FR2740223A1 - Procede de determination d'auto-anticorps revelateurs de complications pathologiques ; dans le serum sanguin, en particulier de diabetiques - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de détermination d'auto-anticorps révélateurs de complications pathologiques, dans le sérum sanguin, en particulier de diabétiques. Ce procédé consiste à déterminer la présence et éventuellement la quantité de ces auto-anticorps par réaction immunologique avec de la sérumalbumine humaine oxydée. Cette détermination peut être effectuée par la méthode ELISA en utilisant comme anticorps secondaires des anticorps anti-IgM marqués à la peroxydase. On peut suivre ainsi l'évolution du diabète vers un déséquilibre du métabolisme aigu et y remédier avant l'apparition de complications graves.

Description

PROCEDE DE DETERMINATION D'AUTO-ANTICORPS REVELATEURS
DE COMPLICATIONS PATHOLOGIQUES, DANS LE SERUM SANGUIN,
EN PARTICULIER DE DIABETIQUES
DESCRIPTION
La présente invention a pour objet un procédé de determination d'auto-anticorps révélateurs de complications pathologiques, dans du sérum sanguin.

Elle s'applique en particulier à la détermination de complications pathologiques éventuelles chez des malades atteints de diabète de type I.

Ce que l'on appelle communément le diabète correspond en fait au diabète sucré, qui se traduit par une augmentation chronique anormale du taux de glucose sanguin (hyperglycémie). Les risques à long terme résident dans la survenue de complications au niveau de la rétine, des reins et des nerfs périphériques, et dans llaugmentation de l'athérosclérose en ce qui concerne les artères cérébrales, les artères coronaires et les artères des membres inférieurs.

La classification clinique du diabète sucré est très large. Les deux principaux types sont le diabète insulino-dépendant, également appelé diabète de type I, et le diabète non insulino-dépendant ou diabète de type II.

Le premier est caractérisé par son début généralement rapide ou brutal, survenant essentiellement chez le sujet jeune. Il est définitif, du fait de la destruction complète du pancréas endocrine. Les complications rétiniennes, rénales et nerveuses surviennent au bout de plusieurs années. Les méthodes de traitement et d'auto-surveillance permettent d'augmenter la longévité et de diminuer la fréquence et la gravité des complications.

Le diabète de type II représente 80 à 85 % des cas de diabète. Il comporte un élément génétique non encore complètement élucidé. il est le plus souvent associé à une obésité. Son début est progressif, l'hyperglycémie est longtemps modérée. L'évolution peut se faire vers le diabète insulino-dépendant, par épuisement du pancréas endocrine restant.

Le diabète est une maladie qui induit un stress oxydatif important.

L'oxydation des protéines par le glucose est un phénomène qui a fait l'objet de nombreux travaux.

Ainsi, il a été montré que les complications engendrées par le diabète étaient corrélées au taux élevé de glucose dans le sang. En effet, le glucose peut se condenser de façon non-enzymatique avec les amines libres des protéines, formant initialement une base de Schiff, qui peut se réarranger pour donner le produit d'Amadori. Cette première étape de la réaction est appelée glycosylation non-enzymatique ou plus communément "glycation". Le produit d'Amadori se dégrade ensuite en alpha-cétoaldéhyde ou en dicétone, comme les 1- et 3-désoxyglucosones qui sont des composés secondaires plus réactifs vis-à-vis des protéines que le glucose ; ces composés peuvent réagir avec les protéines pour former des produits avancées de glycation (AGE) ou produits de Mail lard, qui conduisent à des pontages. Les protéines ainsi modifiées sont appelées protéines glyquées.

Ce processus d'oxydation des protéines par le glucose correspond aux schémas réactionnels suivants

<tb> Protéine <SEP> -NH2 <SEP> + <SEP> HCO-(CHOH)4-CH2OH <SEP> Glucose
<tb> Protéine <SEP> -N <SEP> = <SEP> CH-(CHOH)4-CH2OH <SEP> Base <SEP> de <SEP> Schiff
<tb> Protéine <SEP> -NH-CH2-CO-(CHOH)3 <SEP> - <SEP> CH2OH <SEP> Composé <SEP> d'Amadori
<tb> Protéine <SEP> -NH2+ <SEP> H3C-CO-CO-(CHOH)2-CH2OH <SEP> Désoxyglucosones
<tb> et H-Co-Co-CH2-(CHOH)2-CH2OH
Les AGE peuvent également être formés par condensation des produits d'Amadori entre eux ou avec des désoxyglucosones. Dans ce cas, il y a production de pyrroles et d'imidazoles qui peuvent former des ponts stables avec les protéines.

Au cours du diabète, on peut également mettre en évidence des protéines oxydées, non complexées au glucose mais qui pourraient être la résultante de processus d'oxydation induits par le glucose. En effet, celui-ci peut s'énoliser et réduire ainsi l'oxygène moléculaire dans les conditions physioloiques, grâce à une catalyse par des métaux de transition. Les radicaux libres et H202 formés de cette façon seraient responsables des principaux dommages structuraux résultants lorsqu'une protéine est exposée à du glucose in vitro.

Les AGE induisent des changements de conformation de la protéine. Par conséquent, des anticorps peuvent être formés contre la protéine modifiée ou plus particulièrement contre les AGE contenus dans cette protéine et entraîner leur précipitation.

Horiuchi et al, 1994, "Advanced glycation end products of the Mail lard reaction and their relation to aging", Gerontology, 40, p. 10-15, ont préparé des anticorps spécifiques d'AGE. Ceci a permis de mettre en évidence le fait que les AGE induisent la formation d'anticorps in vitro. Cohen et al., (1994),"Amelioration of diabetic nephropathy by treatment with monoclonal antibodies against glycated albumin", Kidney-Int., 45, p167-1679, ont par ailleurs mis au point une nouvelle approche thérapeutique pour les diabétiques : un anticorps monoclonal réagissant spécifiquement avec les AGE présents dans de l'albumine, a été produit in vitro. Le complexe AGEanticorps monoclonal formé possède la particularité de ne pas précipiter. Par conséquent, l'utilisation de cet anticorps permet de réduire la concentration d'albumine glyquée dans le plasma.

Cependant, aucune étude n'a permis, à ce jour de mettre en évidence des anto-anticorps anti-protéines oxydées.

Les processus d'oxydation ne concernent pas uniquement les protéines sériques.

Ainsi, Frenkel et al. (1993), "Recognition of oxidized DNA bases by sera of patients with inflammatory diseases", Free Rad. Biol. Med., 14, p. 483-494, ont montré que le sérum de malades atteints d'inflammations chroniques contient des anticorps, essentiellement de type IgM, dirigés contre une lésion de l'ADN : la 5-hydroxyméthyl-2'-désoxyuridine (HMdUrd). En effet, un stress oxydant apparaît chez ces malades, ce qui provoque une augmentation du taux d'espèces réactives de l'oxygène et en particulier il y formation de H202. Cette molécule traverse les membranes cellulaires et nucléaires et peut ainsi atteindre 1'ADN, où elle peut alors interagir avec des sites contenant du fer ou du cuivre pour former des radicaux hydroxyles.

Ceux-ci induisent des dommages spécifiques de 1'ADN comme des coupures de chaînes ou des bases oxydées dont la 5-hydroyméthyluracile et la 8oxoguanosine. Ces bases oxydées peuvent être excisées par des enzymes de réparation, mais ce processus de réparation induit également des coupures de chaînes d'ADN. Par conséquent, si l'oxydation des bases est importante, des fragments d'ADN seront libérés pendant le processus de réparation. La capacité de réparation des cellules peut alors être dépassée en raison d'un trop grand nombre de bases oxydées, ce qui entraînerait une libération de fragments d'ADN contenant des bases oxydées. Ceux-ci pourront servir de déterminants antigéniques, conduisant ainsi à la production d'autoanticorps contre de l'ADN contenant des bases modifiées.

En conclusion, certaines pathologies provoquent un stress oxydatif qui se traduit par une modification des bases nucléiques et/ou des protéines sériques. Ces altérations peuvent conduire à une réaction immunitaire et on retrouve alors, dans le sérum de ces patients, des anticorps dirigés contre des biomolécules oxydées.

La présente invention a précisément pour objet la détermination d'auto-anticorps présents dans le sérum sanguin, notamment de diabétiques, qui sont révélateurs de complications pathologiques dues à une augmentation du stress oxydatif.

En effet, on a découvert, selon l'invention, qu'une augmentation de ce stress oxydatif pouvait être mise en évidence en déterminant dans le sérum sanguin la présence d'auto-anticorps par réaction de ces autoanticorps avec une sérumalbumine humaine (HSA) oxydée.

On pense que les auto-anticorps ainsi déterminés sont des anticorps reconnaissants les protéines glyquées ou modifiées, produites par un processus oxydatif dû par exemple à une augmentation anormale du taux de glucose sanguin, chez des diabétiques.

Selon l'invention, le procédé de détermination d'auto-anticorps révélateurs de complications pathologiques dans du sérum sanguin consiste à déterminer la présence et éventuellement la quantité de ces auto-anticorps par réaction immunologique avec de la sérumalbumine humaine oxydée.

Le procédé de l'invention est très avantageux car il permet de faire un diagnostic précoce de complications pathologiques pouvant survenir chez des diabétiques, en utilisant les modes de dosage immunologique classiques et un réactif facilement accessible, la sérumalbumine humaine oxydée.

En effet, selon l'invention, on a découvert que la sérumalbumine humaine oxydée, bien qu'elle ne corresponde pas exactement aux protéines glyquées ou modifiées, formées dans le sérum sanguin par action du glucose, réagit avec les auto-anticorps dirigés contre ces protéines modifiées, ce qui permet de suivre l'état de patients atteints de diabète de type I.

En effet, une augmentation de ce taux d'anticorps traduit une évolution de la maladie vers un état de déséquilibre aigu de la balance oxydantantioxydant, et on peut ainsi remédier à cette situation avant l'apparition de complications graves.

Selon 11 invention, on peut réaliser le dosage immunologique par n'importe quel procédé existant, par exemple en utilisant les techniques de dosage en phase homogène ou hétérogéne, par compétition ou faisant appel à deux anticorps comme la technique sandwich.

Selon l'invention, on préfère généralement réaliser le dosage par une méthode immunologique du type "sandwich" en fixant la HSA oxydée sur une phase solide et en utilisant un anticorps secondaire marqué capable de réagir immunologiquement avec les autoanticorps à déterminer.

Dans ce cas, le procédé comprend les étapes successives suivantes
- 1) fixer de la sérumaîbumine humaine oxydée sur une phase solide,
- 2) mettre en contact un échantillon du sérum sanguin avec la phase solide obtenue dans la première étape,
- 3) séparer la phase solide de l'échantillon de sérum,
- 4) mettre en contact avec la phase solide un anticorps secondaire anti-immunoglobuline humaine marqué, capable de réagir immunologiquement avec les auto-anticorps à déterminer, et
- 5) déterminer la présence et éventuellement la quantité d'anticorps secondaire marqué, fixé sur la phase solide.

En effet, ces dosages immunologiques permettent l'obtention d'une plus grande sensibilité, notamment lorsque les anticorps secondaires marqués sont des anticorps marqués par une enzyme.

Toutefois, on peut utiliser conformément à l'invention des anticorps secondaires marqués au moyen d'autres marqueurs, par exemples de marqueurs radioactifs, de marqueurs fluorescents, de marqueurs luminescents, de molécules capables de réagir avec l'avidine ou la streptavidine, ou toute molécule utilisée comme marqueur dans des dosages de ce type.

De préférence, on utilise comme marqueur une enzyme telle qu'une peroxydase.

Les anticorps secondaires sont des anticorps anti-immunoglobulines humaines. Ceux-ci peuvent être produits chez l'animal par des techniques classiques d'immunisation à partir d'immunoglobulines humaines, de préférence de type IgM.

Ainsi, les anticorps secondaires sont de préférence des anticorps anti-IgM car on a vérifié que la plupart des auto-anticorps à déterminer appartiennent au type IgM et réagissent donc avec les anticorps anti-IgM.

Pour réaliser le dosage de l'invention, on utilise de la sérumalbumine humaine oxydée. Celle-ci peut être obtenue par réaction de la sérum albumine humaine avec un agent oxydant.

De préférence, on prépare cette HSA oxydée par la méthode d'Erlanger et Beiser décrite dans
Biochemistry, vol 52, 1964, p. 68, qui utilise comme agent oxydant un periodate de métal alcalin tel que
NaIO4, et on effectue ensuite une réaction de la protéine oxydée, de préférence avec NaBH4 ou NaBH3CN.

Ainsi, cette oxydation n'est pas effectuée par le glucose mais par l'action combinée de NAIS4 et NaBH4 qui conduit à la formation de sérumalbumine oxydée, probablement analogue aux protéines oxydées par action du glucose.

La phase solide utilisée dans le procédé de l'invention pour immobiliser la HSA oxydée, peut être n'importe quel matériau solide utilisable dans des dosages immunologiques, par exemple un matériau capillaire, poreux, chromatographique ou absorbant.

Le matériau utilisé peut être un matériau naturel ou synthétique tel que les polysaccharides y compris les matériaux cellulosiques et leurs dérivés, la silice, les fibres de verre, un matériau inorganique comme l'alumine, un polymère organique comme le polychlorure de vinyle et les copolymères de chlorure de vinyle et de propylène, un tissu naturel ou synthétique, un gel tel que le gel d'agarose, ou un film polymérique tel que le polyacrylamide.

La phase solide peut par exemple être constituée par des perles de polyacrylamide, des perles ou des tubes de polystyrène, des perles magnétiques, une plaque de microtitration.

Selon l'invention, on utilise avantageusement une plaque de microtitration, réalisée par exemple en polymère tel que le polystyrène.

Pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, il est important d'utiliser une quantité de HSA oxydée représentant un excès par rapport à la quantité d'auto-anticorps présents dans le sérum sanguin.

Dans ce but, on dilue généralement l'échantillon de sérum sanguin dans un diluant approprié tel que le PBS-Azide (solution saline de tampon phosphate et azidure de sodium) . Les taux de dilution appropriés sont de préférence de 5.10-3 à 10-4 ; à titre d'exemple, on peut utiliser 25 pl de sérum sanguin présentant ce taux de dilution, par ng de
HSA oxydée, fixée sur la phase solide.

Par ailleurs, il convient de tenir compte dans le dosage des fixations d'anticorps non spécifiques, par exemple de fixations d'anticorps avec la HSA non oxydée. C'est pourquoi on réalise généralement le dosage d'une part sur l'échantillon de sérum à doser et, d'autre par sur un échantillon de sérumalbumine humaine seule, et on retranche des résultats obtenus avec 11 échantillon le résultat obtenu avec l'échantillon de sérumalbumine seule pour éliminer l'incidence de ces fixations non spécifiques.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront mieux à la lecture de la description qui suit, donnée bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence au dessin annexé sur lequel
- La figure 1 est une représentation schématique du mode de remplisssage de la plaque de microtitration utilisée dans l'exemple 1.

- La figure 2 est un diagramme représentant l'évolution de l'absorbance et par conséquent de la quantité d'anticorps présents, en fonction de la dilution de l'échantillon de sérum, dans un dosage utilisant des anticorps marqués à la peroxydase.

- La figure 3 illustre l'évolution de l'absorbance en fonction de la dilution de l'échantillon de sérum, pour des dosages réalisés sur divers patients atteints de diabète.

EXEMPLE 1
Dans cet exemple, on analyse des échantillons de sérum sanguin provenant d'un patient diabétique (Sérum n l) et d'une personne normale (Sérum T), par la méthode ELISA en utilisant comme enzyme la peroxidase, comme phase solide une plaque rigide de microtitration en polystyrène à 96 puits, comme anticorps secondaires des anticorps de chèvre dirigés contre les IgM humaines (spécifiques de la chaîne p) couplés à la peroxydase provenant de Sigma Chemical Co, et de la sérumalbumine humaine (HSA) provenant également de Sigma Chemical Co.

Dans un premier temps, on prépare la sérumalbumine humaine oxydée de la façon suivante.

On dissout dans 4 ml d'eau 13 mg (0,061 mmol) de periodate de sodium et 32 mg (4,9.10-4 mmol) de sérumalbumine humaine, puis après 5 min on ajoute 2 pl d'éthylène-glycol et on ajuste le pH à 9,5 en utilisant du bicarbonate de potassium.

On maintient la solution sous agitation à la température ambiante pendant 45 min, puis on ajoute 18 mg (0,48 mmol) de borohydrure de sodium. Après une nuit, on arrête la réaction en remontant le pH de la solution à 7,5 avec de l'acide formique 1M, puis on agite le mélange pendant 1 h à la température ambiante, on dialyse la solution contre de l'eau pure et on contrôle sa conductimétrie, puis on lyophilise la HSA oxydée ainsi obtenue.

Pour l'analyse, on utilise la plaque de microtitration à 96 puits représentée sur la figure 1.

Sur cette figure, chaque carré symbolise un puits de la plaque, les puits de la partie gauche de cette plaque sont réservés à l'analyse du sérum n0 1 alors que la partie droite est destinée à l'analyse du sérum T, comme il est mentionné en haut de la figure.

Les chiffres en dessous indiquent les taux de dilution du sérum n01 et du sérum T qui correspondent à la rangée verticale de puits sous-jacente.

Sur la partie droite de la figure, on a indiqué la concentration en HSA oxydée ou HSA seule utilisée pour chaque rangée horizontale de puits, et à la base on a précisé quels étaient les puits remplis de HSA oxydée et les puits remplis de HSA seule servant à déterminer les liaisons non spécifiques.

Pour réaliser l'analyse, on procède de la façon suivante. On introduit dans chaque puits de la plaque de microtitration, 40 ul de PBS-azide contenant la quantité de HSA oxydée obtenue précédemment ou la quantité de HSA seule figurant sur la partie droite de la figure 1, qui varie selon le puits de 2 ng à 2000 ng. On sèche alors la plaque pendant une nuit à 37"C, puis on la lave 6 fois dans un bain de tampom
PBS-Tween (solution de Tween-20 à 0,05 % dans du PBS).

On enlève ensuite l'excès de tampon PBS en tapant la plaque sur du papier absorbant, puis on ajoute 25 pl de
PBS dans chaque puits, ainsi que 25 ul du sérum humain n"l ou du sérum témoin T, au taux de dilution de 10-1, 10-2 ou 10-3 selon le puits, comme indiqué dans la partie haute de la figure 1.

Après 90 min d'incubation à la température ambiante, on vide la plaque, puis on la lave 6 fois dans un bain de PBS-Tween identique à celui utilisé précédemment.

On ajoute alors dans chaque puits 50 ul d'anticorps de chèvre (taux de dilution de 1/5000 dans du PBS-azide) dirigés contre les IgM humains et couplés à la peroxydase, et on laisse incuber 90 min à la température ambiante. On vide alors les puits, et on les lave avec du PBS-Tween en finissant par un lavage avec de l'eau distillée.

On ajoute alors dans chaque puits 50 ul d'une solution de substrat de 11 enzyme, constituée de 10 ml de tampon citrate (50 mM, pH = 5) contenant 1 mg de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine TMB dans 0,1 ml de diméthyl sulfoxyde (DMSO), ainsi que 2 ul de H202 à 30 %. On laisse alors incuber 7 min à la température ambiante et à l'abri de l'air, en recouvrant la microplaque d'un film de plastique, puis on stoppe la réaction par addition de 50 ul d'acide chlorhydrique 1M dans chaque puits. On mesure alors l'absorbance à 450 nm au moyen d'un lecteur automatique de microplaques
Labsystems Multiskan.

On analyse les résultats obtenus en comparant l'absorbance d'un puits ayant HSA oxydée à l'absorbance du puits témoin ayant HSA seule, correspondant aux mêmes dilutions de HSA (seule ou oxydée) et de sérum sanguin dans le cas du sérum n"l et dans le cas du sérum témoin.

Cette comparaison indique qu'il n'y a pas de différence d'absorbance dans le cas du sérum témoin. Le résultat de l'essai est négatif, on n'a pas détecté la présence d'auto-anticorps.

En revanche dans le cas du sérum n"l qui provenait d'un diabétique ayant eu récemment un déséquilibre du métabolisme aigu, il y a une différence d'absorbance, ce qui traduit la présence d'autoanticorps capables de réagir avec HSA oxydée.

On a ainsi mis en évidence la présence d'autoanticorps anti-protéine oxydée dans le sérum sanguin de patients atteints de diabète de type I.

Ce résultat est très intéressant sur le plan clinique car de nombreux liens semblent exister entre albumines modifiées, rétinopathie et néphrophatie qui compliquent le diabète. Aussi, la détection de ces auto-anticorps peut être un élément prédictif de survenue de ces complications.

EXEMPLE 2
Dans cet exemple, on analyse de nouveaux échantillons du sérum sanguin n01 en suivant le même mode opératoire que dans l'exemple 1, mais en utilisant des taux de dilution du sérum sanguin allant de 10-4 à 2.10-2 et une concentration constante en HSA oxydée ou
HSA seule de 2 ng par puits, dans 40 ul de PBS-azide.

Les résultats obtenus, différences d'absorbance entre le puits avec HSA oxydée et le puits avec HSA seule, sont donnés sur la figure 2.

Cette figure 2 représente l'évolution de l'absorbance (différence d'absorbance) en fonction du taux de dilution de l'échantillon de sérum n01 et elle montre clairement que l'absorbance varie en fonction de la quantité d'anticorps présents dans l'échantillon.

Par ailleurs, elle montre qu'il est avantageux d'utiliser des taux de dilution du sérum allant de 10-4 à 5. 10-3 pour se situer dans la partie linéaire de la courbe où les variations sont plus significatives.

EXEMPLE 3
Dans cet exemple, on effectue la même analyse que dans l'exemple 2 sur des échantillons de sérums sanguins provenant de différents patients mais en utilisant des taux de dilution du sérum allant de 5.10-3 à 10-4
Ainsi, on teste 4 sérums (sérums n"l à 4) qui ont été prélevés chez des personnes atteintes de diabète de type I, à différents intervalles de temps par rapport à un déséquilibre du métabolisme aigu. On teste également 3 sérums (sérums n05 à 7) de personnes atteintes de diabète de type I mais n'ayant pas eu de déséquilibre du métabolisme aigu depuis au moins 3 mois, et on teste de plus le sérum d'une personne non diabétique (sérum témoin).

Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 3 qui représente l'évolution de l'absorbance (différence d'absorbance entre HSA oxydée et HSA seule) en fonction du taux de dilution du sérum dans le cas de chacun des sérums analysés.

Sur cette figure, les numéros des courbes se rapportent aux numéros des sérums testés. Ainsi, pour les sérums n"l à 4 qui se rapportent aux sérums de personnes atteintes de diabète de type I, prélevés à différents intervalles de temps par rapport à un déséquilibre du métabolisme aigu, on remarque des variations d'absorbance plus ou moins importantes qui dépendent en particulier du moment du prélèvement.

En revanche, dans le cas des courbes 5, 6 et 7 qui se rapportent aux sérums n"5-7 de personnes atteintes de diabète de type I mais n'ayant pas eu de déséquilibre depuis au moins 3 mois, on remarque que les variations d'absorbance en fonction du taux de dilution ne sont pas significatives comme dans le cas de la courbe T qui se rapporte au sérum témoin.

Ainsi, seules les courbes des 4 sérums très positifs, c'est-à-dire de patients ayant eu une crise récente, mettent en évidence la présence d'anticorps dirigés contre la sérumalbumine humaine oxydée.

Les dosages décrits ci-dessus sont donc très intéressants car ils permettent de dépister la présence d'auto-anticorps dirigés contre la HSA oxydée chez des malades ayant souffert d'importantes crises de diabète et, comme ils sont très peu coûteux, ils peuvent être utilisés comme moyen de dépistage systématique des complications du diabète ou d'autres maladies induisant un stress oxydatif important.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Procédé de détermination d'auto-anticorps révélateurs de complications pathologiques, dans du sérum sanguin, caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer la présence et éventuellement la quantité de ces auto-anticorps par réaction immunologique avec de la sérumalbumine humaine oxydée.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes

- 1) fixer la sérum albumine humaine oxydée sur une phase solide,

- 2) mettre en contact un échantillon du sérum sanguin avec la phase solide obtenue dans la première étape,

- 3) séparer la phase solide de l'échantillon de sérum,

- 4) mettre en contact avec la phase solide un anticorps secondaire anti-immunoglobuline humaine marqué, capable de réagir immunologiquement avec les auto-anticorps à déterminer, et

- 5) déterminer la présence et éventuellement la quantité d'anticorps secondaire marqué, fixé sur la phase solide.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les anticorps secondaires sont des anti-corps anti-IgM.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que les anticorps secondaires sont marqués par une enzyme.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'enzyme est une peroxydase.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la HSA oxydée est préparée par réaction de sérum albumine humaine avec un agent oxydant.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent oxydant est le periodate de sodium, et en ce que la protéine oxydée est ensuite mise à réagir avec le borohydrure de sodium.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que la phase solide est une plaque de microtitration.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que l'on utilise 25 p1 de sérum sanguin, ayant un taux de dilution de 5.10-3 à 10-4, par ng de HSA oxydée fixée sur la phase solide.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on effectue la même détermination d'autoanticorps sur de la sérumalbumine humaine seule et en ce que l'on retranche du résultat obtenu avec le sérum sanguin à doser le résultat obtenu avec la sérumalbumine humaine seule.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le sérum sanguin provient de malades atteints de diabète insulino dépendant.