ES2896100T3

ES2896100T3 - Dominio FKBP con sitio de reconocimiento de transglutaminasa

Info

Publication number: ES2896100T3
Application number: ES16822389T
Authority: ES
Inventors: Michael Schraeml; Wojtek Steffen
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2022-02-23
Anticipated expiration: 2036-12-13
Also published as: JP6967002B2; KR20180087431A; JP2019508366A; CN108699104A; BR112018012055A2; CN108699104B; EP3390424A1; US20190381181A1; WO2017102759A1; EP3390424B1

Abstract

Sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la siguiente fórmula general I (F*-L)y-X (I) en la que F* se selecciona de una secuencia de aminoácidos del dominio FKBP que comprende los aminoácidos N terminales 1 a 64 y 123 a 149 del polipéptido SLYD, en la que los aminoácidos 65 a 122 se reemplazan por una secuencia de aminoácidos ("marca Q") de 5 a 15 aminoácidos, comprendiendo la marca Q una subsecuencia de 5 aminoácidos contiguos que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con la porción YRYRQ de la secuencia peptídica X1-YRYRQ-X2 (SEQ ID NO: 1), en la que X1 y X2 están ausentes o constituyen aminoácidos conectores, en la que la marca Q es una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20; L está ausente o se selecciona de una secuencia de aminoácidos conectora; y X es una proteína de interés seleccionada de una enzima, un antígeno, tal como una proteína vírica, un anticuerpo o fragmento del mismo, y otros compañeros de unión inmunológicos; y es un número entero de entre 1 y 100, y en el que dicho sustrato de TG es un sustrato para la función TG de la TG de Kutzneria albida de acuerdo con SEQ ID NO: 23.

Description

DESCRIPCIÓN

Dominio FKBP con sitio de reconocimiento de transglutaminasa

La presente invención se refiere a un sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio FKBP de un polipéptido FKBP, en el que el dominio de "inserción en solapa" (insert-in-flap, IF) del mismo está, al menos en parte, reemplazado por una secuencia de aminoácidos ("marca Q") de 5 a 15 aminoácidos que comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica X¹-YRYRQ-X²(SEQ ID NO: 1), específicamente con la porción YRYRQ de la secuencia peptídica, y en el que dicho sustrato de TG es un sustrato para la función TG de la TG de Kutzneria albida (KalbTG). La presente invención se refiere además a usos de dicho sustrato.

Antecedentes de la invención

Los antígenos solubles y/o inmunorreactivos y variantes de los mismos son esenciales para las pruebas diagnósticas in vitro. Como ejemplo, se usa una variante recombinante y soluble de la proteína de la cubierta vírica gp41 para detectar una infección por el VIH-1.

La solubilidad requerida de antígenos inmunorreactivos y variantes de los mismos puede ser un desafío en el diseño de ensayos eficaces, pero se puede mejorar fusionando una o más unidades chaperonas que tienen actividad peptidil prolil isomerasa (PPIasa). La técnica de usar un armazón de proteína para genomanipular dominios polipeptídicos presentados por el armazón es conocida en el campo de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Por tanto, se han genomanipulado extensamente dominios tales como bucles variables de regiones de unión a antígeno de anticuerpos para producir segmentos de secuencias de aminoácidos que tienen una unión mejorada (por ejemplo, afinidad y/o especificidad) a dianas conocidas (véase el documento WO 2014/071978).

Se han identificado proteínas de unión a FK506 (FKBP) en muchos eucariotas, desde levaduras hasta seres humanos, y funcionan como chaperonas de plegamiento de proteínas para proteínas que contienen residuos de prolina. Junto con la ciclofilina, las FKBP pertenecen a la familia de las inmunofilinas. En el genoma humano se codifican quince proteínas cuyos segmentos tienen una homología significativa con la secuencia de la proteína de 12 kDa que es la diana de los potentes macrólidos inmunosupresores FK506 o rapamicina. El arquetipo de 12 kDa de la proteína de unión a FK506 (FKBP), conocida como FKBP-12, es una proteína intracelular abundante. FKBP12 funciona como una PPIasa que cataliza la interconversión entre las conformaciones de prolilo cis/trans. Las FKBP están implicadas en diversas funciones celulares, que incluyen el plegamiento de proteínas, la señalización celular, la apoptosis y la transcripción. Provocan su función a través de la unión directa y alteración de la conformación de sus proteínas diana, por lo que actúan como interruptores moleculares.

El gen slyD bacteriano codifica una peptidil-prolil cis-trans isomerasa de tipo FKBP (PPIasa). SlyD es una proteína bacteriana de dos dominios que funciona como una chaperona molecular, una prolil cis/trans isomerasa y una proteína de unión a níquel. La función chaperona localizada en un dominio de SlyD está implicada en la translocación de argininas gemelas e incrementa la eficacia catalítica del dominio prolil cis/trans isomerasa en el plegamiento de proteínas en dos órdenes de magnitud.

Schlapschy y Skerra (en: Periplasmic chaperones used to enhance functional secretion of proteins in E. coli. Methods Mol Biol. 2011; 705:211-24) divulgan que se encuentran con frecuencia en Escherichia coli problemas con el plegamiento del producto génico recombinante, así como la agregación de proteínas, es decir, la formación de cuerpos de inclusión. Esto es cierto en particular para las proteínas que portan enlaces disulfuro estructurales, incluyendo fragmentos de anticuerpos, citocinas, factores de crecimiento y fragmentos extracelulares de receptores de superficie de células eucariotas. Por lo tanto, han desarrollado el plásmido auxiliar pTUM4, que afecta a la sobreexpresión de cuatro chaperonas periplásmicas y/o catalizadores del plegamiento establecidos: las tioldisulfuro oxidorreductasas DsbA y DsbC, que catalizan la formación e isomerización de puentes disulfuro, y dos peptidilprolil cis/trans isomerasas con actividad chaperona, FkpA y SurA.

SlyD de E. coli y FKBP12 (natural y mutantes C23A y C23S) se pueden producir de forma recombinante en E. coli con alto rendimiento en forma soluble (Standaert, R.F., et al., Nature 346 (1990) 671-674). FKBP derivada de organismos termófilos y SlyD de E. coli se pueden usar como chaperonas en la expresión recombinante de polipéptidos quiméricos en E. coli (Ideno, A., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 64 (2004) 99-105). Los polipéptidos SlyD de E. coli y FKBP12 son polipéptidos de plegamiento reversible (Scholz, C, et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 12703-12707). Low C, et al. J. Mol. Biol. 398 (2010) 375-390 informan de la estructura cristalina y la caracterización funcional de la metalochaperona SlyD de Thermus thermophilus. Thermus thermophilus consiste en dos dominios que representan dos unidades funcionales. La actividad PPIasa se localiza en un dominio FKBP típico, mientras que la función de chaperona se asocia con el dominio de inserción en solapa (IF) plegado de forma autónoma. Los dos dominios aislados son estables y funcionales en solución.

Kovermann et al. (en: Kovermann M, Schmid FX, Balbach J Molecular function of the prolyl cis/trans isomerase and metallochaperone SlyD. Biol Chem. Agosto de 2013; 394(8):965-75) divulgan que SlyD es una proteína bacteriana de dos dominios que funciona como una chaperona molecular, una prolil cis/trans isomerasa y una proteína de unión a níquel. Resumen los hallazgos recientes sobre el mecanismo enzimático molecular de SlyD. La función chaperona localizada en un dominio de SlyD está implicada en la translocación de argininas gemelas e incrementa la eficacia catalítica del dominio prolil cis/trans isomerasa en el plegamiento de proteínas en dos órdenes de magnitud.

La secuencia de aminoácidos del polipéptido FKBP12 comprende un único residuo de triptófano en la posición 60. Por tanto, se puede analizar la integridad estructural de los mutantes de FKBP12 simplemente analizando la fluorescencia del triptófano (DeCenzo, M.T., et al., Protein Eng. 9 (1996) 173-180). Se puede realizar una prueba para determinar la actividad catalítica restante del mutante de FKBP12 determinando la actividad rotamasa restante (Brecht, S., et al., Neuroscience 120 (2003) 1037-1048; Schories, B., et al., J. Pept. Sci. 13 (2007) 475-480; Timerman, A.P., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 2451-2459). También es posible determinar la integridad estructural de los mutantes de FKBP12 determinando la unión a FK506 o rapamicina (DeCenzo, M.T., et al., Protein Eng. 9 (1996) 173-180).

Geitner et al. (en: Geitner AJ1, Varga E, Wehmer M, Schmid FX. Generation of a highly active folding enzyme by combining a parvulin-type prolyl isomerase from SurA with an unrelated chaperone domain. J Mol Biol. 15 de noviembre de 2013;425 (22):4089-98) divulgan parvulinas como pequeñas prolil isomerasas que sirven como dominios catalíticos de enzimas de plegamiento. SurA (proteína de supervivencia A) del periplasma de Escherichia coli consiste en un dominio de parvulina inactivo (Par1) y uno activo (Par2), así como un dominio de chaperona. En ausencia del dominio de chaperona, la actividad de plegamiento de Par2 está prácticamente anulada. Crearon una proteína quimérica insertando el dominio de chaperona de SlyD, una enzima de plegamiento no relacionada de la familia FKBP, en un bucle del dominio Par2 aislado de SurA. Esto incrementó su actividad de plegamiento 450 veces a un valor mayor que la actividad de SurA, en la que Par2 está unida con su dominio de chaperona natural. En presencia del dominio de chaperona tanto natural como exógeno, la actividad de plegamiento de Par2 se incrementó 1500 veces. Por tanto, los dominios de chaperona relacionados y no relacionados son eficaces de forma similar para potenciar la actividad de plegamiento de la prolil isomerasa Par2. Un análisis de secuencias de diversos dominios de chaperona sugiere que los grupos de residuos de metionina expuestos en las regiones de cadena móvil podrían ser importantes para una interacción genérica con cadenas de proteínas desplegadas. Esta unión es altamente dinámica para permitir la transferencia frecuente de cadenas de proteínas de plegamiento entre los dominios de chaperona y catalítico.

Para los sistemas diagnósticos inmunológicos, los antígenos y/o anticuerpos u otros compañeros de unión inmunológicos (proteínas de interés) se conjugan además a menudo, por ejemplo, con biotina (para una inmovilización con estreptavidina) u otros marcadores, como rutenio, para su detección. Normalmente, se usan procedimientos químicos para conjugar dichos marcadores con restos amino o sulfhidrilo reactivos.

Desafortunadamente, las estrategias químicas convencionales para la modificación de proteínas son difíciles de controlar y dan lugar a poblaciones heterogéneas de inmunoconjugados con estequiometrías variables, cada una de las cuales tiene sus propias características in vivo. Además, el número de moléculas conjugadas o marcador no se puede controlar y, por tanto, no está definido, y normalmente sigue una distribución normal, lo que provoca problemas cuando se desea cuantificar reacciones.

La introducción de grupos bioortogonales artificiales para la modificación de proteínas estequiométricas y específicas de sitio ofrece una solución potencial a este problema. Dichas estrategias están de moda, pero a menudo son laboriosas y todavía provocan un riesgo de heterogeneidad de los productos. Además, todos los componentes del sistema deben ser y deben permanecer estables durante períodos prolongados de tiempo y en condiciones de conjugación. Además, la posición/localización de la(s) conjugación(ones) no se puede controlar. Una inclusión no específica del marcador, por ejemplo, en o cerca del centro activo de una proteína, o en una posición en o cerca de la(s) posición(ones) que media(n) las actividades inmunológicas puede interferir con la inmunorreactividad o incluso inhibirla completamente.

Son conocidos procedimientos para una conjugación enzimática de marcadores específica de sitio (por ejemplo, sortasa, TGM), pero estos requieren la presencia de una secuencia de reconocimiento específica adicional (secuencia de marca) en la proteína de interés que se va a marcar.

La transglutaminasa microbiana (TGM) es una de las enzimas más importantes para la reticulación de proteínas y péptidos en muchas aplicaciones alimentarias y biotecnológicas. La TGM se descubrió por primera vez en el organismo Streptomyces mobaraensis y posteriormente se extrajo de este. La TGM de Streptomyces mobaraensis producida de forma recombinante representa actualmente la mayor parte de la TGM usada industrialmente. La enzima cataliza la formación de un enlace isopeptídico entre un grupo acilo, por ejemplo, una cadena lateral de glutamina (Q) y una alquilamina, por ejemplo, una cadena lateral de lisina (K). En ausencia de grupos amina reactivos, la reacción enzimática con agua da lugar a la desaminación de las cadenas laterales de la glutamina. La enzima bacteriana funciona sin la adición de cofactores tales como Ca2+ o GTP y en una amplia gama de condiciones de pH, tampón y temperatura. La TGM ya se ha usado para el desarrollo de conjugados terapéuticos de anticuerpo-fármaco, pero, debido a la baja especificidad de la enzima, aún no se ha establecido la producción a gran escala de dichos conjugados mediados por la TGM. Todas las especies activas de transglutaminasa microbiana conocidas presentan pesos moleculares >38 kDa. Al ser una enzima de reticulación por naturaleza, la transglutaminasa microbiana muestra una amplia especificidad de sustrato por moléculas donantes de amina y una especificidad relativamente baja por donantes de acilo. Dado que solo son conocidas las especificidades de sustrato de la enzima de Streptomyces mobaraenis y enzimas homólogas, actualmente no es posible un enfoque de conjugación bioortogonal, por ejemplo, el marcaje simultáneo de una biomolécula usando dos o más sustratos marcadores diferentes y dos o más especies de transglutaminasa.

Los documentos WO 00/43492 y WO 2012/059882 divulgan un sustrato de TG recombinante que está adaptado para una transglutaminasa diferente a la de la presente invención. Además, la presentación de la marca Q incrustada en el dominio FKBP de acuerdo con la invención no interfiere sustancialmente con ningún otro componente funcional de la proteína de interés.

En vista de lo anterior, es un objetivo de la presente invención proporcionar nuevas herramientas y procedimientos para proporcionar un marcaje eficaz y controlado de antígenos y/o anticuerpos u otros compañeros de unión inmunológicos (proteínas de interés) en el contexto de sistemas y procedimientos diagnósticos y/o terapéuticos inmunológicos. Otros aspectos y objetivos resultarán evidentes para el experto tras la lectura de la siguiente descripción más detallada de la invención.

De acuerdo con un primer aspecto de la misma, los objetivos anteriores se resuelven mediante la disposición de un sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la siguiente fórmula general I

(F*-L)y-X (I).

En dicha fórmula (I), F* se selecciona de una secuencia de aminoácidos del dominio FKBP que comprende los aminoácidos N terminales 1 a 64 y 123 a 149 del polipéptido SLYD, en la que los aminoácidos 65 a 122 están reemplazados por una secuencia de aminoácidos ("marca Q") de 5 a 15 aminoácidos, comprendiendo la marca Q una subsecuencia de 5 aminoácidos contiguos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la porción YRYRQ de la secuencia peptídica X¹-YRYRQ-X ²(SEQ ID NO: 1), en la que X¹y X²están ausentes o constituyen aminoácidos conectores, en la que la marca Q es una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20; L está ausente o se selecciona de una secuencia de aminoácidos conectora; y X es una proteína de interés seleccionada de una enzima, un antígeno, tal como una proteína vírica, un anticuerpo o fragmento del mismo, y otros compañeros de unión inmunológicos; y es un número entero de entre 1 y 100, y en el que dicho sustrato de TG es un sustrato para la función TG de la t G de Kutzneria albida de acuerdo con SEQ ID NO: 23.

Se entiende además que, de acuerdo con la invención, los aminoácidos conectores X¹y X², si están presentes, se seleccionan independientemente entre sí.

Son preferentes marcas Q de acuerdo con la presente invención que se seleccionan de las secuencias

X¹-YKYRQ-X²(SEQ ID NO: 8), X¹-LRYRQ-X²(SEQ ID NO: 11), X¹-PRYRQ-X²(SEQ ID NO: 18) y X¹-VRYRQ-X²(SEQ ID NO: 20), en las que X¹y X²son como anteriormente.

Sorprendentemente, se descubrió que las dos partes de la inserción anterior y posterior al dominio FKBP del dominio IF funcionan como un armazón o "collar" estructuralmente bastante rígido y preciso para la secuencia que se inserta en y/o reemplaza a la parte del dominio IF ("cabeza", "marca Q"). Debido a esto, la presentación y orientación de la inserción/reemplazo de manera fiable no interfiere sustancialmente con ninguna otra función de los otros componentes del sustrato, en particular la(s) función(ones) de la proteína de interés (X). Además, la presentación del, en este caso, sitio de unión al sustrato de TG (marca Q) da lugar a una unión estequiométrica altamente controlada del marcador y, por lo tanto, al marcaje de la proteína de interés.

En la fórmula (I), L está ausente o se selecciona de una secuencia de aminoácidos conectora. Preferentemente, dicha secuencia conectora L comprende entre 1 a 20 aminoácidos y, más preferente, dichos aminoácidos no interfieren esencialmente con la(s) función(ones) del dominio FKBP (en particular el reemplazo/inserción) y/o la(s) proteína(s) de interés (por ejemplo, funciones inmunológicas).

X designa la proteína de interés; que se selecciona preferentemente de una enzima, un antígeno, tal como una proteína vírica, un anticuerpo o fragmento del mismo, y otros compañeros de unión inmunológicos.

En la fórmula (I), y es un número entero de entre 1 y 100, por tanto, se pueden unir varios grupos marcadores F*-L a la proteína de interés.

Preferentemente, el sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la invención puede comprender además marcas de proteína para purificación y/o inmovilización, por ejemplo, en el extremo N y/o C, como biotina, maltosa o marca(s) de his.

Preferentemente, los diferentes componentes del sustrato F*, L y/o X se unen covalentemente entre sí para permitir el marcaje controlado del sustrato usando la actividad TG. El sustrato se puede producir de forma recombinante como una proteína de fusión, y expresar y purificar a partir de células huésped, tales como, por ejemplo, células huésped bacterianas o de levadura. Los procedimientos respectivos son bien conocidos para el experto. Los componentes también se pueden producir (por ejemplo, sintetizar) por separado o en partes, y, a continuación, se unen posteriormente, de forma covalente o bien conjugados, dependiendo de las circunstancias y el(los) propósito(s) deseado(s) de los mismos.

De acuerdo con la invención, el sustrato de TG según la invención es un sustrato para la función de transglutaminasa (TG) de la TG de Kutzneria albida de acuerdo con SEQ ID NO: 23, o una proteína homóloga que es idéntica a al menos un 80 %, preferentemente a al menos un 90 %, más preferentemente a al menos un 95, 98 o 99 % de la secuencia de aminoácidos de la misma, y presenta una actividad TG sustancial como se describe en el presente documento. Preferentemente, el polipéptido TG o una parte del mismo que tiene una función o actividad transglutaminasa sustancial se clona y se produce de forma recombinante en células huésped, y posteriormente (al menos en parte) se purifica, dependiendo de las circunstancias y el(los) propósito(s) deseado(s) del mismo. Los procedimientos respectivos son bien conocidos para el experto. La actividad Tg se puede medir usando ensayos que también son bien conocidos por el experto. "Sustrato de TG recombinante" en el contexto de la invención significará que el sustrato en su conjunto no se produce en la naturaleza.

El dominio FKBP como se usa para el sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la presente invención se selecciona preferentemente de un polipéptido FKBP eucariótico o bacteriano seleccionado de FKBP12, AIP, AIPL1, FKBP1A, FKBP1B, FKBP2, FKBP3, FKBP5, FKBP6, FKBP7, FKBP8, FKBP9, FKBP9L, FKBP10, FKBP11, FKBP14, FKBP15, FKBP52, LOC541473 y SLYD, y homólogos de los dominios FKBP de los mismos que son idénticos a al menos un 80 %, preferentemente a al menos un 90 %, más preferentemente a al menos un 95, 98 o 99 % de la secuencia de aminoácidos del mismo, y son adecuados para la inserción de una marca Q. Los dominios respectivos se pueden analizar para determinar su idoneidad como se describe en el presente documento, y en la literatura, por ejemplo, usando programas de alineación, en particular para identificar alineaciones estructurales.

En un modo de realización, un dominio FKBP como se usa para el sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido con actividad PPIasa. El polipéptido con actividad PPIasa es de origen procariótico o eucariótico, o el polipéptido con actividad PPIasa como una variante artificial (mutante) del mismo. Se puede generar una variante artificial de un polipéptido con actividad PPIasa mediante una técnica de acuerdo con el estado de la técnica de la genomanipulación de proteínas. De acuerdo con la invención, una variante artificial de un polipéptido con actividad PPIasa se caracteriza, por ejemplo, por el reemplazo, adición o deleción de uno o más aminoácidos. En un modo de realización específico, la actividad PPIasa y/o la función de chaperona del dominio FKBP como se usa para el sustrato de transglutaminasa recombinante de acuerdo con la presente invención se conservan en una variante artificial.

Knappe et al. (en: Knappe TA, Eckert B, Schaarschmidt P, Scholz C, Schmid FX. Insertion of a chaperone domain converts FKBP12 into a powerful catalyst of protein folding. J Mol Biol. 18 de mayo de 2007; 368(5):1458-68. Publicación electrónica del 14 de marzo de 2007) divulgan que la actividad catalítica de la FKBP12 humana como prolil isomerasa es alta frente a los péptidos cortos, pero muy baja en las reacciones de plegamiento de proteínas limitadas por prolina. Por el contrario, las proteínas SlyD, que son miembros de la familia FKBP, son altamente activas como enzimas de plegamiento. Contienen un dominio de "inserción en solapa" o IF adicional cerca del sitio activo de prolil isomerasa. La escisión de este dominio no afectó a la actividad prolil isomerasa de SlyD de Escherichia coli para con sustratos de péptidos cortos, pero anuló su actividad catalítica en reacciones de plegamiento de proteínas limitadas por prolina. La inserción recíproca del dominio IF de SlyD en FKBP12 humana incrementó su actividad de plegamiento 200 veces y generó un catalizador de plegamiento que es más activo que la propia SlyD. El dominio IF se une a las cadenas de proteínas de replegamiento y, por tanto, funciona como un módulo de chaperona.

En E. coli, se cree que los aminoácidos 1 a 69 de SLYD forman la primera parte del dominio PPIasa, los aminoácidos 76 a 120 forman el (dominio) IF-chaperona y los aminoácidos 129 a 151 forman la segunda parte del dominio PPIasa. Por tanto, los aminoácidos 1 a 151 forman el dominio FKBP. Los aminoácidos 152 a 196 están implicados en la unión a metales.

Es preferente el sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la presente invención, en el que dicho dominio FKBP tiene una longitud de entre aproximadamente 120 a 170, preferentemente entre aproximadamente 130 a 160, y lo más preferente entre aproximadamente 145 a 155 de los aminoácidos N terminales de dicho polipéptido FKBP. Esto incluye la secuencia del dominio IF.

"Aproximadamente" en el contexto de la presente invención significará /-10 % de un valor dado.

Es preferente el sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la presente invención en el que dicho dominio FKBP comprende los aminoácidos N terminales 1 a 64 y 123 a 149 del polipéptido SLYD, y en el que los aminoácidos 65 a 122 se reemplazan por dicha marca Q.

Como se menciona anteriormente, la secuencia conectora L puede comprender entre 1 a 20 aminoácidos, preferentemente 1 a 10 aminoácidos, más preferente 1 a 5 aminoácidos, en la que preferentemente dichos aminoácidos no interfieren esencialmente con el dominio FKBP y/o la proteína de interés. Los aminoácidos conectores preferentes son aminoácidos pequeños, como glicina o alanina. Los conectores de aminoácidos y sus composiciones son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Chichili et al. Linkers in the structural biology of protein-protein interactions Protein Sci. Febrero de 2013; 22(2): 153-167).

Las proteínas de interés en el contexto de la presente invención son, en general, todas proteínas que se pueden marcar usando la presente tecnología. Es preferente el sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la presente invención, en el que dicha proteína de interés se selecciona de una enzima, un antígeno, tal como una proteína vírica, un anticuerpo o fragmento del mismo, y otros compañeros de unión inmunológicos. La presente invención es de uso particular para reacciones y ensayos inmunológicos, donde se desea una cuantificación.

Otro aspecto de la presente invención a continuación se refiere a un procedimiento in vitro para marcar una proteína de interés, que comprende a) proporcionar el sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la presente invención que comprende una proteína de interés; b) proporcionar una cantidad eficaz de la transglutaminasa de Kutzneria albida (por ejemplo, de acuerdo con SEQ ID NO: 23) o un homólogo de la misma como se describe en el presente documento, c) proporcionar un marcador adecuado que comprende un grupo alquilamina ("donante de amina"), tal como, por ejemplo, una lisina, y d) poner en contacto dichos componentes de acuerdo con a) a c), con lo que dicha (actividad) transglutaminasa une dicho marcador a dicho sustrato.

Es preferente un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha transglutaminasa de Kutzneria albida o un homólogo de la misma como se describe en el presente documento se produce de forma recombinante, como se describe en el presente documento.

En este procedimiento de acuerdo con la presente invención, el sustrato que comprende el grupo F* que comprende la marca Q (que opcionalmente reemplaza la región del dominio IF) se marca usando la actividad de la transglutaminasa de Kutzneria albida. Preferentemente, el marcador que se va a unir se selecciona de una enzima, biotina, un grupo radiactivo, un tinte, tal como un tinte fluorescente, un isótopo y un metal. Dicho marcador forma parte del componente/compuesto marcador que comprende un grupo alquilamina, tal como, por ejemplo, una lisina. Lo más preferente, dicho componente/compuesto marcador comprende una marca donante de amina ("marca K") que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica RYESK. A continuación se describen ejemplos de marcas K preferentes y su composición, y también se pueden encontrar en la literatura.

Es preferente un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicho marcaje se controla y, por ejemplo, se logra en una proporción estequiométrica de marcador y proteína de interés, por ejemplo, de aproximadamente 1:1. También se puede lograr un marcaje múltiple usando enzimas adicionales (por ejemplo, otras TG distintas de Kalb-TG) y otros sustratos de TG respectivos, para unir dos o incluso múltiples marcadores a una proteína/proteínas de interés.

Es preferente el procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha proteína de interés se selecciona de una enzima, un antígeno, tal como una proteína vírica, un anticuerpo o fragmento del mismo, y otros compañeros de unión inmunológicos. La presente invención es de uso particular para reacciones y ensayos inmunológicos, donde se desea una cuantificación.

La elección de la proteína de interés también puede depender del uso previsto de las moléculas de ARNip como se usan, en tratamiento, investigación y/o bien diagnóstico. Es preferente el procedimiento de acuerdo con la invención, en el que dicha proteína de interés se selecciona de una proteína implicada en/causante de cáncer, enfermedades neurológicas, enfermedades inmunitarias, alergia, enfermedades metabólicas, fertilidad (por ejemplo, tasa o número reproductivo), producción animal (por ejemplo, cantidad de carne o leche), proteína esencial para el crecimiento y/o desarrollo celular, para degradación del ARNm, para represión de la traducción y/o para silenciamiento génico transcripcional.

Otro aspecto de la presente invención a continuación se refiere a una composición farmacéutica o diagnóstica que comprende al menos un sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la invención, conjuntamente con vehículos y componentes farmacéuticamente aceptables, tales como tampones. También se pueden obtener composiciones farmacéuticas o diagnósticas para marcaje múltiple que comprenden enzimas adicionales (por ejemplo, otras TG distintas de Kalb-TG) y otros sustratos de TG respectivos, para poder unir dos o incluso múltiples marcadores a una proteína/proteínas de interés.

Otro aspecto de la presente invención a continuación se refiere a una composición farmacéutica o diagnóstica que comprende al menos una proteína marcada de interés como se produce de acuerdo con un procedimiento de acuerdo con la presente invención, conjuntamente con vehículos y componentes farmacéuticamente aceptables, tales como tampones.

Es preferente la composición farmacéutica o diagnóstica de acuerdo con la presente invención, en la que dicha proteína de interés está marcada en una proporción estequiométrica de marcador y proteína de interés de, por ejemplo, aproximadamente 1:1. También se pueden unir dos o incluso varios marcadores a una proteína/proteínas de interés.

Otro aspecto de la presente invención a continuación se refiere a un kit diagnóstico, que comprende la composición diagnóstica de acuerdo con la presente invención, opcionalmente conjuntamente con otros componentes para realizar un inmunoanálisis. El kit puede comprender, en recipientes conjuntos o separados, una transglutaminasa microbiana recombinante, por ejemplo, una transglutaminasa microbiana purificada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida como se describe en el presente documento. El kit puede incluir además sustratos, tales como un sustrato que incluye una marca donante de amina que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica RYESK. El kit también puede incluir instrucciones para realizar reacciones (por ejemplo, inmunoanálisis) que requieren el uso del sustrato de acuerdo con la invención, marcado o bien no marcado.

Se divulga el uso del sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante, la composición farmacéutica o diagnóstica, o el kit de acuerdo con la presente invención para el marcaje o en el marcaje de una proteína de interés, en particular en reacciones y ensayos inmunológicos, donde se desea una cuantificación.

Los procedimientos de la presente invención se pueden realizar in vivo o in vitro, en animales de laboratorio o en cultivo.

La presente invención se ilustrará ahora además en los siguientes ejemplos no limitantes, con referencia a las figuras adjuntas.

La figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos de la transglutaminasa de Kutzneria albida (n.° de la base de datos WP_030111976), la secuencia de aminoácidos de slyD de E. coli, la secuencia de aminoácidos de slyD de bacteria Cyclobacteriaceae AK24 y la secuencia de aminoácidos de slyD de bacteria Bacteroidales.

La figura 2 muestra los resultados del marcaje usando Cy3 o Cy5 de acuerdo con los ejemplos, a continuación. La figura 2B muestra la independencia relativa del pH en el intervalo de entre 6,2 a 9,0.

La figura 3A muestra la estructura general de una construcción de fusión marcada con rutenio, y la figura 3A muestra los resultados de marcaje usando SDS-PAGE de acuerdo con los ejemplos, a continuación.

La figura 4 muestra un modo de realización preferente de una proteína de interés marcada con sustrato (aquí, dos cadenas de un anticuerpo) de acuerdo con la presente invención.

La figura 5A presenta una vista esquemática de "TtSlyQD-Xa-gp21-8H" de SEQ ID NO: 60. Se indican las porciones de SlyD, además de la marca Q en la proteína de fusión, así como un sitio de reconocimiento para la proteasa del factor Xa, y la porción "gp21" como se indica en los ejemplos. La estrella simboliza un marcador de rutenio. La figura 5B muestra los resultados después del análisis por SDS-PAGE que muestran el marcaje con rutenio específico e inespecífico del antígeno gp21 recombinante (HTLV) con la transglutaminasa bacteriana de Streptomyces mobaraensis. Se muestran las proteínas de fusión "TtSlyQD-Xa-gp21-8H" sin marcaje, con marcaje único, con marcaje doble y con marcaje triple después del marcaje con Ru.

La figura 5C muestra el marcador de rutenio.

Las figuras 6A-E presentan resultados usando "TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H" marcado de acuerdo con SEQ ID NO: 62 en un ensayo Elecsys.

SEQ ID NO: 1 a 22 muestran las secuencias de los motivos de la marca Q identificados, en los que la X N terminal es como X¹anteriormente, y la X C terminal es como X²anteriormente.

SEQ ID NO: 23 muestra la secuencia de aminoácidos de la transglutaminasa de Kutzneria albida (n.° de base de datos WP_030111976).

SEQ ID NO: 24 muestra la secuencia de aminoácidos de slyD de E. coli.

SEQ ID NO: 25 muestra la secuencia de aminoácidos de slyD de bacteria Cyclobacteriaceae AK24.

SEQ ID NO: 26 muestra la secuencia de aminoácidos de slyD de bacteria Bacteroidales CF.

SEQ ID NO: 27 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio FKBP de slyD de E. coli.

SEQ ID NO: 28 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio FKBP de FKBP16 de E. coli.

SEQ ID NO: 29 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio FKBP de slyD de Thermus thermophilus. SEQ ID NO: 30 a 51 muestran las secuencias de los motivos de la marca Q identificados, en las que el aminoácido N terminal y C terminal es un conector de glicina ejemplar.

SEQ ID NO: 52 muestra la secuencia de aminoácidos de la secuencia donadora de glutamina de KalbTG que se injertó de forma recombinante en el dominio FKBP de SlyD.

SEQ ID NO: 53 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia donante de lisina de transglutaminasa (marca K).

SEQ ID NO: 54 muestra la secuencia de aminoácidos de SlyD.

SEQ ID NO: 55 muestra la secuencia de aminoácidos de SlyD con una marca Q de TGM.

SEQ ID NO: 56 muestra la secuencia de aminoácidos de SlyD con una marca Q de KalbTG.

SEQ ID NO: 57 muestra la secuencia de aminoácidos de SlpA.

SEQ ID NO: 58 muestra la secuencia de aminoácidos de la glucoproteína de la envoltura vírica y el antígeno de HTLV principal "gp21".

SEQ ID NO: 59 muestra la secuencia de aminoácidos de la secuencia polipeptídica del ectodominio de "gp21" modificada, genomanipulada para una mejor solubilidad, estabilidad y reactividad en el inmunoanálisis.

SEQ ID NO: 60 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión recombinante "TtSlyQD-Xa-gp21-8H".

SEQ ID NO: 61 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión recombinante "TtSlyD-Xa-gp21-8H". SEQ ID NO: 62 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión recombinante "TtSlyKQD-SlpA-Xagp21-8H".

Ejemplos

Identificación de la posición del dominio IF

En principio, se pueden usar alineaciones de la estructura primaria de las secuencias de aminoácidos de los dominios FKBP para identificar la posición del dominio IF que se va a reemplazar (o añadir), por ejemplo, usando el programa Clustal Omega. Una alternativa, en particular con respecto a las FKBP no bacterianas, es la alineación de estructuras 3D (por ejemplo, usando el programa PyMol), dado que el dominio constituye un elemento estructuralmente conservado.

Ejemplos específicos son como sigue:

Peptidil-prolil cis-trans isomerasa SlyD de tipo SLYD-ECOLI FKBP de Escherichia coli (cepa K12). Dominio FKBP, dominio IF doble subrayado.

MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAV GANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHM LAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHD (SEQ ID NO: 27).

Peptidil-prolil cis-trans isomerasa de 16 kDa de tipo ECOLI FKBP de Escherichia coli (cepa K12). Dominio FKBP, dominio IF doble subrayado.

MSESVQSKSAVLVHFTLKLDDGTTAESTRNNGKPALFRLGDASLSEGLEQHLLGLKVGDKTT FSLEPDAAFGVPSPDLIQYFSRREFMDAGEPEIGAIMLFTAMDGSEMPGVIRE1HGDSITVD FHHPLAGOTVHFDIEVLE ID PALEA (SEQ ID NO: 28).

Peptidil-prolil cis-trans isomerasa de Thermus thermophilus (cepa HB8/ATCC27634) dominio FKBP, dominio IF doble subrayado.

MKVGQDKWTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKA YGPHDPEGVOWPLSAFPEDAEVVPGAOFYAQDMEGHPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGK DLDFQVEWKVREATPEELLHGHAH (SEQ ID NO: 29).

Análisis de las secuencias de marca Q para KalbTG

El análisis de los sustratos del péptido KalbTG que se identificaron usando ensayos de marcaje con un conjunto de péptidos que comprendían secuencias de aminoácidos pentaméricas con tres (3) residuos de glicina N y C terminales (G¹y G²) unidos reveló un conjunto de características compartidas por estos sustratos. Ejemplos específicos fueron como sigue:

G¹-YRYRQ-G²(SEQ ID NO: 30), G¹-RYRQR-G²(SEQ ID NO: 31), G¹-RYSQR-G²(SEQ ID NO: 32), G¹-FRQRQ-G²(SEQ ID NO: 33), G¹-RQRQR-G²(SEQ ID NO: 34), G¹-FRQRG-G²(SEQ ID NO: 35), G¹-QRQRQ-G²(SEQ ID NO: 36), G¹-YKYRQ-G²(SEQ ID NO: 37), G¹-QYRQR-G²(SEQ ID NO: 38), G¹-YRQTR-G²(SEQ ID NO: 39), G¹-LRYRQ-G²(SEQ ID NO: 40), G¹-YRQSR-G²(SEQ ID NO: 41), G¹-YQRQR-G²(SEQ ID NO: 42), G¹-RYTQR-G²(SEQ ID NO: 43), G¹-RFSQR-G²(SEQ ID NO: 44), G¹-QRQTR-G²(SEQ ID NO: 45), G¹-WQRQR-G²(SEQ ID NO: 46), G¹-PRYRQ-G²(SEQ ID NO: 47), G¹-AYRQR-G²(SEQ ID NO: 48), G¹-VRYRQ-G²(SEQ ID NO: 49), G¹-VRQRQ-G²(SEQ ID NO: 50) y G¹-YRQRA-G²(SEQ ID NO: 51).

Para la KalbTG, los datos revelaron que un sustrato donante de acilo que incluye una secuencia de aminoácidos pentamérica que tiene la fórmula Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5, donde Xaa es cualquier aminoácido, cumplió en general con varias reglas de diseño. En primer lugar, cada secuencia pentamérica incluía al menos una glutamina (Q). Más en particular, al menos una de las posiciones tercera, cuarta y quinta de la secuencia pentamérica (es decir, Xaa3, Xaa4 y Xaa5) era una glutamina. Se observaron varias secuencias que incluían una glutamina en cada una de las posiciones tercera y quinta. Además, se hizo la observación de que cada secuencia pentamérica incluía al menos una arginina (R). Más en particular, al menos una de las posiciones cuarta y quinta de la secuencia pentamérica (es decir, Xaa4 y Xaa5) era una arginina.

Ensayos de marcaje

1. Tinte fluorescente

Para los ensayos de marcaje se usó la chaperona SlyD de Thermus thermophilus (Universal Protein Resource (UniProt) número Q5SLE7) como armazón de marcaje para la KalbTG. La secuencia de la SlyD es:

MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAH VPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDM EGNPM PLTVVAVEGEE VTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH (SEQ ID NO: 29).

Una secuencia donante de glutamina de la KalbTG (marca Q, subrayada) se injertó de forma recombinante en el dominio FKBP de la SlyD, proporcionando la siguiente secuencia polipeptídica:

MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAH VPAEKAYGAGSGGGGRYRORGGGGGSSGKDLDFOVEVVKVREATPEELLHGHAHH HHHHHH (SEQ ID NO: 52).

La proteína marcada con 8X-histidina se produjo en E. coli Bl21 Tuner y se purificó mediante cromatografía de afinidad estándar con iones metálicos inmovilizados basada en Ni Sepharose y exclusión por tamaño (HisTrap, Superdex 200; GE Healthcare). Todos los péptidos se sintetizaron por medio de síntesis de péptidos en fase sólida basada en fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC) estándar.

Los péptidos marcados se sintetizaron químicamente para tener (del extremo N al extremo C) un grupo protector Z (es decir, un grupo carboxibencilo), una secuencia donante de lisina de la transglutaminasa (marca K), ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (O2Oc), péptido y un tinte fluorescente Cy3 o Cy5. La estructura química primaria de los péptidos marcados fue:

Z-RYESK G -020c-EUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEU-C(sCy3-M H)-OH (SEQ ID NO; 53).

Las reacciones de marcaje se realizaron durante 15 minutos a 37 °C en presencia de proteína de sustrato 72 |j M, péptido marcador 720 j M y transglutaminasa 1 j M en MOPS 200 mM pH 7,2 y EDTA 1 mM. Después de la incubación durante 30 minutos a 37 °C, se añadió marca K-Cy5 o -Cy3 1 mM y se incubó durante 15 minutos adicionales a 37 °C. La reacción se detuvo mediante la adición de TCA 50 mM. Se tomaron muestras entre las etapas de incubación y se analizaron mediante SDS-PAGE con fluorescencia en gel (sistema de documentación en gel BioRad ChemiDoc, LED Cy3 y Cy5 y conjuntos de filtros). Los resultados se muestran en la figura 2.

2. Marcador de rutenio

Se sometió a prueba una construcción de marca Q similar, que consistía en una fusión de gp21 como marca Q y slyD (véase la figura 3B), en la que el marcador era un marcador de rutenio. Los resultados en SDS-PAGE en la figura 3A muestran una buena proporción 1:1 entre marcador y construcción.

Producción de antígenos TtSlyD-gp21 (HTLV) marcados con biotina y rutenio

Para otros ensayos de marcaje, se usó una fusión recombinante entre la chaperona SlyD de Thermus thermophilus (Universal Protein Resource (UniProt) número Q5SLE7), la glucoproteína de la envoltura vírica de HTLV "gp21" (número de acceso de Genbank DQ224032,1) y, en un ejemplo, la chaperona SlpA de Escherichia coli (UniProt número P0AEM0) como un armazón de marcaje para TGM o KalbTG. La secuencia de la SlyD es:

MKVGQDKVVT1RYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAH VPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDM EGNPM PLTVVAVEGEE VTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH (SEQ ID NO:54)

Una secuencia donante de glutamina de la TGM o la KalbTG (marca Q) se injertó de forma recombinante en el dominio FKBP de SlyD, proporcionando las siguientes secuencias polipeptídicas:

SlyD con marca Q para TGM:

MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAH VPAEKAYGAGSGGGGDYALQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH

(SEQ ID NO:55)

SlyD con marca Q para KalbTG:

MKVGQDKVVT1RYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAH VPAEKAYGAGSGGGGYRYRQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH

(SEQ ID NO:56)

La secuencia de SlpA es:

M SESVQSNSAVLVHFTLKEDDGTTAESTRNNGKPALFRLGDASLSEGLEQHLLGLKV GDKTTFSLEPDAAFGVPSPDLIQYFSRREFMDAGEPEIGAIMLFTAMDGSEMPGVIREI NGDSITVDFNHPLAGQTVHFDIEVLEIDPALEA (SEQ ID NO :57)

La secuencia de la glucoproteína de la envoltura vírica y el antígeno de HTLV principal "gp21" es:

IVSSACNNSLILPPFSLSPVPTVGSRSRRAVPVAVW FVSALAM GAGVAGGITGSM SLA SGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLCKALQ EQCCFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTGITLVALLLL VILAGPCIRCPCRTMHP (SEQ ID NO:58)

La secuencia polipeptídica del ectodominio de gp21, genomanipulada para una mejor solubilidad, estabilidad y reactividad en el inmunoanálisis, es:

MSLASGKSLLHEVDKD1SQLTQA1VKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLA KALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQTG ID MO:59)

Las secuencias de fusión recombinantes usadas para los ensayos de marcaje fueron:

"TtSlyQD-Xa-gp21-8H":

MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAH VPAEKA YGAGSGGGGDYA LQGGGGGSSGK D L D FQ VEVV KVREAT P EELLHGHAHG GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNFIKNL LK1AQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLT GWGLNWDLGLSQWAREALQTGGHHHHHHHH (SEQ ID NO:60)

"TtSlyD-Xa-gp21-8H":

M KVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYIHGIIRNLIPGLIIALEGREEGEAFQAII VPAEKA YGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDM EGNPM PLTV VA VEGEE VTVDFN H PLAGKD LDFQV EV VK VREAT PEE L L HGH AHGGGSGGGSGGGSGGGSGG GSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKJAQYAAQNRRGLDLL FWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWARE ALQTGGHHHHHHHH (SEQ ID NO:61)

"TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H":

MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAH VPAEKAYGAGSGGGGYRYRQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHG GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGM SESVQSNSAVLVHFTLKLDDGTTAESTRNNGKP ALFRLGDASLSEGLEQHLLGLKVGDKTTFSLEPDAAFGVPSPDLIQYFSRREFMDAGE PEIGAIMLFTAMDGSEMPGVIREINGDSITVDFNHPLAGQTVHFDIEVLEIDPALEAGG GSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLL KJAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTG WGLNWDLGLSQWAREALQTGGHHHHHHHH (SEQ ID NO:62)

Las proteínas marcadas con 8X-histidina se produjeron en E. coli B121 Tuner y se purificaron mediante cromatografía de afinidad estándar con iones metálicos inmovilizados basada en Ni Sepharose y exclusión por tamaño (HisTrap, Superdex 200; GE Healthcare).

Los péptidos marcados se sintetizaron químicamente para tener (del extremo N al extremo C) un grupo "Z-" (es decir, un grupo carboxibencilo), una secuencia donante de lisina de la transglutaminasa (marca K), polietilenglicol (PEG), péptido y un complejo de un marcador de biotina o rutenio de bipirimidina (BPRu). Las estructuras químicas primarias de los péptidos marcados fueron:

Marca K-Bi de KalbTG ("Bi" representa un marcador de biotina):

Z-RYESKG-PEG27-K(Bi)-OH (2532,0 g/mol)

Marca K-Ru de KalbTG ("Ru" representa un marcador basado en rutenio para electroquimioluminiscencia): Z-RYESKG-PEG27-K(BPRu)-OH (2958,4 g/mol)

Si no se indica de otro modo, las reacciones de marcaje típicas se realizaron durante 15 minutos a 37 °C en presencia de proteína de sustrato 65 |jM, péptido marcador 1000 |jM y transglutaminasa 0,1 |jM en MOPS 200 mM pH7,4 para marcar con la enzima KalbTG y a 37 °C en presencia de proteína de sustrato 72 jiM, péptido marcador 720 jiM y transglutaminasa 1 jiM en MOPS 200 mM pH7,4 con la enzima TGM. El marcaje de la transglutaminasa se describe con más detalle en las solicitudes US2016/0178627 "System and Method for Identification and Characterization of Transglutaminase Species" y WO 2016/096785 "IDENTIFICATION OF TRANSGLUTAMINASE SUBSTRATES AND USES THEREFOR".

La mezcla de reacción de marcaje se separó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200; GE Healthcare) y las fracciones que contenían proteínas de fusión marcadas se aislaron para su análisis posterior.

Análisis del marcaje con biotina y rutenio e inmunoanálisis

La calidad y cantidad de las reacciones de marcaje se analizaron mediante SDS-PAGE. La eficacia del marcaje de biotina se estimó mediante el cambio en el peso molecular de las bandas en el gen teñido con Coomassie. La eficacia del marcaje con rutenio se estimó mediante el cambio en el peso molecular de las bandas en el gel teñido con Coomassie y mediante la fluorescencia en el gel (sistema de documentación en gel BioRad ChemiDoc, LED Cy3 y conjunto de filtros). Los inmunoanálisis de diagnóstico (Roche HTLV I/II) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un instrumento Elecsys e411, reemplazando el resto del antígeno marcado con biotina en el reactivo R1 de la prueba por "TtSlyD-Xa-gp21-8H" marcada con biotina con TGM o "TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H" marcada con biotina con KalbTG, respectivamente, y reemplazando el resto del antígeno marcado con rutenio en el reactivo R2 de la prueba por "TtSlyD-Xa-gp21-8H" marcada con rutenio con TGM o "TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H" marcada con rutenio con KalbTG, respectivamente. Los controles positivos se realizaron con sueros positivos para HTLV y el kit HTLV I/II disponible comercialmente. Los controles negativos se realizaron con sueros HTLV negativos y con sueros HTLV positivos en combinación con diferentes calibradores y soluciones de control.

Para los resultados véanse las figuras 5 y 6.

Análisis espectrométrico de masas de marcaje con rutenio de TtSlyQD-Xa-gp21-8H

La figura 5A representa esquemáticamente la proteína de fusión "TtSlyQD-Xa-gp21-8H" de SEQ ID NO: 60. La figura 5B muestra los resultados después del análisis por SDS-PAGE que muestran el marcaje con rutenio específico e inespecífico del antígeno gp21 recombinante (HTLV) con la transglutaminasa bacteriana de Streptomyces mobaraensis. Se muestran las proteínas de fusión "TtSlyQD-Xa-gp21-8H" sin marcaje, con marcaje único, con marcaje doble y con marcaje triple después del marcaje con Ru. Marcador con Ru, véase en la figura 5C.

Se analizaron dos fracciones combinadas de la proteína de fusión marcada con rutenio, [1] TtSlyQD-Xa-gp21-8H_Fracción 17-19 y [2] TtSlyQDXa-gp21-8H_Fracción 20-23; la proteína "TtSlyQD-Xa-gp21-8FF" no marcada sirvió como control (TtSlyQD-Xa-gp21-8H_Control).

Se realizó cartografía peptídica. Después de la cartografía peptídica por digestión con tripsina, separación cromatográfica, análisis posterior por EM/EM y búsqueda en bases de datos en combinación con herramientas de interpretación manual, se encontró lo siguiente:

(a) El péptido tripsínico, 62-85' “ A Y G A G S G G G G D Y A L O G G G G G S S G K ” SEQ ID NO: 63 (la numeración se refiere a la secuencia dada a continuación) con un marcador se encontró en ambas fracciones, TtSlyQD-Xa-gp21-8H_Fracción 17-19' y TtSlyQD-Xa-gp21-8H_Fracción 20-23'.

(b) El péptido tripsínico, 195-222' “ A L O E O A A F L N IT N S H V S IL O E R P P L E N R ” SEQ ID NO: 64 con un marcador se encontró en cantidades pequeñas solo en TtSlyQD-Xa-gp21-8H_Fracción 17-19'.

(c) El péptido tripsínico, 241-255' E A L Q T G G H H H H H H H H ’ SEQ ID NO: 65 (marca de His) con un marcador se encontró en ambas fracciones, TtSlyQD-Xa-gp21-8H_Fracción 17-19' y TtSlyQD-Xa-gp21-8H_Fracción 20-23'.

(d) Además de lo anterior, también se descubrió que estaban presentes otros péptidos/subproductos marcados con rutenio en ambas fracciones, aunque en cantidades insignificantes.

La secuencia de aminoácidos de TtSlyQD-Xa-gp21-8H, péptidos tripsínicos como se da anteriormente en (a-c) están marcados en negrita y subrayados:

MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAH VPAEKA Y G A G SC G G G D Y A LO G G G G G SSG K DLDFOVEVVKVREATPEELLHGHAH GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKN LLKlAOYAAONRRGLDLLFWEOGGLAKA LO EO A AFLNITN SH VSILO ERPPLEtVRV LTGWGLMWDLGLSOWAREA LQ TG G H H H H H H H H (SEO ID NO:60)

El antígeno gp21 recombinante (HTLV), marcado de forma específica de sitio con biotina y rutenio usando la transglutaminasa bacteriana de Kutzneria albida demuestra las ventajas de la invención en el ensayo de diagnóstico in vitro Elecsys HTLV-I/II.

Los resultados se presentan en la figura 6 y lo siguiente.

La figura 6A representa representaciones esquemáticas que muestran la estructura primaria del antígeno gp21 marcado con rutenio y biotina (Q = marca Q para KalbTG, L = conector, Xa = sitio de escisión del factor Xa, 8H = marca de His) y el principio de prueba diagnóstica; el anticuerpo sérico de una muestra de un paciente (rojo) es un puente entre los antígenos marcados con biotina y rutenio (verde).

Figura 6B-D: Análisis por SDS-PAGE que muestra el marcaje simple con biotina o rutenio de gp21 con KalbTG. B: Gel SDS-PAGE teñido con Coomassie que muestra el marcaje con biotina, carril 1: marcador de peso molecular de la proteína antes de la tinción, carril 2: TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H incubada con KalbTG y marcador de biotina. C: Gel SDS-PAGE teñido con Coomassie que muestra el marcaje con rutenio, carril 3a: TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H incubada con KalbTG y marcador de rutenio, carril 4a: TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H sin modificar (control). D: Imagen de fluorescencia del análisis por SDS-PAGE que se muestra en C. Los carriles 3b-4b corresponden a los carriles 3a-4a.

Figura 6E: Ensayo Elecsys (HTLV-I/II) en sueros negativos (izquierda) y positivos (derecha) para el anticuerpo contra HTLV usando los reactivos marcados con TGM o los reactivos del kit comercial (control). Téngase en cuenta que la señal de control positiva es mayor que la señal de gp21 marcada con KalbTG, dado que la estequiometría del marcaje en el control es mayor que 1:1. Es decir, la molécula marcada con KalbTG lleva menos marcador. Se realizaron mediciones por duplicado, se muestra la señal promedio.

La secuencia de aminoácidos de TtSlyKQD-SlpA-Xa-gp21-8H es como sigue:

MKVGQDICVVT1RYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAH VPAEKAYGAGSGGGGYRYRQGGGGGSSGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHG GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGM SESVQSNSAVLVHFTLKLDDGTTAESTRNNGKP ALFRLGDASLSEGLEQHLLGLKVGDKTTFSLEPDAAFGVPSPDLIQYFSRREFMDAGE PEIGAIMLFTAMDGSEMPGVIREINGDSITVDFNHPLAGQTVHFDIEVLEIDPALEAGG GSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMSLASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLL KIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLAKALQEQAAFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTG W GLNWDLGLSQWAREALQTGGHHHHHHHH (SEQ ID NO:62).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la siguiente fórmula general I

(F*-L)y-X (I)

en la que

F* se selecciona de una secuencia de aminoácidos del dominio FKBP que comprende los aminoácidos N terminales 1 a 64 y 123 a 149 del polipéptido SLYD, en la que los aminoácidos 65 a 122 se reemplazan por una secuencia de aminoácidos ("marca Q") de 5 a 15 aminoácidos, comprendiendo la marca Q una subsecuencia de 5 aminoácidos contiguos que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con la porción YRYRQ de la secuencia peptídica X¹-YRYRQ-X²(SEQ ID NO: 1), en la que X¹y X²están ausentes o constituyen aminoácidos conectores, en la que la marca Q es una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20;

L está ausente o se selecciona de una secuencia de aminoácidos conectora; y

X es una proteína de interés seleccionada de una enzima, un antígeno, tal como una proteína vírica, un anticuerpo o fragmento del mismo, y otros compañeros de unión inmunológicos;

y es un número entero de entre 1 y 100,

y en el que dicho sustrato de TG es un sustrato para la función TG de la TG de Kutzneria albida de acuerdo con SEQ ID NO: 23.

2. El sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia conectora L comprende entre 1 y 20 aminoácidos, en el que preferentemente dichos aminoácidos no interfieren esencialmente con el dominio FKBP y/o la proteína de interés.

3. Un procedimiento in vitro para marcar una proteína de interés seleccionada de una enzima, un antígeno, tal como una proteína vírica, un anticuerpo o fragmento del mismo, y otros compañeros de unión inmunológicos, que comprende

a) proporcionar el sustrato de transglutaminasa (TG) recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2,

b) proporcionar una cantidad eficaz de la transglutaminasa de Kutzneria albida, preferentemente de acuerdo con SEQ ID NO: 23,

c) proporcionar un marcador adecuado conectado que comprende un grupo alquilamina, tal como, por ejemplo, una lisina, y

d) poner en contacto dichos componentes de acuerdo con a) a c), con lo que dicha transglutaminasa une dicho marcador a dicho sustrato.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha transglutaminasa de Kutzneria albida se produce de forma recombinante.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en el que dicho marcador se selecciona de una enzima, biotina, un grupo radiactivo, un tinte, tal como un tinte fluorescente, un isótopo, un marcador quimioluminiscente y un metal.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que dicho marcaje se logra en una proporción estequiométrica de marcador y proteína de interés, por ejemplo, de aproximadamente 1:1.

7. Una composición farmacéutica o diagnóstica que comprende al menos una proteína de interés marcada producida de acuerdo con un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, conjuntamente con compuestos de vehículo farmacéuticamente aceptables.

8. La composición farmacéutica o diagnóstica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicha proteína de interés está marcada en una proporción estequiométrica de marcador y proteína de interés de, por ejemplo, aproximadamente 1:1.

9. Un kit de diagnóstico, que comprende la composición diagnóstica de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, opcionalmente conjuntamente con otros componentes para realizar un inmunoanálisis.