LU88181A1 - Procédé de préparation d'un réactif destiné à la détection des affections cancéreuses, réactif ainsi obtenu, et méthode de d'utilisation de ce réactif - Google Patents

Description

La présente invention est relative à la préparation d'un réactif formé essentiellement d'une substance protéique active, au réactif ainsi obtenu , ainsi qu'à la méthode d'utilisation de ce réactif, permettant de détecter et de diagnostiquer les affections cancéreuses chez l'être humain.

Le cancer de l'homme a fait l'objet ces derniers temps d'un effort considérable de recherches dans la voie de son diagnostic. Comme on le sait, une active propagande est menée par les pouvoirs publics secondés par certains organismes privés contre le cancer, en faveur de mesures deSLLnéés à réaliser un dépistage précoce de la maladie; on s'attache également à convaincre la population que le cancer est guérissable. L'espoir d'un traitement efficace devient de plus en plus une réalité.

Dans des cas de plus en plus nombreux, on obtient des rémissions, des stabilisations prolongées, dont certaines ont toute chance d'être des guérisons définitives.

Les cancérologues travaillent d'un élan qui ne se ralentit pas. L'évolution du cancer n'est plus attendue comme une progression régulière mais elle se comprend comme la résultante de relations bilatérales établies entre l'hôte et sa tumeur, susceptibles de variations dans les deux sens. Les efforts d'autres disciplines rejoignent ceux de la cancérologie : biologie moléculaire , génétique, virologie et immunologie dont les apports deviennent prometteurs. On recherche, à cet effet, dans la thérapeutique ch cancer la meilleure stratégie dans l'utilisation de la chirurgie, des radiations, de la chimiothérapie, de l'immunothérapie. Les traitements sont planifiés , mis en oeuvre avec un soin méticuleux. Ils sont d'autant plus efficaces que le diagnostic est précoce. C'est pourquoi il est important d'employer tous ]e s moyens possibles pour dépster le cancer à son début. Il faut faire périodiquement des examens systématiques qui ne doivent plus être refusés par une sorte de crainte irraisonnée. Plusieurs méthodes sont déjà utilisées actuellement pour tenter de diagnostiquer les affections cancéreuses. Jusqu'à présent, la biopsie, basée sur des études cytologique ou histologique, était considérée comme étant l'examen fondamental pour le diagnostic du cancer. Lorsque le geste chirurgical est aisé, la biopsie est facile et sans danger? par contre, s'il s'agit d'un organe profond, le risque est celui du geste chirurgical. D'autre part, la biopsie n'est applicable que lorsque l'examen se fait sur un organe bien spécifique, mais cet examen ne peut être que local. C'est ainsi, par exemple, qu'une tumeur aux poumons ne pourrait être révélée par l'examen cytologique ou histologique d'un autre organe. C-'est la raison pour laquelle les recherches récentes dans ce domaine se sont orientées vers des méthodes de diagnostic basées sur les réactions antigènes-anticorps, ou immunologiques, pour caractériser la présence ou l'absence d'affections cancéreuses.

Bien que certaines de ces méthodes permettent de localiser d'une façon assez précise les affections cancéreuses, elles présentent toutes l'inconvénient d'être extrêmement coûteuses, et de demander notamment un appareillage plus sophistiqué que celui de laboratoires d'analyses biologiques ordinaires.

On a également fait état dans un certain nombre de publications antérieures, qu'une affection cancéreuse de quelque type qu'elle soit s'accompagne de l'apparition dans le sang du malade de couples antigènes-anticorps. C'est ainsi que selon ces publications, à un organisme sain correspondrait un fort potentiel d'auto-défense 4 grandes quantités d'anticorps) et à un organisme affecté, correspondrait un potentiel d'autodéfense augmenté sauf à la phase terminale de l'affection. Il a été précisé à cet effet que le sang, et notamment le sang de cancéreux extrait de l'organisme, donc séparé des centres générateurs d'anticorps, pourrait être le siège du développement de formes porteuses de caractères antigéniques et qu'en outre après introduction dans un milieu et sous des conditions appropriées, le développement polymorphe de ces formes se poursuivrait. Ces formes resteraient à leur stade initial corpusculaire, porteuses d'un caractère antigénique actif. L'une de ces publications antérieures repose sur le fait que lorsque du sang humain complet de cancéreux, lorsqu'il est abandonné à l'autolyse sous certaines conditions, fournit à la fin de l'hémolyse un milieu antigénique qui, mis en incubation avec du sérum humain normal, provoque la formation d'un précipité visible, ce précipité étant moins abondant, et parfois même absent, si le sérum humain normal est remplacé par du sérum de cancéreux. Bien qu'il ait été précisé dans cette publication que les résultats obtenus s'avéraient satisfaisants, la demanderesse en procédant de la même façon et sous les mêmes conditions de traitement, n'a obtenu que des résultats peu satisfaisants.

La présente invention a pour but de remédier aux inconvénients susmentionnés, et d'offrir des méthodes de détection du cancer d'une grande simplicité et d'une grande exactitude, dont les résultats pourraient être à la base d'un test de routine permettant de faire une discrimination entre les populations des patients normaux d'une part et cancéreux d'autre part, et de prédire de façon précise, au sein de la population cancéreuse, l'état d'évolution de la maladie. L'invention repose également sur l'observation expérimentale initiale suivante; le sang humain complet de cancéreux, lorsqu'il est abandonné à l'autolyse dans des conditions bien spécifiques, fournit à la fin de l'hémolyse un produit de dégradation qui, mis en incubation avec du sérum humain normal, provoque la formation d'un précipité visible, opalescent et centri-fugeable, le précipité étant moins abondant, et parfois même absent, si le sérum humain normal est remplacé par du sérum de cancéreux. A cet effet, suivant l'invention, on prépare un réactif formé essentiellement d'une substance protéique active, à partir de sang de cancéreux humain ou de sang d'animal immunisé avec des extraits tumoraux humains d'origine cancéreuse, en extrayant la substance protéique active , sous des conditions stériles, soit par autolyse du sang complet ou des globules rouges seuls lavés,soitpc la lyse des globules rouges seuls frais, lavés, en milieu hypotonique ou hypertonique, suivie d'une ultracentrifugation pour en séparer au moins partiellement les débris cellulaires, en soumettant la substance protéique ainsi extraite à une incubation dans un milieu nutritif neutre ou légèrement basique pendant une durée de l'ordre de 5 à 8 jours à une température de l'ordre de 37°C, en centrifugeant la solution d'incubation ainsi obtenue jusqu'à l'obtention d'un surnageant, de manière à concentrer ainsi pratiquement la totalité des débris cellulaires encore présents dans le restant de la solution, et en séparant le surnageant formé essentiellement de la substance protéique active, du reste de la solution.

Suivant une forme de réalisation particulière du procédé de l'invention, l'aut&yse du sang complet, dont la durée est de l'ordre de 2 mois, est effectuée en présence d'un anticoagulant, et de préférence en présence d'une solution aqueuse contenant 1 à 2% de polyanéthol sulfonate de sodium, le processus d'autolyse pouvant éventuellement être accéléré par chauffage à une température de l'ordre de 37°C.

Suivant une autre forme de réalisation particulière du procédé de l'invention, l'on centrifuge la solution d'incubation à environ 3000 fois G pendant une période de l'ordre d'une demi-heure, et on filtre le surnageant après l'avoir séparé du reste de la- solution.

Avantageusement, l'on marque le réactif au moyen d'une substance radioactive, par exemple en marquant les globules 51 rouges laves avant leur lyse, au moyen de .Cr sous forme de chromate de sodium, ou bien en marquant le réactif après sa sépa- 325 ration du restant de la solution, au moyen de I . L'invention concerne également la méthode d'utilisation du réactif tel qu'obtenu ci-deqsus, en vue d'un diagnostic sérologique d'une affection cancéreuse chez un patient, qui consiste à ajouter le réactif, dilué ou éventuellement reconstitué au moyen d'un milieu tamponné alcalin, par exemple de pH 8, au sérum du patient à diagnostiquer.

Suivant une forme de réalisation particulière de la méthode d'utilisation de l'invention, la ccnolusion d 'un diagnostic positif est déduite du fait qu'après une période d'incubation de l'ordre d'une heure à une température de l'ordre de 37 à 45°C suivie d'une période de repos d'environ 16 heures à la température ambiante, du réactif dilué ou reconstitué auquel on a ajouté le sérum à diagnostiquer, dilué de façon appropriée, le précipité est peu important ou absent comparativement au précipité obtenu dans les mêmes conditions avec un sérum humain normal.

Suivant une autre forme de réalisation particulière de la méthode d'utilisation de l'invention, la conclusion d'un diagnostic positif est déduite du fait qu'après une période d'incubation de l'ordre d'une heure à une température de l'ordre ; de 37 à 45°C suivie d'une période de repos de l'ordre de 3 heures i à une température de l'ordre de 4°C et d'une centrifugation du réactif dilué ou reconstitué auquel on a ajouté le sérum à diagnostiquer, dilué de façon appropriée, le précipité est peu important ou absent comparativement au précipité obtenu dans les mêmes conditions avec un sérum humain normal.

Avantageusement, l'aspect du ou des précipités est apprécié de façon visuelle, par détermination de la densité optique du surnageant après précipitation, par spectrophotométrie après centrifugation et dissolution du précipité, ou bien par comptage de la radioactivité résiduelle du précipité après marquage avec du réactif.

Ainsi qu'on le verra plus en détail ci-après, ce sont essentiellement les différentes opérations de purification du réactif réalisées lors de sa préparation, dont le but est d'éliminer les produits résiduaires, et notamment les débris cellulaires, qui permettent par la suite lors de la réaction du réactif avec le sérum à diagnostiquer, d'atteindre des résultats d'une grande exactitude, qui n'ont jamais été réalisés jusqu'à présent avec les méthodes connues se basant sur le même principe.

Comme l'ont mis en évidence les recherches fondamentales entreprises peur dégager un mécanisme réactionnel et aboutir à l'identification des partenaires impliqués dans la réaction entre le réactif et le partenaire sérique, le réactif préparé consiste essentiellement en une protéine ayant de nombreuses caractéristiques communes à l'hémoglobine, notamment son poids moléculaire, sa couleur, son comportement chromatogra-phique et d'autres propriétés physico-chimiques. Cette protéine, que l'on nommera désormais ci-après " néohémoglobine", diffère néanmoins de l'hémoglobine normale de par sa structure et de son comportement vis-à-vis des séra étudiés. D'autre part, il semble que les protéines sériques impliquées dans le phénomène de précipitation n'aient qu'un effet catalytique sur celle-ci, car on ne retrouve pas de protéines sériques décelables dans le précipité. Le réactif contient de la néo hémoglobine colorée porteuse de hême, alors que le précipité qui est blanc ne contient donc plus que de la globine sans hême. Pour expliquer cette disparition de l'hême, on peut envisager deux hypothèses, soit qu'il y ait une précipitation sélective des molécules de globines (du réactif) ayant perdu leur hême alors que les molécules d'hémoglobine intactes ne précipitent pas, soit que la réaction enzymatique provoque le détachement<fe l'hême.

Le type de réaction enzymatique responsable de la polymérisation de la néo'hémoglobine n'est pas encore déterminé.

Il peut s'agir d'une réaction de protéolyse analogue à celle observée lors de la polymérisation de la fibrine ou de la caséine . L1 inhibition de la réaction par le fluorure de phényl-méthyl-sulfonyle, inhibiteur connu des protéases, serait en faveur de cette hypothèse, il peut également s'agir d'une réaction d'oxydation provoquant la formation de ponts disulfure entre chaînes d'hémoglobine. L'inhibition de la réaction par un réducteur comme l'azide de sodium, ainsi que le fait qu'il faille réduire les protéines du précipité par le mercaptoéthanol pour dissocier les tétramères et trimères de globine, parle en faveur de cette seconde hypothèse. Il se peut également que ces deux réactions aient lieu simultanément.

La question principale reste de savoir pourquoi cette réaction enzymatique est moins active en présence de sérum de patients cancéreux qu'en présence de sérum d'individus bien portants. Il ne semble pas que ce phénomène puisse être expliqué par un manque d'enzyme(s) dans le sérum des patients cancéreux, car c'est en léger excès de sérum que le test est le plus discri-minatif (dans les tubes 4 et 5 du test, contenant 0,3 à 0,35 ml de sérum; voir le chapitre "Mode opératoire" ci-après) . Cette observation suggère plutôt qu'il existe un inhibiteur d'enzyme présent en plus grande quantité dans le sérum des patients cancéreux . Ce serait donc cet inhibiteur qui serait responsable de la diminution de la précipitation observée chez les patients cancéreux. Dans le domaine des protéases, on sait que de nombreux inhibiteurs d'enzymes existent, tels que 1'alpha-l-anti-trypsine ou l'anti-chymotrypsine. C'est donc dans cette direction que les recherches seront orientées pour arriver à comprendre encore mieux le mécanisme intime de ce test.

De toute façon, il ne s'agit en aucun cas d'une réaction immunologique du type antigène-anticorps, comme cela avait été mentionné dans l'état antérieur de la technique, ainsi qu'on le verra plus en détail ci-après. L'analyse de cette réaction, comme on le verra ci-après, comprend la description détaillée de la préparation du réactif et de l'analyse de son contenu chimique, ainsi que la description de son interaction avec un contenu sérique et du résultat de cette interaction qui est le précipité.

Mode de préparation du réactif. 1. Substance de base, origine et préparation.

La substance de base qui sert à la préparation du réactif provient du sang de cancéreux humain ou du sang d'animaux immunisés avec des extraits tumoraux humains d'origine cancéreuse. Il est prouvé que la substance active se trouve à l'intérieur des globules rouges et qu'il faut donc procéder à la lyse érythrocytaire pour qu'elle soit libérée. Cette opération peut être menée, suivant l'invention, de différentes manières, soit : a) par autolyse, sous des conditions stériles, du sang complet ou des globules rouges seuls, lavés. L'autolyse du sang complet se fait en présence d'une substance anticoagulante, par exemple en présence d'une solution contenant 1 à 2% , de préférence 1,2%, de polyanéthol sulfonate de sodium. Ce processus naturel est lent et peut être considéré comme terminé deux mois après la prise de sang. Il peut néanmoins être accéléré par chauffage à 370C. b) par la lyse, sous des conditions stériles , des globules rouges frais, lavés, en milieu hypotonique ou hypertonique, suivie d'une centrifugation permettant de se débarrasser d'une partie au moins des débris cellulaires. Cette opération conduit à moins de produit brut actif. On peut utiliser, à cet effet, comme milieu hypotonique, de l'eau distillée et, comme milieu hypertonique, une solution aqueuse de chlorure de sodium dont la concentration varie entre 0,5 et 1,5% en poids, par exemple une solution aqueuse à 0,8% de chlorure de sodium.

Dans les deux cas, on lave les globules rouges avec de l'eau physiologique. 2. Réactif. a) Préparation; On soumet la substance de base, qui est un produit brut, à une incubation dans un milieu nutritif neutre ou légèrement basique. Cette opération se déroule dans une étuve maintenue à 37°C pendant 5 à 8 jours. Le milieu nutritif utilisé peut être du tampon borate HCl de pH 8. Cette opération augmente notamment le produit final obtenu en substance active. Le rapport volumique de la substance de base active au milieu nutritif est de l'ordre de 1/5 à 1/3, un rapport volumique substance active/milieu nutritif de 1/4 s'avérant particulièrement approprié. Après incubation, la solution ainsi obtenue contenant les produits de dégradation est centrifugée à environ 3000 fois G pendant une période de l'ordre d'une demi-heure. Cette centrifugation, étape essentielle du procédé de l'invention, permet de concentrer pratiquement la totalité des débris cellulaires encore présents dans le restant de la solution. Une filtration du surnageant, par exemple sur filtre Millipore de 0,22 /(m,s'il n'améliore pas le réactif en produit actif, présente l'avantage d'une part d'éliminer tous 3es éléments figurés et d'autre part de stériliser la préparation. Le surnageant provenant de différentes substances de base, si l'on a effectué des prélèvements de sang sur un certain nombre de sujets, est homogénisé et réparti, par exemple en flacons de 2 ml. Les flacons sont congelés et maintenus ensuite à -20°C avant l'emploi.

Comme on peut le voir d'après ce qui précède, le réactif ainsi obtenu, formé essentiellement de néohémoglcbineest obtenu sous une forme pratiquement pure, la majeure partie des produits résiduaires, tels que les débris cellulaires, ayant été éliminés au cours des différentes opérations de purification susmentionnées, ces opérations de purification permettant notamment d'atteindre un diagnostic d'une grande exactitude, lorsque l'on mélange le réactif avec du sérum humain à diagnostiquer. b) Caractéristiques physico-chimiques et réactivité.

Le réactif a une couleur brun rouge. Lorsqu'il est filtré sur Séphadex G-200, la majorité des protéines colorées actives dans le test de précipitation est éluée avec un poids moléculaire apparent de 68.000 daltons, comme l'hémoglobine humaine normale ou l'albumine. Moins de 10% des protéines colorées sont éluées avec le volume d'exclusion de la colonne, probablement sous forme d'aggrégats de haut poids moléculaire également actifs dans le test de précipitation. Si l'on sépare le pic principal du fractionnement Séphadex G-200 ayant un poids moléculaire de 68.000 daltons sur une colonne échangeuse d'ions sur DE-52 cellulose (Whatman) équilibrée en tampon phosphate de Na 0,01 M pH 7,4, par un gradient de polarité croissante, la protéine colorée active est éluée très rapidement avec une molarité de 0,015 M de phosphate de Na pH 7,4. L'analyse par focalisation isoélectrique donne un pH de 7,6-8,0 pour cette protéine purifiée. Ce pH est très semblable à celui de l'hémoglobine normale . L'analyse de cette protéine par électrophorèse en gel d'acrylamide contenant 0,1 % de dodécyl sulfate de sodium (SDS) donne une bande principale d'un poids moléculaire de 18.000 daltons identique à celle obtenue avec de l'hémoglobine purifiée dont les chaînes sont dissociées par le SDS et une deuxième bande moins intense d'un poids moléculaire d'environ 36.000 correspondant probablement à un dimère de chaîne d'hémoglobine. Lorsque la protéine est réduite par le mercaptoéthanol 0,2 M avant l'électrophorèse, elle ne donne plus qu'une seule bande d'un poids molécubire de 18.000. Les deux bandes non réduites ainsi que la bande réduite donnent une réaction positive (coloration brune) avec le diaminobenzidine et l'H»0 , indiquant que ces

^ Z protéines ont une action peroxydasique.

Si l'on examine les spectres d'absorption dans le visible et l'ultraviolet de l'hémoglobine normale et de la néohémoglobine dissoutes dans le même solvant (urée 8M) que celui utilisé pour dissocier le précipité, l'on constate des différences importantes et notamment l'apparition dans l'hémoglobine du réactif d'une bande d'absorption supplémentaire dans le visible.

Ces différences impliquent des structures moléculaires différentes. La dissolution de la néohémoglobine dans un tampon glycine-HCl 'de pH 2,3 provoque quant à elle des modifications plus drastiques encore ainsi qu'une modification de la couleur. Si l'on compare la réactivité des hémoglobines normale et du réactif vis-à-vis du sérum, on constate un comportement différent, seul la néohémoglobine est susceptible de faire une discrimination nette entre les séra de patient normal et cancéreux, par une différence de précipitation.

En conclusion de ces analyses, on peut dire que la protéine purifiée active du réactif a des propriétés physico-chimi- ques voisines de celles de l'hémoglobine. La réaction positive à la benzidine indique que cette protéine contient l'hême nécessaire à son action peroxydasique. On ne peut cependant exclure qu'une partie des molécules d 'hémoglobine présentes dans le réactif aient perdu leur hême car, comme on le verra dans l'analyse du précipité, celui-ci contient de la globine, mais plus d'activité peroxydasique, donc plus de hême.

Un antisérum obtenu par immunisation d'un lapin par la protéine purifiée du réactif n'a donné qu'une seule ligne de précipitation en double diffusion avec le réactif total. c) marquage du réactif :I1 est possible d'obtenir un réactif marqué à l'aide de substances radioactives: 51 1°) soit en injectant du Cr sous forme de chromate de sodium aux globules rouges lavés, puis en les lysant; 2°) soit en marquant de façon habituelle le réactif purifié avec de 1' I.

Ces deux substances peuvent servir de traceur lors de la réalisation du test, c'est-à-dire lors de la réaction entre le réactif et le sérum à diagnostiquer . d) conservation du réactif ; Le réactif peut être conservé à -20°C pendant plusieurs années ou lyophilisé et reconstitué avec du tampon alcalin, par exemple de pH 8, au moment de l'emploi. La dilution exacte à effectuer ensuite est dépendante de la concentration en substance active, mais la quantité de tampon ajoutée à 2 ml de réactif varie de 2 à 4 ml au maximum. Méthodesd'utilisation du réactif. 1, Définition. pour être efficace, il a été montré que l'interaction entre le réactif et le sérum de patient à jeun dilué de moitié dans un milieu tamponné alcalin donne lieu à une précipitation lorsque l'on observe une incubation d'une heure à 41°C (domaine de température valable : de 37°C à 45°C) suivie d'un repos à température ambiante d'environ 16 heures. Cette période de repos est nécessaire pour que le précipité soit bien formé et pour qu'il soit interprétable par une lecture à l'oeil. Cependant pour d'autres types de lectures, un repos de 3 heures à 4°C, suivi d'une centrifugation est suffisant à l'obtention d'un précipité de manière quantitative. 2 . Etude de la réaction. a) Analyse du partenaire sérique :

Comme on le sait, la filtration de sérum humain normal sur Séphadex G-200 donne trois p.cs chromatographiques, le premier contenant l'IgM et les protéines de poids moléculaire élevé, le deuxième contenant surtout l'IgG et le troisième l'albumine.

Les protéines de ces trois pics ont été testées quant à leur capacité de provoquer la précipitation du réactif. Seules les protéines du troisième pic ayant un poids moléculaire de 60-70.000 daltons se sont révélées actives. Ce résultat, confirmé par plusieurs tests, a permis d'emblée d'exclure la possibilité qu'un anticorps soit responsable de la précipitation observée. Le fractionnement par échangeur d'ions sur DE-52 cellulose des protéines sériques du 3ème pic de la colonne de Séphadex G-200 a montré que la protéine active dans le test de précipitation était éluée de manière relativement diffuse avec des molarités de phosphate de Na pH 7,4 allant de 0,08 à 0,2 M. Toutes ces fractions actives ont toujours contenu des quantités importantes d'albumine. On a même observé que des fractions qui semblaient ne contenir que de l'albumine ont donné un test de précipitation positif. Cependant, l'albumine sérique purifiée, marquée à 125 l'iode et incubee avec un test de précipitation habituel, ne s'est pas incorporée de manière significative au précipité. Ceci a été déterminé par comptage radioactif du précipité centrifugé. Donc, les seules informations précises sur le partenaire sérique de la réaction est qu'il a un poids moléculaire d'environ 60 à 70.000 daltons selon son élution sur Séphadex G-200 et qu'il a des charges plutôt acides à en juger par son élution sur DE-52 cellulose. b) Inhibition de la réaction :

La précipitation du réactif par le sérum est inhibée à 100% par la présence d'azide de sodium à une concentration finale de 0,05%. Elle est également inhibée par le fluorure de phényl- méthyl-sulfonyle (PMSF), inhibiteur connu des protéines.

Elle n'est pas inhibée par la présence d'EDTA ou d'EGTA, ce qui ++ ++ indique que la présence d'ions Ca ou Mg n'est pas nécessaire à la réaction.

Il a été également montré que la substan œ sérique active est sensible à la chaleur; un chauffage de 56°C pendant 1/2 heure du sérum humain normal altère complètement la nature de la précipitation, tout au plus observe-t-on un léger trouble dans les tubes d'essai où la précipitation est la plus forte. L'action de l'albumine est quant à elle totalement inhibée par la chaleur. g) Analyse du précipité :

Le précipité peut être centrifugé et lavé après décantation de l'excès de réactif et de sérum. Pour laver le précipité, on le disperse dans du tampon borate 0,15 m de pH 7,4 et on le recentrifuge. Le précipité peut également être parfaitement solubilisé : a) en tampon acide, glycine-HCl pH 2,3, ce qui permet de déterminer la densité optique des protéines qu'il contient, b) en urée 6 M, ce qui permet son analyse par focalisation isoélectrique, et c) en SDS (dodécyl sulfate de sodium) à 5%, ce qui permet son analyse par électrophorèse en gel d'acrylamide SDS. L'analyse des spectres d'absorption du précipité dissous soit dans le tampon glycine, soit dans l'urée 8M révèle, en plus de la bande à environ 280 nm caractéristique des protéines, une autre bande d'intensité plus faible, bien visible dans l'urée, à 414 nm (400 nm pour le spectre de la solution acide). Il est à remarquer que les deux bandes d'absorption existent déjà dans le spectre des hémoglobines. L'analyse du précipité en focalisation isoélectrique n'a permis de mettre en évidence que quelques bandes d'un pH très voisin de celles du réactif et de l'hémoglobine norna le (légèrement plus alcaline, pH de 7,8-8,4), mais pas de bandes additionnelles qui puissent correspondre au partenaire sérique, notamment aucune bande au-dessous du pHi de 7,5. y L'analyse du précipité (non réduit par le mercap-toéthanol) par électrophorèse en gel d'acrylamide contenant 0,1% de SDS a révélé 4 bandes de poids moléculaire d'environ 18, 36, 54 et 68.000 daltons, qui semblent correspondre à des monomères, dimères, trimères et tétramères de chaînes d'hémoglobine ou de gldoine. Cette interprétation est renforcée par le fait que le même précipité dissocié en SDS et réduit par le mercaptoéthanol 0,2 M ne donne plus que deux bandes de 18 et 36.000 de poids . moléculaire, indiquant une dissociation des trimères et tétramères en monomères et dimères. Il faut noter qu'après réduction, il n'y a plus aucune bande de poids moléculaire au-dessus de 40.000 qui puisse correspondre à un partenaire sérique tel que l'albumine ou l'haptoglobine. Toutes les bandes de protéines décrites ici ont été colorées par le bleu de Coomassie, en outre des gels similaires ont été colorés par le PAS (periodic acid Schiff), colorant des glycoprotéines. Ce dernier colorant n'a permis de mettre en évidence aucune glycoprotéine dans le précipité solubilisé en SDS .

Enfin, point important, toutes les bandes du précipité ne sont pas révélées par la réaction à la benzidine, alors que dans le même gel les bandes parallèles obtenues avec l'hémoglobine normale et le réactif purifié donnent une réaction positive à la benzidine. Ceci indique que les protéines du précipité ne contiennent plus de hêmes.

Les conclusions de ces analyses sont que le précipité n'est composé que de polymères de gldoine dépourvus de hême et que la polymérisation observée en gel d'acrylamide explique probablement la précipitation observée macroscopiquement. Il semble donc qu'il n'y ait plus de partenaire sérique décelable dans le précipité. L'absence de hême démontrée par la réaction négative à la benzidine explique également pourquoi le précipité n'a pas la couleur brun rouge de l'hémoglobine présente dans le réactif. L'absence de partenaire sérique dans le précipité est également confirmée par le fait qu'un lapin immunisé par des protéines purifiées du précipité a donné un antisérum qui ne révèle aucune protéine sérique en immunoélectrophorèse et qui réagit uniquement avec le réactif et l'hémoglobine.

Ces résultats suggèrent fortement que le partenaire sérique est une enzyme qui catalyse la réaction de polymérisation de l'hémoglobine du réactif sans être elle-même précipitée. 3. Mode opératoire; méthode visuelle.

Préparer 5 tubes en verre de 3 ml dans lesquels on ajoute les réactifs de la façon suivante (quantités en ΜΛ.) : 1 2 3 4 5 tampon pH 8 150 200 250 300 350 sérum 150 200 250 300 350 réactif reconstitué 100 100 100 100 100

Agiter doucement à la main Incuber une heure à 41°C

Repos à température ordinaire pendant 16 heures (pendant la nit) . Lecture visuelle à l'aide d'un miroir éclairé.

La quantification visuelle du précipité demande un certain entraînement.

Des chiffres arbitraires sont attribués aux 5 tubes pour un sérum humain normal, chiffres qui marquent une décroissance régulière mais faible quand on lit du 1er au 5ème tube : 4 3 2t5 2 1,5 soit un total de 13.

Les cas pathologiques sont définis à partir de ces mêmes chiffres: on observe à la fois une quantité moindre de précipité et une décroissance plus forte. Par exemple : 2 1 0,5 0 0 soit un total de 3,5.

Valeurs normales après étude d'un grand nombre de cas :

Normal : 10-14 Douteux : 9-8 Pathologique : 7-0 4. Autres méthode que la méthode visuelle.

Divers moyens de quantification existent, la plupart ont déjà été testés mais le choix ne s'est pas encore fait pour déterminer quelle est la méthode à utiliser en remplacement de la méthode visuelle. a) Etude du surnageant reconnaissant l'absorption du réactif préparé pour la manipulation, il est théoriquement possible, en relevant les densités optiques des 5 surnageants après précipitation, d'estimer la quantité de réactif non consommé et de le relier à la quantité de substance sérique active. b) Etude du précipité rAprès centrifugation et lavages du précipité, ce dernier peut être dissous soit dans le tampon acide gycine-HCl, soit dans de l'urée fortement concentrée (6 à 8 M/l) . Dans les deux cas, la lecture spectrophotométrique peut être effectuée à 280 nm, mais dans le cas de l'urée, il est aussi possible d'effectuer un dosage précis de la quantité de précipité à 414 nm. Un parallélisme est observé entre la lecture visuelle et la lecture spectrophotométrique. c) Marquage du réactif : Ainsi qu'on l'a mentionné précédemment, deux méthodes peuvent être utilisées pour marquer le réactif 51 préparé suivant l'invention. L'incorporation du Cr aux globules rouges fournit en fin de préparation un réactif marqué qui donne lieu à un précipité marqué faiblement. Le taux de radioactivité présente suffit néanmoins à obtenir un bon parallélisme avec les lectures à l'oeil. La néohémoglobine marquée 125 au I est ajoutée en quantité connue au mélange hàituel réactif-sérum. L'incorporation de radioactivité au précipité est également observée. Ces méthodes présentent pourtant l'inconvénient de fournir un matériel qui par nature est rapidement périssable.

On donne ci-après un certain nombre de résultats cliniques obtenus par la méthode d'utilisation du réactif suivant 1'invention. a) Population normale.

Une analyse d'un très grand nombre de tests effectués sur des patients normaux (plus de 10.000 cas) augmentée d'une étude en double aveugle pefmet de situer le taux de faux ' positifs dans la population normale aux environs de 2 à 3% maximum. b) Population cancéreuse.

Plusieurs études ont déjà été faites ou sont encore en cours. On donne ci-après des tableaux résumant les résultats préliminaires.

Etude 1. CANCERS DETERMINES PAR LE TYPE D'ORGANE ATTEINT. CORRELATION AVEC L'ETAT CLINIQUE : Positifs le test et l'état clinique correspondent (++ ou --) Négatif = non correspondance (+- ou -+)

TOTAL POSITIFS NEGATIFS

Tube digestif et organes annexes colon 22 0 rectum 12 7 5 estomac 12 8 4 oesophage 65 1 intestin 54 1 pancréas 32 1 foie 10 1 vésicule 11 0 42 29 13 (69%) (31%) Tête et cou larynx 75 2 langue 22 0 bouche 22 0 thyroïde 22 0 mâchoire 10 1 oeil 11 0 amygdales 33 0 18 15 3 (83%) (17%)

Gynécologie Ç sein 22 8 (36%) 14(64%) vulve 63 3 col utérus 64 2 endomètre 22 0 36 17 19 (47%) (53%)

Etude 1. (suite)_TOTAL_POSITIFS_NEGATIFS

Gynécologie ^^prostate 2 1 1 gonades 10 1

testicules 11 O divers (non précisés) 10 7 3 14 (8¾) 5 poumon 65 53 12

Urinaire-rénal rein 2 2 0 vessie 22 0 4 4 0

Autres peau 21 1 cerveau 54 1 crête iliaque 11 0 CANCERS DETERMINES PAR LEUR DIAGNOSTIC. lymphomes 65 1 méningiomes 11 0 glioblastomes 13 11 2 TUMEURS MALIGNES ' NON PRECISEES. 13 11 2 TOTAL 220 161 59 (73%) (2 7%)

Etude 2. CLASSEMENT DES CANCERS. ACTIF : 1) Avant traitement ou tout au début du traiement par RX Sans chirurgie ou chimiothérapie 2) Généralisation prouvée avant ou au début du · traitement 3) Récidive sans traitement. NON ACTIF: 1) Traitement par RX complet 2) Chirurgie faite : RX en cours 3) Cure chimiothérapique faite : RX en cours 4) Examen de contrôle sans signe de récidive ou de généralisation TPR : Rapport positif réel TNR : Rapport négatif réel PPV : Indice de prédiction positif NPV : Indice de prédiction négatif 0 .A . : Exactitude globale f

ί

CAS PARTICULIER DES CANCERS DU POUMON.

Les résultats de l'étude 2 montrent : 1°) qu'un test donnant des résultats positifs (0-7) indique une très forte probabilité de cancers évolutifs. 2°) qu'un cancer non actif donne une forte proportion de résultats négatifs (10-13). > 3°) une corrélation globale test/clinique de plus de 70% (même résultat que l'étude 1) ' 4°) que les cancers pulmonaires sont ceux pour lesquels le taux de positivité et de corrélation globale est le plus élevé.

Etude 3.

Etude comparative de plus de 350 cas de cancers dont l'état clinique était bien connu au moment de la prise de sang et qui étaient dans leur grande majorité évolutifs.

La comparaison a porté entre le test réalisé suivant Γinvention (l)et le test carcinoembryonnaire (CEA) (II).

Le graphique de la figure 1 annexée montre la positivité de chacun des tests. On s'aperçoit : 1°) qu'il y a une bonne concordance des tests dans leur zone normale ou douteuse ; 2°) que le test suivant l'invention met en évidence un beaucoup plus grand nombre de cas pathologiques .

La figure 2 montre la corrélation test/état clinique globale .

Dans cette comparaison, le test de l'invention montre une meilleure corrélation avec l'état clinique que le test CEA.

Il est bien entendu que l'invention n'est pas limitée aux formes de réalisation décrites et que bien des modifications peuvent y être envisagées sans sortir du cadre du présent brevet.

Claims (25)

RE VEND ICA TI ONS.-

1. Procédé de préparation d'un réactif formé essentiellement d'une substance protéique active appelée néohémoglobine, destiné à la détection d'une affection cancéreuse, à partir de sang de cancéreux humain ou de sang d'animal immunisé avec des extraits tumoraux humains d'origine cancéreuse, caractérisé en ce qu'il consiste à extraire la substance protéique active , sous des conditions stériles, soit par autiyse du sang complet i ou des globules rouges seuls lavés, soit par la lyse des globules rouges seuls frais, lavés, en milieu hypotonique ou hypertonique, suivie d'une ultracentifugation pour en séparer au moins partiellement les débris cellulaires, à soumettre la substance protéique ainsi extraite à une incubation dans un milieu nutritif neutre ou légèrement basique pendant une durée de l'ordre de cinq à huit jours à une température de l'ordre de 37°C, à centrifuger la solution d'incubation ainsi obtenue jusqu'à l'obtention d'un surnageant, en concentrant ainsi pratiquement la totalité des débris cellulaires encore présents dans le restant de la solution, et à séparer le surnageant formé essentiellement de la substance protéique active du reste de la solution.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue l'autolyse du sang complet en présence d'un anticoagulant.

3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'anticoagulant est une solution aqueuse contenant 1 à 2% de polyanéthol sulfonate de sodium.

4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la durée de l'autolyse est de l'ordre de deux mois.

5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on accélère le processus d'auto-lyse par chauffage à une température de l'ordre de 37°C.

6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise comme milieu hypotonique, de l'eau distillée .

7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise comme milieu hypertonique, une solution aqueuse de chlorure de sodium dont la concentration varie entre 0,5 et 1,5%.

8. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on utilise comme milieu nutritif un tampon de pH 8 formé de borate-HCl.

9. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le rapport volumique du réactif au milieu nutritif est de l'ordre de 1/5 à 1/3.

10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que le rapport volumique réactif/milieu nutritif est de 1'ordre de 1/4.

11. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on centrifuge la solution d'incubation à environ 3000 x G pendant une période de l'ordre d'une demi-heur e .

12. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on filtre le surnageant après * ' l'avoir séparé du reste de la solution.

13. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le réactif est congelé et maintenu à une température de l'ordre de -20°C avant l'emploi.

14. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le réactif est lyophilisé et reconstitué avec un tampon approprié au moment de l'emploi. J

15. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le réactif est marqué au moyen d'une substance radioactive.

16. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que l'on marque les globules rouges lavés avant leur lyse, 51 au moyen de Cr sous forme de chromate de sodium.

17. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que l'on marque le réactif après sa séparation du restant 125 de la solution, au moyen du I.

18. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que l'on effectue des prélèvements de sang sur un certain nombre de sujets.

19. Méthode d'utilisation du réactif préparé suivant 1 une quelconque des revendications 1 à 18, en vue d'un diagnostic sérologique d'une affection cancéreuse chez un patient, caractérisée en ce qu'elle consiste à ajouter le réactif, dilué ou éventuellement reconstitué au moyen d'un milieu tamponné alcalin,au sérum du patient à diagnostiquer.

20. Méthode suivant la revendication 19, caractérisé en ce que l'on utilise du sérum de patient à jeun dilué de moitié dans un milieu tamponné alcalin .

21. Méthode suivant la revendication 20, caractérisé en ce que la conclusion d'un diagnostic positif est déduite du fait qu'après une période d'incubation de l'ordre d'une heure à une température de l'ordre de 37°C à 45°C suivie d'une période de repos d'environ 16 heures à la température ambiante, du réactif dilué ou reconstitué auquel on a ajouté le sérum à diagnostiquer, dilué de façon appropriée, le précipité est peu î important ou absent comparativement au précipité obtenu dans les mêmes conditions avec un sérum humain normal. :

22. Méthode suivant la revendication 20, caractérisée en ce que la conclusion d'un diagnostic positif est j j déduite du fait qu'après une période d'incubation de l'ordre d'une heure à une température de l'ordre de 37 à 45°C suivie d'une période de repos de l'ordre de trois heures à une température de l'ordre de 4°C et d'une centrifugation du réactif dilué ou reconstitué auquel on a ajouté le sérum à diagnostiquer, dilué de façon appropriée, le précipité est peu important ou absent comparativement au précipité obtenu dans les mêmes conditions avec un sérum humain normal.

23. Méthode suivant l'une ou l'autre des revendications 21 et 22, caractérisée en ce que l'aspect du précipité est apprécié de façon visuelle, par détermination de la densité optique du surnageant après précipitation, par spectrophoto-métrie après centrifugation et dissolution du précipité, ou par comptage de la radioactivité résiduelle du précipité après marquage du réactif.

24. Procédé de préparation d'un réactif formé essentiellement d'une substance protéique active appelée néohémoglobine, destiné à la détection d'une affection cancéreuse, à partir du sang de cancéreux humain ou de sang d'animal immunisé avec des extraits tumoraux humains d'origine cancéreuse, et méthode d'utilisation de ce réactif en vue d'un diagnostic sérologique d'une affection cancéreuse chez un patient, tels que décrits ci-dessus.

25. Réactif destiné à la détection d'une affection cancéreuse, tel qu'obtenu par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 18 et 24. i