CN103421753B

CN103421753B - 一种酶活和热稳定性提高的谷氨酰胺转胺酶突变体及其构建方法

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Publication number: CN103421753B
Application number: CN201310315275.XA
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 王广圣; 陈康康; 刘松; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-07-25
Filing date: 2013-07-25
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2033-07-25
Also published as: CN103421753A

Abstract

本发明公开了一种酶活和热稳定性提高的谷氨酰胺转胺酶突变体，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。本发明还公开了上述突变体的构建方法，1）通过PCR或化学全合成的方法获得Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062，得到谷氨酰胺转胺酶基因序列及其上下游序列，序列如Genbank：EU477523所示，克隆到表达载体；2）通过缺失突变获得Del1-4谷氨酰胺转胺酶突变体；3）以在步骤2）获得的突变体基础上，通过定点突变对E62进行突变，获得突变体Del1-4/E62D谷氨酰胺转胺酶突变体；4）在步骤3）获得的突变体基础上，融合tag1获得如SEQ ID NO.1所示的谷氨酰胺转胺酶突变体。本发明提供的突变体在48h胞外积累量最高，酶活可达14.8U/mL，与野生酶相比提高49%，生产强度也由0.21U/ml/h增加到0.31U/ml/h。

Description

一种酶活和热稳定性提高的谷氨酰胺转胺酶突变体及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种酶活和热稳定性提高的谷氨酰胺转胺酶突变体及其构建方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶（蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，MicrobialTransglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG）能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸ε-酰基或其他酰基反应，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键。特殊的催化能力使TGase广泛应用于食品工程、纺织与皮革加工、材料工程、生物医药等领域。但由于MTG异源表达分泌量低等缺陷，限制了MTG的应用范围。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种酶活和热稳定性提高的谷氨酰胺转胺酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明要解决的另一个技术问题是提供获得上述谷氨酰胺转胺酶突变体的方法，包括如下步骤：

1）通过PCR或化学全合成的方法获得Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062，得到谷氨酰胺转胺酶基因序列及其上下游序列，序列如Genbank：EU477523所示；2）通过缺失突变获得Del1-4谷氨酰胺转胺酶突变体；3）以在步骤2）获得的突变体基础上，通过定点突变对E62进行突变，获得突变体Del1-4/E62D谷氨酰胺转胺酶突变体；4）在步骤3）获得的突变体基础上，融合tag1获得如SEQ ID NO.1所示的谷氨酰胺转胺酶突变体。

其中Del1-4/E62D构建方法如下；

在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株（Streptomyceshygroscopicus CCTCC M203062），通过基因克隆或化学全合成方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子（Genbank：EU477523），将其克隆到表达质粒pBB1-1011作为本发明改造中的模板。

a）以上述模板为材料，通过SEQ ID NO.3为上游引物，SEQ ID NO.4为下游引物，PCR获得TG突变体的基因序列，将获得的TG突变体基因连接到表达载体pET-22b(+)上，转化到E.coli JM109挑选阳性转化子，将测序正确的突变质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得突变体Del1-4；

SEQ ID NO.3为GAGAGGGTGACCCCTCCTGCCGAG

SEQ ID NO.4为GGGGGCCCGGAAGAGCGCACTG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃1min40s24个循环72℃10min

b）Del1-4基因为模板，对E62进行突变，引物如下。

SEQ ID NO.5为GACAGGGTGACCCCTCCTGCCGAG

SEQ ID NO.6为GGGGGCCCGGAAGAGCGCACTG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃7min24个循环72℃10min

将获得的TG突变体基因连接到表达载体pET-22b(+)上，转化到E.coli JM109挑选阳性转化子，提取质粒测序。测序反应由上海生工生物工程公司完成。将测序正确的突变质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得突变体Del1-4/E62D。

由于C端氨基酸对TGase催化活性和热稳定性具有重要作用，因此选取在TGase酶C端添加稳定短肽，通过增加其与成熟酶N端或其他区域之间相互作用，提高蛋白稳定性。在蛋白C端添加适当的短肽可提高蛋白稳定性，将7个氨基酸作为稳定短肽插入到Del1-4/E62D谷氨酰胺转氨酶突变体C端，得到对应突变酶为Del1-4/E62D-tag1。

以突变质粒Del1-4/E62D为模板，进行全质粒PCR。引物如下。

SEQ ID NO.7为：ATCGGTTGCATCATCCTGACGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAG

SEQ ID NO.8为CGACCAGCCCTGCTTCACCTCG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃7min24个循环72℃10min

将获得的TG突变体基因连接到表达载体pET-22b(+)上，转化到E.coli JM109挑选阳性转化子，提取质粒测序。测序反应由上海生工生物工程公司完成。将测序正确的突变质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得突变体。

本发明提供的突变体Del1-4/E62D-tag1在48h胞外积累量最高，酶活可达14.8U/mL，与野生酶相比提高49%，生产强度也由0.21U/ml/h增加到0.31U/ml/h。

附图说明

图1E62饱和突变体发酵上清酶活力。

图2E62饱和突变体发酵上清残留酶活。

图3突变酶残留酶活检测；

（●：野生酶；○：Del1-4；▼：Del1-4/E62D；△：Del1-4/E62K；■：Del1-4/E62C；□：Del1-4/E62L）。

图4野生酶及突变酶E62D胞外累积酶活和最适反应温度；

（a：胞外累积酶活；b：最适反应温度；●：WT；○：E62D）。

图5CD检测野生酶和突变酶Del1-4/E62D在40-80℃热变性过程；

（a：野生酶不同温度下CD曲线；b：野生酶不同温度下222nm值；c：Del1-4/E62D不同温度下CD曲线；d：Del1-4/E62D不同温度下222nm值；●：40℃；○：50℃；▼：60℃；△：70℃；■：80℃）。

具体实施例

培养基

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0；

从重组菌甘油管中取50μL菌液接种至装液量为50mL培养基/250mL的摇瓶中，于37℃，200r/min培养8-10h。将100mL种子接入装液量为1.5L发酵培养基的3L发酵罐(NewBrunswick Scientific)。搅拌转速为400r/min，培养温度为37℃，通气量为1vvm。当菌体浓度OD₆₀₀达到8时，将发酵液温度降至20℃，加入终浓度0.4mmol/L IPTG诱导。

本发明中谷氨酰胺转胺酶活力的测定：

比色法测定酶活：以N-α-CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-γ单羟胺酸做标准曲线。1个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmol L-谷氨酸-γ单羟胺酸的酶量(U/mL)。

试剂A：100mg的Nα-CBZ-GLN-GLY溶解于2mL0.2moL/L的NaOH溶液中，加入0.2mol/LpH6.0的Tris-HC缓冲液4mL，0.1mol/L羟胺2mL，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2mL，并调节pH至6.0。

试剂B：3mol/L的HCL，12%TCA，5%FeCL₃按1：1：1混合。

配制0-4μmol/mL的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液。取1mL试剂A与0.4mL不同浓度的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液混合，37℃水浴10分钟。加0.4mL试剂B终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0.4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100℃加热10分钟的离心后的上清液为空白。

酶活力(u/mL)=(6.8548×OD₅₂₅-0.0164)×稀释倍数

最适反应温度检测：20mmol/L Tris缓冲液(pH6.0)中，测定TGase在30～70℃之间催化酶活力，将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下TGase酶的相对酶活力，确定TGase最适反应温度。

实施例1：Del1-4/E62D突变体的获得

在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株（Streptomyceshygroscopicus CCTCC M203062），通过基因克隆方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子（Genbank：EU477523），以S.hygroscopicus pro-TGase表达质粒pBB1-1011为模板（具体文献为Liu S,Zhang D,Wang M,Cui W,Chen K,Liu Y,Du G,Chen J,Zhou Z(2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicus transglutaminase affects its secretion byEscherichia coli.FEMS Microbiol Lett324(2):98-105），通过引物SEQ ID NO.3、SEQID NO.4，获得Del1-4突变体。

SEQ ID NO.3为GAGAGGGTGACCCCTCCTGCCGAG

SEQ ID NO.4为GGGGGCCCGGAAGAGCGCACTG

以Del1-4基因为模板，对E62进行突变，通过引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，获得Del1-4/E62D突变体。

SEQ ID NO.5为GACAGGGTGACCCCTCCTGCCGAG

SEQ ID NO.6为GGGGGCCCGGAAGAGCGCACTG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃7min24个循环72℃10min

pro-TGase中前57个氨基酸为前导肽序列，因此从成熟酶D58开始逐段缺失，分别缺失D58、D58-A59、D58-A60、D58-D61、D58-E62、D58-R63、D58-V64，对应突变酶为Del1、Del1-2、Del1-3、Del1-4、Del1-5、Del1-6、Del1-7。

如表2所示，与野生酶相比，突变酶Del1比酶活无明显变化，但Del1-2的催化活性略低，Del1-3和Del1-4的比酶活分别提高了14.4%和32.9%。当缺失N端前5和6个氨基酸，突变酶比酶活显著降低，仅为野生酶的64.7%和56.2%，而缺失N端7个氨基酸，突变酶Del1-7检测不到活性。尽管N端缺失对TGase比酶活具有重要影响，但所有突变酶热稳定性并无提高。由上述结果可看出，TGaseN端前4个氨基酸非其活性必需，但第5个及其后氨基酸对维持TGase正常催化活性具有重要作用。

表1TGase酶N端氨基酸序列和突变酶酶学性质

由突变酶Del1-4和Del1-5酶学性质可看出，缺失E62突变酶比酶活由20.4降低至10.1U/mg(表1)，表明E62可影响TGase催化活性。因此以突变酶Del1-4基因为模板，对E62进行饱和突变，以期改善TGase酶学性质。如图1所示，将E62突变成其它19个氨基酸对pro-TGase分泌没有影响，重组pro-TGase都可分泌到胞外。同时检测发酵上清酶活，突变酶之间表现出不同活性，突变酶Del1-4/E62D和Del1-4/E62K发酵上清酶活较高，分别为5.5和4.6U/mL，而突变酶Del1-4/E62I和Del1-4/E62Y酶活仅为野生酶的30%，其余突变酶与野生酶基本一致。将含有不同突变酶的发酵上清于50oC水浴处理10min，检测残留酶活，初步确定突变酶热稳定性。如图2所示，与野生酶相比，突变酶Del1-4/E62L、Del1-4/E62K、Del1-4/E62C和Del1-4/E62D表现出较高的残留酶活。综合突变酶发酵上清酶活和热稳定性，选取突变酶Del1-4/E62L、Del1-4/E62K、Del1-4/E62C和Del1-4/E62D为研究对象，对目的蛋白进行纯化，确认其酶学性质变化。

表2突变酶酶学性质

对突变酶Del1-4/E62L、Del1-4/E62K、Del1-4/E62C、Del1-4/E62D进行纯化及酶学性质检测。如表2所示，所有突变酶比酶活都有提高，尤其是突变酶Del1-4/E62D，比酶活由15.3U/mg增加到了28.4U/mg。同时对突变酶热稳定性进行检测，如图3所示，突变酶E62D和E62C在50℃水浴10min后仍保留50%和25%的活性，表现出较高的稳定性，而Del1-4/E62L和Del1-4/E62K酶活残留曲线与野生酶一致，热稳定性并无提高。计算突变酶在50℃的半衰期，突变酶Del1-4/E62D和Del1-4/E62C的半衰期分别被延长至10.1min和6.2min，是野生酶的2.7和1.7倍。综合比较突变酶性质，Del1-4/E62D具有最高比酶活和热稳定性，因此选取突变酶Del1-4/E62D继续深入研究。

为分析突变酶Del1-4/E62D热稳定性，在底物过量存在前提下，测定TGase在50℃水浴中酶活积累，如图4所示，随着时间的延长，野生酶和Del1-4/E62D的累积反应酶活都得到提高，但突变酶Del1-4/E62D终酶活明显提高野生酶，增加了1.6倍，表明Del1-4/E62D热稳定性提高。同时检测突变酶最适反应温度，与野生TGase相比，突变酶最适反应温度由40℃提高到45℃(图4b)。

为分析突变酶Del1-4/E62D催化活性及热稳定性提高原因，利用CD光谱检测Del1-4/E62D二级结构。在40℃时，野生酶和突变酶Del1-4/E62D的CD光谱基本一致(图5a和c)，表明氨基酸缺失和置换对TGase整体结构并无明显影响。为进一步分析突变酶和野生酶热稳定性之间的差异，检测在不同温度下蛋白的结构。随着温度提高，野生酶变性过程明显高于Del1-4/E62D，野生酶在70℃时CD曲线变化幅度已达最大(图5a)，说明蛋白结构被破坏。而突变酶在70℃时仍能维持一定结构，直到80℃时CD曲线变化幅度才达到最大(图5a和c)。此外由222nm的吸光值曲线可看出(图5b和d)，Del1-4/E62D的T_m由68.9℃提高到79.1℃。上述结果表明E6D有助于提高蛋白热稳定性，但并非通过影响TGase整体结构来实现，其作用区域应在TGase N端。

实例2：重组突变体Del1-4/E62D-tag1的获得

利用定点突变技术，以成熟酶N端缺失及置换突变质粒Del1-4/E62D为模板，进行全质粒PCR。引物如表4所示，由上海生工生物工程公司合成。引物如下：

SEQ ID NO.7为：ATCGGTTGCATCATCCTGACGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAG

SEQ ID NO.8为CGACCAGCCCTGCTTCACCTCG

实例3：重组突变体Del1-4/E62D-tag1分批发酵

基于上述研究，将最佳突变体Del1-4/E62D-tag1在3L发酵罐上进行发酵优化，以期提高pro-TGase产量。实验室前期研究发现，重组大肠杆菌生产pro-TGase分批发酵过程中，利用TB培养基，诱导菌体密度OD600为8，诱导温度为20℃，诱导剂IPTG终浓度为0.4mmol/L时，突变体Del1-4/E62D-tag1在48h胞外积累量最高，酶活可达14.8U/mL，与野生酶相比提高49%，生产强度也由0.21U/ml/h增加到0.31U/ml/h。

Claims

1.一种酶活和热稳定性提高的谷氨酰胺转胺酶突变体，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述谷氨酰胺转胺酶突变体的构建方法，其特征在于具体步骤为：1)通过PCR或化学全合成的方法获得Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062的谷氨酰胺转胺酶基因序列及其上下游序列，其序列是Genbank：EU477523所示，克隆到表达载体；2)通过缺失突变谷氨酰胺转氨酶N端前4个氨基酸，获得Del1-4谷氨酰胺转胺酶突变体；3)以在步骤2)获得的突变体基础上，通过定点突变对E62进行突变，获得突变体Del1-4/E62D谷氨酰胺转胺酶突变体；4)在步骤3)获得的突变体基础上，融合tag1获得如SEQ ID NO.1所示的谷氨酰胺转胺酶突变体，转化大肠杆菌获得含有谷氨酰胺转胺酶突变体的工程菌。

3.权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述表达载体为pBB1-1011。

4.一种发酵生产权利要求1所述谷氨酰胺转胺酶突变体的方法，其特征在于以权利要求2所述方法构建的突变体转化大肠杆菌后得到的工程菌为生产菌株，利用TB培养基，诱导菌体密度OD₆₀₀为8，诱导温度为20℃，诱导剂IPTG浓度为0.4mmol/L，获得谷氨酰胺转胺酶突变体。