FR2561660A1 - Nouveaux anticorps diriges contre un groupement haptenique contenant un motif choline, leur preparation et leur application, et nouveaux antigenes permettant de les preparer - Google Patents

Abstract

NOUVEAUX ANTICORPS DIRIGES CONTRE UN GROUPEMENT HAPTENIQUE DE FORMULEI:-X-CO-O-CH-CH-N(CH)DANS LAQUELLE X REPRESENTE UN GROUPEMENT ALKYLE EVENTUELLEMENT SUBSTITUE AYANT 2 A 8 ATOMES DE CARBONE, L'EXTREMITE LIBRE DE X, SUR LA FORMULEI, POUVANT COMPORTER UN GROUPEMENT FONCTIONNEL TEL QU'UN GROUPEMENT -CO- OU -NH-; LEUR PREPARATION, ET ANTIGENES PERMETTANT DE LES PREPARER. APPLICATION A LA DETECTION ETOU AU DOSAGE DES ESTERS DE CHOLINE SELON LES TECHNIQUES IMMUNOCHIMIQUES OU IMMUNOCYTOCHIMIQUES.

Description

La présente invention a pour objet de nouveaux anticorps diriges contre un groupement hapténique contenant un motif choline, leur preparation et leur application, ainsi que de nouveaux antigenes permettant de les préparer.

On sait que de nombreuses mole cules de petite taille sont incapables d'induire par elles-mêmes la production d'anticorps, tout en étant capables de reagir avec des anticorps. Ces molecules sont appelées "haptenes". Pour induire la production d'anticorps dirigés contre les haptènes, il est necessaire de fixer prealablement ceux-ci, généralement par liaison covalente, sur une molécule de grande taille appelée "porteur". La substance obtenue (appelée "conjuguse") est alors capable de stimuler la production d'anticorps, et constitue un immunogene.

Par ailleurs, on sait que les réactions antigene-anticorps constituent, en raison de leur grande sensibilité, une méthode particulierement intéressante de détection pour le dosage et la visualisation des haptenes, grace notamment aux techniques d'immunofluorescence et aux dosages radjo-immunologiques. Ces méthodes ont déjà été utilisées notamment pour Ü quantification de diverses hormones.

Dans le domaine de la neurobiologie, on sait que l'identification spécifique des molécules informatives, ainsi que leur localisation dans le système nerveux central, constituent actuellement l'un des sujets de recherche les plus importants, car il permet d'élucider non seulement l'organisation mais aussi le fonctionnement du système nerveux.

Mais les relations entre les substances neuro-effectrices et les fonctions du système nerveux central sont très difficiles à étudier et ne progressent que lentement. Les méthodes immunologiques apparaissent particulièrement prometteuses dans ce domaine. Toutefois, ici encore, les progres ont été relativement lents depuis que les premiers essais d'obtention d'anticorps dirigés contre les dérivés indoliques ont été décrits par RANADIVE
N.S. et SELON A.H.,Can,J. Biochem. 45, pp. 1689-1700 (1967).

Le premier probleme à résoudre est d'obtenir un immunogène induisant la production d'anticorps hautement spécifiques et affins. On sait que par administration d'un haptène couplé à une protéine porteuse, on obtient plusieurs catégories d'anticorps : des anticorps dirigés contre le porteur, des anticorps dirigés contre 13haptène et enfin des anticorps dirigés contre mi determinant antigénique situé dans la zone de contact entre l'haptène et le porteur. Généralement, on élimine les anticorps anti-porteur par passage sur un immuncadscrbant solide contenant l'haptène Les anticorps spécifiques qui se fixen' sont ensuite élues.

On congoit donc que la nature du couplage entre l'haptène et le porteur est susceptible de jouer un rôle tries important dans l'obtention d anticorps hautement spécifiques contre l'haptêne.

On sait que l'acétylcholine, qui repond à la formule
(CH3)3-N±CH2-CH2-O-CO-CH3 .Z (z étant un anion, normalement l'anion chlorure), est un neuromédiateur très important en raison de son rôle dans le transfert de l'information au sein des systèmes nerveux central et périphérique et à la jonction neuromusculaire.

C'est en effet la découverte de l'acétylcholine et de son rôle qui a été a l'origine de la notion de transfert chimique de l'information.

Paradoxalement, il n'existe encore à l'heure actuelle aucune méthode précise permettant l'approche immunologique directe de cette molécule.

On a maintenant découvert qu'il est possible d'obtenir des anticorps anti-acétylcholine hautement spécifiques à l'aide d'un immunogene obtenu grâce à des agents de couplage particuliers.

Pour coupler l'acétylcholine à une macromolécule antigénique en vue d'obtenir un bon immunogène, il convient d'orienter l'optimum de l'affinité du site anticorps vers la molécule d'acétylcholine et d'obtenir un encombrement suffisant du site anticorps.

On a découvert qu'il est possible d'obtenir un bon immunogène en réalisant un couplage en deux étapes, Dans une première étape, on fixe sur la macromolécule des bras comportant à leur extrémité un groupenent terminal carboxylique. On fixe de tels bras à l'aide d'un réactif agissant sur un groupement fonctionnel présent dans la macromolécule, notamment sur les groupements amine des motifs lysine ou arginine, ou sur les groupements carboxyliques des motifs aspartique ou glutamique présents dans la macromolécule.

Dans une seconde étape, on estérifie avec la choline, les groupements carboxyliques des bras ainsi fixés sur la macromolécule.

L'immunisation à l'aide des immunogènes ainsi obtenus a permis d'obtenir les nouveaux anticorps qui font l'objet de la présente demande.

La présente invention a pour objet de nouveaux anticorps capables de reconnaRtre spécifiquement un groupement hapténique, caractérisés par le fait que ledit groupement hapténique répond à la formule T -X-CO-O-CH2-CH2- 15 (CH3)3 (1) dans laquelle,
X représente un groupement alkyle éventuellement substitué ayant 2 à 8 atomes de carbone, l'extrémité libre de X, sur la formule I, pouvant comporter un groupement fonctionnel tel qu'un groupement -CO- ou -NH-.

Parmi ces anticorps, on peut citer en particulier ceux qui sont capables de reconnatre spécifiquement un groupement hapténique de formule lA
-X1-(CH2)n-CO-O-CH2-CH2-+N(CH3)3 (IA) dans laquelle n est un nombre entier pouvant varier de 2 à 6 et X1 représente un groupement fonctionnel tel qu'un groupement -CO- ou -NEI-, ou bien X1 représente une liaison covalente.

L'invention concerne notamment les anticorps capables de reconnaître un groupement hapténique de formule IB
-CO-(CH2)n-CHO-O-CH2-CH2-N+(CH3)3 (IB) dans laquelle, n est défini comme précédemment.

Bien entendu, dans les formules I, IA et lB, la charge cationique du groupement hapténique est équilibrée par celle d'un anion.

Il est évident pour 3es spécialistes que la nature de l'anion est sans importance pour la reconnaissance par les anticorps, à condition qu'il s'agisse d'un anion de petite taille par rapport au groupement hapténique de formule I, par exemple un anion minéral ou un anion organique de faible poids moléculaire. Autrement dit, si l'anion est un anion halogénure tel qu'un anion chlorure, il est évident que l'anticorps reconnaissant le groupement haptenique de formule T sous forme de chlorure reconnattra également les mêmes groupements hapténiques dont la charge cationique est neutralisée par un autre anion simple.

L'invention s'étend aux anticorps tels que définis précédemment mais modifiés par marquage avec un traceur radioactif, fluorescent ou enzymatique, obtenu selon les méthodes classiques de préparation de tels anticorps marqués.

Par exemple, le traceur peut être un traceur radioactif obtenu par échange isotopique avec un isotope radioactif tel que I 125. Le couplage des anticorps avec un agent traceur radioactif est connu en soi et peut être réalisé par exemple selon la méthode de GREENWOOD.

Le couplage des anticorps avec un fluorochrome (par exemple isothiocyanate de fluorescéine ou de rhodamine) est bien connu.

Le couplage des anticorps avec un traceur enzymatique est également connu en soi et peut hêtre réalisé par exemple en fixant l'enzyme sur les molécules d'immunoglobines selon une méthode analogue à celle décrite par
NAKANE, Journal Histochemistry Cytochemistry, 22 : 1984-1991 (1974).

l'enzyme est par exemple une peroxydase ou une phosphatase alcaline.

L'activité enzymatique éventuellement présente sur le réactif, après réalisation d'un test, peut être déterminée selon les méthodes connues avec un substrat approprié permettant par exemple une révélation par colorimétrie, par fluoresrenee, par luminescence, par potentiométrie, etc ...

L' uvention s'étend également aux anticorps monoclonaux obtenus selon la technique connue des hybr domes au départ des lymphocytes prélevés ru les animaux immunisés selon la méthode qui sera décrite ci-après.

L'invention s 'détend en outre aux anticorps polyclonaux ou monoclonaux, marqués ou non, fixés sur un support solide permettant leur utilisation comme agents fmmunoadsorbants dans des méthodes de chromatographie d'affinité ou comme réactifs d'analyse.

Ledit support solide peut être réalisé avec tout matériau solide, biologique ou synthétique, doué de propriétés adsorbantes ou capable de fixer un agent de couplage. Ces matériaux sont connus et décrits dans la littérature. Parmi les matériaux solides capables de fixer les anticorps par adsorption, on citera par exemple le polystyrène, le polypropylène, les latex, etc... Parmi les matériaux utilisables pour fixer les anticorps par covalence a l'aide d'un agent de couplage, on peut citer notamment le dextran, la cellulose, leurs dérivés aminés (diéthylamino-cellulose ou diéthylaminodextran), etc
Le support peut se présenter par exemple sous forme de disques, de tubes, de baguettes, de billes, ou de plaques de microtitration.

Les agents de couplage permettant de fixer par covalence les anticorps sur le support solide sont des dérivés bifonctionnels tels que des dialdéhydes, des quinones, etc...

Les anticorps peuvent également être fixés sur des supports solides minéraux par exemple selon les methodes décrites dans les brevets français n0 76 23176 (nO de publication 2.319.176), 77 28161 (nO de publication 2.403.556) et 77 28163 (n" de publication 2.403.098).

L'invention a également pour objet un procédé de préparation des anticorps tels que définis ci-dessus.

Ce procédé est principalement caractérisé par le fait que l'on immunise des animaux par administrations répétées, selon les méthodes connues, d'un ou plusieurs immunogènes de formule II

dans laquelle M est le reste d'une macromolécule substituée par les bras -X-CO-O-CH2-CH2-+N(CH3)3 z
x est le nombre de bras portés par ladite macromolécule,
et X est défini comme précédemment, puis que 3'on recueille les anticorps sériques desdits animaux immunisés, et que, si désiré, on fixe lesdits anticorps sur un support selon les méthodes connues et/ou les fait réagir avec un marqueur radioactif, fluorescent ou enzymatique selon les méthodes connues et/ou vérifie la spécificité des anticorps obtenus.Pour recueillir les anticorps sériques, on utilise les techniques classiques de fractionnement permettant d'isoler les immunoglobul 3nes.

L'invention concerne en particulier le procédé d 'immunisation, tel que défini précédemment, consistant à administrer au moins un immunogène de formule TIA

dans laquelle, M, X1, Z, x et n sont définis comme précédemment.

L'invention a notamment -pour objet le procédé d'immunisation, tel que défini précédemment, consistant à administrer au moins un immunogène de formule TTB

dans laquelle,
Z et n sont définis comme précédemment,
M1 est le reste d'une macromolécule aminée de formule M1-(H)x',
Z est un anion et
x' est un nombre égal ou supérieur à 1 et au plus égal au nombre de groupements amine primaire et amine secondaire portés par ladite macromolécule, étant entendu que dans la formule IIB les groupements choline-glutaryle sont liés à ladite macromolécule aminée par l'atome d'azote d'un groupement amine primaire ec/ou amine secondaire de ladite macromolécule.

Dans des modes d'exécution préférés du procédé de préparation des anticorps de l'invention, ladite macromolécule M ou M1 est une protéine, un fragment de protéine, ou un polypeptide synthétique ou semi-synthétique etc.,.; on peut citer par exemple une sérum albumine, une hémoglobine, etc...

Généralement, on utilise une macromolécule antigénique, bien que cela ne soit pas toujours necessaire, en particulier lorsqu'il s'agit de faire des injections de rappel lors du processus d'immunisation des animaux 9 on peut par exemple effectuer des injections de rappel avec un immunogène de formule II dans laquelle X est le reste d'une polylysine.

L'invention a également pour objet les nouveaux antigènes permettant notamment d'obtenir par immunisation les anticorps décrits ci-dessus.

Ces antigènes sont caractérisés par le fait qu'ils répondent à la formule T I I: M

fans c-qusll' M' est le reste d'une molécule ou macromolécule (M') comportant au moine ur groupement amine ou carboxylique, z est un nombre supérieur ou égal à 1 et au plus égal au nombre de groupements aminés ou au nombre de groupements acide carboxylique portés par ladite molécule ou macromolécule, et
Z et Z sont définis comme précédemment, étant entendu que le ou les bras -X-CO-O-CH2-CH2-+N(CH2)2 .Z sont liés au reste M' soit par l'atome d'azote d'un groupement aminé, soit par l'atome de carbone d'un groupement carboxylique de ladite molécule ou macromolécule.

L'invention a en particulier pour objet les antigènes de formule IIIA :

dans laquelle M'X1,Z , n et z sont définis comme précédemment, et notamment les antigènes de formule IIIB :

dans laquelle n et Z sont définis comme précédemment, M > 1 est le reste d'une molécule ou macromolécule aminée de formule M'1-(H)z', étant entendu que les groupements choline-glutaryle sont liés à ladite molécule aminée par l'atone d'azote d'un groupement amine primaire ou amine secondaire de ladite molécule aminée, et z' est un nombre égal ou supérieur à 1 et au plus égal au nombre de groupements amine primaire et/ou amine secondaire de ladite molécule ou macromolécule aminée.

L'invention s'étend également auxdits antigènes modifiés par marquage avec un traceur, par exemple un traceur radioactif, ainsi qu'auxdits antigènes fixés sur un support solide selon les techniques classiques de fixation à l'aide par exemple d'agents de couplage bi-fonctionnels
Lorsque la molécule aminée est une macromolécule (M'=M) l'antigène est utilisable comme immunogène.

Lorsque la molécule aminée n'est pas une macromolécule, l'antigène peut servir à suivre l'évolution du titre des anticorps lors de l'immunisation et à vérifier la spécificité et l'affinité des anticorps obtenus après immunisation. Ces derniers antigènes sont préparés de la rese façon que les immunogènes mais à partir de molécules aminées de faible poids moléculaire, généralement inférieur à 1000 et le plus souvent inférieur à 500.

L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un antigène tel que défini précédemment.

Ce procédé est principalement caractérisé par le fait
a) que l'on fait réagir une molécule ou macromolécule (M') comportant au moins un groupement aminé ou carboxylique avec un composé de formule IV
Y-X2-CO-Z' ( IV) dans laquelle X2 est un groupement allyle éventuellement substitué ayant 2 a atomes de carbone, Z' représente soit un groupement -CH soit un groupement protecteu- approprié, Y est am groupement fonctionnel capable de réagir sur un groupement aminé ou carboxylique de la molécule (M') pour fixer un groupement sur CO-Ze sur ladite molécule (M'), Y1 étant le reste du groupement fonctionnel Y après réaction avec (M'), étant entendu que -Y1-X2 est égal à -X- tel que défini précédemment, pour obtenir, après déprotection, le cas échéant, du carboxyle, un composé de formule V

dans laquelle M', X et z sont définis comme précédemment9 et
b) que l'on estérifie le composé V avec la choline pour obtenir un composé de formule III.

On voit que la formule V peut également s'écrire

Y1 étant soit une liaison covalente, soit un reste tel que -CO- ou -NH-.

Autrement dit, Y1 a la même définition que celle donnée pour X1 dans les formules IIA et lITA.

Par exemple, Si dans la formule IV, Y est un atome d'halogène, IV réagit avec les groupements aminés de la molécule ou macromolécule (M') pour former le composé V avec X = X2, -Y1- représentant alors une liaison covalente.

Le cas échéant, on prend les precautions pour éviter que le groupement -COZ' de IV ne réagisse avec les groupements aminés de (M'), par exemple en protégeant ledit groupement à l'aide d'un groupement protecteur des carboxyles, selon les techniques usuelles. Pour la description des groupements protecteurs des carboxyles, on peut citer par exemple la revue de
J.F.W. Mc OMIE, "Protective Groups", in Advances in Organic Chemistry, Volume 3, Interscience Publishers (1963) pages 244-251.

Dans le composé IV, le groupement carboxylique peut être protégé par exemple sous la forme d'un anhydride. Dans ce cas on fait réagir le composé
IV'

avec la molécule (M') en milieu alcalin.

On voit que 1V' correspond a Ta formule IV dans le cas où Y et Z' représentent ensemble le groupement -CO-O-.

On obtient alors le composé de formule V (avec X = -Y1-X2- = -CO-X2) sous forme de sel alcalin.

Pour estérifier le composé de formule V, on utilise de préférence la méthode suivante
a) on soumet le composé V à l'action d'un chloroformiate d'alkyle inférieur (I'alkyle ayant de préférence 1 à 4 atomes de carbone) en milieu anhydre et en présence d'une base telle qu'une amine tertiaire, pour obtenir un dérivé de formule (VI) : -

et b) on soumet le derive VI à l'action de la choline pour obtenir le composé de formule III.

L'invention concerne en particulier un procédé de préparation, tel que défini ci-dessus, des antigènes de formule lITA ou IIIB, au départ des composés de formule IV"
Y-(CH2)n-CO-Z' (IV") dans laquelle Y, Z' et n sont définis comme précédemment.

En particulier, dans le cas où Y et Z' représentent ensemble, dans la formule IV", un groupement -CO-O-, le procédé est caractérisé par le fait que lton fait réagir une molécule aminée de formule M'1-(H)z', telle que définie précédemment, en solution, en présence d'une base alcaline, avec un anhydride de formule IVB

dans laquelle n est défini comme précédemment, pour obtenir un dérivé glutarylé de formule
VB (sous forme de sel alcalin correspondant)

dans laquelle : les groupements -CO-(CH2)n-COOH sont liés a la molécule aminée par l'atome d'azote d'un groupement amine primaire ou amine secondaire de ladite molécule aminée, et que l'on estérifie le produit obtenu avec la choline.Par exemple, pour faire cette estérification, on soumet ledit dérivé (VB) a l'action d'un chloroformiate d'alkyle inférieur (l'alkyle ayant de préférence 1 a 4 atomes de carbone) en milieu anhydre et en présence d'une base telle qu'une amine tertiaire. nour obtenir un dérivé de formule VIB :

et l'on soumet ledit dérivé à l'action de la choline pour obtenir un composé de formule IIIB.

Dans des modes d'exécution préférés, le procédé de l'invention peut encore présenter les caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison
- la molécule aminée en solution aqueuse est soumise à l'action de l'anhydride en excès ; on élimine ensuite) selon les méthodes connues, l'excès d acide formé correspondant audit anhydride, par exemple par dialyse
- le dérivé V (sous forme de sel alcalin) est séché (par exemple par lyophilisation), puis est repris dans un solvant organique anhydre tel que la diméthylformamide (DMF) ou le dioxane et on le fait réagir avec le chloro- formiate d'alkyîe en présence d'une base telle que la triéthylamine 9 on opère de préférence a une température inférieure a lO0C, par exemple a une température de 2 a 4 C ; le chloroformiate est notamment le chloroformiate d'éthyle ou de btyle
- on ajoute ensuite la choline sous la forme d'une solution aqueuse et on purifie le dérivé de la formule III obtenu. ; la réaction avec la choline9 par exemple pour l'obtention du compose IIIB, peut être schématisée comme suit

Four suivre la reaction de couplage, on peut utiliser comme reactif une solution de choline marquée avec un traceur radioactifs par exemple une choline tvit ee. On évalue ainsi la radioactivité liée a la molécule aminée.

L'invention a également pour objet l'application des anticorps tels ;ne définis ci-dessus. Cette application consiste principalement a utiliser lesdits anticorps
- soit selon les techniques immunochimiques connues afin de détecter et da doser dans des solutions9 notamment des extraits cellulaires ou tissulaires déprotéinés, l'acétylcholine ou des dérivés analogues comme d'autres esters de choline (par exemple butyrylcholine)
soit selon les techniques immunocytochimiques classiques pour détecter et doser, dans des coupes de tissu convenablement fixées, l'acétylcholine.

Par exemple9 pour détecter ou doser l'acétylcholine ou un de ses analogues en solution, on peut utiliser les techniques immunoenzymatiques connues (notamment na test ELISA). On net en contact la solution à tester avec un support adsorbant de façon a adsorber l'haptène, s'il est pressent. On sature ensuite par une solution de protéines les sites adsorbants non occupés.

On ajoute une première solution d'anticorps spécifiques tels que ceux définis ci-dessus. On rince et on ajoute ensuite une deuxième solution dtanticorps, qui sont cette fois des anti-immunoglobulines marquées par un traceur enzymatique, ces ant- immunoglobulines étant dirigées contre les anticorps de l'espèce animale ayant servi a préparer les anticorps de ladite première solution. On rince à nouveau le support.

i suffit ensuite de révéler la présence des anticorps marqués éventuellement fixés sur le support pour savoir si l'haptène recherché était présent et pour le doser si désiré.

Comme indiqué ci-dessus, les anticorps de l'invention sont également utilisables pour réaliser des essais immunocytochimiques.

I1 faut remarquer que l'utilisation de ces anticorps pour détecter ou doser l'acétylcholine à l'aide d'un essai immunocytochimique pose un difficile problème de fixation de l'acétylcholine sur la coupe de tissu cellulaire étudiée. En effet, il n'est pas possible de fixer l'acétylcholine (du fait que son groupement alcool est estérifié) de la même façon que l'on a fixé la choline sur le composé de formule VI pour obtenir l'immunogêne.

Toutefois, on a découvert, de façon surprenante, que les anticorps tels que définis précédemment sont capable de reconnaltre sélectivement l'acétylcholine, lorsque celle-ci est fixée sur les coupes de tissu étudiées, a l'aide d'un mélange d'un alcool bifonctionnel et d'un aldéhyde choisi parmi le formaldéhyde et les dialdéhydes de formule générale
O = CH (CH2)n-CH = O n étant défini comme précédemment, à pH = 10-12 environ ; l'alcool bifonctionnel est par exemple l'alcool allylique ; de préférence l'alcool bifonctionnel et l'aldéhyde sont présents dans ledit mélange dans des proportions pouvant aller de 2 : 1 a 1 : 1 ; on peut utiliser notamment une solution d'alcool allylique 0,5 M - 1 M contenant de 1 a 5 z de glutaraldéhydr, par exemple en solution aqueuse cacodylate 0,1'M ou bien contenant de 10 - 12 % de formaldéhyde, par exemple en solution aqueuse cacodylate 0,1 M ; on opère de préférence à un pH égal ou supérieur à 11.

A cette valeur de pH importante, on pouvait s'attendre à ce que les aldéhydes aient tendance à se polymériser. Mais on a constaté de façon surprenante qu'avec l'alcool bifonctionnel, ils sont stabilisés et ainsi sont très actifs
L'invention a également pour objet des immunogènes obtenus par fixation d'acétylcholine sur des macromolécules aminées à l'aide du mélange d'alcool bifonctionnel, en particulier d'alcool allylique, et d'aldéhyde qui vient d'être décrit, ainsi que l'obtention d'anticorps par Immunisation a l'aide de ces antigènes. Ces anticorps sont capables de reconnaître spécifiquement les groupements hapténiques tels que I, TA et IB.

Les exemples suivants illustrent l'invention saris toutefois la limiter :
EXEMPLE 1
(a) 100 mg de sérum albumine bovine (BSA) sont dilués dans 4 mi de solution aqueuse de soude a pH 10. Dans 500 microlitres de diméthyl formamîde (DMF), on met 100 mg d'anhydride glutarique (AC) qui sont mélangés très rapidement la solution de protéine. Par dialyse contre de l'eau pendant 2 jours à 40C, l'excès d'acide glutamique formé et le MF sent éliminés. La protéine glutarylée obtenue est ensuite lyophilisée.

() Cette protéine glutarylée (30 mg) est reprise dans 2 ml de diméthylformamide contenant 40 microlitres de triéthylamine. Puis, à 4 C, on ajoute 150 microlitres d'une dilution au 1/16 de chloroformiate d'éthyle dans la DMF. L'activation des groupements carboxyliques est ainsi obtenue. Après 5 min. à 4 C, on ajoute 1 ml d'une solution de choline (20 mg/ml) contenant microlitre de (3H) choline, permettant ainsi de suivre la réaction de couplage et 40 microlitres de triéthylamine. La solution d'immunogène est dialysée contre de l'eau bidistillée pendant 2 jours à 4 C.

On détermine par le comptage de 100 microlitres de la solution dialysée la radioactivité liée à la protéine et la concentration molaire de la protéine par la mesure de la densité optique à 280 nm. Le rapport molaire choline fixee/proteine oscille entre 70 et 120 environ.

L' immunogène obtenu présente une structure du type suivant

14' étant le reste de la protéine ou macromolécule (qui est ici le sérum albumine bovine) et x étant défini comme précédemment (ici 70 < x < 120).

De façon analogue, on a préparé des immunogènes par fixation de glutarylcholine sur sérum albumine humaine (HSA) et sur hémoglobine (ffb).

EXEMPLE 2 : Immunisation
Deux lapins sont immunisés selon la méthode décrite par VAITUKAITIS et al, J. Clin. Endocr. 33, pp. 988-991 (1971). On administre alternativement des immunogènes différents par leur protéine porteuse mais ayant en commun la séquence : choline-glutaryle, à savoir BSA-AG-choline, HSA-AG-cholina et
Hb-AG-choline, à raison d'une immunisatior sous-cutanée toutes les trois semaines pendant 6 mois.

Pour caque immunisation, on administre à chaque lapin 500 microgrammes d'immunogène émulsionné dans 500 microlitres d'une solution de
NaCl et 500 microlitres d'adjuvant complet de Freund. On fait en outre une -Injection de rappel par voie intramusculaire tous les 1D jours.

EXEMPLE 3 | Etude de la spécificité des immunsérums obtenus
L'étude a été conduite en méthode ELISA (Enzyme-Linked-
Immunoadsorbant Assay).

Un immunogène nouvellement synthétisé dilué (dilution finale 1 microgramme/ml) dans un tampon carbonate 0,05 M (pH 9,6) est dépose dans les cupules d'une plaque de microtitration et ainsi laissé durant 16 heures à 106,
Les sérums natifs étudiés sont adsorbés sur les diverses protéines glatarylees ayant été utilisées lors des différentes immunisations9 afin d'éliminer les anticorps non spécifiques de l'haptène. Les dilutions sériques sont ajustées de foçon à obtenir une bonne lecture de la densité optique. En effet la fixation spécifique est révélée par une réaction peroxydasique utilisant l'orthophénylène diamine (OPD) comme chromophore.

Après l'adsorption sur les plaques de microtitration, un tampon contenant une forte concentration de sérum albumine bovine est employé pour saturer les sites de fixation non occupés par l'immunogène, en vue de diminuer le "bruit de fond". Trois rin5ages successifs sont faits avec un tampon phosphate (PBS) contenant du Tween 0,05 2. Les anticorps primaires spécifiques sont utilisés à une dilution 1/2000 et déposés sur les plaques de titration pendant 1H30 à 37 C. Trois rinçages permettent d'éliminer les immunoglobulines non fixées.Seules restent celles qui sont spécifiquement liées. Vn second anticorps anti-immuno- globulines de lapin couplé à une peroxydase est ensuite appliqué à une dilution de l'ordre de 1/1000 pendant 30 min à 37 C. Trois rincages sont effectués, puis 11 application du mélange OPD + 11202 en tampon citrate-phosphate 0,1 M à p11 5 permet d'obtenir une réaction colorée, lue au spectrophotomètre "Titertek" à 492 nm. Cet appareil donne une lecture rapide des densités optiques révélées dans les 96 puits d'une plaque utilisée en système ELISA.

RESULTATS
1. Par cette approche technique, l'évolution du titre des anticorps a été mesurée lors de l'immunisation. On note une augmentation croissante du titre des anticorps spécifiques puis une stabilisation de la réponse immune.

2. L'étude du déplacement protétne-AG-choline par les analogues de l'antigène (phosphatidyl-choline, choline acétyl-choline) non conjugés et par les immunogènes analogues (choline-glutaryl-hémoglobine, poly-L-lysine-AGcholine) révèle une bonne affinité des anticorps pour la choline-glutarylprotéine et une très faible affinité pour la choline et la phosphatidylcholine, mais celle-ci est plus élevée pour lsacétylcholine bien que restant faible. Les courbes de déplacement obtenues par le systeme ELISA montrent une bonne affinité des anticorps pour les groupements hapténiques cholineglutaryle ; en effet, le self-déplacement a lieu entre 10-8 8 et l06N.

Ainsi, la spécificité des immunsérums et leur affinité portent sur la structure choline-glutaryle, recouvrant largement la molécule d'acétylcholine.

Les courbes de déplacement obtenues dans le système ENLISA lors des essais de compétition entre la BSA-AG-choline adsorbée sur le support, et la choline ou la phosphatidyl-choline (courbe 1) ou l'acétyl-choline (courbe 2) ou la poly-L-lysine-ACcholine (courbe 3), après incubation avec les anticorps pendant 1 heure à 37 C, sont représentées sur la Figure 1 ci-jointe.

La technique utilisée était la suivante : on dépose sur les cupules en polystyrène de la plaque de microtitration (commercialisée sous la marque
NUNC) 200 microlitres d'une solution de BSA-AG-choline à 1 microgramm/ml dans un tampon carbonate 0,05 M de p11 9,6 et on laisse incuber pendant 16 heures à 4C. On ajoute ensuite un tampon phosphate contenant 0,05 z0 de Tween 100 et 1 g/l de serum de mouton et on laisse incuber pendant 30 min. à 370C. Les cupules sont ensuite rincées trois fois avec le mélange PBS-Tween.

Les anticorps anti-acétyleholine sont alors ajoutés et on les laisse incuber à 37 C pendant 90 min. soit seuls, soit avec le composé ajouté en vue d'étudier le phénomène de compétition. Les cupules sont ensuite lavées trois fois avec le mélange PBS-Tween puis remplies avec 200 microlitres d'une dilution au 1/1000 d'anticorps de chèvre anti-lapin marqués à la peroxydase de raifort dans le mélange PBS-Tween .Après incubation pendant 45 min. à 37 C les cupules sont lavées a nouveau trois fois avec le mélange PBS-Tween. On révèle la réaction a T'aide d'une solution contenant 10 mg/ml de dichlorhydrate de phénylènediamine dans un tampon 0,1 M citrate-phosphate de pH 5 contenant 200 microlitres d'eau oxygénée à 30 volumes pendant 10 mine à l'obscurité. On arrête la réaction par addition de 50 microlitres par cupule d'une solution 4
M d'acide sulfurique et on effectue la lecture au spectrophotomètre à 492 nm.

Les valeurs obtenues sont corrigées en soustrayant les valeurs données par les cupules revêtues simplement de protéines glutarylées (BSA-AG).

Les résultats obtenus à partir des courbes de la Figure 1 sont résumés dans le tableau suivant
TABLEAU 1

<tb> <SEP> Composés <SEP> Constantes <SEP> Constantes <SEP> Rapport <SEP> de
<tb> étudiés <SEP> de <SEP> dissociation <SEP> (Kn) <SEP> d'affinité <SEP> (KA) <SEP> réactivité <SEP> croisé
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c)
<tb> -3 <SEP> 2
<tb> <SEP> Choline <SEP> 1,98 <SEP> x <SEP> 10-3 <SEP> 5,05 <SEP> x <SEP> 102 <SEP> 235000
<tb> <SEP> Phosphatidyl- <SEP>
<tb> <SEP> choline <SEP> 1,98 <SEP> x <SEP> 10-3 <SEP> 5,05 <SEP> x <SEP> 102 <SEP> 235000
<tb> Acéthylcholine <SEP> 3,2 <SEP> x <SEP> 10-4 <SEP> 3,13 <SEP> x <SEP> 103 <SEP> 11670
<tb> <SEP> Poly-L-lysine
<tb> AG-choline <SEP> 2,86 <SEP> x <SEP> 10-7 <SEP> 3,5 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1
<tb> (a) Les constantes de dissociation sont obtenues par une représentation de Scatebard pour chaque composé en utilisant les résultats des expériences de compétition.

(b) Les constantes d'affinité sont obtenues en calculant l'inverse de KD.

(c) Ce rapport a été calculé en divisant la concentration en lysine-AG choline par le concentration en analogue à moitié du déplacement.

EXEMPLE 4 : Applications de l'immunsérum anti-ncétylcholine
(1) Immunocytochimie
Avant d'appliquer de tels immunsérums sur des coupes de tissus, il convient de fixer l'acétylcholine. Les agents couplants usuels tels que le glutaraldéhyde ou le formaldéhyde ne permettent pas seuls de fixer de façon covalente l'acétylcholine sur les protéines tissulaires. Pour cela, on a utilisé un mélange d'alcool bifonctionne3 et d'un aldéhyde formaldéhyde ou glutaraldéhyde.

L'alcool bifonctionnel utilisé est l'alcool allylique.

La spécificité de la réaction a été étudiée in vitro par réaction des différents partenaires chimiques : alcool allylique et aldéhyde, pE=ll, an présence de protéines et de choline (ou acétylcholine) tritiée.

ler point : La meilleure rétention de la choline et de l1acétyl- choline sur la protéine est obtenue lorsque le mélange : glutaraldéhyde 5 % dans un tampon cacodylate 0,1 M, pH = 11, + alcool allylique IM ou bien le mélange formaldéhyde 10 % dans un tampon cacodylate 0,1 M, pH = 11, + alcool allylique 1 M, est employé.

Le pH très alcalin est important pour la rétention de l'acetylcholine sur les protéines tant in vitro que dans les tissus biologiques.

2ème point : L'étude de l'immunoréactivité des conjugués a été effectuée dans les mêmes conditions que celles pratiquées pour la spécificité de l'immunsérum.

Le meilleur déplacement est obtenu pour les conjugués synthétisés (1) - avec acétylcholine + formaldébyde 10 % + alcool allylique IN sur protéine porteuse
KD = 4,82 10 M (2) - avec acétylcholine + glutaraldéhyde 5 % + alcool allylique 1M sur protéine porteuse
KD = 2,37 10 M.

Les autres conjugués avec choline ou acétylcholine et/ou avec formaldéhyde seul et/ou glutaraldéhyde seul et/ou alcool allylique seul donnent une immuno-réactivité plus faible et sont donc moins bien reconnus.

Après fixation sur les tissus par la méthode qui avent d'être décrite, l'immunoreconnaissance est tres bonne.

Les résultats ont été d'emblée positifs, reproductibles et spécifiques sur les différents tissus testés (cerveau de rat, cerveau d'invertébré, ganglions périphériques, moelie épinière). les immunsérums sont dilués jusqu'au 1/4000 pour leurs applications en immunocytochimie. Le mélange glutaraldéhyde ou formaldéhyde et alcool allylique, pH Il, donne une bonne fixation des tissus.De plus, Si l'on effectue la fixation en utilisant la technique : tarpon pH 11 contenant de l'alcool allylique, du glutaraldéhyde et un protecteur (agent réducteur tel que le métabisulfite de sodium), il est possible de visualiser sur une marne coupe (ou tout au moins sur des coupes sériées) plusieurs neuromédiateurs : acétylcholine, dopamine, GABA, noradrénaline, etc... appartenant aux différentes classes de neuro-médiateurs e pour lesquels des anticorps spécifiques ont été obtenus au laboratoire.

L'agent protecteur a pour fonction d'empêcher l'oxydation des catécholamines.

(2) Immunoanalyse
Etant donné l'affinité des anticorps pour le groupement hapténique choline-glutaryle, on peut, après synthèse d'un traceur iodé choline-glutarylglycyl-tyrosine, développer un dosage radio-immunologique de l'acétylcholine.

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Ante corps capables de reconnaître spécifiquement un groupement hapténique, caractérisés par le fait que ledit groupement hapténique répond à la formule I :

-X-CO-O-CH2-CH2-+N(CH3)3 (I) dans laquelle X représente un groupement allyle éventuellement substitué ayant 2 à 8 atomes de carbone, l'extrémité libre de X, sur la formule I, powant comporter un groupement fonctionnel tel qu'un groupement -CO- eu -NH-,

2.Anticorps selon a revendication 1, caractérisés par le fait qu'ils sont capables de reconnaître sélectivement un groupement hapténique de formule IA : -X1- (CH2), -CO-O-CH2-CH2-$N(CH3)3 (TA) dans laquelle n est un nombre entier pouvant varier de 2 a 6 et X1 représente un groupement fonctionnel tel qu'un groupement -CO- ou -1H-, ou bien X0 représente une liaison covalente.

3. Anticorps selon a revendication 1, caractérisés par le fait qu'ils sont capables de reconnaître un groupement bapténique de formule IF

-CO-(CH2)n-CO-O-CH2-CH-N+(CH3)3 (IB)

4. Anticorps selon la revendication 1, caractérisés par le fait qu'ils sont marqués à l'aide d'un traceur radioactif, fluorescent ou enzymatique.

5. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés par le fait qu'ils sont fixés sur un support solide permettant leur utilisation comme agents immunoadsorbants dans des méthodes chromatographiques ou comme réactifs d'analyse.

6. Procédé de préparation des anticorps tels que définis dans l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on immunise des animaux par administrations répétées, selon les méthodes connues, d'un ou plusieurs immunogènes de formule II

dans laquelle M est le reste d'une macromolécule substituée par les bras -X-CO-O-CH2-CH2-+N(CH3)3 .Z x est le nombre de bras portés par ladite macromolécule, et X est défini comme précédemment, puis que l'on recueille les anticorps sériques desdits animaux immunisés, et que, si désiré, on fixe lesdits anticorps sur un support selon les méthodes connues et/ou les fait réagir avec un marqueur radioactif, fluorescent ou enzymatique selon les méthodes connues et/ou vérifie la spécificité des anticorps obtenus.

7. Antigènes, caractérisés par le fait qu'ils répondent a la formule III

dans laquelle M' est le reste d'une molécule ou macromolécule (M') comportant au moins un groupement aminé ou carboxylique, z est un nombre supérieur ou égal à ] et au plus égal au nombre de groupements aminés ou au nombre de groupements acide carboxylique portés par ladite molécule ou macromolécule, et

X et Z sont définis comme précédemment, étant entendu que le ou les bras -X-CO-O-CH2-CH2-+N(CH3)3 .Z sont liés au reste M' soit par l'atome d'azote d'un groupement aminé, soi t par l'atome de carbone d'un groupement carboxylique de ladite molécule ou macromolécule.

8. Antigènes selon la revendication 7, caractérisés par le fait qu'ils répondent à la formule IIIA

dans laquelle M'X1,Z, n et z sont définis comme précédemment,

9. Antigènes selon la revendication 7, caractérisés par le fait qu'ils répondont à la formule TITB

dans laquelle: n et Z sont définis comme précédemment, M'1 est le reste d'une molécule ou macromolécule aminée de formule M'1-(H)z', étant entendu que les groupements choline-glutaryle sont liés à ladite molécule aminée par ltatome d'azote d'un grrjupement amine primaire ou amine secondaire de ladite molécule aminée, et z' est un nombre égal ou supérieur à 1 et au plus égal au nombre de groupements amine primaire et/ou amine secondaire de ladite molécule ou macromolécule aminée.

10. Antigènes selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé par le fait que ladite molécule M' ou M' est une macromolécule antigénique,

11. Antigènes selon la revendication 10, caractérisés par le fait que ladite molécule M' ou M' 1est une protéine, un fragment de protéine ou un polypeptide synthétique ou semi-synthétique.

12. Procédé de préparation d'un antigène tel que défini dans l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé par le fait

a) que l'on fait réagir une molécule ou macromolécule (M?) comportant au moins un grouoement aminé ou carboxylique,avec un composé de formale IV ::

Y-X2-CO-Z' (IV) dans laquelle X2 est un groupement alkyle éventuellement substitué ayant 2 à fi atomes de carbone, Z' représente soit un groupement -OK soit un groupement protecteur approprié, Y est un groupement fonctionnel capable de réagir sur un groupement aminé ou carboxylique de la molécule (M') pour fixer un groupement -Y1-X2-CO-Z' sur ladite molécule (M'), Y1 étant le reste du groupement fonctionnel Y après réaction avec (M'), étant entendu que -Y1-X2 est égal à -X- tel que défini précédemment, pour obtenir, après déprotection, le cas échéant, du carboxyle, un composé de formule V :

dans laquelle, M', X et z sont définis comme précédemment, et

b) que l'on estérifie le composé V avec la choline pour obtenir un composé de formule ITI.

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que l'on fait réagir le composé IV'

avec la molécule (M') en milieu alcalin, pour obtenir le composé V sous forme de sel alcalin.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisé par le fait que pour estérifier le composé de formule V

a) on soumet le composé V à l'action d'un cbloroformiate d'alkyle inférieur (l'alkyle ayant de préférence 1 à 4 atomes de carbone) en milieu anhydre et en présence d'une base telle qu'une amine tertiaire, pour obtenir un dérivé de formule (VI) :

et b) on soumet le dérivé VI à l'action de la choline pour obtenir le composé de formule III.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que l'on fait réagir une molécule aminée de formule M'1-(H)z', telle que définie précédemment, en solution5 en présence dVune base alcaline avec un anhydride de formule IVI

dans laquelle n est défini comme précédemment, pour obtenir un dérivé glutarylé de formule

VB (sous forme de sel alcalin correspondant)

dans laquelle les groupements -CO-(CH2)n-COOH sont liés à la molécule aminée par l'atome d'azote d'un groupement amine primaire ou amine secondaire de ladite molécule aminée, et que l'on estérifie le produit obtenu avec la choline.

16. Application des anticorps tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée par le fait que l'on utilise lesdits anticorps soit selon les techniques immunochimiques connues afin de détecter et de doser dans des solutions l'aeétylcholine ou des dérivés analogues tels que des esters de choline, soit selon les techniques immunocytochimiques pour détecter et doser l'acétylcholine dans des coupes de tissus convenablement fixées.

17. Application selon la revendication 16, caractérisée par le fait que l'on détecte ou dose l'acétylcholine ou un ester de choline en utilisant lesdits anticorps.

18. Application selon la revendication 16, caractérisée par le fait que l'on fixe lesdites coupes de tissu à l'aide d'un mélange d'un alcool bifonctionnel et d'un aldéhyde choisi parmi le formaldéhyde et les dialdéhydes de formule :

O = CH - (CH2)n-CH = O n étant défini comme précédemment, à p 10-12 environ.

19. Application selon la revendication 18, caractérisée par le fait que l'alcool bifonctionnel et l'aldéhyde sont présents dans ledit mélange dans des proportions pouvant aller de 2 : à i 1.

2C. Application selon l'une quelconque des revendications 18 et 19, caractérisé par le fait que ledit alcool bifonctionnel est l'alcool allylique.

21. Application selon la revendication 20, caractérisée par le fait que l'or utilise une solution d'alcool allylique 0,5 M - 1 M contenant de 1 à 5 % de glutaraldéhyde.

22. Application selon la revendication 20, caractérisée par le fait que l'on utilise une solution d'alcool allylique 0,5 M - 1 M contenant de 10 à 12 % de formaldéhyde.