CN114507654A

CN114507654A - 新型Cas酶和系统以及应用

Info

Publication number: CN114507654A
Application number: CN202210413495.5A
Authority: CN
Inventors: 李珊珊; 孙洁; 赵庆芝
Original assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2042-04-20
Also published as: CN114507654B; WO2023202116A1

Abstract

本发明属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域，涉及新型Cas酶和系统以及应用。具体而言，本发明提供了一种新型的Cas酶，其与已报道的Cas酶的同源性较低，可以在细胞内和细胞外表现出核酸酶的活性，具有广泛的应用前景。

Description

新型Cas酶和系统以及应用

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明涉及一种新型的CRISPR酶（或者，称之为CRISPR蛋白、Cas效应蛋白、Cas酶或Cas蛋白），包含此类蛋白的融合蛋白，以及编码它们的核酸分子。本发明还涉及用于核酸编辑（例如，基因或基因组编辑）的复合物和组合物，其包含本发明的Cas蛋白或融合蛋白，或编码它们的核酸分子。

背景技术

CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。

CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3’-NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5’-TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1, C2c1, CasX, CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9, C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5’-TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。

总之，鉴于目前可获得的CRISPR/Cas系统都受限于一些缺陷，开发一种更稳健的、具有多方面良好性能的新型CRISPR/Cas系统对生物技术的发展具有重要意义。

发明内容

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现了一种新型核酸内切酶（Cas酶）。基于这一发现，本发明人开发了新的CRISPR/Cas系统以及基于该系统的基因编辑方法和核酸检测方法。

Cas效应蛋白

一方面，本发明提供了一种Cas蛋白，所述Cas蛋白是CRISPR/Cas系统中的效应蛋白，在本发明，将其称之为Cas-sf0740（SEQ ID No.1所示）。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白氨基酸序列与SEQ ID No.1相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、或至少99.9%的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能。优选的，所述Cas蛋白与Cas-sf0740来源于同一物种。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；所述一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加。优选的，所述Cas蛋白与Cas-sf0740来源于同一物种。

本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如，可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代, 这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。

保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变（缺失、取代或置换）而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在上述Cas蛋白的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。

表1

本领域熟知，可以从蛋白质的N和/或C末端改变（置换、删除、截短或插入）一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从Cas蛋白的N和/或C末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本发明的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如PCR而引入的改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。

应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备上述蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

领域技术人员能够理解，本发明Cas蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r-DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。

本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定本发明Cas蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白含有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白是与具有SEQ ID No.1所示的序列的蛋白质相同生物学功能的衍生化蛋白。

所述生物学功能包括但不限于，与指导RNA结合的活性、核酸内切酶活性、在指导RNA引导下与靶序列特定位点结合并切割的活性，包括但不限于Cis切割活性和Trans切割活性。

本发明还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括如上所述的Cas蛋白和其他的修饰部分。

在一个实施方式中，所述修饰部分选自另外的蛋白或多肽、可检测的标记或其任意组合。

在一个实施方式中，所述修饰部分选自表位标签、报告基因序列、核定位信号（NLS）序列、靶向部分、转录激活结构域（例如，VP64）、转录抑制结构域（例如，KRAB结构域或SID结构域）、核酸酶结构域（例如，Fok1），以及具有选自下列的活性的结构域：核苷酸脱氨酶，甲基化酶活性, 去甲基化酶, 转录激活活性, 转录抑制活性, 转录释放因子活性, 组蛋白修饰活性, 核酸酶活性, 单链RNA切割活性, 双链RNA切割活性, 单链DNA切割活性,双链DNA切割活性和核酸结合活性；以及其任意组合。所述NLS序列是本领域技术人员熟知的，其实例包括但不限于所述，SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。

在一个实施方式中，所述NLS序列位于、靠近或接近本发明的Cas蛋白的末端（例如，N端、C端或两端）。

所述表位标签(epitope tag)是本领域技术人员熟知的，包括但不限于His、V5、FLAG、HA、Myc、VSV-G、Trx等，并且本领域技术人员可以选择其他合适的表位标签（例如，纯化、检测或示踪）。

所述报告基因序列是本领域技术人员熟知的，其实例包括但不限于GST、HRP、CAT、GFP、HcRed、DsRed、CFP、YFP、BFP等。

在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包含能够与DNA分子或细胞内分子结合的结构域，例如麦芽糖结合蛋白(MBP)、Lex A的DNA结合结构域(DBD)、GAL4的DBD等。

在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包含可检测的标记，例如荧光染料，例如FITC或DAPI。

在一个实施方式中，本发明的Cas蛋白任选地通过接头与所述修饰部分偶联、缀合或融合。

在一个实施方式中，所述修饰部分直接连接至本发明的Cas蛋白的N端或C端。

在一个实施方式中，所述修饰部分通过接头连接至本发明的Cas蛋白的N端或C端。这类接头是本领域熟知的，其实例包括但不限于包含一个或多个（例如，1个，2个，3个，4个或5个）氨基酸（如，Glu或Ser）或氨基酸衍生物（如，Ahx、β-Ala、GABA或Ava）的接头，或PEG等。

本发明的Cas蛋白、蛋白衍生物或融合蛋白不受其产生方式的限定，例如，其可以通过基因工程方法（重组技术）产生，也可以通过化学合成方法产生。

Cas蛋白的核酸

另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含：

(a)编码本发明的Cas蛋白或融合蛋白的多核苷酸序列；

或者，(b)序列如SEQ ID No.2或3所示的多核苷酸；

或者，(c)与(a)-(b)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个实施方式中，(a)-(c)任一项中所述的核苷酸序列经密码子优化用于在原核细胞中进行表达。在一个实施方式中，(a)-(c)任一项中所述的核苷酸序列经密码子优化用于在真核细胞中进行表达。

在一个实施方式中，所述细胞是动物细胞，例如，哺乳动物细胞。

在一个实施方式中，所述细胞是人类细胞。

在一个实施方式中，所述细胞是植物细胞，例如栽培植物（如木薯、玉米、高粱、小麦或水稻）、藻类、树或蔬菜具有的细胞。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。

同向重复（Direct Repeat）序列

另一方面，本发明提供了一种与上述Cas蛋白形成复合物的工程化同向重复序列。

所述同向重复序列与能够和靶序列杂交的引导序列连接后构成指导RNA（guideRNA 或gRNA）。

所述靶序列与gRNA的杂交，代表靶序列和gRNA的核酸序列至少70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，或100%的同一性，从而可以杂交形成复合物；或者代表靶序列和gRNA的核酸序列至少有12个，15个，16个，17个，18个，19个，20个，21个，22个，或更多个碱基可以互补配对，形成复合物。

在一些实施例中，该同向重复序列与SEQ ID No.4所示序列具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，该同向重复序列与SEQ ID No.4所示的序列相比具有一个或多个碱基的置换、缺失或添加（例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个碱基的置换、缺失或添加）的序列。

在一些实施例中，同向重复序列如SEQ ID No.4所示。

指导RNA（gRNA）

另一方面，本发明提供了一种gRNA，所述gRNA包括第一区段和第二区段；所述第一区段又称为“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复（DirectRepeat）序列”；所述第二区段又称为“靶向核酸的靶向序列”或者“靶向核酸的靶向区段”，或者“靶向靶序列的引导序列”。

所述gRNA的第一区段能够与本发明的Cas蛋白相互作用，从而使Cas蛋白和gRNA形成复合物。

在优选的实施方式中，所述第一区段为如上所述的同向重复序列。

本发明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段包含与靶核酸中的序列互补的核苷酸序列。换言之，本发明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段经过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。因此，靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段可改变，或可被修饰以杂交靶核酸内的任何希望的序列。所述核酸选自DNA或RNA。

靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段与靶核酸的靶序列之间的互补百分比可为至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)。

本发明gRNA的“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复序列”可以与CRISPR蛋白（或者，Cas蛋白）相互作用。本发明gRNA经过靶向核酸的靶向序列的作用将其相互作用的Cas蛋白引导至靶核酸内的特异性核苷酸序列。

优选的，所述指导RNA从5’至3’方向包含第一区段和第二区段。

本发明中，所述第二区段还可以理解为与靶序列杂交的引导序列。

本发明的gRNA能够与所述Cas蛋白形成复合物。

本发明的Cas-sf0740蛋白的gRNA包含与靶核酸杂交的引导序列，其中，所述靶核酸包括位于原型间隔区相邻基序(PAM)的3’端的序列；前述PAM序列为5’TTN-3’，其中，N=A/T/C/G。

载体

本发明还提供了一种载体，其包含如上述的Cas蛋白、分离的核酸分子或多核苷酸；优选的，其还包括与之可操作连接的调控元件。

在一个实施方式中，所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。

在一个实施方式中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体。

在一些实施方案中，所述系统中包括的载体是病毒载体（例如逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关载体和单纯疱疹载体），还可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。

CRISPR系统

本发明提供了一种工程化的非天然存在的载体系统，或者是CRISPR-Cas系统，该系统包括Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列以及编码一种或多种指导RNA的核酸。

在一种实施方式中，所述编码所述Cas蛋白的核酸序列和编码一种或多种指导RNA的核酸是人工合成的。

在一种实施方式中，所述编码所述Cas蛋白的核酸序列和编码一种或多种指导RNA的核酸并不共同天然存在。

该一种或多种指导RNA在细胞中靶向一个或多个靶序列。所述一个或多个靶序列与编码一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位杂交，并且引导该Cas蛋白到达所述一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位部位，Cas蛋白到达靶序列位置后对靶序列进行修饰、编辑或切割，由此该一种或多种基因产物的表达被改变或修饰。

本发明的细胞包括动物、植物或微生物中的一种或多种。

在一些实施例中，该Cas蛋白是密码子优化的，用于在细胞中进行表达。

在一些实施例中，该Cas蛋白指导切割在该靶序列位置处的一条或两条链。

本发明还提供了一种工程化的非天然存在的载体系统，该载体系统可以包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：

a)第一调控元件，该第一调控元件可操作地与gRNA连接，

b)第二调控元件，该第二调控元件可操作地与所述Cas蛋白连接；

其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上。

所述第一和第二调控元件包括启动子（例如，组成型启动子或诱导型启动子）、增强子（例如35S promoter或35S enhanced promoter）、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。

在一些实施方案中，所述系统中的载体是病毒载体（例如逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关载体和单纯疱疹载体），还可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。

在一些实施例中，本文提供的系统处于递送系统中。在一些实施方案中，递送系统是纳米颗粒，脂质体，外体，微泡和基因枪。

在一个实施方式中，所述靶序列是来自原核细胞或真核细胞的DNA或RNA序列。在一个实施方式中，所述靶序列是非天然存在的DNA或RNA序列。

在一个实施方式中，所述靶序列存在于细胞内。在一个实施方式中，所述靶序列存在于细胞核内或细胞质（例如，细胞器）内。在一个实施方式中，所述细胞是真核细胞。在其他实施方式中，所述细胞是原核细胞。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白连接有一个或多个NLS序列。在一个实施方式中，所述融合蛋白包含一个或多个NLS序列。在一个实施方式中，所述NLS序列连接至所述蛋白的N端或C端。在一个实施方式中，所述NLS序列融合至所述蛋白的N端或C端。

另一方面，本发明涉及一种工程化的CRISPR系统，所述系统包含上述Cas蛋白以及一种或多种指导RNA，其中，所述指导RNA包括同向重复序列和能够与靶核酸杂交的间隔序列，所述Cas蛋白能够结合所述指导RNA并靶向与间隔序列互补的靶核酸序列。

在一个实施方式中，当所述靶核酸为DNA（优选，双链DNA）时，所述靶核酸位于原间隔序列临近基序(PAM)的3’端，并且所述PAM具有5’TTN-3’所示的序列，其中，N=A/T/C/G。

蛋白-核酸复合物/组合物

另一方面，本发明提供了一种复合物或者组合物，其包含：

(i) 蛋白组分，其选自：上述Cas蛋白、衍生化蛋白或融合蛋白，及其任意组合；和

(ii) 核酸组分，其包含(a)能够与靶序列杂交的引导序列；以及(b)能够与本发明的Cas蛋白结合的同向重复序列。

所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。

在一个实施方式中，所述核酸组分是CRISPR-Cas系统中的指导RNA。

在一个实施方式中，所述复合物或组合物是非天然存在的或经修饰的。在一个实施方式中，所述复合物或组合物中的至少一个组分是非天然存在的或经修饰的。在一个实施方式中，所述第一组分是非天然存在的或经修饰的；和/或，所述第二组分是非天然存在的或经修饰的。

活化的CRISPR复合物

另一方面，本发明还提供了一种活化的CRISPR复合物，所述活化的CRISPR复合物包含：（1）蛋白组分，其选自：本发明的Cas蛋白、衍生化蛋白或融合蛋白，及其任意组合；（2）gRNA，其包含(a)能够与靶序列杂交的引导序列；以及(b)能够与本发明的Cas蛋白结合的同向重复序列；以及（3）结合在gRNA上的靶序列。优选的，所述结合为通过gRNA上的靶向核酸的靶向序列与靶核酸进行的结合。

本文所用术语“活化的CRISPR复合物”，“活化复合物”或“三元复合物”是指CRISPR系统中Cas蛋白、gRNA与靶核酸结合或修饰后的复合物。

本发明的Cas蛋白和gRNA可以形成二元复合物，该二元复合物在与核酸底物结合时被活化，形成活化的CRISPR复合物该核酸底物与gRNA中的间隔序列（或者称之为，与靶核酸杂交的引导序列）互补。在一些实施方案中，gRNA的间隔序列与靶底物完全匹配。在其它实施方案中，gRNA的间隔序列与靶底物的部分（连续或不连续）匹配。

在优选的实施方式中，所述活化的CRISPR复合物可以表现出侧枝核酸酶切活性，所述侧枝核酸酶切活性是指活化的CRISPR复合物表现的对单链核酸的非特异切割活性或乱切活性，在本领域又称之为trans切割活性。

递送及递送组合物

本发明的Cas蛋白、gRNA、融合蛋白、核酸分子、载体、系统、复合物和组合物，可以通过本领域已知的任何方法进行递送。此类方法包括但不限于，电穿孔、脂转染、核转染、显微注射、声孔效应、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状转染、热激转染、核转染、磁转染、脂转染、穿刺转染、光学转染、试剂增强性核酸摄取、以及经由脂质体、免疫脂质体、病毒颗粒、人工病毒体等的递送。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种递送组合物，其包含递送载体，以及选自下列的一种或任意几种：本发明的Cas蛋白、融合蛋白、核酸分子、载体、系统、复合物和组合物。

在一个实施方式中，所述递送载体是粒子。

在一个实施方式中，所述递送载体选自脂质颗粒、糖颗粒、金属颗粒、蛋白颗粒、脂质体、外泌体、微泡、基因枪或病毒载体（例如，复制缺陷型逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒）。

宿主细胞

本发明还涉及一种体外的、离体的或体内的细胞或细胞系或它们的子代，所述细胞或细胞系或它们的子代包含：本发明所述的Cas蛋白、融合蛋白、核酸分子、蛋白-核酸复合物、活化的CRISPR复合物、载体、本发明递送组合物。

在某些实施方案中，所述细胞是原核细胞。

在某些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是人类细胞。某些实施方案中，所述细胞是非人哺乳动物细胞，例如非人灵长类动物、牛、羊、猪、犬、猴、兔、啮齿类（如大鼠或小鼠）的细胞。在某些实施方案中，所述细胞是非哺乳动物真核细胞，例如家禽鸟类（如鸡）、鱼类或甲壳动物（如蛤蜊、虾）的细胞。在某些实施方案中，所述细胞是植物细胞，例如单子叶植物或双子叶植物具有的细胞或栽培植物或粮食作物如木薯、玉米、高粱、大豆、小麦、燕麦或水稻具有的细胞，例如藻类、树或生产植物、果实或蔬菜（例如，树类如柑橘树、坚果树；茄属植物、棉花、烟草、番茄、葡萄、咖啡、可可等）。

在某些实施方案中，所述细胞是干细胞或干细胞系。

在某些情况下，本发明的宿主细胞包含基因或基因组的修饰，该修饰是在其野生型中不存在的修饰。

基因编辑方法和应用

本发明的Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物或者上述宿主细胞可用于以下任一或任意几个用途：靶向和/或编辑靶核酸；切割双链DNA、单链DNA或单链RNA；非特异性切割和/或降解侧枝核酸；非特异性切割单链核酸；核酸检测；检测目标样品中的核酸；特异性地编辑双链核酸；碱基编辑双链核酸；碱基编辑单链核酸。在其他的实施方式中，还可以用于制备用于上述任一或任意几个用途的试剂或试剂盒。

本发明还提供了上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物在基因编辑、基因靶向或基因切割中的应用；或者，在制备用于基因编辑、基因靶向或基因切割的试剂或试剂盒中的用途。

在一个实施方式中，所述基因编辑、基因靶向或基因切割为在细胞内和/或细胞外进行基因编辑、基因靶向或基因切割。

本发明还提供了一种编辑靶核酸、靶向靶核酸或切割靶核酸的方法，所述方法包括将靶核酸与上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物进行接触。在一个实施方式中，所述方法为在细胞内或细胞外编辑靶核酸、靶向靶核酸或切割靶核酸。

所述基因编辑或编辑靶核酸包括修饰基因、敲除基因、改变基因产物的表达、修复突变、和/或插入多核苷酸、基因突变。

所述编辑可以在原核细胞和/或真核细胞中进行编辑。

另一方面，本发明还提供了上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物在核酸检测中的应用，或在制备用于核酸检测的试剂或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明还提供了一种切割单链核酸的方法，所述方法包括，使核酸群体与上述Cas蛋白和gRNA接触，其中所述核酸群体包含靶核酸和多个非靶单链核酸，所述Cas蛋白切割所述多个非靶单链核酸。

所述gRNA能够结合所述Cas蛋白。

所述gRNA能够靶向所述靶核酸。

所述接触可以是在体外、离体或体内的细胞内部。

优选的，所述切割单链核酸为非特异性的切割。

另一方面，本发明还提供了上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物在非特异性的切割单链核酸中的应用，或在制备用于非特异性的切割单链核酸的试剂或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明还提供了一种用于基因编辑、基因靶向或基因切割的试剂盒，所述试剂盒包括上述Cas蛋白、gRNA、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物、上述活化的CRISPR复合物或上述宿主细胞。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测样品中的靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：(a) Cas蛋白，或编码所述Cas蛋白的核酸；(b) 指导RNA，或编码所述指导RNA的核酸，或包含所述指导RNA的前体RNA，或编码所述前体RNA的核酸；和(c)为单链的且不与所述指导RNA杂交的单链核酸检测器。

本领域知晓，前体RNA可被切割或加工成为上述成熟的指导RNA。

另一方面，发明提供了上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物、上述活化的CRISPR复合物或上述宿主细胞在制备制剂或试剂盒中的用途，所述制剂或试剂盒用于：

(i) 基因或基因组编辑；

(ii) 靶核酸检测和/或诊断；

(iii) 编辑靶基因座中的靶序列来修饰生物或非人类生物；

(iv) 疾病的治疗；

(iv) 靶向靶基因。

优选的，上述基因或基因组编辑为在细胞内或细胞外进行基因或基因组编辑。

优选的，所述靶核酸检测和/或诊断为在体外进行靶核酸检测和/或诊断。

优选的，所述疾病的治疗为治疗由靶基因座中的靶序列的缺陷引起的病症。

另一个方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与所述Cas蛋白、gRNA（指导RNA）和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的指导序列；检测由所述Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交。

特异性修饰靶核酸的方法

另一方面，本发明还提供了一种特异性修饰靶核酸的方法，方法包括：使靶核酸与上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物接触。

该特异性修饰可以发生在体内或者体外。

该特异性修饰可以发生在细胞内或者细胞外。

在一些情况下，细胞选自原核细胞或真核细胞，例如，动物细胞、植物细胞或微生物细胞。

在一个实施方式中，所述修饰是指所述靶序列的断裂，如，DNA的单链/双链断裂，或者RNA的单链断裂。

在一些情况下，所述方法还包括使靶核酸与供体多核苷酸接触，其中将供体多核苷酸、供体多核苷酸的部分、供体多核苷酸的拷贝或供体多核苷酸的拷贝的部分整合到靶核酸中。

在一个实施方式中，所述修饰还包括将编辑模板（例如外源核酸）插入所述断裂中。

在一个实施方式中，所述方法还包括：将编辑模板与所述靶核酸接触，或者递送至包含所述靶核酸的细胞中。在此实施方式中，所述方法通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述断裂的靶基因；在一些实施方式中，所述修复导致一种突变，包括所述靶基因的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代，在其他的实施方式中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。

检测（非特异切割）

另一方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物和单链核酸检测器接触；检测由所述Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸。

本发明中，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸；包括单链核酸、双链核酸，例如单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA。

在一个实施方式中，所述靶核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物等样品。优选的，所述靶核酸为PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM等方法富集或扩增的产物。

在一个实施方式中，所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸、与疾病相关的特异核酸，如特定的突变位点或SNP位点或与对照有差异的核酸；优选地，所述病毒为植物病毒或动物病毒，例如，乳头瘤病毒，肝DNA病毒，疱疹病毒，腺病毒，痘病毒，细小病毒，冠状病毒；优选地，所述病毒为冠状病毒，优选地，SARS、SARS-CoV2（COVID-19）、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。

本发明中，所述gRNA 与靶核酸上的靶序列至少有50%的匹配度，优选至少60%，优选至少70%，优选至少80%，优选至少90%。

在一个实施方式中，当所述的靶序列含有一个或多个特征位点（如特定的突变位点或SNP）时，所述的特征位点与gRNA完全匹配。

在一个实施方式中，所述检测方法中可以包含一种或多种导向序列互不相同的gRNA，其靶向不同的靶序列。

本发明中，所述单链核酸检测器包括但不限于单链DNA、单链RNA、DNA-RNA杂交体、核酸类似物、碱基修饰物、以及含有无碱基间隔物的单链核酸检测器等；“核酸类似物”包括但不限于：锁核酸、桥核酸、吗啉核酸、乙二醇核酸、己糖醇核酸、苏糖核酸、阿拉伯糖核酸、2’氧甲基RNA、2’甲氧基乙酰基RNA、2’氟RNA、2’氨基RNA、4’硫RNA及其组合，包括任选的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基。

本发明中，所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于荧光信号的检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

本发明中，优选的，所述单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的荧光信号。所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过胶体金检测的方式，检测所述单链核酸检测器被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后的胶体金测试结果；所述单链核酸检测器被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后在胶体金的检测线和质控线上将表现出不同的显色结果。

在一些实施方案中，检测靶核酸的方法还可以包括将可检测信号的电平与参考信号电平进行比较，以及基于可检测信号的电平确定样品中靶核酸的量。

在一些实施方案中，检测靶核酸的方法还可以包括在不同的通道上使用RNA报告核酸和DNA报告核酸（例如，荧光颜色），并通过测量RNA和DNA报告分子的信号电平，以及通过测量RNA和DNA报告分子中靶核酸的量来确定可检测信号的电平，基于组合（例如，使用最小或乘积）可检测信号的电平来采样。

在一个实施方式中，所述靶基因存在于细胞内。

在一个实施方式中，所述细胞是原核细胞。

在一个实施方式中，所述细胞是真核细胞。

在一个实施方式中，所述细胞是动物细胞。

在一个实施方式中，所述细胞是人类细胞。

在一个实施方式中，所述靶基因存在于体外的核酸分子（例如，质粒）中。

在一个实施方式中，所述靶基因存在于质粒中。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

Cas蛋白

在本发明中，Cas蛋白、Cas酶、Cas效应蛋白可以互换使用；本发明人首次发现并鉴定了一种Cas效应蛋白，其具有选自下列的氨基酸序列：

(i) SEQ ID No.1；

(ii) 与SEQ ID No.1所示的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加（例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加）的序列；或

(iii) 与SEQ ID No.1所示的序列具有至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的序列同一性的序列。

本文中的核酸切割或切割核酸包括:由本文所述Cas酶产生的靶核酸中的DNA或RNA断裂（Cis切割）、DNA或RNA在侧枝核酸底物（单链核酸底物）中的断裂（即非特异性或非靶向性，Trans切割）。在一些实施方式中，所述切割是双链DNA断裂。在一些实施方案中，切割是单链DNA断裂或单链RNA断裂。

CRISPR系统

如本文中所使用的，术语“规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR-相关(Cas) (CRISPR-Cas)系统”或“CRISPR系统”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义，其通常包含与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达有关的转录产物或其他元件，或者能够指导所述Cas基因活性的转录产物或其他元件。

CRISPR/Cas复合物

如本文中所使用的，术语“CRISPR/Cas复合物”是指，指导RNA(guide RNA)或成熟crRNA与Cas蛋白结合所形成的复合体，其包含杂交到靶序列的引导序列上并且与Cas蛋白结合的同向重复序列，该复合体能够识别并切割能与该指导RNA或成熟crRNA杂交的多核苷酸。

指导RNA(guide RNA，gRNA)

如本文中所使用的，术语“指导RNA(guide RNA，gRNA)”、“成熟crRNA” 、“指导序列”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，指导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat)和引导序列，或者基本上由或由同向重复序列和引导序列组成。

在某些情况下，指导序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。在一个实施方式中，当最佳比对时，指导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少99%。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

靶序列

“靶序列”是指被gRNA中的引导序列所靶向的多核苷酸，例如与该引导序列具有互补性的序列，其中靶序列与引导序列之间的杂交将促进CRISPR/Cas复合物（包括Cas蛋白和gRNA）的形成。完全互补性不是必需的，只要存在足够互补性以引起杂交并且促进一种CRISPR/Cas复合物的形成即可。

靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA。在某些情况下，所述靶序列位于细胞内或细胞外。在某些情况下，所述靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在某些情况下，该靶序列可位于真核细胞的一个细胞器例如线粒体或叶绿体内。可被用于重组到包含该靶序列的靶基因座中的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一个实施方式中，所述编辑模板为外源核酸。在一个实施方式中，该重组是同源重组。

在本发明中，“靶序列”或“靶多核苷酸”或“靶核酸”可以是对细胞（例如，真核细胞）而言任何内源或外源的多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种存在于真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。在某些情况下，该靶序列应该与原间隔序列临近基序(PAM)相关。

单链核酸检测器

本发明所述的单链核酸检测器是指含有2-200个核苷酸的序列，优选，具有2-150个核苷酸，优选，3-100个核苷酸，优选，3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。优选为单链DNA分子、单链RNA分子或单链DNA-RNA杂交体。

所述的单链核酸检测器两端包括不同的报告基团或标记分子，当其处于初始状态（即未被切割状态时）不呈现报告信号，当该单链核酸检测器被切割后，呈现出可检测的信号，即切割后与切割前表现出可检测的区别。

在一个实施方式中，所述的报告基团或标记分子包括荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述的单链核酸检测器具有连接至5’端第一分子（如FAM或FITC）和连接至3’端的第二分子(如生物素)。所述的含有单链核酸检测器的反应体系与流动条配合用以检测靶核酸（优选，胶体金检测方式）。所述的流动条被设计为具有两条捕获线，在样品接触端（胶体金）设有结合第一分子的抗体（即第一分子抗体），在第一线（control line）处含有结合第一分子抗体的抗体，在第二线（test line）处含有与第二分子结合的第二分子的抗体（即第二分子抗体，如亲和素）。当反应沿着条带流动时，第一分子抗体与第一分子结合携带切割或未切割的寡核苷酸至捕获线，切割的报告子将在第一个捕获线处结合第一分子抗体的抗体，而未切割的报告子将在第二捕获线处结合第二分子抗体。报告基团在各条线的结合将导致强读出/信号(例如颜色)。随着更多的报告子被切割，更多的信号将在第一捕获线处累积，并且在第二线处将出现更少的信号。在某些方面，本发明涉及如本文所述的流动条用于检测核酸的用途。在某些方面，本发明涉及用本文定义的流动条检测核酸的方法，例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。在某些方面，所述单链核酸检测器中的分子可相互替换，或改变分子的位置，只要其报告原理与本发明相同或相近，所改进的方式也均包含在本发明中。

本发明所述的检测方法，可用于待检测靶核酸的定量检测。所述的定量检测指标可以根据报告基团的信号强弱进行定量，如根据荧光基团的发光强度，或根据显色条带的宽度等。

野生型

如本文中所使用的，术语“野生型”具有本领域技术人员通常理解的含义，其表示生物、菌株、基因的典型形式或者当它在自然界存在时区别于突变体或变体形式的特征，其可从自然中的来源分离并且没有被人为有意地修饰。

衍生化

如本文中所使用的，术语“衍生化”是指，对氨基酸、多肽或蛋白的化学修饰，其中一个或多个取代基已与所述氨基酸、多肽或蛋白共价连接。取代基也可称为侧链。

衍生化的蛋白是该蛋白的衍生物，通常，蛋白的衍生化不会不利影响该蛋白的期望活性（例如，与指导RNA结合的活性、核酸内切酶活性、在指导RNA引导下与靶序列特定位点结合并切割的活性），也就是说蛋白的衍生物与蛋白有相同的活性。

衍生化蛋白

又称“蛋白衍生物”，是指蛋白的经修饰形式，例如其中所述蛋白的一个或多个氨基酸可以被缺失、插入、修饰和/或取代。

非天然存在的

如本文中所使用的，术语“非天然存在的”或“工程化的”可互换地使用并且表示人工的参与。当这些术语用于描述核酸分子或多肽时，其表示该核酸分子或多肽至少基本上从它们在自然界中或如发现于自然界中的与其结合的至少另一种组分游离出来。

直系同源物（orthologue, ortholog）

如本文中所使用的，术语“直系同源物（orthologue, ortholog）”具有本领域技术人员通常理解的含义。作为进一步指导，如本文中所述的蛋白质的“直系同源物”是指属于不同物种的蛋白质，该蛋白质执行与作为其直系同源物的蛋白相同或相似的功能。

同一性

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar, Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J. Mol. Biol. 48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E. Meyers和W. Miller(Comput. Appl Biosci.，4:11-17 (1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weightresidue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch (J MoI Biol. 48:444-453 (1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

载体

术语“载体”是指一种核酸分子，它能够运送与其连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的)的核酸分子；包括DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。一种载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的蛋白、融合蛋白、分离的核酸分子等(例如，CRISPR转录物，如核酸转录物、蛋白质、或酶)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的环状双链DNA环。

另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒)的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。

其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到该宿主细胞的基因组中，并且由此与该宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。

宿主细胞

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如微生物细胞、真菌细胞、动物细胞和植物细胞的真核细胞。

本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。

调控元件

如本文中所使用的，术语“调控元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)，其详细描述可参考戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段( (Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。

启动子

如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。

NLS

“核定位信号”或“核定位序列”(NLS)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有NLS的蛋白质被转运至细胞核。典型地，NLS包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的Lys或Arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的NLS：SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。在一些实施例中，该NLS包含PKKKRKV序列。在一些实施例中，该NLS包含AVKRPAATKKAGQAKKKKLD序列。在一些实施例中，该NLS包含PAAKRVKLD序列。在一些实施例中，该NLS包含MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN序列。在一些实施例中，该NLS包含KLKIKRPVK序列。其他核定位序列包括但不限于hnRNP A1的酸性M9结构域、酵母转录抑制子Matα2中的序列KIPIK和PY-NLS。

可操作地连接

如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。

互补性

如本文中所使用的，术语“互补性”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克或其他非传统类型形成一个或多个氢键的能力。互补百分比表示一个核酸分子中可与一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。

严格条件

如本文中所使用的，对于杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的一个核酸主要地与该靶序列杂交并且基本上不杂交到非靶序列上的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且取决于许多因素而变化。一般而言，该序列越长，则该序列特异性地杂交到其靶序列上的温度就越高。

杂交

术语“杂交”或“互补的”或“基本上互补的”是指核酸（例如RNA、DNA）包含使其能够非共价结合的核苷酸序列，即以序列特异性，反平行的方式（即核酸特异性结合互补核酸）与另一核酸形成碱基对和/或G/U碱基对，“退火”或“杂交”。

杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间可能存在错配。两个核酸之间杂交的合适条件取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域公知的变量。典型地，可杂交核酸的长度为8个核苷酸或更多（例如，10个核苷酸或更多，12个核苷酸或更多，15个核苷酸或更多，20个核苷酸或更多，22个核苷酸或更多，25个核苷酸或更多，或30个核苷酸或更多）。

应当理解，多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100%互补以特异性杂交。多核苷酸可包含60%或更高，65%或更高，70%或更高，75%或更高，80%或更高，85%或更高，90%或更高，95%或更高，98%或更高，99%或更高，99.5%或更高，或与其杂交的靶核酸序列中的靶区域的序列互补性为100%。

靶序列与gRNA的杂交代表靶序列和gRNA的核酸序列至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%的可以杂交，形成复合物；或者代表靶序列和gRNA的核酸序列至少有12个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或更多个碱基可以互补配对，杂交形成复合物。

表达

如本文中所使用的，术语“表达”是指，藉此从DNA模板转录成多核苷酸(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后藉此翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。

接头

如本文中所使用的，术语“接头”是指，由多个氨基酸残基通过肽键连接形成的线性多肽。本发明的接头可以为人工合成的氨基酸序列，或天然存在的多肽序列，例如具有铰链区功能的多肽。此类接头多肽是本领域众所周知的(参见例如，Holliger, P.等人（1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 ；Poljak, R. J.等人（1994) Structure2:1121-1123)。

治疗

如本文中所使用的，术语“治疗”是指，治疗或治愈病症，延缓病症的症状的发作，和/或延缓病症的发展。

受试者

如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物、植物和微生物。

动物

例如哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物（例如，小鼠或大鼠）、非人灵长类动物（例如，猕猴或食蟹猴）或人。在某些实施方式中，所述受试者（例如人）患有病症（例如，疾病相关基因缺陷所导致的病症）。

植物

术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。

发明的有益效果

本发明发现了一种新型的Cas酶，Blast结果显示，本申请的Cas酶与已经报道的Cas酶的一致性较低，其可以在体内和体外表现出核酸酶的活性，具有广泛的应用前景。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1. Cas-sf0740的PAM结构。

图2. Cas-sf0740对真核细胞编辑后的靶基因测序结果。

图3. Cas-sf0740用于单链靶核酸检测的荧光结果图。

图4. Cas-sf0740用于双链靶核酸检测的荧光结果图。

图5.Cas-sf0740对双链核酸的体外切割结果。

序列信息

具体实施方式

以下实施例仅用于描述本发明，而非限定本发明。除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORYMANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1. Cas蛋白的获得

发明人对未培养物的宏基因组进行分析，通过对去冗余、蛋白质聚类分析，鉴定得到了一个新的Cas酶。Blast结果显示，Cas蛋白与已报道的Cas蛋白的序列一致性较低，本发明中将其命名为Cas-sf0740，上述蛋白的氨基酸序列、编码核酸序列以及人源密码子优化后的核酸序列如下所示：

对上述蛋白所对应的gRNA的同向重复序列进行分析，结果显示：

Cas-sf0740蛋白对应的gRNA的同向重复序列为：

GUGCUACAAGCGAAAAAGAUCGCUUGUGAUUUGCAC（SEQ ID No.4）。

实施例2.Cas-sf0740蛋白PAM结构域鉴定

构建PAM文库，合成序列:

CGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCNNNNNNTCCCCTACGTGC TGCTGAAGTTGCCCGCAA，N为随机脱氧核苷酸，下划线为靶点序列。经Klenow酶补平后连入pacyc184载体。转化大肠杆菌后提取质粒形成PAM文库。gRNA Cas-sf0740-5'spacer120bp：

GUGCUACAAGCGAAAAAGAUCGCUUGUGAUUUGCACUCCCCUACGUGCUGCUGAAG（下划线区域为靶向区）

引物序列：TK-117：CGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT；

TK-111：GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCG；

PQ0076-PAM-F：ACACGTGGGTCTTCGGTTTCCGTGTT；

S6-PAM-after：ACTCAGCTGAACCGCTCTTCCG

获取Cas-sf0740蛋白偏好PAM库：50nM Cas-sf0740蛋白，50nM gRNA在缓冲液25℃，孵育10min。添加PAM文库质粒（10ng/μL），37℃孵育1h；85℃孵育20min。在上述体系中添加2.5U DreamTaq DNA Polymerase (5 U/µL) (Thermo Fisher Scientific)和4μL 2.5mMdNTP Mix（全式金），72℃孵育30min，进行切割末端的补平及3’端加A。对上述产物经试剂盒（Omega Gel Extraction Kit D2500）进行产物纯化。引物TK-117 和TK-111退火后与上述产物经T4 连接酶连接。得到的连接产物用引物PQ0076-PAM-F和S6-PAM-after进行PCR反应得到Cas-sf0740蛋白偏好PAM库，PCR产物进行二代测序，经分析得到PAM序列，使用Weblogo作图，结果如图1所示，Cas-sf0740识别的PAM序列为5’TTN-3’，其中，N=A/T/C/G。

实施例3. Cas-sf0740蛋白在动物细胞中的编辑效率

采用Cas-sf0740蛋白在动物细胞中验证其基因编辑的活性，针对中国仓鼠卵巢细胞（CHO）FUT8基因设计靶点，gR4-FUT8：TTA CTTACCCTTGGCTGTACCAGAAG，斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。载体pcDNA3.3经改造后带有EGFP荧光蛋白及PuroR抗性基因。经酶切位点BsmB1插入SV40 NLS-Cas-sf0740融合蛋白；经酶切位点Mfe1插入U6 启动子及gRNA 序列。CMV 启动子启动融合蛋白SV40 NLS-Cas-sf0740-NLS-GFP表达。蛋白Cas-sf0740-NLS与蛋白GFP用连接肽T2A进行连接。启动子EF-1α启动嘌呤霉素抗性基因表达。

铺板：CHO细胞融合度至70-80%进行铺板，12孔板中接种细胞数为8*10^4细胞/孔。

转染：铺板6-8h进行转染，125µl opti-MEM中加入3.25µl Lipo3000混匀；125µlopti-MEM中加入3ug质粒、10µl P3000,混匀。稀释好的Lipo3000与稀释后的质粒混合均匀，室温孵育5min。孵育好的混合液加入铺有细胞的培养基中进行转染。

加嘌呤霉素筛选：转染24h 加嘌呤霉素，终浓度10μg/ml。嘌呤霉素处理24h更换成正常培养基继续培养24h。

提DNA、PCR扩增编辑区附近、送hiTOM测序：细胞经胰酶消化处理后进行收集，经细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（百泰克）进行基因组DNA提取。对基因组DNA扩增靶点附近区域。PCR产物进行hiTOM测序。

测序数据分析，统计靶点位置上游10nt、下游10nt范围内的序列种类及比例，统计序列中SNV频率大于/等于1%或非SNV的突变频率大于/等于0.1%的序列，得到Cas-sf0740蛋白对靶点位置的编辑效率。

CHO细胞FUT8基因靶点序列：gR4-FUT8：

TTA CTTACCCTTGGCTGTACCAGAAG，斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。gRNA序列为：

GUGCUACAAGCGAAAAAGAUCGCUUGUGAUUUGCACCUUACCCUUGGCUGUACCAGAAG，下划线区域为靶向区。

采用上述相同的方法验证Cas-sf0740在293T细胞中的编辑效率，其中，293T细胞针对CHEK2基因靶点；gR3-CHEK2：TTC CATCCTGAAACACAAAGGCAA，斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区；gRNA序列为:GUGCUACAAGCGAAAAAGAUCGCU

UGUGAUUUGCACCAUCCUGAAACACAAAGGCAA，下划线区域为靶向区。

分析结果显示，Cas-sf0740在CHO细胞的gR4-FUT8的编辑效率为3.86%，编辑类型为InDel。Cas-sf0740在CHEK2细胞的gR3-CHEK2的编辑效率为14.82%，编辑类型主要为InDel，占比14.75%。经编辑后的靶核酸的部分测序结果如图2所示。

实施例4. Cas-sf0740蛋白在进行核酸检测时的应用

本实施例通过体外检测以验证Cas-sf0740的trans切割活性。本实施例中利用可以与靶核酸配对的gRNA引导Cas-sf0740蛋白识别并结合在靶核酸上；随后，Cas-sf0740蛋白激发对任意单链核酸的trans切割活性，从而切割体系里的单链核酸检测器；单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，如果单链核酸检测器被切割，则会激发荧光；在其他的实施方式中，单链核酸检测器的两端还可以设置成能够被胶体金检测的标记。

本实施例中选择靶核酸为单链DNA，ssDNA：

TCAAGCTGGTTCAATCTGTCAAGCAGCAGCAAAGCAAGAGCAGC ；

gRNA序列为:

GUGCUACAAGCGAAAAAGAUCGCUUGUGAUUUGCACUUGCUGCUGCUUGACAGAUU（下划线区域为靶向区）；

单链核酸检测器序列为FAM-TTATT-BHQ1；

采用如下反应体系：Cas-sf0740终浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，靶核酸终浓度为50nM, 单链核酸检测器终浓度200nM。37℃孵育，读取FAM荧光/30s。对照组1不添加靶核酸，对照组2不添加gRNA。

如图3所示，与对照相比，在有靶核酸及gRNA存在的情况下，Cas-sf0740能够切割体系里的单链核酸检测，快速的报告出荧光。以上实验反映出，配合单链核酸检测器，Cas-sf0740可以用于靶核酸的检测。图3中，1为Cas-sf0740添加靶核酸的实验结果，2为Cas-sf0740不添加靶核酸的对照组1，3为Cas-sf0740不添加gRNA的对照组2。

进一步选择靶核酸为双链DNA ，T-N-B-TTT，其序列为：

AACATTGGCCGCAAATTGCACAATttt CCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCA；双链DNA T-N-B-TTA，其序列为：

AACATTGGCCGCAAATTGCACAATtta CCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCA；双链DNA T-N-B-TTC，其序列为：

AACATTGGCCGCAAATTGCACAATttc CCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCA；双链DNA T-N-B-TTG，其序列为：

AACATTGGCCGCAAATTGCACAATttg CCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCA连入载体T-Vector-pEASY-Blunt Simple Cloning Vector；斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。gRNA Cas-sf0740-N-B-i3g1:

GUGCUACAAGCGAAAAAGAUCGCUUGUGAUUUGCACCCCCCAGCGCUUCAGCGUUC（下划线区域为靶向区）；

单链核酸检测器序列为FAM-TTATT-BHQ1；

采用如下反应体系：Cas终浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，双链靶核酸终浓度为5ng/µL, 单链核酸检测器终浓度200nM。37℃孵育，读取FAM荧光/30s。实验组添加靶核酸和gRNA，对照组不添加gRNA。

如图4所示，1、2、3、4为实验组添加靶核酸和gRNA，5、6、7、8为对照组不添加gRNA。与不加gRNA的对照相比，在有靶核酸和gRNA存在的情况下，Cas-sf0740与靶核酸、gRNA形成复合物后切割体系里的单链核酸，快速的报告出荧光。以上实验反映出，配合单链核酸检测器，Cas-sf0740可以用于双链靶核酸的检测。

实施例5. Cas-sf0740蛋白在进行双链核酸编辑的应用

本实施例通过体外检测测定Cas-sf0740蛋白双链DNA的切割活性。本实施例中利用可以与双链靶核酸配对的gRNA引导Cas-蛋白识别并结合在双链靶核酸上；随后，Cas蛋白激发对双链靶核酸的切割活性，从而切割体系里的双链靶核酸。切割后的双链靶核酸进行琼脂糖电泳检测。

本实施例中选择靶核酸为双链DNA（质粒），T-N-B-TTT，其序列为：

AACATTGGCCGCAAATTGCACAATttg CCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCA连入载体T-Vector-pEASY-Blunt Simple Cloning Vector；斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。gRNA为Cas-sf0740-N-B-i3g1：

采用如下反应体系：Cas终浓度为50nM，gRNA终浓度为500nM，双链靶核酸终浓度为5ng/µL。Cas蛋白、gRNA，25℃孵育10min；加入双链靶核酸，37℃孵育1h。1.0%琼脂糖电泳检测。实验组添加靶核酸和gRNA，对照组不添加gRNA。

如图5所示，泳道1为Trans15K DNA marker，泳道2、3、4、5分别为T-N-B-TTT、T-N-B-TTA、T-N-B-TTC、T-N-B-TTG的实验组，泳道6、7、8、9分别为T-N-B-TTT、T-N-B-TTA、T-N-B-TTC、T-N-B-TTG的对照组。在PAM序列为TTN时，与不添加gRNA的对照相比，含有靶核酸和gRNA的实验组能够有效切割体系里的双链核酸。实验结果表明Cas-sf0740可以用于双链靶核酸的编辑。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 新型Cas酶和系统以及应用

<130> SF093-1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 951

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas-sf0740

<400> 1

Met Lys Lys Trp Leu Arg Ser Tyr Asp Phe Ser Leu Glu Val Ser Glu

1 5 10 15

Glu Asp Thr Leu His Leu Leu Glu Cys Val Lys Glu Tyr Asn Glu Leu

20 25 30

Ser Lys Ala Tyr Met Asp Tyr Met Phe Lys Leu Lys Glu Asp His Lys

35 40 45

Asp Asp Leu Asp Val Cys Asn Leu Ile Glu Arg Leu Gln Asn Gly Ser

50 55 60

Gly Lys Glu Leu Arg Ala Leu Ala Ser Cys Ile Phe Gly Gly Arg Lys

65 70 75 80

Thr Ser Glu Asp Val Phe Leu Arg Val Lys Ser Tyr Lys Lys Ala Leu

85 90 95

Val Leu Ile Asp Ser Gly Glu Val Lys Thr Tyr Glu Asp Leu Ser Lys

100 105 110

Ser Leu Gly Glu Lys Thr Gly Leu Arg Gly Thr Asn Ser Leu Phe Lys

115 120 125

Glu Pro Lys Lys Glu Gly Lys Arg Lys Asp Arg Thr Gly Pro Leu Lys

130 135 140

Glu Asp Gln Ala Lys Lys Ile Asn Lys Met Leu Ala Ala Asp Leu Gly

145 150 155 160

Ile Val Ser Ala Leu Asn Leu Cys Gln Lys Gly Leu Leu Pro Ile Pro

165 170 175

Glu Phe Ala Lys Asn Val Glu Lys Leu Asn Lys Asn Val Leu Tyr Gly

180 185 190

Ile Ile Ser Gln Ala Gly Ser Arg Met Lys Ser Phe Leu Lys Cys Asp

195 200 205

Asp Leu Thr Gln Gln Asn His Leu Asn Leu Lys Glu Ile Leu Lys Ser

210 215 220

Tyr Arg Leu Glu Tyr Asn Leu Asp Glu Phe Gln Glu Gln Glu Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Gln Gln Trp Leu Ser Arg Met Lys Ser Leu Asn Ser Phe Ala Leu

245 250 255

Thr His Arg Phe Leu Gln Gly Trp Ala Lys Arg Trp Arg Lys Gln Phe

260 265 270

Leu Ala Gly Lys Asp Pro Ser Trp Thr Leu Gly Glu Glu Ala Thr Lys

275 280 285

Ile Cys Lys Glu Tyr Gln His Leu Phe Val Asp Asn Asp Phe Ile Tyr

290 295 300

Leu Phe Gly Lys Glu Asp Leu Leu Lys Leu Lys Val Glu Glu Arg Lys

305 310 315 320

Gln Asn Ala Gln Phe Thr Leu Pro Asp Val Ile Lys Ser Pro Ile Tyr

325 330 335

Pro Gln Leu Gly Asn Asn Gly Gln Gly Phe Gly Ile Glu Gln Val Asp

340 345 350

Asn Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gln Ser Cys Phe Ile Asp Arg Pro Asn

355 360 365

Ile Arg Ala Lys Ile Val Pro His Lys Lys Thr Ser Val Trp Ser Leu

370 375 380

Glu Gln Glu Asn Thr Lys Gln Thr Lys Lys Lys Asn Ala Gln Ile Asp

385 390 395 400

Lys Asn Lys Ile Pro Tyr Lys Leu Phe Leu Arg Arg Ala Ala Asp Arg

405 410 415

Tyr Glu Lys Gln Ile Glu Ile Ser Glu Cys Arg Leu Gln His Arg Phe

420 425 430

Cys Ser Gly Lys Ala Asn Phe His Val Val Phe Ser Leu Lys Gly Glu

435 440 445

Ala Asn Asp Thr Leu Thr Lys Ala Ser Thr Leu Phe Leu Thr Ala Thr

450 455 460

Gln Lys Pro Val Ser Glu Trp Ser Lys Asp Asn Leu Pro Lys Gln Met

465 470 475 480

Arg Val Ala Phe Val Asp Ile Gly Leu Asn Pro Pro Leu Ser Met Ser

485 490 495

Ile Tyr Asp Tyr Asn Gln Glu Asp Asn Ser Gly Glu Asn Leu Val Tyr

500 505 510

Ala Gly Ala Asp Gln Gln Val Pro Phe Gly Ser Ala Asn Phe Val Arg

515 520 525

Glu Asp Gln Ile Gly Asn Val Tyr Asn Gln Asn Leu Lys Arg Arg Ile

530 535 540

Glu Glu Leu Asn Asp Lys Ile Phe Tyr Ala Ser Ser Cys Val Ser Phe

545 550 555 560

Tyr Lys Asn Ile Ser Ser Leu Glu Gly Ala Thr Val Glu Leu Val Gly

565 570 575

Gly Arg Lys Val Met Cys Arg Gln Phe Asp Glu Glu Lys Val Lys Asp

580 585 590

Leu Tyr Ser Val Pro Val Lys Ala Leu Arg Glu Leu Gly Leu Asp His

595 600 605

Phe Phe Gly Leu Pro Glu Asp Leu Asp Gln Gln Asn Val Glu Ala Ala

610 615 620

Thr Phe Tyr Ile Glu Asn His Ile His His Asn Lys Leu Thr Arg Lys

625 630 635 640

Ser Phe Leu Ser Phe Arg Cys Lys Leu Trp Asp Tyr Ile His Glu Lys

645 650 655

Ile Leu Pro Glu Phe Ser Val Ile Arg Asn Gly Arg His Phe Gln Phe

660 665 670

Asn Lys Gln Phe Cys Ser Glu Ala Tyr Ser Trp Met Phe Leu Ile His

675 680 685

Ser Met Ile Arg Leu Lys Lys Ser Leu Ser Tyr Ser His Ser Glu Pro

690 695 700

Leu Lys Lys Gly Glu Pro Ala Thr Phe Val Phe Lys Asn Leu Gln Asn

705 710 715 720

Tyr Phe Asn Asn Phe Ser Lys Asn Val Leu Lys Thr Val Ala Ala Lys

725 730 735

Leu Arg Asp Tyr Cys Thr Thr His Asn Val Ser Leu Cys Val Val Glu

740 745 750

Asp Leu Glu Lys Phe Arg Thr Ser Ser Leu Asn Ser Lys Asp Lys Asn

755 760 765

Arg Leu Leu Ser Ile Trp Ser His Arg Asn Val Val Gln Arg Phe Glu

770 775 780

Glu Val Leu Thr Glu Val Gly Ile Thr Ile Val Ser Asn Asp Ala Arg

785 790 795 800

His Ser Ser Gln Leu Asp Pro Val Thr Met Asp Trp Ala Tyr Arg Asp

805 810 815

Glu Gln Asp Lys Ser Lys Leu Trp Val Lys Arg Asp Gly Glu Ile Phe

820 825 830

His Ile Asn Ala Asp Ile Ser Ser Thr Gln Val Gln Ala Lys Arg Phe

835 840 845

Phe Ser Arg Tyr Ala Asp Ile Val Tyr Met Lys Thr Leu Leu Lys Lys

850 855 860

Asp Asp Asn Gly Ser Leu Arg Lys Leu Val Val Ser Asp Asn Ser Thr

865 870 875 880

Arg Ile Gln Ser Tyr Leu Leu Arg Thr Ile Asn Ser Lys Tyr Ala Ile

885 890 895

Leu Glu Gln Asp Lys Leu Val Pro Ile Asn Gln Gln Glu Tyr Asn Gln

900 905 910

Ile Val Gly Leu Lys Thr Ser Gly Val Glu Glu Ile Tyr Arg His Gly

915 920 925

Glu Ser Trp Val Asn Leu Ile Thr His Lys Thr Leu Gln Lys Glu Ile

930 935 940

Gly Ala Arg Thr Asn Val Gln

945 950

<210> 2

<211> 2856

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas-sf0740

<400> 2

atgaaaaaat ggctacgatc ttacgatttc agtcttgagg tttctgagga agacacactt 60

catcttttag agtgcgtcaa ggaatacaac gaactttcca aagcatatat ggactatatg 120

tttaagttga aagaagatca caaagatgat cttgacgttt gtaacttaat tgagcgactt 180

caaaacggta gcggtaaaga acttcgtgcg ttggcatcct gtatatttgg aggcagaaaa 240

acgtcagaag atgtttttct cagagtcaaa agctacaaaa aagcccttgt tttaattgat 300

agtggtgaag taaaaaccta cgaggattta tcgaaatctc tgggtgaaaa gacgggattg 360

cgtggcacaa atagtttgtt caaggaaccc aaaaaagaag gtaaacgaaa agacagaacg 420

gggccactta aagaagatca agcaaaaaaa atcaacaaaa tgctcgctgc cgaccttggc 480

atcgtttctg ctttgaatct ttgtcaaaag ggtttactcc ccattccaga atttgccaaa 540

aatgttgaaa aactaaataa gaatgtttta tatggaataa tttcccaagc aggttcaaga 600

atgaaatcat tcttgaaatg cgatgattta acccaacaaa accatttgaa tttaaaggaa 660

atacttaaat cttatcgttt agaatacaat ttggatgaat tccaagagca agaagcgagt 720

tatcaacaat ggctgtctcg catgaagtct cttaattctt tcgctttgac ccatcgtttc 780

cttcaaggct gggcaaaaag atggcgaaag caatttcttg ctggcaaaga cccctcttgg 840

acattgggag aagaggctac taaaatttgt aaggaatatc aacatttatt tgttgataat 900

gatttcattt atctttttgg gaaagaagat ttactcaaac tcaaagttga agaaagaaag 960

caaaatgcac aatttaccct accagatgta attaaatctc caatttatcc acaattgggg 1020

aataatggtc aagggttcgg catagaacag gttgacaatg atatttatct gattattcag 1080

tcttgtttta ttgatagacc taatattcgt gcgaaaattg taccgcacaa aaagacttct 1140

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aagaataaaa tcccatataa gttgtttttg cgtcgtgccg ctgatcgcta tgaaaaacag 1260

atcgaaatta gcgaatgtcg attacagcat agattttgtt caggcaaagc taattttcat 1320

gttgtatttt ctttgaaagg ggaagcaaac gacactttaa ctaaagcctc taccctcttt 1380

cttacagcaa cccaaaaacc agtgtccgaa tggagcaaag ataatctgcc aaaacaaatg 1440

cgagtggcat ttgtagatat tggactaaat cccccattga gtatgtctat ctatgattat 1500

aatcaggaag ataattcagg ggaaaacctt gtctatgccg gtgccgatca acaagttcct 1560

tttggctctg ccaactttgt tcgtgaagac caaattggga atgtttataa tcagaacctt 1620

aaaagacgaa ttgaagaatt gaatgacaaa atcttctacg catcttcttg tgtttctttt 1680

tataagaata tttcatcact agagggtgca acagtcgaac ttgttggcgg caggaaggtt 1740

atgtgccgcc aatttgatga agagaaagtc aaagatttat atagcgtccc cgtcaaagca 1800

ttgcgagaat tgggattaga tcattttttt ggactgccag aagatttgga ccaacaaaat 1860

gttgaggcgg ctaccttcta tatcgagaat catatacatc acaacaagct cacacggaaa 1920

tcgtttttga gctttcgatg taaactctgg gattatatcc acgagaagat tctacctgaa 1980

ttttcagtga tccgaaatgg tcgccatttt cagtttaaca aacagttttg ttcggaagcc 2040

tattcttgga tgttccttat tcattccatg attagactca agaaatcttt gagttacagt 2100

cacagcgaac ctctcaagaa aggcgaacca gcaacctttg tgtttaagaa tttgcaaaat 2160

tatttcaata atttcagcaa aaatgtattg aagaccgtgg cagcgaaatt gagagattat 2220

tgtacaacac ataatgtttc tctatgtgtt gttgaagatt tggaaaaatt cagaacaagt 2280

tctcttaatt ccaaagacaa aaaccgtctc ttgtctattt ggagccatcg taacgtagtg 2340

caacgatttg aagaggtttt gaccgaagtg ggaattacca tcgtatcaaa cgatgcacgg 2400

cattcaagcc aactcgatcc agtaacaatg gattgggctt atcgtgacga acaagacaag 2460

agtaaacttt gggttaagcg tgatggcgag atatttcata tcaatgccga tatttcttcg 2520

actcaagttc aagctaaacg gtttttcagc cgctacgcag atattgttta tatgaagact 2580

ttgttgaaaa aagatgataa tggttcttta aggaaacttg tcgtatccga taattcgaca 2640

agaatccaaa gctatttgct ccgcacaatt aacagcaaat acgccatttt agagcaagat 2700

aaacttgttc caatcaatca acaagaatat aatcaaatcg taggacttaa aacgtctggg 2760

gtagaagaaa tctatcgaca tggagagtct tgggtaaact tgataaccca taaaactctg 2820

caaaaagaaa tcggtgcgag aaccaacgtg caatga 2856

<210> 3

<211> 2856

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas-sf0740-hu

<400> 3

atgaagaagt ggctgagaag ctacgacttc agcctggagg tgagcgagga ggacacactg 60

catctgctgg agtgtgtgaa ggagtacaac gagctgagca aggcctacat ggactacatg 120

ttcaagctga aggaggacca caaggacgac ctggacgtgt gcaacctgat cgagagactg 180

cagaacggca gcggcaaaga gctgagagct ctggctagct gtattttcgg cggcagaaaa 240

accagcgagg acgtgttcct gagagtgaag agctacaaga aggccctggt gctgatcgac 300

agcggcgaag tgaaaaccta tgaggacctg agcaagagcc tgggcgagaa gacaggcctt 360

agaggcacaa acagcctgtt taaggagccc aagaaggagg gcaagagaaa ggacagaacc 420

ggccccctga aagaggacca agccaaaaaa attaacaaga tgctggccgc cgacctgggc 480

attgtgtctg ctcttaatct gtgtcagaag ggcctgctgc ccatccccga atttgccaaa 540

aacgtggaga agctgaacaa gaacgtgctg tacggcatca tcagccaggc cggcagcaga 600

atgaagagct tcctgaagtg cgacgacctg acccagcaga accacctgaa cctgaaggag 660

atcctgaaga gctacagact ggagtacaac ctggacgagt tccaggagca ggaggccagc 720

tatcagcaat ggctgagcag aatgaagagc ctgaacagct tcgccctgac ccacagattc 780

ctgcagggct gggctaaaag atggagaaag cagttcctgg ccggcaagga ccccagctgg 840

acacttggag aagaagctac aaagatttgc aaggagtacc agcacctgtt cgtggacaac 900

gacttcatct acctgttcgg caaggaggac ctgctgaagc tgaaggtgga ggagagaaag 960

cagaacgccc agttcaccct gcccgacgtg ataaaaagcc ccatttatcc ccagctgggc 1020

aacaacggcc agggctttgg aattgagcag gtggacaatg acatctacct gatcatccag 1080

agctgcttca tcgacagacc caacatcaga gccaagatcg tgccccacaa gaagaccagc 1140

gtgtggagcc tggaacagga gaatacaaag cagaccaaga agaagaacgc ccagatcgac 1200

aagaacaaga tcccctacaa gctgttcctg agaagagccg ccgacagata cgagaagcag 1260

atcgagatca gcgagtgcag actgcagcac agattctgca gcggcaaggc caatttccac 1320

gtggtgttca gcctgaaggg cgaggccaat gacaccctga caaaagccag cacactgttc 1380

ctgaccgcca cacagaaacc cgtgagcgag tggtctaaag acaacctgcc caagcagatg 1440

agagtggcct tcgtggacat cggcctgaac ccccctctta gcatgtctat ttacgactac 1500

aaccaggagg acaacagcgg cgagaacctg gtgtatgccg gcgctgatca acaagtgcct 1560

tttggaagcg ctaacttcgt gagagaggac cagatcggca acgtgtacaa ccagaacctg 1620

aagagaagaa tcgaggagct gaacgacaag atcttctacg ccagcagctg cgtgagcttc 1680

tacaagaaca tcagcagcct ggagggcgcc accgtggaac ttgtgggagg aagaaaagtg 1740

atgtgcagac agttcgacga ggagaaggtg aaggacctgt acagcgtgcc cgtgaaggcc 1800

ctgagagaac tgggacttga ccatttcttt ggcctgcctg aagacctgga tcagcagaac 1860

gtggaggccg ccacatttta cattgagaac cacatccacc acaacaagct gaccagaaag 1920

agcttcctga gcttcagatg caagctgtgg gactacatcc acgagaagat cctgcccgag 1980

ttcagcgtga tcagaaacgg cagacacttc cagttcaaca agcagttctg cagcgaggcc 2040

tacagctgga tgttcctgat ccacagcatg atcagactga agaagagcct gagctacagc 2100

cacagcgagc ccctgaaaaa gggcgagccc gctacatttg tgttcaagaa tctgcagaac 2160

tacttcaaca acttcagcaa gaacgtgctg aagaccgtgg ccgccaaact gagagattat 2220

tgcaccaccc acaacgtgag cctgtgcgtg gtggaagacc tggagaaatt cagaaccagc 2280

agcctgaaca gcaaggacaa gaacagactg ctgagcatct ggagccacag aaacgtggtg 2340

cagagattcg aggaggtgct gaccgaggtg ggcattacca ttgtgagcaa tgacgccaga 2400

cacagcagcc agctggaccc cgtgacaatg gattgggctt atagagatga gcaggacaag 2460

agcaagctgt gggtgaagag agatggcgag atcttccaca tcaacgccga catcagcagc 2520

acccaggtgc aggctaaaag attcttcagc agatacgccg acatcgtgta catgaagacc 2580

ctgctgaaga aggacgacaa cggcagcctg agaaagctgg tggtgagcga caatagcacc 2640

agaatccaga gctacctgct gagaaccatc aacagcaagt acgccatcct ggagcaggac 2700

aagctggtgc ccattaacca gcaggagtac aaccagatcg tgggcctgaa gaccagcggc 2760

gtggaagaaa tttatagaca cggcgagagc tgggtgaacc tgatcaccca taaaaccctg 2820

cagaaggaga tcggcgccag aaccaatgtg cagtga 2856

<210> 4

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas-sf0740-DR

<400> 4

gugcuacaag cgaaaaagau cgcuugugau uugcac 36

Claims

1.一种Cas蛋白，其特征在于，所述Cas蛋白为以下I-III任一所述的Cas蛋白：

I、Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少95%的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；

II、所述Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；

III、所述Cas蛋白包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1所述的Cas蛋白和其他的修饰部分。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述Cas蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列。

4.一种gRNA，其特征在于，所述gRNA包括能够结合权利要求1所述的Cas蛋白的同向重复序列和能够靶向靶序列的引导序列。

5.一种同向重复序列，其特征在于，所述同向重复序列包含SEQ ID No.4所示的序列。

6.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。

7.一种CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1所述的Cas蛋白以及至少一种权利要求4所述的gRNA。

8.一种载体系统，其特征在于，所述载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：

a)第一调控元件，该第一调控元件可操作地与权利要求4所述的gRNA连接，

b)第二调控元件，该第二调控元件可操作地与权利要求1所述的Cas蛋白连接；

其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上。

9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：

(i) 蛋白组分，其选自：权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白；

(ii) 核酸组分，其选自：权利要求4所述的gRNA，或编码权利要求4所述的gRNA的核酸，或权利要求4所述的gRNA的前体RNA，或编码权利要求4所述的gRNA的前体RNA核酸；

所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。

10.一种活化的CRISPR复合物，所述活化的CRISPR复合物包含：

(iii)结合在权利要求4所述的gRNA上的靶序列。

11.一种工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求6所述的载体，或权利要求7所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求8所述的载体系统，或权利要求9所述的组合物，或权利要求10所述的活化的CRISPR复合物。

12.权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求6所述的载体，或权利要求7所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求8所述的载体系统，或权利要求9所述的组合物，或权利要求10所述的活化的CRISPR复合物，或权利要求11所述的宿主细胞在基因编辑、基因靶向或基因切割中的应用；或者，在制备用于基因编辑、基因靶向或基因切割的试剂或试剂盒中的用途。

13.权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求6所述的载体，或权利要求7所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求8所述的载体系统，或权利要求9所述的组合物，或权利要求10所述的活化的CRISPR复合物，或权利要求11所述的宿主细胞在选自如下任一或任意几种中的应用：

靶向和/或编辑靶核酸；切割双链DNA、单链DNA或单链RNA；非特异性切割和/或降解侧枝核酸；非特异性的切割单链核酸；核酸检测；特异性地编辑双链核酸；碱基编辑双链核酸；碱基编辑单链核酸。

14.一种编辑靶核酸、靶向靶核酸或切割靶核酸的方法，所述方法包括将靶核酸与权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求6所述的载体，或权利要求7所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求8所述的载体系统，或权利要求9所述的组合物，或权利要求10所述的活化的CRISPR复合物，或权利要求11所述的宿主细胞进行接触。

15.一种切割单链核酸的方法，所述方法包括，使核酸群体与权利要求1所述的Cas蛋白和权利要求4所述的gRNA接触，其中所述核酸群体包含靶核酸和至少一个非靶单链核酸，所述gRNA能够靶向所述靶核酸，所述Cas蛋白切割所述非靶单链核酸。

16.一种用于基因编辑、基因靶向或基因切割的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求6所述的载体，或权利要求7所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求8所述的载体系统，或权利要求9所述的组合物，或权利要求10所述的活化的CRISPR复合物，或权利要求11所述的宿主细胞。

17.一种用于检测样品中的靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：(a) 权利要求1所述的Cas蛋白，或编码所述Cas蛋白的核酸；(b) 权利要求4所述的gRNA，或编码所述gRNA的核酸，或包含所述gRNA的前体RNA，或编码所述前体RNA的核酸；和(c)为单链的且不与所述gRNA杂交的单链核酸检测器。

18.权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求6所述的载体，或权利要求7所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求8所述的载体系统，或权利要求9所述的组合物，或权利要求10所述的活化的CRISPR复合物，或权利要求11所述的宿主细胞在制备制剂或试剂盒中的用途，所述制剂或试剂盒用于：

(i) 基因或基因组编辑；

(ii) 靶核酸检测和/或诊断；

(iii) 编辑靶基因座中的靶序列来修饰生物或非人类生物；

(iv) 疾病的治疗；

(v) 靶向靶基因；

(vi) 切割目的基因。

19.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与权利要求1所述的Cas蛋白、gRNA（指导RNA）和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的指导序列；检测由所述Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交。