JP2015223107A - プロモーターアッセイ - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、信頼性の高いプロモーターアッセイを提供することにある。【解決手段】実施形態に係るプロモーターアッセイは、細胞を用意する工程と、発光強度を経時的に測定する工程と、発光強度の変化率を算出する工程とを含む。細胞を用意する工程では、プロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し前記プロモーターによって発現が誘導されるルシフェラーゼ遺伝子とから成る組み合わせを２種以上有する細胞を用意する。ルシフェラーゼタンパク質のＡＴＰに対するＫｍ値の各々は、最も高いＫｍ値から２０％以内の範囲に含まれる。発光強度の変化率を算出する工程では、測定対象とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質の変化率と、基準とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質の変化率とのずれを算出する。【選択図】図４

Description

本発明は、プロモーターアッセイに関する。

遺伝子発現の活性を測定する方法の１つとして、プロモーターアッセイが存在する。プロモーターアッセイでは、測定対象とする遺伝子を、蛍光タンパク質の遺伝子や発光タンパク質の遺伝子といったレポーターとなる遺伝子に置き換え、蛍光または発光を検出することにより、測定対象とする遺伝子の発現の状態を測定する。プロモーターアッセイは、レポーターアッセイとも呼ばれる。

プロモーターアッセイにおいて、レポーターとなる遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子が使用される。特に、甲虫から取得されたルシフェラーゼ遺伝子は、高い発光強度が得られるため、多用される。甲虫由来のルシフェラーゼは、ルシフェリン、ＡＴＰおよび酸素を基質として、発光反応を触媒する。

甲虫由来のルシフェラーゼのように、基質としてＡＴＰを含む場合、環境中のＡＴＰ濃度の変動が、プロモーターアッセイに影響を与える可能性がある。例えば、低い発光強度が測定されたとしても、プロモーターの活性が低下したのではなく、ＡＴＰが不足したことにより発光反応の速度が低下し、その結果、発光強度が低下した可能性が残る。

ルシフェラーゼには、甲虫由来のルシフェラーゼの他に、海洋動物に由来するルシフェラーゼも存在する。このようなルシフェラーゼは、イミダゾピラジン骨格を有する化合物および酸素を基質とし、ＡＴＰを基質として含まない。そのため、このルシフェラーゼをプロモーターアッセイに使用すれば、ＡＴＰ濃度に影響を受ける可能性が生じない。しかしながら、このようなルシフェラーゼは、一般的に、発光の減衰が極めて速く、経時的な測定には不向きである。

先行文献１は、複数のルシフェラーゼを使用するプロモーターアッセイを開示している。この方法では、測定対象のルシフェラーゼによる発光強度を定量的に測定する目的で、別のルシフェラーゼを内部標準として使用している。

Yoshihiro Nakajima et al., "Multicolor luciferase assay system: one-step monitoring of multiple gene expressions with a single substrate", BioTechniques 38:891-894(June 2005)

本発明の目的は、信頼性の高いプロモーターアッセイを提供することにある。

実施形態に係るプロモーターアッセイは、細胞を用意する工程と、発光強度を経時的に測定する工程と、発光強度の変化率を算出する工程とを含む。細胞を用意する工程では、プロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し前記プロモーターによって発現が誘導されるルシフェラーゼ遺伝子とから成る組み合わせを２種以上有する細胞を用意する。前記プロモーターの少なくとも１種は測定対象とするプロモーターである。前記プロモーターの少なくとも１種は基準とするプロモーターである。前記ルシフェラーゼ遺伝子から生じるルシフェラーゼタンパク質に起因する発光の最大発光波長の各々は、互いに区別可能である。前記ルシフェラーゼタンパク質のＡＴＰに対するＫ_ｍ値の各々は、最も高いＫ_ｍ値から２０％以内の範囲に含まれる。発光強度を経時的に測定する工程では、前記発光の各々の発光強度を経時的に測定する。発光強度の変化率を算出する工程では、前記ルシフェラーゼタンパク質の各々について、任意の単位時間における発光強度の変化率を算出する。さらに、前記測定対象とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質の変化率と、前記基準とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質の変化率とのずれを算出する。前記ずれが所定の値以上である場合に、前記測定対象とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質により誘導される発光強度の変化を、前記測定対象とするプロモーターの活性の変化として採用する。

本発明のプロモーターアッセイによれば、レポーター遺伝子の発現の検出と同時に、ＡＴＰ濃度の影響の有無を調べることができ、より信頼性の高い結果を得ることができる。

図１は、ＡＴＰに対するＫ_ｍ値が異なる２つのルシフェラーゼの、ＡＴＰ濃度と発光強度との関係を示すグラフである。 図２は、Ｅｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃの発光スペクトルである。 図３は、Ｌｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼの発光スペクトルである。 図４は、ＮＦκＢ−ＥＬｕｃおよびＣＭＶ−ＳＰ１ルシフェラーゼを導入したＨｅＬａ細胞における、ＴＮＦ−α刺激後の発光強度の経時変化を示すグラフである。 図５は、ＮＦκＢ−ＥＬｕｃおよびＣＭＶ−ＳＰ１ルシフェラーゼを導入したＨｅＬａ細胞における、スタウロスポリン刺激後の発光強度の経時変化を示すグラフである。 図６は、ＮＦκＢ−ＥＬｕｃおよびＣＭＶ−ＳＰ１ルシフェラーゼを導入したＨｅＬａ細胞における、薬剤による刺激を与えない場合の発光強度の経時変化を示すグラフである。

本発明の実施形態の１つは、プロモーターアッセイである。

実施形態に係るプロモーターアッセイは、細胞を用意する工程、発光を測定する工程および測定結果を処理する工程を含む。

細胞を用意する工程では、プロモーターと、このプロモーターの下流に位置し、このプロモーターによって発現が誘導されるルシフェラーゼ遺伝子とから成る組み合わせを２種以上有する細胞が用意される。

実施形態に係るプロモーターアッセイにおいて、細胞は、一般的なプロモーターアッセイにおいて使用される細胞であってよい。例えば、細胞は、動物細胞、植物細胞等の培養細胞、または大腸菌および酵母といった微生物の細胞であってよい。

細胞は、プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子との組み合わせを、ゲノムに組み込んだ状態で含んでいてよく、または、そのような組み合わせを含むベクターを含んでいてよい。あるいは、細胞は、組み合わせの一部をゲノムに組み込んだ状態で含み、その他をベクターの状態で含んでいてよい。

プロモーターの少なくとも１種は、測定対象とするプロモーターである。測定対象とするプロモーターとは、本来、ある遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を制御するプロモーターを意味する。測定対象とするプロモーターは、アッセイの目的に応じて任意に選択される。

プロモーターの少なくとも１種は、基準とするプロモーターである。基準とするプロモーターとは、測定対象とするプロモーターの活性に対するＡＴＰ濃度の影響を検出する上で基準として利用されるプロモーターである。基準とするプロモーターは、測定対象のプロモーターとは独立に遺伝子発現を制御する。基準とするプロモーターは、恒常的に発現を誘導するプロモーターであってよく、あるいは、刺激に応じて発現を誘導するプロモーターであってよい。基準とするプロモーターの具体例は、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＭＶ ｅａｒｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｅｔａ ａｃｔｉｎ （ＣＡＧ）プロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーターおよびβ−ａｃｔｉｎプロモーターである。

プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子との組み合わせが３種以上細胞に含まれる場合、少なくとも１種のプロモーターは測定対象であり、少なくとも１種のプロモーターは基準であり、残るプロモーターは、測定対象であっても、基準であってもよい。残るプロモーターが測定対象である場合、そのプロモーターは、先の測定対象と同じものであってよく、または異なる測定対象であってよい。また、残るプロモーターが基準である場合、そのプロモーターは、先の基準と同じものであってよく、または異なる基準であってよい。

ルシフェラーゼ遺伝子は、一般的なプロモーターアッセイにおいて使用されるルシフェラーゼ遺伝子であってよい。ただし、実施形態に係るプロモーターアッセイにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子は、ＡＴＰ濃度の影響を受け得るものである。すなわち、ルシフェラーゼ遺伝子は、ＡＴＰを基質とする発光反応を触媒するルシフェラーゼの遺伝子であることが好ましい。ルシフェラーゼ遺伝子の例は、甲虫に由来するルシフェラーゼ遺伝子である。

ルシフェラーゼ遺伝子から生じるルシフェラーゼタンパク質は、発光の測定によって区別可能である。すなわち、ルシフェラーゼタンパク質に起因する発光の最大発光波長の各々は、互いに区別可能である。ルシフェラーゼタンパク質に起因する発光は、個々の発光強度を同時に測定することが可能である。発光を測定する際、特定の波長の光を選択的に透過させる光学フィルターを利用することが可能であり、この場合、利用する光学フィルターの種類に応じて、区別可能な最大発光波長の数値は変わる。好ましくは、ルシフェラーゼタンパク質に起因する発光の最大発光波長は、互いに少なくとも２０ｎｍ異なる。

実施形態に係るプロモーターアッセイでは、ＡＴＰに対する親和性が互いに近いルシフェラーゼタンパク質が使用される。例えば、ルシフェラーゼタンパク質のＡＴＰに対するミカエリス・メンテン定数（Ｋ_ｍ）の値の各々は、最も高いＫ_ｍ値から２０％以内の範囲に含まれ、好ましくは１０％以内の範囲に含まれ、最も好ましくは７％以内の範囲に含まれる。

以下の表１には、ルシフェラーゼタンパク質の例と、そのＡＴＰに対するＫ_ｍ値が示される。斜体の表記は、ルシフェラーゼタンパク質の由来となる生物の学名であり、正体の表記は、ルシフェラーゼタンパク質の一般的な名称または市販される名称である。それぞれのルシフェラーゼについて、Ｄ−ルシフェリンに対するＫ_ｍ値およびＡＴＰに対するＫ_ｍ値が示される。

表１中のルシフェラーゼから、ＡＴＰに対するＫ_ｍ値が近い物を組み合わせて使用できる。例えば、ＡＴＰに対するＫ_ｍ値が１９５μＭであるＬｕｃｉｏｌａ ｓｐ１と、１８２μＭであるＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃとを選択できる。

細胞を用意する工程に続き、発光を測定する工程が行われる。

発光を測定する工程では、発光の各々の発光強度が経時的に測定される。測定は、少なくとも２回行われる。好ましくは、一定の時間間隔で複数回測定される。ルシフェラーゼタンパク質の種類に応じて複数の発光が細胞から発せられるが、それらは同時にまたはほぼ同時に測定される。

また、測定は、一般的なプロモーターアッセイと同様に行うことができる。細胞は、発光が可能な環境におかれる。例えば、細胞を含む培地にルシフェリンが適量添加される。測定対象となる遺伝子の機能に応じて、細胞に対して適宜刺激を与えてもよい。発光は、ルミノメーターや発光顕微鏡により検出することができる。ルミノメーターや発光顕微鏡は、特定の波長の光を選択的に透過させる光学フィルターを備えていてもよい。

発光を測定する工程に続き、測定結果を処理する工程が行われる。

測定結果を処理する工程では、まず、ルシフェラーゼタンパク質ごとに、任意の単位時間における発光強度の変化率が算出される。この単位時間は、全てのルシフェラーゼタンパク質について同一の単位時間が選択される。例えば、０分の時点における発光強度、および３０分の時点における発光強度が選択され、３０分の時点における発光強度を０分における発光強度で割った値が変化率として算出される。変化率は、例えば、１以上の値として算出することができる。

その後、そのように算出した変化率のうち、測定対象とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質の変化率と、基準とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質の変化率とのずれが算出される。測定対象とするプロモーターが複数種存在する場合には、それぞれについて基準からのずれを算出することができる。また、基準とするプロモーターが複数種存在する場合には、それぞれについて測定対象からのずれを算出することができる。

ずれは、例えば、百分率により表すことができる。例えば、比較する２つの変化率の差をもとめ、その値を、２つの変化率の内の値の大きい方の変化率で割り、１００倍することで、変化率のずれが算出される。

変化率のずれの算出に続いて、ずれが所定の値以上であるか否かが判断される。ずれが所定の値以上である場合、測定対象とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質により誘導される発光強度の変化を、測定対象とするプロモーターの活性の変化として採用する。一方、ずれが所定の値未満である場合、測定対象とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質により誘導される発光強度の変化は、ＡＴＰ濃度の変動により生じた変化である可能性が高いとして、測定対象とするプロモーターの活性の変化としては採用しない。

所定の値は、プロモーターアッセイの条件に応じて、適宜設定可能である。より大きな値に設定するほど、測定結果の採用の条件は厳しくなり、より精度の高い結果が得られる。好ましくは、ずれの所定の値は５％である。

実施形態に係るプロモーターアッセイでは、上記のように、ＡＴＰ濃度の変動を調べる目的で基準とするプロモーターとその下流のルシフェラーゼ遺伝子の組み合わせが利用されるが、先行技術文献１のように、定量性を向上させるために複数のルシフェラーゼを利用するプロモーターアッセイと組み合わせてもよい。例えば、定量するための基準となるプロモーターとルシフェラーゼとの組み合わせを更に利用してもよい。あるいは、ＡＴＰ濃度の影響を調べるためのプロモーターとルシフェラーゼとの組み合わせを、定量するための組み合わせとして利用してもよい。

実施形態に係るプロモーターアッセイによれば、測定対象とする遺伝子の発現の検出と同時に、ＡＴＰ濃度の影響の有無を調べることができる。この理由は以下の通りである。

図１は、仮想的なルシフェラーゼである、ルシフェラーゼＡ、ルシフェラーゼＢおよびルシフェラーゼＣの、ＡＴＰ濃度と発光強度との関係を示すグラフである。横軸は基質であるＡＴＰの濃度を示し、縦軸は発光強度（すなわち反応速度）を示す。

ルシフェラーゼＡおよびルシフェラーゼＢでは、ＡＴＰ濃度が無限大であるときの反応速度（Ｖ_ｍａｘ）は同一であるものの、ＡＴＰに対するＫ_ｍ値は異なる。そのため、図１のような基質と反応速度との関係を示す曲線を描いた場合、基質濃度が上昇したときの反応速度の立ち上がり方が異なる。例えば、ＡＴＰ濃度がＳ_１からＳ_２に変化した場合、ルシフェラーゼＡでは速度の変化量はΔＶ_１（縦軸３目盛分）であるのに対し、ルシフェラーゼＢではΔＶ_２（縦軸２目盛分）である。

一方、ルシフェラーゼＡとルシフェラーゼＣとは、Ｖ_ｍａｘおよびＫ_ｍ値が近い値となっており、これらのルシフェラーゼの曲線は非常に近い軌道を描いている。そして、ＡＴＰ濃度の変化に対する速度の変化量ΔＶもほぼ同じとなっている。

また、Ｖ_ｍａｘが異なる場合であっても、Ｋ_ｍが同一または近い値であれば、ＡＴＰ濃度の変化に対する速度の「変化率」は、ほぼ同じとなる。このことは、ミカエリス・メンテン式から明らかである。

ルシフェラーゼのような酵素において、基質と反応速度との関係は、以下の式１に示されるミカエリス・メンテン式に従う。式中、「ｖ」は反応速度であり、図１では縦軸に対応し、「［Ｓ］」はＡＴＰ濃度であり、図１では横軸に対応する。

あるルシフェラーゼについて、ＡＴＰ濃度がＳ_１からＳ_２に変化したときの、反応速度の変化率（ｖ_２／ｖ_１）は以下の式２のように計算される。

式２に示されるように、変化率（ｖ_２／ｖ_１）は、Ｖ_ｍａｘに依存せず、Ｓ_１、Ｓ_２およびＫ_ｍの値によって定まる。

したがって、Ｋ_ｍが同一である２つのルシフェラーゼでは、ＡＴＰ濃度がＳ_１からＳ_２に変化したときの、反応速度の変化率（ｖ_２／ｖ_１）は、同一の値となる。また、Ｋ_ｍが同一でなくとも、近い値であれば、それに応じて変化率も近い値となる。

以上のように、同一の環境において、Ｋ_ｍ値が近い２種以上のルシフェラーゼに発光反応を触媒させた場合、基質であるＡＴＰ濃度が変動すると、それによって生じる発光強度（反応速度）の変化率はほぼ一致する。逆に、Ｋ_ｍ値が近い２種以上のルシフェラーゼに由来する発光の単位時間当たりの変化率がほぼ一致する場合、その発光の変化はＡＴＰ濃度の変動に起因する可能性があると推定することができる。

実施形態に係るプロモーターアッセイでは、以上のような原理を利用して、発光強度の変化が、真に測定対象とするプロモーターの活性の変化を表したものであるのか、ＡＴＰ濃度の変化を表したものであるのかを判定することができる。

従来のプロモーターアッセイでは、一般的に、レポーターとして、ＡＴＰを基質として使用するルシフェラーゼが使用されるが、このようなアッセイでは、ＡＴＰ濃度の変動による影響の可能性を排除できない。また、海洋性生物由来のルシフェラーゼのように、ＡＴＰを基質として使用しないルシフェラーゼを使用すれば、ＡＴＰの影響を排除することは可能であるが、海洋性生物由来のルシフェラーゼは、発光の減衰が極めて速く、経時的な測定が困難であり、レポーターとして役割を十分に果たせない。

これに対し、実施形態に係るプロモーターアッセイでは、レポーター遺伝子の発現の検出と同時に、ＡＴＰ濃度の影響の有無を調べることができる。このため、得られた結果に対して、ＡＴＰ濃度の影響を受けているか否かを判定することが可能となり、より信頼性の高い結果を得ることができる。

Ｋ_ｍ値の近い２種のルシフェラーゼを使用することで、ＡＴＰ濃度の変動を調べることが可能なプロモーターアッセイを行うことができることを、以下の通り実証した。

＜２種のルシフェラーゼの準備＞
まず、Ｌｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼおよびＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃ（東洋紡株式会社製）の２種のルシフェラーゼについて、タンパク質の精製および速度論的解析を行った。

なお、Ｌｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）および塩基配列（配列番号２）は、それぞれ以下の通りである。
アミノ酸配列：
MNNMDDGEHIVVGPQPFYPVEEGSAGTQLLKYLKQYSKLGAIAFSNAHTKVDISYAEYLDTSVRLAQALINYGIPIDGRIALCSENCEEFYFPVLAGLYIGAGVAPTNEIYTLRELVHSLGISKPTIVFSSKKGLEKVITVQKTVTCIKTIVILDSKVDYQGYDCLETFIKKYLPAGFSVENFIPREVNRKEQVALVMNSSGSTGLPKGVQITHEGAVTRFSHARDPIYGNQVSPGTAILTIVPFHHGFGMFTNLGYLTCGYRIVMLTKFDEELFLKTLADYKCTSVILVPTLFAILSKSVLLEKYDLSNLVEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGIRQGYGLTETTSAIIITPEGDDKPGASGKIVPLFRAKVVDLDTQKTLGPNRRGEICVKGPMLMKGYVDDPVATSQIIDKDGWLHTGDIGYFDEDKHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPDIFDAGVAGLPDPLAGELPGAVVVLEKGRHMTEQQVMDYVAGQVSNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDSKAIREILKSPKAKM*（配列番号１）。
塩基配列：
ATGAATAATATGGATGACGGTGAACACATCGTGGTTGGGCCTCAACCATTTTACCCGGTTGAAGAAGGGTCCGCTGGCACGCAGCTGCTCAAGTACCTGAAGCAATATTCCAAACTTGGAGCGATTGCCTTTTCCAATGCTCATACTAAGGTGGACATCAGCTATGCAGAGTACTTGGACACCAGCGTTCGGTTGGCTCAGGCCCTGATCAACTACGGAATCCCTATTGATGGGCGGATAGCCCTGTGCTCAGAGAACTGTGAGGAGTTTTATTTTCCAGTCCTCGCTGGATTGTACATTGGTGCTGGGGTGGCTCCAACTAACGAAATCTACACACTCAGGGAGCTGGTGCACTCTCTGGGGATAAGTAAACCCACTATTGTGTTCTCCTCCAAAAAGGGACTGGAGAAGGTTATCACCGTTCAAAAGACAGTGACCTGCATCAAAACCATCGTGATCCTCGATAGCAAGGTCGATTATCAAGGTTACGACTGCTTGGAAACCTTTATAAAAAAATACCTGCCTGCCGGATTCAGCGTGGAGAACTTTATTCCGAGAGAGGTAAACAGGAAAGAACAGGTCGCACTGGTCATGAACAGCTCAGGTAGCACTGGGCTGCCGAAAGGCGTCCAAATTACTCATGAGGGCGCGGTCACGAGATTCTCACATGCTCGCGATCCTATCTATGGCAACCAGGTTTCACCAGGCACCGCTATTCTGACAATTGTCCCATTCCATCACGGCTTTGGGATGTTTACCAACCTGGGCTATCTGACCTGCGGATACCGCATCGTCATGTTGACAAAGTTCGATGAAGAACTGTTTCTCAAAACGCTGGCCGATTATAAGTGTACTTCTGTGATCCTGGTGCCAACCCTGTTTGCCATTCTTAGCAAATCCGTGTTGCTGGAGAAGTATGACCTTTCCAACCTTGTTGAAATCGCCAGCGGTGGGGCCCCTCTGGCCAAGGAAGTTGGCGAGGCCGTGGCACGAAGGTTTAACCTGCCAGGGATTCGCCAGGGGTATGGGCTGACCGAAACAACAAGTGCCATAATCATTACTCCCGAAGGGGACGATAAACCCGGAGCCTCAGGAAAGATCGTGCCTCTGTTCAGAGCGAAGGTGGTTGATCTGGACACTCAGAAGACTCTTGGACCTAATAGAAGGGGCGAGATCTGCGTGAAAGGACCCATGTTGATGAAGGGCTATGTCGATGATCCAGTCGCCACAAGTCAAATTATCGACAAGGACGGCTGGCTGCATACAGGGGATATAGGATATTTCGATGAGGATAAGCACTTCTTCATCGTCGACCGACTCAAGTCCCTGATTAAATACAAGGGATACCAGGTCCCACCTGCGGAACTCGAAAGCGTCCTCCTCCAGCATCCGGACATCTTTGATGCAGGTGTGGCCGGGCTTCCAGATCCATTGGCAGGCGAACTCCCAGGTGCCGTCGTTGTTTTGGAGAAAGGCCGACACATGACCGAACAGCAGGTCATGGACTACGTCGCAGGTCAAGTCAGCAATGCGAAGAGGCTTCGAGGCGGCGTGAGATTCGTGGATGAGGTGCCGAAGGGACTGACCGGCAAGATCGACAGTAAGGCCATACGCGAAATCCTGAAAAGCCCAAAAGCCAAGATGTAG（配列番号２）。

また、Ｅｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃのアミノ酸配列（配列番号３）および塩基配列（配列番号４）は、それぞれ以下の通りである。
アミノ酸配列：
MEREKNVVYGPEPKHPLGNFTAGEMLYNALHKHSHIPQAILDVMGNESLSYQEFFDTTVKLGQSLQNCGYKMNDVVSICAENNKRFFIPIISAWYIGMVVAPVNEDYIPDELCKVTGISKPILVFTTRKILPKVLEVKDRTNYIKRIIILDSEENLLGCESLHNFMSRYSDNNLQTFKPLHYDPVDQVAAILCSSGTTGLPKGVMQTHRNICVRLTHASDPRVGTQLIPGVSVLAYLPFFHAFGFSINLGYFMVGLRVVMLRRFNQEVFLKAIQDYEVRSVINVPSTILFLSKSPLVDKYDLSTLAELCCGAAPLAKEVAEIAVKRLNLPGIRCGYGLTESTSANIHTLHNEFKSGSLGKVTPYMAAKIIDRNTGEALGPNQVGELCIWGPMVTKGYVNNPQATKEAIDDDGWLHSGDFGYYDEDEYFYIVDRYKELIKYKGYQVAPVELEEILLQHPGIRDVAVVGIPDIEAGELPAGFVVKQPGAQLTAKEVYDFLAQRVSHSKYLRGGVRFVDSIPRNVTGKISRKELREALMEKASKL*（配列番号３）。
塩基配列：
ATGGAGAGAGAGAAGAACGTGGTGTACGGCCCCGAGCCCAAGCACCCTCTGGGCAACTTCACCGCCGGCGAGATGCTGTACAACGCTCTGCACAAGCACTCCCACATCCCCCAGGCCATCCTGGACGTGATGGGCAACGAGTCCCTTTCCTACCAGGAGTTCTTCGACACTACTGTGAAGCTGGGCCAGAGCCTCCAGAACTGTGGCTACAAGATGAACGATGTCGTGTCGATCTGTGCAGAGAACAACAAGAGATTCTTCATCCCCATCATCTCCGCCTGGTACATCGGCATGGTGGTGGCCCCTGTGAACGAGGACTATATCCCAGACGAGCTGTGTAAAGTGACCGGCATCTCCAAGCCGATCCTGGTCTTCACCACTAGGAAGATCCTGCCTAAGGTTTTGGAGGTTAAAGACAGAACCAACTACATAAAGAGGATCATCATACTGGACTCTGAAGAGAACCTGCTGGGCTGCGAGAGCCTGCACAACTTCATGTCCAGGTACTCCGACAACAACCTCCAAACATTCAAGCCTCTGCACTACGACCCTGTGGACCAGGTAGCCGCCATCCTGTGCTCCTCCGGCACAACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCAGACCCACAGGAACATCTGTGTGAGACTCACACACGCATCTGACCCCAGAGTGGGTACACAACTCATCCCCGGCGTATCCGTGCTGGCCTACCTGCCATTCTTCCACGCCTTCGGCTTCAGTATCAACCTGGGCTATTTCATGGTGGGCCTGAGAGTGGTGATGCTCCGAAGGTTTAACCAGGAGGTGTTCCTGAAGGCCATCCAGGACTACGAGGTGAGGAGCGTGATCAACGTTCCCTCCACAATCCTGTTCCTGTCCAAGAGCCCTCTGGTGGACAAGTACGACCTATCCACCCTGGCGGAGCTGTGCTGTGGAGCCGCTCCTCTGGCGAAGGAGGTGGCCGAGATCGCCGTGAAGAGGCTGAACCTGCCAGGGATACGGTGTGGCTACGGTCTAACAGAGTCTACCTCCGCCAACATCCATACTCTGCACAACGAGTTCAAGTCCGGCTCCCTGGGCAAGGTGACACCTTACATGGCCGCCAAGATCATCGACAGGAACACCGGCGAGGCCCTGGGTCCAAACCAGGTGGGCGAGCTGTGCATCTGGGGACCTATGGTAACAAAAGGCTATGTGAACAACCCACAGGCTACTAAGGAGGCCATCGACGACGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACTTCGGCTACTACGACGAGGACGAGTATTTCTACATCGTGGACCGGTACAAGGAGCTGATCAAATACAAGGGCTATCAGGTCGCCCCTGTGGAGCTGGAGGAGATCCTCCTTCAGCACCCAGGCATCAGGGACGTGGCCGTCGTGGGTATCCCTGACATCGAGGCCGGCGAGCTGCCAGCCGGCTTCGTGGTGAAGCAGCCCGGCGCCCAACTCACCGCTAAGGAGGTGTACGACTTCCTGGCCCAGAGGGTGTCTCACTCCAAGTACCTGAGGGGCGGCGTAAGGTTCGTGGACTCTATCCCCAGGAACGTGACAGGCAAGATTAGTCGAAAAGAGCTGAGGGAGGCCCTGATGGAGAAGGCTTCTAAGCTGTAA（配列番号４）。

［タンパク質の精製］
ＪＭ１０９（ＤＥ３）を含む大腸菌溶液５０μｌに対して、Ｌｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼ用発現ベクターおよびＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃ用発現ベクターをそれぞれ０．５μｌずつ添加した後、氷上で１０分、その後４２℃で１分、最後に氷上で２分ずつインキュベートした。その後、その大腸菌溶液５０μｌをＳＯＣ培地２００μｌに加えた。その大腸菌／ＳＯＣ培地混合溶液を３７℃で２０分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル１００μｌをＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含む）にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、５００ｍｌスケールのＬＢ培地で培養した。培養は３７℃で２４時間、１８℃で２４時間行った。

合計４８時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）し、沈査を除去して上清を回収した。

ベッドボリューム２ｍｌのカラムにＮｉ−Ａｇａｒ懸濁液５００μｌと０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ｍｌを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て４℃の条件で行った。２５ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液２ｍｌでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに５００ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２ｍｌ加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ６（ザルトリウス）で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、５０％グリセリン溶液とした。保存は−２０℃で行った。

［発光スペクトルの測定］
測定のための装置としてＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）を用い、０．１Ｍクエン酸／０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に１ｍＭ Ｄ−ルシフェリン、２ｍＭ ＡＴＰおよび４ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む溶液に、精製で得られたＬｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼおよびＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃを１μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、酵素添加後１５秒経過時点で発光スペクトルを測定した。Ｅｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃの発光スペクトルについては図１に、Ｌｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼの発光スペクトルについては図２に示す。測定の結果、Ｅｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃの発光極大波長は５４５ｎｍであり、Ｌｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼの発光極大波長は５８６ｎｍであることがわかった。

［速度論的解析］
・Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰの濃度の決定
上記２種のルシフェラーゼの速度論的解析に先立ち、使用するＤ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液における、Ｄ−ルシフェリン濃度およびＡＴＰ濃度をそれぞれ以下の通りに決定した。

ＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて、Ｄ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定し、この測定結果と以下のε値とから濃度を算出した。
Ｄ−ルシフェリン：λ_ｍａｘ ３２８ｎｍ、ε１８２００、ｐＨ５．０
ＡＴＰ：λ_ｍａｘ ２５９ｎｍ、ε１５４００、ｐＨ７．０。

測定はそれぞれ１０回ずつ行い、吸光度の平均値を濃度算出に用いた。このように濃度を決定したＤ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液を用いて、以下のＫｍ値算出を行った。

・ＡＴＰに対するＫｍ値の測定
様々なＡＴＰ濃度の環境下において、２種のルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ＡＴＰに対する各ルシフェラーゼのＫｍ値を決定した。

ＡＴＰを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、それぞれ５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、４８０、６４０、８００、１２８０、１６００および１９２０μＭの濃度でＡＴＰを含む、１２種類のＡＴＰ溶液を作製した。これらのＡＴＰ溶液をそれぞれ９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、１ｍＭ Ｄ−ルシフェリンおよび８ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）の標準ポンプに接続し、この溶液をウェルに５０μｌずつ添加すると同時にフォトンカウント測定を行った。測定は室温で行い、各ＡＴＰ濃度について３回ずつ実施した。得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ＡＴＰ濃度Ｓに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。

このようにして決定されたＬｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼおよびＥｍｅｒａｌｄ ＬｕｃのＡＴＰに対するＫｍ値を以下の表２に示す。

表２に示されるように、Ｌｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼおよびＥｍｅｒａｌｄ ＬｕｃのＡＴＰに対するＫｍ値の差は１３μＭであり、非常に近い値を持っていると言える。

次にＡＴＰに対するＫｍ値が近しいこれら２種類のルシフェラーゼを用いて、ＨｅＬａ細胞における薬剤刺激後の発光強度変化を経時的に測定した。

＜ＨｅＬａ細胞への薬剤刺激後の発光強度変化の計測＞
コドンを哺乳細胞用に最適化したＬｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイト間に挿入し、ＣＭＶプロモーターの制御下でＬｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラスミド（ＣＭＶ：：Ｌｕｃｉ５ベクター）を作製した。

さらに、ＮＦκＢ結合配列の下流にＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃ遺伝子を結合し、ＮＦκＢの活性化に伴いＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃ遺伝子が発現するＮＦκＢレポータープラスミド（ＮＦｋＢ：：Ｅｌｕｃベクター）を作製した。

これらのプラスミドを、３５ｍｍプラスチックディッシュに播種したＨｅＬａ細胞にリポフェクション法で遺伝子導入し、ＮＦｋＢ：：ＥｌｕｃベクターおよびＣＭＶ：：Ｌｕｃｉ５ベクターの両方を含むＨｅＬａ細胞を作製した。

２４時間後、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を、１０％ＦＢＳを含むＣＯ２ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換した。測定直前にＤ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを最終濃度１ｍＭで添加した。さらに、細胞を３つに分け、それぞれを以下の条件においた。
サンプル１：１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを添加した。
サンプル２：４μＭのスタウロスポリンを添加した。
サンプル３：薬剤を添加しなかった。

ＴＮＦ−αはＮＦκＢを活性化させることが知られている。また、スタウロスポリンはＨｅＬａ細胞にアポトーシスを誘導し、ＨｅＬａ細胞内のＡＴＰ量を約３０分で上昇させることが知られている（参考文献Zamaraeva MV, et al. Cell Death and Differentiation 2005;12: 1390-97）。

これらの薬剤を添加した後、培養細胞用ルミノメーターＫｒｏｎｏｓ（ＡＴＴＯ）を用いて発光強度を経時的に測定した。上記の通り、Ｅｍｅｒａｌｄ ＬｕｃおよびＬｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼのそれぞれの発光極大波長は５４５ｎｍおよび５８６ｎｍであるため、Ｆ０（フィルターなし）、Ｆ１（５６０ｎｍロングパスフィルター）およびＦ２（６１０ｎｍロングパスフィルター）のフィルターをそれぞれ用いた３種類の測定を各サンプルについて経時的に実施した。発光色の各成分の分離は機器の取り扱い説明書に記載の方法で実施した。

測定結果を図４から６に示す。

図４は、サンプル１の結果、すなわちＴＮＦ−α刺激後の発光強度の経時変化を示すグラフである。図４に示されるように、ＴＮＦ−α刺激後、Ｅｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃの発光強度が大きく上昇したのに対して、Ｌｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼの発光強度はほぼ一定のまま上昇しないことがわかる。

図４において、３０分経過時点におけるＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃの発光強度の変化率を算出すると、６７９５３２１（３０分経過時点の発光強度）／５４２４６８２（０時間における発光強度）＝１．２５倍であった。また、３０分経過時点におけるＬｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼの発光強度の変化率を算出すると、３２０２３７７（３０分経過時点の発光強度）／３１８１４８５（０時間における発光強度）＝１．０１倍であった。変化率のずれは、１．２５−１．０１＝０．２４ポイントとなり、変化率の値の大きい１．２５倍を基準とすると、０．２４／１．２５×１００＝１９．２％のずれとなった。

図５は、サンプル２の結果、すなわちスタウロスポリン刺激後の発光強度の経時変化を示すグラフである。図５に示されるように、スタウロスポリン刺激後、Ｌｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼの発光強度が上昇し、Ｅｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃでは、全体的な発光強度は低いものの、同じタイミングで上昇したことがわかる。

図５において、３０分経過時点におけるＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃの発光強度の変化率を算出すると、３５１４０（３０分経過時点の発光強度）／１５５３７（０時間における発光強度）＝２．２６倍であった。また、３０分経過時点におけるＬｕｃｉｏｌａ ＳＰ１ルシフェラーゼの発光強度の変化率を算出すると、４９１６３７（３０分経過時点の発光強度）／２２２２９８（０時間における発光強度）＝２．２１倍であった。変化率のずれは、２．２６−２．２１＝０．０５ポイントとなり、変化率の値の大きい２．２６倍を基準とすると、０．０５／２．２６×１００＝２．２１％のずれとなった。

図６は、サンプル３の結果、すなわち薬剤による刺激を与えない場合の発光強度の経時変化を示すグラフである。刺激がない場合、２種のルシフェラーゼの発光強度の変動に、関連性が見られないことがわかる。

上記の通り、スタウロスポリンによってアポトーシスが誘導された場合、ＨｅＬａ細胞内のＡＴＰ量は約３０分で上昇することが知られており、サンプル２において、２種のルシフェラーゼの発光強度の変化率がほぼ等しくなったのは、Ｋ_ｍ値のほぼ等しいこれらのルシフェラーゼがＨｅＬａ細胞内のＡＴＰ量の上昇に応じて、その発光強度を増大させたためだと考えられる。サンプル２の結果は、細胞内のＡＴＰ量の上昇を正確に反映していることがわかる。

一方、サンプル１において、発光強度の変化率のずれが大きくなったことから、サンプル２のような細胞内ＡＴＰ量の増大があったとは予想されず、ＮＦκＢのプロモーターの活性の増大により、発光強度が増大したと結論できる。サンプル１の結果は、ＴＮＦ−α刺激によるＮＦκＢのプロモーターの活性化を正確に反映していることがわかる。

以上より、ＡＴＰに対するＫ_ｍ値の等しい２種類のルシフェラーゼを使用して、その発光強度の変化率を測定することによって、プロモーター活性の変動による発光強度の変化とＡＴＰ濃度の変動による発光強度の変化とを区別することが可能であることが実証された。

Claims (5)

1. プロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し前記プロモーターによって発現が誘導されるルシフェラーゼ遺伝子とから成る組み合わせを２種以上有する細胞を用意する工程であって、前記プロモーターの少なくとも１種は測定対象とするプロモーターであり、前記プロモーターの少なくとも１種は基準とするプロモーターであり、前記ルシフェラーゼ遺伝子から生じるルシフェラーゼタンパク質に起因する発光の最大発光波長の各々は、互いに区別可能であり、前記ルシフェラーゼタンパク質のＡＴＰに対するＫ_ｍ値の各々は、最も高いＫ_ｍ値から２０％以内の範囲に含まれる工程と、
   前記発光の各々の発光強度を経時的に測定する工程と、
   前記ルシフェラーゼタンパク質の各々について、任意の単位時間における発光強度の変化率を算出し、さらに、前記測定対象とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質の変化率と、前記基準とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質の変化率とのずれを算出し、前記ずれが所定の値以上である場合に、前記測定対象とするプロモーターに対応するルシフェラーゼタンパク質により誘導される発光強度の変化を、前記測定対象とするプロモーターの活性の変化として採用する工程と
   を含むプロモーターアッセイ。
2. 前記ルシフェラーゼタンパク質のＡＴＰに対するＫ_ｍ値の各々は、最も高いＫ_ｍ値から１０％以内の範囲に含まれる請求項１に記載のプロモーターアッセイ。
3. 前記ルシフェラーゼタンパク質のＡＴＰに対するＫ_ｍ値の各々は、最も高いＫ_ｍ値から７％以内の範囲に含まれる請求項１に記載のプロモーターアッセイ。
4. 前記発光の最大発光波長の各々は、互いに少なくとも２０ｎｍ異なる請求項１から３の何れか１項に記載のプロモーターアッセイ。
5. 前記ずれの所定の値は５％である請求項１から３の何れか１項に記載のプロモーターアッセイ。

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