JPH09187281A

JPH09187281A - 抗体−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質、抗体−ホタルルシフェラーゼ融合遺伝子、新規な組換え体ｄｎａ及び抗体−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質の製造法

Info

Publication number: JPH09187281A
Application number: JP8001812A
Authority: JP
Inventors: Susumu Masuda; 進増田; Hiroki Tatsumi; 宏樹辰巳; Taiji Koyama; 泰二小山
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1996-01-09
Filing date: 1996-01-09
Publication date: 1997-07-22

Abstract

(57)【要約】【解決手段】抗体活性を有するペプチドからなる抗体
部分と、ホタルルシフェラーゼからなる酵素部分とを連
結してなることを特徴とする抗体−ホタルルシフェラー
ゼ融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする遺伝
子及び該融合タンパク質の製造法。【効果】抗体−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質
を効率よく生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗体活性を有する
ペプチドからなる抗体部分と、ホタルルシフェラーゼか
らなる酵素部分とを連結してなることを特徴とする抗体
−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質、該融合タンパ
ク質をコードする遺伝子及び該融合タンパク質の製造法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】特定の抗原に選択的な結合能を有する抗
体と、特定の触媒活性を有する酵素とが連結されたタン
パク質は、医療用及び診断用試薬（例えば、エンザイム
イムノアッセイ用、DNA の検出用等）として広く用いら
れている。従来、抗体と酵素を連結させる場合には、酵
素と抗体を別々に調製した後、化学的修飾法（例えば、
マレイミド法、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法
等）によって両者を連結する方法が用いられている。化
学的修飾法においては、抗体と酵素の連結効率が低く、
両者の連結比率（モル比）が不安定であるために、目的
とするタンパク質を多量に生産することが困難であると
いう問題があった。また、化学的修飾法で使用する試薬
によって、酵素及び抗体の活性が著しく低下するという
問題があった。

【０００３】抗体と酵素とが連結されたタンパク質にお
いて、酵素部分としては、アルカリフォスファターゼ、
ペルオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ等が使用され
ているが、とりわけホタルルシフェラーゼは、他の酵素
に較べて、連結用試薬による活性中心の修飾が起こり易
いため、酵素活性の低下は特に問題であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抗体
活性を有するペプチドからなる抗体部分と、ホタルルシ
フェラーゼからなる酵素部分とを連結してなることを特
徴とする抗体−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質
を、効率よく生産する方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討を行なった結果、抗体とホタルル
シフェラーゼとを遺伝子レベルで直鎖状に連結し、単一
な融合タンパク質として発現させることに成功し、本発
明を完成するに至った。

【０００６】すなわち本発明は、（１）抗体活性を有するペプチドからなる抗体部分と、
ホタルルシフェラーゼからなる酵素部分とを連結してな
ることを特徴とする抗体−ホタルルシフェラーゼ融合タ
ンパク質；（２）抗体部分をコードする遺伝子と、ホタルルシフェ
ラーゼ遺伝子とを連結してなることを特徴とする抗体−
ホタルルシフェラーゼ融合遺伝子；（３）抗体部分をコードする遺伝子が、免疫グロブリン
のＨ鎖の可変部（Ｖ_H）をコードする遺伝子及びＬ鎖の
可変部（Ｖ_L）をコードする遺伝子を、リンカーペプチ
ドをコードする遺伝子を介して連結してなるものである
ことを特徴とする（２）記載の融合遺伝子；

【０００７】（４）抗体部分をコードする遺伝子が、実
質的に配列番号２記載のアミノ酸配列をコードすること
を特徴とする（２）記載の融合遺伝子；（５）実質的に配列番号７記載のアミノ酸配列をコード
する抗体−ホタルルシフェラーゼ融合遺伝子；（６）上記（２）、（３）、（４）又は（５）記載の融
合遺伝子をベクターＤＮＡに挿入してなることを特徴と
する新規な組み換え体ＤＮＡ；（７）エッシェリシア属に属し、（６）記載の組み換え
体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、培養物より
抗体−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質を採取する
ことを特徴とする抗体−ホタルルシフェラーゼ融合タン
パク質の製造法；に関する。

【０００８】尚、「実質的に」とは、上記抗体または蛋
白質の活性を有する限りアミノ酸配列の一部にアミノ酸
の幾つかについて欠失、置換、付加、重合などを許容す
ることを意味するものである。以下、本発明を詳細に説
明する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の抗体−ホタルルシフェラ
ーゼ融合タンパク質（以下、単に「融合タンパク質」と
いう）における抗体とは、抗原刺激の結果、免疫応答に
よって生体内に産生されるタンパク質であって、抗原と
特異的に結合する活性をもつものを意味する。抗体が認
識する抗原は、融合タンパク質を使用する目的によって
異なるが、タンパク質（例えば、酵素、ホルモン、細菌
性トキシン等）、核酸、多糖類（細胞壁多糖類等）、及
びこれらの集合体（例えば、ウイルス粒子、花粉、室内
塵等）等が挙げられる。

【００１０】本発明の抗体は、天然型であってもよく、
又、抗体としての活性を失うことのない範囲で、１個以
上のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されている変
異型であってもよい。より具体的には、免疫グロブリン
分子或いはその一部、すなわち、Fab、Fab2、Fv、一本
鎖抗体等が挙げられる。

【００１１】これらの抗体の起源は、ヒトであってもよ
く、又、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の非ヒト動物
であってもよい。更には、ヒト起源の領域と、非ヒト動
物起源の領域とが遺伝子レベルで連結されたキメラ抗体
であってもよい。一本鎖抗体とは、免疫グロブリン分子
を構成するＨ鎖の可変部（Ｖ_H）とＬ鎖の可変部（Ｖ_L）
とがリンカーペプチドを介して連結された人工抗体であ
る。一本鎖抗体は、Ｖ_Hをコードする遺伝子とＶ_Lをコ
ードする遺伝子とを、リンカーペプチドをコードする遺
伝子を介して連結し、それを発現ベクターに導入するこ
とによって生産されている。一本鎖抗体遺伝子は、R.
E. Birdらの方法（Science,242,423-426,1988)、J. S.
Hustonらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85,5879
-5883,1988)、E. S. Wardらの方法（Nature,341,544-54
6,1989）等により調製することができる。

【００１２】一本鎖抗体遺伝子の調製法の概要を以下に
示す。尚、一本鎖抗体遺伝子は、市販のキット、例え
ば、Recombinant Phage Antibody System（ファルマシ
ア社製）等を用いて調製することもできる。

【００１３】（１）抗原を用いて免疫されたマウスの脾
臓細胞、もしくは抗体産生能を持つハイブリドーマ細胞
から mRNA を精製する。得られたmRNAを鋳型として、フ
ァーストストランドcDNAを合成する。次いで、上記のフ
ァーストストランドcDNAを鋳型とし、Ｖ_H遺伝子の一部
に対応するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣ
Ｒを行い、Ｖ_HcDNAを増幅する。同様の方法を用いてＶ
_LcDNAも増幅する。

【００１４】（２）増幅されたＶ_HcDNA及びＶ_LcDNA
を、リンカーペプチドをコードする遺伝子を介して連結
し、一本鎖抗体遺伝子を構築する。リンカーペプチドと
しては、例えば、 (Gly4Ser)3 〔J. S. Huston et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)〕を使用すること
ができる。連結操作は、ＰＣＲを用いて行うことができ
る。具体的な方法を、実施例〔１〕−（２）に記載し
た。ＰＣＲは、 T. Maniatisらの方法（Molecular Clon
ing.A Laboratory Manual.,1989)に従って行えばよい。

【００１５】（３）一本鎖抗体遺伝子を、ベクターＤＮ
Ａに挿入して組み換え体ＤＮＡを調製し、該組み換え体
ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換する。発現ベクター
としては、pCANTAB5E（ファルマシア社製）、SurfZap
（Stratagene社製）等が使用でき、宿主細胞としては、
大腸菌TG1（ファルマシア社製）、XL1-Blue（Stratagen
e社製）等が使用できる。

【００１６】（４）形質導転換株に、ヘルパーファージ
M13KO7（ファルマシア社製）を加える。これにより、
一本鎖抗体とM13 ファージコートタンパク質からなる融
合タンパク質が、ファージ表面上に発現される。一本鎖
抗体を発現するファージは、パニング操作、すなわち、
抗体が認識する抗原を結合させたイムノプレート上での
濃縮を繰り返すことにより選択することができる。

【００１７】本発明のホタルルシフェラーゼとしては、
例えば、ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）、
ルシオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）〔何れも
N. Kajiyama et al., Biochim. Biophys. Acta, 1120,
228 ,1992〕、ルシオラ・ミングレリカ（Luciola mingr
elica）〔N. Yu. Philippova and N. N. Ugarova, Biok
himiya, 44, 1508,1979〕、フォティナス・ピラリス
〔M. DeLuca and W. D. McElroy, Meth. Enzymol., 72,
3,1978〕等のホタル由来のルシフェラーゼが挙げられ
る。

【００１８】ホタルルシフェラーゼ遺伝子は、通常の方
法〔J. Sambrook et al. et al., Molecular Cloning A
Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Labor
atory Press〕を用いて、染色体ＤＮＡ、又はｃＤＮＡ
よりクローニングすることができる。アミノ酸配列が既
知の場合は、ＰＣＲを用いてクローニングすることがで
きる。

【００１９】本発明のホタルルシフェラーゼのアミノ酸
配列は、ルシフェラーゼ活性を失うことのない限り、１
個以上のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されてい
てもよい。ルシフェラーゼ活性を失うことのない範囲で
アミノ酸配列が変異されたポリペプチド及び該ポリペプ
チドをコードする遺伝子は、全て本発明に含まれる。

【００２０】変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子は、野
生型の遺伝子に変異を導入することにより得られる。遺
伝子に変異を導入する方法としては、野生型遺伝子と変
異原となる薬剤、具体的にはヒドロキシルアミン、亜硝
酸、亜硫酸、５−ブロモウラシル等を接触させる方法を
挙げることができる。この他、紫外線照射法、カセット
変異法、ＰＣＲ法を用いた部位特異的変異導入法等の方
法を広く用いることができる。更には、化学合成したＤ
ＮＡをアニーリングして所望の部位に変異を有する変異
型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を構築することも可能で
ある。

【００２１】変異型ホタルルシフェラーゼとしては、例
えば、特開平5-244942号公報記載の耐熱性ホタルルシフ
ェラーゼが挙げられる。この変異型ホタルルシフェラー
ゼは、ヘイケボタル（Luciola lateralis）由来であっ
て、Ｎ末端から217番目のAlaがLeuに置換されている。

【００２２】本発明の融合タンパク質において、抗体と
ホタルルシフェラーゼの一次配列上の配置は、両者の機
能を損なわない限り、如何なるものでもよい。すなわ
ち、いずれをＮ末端に配置してもよく、又、一方を他方
の配列内に配置してもよい。又、両者の間にリンカーペ
プチド、例えば(Gly2)〔I. Pasten et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA (1988)〕、(Gly4Ser)3〔J. S. Hust
on et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA (1988)〕、Ser
Ser Ala(Asp Asp Ala Lys Lys)4 Asp Gly 〔M.W. Pant
oliano et al., Biochemistry, 30, 10117,1991〕等を
配置してもよい。このような融合タンパク質をコードす
る遺伝子、すなわち融合遺伝子は、抗体遺伝子及びホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子をオープンリーディングフレー
ムをそろえて連結することにより得られる。具体的な方
法を、実施例〔３〕に記載した。

【００２３】融合遺伝子を、プロモーター配列、マーカ
ー遺伝子、複製起点を有するベクターＤＮＡに連結した
後、適当な宿主細胞を形質転換又は形質導入することに
より、本発明の融合タンパク質の生産能を有する組み換
え微生物を得ることができる。

【００２４】宿主細胞としては、真核細胞及び原核細胞
のいずれをも使用できる。真核細胞としては動物、植
物、昆虫、酵母等の細胞が、原核細胞としては大腸菌、
枯草菌、放線菌等が挙げられる。動物細胞としては、CH
O 、COS、HeLa細胞及びミエローマ細胞系統の細胞が、
原核細胞としては、エッシェリシア属に属する微生物、
例えば大腸菌XL1-Blue（Stratagene社製）JM109（宝酒
造社製）、HB101(ATCC33694)等が使用できる。

【００２５】融合遺伝子を挿入するためのベクターＤＮ
Ａは、宿主細胞で複製可能なものであれば如何なるもの
でもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファ
ージＤＮＡ等が挙げられる。宿主細胞が大腸菌である場
合のベクターＤＮＡとしては、プラスミドpUC119（宝酒
造社製）、pBluescript SK+(Stratagene社製)、pMAL-C2
（NEW England Labs社製）、pGEX-5X-1（ファルマシア
社製）、pXa1（ベーリンガー社製）、pMA56（G.Ammere
r, Meth. Enzymol., 101, 192,1983）、実施例〔1〕-
(5)で得られるベクターpUTE500K'等が使用できる。

【００２６】本発明においては、形質転換は、例えば、
D.M.Morrisonの方法（Meth. Enzymol.,68,326-331,197
9）等により、形質導入は、例えば、B.Hohnの方法（Met
h. Enzymol.,68,299-309,1979）等により行うことがで
きる。

【００２７】組み換え微生物より組み換え体ＤＮＡを精
製する方法としては、例えば、P.Guerryの方法（J.Bact
eriology,116,1064-1066,1973）、D.B.Clewellの方法
（J.Bacteriology,110,667-676,1972）等を用いること
ができる。又、組み換え体ＤＮＡに挿入された遺伝子の
塩基配列の決定は、例えば、Maxam-Gilbert 法（Proc.N
atl. Acad. Sci. USA,74,560-564,1977）、Dideoxy法
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74,5463-5467,1977）等
により行うことができる。

【００２８】上記の方法により得られた組み換え微生物
を培地中で培養することにより、本発明の融合タンパク
質を生産することができる。宿主細胞が大腸菌である場
合、組み換え大腸菌を固体培養法で培養してもよいが、
液体培養法により培養するのが好ましい。培地として
は、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エ
キス、コーンスティープリカーあるいは大豆もしくは小
麦ふすま浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウ
ム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄、
あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加
し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加し
たものが用いられる。なお、培地の初発 pH は、 pH 7
〜9に調製するのが適当である。また培養は30〜42℃、
好ましくは37℃前後で3〜24時間、好ましくは5〜8時
間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により
実施するのが好ましい。

【００２９】組み換え大腸菌の培養終了後、培養物より
融合タンパク質を採取するには、通常の酵素採取手段を
用いることができる。すなわち、培養物を遠心分離して
菌体を得た後、リゾチーム等の酵素を用いた溶菌処理、
超音波破砕処理、磨砕処理等により菌体を破壊し、融合
タンパク質を菌体外に排出させる。次いで、ろ過又は遠
心分離等を用いて不溶物を除去することにより、融合タ
ンパク質を含有する粗酵素液を得ることができる。

【００３０】本発明では、上記の粗酵素液をそのまま融
合タンパク質標品としてもよいが、通常のタンパク質精
製法を用いて、更に純度を高めてもよい。具体的には、
硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラ
フィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグ
ラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み
合わせて用いることができる。融合タンパク質標品中の
ホタルルシフェラーゼ活性は、J. R. De Wetらの方法
（Meth. Enzymol., 133, 3 ,1986）により測定すること
ができる。

【００３１】

【実施例】以下に、実施例によって本発明を更に詳細に
説明する。実施例においては、Ｎ末端より抗体−リンカ
ーペプチド−ホタルルシフェラーゼとなるような融合タ
ンパク質の製造法を例示した。尚、抗体としてはヒト成
長ホルモン（ＨＧＨ）に結合能を有する一本鎖抗体を使
用し、ホタルルシフェラーゼとしては特開平5-244942号
公報記載の耐熱性変異型ルシフェラーゼを使用した。

【００３２】〔１〕一本鎖抗体遺伝子の調製法（１）５０μｇのＨＧＨ（フナコシ社製）を、フリュー
エンドアジュバンドに懸濁した後、マウスの腹腔内に２
１日間隔で３回注射し、該マウスを免疫した。免疫され
たマウスの脾臓を摘出し、脾臓細胞から、オリゴdTセル
ロースカラムを用いて mRNAを精製した。得られたmRNA
を鋳型とし、オリゴdTをプライマーとして、ファースト
ストランドcDNAを合成した。逆転写酵素としては、宝酒
造社のAMV-Reverse transcriptase（宝酒造社製）を用
いた。

【００３３】該ファーストストランドcDNAを鋳型とし、
Ｖ_H遺伝子の一部に対応する下記のオリゴヌクレオチド
をプライマーとしてＰＣＲを行い、Ｖ_HcDNAを増幅し
た。

【００３４】

【外１】 5'側のプライマー：GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCA 3'側のプライマー：GGCTCGAGCC GTT(A/T)GATCTC CAGCTT
GGTC CC

【００３５】次いで、Ｖ_L遺伝子の一部に対応する下記
のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行
い、Ｖ_LcDNAを増幅した。

【００３６】

【外２】5'側のプライマー：CCCCTCGAGC AGGT(C/G)(A/
C)A(A/G)CT GCAG(C/G)AG(C/G)AGTC(A/T)GG 3'側のプライマー：TGAGGAGACG GTGCCGTGGT CCCTTGGCCC
CGGGGCAAGG GACCACGGTC ACCGTCTCCT CA

【００３７】得られたＶ_HcDNA及びＶ_LcDNAを、リンカ
ーペプチド遺伝子を介して直鎖状に連結し、一本鎖抗体
遺伝子を構築した。リンカーペプチド遺伝子がコードす
るアミノ酸配列は、(Gly4Ser)3である。一本鎖抗体遺伝
子の構築は、２段階のＰＣＲにより行った。先ず、Ｖ_H
cDNAとＶ_LcDNAの混合物を鋳型とし、下記の二本鎖ＤＮ
Ａをプライマーとして１回目のＰＣＲを行った。

【００３８】

【外３】ＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣ
ＣＴＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＣ
ＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡ
ＴＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＣＡＡ
ＴＧＴＣ

【００３９】該ＤＮＡは、Ｖ_HcDNAの一部、リンカーペ
プチド遺伝子及びＶ_LcDNAの一部に対応する塩基配列を
有している。

【００４０】次いで、１回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、
２回目のＰＣＲを行い、一本鎖抗体遺伝子を下記のプラ
イマーを使用して増幅した。

【００４１】

【外４】5'側のプライマー：GGCCCAGCCG GCCATGGCC(C/
G) AGGT(C/G)(A/C)A(A/G)CT GCAG(C/G)AGTC(A/T) GG 3'側のプライマー：GAGTCATTCT GCGGCCGCCC GTTT(G/T/
C)A(T/G)(T/C)TC CAGCTT(G/T)GTC CC

【００４２】（２）得られた一本鎖抗体遺伝子を、プラ
スミドpCANTAB5E（ファルマシア社製）のSfiI／NotI部
位に挿入し、得られた組み換え体ＤＮＡを用いて大腸菌
TG1（ファルマシア社製）を形質転換した。形質転換株
に、ヘルパーファージ M13KO7（ファルマシア社製）を
加え、30℃で１２時間振盪培養し、一本鎖抗体を、M13
ファージコートタンパク質との融合タンパク質として発
現させた。培養液を遠心分離し、上清としてファージ溶
液を得た。

【００４３】（３）パニング操作を以下の方法で行い、
ＨＧＨとの結合能を有するファージを濃縮した。イムノ
プレート（スミロン住友製薬社製）に、5mlのＨＧＨ
溶液（10μg/ml）を加え、一昼夜、４℃で静置した。次
いで、イムノプレートに3% BSA溶液を加え、一昼夜ブロ
ッキングを行った。3% BSA溶液を廃棄した後、（２）の
ファージ溶液 5mlをイムノプレートに加えて30℃で２時
間静置した。イムノプレートからファージ溶液を取り除
き、PBS バッファー〔 65 mM塩化ナトリウム, 10 mM リ
ン酸ナトリウム ( pH 7.2 )〕 10ml で 20 回、T-PBS
0.1 バッファー〔トゥイーン(tween 20) 0.1%, 65 mM塩
化ナトリウム, 10 mM リン酸ナトリウム ( pH 7.2)〕10
mlで 20 回、イムノプレートを洗浄した。イムノプレー
トに、大腸菌TG1（ファルマシア社製）の培養液 5ml
（O.D.=0.5)を加え、30℃で２時間振盪培養した。次い
で、ヘルパーファージ M13KO7 を加え、30℃で１２時間
振盪培養し、イムノプレートに結合しているファージを
大腸菌に感染させた。培養液を遠心分離し、上清として
ファージ溶液を得た。上記のパニング操作を３回繰り返
した。

【００４４】（４）ＨＧＨと特異的に結合するファージ
のスクリーニングを以下の方法により行った。（３）の
パニング操作で得られたファージを大腸菌TG1に感染さ
せた後、アンピシリン（50μg/ml）を含むＴＹ寒天培地
に播き、３０℃で２４時間培養した。培地上に出現した
コロニーのうち、単コロニー３８４個を滅菌したつまよ
うじで拾い、ＴＹ培地におのおの懸濁した。

【００４５】各コロニーにヘルパーファージ M13KO7 を
加え、30℃で１２時間振盪培養した。培養液を遠心分離
し、上清としてファージ溶液を得た。マイクロタイター
イムノアッセイプレートFluoroNunc Plates C96 Maxiso
rp（Nunc社製）のウェルに 50 μlのＨＧＨ溶液〔1μg/
mlＨＧＨ、15 mM 炭酸ナトリウム (pH 9.6)〕を加えた
後、4℃で16時間放置し、HGHを固定した。ウェルよりＨ
ＧＨ溶液を廃棄し、各ウェルを 300μlのPBS 〔 65 mM
塩化ナトリウム, 10 mMリン酸ナトリウム ( pH 7.2 )〕
にて２回洗浄した。次いで、300μlのブロッキング溶液
〔1% BSA, 65 mM 塩化ナトリウム, 10 mM リン酸ナトリ
ウム (pH 7.2)〕を加えた後、37℃で２時間放置し、ウ
ェルのブロッキングを行なった。ブロッキング溶液を廃
棄した後、300 μlの TPBS で各ウェルを洗浄し、上述
のファージ溶液を加え、室温で１時間放置した。ファー
ジ溶液を廃棄し、各ウェルを 300μlの PBSにて４回洗
浄した。

【００４６】各ウェルの抗ＨＧＨ抗体活性は、２次抗体
として西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したウサギ由
来の抗M13ファージ抗体（ファルマシア社製）を、発色
試薬として ABTS （ベーリンガーマンハイム社製）を用
いて測定した。最も強い発色を示した一本鎖抗体を発現
する形質転換体より、Qiagen PlasmidMini Kit（フナコ
シ社製）を用いて組換え体プラスミドを精製した。得ら
れた組み換え体プラスミドをpSCFV4と命名した。pSCFV4
に挿入された一本鎖抗体遺伝子の塩基配列は、サイクル
シークエンシングキット（パーキンエルマー社製）を用
いて決定した。一本鎖抗体遺伝子の塩基配列を配列番号
１に、該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号
２、および図１に示した。

【００４７】（５）pSCFV4に挿入された一本鎖抗体遺伝
子のサブクローニングを以下の方法により行った。pSCF
V4を鋳型とし、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行
い、一本鎖抗体遺伝子の 5'末端に NdeI 部位を、3'末
端に XhoI部位及びBglII部位を付加した。

【００４８】

【外５】５’側プライマー：TTGGAGATTT TCCATATGAA AA
AATTATTA TTCACAATT ３’側プライマー：CGGCCAGAGA TCTACTAGTC ACTCGAGGCC
GCCTTTTATT TCCAGCTTGG TCCCGAGCC

【００４９】得られたPCR 産物を挿入するためのプラス
ミドpUTE500K'を、以下のように調製した。

【００５０】（６）発現ベクターpUTE500K'を、以下の
ように作製した。プラスミドベクターpBR322DNA （宝酒
造社製）をNdeIで消化後、DNA BluntingKit (宝酒造社
製) で平滑末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ
ーマンハイム社製）で環状に戻すことによりNdeI部位を
消去した。次いで、このベクターをEcoRI 及びNruIで消
化し、上記DNA Blunting Kitで平滑末端とした後、常法
に従ってアガロースゲル電気泳動を行い、GENECLEAN II
KIT〔フナコシ（株）製〕により複製起点を含む約3.4k
b のＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより環状にした後、EcoRI 切断を行い、直
鎖にした。

【００５１】次いで、以下に示すような大腸菌ラクトー
スオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター、
リボソーム結合部位及びターミネーター等の発現調節領
域並びにNdeI切断部位及びシークエンシング・プライマ
ー (-21M13 Forward Primer)結合部位を含むＤＮＡ配列
(The Operon, p.227, Cold Spring Harbor Laborator
y, 1980を参照):

【００５２】

【外６】 AATTCGGTACCGGATCCGCTAGCTTTACATTATGCTTCCGGCTCGTATAA GCCATGGCCTAGGCGATCGAAATGTAATACGAAGGCCGAGCATATT TGTGTGGAATTGTGAGGGGATAACAATTTCACACAGGAGGTTTCATATGC ACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCCTCCAAAGTATACG ATTGATCATTAATTAATAGCCCGCCTAATGACCGGGCTTTTTTTTACTAG TAACTAGTAATTAATTATCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAATGATC TAGATCTCTGGCCGTCGTTTTACAGTCGACGGTACCG ATCTAGAGACGGGCAGCAAAATGTCAGCTGCCATGGCTTAA

【００５３】をDNA Synthesizer Model 392 （アプライ
ドバイオシステムズ社製）を用いて合成し、上記で得ら
れたEcoRI 断片と連結して発現ベクターpUTE500 を作製
した。このpUTE500 をSalIで切断消化し、これをSalI部
位で消化したカナマイシン耐性遺伝子（ファルマシア社
製）を連結して発現ベクターpUTE500K' を作製した。

【００５４】（５）記載のPCR 産物をNdeI及びBglII で
消化した後、NdeIとBglII で切断したpUTE500K' と混合
し、T4ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて両者を連
結した。得られた組み換え体プラスミドをpHSCFV4 と命
名した。pHSCFV4 に挿入された一本鎖抗体遺伝子は、β
−ガラクトシダーゼプロモーターより順方向に転写され
る。

【００５５】〔２〕ホタルルシフェラーゼ遺伝子の調製
法ホタルルシフェラーゼ遺伝子を以下の方法により調製し
た。（１）ビオチン化ホタルルシフェラーゼbL203 を発現す
るプラスミドの作製ビオチン化ペプチド♯84 (Met Ala Phe Ser Leu Arg Se
r Ile Leu Glu Ala Gln Lys Met Glu Leu Arg Asn Thr
Pro Gly Gly Ser) [P. J. Shatz, BIO/TECHNOLOGY, 11,
1138 (1993), ビオチンホロエンザイムシンセターゼの
作用により13番目のLys 残基がビオチン化されると考え
られる。] をコードし、下流に制限酵素XhoI部位と制限
酵素MunI部位を持つオリゴヌクレオチド〔順鎖のSLF69
と逆鎖のSLF70 の合計２本〕をDNA Model 392 シンセサ
イザー(Applied Biosystems 社製) を用いて合成した。

【００５６】

【外７】合成オリゴヌクレオチドSLF69 ：ATGGCATTTT C
ATTACGTTC TATTCTTGAA GCTCAAAAAA TGGAATTACG TAACACT
CCAGGAGGTAGTC TCGAGGCTAC AATTG 合成オリゴヌクレオチドSLF70 ：CAATTGTAGC CTCGAGACT
ACCTCCTGGAG TGTTACGTAA TTCCATTTTT TGAGCTTCAAGAATA
GAACG TAATGAAAA TGCCAT

【００５７】オリゴヌクレオチドSLF69 及びSLF70 各々
1pmol をT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を
用いてリン酸化した後、両者を混合し、90℃にて10分間
保温後、更に37℃にて10分間保温し、２種のオリゴヌク
レオチドのアニーリングを行った。次いで、プラスミド
pUTE100 ＤＮＡ（特開平5-317055号公報記載) を制限酵
素HpaIで切断した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒
造社製）にて脱リン酸化を行い、これに上記のアニーリ
ングしたオリゴヌクレオチドを加え、T4DNA リガーゼ
（宝酒造社製）を用いて連結し、プラスミドpUTE100 Ｄ
ＮＡのHpaI部位にビオチン化ペプチド♯84をコードする
オリゴヌクレオチドがβ−ガラクトシダーゼプロモータ
ーより順方向に転写される方向に挿入された組み換え体
プラスミドpHLf200 ＤＮＡを取得した（図２参照）。

【００５８】一方、組み換え体プラスミドpHLf7-217Leu
[プラスミドpUC119に217 番目のAla がLeu に置換され
た耐熱変異型ヘイケボタルルシフェラーゼの遺伝子（特
開平5-244942号公報記載) が挿入されたものであり、こ
の耐熱性変異型ヘイケボタルルシフェラーゼのアミノ酸
配列を配列番号３及び図３に示す。] の１本鎖ＤＮＡを
ヘルパーファージM13 KO7 （宝酒造社製）を用いて調製
し、オリゴヌクレオチドSLF15 (AGGAATAAAGAACTCTTCACA
GTT)とオリゴヌクレオチド−ダイレクティッドインビト
ロミュータジェネシスシステムバージョン２ (Amer
sham社製) を用いて、ルフェラーゼ遺伝子がコードする
アミノ酸配列は変えずにルシフェラーゼ遺伝子の内部に
存在するEcoRI 部位を除去したプラスミドpHLf107 ＤＮ
Ａを得た（図２参照）。次いで、同様の方法により、組
み換え体pHLf107 ＤＮＡのルシフェラーゼ遺伝子の5'端
付近に、オリゴヌクレオチドSLF43 (TTCATCGTTCTCGAGGT
TTTCCATAGA)(下線部は制限酵素XhoI部位) を用いてXhoI
部位を導入したプラスミドpHLf108 を取得した（図２参
照）。

【００５９】pHLf108 を制限酵素XhoI（宝酒造製）及び
EcoRI （同社製）で切断した後、アガロースゲル電気泳
動とgene clean II kit (BIO101 社製) によりルシフェ
ラーゼ遺伝子断片を調製した。この断片を、予めXhoIと
MunI（何れも宝酒造社製）で切断したpHLf200 と連結
し、ビオチン化ホタルルシフェラーゼbL203 をβ−ガラ
クトシダーゼプロモーターにより発現させることのでき
る組み換え体プラスミドpHLf203 ＤＮＡを構築した（図
２参照）。組み換え体プラスミドpHLf203 に挿入された
ビオチン化ホタルルシフェラーゼbL203 遺伝子の塩基配
列を配列番号４に、また該遺伝子から発現されるアミノ
酸配列を配列番号５に示した。

【００６０】〔３〕融合遺伝子の調製ホタルルシフェラーゼ遺伝子が挿入されているpHLf203
を、制限酵素 XhoIと BglII（いずれも宝酒造社製）で
切断した後、アガロースゲル電気泳動に供した。約１６
００ｂｐの鎖長を有するＤＮＡ断片を、gene clean II
kit （BIO101社製）を用いてゲルより精製した。該ＤＮ
Ａ断片にはホタルルシフェラーゼ遺伝子が含まれてい
る。

【００６１】該ＤＮＡ断片を、XhoIと BglIIで切断しpH
SCFV4 と混合した後、T4 DNAリガーゼを用いて両者を連
結した。得られた組み換え体プラスミド pHLf301と命名
した。pHLf301は、β−ガラクトシダーゼプロモーター
により融合タンパク質を発現する。pHLf301を用いて大
腸菌 XL1-Blue（Stratagene社製）を形質転換し、得ら
れた形質転換株を、大腸菌 XL1-Blue(pHLf301)と命名し
た。大腸菌 XL1-Blue(pHLf301)は、工業技術院生命工学
工業技術研究所にFERM BP-5336として寄託されている。
pHLf301 に挿入された融合遺伝子の塩基配列を配列番号
６に、該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号７
及び図４に示した。

【００６２】〔４〕融合タンパク質の発現組み換え大腸菌 XL1-Blue(pHLf301)を、 2 mM のイソプ
ロピル-β-チオガラクトサイド(IPTG)と 50 μg/mlのア
ンピシリンを含むＬＢ培地(1% バクトトリプトン, 0.5%
酵母エキス, 0.5%塩化ナトリウム) 2 ml中にて、30℃で
5時間振盪培養し、融合タンパク質の発現を誘導した。
培養液を5,000 r.p.m.で5分間遠心分離し、菌体を集菌
した。超音波処理により菌体を破砕した後、12,000 r.
p.m.で5分間遠心分離して不溶物を除去し、粗酵素液を
得た。

【００６３】〔５〕融合タンパク質の活性測定粗酵素液中の融合タンパク質の活性は、以下の方法によ
り測定した。（１）マイクロタイターイムノアッセイプレートFluoro
Nunc Plates C96 White Maxisorp（Nunc社製）のウェル
に 50 μlのＨＧＨ溶液〔1μg/ml,15 mM炭酸ナトリウム
(pH 9.6)〕を加え、4℃で16時間放置し、ＨＧＨの固定
を行なった。尚、対照として、ＨＧＨ溶液の代わりにＢ
ＳＡ溶液〔1% BSA, 65 mM 塩化ナトリウム, 10 mM リン
酸ナトリウム (pH 7.2)〕を用いて同様の固定操作を行
い、ＨＧＨ無添加のマイクロタイターイムノアッセイプ
レートを調製した。

【００６４】ウェルよりＨＧＨ溶液を廃棄し、各ウェル
を 300μlのＴＰＢＳ溶液〔0.05%トゥイーン（tween）2
0, 65 mM 塩化ナトリウム, 10 mM リン酸ナトリウム (
pH7.2 )〕にて２回洗浄した後、300 μlのブロッキング
溶液〔1% BSA, 65 mM 塩化ナトリウム, 10 mM リン酸ナ
トリウム (pH 7.2)〕を加え、37℃にて２時間放置し、
ウェルのブロッキングを行なった。ブロッキング溶液を
廃棄した後、300μlのTPBS溶液で各ウェルを洗浄した。

【００６５】（２）各ウェルに粗酵素液を加えて室温で
１時間放置した。次いで粗酵素液を廃棄し、各ウェルを
300μlのＴＰＢＳ溶液にて４回洗浄した。次いで、マ
イクロタイターイムノアッセイプレートを、マイクロプ
レートルミノメーターML3000（DYNATECH社製）に装着
し、50μlの基質溶液〔0.069 mMルシフェリン（SIGMA社
製）, 4 mM ATP, 4.3 mM塩化マグネイシウム, 25 mM グ
リシルグリシン (pH 7.8)〕を加え、20秒間に発生する
フォトンの数を測定した。

【００６６】活性測定の結果を表１に示した。又、変異
型ホタルルシフェラーゼ遺伝子のみが挿入されているpH
Lf7-217Leuを用いて形質転換した大腸菌XL1-Blue(pHLf7
-217Leu)の培養物から得た粗酵素液についても、同様の
測定を行った。

【００６７】

【表１】

【００６８】表１の結果から明らかなように、大腸菌 X
L1-Blue(pHLf301)から得られた粗酵素液において、ＨＧ
Ｈ無添加のウェルでの発光が40067カウントであったの
に対し、ＨＧＨを添加したウェルでは 234,766カウント
の発光が観察され、顕著なルシフェラーゼ活性の増加が
認められた。

【００６９】従って、大腸菌 XL1-Blue(pHLf301)から得
られた粗酵素液には、ＨＧＨに対して結合能を有し、且
つホタルルシフェラーゼ活性のある融合タンパク質が存
在することが確認された。

【００７０】

【発明の効果】本発明により、抗体−ホタルルシフェラ
ーゼ融合タンパク質、抗体−ホタルルシフェラーゼ融合
遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及び抗体−ホタルルシ
フェラーゼ融合タンパク質の製造法が提供された。本発
明の方法により、抗体−ホタルルシフェラーゼ融合タン
パク質を効率よく生産することができるので、本発明は
産業上極めて有用である。

【００７１】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：７３２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGGCCAAGG TGAAGCTGCA GGAGTCAGGA GCTGAGCTGG TGAGGCCTGG GTCCTCAGTG 60 AAGATTTCCT GCAAGGCTTC TGGCTATGTA TTCAGTAGCT ACTGGATGAA CTGGGTGAAG 120 CAGAGGCCTG GACAGGGTCT TGAGTGGATT GGACAGATTA ATCCTGGAGA TGGTGATACG 180 AATTACAATG GAAAGTTCAA GGGTAAAGTC ACACTGACTG CAGACAAATC CTCCAGCACA 240 GCCCACATGC AGCTCAGCAG CCTAACATCT GAAGACTCTG CGGTCTATTT CTGTACAAGA 300 ATGGGGGTAC GACGGGACTA CTGGGGCCAA GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGGTGGA 360 GGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGG ACATCGAGCT CACTCAGTCT 420 CCAGCAATCA TGTCTGCATC TCTAGGGGAA CGGGTCACCA TGACCTGCAC TGCCAGCTCA 480 AGTGTAAGTT CCAGCAACTT GCACTGGTAC CAGCAGAAGT CAGAAACCTC CCCCAAACCC 540 TGGATTTATG GCACATCCAA CCTGGCTTCT GGAATCCCTG TTCGCTTCAG TGGCAGTGGA 600 TCTGGGACCT CTTATTCTCT CACAATCAGC AGCATGGAGG GTGAAGATGC TGCCACTTAT 660 TACTGCCAGC AGTGGAGTAG TAACCCATTC ACGTTCGGCT CGGGGACCAA GCTGGAAATA 720 AAACGGGCGG CC

【００７２】配列番号：２配列の長さ：２４２配列の型：アミノ酸トポロジー：不明配列の種類：ペプチド配列 Met Ala Lys Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 5 10 15 Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Gln Ile Asn Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly 50 55 60 Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ala His Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Phe Cys Thr Arg Met Gly Val Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met 130 135 140 Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser 145 150 155 160 Ser Val Ser Ser Ser Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr 165 170 175 Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile 180 185 190 Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 195 200 205 Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220 Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240 Lys Arg

【００７３】配列番号：３配列の長さ：５４８配列の型：アミノ酸トポロジー：不明配列の種類：ペプチド配列： Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Tyr Gly Pro Glu Pro 5 10 15 Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln Leu Arg Lys Tyr 20 25 30 Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Leu 35 40 45 Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys 50 55 60 Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile 65 70 75 80 Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Leu Ala 85 90 95 Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr 100 105 110 Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val 115 120 125 Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr 130 135 140 Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr 145 150 155 160 Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys Asn Thr Pro Gln 165 170 175 Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asn Arg Lys Glu 180 185 190 Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys 195 200 205 Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Leu Val Thr Arg Phe Ser His Ala 210 215 220 Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Ile Leu 225 230 235 240 Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly 245 250 255 Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu 260 265 270 Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Ser Ser Val Ile 275 280 285 Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Glu Leu Leu Asp 290 295 300 Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro 305 310 315 320 Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro 325 330 335 Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile 340 345 350 Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val 355 360 365 Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Thr Leu 370 375 380 Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met 385 390 395 400 Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu Ile Ile Asp Glu 405 410 415 Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys 420 425 430 His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly 435 440 445 Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro 450 455 460 Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Ile Ala Gly 465 470 475 480 Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Glu Lys Gly Lys Ser Met Thr 485 490 495 Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys 500 505 510 Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu 515 520 525 Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro 530 535 540 Val Ala Lys Met 545

【００７４】配列番号：４配列の長さ：１７０４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：不明配列の種類：cDNA to mRNA 配列： ATGGCATTTT CATTACGTTC TATTCTTGAA GCTCAAAAAA TGGAATTACG TAACACTCCA 60 GGAGGTAGTC TCGAGAACGA TGAAAATATT GTGTATGGTC CTGAACCATT TTACCCTATT 120 GAAGAGGGAT CTGCTGGAGC ACAATTGCGC AAGTATATGG ATCGATATGC AAAACTTGGA 180 GCAATTGCTT TTACTAACGC ACTTACCGGT GTCGATTATA CGTACGCCGA ATACTTAGAA 240 AAATCATGCT GTCTAGGAGA GGCTTTAAAG AATTATGGTT TGGTTGTTGA TGGAAGAATT 300 GCGTTATGCA GTGAAAACTG TGAAGAGTTC TTTATTCCTG TATTAGCCGG TTTATTTATA 360 GGTGTCGGTG TGGCTCCAAC TAATGAGATT TACACTCTAC GTGAATTGGT TCACAGTTTA 420 GGCATCTCTA AGCCAACAAT TGTATTTAGT TCTAAAAAAG GATTAGATAA AGTTATAACT 480 GTACAAAAAA CGGTAACTGC TATTAAAACC ATTGTTATAT TGGACAGCAA AGTGGATTAT 540 AGAGGTTATC AATCCATGGA CAACTTTATT AAAAAAAACA CTCCACAAGG TTTCAAAGGA 600 TCAAGTTTTA AAACTGTAGA AGTTAACCGC AAAGAACAAG TTGCTCTTAT AATGAACTCT 660 TCGGGTTCAA CCGGTTTGCC AAAAGGTGTG CAACTTACTC ATGAAAATTT GGTCACGCGT 720 TTTTCTCACG CTAGAGATCC AATTTATGGA AACCAAGTTT CACCAGGCAC GGCTATTTTA 780 ACTGTAGTAC CATTCCATCA TGGTTTTGGT ATGTTTACTA CTTTAGGCTA TCTAACTTGT 840 GGTTTTCGTA TTGTCATGTT AACGAAATTT GACGAAGAGA CTTTTTTAAA AACACTGCAA 900 GATTACAAAT GTTCAAGCGT TATTCTTGTA CCGACTTTGT TTGCAATTCT TAATAGAAGT 960 GAATTACTCG ATAAATATGA TTTATCAAAT TTAGTTGAAA TTGCATCTGG CGGAGCACCT 1020 TTATCTAAAG AAATTGGTGA AGCTGTTGCT AGACGTTTTA ATTTACCGGG TGTTCGTCAA 1080 GGCTATGGTT TAACAGAAAC AACCTCTGCA ATTATTATCA CACCGGAAGG CGATGATAAA 1140 CCAGGTGCTT CTGGCAAAGT TGTGCCATTA TTTAAAGCAA AAGTTATCGA TCTTGATACT 1200 AAAAAAACTT TGGGCCCGAA CAGACGTGGA GAAGTTTGTG TAAAGGGTCC TATGCTTATG 1260 AAAGGTTATG TAGATAATCC AGAAGCAACA AGAGAAATCA TAGATGAAGA AGGTTGGTTG 1320 CACACAGGAG ATATTGGGTA TTACGATGAA GAAAAACATT TCTTTATCGT GGATCGTTTG 1380 AAGTCTTTAA TCAAATACAA AGGATATCAA GTACCACCTG CTGAATTAGA ATCTGTTCTT 1440 TTGCAACATC CAAATATTTT TGATGCCGGC GTTGCTGGCG TTCCAGATCC TATAGCTGGT 1500 GAGCTTCCGG GAGCTGTTGT TGTACTTGAA AAAGGAAAAT CTATGACTGA AAAAGAAGTA 1560 ATGGATTACG TTGCTAGTCA AGTTTCAAAT GCAAAACGTT TGCGTGGTGG TGTCCGTTTT 1620 GTGGACGAAG TACCTAAAGG TCTCACTGGT AAAATTGACG GTAAAGCAAT TAGAGAAATA 1680 CTGAAGAAAC CAGTTGCTAA GATG 1704

【００７５】配列番号：５配列の長さ：５６８配列の型：アミノ酸トポロジー：不明配列の種類：ペプチド配列： Met Ala Phe Ser Leu Arg Ser Ile Leu Glu Ala Gln Lys Met Glu Leu 5 10 15 Arg Asn Thr Pro Gly Gly Ser Leu Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Tyr 20 25 30 Gly Pro Glu Pro Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln 35 40 45 Leu Arg Lys Tyr Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe 50 55 60 Thr Asn Ala Leu Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Lys Ser Cys Cys Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val 85 90 95 Asp Gly Arg Ile Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile 100 105 110 Pro Val Leu Ala Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn 115 120 125 Glu Ile Tyr Thr Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys 130 135 140 Pro Thr Ile Val Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr 145 150 155 160 Val Gln Lys Thr Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser 165 170 175 Lys Val Asp Tyr Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys 180 185 190 Asn Thr Pro Gln Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val 195 200 205 Asn Arg Lys Glu Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr 210 215 220 Gly Leu Pro Lys Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Leu Val Thr Arg 225 230 235 240 Phe Ser His Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly 245 250 255 Thr Ala Ile Leu Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe 260 265 270 Thr Thr Leu Gly Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr 275 280 285 Lys Phe Asp Glu Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys 290 295 300 Ser Ser Val Ile Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser 305 310 315 320 Glu Leu Leu Asp Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser 325 330 335 Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg 340 345 350 Phe Asn Leu Pro Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr 355 360 365 Ser Ala Ile Ile Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser 370 375 380 Gly Lys Val Val Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr 385 390 395 400 Lys Lys Thr Leu Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly 405 410 415 Pro Met Leu Met Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu 420 425 430 Ile Ile Asp Glu Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr 435 440 445 Asp Glu Glu Lys His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile 450 455 460 Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu 465 470 475 480 Leu Gln His Pro Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp 485 490 495 Pro Ile Ala Gly Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Glu Lys Gly 500 505 510 Lys Ser Met Thr Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val 515 520 525 Ser Asn Ala Lys Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val 530 535 540 Pro Lys Gly Leu Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile 545 550 555 560 Leu Lys Lys Pro Val Ala Lys Met 565

【００７６】配列番号：６配列の長さ：２４０４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：不明配列の種類：cDNA to mRNA 配列： ATGGCCAAGG TGAAGCTGCA GGAGTCAGGA GCTGAGCTGG TGAGGCCTGG GTCCTCAGTG 60 AAGATTTCCT GCAAGGCTTC TGGCTATGTA TTCAGTAGCT ACTGGATGAA CTGGGTGAAG 120 CAGAGGCCTG GACAGGGTCT TGAGTGGATT GGACAGATTA ATCCTGGAGA TGGTGATACG 180 AATTACAATG GAAAGTTCAA GGGTAAAGTC ACACTGACTG CAGACAAATC CTCCAGCACA 240 GCCCACATGC AGCTCAGCAG CCTAACATCT GAAGACTCTG CGGTCTATTT CTGTACAAGA 300 ATGGGGGTAC GACGGGACTA CTGGGGCCAA GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGGTGGA 360 GGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGG ACATCGAGCT CACTCAGTCT 420 CCAGCAATCA TGTCTGCATC TCTAGGGGAA CGGGTCACCA TGACCTGCAC TGCCAGCTCA 480 AGTGTAAGTT CCAGCAACTT GCACTGGTAC CAGCAGAAGT CAGAAACCTC CCCCAAACCC 540 TGGATTTATG GCACATCCAA CCTGGCTTCT GGAATCCCTG TTCGCTTCAG TGGCAGTGGA 600 TCTGGGACCT CTTATTCTCT CACAATCAGC AGCATGGAGG GTGAAGATGC TGCCACTTAT 660 TACTGCCAGC AGTGGAGTAG TAACCCATTC ACGTTCGGCT CGGGGACCAA GCTGGAAATA 720 AAAGGCGGCC TCGAGAACGA TGAAAATATT GTGTATGGTC CTGAACCATT TTACCCTATT 780 GAAGAGGGAT CTGCTGGAGC ACAATTGCGC AAGTATATGG ATCGATATGC AAAACTTGGA 840 GCAATTGCTT TTACTAACGC ACTTACCGGT GTCGATTATA CGTACGCCGA ATACTTAGAA 900 AAATCATGCT GTCTAGGAGA GGCTTTAAAG AATTATGGTT TGGTTGTTGA TGGAAGAATT 960 GCGTTATGCA GTGAAAACTG TGAAGAGTTC TTTATTCCTG TATTAGCCGG TTTATTTATA 1020 GGTGTCGGTG TGGCTCCAAC TAATGAGATT TACACTCTAC GTGAATTGGT TCACAGTTTA 1080 GGCATCTCTA AGCCAACAAT TGTATTTAGT TCTAAAAAAG GATTAGATAA AGTTATAACT 1140 GTACAAAAAA CGGTAACTGC TATTAAAACC ATTGTTATAT TGGACAGCAA AGTGGATTAT 1200 AGAGGTTATC AATCCATGGA CAACTTTATT AAAAAAAACA CTCCACAAGG TTTCAAAGGA 1260 TCAAGTTTTA AAACTGTAGA AGTTAACCGC AAAGAACAAG TTGCTCTTAT AATGAACTCT 1340 TCGGGTTCAA CCGGTTTGCC AAAAGGTGTG CAACTTACTC ATGAAAATTT GGTCACGCGT 1400 TTTTCTCACG CTAGAGATCC AATTTATGGA AACCAAGTTT CACCAGGCAC GGCTATTTTA 1460 ACTGTAGTAC CATTCCATCA TGGTTTTGGT ATGTTTACTA CTTTAGGCTA TCTAACTTGT 1520 GGTTTTCGTA TTGTCATGTT AACGAAATTT GACGAAGAGA CTTTTTTAAA AACACTGCAA 1580 GATTACAAAT GTTCAAGCGT TATTCTTGTA CCGACTTTGT TTGCAATTCT TAATAGAAGT 1640 GAATTACTCG ATAAATATGA TTTATCAAAT TTAGTTGAAA TTGCATCTGG CGGAGCACCT 1700 TTATCTAAAG AAATTGGTGA AGCTGTTGCT AGACGTTTTA ATTTACCGGG TGTTCGTCAA 1760 GGCTATGGTT TAACAGAAAC AACCTCTGCA ATTATTATCA CACCGGAAGG CGATGATAAA 1840 CCAGGTGCTT CTGGCAAAGT TGTGCCATTA TTTAAAGCAA AAGTTATCGA TCTTGATACT 1900 AAAAAAACTT TGGGCCCGAA CAGACGTGGA GAAGTTTGTG TAAAGGGTCC TATGCTTATG 1960 AAAGGTTATG TAGATAATCC AGAAGCAACA AGAGAAATCA TAGATGAAGA AGGTTGGTTG 2020 CACACAGGAG ATATTGGGTA TTACGATGAA GAAAAACATT TCTTTATCGT GGATCGTTTG 2080 AAGTCTTTAA TCAAATACAA AGGATATCAA GTACCACCTG CTGAATTAGA ATCTGTTCTT 2140 TTGCAACATC CAAATATTTT TGATGCCGGC GTTGCTGGCG TTCCAGATCC TATAGCTGGT 2200 GAGCTTCCGG GAGCTGTTGT TGTACTTGAA AAAGGAAAAT CTATGACTGA AAAAGAAGTA 2260 ATGGATTACG TTGCTAGTCA AGTTTCAAAT GCAAAACGTT TGCGTGGTGG TGTCCGTTTT 2320 GTGGACGAAG TACCTAAAGG TCTCACTGGT AAAATTGACG GTAAAGCAAT TAGAGAAATT 2380 CTGAAGAAAC CAGTTGCTAA GATG

【００７７】配列番号：７配列の長さ：７８８配列の型：アミノ酸トポロジー：不明配列の種類：ペプチド配列： Met Ala Lys Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 5 10 15 Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Gln Ile Asn Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly 50 55 60 Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ala His Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Phe Cys Thr Arg Met Gly Val Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met 130 135 140 Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser 145 150 155 160 Ser Val Ser Ser Ser Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr 165 170 175 Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile 180 185 190 Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 195 200 205 Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu 210 215 220 Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240 Lys Gly Gly Leu Glu Asn Trp Glu Asn Ile Val Tyr Gly Pro Glu Pro 245 250 255 Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln Leu Arg Lys Tyr 260 265 270 Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Leu 275 280 285 Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys 290 295 300 Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile 305 310 315 320 Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Leu Ala 325 330 335 Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr 340 345 350 Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val 355 360 365 Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr 370 375 380 Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr 385 390 395 400 Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys Asn Thr Pro Gln 405 410 415 Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asn Arg Lys Glu 420 425 430 Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys 435 440 445 Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Ala Val Thr Arg Phe Ser His Ala 450 455 460 Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Ile Leu 465 470 475 480 Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly 485 490 495 Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu 500 505 510 Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Ser Ser Val Ile 515 520 525 Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Glu Leu Leu Asp 530 535 540 Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro 545 550 555 560 Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro 565 570 575 Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile 580 585 590 Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val 595 600 605 Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Thr Leu 610 615 620 Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met 625 630 635 640 Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu Ile Ile Asp Glu 645 650 655 Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys 660 665 670 His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly 675 680 685 Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro 690 695 700 Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Ile Ala Gly 705 710 715 720 Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Glu Lys Gly Lys Ser Met Thr 725 730 735 Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys 740 745 750 Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu 755 760 765 Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro 770 775 780 Val Ala Lys Met 785

【図面の簡単な説明】

【図１】ペプチド一本鎖抗体のアミノ酸配列を示す。

【図２】組み換え体プラスミドpHLf203 DNA の構築図を
示す。

【図３】ヘイケボタル（Luciola lateralis）由来の、2
17番目のAlaがLeuに置換された耐熱性変異型ホタルルシ
フェラーゼ（特開平5-244942号公報記載）のアミノ酸配
列を示す。

【図４】組み換え体プラスミドpHLf301 DNAの持つ抗体
−ホタルルシフェラーゼ融合遺伝子の塩基配列より演繹
されるアミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＧ０１Ｎ 33/535 Ｇ０１Ｎ 33/535 // Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 9/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗体活性を有するペプチドからなる抗体
部分と、ホタルルシフェラーゼからなる酵素部分とを連
結してなることを特徴とする抗体−ホタルルシフェラー
ゼ融合タンパク質。
【請求項２】抗体部分をコードする遺伝子と、ホタル
ルシフェラーゼ遺伝子とを連結してなることを特徴とす
る抗体−ホタルルシフェラーゼ融合遺伝子。
【請求項３】抗体部分をコードする遺伝子が、免疫グ
ロブリンのＨ鎖の可変部（Ｖ_H) をコードする遺伝子及
びＬ鎖の可変部（Ｖ_L）をコードする遺伝子を、リンカ
ーペプチドをコードする遺伝子を介して連結してなるも
のであることを特徴とする請求項２記載の融合遺伝子。
【請求項４】抗体部分をコードする遺伝子が、実質的
に配列番号２記載のアミノ酸配列をコードすることを特
徴とする請求項２記載の融合遺伝子。
【請求項５】実質的に配列番号７記載のアミノ酸配列
をコードする抗体−ホタルルシフェラーゼ融合遺伝子。
【請求項６】請求項２、３、４又は５記載の融合遺伝
子をベクターＤＮＡに挿入してなることを特徴とする新
規な組み換え体ＤＮＡ。
【請求項７】エッシェリシア属に属し、請求項６記載
の組み換え体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、
培養物より抗体−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質
を採取することを特徴とする抗体−ホタルルシフェラー
ゼ融合タンパク質の製造法。