KR20120129851A - 심해 해저에서 분리된 에스터라제 ｋｔｌ 7 - Google Patents

Abstract

본 발명은 심해 해저에서 분리된 리파제 및 에스터라제 효소 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 서남태평양 해역(남위 3°89′, 동경 152°49′) 깊이 1,400 미터에 이르는 심해 퇴적물, 북극 다산기지 주변 연안 퇴적물, 강화도 갯벌 퇴적물로부터 구축된 메타게놈 라이브러리를 대상으로 분리한 신규 리파제 및 에스터라제 효소, 이들을 암호화 하는 유전자 및 리파제 및 에스터라제 효소 생산방법을 제공한다.

Description

심해 해저에서 분리된 에스터라제 ＫＴＬ 7{Esterases KTL 7 Isolated from Deep Sea Sediment}

본 발명은 신규 리파제, 이를 암호화하는 유전자 및 리파제를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 신규 에스터라제, 이를 암호화하는 유전자 및 에스터라제를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

리파제(lipase, glycerol ester hydrolases)란 다양한 범위의 수용성 혹은 비수용성 카르복실산 에스테르(carboxylic acid ester)나 아마이드(amide)의 가수분해 혹은 합성을 촉매하는 효소를 말하며 가수분해 (hydrolysis), 알콜분해 (alcoholysis), 산 분해 (acidolysis), 에스테르화 (esterification), 아미노분해(aminolysis) 등과 같이 다양한 생물 촉매 반응에 관여하고, 수용액 상태에서 뿐 아니라 유기 용매에서도 활성을 유지하고, 촉매반응 과정에 별도의 보조인다(cofactor)를 필요로 하지 않고, 다양한 기질에 대해 기질 특이성을 나타내고, 광학이성질체중 어느 한쪽에 대해서만 활성을 나타내는 이성질체 선택성을 가지고 있어 산업적 응용성이 높은 효소 중의 하나이다. 현재까지 많은 종류의 동물, 식물, 미생물이 리파제를 생산하는 것으로 알려졌으며, 리파제의 생화학적 특성에 대한 연구, 리파제 유전자를 확보하기 위한 연구가 진행되고 있으며, 특히 식품, 세제, 정밀화학, 화장품 및 환경소재공업등 산업 전반에 걸쳐서 리파제를 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고있다.

의약품을 비롯한 부가가치가 높은 선도물질을 합성하는 정밀화학분야에서, 기존의 화학적인 방법으로 에스테르화합물을 합성하는 경우, 고온과 고압에서 합성되기 때문에 에너지가 많이 소모되며 품질에 나쁜 영향을 주는 여러 가지 부반응이 일어날 뿐 아니라, 전환율 및 특정 광학이성체의 순도가 낮아서 고순도의 정밀화학제품 생산에 어려움이 있어 왔다. 최근에는 이러한 문제점을 보완하기 위해서, 위치특이성과 광학활성 특이성을 나타내는 리파제를 생촉매로 사용하는 반응이 활발히 연구되고 있으나, 리파제가 저온에서 활성이 떨어지는 단점 때문에 응용 가능성에 제한을 받고 있다.

또한, 리파제는 지방 성분의 때를 물에 잘 녹는 지방산 또는 글리세롤로 가수분해시켜 계면활성제의 작용을 용이하게 해주는 기능이 있어 세제, 표백제의 첨가제로 연구되어져 왔지만, 현재까지 사용실적이 미미한 상태이다. 이는 낮은 세정 온도에서 리파제의 활성이 떨어지는 단점으로 인해, 지방이나 유지성분이 불량하게 혹은 불완전하게 제거되기 때문이다.

에스터라제는 에스테르 결합을 분해하여 저분자의 지방과 알코올을 만드는 효소로서, 탄소 10개 이하의 아실 사슬을 가진 글리세롤에스테르(glycerolester)에 대해서만 활성을 가지고 있다. 현재까지 박테리아, 효모 및 고등생물을 비롯하여 식물을 포함한 다양한 생물체에서 많은 종류의 에스터라제가 발견되어 왔으며, 이에 대한 생화학적 특성 및 에스터라제 유전자 자체에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 에스터라제는 리피드(lipid)의 가수분해(hydrolysis) 반응, 가산분해(acidolysis, 에스테르화된 지방산을 유리지방산으로 치환) 반응, 트랜스에스테르화(transesterification, 중성지방(triglyceride)간 지방산의 교환), 에스테르의 합성 등에 사용되어, 산업적으로 매우 중요한 효소이다. 특히, 세탁물 얼룩 내의 지방성분을 쉽게 제거 가능한 친수성 물질로 분해할 수 있어 세제 산업에 사용될 수 있고, 치즈의 숙성 및 향미를 추가하는 등의 치즈 생산 및 제빵용 노화 방지제나 천연 버터 향미를 가진 마가린의 제조와 같은 식음료 산업, 쓰레기 처리 산업, 그리고 소화제의 주요성분으로서 제약 산업 등에 이용될 수 있다. 이밖에도 에스터라제는 기질 특이성, 광학활성 특이성 및 위치 특이성 등의 독특한 특성을 갖고 있어 여러가지 생리 활성 키랄 의약품을 개발하는데 그 용도가 주목받고 있다.

이러한 광학활성 의약품 생산에 유용한 키랄 화합물의 생산은 의약산업의 경쟁력 확보와 국민 건강 증진에 매우 큰 영향력을 가지는 과제로 관심을 모으고 있다.

상기의 중요한 반응은 때때로 고온과 유기 용매 하에서 효과적으로 수행된다. 특히, 식품산업에서 유리 지방산의 생산에 주로 이용되는 우지 (beef tallow) 및 야자유 (palm oil)는 보통의 효소 반응 온도에서는 고체상태를 유지하므로 이러한 재료의 효소적 가공을 위해서는 고온의 반응 환경이 요구된다. 따라서, 고온에서 안정한 내열성 에스터라제가 절실히 요구되고 있다.

본 발명은 신규의 리파제 및 에스터라제 효소를 제공하는 것이다.

본 발명은 신규의 리파제 및 에스터라제 효소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다

본 발명은 리파제 효소 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 에스터라제 효소 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 리파제 효소를 암호화하는 분리된 DNA 서열 및 이를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한 본 발명은 에스터라제제 효소를 암호화하는 분리된 DNA 서열 및 이를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 리파제 효소 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 에스터라제 효소 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 유전공학적 방법에 의한 제조방법이다.

제 1 양태로, 본 발명은 서열번호 7 또는 11을 가지는 신규 리파제 효소들을 암호화하는 핵산서열 및 상기 서열에 등가의 핵산서열들을 제공한다. 또한 서열번1, 3, 5, 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33의 서열을 가지는 신규 에스터라제 효소들을 암호화하는 핵산서열 및 상기 서열에 등가의 핵산서열들을 제공한다.

"등가의 핵산서열"에는 상기 리파제 효소 및 에스터라제 서열의 코돈 축퇴성 서열을 포함한다.

"코돈 축퇴성 서열"이란 상기 자연 발생의 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 자연 발생의 리파제 및 에스터라제 효소와 동일한 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 의미한다.

제 2 양태로, 본 발명은 서열번호 8 또는 12의 아미노산 서열을 가지는 리파제 효소및 이의 기능적 동등물을 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 10, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 34의 아미노산 서열을 가지는 에스터라제 효소 및 이의 기능적 동등물을 제공한다.

본 발명의 "기능적 동등물"에는 서열번호 8 또는 12의 리파제 및 서열번호 2, 4, 6, 10, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 34 의 에스터라제 효소 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 상기 효소 기능을 유지하는 것 모두를 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 리파제 및 에스터라제 효소의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

본 발명은, 제 3 양태로는 상기 리파제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 7 또는 11의 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한 상기 에스터라제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 1, 3, 5, 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33의 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 벡터라는 용어는 또다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현벡터란 용어는 상기 벡터에 의해 운반되는 각 재조합형 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 합성시킬 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파아지를 포함한다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.

본 발명의 제 4 양태로는, 리파제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 7 또는 11의 DNA 분절을 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 또한 상기 에스터라제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 1, 3, 5, 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33의 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다.

적합한 형질전환세포로는 원핵생물, 곰팡이, 식물, 동물세포 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 대장균을 이용한다.

본 발명의 제 5 양태로는 리파제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 7 또는 11의 DNA 분절을 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 세포를 이용하여 리파제를 생산하는 방법을 제공한다. 또한 상기 에스터라제 효소를 암호화하는 분리된 서열번호 1, 3, 5, 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33의 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 이용하여 에스터라제 효소를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 신규 리파제 및 에스터라제 및 이를 암호화하는 유전자, 신규 리파제 및 에스터라제를 생산하는 형질전환된 대장균, 이를 배양하여 리파제 및 에스터라제를 대량 생산하는 방법 및 생산된 리파제 및 에스터라제의 응용에 관한 것으로, 상술한 바와 같이, 신규 리파제 및 에스터라제의 활성이 우수하였고, 폭 넓은 온도에서 안정성을 가지고 있으며, 고부가가치의 정밀화학 산업과 화장품, 세제 산업등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 서열번호 1 및 서열번호 2의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L1).
도 2는 서열번호 3 및 서열번호 4의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L2).
도 3은 서열번호 5 및 서열번호 6의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L3).
도 4는 서열번호 7 및 서열번호 8의 리파제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L4).
도 5는 서열번호 9 및 서열번호 10의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L6).
도 6은 서열번호 11 및 서열번호 12의 리파제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(EM2L7).
도 7은 서열번호 13 및 서열번호 14의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL1).
도 8은 서열번호 15 및 서열번호 16의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL3).
도 9는 서열번호 17 및 서열번호 18의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL5).
도 10은 서열번호 19 및 서열번호 20의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL6).
도 11은 서열번호 21 및 서열번호 22의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL7).
도 12는 서열번호 23 및 서열번호 24의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(ATL11).
도 13은 서열번호 25 및 서열번호 26의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL1).
도 14는 서열번호 27 및 서열번호 28의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL3).
도 15는 서열번호 29 및 서열번호 30의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL4).
도 16은 서열번호 31 및 서열번호 32의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL7).
도 17은 서열번호 33 및 서열번호 34의 에스터라제 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(KTL9).

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > 유전자의 분리 및 미생물

본 발명의 신규 리파제 및 에스터라제를 생산하는 유전자는 서남태평양 해역의 깊이 1,400미터에 이르는 퇴적물로부터 환경 DNA를 추출하여, 정제 과정을 거쳐서 포스미드(Fosmid) 벡터를 이용하여 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리의 평균 인서트(insert) DNA 크기는 약 32 kb로 8천여 클론이 구축되었으며, 이는 약 280 mb의 염기쌍에 해당된다. 구축된 메타게놈 라이브러리로부터 트리카프릴닌(Tricaprylin) 평판배지에서 활성을 나타내는 클론으로부터 분리하였다.

< 실시예 2 > 리파제 및 에스터라제 유전자의 클로닝 및 아미노산 서열 결정

메타게놈 라이브러리로부터 발견된, 트리카프릴닌 분해 활성이 있는 클론의 포스미드 디엔에이(fosmid DNA)를 대량 얻은 후에 네불라이저(Nebulizer)를 이용하여 2?4 kb로 자른후 말단 리페어링(end-repairing) 효소를 사용하여 각각의 DNA 절편을 블런트 엔드(blunt-end)로 만들어 작은 크기의 삽입될 DNA를 준비한다. 피블루스크립트(pBluescript SK) 벡터는 제한 효소 에콜알오(EcoRⅤ)로 자른 후, 포스파타제(calf intestinal phosphatase)로 처리한 후, 삽입될 DNA와 리게이션(ligation)시켜 E. coli DH5α에 형질전환 시켰다. 이것을 암피실린(ampicillin)을 첨가한 트리카프릴닌(Tricaprylin) 평판배지 (1% 트립톤(tryptone), 0.5% 효모 추출물(yeast extract), 1% 염화나트륨(NaCl), 1% 트리카프릴닌(Tricaprylin))에 도말하고 37℃에서 24시간 배양하여 트리카프릴닌을 분해하여 투명 환을 형성하는 군락(colony)을 찾았다. 이것을 배양하여 플라스미드를 분리하여 확인하였다. 삽입 DNA의 염기서열분석은 시퀀싱 키트(sequenase kit)와 티세븐 프라이머(T7 primer), 티쓰리 프라이머(T3 primer), 그리고 염기서열결정에 필요한 프라이머(primer)를 디자인하여 사용하였고, 생어 다이 데옥시 체인 터미네이션(Sanger dideoxy chain termination) 방법으로 결정하였다. 벡터 엔티아이(NTI) 프로그램을 이용하여 조립(assemble)을 수행하였고, 엔씨비아이(NCBI)의 오알에프 예측 프로그램(ORF finder)를 이용하여 오알에프(open reading frame; ORF)를 발견하였다.

그 결과, EM2L4 및 EM2L7는 신규 리파제로 나타났고, EM2L1, EM2L2, EM2L3, EM2L6, ATL1, ATL3, ATL5, ATL6, ATL7, ATL11, KTL1, KTL3, KTL4, KTL7 및 KTL9는 신규 에스터라제로 나타났다(표 1).

신규 리파제 및 에스터라제

클론 이름	리파제/ 에스터라제 (bp)	발현 벡터	효소 사이트	아미노산	특성					활성
					pH	pH 범위	온도	온도 범위	기질
EM2L1	780 (서열번호1)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	259 (서열번호2)	8	7?10	20	5?40	C6	에스터라제
EM2L2	1215 (서열번호3)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	404 (서열번호4)	9	7?10	30	10?40	C6	에스터라제
EM2L3	900 (서열번호5)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	299 (서열번호6)	8.5	6.5?9.5	15	5?60	C6	에스터라제
EM2L4	993 (서열번호7)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	330 (서열번호8)						리파제
EM2L6	807 (서열번호9)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	268 (서열번호10)						에스터라제
EM2L7	834 (서열번호11)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	277 (서열번호12)						리파제
ATL1	912 (서열번호13)	pET 24d(+)	NcoI 및 Not I	303 (서열번호14)	8	7.0-9.0	35	20-50	C4	에스터라제
ATL3	918 (서열번호15)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	305 (서열번호16)	8.5	6.5?10	20	5?30	C4	에스터라제
ATL5	1080 (서열번호17)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	359 (서열번호18)						에스터라제
ATL6	870 (서열번호19)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	289 (서열번호20)	8	6.5?10	40	20?50	C6	에스터라제
ATL7	1248 (서열번호21)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	416 (서열번호22)						에스터라제
ATL11	939 (서열번호23)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	312 (서열번호24)	8	7.5-8.5	35	25-40	C6	에스터라제
KTL1	1566　 (서열번호25)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	521 (서열번호26)	8	6.5?10	30	5?45	C4	에스터라제
KTL3	1500 (서열번호27)	pET 24a(+)	NdeI 및 Not I	499 (서열번호28)						에스터라제
KTL4	1059 (서열번호29)	pET 24a(+)	NdeI 및 Not I	352 (서열번호30)	8.5	6.5?10	20	5?25	C6	에스터라제
KTL7	951 (서열번호31)	pET 24d(+)	NcoI 및 Not I	316 (서열번호32)	8	7?9	30	15?35	C6	에스터라제
KTL9	1119 (서열번호33)	pET 24a(+)	NdeI 및 XhoI	372 (서열번호34)	8	6.5?10	30	5?45	C6	에스터라제

< 실시예 3 > 리파제 및 에스터라제의 대량생산을 위한 재조합 플라스미드 개발

메타게놈 라이브러리로부터 찾아낸 신규 리파제 및 에스터라제를 대량으로 생산하기 위해서 대량 생산용 재조합 플라스미드를 개발하였다. 리파제 및 에스터라제 유전자를 포함하는 DNA를 주형(template) DNA로 이용하고 합성된 2개의 프라이머를 사용하여 핵산증폭반응(PCR)을 수행하였다. 제한효소는 표 1에서와 같이 각각의 인지 부위를 갖도록 합성된 DNA 양끝을 자른 후, 동일한 제한효소로 처리된 대량 생산용 벡터와 함께 리게이션(ligation) 시킴으로써 대량 생산용 재조합 플라스미드들을 개발하였다(표 1).

재조합 플라스미드에는 강력한 티세븐 프로모터(T7 promotor)와 번역(translation) 신호가 내재되어 있어서 T7 RNA polymerase 유전자를 갖고 있는 E. coli BL21(DE3)를 숙주로 사용하는 경우 원하는 리파제의 대량 생산이 가능하다.

리파제의 활성은 일정한 pH에서 올리브유가 효소에 의해 가수분해되어 생성되는 지방산의 양을 수산화나트륨(NaOH)으로 적정하는 pH 스텟(stat) 방법에 의해 측정하였고, 효소의 1 유닛(unit)은 분당 1 μ㏖의 지방산을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.

에스터라제의 활성은 p-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate; pNPB) 또는 다른 p-니트로페틸 에스터(p-nitrophenyl esters; pNPEs)를 기질로서 사용하여 측정하였다. 반응혼합액은 아세노니트릴에 녹인 0.01ml의 10mM 기질, 0.04ml 에탄올 및 0.95ml의 50mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 적절한 양의 효소를 포함하여 구성하였다. 효소 반응은 35℃에서 3분 동안 수행하였다. 반응하는 동안 유리된 p-니트로페놀의 양을 405nm에서 측정하였다. 효소의 1 유닛은 35℃에서 분당 1 μ㏖의 p-니트로페놀을 필요로 하는 효소의 양으로 정의하였다,

< 실시예 4 > 리파제 및 에스터라제의 대장균에서의 발현 및 생산

재조합 플라스미드를 지니는 대장균(E. coli BL21(DE3)) 균을 카나마이신(kanamycin) ml당 50 마이크로그램(ug)이 포함된 액체배지(LB) (1% 트립톤(tryptone), 0.5% 효모 추출물(yeast extract), 1% 염화나트륨(NaCl))에서 흡광오디(OD600 nm)가 0.6으로 될 때 까지 배양한 후, 아이피티지(IPTG)를 최종농도 1 mM이 되게 첨가하여 25℃에서 12시간 배양하여, 라파제 및 에스터라제 효소를 얻을 수 있었다.

< 실시예 5 > 리파제 및 에스터라제의 분리 정제 방법

대장균(E. coli BL21(DE3)이 생산한 리파제 및 에스터라제를 다음과 같이 순수분리하였다. 대량 생산된 균체를 원심분리를 통해서 회수하였다. 회수된 균체를 초음파 분쇄법으로 깬 후에 원심분리(12,000×g, 4℃, 10분)하여 얻은 상층액만을 얻어 조효소액으로 하였다. 히스바인딩(His Bind) 컬럼은 결합 버퍼(500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 40 mM imidazole, pH 7.9)로 평형시킨 후 위에서 얻은 조효소액을 컬럼에 통과시킨다. 세척용 완충용액(500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 60 mM imidazole, pH 7.9)으로 세척 후 동일한 버퍼 조건에서 이미다졸(imidazole) 농도를 100 mM로 높여서 리파아제 및 에스터라제를 정제하였다.

<110> Korea Ocean Research & Development Institute <120> lipases and esterases isolated from deep sea sediment <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 780 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> DNA isolated from metagenome library <400> 1 atgcttatcc cttccgatgg tctggaactg gccgtagagt gttttggcga gggaccgtca 60 ctgattttcg cgcacgggct gacgggcaac cgccacttct cgcggcaaca gcttgcacca 120 ctggcggacc aatatacgat catcatctac gaccagcgcg gccactgcga ctcttccccc 180 gtcaccgacc cggctttgta cgatcccgtg cgcatggccg aagatatgac ggccgttctc 240 gatacactcg gtatcaaaaa agcgatcgtt ggcggcgaat caatgggcgc ggcgacgacg 300 ctgctttttg ccctgcgcca cccgcaacgt gtagaaaaat tactgctcac tgctcccgcc 360 tttggcgata cccgcagcag cgaagccgct ggactgcaac agatggggca gcggattgcc 420 gccattggca tcgaggcgtt tttagcggaa tcggcggtga gccagcgtga ggaactgggt 480 tggccggaac ctgtcatcac tgccgtggcc gccatgcaag gttcgcacga aacccacagt 540 atagcgaccg cctgccagag tgtcattgag tggacgctgg atttatcgcc gctgtctacc 600 atcgcttgcc ccacctgcat tattgcctgg gaagacgacc cgctgcaccc 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acccagcggc tccaggcttt tgtgtgctta tcccgaagtt 1500 gcccaatacg acggcaaagg ggatacgcgc gatgcagcca gctttagctg tgtgagccca 1560 gactag 1566 <210> 26 <211> 521 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> protein isolated from metagenome library <400> 26 Met Lys Lys Ala Thr Ala Val Phe Ile Leu Ile Val Ser Val Tyr Phe 1 5 10 15 Pro Ser Tyr Val Phe Ala Gly Ser Phe Ile Gln Ser Asp Gln Cys Asn 20 25 30 Ile Glu Gly Leu Pro Ser Leu Pro Asp Val Asn Ile Ile Ser Ala Thr 35 40 45 Gln Glu Ile Ser Pro Ala Pro His Cys Lys Val Ala Gly Val Ile Gly 50 55 60 Pro Glu Ile His Phe Glu Leu Leu Leu Pro Glu Lys Trp Asn Gly Lys 65 70 75 80 Phe Val Met Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Val Gly Ser Val Val Asn Val 85 90 95 Ala Glu Asp Leu Tyr Gly Ala Val Ser Ser Gly Tyr Ala Thr Ala Gly 100 105 110 Thr Asp Thr Gly His Gln Ala His Ser Leu Asp Ala Ser Trp Ala Gln 115 120 125 Asn Asn Met Glu Arg Ile Val Asn Phe Gly His Gln Ala Val His Arg 130 135 140 Thr Lys Val Thr Ala Lys Ala Leu Ile Glu Ser Tyr Tyr Gln Gln Asp 145 150 155 160 Ile Ser Arg 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tattactcgc gcttcaaaat aggggaaata 180 acaatgaaaa agctaatgca gtcattcttt atcgtcattc tgtttgcatg gggcagcgct 240 gctgcggaca aaccgccggg ctatttcgtc gatgagagta aactcccgtt ccccgcactg 300 ccaagtgcca cggccatgtg gggagtgcat aaaggtgccg gctatcgtat tgaagtgccg 360 gataactgga acgggacgct ggtcgtctgg gcgcacggtt tccgcggcac cggacttgag 420 ctgaccgtcg acaaccaccc cctgcgcgaa tatctgattc ccaacggtta cgcttgggcg 480 gcatcgagtt acagtcgcaa cgattacgat attacgactg gcgttcagga tacgcacgcg 540 cttacccagc gcttcaacgg catcgtcggc aagcccgaca aagtttatct gaccggtgcg 600 tcaatgggcg gtcatgtcac ggccgtagcg atcgagcagt atccaaacac ctacgacgcg 660 gccttgccca tttgcggcgt gctcggagac tacgaattgt tcgattactt cctggatttc 720 aatgtggctg cgcagcagct gggtgtaggc ggttcgcagt acccggtcga tccgattccg 780 tatcttttcg gaacagtgcc ggcaataaaa ggtaacttgg agcaattccc cgggggatgg 840 cctgtggatt tgaatgcaca gggaacccag ctgaagtcgc tgacagagct tcgcagtggc 900 ggcaagcggc caaatttcga tgaggcctgg tttttctgga atacttttgc aaactttgaa 960 tccggccccg gcaatttctt gttcgatcta gcgatcggcg acggcactct gccacgcaca 1020 cccggtgttg gagtcgataa cagcgatacg gtctatcagt tcgacaccga cccgtccctg 1080 agcaccgaag aagaaaactt caacaatgat gttgtccgcg tcgcagccga tccacagggc 1140 cgaaatccga acggcttgtc tcaggtacca gtgatctcag gagatatcca gattccggta 1200 ctcacgttgc acaatctagg cgatttgttc gtgccggttc ttaacgaagt cgaatatgca 1260 tcccgcgtag cggcgaatgg aaaaagtgac cttctggtac agcgcgcaat tcgcggcgtg 1320 cttcactgcg acttcactcc agttgaattt gtaacggcat tcgcggaatt agcagcctgg 1380 gagtccttcg gagtgaaacc tgctggcgat gactggctcg atccagcggc agtagccgat 1440 ccattgttcg gctgcgcctt cacggacggg ccccacctct tcggcacacc ctgtccgtaa 1500 1500 <210> 28 <211> 499 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> protein isolated from metagenome library <400> 28 Met Ala Met Leu Asn Cys Ser Ser Arg Leu Pro Met Val Ser Ser Ser 1 5 10 15 Tyr Asn Asn Glu Lys Pro Thr Phe Ile His Gly Arg Gly Phe Ser Lys 20 25 30 Phe Leu Ile Leu Leu Lys Val Asn Tyr Gln Val Ser Thr Asn Leu Arg 35 40 45 Ser Arg Tyr Tyr Ser Arg Phe Lys Ile Gly Glu Ile Thr Met Lys Lys 50 55 60 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gagacacgtg gtacacgctg 720 gaaggtcttg actcgcttgg tcgatacgat ggtttcctcg ccgcctgctt cgaggcctac 780 ttcccttcaa aggattcctc taatccgctg gtctctcctg tccgtggtga cgtcaagggc 840 ttcccaccta cgattctgat ttcaggcacg cgggacttac ttctcagcga caccgcacga 900 atgcaccgcg cgctgcgcga ggccgaagtt gaagccgaac tccacgtcta cgaggggcaa 960 tctcacggtg attatctcat gggcactctg gttgatgcgc cagaatcaaa agacgcgcag 1020 aaggagatct tccgattctt tgacaagcat ctaaagtga 1059 <210> 30 <211> 352 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> protein isolated from metagenome library <400> 30 Met Asn Ser Arg Leu Ala Ile Ile Leu Val Ala Val Leu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Pro Leu Ala Ser Ser Ala Gln Asp Ser Ser Asp Ser Lys 20 25 30 Thr Met Glu His Arg Trp Ile Pro Thr Pro Ala Gly Val Ser Gln Glu 35 40 45 Leu Gln Ala Phe Ile Ala Gly Lys Val Ile Pro Pro Pro Met Pro Val 50 55 60 Pro Lys Thr Arg Glu Glu Trp Leu Thr Leu Gln Arg Thr Lys Asp Ala 65 70 75 80 Gly Asp Ala Lys Gln Ala Glu Glu Phe Ala Lys Lys Leu Gly Ala Ser 85 90 95 Trp Lys Ala Met Lys Val Gly 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Ala Pro Ser Ala Thr 100 105 110 Asp Asp Val Ile Thr Val Trp Lys Glu Leu Leu Lys Thr Arg Ala His 115 120 125 Thr Ser Met Ala Met Gly Gly Thr Ser Ala Gly Gly Asn Ile Ala Leu 130 135 140 Ala Ser Ser Gln Arg Phe Val Gly Leu Gly Met Ala Val Pro Ala Ala 145 150 155 160 Leu Tyr Ile Gly Thr Pro Thr Val Asp Leu Asn Ala Glu Ala Gly Asp 165 170 175 Ser Arg Tyr Leu Asn Glu Gly Ala Asp Arg Val Leu Ile Lys Met Gly 180 185 190 Asp Phe Gly Ala Ala Ala Met Asn Leu Tyr Ala Gly Lys Leu Gly Leu 195 200 205 Asn His Pro Tyr Val Ser Pro Ile Phe Gly Asp Phe Thr Gly Leu Pro 210 215 220 Pro Thr Tyr Leu Ile Thr Gly Thr Arg Asp Leu Leu Leu Ser Asp Thr 225 230 235 240 Val Arg Ala His Arg Ala Leu Arg Arg Ala Gly Ile Ala Ala Glu Leu 245 250 255 His Val Tyr Glu Gly Gln Gly His Ala Asp Tyr Ile Val Ala Met Lys 260 265 270 Thr Pro Glu Ser Ala Glu His Tyr Ala Glu Leu Asn Arg Phe Val Leu 275 280 285 Glu His Leu Ser Ala Pro Leu Val Thr Glu Ser Met Ile Ser Gly Glu 290 295 300 Gln Ile Pro Lys Glu Ile Pro Lys Ser Val Gly Tyr 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acggactttt agagcaagcg 780 ctgaaaatgt atgcagtcag ttacgatctt acacaccccc atgtttcacc catttacgga 840 gattttgagg gttttccgcc aagttatctg atcagcggaa caagggatct tatgttgagt 900 gataccgttc gcgtacaccg gaaattgcga agggccggtg tggatgcgga cctgcacgta 960 tatgaaggcc aatcacatgc tgactatgtc aaggttatta atgcgcccga gtcctttgag 1020 cacttcgccg aactgaatgc attcttgcta aaacatctcc agtatccgtt gctgtctaag 1080 ccagtcgaga cgttgaagga tattgaggtc ccgaaataa 1119 <210> 34 <211> 372 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> protein isolated from metagenome library <400> 34 Met Lys Ser Asn Leu Ile Arg Ile Gln Ala Phe Val Phe Ala Phe Met 1 5 10 15 Ser Leu Ala Val Ile Ala Asn Ala Leu Ala Lys Glu Asn Ile Trp Thr 20 25 30 Ile Gly Pro Arg Ile Leu Pro Pro Ser Val Asp Val Ser Asp Glu Phe 35 40 45 Arg Glu Val Met Leu Asn Thr Pro Ala Pro Asp Val Lys Ala Val Lys 50 55 60 Lys Asn Val Pro Glu Thr Thr Glu Gln Trp Val Thr Met Ile Arg Ala 65 70 75 80 Leu Asp Asp Lys Thr Ala Ala Val Ala Arg Lys Leu Ala Gln Thr Leu 85 90 95 Ser Val Asn Val Gln His Asp Thr Ile Ala Gly Val Asn Val Tyr Arg 100 105 110 Val Met Pro Pro Glu Ile Ala Pro Glu His Gln Lys His Leu Phe Phe 115 120 125 His Val His Gly Gly Gly Tyr Ile Leu Asn Gly Gly Glu Ala Gly Thr 130 135 140 Tyr Glu Ala Val Leu Ile Ala Ser His Leu Lys Ile Gly Val Val Ser 145 150 155 160 Ile Asp Tyr Arg Met Pro Pro Lys His Pro Ala Pro Ala Ala Met Glu 165 170 175 Asp Val Val Leu Val Trp Lys Glu Leu Leu Lys Glu Arg Ser Pro Ala 180 185 190 Leu Met Ala Met Gly Gly Thr Ser Gly Gly Ala Gly Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Ser Val Gln His Phe Lys Glu Leu Gly Leu Ala Leu Pro Gln Ala Leu 210 215 220 Leu Leu Gly Thr Pro Cys Val Asp Ala Gly Lys Val Gly Asp Ala Arg 225 230 235 240 Tyr Ile Asn Asp Gly Ile Asp Thr Ser Leu Ala Ser Trp Asp Gly Leu 245 250 255 Leu Glu Gln Ala Leu Lys Met Tyr Ala Val Ser Tyr Asp Leu Thr His 260 265 270 Pro His Val Ser Pro Ile Tyr Gly Asp Phe Glu Gly Phe Pro Pro Ser 275 280 285 Tyr Leu Ile Ser Gly Thr Arg Asp Leu Met Leu Ser Asp Thr Val Arg 290 295 300 Val His Arg Lys Leu Arg Arg Ala Gly Val Asp Ala Asp Leu His Val 305 310 315 320 Tyr Glu Gly Gln Ser His Ala Asp Tyr Val Lys Val Ile Asn Ala Pro 325 330 335 Glu Ser Phe Glu His Phe Ala Glu Leu Asn Ala Phe Leu Leu Lys His 340 345 350 Leu Gln Tyr Pro Leu Leu Ser Lys Pro Val Glu Thr Leu Lys Asp Ile 355 360 365 Glu Val Pro Lys 370

Claims (7)

1. 서열번호 32의 아미노산 서열을 가진 단백질.
2. 제 1 항의 단백질을 암호화하는 유전자.
3. 서열번호 32의 아미노산 서열을 가진 에스터라제.
4. 제 3 항의 에스터라제를 암호화하는 것을 특징으로 하는 에스터라제 유전자.
5. 서열번호 31을 포함하는 재조합 벡터.
6. 제 5 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
7. 제 6 항에 따른 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 배양된 세포로부터 에스터라제 효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 에스터라제 효소 생산방법.
   

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