CN102010890B - 线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒，含有试剂1和试剂2，所述试剂1含有天门冬氨酸蛋白酶、α-酮戊二酸、L-天门冬氨酸、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、防腐剂和PEG6000。所述试剂1中的天门冬氨酸蛋白酶、苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的酶活力比为(0.1-50)∶(0.1-50)∶(0.1-10)，α-酮戊二酸与苹果酸脱氢酶的比为(0.5-60)g∶(0.1-50)KU；α-酮戊二酸、L-天门冬氨酸、防腐剂和PEG6000的质量比为(0.5-60)∶(5-200)∶(0.2-10)∶(1-100)。所述试剂2中的NADH、防腐剂和EDTA·2Na的质量比为(0.5-10)∶(0.2-10)∶(1-50)。本发明的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的活性，不受高细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶的干扰，结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒。
背景技术
天门冬氨酸氨基转移酶存在两种同工酶，即线粒体天门冬氨酸氨基转移酶和细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶。线粒体天门冬氨酸氨基转移酶和细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶是1950被Hird和Rowsell发现并在1960年被Fleisher等用电泳确证的，实验表明：在碱性溶液中，线粒体天门冬氨酸氨基转移酶向阴极移动，而细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶向阳极移动。
线粒体天门冬氨酸氨基转移酶和细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶广泛存在于人体各种组织细胞中，以肝、心细胞含量最为丰富。其中线粒体天门冬氨酸氨基转移酶存在于线粒体内，而细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶则存在于细胞浆内，属细胞内同工酶。细胞作为一个整体，其中的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶含量占80％，而细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶含量只占20％。
线粒体天门冬氨酸氨基转移酶和细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶这两种同工酶都是由两条相同的多肽亚单位所组成，每个亚单位的相对分子量是46,000，整个酶的分子量是92,000。这两种同工酶在相应的基因组成上有差异，在氨基酸组成和免疫特性上不同。在细胞轻度损害时，主要是细胞浆内的细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶透过细胞膜释放入血，而线粒体内的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶有两层线粒体膜的保护，不易释放入血。线粒体内的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶浓度一般比血清中的浓度高数千倍，当细胞炎症、坏死等使细胞严重损害时，线粒体天门冬氨酸氨基转移酶迅速释放入血，因此测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶作为判定肝脏、心脏的损害程度及预后的评价指标，对疾病的诊断、治疗、疗效及护理有重要价值。
线粒体天门冬氨酸氨基转移酶与CK、CK-MB及ALT相比，CK、CK-MB及ALT均为细胞质酶，当缺血、缺氧使细胞通透性改变时，即可释放入血，其增高不完全说明细胞坏死损伤，而此时线粒体中的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶不释放入血，故同时测定细胞不同部位的酶可鉴别细胞损伤的程度。以线粒体天门冬氨酸氨基转移酶为细胞坏死指示酶，对肝细胞坏死的诊断有重要应用价值。如急性肝炎时，肝细胞内的线粒子体严重破坏，线粒体天门冬氨酸氨基转移酶升高。当肝细胞不再继续破坏时迅速下降，表示预后较好；反之，说明肝细胞仍继续坏死，疾病可能趋向慢性化。再如线粒体天门冬氨酸氨基转移酶在乙醇性肝炎时明显增高，说明该病为肝细胞坏死性损伤；线粒体AST与总AST的比值有助于鉴别诊断酒精性肝炎与其他肝病。肝脏手术前测定血清线粒体天门冬氨酸氨基转移酶，对手术的成功及预后有重要意义，对肝脏手术术前指征的判定有重要应用价值。
以线粒体天门冬氨酸氨基转移酶为细胞坏死指示酶，对急性心肌梗死的诊断也具有重要应用价值。线粒体天门冬氨酸氨基转移酶活性峰与总CK、CK-MB或细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶的活性峰略相关，因此，可疑急性心肌梗死患者测定线粒体AST，能提供这类患者通常测定的酶及同工酶所不能提供的新信息。在缺氧阶段细胞膜通透性改变，CK酶和其他细胞浆酶就从细胞释放了，即使此时尚无细胞坏死。这些酶释放不是细胞坏死的标志。另一方面，CK和其他细胞浆酶反映心肌组织损害的面积，线粒体AST的释放更多地反映亚细胞坏死损伤的严重程度。心脏手术前测定血清线粒体天门冬氨酸氨基转移酶，对手术的成功及预后有重要意义，对心脏手术术前指征的判定有重要应用价值。
目前，血清中线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的测定主要有电泳、层析法以及免疫学方法包括酶免、放免，免疫抑制法等。电泳、层析法测定时费时，难于自动化测定，不能用于临床大规模标本的应用。由于上述方法学的缺陷导致线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的测试长期不能在临床上的到广泛开展，因而肝脏和心脏等脏器损伤的严重程度缺乏直接的指标。
发明内容
本发明的目的是提供一种不受细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶的干扰，结果准确的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒，以弥补上述缺陷。
本发明的所提供的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒，含有试剂1和试剂2，所述试剂1含有天门冬氨酸蛋白酶、α-酮戊二酸、L-天门冬氨酸、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、防腐剂和PEG6000；所述试剂2含有NADH、防腐剂和EDTA·2Na。
所述试剂1中的天门冬氨酸蛋白酶、苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的酶活力比为(0.1-50)∶(0.1-50)∶(0.1-10)，α-酮戊二酸与苹果酸脱氢酶的比为(0.5-60)g∶(0.1-50)KU；α-酮戊二酸、L-天门冬氨酸、防腐剂和PEG6000的质量比为(0.5-60)∶(5-200)∶(0.2-10)∶(1-100)。
所述试剂2中的NADH、防腐剂和EDTA·2Na的质量比为(0.5-10)∶(0.2-10)∶(1-50)。
试剂1中所述α-酮戊二酸和试剂2中所述NADH的质量比为(0.5-60)∶(0.5-10)。
所述防腐剂为PC300或NaN3。
所述试剂1和2都为溶液，其溶剂也都为水。
所述试剂1和所述试剂2还含有三羟甲基氨基甲烷和盐酸。
所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为(1-25)g/L，所述盐酸的浓度为(1-20)ml/L。
所述天门冬氨酸蛋白酶的浓度为0.1KU/L-50KU/L。
本发明的线粒天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒，不受高细胞浆天门冬氨酸氨基转移酶的干扰，结果准确；可用全自动生化分析仪，亦可手工或半自动测定，适用于大、中、小各层次医院。
具体实施方式
实施例1线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的测定
使用本发明的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶，该试剂盒包括试剂1和试剂2，并且试剂1和试剂2均为液体制剂，在测定时试剂1和2结合使用。
其中，试剂1的溶剂为水，其溶质如表1所示：
表1.试剂1中的溶质
| 三羟甲基氨基甲烷(Tris) | 1g/L |
| HCl | 1ml/L |
| 苹果酸脱氢酶 | 0.1KU/L |
| 乳酸脱氢酶 | 0.1KU/L |
| PC300 | 0.2g/L |
| 天门冬氨酸蛋白酶 | 0.1KU/L |
| PEG6000 | 1g/L |
| α-酮戊二酸 | 0.5g/L |
| L-天门冬氨酸 | 5g/L |
试剂2的溶剂为水，溶质如表2所示：
表2.试剂2中的溶质
| Tris | 1g/L |
| HCl | 1ml/L |
| NaN3 | 0.2g/L |
| NADH | 0.5g/L |
| EDTA·2Na | 1g/L |
待测样品：人的不溶血的血清或肝素抗凝血浆样品7份，用免疫学方法测定7份样品的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶，结果如表3所示。
表3.免疫学测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的结果
| 编号 | 线粒体天门冬氨酸氨基转移酶(U/L) |
| 1 | 5.2 |
| 2 | 1.3 |
| 3 | 6.2 |
| 4 | 15.4 |
| 5 | 2.1 |
| 6 | 58.5 |
| 7 | 310 |
两步法测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶活性的方法如下：
设置空白管、标准管和测定管，按照表4所示的反应体系加入反应物：
表4.测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的反应体系
延迟时间60秒，然后用生化分析仪比色测定，测定时间180秒，主波长340nm，副波长405nm，以空白管调零，测定各管ΔA/min。
按照如下公式计算线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的活性：
线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的活性(U/L)＝ΔA(测定管-空白管)/min*3376
测定后的结果如表5所示。
表5.实施例1的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒的测定结果
| 编号 | ΔA(测定管-空白管)/min | 线粒体天门冬氨酸氨基转移酶(U/L) |
| 1 | 0.0016 | 5.4 |
| 2 | 0.0005 | 1.7 |
| 3 | 0.0017 | 5.7 |
| 4 | 0.0046 | 15.5 |
| 5 | 0.006 | 20.3 |
| 6 | 0.0171 | 57.7 |
| 7 | 0.092 | 310.6 |
从表5结果可以看出：使用本发明的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的结果准确。
实施例2线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定
使用本发明的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶，该试剂盒包括试剂1和试剂2，并且试剂1和试剂2均为液体制剂，，在测定时试剂1和2结合使用。
其中，试剂1的溶剂为水，其溶质如表6所示：
表6.试剂1中的溶质
| Tris | 25g/L |
| HCl | 20ml/L |
| 苹果酸脱氢酶 | 50KU/L |
| 乳酸脱氢酶 | 10KU/L |
| NaN3 | 10g/L |
| 天门冬氨酸蛋白酶 | 50KU/L |
| PEG6000 | 100g/l |
| α-酮戊二酸 | 60g/L |
| L-天门冬氨酸 | 200g/L |
试剂2的溶剂为水，其溶质如表7所示：
表7.试剂2中的溶质
| Tris | 25g/L |
| HCl | 20ml/L |
| NaN3 | 10g/L |
| NADH | 10g/L |
| EDTA·2Na | 50g/L |
待测样品：实施例1中的7份人的不溶血的血清或肝素抗凝血浆样品测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶活性的方法同实施例1中的两步法相同。
测定后的结果如表8所示。
表8.实施例2的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒的测定结果
| 编号 | ΔA(测定管-空白管)/min | 线粒体天门冬氨酸氨基转移酶(U/L) |
| 1 | 0.0016 | 5.3 |
| 2 | 0.0005 | 1.8 |
| 3 | 0.0018 | 6 |
| 4 | 0.0048 | 16.2 |
| 5 | 0.0060 | 20.1 |
| 6 | 0.0172 | 58.1 |
| 7 | 0.0924 | 312.1 |
从表8结果看出：使用本发明的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的结果准确。
实施例3线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的测定
线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的测定使用本发明的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒，该试剂盒包括试剂1和试剂2，并且试剂1和试剂2均为液体制剂，在测定时试剂1和2结合使用。
其中，试剂1的溶剂为水，其溶质如表9所示：
表9.试剂1中的溶质
| Tris | 12.25g/L |
| HCl | 16.5ml/L |
| 苹果酸脱氢酶 | 2KU/L |
| 乳酸脱氢酶 | 2KU/L |
| NaN3 | 1g/L |
| 天门冬氨酸蛋白酶 | 8KU/L |
| PEG6000 | 10g/L |
| α-酮戊二酸 | 5g/L |
| L-天门冬氨酸 | 15g/L |
试剂2的溶剂为水，溶质如表10所示：
表10.试剂2中的溶质
| Tris | 12.25g/L |
| HCl | 16.5ml/L |
| NaN3 | 1g/L |
| NADH | 2.5g/L |
| EDTA·2Na | 5g/L |
待测样品：实施例1中的7份人的不溶血的血清或肝素抗凝血浆样品。
测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶活性的方法同实施例1中的两步法相同。
测定后的结果如表11所示。
表11.实施例3的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒的测定结果
| 编号 | ΔA(测定管-空白管)/min | 线粒体天门冬氨酸氨基转移酶(U/L) |
| 1 | 0.0015 | 5.1 |
| 2 | 0.0005 | 1.7 |
| 3 | 0.0018 | 6.1 |
| 4 | 0.0046 | 15.5 |
| 5 | 0.0061 | 20.6 |
| 6 | 0.0174 | 58.7 |
| 7 | 0.0930 | 314.0 |
从表11结果可以看出：使用本发明的线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒测定线粒体天门冬氨酸氨基转移酶的结果准确。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (1)
1.一种线粒体天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒，含有试剂1和试剂2，所述试剂1含有天门冬氨酸蛋白酶、α-酮戊二酸、L-天门冬氨酸、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、防腐剂和PEG6000；所述试剂2含有NADH、防腐剂和EDTA·2Na；
所述试剂1中的天门冬氨酸蛋白酶、苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的酶活力比为（0.1-50）:（0.1-50）:（0.1-10），α-酮戊二酸的质量与苹果酸脱氢酶的比为(0.5-60)g:（0.1-50）KU；α-酮戊二酸、L-天门冬氨酸、防腐剂和PEG6000的质量比为（0.5-60）:（5-200）:（0.2-10):（1-100)；
所述试剂2中的NADH、防腐剂和EDTA·2Na的质量比为（0.5-10）:（0.2-10）:（1-50）；
所述α-酮戊二酸和NADH的质量比为（0.5-60):（0.5-10）；
所述防腐剂为PC300或NaN3；
所述试剂1和2都为溶液，其溶剂为水；
所述试剂1和试剂2进一步包括三羟甲基氨基甲烷和盐酸，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为1-25g/L，所述盐酸的浓度为1-20ml/L；
所述天门冬氨酸蛋白酶的浓度为0.1KU/L-50KU/L。
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