JPH10150991A - ルシフェラーゼ−リゾスタフィン融合タンパク質、その製造法及びそれを用いた生物発光分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】（１）ルシフェラーゼと、リゾスタフィン
とを連結してなることを特徴とするルシフェラーゼ−リ
ゾスタフィン融合タンパク質。（２）該融合タンパク質
をコードする融合遺伝子。（３）該融合遺伝子をベクタ
ーＤＮＡに挿入してなることを特徴とする新規な組み換
え体ＤＮＡ。（４）エッシェリシア属に属し、該組み換
え体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、培養物よ
り融合タンパク質を採取することを特徴とする該融合タ
ンパク質の製造法。（５）該融合タンパク質を用いるこ
とを特徴とする生物発光分析法。 【効果】本発明によれば、ルシフェラーゼ−リゾスタフ
ィン融合タンパク質を効率よく生産することができる。
該融合タンパク質は、生物発光分析法、特に黄色ブドウ
球菌の検出法に好適に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ルシフェラーゼ−
リゾスタフィン融合タンパク質、その製造法及びそれを
用いた生物発光分析法に関する。

【０００２】

【従来の技術】黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureu
s、S.aureus）は、ヒトや動物に種々の疾患を惹起する
病原性細菌の一種である。黄色ブドウ球菌が食物を汚染
し、そこで増殖すると、菌体外毒素（エンテロトキシ
ン）が産生される。エンテロトキシンを含有する食物を
摂取すると、2〜6時間後に急性胃腸炎の症状が現れ、そ
の後、嘔吐、腹痛、下痢を起こす。重症の場合には微熱
を伴い、血圧の低下、胸内苦悶、意識混濁、脈拍数の減
少などの著明な中毒症状を起こし、緊急入院を必要とす
る場合もある。又、黄色ブドウ球菌の一種であるMRSA
（メシチリン耐性黄色ブドウ球菌）は、大きな社会問題
となっている病院内感染症の原因菌である。

【０００３】黄色ブドウ球菌は、食品衛生上及び医学
上、ヒトと深く関わっているため、これを、簡単で迅速
且つ高精度に検出する方法の確立が求められている。黄
色ブドウ球菌の検出法は、これまで、選択分離培地を用
いる培養法が中心であった。培養法でば、まず、マンニ
ット食塩培地等を用いて48時間の前培養を行う。次い
で、24時間の純培養を行って菌を鑑別し、更にウサギプ
ラズマ、PSラテックスを用いて菌の同定作業を行ってい
る（食品衛生検査指針、微生物編）。培養法において
は、選択分離培地の保存性及び培地作製の煩雑さが問題
となっており、また、培養に多くの時間がかかる点も問
題となっている。

【０００４】培養以外の検出法としては、黄色ブドウ球
菌に特異的なリボゾームRNA遺伝子に対するDNAプローブ
を用いる方法（特開平5−49477号公報）が知られてい
る。この方法は、煩雑なDNA抽出操作を必要とするため
に、日常検査法として適当ではなく、且つ培養法と比べ
てコストが高いという点が問題となっていた。上記以外
の検出法として、黄色ブドウ球菌全菌体、菌体表面のテ
イコ酸、莢膜、プロテインＡ、黄色ブドウ球菌が産生す
るサーモヌクレアーゼ或いはエンテロトキシンに対する
抗体を利用した酵素免疫測定法（Enzyme-linked immuno
sorbent assay、ELISA法）を用いる方法〔Acta path. m
icrobiol. scand. Sect. B, 95: 115-120, 1987、Journ
al of Clinical Microbiology, May 1989, 989-993、Jo
urnal of Immunological Methods, 149(1992) 21-27、A
rchiv fur Lebensmittelhygiene, 35, 97（1984）、特
開平6−88824号公報〕が知られている。しかしながら、
通常ELISA法では多段階の煩雑な操作が必要であり、ELI
SA法に好適な抗体を安定的に得るのは困難である。

【０００５】ところで、リゾスタフィンは、Staphyloco
ccus simulans (NRRL B-2628)が分泌する亜鉛プロテア
ーゼである。リゾスタフィンは、黄色ブドウ球菌または
その同属菌の細胞壁ペプチドグリカンのグリコペプチド
鎖中のグリシルグリシン結合を加水分解することによ
り、これらの菌を溶菌する（H. P. Browder et al., Bi
ochem. Biophys. Res. Comm., 19, 383, (1965), J. L.
Strominger and J.-M.,Ghuysen, Science, 156, 213
(1967), H. R. Trayer and C. E. Buckley III,J. Bio
l. Chem., 245, 4842 (1970)）。最近、リゾスタフィン
のC末端アミノ酸92残基よりなる領域が、黄色ブドウ球
菌又は同属の細菌の細胞壁に強い親和性を持つとの知見
が発表された（T.Baba and O.Schneewind,The EMBO jou
rnal,15,18,4789-4797(1996)）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ルシ
フェラーゼ−リゾスタフィン融合タンパク質及びそれを
用いた生物発光分析法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ルシフェラーゼ
とリゾスタフィンとを遺伝子レベルで直鎖状に連結し、
単一な融合タンパク質として発現させることに成功し
た。さらに本発明者らは、該融合タンパク質が、生物発
光分析法、特に黄色ブドウ球菌の検出法に好適に用いら
れることを見いだし、本発明を完成した。

【０００８】すなわち本発明は、 （１）ルシフェラーゼからなるペプチド部分と、リゾス
タフィンからなるペプチド部分とを連結してなることを
特徴とするルシフェラーゼ−リゾスタフィン融合タンパ
ク質。 （２）ルシフェラーゼをコードする遺伝子と、リゾスタ
フィンをコードする遺伝子とを連結してなることを特徴
とするルシフェラーゼ−リゾスタフィン融合遺伝子。 （３）リゾスタフィンをコードする遺伝子が、実質的に
配列番号３記載のアミノ酸配列をコードすることを特徴
とする（２）記載の融合遺伝子。 （４）実質的に配列番号２記載のアミノ酸配列をコード
するルシフェラーゼ−リゾスタフィン融合遺伝子。

【０００９】（５）上記（２）（３）又は（４）記載の
融合遺伝子をベクターＤＮＡに挿入してなることを特徴
とする新規な組み換え体ＤＮＡ。 （６）エッシェリシア属に属し、請求項５記載の組み換
え体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、培養物よ
りルシフェラーゼ−リゾスタフィン融合タンパク質を採
取することを特徴とするルシフェラーゼ−リゾスタフィ
ン融合タンパク質の製造法。 （７）ルシフェラーゼ−リゾスタフィン融合タンパク質
を用いることを特徴とする生物発光分析法。 （８）生物発光分析法が、黄色ブドウ球菌の検出法であ
る請求項７記載の生物発光分析法。に関する。

【００１０】本発明でいう「実質的に」とは、リゾスタ
フィン活性及びルシフェラーゼ活性を有する限り、上記
の融合タンパク質のアミノ酸配列において、１個以上の
アミノ酸が欠失、置換、付加もしくは重合されていても
よいことを意味する。尚、リゾスタフィン活性とは、黄
色ブドウ球菌との結合活性を意味し、また、ルシフェラ
ーゼ活性とは発光反応の触媒活性を意味する。以下、本
発明について詳細に説明する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のルシフェラーゼ−リゾス
タフィン融合タンパク質（以下、単に「融合タンパク
質」という）は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子
（以下「ルシフェラーゼ遺伝子」という）と、リゾスタ
フィンをコードする遺伝子（以下「リゾスタフィン遺伝
子」という）とを連結して融合遺伝子を調製し、これを
発現させることによって生産することができる。

【００１２】１．リゾスタフィン遺伝子の調製法 本発明の融合タンパク質において、リゾスタフィンから
なる部分は、黄色ブドウ球菌との結合活性を有する部分
である。本発明のリゾスタフィンは、天然型のアミノ酸
配列を有するもの（P.A.Recsei et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA,84, 1127 (1987))であってもよく、又、
黄色ブドウ球菌との結合活性を失うことのない範囲で、
１個以上のアミノ酸が、付加、欠失、置換もしくは重合
されている変異型であってもよい。変異型リゾスタフィ
ンの一例を実施例に示した。

【００１３】リゾスタフィン遺伝子は、例えば、通常の
遺伝子クローニング法〔J. Sambrook et al., Molecula
r Cloning A Laboratory Manual (1989) Cold Spring H
arbor Laboratory Press〕により得ることができる。ま
た、該遺伝子は、Staphylococcus simulans (NRRL B-26
28)等を由来とする総DNAを鋳型とし、リゾスタフィン遺
伝子の塩基配列(P.A.Recsei et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 84, 1127(1987))を基にして合成したオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ鎖反
応（ＰＣＲ）により取得することができる。ＰＣＲを用
いることにより、天然型リゾスタフィン遺伝子の全長或
いはその一部を調製することができる。総DNAの調製
は、Hoffman等の方法（Gene, 57, 267 (1987)）により
実施されうる。また、該遺伝子は、DNA合成機を用いた
化学合成により得ることもできる。

【００１４】変異型リゾスタフィン遺伝子は、天然型リ
ゾスタフィン遺伝子に変異を導入することにより得られ
る。遺伝子に変異を導入する方法としては、野生型遺伝
子と変異原となる薬剤（例えば、ヒドロキシルアミン、
亜硝酸、亜硫酸、５−ブロモウラシル等）とを接触させ
る方法を挙げることができる。この他、紫外線照射法、
カセット変異法、ＰＣＲ法を用いた部位特異的変異導入
法等の方法を広く用いることができる。更には、化学合
成したＤＮＡをアニーリングして所望の部位に変異を有
する変異型遺伝子を構築することも可能である。

【００１５】２．ルシフェラーゼ遺伝子の調製 本発明のルシフェラーゼとしては、例えば、ルシオラ・
クルシアタ（Luciolacruciata）、ルシオラ・ラテラリ
ス（Luciola lateralis）〔何れもN. Kajiyamaet al.,
Biochim. Biophys. Acta, 1120, 228 ,1992〕、ルシオ
ラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）〔N. Yu. Phi
lippova and N. N. Ugarova, Biokhimiya, 44, 1508,19
79〕、フォティナス・ピラリス〔M. DeLuca and W. D.
McElroy,Meth. Enzymol., 72, 3,1978〕等のホタル由来
のルシフェラーゼが挙げられる。また、ホタルルシフェ
ラーゼと相同性があり、同じ反応を触媒するクリックビ
ートル（Elateridae）由来のルシフェラーゼも挙げられ
る（K.V.Wood et al.,Science,244,700,1989）。本発明
のルシフェラーゼのアミノ酸配列は、天然型であっても
よく、又、ルシフェラーゼ活性を失うことのない範囲
で、１個以上のアミノ酸が、付加、欠失、置換もしくは
重合されている変異型であってもよい。天然型ルシフェ
ラーゼ遺伝子は、通常の遺伝子クローニング法、又は、
アミノ酸配列が既知の場合は、ＰＣＲ法により得ること
ができる。また、変異型ルシフェラーゼ遺伝子は、前述
の変異導入法により得ることができる。変異型ルシフェ
ラーゼとしては、例えば、特開平5-244942号公報記載の
耐熱性変異型ホタルルシフェラーゼが挙げられる。この
変異型ホタルルシフェラーゼは、ヘイケボタル（Luciol
a lateralis）を由来とする天然型ホタルルシフェラー
ゼのＮ末端から217番目のAlaが、Leuに置換されてい
る。

【００１６】３．融合遺伝子の調製 融合遺伝子は、リゾスタフィン遺伝子とルシフェラーゼ
遺伝子とを、オープンリーディングフレームをそろえて
連結することにより得られる。遺伝子の連結は、通常の
方法（J. Sambrook et al., Molecular Cloning A Labo
ratory Manual(1989) Cold Harbor Laboratory Press)
を用いればよい。本発明の融合タンパク質において、リ
ゾスタフィンとルシフェラーゼの一次配列上の配置は、
両者の活性を損なわない限り、如何なるものでもよい。
すなわち、いずれをＮ末端に配置してもよく、又、一方
を他方の配列内に配置してもよい。更に、リゾスタフィ
ン及び／又はルシフェラーゼを、融合タンパク質１分子
中に複数個配置してもよい 又、両者の間にリンカーペ
プチド、例えば(Gly₂)〔I.Pasten et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1988)〕、(Gly₄Ser)₃〔J. S. Huston
et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA (1988)〕、Ser S
er Ala(Asp Asp Ala Lys Lys)₄ Asp Gly 〔M.W. Pantol
iano et al., Biochemistry, 30, 10117,1991〕等を配
置してもよい。具体的な方法を、実施例に記載した。

【００１７】４．融合タンパク質の生産能を有する組み
換え生物の調製 融合遺伝子を、通常の方法により、プロモーター配列、
マーカー遺伝子、複製起点を有するベクターに連結し、
適当な宿主細胞を形質転換又は形質導入することによ
り、本発明の融合タンパク質の生産能を有する組み換え
生物を得ることができる。宿主細胞としては、真核細胞
及び原核細胞のいずれをも使用できる。真核細胞として
は動物、植物、昆虫、酵母等の細胞が、原核細胞として
は大腸菌、枯草菌、放線菌等が挙げられる。動物細胞と
しては、CHO 、COS、HeLa細胞及びミエローマ細胞系統
の細胞が、原核細胞としては、エッシェリシア属に属す
る微生物、例えば大腸菌XL1-Blue（Stratagene社製）JM
109（宝酒造社製）、HB101(ATCC33694)等が使用でき
る。

【００１８】融合遺伝子を挿入するためのベクターＤＮ
Ａは、宿主細胞で複製可能なものであれば如何なるもの
でもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファ
ージＤＮＡ等が挙げられる。宿主細胞が大腸菌である場
合のベクターＤＮＡとしては、プラスミドpUC119（宝酒
造社製）、pBluescript SK+(Stratagene社製)、pMAL-C2
（NEW England Labs社製）、pGEX-5X-1（ファルマシア
社製）、pXa1（ベーリンガー社製）等が使用できる。本
発明においては、形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの
方法（Meth. Enzymol.,68,326-331,1979）等により、形
質導入は、例えば、B.Hohnの方法（Meth. Enzymol.,68,
299-309,1979）等により行うことができる。組み換え生
物より組み換え体ＤＮＡを精製する方法としては、例え
ば、P.Guerryの方法（J.Bacteriology,116,1064-1066,1
973）、D.B.Clewellの方法（J.Bacteriology,110,667-6
76,1972）等を用いることができる。又、組み換え体Ｄ
ＮＡに挿入された遺伝子の塩基配列の決定は、例えば、
Maxam-Gilbert 法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74,56
0-564,1977）、Dideoxy法（Proc. Natl. Acad. Sci.US
A,74,5463-5467,1977）等により行うことができる。

【００１９】５．融合タンパク質の生産 上記の方法により得られた組み換え生物を培地中で培養
することにより、本発明の融合タンパク質を生産するこ
とができる。宿主細胞が大腸菌である場合、組み換え大
腸菌を固体培養法で培養してもよいが、液体培養法によ
り培養するのが好ましい。培地としては、例えば、酵母
エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンステ
ィープリカーあるいは大豆もしくは小麦ふすま浸出液等
の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸１カリ
ウム、リン酸２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄、あるいは硫酸マン
ガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により
糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられ
る。なお、培地の初発 pH は、pH 7〜9に調製するのが
適当である。また培養は、25〜40℃、好ましくは30℃前
後で、3〜24時間、好ましくは5〜8時間、通気攪拌深部
培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ま
しい。

【００２０】６．融合タンパク質の採取 組み換え生物の培養終了後、培養物より融合タンパク質
を採取するには、通常の酵素採取手段を用いることがで
きる。組み換え生物が組み換え大腸菌である場合は、培
養物を遠心分離して菌体を得た後、リゾチーム等の酵素
を用いた溶菌処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により
菌体を破壊し、融合タンパク質を菌体外に排出させる。
次いで、ろ過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去する
ことにより、融合タンパク質を含有する粗酵素液を得る
ことができる。本発明では、上記の粗酵素液をそのまま
融合タンパク質標品としてもよいが、通常のタンパク質
精製法を用いて、更に純度を高めてもよい。具体的に
は、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマト
グラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマ
トグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、電気泳動法等を、単独又は適宜
組み合わせて用いることができる。融合タンパク質標品
中のルシフェラーゼ活性は、T.Masuda等の方法(Gene, 7
7,265 (1989))により測定することができる。

【００２１】７．融合タンパク質を用いた生物発光分析
法 このようにして得られた融合タンパク質は、生物発光分
析法、特に、黄色ブドウ球菌の検出法に利用できる。黄
色ブドウ球菌の検出は、例えば、以下のように実施され
る。先ず、黄色ブドウ球菌を含む可能性のある試料を、
固相に直接、又は黄色ブドウ球菌との結合活性を有する
分子を介して結合させる。そのような分子としては、抗
黄色ブドウ球菌抗体（マウスモノクロナール抗体や兎ポ
リクロナール抗体等いかなる種類の抗体でも可）、黄色
ブドウ球菌のもつ種々のアドヘシン（フィブロネクチン
やフィブリノーゲン等に対するレセプター、テイコ酸、
プロテインＡ等）等が挙げられる。次いで、非吸着の試
料を除去した後、融合タンパク質を添加して固相上の黄
色ブドウ球菌と反応させる。非吸着の融合タンパク質を
除去した後、ルシフェリンを含むルシフェラーゼの基質
溶液を添加する。反応液の発光を測定することにより、
試料中の黄色ブドウ球菌を検出することができる。

【００２２】

【実施例】以下に、実施例によって本発明を更に詳細に
説明する。 １．リゾスタフィン遺伝子の調製 リゾスタフィン遺伝子として、Staphylococcus simulan
s由来のリゾスタフィンのC末端アミノ酸９１残基よりな
る領域をコードする遺伝子（以下「LST-C遺伝子」とい
う）を調製した。まず、Staphylococcus simulans(NRRL
B-2628)をBHI培地(DIFCO社製)にて37℃、120 rpmで14
時間振とう培養した。遠心分離により菌体を取得した
後、Hoffman等の方法により、総DNAを取得した。公知の
リゾスタフィン遺伝子の塩基配列(Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A., 84, 1127 (1987))を参考に、5'側プライマ
ーとしてSLF135(ACGCCGAATACAGGATCCAAAACAAACAAA：配
列 番号４）を、３'側プライマーとしてSLF136(AATTATC
ATATAAGTTTAGGATCCACTAGTTCACTTTATAGTTCCCCA：配列番
号５)を合成した。ＤＮＡ合成には、DNA Model392シン
セサイザー(Perkin Elmer社製)を用いた。なお、それぞ
れのプライマーの内部には後のサブクローニングのた
め、制限酵素BamHI部位（下線部）を導入した。SLF135
とSLF136各1 pmol、総DNA 0.1 μg及びKOD DNAポリメラ
ーゼ(TOYOBO社製)を混合した後、DNA Thermal Cycler
(Perkin Elmer社製)を用いてＰＣＲを行い、LST-C遺伝
子を増幅した。

【００２３】２．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の調製 ルシフェラーゼ遺伝子として、耐熱性変異型ヘイケボタ
ルルシフェラーゼ遺伝子(特開平5-244942号公報記載）
を調製した。まず、プラスミドpHLf7-217Leu(特開平5-2
44942号公報記載）の一本鎖DNAを、ヘルパーファージM1
3 KO7(宝酒造社製)を用いて調製した。該プラスミドに
は、217番目のAlaがLeuに置換された耐熱性変異型ヘイ
ケボタルルシフェラーゼ遺伝子が挿入されている。オリ
ゴヌクレオチドSLF15(AGGAATAAAGAACTCTTCACAGTT：配列
番号６)とオリゴヌクレオチド―ダイレクティドインビ
トロミュータジェネシスシステムバージョン２(Amersha
m社製)を用いて、pHLf7-217Leuに挿入されたルシフェラ
ーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列は変えずに、ルシ
フェラーゼ遺伝子の5'末付近に存在するEcoRI部位を除
去した。得られたプラスミドをpHLf107 と命名した。

【００２４】次に、オリゴヌクレオチドSLF81(TGATTGAC
ATGGATCCCTTAGCAACT：配列番号７、下線部は制限酵素Ba
mHI部位)とオリゴヌクレオチド―ダイレクティドインビ
トロミュータジェネシスシステムバージョン２(Amersha
m社製)を用いて、プラスミドpHLf107のルシフェラーゼ
遺伝子の3'末付近に、BamHI部位を導入した。得られた
プラスミドをpHLf142 と命名した。

【００２５】３．融合タンパク質を発現する組み換え体
プラスミドpHLf273の調製 プラスミドpHLf142 を制限酵素BamHI及びEcoRIで切断し
た後、アガロースゲル電気泳動に供した。ゲル中のルシ
フェラーゼ遺伝子断片を、gene clean II kit(BIO101社
製)を用いて調製した。この断片を、予めBamHIとEcoRI
で切断したプラスミドpUC118 DNA(宝酒造社製)と連結
し、得られたプラスミドをpHLf230と命名した。上述のL
ST-C遺伝子断片をBamHIで切断後、pHLf230のBamHI部位
に挿入し、組み換え体プラスミドpHLf273を得た。pHLf2
73は、ラクトースプロモーター支配下で、本発明の融合
タンパク質を発現する。プラスミドpHLf273の構築図を
図１に示した。なお、図中の略語の意味は以下の通りで
ある。 ＬＩＬ：耐熱性変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子 Ａｐ：β−ラクタマーゼ遺伝子 ｌａｃＰ：ｌａｃＺプロモーター Ｅ：ＥｃｏＲＩ Ｂ：ＢａｍＨＩ

【００２６】４．組み換え大腸菌TG1[pHLf273]の調製 pHLf273を用いて大腸菌TG1(Amersham社製)を形質転換
し、得られた形質転換株を大腸菌TG1[pHLf273]と命名し
た。大腸菌TG1[pHLf273]は、工業技術院生命工学工業技
術研究所に、FERM P-15891として寄託されている。プラ
スミドpHLf273に挿入された融合遺伝子の塩基配列を配
列番号１に、該遺伝子がコードする融合タンパク質のア
ミノ酸配列を配列番号２に示した。配列番号２記載のア
ミノ酸配列において、アミノ酸番号１−５４７番はホタ
ルルシフェラーゼであり、アミノ酸番号５４８−５４９
番はリンカーペプチドである。また、アミノ酸番号５５
０−６４０番はリゾスタフィンである。リゾスタフィン
のアミノ酸配列を、配列番号３に示した。

【００２７】５．融合タンパク質の生産 組み換え大腸菌JM101[pHLf273]を、0.2 mMのイソプロピ
ル-β-チオガラクトサイド(IPTG)と50 μg/mlのアンピ
シリンを含むLB培地(1% バクトトリプトン、0.5% 酵母
エキス、0.5% 塩化ナトリウム) 2 mlにて、30℃、120rp
mで5時間振とう培養した。培養液を5,000 rpmで5分間遠
心分離して菌体を得た。該菌体を超音波処理により破砕
した後、1,200 rpmで5分間遠心分離して不溶物除去し、
粗酵素液を得た。粗酵素液がルシフェラーゼ活性を有す
ることを、T.Masuda等の方法(Gene,77, 265 (1989))に
より確認した。

【００２８】６．融合タンパク質を用いた黄色ブドウ球
菌の検出法 上記の粗酵素液を用いて黄色ブドウ球菌の検出を行っ
た。なお検定菌として、下記の６菌株を用いた。 （１）黄色ブドウ球菌〔Staphylococcus aureus Wood46
株（ATCC10832）、Staphylococcus aureus CowanI株（A
TCC12598）〕 （２）黄色ブドウ球菌以外の菌株〔Staphylococcus epi
dermidis T6株（ATCC14990）、Staphylococcus capiti
s T13株（ATCC27840）、Micrococcus sp. DY12株（東京
都衛生研究所より分与）、Salmonella typhimurium TA-
100株（IFO1494）〕 上記の検定菌を、それぞれ5 mlのBHI培地で37℃、20時
間静置培養した。15分間煮沸殺菌後、3000 rpm、20分間
の遠心分離により集菌し、湿重量で0.5 mg/mlになるよ
うに0.5 M 炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)に再懸濁し
た。

【００２９】菌懸濁液をポリスチレンチューブに100 μ
lずつ移し、37℃で2時間振とうして吸着させた。TBS-T
（20 mM Tris-HCl, pH7.5、0.5 M NaCl、0.05% Tween2
0）で各チューブを4回ずつ洗浄した後、4倍希釈したブ
ロックエース溶液（大日本製薬社製）300 μlずつ加え3
7℃で2時間振とうし、ブロッキングを行った。TBS-Tで4
回洗浄した後、各チューブにルシフェラーゼ希釈液（1%
BSA、1 mM EDTA、1 mMβ-メルカプトエタノール、50 m
M HEPES, pH7.5 ）で20倍に希釈した粗酵素液を100 μl
ずつ加え、室温で30分振とうした。T-TBSで同様に洗浄
した後、ピッカジーン（東洋インキ社製）を基質として
100 μlずつ加え、ルミテスターK-200（キッコーマン社
製）を用いて発光量（ＲＬＵ）を測定した。結果を表１
に示す。

【００３０】

【００３１】表１から明らかな通り、２株の黄色ブドウ
球菌においてのみ強い発光が得られた。本発明の融合タ
ンパク質が、黄色ブドウ球菌の特異的検出に好適に使用
され得ることが示された。

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、ルシフェラーゼ-リゾ
スタフィン融合タンパク質を効率よく生産することがで
きる。該融合タンパク質は、生物発光分析法、特に黄色
ブドウ球菌の検出法に好適に用いることができる。

【００３３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の数：１９２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA

【００３４】 配列： ATG GAA AAC ATG GAG AAC GAT GAA AAT ATT GTG TAT GGT CCT GAA CCA 48 TTT TAC CCT ATT GAA GAG GGA TCT GCT GGA GCA CAA TTG CGC AAG TAT 96 ATG GAT CGA TAT GCA AAA CTT GGA GCA ATT GCT TTT ACT AAC GCA CTT 144 ACC GGT GTC GAT TAT ACG TAC GCC GAA TAC TTA GAA AAA TCA TGC TGT 192 CTA GGA GAG GCT TTA AAG AAT TAT GGT TTG GTT GTT GAT GGA AGA ATT 240 GCG TTA TGC AGT GAA AAC TGT GAA GAG TTC TTT ATT CCT GTA TTA GCC 288 GGT TTA TTT ATA GGT GTC GGT GTG GCT CCA ACT AAT GAG ATT TAC ACT 336 CTA CGT GAA TTG GTT CAC AGT TTA GGC ATC TCT AAG CCA ACA ATT GTA 384 TTT AGT TCT AAA AAA GGA TTA GAT AAA GTT ATA ACT GTA CAA AAA ACG 432 GTA ACT GCT ATT AAA ACC ATT GTT ATA TTG GAC AGC AAA GTG GAT TAT 480 AGA GGT TAT CAA TCC ATG GAC AAC TTT ATT AAA AAA AAC ACT CCA CAA 528 GGT TTC AAA GGA TCA AGT TTT AAA ACT GTA GAA GTT AAC CGC AAA GAA 576 CAA GTT GCT CTT ATA ATG AAC TCT TCG GGT TCA ACC GGT TTG CCA AAA 624 GGT GTG CAA CTT ACT CAT GAA AAT TTG GTC ACG CGT TTT TCT CAC GCT 672 AGA GAT CCA ATT TAT GGA AAC CAA GTT TCA CCA GGC ACG GCT ATT TTA 720 ACT GTA GTA CCA TTC CAT CAT GGT TTT GGT ATG TTT ACT ACT TTA GGC 768 TAT CTA ACT TGT GGT TTT CGT ATT GTC ATG TTA ACG AAA TTT GAC GAA 816 GAG ACT TTT TTA AAA ACA CTG CAA GAT TAC AAA TGT TCA AGC GTT ATT 864 CTT GTA CCG ACT TTG TTT GCA ATT CTT AAT AGA AGT GAA TTA CTC GAT 912 AAA TAT GAT TTA TCA AAT TTA GTT GAA ATT GCA TCT GGC GGA GCA CCT 960 TTA TCT AAA GAA ATT GGT GAA GCT GTT GCT AGA CGT TTT AAT TTA CCG 1008 GGT GTT CGT CAA GGC TAT GGT TTA ACA GAA ACA ACC TCT GCA ATT ATT 1056 ATC ACA CCG GAA GGC GAT GAT AAA CCA GGT GCT TCT GGC AAA GTT GTG 1104 CCA TTA TTT AAA GCA AAA GTT ATC GAT CTT GAT ACT AAA AAA ACT TTG 1152 GGC CCG AAC AGA CGT GGA GAA GTT TGT GTA AAG GGT CCT ATG CTT ATG 1200 AAA GGT TAT GTA GAT AAT CCA GAA GCA ACA AGA GAA ATC ATA GAT GAA 1248 GAA GGT TGG TTG CAC ACA GGA GAT ATT GGG TAT TAC GAT GAA GAA AAA 1296 CAT TTC TTT ATC GTG GAT CGT TTG AAG TCT TTA ATC AAA TAC AAA GGA 1344 TAT CAA GTA CCA CCT GCT GAA TTA GAA TCT GTT CTT TTG CAA CAT CCA 1392 AAT ATT TTT GAT GCC GGC GTT GCT GGC GTT CCA GAT CCT ATA GCT GGT 1440 GAG CTT CCG GGA GCT GTT GTT GTA CTT GAA AAA GGA AAA TCT ATG ACT 1488 GAA AAA GAA GTA ATG GAT TAC GTT GCT AGT CAA GTT TCA AAT GCA AAA 1536 CGT TTG CGT GGT GGT GTC CGT TTT GTG GAC GAA GTA CCT AAA GGT CTC 1584 ACT GGT AAA ATT GAC GGT AAA GCA ATT AGA GAA ATA CTG AAG AAA CCA 1632 GTT GCT AAG GGA TCC AAA ACA AAC AAA TAT GGC ACA CTA TAT AAA TCA 1680 GAG TCA GCT AGC TTC ACA CCT AAT ACA GAT ATA ATA ACA AGA ACG ACT 1728 GGT CCA TTT AGA AGC ATG CCG CAG TCA GGA GTC TTA AAA GCA GGT CAA 1776 ACA ATT CAT TAT GAT GAA GTG ATG AAA CAA GAC GGT CAT GTT TGG GTA 1824 GGT TAT ACA GGT AAC AGT GGC CAA CGT ATT TAC TTG CCT GTA AGA ACA 1872 TGG AAT AAA TCT ACT AAT ACT TTA GGT GTT CTT TGG GGA ACT ATA AAG 1920

【００３５】配列番号２ 配列の数：６４０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質

【００３６】 配列： Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Tyr Gly Pro Glu Pro 1 5 10 15 Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln Leu Arg Lys Tyr 20 25 30 Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Leu 35 40 45 Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys 50 55 60 Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile 65 70 75 80 Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Leu Ala 85 90 95 Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr 100 105 110 Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val 115 120 125 Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr 130 135 140 Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr 145 150 155 160 Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys Asn Thr Pro Gln 165 170 175 Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asn Arg Lys Glu 180 185 190 Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys 195 200 205 Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Leu Val Thr Arg Phe Ser His Ala 210 215 220 Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Ile Leu 225 230 235 240 Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly 245 250 255 Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu 260 265 270 Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Ser Ser Val Ile 275 280 285 Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Glu Leu Leu Asp 290 295 300 Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro 305 310 315 320 Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro 325 330 335 Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile 340 345 350 Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val 355 360 365 Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Thr Leu 370 375 380 Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met 385 390 395 400 Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu Ile Ile Asp Glu 405 410 415 Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys 420 425 430 His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly 435 440 445 Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro 450 455 460 Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Ile Ala Gly 465 470 475 480 Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Glu Lys Gly Lys Ser Met Thr 485 490 495 Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys 500 505 510 Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu 515 520 525 Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro 530 535 540 Val Ala Lys Gly Ser Lys Thr Asn Lys Tyr Gly Thr Leu Tyr Lys Ser 545 550 555 560 Glu Ser Ala Ser Phe Thr Pro Asn Thr Asp Ile Ile Thr Arg Thr Thr 565 570 575 Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly Val Leu Lys Ala Gly Gln 580 585 590 Thr Ile His Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln Asp Gly His Val Trp Val 595 600 605 Gly Tyr Thr Gly Asn Ser Gly Gln Arg Ile Tyr Leu Pro Val Arg Thr 610 615 620 Trp Asn Lys Ser Thr Asn Thr Leu Gly Val Leu Trp Gly Thr Ile Lys 625 630 635 640

【００３７】配列番号３ 配列の数：９１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Staphylococcus simulans 株名：NRRL B-2628

【００３８】 配列： Lys Thr Asn Lys Tyr Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser Phe 1 5 10 15 Thr Pro Asn Thr Asp Ile Ile Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe Arg Ser 20 25 30 Met Pro Gln Ser Gly Val Leu Lys Ala Gly Gln Thr Ile His Tyr Asp 35 40 45 Glu Val Met Lys Gln Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr Thr Gly Asn 50 55 60 Ser Gly Gln Arg Ile Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys Ser Thr 65 70 75 80 Asn Thr Leu Gly Val Leu Trp Gly Thr Ile Lys 85 90

【００３９】配列番号４ 配列の数：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ

【００４０】配列： ACGCCGAATA CAGGATCCAA AACAAACAAA 30

【００４１】配列番号５ 配列の数：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ

【００４２】 配列： AATTATCATA TAAGTTTAGG ATCCACTAGT TCACTTTATA GTTCCCCA 48

【００４３】配列番号６ 配列の数：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： AGGAATAAAG AACTCTTCAC AGTT 34

【００４４】配列番号７ 配列の数：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TGATTGACAT GGATCCCTTA GCAACT 36

【図面の簡単な説明】

【図１】 組み換え体プラスミドpHLf273の構築図を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/66 Ｃ１２Ｑ 1/66 //(Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ルシフェラーゼからなるペプチド部分
   と、リゾスタフィンからなるペプチド部分とを連結して
   なることを特徴とするルシフェラーゼ−リゾスタフィン
   融合タンパク質。
2. 【請求項２】 ルシフェラーゼをコードする遺伝子と、
   リゾスタフィンをコードする遺伝子とを連結してなるこ
   とを特徴とするルシフェラーゼ−リゾスタフィン融合遺
   伝子。
3. 【請求項３】 リゾスタフィンをコードする遺伝子が、
   実質的に配列番号３記載のアミノ酸配列をコードするこ
   とを特徴とする請求項２記載の融合遺伝子。
4. 【請求項４】 実質的に配列番号２記載のアミノ酸配列
   をコードするルシフェラーゼ−リゾスタフィン融合遺伝
   子。
5. 【請求項５】 請求項２、３又は４記載の融合遺伝子を
   ベクターＤＮＡに挿入してなることを特徴とする新規な
   組み換え体ＤＮＡ。
6. 【請求項６】 エッシェリシア属に属し、請求項５記載
   の組み換え体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、
   培養物よりルシフェラーゼ−リゾスタフィン融合タンパ
   ク質を採取することを特徴とするルシフェラーゼ−リゾ
   スタフィン融合タンパク質の製造法。
7. 【請求項７】ルシフェラーゼ−リゾスタフィン融合タン
   パク質を用いることを特徴とする生物発光分析法。
8. 【請求項８】生物発光分析法が、黄色ブドウ球菌の検出
   法である請求項７記載の生物発光分析法。