JP2003516756A - ヒトＣｄｃ２５ホスファターゼの取得方法及びヒトＣｄｃ２５ホスファターゼモジュレーターの同定方法 - Google Patents

ヒトＣｄｃ２５ホスファターゼの取得方法及びヒトＣｄｃ２５ホスファターゼモジュレーターの同定方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトcdc25B1、cdc25B2、cdcB3及びcdc25Cホスファターゼを得る方法に関する。特に、本発明は、ヒトcdc25B1、cdc25B2、cdcB3又はcdc25Cホスファターゼと、大腸菌のマルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質、該融合タンパク質をコードするDNA配列、上記融合タンパク質の製造方法及びヒトcdc25B1、cdc25B2、cdcB3又はcdc25Cタンパク質モジュレーターの同定方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ヒトCdc25ホスファターゼの取得方法に関する。本発明は、また、
ヒトCdc25ホスファターゼモジュレーターの同定方法に関する。
【０００２】 細胞分割過程への細胞の参入は一群のキナーゼによって調節されそして細胞周
期の種々の相の同調(synchronization)に有用なホスファターゼにより細胞構造(
cell architecture)の再組織化(reorganisation)が行われる。
【０００３】 サイクリン依存性キナーゼ(cycline dependent kinase)(CDK)は上記した調節
において主要な役割を果たし、このキナーゼ類の種々の阻害剤が同定されている
。これらの化合物の一つ(フラボピリドール)は既に臨床フェーズII中にある (Senderowicz and Sausville,J.Natl.Cancer Inst.(2000),92,376-387)。
【０００４】 これらのCDKは、Cdc25ホスファターゼによりチロシン及びスレオニン残基につ
いて行われる脱リン酸化により活性化される。ヒト細胞においては、Cdc25タン
パク質は、一つの系：Cdc25A、Cdc25B及びCdc25Cによって示される (Cans et al, Medicine Sciences(1998),3,269-274)。
【０００５】 少数のCdc25阻害剤が同定されているが、これらは弱い活性しか有していない
(Baratte,B., Meijer,L., Galaktinov,K., Beach,D., Anticancer Res. (1992),
12,873-880；Rice,R.L.et al, Biochemistry(1997),36,15965-15974；Ham,S.W.
, Park,J., Lee,S.J., Kim,W., Kang,K., Choi, K.H., Bioorg. Med. Chem.
Lett. (1998),8,2507-2510参照)。
【０００６】 Cdc25B2は、Cdc25Bホスファターゼ(Cdc25B1と称する)に類似するプロテインチ
ロシンホスファターゼである。これはバーキットリンパ腫をコードするDNAバン
クにおいて同定されている。Cdc25B2は、触媒ドメインの上流側で、14個のアミ
ノ酸が挿入され、41個のアミノ酸が削除されていることによりCdc25B1と相違す
る。Cdc25B1とCdc25B2は同一の遺伝子のスプライシング変異体(sｐlicing varia
nt)である。14個及び41個のアミノ酸の２つの配列を有する第３の変異体、Cdc25
B3は上記と同一のバンクから同定される(Baldin et al, Oncogene (1997), 14,
2485-2495)。これらの３種の変異体はプライモカルチャー (primoculture)及び細胞系統で検出される。３種の変異体の分析によりCdc25B2
は試験した全ての系統においてCdc25B3より弱く発現されるが、２種の変異体の
発現はG２相(G２phase)及び有糸分裂中に増大することが示された（Forrest
et al, Biochem.Biophys.Res.Commun.(1999),260,510-515）。Hernandez等によ
りCdc25B1,-B3及び-Cではなしに、Cdc25A及び-B2は、多数のリンパ腫中で過剰発
現されること(overexpress)が報告されている(35％及び39％)(Hernandez
et al, Int.J.Cancer(2000),89(2),148-52）。通常のリンパ球はCdc25B1及び-B3
メッセンジャーを発現し、Cdc25A,-B2及び-Cのメッセンジャーを非常に弱く発現
する。
【０００７】 酵母における３種のCdc25B変異体の過剰発現は、Cdc25B2はB1又はB3より活性
であると考えられることを示している(B2＞B3＞B1)。従って、Cdc25Bの交互スプ
ライシング(alternative splicing)は細胞増殖を制御する役割を行う。
【０００８】 Cdc25Cホスファターゼは、更に、それ自体、他のCds1又はChk1酵素によるセリ
ン-216上でのリン酸化により調節され、14-3-3プロテイン系の高度に保存された
(conserved)メンバーにそれ自体を結合させる(Zeng,Y. et al,Nature (1998),
395,507-510)。
【０００９】 より効果的なホスファターゼ阻害剤の研究においては、そのホスファターゼ活
性を、大規模なスクリーニングを許容するように、限定されない量で保持するタ
ンパク質を得るという必要性を克服する必要がある。
【００１０】 タンパク質の研究においては、特に、生物物理学(サイズ、配列、構造等)、生
化学(活性、安定性、調節等)又は製剤学(活性化剤、阻害剤等)のごとき分野にお
いて、分析し得る特性の全てを満足させるために多量のタンパク質を必要とする
。
【００１１】 多量のタンパク質の製造と精製は、下記のごとき種々の障害に遭遇する： −タンパク質の発現の欠如又はタンパク質の弱すぎる発現； −先端の切断された(truncated)タンパク質の発現； −生物学的活性を有していないタンパク質の取得 −精製時のタンパク質の生物学的活性の損失； −非常に低い精製収率； −貯蔵時の生物学的活性の損失； −製造源の損失。
【００１２】 これらの段階の各々の完了に成功した場合にのみ、生物学的に活性なタンパク
質を制限されない量で、長期間、製造することが可能である。かかる要求に直面
した場合、多数のタンパク質の精製は、ある場合には、非常に困難な、不可能で
もあり得るプロセスである。
【００１３】 しかしながら、下記のごとき新規な製造及び精製手段を開発するために、多大
な努力がなされている： −大規模な細胞培養(動物及び植物)； −大規模な微生物培養(バクテリア、酵母)； −特定の抗体を使用するタンパク質混合物からの免疫沈降； −特定のリガンド(エフェクター、リプレッサー、アクチベーター)を使用する アフィニテイークロマトグラフィー； −タンパク質の分子量及び等電点の関数としての二元電気泳動(bidimensional electrophoresis）； −毛管電気泳動； −異なる塩類を使用する示差沈降(differential precipitation)による富化。
【００１４】 更に、新しいシステムにおいては、現在、タンパク質の製造と精製を結合させ
ることが試みられている。これらのシステムは、アフィニテイークロマトグラフ
ィーを可能にするタンパク質と融合した組換え体タンパク質(tagプロテインと呼
ばれる)の製造についての、しばしば誘導性の発現(often inducible
expression）を可能にする。この最後の部分は融合の位置を特異的に認識するプ
ロテアーゼの添加により省略し得る(Sheibani,N., Prep. Biochem. Biotechnol.
(1999),29,77-90)。提案されているシステムの数は増大しているが、これらの
種々の試みの成功性は、精製すべきタンパク質の種類に大きく依存している。タ
ンパク質の立体配座と溶解性は、依然として、これらの新しいシステムにおいて
制御することの不可能なパラメーターである(Guise,A.D., West,S.M.,
Chaudhuri,J.B., Mol.Biotechnol.(1996),6,53-64； Kelley,R.F.,Winkle,M.E.,
Genet.Eng.(N.Y.,1990),12,1-19参照）。
【００１５】 Cdc25B1、Cdc25B2、Cdc25B3又はCdc25Cタンパク質は、下記のごとき系と融合
し得る： 1. ６ ヒスチジン アンチ-モチーフ抗体(six histidine anti-motif antibody
)抗体によって認識される、６個のヒスチジンの残基(Katsafans,G.C., Moss,B.,
Virology(1999),258,469−479）； ２. 3F10抗体によって認識される、インフルエンザからの赤血球凝集素 (hemaglutinin)の９個のアミノ酸の残基(Robert,I., Quirin-Stricker,C.,
J. Mol.Neurosci.(1998),11,243-251）； ３．P5D4によって認識される、小胞口内炎ウイルスの11個のアミノ酸の残基(T
he Maout,S.,et al, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1997),94,13329-13334)； ４．抗-AUI抗体によって認識される、ウシ乳頭腫ウイルス（AUI）のカプシド
タンパク質の６個のアミノ酸の残基(The Maout,S.,et al, Proc.Natl. Acad.Sci
. U.S.A.(1997),94,13329-13334)； ５．HPC4抗体によって認識される、Cタンパク質のH鎖の12個のアミノ酸の残基
(Rezaie,A.R.,et al, Protein Expr.Purif.(1992),3,453-460)； ６．9E10抗体によって認識される、C-mycタンパク質(Bae,S.H.,et al.,
J.Biol.Chem.(1999),274,14624-14631)； ７．アミノ-フェニル-β-D-チオガラクトピラノシドに対して親和性を有する
ベータガラクトシダーゼ(Germino,J., Bastia,D., Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.
(1984), 81,4692-4696)； ８．抗GST抗体によって認識される、グルタチオンS-トランスフェラーゼタン
パク質(Carr,S.,et al., Vaccine(1999),18,153-159)； ９．アビジンに対して親和性有するビオチン-カルボキシラーゼ担体 （Germino,F.J., Moskowitz,N.K., Methods Enzymol.(1999),303,422-450）； 10．キチンに対して親和性を有するインテイン(intein)タンパク質 (Chong,S., et al, Gene(1997),192,271-281；Carr,S.,et al., Vaccine (1999), 18,153-159)； 11．アミロースに対して親和性を有するマルトース結合タンパク質 (Aheded,A.,et al, Prep.Biochem.Biotechnol.(1999),29、163-176)。
【００１６】 それにも拘わらず、操作が実際に成功するか否かを予測させるものは何も存在
していない。
【００１７】 しかしながら、本出願人は、今般、ヒトCdc25B1、Cdc25B2、Cdc25B3及びCdc25
C酵素を活性な形でかつ制限されない量で得ることのできる方法を完成した。本
発明によれば、一方においては、このタンパク質の生理学的及び/又は生理病理
学的作用の調査と研究が促進され、他方においては、これらの活性を変性する薬
剤の調査が促進される。
【００１８】 本発明によれば、ヒトCdc25B1、Cdc25B2、Cdc25B3又はCdc25Cタンパク質とマ
ルトース結合タンパク質(MBP)との組換え体であって、MBP部分の分離を必要とす
ることなしに、その活性を保持しており、かくして、プロテアーゼの混入を回避
し得る組換え体を得ることができる。
【００１９】 従って、本発明の第１の主題は、マルトース結合タンパク質(MBP)と、Cdc25B1
、Cdc25B2、Cdc25B3及びCdc25Cタンパク質から選ばれたタンパク質との融合タン
パク質である。
【００２０】 本発明は、特に、下記のタンパク質から選ばれたタンパク質に関する： −配列SEQ.ID No.12（後記）によってコードされることを特徴とする、ヒト Cdc25B1ホスファターゼとMBPとの融合タンパク質； −配列SEQ.ID No.13（後記）によってコードされることを特徴とする、ヒト Cdc25B2ホスファターゼとMBPとの融合タンパク質； −配列SEQ.ID No.14（後記）によってコードされることを特徴とする、ヒト Cdc25B3ホスファターゼとMBPとの融合タンパク質；及び −配列SEQ.ID No.１(後記)によってコードされることを特徴とする、ヒト Cdc25CホスファターゼとMBPとの融合タンパク質。
【００２１】 本発明の主題は、更に、前記融合タンパク質をコードするDNA及び前記融合タ
ンパク質をコードするDNAに相補的なDNAである。
【００２２】 更に、本発明の主題は −配列SEQ.ID No.９(後記)を有するプラスミドによってトランスフェクトされ
た細菌株(bacterial strain) JM 109：この菌株はCdc25B1タンパク質の調製に有
用である； −配列SEQ.ID No.10(後記)を有するプラスミドによってトランスフェクトされ
た細菌株JM 109：この菌株はCdc25B2タンパク質の調製に有用である； −配列SEQ.ID No.11(後記)を有するプラスミドによってトランスフェクトされ
た細菌株JM 109：この菌株はCdc25B3タンパク質の調製に有用である；及び −配列SEQ.ID No.５(後記)を有するプラスミドによってトランスフェクトされ
た細菌株JM 109：この菌株はCdc25Cタンパク質の調製に有用である。
【００２３】 本発明は、更に、下記の連続工程： −配列SEQ.ID No.９を有するプラスミド、配列SEQ.ID No.10を有するプラスミ
ド、配列SEQ.ID No.11を有するプラスミド又は配列SEQ.ID No.５を有するプラス
ミドによってトランスフェクトされた細菌株JM 109を、アンピシリンを添加した
LB培地中で培養する工程； −イソプロピルチオガラクトシドを添加することにより融合タンパク質の合成
を誘導する工程； −バクテリアを溶菌(lysis)する工程；及び −得られた融合タンパク質をアミロースーアガロース樹脂上でのクロマトグラ
フィーにより精製しついで精製されたタンパク質を含有するフラクションを回収
する工程； からなることを特徴とする前記融合タンパク質の調製方法に関する。
【００２４】 最後に、本発明は、下記の連続工程： −前記した調製方法によって得られるごとき融合タンパク質とCdc25B1、
Cdc25B2、Cdc25B3又はCdc25Cタンパク質のモジュレーターと推定され化合物とを
、3-O-メチルフルオレセインホスフェートの溶液に添加する工程； −3-O-メチルフルオレセインホスフェートの当初の量に対する、生成した 3-O-メチルフルオレセインの量を測定する工程； からなることを特徴とする、Cdc25B1、Cdc25B2、Cdc25B3又はCdc25Cタンパク質
のモジュレーターを同定するための方法における、前記融合タンパク質の使用に
関する。
【００２５】 生成した3-O-メチルフルオレセインの量の測定は、例えば、溶液の光学濃度、
即ち、477nmの波長での3-O-メチルフルオレセインに関連する吸光度を測定する
ことにより、或いは、475nmの波長での励起を使用するかつ510nmの波長で読み取
る蛍光定量法により行い得る。
【００２６】 別に定義されていない限り、本明細書中で使用される技術及び科学用語は、本
発明の属する分野での通常の専門家によって理解されているものと同一の意味を
有する。同様に、本明細書中で参照されている刊行物、特許出願、全ての特許及
び他の参照文献は、参照として、本明細書中に包含される。
【００２７】実験の部 A/ MBP-Cdc25C融合タンパク質： 1−MBP-Cdc25C用の発現ベクターの構築 1.1−使用したシステムの原理 使用したシステム(New England Biolabs #800-p-MALTM融合タンパク質及び精
製システム)は、興味のあるタンパク質、ここでは、ヒトCdc25Cと、大腸菌のバ
クテリアタンパク質MBP(マルトース結合タンパク質)との融合タンパク質の製造
に基づくものである。この方法によれば、マルトースに対するMBPの親和性によ
り、融合タンパク質の一工程精製が可能である。
【００２８】 1.2−Cdc25CのcDNAの起源 ヒトCdc25CホスファターゼをコードするDNAは受託番号(accession number)
4502706に対応する。
【００２９】 このプラスミドから出発して、C-XBAI SENNSE及びANTI-SENNSE C-XBAIプライ
マー(それぞれ、配列SEQ ID No.３及び４を有する)を使用して、ポリメラーゼ連
鎖反応(PCR)より、Cdc25CをコードするDNAを増幅しついでベクター pcDNA3-HAのXbaI部位に導入して、ベクターCdc25C pcDNA3-HAを製造した Cdc25C/XbaIインサートは、この段階では、その全体において配列決定された。
【００３０】 C-XBAI SENNSEプライマーは、その配列として、以下に示す配列SEQ ID No.３
を有する： 5’-GTTCTAGAAT GTCTAGAA CTCTTC-3’ C-XBAI ANTI-SENNSEプライマーは、その配列として、以下に示す配列SEQ ID
No.４を有する： 5’-GGCTCTGA-GTTGCGC-CGG-3’
【００３１】 1.3−ベクターpMAL−HsCdc25Cの構築 ベクターCdc25C pcDNA3-HAをXbaIで消化し、Cdc25C/XbaIインサート(1456塩基
対)を精製しついでベクター p-MALTM-c2X(New England Biolabs, #800-76)の
XbaI部位に導入して、ベクター p-MAL-Hs Cdc25C(配列SEQ ID No.２)を有する)
を製造した。このベクターは、イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)によって誘
導し得るPtacバクテリアプロモーターから、868アミノ酸の融合タンパク質 MBP-Cdc25Cを製造することを可能にする。
【００３２】 XBAI制限末端を有するHs Cdc25Cの配列SEQ ID No.２は下記の通りである：
【００３３】 (XBAI部位には連続的に下線が引かれており、Cdc25Cのオープンリーデイングフ
レーム(ORF)には点線が引かれている)
【００３４】 1.4−JM109/p-MAL-Hs Cdc25C株の創成 ベクターCdc25C pMAL−Hsを大腸菌(E.Coli) JM109(Strategene #200271)株に
導入した。単離されたコロニーを選択し、IPTGの存在下での培養後の、97kDAの
理論見掛分子量を有するタンパク質の生成を、変性ポリアクリルアミドゲル上で
かつクーマシーブルーで染色して全バクテリアタンパク質を分析することにより
観察した。ついで、融合タンパク質の同一性を抗−Cdc25C抗体を使用するウエス
タンブロット及び免疫検定により確認した。
【００３５】 最後に、このクローンから単離されたプラスミドDNAをCdc25Cに相当する領域
において配列決定して、サブ−クローニング及び/又はDNAの形質転換中に発生し
得る、配列の突然変異又は変性が生じていないことを確認した。
【００３６】 JM109/p-MAL-Hs Cdc25C株について、下記の配列(SEQ ID No.５と称する)が得
られた： (XBA1部位には、一重の連続線が引かれており、Cdc25CのORFには点線が引かれて
おり、マルトース結合タンパク質(MBP)配列には二重の連続線が引かれており、
太字の配列はJM109株から単離しついで配列決定したプラスミドDNA領域に相当す
る)
【００３７】 このクローンは、添加されたグリセロール(最終濃度25％)を含有する飽和培地
、即ち、“ストックグリセロール”の形で-80℃で保存し得る。
【００３８】 ２−MBP-Cdc25Cタンパク質の製造及び精製 注：特に説明がない場合、全ての化学薬剤はSIGMA-ALDRICHによって提供さ
らたものである。
【００３９】 2.1−バクテリアの培養及び融合タンパク質の発現の誘導 50mlのLB培地＋アンピシリン100μg/ml(LBamp)にJM109/p-MAL-Cdc25Cクローン
からの100μlのストックグルセロールを接種し、撹拌下(180-220rpm)、37℃で14
〜16時間培養した。ついで、この予備培養物をLBamp培地＋２g/lのグルコース中
で50倍に希釈し(培地１リットル当り、20ml)ついで37℃/180rpmで培養して、600
nmでの光学濃度を0.55〜0.60に到達させた。ついで、IPTG(0.3
mM）を37℃で３時間に亘って添加することにより、融合タンパク質の合成を誘導
した。バクテリアを遠心分離により捕集し、培養物１リットル当り、40mlの冷
PBSで1回洗浄しついで細菌ペレットを液体窒素中で凍結し、-80℃で貯蔵した。
【００４０】 誘導の分析は、誘導の前及び後に取出した2.5 x 107個の細胞を変性ポリアク
リルアミドゲル上に沈着させついでタンパク質をクーマシーブルーで染色するこ
とにより直ちに行った(それぞれ、図１、ライン１及び２)。
【００４１】 2.2−溶解及び抽出 １リットルの誘導培養物に相当する細菌ペレットを氷中に溶解し、35mlの溶解
緩衝液(lysis buffer)(20mMのTris-HCl、pH 7.4；250mMのNaCl；１mMのEDTA；１
mMのDTT；10μg/mlのリゾチーム；１μg/mlのロイペプチン； ２μg/mlのアプロチニン；１mMのPMSF）中に再懸濁させついで氷中で45分間イン
キュベートした。ついで、細菌懸濁液を音波処理し(不連続モード50％で１分間
の４サイクル、１分間の中断)、ついで、110000gで35分間遠心分離した。上澄み
液又は可溶性抽出物をMBP-Cdc25Cタンパク質の生成のために保存した (図１、ライン３)。
【００４２】 2.3−アミロース−アガロース樹脂上でのアフィニテイー精製 １リットルの誘導細菌培養物に相当する可溶性抽出物については、２mlのアミ
ロース−アガロース樹脂(New England Biolabs #800-21)を、HR 5/10クロマトグ
ラフカラム(Pharmacia)上に沈着させ、20ml(10容量)のカラム緩衝液(column buf
fer)(20mMのTris-HCl、pH 7.4；250mMのNaCl；１mMのEDTA；１mMのDTT；１μg/m
lのロイペプチン；２μg/mlのアプロチニン)で洗浄した。可溶性抽出物を0.15ml
/分の速度でアフィニテイーカラムを通過させた；溶出液(即ち、アミロース−ア
ガロース上に保持されなかったフラクション)を分析のために捕集した(図１、ラ
イン４)。カラムを20ml(10容量)のカラム緩衝液で洗浄した。可溶性抽出物の通
過後のアフィニテイーマトリックスは場合により分析し得る(図１、ライン５)。
【００４３】 アフィニテイーマトリックスのタンパク質の溶離をマルトース緩衝液(20mMの
Tris-HCl、pH 7.4；250mMのNaCl；１mMのEDTA；１mMのDTT；10mMのマルトース)
を使用して行った。0.5mlの溶離フラクションが20個捕集された。各々のフラク
ションについて、全タンパク質濃度をブラッドフォード型試験により評価し、そ
して、フラクションの分析は、変性ポリアクリルアミドゲル上に沈着させついで
クーマシーブルーで染色することにより行った(図１、ライン６)。完全なMBP-Cd
c25C融合タンパク質が全タンパク質の少なくとも９０％を占めるフラクションを
捕集してバッチを形成させ、その活性を試験した。バッチは-80℃で貯蔵した。
【００４４】 XbaI部位間に含有されるインサートの配列決定により次の結果が得られた： (XbaI部位には一重の連続線が引かれており、Cdc25CのORFには点線が引かれてお
りそしてイタリックで記載されている配列はマルトース結合タンパク質(MBP)のO
RFに相当する)
【００４５】 従って、得られたMBP-Cdc25C融合タンパク質の配列は、以下に示す配列SEQ
ID No.１に相当する： ３−MBP-Cdc25C融合タンパク質の活性の測定： MBP-Cdc25Cタンパク質のホスファターゼ活性の測定は、3-O-メチルフルオレセ
インホスフェート(OMPF)の脱リン酸化試験により、反応生成物(OMF)の477nmでの
吸光度(OD477)を測定することにより行った。
【００４６】 溶離緩衝液(2.3で述べたものと同一)中に貯蔵したMBP-Cdc25Cタンパク質を、
ホスファターゼ反応緩衝液(50mMのTris-HCl pH 8.2；50mMのNaCl；１mMのDTT；
20％グリセロール)中で、20nMの濃度に周囲温度で希釈し、全反応容量を１mlと
した。OMPFの0.3mM溶液(100％DMSO中の7.5mMの貯蔵溶液(Sigma #M2629)から、そ
の場で、調製)を添加することにより反応を開始させ、分光光度計用の使い捨て
ポリスチレンキュベット(Fisher Scientific #12-103-056)中で25℃で生起させ
た。90分後にOD477nmを測定した。吸光度測定用の対照は、0.3mMのOMFPを含有す
るが、MBP-Cdc25Cタンパク質を含有していない反応緩衝液により構成した(反応
時間t0)。活性の測定結果の代表的な例は図２に例示されている。
【００４７】 B/ MBP-Cdc25B1、MBP-Cdc25B2及びMBP-Cdc25B3融合タンパク質： １-MBP-Cdc25B1、MBP-Cdc25B2及びMBP-Cdc25B3用の発現ベクターの構築 1.1−使用したシステムの原理 使用したシステム(New England Biolabs #800-p-MALTM融合タンパク質及び精
製システム)は、興味のあるタンパク質、ここでは、Cdc25Bと、大腸菌のバクテ
リアタンパク質MBP(マルトース結合タンパク質)との融合タンパク質の製造に基
づくものである。この方法によれば、マルトースに対するMBPの親和性により、
融合タンパク質の一工程精製が可能である。
【００４８】 1.2−Cdc25BのcDNAの起源 ヒトCdc25Bホスファターゼの３種のスプラシング変種(splicing variant)をコ
ードするDNAは受託番号M81934及びZ68092に相当する。
【００４９】 1.3−pMAL-Hs Cdc25Bの構築 Cdc25Bの３種の変種の相違は、分子の調節領域(reglulatory region)に位置す
る14個及び42個のアミノ酸のドメインをコードする２つのエクソンに関係し (Baldin et al., Oncogene(1997),14,2485-2490)、５’及び３’領域には影響
しない。従って、これらの３種の変種について使用されるクローニング法は同一
である。
【００５０】 NdeI(Klenow)/BamHIインサートの形のCdc25BのcDNAを、pMALTM-C2Xベクター (NEW England Biolabs, #800-76)のEcoRI(Klenow)/BamHI部位に導入して、それ
ぞれ、pMAL-Hs Cdc25B1、pMAL-Hs Cdc25B2及びpMAL-Hs Cdc25B3を製造した。こ
れらのベクターはイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)により誘導し得るPtacバ
クテリアプロモーターからの、MBP-Cdc25B1(962個のアミノ酸)、MBP-Cdc25B2(93
3個のアミノ酸)及びMBP-Cdc25B3(974個のアミノ酸)融合蛋白質の製造を可能にす
る。
【００５１】 NdeI及びBamHI制限末端を有するHs Cdc25B1の配列SEQ ID No.６は下記の通り
である： (NdeI及びBamHI部位は連続的に下線が引かれている)
【００５２】 NdeI及びBamHI制限末端を有するHs Cdc25B2の配列SEQ ID No.７は下記の通り
である： (NdeI及びBamHI部位は連続的に下線が引かれている)
【００５３】 NdeI及びBamHI制限末端を有するHs Cdc25B3の配列SEQ ID No.８は下記の通り
である： (NdeI及びBamHI部位は連続的に下線が引かれている)
【００５４】 1.4−JM109/pMAL-Cdc25B1,B2及びB3株の創生 ベクターCdc25B1−3の各々を大腸菌JM109(Strategene #200271) 株に導入した
。コロニーをIPTGの存在下で培養した後に融合タンパク質を生成する能力に基づ
いて選択した。融合タンパク質の同一性(edentity)をCdc25Bに対するポリクロナ
ール抗体を使用する免疫検定により確認した。
【００５５】 これらの３種のクローンから単離されたプラスミドDNAをCdc25Bに相当する領
域において配列決定した。下記の配列が得られた(二重に下線が引かれている部
分はMBPのORFに相当し、点線が引かれている部分はCdc25B1、Cdc25B2又は
Cdc25B3のORFに相当する)：
【００５６】 ・SEQ ID No.９(pMAL-Hs-Cdc25B1)：
【００５７】 ・SEQ ID No.10(pMAL-Hs-Cdc25B2)：
【００５８】 ・SEQ ID No.11(pMAL-Hs-Cdc25B3)：
【００５９】 これらのクローンを、グルセロールを添加した飽和培養液(最終濃度25％)の形
で-80℃に保持した。ついで、これらの菌株を以後の全ての製造プロセスに使用
した。
【００６０】 ２−組換え体MBP-Cdc25B1、MBP-Cdc25B2及びMBP-Cdc25B3タンパク質の製造及び
精製： 組換え体MBP-Cdc25B1、B2及びB3タンパク質を、MBP-Cdc25Cについて述べた方
法と全く同一の方法で製造した。
【００６１】 MBP-Cdc25B1、MBP-Cdc25B2及びMBP-Cdc25B3融合タンパク質について、それぞ
れ、配列SEQ ID No.12、SEQ ID No.13及びSEQ ID No.14が得られた：
【００６２】 ・SEQ ID No.12(MBP-Cdc25B1)：
【００６３】 ・SEQ ID No.13(MBP-Cdc25B2)：
【００６４】 ・SEQ ID No.14(MBP-Cdc25B3)：
【００６５】 3−MBP-Cdc25B1、MBP-Cdc25B2及びMBP-Cdc25B3融合タンパク質の活性の測定： 3−MBP-Cdc25B1、MBP-Cdc25B2及びMBP-Cdc25B3融合タンパク質の活性を MBP-Cdc25C融合タンパク質について述べたものと同一の条件で測定した。結果は
図３に示されている。
【００６６】図の説明 図１は、MBP-Cdc25C融合タンパク質の発現の誘導についての分析クロマトグラ
フィーを示す。図１のライン１及び２は、それぞれ、IPTGを添加した場合と添加
しない場合の全JM109/pMAL-Cdc25C抽出物に相当する。ライン３は可溶性抽出物
に相当する。ライン４及び５は、それぞれ、アミロース−アガロース上に保持さ
れたフラクション及び保持されなかったフラクションに相当する。最後に、図１
のライン６は、実際上、融合タンパク質だけを含有する溶離フラクションNo.12
に相当する。
【００６７】 図２は、組換え体MBP-Cdc25Cタンパク質の活性の測定結果を示す(“＋”はサ
ンプルにメナジオンを添加したことを示し、“−”はサンプルにメナジオンを添
加しなかったことを示す)。
【００６８】 図３は、組換え体MBP-Cdc25B1、MBP-Cdc25B2及びMBP-Cdc25B3タンパク質の活
性の測定結果を示す。反応は試験1回当り、300ngの酵素を使用して実施されてい
る。対照試験では同一濃度のMBPを使用した。蛍光測定値から対照については
0.0025Δfluo/秒、Cdc25B1については0.0361Δfluo/秒、Cdc25B2については0.03
50Δfluo/秒及びCdc25B3については0.0372Δfluo/秒のスロープを算定すること
ができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、MBP-Cdc25C融合タンパク質の発現の誘導についての分析クロマトグラ
フィーを示す。
【図２】 図２は、組換え体MBP-Cdc25Cタンパク質の活性の測定結果を示す。
【図３】 図３は、組換え体MBP-Cdc25B1、MBP-Cdc25B2及びMBP-Cdc25B3タンパク質の活
性の測定結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｑ 1/42 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ００／１２００８ (32)優先日 平成12年９月21日(2000．9．21) (33)優先権主張国 フランス（ＦＲ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゴーバン−グラマテイカ，フランソワ フランス国 エフ−47000 アガン，リュ プイ デュ ソーモン，６ (72)発明者 デュコミュン，ベルナール フランス国 エフ−31450 ベルベロー， シュマン デュ パラデイ (72)発明者 プレヴオスト，グレゴワール フランス国 エフ−92160 アントニイ， アヴニュー ド ラ プロヴイダンス，12 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA11 CA04 DA06 EA04 GA11 HA08 HA09 4B050 CC03 CC05 DD07 EE02 FF09C LL01 4B063 QA01 QA18 QQ13 QR13 QR76 4B064 AG01 CA02 CA19 CB04 CC24 CE12 DA01 DA05 4B065 AA26X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA29 CA44 4H045 AA10 AA20 AA30 BA09 BA41 CA40 DA89 EA20

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 マルトース結合タンパク質(MBP)と、Cdc25B1、Cdc25B2、Cdc25
    B3及びCdc25Cタンパク質から選ばれたタンパク質との融合タンパク質であること
    を特徴とするタンパク質。
  2. 【請求項２】 下記のタンパク質から選ばれた請求項１に記載のタンパク質： −配列SEQ.ID No.12によってコードされる、ヒトCdc25B1ホスファターゼとMBP
    との融合タンパク質； −配列SEQ.ID No.13によってコードされる、ヒトCdc25B2ホスファターゼとMBP
    との融合タンパク質； −配列SEQ.ID No.14によってコードされる、ヒトCdc25B3ホスファターゼとMBP
    との融合タンパク質；及び −配列SEQ.ID No.１によってコードされる、ヒトCdc25CホスファターゼとMBP
    との融合タンパク質。
  3. 【請求項３】 配列SEQ.ID No.１によってコードされる、請求項２に記載のタ
    ンパク質。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３の一つに記載のタンパク質をコードすることを特
    徴とするDNA。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載のDNAに対する相補的DNA。
  6. 【請求項６】 配列SEQ.ID No.９のプラスミド、配列SEQ.ID No.10のプラスミ
    ド、配列SEQ.ID No.11のプラスミド及び配列SEQ.ID No.５のプラスミドから選ば
    れたプラスミドによってトランスフェクトされたJM 109細菌株であることを特徴
    とする細菌株。
  7. 【請求項７】 下記の連続工程： 配列SEQ.ID No.９のプラスミド、配列SEQ.ID No.10のプラスミド、配列SEQ.ID
    No.11のプラスミド又は配列SEQ.ID No.５のプラスミドによってトランスフェク
    トされた細菌株JM 109を、アンピシリンを添加したLB培地中で培養する工程； イソプロピルチオガラクトシドを添加することにより融合タンパク質の合成を
    誘導する工程； バクテリアを溶菌する工程；及び 得られた融合タンパク質をアミロースーアガロース樹脂上でのクロマトグラフ
    ィーにより精製しついで精製されたタンパク質を含有するフラクションを回収す
    る工程； からなる、請求項１に記載のタンパク質の調製方法。
  8. 【請求項８】 下記の連続工程： 請求項７に記載の調製方法によって得られるごとき融合タンパク質とCdc25B1
    、Cdc25B2、Cdc25B3又はCdc25Cタンパク質のモジュレーターと推定される化合物
    とを、3-O-メチルフルオレセインホスフェートの溶液に添加する工程； 3-O-メチルフルオレセインホスフェートの当初の量に対する、生成した 3-O-メチルフルオレセインの量を測定する工程； からなることを特徴とする、Cdc25B1、Cdc25B2、Cdc25B3又はCdc25Cタンパク質
    のモジュレーターを同定するための方法における、請求項１に記載のタンパク質
    の使用。
  9. 【請求項９】 3-O-メチルフルオレセインホスフェートの当初の量に対する、
    生成した3-O-メチルフルオレセインの量の測定は、477nmの波長での3-O-メチル
    フルオレセインホスフェートに関連する吸光度を測定することにより行う、請求
    項８に記載の使用。
  10. 【請求項１０】 3-O-メチルフルオレセインホスフェートの当初の量に対する
    、生成した3-O-メチルフルオレセインの量の測定は、475nmの波長での励起を使
    用するかつ510nmの波長で読み取る蛍光定量法により行う、請求項８に記載の使
    用。
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FR99/15722 1999-12-14
FR00/06883 2000-05-30
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FR00/12008 2000-09-21
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