FR2788603A1 - PROCEDE D'IMMUNOANALYSE D'UNE PROTEINE MATRICIELLE OLIGOMERIQUE DU CARTILAGE -comp-, SONDE ANTIGENIQUE, ANTICORPS ET NECESSAIRE D'IMMUNOANALYSE UTILISE POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE - Google Patents
PROCEDE D'IMMUNOANALYSE D'UNE PROTEINE MATRICIELLE OLIGOMERIQUE DU CARTILAGE -comp-, SONDE ANTIGENIQUE, ANTICORPS ET NECESSAIRE D'IMMUNOANALYSE UTILISE POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne l'immunoanalyse, par les fluides biologiques, de la protéine COMP, qui est un traceur intéressant dans la sémiologie des maladies articulaires. Le but de l'invention est la mise au point d'une technique perfectionnée de détection et de dosage de la COMP dans les fluides biologiques, qui permette de s'affranchir des inconvénients liés à la purification de la COMP et aux faux positifs trombospondines. L'invention a consisté à isoler et à sélectionner une séquence peptidique hautement spécifique de la COMP (séquence de reconnaissance spécifique = SRS) Cette SRS comprend au plus 50 acides aminés. Elle est située dans l'une des extrémités N-terminale d'au moins l'une des sous unités formant la COMP. SRS est de préférence : GlnGlyGlnSerProLeuGlySerAspLeuGlyProGlnMetLeu Le procédé d'immunoanalyse de la COMP selon l'invention consiste à utiliser des anticorps anti-SRS. L'invention concerne également la sonde d'immunoanalyse consituée par SRS; les anticorps anti-SRS et le nécessaire d'immunoanalyse pour la mise en oeuvre du procédé.
Description
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Le domaine de l'invention est celui de l'analyse biologique et biochimique par mise en oeuvre de techniques de dosages immunologiques, dans lesquelles la révélation de la réaction antigène-anticorps peut se faire notamment par voie enzymatique (colorimétrie), par fluorescence, voire par radioactivité.
Plus précisément, l'invention concerne un procédé d'immunoanalyse qualitative et quantitative de tout ou partie d'une protéine matricielle oligomérique du cartilage - dénommée COMP-.
L'invention est également relative aux moyens utilisés notamment pour la mise en oeuvre de ce procédé d'immuno-analyse.
Ces moyens sont constitués par une sonde antigénique de nature peptidique et par des anticorps primaires AcI de reconnaissance de cette sonde.
L'invention a également trait au procédé d'obtention de la sonde et des AcI, de même qu'à l'application de cette sonde et de ces AcI pour la détection et le dosage de la COMP en vue du diagnostic, du pronostic ou d'études cliniques de maladies articulaires.
Enfin, l'invention vise à un nécessaire d'immunoanalyse de la COMP selon le procédé susmentionné.
Le terme COMP est un accronyme anglais désignant "Cartilage Oligomeric Matrix Protein".
La COMP est donc une glycoprotéine oligomérique non collagénique synthétisée par les chondrocytes présents dans tous les types de cartilages. Cette protéine possède une masse moléculaire d'environ 524 kDa Sa structure est de type pentamérique constituée de cinq sous-unités d'environ 110 kDa chacune Il semble qu'elle ait été isolée pour la première fois en 1984 par Fife et Brandt (Fife R.S, Brandt K.D.
"Identification of a high molecular weight (400000) protein in hyaline cartilage ".
Biochim Biophys Acta 1984, 802, 506-214).
La COMP a été purifiée à partir de cartilage articulaire par Di Cesare en 1994 (Di CesareP. Hauser, N. Lehman, D. Aeschlimann, D. Paulsson, M. Rosa-Pimentel, E. Sommaire, Y Wendel, M. Oldberg, A and Heinegard, D. "Cartilage Matrix proteins. An oligomeric (COMP) detected only in cartilage" J. Biol Chem. 1992, 267, 6132-6136).
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La COMP est une N-glycoprotéine à caractère acide, riche en acide aspartique, acide glutamique et cystéine. L'absence d'hydroxyproline confirme sa nature non collagénique. L'analyse tridimensionnelle montre une conformation en bouquet composé d'une structure cylindrique avec cinq bras flexibles, chacun étant terminé par un domaine globulaire. (Morgelin M., Heinegard D., Engel J., Paulsson M, "Electron microscopy of native cartilage olifomeric matric protein (COMP) is structural!)? related to the thrombospondins" J. Biol Chem. 1992, 267, 5131-6141) La COMP ressemble donc très fortement à la thrombospondine et à d'autres protéines oligomériques comme la fraction Clq du complément ou comme la protéine A du surfactant Son appartenance aux thrombospondines a été démontrée par clonage et analyse d'ADN. La très forte homologie de structure entre ces protéines suggère qu'elles dérivent du même gène ancestral et qu'elles possèdent des propriétés fonctionnelles voisines.
La COMP a une origine presque exclusivement articulaire cartilage, membrane synoviale et tendons. Les différents types de cartilage renferment la COMP ; les concentrations les plus élevées de COMP sont observées dans le cartilage articulaire, son poids sec est estimé à 1% de celui du tissu (Hauser N. Greiss J. Neidhart, M. Paulsson, M. Hauselmann, H.J. "Distribution of CPM and COMP in numan cartilage" Acta Orthop. Scand 1995, 66, 71-79). Sa localisation semble double, à la fois matricielle pour la majeure partie de la protéine et aussi membranaire, associée à la membrane du chondrocyte étroitement liée à la coeruloplasmine. Enfin, lors de la chondrogénèse, la COMP apparaît à un moment déterminé, différent de celui du collagène de type II. (Ekman S, Reinholt FP, Hultenby K, Hemegard D, "Ultrastructural immunolocalization of COMP in porcine growth cartilage CalcifTissue" Int. 1997, 60, 547-553) et (Fife R.S., Kluve-Beckerman, B. Houser D.S. "Evidence that a 555000 Da cartilage matrix protein is a chondrocyte membrane-associated protein closely related to ceruloplasmin" J. Biol. Chem. 1993, 268, 4407-4411).
Ces différentes observations laissent supposer que la COMP exprime les fonctions suivantes au niveau du cartilage :
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- un rôle important dans les interactions entre les composants de la matrice extracellulaire (collagène, fibronectine, protéoglycannes, laminine) et les chondrocytes - un rôle dans les transferts protéiques.
- un rôle de prévention dans la vascularisation du cartilage.
La COMP a fait l'objet d'études comme marqueur potentiel synovial et sérique dans : # l'arthrose (Fife R.S. "Identification of cartilage matrix protein in synovial fluids in human osteoarthritis" Arthritis Rheum. 1988,31,
553-556) et (Sharif M. Saxne T., Shepston L., Kirwam J.R.,
Elson C.J, Heinegard D., Dieppe PA., "Relation ship between sérum cartilage oligomeric protein levels and discase progression in osteoarthritis ofthe knee joint "Br. J. Rheumatol, 1995, 34, 306-310) ,. la polyarthrite rhumatoïde (Forslink K, Eberhardt K., Jousson A., Saxne T., "Increased sérum concentrations of cartilage oligomeric matrix protein. A prognosis marker in early rheumatoid arthritis" Br.
553-556) et (Sharif M. Saxne T., Shepston L., Kirwam J.R.,
Elson C.J, Heinegard D., Dieppe PA., "Relation ship between sérum cartilage oligomeric protein levels and discase progression in osteoarthritis ofthe knee joint "Br. J. Rheumatol, 1995, 34, 306-310) ,. la polyarthrite rhumatoïde (Forslink K, Eberhardt K., Jousson A., Saxne T., "Increased sérum concentrations of cartilage oligomeric matrix protein. A prognosis marker in early rheumatoid arthritis" Br.
J. Rheum. 1991, 31, 593-598) # et l'arthrite réactionnelle (Saxne T., Gleinnas A., Kvien TK., Melby K,
Heinegard D. Realase of cartilage macromolecules into the synovial fluid in patients with acute andprolonged phases ofreactive arthritis.
Heinegard D. Realase of cartilage macromolecules into the synovial fluid in patients with acute andprolonged phases ofreactive arthritis.
Arthritis Theum. 1993, 36, 20-25).
De ces études, il ressort : - une augmentation de la teneur sérique et synoviale chez les patients atteints d'arthrose et de polyarthrite à un stade modéré (Saxne T.,
Heinegard D. "COMP : a novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fluid and blood". Br. J. Rheumatol. 1992,30,
583-591).
Heinegard D. "COMP : a novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fluid and blood". Br. J. Rheumatol. 1992,30,
583-591).
- une valeur prédictive de l'évolution à long terme de la maladie. C'est ainsi qu'une concentration sérique élevée de COMP au début de la maladie serait un facteur défavorable chez les patients atteints de polyarthrite et qu'un taux sérique de COMP est corrélé à l'apparition d'une gonarthrose précoce chez les patients souffrant de douleurs chroniques du genou.
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Pour accéder aux concentrations synoviales et sériques de la COMP et pour disposer ce faisant d'outils de pronostic, de diagnostic et d'études cliniques de maladies osseuses et/ou articulaires entraînant la dégradation du cartilage, il importe e pouvoir mettre en oeuvre des techniques de dosage et de détection simples et fiables de la COMP dans les liquides biologiques.
Dans la référence Saxne & Heinegard - Br. J. Rheumatol 1992: 31 : 583-591, est décrite une technique imunoenzymatique ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) pour la quantification de la COMP dans le fluide synovial et dans le sérum.
Dans ce dosage, les auteurs ont utilisé des anticorps polyclonaux anti-COMP produits par le lapin. L'antigène utilisé pour la production des anticorps primaires AcI polyclonaux, est une COMP extraite du cartilage articulaire bovin ou du cartilage humain de tête fémorale. Il ressort de cet article que l'opération d'extraction/purification de la COMP est délicate et imparfaite. Une centrifugation et trois chromatographies successives ne permettent pas d'obtenir une purification entièrement satisfaisante Il en résulte que les anticorps AcI produits à partir de cet antigène n'ont qu'une spécificité modeste largement perceptible.
Pour tenter de remédier à cela, il a été proposé d'augmenter la pureté des anticorps polyclonaux AcI anti-COMP en les soumettant à un traitement d'épuisement par une protéine homologue de la COMP, à savoir la thrombospondine. Le revers de cette purification complémentaire à l'aide de thrombospondine est qu'elle entraîne l'apparition de faux positifs lors du dosage ELISA.
On connaît par ailleurs dans le domaine de l'exploration des maladies osseuses, à distinguer des pathologies du cartilage, une technique de dosage et de détection dans les fluides biologiques d'un traceur constitué par un peptide collagénique résultant de la dégradation du collagène de type I ou II Cette technique baptisée CROSSLAPS permet l'étude sémiologique des maladies osseuses telles que l'ostéoporose. Cette technique est décrite dans la demande PCT WO 96:30765.
L'intérêt que suscite la technique d'analyse CROSSLAPS dans le domaine des maladies osseuses n'a fait qu'accroître le besoin en moyen d'analyse de la COMP synoviale et sérique dans le domaine des pathologies articulaires.
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Il existe également des tests génétiques pour la détection de ces maladies articulaires mais ces test sont coûteux et compliqués et ne renseignent pas sur la fonctionnalité du gène topique de la maladie. L'opérabilité du gêne n'est pas lisible.
Il en découle, qu'à ce jour la concentration sérique ou synoviale de COMP semble être le traceur le plus intéressant dans la sémiologie des maladies articulaires.
Dans cet état de connaissances, la problématique à la base de la présente invention est la mise au point d'une technique perfectionnée de détection et de dosage de la COMP dans les fluides biologiques, qui permette de s'affranchir des inconvénients liés à la purification de la COMP et aux faux positifs thrombospondine.
L'enjeu d'une telle mise au point est la fourniture d'un procédé d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de la COMP ou d'une ou plusieurs fractions de celle-ci dans le sérum ou le liquide synovial, un tel procédé se devant d'être un outil fiable, simple à mettre en oeuvre, hautement spécifique et largement utilisable dans la sémiologie de pathologies articulaires.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé d'immunoloanalyse de la COMP qui permette de faire des mesures qualitatives et quantitatives précises, reproductibles et peu onéreuses.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est d'isoler et de caractériser une sonde peptidique utile notamment pour l'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de tout ou partie de protéine de type COMP
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir des anticorps ou des fragments d'anticorps utiles notamment comme anticorps primaires Ad de reconnaissance spécifique de tout ou partie de la protéine COMP dans le cadre d'une technique d'immunoanalyse.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir des anticorps ou des fragments d'anticorps utiles notamment comme anticorps primaires Ad de reconnaissance spécifique de tout ou partie de la protéine COMP dans le cadre d'une technique d'immunoanalyse.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé d'obtention des anticorps AcI susvisés.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de proposer l'application du procédé, de la sonde peptidique et des anticorps primaires susvisés dans la sémiologie de maladies articulaires.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un nécessaire (ou kit) d'immunoanalyse pour la mise en oeuvre du procédé susvisé de dosage et de détection de la COMP.
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Dans ce contexte, les inventeurs ont eu le mérite de sélectionner, après de longues et laborieuses recherches et expérimentations, une séquence peptidique ou sonde peptidique hautement spécifique de la COMP et noyée au sein d'une séquence peptidique comportant plusieurs milliers d'acides aminés.
D'où il s'ensuit que la présente invention concerne tout d'abord un procédé d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de tout ou partie d'une protéine matricielle oligomérique du cartilage-dénommée COMP- caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en oeuvre des anticorps,-ou des fragments d'anticorps- aptes à former des complexes avec des antigènes constitués par au moins une Séquence de Reconnaissance Spécifique (SRS) de la COMP, cette SRS ayant pour caractéristique d'être constituée au plus de 50 acides aminés et d'être située dans l'une des extrémités N-terminale d'au moins l'une des sous-unités formant la COMP
Cette SRS exploitée dans le procédé selon l'invention est à ce point spécifique de la COMP qu'elle permet de distinguer cette dernière de son analogue proche la thrombospondine. On élimine de ce fait les problèmes de faux positifs liés à cet analogue proche et il n'est désormais plus nécessaire d'isoler la COMP sous forme pure et dans son intégralité, pour produire des anticorps primaires AcT. En effet, la production d'une sonde peptidique pure spécifique de la SRS, est parfaitement envisageable par les techniques connues de synthèse peptidique.
Cette SRS exploitée dans le procédé selon l'invention est à ce point spécifique de la COMP qu'elle permet de distinguer cette dernière de son analogue proche la thrombospondine. On élimine de ce fait les problèmes de faux positifs liés à cet analogue proche et il n'est désormais plus nécessaire d'isoler la COMP sous forme pure et dans son intégralité, pour produire des anticorps primaires AcT. En effet, la production d'une sonde peptidique pure spécifique de la SRS, est parfaitement envisageable par les techniques connues de synthèse peptidique.
On obtient des Ad parfaitement spécifiques de la SRS et capables de s'apparier à elle, qu'elle se présente sous forme de sonde peptidique prise isolément ou sous forme de SRS intégrée au sein de la structure complexe de tout ou partie de la protéine COMP
Suivant une caractéristique préférée de l'invention, la SRS COMP de l'invention, la SRS comporte au moins cinq, de préférence au moins dix acides aminés.
Suivant une caractéristique préférée de l'invention, la SRS COMP de l'invention, la SRS comporte au moins cinq, de préférence au moins dix acides aminés.
De manière plus préférentielle encore, la SRS est une séquence peptidique de formule désignée par la référence SEQ ID NO : 1 dans la liste de séquence annexée :
GlnGlyGlnSerProLeuGlySerAspLeuGlyProGlnMetLeu
GlnGlyGlnSerProLeuGlySerAspLeuGlyProGlnMetLeu
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et/ou une ou plusieurs séquences peptidiques homologues de SEQ ID NO : 1 : comprenant au moins un épitope dans la séquence SEQ ID NO : 1 :.
Ces différents analogues ou variants de SEQ ID NO : 1 :, équivalents sur le plan antigénique (épitope) peuvent exister au sein de l'espèce humaine et/ou au sein d'autres espèces animales.
En effet, la présente invention s'applique à l'immunoanalyse aussi bien de la COMP humaine que de la COMP animale.
Sans que cela ne soit limitatif, on entend par homologue de la SRS désignée par la référence SEQ ID NO . 1 :, toute séquence ou portion de séquence présentant une homologie avec SEQ ID NO : 1 : d'au moins 20 %.
De manière connue en soi, le procédé d'immunoanalyse selon l'invention est fondé sur la mise en oeuvre d'espèces immunologiques, de préférence des anticorps AcI, spécifiques de la SRS et donc aptes à la reconnaître et à former avec elle des complexes antigènes/anticorps.
Le terme anticorps désigne au sens du présent exposé aussi bien les anticorps dans leur intégralité structurelle que des fragments de ces anticorps capables de reconnaître et de se lier aux mêmes déterminants antigéniques Cela inclus notamment les fragments Fab, Fab', Fab et F(ab')2
Conformément à l'invention, la technique de dosage utilisée est avantageusement du type "ELISA", immunohistochimie, immunocytologie, immunoprécipitation, immunoagglutination, radioimmunologie (RIA), "DOT BLOT" ou "WESTERN BLOT", de préférence "ELISA" et, plus préférentiellement encore, "ELISA" indirecte par inhibition.
Conformément à l'invention, la technique de dosage utilisée est avantageusement du type "ELISA", immunohistochimie, immunocytologie, immunoprécipitation, immunoagglutination, radioimmunologie (RIA), "DOT BLOT" ou "WESTERN BLOT", de préférence "ELISA" et, plus préférentiellement encore, "ELISA" indirecte par inhibition.
La technique "ELISA" indirecte par inhibition consiste essentiellement : * à mettre en compétition : (i) les antigènes COMP éventuellement présents dans le milieu d'analyse avec des antigènes COMP immobilisés sur le support du test ELISA, vis- à-vis de la complexation avec des anticorps AcI anti-COMP libres, ou (ii) les antigènes COMP éventuellement présents dans le milieu d'analyse avec des antigènes COMP libres de référence, vis-à-vis de la complexation
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avec des anticorps Ad anti-COMP immobilisés sur le support du test
ELISA ; * et à révéler les complexes formés entre: (i) les antigènes COMP immobilisés et les AcI libres, ou (ii) les AcI anti-COMP immobilisés et les antigènes COMP libres de référence.
ELISA ; * et à révéler les complexes formés entre: (i) les antigènes COMP immobilisés et les AcI libres, ou (ii) les AcI anti-COMP immobilisés et les antigènes COMP libres de référence.
Les moyens de révélation employés sont respectivement spécifiques (i) des AcI et (ii) des antigènes libres de référence piégés dans les complexes Ag/Ac et ainsi retenus sur le support après lavage et élimination du milieu d'analyse.
Ainsi, l'absence de révélation correspond à une concentration élevée en antigène COMP recherché dans le milieu d'analyse, tandis qu'un maximum de révélation traduit une concentration nulle en antigène COMP recherché dans le milieu d'analyse.
La technique "ELISA" directe consiste plus simplement à immobiliser le milieu à analyser sur le support et à faire réagir ensuite ce support avec des anticorps primaires AcI, voire des anticorps secondaires AcII anti-AcI. Une alternative en "ELISA" directe est de fixer sur le support les anticorps anti-COMP recherchés dans le milieu d'analyse puis de mettre en présence ce support avec le milieu d'analyse, voire avec des anticorps secondaires AcII anti-AcI, avant de procéder à la révélation des complexes antigène/anticorps éventuellement formés.
Indépendamment du fait qu'elle soit directe ou indirecte par inhibition, la technique de dosage "ELISA" préférée conformément à l'invention, peut être mise en #uvre selon différents modes.
Ainsi, selon un premier mode de mise en #uvre, le procédé d'immunoanalyse selon l'invention dans sa variante "ELISA", consiste essentiellement : - à utiliser au moins un support sur lequel : # est immobilisée au moins une SRS telle que définie ci-dessus ("ELISA" indirecte par inhibition) ; ou
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# est retenu au moins une partie du milieu à analyser comprenant éventuellement de la COMP ("ELISA" directe) ; - à mettre en présence les éléments immobilisés ou retenus sur le support avec des anticorps primaires Ad libres de référence anti-SRS ; - et à révéler les éventuels complexes SRS /AcI formés sur le support à l'aide de moyens de révélation comprenant des marqueurs portés les
AcI et/ou par des anticorps secondaires AcII, anti-Ad.
AcI et/ou par des anticorps secondaires AcII, anti-Ad.
Conformément à ce premier mode de mise en #uvre, l'espèce associée au support est l'espèce antigènique sous forme de sonde SRS dans le cas d'un "ELISA" indirect par inhibition. Cette sonde SRS immobilisée est en compétition avec l'antigène COMP recherché éventuellement présent dans le milieu d'analyse, au regard de la complexation avec les AcI libres de référence.
Au terme de la compétition dans laquelle sont en lice l'éventuelle COMP présente dans le milieu d'analyse et les anticorps AcI libres de référence, et qui se déroule pendant une période d'incubation, on procède en pratique à un lavage du support de façon à éliminer tout ce qui n'est pas complexé aux sondes SRS immobilisées, avant de mettre en #uvre l'étape de révélation.
A ce stade, deux variantes sont envisageables selon que les marqueurs compris dans les moyens de révélation sont portés directement par les AcI de référence et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-AcI. Dans cette dernière hypothèse, il convient de faire réagir les AcII avec les AcI de référence complexés aux sondes SRS immobilisées. De manière commune aux deux variantes, on procède ensuite à l'introduction de la substance qui va réagir avec les marqueurs des AcI ou des AcII pour produire des signaux, par exemple lumineux, qui sont enregistrés comme traceurs du dosage.
Dans le cas d'un "ELISA" direct selon ce premier mode de mise en #uvre, on vise l'immobilisation sur le support de la COMP éventuellement présente dans le milieu d'analyse.
De manière classique, l'immobilisation des séquences SRS sur le support peut se faire par liaison covalente. S'agissant de la rétention du milieu à analyser sur le support, elle peut résulter d'un phénomène d'absorption.
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Les anticorps primaires Ad peuvent être monoclonaux ou polyclonaux et obtenus selon les procédures traditionnelles. Il en va de même en ce qui concerne les éventuels AcII anti-AcI.
Suivant un deuxième mode de mise en #uvre du procédé de l'invention conformément à une procédure "ELISA" : - on utilise au moins un support sur lequel sont immobilisés des AcI anti-
SRS; - on met en présence les AcI immobilisés avec des SRS libres de référence et le milieu à analyser comprenant éventuellement de la COMP ; - et on révèle les éventuels complexes SRS/AcI formés sur le support à l'aide de moyens de révélation comprenant des marqueurs portés par les SRS de référence et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-
COMP Ce deuxième mode de mise en #uvre "ELISA" est du type indirect par inhibition. Au plus la COMP est présente dans le milieu à analyser, au plus elle forme des complexes avec les anticorps primaires AcI anti-SRS immobilisés sur le support, au détriment des sondes SRS de référence. Ainsi, en l'absence de COMP dans le milieu à analyser, seules les sondes libres SRS de référence se lient avec les anticorps AcI immobilisés et dans la mesure où la révélation vise ces sondes SRS de référence piègés dans ces complexes, cette révélation estmaximale dans un tel cas de figure.
SRS; - on met en présence les AcI immobilisés avec des SRS libres de référence et le milieu à analyser comprenant éventuellement de la COMP ; - et on révèle les éventuels complexes SRS/AcI formés sur le support à l'aide de moyens de révélation comprenant des marqueurs portés par les SRS de référence et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-
COMP Ce deuxième mode de mise en #uvre "ELISA" est du type indirect par inhibition. Au plus la COMP est présente dans le milieu à analyser, au plus elle forme des complexes avec les anticorps primaires AcI anti-SRS immobilisés sur le support, au détriment des sondes SRS de référence. Ainsi, en l'absence de COMP dans le milieu à analyser, seules les sondes libres SRS de référence se lient avec les anticorps AcI immobilisés et dans la mesure où la révélation vise ces sondes SRS de référence piègés dans ces complexes, cette révélation estmaximale dans un tel cas de figure.
Les anticorps primaires AcI spécifiques de SRS peuvent être polyclonaux ou monoclonaux.
Au terme de la compétition dans laquelle sont en lice l'éventuelle COMP présente dans le milieu à analyser et les sondes SRS libres de référence et qui se déroule pendant une période d'incubation, on procède, en pratique, à un lavage du support de façon à éliminer tout ce qui n'est pas complexé aux anticorps AcI immobilisés, avant de mettre en #uvre l'étape de révélation.
A ce stade, deux variantes sont envisageables selon que les marqueurs compris dans les moyens de révélation sont portés directement par les sondes SRS de référence et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-COMP et plus précisément anti-SRS.
Dans cette dernière hypothèse, il convient de faire réagir les AcII avec les sondes SRS
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de référence complexées aux AcI immobilisés. De manière commune aux deux variantes, on procède ensuite à l'introduction de la substance qui va réagir avec les marqueurs des AcII ou des sondes SRS, pour produire des signaux, par exemple lumineux, qui sont enregistrés comme traceurs du dosage.
La technique de dosage indirecte par inhibition (compétition) envisagée dans le premier et le deuxième modes de mise en #uvre du procédé de l'invention, est particulièrement appropriée dans le cas où les anticorps AcI mis en #uvre sont polyclonaux. Cela permet d'augmenter la sensibilité du dosage.
Dans cette technique on appréhende, de manière classique, 'aspect quantitatif du dosage par utilisation de gammes-étalons de concentrations connues en COMP
Suivant un troisième mode de mise en #uvre du procédé selon l'invention, conformément à une technique de dosage de type "ELISA" : - on utilise au moins un support sur lequel sont immobilisés des AcI anti-
SRS; - on met en présence les AcI immobilisés et le milieu à analyser comprenant éventuellement de la COMP ; - et on révèle les éventuels complexes COMP/AcI formés sur le support à l'aide de moyens de révélation comprenant des marqueurs portés par des anticorps Ach anti-protéines homologues de la COMP, et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-Ach.
Suivant un troisième mode de mise en #uvre du procédé selon l'invention, conformément à une technique de dosage de type "ELISA" : - on utilise au moins un support sur lequel sont immobilisés des AcI anti-
SRS; - on met en présence les AcI immobilisés et le milieu à analyser comprenant éventuellement de la COMP ; - et on révèle les éventuels complexes COMP/AcI formés sur le support à l'aide de moyens de révélation comprenant des marqueurs portés par des anticorps Ach anti-protéines homologues de la COMP, et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-Ach.
Il s'agit ici d'une technique "ELISA" directe puisque la COMP éventuellement présente dans le milieu d'analyse est la seule à pouvoir réagir avec les anticorps primaires AcI anti-SRS immobilisés sur le support L'originalité de ce mode de mise en #uvre est de faire appel à des anticorps Ach, anti-protéines homologues de la COMP. Ces homologues sont, de préférence, celles choisies dans le groupe comprenant la thrombospondine et/ou la fraction Clq du complément et/ou de la protéine A du surfactant.
Au terme de l'incubation au cours de laquelle, une fois que le milieu d'analyse est mis en présence avec des AcI immobilisés, on procède à un lavage du support et on fait réagir la COMP éventuellement ancrée sur les AcI, avec les Ach On fait ensuite
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éventuellement réagir ces derniers avec des AcII anti-Ach La procédure de révélation est du même que celle précisée ci-dessus.
S'agissant de la révélation, il convient de noter que suivant une disposition avantageuse de l'invention, les marqueurs compris dans les moyens de révélation et fixés selon les cas sur les Ad anti-SRS, les AcII anti-Ad, les sondes SRS de référence, les Ach ou les AcII anti-Ach, sont sélectionnés dans le groupe comprenant : les enzymes, les substrats enzymatiques, les inhibiteurs d'enzymes, les co-enzymes, les matériaux paramagnétiques, les séquences d'acides nucléiques ou d'analogues d'acides nucléiques, les agents de luminescence, les agents de radiomarquage, la biotine, la digoxigénine et leurs mélanges.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne une sonde, notamment, pour l'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de tout ou partie d'une protéine matricielle oligomérique de cartilage-dénommée COMP- caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence peptidique de formule (SEQ ID NO . 1 : ) suivante : GlnGlyGlnSerProLeuGlySer AspLeuGlyProGlnMetLeu et/ou une ou plusieurs séquences peptidiques homologues de SEQ ID NO : 1 comprenant au moins un épitope dans la séquence SEQ ID NO - 1 Cette sonde peptidique antigénique correspond-comme déjà indiqué ci-dessus- à la séquence de reconnaissance spécifique SRS que les inventeurs ont isolée et caractérisée au sein de la COMP. Il s'agit d'un produit nouveau en tant que tel, qui peut être aisément obtenu, de manière connue en soi, par exemple à l'aide d'un synthétiseur de peptides Cette synthèse est d'autant plus facile que la longueur de la sonde peptidique selon l'invention est faible La sonde peptidique selon l'invention peut donc faire fonction d'antigène dans les procédés d'immunoanalyse de COMP, et en particulier comme prévu dans le deuxième mode de mise en #uvre "ELISA", tel que décrit supra, du procédé selon l'invention.
Parmi les atouts de cette sonde peptidique antigénique, il convient d'insister à nouveau sur sa très haute spécificité. En outre, sa synthèse est aisée et économique. Enfin, il convient de signaler que dans la mesure où cette sonde peptidique antigénique peut
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être obtenue sous forme pure et stérile, elle ne présente pas le risque d'être un vecteur de contamination, contrairement à ce qu'on peut observer dans le cas où l'on utilise la protéine totale comme antigène.
Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention concerne des anticorps anti-SRS ou des fragments d'anticorps anti-SRS, notamment pour 1"immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de tout ou partie d'une protéine matricielle oligomérique du cartilage COMP caractérisés en ce qu'ils sont spécifiques d'une Séquence de Reconnaissance Spécifique (SRS) de la COMP, cette SRS ayant la formule SEQ ID NO : 1 : suivante :
GlnGlyGlnSerProLeuGlySerAspLeuGlyProGlnMetLeu Ces anticorps anti-SRS peuvent notamment être des anticorps primaires AcI que l'on utilise dans le cadre de dosages immunologiques et ces AcI ont ceci de caractéristique qu'ils peuvent reconnaître et s'apparier spécifiquement à la SRS de la COMP Ces anticorps anti-SRS pris dans leur intégralité ou sous forme de fragments sont des produits nouveaux en tant que tels Ils existent indépendamment du procédé d'immunoanalyse selon l'invention, mais il est clair qu'ils peuvent constituer des moyens essentiels de mise en oeuvre dudit procédé.
GlnGlyGlnSerProLeuGlySerAspLeuGlyProGlnMetLeu Ces anticorps anti-SRS peuvent notamment être des anticorps primaires AcI que l'on utilise dans le cadre de dosages immunologiques et ces AcI ont ceci de caractéristique qu'ils peuvent reconnaître et s'apparier spécifiquement à la SRS de la COMP Ces anticorps anti-SRS pris dans leur intégralité ou sous forme de fragments sont des produits nouveaux en tant que tels Ils existent indépendamment du procédé d'immunoanalyse selon l'invention, mais il est clair qu'ils peuvent constituer des moyens essentiels de mise en oeuvre dudit procédé.
Avantageusement, ces anticorps AcI peuvent être obtenus selon un procédé caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à utiliser la sonde peptidique antigénique de séquence SRS, comme antigène dans un système immunitaire apte à produire des anticorps et/ou des fragments de ceux-ci spécifiques de cet antigène SRS.
Classiquement, ces anticorps AcI peuvent être des anticorps polyclonaux de lapin, de chèvre, de souris, de rat ou de tout autre animal.
Selon une alternative, les anticorps AcI peuvent être des anticorps monoclonaux produits par des lignées cellulaires hybrides (hybridomes) résultant, par exemple, de la fusion de splénocytes de souris immunisées contre un antigène constitué par une sonde antigénique peptidique définie par la séquence SRS conforme à la présente invention.
D'où il s'ensuit que la présente invention a également pour objet ses lignées cellulaires hybrides aptes à produire les anticorps anti-SRS selon l'invention.
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Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention concerne l'application de la sonde peptide antigénique telle que définie ci-dessus dans le procédé également défini supra, notamment en vue du diagnostic, du pronostic ou d'études cliniques de maladies articulaires.
De la même façon, l'invention a pour objet l'application des anticorps et/ou des fragments de ceux-ci tels que définis ci-dessus en tant que produits per se ou en tant que produits obtenus par l'un de leurs procédés de synthèse, dans le procédé d'immunoanalyse selon l'invention, notamment en vue du diagnostic, du pronostic ou d'études cliniques de maladies articulaires.
Etant donné que la révélation des réactions immunologiques entre anticorps primaires AcI et antigènes, en l'occurrence SRS, peut être effectuée par l'intermédiaire de marqueurs portés par les anticorps primaires AcII eux-mêmes et/ou par des anticorps secondaires AcII, anti-AcI ou anti-Ach, la présente invention concerne également des conjugués comprenant, d'une part, des anticorps primaires Ad ou des AcII tels que définis ci-dessus et, d'autre part, des marqueurs détectables appartenant au groupe des marqueurs appropriés tels que définis ci-dessus et rappellés ci-après : enzymes, substrats enzymatiques, chromophores, fluorophores, coenzymes, inhibiteurs d'enzymes, produits chimiluminescents, matériaux paramagnétiques, radioisotopes, ou séquences d'acides nucléiques ou d'analogues d'acides nucléiques, biotine, digoxigénine et leurs mélanges.
Au-delà des considérations méthodologiques, la présente invention vise également les moyens matériels d'immunoanalyse et en particulier un nécessaire d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de tout ou partie d'une protéine matricielle oligomérique de cartilage -dénommée COMP-.
Classiquement, ce nécessaire d'immunoanalyse se présente sous forme de coffret de diagnostic utilisable par les professionnels de la santé pour doser la COMP dans le sérum ou le liquide synovial de patients, et en déduire par la même un diagnostic, un pronostic, ou bien encore en vue d'effectuer des études cliniques.
On a vu que le procédé selon l'invention existe notamment selon trois modes de mise en #uvre "ELISA". Il en va de même par conséquent pour le nécessaire d'immunoanalyse susvisé.
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Ainsi, selon un premier de ses modes de réalisation, le nécessaire d'immunoanalyse selon l'invention, le nécessaire d'immunoanalyse comporte : - des anticorps Ad anti-SRS libres de référence ou des fragments de ceux-ci tels que définis ci-dessus en tant que tels et/ou obtenus par le procédé défini tel que défini supra, - un support constituant le site réactionnel et le site de fixation de l'antigène SRS ; - des moyens de révélation des complexes anticorps/antigène susceptible de se former, ces moyens de révélation comprenant marqueurs portés par les anticorps primaires Ad et/ou par des anticorps secondaires
AcII anti-Ad, - des solutions de lavage et de saturation et des tampons de dilution.
AcII anti-Ad, - des solutions de lavage et de saturation et des tampons de dilution.
Selon un deuxième de ses modes de réalisation, le susdit nécessaire d'immunoanalyse comprend : - des antigènes libres de référence constitués par la SRS telle que définie supra et/ou par la sonde telle que définie ci-dessus ; - un support constituant le site réactionnel et le site de fixation des anticorps anti-SRS correspondant à des anticorps primaires AcI, - des moyens de révélation des complexes anticorps / antigène susceptibles de se former, ces moyens de révélation comprenant des marqueurs portés par les antigènes de référence SRS et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-COMP ; - des solutions de lavage et de saturation et des tampons de dilution.
Selon un troisième de ses modes de réalisation, le susdit nécessaire d'immunoanalyse comprend : - un support constituant le site réactionnel et le site de fixation des anticorps anti-SRS correspondant à des anticorps primaires AcI, - des moyens de révélation des complexes anticorps/antigène (COMP) susceptibles de se former, ces moyens de révélation comprenant, d'une part, des anticorps Ach, anti-protéines homologues de la COMP, ces protéines homologues étant de préférence celles choisies dans le groupe comprenant la thrombospondine et/ou la fraction C 1 q du
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complément et/ou la protéine A du surfactant et, d'autre part, des marqueurs portés par les Ach et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-Ach ; - des solutions de lavage et de saturation et des tampons de dilution.
La présente invention concerne également des nécessaires d'immunoanalyse, notamment selon l'un quelconque des trois modes de réalisation sus-évoqués, caractérisés - en ce que les marqueurs des moyens de révélation sont sélectionnés dans le groupe comprenant : les enzymes, les substrats enzymatiques, les inhibiteurs d'enzymes, les co-enzymes, les matériaux paramagnétiques, les séquences d'acides nucléiques ou d'analogues d'acides nucléiques, les agents de luminescence, les agents de radiomarquage, la biotine, la digoxigénine et leurs mélanges, - et en ce que ces moyens de révélation comportent en outre, éventuellement : * des enzymes ou des substrats enzymatiques destinés à réagir respectivement avec les substrats enzymatiques et les enzymes des marqueurs ; * et/ou des moyens de lecture des signaux émis après révélation des complexes formés.
Dans le cas où la technique de dosage employée est de type ELISA, il peut s'agir d'un ELISA SANDWICH ou d'un WESTERNBLOT ou DOTBLOT.
S'agissant du support compris dans le nécessaire d'immunoanalyse, il peut être de type solide ou liquide.
Les supports solides sont par exemple : - des plaques de micro titration entière ou sécables (ELISA) - des membranes de nitrocellulose de fluorure de polyvinylidène ou de nylon.....
- des tubes à essais en polymère synthétique ou en verre, - des polymères biologiques, - des lames d'immunohistologie,
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- des billes - ou autres.
Les supports liquides peuvent être constitués par des solutions, des émulsions, ou des dispersions formant une partie du milieu d'analyse. Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention et de faire ressortir tous ses avantages et variantes de mise en oeuvre EXEMPLES Description des Figures - La Fig. 1 est le graphe obtenu après analyse du peptide SRS, synthétisé et purifié à l'exemple 1, en spectroscopie de masse, avec en abscisse la masse molaire M et en ordonnée le nombre N d'impulsions enregistrées.
- La Fig. 2 montre 3 courbes donnant le suivi des titres ELISA de sérums de lapin respectivement le même jour (JO), 49 jours (J49) et 72 jours (J72) après l'inoculation d'un immunogène comprenant la SRS, conformément à la procédure donnée dans l'exemple 2 L'axe des abscisses correspond aux quantièmes des sérums (1/dilution).
L'axe des ordonnées correspond aux densités optiques (DO) mesurées à 450 nm après révélation - La Fig. 3 représente une courbe donnant le pourcentage d'inhibition de la réactivité de l'anticorps anti-SRS présent dans une dilution au 1/10000ème du sérum de lapin, pour différentes concentrations en SRS ( M) données en abscisses, conformément à une procédure définie dans l'exemple 2.
- La Fig. 4 est une plaque photographique montrant le résultat d'un WESTERNBLOT de détection de la protéine COMP présente dans des échantillons, à l'aide d'AcI anti-SRS.
- La Fig. 5 est une plaque photographique montrant le résultat d'un WESTERNBLOT de détection de la protéine COMP présente dans des échantillons à l'aide d'Ad anti-SRS ayant préalablement réagi avec SRS (inhibition).
- La Fig. 6 est un graphe comprenant trois courbes standard (essais 1 à 3) du pourcentage d'inhibition de la réaction entre des anticorps Ad anti-SRS et des SRS immobilisées sur un support, par différentes concentrations de SRS libres (en g / ml)
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- La Fig. 7 représente un graphe donnant les résultats de dosage de la COMP exprimé en équivalents SRS ( g/ml), à l'aide du kit ELISA-COMP décrit à l'exemple 3 2 , dans des sérums de patients normaux et de patients atteints d'arthrose ou de polyarthrite.
Exemple 1 Synthèse peptidique de la séquence de Reconnaissance Spécifique (SRS) selon l'invention de la COMP et développement d'anticorps anti-SRS chez le lapin Le peptide SRS a été synthétisé en utilisant la chimie F-moc/t-Bu puis purifié par H P L C et analysé par spectrophotométrie de masse Les résultats de cette analyse montre que le peptide présente une masse de 1639 g/ mol qui est conforme à la masse calculée du peptide (voir figure 1) Le peptide SRS a été ensuite couplé à la protéine KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) pour le rendre immunogène en utilisant la glutaraldélyde comme agent de couplage.
Deux lapins ont été ensuite injectés par voie sous-cutanée avec un mélange contenant de l'adjuvant de Freund et de l'immunogène (KLH-peptide) Les animaux ont reçu d'autres injections (rappels) avant de prélever des aliquotes de sang aux jours 49 (J49) et 74 (J74) pour mesurer la présence d'anticorps anti-SRS (Ad).
Pour effectuer ce dosage, un test de type ELISA a été développé de la façon suivante : - sur des plaques de microtitration de type CovAbtest commercialisées par la société COVALAB, 1 g de peptide a été couplé de façon covalente dans chaque puits - une solution de 0,5 % de SAB (Sérum Albumine Bovine) dans le tampon PBS a été ajoutée dans la plaque pour saturer les site non-spécifiques puis incubée 30 minutes à 37 C.
- les sérums de lapin pré-immuns (JO) et hyper-immuns (J49 et J75) ont été dilués de
1/2000 à 1/200000 dans du PBS - 0,1% Tween 20 (PBS-T) puis ajoutés dans les plaques de microtitration et ensuite incubés pendant 1 heure à 37 C - après plusieurs lavages de la plaque en PBS-T, le conjugué anti-IgG (AcII) de lapin marqué à la peroxydase est dilué au 1/2000 dans le tampon PBS-T puis incubé dans la plaque pendant 30 minutes à 37 C.
1/2000 à 1/200000 dans du PBS - 0,1% Tween 20 (PBS-T) puis ajoutés dans les plaques de microtitration et ensuite incubés pendant 1 heure à 37 C - après plusieurs lavages de la plaque en PBS-T, le conjugué anti-IgG (AcII) de lapin marqué à la peroxydase est dilué au 1/2000 dans le tampon PBS-T puis incubé dans la plaque pendant 30 minutes à 37 C.
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- la plaque est ensuite lavée comme décrit ci-dessus puis le chromogène tetramethylbenzidine (TMB) mélangé avec le substrat peroxyde d'hydrogène (H202) est ajouté dans la plaque pour révéler la présence de la peroxydase.
- après 5 minutes la réaction enzymatique est arrêtée par l'addition de l'acide sulfurique et l'intensité de la coloration jaune a été mesurée à la longueur d'onde de 450 nm.
Les résultats de cette étude sont présentés dans la figure 2. Ils montrent que le sérum de lapin avant immunisation (JO) ne réagit pas avec le peptide fixé sur la plaque.
Cependant, les prélèvements de J49 et J75 montrent qu'après plusieurs immunisations, le lapin à développé des anticorps (AcI) qui reconnaissent le peptide SRS avec un titre plus élevé à J75 qu'à J49 Afin d'évaluer le degré de spécificité de l'immunoréactivité des anticorps, une étude d'inhibition de la réactivité de l'anticorps avec le peptide libre a été réalisée Pour cela, le sérum de lapin dilué au 1 / 10000 a été incubé 30 minutes à 37 C avec différentes concentrations du peptide libre. Ensuite le test ELISA a été effectué comme décrit précédemment.
La figure 3 montre que l'immunoréactivité de l'anticorps anti-peptide est inhibée et que cette inhibition varie de 0 % à 100 % selon la dose de peptide ajoutée.
Exemple 2 : Détection de la COMP endogène par WESTERN BLOT La protéine COMP a été recherchée dans les homogénats de cartilage de boeuf, de cartilage humain et dans les liquides synoviaux de patients.
Les échantillons suivants ont été déposés sur le gel de polyacrylamide à 6 %.
La technique d'électrophorèse en gel de polyacrylamide décrite par Laemmli, Nature 227,680 (1970) a été utilisée pour séparer et transférer sur membrane de nitrocellulose les protéines cellulaires. La membrane est ensuite traitée avec différents réactifs dans les conditions suivantes : - Saturation des sites non spécifiques sur la membrane avec du lait écrémé à 5 % dans du tampon PBS pendant 30 minutes.
- Incubation de la membrane avec l'anticorps Acl, spécifique de la SRS pendant 1 heure à 37 C.
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- Lavage en PBS-Tween 0,2 % et incubation avec l'anticorps polyclonal AcII anti-AcI de chèvre anti-lapin marqué à la peroxydase pendant1 heure à 37 C.
Après 4 lavages de 5 minutes en PBS-Tween 0,2%, la membrane est immergée dans le réactif chimiluminescent "Covalight" (CovalAb) pendant 3 minutes. Ensuite la membrane est égouttée puis couverte d'un film plastique et exposée à un film X-ray pour une durée de 30 secondes, puis développée.
Sur la figure 4, les nombres 1 à 6 annotés sur le bord supérieur longitudinal correspondent aux échantillons suivants : (ST) : standard de poids moléculaires indiqués en KD sur le bord transversal (1) homogénat de cartilage de boeuf (2) homogénat de cartilage humain (3) homogénat de cartilage de lapin (4) COMP purifié du cartilage de boeuf (5) liquide synovial humain (patient 1) (6) : liquide synovial humain (patient 2).
Sur la figure 4, on constate clairement que la protéine COMP présente dans les différentes préparations provenant de différentes espèces a été reconnue par l'anticorps développé contre le peptide SRS L'étude de la spcécificité de l'anticorps anti-COMP (AcI) a été effectuée en réalisant une expérience ou l'anticorps (AcI) est incubé préalablement avec le peptide SRS (10 M) pendant 30 minutes à 37 C.
Ensuite la membrane est incubée avec le mélange AcI et le peptide SRS comme nous l'avons décrit précédemment.
Sur la figure 5, les nombres 1 à 6 correspondent aux mêmes échantillons que sur la figure 4. Les nombres 205, 116 et 97,4 sont les poids moléculaires en KD des standard (ST).
Sur cette figure 5, on constate que l'immunoréactivité de l'anticorps anti-COMP est spécifique puisqu'elle est inhibée quand l'anticorps est incubé préalablement avec le peptide SRS. Cela traduit bien l'extrême spécificité de l'anticorps.
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Exemple 3 : Dosage de la protéine COMP dans les sérums de patients normaux et de patients atteints d'arthrose ou de polyarthrite.
3.1 : Descriptif du nécessaire d'immunoanalyse de la COMP (= kit
ELISA - COMP) selon l'invention 1 - Le principe Le dosage de la protéine COMP (Cartilage Oligomeric Matrix Protein) est un dosage de type ELISA indirect par inhibition La réactivité d'un anticorps anti-SRS est déterminée par ELISA sur une plaque sur laquelle est couplée, de façon covalente, la séquence peptidique SRS selon l'invention de la protéine COMP. La quantité de COMP présente dans l'échantillon analysé est déterminée en comparant l'inhibition de la réactivité de l'anticorps avec des concentrations connues de la séquence peptidique utilisées en étalon (COMP standard : réactif 4).
ELISA - COMP) selon l'invention 1 - Le principe Le dosage de la protéine COMP (Cartilage Oligomeric Matrix Protein) est un dosage de type ELISA indirect par inhibition La réactivité d'un anticorps anti-SRS est déterminée par ELISA sur une plaque sur laquelle est couplée, de façon covalente, la séquence peptidique SRS selon l'invention de la protéine COMP. La quantité de COMP présente dans l'échantillon analysé est déterminée en comparant l'inhibition de la réactivité de l'anticorps avec des concentrations connues de la séquence peptidique utilisées en étalon (COMP standard : réactif 4).
II - Composition du kit Solution A (tampon de dilution de l'échantillon 2X concentrée)
2,5 ml PO41M ; NaCl 2M (PO4 0,1M, NaCl 0,2 M)
20 ml SDS20% (1,6 %)
200 ml H20
5 ml Thimerosal (0,02%) Solution B (tampon de dilution de l'antisérum)
2,5 ml P041M; pH 7,4 (PO4 10 mM) 10 ml Triton XI 00 (4%)
232,5 ml H2O
5 ml Thimerosal 1 % ( 0,02%) Solution C (solution de saturation de la plaque)
1,25 g Gélatine 60 Bloom
25 ml PBS 10X qsp 245 ml
2,5 ml PO41M ; NaCl 2M (PO4 0,1M, NaCl 0,2 M)
20 ml SDS20% (1,6 %)
200 ml H20
5 ml Thimerosal (0,02%) Solution B (tampon de dilution de l'antisérum)
2,5 ml P041M; pH 7,4 (PO4 10 mM) 10 ml Triton XI 00 (4%)
232,5 ml H2O
5 ml Thimerosal 1 % ( 0,02%) Solution C (solution de saturation de la plaque)
1,25 g Gélatine 60 Bloom
25 ml PBS 10X qsp 245 ml
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Solution D (solution de lavage 10X concentrée) .
20 g NaCl (1,36 M)
25 ml Tris HCL pH8 1 M (0,1M) 2,5 ml Tween (0,1%)
5 ml Thimerosal 1% (0,02%) qsp 250 ml H20 Plaques : chaque plaque est une plaque du type CovAbtest commercialisée par la Société COVALAB permettant de fixer le peptide SRS par liaisons covalentes.
25 ml Tris HCL pH8 1 M (0,1M) 2,5 ml Tween (0,1%)
5 ml Thimerosal 1% (0,02%) qsp 250 ml H20 Plaques : chaque plaque est une plaque du type CovAbtest commercialisée par la Société COVALAB permettant de fixer le peptide SRS par liaisons covalentes.
Pour ce faire, le peptide SRS est dissous dans le tampon PBS (Phosphate 10 mM & pH 7,2 - Nacl 0,14 M), à raison de 10 g par ml.
100 pl de cette solution sont versés dans chaque puit et incubés 1 H à température ambiante.
Solution E (tampon de dilution du conjugué)
2,5ml PBS 10X
250 l Tween (0,1 %)
5 ml Thimerosal 1% (0;02%) qsp 250 ml H20 Solution F (solution d'arrêt):
14 ml H2SO4 concentré qsp 250 ml H20 Réactif 1 (antisérum anti COMP de lapin) : Anticorps purifié anti-SRS de lapin Réactif 2 (conjugué anti lapin - Peroxydase ) . Conjugué anti lapin - peroxydase (Covalab) Réactif 3 (chromogène TMB) :Chromogène TMB (Covalab) Réactif 4 : de peptide SRS à 50 g/ml dans la solution A.
2,5ml PBS 10X
250 l Tween (0,1 %)
5 ml Thimerosal 1% (0;02%) qsp 250 ml H20 Solution F (solution d'arrêt):
14 ml H2SO4 concentré qsp 250 ml H20 Réactif 1 (antisérum anti COMP de lapin) : Anticorps purifié anti-SRS de lapin Réactif 2 (conjugué anti lapin - Peroxydase ) . Conjugué anti lapin - peroxydase (Covalab) Réactif 3 (chromogène TMB) :Chromogène TMB (Covalab) Réactif 4 : de peptide SRS à 50 g/ml dans la solution A.
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111-Procédure 1ère étape : Réaction d'inhibition 1 - Préparation des échantillons (sérums et liquides synoviaux) : L'échantillon à tester est dilué à dans le tampon A non dilué, puis chauffé 5 minutes dans un bain marie à 95 C (si un précipité se forme, on centrifuge légèrement et on ne travaille que sur le surnageant). L'échantillon peut alors être dilué à , 1/8 et 1/16 dans le tampon A préalablement dilué 2 fois en eau.
100 l de chaque dilution de l'échantillon sont alors transvasés dans un tube.
Le réactif4 ne doit pas être chauffé.
Il est préconisé d'effectuer une gamme de dilutions dans le tampon A dilué 2 fois en eau.
2 - Addition de l'anticorps - Dilution : l'anticorps (réactif 1) est dilué au 1/1 000 dans la solution B - Dépôt : 100 l sont ajoutés dans les tubes contenant l'échantillon ou le standard.
- Incubation : la nuit (16 à 24 h) à 37 C sous agitation vigoureuse.
2ème étape : Détermination de la réactivité 1- Saturation - Après préchauffage de la solution C à 37 C - Dépôt : 150 ml par points de solution C - Temps d'incubation : 30 min à 37 C - Les puits sont vidés par retournement de la plaque 2 - Incubation du premier anticorps (mélange échantillon/anticorps) - Dépôt 100 l par puits de la préparation incubée la nuit - Temps d'incubation : 30 min à 37 C - Lavages : 4 fois en solution D préalablement diluée 10 fois en eau.
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3. Incubation du deuxième anticorps (anti IgG de lapin marqué à la Peroxydase) - Le réactif 2 est dilué au 1/2000 en tampon E - Dépôt . 100 l par puits - Temps d'incubation : 30 min à 37 C - Lavages : 4 fois en solution D préalablement diluée 10 fois en eau.
- Préparation Ajouter une goutte de chaque réactif n 3 (tampon/TMB/oxydant) pour 7 ml d'eau
Dépôt : 100 l par puits - Incubation : 5 min à température ambiante - Arrêt de la réaction par 50 l de solution F 4. Lecture à 450 nm
3 - 2 :Etablissement d'une gamme étalon à partir du peptide SRS Le standard est le réactif 4 selon 3.1.
Dépôt : 100 l par puits - Incubation : 5 min à température ambiante - Arrêt de la réaction par 50 l de solution F 4. Lecture à 450 nm
3 - 2 :Etablissement d'une gamme étalon à partir du peptide SRS Le standard est le réactif 4 selon 3.1.
Cette solution peut être utilisée directement pour l'incubation avec le réactif 1 (antisérui de lapin anti-COMP), elle constitue le premier point de la gamme (50 pg/ml)
Les autres points de la gamme seront effectués avec des solutions à 25 - 12,5 - 6,25 3, - 1,5 - 0,78 et 0,39 g/ml. La dilution doit être effectuée en tampon A dilué 2 fois. L gamme peut être élargie si l'utilisateur le désire.
Les autres points de la gamme seront effectués avec des solutions à 25 - 12,5 - 6,25 3, - 1,5 - 0,78 et 0,39 g/ml. La dilution doit être effectuée en tampon A dilué 2 fois. L gamme peut être élargie si l'utilisateur le désire.
En l'absence de standard international de la COMP, le peptide SRS spécifique de 1 COMP a été utilisé comme étalon standard pour estimer le taux de la COMP dans le échantillons biologiques De ce fait les résultats seront exprimés en équivalent de peptide (SRS) en ug/ml selon les courbes standard présentées dans la figure 6 et obtenues à l'issue de 3 essais différents en partant du réactif 4.
3.3. Dosage de la COMP dans les échantillons biologiques Le dosage de la protéine COMP dans les sérums de patients a été réalisé en utilisant le kit ELISA COMP décrit ci-dessus et en comparant un groupe de patients normaux (n=69) et un groupe de patients malades atteints d'arthrose ou de polyarthrite (n=39).
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La concentration de la COMP dans les échantillons étudiés est estimée en calculant d'abord le pourcentage d'inhibition du peptide SRS dans les sérums, ensuite ce pourcentage est reporté sur les courbes étalons (figure 6) pour déterminer l'équivalent en g/ml du peptide.
Les résultats présentés dans la figure 7 montrent une différence significative en équivalent de la protéine COMP entre les sérums normaux (1,18 g/ml) et pathologiques (1,85 g/ml). En effet, la protéine COMP semble être augmentée dans les sérums de malades atteints d'arthrose et de polyarthrite.
Exemple 4 : Variation du taux de cartilage oligomeric matrix protein (COMP) après injection intra-articulaire dans la gonarthrose La COMP est une protéine du cartilage articulaire, dosàble dans le sérum et le liquide synovial (LS). Son augmentation dans l'arthrose pourrait témoigner de la destruction du cartilage, mais aussi provenir en partie de la synoviale.
Objectif : Etudier les variations du taux de COMP du LS sous l'effet de différents traitements intra-articulaires dans la gonarthrose Méthode : Etude prospective : 33 sujets ayant une gonarthrose fémorotibiale avec épanchement. Arthrocenthèse à JO et à J30 (10 jours) A JO injection intraarticulaire, soit de sérum salé (n=9), soit d'hexacétonamide de triamcinolone (n=9), d'aprotinine (n=7) ou d'acide hyaluronique AH (n=8). Evaluation radiologique du pincement (stades 0-3/score d'Altman). Dosage de la COMIP du LS à JO-J30 comme décrit à l'exemple 3.
Résultats : La COMP ( erreur standard) à JO était de 7.73 1.18 g/ml (médiane : 6.56 ; extrêmes 0.36-19.8). Elle est significativement plus élevée dans les stades 2 et 3 (10.9 et 7.7 g/ml) que dans le stade 1 (2.5 g/ml) p=0. 04. Elle est significativement abaissée à J30 . 4. 88 0. 99 (3.75 ; 0.40-19.2 ; p=0. 026). Cette diminution n'est significative que dans le groupe traité par triamcinolone (4. 08
1. 49 g/mI soit-39.4%, p=0. 04) mais pas par sérum salé (21 6%), ni par aprotinine
1. 49 g/mI soit-39.4%, p=0. 04) mais pas par sérum salé (21 6%), ni par aprotinine
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(-16. 8%) ou AH (-27%). La concentration de COMP est réduite de 55% dans le stade 2 mais seulement de 12. 5% dans le stade 3.
Conclusion: L'injection intra-articulaire de triamcinolone réduit la concentration de COMP du LS dans la gonarthrose.
Claims (17)
1 - Procédé d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de tout ou partie d'une protéine matricielle oligomérique du cartilage -dénommée COMP- caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en oeuvre des anticorps-ou des fragments d'anticorps- aptes à former des complexes avec des antigènes constitués par au moins une Séquence de Reconnaissance Spécifique (SRS) de la COMP, cette SRS ayant pour caractéristique d'être constituée au plus de 50 acides aminés et d'être située dans l'une des extrémités N-terminale d'au moins l'une des sous-unités formant la COMP
2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la SRS comporte au moins cinq, de préférence au moins dix acides aminés.
3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la SRS est une séquence peptidique de formule désignée par la référence SEQ ID NO : 1 : dans la liste de séquence annexée : GlnGlyGlnSerProLeuGlySer AspLeuGlyProGlnMet Leu et/ou une ou plusieurs séquences peptidiques homologues de SEQ ID NO : 1. comprenant au moins un épitope dans la séquence SEQ ID NO : 1
4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la technique de dosage utilisée est de type "ELISA", immunohistochimie, immunocytologie, immunoprécipitation, immunoagglutination, radioimmunologie, (RIA), "DOT BLOT" ou "WESTERN BLOT", de préférence "ELISA" et, plus préférentiellement encore, "ELISA" indirecte par inhibition.
5 - Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en #uvre une technique de dosage de type "ELISA" dans laquelle : - on utilise au moins un support sur lequel : # est immobilisée au moins une SRS telle que définie dans au moins l'une des revendications 1 à 3, ("ELISA" indirecte) ; ou est retenu au moins une partie du milieu à analyser comprenant éventuellement de la COMP ("ELISA" directe) , - on met en présence les éléments immobilisés ou retenus sur le support avec des anticorps libres de référence primaires AcI anti-SRS ;
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- et on révèle les éventuels complexes SRS/ AcI formés sur le support à l'aide de moyens de révélation comprenant des marqueurs portés par les AcI et/ou par des anticorps secondaires AcII, anti-Ad.
6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en #uvre une technologie de dosage de type "ELISA" dans laquelle : - on utilise au moins un support sur lequel sont immobilisés des AcI anti
SRS ; - on met en présence les AcI immobilisés avec des SRS libres de référence et le milieu à analyser comprenant éventuellement de la COMP ; - et on révèle les éventuels complexes SRS/AcI formés sur le support à l'aide de moyens de révélation comprenant des marqueurs portés par les SRS de référence et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-
COMP
7 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en #uvre une technologie de dosage de type "ELISA" dans laquelle .
SRS; - on met en présence les AcI immobilisés avec le milieu à analyser comprenant éventuellement de la COMP ; - et on révèle les éventuels complexes COMP/AcI formés sur le support à l'aide de moyens de révélation comprenant des marqueurs portés par des anticorps Ach anti-protéines homologues de la COMP, et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-Ach.
- on utilise au moins un support sur lequel sont immobilisés des AcI anti-
8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on effectue la révélation des complexes SRS/AcI à l'aide d'anticorps Ach anti-protéines homologues de la COMP, ces homologues sont de préférence celles choisies dans le groupe comprenant la thrombospondine et/ou la fraction Clq du complément et/ou de la protéine A du surfactant.
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9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que les marqueurs des moyens de révélation sont sélectionnés dans le groupe comprenant : les enzymes, les substrats enzymatiques, les inhibiteurs d'enzymes, les co-enzymes, les matériaux paramagnétiques, les séquences d'acides nucléiques ou d'analogues d'acides nucléiques, les agents de luminescence, les agents de radiomarquage, la biotine, la digoxigénine et leurs mélanges.
10 - Sonde, notamment pour l'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de tout ou partie d'une protéine matricielle oligomérique du cartilage -dénommée COMP- caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence peptidique de formule (SEQ ID NO : 1 :) suivante : GlnGlyGlnSerProLeuGlySer AspLeuGlyProGlnMetLeu et/ou une ou plusieurs séquences peptidiques analogues de SEQ ID NO : 1 :, comprenant au moins un épitope dans la séquence SEQ ID NO 1
11 - Anticorps ou fragments d'anticorps, notamment pour 1"immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de tout ou partie d'une protéine matricielle oligomérique du cartilage - dénommée COMP - caractérisés en ce qu'ils sont spécifiques d'une Séquence de Reconnaissance Spécifique de la COMP, de formule SEQ ID NO : 1 : suivante :
GlnGlyGlnSerProLeuGlySerAspLeuGlyProGlnMetLeu
12 - Procédé d'obtention des anticorps ou des fragments de ceux-ci selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à utiliser la sonde selon la revendication 10 comme antigène dans un système immunitaire apte à produire des anticorps et/ou des fragments de ceux-ci spécifiques de cet antigène.
13 - Application de la sonde selon la revendication 10 et/ou des anticorps anti- SRS ou de fragments de ceux-ci selon la revendication 11, et/ou obtenus par le procédé selon la revendication 12, dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, notamment en vue du diagnostic, du pronostic ou d'études cliniques de maladies articulaires
14 - Nécessaire d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de tout ou partie d'une protéine matricielle oligomérique de cartilage-dénommée COMP- caractérisé en ce qu'il comprend :
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- des anticorps primaires AcI anti-SRS libres de référence ou des fragments de ceux-ci selon la revendication Ilet/ou obtenus par le procédé selon la revendication 12 ; - un support constituant le site réactionnel et le site de fixation de l'antigène SRS ; - des moyens de révélation des complexes anticorps/antigène susceptibles de se former, ces moyens de révélation comprenant des marqueurs portés par les anticorps primaires AcI et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-AcI.
- des solutions de lavage et de saturation et des tampons de dilution.
15 - Nécessaire d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de tout ou partie d'une protéine matricielle oligomérique de cartilage -dénommée COMP- caractérisé en ce qu'il comprend : - des antigènes libres de référence constitués par la SRS telle que définie dans au moins l'une des revendications 1 à 3, et/ou par la sonde selon la revendication 10, - un support constituant le site réactionnel et le site de fixation des anticorps anti-SRS correspondant à des anticorps primaires AcI, - des moyens de révélation des complexes anticorps/antigène susceptibles de se former, ces moyens de révélation comprenant des marqueurs portés par les antigènes de référence SRS et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-COMP ; - des solutions de lavage et de saturation et des tampons de dilution.
16 - Nécessaire d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de tout ou partie d'une protéine matricielle oligomérique de cartilage-dénommée COMP- caractérisé en ce qu'il comprend : - un support constituant le site réactionnel et le site de fixation des anticorps anti-SRS correspondant à des anticorps primaires AcI, - des moyens de révélation des complexes anticorps/antigène (COMP) susceptible de se former, ces moyens de révélation comprenant, d'une part, des anticorps Ach anti-protéines homologues de la COMP, ces protéines homologues étant de préférence celles choisies dans le
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groupe comprenant la thrombospondine et/ou la fraction Clq du complément et/ou la protéine A du surfactant et, d'autre part, des marqueurs portés par les Ach et/ou par des anticorps secondaires AcII anti-Ach ; - des solutions de lavage et de saturation et des tampons de dilution.
17 - Nécessaire selon l'une quelconque des revendications 14 à 16 en ce que les marqueurs des moyens de révélation sont sélectionnés dans le groupe comprenant : les enzymes, les substrats enzymatiques, les inhibiteurs d'enzymes, les co- enzymes, les matériaux paramagnétiques, les séquences d'acides nucléiques ou d'analogues d'acides nucléiques, les agents de luminescence, les agents de radiomarquage, la biotine, la digoxigénine et leurs mélanges, et en ce que ces moyens de révélation comportent en outre éventuellement .
* des enzymes ou des substrats enzymatiques destinés à réagir respectivement avec les substrats enzymatiques et les enzymes des marqueurs ; * et/ou des moyens de lecture des signaux émis après révélation des complexes formés
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| WO1998007035A1 (fr) * | 1996-08-15 | 1998-02-19 | Novartis Ag | Dosage pour quantifier une atteinte arthritique |
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| WO1998007035A1 (fr) * | 1996-08-15 | 1998-02-19 | Novartis Ag | Dosage pour quantifier une atteinte arthritique |
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| US7732156B2 (en) | 1999-11-22 | 2010-06-08 | Anamar Medical Ab | Sandwich immunoassay and monoclonal antibodies for COMP, Cartillage Oligomeric Matrix Protein |
| US8110663B2 (en) | 1999-11-22 | 2012-02-07 | Anamar Ab | Monoclonal antibodies for cartillage oligomeric matrix protein |
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