KR20120129852A - 심해 해저에서 분리된 에스터라제 ktl 9 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 심해 해저에서 분리된 리파제 및 에스터라제 효소 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 서남태평양 해역(남위 3°89′, 동경 152°49′) 깊이 1,400 미터에 이르는 심해 퇴적물, 북극 다산기지 주변 연안 퇴적물, 강화도 갯벌 퇴적물로부터 구축된 메타게놈 라이브러리를 대상으로 분리한 신규 리파제 및 에스터라제 효소, 이들을 암호화 하는 유전자 및 리파제 및 에스터라제 효소 생산방법을 제공한다.
Description
본 발명은 신규 리파제, 이를 암호화하는 유전자 및 리파제를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 신규 에스터라제, 이를 암호화하는 유전자 및 에스터라제를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
리파제(lipase, glycerol ester hydrolases)란 다양한 범위의 수용성 혹은 비수용성 카르복실산 에스테르(carboxylic acid ester)나 아마이드(amide)의 가수분해 혹은 합성을 촉매하는 효소를 말하며 가수분해 (hydrolysis), 알콜분해 (alcoholysis), 산 분해 (acidolysis), 에스테르화 (esterification), 아미노분해(aminolysis) 등과 같이 다양한 생물 촉매 반응에 관여하고, 수용액 상태에서 뿐 아니라 유기 용매에서도 활성을 유지하고, 촉매반응 과정에 별도의 보조인다(cofactor)를 필요로 하지 않고, 다양한 기질에 대해 기질 특이성을 나타내고, 광학이성질체중 어느 한쪽에 대해서만 활성을 나타내는 이성질체 선택성을 가지고 있어 산업적 응용성이 높은 효소 중의 하나이다. 현재까지 많은 종류의 동물, 식물, 미생물이 리파제를 생산하는 것으로 알려졌으며, 리파제의 생화학적 특성에 대한 연구, 리파제 유전자를 확보하기 위한 연구가 진행되고 있으며, 특히 식품, 세제, 정밀화학, 화장품 및 환경소재공업등 산업 전반에 걸쳐서 리파제를 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고있다.
의약품을 비롯한 부가가치가 높은 선도물질을 합성하는 정밀화학분야에서, 기존의 화학적인 방법으로 에스테르화합물을 합성하는 경우, 고온과 고압에서 합성되기 때문에 에너지가 많이 소모되며 품질에 나쁜 영향을 주는 여러 가지 부반응이 일어날 뿐 아니라, 전환율 및 특정 광학이성체의 순도가 낮아서 고순도의 정밀화학제품 생산에 어려움이 있어 왔다. 최근에는 이러한 문제점을 보완하기 위해서, 위치특이성과 광학활성 특이성을 나타내는 리파제를 생촉매로 사용하는 반응이 활발히 연구되고 있으나, 리파제가 저온에서 활성이 떨어지는 단점 때문에 응용 가능성에 제한을 받고 있다.
또한, 리파제는 지방 성분의 때를 물에 잘 녹는 지방산 또는 글리세롤로 가수분해시켜 계면활성제의 작용을 용이하게 해주는 기능이 있어 세제, 표백제의 첨가제로 연구되어져 왔지만, 현재까지 사용실적이 미미한 상태이다. 이는 낮은 세정 온도에서 리파제의 활성이 떨어지는 단점으로 인해, 지방이나 유지성분이 불량하게 혹은 불완전하게 제거되기 때문이다.
에스터라제는 에스테르 결합을 분해하여 저분자의 지방과 알코올을 만드는 효소로서, 탄소 10개 이하의 아실 사슬을 가진 글리세롤에스테르(glycerolester)에 대해서만 활성을 가지고 있다. 현재까지 박테리아, 효모 및 고등생물을 비롯하여 식물을 포함한 다양한 생물체에서 많은 종류의 에스터라제가 발견되어 왔으며, 이에 대한 생화학적 특성 및 에스터라제 유전자 자체에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 에스터라제는 리피드(lipid)의 가수분해(hydrolysis) 반응, 가산분해(acidolysis, 에스테르화된 지방산을 유리지방산으로 치환) 반응, 트랜스에스테르화(transesterification, 중성지방(triglyceride)간 지방산의 교환), 에스테르의 합성 등에 사용되어, 산업적으로 매우 중요한 효소이다. 특히, 세탁물 얼룩 내의 지방성분을 쉽게 제거 가능한 친수성 물질로 분해할 수 있어 세제 산업에 사용될 수 있고, 치즈의 숙성 및 향미를 추가하는 등의 치즈 생산 및 제빵용 노화 방지제나 천연 버터 향미를 가진 마가린의 제조와 같은 식음료 산업, 쓰레기 처리 산업, 그리고 소화제의 주요성분으로서 제약 산업 등에 이용될 수 있다. 이밖에도 에스터라제는 기질 특이성, 광학활성 특이성 및 위치 특이성 등의 독특한 특성을 갖고 있어 여러가지 생리 활성 키랄 의약품을 개발하는데 그 용도가 주목받고 있다.
이러한 광학활성 의약품 생산에 유용한 키랄 화합물의 생산은 의약산업의 경쟁력 확보와 국민 건강 증진에 매우 큰 영향력을 가지는 과제로 관심을 모으고 있다.
상기의 중요한 반응은 때때로 고온과 유기 용매 하에서 효과적으로 수행된다. 특히, 식품산업에서 유리 지방산의 생산에 주로 이용되는 우지 (beef tallow) 및 야자유 (palm oil)는 보통의 효소 반응 온도에서는 고체상태를 유지하므로 이러한 재료의 효소적 가공을 위해서는 고온의 반응 환경이 요구된다. 따라서, 고온에서 안정한 내열성 에스터라제가 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 신규의 리파제 및 에스터라제 효소를 제공하는 것이다.
본 발명은 신규의 리파제 및 에스터라제 효소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다
본 발명은 리파제 효소 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 에스터라제 효소 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 리파제 효소를 암호화하는 분리된 DNA 서열 및 이를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한 본 발명은 에스터라제제 효소를 암호화하는 분리된 DNA 서열 및 이를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 리파제 효소 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 에스터라제 효소 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 유전공학적 방법에 의한 제조방법이다.
제 1 양태로, 본 발명은 서열번호 7 또는 11을 가지는 신규 리파제 효소들을 암호화하는 핵산서열 및 상기 서열에 등가의 핵산서열들을 제공한다. 또한 서열번1, 3, 5, 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33의 서열을 가지는 신규 에스터라제 효소들을 암호화하는 핵산서열 및 상기 서열에 등가의 핵산서열들을 제공한다.
"등가의 핵산서열"에는 상기 리파제 효소 및 에스터라제 서열의 코돈 축퇴성 서열을 포함한다.
"코돈 축퇴성 서열"이란 상기 자연 발생의 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 자연 발생의 리파제 및 에스터라제 효소와 동일한 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 의미한다.
제 2 양태로, 본 발명은 서열번호 8 또는 12의 아미노산 서열을 가지는 리파제 효소및 이의 기능적 동등물을 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 10, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 34의 아미노산 서열을 가지는 에스터라제 효소 및 이의 기능적 동등물을 제공한다.
본 발명의 "기능적 동등물"에는 서열번호 8 또는 12의 리파제 및 서열번호 2, 4, 6, 10, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 34 의 에스터라제 효소 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 상기 효소 기능을 유지하는 것 모두를 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 리파제 및 에스터라제 효소의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.
본 발명은, 제 3 양태로는 상기 리파제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 7 또는 11의 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한 상기 에스터라제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 1, 3, 5, 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33의 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 벡터라는 용어는 또다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현벡터란 용어는 상기 벡터에 의해 운반되는 각 재조합형 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 합성시킬 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파아지를 포함한다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.
본 발명의 제 4 양태로는, 리파제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 7 또는 11의 DNA 분절을 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 또한 상기 에스터라제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 1, 3, 5, 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33의 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다.
적합한 형질전환세포로는 원핵생물, 곰팡이, 식물, 동물세포 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 대장균을 이용한다.
본 발명의 제 5 양태로는 리파제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 7 또는 11의 DNA 분절을 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 세포를 이용하여 리파제를 생산하는 방법을 제공한다. 또한 상기 에스터라제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 1, 3, 5, 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33의 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 이용하여 에스터라제 효소를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 신규 리파제 및 에스터라제 및 이를 암호화하는 유전자, 신규 리파제 및 에스터라제를 생산하는 형질전환된 대장균, 이를 배양하여 리파제 및 에스터라제를 대량 생산하는 방법 및 생산된 리파제 및 에스터라제의 응용에 관한 것으로, 상술한 바와 같이, 신규 리파제 및 에스터라제의 활성이 우수하였고, 폭 넓은 온도에서 안정성을 가지고 있으며, 고부가가치의 정밀화학 산업과 화장품, 세제 산업등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 서열번호 1 및 서열번호 2의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L1).
도 2는 서열번호 3 및 서열번호 4의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L2).
도 3은 서열번호 5 및 서열번호 6의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L3).
도 4는 서열번호 7 및 서열번호 8의 리파제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L4).
도 5는 서열번호 9 및 서열번호 10의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L6).
도 6은 서열번호 11 및 서열번호 12의 리파제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L7).
도 7은 서열번호 13 및 서열번호 14의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL1).
도 8은 서열번호 15 및 서열번호 16의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL3).
도 9는 서열번호 17 및 서열번호 18의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL5).
도 10은 서열번호 19 및 서열번호 20의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL6).
도 11은 서열번호 21 및 서열번호 22의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL7).
도 12는 서열번호 23 및 서열번호 24의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL11).
도 13은 서열번호 25 및 서열번호 26의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL1).
도 14는 서열번호 27 및 서열번호 28의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL3).
도 15는 서열번호 29 및 서열번호 30의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL4).
도 16은 서열번호 31 및 서열번호 32의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL7).
도 17은 서열번호 33 및 서열번호 34의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL9).
도 2는 서열번호 3 및 서열번호 4의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L2).
도 3은 서열번호 5 및 서열번호 6의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L3).
도 4는 서열번호 7 및 서열번호 8의 리파제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L4).
도 5는 서열번호 9 및 서열번호 10의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L6).
도 6은 서열번호 11 및 서열번호 12의 리파제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L7).
도 7은 서열번호 13 및 서열번호 14의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL1).
도 8은 서열번호 15 및 서열번호 16의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL3).
도 9는 서열번호 17 및 서열번호 18의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL5).
도 10은 서열번호 19 및 서열번호 20의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL6).
도 11은 서열번호 21 및 서열번호 22의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL7).
도 12는 서열번호 23 및 서열번호 24의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL11).
도 13은 서열번호 25 및 서열번호 26의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL1).
도 14는 서열번호 27 및 서열번호 28의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL3).
도 15는 서열번호 29 및 서열번호 30의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL4).
도 16은 서열번호 31 및 서열번호 32의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL7).
도 17은 서열번호 33 및 서열번호 34의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL9).
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.
<
실시예
1 > 유전자의 분리 및 미생물
본 발명의 신규 리파제 및 에스터라제를 생산하는 유전자는 서남태평양 해역의 깊이 1,400미터에 이르는 퇴적물로부터 환경 DNA를 추출하여, 정제 과정을 거쳐서 포스미드(Fosmid) 벡터를 이용하여 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리의 평균 인서트(insert) DNA 크기는 약 32 kb로 8천여 클론이 구축되었으며, 이는 약 280 mb의 염기쌍에 해당된다. 구축된 메타게놈 라이브러리로부터 트리카프릴닌(Tricaprylin) 평판배지에서 활성을 나타내는 클론으로부터 분리하였다.
< 실시예 2 > 리파제 및 에스터라제 유전자의 클로닝 및 아미노산 서열 결정
메타게놈 라이브러리로부터 발견된, 트리카프릴닌 분해 활성이 있는 클론의 포스미드 디엔에이(fosmid DNA)를 대량 얻은 후에 네불라이저(Nebulizer)를 이용하여 2?4 kb로 자른후 말단 리페어링(end-repairing) 효소를 사용하여 각각의 DNA 절편을 블런트 엔드(blunt-end)로 만들어 작은 크기의 삽입될 DNA를 준비한다. 피블루스크립트(pBluescript SK) 벡터는 제한 효소 에콜알오(EcoRⅤ)로 자른 후, 포스파타제(calf intestinal phosphatase)로 처리한 후, 삽입될 DNA와 리게이션(ligation)시켜 E. coli DH5α에 형질전환 시켰다. 이것을 암피실린(ampicillin)을 첨가한 트리카프릴닌(Tricaprylin) 평판배지 (1% 트립톤(tryptone), 0.5% 효모 추출물(yeast extract), 1% 염화나트륨(NaCl), 1% 트리카프릴닌(Tricaprylin))에 도말하고 37℃에서 24시간 배양하여 트리카프릴닌을 분해하여 투명 환을 형성하는 군락(colony)을 찾았다. 이것을 배양하여 플라스미드를 분리하여 확인하였다. 삽입 DNA의 염기서열분석은 시퀀싱 키트(sequenase kit)와 티세븐 프라이머(T7 primer), 티쓰리 프라이머(T3 primer), 그리고 염기서열결정에 필요한 프라이머(primer)를 디자인하여 사용하였고, 생어 다이 데옥시 체인 터미네이션(Sanger dideoxy chain termination) 방법으로 결정하였다. 벡터 엔티아이(NTI) 프로그램을 이용하여 조립(assemble)을 수행하였고, 엔씨비아이(NCBI)의 오알에프 예측 프로그램(ORF finder)를 이용하여 오알에프(open reading frame; ORF)를 발견하였다.
그 결과, EM2L4 및 EM2L7는 신규 리파제로 나타났고, EM2L1, EM2L2, EM2L3, EM2L6, ATL1, ATL3, ATL5, ATL6, ATL7, ATL11, KTL1, KTL3, KTL4, KTL7 및 KTL9는 신규 에스터라제로 나타났다(표 1).
클론 이름 |
리파제/ 에스터라제 (bp) |
발현 벡터 |
효소 사이트 |
아미노산 | 특성 | 활성 | ||||
pH | pH 범위 |
온도 | 온도 범위 |
기질 | ||||||
EM2L1 | 780 (서열번호1) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 259 (서열번호2) |
8 | 7?10 | 20 | 5?40 | C6 | 에스터라제 |
EM2L2 | 1215 (서열번호3) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 404 (서열번호4) |
9 | 7?10 | 30 | 10?40 | C6 | 에스터라제 |
EM2L3 | 900 (서열번호5) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 299 (서열번호6) |
8.5 | 6.5?9.5 | 15 | 5?60 | C6 | 에스터라제 |
EM2L4 | 993 (서열번호7) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 330 (서열번호8) |
리파제 | |||||
EM2L6 | 807 (서열번호9) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 268 (서열번호10) |
에스터라제 | |||||
EM2L7 | 834 (서열번호11) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 277 (서열번호12) |
리파제 | |||||
ATL1 | 912 (서열번호13) |
pET 24d(+) | NcoI 및 Not I | 303 (서열번호14) |
8 | 7.0-9.0 | 35 | 20-50 | C4 | 에스터라제 |
ATL3 | 918 (서열번호15) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 305 (서열번호16) |
8.5 | 6.5?10 | 20 | 5?30 | C4 | 에스터라제 |
ATL5 | 1080 (서열번호17) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 359 (서열번호18) |
에스터라제 | |||||
ATL6 | 870 (서열번호19) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 289 (서열번호20) |
8 | 6.5?10 | 40 | 20?50 | C6 | 에스터라제 |
ATL7 | 1248 (서열번호21) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 416 (서열번호22) |
에스터라제 | |||||
ATL11 | 939 (서열번호23) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 312 (서열번호24) |
8 | 7.5-8.5 | 35 | 25-40 | C6 | 에스터라제 |
KTL1 | 1566 (서열번호25) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 521 (서열번호26) |
8 | 6.5?10 | 30 | 5?45 | C4 | 에스터라제 |
KTL3 | 1500 (서열번호27) |
pET 24a(+) | NdeI 및 Not I | 499 (서열번호28) |
에스터라제 | |||||
KTL4 | 1059 (서열번호29) |
pET 24a(+) | NdeI 및 Not I | 352 (서열번호30) |
8.5 | 6.5?10 | 20 | 5?25 | C6 | 에스터라제 |
KTL7 | 951 (서열번호31) |
pET 24d(+) | NcoI 및 Not I | 316 (서열번호32) |
8 | 7?9 | 30 | 15?35 | C6 | 에스터라제 |
KTL9 | 1119 (서열번호33) |
pET 24a(+) | NdeI 및 XhoI | 372 (서열번호34) |
8 | 6.5?10 | 30 | 5?45 | C6 | 에스터라제 |
< 실시예 3 > 리파제 및 에스터라제의 대량생산을 위한 재조합 플라스미드 개발
메타게놈 라이브러리로부터 찾아낸 신규 리파제 및 에스터라제를 대량으로 생산하기 위해서 대량 생산용 재조합 플라스미드를 개발하였다. 리파제 및 에스터라제 유전자를 포함하는 DNA를 주형(template) DNA로 이용하고 합성된 2개의 프라이머를 사용하여 핵산증폭반응(PCR)을 수행하였다. 제한효소는 표 1에서와 같이 각각의 인지 부위를 갖도록 합성된 DNA 양끝을 자른 후, 동일한 제한효소로 처리된 대량 생산용 벡터와 함께 리게이션(ligation) 시킴으로써 대량 생산용 재조합 플라스미드들을 개발하였다(표 1).
재조합 플라스미드에는 강력한 티세븐 프로모터(T7 promotor)와 번역(translation) 신호가 내재되어 있어서 T7 RNA polymerase 유전자를 갖고 있는 E. coli BL21(DE3)를 숙주로 사용하는 경우 원하는 리파제의 대량 생산이 가능하다.
리파제의 활성은 일정한 pH에서 올리브유가 효소에 의해 가수분해되어 생성되는 지방산의 양을 수산화나트륨(NaOH)으로 적정하는 pH 스텟(stat) 방법에 의해 측정하였고, 효소의 1 유닛(unit)은 분당 1 μ㏖의 지방산을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.
에스터라제의 활성은 p-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate; pNPB) 또는 다른 p-니트로페틸 에스터(p-nitrophenyl esters; pNPEs)를 기질로서 사용하여 측정하였다. 반응혼합액은 아세노니트릴에 녹인 0.01ml의 10mM 기질, 0.04ml 에탄올 및 0.95ml의 50mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 적절한 양의 효소를 포함하여 구성하였다. 효소 반응은 35℃에서 3분 동안 수행하였다. 반응하는 동안 유리된 p-니트로페놀의 양을 405nm에서 측정하였다. 효소의 1 유닛은 35℃에서 분당 1 μ㏖의 p-니트로페놀을 필요로 하는 효소의 양으로 정의하였다,
<
실시예
4 >
리파제
및
에스터라제의
대장균에서의
발현 및 생산
재조합 플라스미드를 지니는 대장균(E. coli BL21(DE3)) 균을 카나마이신(kanamycin) ml당 50 마이크로그램(ug)이 포함된 액체배지(LB) (1% 트립톤(tryptone), 0.5% 효모 추출물(yeast extract), 1% 염화나트륨(NaCl))에서 흡광오디(OD600 nm)가 0.6으로 될 때 까지 배양한 후, 아이피티지(IPTG)를 최종농도 1 mM이 되게 첨가하여 25℃에서 12시간 배양하여, 라파제 및 에스터라제 효소를 얻을 수 있었다.
<
실시예
5 >
리파제
및
에스터라제의
분리 정제 방법
대장균(E. coli BL21(DE3)이 생산한 리파제 및 에스터라제를 다음과 같이 순수분리하였다. 대량 생산된 균체를 원심분리를 통해서 회수하였다. 회수된 균체를 초음파 분쇄법으로 깬 후에 원심분리(12,000×g, 4℃, 10분)하여 얻은 상층액만을 얻어 조효소액으로 하였다. 히스바인딩(His Bind) 컬럼은 결합 버퍼(500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 40 mM imidazole, pH 7.9)로 평형시킨 후 위에서 얻은 조효소액을 컬럼에 통과시킨다. 세척용 완충용액(500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 60 mM imidazole, pH 7.9)으로 세척 후 동일한 버퍼 조건에서 이미다졸(imidazole) 농도를 100 mM로 높여서 리파아제 및 에스터라제를 정제하였다.
<110> Korea Ocean Research & Development Institute
<120> lipases and esterases isolated from deep sea sediment
<160> 34
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 780
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA isolated from metagenome library
<400> 1
atgcttatcc cttccgatgg tctggaactg gccgtagagt gttttggcga gggaccgtca 60
ctgattttcg cgcacgggct gacgggcaac cgccacttct cgcggcaaca gcttgcacca 120
ctggcggacc aatatacgat catcatctac gaccagcgcg gccactgcga ctcttccccc 180
gtcaccgacc cggctttgta cgatcccgtg cgcatggccg aagatatgac ggccgttctc 240
gatacactcg gtatcaaaaa agcgatcgtt ggcggcgaat caatgggcgc ggcgacgacg 300
ctgctttttg ccctgcgcca cccgcaacgt gtagaaaaat tactgctcac tgctcccgcc 360
tttggcgata cccgcagcag cgaagccgct ggactgcaac agatggggca gcggattgcc 420
gccattggca tcgaggcgtt tttagcggaa tcggcggtga gccagcgtga ggaactgggt 480
tggccggaac ctgtcatcac tgccgtggcc gccatgcaag gttcgcacga aacccacagt 540
atagcgaccg cctgccagag tgtcattgag tggacgctgg atttatcgcc gctgtctacc 600
atcgcttgcc ccacctgcat tattgcctgg gaagacgacc cgctgcaccc gctggcgttg 660
gcccaaagat atgctgctga aattcctaac gcccggctgg aagttctgcc gtcgctggca 720
gaatttttct ctaatccagc aattattggg gggatatacg gccgtttttt ggcaaactga 780
780
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
<400> 2
Met Leu Ile Pro Ser Asp Gly Leu Glu Leu Ala Val Glu Cys Phe Gly
1 5 10 15
Glu Gly Pro Ser Leu Ile Phe Ala His Gly Leu Thr Gly Asn Arg His
20 25 30
Phe Ser Arg Gln Gln Leu Ala Pro Leu Ala Asp Gln Tyr Thr Ile Ile
35 40 45
Ile Tyr Asp Gln Arg Gly His Cys Asp Ser Ser Pro Val Thr Asp Pro
50 55 60
Ala Leu Tyr Asp Pro Val Arg Met Ala Glu Asp Met Thr Ala Val Leu
65 70 75 80
Asp Thr Leu Gly Ile Lys Lys Ala Ile Val Gly Gly Glu Ser Met Gly
85 90 95
Ala Ala Thr Thr Leu Leu Phe Ala Leu Arg His Pro Gln Arg Val Glu
100 105 110
Lys Leu Leu Leu Thr Ala Pro Ala Phe Gly Asp Thr Arg Ser Ser Glu
115 120 125
Ala Ala Gly Leu Gln Gln Met Gly Gln Arg Ile Ala Ala Ile Gly Ile
130 135 140
Glu Ala Phe Leu Ala Glu Ser Ala Val Ser Gln Arg Glu Glu Leu Gly
145 150 155 160
Trp Pro Glu Pro Val Ile Thr Ala Val Ala Ala Met Gln Gly Ser His
165 170 175
Glu Thr His Ser Ile Ala Thr Ala Cys Gln Ser Val Ile Glu Trp Thr
180 185 190
Leu Asp Leu Ser Pro Leu Ser Thr Ile Ala Cys Pro Thr Cys Ile Ile
195 200 205
Ala Trp Glu Asp Asp Pro Leu His Pro Leu Ala Leu Ala Gln Arg Tyr
210 215 220
Ala Ala Glu Ile Pro Asn Ala Arg Leu Glu Val Leu Pro Ser Leu Ala
225 230 235 240
Glu Phe Phe Ser Asn Pro Ala Ile Ile Gly Gly Ile Tyr Gly Arg Phe
245 250 255
Leu Ala Asn
<210> 3
<211> 1215
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA isolated from metagenome library
<400> 3
atgaacagaa tgacaatagg cttctcacca atagtactgc tgggttttgc gctgattgcc 60
gcttgtggtt ccggtcatga tgacgatgac gtaaccggcg cggtaaaccc ctttgtgggc 120
tatacaagcg agcaatacag caacagtgcg aattggctat gtcatgcggg tcttgcgaca 180
gccgataatg tatgcgccgc aaacctcgat gcgacgatcg tctttgcgga cggaacgacg 240
gagctggaac ctttcgaacc gctggccgag ccgcctgtcg attgctttta cgtctatccc 300
acggtgagtt cggacagcag cggtaattcg gacctgatcc ccgatgagga gcgatttgtc 360
gtggtcagtc aggcggctcg ttacagtgcc gtatgtcgcg tatttgcgcc tctctaccgg 420
caggtgacgg tgaccgcgtt gttcagcgat atcgagggcg attttgaact cgcctatggc 480
gatgtggtcg atgcgttcaa acattacatg gccaatgaga ataacggtcg gggctttgtg 540
cttatcggcc actcccaggg cacaggacac cttcgccgct tgattgccga ggaaattgaa 600
accgacagtt atctattgga tcggctgatc gcggcgcacc tgataggcct gactgtcgag 660
ataccgaaag gcgcggatgt cggtgccacc ttccagcagg tgcccgtgtg tcgaaaagca 720
gatgaaaccg cctgtgtcgt cagctatgcc agtttccgca ataccgaccc cctgttggct 780
gatgccgtct ttggtgtcac cgacgacgaa agtaccgagg ctgtatgcac caatcccgcc 840
gcgcttgccg gcggcagcgc gactctcgat gcctatttca ataacgaatc catccccgca 900
ctggacgccg tcctgattca acgggcaccg ggtggtccct ttgccgatga aagcttgcgg 960
gatactatca ccacgccgtt ctataaaatg ccggattttt tactgggcga atgtaaaatc 1020
tcgcccgggg gcgcaaacat tctgcaggtg accgcgcaag tcgatgccga tgacccccgt 1080
gcggatgatt tcaacggcga gttcactatc ggcccgggtt ggggcctgca tctggtggat 1140
atcaatctgg gcatgggaaa cctggtcgag ctggccgcaa cgcaaagcca atcctggttg 1200
caagacaata attag 1215
<210> 4
<211> 404
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
<400> 4
Met Asn Arg Met Thr Ile Gly Phe Ser Pro Ile Val Leu Leu Gly Phe
1 5 10 15
Ala Leu Ile Ala Ala Cys Gly Ser Gly His Asp Asp Asp Asp Val Thr
20 25 30
Gly Ala Val Asn Pro Phe Val Gly Tyr Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Asn
35 40 45
Ser Ala Asn Trp Leu Cys His Ala Gly Leu Ala Thr Ala Asp Asn Val
50 55 60
Cys Ala Ala Asn Leu Asp Ala Thr Ile Val Phe Ala Asp Gly Thr Thr
65 70 75 80
Glu Leu Glu Pro Phe Glu Pro Leu Ala Glu Pro Pro Val Asp Cys Phe
85 90 95
Tyr Val Tyr Pro Thr Val Ser Ser Asp Ser Ser Gly Asn Ser Asp Leu
100 105 110
Ile Pro Asp Glu Glu Arg Phe Val Val Val Ser Gln Ala Ala Arg Tyr
115 120 125
Ser Ala Val Cys Arg Val Phe Ala Pro Leu Tyr Arg Gln Val Thr Val
130 135 140
Thr Ala Leu Phe Ser Asp Ile Glu Gly Asp Phe Glu Leu Ala Tyr Gly
145 150 155 160
Asp Val Val Asp Ala Phe Lys His Tyr Met Ala Asn Glu Asn Asn Gly
165 170 175
Arg Gly Phe Val Leu Ile Gly His Ser Gln Gly Thr Gly His Leu Arg
180 185 190
Arg Leu Ile Ala Glu Glu Ile Glu Thr Asp Ser Tyr Leu Leu Asp Arg
195 200 205
Leu Ile Ala Ala His Leu Ile Gly Leu Thr Val Glu Ile Pro Lys Gly
210 215 220
Ala Asp Val Gly Ala Thr Phe Gln Gln Val Pro Val Cys Arg Lys Ala
225 230 235 240
Asp Glu Thr Ala Cys Val Val Ser Tyr Ala Ser Phe Arg Asn Thr Asp
245 250 255
Pro Leu Leu Ala Asp Ala Val Phe Gly Val Thr Asp Asp Glu Ser Thr
260 265 270
Glu Ala Val Cys Thr Asn Pro Ala Ala Leu Ala Gly Gly Ser Ala Thr
275 280 285
Leu Asp Ala Tyr Phe Asn Asn Glu Ser Ile Pro Ala Leu Asp Ala Val
290 295 300
Leu Ile Gln Arg Ala Pro Gly Gly Pro Phe Ala Asp Glu Ser Leu Arg
305 310 315 320
Asp Thr Ile Thr Thr Pro Phe Tyr Lys Met Pro Asp Phe Leu Leu Gly
325 330 335
Glu Cys Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ala Asn Ile Leu Gln Val Thr Ala
340 345 350
Gln Val Asp Ala Asp Asp Pro Arg Ala Asp Asp Phe Asn Gly Glu Phe
355 360 365
Thr Ile Gly Pro Gly Trp Gly Leu His Leu Val Asp Ile Asn Leu Gly
370 375 380
Met Gly Asn Leu Val Glu Leu Ala Ala Thr Gln Ser Gln Ser Trp Leu
385 390 395 400
Gln Asp Asn Asn
<210> 5
<211> 900
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA isolated from metagenome library
<400> 5
gtgatccttt ttagcttggt cggtgtctat ttcctatttc ctgaagtaac gtctgatctc 60
ctgctaaagg tggagcgaag caccgggggt cttaagcagc gcagcatcga agtggatggg 120
ctgcggattg aatacctgga aggaggaaaa ggcgatgtcc ttgtactact ccacggcttc 180
agtgccaaca aggacaactg ggcgcggatt ggaaaatatc tcacacccta tttcagggtg 240
attgcaccgg atctgcccgg tttcggtgaa agcagccttg accctggcgg tgactatagc 300
atcggcgttc aggttgagcg ggtgaaagca tttatccggg ccctgggaat caagtcgttg 360
catctcggcg gaagttccat ggggggcggc atcgcaggcg cgtatgcggc aaggtatcca 420
gacgatctca aaagcctcct gctgatctcc ccgggcggcg ttgcctcttc tgaaccaagt 480
gagatgtttc gtctgttgaa gaaggataag ctaaatccgc tgattgcaaa gaacgccgaa 540
gactacgagt acttgctgga tttcgttttt gtgaaaaagc ctttcatacc cggccccgtc 600
aaaaagtctc taattcaggt ggctatcgag catgagccgc tctatcaaaa gatatttaaa 660
caactcctca gctctacgga ttcacccctg gagatcgttc tggaagggct gccggttccc 720
acccttatca tctggggcgc acaggacagg gtgctgcatg tatccggtgc aaaaattctt 780
gaatcggtta taccgaaggc caaggtagaa ataattgatg ccgtgggcca ccttcccatg 840
attgaaaaac cggaagaaac agcgaagttg tacttgaatt ttcttgggat taagacataa 900
900
<210> 6
<211> 299
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
<400> 6
Val Ile Leu Phe Ser Leu Val Gly Val Tyr Phe Leu Phe Pro Glu Val
1 5 10 15
Thr Ser Asp Leu Leu Leu Lys Val Glu Arg Ser Thr Gly Gly Leu Lys
20 25 30
Gln Arg Ser Ile Glu Val Asp Gly Leu Arg Ile Glu Tyr Leu Glu Gly
35 40 45
Gly Lys Gly Asp Val Leu Val Leu Leu His Gly Phe Ser Ala Asn Lys
50 55 60
Asp Asn Trp Ala Arg Ile Gly Lys Tyr Leu Thr Pro Tyr Phe Arg Val
65 70 75 80
Ile Ala Pro Asp Leu Pro Gly Phe Gly Glu Ser Ser Leu Asp Pro Gly
85 90 95
Gly Asp Tyr Ser Ile Gly Val Gln Val Glu Arg Val Lys Ala Phe Ile
100 105 110
Arg Ala Leu Gly Ile Lys Ser Leu His Leu Gly Gly Ser Ser Met Gly
115 120 125
Gly Gly Ile Ala Gly Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Pro Asp Asp Leu Lys
130 135 140
Ser Leu Leu Leu Ile Ser Pro Gly Gly Val Ala Ser Ser Glu Pro Ser
145 150 155 160
Glu Met Phe Arg Leu Leu Lys Lys Asp Lys Leu Asn Pro Leu Ile Ala
165 170 175
Lys Asn Ala Glu Asp Tyr Glu Tyr Leu Leu Asp Phe Val Phe Val Lys
180 185 190
Lys Pro Phe Ile Pro Gly Pro Val Lys Lys Ser Leu Ile Gln Val Ala
195 200 205
Ile Glu His Glu Pro Leu Tyr Gln Lys Ile Phe Lys Gln Leu Leu Ser
210 215 220
Ser Thr Asp Ser Pro Leu Glu Ile Val Leu Glu Gly Leu Pro Val Pro
225 230 235 240
Thr Leu Ile Ile Trp Gly Ala Gln Asp Arg Val Leu His Val Ser Gly
245 250 255
Ala Lys Ile Leu Glu Ser Val Ile Pro Lys Ala Lys Val Glu Ile Ile
260 265 270
Asp Ala Val Gly His Leu Pro Met Ile Glu Lys Pro Glu Glu Thr Ala
275 280 285
Lys Leu Tyr Leu Asn Phe Leu Gly Ile Lys Thr
290 295
<210> 7
<211> 993
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA isolated from metagenome library
<400> 7
atgactggta gaattgggcg tatcatattg gtggttgtcg tggcgatcgt gttggtgctg 60
tgcattgccg cgatggtgac ctattggatg gtgggtccga ccccgcgctg cgcactgccg 120
gcggaggggc cgtctgggcc aggctggtcg gcccggaccc tggactcggg tggccgtgag 180
cgctgttacc atctctacgt gccgccgggg tacaatcccg cccagccagc gccagtggtc 240
gtgagtttcc atggcttcct gtccaacccc aacagccacg cgctcatcag cggctggcac 300
aagctcgccg agcaggaggg ctttctggtg gcctatcccc agggcacgtc gttcccgcta 360
cgatgggacg ccggctcgac gtggggagcg ccgggggtca acgacgtgca gttcttccgc 420
gatatggtcg acgacatggc caatgtggcg gccgtcgacc gctcgcgggt gtatgtcaat 480
ggcttttcca acggcggcgg catggccgtg cgtatcggct gcgaggctgc cggagaagtg 540
gccgcgctgg gttcggttgc gggcgccgtc gtcgagatag aggagtgcag cccatcacgc 600
cctgtgccgg tcatggccta ccacgggacg gcggaccctg ttgtgccgta cgagggcggc 660
gagatgcaag gttggctgct gcgctggggg gccggcgctg ttgacgcgcc cgtctacttt 720
gtgggcgccg aggactgggt ctccctctgg gcggcgggga atggctgcga tcccacgccg 780
gacgtggtcc cggcgcaagg ggatgcgagt ggcatccgct acaccgggtg cgaccaggac 840
gccgaggtgt ccttgtatac cattgacggc ggcgggcata cctggcccgg gggctggccg 900
atccccgccg tgggcaagac aagtaccgac atcaatgcga ccggggagat gtggcagttc 960
ttccagagat accaactgga ggagcagccg tag 993
<210> 8
<211> 330
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
<400> 8
Met Thr Gly Arg Ile Gly Arg Ile Ile Leu Val Val Val Val Ala Ile
1 5 10 15
Val Leu Val Leu Cys Ile Ala Ala Met Val Thr Tyr Trp Met Val Gly
20 25 30
Pro Thr Pro Arg Cys Ala Leu Pro Ala Glu Gly Pro Ser Gly Pro Gly
35 40 45
Trp Ser Ala Arg Thr Leu Asp Ser Gly Gly Arg Glu Arg Cys Tyr His
50 55 60
Leu Tyr Val Pro Pro Gly Tyr Asn Pro Ala Gln Pro Ala Pro Val Val
65 70 75 80
Val Ser Phe His Gly Phe Leu Ser Asn Pro Asn Ser His Ala Leu Ile
85 90 95
Ser Gly Trp His Lys Leu Ala Glu Gln Glu Gly Phe Leu Val Ala Tyr
100 105 110
Pro Gln Gly Thr Ser Phe Pro Leu Arg Trp Asp Ala Gly Ser Thr Trp
115 120 125
Gly Ala Pro Gly Val Asn Asp Val Gln Phe Phe Arg Asp Met Val Asp
130 135 140
Asp Met Ala Asn Val Ala Ala Val Asp Arg Ser Arg Val Tyr Val Asn
145 150 155 160
Gly Phe Ser Asn Gly Gly Gly Met Ala Val Arg Ile Gly Cys Glu Ala
165 170 175
Ala Gly Glu Val Ala Ala Leu Gly Ser Val Ala Gly Ala Val Val Glu
180 185 190
Ile Glu Glu Cys Ser Pro Ser Arg Pro Val Pro Val Met Ala Tyr His
195 200 205
Gly Thr Ala Asp Pro Val Val Pro Tyr Glu Gly Gly Glu Met Gln Gly
210 215 220
Trp Leu Leu Arg Trp Gly Ala Gly Ala Val Asp Ala Pro Val Tyr Phe
225 230 235 240
Val Gly Ala Glu Asp Trp Val Ser Leu Trp Ala Ala Gly Asn Gly Cys
245 250 255
Asp Pro Thr Pro Asp Val Val Pro Ala Gln Gly Asp Ala Ser Gly Ile
260 265 270
Arg Tyr Thr Gly Cys Asp Gln Asp Ala Glu Val Ser Leu Tyr Thr Ile
275 280 285
Asp Gly Gly Gly His Thr Trp Pro Gly Gly Trp Pro Ile Pro Ala Val
290 295 300
Gly Lys Thr Ser Thr Asp Ile Asn Ala Thr Gly Glu Met Trp Gln Phe
305 310 315 320
Phe Gln Arg Tyr Gln Leu Glu Glu Gln Pro
325 330
<210> 9
<211> 807
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA isolated from metagenome library
<400> 9
atgaaatgca tcccatcaga cggcctgcaa ctggccgtag aaacctttgg cagcggcccg 60
ccgctgatca tggcacatgg attaaccggc aaccggaaca tgagccgcca acaattggcg 120
ccgctggccg acagctaccg cgtcattgtc tttgaccagc gcgggcacaa cgaatccacc 180
cctgtcaccg atcccgccct ctacgacccg ctgcgcatgg cggccgatat cggtaacatc 240
ctcgacgctt ttaacgtgga acgggccatc atcggcggcg aatcaatggg cgcagccact 300
gccttaacct ttgccctcaa ctggccgcag cgtgtcgaaa cattattact caccgcccct 360
gcttttggcg acaagccaaa cccggagtcc gagggcattc gagaaatggg cgctgccatt 420
gccactgtcg gcattgaagc ctttctcgac gccgccgagg tgaagtggcg cgaagaatta 480
gagtggccac aagttgtgat agaccatgtg cgggccatgc aaagctgcca tgacgcggcc 540
agcctcgccg tcgcctgtca gacagtgatt gattggcagc tatttacaaa cctgtcggtt 600
gtgagtcagt tggagatgcc ggtacgcatc gtggcctggg agaatgacga tctgcatccg 660
ttaatcctcg cccagcgcat ggcggcgtta atcccggatg tgaagatgac agtgctggct 720
tcgctcacgg agatgttttc caacccggcc gtcatcacta tccattaccg gcgctttctg 780
gaggaattag gctcgaataa tgattag 807
<210> 10
<211> 268
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
<400> 10
Met Lys Cys Ile Pro Ser Asp Gly Leu Gln Leu Ala Val Glu Thr Phe
1 5 10 15
Gly Ser Gly Pro Pro Leu Ile Met Ala His Gly Leu Thr Gly Asn Arg
20 25 30
Asn Met Ser Arg Gln Gln Leu Ala Pro Leu Ala Asp Ser Tyr Arg Val
35 40 45
Ile Val Phe Asp Gln Arg Gly His Asn Glu Ser Thr Pro Val Thr Asp
50 55 60
Pro Ala Leu Tyr Asp Pro Leu Arg Met Ala Ala Asp Ile Gly Asn Ile
65 70 75 80
Leu Asp Ala Phe Asn Val Glu Arg Ala Ile Ile Gly Gly Glu Ser Met
85 90 95
Gly Ala Ala Thr Ala Leu Thr Phe Ala Leu Asn Trp Pro Gln Arg Val
100 105 110
Glu Thr Leu Leu Leu Thr Ala Pro Ala Phe Gly Asp Lys Pro Asn Pro
115 120 125
Glu Ser Glu Gly Ile Arg Glu Met Gly Ala Ala Ile Ala Thr Val Gly
130 135 140
Ile Glu Ala Phe Leu Asp Ala Ala Glu Val Lys Trp Arg Glu Glu Leu
145 150 155 160
Glu Trp Pro Gln Val Val Ile Asp His Val Arg Ala Met Gln Ser Cys
165 170 175
His Asp Ala Ala Ser Leu Ala Val Ala Cys Gln Thr Val Ile Asp Trp
180 185 190
Gln Leu Phe Thr Asn Leu Ser Val Val Ser Gln Leu Glu Met Pro Val
195 200 205
Arg Ile Val Ala Trp Glu Asn Asp Asp Leu His Pro Leu Ile Leu Ala
210 215 220
Gln Arg Met Ala Ala Leu Ile Pro Asp Val Lys Met Thr Val Leu Ala
225 230 235 240
Ser Leu Thr Glu Met Phe Ser Asn Pro Ala Val Ile Thr Ile His Tyr
245 250 255
Arg Arg Phe Leu Glu Glu Leu Gly Ser Asn Asn Asp
260 265
<210> 11
<211> 834
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA isolated from metagenome library
<400> 11
atgacttatc cgattgtgct cgcccatggc gtgtgtcgtt ttgacgcctt gttgaacgac 60
gccctggacc tcgacaataa cgatgatccg gagcttgaca acctgcacta tttcaaaggc 120
atacggacga tgctaaagca gaaaggatat atcgtttatc attccaacgt tgcctgggca 180
gcaggggtag agaaacgggc cgatgacctg aaagaaaacc tgttgaagat tcttaacgaa 240
acacgaacgg aaaaggtcaa cattatcgca cacagcatgg gtggactgga tgcgcgtcac 300
atgatgttta atgatcgtaa tgatgaagaa atccaccaac gtatagcttc tcttactact 360
atctctacac ctcacgaggg atctccattc gccgactggg ggcttgataa cctcacgcct 420
ctgcatttat taatccaaaa gctgggtgtg gacttgagcg ctttgaagga tctaaggacg 480
gatacatgca aaacgttcaa tgaacatcag gatgtcaaag aattcgaaat ggcatgtaag 540
ggtacgataa agttccagac ctatgctgga agacaggatt tttggggtgt ctttagtgga 600
ctcaaaattc cctttgagat aatcaggaag gcagaaggtg aaaatgacgg tatggtttca 660
gttaggtcag ccacatggag agatgagtat ttcaagggaa cactcgataa aactgaccat 720
ctcaatgaga tggggtggtg ggcccctgat caacttttag ctgccgagag tccggacgag 780
ttgcttgccc gtatacacag cttttatgcc ggaatcgcgg aacaactacc ttaa 834
<210> 12
<211> 277
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
<400> 12
Met Thr Tyr Pro Ile Val Leu Ala His Gly Val Cys Arg Phe Asp Ala
1 5 10 15
Leu Leu Asn Asp Ala Leu Asp Leu Asp Asn Asn Asp Asp Pro Glu Leu
20 25 30
Asp Asn Leu His Tyr Phe Lys Gly Ile Arg Thr Met Leu Lys Gln Lys
35 40 45
Gly Tyr Ile Val Tyr His Ser Asn Val Ala Trp Ala Ala Gly Val Glu
50 55 60
Lys Arg Ala Asp Asp Leu Lys Glu Asn Leu Leu Lys Ile Leu Asn Glu
65 70 75 80
Thr Arg Thr Glu Lys Val Asn Ile Ile Ala His Ser Met Gly Gly Leu
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Asp Ala Arg His Met Met Phe Asn Asp Arg Asn Asp Glu Glu Ile His
100 105 110
Gln Arg Ile Ala Ser Leu Thr Thr Ile Ser Thr Pro His Glu Gly Ser
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Pro Phe Ala Asp Trp Gly Leu Asp Asn Leu Thr Pro Leu His Leu Leu
130 135 140
Ile Gln Lys Leu Gly Val Asp Leu Ser Ala Leu Lys Asp Leu Arg Thr
145 150 155 160
Asp Thr Cys Lys Thr Phe Asn Glu His Gln Asp Val Lys Glu Phe Glu
165 170 175
Met Ala Cys Lys Gly Thr Ile Lys Phe Gln Thr Tyr Ala Gly Arg Gln
180 185 190
Asp Phe Trp Gly Val Phe Ser Gly Leu Lys Ile Pro Phe Glu Ile Ile
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gly Glu Asn Asp Gly Met Val Ser Val Arg Ser Ala
210 215 220
Thr Trp Arg Asp Glu Tyr Phe Lys Gly Thr Leu Asp Lys Thr Asp His
225 230 235 240
Leu Asn Glu Met Gly Trp Trp Ala Pro Asp Gln Leu Leu Ala Ala Glu
245 250 255
Ser Pro Asp Glu Leu Leu Ala Arg Ile His Ser Phe Tyr Ala Gly Ile
260 265 270
Ala Glu Gln Leu Pro
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<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA isolated from metagenome library
<400> 13
atgacgatga gccgccgtgc aaaatttgtt cgctggttaa ccagcggata catgcaaaaa 60
ctggacgtgg cgaatgtgcc ggtcgacaca gcgagaaagc acctcgaaac ggtcgcccgg 120
acgttgctgg tccgagcgac tggcgtccat gttgaacagt cgcaacttgc cgggattgac 180
gttgactggc taagaccgaa agaggcacgc aaggacaagg tcctgtttta tttgcatggc 240
ggcgcttacg tcctgggcag tcgtcggaca caccgccagc tagtgagtca tatggcaagg 300
gaggccggca tcaccgcggt acttccagag tatcgactgg ctcccgagca cccgtttcct 360
gcggcgatcg acgatgcggt agctgtgtac cgggcgcttc tcgaatccgg cttcaaaccg 420
gaggacatcg ttatctcggg agattcggct ggtgggggct tgtcggtcgc gacgctgctc 480
gcacttcgac acgccggaga tcccctccct gcggctgccg tgttgctttc gccatttctc 540
gatgtcacag cgagcggcga atcggcgacg acgcgagcgg accaggaccc ctggtttgat 600
gtgcatgaca tggaggtcgt ggcgcgctac tactgtgcgg atgagagcaa gtggcgcgac 660
ccactgatat caccggtgtt cgccaacgtc tcgggtcttc cgcccatgct tattcaggta 720
ggtgacgacg aaatactcct cgacgactcg acgcgactgg cagaaaaact cgaggcggca 780
ggcattgacg tcgagatcga gatttggccg aacatgtggc acgttttcca gatgttcatt 840
ggcaagatgc cggaaagccg caaggccgtc gagaagatag ggaagtacat cgaccaggcg 900
gtttcgaagt ag 912
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
<400> 14
Met Thr Met Ser Arg Arg Ala Lys Phe Val Arg Trp Leu Thr Ser Gly
1 5 10 15
Tyr Met Gln Lys Leu Asp Val Ala Asn Val Pro Val Asp Thr Ala Arg
20 25 30
Lys His Leu Glu Thr Val Ala Arg Thr Leu Leu Val Arg Ala Thr Gly
35 40 45
Val His Val Glu Gln Ser Gln Leu Ala Gly Ile Asp Val Asp Trp Leu
50 55 60
Arg Pro Lys Glu Ala Arg Lys Asp Lys Val Leu Phe Tyr Leu His Gly
65 70 75 80
Gly Ala Tyr Val Leu Gly Ser Arg Arg Thr His Arg Gln Leu Val Ser
85 90 95
His Met Ala Arg Glu Ala Gly Ile Thr Ala Val Leu Pro Glu Tyr Arg
100 105 110
Leu Ala Pro Glu His Pro Phe Pro Ala Ala Ile Asp Asp Ala Val Ala
115 120 125
Val Tyr Arg Ala Leu Leu Glu Ser Gly Phe Lys Pro Glu Asp Ile Val
130 135 140
Ile Ser Gly Asp Ser Ala Gly Gly Gly Leu Ser Val Ala Thr Leu Leu
145 150 155 160
Ala Leu Arg His Ala Gly Asp Pro Leu Pro Ala Ala Ala Val Leu Leu
165 170 175
Ser Pro Phe Leu Asp Val Thr Ala Ser Gly Glu Ser Ala Thr Thr Arg
180 185 190
Ala Asp Gln Asp Pro Trp Phe Asp Val His Asp Met Glu Val Val Ala
195 200 205
Arg Tyr Tyr Cys Ala Asp Glu Ser Lys Trp Arg Asp Pro Leu Ile Ser
210 215 220
Pro Val Phe Ala Asn Val Ser Gly Leu Pro Pro Met Leu Ile Gln Val
225 230 235 240
Gly Asp Asp Glu Ile Leu Leu Asp Asp Ser Thr Arg Leu Ala Glu Lys
245 250 255
Leu Glu Ala Ala Gly Ile Asp Val Glu Ile Glu Ile Trp Pro Asn Met
260 265 270
Trp His Val Phe Gln Met Phe Ile Gly Lys Met Pro Glu Ser Arg Lys
275 280 285
Ala Val Glu Lys Ile Gly Lys Tyr Ile Asp Gln Ala Val Ser Lys
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<212> DNA
<213> Unknown
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<223> DNA isolated from metagenome library
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atgaaggctg tctggtacac cgtgctggca atgcttctgc ttttgacctc ctgcgttaag 60
gttccggatg gaacgcttca ggatgatctg cgaaacaggg aaataaagtt tgcggtctgg 120
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tacagtaatt tcaactggct gacccgtgtt ctggttgagc atggctacgt cgtggcggcc 240
gtcaaccacc ctttcaacac gacgggaaat gacacaccgg agggcgtggc aagggcctgg 300
gaccggccgc ctgatctgtc actgctgatc tctgaattgc tatccaatcc tgaatgggcc 360
gctgcaatag acagtactcg tataggtgca actggctttt cttcgggggg gtatacggtt 420
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gaagctggtc ccgagtgtgg tctggcagtc gcactgcctg cggctgatcc ggatgcttcc 540
tccttattaa aggacccgag aataaaggcc gtatttgcca tggcgccggg atggggtgca 600
gctaccaggt ctgatagtct tgaagccatc gatattccgg tcaagatagt tgcggctgag 660
gatgatgaaa tacttatacc cgcgcatcat gcggtttatt ttgatgaatt aattcctgat 720
tcagtgctcg tgatgctgcc caagggtggt cactttatat ttcttagctg cagccccatg 780
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<212> PRT
<213> Unknown
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<223> protein isolated from metagenome library
<400> 16
Met Lys Ala Val Trp Tyr Thr Val Leu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ser Cys Val Lys Val Pro Asp Gly Thr Leu Gln Asp Asp Leu Arg Asn
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Arg Glu Ile Lys Phe Ala Val Trp Val Pro Glu Ser Thr Glu Pro Ala
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Pro Leu Ile Val Leu Ser His Gly Ser Gly Gly His Tyr Ser Asn Phe
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Asn Trp Leu Thr Arg Val Leu Val Glu His Gly Tyr Val Val Ala Ala
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Val Asn His Pro Phe Asn Thr Thr Gly Asn Asp Thr Pro Glu Gly Val
85 90 95
Ala Arg Ala Trp Asp Arg Pro Pro Asp Leu Ser Leu Leu Ile Ser Glu
100 105 110
Leu Leu Ser Asn Pro Glu Trp Ala Ala Ala Ile Asp Ser Thr Arg Ile
115 120 125
Gly Ala Thr Gly Phe Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Val Leu Ala Leu Ala
130 135 140
Gly Ala Val Tyr Asp Ile Asp Gln Met His Ala Tyr Cys Asn Ser Thr
145 150 155 160
Glu Ala Gly Pro Glu Cys Gly Leu Ala Val Ala Leu Pro Ala Ala Asp
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Pro Asp Ala Ser Ser Leu Leu Lys Asp Pro Arg Ile Lys Ala Val Phe
180 185 190
Ala Met Ala Pro Gly Trp Gly Ala Ala Thr Arg Ser Asp Ser Leu Glu
195 200 205
Ala Ile Asp Ile Pro Val Lys Ile Val Ala Ala Glu Asp Asp Glu Ile
210 215 220
Leu Ile Pro Ala His His Ala Val Tyr Phe Asp Glu Leu Ile Pro Asp
225 230 235 240
Ser Val Leu Val Met Leu Pro Lys Gly Gly His Phe Ile Phe Leu Ser
245 250 255
Cys Ser Pro Met Thr Arg Val Ala Asp Trp Phe Ile Asp Arg Phe Asn
260 265 270
Leu Cys Gly Ile Gly Ile Asp Val Asp Arg Asp Ala Val Gln Lys Glu
275 280 285
Thr Ala Ala Leu Ala Val Gln Phe Phe Asp Gln His Leu Arg Ala Val
290 295 300
Glu
305
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<212> DNA
<213> Unknown
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<223> DNA isolated from metagenome library
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cttcatgctg agaatacgcc ggtgcggcca gtttttgacg aagcaggcac ggtccatgtt 120
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gatgttgatc ctgatcgtgt cctcatcaac ctgcatggcg gcgcttttac gacatgctgg 420
gagtcctgtt caatgctgga atcggcaccc atcgcgtcgc ttggtggcta caaagttgtc 480
tctgttaatt accgcatggc gccagaggct actcatccgg cgggagttga agatgttgcc 540
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1080
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
<400> 18
Met Lys Arg Asn Leu Phe Tyr Leu Ala Ala Gly Leu Met Cys Val Thr
1 5 10 15
Ser Thr Val Ser Leu His Ala Glu Asn Thr Pro Val Arg Pro Val Phe
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Asp Glu Ala Gly Thr Val His Val Pro Ala Phe Glu Leu Pro Pro Ser
35 40 45
Val Phe Ser Ser Gln Glu Ala Gln Asp Phe Met Lys Leu Arg Ala Arg
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Met Pro Ser Glu Leu Pro Thr Lys Glu Pro Asp Ile Val Lys Ser Arg
65 70 75 80
Lys Gly Leu Glu Ala Met Leu Ala Pro Gln Val Ala Gly Met Leu Lys
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Leu His Pro Val Asp Val Val Asp Glu Thr Ile Asn Gly Val Pro Thr
100 105 110
Arg Ile Val Thr Pro Lys Gly Lys Asp Val Asp Pro Asp Arg Val Leu
115 120 125
Ile Asn Leu His Gly Gly Ala Phe Thr Thr Cys Trp Glu Ser Cys Ser
130 135 140
Met Leu Glu Ser Ala Pro Ile Ala Ser Leu Gly Gly Tyr Lys Val Val
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Ser Val Asn Tyr Arg Met Ala Pro Glu Ala Thr His Pro Ala Gly Val
165 170 175
Glu Asp Val Ala Lys Val Tyr Ser Glu Leu Leu Lys Thr Tyr Glu Ser
180 185 190
Lys His Ile Gly Ile Tyr Gly Cys Ser Ala Gly Gly Ala Leu Thr Ala
195 200 205
Gln Thr Ala Ala Trp Leu Pro Thr His Asn Leu Pro Gln Ala Gly Ala
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Val Gly Ile Phe Gly Ala Gly Gly Val Arg Phe Ser Glu Gly Asp Ser
225 230 235 240
Ala Tyr Ile Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Ser Phe Pro Pro Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Gly Glu Thr Lys Ile Asp Met Thr Arg Gly Tyr Phe Ala Asn Ala
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Asp Met Ser Asp Ala Ile Ile Ser Pro Ala Leu His Pro Ser Val Leu
275 280 285
Lys Asn Phe Pro Pro Ala Leu Ile Ile Thr Gly Thr Arg Ala Met Asp
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Met Ser Pro Ala Ile Val Thr Asn Ser Asn Leu Ile Arg Ala Gly Ile
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Arg Ser Thr Leu Ile Val Gly Glu Gly Met Gly His Cys Tyr Ile Tyr
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Met Ala Gln Leu Pro Glu Ala Gln Asp Ala His Ser Ala Ile Val Ala
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Phe Phe Asp Glu Asn Leu Arg
355
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<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA isolated from metagenome library
<400> 19
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ctctttaccc tggacaaact gaaggttctg aatatggtgg acttttcatt tagcaaacag 240
ggactggtga aaggagatcg tgtaagtggc aggatgaaga ggcttatggc tgacacccag 300
attgaggatc ttagaattcc ctttgctgca gtggcagtgg atctggtcca ttcgaaggag 360
gtagtcttta gaagcgggag catgtatgag gcccttcggg cttctgtttc cattccgacc 420
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gaatcctgtg aaatgtatga cttctacaag gcagaagaga tggtggagat tgggaggcat 840
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
<400> 20
Met Lys Gln Lys Val Ala Leu Val Leu Ser Gly Gly Gly Ala Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala His Ile Gly Val Ile Glu Glu Leu Glu Ser Gln Gly Phe Glu
20 25 30
Ile Thr Ser Ile Ala Gly Thr Ser Met Gly Ser Val Val Gly Gly Ile
35 40 45
Tyr Ala Ser Gly Lys Leu Asp Val Leu Lys Lys Trp Leu Phe Thr Leu
50 55 60
Asp Lys Leu Lys Val Leu Asn Met Val Asp Phe Ser Phe Ser Lys Gln
65 70 75 80
Gly Leu Val Lys Gly Asp Arg Val Ser Gly Arg Met Lys Arg Leu Met
85 90 95
Ala Asp Thr Gln Ile Glu Asp Leu Arg Ile Pro Phe Ala Ala Val Ala
100 105 110
Val Asp Leu Val His Ser Lys Glu Val Val Phe Arg Ser Gly Ser Met
115 120 125
Tyr Glu Ala Leu Arg Ala Ser Val Ser Ile Pro Thr Ile Phe Thr Pro
130 135 140
Val Lys Thr Asp Asp Gly Leu Leu Val Asp Gly Gly Val Met Asn Asn
145 150 155 160
Val Pro Ile Asp Arg Val Glu Arg Thr Pro Gly Asp Ile Leu Val Ala
165 170 175
Val Asp Val Asn Ala Ser Val Pro Val Asn Lys Pro Ala Ile Thr Lys
180 185 190
Lys Glu Glu Lys Ala Arg Gln Ser Leu Tyr Arg Lys Lys Met Leu Glu
195 200 205
Phe Gln Gln His Leu Arg Gly Ser Gly Pro Lys Ser Ser Gly Pro Asn
210 215 220
Leu Gly Tyr Phe Asp Leu Ile Asn Lys Thr Leu Ser Leu Met Thr His
225 230 235 240
His Thr Ala Arg Leu Leu Met Glu Lys His Lys Pro Asp Ile Leu Ile
245 250 255
Glu Val Ser His Glu Ser Cys Glu Met Tyr Asp Phe Tyr Lys Ala Glu
260 265 270
Glu Met Val Glu Ile Gly Arg His Ala Ala Ser Leu Lys Leu Ser Ser
275 280 285
Arg
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<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA isolated from metagenome library
<400> 21
atggccggac tatattttac gctcgcagtg ctgggcgcac tgggtacatt tacagccctg 60
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gcctggatca ttggtgagaa agaacaacag gccaagccgc tcatgtacca catgtcccag 600
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catatcgtcg atgttaaaaa agccatcgcc tgggtcaggg aaaatattgc ccagtacggg 720
ggcgacccca actttattgc tattaccggg ggctccgctg ggggccacct cagttcgctg 780
gccgcactga cgcccaaccg tgcccagtgg cagccggggt ttgaagacgc ggacacgacg 840
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<223> protein isolated from metagenome library
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Met Ala Gly Leu Tyr Phe Thr Leu Ala Val Leu Gly Ala Leu Gly Thr
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Phe Thr Ala Leu Val Gln Ala Arg Arg Leu Gly Trp Leu Val Pro Val
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Leu Leu Gln Leu Thr Leu Thr Ala Leu Met Ala Phe Gly Gly Val Phe
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Ser Asp Pro Leu Ala Gln Thr Gly Leu Gly Ile Phe Ala Leu Ser Trp
65 70 75 80
Leu Gly Leu Ile Tyr Leu His Ile Gln Ala Met Asp Thr Pro Gln Tyr
85 90 95
Leu Arg Ala Ala Leu His Arg Ala Leu Gly Ala Asp Tyr Arg Asn Ser
100 105 110
Ile Pro Glu Glu Arg Arg Glu Val Leu Ser Glu Asn Ile Val Ser Arg
115 120 125
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130 135 140
Asn Asn Ile Ser Tyr Gly Glu Ala Gly Lys Arg Asn Leu Leu Asp Val
145 150 155 160
Tyr Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Gly Gly Ala Pro Val Leu Leu Gln
165 170 175
Val His Gly Gly Ala Trp Ile Ile Gly Glu Lys Glu Gln Gln Ala Lys
180 185 190
Pro Leu Met Tyr His Met Ser Gln Arg Gly Trp Val Cys Val Ala Ile
195 200 205
Asn Tyr Arg Leu Ser Pro Lys Glu Ala Phe Pro Ala His Ile Val Asp
210 215 220
Val Lys Lys Ala Ile Ala Trp Val Arg Glu Asn Ile Ala Gln Tyr Gly
225 230 235 240
Gly Asp Pro Asn Phe Ile Ala Ile Thr Gly Gly Ser Ala Gly Gly His
245 250 255
Leu Ser Ser Leu Ala Ala Leu Thr Pro Asn Arg Ala Gln Trp Gln Pro
260 265 270
Gly Phe Glu Asp Ala Asp Thr Thr Ile Gln Ala Ala Val Pro Phe Tyr
275 280 285
Gly Val Tyr Asp Phe Leu Asp Arg Tyr Asp Ile Arg Pro Asp Met Ser
290 295 300
Met Glu Asp Ile Ile Ala Asp Lys Val Leu Gln Cys Ala Lys Glu Asp
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Asn His Gln Leu Trp Glu Asp Gly Ser Pro Met Ser His Ile Gly Ala
325 330 335
His Ala Pro Pro Met Tyr Val Ile Gln Gly Thr His Asp Ser Leu Val
340 345 350
Trp Val Glu Glu Ala Arg Thr Phe Val Ala Ala Leu Gln Glu Val Ala
355 360 365
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Glu Ile Phe His Ser Val Arg Thr Asp His Thr Val Asn Ser Val Ala
385 390 395 400
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<212> DNA
<213> Unknown
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<223> DNA isolated from metagenome library
<400> 23
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ctggtgccgg aaggatgtga tggcgcaccg atactttatt acctgcatgg cggtgcctac 240
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atgcgggcgt tgctgccgga ctatcgcctc gccccggaaa acccgttccc ggcgtcgctc 360
gaagactcga ccagggtcta tcgtgcgctg attgaggccg gcacagattc gtcgaccatg 420
gcattcggtg gcgattcagc cggaggaaac ctggccatgg caacactgct ggcgctacgc 480
gatgcaggtg atcccttgcc ggcaacctgt ttcctgctgt caccatggct cgatctcgcg 540
gcccagggcg agtcacacga atcgcgcgcc gagcacgatc cgtggttcag agcagcagac 600
atgccggaga tcgtcatgaa gttttgttcc gaattcgacg taaaaaatcc gttggtgtcg 660
cctgtctacg ccgatgcatc tgatctgccg ccgatgctga ttcaggtagg ggatcatgag 720
attttgctca gcgattcaac ccgacttgca gataatattg caaaggcggg cggtgaggtt 780
acgttacagg tctggcccga tatgtggcat gtatttcagt tttttatagg ccagatgccg 840
gagagcaaaa aggcgatcaa aggaatagca gagtatttgc agaagcggtt tggtgcgcag 900
gaggtagtgc agcagccgca agaggatcag gctgcgtga 939
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<211> 312
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
<400> 24
Met Ile Ser Leu Arg Gly Arg Met Ile Arg Phe Met Ser Lys Gln Phe
1 5 10 15
Phe Lys Arg Ile Arg Pro Asp Ser Asp Ile His Lys Leu Arg Thr Glu
20 25 30
Phe Glu Ala Ile Gly Thr Lys Met Arg Pro Ala Glu Gly Val Gln Val
35 40 45
Arg His Thr Lys Ile Ala Gly Ile Glu Cys Asp Trp Leu Val Pro Glu
50 55 60
Gly Cys Asp Gly Ala Pro Ile Leu Tyr Tyr Leu His Gly Gly Ala Tyr
65 70 75 80
Met Met Gly Ser Pro Lys Thr His Arg Arg Met Val Ser His Ile Ile
85 90 95
Lys Arg Ala Gly Met Arg Ala Leu Leu Pro Asp Tyr Arg Leu Ala Pro
100 105 110
Glu Asn Pro Phe Pro Ala Ser Leu Glu Asp Ser Thr Arg Val Tyr Arg
115 120 125
Ala Leu Ile Glu Ala Gly Thr Asp Ser Ser Thr Met Ala Phe Gly Gly
130 135 140
Asp Ser Ala Gly Gly Asn Leu Ala Met Ala Thr Leu Leu Ala Leu Arg
145 150 155 160
Asp Ala Gly Asp Pro Leu Pro Ala Thr Cys Phe Leu Leu Ser Pro Trp
165 170 175
Leu Asp Leu Ala Ala Gln Gly Glu Ser His Glu Ser Arg Ala Glu His
180 185 190
Asp Pro Trp Phe Arg Ala Ala Asp Met Pro Glu Ile Val Met Lys Phe
195 200 205
Cys Ser Glu Phe Asp Val Lys Asn Pro Leu Val Ser Pro Val Tyr Ala
210 215 220
Asp Ala Ser Asp Leu Pro Pro Met Leu Ile Gln Val Gly Asp His Glu
225 230 235 240
Ile Leu Leu Ser Asp Ser Thr Arg Leu Ala Asp Asn Ile Ala Lys Ala
245 250 255
Gly Gly Glu Val Thr Leu Gln Val Trp Pro Asp Met Trp His Val Phe
260 265 270
Gln Phe Phe Ile Gly Gln Met Pro Glu Ser Lys Lys Ala Ile Lys Gly
275 280 285
Ile Ala Glu Tyr Leu Gln Lys Arg Phe Gly Ala Gln Glu Val Val Gln
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Gln Pro Gln Glu Asp Gln Ala Ala
305 310
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<212> DNA
<213> Unknown
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<223> DNA isolated from metagenome library
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tttgatgtgg gagccctgct gtgtaaggag actgatgggc aatgcctcag tcagcagcaa 840
ctagatgcag tccgcgttta ttatgaagga cccaaagata ataagggaaa ctcactctat 900
tatggctatc cccttggcgg cgaaaccagt ccgaccggtt ggtccttgtg gttaacaggc 960
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ctaaccgatc tcgataagtg ggtagagtca ggcaaggcgc ccgaacaaac taccgcattt 1440
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gcccaatacg acggcaaagg ggatacgcgc gatgcagcca gctttagctg tgtgagccca 1560
gactag 1566
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
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Pro Ser Tyr Val Phe Ala Gly Ser Phe Ile Gln Ser Asp Gln Cys Asn
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Ile Glu Gly Leu Pro Ser Leu Pro Asp Val Asn Ile Ile Ser Ala Thr
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Gln Glu Ile Ser Pro Ala Pro His Cys Lys Val Ala Gly Val Ile Gly
50 55 60
Pro Glu Ile His Phe Glu Leu Leu Leu Pro Glu Lys Trp Asn Gly Lys
65 70 75 80
Phe Val Met Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Val Gly Ser Val Val Asn Val
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Thr Asp Thr Gly His Gln Ala His Ser Leu Asp Ala Ser Trp Ala Gln
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Thr Lys Val Thr Ala Lys Ala Leu Ile Glu Ser Tyr Tyr Gln Gln Asp
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Ile Ser Arg Asn Tyr Phe Ile Gly Cys Ser Arg Gly Gly Gly Gln Gly
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Leu Met Ala Ala Gln Arg Tyr Pro Asp Asp Phe Asp Ala Ile Ala Ala
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Gly Ala Pro Ala Tyr Asn Trp Thr Gly Gln Leu Gly Ala Ala Met Val
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Ile Ile Gly Pro Lys Glu Gln Ala Leu Ile Glu Ser Ser Tyr Leu Ala
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Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gly Ile Lys Asp Gly Ile Leu Asn Asp Pro
245 250 255
Arg Asp Cys Lys Phe Asp Val Gly Ala Leu Leu Cys Lys Glu Thr Asp
260 265 270
Gly Gln Cys Leu Ser Gln Gln Gln Leu Asp Ala Val Arg Val Tyr Tyr
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Glu Gly Pro Lys Asp Asn Lys Gly Asn Ser Leu Tyr Tyr Gly Tyr Pro
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Leu Gly Gly Glu Thr Ser Pro Thr Gly Trp Ser Leu Trp Leu Thr Gly
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Gly Leu Lys Tyr Thr Asp Asn Ser Gly Asp Phe Gln Ala Gly Thr Arg
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Ser Asp Phe Glu Ala Pro Val Thr Pro Asn Ala Met Phe Pro Phe Ser
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<223> DNA isolated from metagenome library
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1500
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<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
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Ser Arg Tyr Tyr Ser Arg Phe Lys Ile Gly Glu Ile Thr Met Lys Lys
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Ala Ala Asp Lys Pro Pro Gly Tyr Phe Val Asp Glu Ser Lys Leu Pro
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Asn Val Ala Ala Gln Gln Leu Gly Val Gly Gly Ser Gln Tyr Pro Val
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Asp Pro Ile Pro Tyr Leu Phe Gly Thr Val Pro Ala Ile Lys Gly Asn
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Leu Pro Arg Thr Pro Gly Val Gly Val Asp Asn Ser Asp Thr Val Tyr
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Gln Phe Asp Thr Asp Pro Ser Leu Ser Thr Glu Glu Glu Asn Phe Asn
355 360 365
Asn Asp Val Val Arg Val Ala Ala Asp Pro Gln Gly Arg Asn Pro Asn
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Gly Leu Ser Gln Val Pro Val Ile Ser Gly Asp Ile Gln Ile Pro Val
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Leu Thr Leu His Asn Leu Gly Asp Leu Phe Val Pro Val Leu Asn Glu
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<212> DNA
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<223> DNA isolated from metagenome library
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<212> PRT
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<220>
<223> protein isolated from metagenome library
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Met Asn Ser Arg Leu Ala Ile Ile Leu Val Ala Val Leu Ala Ala Gly
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Lys Lys Ile Gly Glu Arg Phe Lys Asp Arg Trp Leu Val His Ile His
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Gly Gly Ala Phe Val Phe Asn Gly Gly Glu Gly Cys Val Thr Glu Ala
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Ile Trp Ile Ala Asp Ala Cys Glu Ser Gln Val Leu Ser Ile Asp Tyr
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Arg Arg Pro Pro Val His Pro Phe Pro Ala Ala Ile Asp Asp Ala Val
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<213> Unknown
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<223> DNA isolated from metagenome library
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agaatgccgc ccaaacatcc tgcgccttcc gccactgacg atgtgattac cgtttggaaa 360
gagctgctga agactcgagc gcacacctct atggcaatgg gggggacatc agcgggagga 420
aatatcgcgc ttgcgtccag ccaacgcttt gtaggccttg gaatggctgt tccagcagcg 480
ctctacatcg gcacgcccac cgtcgatttg aatgcagaag ctggggacag ccgttacctg 540
aatgaagggg ctgaccgagt tctgatcaag atgggcgact ttggcgcagc tgcgatgaac 600
ctatatgctg ggaaactggg tctgaaccat ccttatgttt ctccaatctt tggtgatttc 660
acagggctac ctccaactta cctcatcacc ggcacaagag atcttcttct gagtgacact 720
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gctgaactga atcggtttgt acttgagcat ctgtcggctc ctttggtgac tgaatctatg 900
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> DNA isolated from metagenome library
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Glu Lys Asp Ala Gly Ala Ala Val Val Ala Gln Ser Ile Ala Asp Ala
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Leu Asn Ile Ala Ile Lys Lys Asp Arg Leu Ala Gly Val Asn Val His
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65 70 75 80
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Asp Asp Val Ile Thr Val Trp Lys Glu Leu Leu Lys Thr Arg Ala His
115 120 125
Thr Ser Met Ala Met Gly Gly Thr Ser Ala Gly Gly Asn Ile Ala Leu
130 135 140
Ala Ser Ser Gln Arg Phe Val Gly Leu Gly Met Ala Val Pro Ala Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Ile Gly Thr Pro Thr Val Asp Leu Asn Ala Glu Ala Gly Asp
165 170 175
Ser Arg Tyr Leu Asn Glu Gly Ala Asp Arg Val Leu Ile Lys Met Gly
180 185 190
Asp Phe Gly Ala Ala Ala Met Asn Leu Tyr Ala Gly Lys Leu Gly Leu
195 200 205
Asn His Pro Tyr Val Ser Pro Ile Phe Gly Asp Phe Thr Gly Leu Pro
210 215 220
Pro Thr Tyr Leu Ile Thr Gly Thr Arg Asp Leu Leu Leu Ser Asp Thr
225 230 235 240
Val Arg Ala His Arg Ala Leu Arg Arg Ala Gly Ile Ala Ala Glu Leu
245 250 255
His Val Tyr Glu Gly Gln Gly His Ala Asp Tyr Ile Val Ala Met Lys
260 265 270
Thr Pro Glu Ser Ala Glu His Tyr Ala Glu Leu Asn Arg Phe Val Leu
275 280 285
Glu His Leu Ser Ala Pro Leu Val Thr Glu Ser Met Ile Ser Gly Glu
290 295 300
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<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA isolated from metagenome library
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cctcaggcgc ttctcctggg cacaccctgc gtagatgccg gcaaagtggg tgatgctcgc 720
tacattaatg acggcatcga cacgagcctg gccagctggg acggactttt agagcaagcg 780
ctgaaaatgt atgcagtcag ttacgatctt acacaccccc atgtttcacc catttacgga 840
gattttgagg gttttccgcc aagttatctg atcagcggaa caagggatct tatgttgagt 900
gataccgttc gcgtacaccg gaaattgcga agggccggtg tggatgcgga cctgcacgta 960
tatgaaggcc aatcacatgc tgactatgtc aaggttatta atgcgcccga gtcctttgag 1020
cacttcgccg aactgaatgc attcttgcta aaacatctcc agtatccgtt gctgtctaag 1080
ccagtcgaga cgttgaagga tattgaggtc ccgaaataa 1119
<210> 34
<211> 372
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> protein isolated from metagenome library
<400> 34
Met Lys Ser Asn Leu Ile Arg Ile Gln Ala Phe Val Phe Ala Phe Met
1 5 10 15
Ser Leu Ala Val Ile Ala Asn Ala Leu Ala Lys Glu Asn Ile Trp Thr
20 25 30
Ile Gly Pro Arg Ile Leu Pro Pro Ser Val Asp Val Ser Asp Glu Phe
35 40 45
Arg Glu Val Met Leu Asn Thr Pro Ala Pro Asp Val Lys Ala Val Lys
50 55 60
Lys Asn Val Pro Glu Thr Thr Glu Gln Trp Val Thr Met Ile Arg Ala
65 70 75 80
Leu Asp Asp Lys Thr Ala Ala Val Ala Arg Lys Leu Ala Gln Thr Leu
85 90 95
Ser Val Asn Val Gln His Asp Thr Ile Ala Gly Val Asn Val Tyr Arg
100 105 110
Val Met Pro Pro Glu Ile Ala Pro Glu His Gln Lys His Leu Phe Phe
115 120 125
His Val His Gly Gly Gly Tyr Ile Leu Asn Gly Gly Glu Ala Gly Thr
130 135 140
Tyr Glu Ala Val Leu Ile Ala Ser His Leu Lys Ile Gly Val Val Ser
145 150 155 160
Ile Asp Tyr Arg Met Pro Pro Lys His Pro Ala Pro Ala Ala Met Glu
165 170 175
Asp Val Val Leu Val Trp Lys Glu Leu Leu Lys Glu Arg Ser Pro Ala
180 185 190
Leu Met Ala Met Gly Gly Thr Ser Gly Gly Ala Gly Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Ser Val Gln His Phe Lys Glu Leu Gly Leu Ala Leu Pro Gln Ala Leu
210 215 220
Leu Leu Gly Thr Pro Cys Val Asp Ala Gly Lys Val Gly Asp Ala Arg
225 230 235 240
Tyr Ile Asn Asp Gly Ile Asp Thr Ser Leu Ala Ser Trp Asp Gly Leu
245 250 255
Leu Glu Gln Ala Leu Lys Met Tyr Ala Val Ser Tyr Asp Leu Thr His
260 265 270
Pro His Val Ser Pro Ile Tyr Gly Asp Phe Glu Gly Phe Pro Pro Ser
275 280 285
Tyr Leu Ile Ser Gly Thr Arg Asp Leu Met Leu Ser Asp Thr Val Arg
290 295 300
Val His Arg Lys Leu Arg Arg Ala Gly Val Asp Ala Asp Leu His Val
305 310 315 320
Tyr Glu Gly Gln Ser His Ala Asp Tyr Val Lys Val Ile Asn Ala Pro
325 330 335
Glu Ser Phe Glu His Phe Ala Glu Leu Asn Ala Phe Leu Leu Lys His
340 345 350
Leu Gln Tyr Pro Leu Leu Ser Lys Pro Val Glu Thr Leu Lys Asp Ile
355 360 365
Glu Val Pro Lys
370
Claims (7)
- 서열번호 34의 아미노산 서열을 가진 단백질.
- 제 1 항의 단백질을 암호화하는 유전자.
- 서열번호 34의 아미노산 서열을 가진 에스터라제.
- 제 3 항의 에스터라제를 암호화하는 것을 특징으로 하는 에스터라제 유전자.
- 서열번호 33을 포함하는 재조합 벡터.
- 제 5 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
- 제 6 항에 따른 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 배양된 세포로부터 에스터라제 효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 에스터라제 효소 생산방법.
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Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020120116123A KR101383548B1 (ko) | 2012-10-18 | 2012-10-18 | 심해 해저에서 분리된 에스터라제 ktl 9 |
Related Parent Applications (1)
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KR1020070104219A Division KR101383546B1 (ko) | 2007-10-16 | 2007-10-16 | 심해 해저에서 분리된 에스터라제 ktl 4 |
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Family
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101661112B1 (ko) | 2015-08-12 | 2016-09-30 | 한국수력원자력 주식회사 | 플라즈마 용융로 설비의 드럼형 폐기물 투입장치 |
-
2012
- 2012-10-18 KR KR1020120116123A patent/KR101383548B1/ko active IP Right Grant
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KR101661112B1 (ko) | 2015-08-12 | 2016-09-30 | 한국수력원자력 주식회사 | 플라즈마 용융로 설비의 드럼형 폐기물 투입장치 |
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