tctgagcgtg ggccccgcat gtgccgtttc 1380 atcagggaac gagaccgtgc tgtcaacgac .taccccagcc tctactaccc tgagatgtat 1440 atcctgaaag gcggctacaa ggagttcttc cctcagcacc cgaacttctg tgaaccccag 1500 gactaccggc ccatgaacca cgaggccttc aaggatgagc taaagacctt ccgcctcaag 1560 actcgcagct gggctgggga gcggagccgg cgggagctct gtagccggct gcaggaccag 1620 tgaggggcct gcgccagtcc tgctacctcc cttgcctttc gaggcctgaa gccagctgcc 1680 ctatgggcct gccgggctga gggcctgctg gaggcctcag gtgctgtcca tgggaaagat 1740 ggtgtggtgt cctgcctgtc tgccccagcc cagattcccc tgtgtcatcc catcattttc 1800 catatcctgg tgccccccac ccctggaaga gcccagtctg ttgagttagt taagttgggt 1860 taataccagc ttaaaggcag tattttgtgt cctccaggag cttcttgttt ccttgttagg 1920 gttaaccctt catcttcctg tgtcctgaaa cgctcctttg tgtgtgtgtc agctgaggat 1980 cc 1982 <210> 8 <211> 2105 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine Hs Cdc25B3 avec ses extrémités de restriction NdeI
et BamHl <400> 8 catatggagg tgccccagcc ggagcccgcg ccaggctcgg ctctcagtcc agcaggcgtg 60 tgcggtggcg cccagcgtcc gggccacctc ccgggcctcc tgctgggatc tcatggcctc 120 ctggggtccc cggtgcgggc ggccgcttcc tcgccggtca ccaccctcac ccagaccatg 180 cacgacctcg ccgggctcgg cagcgaaacc ccaaagagtc aggtagggac cctgctcttc 240 cgcagccgca gccgcctgac gcacctatcc ctgtctcgac gggcatccga atcctccctg 300 tcgtctgaat cctccgaatc ttctgatgca ggtctctgca tggattcccc cagccctatg 360 gacccccaca tggcggagca gacgtttgaa caggccatcc aggcagccag ccggatcatt 420 cgaaacgagc agtttgccat cagacgcttc cagtctatgc cggtgaggct gctgggccac 480 agccccgtgc ttcggaacat caccaactcc caggcgcccg acggccggag gaagagcgag 540 gcgggcagtg gagctgccag cagctctggg gaagacaagg agaatgatgg atttgtcttc 600 aagatgccat ggaagcccac acatcccagc tccacccatg ctctggcaga gtgggccagc 660 cgcagggaag cctttgccca gagacccagc tcggcccccg acctgatgtg tctcagtcct 720 gaccggaaga tggaagtgga ggagctcagc cccctggccc taggtcgctt ctctctgacc 780 cctgcagagg gggatactga ggaagatgat ggatttgtgg acatcctaga gagtgactta 840 aaggatgatg atgcagttcc cccaggcatg gagagtctca ttagtgcccc actggtcaag 900 accttggaaa aggaagagga aaaggacctc gtcatgtaca gcaagtgcca gcggctcttc 960 cgctctccgt ccatgccctg cagcgtgatc cggcccatcc tcaagaggct ggagcggccc 1020 caggacaggg acacgcccgt gcagaataag cggaggcgga gcgtgacccc tcctgaggag 1080 cagcaggagg ctgaggaacc taaagcccgc gtcctccgct caaaatcact gtgtcacgat 1140 gagatcgaga acctcctgga cagtgaccac cgagagctga ttggagatta ctctaaggcc 1200 ttcctcctac agacagtaga cggaaagcac caagacctca agtacatctc accagaaacg 1260 atggtggccc tattgacggg caagttcagc aacatcgtgg ataagtttgt gattgtagac 1320 tgcagatacc cctatgaata tgaaggcggg cacatcaaga ctgcggtgaa cttgcccctg 1380 gaacgcgacg ccgagagctt cctactgaag agccccatcg cgccctgtag cctggacaag 1440 agagtcatcc tcattttcca ctgtgaattc tcatctgagc gtgggccccg catgtgccgt 1500 ttcatcaggg aacgagaccg tgctgtcaac gactacccca gcctctacta ccctgagatg 1560 tatatcctga aaggcggcta caaggagttc ttccctcagc acccgaactt ctgtgaaccc 1620 caggactacc ggcccatgaa ccacgaggcc ttcaaggatg agctaaagac cttccgcctc 1680 aagactcgca gctgggctgg ggagcggagc cggcgggagc tctgtagccg gctgcaggac 1740 cagtgagggg cctgcgccag tcctgctacc tcccttgcct ttcgaggcct gaagccagct 1800 gccctatggg cctgccgggc tgagggcctg ctggaggcct caggtgctgt ccatgggaaa 1860 gatggtgtgg tgtcctgcct gtctgcccca gcccagattc ccctgtgtca tcccatcatt 1920 ttccatatcc tggtgccccc cacccctgga agagcccagt ctgttgagtt agttaagttg 1980 ggttaatacc agcttaaagg cagtattttg tgtcctccag gagcttcttg tttccttgtt 2040 agggttaacc cttcatcttc ctgtgtcctg aaacgctcct ttgtgtgtgt gtcagctgag 2100 gatcc 2105 <210> 9 <211> 3236 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25Bl <400> 9 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 1200 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 1260 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 1320 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagccgc 1380 agccgcctga cgcacctatc cctgtctcga cgggcatccg aatcctccct gtcgtctgaa 1440 tcctccgaat cttctgatgc aggtctctgc atggattccc ccagccctat ggacccccac 1500 atggcggagc agacgtttga acaggccatc caggcagcca gccggatcat tcgaaacgag 1560 cagtttgcca tcagacgctt ccagtctatg ccggtgaggc tgctgggcca cagccccgtg 1620 cttcggaaca tcaccaactc ccaggcgccc gacggccgga ggaagagcga ggcgggcagt 1680 ggagctgcca gcagctctgg ggaagacaag gagaatgatg gatttgtctt caagatgcca 1740 tggaagccca cacatcccag ctccacccat gctctggcag agtgggccag ccgcagggaa 1800 gcctttgccc agagacccag ctcggccccc gacctgatgt gtctcagtcc tgaccggaag 1860 atggaagtgg aggagctcag ccccctggcc ctaggtcgct tctctctgac ccctgcagag 1920 ggggatactg aggaagatga tggatttgtg gacatcctag agagtgactt aaaggatgat 1980 gatgcagttc ccccaggcat ggagagtctc attagtgccc cactggtcaa gaccttggaa 2040 aaggaagagg aaaaggacct cgtcatgtac agcaagtgcc agcggctctt ccgctctccg 2100 tccatgccct gcagcgtgat ccggcccatc ctcaagaggc tggagcggcc ccaggacagg 2160 gacacgcccg tgcagaataa gcggaggcgg agcgtgaccc ctcctgagga gcagcaggag 2220 gctgaggaac ctaaagcccg cgtcctccgc tcaaaatcac tgtgtcacga tgagatcgag 2280 aacctcctgg acagtgacca ccgagagctg attggagatt actctaaggc cttcctccta 2340 cagacagtag acggaaagca ccaagacctc aagtacatct caccagaaac gatggtggcc 2400 ctattgacgg gcaagttcag caacatcgtg gataagtttg tgattgtaga ctgcagatac 2460 ccctatgaat atgaaggcgg gcacatcaag actgcggtga acttgcccct ggaacgcgac 2520 gccgagagct tcctactgaa gagccccatc gcgccctgta gcctggacaa gagagtcatc 2580 ctcattttcc actgtgaatt ctcatctgag cgtgggcccc gcatgtgccg tttcatcagg 2640 gaacgagacc gtgctgtcaa cgactacccc agcctctact accctgagat gtatatcctg 2700 aaaggcggct acaaggagtt cttccctcag cacccgaact tctgtgaacc ccaggactac 2760 cggcccatga accacgaggc cttcaaggat gagctaaaga ccttccgcct caagactcgc 2820 agctgggctg gggagcggag ccggcgggag ctctgtagcc ggctgcagga ccagtgaggg 2880 gcctgcgcca gtcctgctac ctcccttgcc tttcgaggcc tgaagccagc tgccctatgg 2940 gcctgccggg ctgagggcct gctggaggcc tcaggtgctg tccatgggaa agatggtgtg 3000 gtgtcctgcc tgtctgcccc agcccagatt cccctgtgtc atcccatcat tttccatatc 3060 ctggtgcccc ccacccctgg aagagcccag tctgttgagt tagttaagtt gggttaatac 3120 cagcttaaag gcagtatttt gtgtcctcca ggagcttctt gtttccttgt tagggttaac 3180 ccttcatctt cctgtgtcct gaaacgctcc tttgtgtgtg tgtcagctga ggatcc 3236 <210> 10 <211> 4955 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25B2 <400> 10 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca açaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 1200 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 1260 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 1320 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagccgc 1380 agccgcctga cgcacctatc cctgtctcga cgggcatccg aatcctccct gtcgtctgaa 1440 tcctccgaat cttctgatgc aggtctctgc atggattccc ccagccctat ggacccccac 1500 atggcggagc agacgtttga acaggccatc caggcagcca gccggatcat tcgaaacgag 1560 cagtttgcca tcagacgctt ccagtctatg ccggtgaggc tgctgggcca cagccccgtg 1620 cttcggaaca tcaccaactc ccaggcgccc gacggccgga ggaagagcga ggcgggcagt 1680 ggagctgcca gcagctctgg ggaagacaag gagaatgatg gatttgtctt caagatgcca 1740 tggaagccca cacatcccag ctccacccat gctctggcag agtgggccag ccgcagggaa 1800 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 1860 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 1920 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 1980 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 2040 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 2100 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 2160 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 2220 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 2280 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 2340 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 2400 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 2460 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 2520 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 2580 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 2640 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 2700 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 2760 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 2820 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 2880 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 2940 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 3000 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 3060 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 3120 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagcgaa 3180 accccaaaga gtcaggtagg gaccctgctc ttccgcagcc gcagccgcct gacgcaccta 3240 tccctgtctc gacgggcatc cgaatcctcc ctgtcgtctg aatcctccga atcttctgat 3300 gcaggtctct gcatggattc ccccagccct atggaccccc acatggcgga gcagacgttt 3360 gaacaggcca tccaggcagc cagccggatc attcgaaacg agcagtttgc catcagacgc 3420 ttccagtcta tgccggatgg atttgtcttc aagatgccat ggaagcccac acatcccagc 3480 tccacccatg ctctggcaga gtgggccagc cgcagggaag cctttgccca gagacccagc 3540 tcggcccccg acctgatgtg tctcagtcct gaccggaaga tggaagtgga ggagctcagc 3600 cccctggccc taggtcgctt ctctctgacc cctgcagagg gggatactga ggaagatgat 3660 ggatttgtgg acatcctaga gagtgactta aaggatgatg atgcagttcc cccaggcatg 3720 gagagtctca ttagtgcccc actggtcaag accttggaaa aggaagagga aaaggacctc 3780 gtcatgtaca gcaagtgcca gcggctcttc cgctctccgt ccatgccctg cagcgtgatc 3840 cggcccatcc tcaagaggct ggagcggccc caggacaggg acacgcccgt gcagaataag 3900 cggaggcgga gcgtgacccc tcctgaggag cagcaggagg ctgaggaacc taaagcccgc 3960 gtcctccgct caaaatcact gtgtcacgat gagatcgaga acctcctgga cagtgaccac 4020 cgagagctga ttggagatta ctctaaggcc ttcctcctac agacagtaga cggaaagcac 4080 caagacctca agtacatctc accagaaacg atggtggccc tattgacggg caagttcagc 4140 aacatcgtgg ataagtttgt gattgtagac tgcagatacc cctatgaata tgaaggcggg 4200 cacatcaaga ctgcggtgaa cttgcccctg gaacgcgacg ccgagagctt cctactgaag 4260 agccccatcg cgccctgtag cctggacaag agagtcatcc tcattttcca ctgtgaattc 4320 tcatctgagc gtgggccccg catgtgccgt ttcatcaggg aacgagaccg tgctgtcaac 4380 gactacccca gcctctacta ccctgagatg tatatcctga aaggcggcta caaggagttc 4440 ttccctcagc acccgaactt ctgtgaaccc caggactacc ggcccatgaa ccacgaggcc 4500 ttcaaggatg agctaaagac cttccgcctc aagactcgca gctgggctgg ggagcggagc 4560 cggcgggagc tctgtagccg gctgcaggac cagtgagggg cctgcgccag tcctgctacc 4620 tcccttgcct ttcgaggcct gaagccagct gccctatggg cctgccgggc tgagggcctg 4680 ctggaggcct caggtgctgt ccatgggaaa gatggtgtgg tgtcctgcct gtctgcccca 4740 gcccagattc ccctgtgtca tcccatcatt ttccatatcc tggtgccccc cacccctgga 4800 agagcccagt ctgttgagtt agttaagttg ggttaatacc agcttaaagg cagtattttg 4860 tgtcctccag gagcttcttg tttccttgtt agggttaacc cttcatcttc ctgtgtcctg 4920 aaacgctcct ttgtgtgtgt gtcagctgag gatcc 4955 <210> 11 <211> 3278 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25B3 <400> 11 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct.gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960
GAGATAGGTGCCTCACTGAT TAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATA
CTTTAGATTGATTTACCCCG GTTGATAATCAGAAAAGCCCCAAAAACAGGAAGATTGTAT
AAGCAAATATTTAAATTGTA AACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTT
AAATCAGCTCATTTTTTAAC CAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAG
AATAGCCCGAGATAGGGTTG AGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGA
ACGTGGACTCCAACGTCAAA GGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTG
AACCATCACCCAAATCAAGT TTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACC
CTAAAGGGAGCCCCCGATTT AGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGG
AAGGGAAGAAAGCGAAAGGA GCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGC
GCGTAACCACCACACCCGCC GCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTAAAAGGATCTAG
GTGAAGATCCTTTTTGATAA TCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCAC
TGAGCGTCAGACCCCGTAGA AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGC
GTAATCTGCTGCTTGCAAAC AAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGAT
CAAGAGCTACCAACTCTTTT TCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAAT
ACTGTCCTTCTAGTGTAGCC GTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCT
ACATACCTCGCTCTGCTAAT CCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGT
CTTACCGGGTTGGACTCAAG ACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACG
GGGGGTTCGTGCACACAGCC CAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTA
CAGCGTGAGCTATGAGAAAG CGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCG
GTAAGCGGCAGGGTCGGAAC AGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGG
TATCTTTATAGTCCTGTCGG GTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGC
TCGTCAGGGGGGCGGAGCCT ATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTG
GCCTTTTGCTGGCCTTTTGC TCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGAT
AACCGTATTACCGCCTTTGA GTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGC
AGCGAGTCAGTGAGCGAGGA AGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCAT
CTGTGCGGTATTTCACACCG CATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCA
TAGTTAAGCCAGTATACACT CCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGAC
ACCCGCCAACACCCGCTGAC GCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACA
GACAAGCTGTGACCGTCTCC GGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGA
AACGCGCGAGGCAGCTGCGG TAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGCAGCGATTCACAGATGT
CTGCCTGTTCATCCGCGTCC AGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTC
TGATAAAGCGGGCCATGTTA AGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTTGATGCCTCCGTG
TAAGGGGGAATTTCTGTTCA TGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCAC
GATACGGGTTACTGATGATG AACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACT
GGCGGTATGGATGCGGCGGG ACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGT
TAATACAGATGTAGGTGTTC CACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAA
CATAATGGTGCAGGGCGCTG ACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAA
WO 01/44467 _ 13 _ PCT/FR00/03496 GACCATTCAT GTTGTTGCTC AGGTCGCAGA CGTTTTGCAG CAGCAGTCGC TTCACGTTCG
CTCGCGTATC GGTGATTCAT TCTGCTAACC AGTAAGGCAA CCCCGCCAGC CTAGCCGGGT
CCTCAACGAC AGGAGCACGA TCATGCGCAC CCGTGGCCAG GACCCAACGC TGCCCGAAAT
T
(les sites XBAI sont soulignés par une simple ligne continue, fORF de Cdc25C
est souligné en pointillé, la séquence de la protéine liant le maltose (MBP) est soulignée par une double ligne continue et la séquence en gras correspond à la région de l'ADN
plasmidique isolé à partir de la souche JM 109 et séquencée).
Ce clone peut être conservé à -80 °C sous forme de culture saturée additionnée de 1o glycérol (concentration finale 25%) ou " stock glycérol ". Cette souche sera utilisée pour toutes les étapes de production ultérieures.
2 - Production et purification de la protéine recombinante MBP-Cdc25C
NB : sauf indication contraire, tous les réactifs chimiques proviennent de SIGMA-ALDRICH.
i5 2.1 - Culture bactérienne et induction d'expression de la protéine de fusion 50 ml de milieu LB + ampicilline 100 ~g/ml (LB amp.) sont inoculés avec 100 ~1 de stock glycérol du clone JM109/pMAL-Cdc25C et cultivés 14 à 16 heures à 37 °C sous agitation (180 à 220 rpm). Cette pré-culture est ensuite diluée cinquante fois (20 ml par litre de milieu) dans un milieu LB amp. + 2 g/1 de glucose et cultivée à 37 °C / 180 rpm 2o pour atteindre une densité optique à 600 nm comprise entre 0,55 et 0,60. La synthèse de la protéine de fusion est alors induite par ajout IPTG (0,3 mM) à 37 °C
pendant 3 heures. Les bactéries sont récoltées par centrifugation, lavées une fois dans 40 ml de PBS froid par litre de culture, et le culot bactérien est ensuite congelé dans l'azote liquide et conservé à -80 °C. .
25 L'induction est analysée immédiatement par dépôt de 2,5.10 cellules, prélevées avant et après induction, sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration des protéines au bleu de Coomassie (Figure 1, lignes 1 et 2 respectivement).
WO 01/44467 _ 14 _ PCT/FR00/03496 2.2 - Lyse et extraction.
Un culot bactérien correspondant à 1 litre de culture induite est décongelé
dans la glace, re-suspendu dans 35 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 250 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 ~g/ml lysozyme, 1 ~g/ml leupeptine, 2 ~g/ml aprotinine, 1 mM PMSF) et incubé 45 min dans la glace. La suspension bactérienne est ensuite soniquée (4 cycles de 1 min en mode discontinu 50%, alternés avec 1 min de pause), puis centrifugée pendant 35 min. à 110 000 g. Le surnageant ou extrait soluble est conservé pour la purification de la protéine MBP-Cdc25C (Figure l, ligne 3).
2.3 - Purification par affinité sur résine d'amylose-agarose.
1o Pour un extrait soluble correspondant à 1 litre de culture bactérienne induite, 2 ml de résine d'amylose-agarose (New England Biolabs #800-21) sont déposés sur une colonne chromatographique HR 5/10 (Pharmacia) et lavés par 20 ml (10 volumes) de tampon de colonne (20 mM Tris-HCl pH 7,4 ; 250 mM NaCI ; 1 mM EDTA ; 1 mM DTT ;
1 ~.g/ml leupeptine ; 2 ~g/ml aprotinine). L'extrait soluble est passé sur la colonne d'affinité à un débit de 0,15 ml/min ; l'éluat (c'est-à-dire la fraction non retenue sur l'amylose-agarose) est récolté pour analyse (Figure 1, ligne 4). La colonne est lavée par ml (10 volumes) de tampon de colonne. Un échantillon de la matrice d'affinité
après passage de l'extrait soluble peut être éventuellement analysé (Figure 1, ligne 5).
L'élution de la protéine de la matrice d'affinité est effectuée avec un tampon maltose 20 (20 mM Tris-HCl pH 7,4 ; 250 mM NaCI ; 1 mM EDTA ; 1 mM DTT ; 10 mM
maltose). 20 fractions d'élution de 0,5 ml sont recueillies. Pour chaque fraction, la concentration protéique totale est évaluée par un essai de type Bradford et la fraction est analysée par dépôt sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration au bleu de Coomassie (Figure 1, ligne 6). Les fractions dans lesquelles la protéine de fusion MBP-Cdc25C complète représente au moins 90 % des protéines totales sont rassemblées pour former un lot dont l'activité est ensuite testée. Les lots sont conservés à -80°C.
Le séquençage de l'insert compris entre les sites XbaI donne le résultat suivant ATGAAAATCG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT
CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
WO 01/44467 _ 15 _ PCT/FR00/03496 ACCCCGGACA AAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTA CCTGGGATGCCGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGT TATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCC CGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAG AACCGTACTTCACCTGGCCG
CTGATTGCTG CTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAA ACGGCAAGTACGACATTAAA
GACGTGGGCG TGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGA CCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCG CAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGT CCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATG GTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTC AACCATCCAAACCGTTCGTT
CTCGAAAACT ATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGG TTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGA AAGATCCACGTATTGCCGCC
ACCATGGAAA ACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACA TCCCGCAGATGTCCGCTTTC
TGGTATGCCG TGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCG GTCGTCAGACTGTCGATGAA
AACCTCGGGA TCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGATCCTC TAGAATGT~T___AGGAAT~T
TCT~ATCCAC____ AAGAGAGGAA____GGAAGCTCTG____GCTCAGGAC____ CAGTTTTAGG____ TTAATAAA
GGAAAATGTT____ AAACCTGT,_TGGAGAGAG,_A~ACTTCCTT__._ TACCGTCTGT_____~AGATGT
._ __ TAGAA~TCC____ AGTGGGCAAA___.TTTTTGGTG____ATTTGCAAA____ TAAGATT_____TTGTTGGAG
20GAACC~AAA _ ATGTTGCCT._GATCTTTCGA____AT~TTAGCAG____ TGGGGAGATA_ ATGAT
__ _. __ AGCTTACCAC____ TTCTGCAGAC__CTTGATGAAA____CTGGTCA~~T____ GGATTCTTCA____ GGA~TT~AGG
__ AAGTGCATTT____ AGCTGGGATG_ AATCATGACC____AGCACTAAT____ GAAATGTAG___._~AGAAG~
__ TTTTTGTAG.___ CACTCCGAAT__GGTTTGGAC____GTGGCCATAG____ AAAGAGAGAT____ G~AATGTGTA
__ GTTATCTGC____ AAATAAAGAA___ AATGACAATG_.._GAAACTTGGT____ GGAAGTGAA_ ATGAAATATT
__ 25TGGGCAGTCC___, ATTACTACT__GTTCCAAAAT____TGGATAAAA.A____ T~AAACTA_ GGAGAAGA
__ __ AGGCAGAAGA __ GATTTCAGAT__GAATTAATGG____AGTTTTCCT____ GAAAGAT~AA_ GAAG~AAAGG
_ __ __ TGAGCAGAAG____ TGGCCTATAT__CGCTCCGT____ CGATGCCAGA____ GAACTTGAAC__._ AGGAAGA~
__ TGAAGCAGGT____ GGAAAA~1TTC_ AAGGAAACA____CAATACCAGA.___ TAAAGTTAAA.__ AAAAAGTATT
__ TTTCTGGCCA __ AGGAAAGCTC_ AGGAAGGGCT____TATGTTTAA~1____ GAAGACAGTC_____T~TTGTGTG
_ __ 30ACATTATAT____ ACTCAGATG___CTGGAGGAAG____ATTCTAACCA____ GGGGA~~TG____ ATTGGTGATT
_ TTTCCAAGGT____ ATGTGCGCTG____CCAACCGTGT____CAGGGAAACA_.._ ~CAAGAT~TG____ AAGTATGTA
ACCCAGAAAC__._ AGTGGCTGCC___TTACTGTCGG____GGAAGTTCCA___. GGGTCTGATT____ GAGAAGTTTT
_ ATGTCATTGA __ TTGTGCTAT____CCATATGAGT____ATCTGGGAGG____ACACATCCAG____ GGAGTTAA
_ ACTTATATAG____ TCAGGAAGAA___CTGTTTAACT__ TCTTTCTGAA____ GAAGCCCATC_____GT~~TTTGG
_ __ 35ACACCCAGAA __ GAGAATAATC__ ATCGTGTTCC____ACTGTGAATT____ CTCCTAGAG____ AGGGG~~~~~
_ _ GAATGTGCCG____ TGTCTGCGT_._GAAGAGGACA____GGTCTCTGAA__,_ CAGTAT~~T_____GATTGTAT
_ ACCCAGAGT_ ___ ATATATCCTT__ AAAGGCGGCT____ACAGAGACTT____ CTTTCAGAA_._TATATGGAA
_ _ TGTGTGAACC____ ACAGAGCTAC___TGCCCTATGC____ATCATCAGGA____ CCACAAGACT____ GAGTTGCTGA
_ GGTGTCGAAG____ ÇÇAGAGCAAA_.__GTGCAGGAAG____GGGAG~GG~A____G~TGëGGGAG_____ëAGATTG~~~
TTCTGGTGAA GGACATGAGC CCATGATAAC ATTCCAGCCA CTGGCTGCTA ACATCTAGA
(les sites XBAI sont soulignés par une simple ligne continue, fORF de Cdc25C
est souligné en pointillé et la séquence en italique correspond à l'ORF de la protéine liant le maltose (MBP)) La séquence de la protéine de fusion MBP-Cdc25C obtenue correspond donc à la séquence SEQ. ID n° 1 représentée ci-dessous ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATC TGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGT
CTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAA GATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCAT
CCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAG GTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATT
ATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGC TACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATC
ACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTG TATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTAC
AACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCT GTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGG GAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTC AACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCG
CTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTC AAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAA
GACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAA GCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGAT TACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCG TGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACC TTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTT
GGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCC AGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTC
CTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGT CTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAA GAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCC
ACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATC ATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTC
TGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAAC GCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAA
GCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGC TCGAACAACAACAACAATAACAATAACAAC
AACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAAT TCGGATCCTCTAGAATGTCTACGGAACTCT
TCTCATCCACAAGAGAGGAAGGAAGCTCTG GC'T_'CAGGACCCAGTTTTAGGTCTAATCAAA
GGAAAATGTTAAACCTGCTCCTGGAGAGAG ACACTTCCTTTACCGTCTGTCCAGATGTCC
CTAGAACTCCAGTGGGCAAATTTCTTGGTG ATTCTGCAAACCTAAGCATTTTGTCTGGAG
GAACCCCAAAATGTTGCCTCGATCTTTCGA A'rCTTAGCAGTGGGGAGATAACTGCCACTC
AGCTTACCACTTCTGCAGACCTTGATGAAA CTGGTCACCTGGATTCTTCAGGACTTCAGG
AAGTGCATTTAGCTGGGATGAATCATGACC AGCACCTAATGAAATGTAGCCCAGCACAGC
TTCTTTGTAGCACTCCGAATGGTTTGGACC GTGGCCATAGAAAGAGAGATGCAATGTGTA
GTTCATCTGCAAATAAAGAAAATGACAATG GAAACTTGGTGGACAGTGAAATGAAATATT
TGGGCAGTCCCATTACTACTGTTCCAAAAT TGGATAAAAATCCAAACCTAGGAGAAGACC
AGGCAGAAGA GATTTCAGAT GAATTAATGG AGTTTTCCCT GAAAGATCAA GAAGCAAAGG
TGAGCAGAAG TGGCCTATAT CGCTCCCCGT CGATGCCAGA GAACTTGAAC AGGCCAAGAC
TGAAGCAGGT GGAAAAATTC AAGGACAACA CAATACCAGA TAAAGTTAAA AAAAAGTATT
TTTCTGGCCA AGGAAAGCTC AGGAAGGGCT TATGTTTAAA GAAGACAGTC TCTCTGTGTG
ACATTACTAT CACTCAGATG CTGGAGGAAG ATTCTAACCA GGGGCACCTG ATTGGTGATT
TTTCCAAGGT ATGTGCGCTG CCAACCGTGT CAGGGAAACA CCAAGATCTG AAGTATGTCA
ACCCAGAAAC AGTGGCTGCC TTACTGTCGG GGAAGTTCCA GGGTCTGATT GAGAAGTTTT
ATGTCATTGA TTGTCGCTAT CCATATGAGT ATCTGGGAGG ACACATCCAG GGAGCCTTAA
ACTTATATAG TCAGGAAGAA CTGTTTAACT TCTTTCTGAA GAAGCCCATC GTCCCTTTGG
ACACCCAGAA GAGAATAATC ATCGTGTTCC ACTGTGAATT CTCCTCAGAG AGGGGCCCCC
GAATGTGCCG CTGTCTGCGT GAAGAGGACA GGTCTCTGAA CCAGTATCCT GCATTGTACT
ACCCAGAGCT ATATATCCTT AAAGGCGGCT ACAGAGACTT CTTTCCAGAA TATATGGAAC
TGTGTGAACC ACAGAGCTAC TGCCCTATGC ATCATCAGGA CCACAAGACT GAGTTGCTGA
GGTGTCGAAG CCAGAGCAAA GTGCAGGAAG GGGAGCGGCA GCTGCGGGAG CAGATTGCCC
TTCTGGTGAA GGACATGAGC CCATGA
3 - Détermination de l'activité de la protéine de fusion MBP-Cdc25C
L'activité phosphatase de la. protéine MBP-Cdc25C est évaluée par un essai de déphosphorylation du phosphate de 3-O-méthylfluorescéine (OMFP) avec 2o détermination de l'absorbance à 477 nm (DO 477 nm) du produit de la réaction (OMF).
La protéine MBP-Cdc25C, conservée dans le tampon d'élution (le même que celui décrit au paragraphe 2.3), est diluée à la concentration de 20 nM dans le tampon de réaction phosphatase (50 mM Tris-HCl pH 8,2 ; 50 mM NaCI ; 1 mM DTT ; 20%
glycérol), à température ambiante, dans un volume réactionnel total de 1 ml.
La réaction est initiée par l'ajout d'une solution 0,3 mM de OMFP (préparée extemporanément à
partir d'une solution stock 7,5 mM dans du DMSO 100% (Sigma #M2629)) et se déroule à 25 °C dans une cuve pour spectrophotométrie à usage unique en polystyrène (Fisher Scientific #A12-103-056). La DO 477 nm est mesurée après 90 min. La référence pour la mesure d'absorbance est constituée par le tampon de réaction contenant 0,3 mM d'OMFP, sans protéine MBP-Cdc25C, au temps t0 de la réaction.
Un exemple représentatif des résultats d'une telle détermination d'activité est illustré par la Figure 2.
B / Protéines____de_____fusion____MBP-~dç25B1_,____MBP-Çdç25B2_____et MBP-Cdc25B3 1 - Construction du vecteur d'expression pour MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 1. 1 - Principe du système utilisé.
Le système utilisé (New England Biolabs #800 - pMALTM protein fusion et système de purification) est basé sur la production d'une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt, ici la protéine Cdc25B humaine, et la protéine bactérienne MBP
(Maltose-Binding Protein) d'Escherichia coli. Cette méthode permet de purifier en une étape la l0 protéine de fusion grâce à l'affinité de la MBP pour le maltose.
1.2 - Origine de l'ADNc de Cdc25B
L'ADN codant pour les trois variants d'épissage de la phosphatase CDC25B
humaine correspond aux numéros d'accession : M81934 et 268092.
1.3 - Construction des vecteurs pMAL - Hs Cdc25B
Les différences entre les ADN des 3 variants de Cdc25B concernent deux exons codant des domaines de 14 et 42 acides aminés localisés dans la région régulatrice de la molécule (Baldin et coll., Oncogene (1997), 14, 2485-2490) et n'affectant pas ses régions 5' et 3'. La stratégie de clonage utilisée pour ces trois variants est donc identique.
Les ADNc de Cdc25B sous la forme d'inserts NdeI(Klenow) / BamHl ont été
introduits dans le vecteur pMALTM-C2X (New England Biolabs, ;#800-76) au site EcoRl (Klenow) / BamHl pour donner respectivement les vecteurs pMAL-Hs Cdc25B1, pMAL-Hs Cdc25B2 et pMAL-Hs Cdc25B3. Ces vecteurs permettent la production des protéines de fusion MBP-Cdc25B1 (962 acides aminés), MPB-Cdc25B2 (933 acides aminés) et MBP-Cdc25B3 (974 acides aminés) à partir du promoteur bactérien Ptac inductible par l'isopropylthiogalactoside (IPTG).
La séquence SEQ. ID. n° 6 de la protéine Hs Cdc25B 1 avec ses extrémités de restriction NdeI et BamHl est la suivante CATATGGAGG TGCCCCAGCCGGAGCCCGCGCCAGGCTCGGCTCTCAGTCC AGCAGGCGTG
TGCGGTGGCG CCCAGCGTCCGGGCCACCTCCCGGGCCTCCTGCTGGGATC TCATGGCCTC
S CTGGGGTCCC CGGTGCGGGCGGCCGCTTCCTCGCCGGTCACCACCCTCAC CCAGACCATG
CACGACCTCG CCGGGCTCGGCAGCCGCAGCCGCCTGACGCACCTATCCCT GTCTCGACGG
GCATCCGAAT CCTCCCTGTCGTCTGAATCCTCCGAATCTTCTGATGCAGG TCTCTGCATG
GATTCCCCCA GCCCTATGGACCCCCACATGGCGGAGCAGACGTTTGAACA GGCCATCCAG
GCAGCCAGCC GGATCATTCGAAACGAGCAGTTTGCCATCAGACGCTTCCA GTCTATGCCG
GGCCGGAGGA AGAGCGAGGCGGGCAGTGGAGCTGCCAGCAGCTCTGGGGA AGACAAGGAG
AATGATGGAT TTGTCTTCAAGATGCCATGGAAGCCCACACATCCCAGCTC CACCCATGCT
CTGGCAGAGT GGGCCAGCCGCAGGGAAGCCTTTGCCCAGAGACCCAGCTC GGCCCCCGAC
CTGATGTGTC TCAGTCCTGACCGGAAGATGGAAGTGGAGGAGCTCAGCCC CCTGGCCCTA
ATCCTAGAGA GTGACTTAAAGGATGATGATGCAGTTCCCCCAGGCATGGA GAGTCTCATT
AGTGCCCCAC TGGTCAAGACCTTGGAAAAGGAAGAGGAAAAGGACCTCGT CATGTACAGC
AAGTGCCAGC GGCTCTTCCGCTCTCCGTCCATGCCCTGCAGCGTGATCCG GCCCATCCTC
AAGAGGCTGG AGCGGCCCCAGGACAGGGACACGCCCGTGCAGAATAAGCG GAGGCGGAGC
AAATCACTGT GTCACGATGAGATCGAGAACCTCCTGGACAGTGACCACCG AGAGCTGATT
GGAGATTACT CTAAGGCCTTCCTCCTACAGACAGTAGACGGAAAGCACCA AGACCTCAAG
TACATCTCAC CAGAAACGATGGTGGCCCTATTGACGGGCAAGTTCAGCAA CATCGTGGAT
AAGTTTGTGA TTGTAGACTGCAGATACCCCTATGAATATGAAGGCGGGCA CATCAAGACT
CCCTGTAGCC TGGACAAGAGAGTCATCCTCATTTTCCACTGTGAATTCTC ATCTGAGCGT
GGGCCCCGCA TGTGCCGTTTCATCAGGGAACGAGACCGTGCTGTCAACGA CTACCCCAGC
CTCTACTACC CTGAGATGTATATCCTGAAAGGCGGCTACAAGGAGTTCTT CCCTCAGCAC
CCGAACTTCT GTGAACCCCAGGACTACCGGCCCATGAACCACGAGGCCTT CAAGGATGAG
TGTAGCCGGC TGCAGGACCAGTGAGGGGCCTGCGCCAGTCCTGCTACCTC CCTTGCCTTT
CGAGGCCTGA AGCCAGCTGCCCTATGGGCCTGCCGGGCTGAGGGCCTGCT GGAGGCCTCA
GGTGCTGTCC ATGGGAAAGATGGTGTGGTGTCCTGCCTGTCTGCCCCAGC CCAGATTCCC
CTGTGTCATC CCATCATTTTCCATATCCTGGTGCCCCCCACCCCTGGAAG AGCCCAGTCT
GCTTCTTGTT TCCTTGTTAGGGTTAACCCTTCATCTTCCTGTGTCCTGAA ACGCTCCTTT
GTGTGTGTGT CAGCTGAGGATCC
(les sites NdeI et BamHl sont soulignés en continu) La séquence SEQ. ID. n° 7 de la protéine Hs Cdc25B2 avec ses extrémités de restriction NdeI et BamHl est la suivante CATATGGAGG TGCCCCAGCCGGAGCCCGCGCCAGGCTCGGCTCTCAGTCC AGCAGGCGTG
TGCGGTGGCG CCCAGCGTCCGGGCCACCTCCCGGGCCTCCTGCTGGGATC TCATGGCCTC
CTGGGGTCCC CGGTGCGGGCGGCCGCTTCCTCGCCGGTCACCACCCTCAC CCAGACCATG
CACGACCTCG CCGGGCTCGGCAGCGAAACCCCAAAGAGTCAGGTAGGGAC CCTGCTCTTC
CGCAGCCGCA GCCGCCTGACGCACCTATCCCTGTCTCGACGGGCATCCGA ATCCTCCCTG
TCGTCTGAAT CCTCCGAATCTTCTGATGCAGGTCTCTGCATGGATTCCCC CAGCCCTATG
CGAAACGAGC AGTTTGCCATCAGACGCTTCCAGTCTATGCCGGATGGATT TGTCTTCAAG
ATGCCATGGA AGCCCACACATCCCAGCTCCACCCATGCTCTGGCAGAGTG GGCCAGCCGC
AGGGAAGCCT TTGCCCAGAGACCCAGCTCGGCCCCCGACCTGATGTGTCT CAGTCCTGAC
CGGAAGATGG AAGTGGAGGAGCTCAGCCCCCTGGCCCTAGGTCGCTTCTC TCTGACCCCT
GATGATGATG CAGTTCCCCCAGGCATGGAGAGTCTCATTAGTGCCCCACT GGTCAAGACC
TTGGAAAAGG AAGAGGAAAAGGACCTCGTCATGTACAGCAAGTGCCAGCG GCTCTTCCGC
TCTCCGTCCA TGCCCTGCAGCGTGATCCGGCCCATCCTCAAGAGGCTGGA GCGGCCCCAG
GACAGGGACA CGCCCGTGCAGAATAAGCGGAGGCGGAGCGTGACCCCTCC TGAGGAGCAG
ATCGAGAACC TCCTGGACAGTGACCACCGAGAGCTGATTGGAGATTACTC TAAGGCCTTC
CTCCTACAGA CAGTAGACGGAAAGCACCAAGACCTCAAGTACATCTCACC AGAAACGATG
GTGGCCCTAT TGACGGGCAAGTTCAGCAACATCGTGGATAAGTTTGTGAT TGTAGACTGC
AGATACCCCT ATGAATATGAAGGCGGGCACATCAAGACTGCGGTGAACTT GCCCCTGGAA
GTCATCCTCA TTTTCCACTGTGAATTCTCATCTGAGCGTGGGCCCCGCAT GTGCCGTTTC
ATCAGGGAAC GAGACCGTGCTGTCAACGACTACCCCAGCCTCTACTACCC TGAGATGTAT
ATCCTGAAAG GCGGCTACAAGGAGTTCTTCCCTCAGCACCCGAACTTCTG TGAACCCCAG
GACTACCGGC CCATGAACCACGAGGCCTTCAAGGATGAGCTAAAGACCTT CCGCCTCAAG
TGAGGGGCCT GCGCCAGTCC'TGCTACCTCCCTTGCCTTTCGAGGCCTGAA GCCAGCTGCC
CTATGGGCCT GCCGGGCTGAGGGCCTGCTGGAGGCCTCAGGTGCTGTCCA TGGGAAAGAT
GGTGTGGTGT CCTGCCTGTCTGCCCCAGCCCAGATTCCCCTGTGTCATCC CATCATTTTC
CATATCCTGG TGCCCCCCACCCCTGGAAGAGCCCAGTCTGTTGAGTTAGT TAAGTTGGGT
GTTAACCCTT CATCTTCCTGTGTCCTGAAACGCTCCTTTGTGTGTGTGTC AGCTGAGGAT
CC
(les sites NdeI et BamHl sont soulignés en continu) La séquence SEQ. ID. n° 8 de la protéine Hs Cdc25B3 avec ses extrémités de restriction NdeI et BamHl est la suivante CATATGGAGG TGCCCCAGCCGGAGCCCGCGCCAGGCTCGGCTCTCAGTCC AGCAGGCGTG
TGCGGTGGCG CCCAGCGTCCGGGCCACCTCCCGGGCCTCCTGCTGGGATC TCATGGCCTC
CTGGGGTCCC CGGTGCGGGCGGCCGCTTCCTCGCCGGTCACCACCCTCAC CCAGACCATG
CACGACCTCG CCGGGCTCGGCAGCGAAACCCCAAAGAGTCAGGTAGGGAC CCTGCTCTTC
CGCAGCCGCA GCCGCCTGACGCACCTATCCCTGTCTCGACGGGCATCCGA ATCCTCCCTG
TCGTCTGAAT CCTCCGAATCTTCTGATGCAGGTCTCTGCATGGATTCCCC CAGCCCTATG
CGAAACGAGC AGTTTGCCATCAGACGCTTCCAGTCTATGCCGGTGAGGCT GCTGGGCCAC
AGCCCCGTGC TTCGGAACATCACCAACTCCCAGGCGCCCGACGGCCGGAG GAAGAGCGAG
GCGGGCAGTG GAGCTGCCAGCAGCTCTGGGGAAGACAAGGAGAATGATGG ATTTGTCTTC
AAGATGCCAT GGAAGCCCACACATCCCAGCTCCACCCATGCTCTGGCAGA GTGGGCCAGC
GACCGGAAGA TGGAAGTGGAGGAGCTCAGCCCCCTGGCCCTAGGTCGCTT CTCTCTGACC
CCTGCAGAGG GGGATACTGAGGAAGATGATGGATTTGTGGACATCCTAGA GAGTGACTTA
AAGGATGATG ATGCAGTTCCCCCAGGCATGGAGAGTCTCATTAGTGCCCC ACTGGTCAAG
ACCTTGGAAA AGGAAGAGGAAAAGGACCTCGTCATGTACAGCAAGTGCCA GCGGCTCTTC
CAGGACAGGG ACACGCCCGTGCAGAATAAGCGGAGGCGGAGCGTGACCCC TCCTGAGGAG
CAGCAGGAGG CTGAGGAACCTAAAGCCCGCGTCCTCCGCTCAAAATCACT GTGTCACGAT
GAGATCGAGA ACCTCCTGGACAGTGACCACCGAGAGCTGATTGGAGATTA CTCTAAGGCC
TTCCTCCTAC AGACAGTAGACGGAAAGCACCAAGACCTCAAGTACATCTC ACCAGAAACG
TGCAGATACC CCTATGAATATGAAGGCGGGCACATCAAGACTGCGGTGAA CTTGCCCCTG
GAACGCGACG CCGAGAGCTTCCTACTGAAGAGCCCCATCGCGCCCTGTAG CCTGGACAAG
AGAGTCATCC TCATTTTCCACTGTGAATTCTCATCTGAGCGTGGGCCCCG CATGTGCCGT
TTCATCAGGG AACGAGACCGTGCTGTCAACGACTACCCCAGCCTCTACTA CCCTGAGATG
CAGGACTACC GGCCCATGAACCACGAGGCCTTCAAGGATGAGCTAAAGAC CTTCCGCCTC
AAGACTCGCA GCTGGGCTGGGGAGCGGAGCCGGCGGGAGCTCTGTAGCCG GCTGCAGGAC
CAGTGAGGGG CCTGCGCCAGTCCTGCTACCTCCCTTGCCTTTCGAGGCCT GAAGCCAGCT
GCCCTATGGG CCTGCCGGGCTGAGGGCCTGCTGGAGGCCTCAGGTGCTGT CCATGGGAAA
TTCCATATCC TGGTGCCCCCCACCCCTGGAAGAGCCCAGTCTGTTGAGTT AGTTAAGTTG
GGTTAATACC AGCTTAAAGGCAGTATTTTGTGTCCTCCAGGAGCTTCTTG TTTCCTTGTT
AGGGTTAACC -CTTCATCTTC CTGTGTCCTG AAACGCTCCT TTGTGTGTGT GTCAGCTGAG
GATCC
(les sites NdeI et BamHl sont soulignés en continu) 1.4 - Création des souches JM109/pMAL-Cdc25B1, B2 et B3 Les vecteurs pMAL-Cdc25B1-3 ont chacun été introduits dans la souche d'Escherichia coli JM109 (Stratagene #200271). Les colonies ont été sélectionnées sur la base de leur capacité à produire une protéine de fusion après culture en présence d'IPTG.
L'identité
des protéines a été vérifiée par immunodétection avec des anticorps polyclonaux dirigés contre Cdc25B.
1o Les ADN plasmidiques isolés de ces trois clones ont été séquencés dans la région correspondant à Cdc25B. Les séquences suivantes ont été obtenues (la partie doublement soulignée correspond à l'ORF de MBP et la partie soulignée en pointillés à
l'ORF de Cdc25B1, Cdc25B2 ou Cdc25B3) ~ SEQ. ID n° 9 (pMAL-MsCdc25Bl) ATGAAAACTGAAGAAGGTAA TGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGT
ACTGGTAATC
CTCGCTGAAGTCGGTAAGAA GATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCAT
ATTCGAGAAA
CCGGATAAACTGGAAGAGAA GTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATT
ATTCCCACAG
ATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATC
ACCCCGGACA GGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTAC
AAGCGTTCCA
AACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCG
CTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAA CGACATTAAA
ACGGCAAGTA
GACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAA
ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACA AAAAGAGTTC
AAGAGCTGGC
CTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGA TATTGCCGCC
AAGATCCACG
ACCATGGAAA ATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTC
ACGCCCAGAA
AGGTGAAATC
TGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAA
GCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAAC
AACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCCATATGG__AGGTGCCA__GGGAG~~
GGCAGGCT..GGCTCTAG__TCAGAGGC__GTGTGGGTG__ GGCAGCG__TCGGG~A
CT~CCGGGCC__T~CTGCTGGG__ATCTCATGG~__CTCCTGGGGT__CCCCGGTGCG__GGCGGGT
TCCTCGGG__TCAA~CCT__CA~AGACC__ATGA~GACC__TGGGGCT_ _CGGAGCCGC
AGCCGCCTGA_CGCATATC__CCTGTCTGA__CGGGCATG__AAT~T~CCT__GTCGTCTGAA
T~CT~GAAT__CTTCTGATGC__AGGT~TCTGC__ATGGATTCCC__~AGCCCTAT__GGA~~CAC
ATGGCGGAGC__AGAGTTTGAACAGGAT__CAGGCAGA__GCCGGATCAT__TCGAAAGAG
_ CAGTTTGCA TAGACGCTT__~~AGTCTATG__CCGGTGAGGC__TGCTGGGCCA__CAGCCCCGTG
_ ~TTCGGAA~ATCA~AACTC__CCAGGGCCC__GACGG~CGGA__GGAAGAGCGA__GGGGGAGT
_ GGAGCTGA_ GCAG~T~TGG__GGAAGA~AAG__GAGAATGATG__GATTTGTCTT__CAAGATGA
TGGAAGCCCACACAT~AG__CTCCAAT__GCTCTGGAG__AGTGGG~CAG__CCGCAGGGAA
_ GCCTTTGCC__AGAGACCCAG__ CTGG~CC__GACCTGATGT__GTTCAGTCC__TGAGGAAG
ATGGAAGTGG__AGGAGTCAG__ CCCCTGGCC__CTAGGT~GCT__TCT~TCTGAC__CCTGCAGAG
GGGGATACTG_AGGAAGATGA__ TGGATTTGTG__ GAC_AT _ AGAGTGACTT_AAAGGATGAT
_ ~ CTAG_ _ GATGAGTTC__CCAGGCAT__GGAGAGTCTC__ATTAGTGCCC__~ACTGGTCAA__GA~TTGGAA
AAGGAAGAGG__AAAAGGACCT.. ~GTCATGTAC__AG~AAGTGC__AGCGGCTTT__CCGCTCT~~G
TCCATGCCT__ GCAGCGTGAT__ GG~C~ATC__ CTAAGAGGC__TGGAGCGG__CCAGGAAGG
GACACGC~CG__ TGCAGAATAA__GGGAGGCGG__AGGTGACCC__CTCCTGAGGA__GCAGCAGGAG
GCTGAGGAAC__ CTAAAGCCG__ CGTTGC__ TCAAAATCAC__ TGTGTCACGA__ TGAGATCGAG
AACCTCCTGG__ACAGTGA~CA__CCGAGAG~TG__ATTGGAGATT__ACTCTAAGG__~TT~TTA
~AGACAGTAG__ACGGAAAGCA_~CAAGACCT__AAGTACAT~T__CACAGAAAC__GATGGTGG~
TATTGACGG__ GCAAGTTCAG__ CAACATCGTG__ GATAAGTTTG__ TGATTGTAGA__ CTGAGATA~
~TATGAAT_ _ ATGAAGGCGG__ GCACATCAAG__A~TGCGGTGA__ACTTGCCCCT__GGAAGGA
GGAGAGCT_ _ TCCTA~TGAA__ GAGCCCCATC__GGCCTGTA__GCCTGGACAA__GAGAGT~AT
CTCATTTTCC__ACTGTGAATT__CTCATCTGAG__GTGGGCCC__GCATGTGCCG__TTT~ATAGG
GAACGAGACC__ GTGCTGTCAA__ CGACTACCCC__AGCCTCTACT__AC~TGAGAT._GTATAT~TG
AAAGGCGGCT__ ACAAGGAGTT._ CTTCCCTCAG__ CACC _ TTGTGAACC_ CCAGGA~TA~
CGAACT_ _ CGGCCCATGA_AACGAGGC__CTTCAAGGAT__GAGCTAAAGA__CTTCCGCT__CAAGAT~G~
AGCTGGGCTG__ GGGAGCGGAG__ CCGGCGGGAG__ CTCTGTAGC__ GGCTGAGGA__ CCAGTGAGGG
GCCTGCGCCAGTCCTGCTACCTCCCTTGCCTTTCGAGGCCTGAAGCCAGCTGCCCTATGG
GCCTGCCGGGCTGAGGGCCTGCTGGAGGCCTCAGGTGCTGTCCATGGGAAAGATGGTGTG
GTGTCCTGCCTGTCTGCCCCAGCCCAGATTCCCCTGTGTCATCCCATCATTTTCCATATC
CTGGTGCCCCCCACCCCTGGAAGAGCCCAGTCTGTTGAGTTAGTTAAGTTGGGTTAATAC
CAGCTTAAAGGCAGTATTTTGTGTCCTCCAGGAGCTTCTTGTTTCCTTGTTAGGGTTAAC
CCTTCATCTTCCTGTGTCCTGAAACGCTCCTTTGTGTGTGTGTCAGCTGAGGATCC
~ SEQ. ID n ° 10 (pMAL-HsCdc25B2) ATGAAAACTGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGT
CTCGCTGAAGTCGGTAAGAA GATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCAT
ATTCGAGAAA
CCGGATAAACTGGAAGAGAA GTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATT
ATTCCCACAG
ATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATC
ACCCCGGACA GGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTAC
AAGCGTTCCA
AACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCG
CTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAA CGACATTAAA
ACGGCAAGTA
GACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAA
ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACA AAAAGAGTTC
AAGAGCTGGC
CTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGA TATTGCCGCC
AAGATCCACG
ACCATGGAAA ATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTC
ACGCCCAGAA
AGGTGAAATC
TGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAA
GCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAAC
AACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCCATATGG__AGGTG~~A__GGGAG~~
GCGCCAGGCT__ CGGCTCTCAG__TCCAGCAGG__GTGTGGGTG__GCG~~AGG__TGGG~A~
CTC~GGGC_ _ TCTGCTGGG__ATCTATGGC__ CTCCTGGGGT__CC~GGTGG__GGGG~~GT
TÇCTëGCÇGG__ TCACCACCCT__ CACÇëAGACC__ATGÇA~GACC__TÇG~~GGG~T__ëGG~AG~GAA
AëCCCAAAGA_GTëAGGTAGG__GAÇëCTGCTC__TTCÇGCAGCC__GCAGCCGëëT__GA~G~AëëTA
TCCCTGTCTC__ GACGGGÇATC__ CGAATCCTCC__CTGTCGTCTG__AATCCT~~GA_.ATëTT~TGAT
GCAGGTCTCT__ GCATGGATTC__ CCCCAGCCCT__ATGGACCÇCë__ACATGG~GGA__G~AGA~GTTT
GAACAGGCCA TCCAGGCAGC__CAGCCGGATC__ATTCGAAACG__AGCAGTTTGë__~ATëAGAëG~
TTCCAGTCTA _ TGCCGGATGG__ATTTGTCTTC__AAGATGCCAT__GGAAGC~~A~__A~ATëë~AG~
TCCACCCATG__CTCTGGCAGA__GTGGGCCAGC__CGÇAGGGAAG__CCTTTGC~~A__GAGAë~ëAG~
TCGGCCCCCG__ ACCTGATGTG__ TCTCAGTCCT__GACCGGAAGA__TGGAAGTGGA__GGAG~T~AG~
CCCCTGGCCC TAGGTCGCTT__CTCTCTGACC__CCTGCAGAGG__GGGATA~TGA__GGAAGATGAT
GGATTTGTGG _ACATCCTAGA_ _ GAGTGACTTA_ _ AAGGATGATG_ _ATGCAGTT~ Ç _ _ ëë
~AGG~ATG
GAGAGTCTCA TTAGTGCCCC__ACTGGTCAAG__ACCTTGGAAA__AGGAAGAGGA__AAAGGA~~T~
GTCATGTACA GCAAGTGCCA__GCGGCTCTTC__CGCTCTCCGT__CCATGCCCTG__~AGCGTGATë
CGGCCCATCC __TCAAGAGGCT__ GGAGCGGCCC__ CAGGACAGGG__ACACGëë~GT__G~AGAATAAG
CGGAGG~GGA_ _ GCGTGACë ëë_ _ TëëTGAGGAG_ _ CAGCAGGAGG_ _ ~TGAGGAA~~ _ _ TAAAGCCÇGC
GTëCTCCGÇT__ ëAAAATCAëT..GTGTÇAëGAT__GAGATCGAGA__AëëT~ëTGGA__~AGTGAÇëA~
CGAGAGCTGA _ TTGGAGATTA__ CTCTAAGGCë__TTëëT~~TAC__AGAÇAGTAGA._ÇGGAAAGCAC
~AAGACCTÇA _AGTA~ATCTC__ACCAGAAA~G__ATGGTGGCCÇ__TATTGA~GGG__ëAAGTTCAGC
AACATCGTGG ATAAGTTTGT GATTGTAGAC TGCAGATACC CCTATGAATA TGAAGGCGGG
CACATCAAGA CTGCGGTGAA CTTGCCCCTG GAACGCGACG CCGAGAGCTT CCTACTGAAG
AGCCCCATCG CGCCCTGTAG CCTGGACAAG AGAGTCATCC TCATTTTCCA CTGTGAATTC
TëATCTGAGC__ GTGGGCÇëCG__ ÇATGTGë~GT__TTCATCAGGG__AAëGAGA~CG__TGCTGTCAAÇ
GACTACCCCA_GC~TCTACTA_CCCTGAGATG__TATATCCTGA__AAGG~GG~TA._~AAGGAGTTC
TTCCCTCAGC ACCCGAACTT CTGTGAACCC CAGGACTACC GGCCCATGAA CCACGAGGCC
TTCAAGGATG AGCTAAAGAC CTTCCGCCTC AAGACTCGCA GCTGGGCTGG GGAGCGGAGC
CGGCGGGAGC TCTGTAGCCG GCTGCAGGAC CAGTGAGGGG CCTGCGCCAG TCCTGCTACC
TCCCTTGCCT TTCGAGGCCT GAAGCCAGCT GCCCTATGGG CCTGCCGGGC TGAGGGCCTG
CTGGAGGCCT CAGGTGCTGT CCATGGGAAA GATGGTGTGG TGTCCTGCCT GTCTGCCCCA
GCCCAGATTC CCCTGTGTCA TCCCATCATT TTCCATATCC TGGTGCCCCC CACCCCTGGA
AGAGCCCAGT CTGTTGAGTT AGTTAAGTTG GGTTAATACC AGCTTAAAGG CAGTATTTTG
TGTCCTCCAG GAGCTTCTTG TTTCCTTGTT AGGGTTAACC CTTCATCTTC CTGTGTCCTG
AAACGCTCCT TTGTGTGTGT GTCAGCTGAG GATCC
~ SEQ. ID n° 1l (pMAL-HsCdc25B3) ATGAAAACTGAAGAAGGTAA TGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGT
ACTGGTAATC
CTCGCTGAAGTCGGTAAGAA TTAAAGTCACCGTTGAGCAT
ATTCGAGAAA
GATACCGGAA
CCGGATAAACTGGAAGAGAA GTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATT
ATTCCCACAG
ATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATC
ACCCCGGACA GGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTAC
AAGCGTTCCA
AACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCG
CTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAA CGACATTAAA
ACGGCAAGTA
GACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAA
ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACA AAAAGAGTTC
AAGAGCTGGC
CTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGA TATTGCCGCC
AAGATCCACG
ACCATGGAAA ATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTC
ACGCCCAGAA
AGGTGAAATC
TGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAA
GCCCTGAAAG TAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAAC
ACGCGCAGAC
AACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCCATATGGAGGTGCCCCAGCCGGAGCCC
GCGCCAGGCTCGGCTCTCAGTCCAGCAGGCGTGTGCGGTGGCGCCCAGCGTCCGGGCCAC
CT~GGGCC__T~CTGCTGGG__ATTCATGG__TTGGGGT_ _~CCGGTGCG__GGGGGCT
T~TCGCGG__TCAACCT__CACCCAGA~__ATGA~GACC__TCGCGGG~T._~GGAGCGAA
ACCCCAAAGAGTCAGGTAGGGACCCTGCTCTTCCGCAGCCGCAGCCGCCTGACGCACCTA
T~CCTGT~TC_GACGGGCATC__CGAATCT~~__CTGTCGTCTG__AATT~~GA__ATTTCTGAT
_ GCAGGTCTCTGCATGGATTCCCCCAGCCCTATGGACCCCCACATGGCGGAGCAGACGTTT
TTCCAGTCTATGCCGGTGAGGCTGCTGGGCCACAGCCCCGTGCTTCGGAACATCACCAAC
TCCCAGGCGCCCGACGGCCGGAGGAAGAGCGAGGCGGGCAGTGGAGCTGCCAGCAGCTCT
GGGGAAGACAAGGAGAATGATGGATTTGTCTTCAAGATGCCATGGAAGCCCACACATCCC
AGCTCCACC__ATGCT~TGGC__AGAGTGGG~__AGCGCAGGG__AAGCTTTG__CCAGAGACC
15AGCTCGGC__CCGA~TGAT__GTGTCTAGT__~CTGACCGGA_.AGATGGAAGT__GGAGGAGT
AGCCCCCTGGCCCTAGGTCGCTTCTCTCTGACCCCTGCAGAGGGGGATACTGAGGAAGAT
GATGGATTTG__TGGACAT~CT__AGAGAGTGA__TTAAAGGATG__ATGATGCAGT__TCCCAGGC
ATGGAGAGTC__TATTAGTGC__ CCCACTGGT~__AAGACCTTGG__AAAAGGAAGA__GGAAAAGGAC
TGTCATGT__A~AGCAAGTG__ CCAGCGGCTC__TT~GTCTC__CGTCATG__CTGCAGGTG
20AT~GGCCCA_TT~AAGAG__GCTGGAGCGG__~CAGGACA__GGGAAGCC__CGTGCAGAAT
AAGCGGAGGCGGAGCGTGACCCCTCCTGAGGAGCAGCAGGAGGCTGAGGAACCTAAAGCC
CGCGTCCTC__ GCTCAAAATC__ACTGTGTAC__GATGAGATG__AGAACCTCT__GGACAGTGA~
CACCGAGAGC__ TGATTGGAGA__ TTACTCTAAG__ GCCTTCT_ TACAGACAGT_AGACGGAAAG
C_ _ ACCAAGA_ _ TAAGTAAT__ CTCACCAGAA__ ACGATGGTGG__ ~~TATTGAC_GGGCAAGTTC
_ 25AGCAACATCG__TGGATAAGTT__TGTGATTGTA__GACTGCAGAT__ACCCCTATGA__ATATGAAGG~
GGGCAATA _AGACTG~GGT__ GAACTTGC~__ CTGGAAGCG__ACGCCGAGAG__CTTCCTA~TG
AAGAG~CA _TCGCG~CTG__TAGCTGGAC__AAGAGAGTCA__TCCTCATTTT__CCACTGTGAA
TTT~ATTG_ _ AGCGTGGGCC__ GATGTGC__ CGTTTCATCA__GGGAAGAGA__CCGTGTGTC
AACGACTACCCCAGCCTCTACTACCCTGAGATGTATATCCTGAAAGGCGGCTACAAGGAG
30TTCTTCCCTC__AGCACCGAA__TTTGTGAA__CCAGGACT__ACCGG~CCAT__GAACACGAG
GCCTTCAAGGATGAGCTAAAGACCTTCCGCCTCAAGACTCGCAGCTGGGCTGGGGAGCGG
AGCCGGCGGGAGCTCTGTAGCCGGCTGCAGGACCAGTGAGGGGCCTGCGCCAGTCCTGCT
ACCTCCCTTGCCTTTCGAGGCCTGAAGCCAGCTGCCCTATGGGCCTGCCGGGCTGAGGGC
CTGCTGGAGGCCTCAGGTGCTGTCCATGGGAAAGATGGTGTGGTGTCCTGCCTGTCTGCC
GGAAGAGCCCAGTCTGTTGAGTTAGTTAAGTTGGGTTAATACCAGCTTAAAGGCAGTATT
TTGTGTCCTCCAGGAGCTTCTTGTTTCCTTGTTAGGGTTAACCCTTCATCTTCCTGTGTC
CTGAAACGCTCCTTTGTGTGTGTGTCAGCTGAGGATCC
Ces clones sont conservés à - 80 °C sous forme de culture saturée additionnée de glycérol (concentration imale 25%). Ces souches sont ensuite utilisées pour toutes les étapes de production ultérieures.
2 - Production et purification des protéines recombinantes s MBP-Cdc25B1, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 Les protéines recombinantes MBP-Cdc25B1, B2 et B3 sont produites exactement comme cela est décrit pour MBP-Cdc25C.
Les séquences SEQ. ID n° 12, SEQ. ID n° 13 et SEQ. ID
n° 14 sont obtenues respectivement pour les protéines de fusion MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et l0 MBP-Cdc25B3:
~ SEQ. ID n ° 12 (MBP-Cdc25Bl) ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT
CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
1s ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG
GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA
GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT
CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC
ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC
TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA
AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG_.AGGTGCCCCA__GCCGGAGCCC
GCGCCAGGCT._ CGGCTCTCAG_.TÇCAGCAGGC__GTGTGCGGTG__GCGCCCAGCG__TCCGGG~~A~
CTCCCGGGCC TCCTGCTGGG__ATCTCATGGC__CTCCTGGGGT__CCCCGGTGCG__GGCGGCÇGëT
WO 01/44467 _ 2g _ PCT/FR00/03496 T~CTÇG~~GG__ T~AÇ~ACÇëT.. ëAëëCAGA~C__ATG~ACGAÇ~__T~GëëGGGëT._ëGG~AGë~G~
AGCÇGëCTGA . ÇGCAë~TATë__ ÇëTGTCTÇGA__ CGGGëATC~G_ _AATëëT~ë~T_.GT~GT~TGAA
TCCTë~GAAT_. ÇTTCTGATGC__AGGTëTCTGC__ATGGATTCCC._~ëAG~~~TAT__GGAëëë~~Aë
ATGGCGGAGÇ _AGAÇGTTTGA._AëAGGCCATC._CAGGÇAGCÇA__GëëGGATëAT__TëGAAA~GAG
CAGTTTGCCA_TCAGA~G~TT__CCAGT~TATG__C~GGTGAGGC_.TGëTGGG~ëA__ëAGëëë~GTG
ëTTCGGAAëA _TÇACCAACTÇ__CëAGGCGCÇë__GACGGCCGGA__GGAAGAG~GA._GGëGGG~AGT
GGAGCTGCCA _GCAGëTëTGG__GGAAGA~AAG_.GAGAATGATG__GATTTGT~TT__~AAGATG~ëA
TGGAAGÇÇ~A _ CAëATCCCAG__ ÇT~ëACCÇAT__GCTëTGGCAG__AGTGGGCCAG__ëëG~AGGGAA
GÇ~TTTGCÇC._ AGAGA~CCAG__ CT~GGCCCCë._ GACCTGATGT__GTëTëAGT~ë_ _TGA~~GGAAG
ATGGAAGTGG._AGGAG~T~AG__CCÇëCTGGCC__CTAGGT~GCT._T~TëTëTGA~__ëëëTG~AGAG
GGGGATACTG_. AGGAAGATGA__ TGGATTTGTG__ GACATCÇTAG_ _AGAGTGA~TT__AAAGGATGAT
GATGCAGTTC_, CCCÇAGG~AT__GGAGAGTCTC_.ATTAGTGCCë__ëA~TGGTëAA__GAëëTTGGAA
AAGGAAGAGG__ AAAAGGACCT__ CGTÇATGTAC_.AGCAAGTGCC__AG~GG~TëTT_.ëëGëTëTëëG
TëCATGÇCÇT__ GCAGëGTGAT__ CCGGCCCATÇ__ CTCAAGAGGë__TGGAGCGGÇC__ÇëAGGAëAGG
GACACGCëëG__TGCAGAATAA__GëGGAGGCGG__AGCGTGAC~C__CTCCTGAGGA__GëAG~AGGAG
GCTGAGGAAC_ _ CTAAAGCCCG_ _ CGT~CTCÇG~_ _ TCAAAATCAC_ _ TGTGTÇAëGA_ _TGAGATëGAG
AACCTCCTGG__ ACAGTGAëCA__ CCGAGAGCTG__ATTGGAGATT__ACTCTAAGGë__ëTTëëTëëTA
~AGACAGTAG_ _ ACGGAAAGëA_ _ C CAAGAC CT~.. AAGTAëATC T. _ ëAë ëAGAAA~ _ _ GATGGTGGë
ëTATTGACGG=_ GëAAGTTÇAG_ _ CAACAT~GTG_ _ GATAAGTTTG. _ TGATTGTAGA_. ~TG~AGATAë
Çë~TATGAAT__ATGAAGGÇGG__GCACATCAAG_.AëTGCGGTGA__ACTTGCCCCT__GGAA~GëGAë
GCCGAGAGÇT__ TCCTACTGAA__GAGCCCCATC__GCGëCCTGTA__GCÇTGGA~AA__GAGAGTëATë
CTCATTTTCë__ ACTGTGAATT__ CTCATCTGAG__ CGTGGGCCCC__GCATGTG~ëG__TTTëATëAGG
GAACGAGACC__ GTGCTGTCAA__ ÇGAëTACCCC__AGC~TCTACT__ACCÇTGAGAT__GTATATëëTG
AAAGGCGGCT_. ACAAGGAGTT__ CTTÇCCTCAG__ CACCëGAAÇT__TCTGTGAA~ë__ëëAGGAëTA~
CGGCCCATGA_ACCAÇGAGGC__CTTëAAGGAT__GAGëTAAAGA__CÇTTëëG~~T__~AAGA~TëGë
AGCTGGGÇTG__ GGGAGÇGGAG__ ÇCGGCGGGAG__ CTCTGTAGCC__GGÇTGëAGGA__~ëAGTGA
~ SEQ. ID n° 13 (MBP-Cdc25B2) ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT
CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT
ATCTTCTGGG CACACGACCG CT.TTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC
ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC
AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG
CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA
GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA
GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT
GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC
CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC
ACCATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC
TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA
GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC
AACCTCGGGA TCGAGGGAAG GATTTCAGAA TTCCATATGG__AGGTGCÇCÇA__G~ëGGAGë~~
GCGCëAGGÇT__ CGGëT~TCAG__TÇCAGÇAGGC__GTGTGCGGTG__GCGCCÇAGÇG__Të~GGG~ëAë
CTCCCGGGÇ~__ TCCTG~TGGG__ATCTÇATGGC__ CT~~TGGGGT__ CCCCGGTG~G__GG~GGëëGëT
TÇCTCGCÇGG__ TCAëCACCCT__ ÇAëCCAGACC__ATGCAëGACC__TCGÇëGGGëT__~GGëAGëGAA
AÇëCCAAAGA_GTÇAGGTAGG__GA~~CTGCTC__TTCCG~AGCC__GCAGëëGëëT__GAÇGëAëëTA
TÇ~CTGT~TC__ GAÇGGGCATC__ ÇGAATëCTCÇ__ ëTGTÇGTCTG__AATëëTëëGA__ATëTT~TGAT
GÇAGGTCTëT__ GCATGGATTC__ C~ëëAGëCCT__ATGGAëCCCC__AÇATGGëGGA__GëAGAëGTTT
GAAÇAGGCCA_TCCAGGëAGC__CAG~~GGATC__ATTCGAAACG__AGCAGTTTGë__ëATÇAGA~Gë
TTÇCAGTCTA_TGëCGGATGG__ATTTGT~TTC__AAGATGC~AT__GGAAG~ë~Aë__AëATë~ëAGë
TCCA~~CATG__CTCTGG~AGA__GTGGG~ÇAGC__ÇG~AGGGAAG__CCTTTG~~ëA__GAGAë~ëAG~
T~GGCÇ~CCG_ _ ACÇTGATGTG_ _ TCTCAGTCCT_ _ GACÇGGAAGA_ _ TGGAAGTGGA_ _ GGAGëTëAGë
ë~ëCTGG~~C_ _ TAGGTCGCTT_. ÇTCTCTGACC_ _ CCTGCAGAGG_ _ GGGATAëTGA_ _GGAAGATGAT
GGATTTGTGG_ _ ACATëCTAGA_ _ GAGTGACTTA_ _ AAGGATGATG_ _ATG~AGTTë~_ _ ë~ëAGG~ATG
GAGAGTCTëA_TTAGTGCCCC__A~TGGTCAAG__ACCTTGGAAA__AGGAAGAGGA._AAAGGAëëT~
GTCATGTACA_GCAAGTGCCA_GCGGCTCTTC__CGCTCTCCGT__CCATGCÇëTG__~AGëGTGATë
ëGGCCCATCC__ TCAAGAGGCT__ GGAGCGGCCÇ__ CAGGACAGGG__A~AÇGëë~GT__GëAGAATAAG
CGGAGG~GGA_GCGTGACCÇ~__TCCTGAGGAG__CAG~AGGAGG__CTGAGGAA~~__TAAAGëëëG~
GTCÇTÇ~GCT__ CAAAATCAÇT__GTGTÇACGAT__GAGATCGAGA__ACCTÇëTGGA__ëAGTGAëëAë
CGAGAGCTGA_TTGGAGATTA__CTCTAAGGCC__TTCCTëëTAC__AGAÇAGTAGA__ëGGAAAG~Aë
CAAGA~CTCA__AGTACA'T_'CTC__ACCAGAAACG__ATGGTGGëCC__TATTGA_C'_GGG__ëAAGTT~11G~
AACATCGTGG_ _ ATAAGTTTGT_ _ GATTGTAGAC_ _ TGCAGATACC_ _ CCTATGAATA_ _ TGAAGGëGGG
CACATCAAGA _ CTGCGGTGAA__ CTTGCCCCTG__GAACGCGACG__CCGAGAG~TT__ëëTAÇTGAAG
AGCCCCATCG__ ~GCCCTGTAG__ CCTGGACAAG__AGAGTCATCC__TCATTTTCCA__~TGTGAATT~
TCATCTGAGC__ GTGGGCCCCG__ CATGTGëëGT__ TTCATCAGGG__AACGAGA~~G__TG~TGTëAAÇ
GACTACCCCA_GCCTCTACTA__CCCTGAGATG__TATATCCTGA__AAGGCGG~TA__ëAAGGAGTT~
TTëCCTCAGC__ACCCGAACTT__ CTGTGAA~CC__CAGGAÇTACC__GGCCCATGAA__ÇëA~GAGG~~
TTCAAGGATG__AGCTAAAGAC__ CTTCCGCCTC__AAGACTÇGCA__GCTGGG~TGG__GGAG~GGAG~
CGGCGGGAGC TCTGTAGCCG GCTGCAGGAC CAGTGA
WO 01/44467 _ 3p _ PCT/FR00/03496 ~ SEQ. ID n° 14 (MBP-Cdc25B3) ATGAAAACTG TGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGT
AAGAAGGTAA
ACTGGTAATC
CTCGCTGAAG GATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCAT
TCGGTAAGAA
ATTCGAGAAA
CCGGATAAAC TGGAAGAGAA GTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATT
ATTCCCACAG
ATCTTCTGGG CACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATC
ACCCCGGACA GGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTAC
AAGCGTTCCA
AACGGCAAGC TGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAA
GATCTGCTGC CGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTG
AAAGCGAAAG GTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCG
ACGGCAAGTA
GACGTGGGCG TGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATT
AAAAACAAAC ACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAA
GGCGAAACAG CGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAA
GTGAATTATG GTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAA
ACCGTTCGTT
AAGAGCTGGC
CTCGAAAACT ATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTG
GGTGCCGTAG CGCTGAAGTCTTACGAGGAA TATTGCCGCC
GAGTTGGCGA
AAGATCCACG
ACCATGGAAA ATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTC
ACGCCCAGAA
AGGTGAAATC
TGGTATGCCG TGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAA
AACCTCGGGA TCGAGGGAAGGATTTCAGAA _AGGTGCA__GGGAGCCC
TTCCATATGG_ GCGAGGCT_ _ CGGTT~AG__TAG~AGGC__GTGTGCGGTG__G~GCCCAGCG__T~CGGGCA
CTCGGGCC_ _ TCCTG~TGGG__ATTATGGC__ CT~CTGGGGT__ CCCGGTGG__GG~GGCCGCT
T~T~GCCGG_ _ TCA~A~~CT__ CAAGACC__ATGCACGAC__TCGCCGGGT__CGGCAGCGAA
25A~AAAGA _GTAGGTAGG__GA~~TGCTC__TTGCAGCC__GCAGCG~CT__GACGCATA
TCTGTCTC_ _ GAGGGCATC_. GAATCCTCC__ TGTCGT~TG__AATCCTCGA__ATCTTTGAT
GAGGTCTCT_ _ G~ATGGATTC__ ~CCCAGCCCT__ATGGACCCC__ACATGGCGGA__GCAGAGTTT
GAACAGG~A _ TCAGGCAG__ CAGCCGGAT__ATTCGAAACG__AGCAGTTTGC__CATAGACGC
TTCCAGTTA _ TGCCGGTGAG__ GCTGCTGGG._ CACAGCCCCG__TGTTCGGAA__CATACCAAC
30T~CCAGGCG_ _CGACGGCCG__GAGGAAGAGC__GAGGCGGGCA__GTGGAG~TGC__CAGCAG~TT
GGGGAAGACA _AGGAGAATGA_TGGATTTGTC__TTAAGATGC__CATGGAAG~C__CACACATC
AGCTCCACCC ATGCTCTGGCAGAGTGGGCCAGCCGCAGGGAAGCCTTTGCCCAGAGACCC
AGCTCGGCC. _ ~GACCTGAT__ GTGTCTCAGT._ CCTGACCGGA__AGATGGAAGT__GGAGGAGCTC
AGCCCCCTGG__ CTAGGTCG_. CTTCTCTCTG__ACCCCTGCAG__AGGGGGATAC__TGAGGAAGAT
35GATGGATTTG__TGGACATCCT__AGAGAGTGAC__TTAAAGGATG__ATGATGCAGT__TCCCCAGG
ATGGAGAGTC __ TATTAGTGC_. CCCACTGGTC_.AAGACCTTGG__AAAAGGAAGA__GGAAAAGGA~
CTCGTCATGT __ ACAGCAAGTG__ CCAGCGGCTC__ TTCCGCTCTC__ CGTCCATGCC__CTGCAG~GTG
AT~~GGCÇëA _ TCÇTCAAGAG_ _ GCTGGAGCGG_ _ ëëÇëAGGACA_ _ GGGACACGëC _ _ CGTGCAGAAT
AAGCGGAGGC__ GGAGCGTGAÇ__ ~ÇCTCÇTGAG__GAG~AGëAGG__AGGCTGAGGA__ACCTAAAGCÇ
~GCGTÇ~TCC__ GCTÇAAAATC__ACTGTGTÇAC__GATGAGATCG__AGAACCTCCT_.GGACAGTGAC
CAÇ~GAGAGC_ _ TGATTGGAGA_ _ TTACTCTAAG_ _ GÇ~TT~~TCC_ _ TACAGAëAGT _ _AGACGGAAAG
ëACCAAGACC__T~AAGTACAT__CTCACCAGAA__ACGATGGTGG__CCCTATTGAC__GGGëAAGTTC
AGÇAACATCG_ _ TGGATAAGTT_ _ TGTGATTGTA_ _ GAëTG~AGAT_ _ACC~~TATGA_ _ATATGAAGG~
GGGÇA~ATCA_AGACTGCGGT__GAACTTGë~C__CTGGAAëGCG__ACGCCGAGAG__ëTT~ÇTACTG
AAGAGCCCëA _ TCGÇGÇëÇTG__TAG~~TGGAë__AAGAGAGTCA__TCÇT~ATTTT__CCAÇTGTGAA
TTëTCATCTG__ AGCGTGGGCC__ CCGÇATGTGC__ ÇGTTTëATCA__GGGAACGAGA__CCGTGCTGTÇ
AACGA~TACC__ëÇAGCCTCTA_CTACÇÇTGAG__ATGTATATCC__TGAAAGGëGG__ëTACAAGGAG
TTCTTCCCTC AGCACCCGAA CTTCTGTGAA CCCCAGGACT ACCGGCCCAT GAACCACGAG
GCÇTTCAAGG__ATGAGCTAAA__GACCTTëCGC__CTCAAGACTC__GCAGCTGGGC__TGGGGAGCGG
AGCCGGCGGG AGCTCTGTAG CCGGCTGCAG GACCAGTGA
3 - Détermination de l'activité des protéines de fusion MBP-Cdc25B1, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 Les activités des protéines de fusion MBP-Cdc25B1, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3 sont mesurées dans les mêmes conditions que celles décrites pour la protéine de fusion MBP-Cdc25C. Les résultats obtenus sont reportés en figure 3.
LEGENDE DES FIGURES
La figure 1 (FIG. 1) représente la chromatographie d'analyse relative à
l'induction d'expression de la protéine de fusion MBP-Cdc25C. Les lignes 1 et 2 de la figure 1 correspondent respectivement à l'extrait total de JM109/pMAL-Cdc25C avec ou sans ajout d'IPTG. La ligne 3 correspond à l'extrait soluble. Les lignes 4 et 5 correspondent respectivement aux fractions non retenue et retenue sur amylose-agarose.
Enfin, la ligne 6 de la figure 1 correspond à la fraction d'élution n° 12 qui ne contient pratiquement que la protéine de fusion.
La figure 2 (FIG. 2) représente les résultats de la mesure de l'activité de la protéine recombinante MBP-Cdc25C (un "+" signifiant que de la ménadione a été ajoutée à
l'échantillon, un "-" que l'échantillon n'a pas été traité par de la ménadione).
La figure 3 (FIG. 3) représente les résultats de la mesure de l'activité des protéines recombinantes MBP-Cdc25Bl, MBP-Cdc25B2 et MBP-Cdc25B3. La réaction est réalisée avec 300 ng d'enzyme par essai. La MBP à la même concentration est utilisée dans le contrôle. Les valeurs de fluorescence mesurées permettent le calcul des pentes : 0,0025 Ofluo/sec pour le contrôle, 0,0361 Ofluo/sec pour Cdc25B l, 0,0350 Ofluo/sec pour Cdc25B2 et 0,0372 Ofluo/sec pour Cdc25B3.
LISTE DE SÉQUENCES
<110> Société de Conseils de Recherches et d'Application <120> Méthode d'obtention de phosphatases humaines Cdc25 et méthode d'identification de modulateurs de phosphatases humaines Cdc25 <130> RS 296 - listing dépôt PCT
<140>
<141>
<150> FR 99/15722 <151> 1999-12-14 <150> FR 00/06683 <151> 2000-05-30 <150> FR 00/12008 <151> 2000-09-21 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2607 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine de fusion MBP-Cdc25C
<400> 1 atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatcct ctagaatgtc tacggaactc 1200 ttctcatcca caagagagga aggaagctct ggctcaggac ccagttttag gtctaatcaa 1260 aggaaaatgt taaacctgct cctggagaga gacacttcct ttaccgtctg tccagatgtc 1320 cctagaactc cagtgggcaa atttcttggt gattctgcaa acctaagcat tttgtctgga 1380 ggaaccccaa aatgttgcct cgatctttcg aatcttagca gtggggagat aactgccact 1440 cagcttacca cttctgcaga ccttgatgaa actggtcacc tggattcttc aggacttcag 1500 gaagtgcatt tagctgggat gaatcatgac cagcacctaa tgaaatgtag cccagcacag 1560 cttctttgta gcactccgaa tggtttggac cgtggccata gaaagagaga tgcaatgtgt 1620 agttcatctg caaataaaga aaatgacaat ggaaacttgg tggacagtga aatgaaatat 1680 ttgggcagtc ccattactac tgttccaaaa ttggataaaa atccaaacct aggagaagac 1740 caggcagaag agatttcaga tgaattaatg gagttttccc tgaaagatca agaagcaaag 1800 gtgagcagaa gtggcctata tcgctccccg tcgatgccag agaacttgaa caggccaaga 1860 ctgaagcagg tggaaaaatt caaggacaac acaataccag ataaagttaa aaaaaagtat 1920 ttttctggcc aaggaaagct caggaagggc ttatgtttaa agaagacagt ctctctgtgt 1980 gacattacta tcactcagat gctggaggaa gattctaacc aggggcacct gattggtgat 2040 ttttccaagg tatgtgcgct gccaaccgtg tcagggaaac accaagatct gaagtatgtc 2100 aacccagaaa cagtggctgc cttactgtcg gggaagttcc agggtctgat tgagaagttt 2160 tatgtcattg attgtcgcta tccatatgag tatctgggag gacacatcca gggagcctta 2220 aacttatata gtcaggaaga actgtttaac ttctttctga agaagcccat cgtccctttg 2280 gacacccaga agagaataat catcgtgttc cactgtgaat tctcctcaga gaggggcccc 2340 cgaatgtgcc gctgtctgcg tgaagaggac aggtctctga accagtatcc tgcattgtac 2400 tacccagagc tatatatcct taaaggcggc tacagagact tctttccaga atatatggaa 2460 ctgtgtgaac cacagagcta ctgccctatg catcatcagg accacaagac tgagttgctg 2520 aggtgtcgaa gccagagcaa agtgcaggaa ggggagcggc agctgcggga gcagattgcc 2580 cttctggtga aggacatgag cccatga 2607 <210> 2 <211> 1461 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine Hs Cdc25C avec ses extrémités de restriction XbaI
<400> 2 tctagaatgt ctacggaact cttctcatcc acaagagagg aaggaagctc tggctcagga 60 cccagtttta ggtctaatca aaggaaaatg ttaaacctgc tcctggagag agacacttcc 120 tttaccgtct gtccagatgt ccctagaact ccagtgggca aatttcttgg tgattctgca 180 aacctaagca ttttgtctgg aggaacccca aaatgttgcc tcgatctttc gaatcttagc 240 agtggggaga taactgccac tcagcttacc acttctgcag accttgatga aactggtcac 300 ctggattctt caggacttca ggaagtgcat ttagctggga tgaatcatga ccagcaccta 360 atgaaatgta gcccagcaca gcttctttgt agcactccga atggtttgga ccgtggccat 420 agaaagagag atgcaatgtg tagttcatct gcaaataaag aaaatgacaa tggaaacttg 480 gtggacagtg aaatgaaata tttgggcagt cccattacta ctgttccaaa attggataaa 540 aatccaaacc taggagaaga ccaggcagaa gagatttcag atgaattaat ggagttttcc 600 ctgaaagatc aagaagcaaa ggtgagcaga agtggcctat atcgctcccc gtcgatgcca 660 gagaacttga acaggccaag actgaagcag gtggaaaaat tcaaggacaa cacaatacca 720 gataaagtta aaaaaaagta tttttctggc caaggaaagc tcaggaaggg cttatgttta 780 aagaagacag tctctctgtg tgacattact atcactcaga tgctggagga agattctaac 840 caggggcacc tgattggtga tttttccaag gtatgtgcgc tgccaaccgt gtcagggaaa 900 caccaagatc tgaagtatgt caacccagaa acagtggctg ccttactgtc ggggaagttc 960 cagggtctga ttgagaagtt ttatgtcatt gattgtcgct atccatatga gtatctggga 1020 ggacacatcc agggagcctt aaacttatat agtcaggaag aactgtttaa cttctttctg 1080 aagaagccca tcgtcccttt ggacacccag aagagaataa tcatcgtgtt ccactgtgaa 1140 ttctcctcag agaggggccc ccgaatgtgc cgctgtctgc gtgaagagga caggtctctg 1200 aaccagtatc ctgcattgta ctacccagag ctatatatcc ttaaaggcgg ctacagagac 1260 ttctttccag aatatatgga actgtgtgaa ccacagagct actgccctat gcatcatcag 1320 gaccacaaga ctgagttgct gaggtgtcga agccagagca aagtgcagga aggggagcgg 1380 cagctgcggg agcagattgc ccttctggtg aaggacatga gcccatgata acattccagc 1440 cactggctgc taacatctag a 1461 <210> 3 <211> 24 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce XbaI SENS
<400> 3 gttctagaat gtctagaact cttc 24 <210> 4 <211> 18 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce XbaI ANTI-SENS
<400> 4 ggctctgagt tgcgccgg 18 <210> 5 <211> 8101 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25C
<900> 5 ccgacaccat cgaatggtgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga 60 gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg 120 gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa 180 cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac 240 aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc 300 acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg 360 tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc 420 ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca 480 ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga 540 cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc 600 tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg 660 cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag 720 cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga 780 atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa 840 tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg 900 acgataccga agacagctca tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc 960 gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga 1020 agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata 1080 cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 1140 cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 1200 gcacaattct catgtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg 1260 tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg 1320 tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt 1380 ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga 1440 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagccagt ccgtttaggt gttttcacga 1500 gcacttcacc aacaaggacc atagattatg aaaatcgaag aaggtaaact ggtaatctgg 1560 attaacggcg ataaaggcta taacggtctc gctgaagtcg gtaagaaatt cgagaaagat 1620 accggaatta aagtcaccgt tgagcatccg .gataaactgg aagagaaatt cccacaggtt 1680 gcggcaactg gcgatggccc tgacattatc ttctgggcac acgaccgctt tggtggctac 1740 gctcaatctg gcctgttggc tgaaatcacc ccggacaaag cgttccagga caagctgtat 1800 ccgtttacct gggatgccgt acgttacaac ggcaagctga ttgcttaccc gatcgctgtt 1860 gaagcgttat cgctgattta taacaaagat ctgctgccga acccgccaaa aacctgggaa 1920 gagatcccgg cgctggataa agaactgaaa gcgaaaggta agagcgcgct gatgttcaac 1980 ctgcaagaac cgtacttcac ctggccgctg attgctgctg acgggggtta tgcgttcaag 2040 tatgaaaacg gcaagtacga cattaaagac gtgggcgtgg ataacgctgg cgcgaaagcg 2100 ggtctgacct tcctggttga cctgattaaa aacaaacaca tgaatgcaga caccgattac 2160 tccatcgcag aagctgcctt taataaaggc gaaacagcga tgaccatcaa cggcccgtgg 2220 gcatggtcca acatcgacac cagcaaagtg aattatggtg taacggtact gccgaccttc 2280 aagggtcaac catccaaacc gttcgttggc gtgctgagcg caggtattaa cgccgccagt 2340 ccgaacaaag agctggcaaa agagttcctc gaaaactatc tgctgactga tgaaggtctg 2400 gaagcggtta ataaagacaa accgctgggt gccgtagcgc tgaagtctta cgaggaagag 2460 ttggcgaaag atccacgtat tgccgccacc atggaaaacg cccagaaagg tgaaatcatg 2520 ccgaacatcc cgcagatgtc cgctttctgg tatgccgtgc gtactgcggt gatcaacgcc 2580 gccagcggtc gtcagactgt cgatgaagcc ctgaaagacg cgcagactaa ttcgagctcg 2640 aacaacaaca acaataacaa taacaacaac ctcgggatcg agggaaggat ttcagaattc 2700 ggatcctcta gaatgtctac ggaactcttc tcatccacaa gagaggaagg aagctctggc 2760 tcaggaccca gttttaggtc taatcaaagg aaaatgttaa acctgctcct ggagagagac 2820 acttccttta ccgtctgtcc agatgtccct agaactccag tgggcaaatt tcttggtgat 2880 tctgcaaacc taagcatttt gtctggagga accccaaaat gttgcctcga tctttcgaat 2940 cttagcagtg gggagataac tgccactcag cttaccactt ctgcagacct tgatgaaact 3000 ggtcacctgg attcttcagg acttcaggaa gtgcatttag ctgggatgaa tcatgaccag 3060 cacctaatga aatgtagccc agcacagctt ctttgtagca ctccgaatgg tttggaccgt 3120 ggccatagaa agagagatgc aatgtgtagt tcatctgcaa ataaagaaaa tgacaatgga 3180 aacttggtgg acagtgaaat gaaatatttg ggcagtccca ttactactgt tccaaaattg 3240 gataaaaatc caaacctagg agaagaccag gcagaagaga tttcagatga attaatggag 3300 ttttccctga aagatcaaga agcaaaggtg agcagaagtg gcctatatcg ctccccgtcg 3360 atgccagaga acttgaacag gccaagactg aagcaggtgg aaaaattcaa ggacaacaca 3420 ataccagata aagttaaaaa aaagtatttt tctggccaag gaaagctcag gaagggctta 3480 tgtttaaaga agacagtctc tctgtgtgac attactatca ctcagatgct ggaggaagat 3540 tctaaccagg ggcacctgat tggtgatttt tccaaggtat gtgcgctgcc aaccgtgtca 3600 gggaaacacc aagatctgaa gtatgtcaac ccagaaacag tggctgcctt actgtcgggg 3660 aagttccagg gtctgattga gaagttttat gtcattgatt gtcgctatcc atatgagtat 3720 ctgggaggac acatccaggg agccttaaac ttatatagtc aggaagaact gtttaacttc 3780 tttctgaaga agcccatcgt ccctttggac acccagaaga gaataatcat cgtgttccac 3840 tgtgaattct cctcagagag gggcccccga atgtgccgct gtctgcgtga agaggacagg 3900 tctctgaacc agtatcctgc attgtactac ccagagctat atatccttaa aggcggctac 3960 agagacttct ttccagaata tatggaactg tgtgaaccac agagctactg ccctatgcat 4020 catcaggacc acaagactga gttgctgagg tgtcgaagcc agagcaaagt gcaggaaggg 4080 gagcggcagc tgcgggagca gattgccctt ctggtgaagg acatgagccc atgataacat 4140 tccagccact ggctgctaac atctagagtc gacctgcagg caagcttggc actggccgtc 4200 gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca 4260 catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa 4320 cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcag cttggctgtt ttggcggatg agataagatt 4380 ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct 4440 ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt 4500 agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat 4560 aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa 4620 cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc 4680 cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc 4740 catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt tttctaaata 4800 cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 4860 aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 4920 ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 4980 cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 5040 agttttcgcc ccgaagaacg ttctccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 5100 gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 5160 cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 5220 gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 5280 ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 5340 gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 5400 gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 5460 cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 5520 ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 5580 gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 5640 gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 5700 gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 5760 ctttagattg atttaccccg gttgataatc agaaaagccc caaaaacagg aagattgtat 5820 aagcaaatat ttaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt 5880 aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag 5940 aatagcccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga 6000 acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg 6060 aaccatcacc caaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc 6120 ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg 6180 aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc 6240 gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtaa aaggatctag 6300 gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac 6360 tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc 6420 gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 6480 caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 6540 actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc ~caccacttca agaactctgt agcaccgcct 6600 acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 6660 cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 6720 gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta 6780 cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 6840 gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 6900 tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc 6960 tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac .gccagcaacg cggccttttt acggttcctg 7020 gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat 7080 aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc 7140 agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 7200 ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 7260 tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct gcgccccgac 7320 acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 7380 gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 7440 aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc gtgcagcgat tcacagatgt 7500 ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag aagcgttaat gtctggcttc 7560 tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt ggtcacttga tgcctccgtg 7620 taagggggaa tttctgttca tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac 7680 gatacgggtt actgatgatg aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact 7740 ggcggtatgg atgcggcggg accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc agcgcttcgt 7800 taatacagat gtaggtgttc cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa 7860 cataatggtg cagggcgctg acttccgcgt .ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa 7920 gaccattcat gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg 7980 ctcgcgtatc ggtgattcat tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggt 8040 cctcaacgac aggagcacga tcatgcgcac ccgtggccag gacccaacgc tgcccgaaat 8100 t 8101 <210> 6 <211> 2063 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine Hs Cdc25B1 avec ses extrémités de restriction NdeI
et BamHl <400> 6 catatggagg tgccccagcc ggagcccgcg ccaggctcgg ctctcagtcc agcaggcgtg 60 tgcggtggcg cccagcgtcc gggccacctc ccgggcctcc tgctgggatc tcatggcctc 120 ctggggtccc cggtgcgggc ggccgcttcc tcgccggtca ccaccctcac ccagaccatg 180 cacgacctcg ccgggctcgg cagccgcagc cgcctgacgc acctatccct gtctcgacgg 240 gcatccgaat cctccctgtc gtctgaatcc tccgaatctt ctgatgcagg tctctgcatg 300 gattccccca gccctatgga cccccacatg gcggagcaga cgtttgaaca ggccatccag 360 gcagccagcc ggatcattcg aaacgagcag tttgccatca gacgcttcca gtctatgccg 420 gtgaggctgc tgggccacag ccccgtgctt cggaacatca ccaactccca ggcgcccgac 480 ggccggagga agagcgaggc gggcagtgga gctgccagca gctctgggga agacaaggag 540 aatgatggat ttgtcttcaa gatgccatgg aagcccacac atcccagctc cacccatgct 600 ctggcagagt gggccagccg cagggaagcc tttgcccaga gacccagctc ggcccccgac 660 ctgatgtgtc tcagtcctga ccggaagatg gaagtggagg agctcagccc cctggcccta 720 ggtcgcttct ctctgacccc tgcagagggg gatactgagg aagatgatgg atttgtggac 780 atcctagaga gtgacttaaa ggatgatgat gcagttcccc caggcatgga gagtctcatt 840 agtgccccac tggtcaagac cttggaaaag gaagaggaaa aggacctcgt catgtacagc 900 aagtgccagc ggctcttccg ctctccgtcc atgccctgca gcgtgatccg gcccatcctc 960 aagaggctgg agcggcccca ggacagggac acgcccgtgc agaataagcg gaggcggagc 1020 gtgacccctc ctgaggagca gcaggaggct gaggaaccta aagcccgcgt cctccgctca 1080 aaatcactgt gtcacgatga gatcgagaac ctcctggaca gtgaccaccg agagctgatt 1140 ggagattact ctaaggcctt cctcctacag acagtagacg gaaagcacca agacctcaag 1200 tacatctcac cagaaacgat ggtggcccta ttgacgggca agttcagcaa catcgtggat 1260 aagtttgtga ttgtagactg cagatacccc tatgaatatg aaggcgggca catcaagact 1320 gcggtgaact tgcccctgga acgcgacgcc gagagcttcc tactgaagag ccccatcgcg 1380 ccctgtagcc tggacaagag agtcatcctc attttccact gtgaattctc atctgagcgt 1440 gggccccgca tgtgccgttt catcagggaa cgagaccgtg ctgtcaacga ctaccccagc 1500 ctctactacc ctgagatgta tatcctgaaa ggcggctaca aggagttctt ccctcagcac 1560 ccgaacttct gtgaacccca ggactaccgg cccatgaacc acgaggcctt caaggatgag 1620 ctaaagacct tccgcctcaa gactcgcagc tgggctgggg agcggagccg gcgggagctc 1680 tgtagccggc tgcaggacca gtgaggggcc tgcgccagtc ctgctacctc ccttgccttt 1740 cgaggcctga agccagctgc cctatgggcc tgccgggctg agggcctgct ggaggcctca 1800 ggtgctgtcc atgggaaaga tggtgtggtg tcctgcctgt ctgccccagc ccagattccc 1860 ctgtgtcatc ccatcatttt ccatatcctg gtgcccccca cccctggaag agcccagtct 1920 gttgagttag ttaagttggg ttaataccag cttaaaggca gtattttgtg tcctccagga 1980 gcttcttgtt tccttgttag ggttaaccct tcatcttcct gtgtcctgaa acgctccttt 2040 gtgtgtgtgt cagctgagga tcc 2063 <210> 7 <211> 1982 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine Hs Cdc25B2 avec ses extrémités de restriction NdeI
et BamHl <400> 7 catatggagg tgccccagcc ggagcccgcg ccaggctcgg ctctcagtcc agcaggcgtg 60 tgcggtggcg cccagcgtcc gggccacctc ccgggcctcc tgctgggatc tcatggcctc 120 ctggggtccc cggtgcgggc ggccgcttcc tcgccggtca ccaccctcac ccagaccatg 180 cacgacctcg ccgggctcgg cagcgaaacc ccaaagagtc aggtagggac cctgctcttc 240 cgcagccgca gccgcctgac gcacctatcc ctgtctcgac gggcatccga atcctccctg 300 tcgtctgaat cctccgaatc ttctgatgca ggtctctgca tggattcccc cagccctatg 360 gacccccaca tggcggagca gacgtttgaa caggccatcc aggcagccag ccggatcatt 420 cgaaacgagc agtttgccat cagacgcttc cagtctatgc cggatggatt tgtcttcaag 480 atgccatgga agcccacaca tcccagctcc acccatgctc tggcagagtg ggccagccgc 540 agggaagcct ttgcccagag acccagctcg gcccccgacc tgatgtgtct cagtcctgac 600 cggaagatgg aagtggagga gctcagcccc ctggccctag gtcgcttctc tctgacccct 660 gcagaggggg atactgagga agatgatgga tttgtggaca tcctagagag tgacttaaag 720 gatgatgatg cagttccccc aggcatggag agtctcatta gtgccccact ggtcaagacc 780 ttggaaaagg aagaggaaaa ggacctcgtc atgtacagca agtgccagcg gctcttccgc 840 tctccgtcca tgccctgcag cgtgatccgg cccatcctca agaggctgga gcggccccag 900 gacagggaca cgcccgtgca gaataagcgg aggcggagcg tgacccctcc tgaggagcag 960 caggaggctg aggaacctaa agcccgcgtc ctccgctcaa aatcactgtg tcacgatgag 1020 atcgagaacc tcctggacag tgaccaccga gagctgattg gagattactc taaggccttc 1080 ctcctacaga cagtagacgg aaagcaccaa gacctcaagt acatctcacc agaaacgatg 1140 gtggccctat tgacgggcaa gttcagcaac atcgtggata agtttgtgat tgtagactgc 1200 agatacccct atgaatatga aggcgggcac atcaagactg cggtgaactt gcccctggaa 1260 cgcgacgccg agagcttcct actgaagagc cccatcgcgc cctgtagcct ggacaagaga 1320 gtcatcctca ttttccactg tgaattctca tctgagcgtg ggccccgcat gtgccgtttc 1380 atcagggaac gagaccgtgc tgtcaacgac .taccccagcc tctactaccc tgagatgtat 1440 atcctgaaag gcggctacaa ggagttcttc cctcagcacc cgaacttctg tgaaccccag 1500 gactaccggc ccatgaacca cgaggccttc aaggatgagc taaagacctt ccgcctcaag 1560 actcgcagct gggctgggga gcggagccgg cgggagctct gtagccggct gcaggaccag 1620 tgaggggcct gcgccagtcc tgctacctcc cttgcctttc gaggcctgaa gccagctgcc 1680 ctatgggcct gccgggctga gggcctgctg gaggcctcag gtgctgtcca tgggaaagat 1740 ggtgtggtgt cctgcctgtc tgccccagcc cagattcccc tgtgtcatcc catcattttc 1800 catatcctgg tgccccccac ccctggaaga gcccagtctg ttgagttagt taagttgggt 1860 taataccagc ttaaaggcag tattttgtgt cctccaggag cttcttgttt ccttgttagg 1920 gttaaccctt catcttcctg tgtcctgaaa cgctcctttg tgtgtgtgtc agctgaggat 1980 cc 1982 <210> 8 <211> 2105 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine Hs Cdc25B3 avec ses extrémités de restriction NdeI
et BamHl <400> 8 catatggagg tgccccagcc ggagcccgcg ccaggctcgg ctctcagtcc agcaggcgtg 60 tgcggtggcg cccagcgtcc gggccacctc ccgggcctcc tgctgggatc tcatggcctc 120 ctggggtccc cggtgcgggc ggccgcttcc tcgccggtca ccaccctcac ccagaccatg 180 cacgacctcg ccgggctcgg cagcgaaacc ccaaagagtc aggtagggac cctgctcttc 240 cgcagccgca gccgcctgac gcacctatcc ctgtctcgac gggcatccga atcctccctg 300 tcgtctgaat cctccgaatc ttctgatgca ggtctctgca tggattcccc cagccctatg 360 gacccccaca tggcggagca gacgtttgaa caggccatcc aggcagccag ccggatcatt 420 cgaaacgagc agtttgccat cagacgcttc cagtctatgc cggtgaggct gctgggccac 480 agccccgtgc ttcggaacat caccaactcc caggcgcccg acggccggag gaagagcgag 540 gcgggcagtg gagctgccag cagctctggg gaagacaagg agaatgatgg atttgtcttc 600 aagatgccat ggaagcccac acatcccagc tccacccatg ctctggcaga gtgggccagc 660 cgcagggaag cctttgccca gagacccagc tcggcccccg acctgatgtg tctcagtcct 720 gaccggaaga tggaagtgga ggagctcagc cccctggccc taggtcgctt ctctctgacc 780 cctgcagagg gggatactga ggaagatgat ggatttgtgg acatcctaga gagtgactta 840 aaggatgatg atgcagttcc cccaggcatg gagagtctca ttagtgcccc actggtcaag 900 accttggaaa aggaagagga aaaggacctc gtcatgtaca gcaagtgcca gcggctcttc 960 cgctctccgt ccatgccctg cagcgtgatc cggcccatcc tcaagaggct ggagcggccc 1020 caggacaggg acacgcccgt gcagaataag cggaggcgga gcgtgacccc tcctgaggag 1080 cagcaggagg ctgaggaacc taaagcccgc gtcctccgct caaaatcact gtgtcacgat 1140 gagatcgaga acctcctgga cagtgaccac cgagagctga ttggagatta ctctaaggcc 1200 ttcctcctac agacagtaga cggaaagcac caagacctca agtacatctc accagaaacg 1260 atggtggccc tattgacggg caagttcagc aacatcgtgg ataagtttgt gattgtagac 1320 tgcagatacc cctatgaata tgaaggcggg cacatcaaga ctgcggtgaa cttgcccctg 1380 gaacgcgacg ccgagagctt cctactgaag agccccatcg cgccctgtag cctggacaag 1440 agagtcatcc tcattttcca ctgtgaattc tcatctgagc gtgggccccg catgtgccgt 1500 ttcatcaggg aacgagaccg tgctgtcaac gactacccca gcctctacta ccctgagatg 1560 tatatcctga aaggcggcta caaggagttc ttccctcagc acccgaactt ctgtgaaccc 1620 caggactacc ggcccatgaa ccacgaggcc ttcaaggatg agctaaagac cttccgcctc 1680 aagactcgca gctgggctgg ggagcggagc cggcgggagc tctgtagccg gctgcaggac 1740 cagtgagggg cctgcgccag tcctgctacc tcccttgcct ttcgaggcct gaagccagct 1800 gccctatggg cctgccgggc tgagggcctg ctggaggcct caggtgctgt ccatgggaaa 1860 gatggtgtgg tgtcctgcct gtctgcccca gcccagattc ccctgtgtca tcccatcatt 1920 ttccatatcc tggtgccccc cacccctgga agagcccagt ctgttgagtt agttaagttg 1980 ggttaatacc agcttaaagg cagtattttg tgtcctccag gagcttcttg tttccttgtt 2040 agggttaacc cttcatcttc ctgtgtcctg aaacgctcct ttgtgtgtgt gtcagctgag 2100 gatcc 2105 <210> 9 <211> 3236 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25Bl <400> 9 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 1200 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 1260 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 1320 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagccgc 1380 agccgcctga cgcacctatc cctgtctcga cgggcatccg aatcctccct gtcgtctgaa 1440 tcctccgaat cttctgatgc aggtctctgc atggattccc ccagccctat ggacccccac 1500 atggcggagc agacgtttga acaggccatc caggcagcca gccggatcat tcgaaacgag 1560 cagtttgcca tcagacgctt ccagtctatg ccggtgaggc tgctgggcca cagccccgtg 1620 cttcggaaca tcaccaactc ccaggcgccc gacggccgga ggaagagcga ggcgggcagt 1680 ggagctgcca gcagctctgg ggaagacaag gagaatgatg gatttgtctt caagatgcca 1740 tggaagccca cacatcccag ctccacccat gctctggcag agtgggccag ccgcagggaa 1800 gcctttgccc agagacccag ctcggccccc gacctgatgt gtctcagtcc tgaccggaag 1860 atggaagtgg aggagctcag ccccctggcc ctaggtcgct tctctctgac ccctgcagag 1920 ggggatactg aggaagatga tggatttgtg gacatcctag agagtgactt aaaggatgat 1980 gatgcagttc ccccaggcat ggagagtctc attagtgccc cactggtcaa gaccttggaa 2040 aaggaagagg aaaaggacct cgtcatgtac agcaagtgcc agcggctctt ccgctctccg 2100 tccatgccct gcagcgtgat ccggcccatc ctcaagaggc tggagcggcc ccaggacagg 2160 gacacgcccg tgcagaataa gcggaggcgg agcgtgaccc ctcctgagga gcagcaggag 2220 gctgaggaac ctaaagcccg cgtcctccgc tcaaaatcac tgtgtcacga tgagatcgag 2280 aacctcctgg acagtgacca ccgagagctg attggagatt actctaaggc cttcctccta 2340 cagacagtag acggaaagca ccaagacctc aagtacatct caccagaaac gatggtggcc 2400 ctattgacgg gcaagttcag caacatcgtg gataagtttg tgattgtaga ctgcagatac 2460 ccctatgaat atgaaggcgg gcacatcaag actgcggtga acttgcccct ggaacgcgac 2520 gccgagagct tcctactgaa gagccccatc gcgccctgta gcctggacaa gagagtcatc 2580 ctcattttcc actgtgaatt ctcatctgag cgtgggcccc gcatgtgccg tttcatcagg 2640 gaacgagacc gtgctgtcaa cgactacccc agcctctact accctgagat gtatatcctg 2700 aaaggcggct acaaggagtt cttccctcag cacccgaact tctgtgaacc ccaggactac 2760 cggcccatga accacgaggc cttcaaggat gagctaaaga ccttccgcct caagactcgc 2820 agctgggctg gggagcggag ccggcgggag ctctgtagcc ggctgcagga ccagtgaggg 2880 gcctgcgcca gtcctgctac ctcccttgcc tttcgaggcc tgaagccagc tgccctatgg 2940 gcctgccggg ctgagggcct gctggaggcc tcaggtgctg tccatgggaa agatggtgtg 3000 gtgtcctgcc tgtctgcccc agcccagatt cccctgtgtc atcccatcat tttccatatc 3060 ctggtgcccc ccacccctgg aagagcccag tctgttgagt tagttaagtt gggttaatac 3120 cagcttaaag gcagtatttt gtgtcctcca ggagcttctt gtttccttgt tagggttaac 3180 ccttcatctt cctgtgtcct gaaacgctcc tttgtgtgtg tgtcagctga ggatcc 3236 <210> 10 <211> 4955 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25B2 <400> 10 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca açaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 1200 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 1260 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 1320 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagccgc 1380 agccgcctga cgcacctatc cctgtctcga cgggcatccg aatcctccct gtcgtctgaa 1440 tcctccgaat cttctgatgc aggtctctgc atggattccc ccagccctat ggacccccac 1500 atggcggagc agacgtttga acaggccatc caggcagcca gccggatcat tcgaaacgag 1560 cagtttgcca tcagacgctt ccagtctatg ccggtgaggc tgctgggcca cagccccgtg 1620 cttcggaaca tcaccaactc ccaggcgccc gacggccgga ggaagagcga ggcgggcagt 1680 ggagctgcca gcagctctgg ggaagacaag gagaatgatg gatttgtctt caagatgcca 1740 tggaagccca cacatcccag ctccacccat gctctggcag agtgggccag ccgcagggaa 1800 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 1860 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 1920 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 1980 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 2040 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 2100 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 2160 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 2220 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 2280 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 2340 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 2400 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 2460 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 2520 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 2580 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 2640 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 2700 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 2760 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 2820 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 2880 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 2940 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 3000 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 3060 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 3120 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagcgaa 3180 accccaaaga gtcaggtagg gaccctgctc ttccgcagcc gcagccgcct gacgcaccta 3240 tccctgtctc gacgggcatc cgaatcctcc ctgtcgtctg aatcctccga atcttctgat 3300 gcaggtctct gcatggattc ccccagccct atggaccccc acatggcgga gcagacgttt 3360 gaacaggcca tccaggcagc cagccggatc attcgaaacg agcagtttgc catcagacgc 3420 ttccagtcta tgccggatgg atttgtcttc aagatgccat ggaagcccac acatcccagc 3480 tccacccatg ctctggcaga gtgggccagc cgcagggaag cctttgccca gagacccagc 3540 tcggcccccg acctgatgtg tctcagtcct gaccggaaga tggaagtgga ggagctcagc 3600 cccctggccc taggtcgctt ctctctgacc cctgcagagg gggatactga ggaagatgat 3660 ggatttgtgg acatcctaga gagtgactta aaggatgatg atgcagttcc cccaggcatg 3720 gagagtctca ttagtgcccc actggtcaag accttggaaa aggaagagga aaaggacctc 3780 gtcatgtaca gcaagtgcca gcggctcttc cgctctccgt ccatgccctg cagcgtgatc 3840 cggcccatcc tcaagaggct ggagcggccc caggacaggg acacgcccgt gcagaataag 3900 cggaggcgga gcgtgacccc tcctgaggag cagcaggagg ctgaggaacc taaagcccgc 3960 gtcctccgct caaaatcact gtgtcacgat gagatcgaga acctcctgga cagtgaccac 4020 cgagagctga ttggagatta ctctaaggcc ttcctcctac agacagtaga cggaaagcac 4080 caagacctca agtacatctc accagaaacg atggtggccc tattgacggg caagttcagc 4140 aacatcgtgg ataagtttgt gattgtagac tgcagatacc cctatgaata tgaaggcggg 4200 cacatcaaga ctgcggtgaa cttgcccctg gaacgcgacg ccgagagctt cctactgaag 4260 agccccatcg cgccctgtag cctggacaag agagtcatcc tcattttcca ctgtgaattc 4320 tcatctgagc gtgggccccg catgtgccgt ttcatcaggg aacgagaccg tgctgtcaac 4380 gactacccca gcctctacta ccctgagatg tatatcctga aaggcggcta caaggagttc 4440 ttccctcagc acccgaactt ctgtgaaccc caggactacc ggcccatgaa ccacgaggcc 4500 ttcaaggatg agctaaagac cttccgcctc aagactcgca gctgggctgg ggagcggagc 4560 cggcgggagc tctgtagccg gctgcaggac cagtgagggg cctgcgccag tcctgctacc 4620 tcccttgcct ttcgaggcct gaagccagct gccctatggg cctgccgggc tgagggcctg 4680 ctggaggcct caggtgctgt ccatgggaaa gatggtgtgg tgtcctgcct gtctgcccca 4740 gcccagattc ccctgtgtca tcccatcatt ttccatatcc tggtgccccc cacccctgga 4800 agagcccagt ctgttgagtt agttaagttg ggttaatacc agcttaaagg cagtattttg 4860 tgtcctccag gagcttcttg tttccttgtt agggttaacc cttcatcttc ctgtgtcctg 4920 aaacgctcct ttgtgtgtgt gtcagctgag gatcc 4955 <210> 11 <211> 3278 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: souche JM109 / pMAL - Hs Cdc25B3 <400> 11 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct.gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960
13 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 1200 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 1260 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 1320 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagcgaa 1380 accccaaaga gtcaggtagg gaccctgctc ttccgcagcc gcagccgcct gacgcaccta 1440 tccctgtctc gacgggcatc cgaatcctcc ctgtcgtctg aatcctccga atcttctgat 1500 gcaggtctct gcatggattc ccccagccct atggaccccc acatggcgga gcagacgttt 1560 gaacaggcca tccaggcagc cagccggatc attcgaaacg agcagtttgc catcagacgc 1620 ttccagtcta tgccggtgag gctgctgggc cacagccccg tgcttcggaa catcaccaac 1680 tcccaggcgc ccgacggccg gaggaagagc gaggcgggca gtggagctgc cagcagctct 1740 ggggaagaca aggagaatga tggatttgtc ttcaagatgc catggaagcc cacacatccc 1800 agctccaccc atgctctggc agagtgggcc agccgcaggg aagcctttgc ccagagaccc 1860 agctcggccc ccgacctgat gtgtctcagt cctgaccgga agatggaagt ggaggagctc 1920 agccccctgg ccctaggtcg cttctctctg acccctgcag agggggatac tgaggaagat 1980 gatggatttg tggacatcct agagagtgac ttaaaggatg atgatgcagt tcccccaggc 2040 atggagagtc tcattagtgc cccactggtc aagaccttgg aaaaggaaga ggaaaaggac 2100 ctcgtcatgt acagcaagtg ccagcggctc ttccgctctc cgtccatgcc ctgcagcgtg 2160 atccggccca tcctcaagag gctggagcgg ccccaggaca gggacacgcc cgtgcagaat 2220 aagcggaggc ggagcgtgac ccctcctgag gagcagcagg aggctgagga acctaaagcc 2280 cgcgtcctcc gctcaaaatc actgtgtcac gatgagatcg agaacctcct ggacagtgac 2340 caccgagagc tgattggaga ttactctaag gccttcctcc tacagacagt agacggaaag 2400 caccaagacc tcaagtacat ctcaccagaa acgatggtgg ccctattgac gggcaagttc 2460 agcaacatcg tggataagtt tgtgattgta gactgcagat acccctatga atatgaaggc 2520 gggcacatca agactgcggt gaacttgccc ctggaacgcg acgccgagag cttcctactg 2580 aagagcccca tcgcgccctg tagcctggac aagagagtca tcctcatttt ccactgtgaa 2640 ttctcatctg agcgtgggcc ccgcatgtgc cgtttcatca gggaacgaga ccgtgctgtc 2700 aacgactacc ccagcctcta ctaccctgag atgtatatcc tgaaaggcgg ctacaaggag 2760 ttcttccctc agcacccgaa cttctgtgaa ccccaggact accggcccat gaaccacgag 2820 gccttcaagg atgagctaaa gaccttccgc ctcaagactc gcagctgggc tggggagcgg 2880 agccggcggg agctctgtag ccggctgcag gaccagtgag gggcctgcgc cagtcctgct 2940 acctcccttg cctttcgagg cctgaagcca gctgccctat gggcctgccg ggctgagggc 3000 ctgctggagg cctcaggtgc tgtccatggg aaagatggtg tggtgtcctg cctgtctgcc 3060 ccagcccaga ttcccctgtg tcatcccatc attttccata tcctggtgcc ccccacccct 3120 ggaagagccc agtctgttga gttagttaag ttgggttaat accagcttaa aggcagtatt 3180 ttgtgtcctc caggagcttc ttgtttcctt gttagggtta acccttcatc ttcctgtgtc 3240 ctgaaacgct cctttgtgtg tgtgtcagct gaggatcc 3278 <210> 12 <211> 2877 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine
14 de fusion MBP-Cdc25B1 <400> 12 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 1200 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 1260 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 1320 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagccgc 1380 agccgcctga cgcacctatc cctgtctcga cgggcatccg aatcctccct gtcgtctgaa 1440 tcctccgaat cttctgatgc aggtctctgc atggattccc ccagccctat ggacccccac 1500 atggcggagc agacgtttga acaggccatc caggcagcca gccggatcat tcgaaacgag 1560 cagtttgcca tcagacgctt ccagtctatg ccggtgaggc tgctgggcca cagccccgtg 1620 cttcggaaca tcaccaactc ccaggcgccc gacggccgga ggaagagcga ggcgggcagt 1680 ggagctgcca gcagctctgg ggaagacaag gagaatgatg gatttgtctt caagatgcca 1740 tggaagccca cacatcccag ctccacccat gctctggcag agtgggccag ccgcagggaa 1800 gcctttgccc agagacccag ctcggccccc gacctgatgt gtctcagtcc tgaccggaag 1860 atggaagtgg aggagctcag ccccctggcc ctaggtcgct tctctctgac ccctgcagag 1920 ggggatactg aggaagatga tggatttgtg gacatcctag agagtgactt aaaggatgat 1980 gatgcagttc ccccaggcat ggagagtctc attagtgccc cactggtcaa gaccttggaa 2040 aaggaagagg aaaaggacct cgtcatgtac agcaagtgcc agcggctctt ccgctctccg 2100 tccatgccct gcagcgtgat ccggcccatc ctcaagaggc tggagcggcc ccaggacagg 2160 gacacgcccg tgcagaataa gcggaggcgg agcgtgaccc ctcctgagga gcagcaggag 2220 gctgaggaac ctaaagcccg cgtcctccgc tcaaaatcac tgtgtcacga tgagatcgag 2280 aacctcctgg acagtgacca ccgagagctg attggagatt actctaaggc cttcctccta 2340 cagacagtag acggaaagca ccaagacctc aagtacatct caccagaaac gatggtggcc 2400 ctattgacgg gcaagttcag caacatcgtg gataagtttg tgattgtaga ctgcagatac 2460 ccctatgaat atgaaggcgg gcacatcaag actgcggtga acttgcccct ggaacgcgac 2520 gccgagagct tcctactgaa gagccccatc gcgccctgta gcctggacaa gagagtcatc 2580 ctcattttcc actgtgaatt ctcatctgag cgtgggcccc gcatgtgccg tttcatcagg 2640 gaacgagacc gtgctgtcaa cgactacccc agcctctact accctgagat gtatatcctg 2700 aaaggcggct acaaggagtt cttccctcag cacccgaact tctgtgaacc ccaggactac 2760 cggcccatga accacgaggc cttcaaggat gagctaaaga ccttccgcct caagactcgc 2820 agctgggctg gggagcggag ccggcgggag ctctgtagcc ggctgcagga ccagtga 2877 <210> 13 <211> 2796 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine de fusion MBP-Cdc25B2 <400> 13 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 1200 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 1260 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 1320 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagcgaa 1380 accccaaaga gtcaggtagg gaccctgctc ttccgcagcc gcagccgcct gacgcaccta 1440 tccctgtctc gacgggcatc cgaatcctcc ctgtcgtctg aatcctccga atcttctgat 1500 gcaggtctct gcatggattc ccccagccct atggaccccc acatggcgga gcagacgttt 1560 gaacaggcca tccaggcagc cagccggatc attcgaaacg agcagtttgc catcagacgc 1620 ttccagtcta tgccggatgg atttgtcttc aagatgccat ggaagcccac acatcccagc 1680 tccacccatg ctctggcaga gtgggccagc cgcagggaag cctttgccca gagacccagc 1740 tcggcccccg acctgatgtg tctcagtcct gaccggaaga tggaagtgga ggagctcagc 1800 cccctggccc taggtcgctt ctctctgacc cctgcagagg gggatactga ggaagatgat 1860 ggatttgtgg acatcctaga gagtgactta aaggatgatg atgcagttcc cccaggcatg 1920 gagagtctca ttagtgcccc actggtcaag accttggaaa aggaagagga aaaggacctc 1980 gtcatgtaca gcaagtgcca gcggctcttc cgctctccgt ccatgccctg cagcgtgatc 2040 cggcccatcc tcaagaggct ggagcggccc caggacaggg acacgcccgt gcagaataag 2100 cggaggcgga gcgtgacccc tcctgaggag cagcaggagg ctgaggaacc taaagcccgc 2160 gtcctccgct caaaatcact gtgtcacgat gagatcgaga acctcctgga cagtgaccac 2220 cgagagctga ttggagatta ctctaaggcc ttcctcctac agacagtaga cggaaagcac 2280 caagacctca agtacatctc accagaaacg atggtggccc tattgacggg caagttcagc 2340 aacatcgtgg ataagtttgt gattgtagac tgcagatacc cctatgaata tgaaggcggg 2400 cacatcaaga ctgcggtgaa cttgcccctg gaacgcgacg ccgagagctt cctactgaag 2460 agccccatcg cgccctgtag cctggacaag agagtcatcc tcattttcca ctgtgaattc 2520 tcatctgagc gtgggccccg catgtgccgt ttcatcaggg aacgagaccg tgctgtcaac 2580 gactacccca gcctctacta ccctgagatg tatatcctga aaggcggcta caaggagttc 2640 ttccctcagc acccgaactt ctgtgaaccc caggactacc ggcccatgaa ccacgaggcc 2700 ttcaaggatg agctaaagac cttccgcctc aagactcgca gctgggctgg ggagcggagc 2760 cggcgggagc tctgtagccg gctgcaggac cagtga 2796 <210> 14 <211> 2919 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine de fusion MBP-Cdc25B3 <400> 14 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 1200 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 1260 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 1320 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagcgaa 1380 accccaaaga gtcaggtagg gaccctgctc ttccgcagcc gcagccgcct gacgcaccta 1440 tccctgtctc gacgggcatc cgaatcctcc ctgtcgtctg aatcctccga atcttctgat 1500 gcaggtctct gcatggattc ccccagccct atggaccccc acatggcgga gcagacgttt 1560 gaacaggcca tccaggcagc cagccggatc attcgaaacg agcagtttgc catcagacgc 1620 ttccagtcta tgccggtgag gctgctgggc cacagccccg tgcttcggaa catcaccaac 1680 tcccaggcgc ccgacggccg gaggaagagc gaggcgggca gtggagctgc cagcagctct 1740 ggggaagaca aggagaatga tggatttgtc ttcaagatgc catggaagcc cacacatccc 1800 agctccaccc atgctctggc agagtgggcc agccgcaggg aagcctttgc ccagagaccc 1860 agctcggccc ccgacctgat gtgtctcagt cctgaccgga agatggaagt ggaggagctc 1920 agccccctgg ccctaggtcg cttctctctg acccctgcag agggggatac tgaggaagat 1980 gatggatttg tggacatcct agagagtgac ttaaaggatg atgatgcagt tcccccaggc 2040 atggagagtc tcattagtgc cccactggtc aagaccttgg aaaaggaaga ggaaaaggac 2100 ctcgtcatgt acagcaagtg ccagcggctc ttccgctctc cgtccatgcc ctgcagcgtg 2160 atccggccca tcctcaagag gctggagcgg ccccaggaca gggacacgcc cgtgcagaat 2220 aagcggaggc ggagcgtgac ccctcctgag gagcagcagg aggctgagga acctaaagcc 2280 cgcgtcctcc gctcaaaatc actgtgtcac gatgagatcg agaacctcct ggacagtgac 2340 caccgagagc tgattggaga ttactctaag gccttcctcc tacagacagt agacggaaag 2400 caccaagacc tcaagtacat ctcaccagaa acgatggtgg ccctattgac gggcaagttc 2460 agcaacatcg tggataagtt tgtgattgta gactgcagat acccctatga atatgaaggc 2520 gggcacatca agactgcggt gaacttgccc ctggaacgcg acgccgagag cttcctactg 2580 aagagcccca tcgcgccctg tagcctggac aagagagtca tcctcatttt ccactgtgaa 2640 ttctcatctg agcgtgggcc ccgcatgtgc cgtttcatca gggaacgaga ccgtgctgtc 2700 aacgactacc ccagcctcta ctaccctgag atgtatatcc tgaaaggcgg ctacaaggag 2760 ttcttccctc agcacccgaa cttctgtgaa ccccaggact accggcccat gaaccacgag 2820 gccttcaagg atgagctaaa gaccttccgc ctcaagactc gcagctgggc tggggagcgg 2880 agccggcggg agctctgtag ccggctgcag gaccagtga 2919
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine de fusion MBP-Cdc25B2 <400> 13 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 1200 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 1260 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 1320 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagcgaa 1380 accccaaaga gtcaggtagg gaccctgctc ttccgcagcc gcagccgcct gacgcaccta 1440 tccctgtctc gacgggcatc cgaatcctcc ctgtcgtctg aatcctccga atcttctgat 1500 gcaggtctct gcatggattc ccccagccct atggaccccc acatggcgga gcagacgttt 1560 gaacaggcca tccaggcagc cagccggatc attcgaaacg agcagtttgc catcagacgc 1620 ttccagtcta tgccggatgg atttgtcttc aagatgccat ggaagcccac acatcccagc 1680 tccacccatg ctctggcaga gtgggccagc cgcagggaag cctttgccca gagacccagc 1740 tcggcccccg acctgatgtg tctcagtcct gaccggaaga tggaagtgga ggagctcagc 1800 cccctggccc taggtcgctt ctctctgacc cctgcagagg gggatactga ggaagatgat 1860 ggatttgtgg acatcctaga gagtgactta aaggatgatg atgcagttcc cccaggcatg 1920 gagagtctca ttagtgcccc actggtcaag accttggaaa aggaagagga aaaggacctc 1980 gtcatgtaca gcaagtgcca gcggctcttc cgctctccgt ccatgccctg cagcgtgatc 2040 cggcccatcc tcaagaggct ggagcggccc caggacaggg acacgcccgt gcagaataag 2100 cggaggcgga gcgtgacccc tcctgaggag cagcaggagg ctgaggaacc taaagcccgc 2160 gtcctccgct caaaatcact gtgtcacgat gagatcgaga acctcctgga cagtgaccac 2220 cgagagctga ttggagatta ctctaaggcc ttcctcctac agacagtaga cggaaagcac 2280 caagacctca agtacatctc accagaaacg atggtggccc tattgacggg caagttcagc 2340 aacatcgtgg ataagtttgt gattgtagac tgcagatacc cctatgaata tgaaggcggg 2400 cacatcaaga ctgcggtgaa cttgcccctg gaacgcgacg ccgagagctt cctactgaag 2460 agccccatcg cgccctgtag cctggacaag agagtcatcc tcattttcca ctgtgaattc 2520 tcatctgagc gtgggccccg catgtgccgt ttcatcaggg aacgagaccg tgctgtcaac 2580 gactacccca gcctctacta ccctgagatg tatatcctga aaggcggcta caaggagttc 2640 ttccctcagc acccgaactt ctgtgaaccc caggactacc ggcccatgaa ccacgaggcc 2700 ttcaaggatg agctaaagac cttccgcctc aagactcgca gctgggctgg ggagcggagc 2760 cggcgggagc tctgtagccg gctgcaggac cagtga 2796 <210> 14 <211> 2919 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: protéine de fusion MBP-Cdc25B3 <400> 14 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccatatgg aggtgcccca gccggagccc 1200 gcgccaggct cggctctcag tccagcaggc gtgtgcggtg gcgcccagcg tccgggccac 1260 ctcccgggcc tcctgctggg atctcatggc ctcctggggt ccccggtgcg ggcggccgct 1320 tcctcgccgg tcaccaccct cacccagacc atgcacgacc tcgccgggct cggcagcgaa 1380 accccaaaga gtcaggtagg gaccctgctc ttccgcagcc gcagccgcct gacgcaccta 1440 tccctgtctc gacgggcatc cgaatcctcc ctgtcgtctg aatcctccga atcttctgat 1500 gcaggtctct gcatggattc ccccagccct atggaccccc acatggcgga gcagacgttt 1560 gaacaggcca tccaggcagc cagccggatc attcgaaacg agcagtttgc catcagacgc 1620 ttccagtcta tgccggtgag gctgctgggc cacagccccg tgcttcggaa catcaccaac 1680 tcccaggcgc ccgacggccg gaggaagagc gaggcgggca gtggagctgc cagcagctct 1740 ggggaagaca aggagaatga tggatttgtc ttcaagatgc catggaagcc cacacatccc 1800 agctccaccc atgctctggc agagtgggcc agccgcaggg aagcctttgc ccagagaccc 1860 agctcggccc ccgacctgat gtgtctcagt cctgaccgga agatggaagt ggaggagctc 1920 agccccctgg ccctaggtcg cttctctctg acccctgcag agggggatac tgaggaagat 1980 gatggatttg tggacatcct agagagtgac ttaaaggatg atgatgcagt tcccccaggc 2040 atggagagtc tcattagtgc cccactggtc aagaccttgg aaaaggaaga ggaaaaggac 2100 ctcgtcatgt acagcaagtg ccagcggctc ttccgctctc cgtccatgcc ctgcagcgtg 2160 atccggccca tcctcaagag gctggagcgg ccccaggaca gggacacgcc cgtgcagaat 2220 aagcggaggc ggagcgtgac ccctcctgag gagcagcagg aggctgagga acctaaagcc 2280 cgcgtcctcc gctcaaaatc actgtgtcac gatgagatcg agaacctcct ggacagtgac 2340 caccgagagc tgattggaga ttactctaag gccttcctcc tacagacagt agacggaaag 2400 caccaagacc tcaagtacat ctcaccagaa acgatggtgg ccctattgac gggcaagttc 2460 agcaacatcg tggataagtt tgtgattgta gactgcagat acccctatga atatgaaggc 2520 gggcacatca agactgcggt gaacttgccc ctggaacgcg acgccgagag cttcctactg 2580 aagagcccca tcgcgccctg tagcctggac aagagagtca tcctcatttt ccactgtgaa 2640 ttctcatctg agcgtgggcc ccgcatgtgc cgtttcatca gggaacgaga ccgtgctgtc 2700 aacgactacc ccagcctcta ctaccctgag atgtatatcc tgaaaggcgg ctacaaggag 2760 ttcttccctc agcacccgaa cttctgtgaa ccccaggact accggcccat gaaccacgag 2820 gccttcaagg atgagctaaa gaccttccgc ctcaagactc gcagctgggc tggggagcgg 2880 agccggcggg agctctgtag ccggctgcag gaccagtga 2919
Claims (10)
1. Protéine caractérisée en ce qu'il s'agit d'une protéine de fusion entre la protéine liant le maltose (MBP) et une protéine choisie parmi les protéines Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 et Cdc25C.
2. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les protéines suivantes :
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B1 humaine et la MBP, laquelle est codée par la séquence SEQ. ID n o 12 ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B2 humaine et la MBP, laquelle est codée par la séquence SEQ. ID n o 13 ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B3 humaine et la MBP, laquelle est codée par la séquence SEQ. ID n o 14 ; et - une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25C humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n o 1.
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B1 humaine et la MBP, laquelle est codée par la séquence SEQ. ID n o 12 ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B2 humaine et la MBP, laquelle est codée par la séquence SEQ. ID n o 13 ;
- une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25B3 humaine et la MBP, laquelle est codée par la séquence SEQ. ID n o 14 ; et - une protéine de fusion entre la phosphatase Cdc25C humaine et la MBP, laquelle est caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n o 1.
3. Protéine selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ. ID n o 1.
4. ADN caractérisé en ce qu'il code pour une protéine selon l'une des revendications 1 à
3.
3.
5. ADN complémentaire à l'ADN selon la revendication 4.
6. Souche bactérienne caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche bactérienne transfectée par un plasmide choisi parmi le plasmide de séquence SEQ. ID n o 9, le plasmide de séquence SEQ. ID n o 10, le plasmide de séquence SEQ. ID n o 11 et le plasmide de séquence SEQ. ID n o 5.
7. Procédé de préparation d'une protéine selon la revendication 1, caractérisé
en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes :
- culture de la souche bactérienne JM 109 transfectée par le plasmide de séquence SEQ. ID n o 9, le plasmide de séquence SEQ. ID n o 10, le plasmide de séquence SEQ. ID n o 11 ou le plasmide de séquence SEQ. ID n o 5, dans un milieu LB
additionné
d'ampicilline;
- induction de la synthèse de la protéine de fusion par ajout d'isopropylthiogalactoside ;
- lyse des bactéries ;
- purification de la protéine de fusion obtenue par chromatographie sur résine d'amylose-agarose et récupération des fractions contenant la protéine purifiée.
en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes :
- culture de la souche bactérienne JM 109 transfectée par le plasmide de séquence SEQ. ID n o 9, le plasmide de séquence SEQ. ID n o 10, le plasmide de séquence SEQ. ID n o 11 ou le plasmide de séquence SEQ. ID n o 5, dans un milieu LB
additionné
d'ampicilline;
- induction de la synthèse de la protéine de fusion par ajout d'isopropylthiogalactoside ;
- lyse des bactéries ;
- purification de la protéine de fusion obtenue par chromatographie sur résine d'amylose-agarose et récupération des fractions contenant la protéine purifiée.
8. Application d'une protéine selon la revendication 1 à une méthode d'identification de modulateurs de la protéine Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C, caractérisée en ce que ladite méthode comporte les étapes successives suivantes :
- ajout, à une solution de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine, de la protéine de fusion telle qu'obtenue par un procédé de préparation selon la revendication 7 et d'un composé
présumé être un modulateur de la protéine Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C
;
- détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite rapportée à
la quantité initiale de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine.
- ajout, à une solution de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine, de la protéine de fusion telle qu'obtenue par un procédé de préparation selon la revendication 7 et d'un composé
présumé être un modulateur de la protéine Cdc25B1, Cdc25B2, Cdc25B3 ou Cdc25C
;
- détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite rapportée à
la quantité initiale de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine.
9. Application selon la revendication 8, caractérisée en ce que la détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite rapportée à la quantité initiale de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine est effectuée par mesure de l'absorbance liée à la 3-O-méthylfluorescéine à la longueur d'onde de 477 nm.
10. Application selon la revendication 8, caractérisée en ce que la détermination de la quantité de 3-O-méthylfluorescéine produite rapportée à la quantité initiale de phosphate de 3-O-méthylfluorescéine est effectuée par fluorimétrie en utilisant une excitation à la longueur d'onde de 475 nm et une lecture à la longueur d'onde de 510 nm.
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9915722A FR2815347A1 (fr) | 1999-12-14 | 1999-12-14 | METHODE D'OBTENTION DE LA PHOSPHATASE Cdc25C HUMAINE ET METHODE D'IDENTIFICATION DE MODULATEURS DE LA PHOSPHATASE Cdc25C HUMAINE |
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