CN103554223B - 一种提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的短肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高谷氨酰胺转氨酶热稳定性的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还公开了一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶，其特征在于C端含有上述短肽，氨基酸如SEQ ID NO.2所示。应用上述短肽能显著提高谷氨酰胺转氨酶的热稳定性，其50℃的半衰期由3.7min延长至9.1min，提高1.5倍；TG-tag1熔解温度为76.4oC，与野生酶相比提高7.5℃。
Description
技术领域
本发明涉及一种短肽及其应用，特别是一种提高谷氨酰胺转氨酶热稳定性的短肽及其应用。
背景技术
微生物谷氨酰胺转胺酶（蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG）能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸ε-酰基或其他酰基反应，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键。特殊的催化能力使TGase广泛应用于食品工程、纺织与皮革加工、材料工程、生物医药等领域。但由于MTG异源表达分泌量低等缺陷，限制了MTG的应用范围。
在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株（Streptomyceshygroscopicus CCTCC M203062），通过基因克隆方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子（Genebank：EU477523），并实现了MTG和其酶原区在大肠杆菌中的高效表达（Liu S,Zhang D,Wang M,Cui W,Chen K,Liu Y,Du G,Chen J,Zhou Z(2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicus transglutaminase affects its secretion byEscherichia coli.FEMS Microbiol Lett324(2):98-105）。
谷氨酰胺转胺酶具有重要的工业应用价值，但其热稳定性始终是一个不可逾越的障碍，为提高TGase酶的稳定性，本发明选取该稳定短肽融合至TGase酶C端，以期得到热稳定性提高的突变酶。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种提高的谷氨酰胺转氨酶热稳定性的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1:短肽氨基酸序列为：IGCIILT。
本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶，其C端含有上述短肽序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：谷氨酰胺转胺酶C端加短肽序列为
ASGGDGEREGSYAETHGLTAEDVKNINALNKRALTAGQPGNSLAELPPSVSALFR
APDAADERVTPPAEPLNRMPDAYRAYGGRATTVVNNYIRKWQQVYSHRDGIQQQMTE
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NGGVGPMNVYESKFRNWSAGYADFDRGTYVITFIPKSWNTAPAEVKQGWSIGCIILT
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用上述短肽提高谷氨酰胺转氨酶热稳定性的方法，将上述短肽插入到谷氨酰胺转胺酶C端。
谷氨酰胺转胺酶活力的测定方法：
比色法测定酶活：以N-α-CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-γ单羟胺酸做标准曲线。1个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmol L-谷氨酸-γ单羟胺酸的酶量(U/mL)。
试剂A：100mg的Nα-CBZ-GLN-GLY溶解于2mL0.2moL/L的NaOH溶液中，加入0.2mol/L pH6.0的Tris-HC缓冲液4mL，0.1mol/L羟胺2mL，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2mL，并调节pH至6.0。
试剂B：3mol/L的HCL，12%TCA，5%FeCL3按1：1：1混合。
配制0-4μmol/mL的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液。取1mL试剂A与0.4mL不同浓度的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液混合，37℃水浴10分钟。加0.4mL试剂B终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0.4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100℃加热10分钟的离心后的上清液为空白。酶活力(u/mL)=(6.8548×OD525-0.0164)×稀释倍数
应用上述短肽能显著提高谷氨酰胺转氨酶的热稳定性，其50℃的半衰期由3.7min延长至9.1min，提高1.5倍；TG-tag1熔解温度为76.4℃，与野生酶相比提高7.5℃。
附图说明
图1SDS-PAGE分析C端氨基酸缺失对pro-TGase分泌的影响
a：发酵上清；b：全细胞
WT：野生酶；1：TGQC-1；2：TGQC-2；3：TGQC-3；4：TGQC-4；5：TGQC-5；6：TGQC-6；M：蛋白质标准分子量
图2TGase结构模拟及Trp331与N端氨基酸之间氢键分析
图3不同链霉菌来源TGase酶N端(a)和C端(b)氨基酸比较
图4突变酶TG-tag1残留酶活检测
图5CD检测突变酶TG-tag1在40-80℃热变性过程
具体实施方式
培养基
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0；
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/L KH2PO4，72mmol/LK2HPO4。
实施例1：吸水链霉菌来源MTG晶体结构模拟
以已报道的S.mobaraensis pro-TGase(PDB code:3IU0)为模板(两者氨基酸相似度为73.1%)，利用在线模拟软件SWISS-MODEL，模拟S.hygroscopicus TGase的晶体结构。
实施例2：TGase C端氨基酸功能分析
为分析TGase C端氨基酸功能，对C端6个氨基酸(VKQGWS)进行逐段缺失，分别缺失389S、388W-389S、387G-389S、386Q-389S、385K-389S和384V-389S，对应突变酶为TGQC-1、TGQC-2、TGQC-3、TGQC-4、TGQC-5和TGQC-6，表1为突变使用的引物。将上述突变酶进行摇瓶发酵，并利用SDS-PAGE检测蛋白分泌。如图1所示，突变酶都可分泌到发酵上清(图1a)，且在胞内无pro-TGase积累(图1b)。对发酵上清进行活化，检测酶活，除突变体TGQC-1可检测到酶活，其它突变体都无活性(表2)。
表1 突变引物设计
对上述突变酶进行纯化(图1c)，检测酶学性质。如表2所示，突变酶TGQC-1比酶活和热稳定性与野生酶基本一致，说明缺失S389对TGase结构和酶学性质没有影响。而缺失W388及更多氨基酸，尽管目的蛋白可以正常表达和分泌，但纯化蛋白检测不到活性。该结果表明，C端氨基酸W388对维持TGase正常催化活性具有重要作用。
表2 突变酶C端氨基酸序列及酶学性质
实施例3：TGase C端氨基酸结构分析
为明确C端氨基酸对TGase催化活性影响，分析C端氨基酸与附近氨基酸之间相互作用。如图2所示，C端区域为loop结构，位于活性裂缝一侧，且距N端氨基酸较近。其中C端W388可与N端D76，A77和Y78之间形成氢键。文献报道氢键对蛋白结构和功能具有重要作用，增加内部氢键有助于提高蛋白稳定性。在TGase酶中，其N端为loop区域，柔性较高，且影响底物与催化活性中心结合。因此推测，W388与N端氨基酸之间的氢键对维持N端位置具有重要作用，避免其阻碍底物与活性中心结合。当W388缺失时，氢键被破坏，N端区域较高的柔性使其易于阻止底物与活性中心的结合，进而使突变酶失活。为进一步确认C端氨基酸功能，对不同链霉菌来源TGase的N端和C端氨基酸进行比对，如图3所示，N端氨基酸D76、A77、Y78和C端氨基酸W388具有高度保守性，表明这些氨基酸对TGase酶结构和功能具有重要影响。
实施例4：TG-tag1构建及酶学性质检测
由于C端氨基酸对TGase催化活性和热稳定性具有重要作用，因此选取在TGase酶C端添加稳定短肽，通过增加其与成熟酶N端或其他区域之间相互作用，提高蛋白稳定性。在蛋白C端添加适当的短肽可提高蛋白稳定性，将7个氨基酸作为稳定短肽插入到TGase酶C端，得到对应突变酶为TG-tag1。
引物序列：
全质粒PCR条件：95℃5min、24个循环（95℃5min、65℃30s、72℃7min）、72℃10min。
在本实例中，选取该短肽作为稳定短肽插入到TGase酶C端，得到对应突变酶为TG-tag1。突变酶TG-tag1发酵结束后，对其进行纯化并检测酶学性质。TG-tag1比酶活与野生酶基本一致，为14.7U/mg，但其热稳定有显著提高，如图4所示，随着处理时间延长，野生酶残留酶活迅速下降，而TG-tag1在5min后仍可以保留60%残留酶活，其50℃的半衰期由3.7min延长至9.1min，提高1.5倍。该结果表明TGase酶C端融合稳定短肽可提高其热稳定性。
为分析tag1对TGase结构影响，利用CD检测突变酶TG-tag1结构。在40℃时，野生酶CD曲线和突变酶TG-tag1(图5a)基本一致，表明C端插入tag1对TGase酶整体结构并无显著影响。同时分析突变酶和野生酶TG-tag1热稳定性之间差异，检测不同温度下蛋白结构。突变酶TG-tag1随温度增加仍能保持一定结构，在80℃时CD曲线变化幅度才达到最大(图5a)。根据蛋白在222nm的吸光值曲线(图5b)，计算TG-tag1熔解温度为76.4℃，与野生酶相比提高7.5℃。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (3)
1.一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶，其特征在于C端含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的短肽，所述谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种应用短肽提高谷氨酰胺转氨酶热稳定性的方法，其特征在于在谷氨酰胺转氨酶C端插入氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的短肽序列；所述谷氨酰胺转氨酶C端加短肽后的序列为SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于所述短肽通过PCR方法或化学全合成的方法插入谷氨酰胺转氨酶C端。
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| Stabilization by Fusion to the C-terminus of Hyperthermophile Sulfolobus tokodaii RNase HI:A Possisility of protein stabilization tag;Kazufumi Takano;《PLOS one》;20110119;第6卷(第1期);第1-7页 e16226 * |
| 分子改造强化Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转氨酶催化性能研究;陈康康;《中国博士学位论文全文数据库》;20140115(第2014年01期);全文 * |
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