JPH06504903A - レニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼのクローニング及び発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レニラ（ｒｅｎｉ　１　１ａ）ルシフェラーゼのクローニング及び発現本発明は 遺伝子工学の分野に関し、特に遺伝子工学を含む方法によるタンパク質の発現に 関する。

ウミスミレとしても知られるレニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）は花虫類として知られる 腔腸動物の綱に属する。レニラの他に花虫類の綱の代表的な生物発光属にはカバ ルヌラリア（Ｃａｖａｒｎｕ１　ａｒｉａ）　ＳプチロサルクＸ　（Ｐｔ　ｉ　 Ｉｏｓａｒｃｕｓ）　、スチラツラ（Ｓｔｙｌａｔｕｌａ）、アカントプチルム （Ａｃａｎｔｈｏ　ｔ　ｉ　ｌｕｍ）及びバラゾアンスス（Ｐａｒａｚｏａｎｔ ｈｕｓ）が含まれる。これらの生物はすべて生物発光性であり、適した生物学的 条件下で基質（ルシフエリン）への酵素（ルシフエラーゼ）の作用の結果として 発光する。以前の研究により上記の花虫類のすべてが類似のルシフエラーゼ及び ルシフエリンを含んでいることが示された。例えばＣｏｒｍｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ ．．ＪエＣｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．　（１９７３）旦１　：　２９１−２９８ を参照せよ。これらの花虫類のそれぞれからのルシフェラーゼ及びルシフエリン は互いに交差反応し、レニラ抽出物中に観察される特徴的な青いルミネセンスを 与える。これらのルシフエラーゼのそれぞれは類似の生物化学的性質を有し、生 物発光するための生物化学的条件はルシフエラーゼがどの花虫類から誘導された かにかかわらず同一である。

分析検定で用いられる放射活性標識をルミネセント標識などの他の種類と置き換 えることに近年かなりの興味が持たれている。かなり異なる構造の分子であり、 レニラ一様ルシフェリンと反応しないホタルルシフェラーゼはそのような標識と して用いるために提案された分子の１つである。しかしホタルルシフェラーゼは 多くの欠点を有し、そのためにこの分子は生物検定において最適以下のものとな っている。例えばＡＴＰがホタルルシフェラーゼ系のトリガーとして作用し、Ａ ＴＰの偏在性がこの変化の制御を困難にしている。

本発明者の１人による先行特許出願である１９８７年６月５日出願の米国特許出 願番号第０５９．１３７号は生物発光標識として腔腸動物−誘導ルシフェラーゼ 及び発光タンパク質の利用につき記載している。同発明者による他の出願、例え ば１９８８年３月１７日出願の米国特許出願番号第１７３，０４５号、及び１９ ８８年２月２９日出願の第１６５゜４２２号は、発光タンパク質アポエクオリン を発現することができる組み替えＤＮＡにつき記載している。

発光タンパク質エクオリン（腔腸動物ルシフェリン分子に結合したアポエクオリ ンを含む）及びレニラルシフエラーゼは両方とも同一の腔腸動物ルシフェリンを 利用し、両方の場合の発光の化学が同一であることが示された。しかしエクオリ ンのルミネセンスはカルシウムによりトリガーされ、溶解酸素を必要とせず、単 一回転現象（ａ　ｓｉｎｇｌｅｔｕｒｎｏｖｅｒ　ｅｖｅｎｔ）を示す。対照的 にレニラルシフエラーゼはカルシウムによりトリガーされず、腔腸動物ルシフェ リンの存在下で発光するために溶解酸素を必要とする。レニラルシフエラーゼは 真の酵素としても作用し、飽和量のルシフェリンの存在下で長期継続的ルミネセ ンスを触媒する。

そのルミネセンスは単一回転現象を示すが、光度計を用いてサブ−アットモル量 のエクオリンを検出することができる。レニラルシフェラーゼはその酵素的能力 の故にエクオリンより１−２桁低い量で検出可能なはずである。さらにレニラル シフェラーゼは熱に対して比較的安定であることが知られており、これは生理学 的温度におけるインキュベーションが含まれることが多い検定のために重要な考 慮である。従ってレニラルシフェラーゼは生物及び他の検定のための非常に有用 な標識である。

他方、レニラは海底の約３０−１００フイートの深さに住み、底ざらえ（ｄｒｅ ｇｇｉｎｇ）により集めなければならない。約１２．０００分の１までのタンパ ク質の精製を必要とする冗長な方法の後で１ｋｇのレニラ（約１０００体）から 約１ｍｇの純粋なレニラルシフェラーゼが検出可能な標識としてのレニラルシフ ェラーゼは開発されなかった。

従ってこの分子が生物発光検定において商業的に用いられるようになる前に、純 粋なレニラルシフエラーゼの製造の改良法が必要である。

図面の簡単な説明 以下の詳細な説明及び実施例、ならびに本明細書の一部を形成する添付図面を参 照することにより、本発明がさらに理解されるであろう。図面中： 図１はレニラレニホルミス（ｒｅｎｔ　１１ａ　ｒｅｎｔ　ｆｏｒｍｉｓ）ルシ フェラーゼｃＤＮＡ配列を含むクローンのヌクレオチド配列である。

図２は図１で示したレニラルシフェラーゼｃＤＮＡの読み枠から誘導されたアミ ノ酸配列である。

図３は組み替えルシフェラーゼアミノ酸配列であり、異なる種類の下線をひいて 本来のルシフェラーゼをＶ−８プロテアーゼで消化することにより得たペプチド の位置を示しである。

図４はＶ−８プロテアーゼ消化により得たレニラレニホルミスペプチドのアミノ 酸配列を示す表である。オリゴヌクレオチドプローブの調製のために選ばれた低 線重度の領域を四角で示す。プローブは図の下部に示す。

図５はレニラルシフエラーゼｃＤＮＡに関する制限酵素地図の略図である。図５ の下部はレニラルシフェラーゼｃＤＮＡの配列決定法の略図である。

図６はレニラルシフェラーゼ発現プラスミドの地図である。

図７はプラスミドｐＴＺＲＬｕｃ−１の調節領域の略図である。

図８は組み替えルシフェラーゼの精製に用いられる精製案の略図である。

発明の概略 本発明はレニラルシフェラーゼをコードする遺伝物質を提供する。遺伝物質は、 生物発光検定における発光タグとして用いるため、及びそのような標識が望まれ ている他の目的のための酵素の製造に用いることができる。さらに遺伝物質は、 関連生物からの他のルシフェラーゼ遺伝子の同定のための核酸ハイブリッド形成 分析で用いることができるプローブの供給源として用いることができる。酵素の フラグメントは、関連生物からのルシフェラーゼ遺伝子の同定を目的とする抗体 の製造に用いることができる。特定の遺伝物質及びルシフェラーゼタンパク質を 以下の詳細な説明及び実施例にて開示する。

特定の具体化の説明 本発明は、以前に限られた量でしか入手できなかった腔腸動物レニラからのルシ フェラーゼをコードする遺伝物質を初めて同定し、得た。ルシフェラーゼは生物 発光標識として多くの用途を持ち、レニラルシフェラーゼはそれを標識として特 に有用なものとする多くの性質を有するので、純粋な形態の酵素をかなりの量で 入手できることは以前の供給源に優る有意な商業的利点を与える。レニラ遺伝物 質は、関連生物におけるルシフェラーゼ遺伝子の位置決定を可能にするハイブリ ッド形成法で用いる核酸プローブの供給源となる。レニラレニホルミスルシフェ ラーゼ遺伝子を含むクローンのためのｃＤＮＡ配列を図１に示し、翻訳されたｃ ＤＮＡアミノ酸配列を図２に示す。図１においてクローンのコード配列はヌクレ オチド１０から始まり、ヌクレオチド９４４の停止コドンまで続く。図３は発現 系により製造される完全組み替えレニラルシフエラーゼアミノ酸配列を示す。

本発明は明確に、図１（読み枠は図１の位置１から始まる）及び表１（下記）に 挙げられている可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することにより作 られるポリヌクレオチドのそれぞれの、及びすべての可能な変型を含み、そのよ うな変型はすべて明確に開示され、図１の配列と同等であると考える。コドンは 酵素を生産する宿主細胞に合うように選択するのが好ましい。異種宿主における タンパク質の発現を最大にするコドンの選択は、既知の方法である。

そのようなペプチドをコードする他のＤＮＡ分子は、表１のコドンの表から容易 に決定することができ、同様に図１のＤＮＡ配列と同等であるものとする。実際 に、ＤＮＡコドンとペプチド中のアミノ酸の間の関係は確定しているので、ペプ チドにおける置換又は他の変更に関する本出願中のいずれの議論も対応するＤＮ Ａ配列又はＤＮＡ分子、組み替えベクター、あるいは配列が置かれた形質転換微 生物にも同様に適用される（逆も同様である）。

表１ 遺伝コード ７−ｙ−ン（ＡｌａＳＡ）　ＣＧＡＳＧＣＣ，ＧＣＧＳＧＣＴアルギニン（Ａｒ ｇ、Ｒ）　ＡＧＡｌＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ，ＣＧＧＳＣＧＴアスパラギン（Ａ ｓｎ、Ｎ）　ＡＡＣ，ＡＡＴアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）　ＧＡＣ，ＧＡＴシ スティン（Ｃｙｓ、Ｃ）　ＴＧＣＳＴＧＴグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）　ＣＡＡ、 ＣＡＧグルタミン酸（Ｇ１　ｕＳＥ）　ＧＡＡ、ＧＡＧグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ） 　ＧＧＡ、ＧＧＣＳＧＧＧＳＧＧＴヒスチジン（ＨｉｓＳＨ）　ＣＡＣＳＣＡＴ イソロイシン（Ｉ　１ｅＳＩ）　ＡＴＡ、ＡＴＣ，ＡＴＴロイシン（ＬｅｕＳＬ ）　ＣＴＡ、ＣＴＣ，ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡＳＴＴＧリシン（ＬｙＳ、Ｋ）　 ＡＡＡ、ＡＡＧメチオニン（ＭｅｔＳＭ）　ＡＴＧ フェニルアラニン（Ｐｈｅ、、Ｆ）　ＴＴＣＳＴＴＴプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）　 ＣＣＡＳＣＣＣＳＣＣＧ、ＣＣＴセリン（Ｓｅｔ、Ｓ）　ＡＧＣ，ＡＧＴＳＴＣ ＡＳＴＣＣ，、ＴＣＧ、ＴＣＴトレオニン（ＴｈｒＳＴ）　ＡＣＡ、ＡＣＣ，Ａ ＣＧ、ＡＣＴトリプトファン（ＴｒＩ）ＳＷ）　ＴＧＧチロシン（ＴｙｒＳＹ） 　ＴＡＣ，ＴＡＴバリン（Ｖａｌ、Ｖ）　ＧＴＡ、ＧＴＣ，ＧＴＧ、ＧＴＴ停止 シグナル　ＴＡＡ％ＴＡＧ、ＴＧＡ記：各３文字３重項は左に５°末端及び右に ３°末端を有するＤＮＡのトリヌクレオチドを示す。ヌクレオチ）１２列を形成 するプリン又はピリミジン塩基を表す文字：Ａ＝アデニン、Ｇ＝ニブアニンＣ＝ シトシン及びＴ＝チミン。ＲＮＡコードはＵ（ウラシル）をＴと置換する以外は 同一である。

図１に挙げた特定のヌクレオチドの他に、本発明のＤＮＡ　（又は対応するＲＮ Ａ）分子は、特に挙げられているヌクレオチドの前又は後に追加のヌクレオチド を有することができる。例えば３゛−末端にポリＡを加えることができ；どちら の末端にも短い（例えば２０ヌクレオチド以下）配列を加えて制限エンドヌクレ アーゼ部位に対応する末端配列を与えることができ、翻訳を停止させるためにペ プチド配列に停止コドンが続くことができる、などである。さらにプロモーター 領域又は他の調節領域を遺伝子から上流に含むＤＮＡ分子を製造することができ る。本発明の配列を含むすべてのＤＮＡ分子は最低でもフラグメント化し、オリ ゴヌクレオチドプローブを与え、生物学的供給源からのＤＮＡの単離又は検出に 用いることができるので、少なくとも１つの目的に有用である。

本明細書で用いられる多（の用語は、その比較的共通の意味の他に特別な意味を 有する。“レニラルシフェラーゼ”はレニラ属のメンバーから単離されたルシフ ェラーゼ酵素、又は他の供給源からあるいは合成によって得た同等分子を意味す る。同等”は、２つのヌクレオチド配列に関して言及する場合、問題の２つのヌ クレオチド配列が同一のアミノ酸の配列をコードすることを意味する。“同等” が２つのペプチドに関して用いられる場合、それは２つのペプチドが実質的に同 一のアミノ酸配列を有することを意味する。“同等”が性質に言及している場合 、その性質は同程度で存在する必要はないが（例えば２つのペプチドは同種の酵 素活性を異なる速度で示すことができる）、性質は実質的に同一であることが好 ましい。“相補的”は、２つのヌクレオチド配列に対して言及する場合、２つの 配列が、向き合ったヌクレオチドの間で好ましくは２５％以下、より好ましくは １５に以下、さらに好ましくは５％以下、最も好ましくはミスマツチがなくハイ ブリッド形成することができることを意味する。好ましいハイブリッド形成条件 （ミスマツチの特定の数に限られない）を実施例に示す。“実質的″という用語 は、関連技術における熟練者が理解する状況により変わり、一般に少な（とも７ ０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好 ましくは少な（とも９５％である。“実質的に同一”という言い方は完全な同一 性、ならびに“実質的”に関する前の定義により定められた完全な同一性以下（ 例えばアミノ酸配列又は酵素活性の）を含む。本文で用いられる“単離された” という用語は、例えば他のペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡから分離されたそれぞれ ペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡを言い、（もしあるとすれば）溶媒、緩衝液、イオ ン又はそれらの生物化学的溶液中に通常存在する他の成分の存在下で存在する。

“単離された”は、本来の状態の天然物質、あるいは（例えばアクリルアミドゲ ル中で２成分に分離されているが純粋な物質又は溶液として得られていない天然 物質を含まない。本文で用いられる“で置換された”又は“置換″という言い方 は、必ずしも起こらなければならない作用を言うとは限らず、示された“置換” アミノ酸が異なる式中でそこに存在することが示されたアミノ酸と同一位置に存 在する場合に存在するペプチドを言う（例えばアミノ酸１１にバリンの代わりに ロイシンが存在する場合）。

レニラルシフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列が同定されたので、合成化学によりＤ ＮＡ遺伝子全体を製造し、その後組み替えＤＮＡ法の既知の方法を用いて多くの 利用できるＤＮＡベクターのいずれかに遺伝子を挿入することができる。従って 本発明は自由に入手でき、遺伝物質の供託を必要とせずに本特許出願の時点で公 有財産である試薬、プラスミド及び微生物を用いて行うことができる。

例えば１００塩基長以上のヌクレオチド配列をＡ１１）ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０Ａ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで、その商 業広告（例えばＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ、Ｎｏｖｅ ｍｂｅｒ／Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１９８４゜ｐ、３）で証明されている通り容易に 合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、中でも重複相補配列 （例えば１−１００のコーディング鎖、０−５０及び５１−１５０の相補鎖、１ ０１−２００のコーディング鎖なと）を調製し、その後ハイブリッド形成、鎖の 連結を行う方法を用いて容易にスプライシングすることができる。そのようなり ｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌ、Ｃｏ、、Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（ １９８６）に詳細に記載されている。その後本文に記載の宿主生物中でペプチド を発現することができる。

さらに本文に開示されるペプチドの多く、特に完全なレニラルシフエラーゼ酵素 以下のペプチドフラグメントの直接合成を容易に行えるようにする自動化装置も 利用できる。上記のＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓの同− 号にて、カップリング効率が９９％以上の商業的に入手可能な自動ペプチド合成 機が広告されている（３４ページ）。

そのような装置は直接合成による、又は他の方法を用いてカップリングさせるこ とができる一連のフラグメントの合成による、本発明のペプチドへの容易な道を 与える。

図２及び３に示す特定のポリペプチド配列の他に、これらの配列及びフラグメン トに基づ（ペプチドフラグメントならびにその小さい変異を示す全長配列は、ル シフェラーゼの生物活性の少な（とも一部を有し、従って適した状況下で有用で あろう。例えばルシフェラーゼ酵素配列のフラグメントを容易に調製し、ルシフ ェリン結合部位モデルとして用いるためにスクリーニングすることができる。小 さいポリペプチドフラグメント（例えば１００アミノ酸以下）の調製にペプチド 合成機を用いることができ、例えば遺伝子工学の方法を用いてより大きなフラグ メントを調製することができる。適したポリペプチドフラグメントを同定する簡 単なスクリーニング法は、例えば腔腸動物ルシフェリン分子などの適した基質を アフィニティーカラムに結合させ、結合した基質により保持されるペプチドフラ グメントを捕獲することを含む。そのようなペプチドは遺伝的に操作された生物 によるルシフェラーゼの発現に関するスクリーニングに用いることができる抗体 の製造のための免疫原として用いることもでき（実際に用いられそうである）、 その場合結合基質は抗体、又はレニラルシフェラーゼに特異的に結合する類似分 子である。

大きなタンパク質から適した結合アフィニティーを有するペプチドフラグメント を調製し、選択できることは当該技術において周知であり、特許を含む多（の文 献に記載されている。例えば全ウィルスタンパク質と同一の抗体と結合するウィ ルスタンパク質の免疫学的活性フラグメントの調製につき記載した米国特許第４ ．６２９，７８３号を参照せよ。

さらに当該技術における熟練者にわかる通り、前記のペプチド及びＤＮＡ分子の 小さい変異も、さらに詳細に示すペプチド及びＤＮＡ分子と同等であるものとす る。例えばインロイシン又はバリンを用いたロイシンの、グルタメートを用いた アスパルテートの、セリンを用いたトレオニンの隔離された置換、又は構造的に 関連するアミノ酸を用いたアミノ酸の類似の置換（保守的置換）は、特に置換が 結合部位又は生物活性の他の部位のアミノ酸を含まない場合、得られる分子の生 物活性に大きな影響を与えないことが合理的に予想される。さらに当該技術にお いて既知の通り２つの末端のいずれにも追加のアミノ酸が存在することができ、 あるいは末端の１つ又は両方からアミノ酸が欠失していることがＳきる。

変化が機能性ペプチドを与えるかどうかは、修飾酵素（又はフラグメント）が天 然のルシフェラーゼ酵素（又はフラグメント）の正常な機能を行う能力に頼った 検定において機能に関して直接分析することにより容易に決定することができる 。例えば修飾ペプチドを、組み替えレニラルシフェラーゼ分子に関して下記に記 載する方法と同一の方法により腔腸動物ルシフェリンからの発光を触媒する能力 につき試験することができる。１つ以上の置換が行われたペプチドは、同様の方 法で容易に試験することができる。好ましいペプチドは、いずれの連続した２０ 個のアミノ酸の群の中でも異なるアミノ酸は１２以下、より好ましくは５以下で ある。アミノ酸の置換が起こる場合それは、標準的同類群（ｓｔａｎｄａｒｄ　 ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｇｒｏｕｐ）内からが好ましい。

アミノ酸の標準的同類群を一文字アミノ酸コードを用いて括弧内に示す：非極性 （Ａ、Ｖ、ＬＳＩ５Ｐ、Ｍ）：芳香族（ＦＳＴ、Ｗ）；非帯電極性（Ｇ、Ｓ、Ｔ 、Ｃ％Ｎ、Ｑ）；酸性（Ｄ、Ｅ）；塩基性（Ｋ、Ｒ。

Ｈ）ｏ芳香族アミノ酸は広義の非極性（Ｆ、Ｗ）又は非帯電極性（Ｔ）群に属す ると考えられることもある。

本文に記載のいずれのペプチドの塩も、そのようなペプチドが種々のｐＨの水溶 液中で（又は単離された形態で）存在する場合に自然に存在する。示された生物 活性を有するペプチドの塩はすべて本発明の範囲内と考える。例としてカルボン 酸残基のアルカリ、アルカリ土類、及び他の金属塩、アミノ残基の酸付加塩（例 えばＨＣｌ）　、及び同一分子内のカルボン酸とアミノ残基の間の反応により形 成される両性イオンが含まれる。

遺伝子及び対応するタンパク質は上記で議論した全合成法により製造することが できるが、本発明の好ましい具体化の場合、遺伝情報を天然の供給源から得、本 文に記載の通りに同定する。遺伝物質を最初に、多数の現存する方法のいずれか を用いて遺伝子ライブラリの形態で得る。

方法の最初はゲノムＤＮＡを無作為に剪断し、この剪断された物質を発現ベクタ ーに挿入することである。十分な組み替え体が生成されると問題の酵素に対応す る融合タンパク質を発現する少な（とも１つの組み替え体を集団の中に含む確率 が高い。

遺伝子ライブラリを製造する他の方法は、生物の全ｍＲＮＡ集団の相補的ＤＮＡ 　（ｃＤＮＡ）コピーを作り、これらを発現ベクター中で組み替え分子としてク ローニングすることである。生物の予想される性質（すなわち真核生物の特徴を 有することが予想された）は、所望の遺伝子のコード領域にイントロンが存在す ることを示した。剪断されたゲノムＤＮＡの利用がイントロンにより妨げられる ことはないが、スクリーニングしなければならない組み替え体の数が増し、その 後の分析を実質的に複雑にする。この結果に基づき、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリ を用いてレニラ遺伝子を得るのが好ましい。

そのようなライブラリは発明者等の実験室で生成され、ルシフェラーゼ活性を有 する遺伝子産物の発現に関してスクリーニングされた。この実施例の詳細は、遺 伝子の完全な配列を得るに至った実験の詳細を含んで下記に示す。しかし発明者 等により製造された配列及び操作された特定の生物が、本明細書に示す指針を用 いて製造することができる他のクローンより優れていると信じる理由はない。実 際にレニラルシフェラーゼの発現を、下記の実施例にて議論する通り他の発現系 の選択により本文に記載の発現より増加させることができるようである。

ここでレニラルシフェラーゼの配列が決定されたので、本発明の遺伝物質を得る ためにこれらに段階を通して行うことはもはや必要でない。

今やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて簡単でより直接的な方法により 天然の供給源から遺伝子を単離することができる。診断における利用を含みＰＣ Ｒ法は米国特許第４．６８３，２０２号に開示されており、それをここに参照と して挿入する。レニラ試料は世界中の海から容易に入手でき、本明細書に示す配 列を用いてＰＣＲプローブを調製することができるので、ＰＣＲ法及び天然に入 手できるレニラゲノム物質の供給源を用いて本文に示す配列のいずれの所望の切 片を得ることも可能である。レニラルシフエラーゼ染色体遺伝子を単離するため のそのような方法の特定の例を下記の実施例に記載する。クローニングされた遺 伝子をその後市販のベクター中に挿入し、発現することができる。

遺伝子の位置決定のための十分な情報が与えられているので、遺伝子工学に関す る当該技術における熟練者の知識及び前記の指針を組み合わせて用いると、上記 に示した方法により所望の遺伝子の単離及び組み替えＤＮＡベクターにおけるそ の利用が容易に可能であるが、同様の結果に導（他の方法も既知であり、本発明 の組み替えＤＮＡベクターの生成に用いることができる。

レニラタンパク質の発現は、形質転換宿主中に多数の遺伝子のコピーを含むこと により；宿主中で再生産されることが知られているベクターを選択して外因性挿 入ＤＮＡから多量のタンパク質を生産することにより（例えばｐＵＣ８；　ｐｔ ａｃ１２　；　ｐＩＮ−Ｉ　Ｉ　Ｉ−ｏｍｐＡｌ、２又は３：ｐＯＴＳ；ｐＡｓ ｌ；あるいはｐＫＫ２２３−３）；あるいはペプチド発現を増加させる他の既知 の手段により増加させることができる。

普通の変法の１つは、融合ポリペプチドの形態で本発明のポリペプチドを製造す ることである。そのようなペプチドは典型的に宿主中で発現されることが知られ ている遺伝子のプロモーター領域を用い、本発明のアミノ酸配列の全体又は主要 部分をコードするヌクレオチドを宿主タンパク質のための遺伝子配列中に挿入す ることにより製造される。そのような融合タンパク質の例にはβ−ガラクトシダ ーゼ融合タンパク質が含まれる。必要なら、タンパク質分解酵素により認謙され る部位が２つの融合タンパク質の間の接合部に存在するように融合タンパク質を 設計することができる。その後タンパク質分解酵素を用いて発現タンパク質を切 断し、所望のルシフェラーゼ酵素を純粋な形態で得ることができる。

すべての場合に、ＤＮＡ配列がベクター中に機能的に挿入されるとレニラルシフ ェラーゼが発現される。“機能的に挿入゛は当該技術における熟練者に十分理解 される通り正しい読み枠及び配向で挿入することを意味する。典型的に遺伝子は プロモーターから下流に挿入され、停止コドンが続（が、必要ならハイブリッド タンパク質としての製造（おそらく切断が続く）を用いることができる。

本発明の実行に従い組み替えＤＮＡ分子及び形質転換単細胞生物の製造に用いる ことができる上記の一般的方法の他に、他の既知の方法及びその修正法を本発明 の実行に用いることができる。特に遺伝子工学に関連する方法が近年爆発的な成 長及び発展を遂げた。最近の多くの米国特許はプラスミド、遺伝子操作された微 生物、及び本発明を行うのに用いることができる遺伝子工学の実行法を開示して いる。例えば米国特許第４．２７３，８７５号はプラスミド及びその単離法を開 示している。米国特許第４，３０４．８６３号はハイブリッドプラスミドを構築 し、それをバクテリア宿主の形質転換に用いる遺伝子工学によるバクテリアの製 造法を開示している。米国特許第４．４１９．４５０号は組み替えＤＮＡ研究に おいてクローニングビークルとして有用なプラスミドを開示している。米国特許 第４．３６２．８６７号は組み替えｃＤＮＡ構築法及びそれによって製造された クローニング法で有用なハイブリッドヌクレオチドを開示している。米国特許第 ４．４０３．０３６号は、ＤＮＡ片の多量のコピーを含むプラスミドの生成のた めの遺伝試薬を開示している。米国特許第４．３６３．８７７号は組み替えＤＮ Ａ転移ベクターを開示している。米国特許第４．３５６．２７０号は、組み替え ＤＮＡクローニングビークルを開示しており、遺伝子工学で用いられる多くの用 語及びそこで用いられる基礎的方法を定義しているので、遺伝子工学の分野にお ける経験の限られた者にとって特に有用な開示である。米国特許第４．３３６． ３３６号は、融合遺伝子及びその製造法を開示している。米国特許第４，３４９ ，６２９号はプラスミドベクター及びその製造と利用を開示している。米国特許 第４．３３２．９０１号は組み替えＤＮＡにおいて有用なりローニングベクター を開示している。これらの特許のいくつかは本発明の範囲内に含まれない特定の 遺伝子産物の製造を目的としているが、そこに記載されている方法は遺伝子工学 の技術における熟練者が本明細書に記載の本発明の実行のために容易に修正する ことができる。

本発明の意味は、有用な量のレニラルシフェラーゼ及び本発明の遺伝物質がハイ ブリッド形成検定の発展又はこれらの物質を用いた他の種類の検定において用い るために利用できるようになるという点で重要である。単離されたレニラルシフ ェラーゼｃＤＮＡの他の発現ベクターへの転移により、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ ｆ）中のルシフェラーゼの発現を増す、又は他の宿主中でポリペプチドを発現す る構築物を製造することができる。

特に意図されているのは、本文に開示されている主な、及び変異ヌクレオチド配 列に基づ（オリゴヌクレオチドプローブを用いた、関連生物からの遺伝子の単離 である。そのようなプローブは全配列よりかなり短いことができるが少なくとも １０．好ましくは少なくとも１４ヌクレオチドの長さでなければならない。２０ −５００．特に３０−２００ヌクレオチドの長さの中間オリゴヌクレオチドは特 に特異的で作用が迅速なプローブを与える。遺伝子の全長までのもっと長いオリ ゴヌクレオチドも有用である。ＲＮＡ及びＤＮＡプローブの両方を用いることが できる。

用いる場合プローブは典型的に検出可能な方法で標識しく例えばｔｐ、ｓＨ１ビ オチン又はアビジン）、遺伝子をめている生物からの１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと 共にインキュベートする。ハイブリッド形成は１１本鎖及び２本鎖（ハイブリッ ド形成した）ＤＮＡ　（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）が（典型的にニトロセルロース紙 を用いて）分離された後に標識を用いて検出される。オリゴヌクレオチドの場合 に用いるのに適したハイブリラド形成法は周知である。通常プローブは検出可能 な標識と共に用いられ、それは同定を容易にするが、非標識オリゴヌクレオチド も標識プローブの前駆体として、及び２本鎖ＤＮＡ　（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）の 直接検出を与える方法で用いるために有用である。従って“オリゴヌクレオチド プローブという用語は標識及び非標識の両形態を言う。

要するに、発明者等はレニラレニホルミスルシフェラーゼのｃＤＮＡクローンの 単離及び配列決定により、本発明の実行を短縮した。第１メチオニン残基から始 まるこのｃＤＮＡからの推定アミノ酸配列は、本来のレニラルシフェラーゼの大 体の大きさである３６ｋｄと等しいＭ、のタンパク質を予言する。推定アミノ酸 配列もその中に、Ｖ−８プロテアーゼ−消化された本来のレニラルフェラーゼか らの６個のペプチド配列をすべて含んでいた。これらの２組のアミノ酸データに 間には１個だけミスマツチが見いだされ、それはペプチド配列中に存在するロイ シンのトリプトファンによる置換であった。本来のアミノ酸組成と予想組み替え ルシフェラーゼ組成の比較により、特定のアミノ酸残基の間で多くが同一であり 、非常に高度の類似性が明らかになった。

さらに遺伝的に操作された生物におけるルフェラーゼの発現が示された。最初の ルシフェラーゼクローンλＲＬｕｃ−６の粗抽出物中でルシフェラーゼ活性が見 いだされた。ｃＤＮＡをベクターｐＴＺ１８Ｒにサブクローニングすると、ｐＴ ＺＲＬｕｃ−１細胞から組み替えルシフェラーゼを精製するのに十分な程この活 性が向上した。組み替えルシフェラーゼは、本来のルシフェラーゼの精製で以前 に用いられた方法よりずっと簡単な方法により精製することができる。組み替え ルシフェラーゼはこれまで分析したすべての点で本来のルシフェラーゼと同様に 機能する。本来のルシフェラーゼと同様に組み替えルシフェラーゼはλｍａｘが ４８０ｎｍであり、４００ｎｍに肩を有する発光スペクトルを有する。

組み替えルシフェラーゼの吸収スペクトルも本来のものと同一である。

さらに本来の、及び組み替えルシフェラーゼの両方共３７℃で数時間非常に安定 であり、４５℃でも有意な安定性を有する。本来のルシフェラーゼに関して決定 された比活性を用い、発光に基づいてなされたタンパク質決定はＡ！、。及びＬ ｏｗｒｙタンパク質決定と非常に良い関連性を示し、組み替えルシフェラーゼの 比活性が本来のルシフェラーゼの比活性と同一でないとしても類似していること を示唆している。最後に、組み替えルシフェラーゼのアミノ−末端アミノ酸配列 分析は、残基２から１８までのｃＤＮＡ−予測アミノ酸配列と同一の配列を示す 。有意な量の組み替えタンパク質がおそらくＮ−ホルミルメチオニンによりアミ ノ末端で遮蔽されており、残基１でアミノ酸を決定できないことを説明している 。

ここで本発明を一般的に記載したが、以下の実施例を参照することによりさらに 良（理解できるであろう。実施例は単に例示を目的としており、そのように特定 されなければ本発明を制限すると考えるべきではない。

ｌ）を１ｍｌのルシフェラーゼ検定緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ。

ＬＭ　ＫＰＯ４りＨ７，６，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＢＳＡ及び０．０ ０４％　ＮａＮ３１に加え、１２ｘ７５ｍｍ試験管で渦動した。合成ベンジルル シフェリン（２，５ナノモル／μｌ保存液、１０μｍ）を反応に加え、最終濃度 を２．５ｘｌＯ°８Ｍとし、混合物を４−５秒間激しく渦動した。管をすぐにＴ ｕｒｎｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　ＴＤ−２０ｅ光度計に入れ、極大発光を決定し、”Ｎ ｉ放射活性発光キャリブレーション標準を用いて光子に変換した。

ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ合成 生きたレニラレニホルミスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｅ。

ｒｇｉａ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅにてＧｅｏｒｇｉａ州の５ａｐｅ ｌｏ島の浅瀬における海底トローリングにより集めた。動物を新しい海水中で十 分に洗浄し、迅速に液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。凍結したレニラ を液体窒素下で乳棒と乳鉢を用いて微粉末に砕いた。粉末とした組織をその後４ Ｍのグアニジンチオシアナート中でＷａｒｉｎｇブレンダーを用いて均質化し、 Ｃｈｔｒｇｗｉｎ　ｅｔ−見±、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７０）１ ８：５２９４−５２９９に記載の通りに全ＲＮＡを単離した。その後金ＲＮＡに オリゴ−ｄＴセルロースカラム上を通過させ、ポリアデニル化ＲＮＡを得、それ をエタノール沈澱物として一２０℃で保存した。下記の通りＧｕｂｌｅｒａｎｄ 　Ｈｏｆｆｍａｎ法、Ｇｕｂｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ（１９８３）２５ 　：　２６３−２６９の修正法によりポリＡ”ＲＮＡから１本鎖及び２本鎖ｃＤ ＮＡを合成した。ｃＤＮＡのＴ−４ポリメラーゼ平滑化及びメチル化の後、合成 ＥｃｏＲＩリンカ−を平滑末端連結した。

ＥｃｏＲＩで消化した後、低−融点アガロースゲル電気泳動により過剰のリンカ −をｃＤＮＡから分離した。長さが約６５０ｂｐ以上のｃＤＮＡのみが低融点ゲ ルから単離された。

λ　ｔｌｌライブラリの構築及びスクリーニング精製ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化 λｇｔｌｌ中に連結した。その後ＤＮＡをλフアージ抽出物を用いてパッケージ した（Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｐｌｕｓ　Ｋｉｔ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）ｏパッケ ージされたライブラリの数留分をＹ１０８８細胞中で滴定した；これらの留分は ＩＰＴＧ−誘導可能β−ガラクトシダーゼ活性の欠如により決定して７１％−８ １％組み替えファージの範囲であうた。組み替えファージの合計数は２゜１ｘｌ Ｏ’ｐｆｕ（プラーク形成単位）に等しかった。その後−次ライブラリをＹ１０ ８８細胞中で増幅し、７％ＤＭＳＯ中で一８０℃にて保存した。増幅ライブラリ の力価は２．５ｘｌＯ’ｐｆｕ／ｍｌであり、約６５％組み替え体であった。

２つの１７−塩基オリゴヌクレオチドプローブを、■−８プロテアーゼ消化され た本来のレニラルシフェラーゼから誘導された単離ペプチド′　からのアミノ酸 配列データに基づいて合成した。７つのＶ−８ルシフエラーゼペプチドのアミノ 酸配列を図４に示す。コドン重複度の最も低いアミノ酸配列を、ルシフェラーゼ オリゴヌクレオチドプローブ＃１及びプローブ＃２の合成のために選択し、それ を誘導ヌクレオチド配列と共に強調して示した（図４の下部）。プローブ＃１は ペプチド７から誘導され、３２重複度を含み、ペプチド１から誘導されたプロー ブ＃２は６４重複度を含んだ。プローブをＴ−４ポリヌクレオチドキナーゼを用 いて高特異的活性に末端標識した（４−９ｘｌＯ’ｃｐｍ／μｇ）。Ｙ１０８８ 細胞を３ｘｌＯ’ｐｆｕ／プレートを与えるのに十分なファージに感染させた。

感染細胞を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む直径が１５０ｍｍのＬｕｒｉａ プレート上に６ｍｌのトップアガロース（ｔ。

ｐ　ａｇａｒｏｓｅ）中で平板培養した。３７℃で終夜インキュベートした後、 プラークを採取する前にプレートを４℃で冷却した。誤った正の信号を除去する ために、各マスタープレートから二重のニトロセルロースフィルタープラークレ プリカを調製した。フィルターを塩基処理により加工し、その後トリス緩衝液中 で中和した。

フィルターを空気乾燥し、８０℃にて真空中でベーキングした。予備ハイブリッ ド形成は６Ｘ　ＳＳＣ，５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）、５Ｘ　デ ンハート溶液、及び１１００ｕ／ｍ１の変性Ｈｅｒｒｉｎｇ精子ＤＮＡ中で３７ ℃にて少なくとも６時間行つた。ハイブリッド形成は、硫酸デキストランを１０ ％の最終濃度まで加えた予備ハイブリッド形成溶液中で３７℃にて終夜行った。

標識プローブは１−２Ｘ１０’ｃｐｍ／ｍｌにてハイブリッド形成溶液に加えた 。

フィルター洗浄は、Ｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　（１９８５）８２：１５８５−１５８８中で１７−塩基オリゴヌ クレオチドに関して記載されている条件下でテトラメチルアンモニウムクロリド の存在下で行った。スクリーニングの第１巡では各二重のフィルターを両方のプ ローブにハイブリツド形成させ、次の巡では二重のフィルターをプローブ＃１又 はプローブ＃２のいずれかにハイブリッド形成させた。すべてのｃＤＮＡクロー ンを３又は４巡のスクリーニングの後にプラーク精製した。ファージＤＮＡを、 ＧｒＯ８ｓｂｅｒｇｅｒ、Ｄ、、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、（１９８７）１旦 （１６）：６７３７に記載の通りにグリセロール段階勾配上で各クローンから単 離した。

ＤＮＡ配列分析 ＤＮＡ配列分析はすべてＭ１３ベクターｍｐ１８及びｍｐ１９中で行った。１本 鎖鋳型を準備し、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ ｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た５６ｑｕｅｎａｓｅＤＮＡ配列決定キットを用いて ジデオキシヌクレオチド配列決定を行つた。配列決定反応はＭ１３普遍プライマ ー、いくつかの構築物中に存在する外因性λｇｔｌｌ　ＤＮＡにハイブリッド形 成したプライマー、あるいはオリゴヌクレオチドプローブを用いて開始させた。

ｃＤＮＡの両端から得た配列データを、６塩基制限酵素部位に関して分析し、そ れを配列決定サブクローンの生成に用いた（図５）。この方法で全１．２ｋｂ　 ｃＤＮＡを両方の鎖について配列決定した（図５の下部）。すべてのＤＮＡ配列 及び翻訳タンパク質配列を集め、Ｂｅｃｋｍａｎから購入したＭｉｃｒｏｇｅｎ ｉｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。

Ｅ、ｃｏｌｉ中における発現 最初のルシフェラーゼｃＤＮＡクローン、λＲＬｕｃ−６は発現ベクターλｇｔ ｌｌ中にあった。クローンをＹ１０８８細胞中で増幅し、高力価材料を用いてＹ １０８９中に溶源菌を形成した。その後λＲＬｕｃ−６溶原菌をアンピシリン（ ５０μｇ／ｍｌ）を加えたＬｕｒｉａブロス中で３７℃にて成育した。細胞をベ レット化し、ＴＥ緩衝液中に再懸濁し、リゾチーム（２ｍｇ／ｍｌ）を用いて溶 解した。細胞破片をその後ペレット化し、上澄み液をルシフェラーゼ活性に関し て分析した。

３゛末端に結合したｌｋｂのλｇｔｌｌ　１ａｃＺ　ＤＮＡを含む２．２ｋｂｐ のλＲＬｕｃ−６挿入片を低融点ゲル上で単離し、ｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）のＥｃｏＲＩ／５ｓｔＩ部位にサブクローニングした。この構築物、ｐ ＴＺＲＬｕｃ−１を組み替えレニラルシフエラーゼの発現及び精製に用いた。

電気泳動及びウェスターン分析 組み替えシルフェラーゼ試料をクーマシーー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で特性 化した。ウェスターン分析の場合、Ｂｕｒｎｅｔｔ、Ｎ。

３０ｍＡにてゲル上を移動させ、ニトロセルロースフィルターに移した。

フィルターを３％のＢＳＡで遮蔽し、１／１０００希釈のポリクローナルウサギ −抗−ルシフェラーゼ抗体と共にインキュベートした。次にフィルターをＴＢＳ 中で洗浄し、１／２５００希釈のホースラディツシュパーオキシダーゼに複合さ せた二次抗体、ヒツジ−抗−ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共にインキュベ ートした。最後にフィルターをＴＢＳ中で洗浄し、ＨＲＰ−発色剤（Ｃｏｌｏｒ 　Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて発色させ た。

発光スペクトル ｐＴＺＬｕｃ−１細胞の粗試料を本文にて前に記載した通りに調製した。試料を １ｍｌのルシフェラーゼ検定緩衝液に加え；１μｌのルシフェリン（９１７ナノ モル／μｌ）を１−２分間隔で加えて信号を維持した。オン−ラインコンピュー ター化５ＰＥＸ蛍光計を用いて生物発光スペクトルを得、集めた。多数のスペク トルを走査平均し、６７５ｎｍ−３７５ｎｍで測定した最終的スペクトルを得た 。

タンパク質精製 ｐＴＺＲＬｕｃ−Ｉ　Ｅ、ｃｏｌｔ抽出物からの組み替えレニラルシフェラーゼ の精製を、３段階のクロマトグラフィーにより行った。組み替えルシフェラーゼ は以下の通りにしてｐＴＺＲＬｕｃ−１細胞から精製した：　ｐＴＺＲＬｕｃ− １細胞を０Ｄｓｏｏ＝０．６で２０ＬのＬｕｒｉａブロス中３７℃にて成育し、 その時点でＩＰＴＧを０゜５ｍＭの最終濃度まで加え：細胞の成育を３０℃にて 終夜続けた。細胞を遠心により収穫し、ＴＥ中で洗浄し、細胞１ｇ当たり５ｍｌ の１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８）中に再懸濁し、−２０℃で凍結した。典型的 精製の場合、１５−３０グラムの細胞を解凍した。リゾチームを４−６ｍｇ／ｍ ｌの最終濃度まで加え、細胞を氷上に４５分間保った。ＤＮＡアーゼ（１０−２ ０ｍｇ）をライセードに加え、それを顕微鏡検査により細胞の９０％の溶解が証 明されるまで、氷上でＢｒａｎｓｏｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｓｒｕｐ　ｔ　ｅ　ｒか らの１分間バーストを用いて音波処理した。

粗材料を４８Ｘｇにて３０分間遠心することにより透明化し、第１カラム上に負 荷した。抽出物を最初にＤＥＡＥ−セルロースイオン−交換カラム、その後Ｇ− １００５ｅｐｈａｄ、ｅｘゲル濾過カラム、及びその後安息香酸−８ｅｐｈａｒ ｏｓｅアフイニテイーカラムに流した。Ｇ−１００カラムはＩＸ　レニラ標準緩 衝液（１，５ｍＭ　トリス、１゜ＯｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，８）中で流した。

他のカラムはＩＸ緩衝液中で流し、ＩＯＸ緩衝液（ＤＥＡＥ）又は１０Ｘ緩衝液 中の安息香酸ナトリウム（安息香酸−３ｅｐｈａｒｏｓｅ）中で溶離した。第１ の安息香酸カラムを０．１Ｍの安息香酸ナトリウムパルスで溶離した。第２の安 息香酸カラムは０−０．５Ｍの安息香酸ナトリウム勾配で溶離した。

本来のルシフェラーゼの吸光係数（ε２．。、、０．　１％＝２．　１）を用い たＡｚＨ測定により、本来のルシフェラーゼの比活性（１，８Ｘ１０１ｓｈｖ秒 −１ｍ　ｇ　−１）を用いた発光により、又はＢｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ、。

Ａｎａｌｙｔｆｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７６）７２：２４８ に記載のＢｒａｄｆｏｒｄ検定によりタンパク質決定を行った。

Ｖａｒｉａｎ　Ｍｏｄｅｌ　ＤＭＳ−１００分光光度計で吸収スペクトルを測定 し、集めた。

λＲＬｕｃ−６の単離及び分析 ｌＸｌ０’個の組み替えファージの一部スクリーニングにより、両レプリカフィ ルター上で同一のオートラジオグラフィー信号を与える９個のクローンが単離さ れた。最初に正であった９個から５個だけが二次スクリーニングで信号を与え、 ５個の中の１個のみが両プローブとハイブリッド形成した。他の４個は配列重複 度が最大であるプローブ＃２のみとハイブリッド形成した。５個のクローンの制 限酵素分析により、λＲＬｕｃ−３及びλＲＬｕｃ−３は同一であり、１．１６ ｋｈの挿入片を含むことが明らかになった。λＲＬｕｃ２．５及び６の挿入片の 大きさはそれぞれ０．　８．２．３４及び１．２ｋｂｐであつた。λＲＬｕｃ− ３及びλＲＬｕｃ−３挿入片のみがＥｃｏＲＩ消化によりＥｃｏＲＩクローニン グ部位から切り出された。他の３個の挿入片は明らかに１個のＥｃｏＲＩリンカ 一部位を失っており；これらはＥｃｏＲＩ及び５ｓｔＩにより切断されるべきも のであった。従ってこれらのｃＤＮＡのそれぞれは一端に結合したｌｋｂのλｇ ｔｌｌ　ＤＮＡを含んだ。λＲＬｕｃ−６のみが両オリゴヌクレオチドプローブ にハイブリッド形成し、約３６ｋｄのタンパク質をコードするのに必要な大きさ のｃＤＮＡを含んでいたので、ＤＮＡ配列分析にそれが選ばれた。

ｌｋｂのλｇｔｌｌ　ｌａｃ　Ｚ　ＤＮＡを含む２．２ｋｂのＥｃ。

ＲＥ／５ｓｔＩフラグメントをＭ１３及びｍｐ１８ならびにｍｐ１９にサブクロ ーニングし、１．２ｋｂのｃＤＮＡの両鏡を完全に配列決定した。全ｃＤＮＡ配 列はＥｃｏＲＩリンカ−を除いて１１９６ｂｐである（図１）。構造的にそれは ヌクレオチド１０で始まる推定開始コドン、ヌクレオチド９４４の停止コドン、 ヌクレオチド１１７０のポリアデニル化共通配列、及び７塩基の短いポリアデニ ル化尾部を含む（図１）。

ヌクレオチド５３７−５５４　（プローブ＃１）及びヌクレオチド８２０−８３ ６　（プローブ＃２）に位置する２個のオリゴヌクレオチドハイブリッド形成部 位も図１にて下線で示す。ｃＤＮＡの３°末端のＥｃｏＲ１部位の消失は配列分 析により確認された。

ｃＤＮＡは第１開始コドンを有する、又はそこから上流の枠内に停止コドンを含 まず、タンパク質コード領域が全長であることを示している。

しかしコード領域は下記の通り完全に活性なレニラルシフェラーゼの組み替え合 成を指示している。ｃＤＮＡ配列のアミノ酸配列への翻訳は、λＲＬｕｃ−６ｃ ＤＮＡがレニラルシフェラーゼｃＤＮＡであることの決定的証明を与える。翻訳 されたｃＤＮＡ配列は３１４アミノ酸の読み枠を含む（図２）。最初のメチオニ ンの前に３個のアミノ酸があり、それは本来のタンパク質配列の一部であるか又 は一部でないかも知れない。生体内の翻訳が第１のメチオニンで開始される場合 、３１１アミノ酸の読み枠が得られ、それは３６Ｋｄの分子量（Ｍ、）のタンパ ク質をコードする。本来のレラニルシフエラーゼのＭ、は種々の方法で測定され 、その値は３３Ｋｄ−３８Ｋｄの範囲である。この翻訳アミノ酸配列のアミノ酸 組成と以前に公開された本来のルシフェラーゼの組成を比較すると、２者の間に 多くの同一のアミノ酸があり、非常に密接な相同を示す（表２）。

表２ 本来の、及び組み替えレニラレニホルミスルシフェラーゼのアミノ酸組成 リシン　２６　２７ ヒスチジン　１０　１０ アルギニン　１２　１３ アスパルテート＊　３１　３０ トレオニン　９６ セリン　２０　１９ グルタメート＊＊　３６　３７ プロリン　１７　１８ バリン　２３　２３ メチオニン　７９ イソロイシン　２０　２１ ０イシン　２３　２２ チロシン　１２　１３ フエニルアラニン　１５　１５ ＊アルパルテート＋アスパラギン ＊＊グルタメート＋グルタミン 本来のルシフェラーゼ組成データはＭａｔｔｈｅｗｓ　ｅｔ　ａｌ、。

ｃＤＮＡがルシフェラーゼをコードするという別の証拠は、ｖ−８プロテア一ゼ ペプチド配列と翻訳ｃＤＮＡ配列の比較により見ることができる（図３）。Ｖ− ３ペプチドはすべて、残基１６１から始まる翻訳コード領域のカルボキシル−末 端半分上に位置し；いくつかが互いに重複している。ｃＤＮＡ配列からはトリプ トファンが推定されるがペプチド６配列が同位置でロイシンを示している１個の 残基、２１９を除いて、すべてのペプチドが翻訳配列の領域と正確に合う。タン パク質配列の一端でペプチドが束になっているのは、本来のタンパク質のアミノ ル末端半分がＶ−８プロテアーゼが近付けないように折り畳まれているためであ ろう。

Ｅ、ｃｏｌｉにおける組み替えルシフェラーゼの発現最初のλＲＬｕｃ　６溶原 菌は、発光により測定して低量のルシフェラーゼ活性を示す。λＲＬｕｃ−６溶 原菌のＩＰＴＧ誘導は、活性を約５０％減少させる。この結果は、後にＤＮＡ配 列データによりｃＤＮＡの３′末端がλｇｔｌｌのｌａｃ　Ｚ配列に隣接するこ とが明らかになった時に説明された。従ってＩＰＴＧ誘導の条件下で、転写はル シフェラーゼｃＤＮＡ配向に関して誤った方向に強制されていた。おそら（この 構築物における非−誘導ルシフェラーゼ発現は、我々が決定していない部位にお けるλｇｔｌｌの左端からのプロモーター活性による。

サザン及びノザン分析におけるプローブとして用いるためのＤＮＡフラグメント の単離を簡単にするために構築物ｐＴＲＬｕｖ−１を形成した（図６）。このプ ラスミドが内在するＥ、ｃｏｌｉ細胞をｐＴＺＲＬｕｃ−１細胞と呼ぶ。λｇｔ ｌｌと同様にｐＴＺ系“ファージミド”は１ａｃＺ’遺伝子に隣接してポリリン カ一部位を含む。このベクター中で発現される遺伝子は、おそら（ｃＤＮＡ翻訳 産物に融合したβ−ガラクトシダーゼの最初の１０−１５アミノ酸を含んで発現 される。ｐＴＺＲＬｕｃ−１細胞上澄み液を発光に関して分析すると、λＲＬｕ ｃ−６と比較して高量のルシフェラーゼ活性が存在することを示した。さらに０ ．５ｍＭのＩＰＴＧを用いてｐＴＺＲＬｕｃ−１細胞を誘導すると、粗抽出物に おいてルシフェラーゼ活性が５−８倍増加する。

これらの粗上澄み液からの生物発光スペクトルは、以前に公開された本来のレニ ラルシフェラーゼに関する生物発光スペクトルと同一であった。発光の波長分布 は基本的に以前の報告と同一である。スペクトルは４８０ｎｍにて極大発光（λ １．８）を有し、４００ｎｍ４：わずかな肩を持ち、それはおそらくルシフェラ ーゼ−オキジルシフェリン錯体中性種励起状態に対応する。

ｐＴＺＲＬｕｃ−１粗上澄み液をさらに５ＤＳ−ＰＡＧＥにより特性化した。ク ーマシーー染色ゲルは多数のバンドを含み、その１つは本来のルシフェラーゼに 近接して移動した。このバンドが組み替えルシフェラーゼであることを確認する ために、本来のレニラルシフェラーゼに対して誘起したウサギポリクローナル抗 体を用いてウェスターン分析を行った。展開ウェスターンは、本来のルシフェラ ーゼと同位置に移動する１つのバンドを示した。β−ガラトシダーゼールシフエ ラーゼ融合ポリペプチドであることを示す他の生成物は現れず、推定融合タンパ ク質が検出できない程低濃度であるか、又は融合タンパク質が形成されなかった かを示している。それはＤＮＡ配列分析により確認されなかったが、第１のｃＤ ＮＡ開始コドンに隣接する最初の３個のコドン内のβ−ガラクトシダーゼＡＴＧ 開始コドンにて開始するｐＴＺＲＬｕｃ−１翻訳産物は、なぜ我々が融合産物の 生産なしにルシフェラーゼ活性のＩ　ＰＴＧ誘導を観察したかを説明することが できる。

組み替えルシフェラーゼのＩＰＴＧ誘導は、その転写がｌａｃ　Ｚプロモーター により方向づけられることを示している。唯一のリポソーム結合部位（ＲＢＳ） の候補はおそらくルシフェラーゼＡＴＧからあまりに位置が離れすぎて（１８ヌ クレオチド）機能できないので、β−ガラクトシダーゼペプチドはルシフェラー ゼＡＴＧに隣接する停止コドンまで翻訳されていると思われる。β−ガラクトシ ダーゼペプチドの翻訳はルシフェラーゼＡＴＧコドンにおけるリポソーム再開始 を容品にすることができる（図７）。この現象はジヌクレオチドＡＧがルシフェ ラーゼｃＤＮＡのためのＲＢＳとして作用する場合に起こり得る。このようにし てＩＰＴＧ誘導可能な非−融合ルシフェラーゼポリペプチドが合成される。発現 ベクターとしてよりむしろ多目的試験管内転写ベクターとして設計されたｐＴＺ １８ベクターを用いて組み替えルシフェラーゼ発現に成功すれば、現在得られて いるより多量にルシフェラーゼを発現する他のクローンを開発できることは明ら かである。

組み替えレニラルシフェラーゼの精製 本来のルシフェラーゼの比活性を用い、ＩＰＴＧ誘導ｐＴＺＲＬｕｃ−１粗上澄 み液中に存在するルシフェラーゼの量に関して計算を行い、生産されている組み 替えルシフェラーゼの量が小規模で最初の精製を試みるのに十分であることを決 定した。

ＩＰＴＧ誘導ｐＴＺＲＬｕｃ−１細胞において組み替えルシフェラーゼは、透明 化粗上澄み液中の全タンパク質の約１２−１４％となる。この最初の精製で組み 替えルシフェラーゼのかなりの損失を受けたが、出発材料の量及び含まれる時間 により、本来のルシフェラーゼの精製と比較して損失は重要でないと思われた。

組み替えレニラルシフェラーゼの場合の精製案を図８に示し、精製を表３にまと める。精製段階の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、汚染タンパク質と比較して組み 替えルシフェラーゼの量が増加することが示された。安息香酸−８ｅｐｈａｒｏ ｓｅルシフエラーゼの純度は、３４Ｋｄに等しいＭ、の単一バンドにより証明さ れる通り約９９％である。２０μｇ以上のタンパク質を負荷するとクーマシー染 色ゲル上に非常にわずかな汚染がわかる。

表３ 組み替えルシフェラーゼ精製 容積　タンパク質　＊＊＊　精製　収率段階　（ｍｌ）（ｍｇ）　活性　比活性 　（％）粗材料　１３８　１１２０　３．２ｘｌＯ’フ　２．９ｘｌＯ”　０　 １００ＤＥＡＥ　４８　２６８　９．１ｘｌＯ”　３．３ｘｌＯ”　１．１　２ ７Ｇ−１００６７５１４８１，９ｘｌＯ”　１．３ｘｌＯ”　、４３　５．８安 息香酸（１）　５５　２６．４　４．５ｘｌＯ”　１．７ｘｌＯＩ５５．８　１ ３．８安息香酸（２）　２８　１０．４５　１．９ｘｌＯ”　１．８ｘｌＯ”　 ６．３　５．９＊ｈｖ秒−１の単位の活性 ＊＊ｈｖ秒−’ｍｇ−’の単位の比活性純粋な組み替えルシフェラーゼの吸収ス ペクトルも本来のルシフェラーゼのものと同一である。本来のルシフェラーゼの 比活性に基づき、発光により決定した組み替えルシフェラーゼのタンパク質濃度 はＡＨｏ及びＬｏｗｒｙ測定に基づくタンパク質濃度と非常に良く関連した。こ の結果は組み替えルシフェラーゼの比活性が本来のものと同一であることを示唆 している。本来のレニラルシフェラーゼは３７℃及び４５℃で温度安定性を示す ことが以前に示された。組み替えタンパク質も温度安定性に関して分析し、本来 のルシフェラーゼと同様に３７℃で数時間、及び４５℃で短時間、活性の有意な 損失なしに安定である。これらの温度における安定性は、組み替えルシフェラー ゼの診断用途における使用に重要な特徴であり、診断用途の多くが生理学的温度 におけるインキュベーションを必要とする。

組み替えレニラルシフエラーゼの精製によりそのアミノ−末端配列の決定が可能 になった。最初の１８残基のアミノ酸配列はＥｄｍａｎ分解により決定した。配 列データのアミノ酸ピークの高さは、実際に配列決定されたタンパク質は最初の タンパク質合成よりずっと少量であったことを示しており、大きなパーセンテー ジの組み替えルシフェラーゼが開始メチオニンでＮ−ホルミル化され、Ｅｄｍａ ｎ反応に遮蔽されたと思われる。この見掛けのアミノ−末端遮蔽にもかかわらず 、十分な非遮蔽種が得られ、組み替えルシフェラーゼの最初の１８残基の配列を 得ることができた。アミノ酸配列は、残基２−１８の翻訳ＣＤＮＡ配列と同一で あった（図７）。アミノ酸配列決定実験の第１サイクルで、我々はＣＤＮＡ配列 により予想された通りに第１残基にメチオニンが存在することを確認できなかっ た。しかし２組のアミノ酸データがアミノ酸残基２（トレオニン）から残基１８ （プロリン）まで同一であることは、我々の配列における推定第１メチオニンが ｐＴＺＲＬｕｃ−１構築物においても開始コドンとして作用しているという我々 の主張を強力に支持している。

本明細書に挙げたすべての文献及び特許出願は、各個別の文献及び特許出願が特 別に、及び個別に引用されることにより本明細書の内容となることが示されてい るのと同様に、引用することにより本明細書の内容となる。

本発明を十分に記載したが、添付する請求の範囲の精神及び範囲から逸脱するこ となくその多くの変更及び修正が可能であることは、当該技術における熟練者に 明らかであろう。

１０３０　１０４０　ｔｏｓｏ　ｔｏｇｏ　ｔｏｙｏ　ｔｏｓ。

１１ｉＡＡＴＡＴＴＴｃＡ　ＣＡ６６ｆｉＡＡＣＡＴ　ＴＣＡＴＡＴＡＴＧＴ　 ＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴ　ＡｒａＣＴＣＱＡＡＣＴ　ＴＴＡＣsＣＴｆｉＴＣ １０９０ｔｔｏｏ　１１１０　１１２０　１１３０　ｔｘ４゜ＡＴＡＴＣＡＴＴ ＴＴ　Ｇ＠ＡＡＴＡＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＣＡＡＴ　ＧＡＡＡＣＴＴＴＡＴ　Ａ ＡＡＣ届ＴＧＧＴ　ＴＣＡＡ丁ＴＡＡＴＴＳｅｒ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ｆ ｉｌｕ　ＩＩ＠　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　 Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｖａ煤@Ｖａｔ　Ｇｉｎ　ＩＩｓ　Ｖａｔ ｚ７ａ　ｚｓ。

Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｑｌｙ　Ｆｈ＠　Ｐｈ＠　Ｓ＠ｔ　Ａｓａ　＾ｌａ　ｌｉ＠　 Ｖａｌ　（ｉｌｕ　（ｉｌｙ　＾ｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐ■■@Ｐｒｏ　Ａｓ ａ　丁ｈｒＧ１ｕ Ｐｈ＊　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓεｌｙ　Ｌ＠ｕ　Ｈｌｓ　Ｐｈ＊　Ｓ ＠ｒ　Ｃ１ｒ＋　＠ｌｕ＾ｓｐ　４１ａ　Ｐｒｏ＾ｓｐ　ＧPｓ＋　１１６６１ ｙ　ＬｙＳ ｊ　目　ご　ヨ　：　コ　ご ２　５　Ｅ　Ｂ、日　ヨ　Ｉ 目　目　！２　２　Ｅｉ；　ｄ　！　！匪　！　ｉ　！　５　目　ミ 共　ｉｉｉ！！ｍ　目　■ を　目　！ｆｆＭ！ｉ：ａ 連　■　日　葺　ヨ　Ｉ ヨ　肩　■　目　ヨ　■ 舊　１　ミ　ョ　目　２　■ １９９　ｉ　躇　Ｈ目　ヨ 目　２　：　足　ヨ　ジ　「　ｉ ２　ジ　目　ｉ　デ　９　＝　シ ミ　鷲　ジ　目　裂　鵬　２　目 目　ｊ　コ　ミ　コ　嚢　コ　ヨ ｄ　ヨ　ラ　２　ミ　に　残　罠 ロ　＝　ヨ　ゴ　＝　さ　＝　ヨ ー　υ　ロ　＞ｎｈ　ｕ　Ｃ２ ４）　１ｉＬｔ１４＄Ｐ−ＩＬＥ−ＩＬｌｌ−Ｌ［０−１１１−ＬＶＳ−＄１ｌ −１ｉＬｔｌＣ３２縮合）　５ｃｃｃｃ 幽 ＦＩＧ、　４ ｐＴＺＲＬｕｃ−１ １ａｃＺ’ＲｆＳＳ　１ｉｃＺ’開始コＦンｌａｃ　Ｚ”枠内停止コドン ＾ＡＡ１３ｍＡＴ１３ＡＴＣＣＡ６ＡＡＩｎｓ−リポソーム結合部位 ＦＩＧ、７ １０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８中のｐＴＺＲＬｕｃ−１細胞遠心４８　ｘ　ｇ、３ Ｑ分 ＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００５ｅｐｈａｄｅｘ 安息香酸５ｅｐｈａｄｅｘ　１ 安息香ｒａＳｅｐｈａｄｅｘ　２ 純粋な組み換えルシフェラーゼ Ｆ　工　（，８ 国際調査報告 、　、、、、、、、、、、、、、、、　、、、Ｈ，、、、、、、、、、、＋ＩＰ ＣＴ、′Ｌ’Ｓ９１　／　０１６昆１−１１＋−−−−ＪＩ　Ａ−幹■−１−− Ｉ１．　ＰＣＴ／じ５９１ｚＯ＋６１５フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：１９） Ｉ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．レニラルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡ又は ＲＮＡ分子。
2. ２．該分子がルシフェラーゼコード配列：【配列があります】 を含む、請求の範囲１に記載の分子又は同等ＤＮＡあるいはＲＮＡ配列。
3. ３．該分子がＤＮＡである、請求の範囲２に記載の分子。
4. ４．該分子が該ルシフェラーゼ配列を含む、請求の範囲３に記載の分子。
5. ５．該分子がＲＮＡであり、該ルシフェラーゼ配列と同等の配列を含む、請求の 範囲２に記載の分子。
6. ６．該配列の前に機能的プロモーター配列５′がある、請求の範囲１に記載の分 子。
7. ７．該配列の少なくとも１個のコピーが組み替えＤＮＡ又はＲＮＡベクター中に 存在する、請求の範囲６に記載の分子。
8. ８．請求の範囲７に記載のベクターを含む、遺伝的操作された微生物。
9. ９．該微生物がＥ．ｃｏｌｉ株である、請求の範囲８に記載の微生物。
10. １０．ヌクレオチド配列： 【配列があります】 相補的ＤＮＡ配列、及び同等又は相補的ＲＮＡ配列から選ばれる少なくとも１０ 個の連続したヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド。
11. １１．該オリゴヌクレオチドが検出可能なタグで標識されている、請求の範囲１ ０に記載のオリゴヌクレオチド。
12. １２．該オリゴヌクレオチドが少なくとも１４個の連続したヌクレオチドを含む 、請求の範囲１０に記載のオリゴヌクレオチド。
13. １３．腔腸動物から遺伝物質を単離して遺伝物質の試料を形成し、該試料をハイ ブリッド形成条件下で請求の範囲１０に記載のオリゴヌクレオチドと接触させ、 該オリゴヌクレオチド及び該試料中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡを含む二重らせ んの形成を検出する段階を含む、腔腸動物ルシフェラーゼ遺伝子をコードする遺 伝物質の同定法。
14. １４．該方法がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求の範囲１３に記載の方法。
15. １５．請求の範囲１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる遺伝的操作さ れたペプチド。
16. １６．該ペプチドが非−グリコシル化である、請求の範囲１５に記載のペプチド 。
17. １７．図３のアミノ酸配列、又は少なくとも５個の連続したアミノ酸残基を含み 、レニラルシフェラーゼと特異的に結合する抗体と免疫学的に反応性である該配 列のフラグメントを含み、他のレニラペプチドを含まないペプチド。