JP2005509426A - 細胞内atpおよび/または遺伝子発現の測定方法 - Google Patents
細胞内atpおよび/または遺伝子発現の測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005509426A JP2005509426A JP2003544475A JP2003544475A JP2005509426A JP 2005509426 A JP2005509426 A JP 2005509426A JP 2003544475 A JP2003544475 A JP 2003544475A JP 2003544475 A JP2003544475 A JP 2003544475A JP 2005509426 A JP2005509426 A JP 2005509426A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- seq
- luciferin
- recycling
- luciferase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
Description
最も一般的な生物発光シグナル伝達系の1つは、ホタルおよび発光虫のような生物において天然で見出される酵素ルシフェラーゼと酵素基質ルシフェリンとの組合せを利用するものである。すべての細胞内で見出されるアデノシン三リン酸(ATP)の存在下、ルシフェラーゼはルシフェリンを酸化してオキシルシフェリン、システインおよび生物発光シグナルを生成し、このシグナルは、例えばルミノメーターを使用してモニターすることが可能である。
V=Vm .[ATP]/Km+[ATP]
西洋発光虫(European glow−worm)であるラムピリス・ノクチルカ(Lampyris noctiluca)を2000年から2002年にかけてイングランド南部で採集した。全ゲノムDNAを、High Pure PCR Template Preparation Kit(Roche)を使用して雌試料から抽出した。凍結乾燥フォチヌス・ピラリス(Photinus pyralis)試料(Sigma)から、同様の方法でゲノムDNAを抽出した。
ラムピリス・ノクチルカ(Lampyris noctiluca)のLRE遺伝子配列(図14)に基づき、各エキソンを個別に増幅する5組のプライマー(NOC LRE EX1〜5)を設計した(図15、表1)。
エキソン連結介在PCRにより得た2つの転写産物(LnocLRE1およびChimLRE1)はそれぞれ864bp長および903bp長である。両方の配列(それぞれ配列番号58および60)は、推定アミノ酸配列(それぞれ配列番号59および61)と共に図16および17に示されている。これらのアミノ酸配列は、既に報告されている他のLRE配列と整列させて示されており(図18)、アミノ酸の同一性(%)は表2に示されている。
選択したベクターにおける正しい配向および発現が可能となるようPCR増幅に制限酵素部位含有プライマーを使用することにより、両方のLRE配列を適当な発現ベクターに導入することが可能である。プライマーは、Nco IおよびXho I部位を有するよう設計した(表1)。PCR産物の制限酵素消化は、付着末端クローニング部位、すなわち、5’末端のNco I部位および3’末端のXho I部位の変換をもたらす。
各構築物の一晩培養物(3ml)(50μg/ml アンピシリンおよび34μg/ml クロラムフェニコールを含有するLB内)を使用して、1Lの培養物に接種した。誘導前に、培養物を分割して対照(未誘導サンプル)および試験(誘導サンプル)を得た。すべての試験サンプルを1mM イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)で0.45〜0.6の光学濃度(A600)で3〜5時間誘導した。タンパク質の発現を調べるために、未誘導培養および誘導培養の両方の1mlのサンプルをペレット化した。
誘導された培養(500ml)を集め、20mlのバッファーに再懸濁させる。超音波処理(25秒間のオン、20秒間のオフの10サイクル)、および遠心分離(14000rpm、20分間)後の上清の採取により、可溶性粗抽出物(清澄化サンプル)を調製する。TALONアフィニティー樹脂を製造業者の指示(BD biosciences)に従い使用して、Hisタグ付きタンパク質を精製する。TELON樹脂は固定化コバルト2+を使用するものであり、ポリヒスチジンタグ付きタンパク質に対する選択性の増強をもたらす。
通常の方法を用いて全細胞を形質転換して、それがLREおよびホタルルシフェラーゼ活性を発現するようにする。これらの細胞を、0.6mM D−ルシフェリンを含有する低pHバッファー(最大pH5.0)中、(細胞型に応じて)0.5〜10分間インキュベートする。
アッセイされるATPを含有するサンプルを、25mM Tricine−NaOH(pH7.8)、4.0mM MgSO4、0.1〜10μgのホタルルシフェラーゼおよび本発明の0.1〜20μgの組換えLREまたは同様に本発明の0.1〜40μgの精製組換えルシフェラーゼ−LRE融合タンパク質、0.5〜5mM D−システインならびに250μM D−ルシフェリンを含有する反応混合物に加える。ルミノメーターまたは他の光検出装置を使用して、該サンプルのATP含量の尺度として、該反応からの光出力を検出し、測定する。
Claims (34)
- ルシフェラーゼとルシフェリンリサイクリングタンパク質とをコードする構築物で細胞を形質転換し、ルシフェリンを該細胞内に導入し、該細胞からの生物発光シグナルをモニターすることを含んでなる、細胞内ATPおよび/または遺伝子発現の測定方法。
- 細胞内ATPレベルをモニターするために使用する、請求項1記載の方法。
- ルシフェラーゼの発現をモニターするために使用する、請求項1記載の方法。
- 該細胞をルシフェリンと接触させ、pHを5未満に減少させた後、該アッセイを開始し、ついで該細胞を生理的pH条件に戻す、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
- さらに、該細胞を、それがL−システインラセマーゼを発現するよう形質転換する、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
- 該細胞が、前記の第1のルシフェラーゼとは異なるKm値および異なる波長出力を有するもう1つのルシフェラーゼを発現しうる、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
- (i)ルシフェラーゼ酵素をコードする核酸配列と、(ii)ルシフェリンリサイクリングタンパク質をコードする核酸配列とを含んでなるDNA構築物。
- ルシフェラーゼとルシフェリンリサイクリングタンパク質とを含む融合タンパク質を発現するよう(i)の核酸配列と(ii)の核酸配列とが連結されている、請求項7記載のDNA構築物。
- (iii)もう1つのルシフェラーゼ酵素をコードする核酸配列と、(iv)L−システインラセマーゼ酵素をコードする核酸配列とから選ばれる1以上の追加的成分を更に含む、請求項7または請求項8記載のDNA構築物。
- 単一のベクターを含む、請求項7〜9のいずれか1項記載のDNA構築物。
- 細胞の共形質転換において使用しうる2以上のベクターを含む、請求項7〜9のいずれか1項記載のDNA構築物。
- 請求項7〜11のいずれか1項記載のDNA構築物で形質転換された細胞。
- 哺乳類細胞または植物細胞である、請求項12記載の細胞。
- 該ルシフェリンリサイクリングタンパク質が配列番号1、62もしくは63のタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片またはこれらのいずれかの変異体である、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法、請求項7〜11のいずれか1項記載のDNA構築物または請求項12〜13のいずれか1項記載の細胞。
- 該ルシフェリンリサイクリングタンパク質が、配列番号3、配列番号39、配列番号59もしくは配列番号61を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片もしくは変異体である、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法、請求項7〜11のいずれか1項記載のDNA構築物または請求項12〜13のいずれか1項記載の細胞。
- 該ルシフェリンリサイクリングタンパク質が、配列番号59を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片もしくは変異体である、請求項15記載の方法、DNA構築物または細胞。
- 発光虫種から入手可能なルシフェリンリサイクリングタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片またはそれに対して少なくとも60%の相同性を有するタンパク質。
- 該発光虫種がラムピリス・ノクチルカ(Lampyris noctiluca)である、請求項18記載のルシフェリンリサイクリングタンパク質。
- 配列番号3、配列番号39もしくは配列番号59またはルシフェリンリサイクリング断片またはこれらのいずれかの変異体を含む、請求項17または請求項18記載のルシフェリンリサイクリングタンパク質。
- 配列番号3もしくは配列番号39またはルシフェリンリサイクリング断片またはこれらのいずれかの変異体を含む、請求項17〜19のいずれか1項記載のタンパク質。
- 配列番号59またはルシフェリンリサイクリング断片またはこれらのいずれかの変異体を含む、請求項17〜19のいずれか1項記載のタンパク質。
- 配列番号59を含む、請求項21記載のタンパク質。
- 異なる種のルシフェラーゼリサイクリングタンパク質遺伝子において見出されるエキソンによりコードされる断片を含んでなるキメラルシフェラーゼリサイクリングタンパク質。
- 該エキソンの少なくとも1つが発光虫種の遺伝子に由来する、請求項23記載のキメラルシフェラーゼリサイクリングタンパク質。
- 該エキソンの少なくとも1つがホタル種の遺伝子に由来する、請求項23または請求項24記載のキメラルシフェラーゼリサイクリングタンパク質。
- ラムピリス・ノクチルカ(Lampyris noctiluca)ルシフェラーゼリサイクリング遺伝子のエキソン2、3、4および5によりコードされる断片に連結された、フォチヌス・ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼリサイクリング遺伝子のエキソン1によりコードされる断片を含む、請求項23〜25のいずれか1項記載のキメラルシフェラーゼリサイクリングタンパク質。
- ルシフェラーゼ酵素とルシフェラーゼリサイクリングタンパク質とを含んでなる融合タンパク質。
- 該ルシフェリンリサイクリングタンパク質が請求項17〜26のいずれか1項記載のタンパク質である、請求項18記載の融合タンパク質。
- 請求項17〜28のいずれか1項記載のタンパク質をコードする核酸。
- 配列番号4または配列番号31〜37のいずれか1つを含む、請求項29記載の核酸。
- 配列番号40またはその変異体を含む、請求項29記載の核酸。
- 配列番号58またはその変異体を含む、請求項29記載の核酸。
- cDNA配列である、請求項29記載の核酸。
- D−ルシフェリンのような光学活性酵素基質の製造方法であって、該基質の酸化形態(例えば、オキシルシフェリン)を、前記請求項のいずれか1項記載のリサイクリングタンパク質、および該変換を行うのに必要ないずれかの他のアミノ酸(例えば、システイン)と接触させることを含んでなる製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0127292A GB0127292D0 (en) | 2001-11-14 | 2001-11-14 | Signal system and elements used therein |
GB0205201A GB0205201D0 (en) | 2001-11-14 | 2002-03-06 | Signal system amd elements used therein |
PCT/GB2002/005120 WO2003042693A2 (en) | 2001-11-14 | 2002-11-13 | Method for measuring intracellular atp and/or gene expression |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005509426A true JP2005509426A (ja) | 2005-04-14 |
JP2005509426A5 JP2005509426A5 (ja) | 2006-01-05 |
Family
ID=26246765
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003544475A Pending JP2005509426A (ja) | 2001-11-14 | 2002-11-13 | 細胞内atpおよび/または遺伝子発現の測定方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050037355A1 (ja) |
EP (1) | EP1468284B1 (ja) |
JP (1) | JP2005509426A (ja) |
CN (1) | CN1304426C (ja) |
AU (1) | AU2002339151B2 (ja) |
CA (1) | CA2464942A1 (ja) |
WO (1) | WO2003042693A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015223107A (ja) * | 2014-05-27 | 2015-12-14 | オリンパス株式会社 | プロモーターアッセイ |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7663022B1 (en) | 2002-07-15 | 2010-02-16 | Bruce Eric Hudkins | Transgenic bioluminescent plants |
US7049483B1 (en) * | 2002-07-15 | 2006-05-23 | Bruce Eric Hudkins | Transgenic bioluminescent plants |
WO2011025980A1 (en) | 2009-08-29 | 2011-03-03 | Targeting Systems | Modified luciferases and uses thereof |
JP5995372B2 (ja) | 2011-03-15 | 2016-09-21 | オリンパス株式会社 | 星虫由来ルシフェラーゼ |
CN106018387A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-10-12 | 孙晓晖 | 一种atp荧光检测方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9301118D0 (en) * | 1993-01-21 | 1993-03-10 | Secr Defence | Enzyme linked assays |
DE69413491T2 (de) * | 1993-10-22 | 1999-03-11 | Toyoda Chuo Kenkyusho Kk | Verfahren zum Nachweis von Mutagenen unter Verwendung eines Lumineszensgens |
GB9417593D0 (en) * | 1994-09-01 | 1994-10-19 | Secr Defence | Luciferase labelling method |
JP4342608B2 (ja) * | 1995-01-20 | 2009-10-14 | スリーエム イノベイティブ プロパティーズ カンパニー | 突然変異体ルシフェラーゼ |
US5814504A (en) * | 1996-08-22 | 1998-09-29 | Kikkoman Corporation | Protein involved in regenerating firefly luciferin |
GB9707486D0 (en) * | 1997-04-11 | 1997-05-28 | Secr Defence | Enzyme assays |
JP2001103972A (ja) * | 1999-10-06 | 2001-04-17 | Kikkoman Corp | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、新規な組み換え体dna及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 |
WO2003074690A1 (fr) * | 2002-03-01 | 2003-09-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Racemase d'acide amine presentant une faible specificite de substrat et procede de fabrication d'acide amine racemique |
-
2002
- 2002-11-13 EP EP02777526A patent/EP1468284B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-13 US US10/495,715 patent/US20050037355A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-13 CN CNB028225031A patent/CN1304426C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-11-13 JP JP2003544475A patent/JP2005509426A/ja active Pending
- 2002-11-13 CA CA002464942A patent/CA2464942A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-13 WO PCT/GB2002/005120 patent/WO2003042693A2/en active IP Right Grant
- 2002-11-13 AU AU2002339151A patent/AU2002339151B2/en not_active Ceased
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015223107A (ja) * | 2014-05-27 | 2015-12-14 | オリンパス株式会社 | プロモーターアッセイ |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2002339151B2 (en) | 2008-06-19 |
CN1613011A (zh) | 2005-05-04 |
WO2003042693A2 (en) | 2003-05-22 |
EP1468284A2 (en) | 2004-10-20 |
WO2003042693A3 (en) | 2004-08-12 |
CN1304426C (zh) | 2007-03-14 |
CA2464942A1 (en) | 2003-05-22 |
EP1468284B1 (en) | 2008-08-06 |
US20050037355A1 (en) | 2005-02-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK2990478T3 (en) | SYNTHETIC OPLOPHORUS LUCIFERASES WITH IMPROVED LIGHT EMISSION | |
JPH06504903A (ja) | レニラ(renilla)ルシフェラーゼのクローニング及び発現 | |
AU772485C (en) | Novel enzyme | |
US20060078909A1 (en) | Novel sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase | |
JP2009148300A6 (ja) | 新規なスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質および熱安定性スルフリラーゼ | |
JP2007097577A (ja) | 変異型ホタルルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法 | |
JPH08510387A (ja) | 突然変異体ルシフェラーゼ | |
US20140186918A1 (en) | Luciferase mutant | |
JP2651651B2 (ja) | 蛍酵素ルシフェラーゼ遺伝子 | |
US7125697B2 (en) | Luciferase and photoprotein | |
JP6147669B2 (ja) | 改良光放射分子 | |
US6387675B1 (en) | Mutant luciferases | |
JP2005509426A (ja) | 細胞内atpおよび/または遺伝子発現の測定方法 | |
KR102018248B1 (ko) | 생물발광 강도가 증폭된 변이 가우시아 루시퍼라아제 | |
AU2002339151A1 (en) | Method for measuring intracellular ATP and/or gene expression | |
ZA200403508B (en) | Signal system and elements used therein | |
JP2008500824A (ja) | Pde5モジュレーターの同定方法 | |
JPWO2004022600A1 (ja) | 分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質 | |
WO2024000408A1 (zh) | 荧光素酶突变体及其应用 | |
US20230416708A1 (en) | Novel Variants of Endonuclease V and Uses Thereof | |
RU2210594C2 (ru) | Мутантная люцифераза (варианты), днк, кодирующая указанную люциферазу, и вектор для экспрессии указанного белка | |
GENE | Jiang et a].(45) Date of Patent:* May 28, 2013 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051107 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051107 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081007 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081219 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090105 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090609 |