JP2610740B2 - 標的特異的細胞障害性組み換えシュードモナスエキソトキシン - Google Patents
標的特異的細胞障害性組み換えシュードモナスエキソトキシンInfo
- Publication number
- JP2610740B2 JP2610740B2 JP3504333A JP50433390A JP2610740B2 JP 2610740 B2 JP2610740 B2 JP 2610740B2 JP 3504333 A JP3504333 A JP 3504333A JP 50433390 A JP50433390 A JP 50433390A JP 2610740 B2 JP2610740 B2 JP 2610740B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- molecule
- amino acid
- cytotoxic
- recombinant
- pseudomonas exotoxin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70514—CD4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/034—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the periplasmic space of Gram negative bacteria as a soluble protein, i.e. signal sequence should be cleaved
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、一般的に、改善された組み換えイムノトキ
シンの製造に関する。より詳細には、本発明は、シュー
ドモナスエキソトキシン（PE）の少なくともカルボキシ
ル末端に認識分子を挿入して標的指向細胞障害作用を得
るための特異的クローニング部位を有する組み換えシュ
ードモナスエキソトキシン（rPE）の造成に関する。
シンの製造に関する。より詳細には、本発明は、シュー
ドモナスエキソトキシン（PE）の少なくともカルボキシ
ル末端に認識分子を挿入して標的指向細胞障害作用を得
るための特異的クローニング部位を有する組み換えシュ
ードモナスエキソトキシン（rPE）の造成に関する。
背景技術 タンパクトキシンが細胞を死滅させる機構は、極めて
複雑である。多くのトキシンが哺乳動物細胞の表面の受
容体と結合し、エンドサイトシスにより内在化し、シト
ゾルに移行し、そこで、酵素活性を示して標的細胞を死
滅させる。したがって、これらのトキシンは、細胞結
合、移行及び基本的な細胞作用を不活性化する酵素活性
用の別個のドメインを有している。シュードモナスエキ
ソトキシンＡ（PE）は、613個のアミノ酸からなる単一
のポリペプチド鎖である。PE分子に関するＸ線結晶研究
と変異分析により、PEが、アミノ末端細胞受容体結合ド
メイン（ドメインＩ）と、中央移行ドメイン（ドメイン
II）と、カルボキシル末端活性領域（ドメインIII）と
の３つのドメインから構成されていることが判明した。
ドメインIIIは、ADPリボシル化と、タンパク合成を阻害
し細胞死を生じる延長因子２（EF−２）の不活性化を触
媒する。ドメインＩの変異分析から、リジン57が、受容
体結合に主要な役割を果たすことが明らかとなった。同
様に、グルタミン酸553、チロシン481及びヒスチジン
426は、ADP−リボシル化活性に重要であることが判明し
た。最近、ドメインIIの変異分析により、このドメイン
のある部分が、PEの細胞障害作用にとって不可欠である
ことが判明した。
複雑である。多くのトキシンが哺乳動物細胞の表面の受
容体と結合し、エンドサイトシスにより内在化し、シト
ゾルに移行し、そこで、酵素活性を示して標的細胞を死
滅させる。したがって、これらのトキシンは、細胞結
合、移行及び基本的な細胞作用を不活性化する酵素活性
用の別個のドメインを有している。シュードモナスエキ
ソトキシンＡ（PE）は、613個のアミノ酸からなる単一
のポリペプチド鎖である。PE分子に関するＸ線結晶研究
と変異分析により、PEが、アミノ末端細胞受容体結合ド
メイン（ドメインＩ）と、中央移行ドメイン（ドメイン
II）と、カルボキシル末端活性領域（ドメインIII）と
の３つのドメインから構成されていることが判明した。
ドメインIIIは、ADPリボシル化と、タンパク合成を阻害
し細胞死を生じる延長因子２（EF−２）の不活性化を触
媒する。ドメインＩの変異分析から、リジン57が、受容
体結合に主要な役割を果たすことが明らかとなった。同
様に、グルタミン酸553、チロシン481及びヒスチジン
426は、ADP−リボシル化活性に重要であることが判明し
た。最近、ドメインIIの変異分析により、このドメイン
のある部分が、PEの細胞障害作用にとって不可欠である
ことが判明した。
ドメインＩを欠いている一形態のPE（PE40）に成長因
子が融合した種々のキメラトキシンを造成するうちに、
PE40のカルボキシル末端にTGFα、インターロイキン−
２又はインターロイキン−４を付着することにより製造
した組み換え融合タンパクは、細胞障害活性が悪いこと
が分かった。このことから、PE分子（ドメインIII）の
カルボキシル末端の役割についての検討を開始した。
子が融合した種々のキメラトキシンを造成するうちに、
PE40のカルボキシル末端にTGFα、インターロイキン−
２又はインターロイキン−４を付着することにより製造
した組み換え融合タンパクは、細胞障害活性が悪いこと
が分かった。このことから、PE分子（ドメインIII）の
カルボキシル末端の役割についての検討を開始した。
発明の開示 したがって、本発明の目的は、細胞障害作用における
PE分子のカルボキシル末端の役割を決定することであ
る。
PE分子のカルボキシル末端の役割を決定することであ
る。
本発明の別の目的は、標的細胞を選択的に死滅させる
ための認識分子の挿入用のPE分子のカルボキシル末端の
特異的領域を同定することである。
ための認識分子の挿入用のPE分子のカルボキシル末端の
特異的領域を同定することである。
本発明のさらなる目的は、改善された標的特異的細胞
障害性組み換えPE分子であって、標的特異的認識分子を
少なくともPE分子のカルボキシル末端のドメインIIIに
挿入することを特徴とする標的特異的細胞障害性組み換
えPE分子を提供することである。
障害性組み換えPE分子であって、標的特異的認識分子を
少なくともPE分子のカルボキシル末端のドメインIIIに
挿入することを特徴とする標的特異的細胞障害性組み換
えPE分子を提供することである。
本発明のさらなる目的は、PEのカルボキシル末端を変
更して、キメラトキシンの効力を増加させることであ
る。
更して、キメラトキシンの効力を増加させることであ
る。
本発明のさらなる目的は、同じ認識分子をアミノ末端
とカルボキシル末端付近等の２つの異なる末端に配置し
て細胞結合を増強するか、または、２つの異なる認識要
素を各々PE分子の２つの異なる領域に挿入して、得られ
たPE分子が前記認識要素が結合できる抗原、受容体等の
２つ以上の異なるエンティティ（entities）を有する細
胞表面により効果的に結合できるようにする、２個の認
識分子（標的リガンド）を有する細胞障害性PEを製造す
ることである。
とカルボキシル末端付近等の２つの異なる末端に配置し
て細胞結合を増強するか、または、２つの異なる認識要
素を各々PE分子の２つの異なる領域に挿入して、得られ
たPE分子が前記認識要素が結合できる抗原、受容体等の
２つ以上の異なるエンティティ（entities）を有する細
胞表面により効果的に結合できるようにする、２個の認
識分子（標的リガンド）を有する細胞障害性PEを製造す
ることである。
本発明のさらなる目的は、反復カルボキシル末端細胞
障害性配列を有することにより細胞障害活性を増強した
組み換えPEを提供することである。
障害性配列を有することにより細胞障害活性を増強した
組み換えPEを提供することである。
種々の他の目的及び利点は、本発明に関する以下の詳
細な説明から明らかになるであろう。
細な説明から明らかになるであろう。
図面の簡単な説明 本発明に関するこれら及び他の目的、特徴並びに付随
する利点は、添付図面との関連において以下の詳細な説
明からよりよく理解されるであろう。
する利点は、添付図面との関連において以下の詳細な説
明からよりよく理解されるであろう。
第１図は、スイス細胞に対するPE及びPE変異株の細胞
障害作用を示したものである。PEタンパクの種々の希釈
液を、0.2％ヒト血清アルブミンを含有するPBSで調製
し、24ウエルプレートに入っている１×10-5個のスイス
3T3細胞に添加した。16時間後、細胞を、3H−ロイシン
でパルスラベルし、そしてタンパク合成の目安としてTC
A沈澱可能細胞関連放射能を測定した。結果を、対照の
百分率で表す。●−●PE;○−○PE△613;□−□PE△61
2、613;及び△−△PE611−613。全てのアッセイは、二
重に行い、２回反復した。
障害作用を示したものである。PEタンパクの種々の希釈
液を、0.2％ヒト血清アルブミンを含有するPBSで調製
し、24ウエルプレートに入っている１×10-5個のスイス
3T3細胞に添加した。16時間後、細胞を、3H−ロイシン
でパルスラベルし、そしてタンパク合成の目安としてTC
A沈澱可能細胞関連放射能を測定した。結果を、対照の
百分率で表す。●−●PE;○−○PE△613;□−□PE△61
2、613;及び△−△PE611−613。全てのアッセイは、二
重に行い、２回反復した。
第2A図および第2B図は、組み換えPEの細胞取り込みに
関する競合の結果を示す。スイス3T3マウス細胞を、400
ng3Ｈ−PE（比活性:3.5×105DPM/μｇ）とともに且つ精
製変異タンパクの濃度を増加させながら、37℃で１時間
培養した。細胞の単層を洗浄し、そして細胞関連放射能
を測定した。●−●PE; ▲−▲PEglu57;△−△PE612、613; ○−○PE△613;■−■PEgly276； □−□PE609−613;＋−−＋PE△609−613＋598−613。
関する競合の結果を示す。スイス3T3マウス細胞を、400
ng3Ｈ−PE（比活性:3.5×105DPM/μｇ）とともに且つ精
製変異タンパクの濃度を増加させながら、37℃で１時間
培養した。細胞の単層を洗浄し、そして細胞関連放射能
を測定した。●−●PE; ▲−▲PEglu57;△−△PE612、613; ○−○PE△613;■−■PEgly276； □−□PE609−613;＋−−＋PE△609−613＋598−613。
発明の具体的説明 本発明の上記及び種々の他の目的並びに利点は、認識
分子によって認識されない他の細胞に対して実質的に細
胞障害作用を示すことなく前記認識分子により認識され
る標的細胞を選択的に死滅させるために認識分子をPEの
カルボキシル末端の少なくともドメインIIIに挿入して
有する細胞障害性組み換えシュードモナスエキソトキシ
ン（rPE）と、そして増加した細胞死滅活性を有する変
更「細胞障害性配列（cytotoxic sequence）」を含むrP
Eにより達成される。
分子によって認識されない他の細胞に対して実質的に細
胞障害作用を示すことなく前記認識分子により認識され
る標的細胞を選択的に死滅させるために認識分子をPEの
カルボキシル末端の少なくともドメインIIIに挿入して
有する細胞障害性組み換えシュードモナスエキソトキシ
ン（rPE）と、そして増加した細胞死滅活性を有する変
更「細胞障害性配列（cytotoxic sequence）」を含むrP
Eにより達成される。
特に定義しない限りは、本明細書において使用する全
ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者に
よって一般的に理解されるのと同じ意味を有している。
本明細書において説明するのと同様であるか等価のいず
れの方法及び材料も本発明の実施や試験に利用できる
が、本発明にとって好ましい方法や材料をここで説明す
る。以下に記載する全ての刊行物に開示されている内容
は、本明細書の開示の一部とされる。特記のない限り
は、本明細書において用いられるか意図される手法は、
当業者に周知の標準的な方法である。本明細書で記載す
る材料、方法及び実施例は、本発明を説明するためのみ
であって、本発明はそれらのものには限定されない。
ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者に
よって一般的に理解されるのと同じ意味を有している。
本明細書において説明するのと同様であるか等価のいず
れの方法及び材料も本発明の実施や試験に利用できる
が、本発明にとって好ましい方法や材料をここで説明す
る。以下に記載する全ての刊行物に開示されている内容
は、本明細書の開示の一部とされる。特記のない限り
は、本明細書において用いられるか意図される手法は、
当業者に周知の標準的な方法である。本明細書で記載す
る材料、方法及び実施例は、本発明を説明するためのみ
であって、本発明はそれらのものには限定されない。
本明細書で用いられる用語「認識分子（recognition
molecule）」とは、死滅させることを意図する標的細胞
のみを認識する分子やリガンドを意味する。このような
認識分子としては、例えば、標的細胞の表面上の分子に
特異的に結合する標的細胞、成長因子、リンホカイン、
サイトカイン、ホルモン等を認識することができる抗体
やそれらの部分が挙げられる。
molecule）」とは、死滅させることを意図する標的細胞
のみを認識する分子やリガンドを意味する。このような
認識分子としては、例えば、標的細胞の表面上の分子に
特異的に結合する標的細胞、成長因子、リンホカイン、
サイトカイン、ホルモン等を認識することができる抗体
やそれらの部分が挙げられる。
本明細書で用いられる用語「細胞障害性配列（cytoto
xic sequence）」とは、PEのカルボキシル末端における
細胞障害性を有する種々の配列を意味する。細胞障害性
配列の存在は、トキシンの細胞致死性活性に欠くことが
できず、そしてその反復配列は細胞障害作用のレベルを
決定することがある。このような配列としては、例え
ば、本明細書において以下で説明する配列の種々の実施
態様から明らかになるであろうKDEL、RDELK等が挙げら
れる。
xic sequence）」とは、PEのカルボキシル末端における
細胞障害性を有する種々の配列を意味する。細胞障害性
配列の存在は、トキシンの細胞致死性活性に欠くことが
できず、そしてその反復配列は細胞障害作用のレベルを
決定することがある。このような配列としては、例え
ば、本明細書において以下で説明する配列の種々の実施
態様から明らかになるであろうKDEL、RDELK等が挙げら
れる。
材料及び方法 材料 特記のない限り、ここで使用した材料及び試薬は市販
のものである。重合連鎖反応（PCR）キット、ジーン・
アンプ・キット（Gene Amp Kit）は、米国コネクチカッ
ト州ノーウォークにあるパーキン・エルマー・シータス
（Perkin Elmer−Cetus）から入手した。
のものである。重合連鎖反応（PCR）キット、ジーン・
アンプ・キット（Gene Amp Kit）は、米国コネクチカッ
ト州ノーウォークにあるパーキン・エルマー・シータス
（Perkin Elmer−Cetus）から入手した。
変異株及びプラスミドの構築 変異株は、ジンノ等（Jinno et al）、1988、J.Biol.
Chem.、263、13203〜13207及びジンノ等、1989、J.Bio
l.Chem.、264、15963〜15959に説明されているプラスミ
ドpVC45f＋Ｔを用いるか、以下で説明するポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）を用いて、オリゴヌクレオチド指向変
異誘発により生成した。pVC45f＋Ｔは、T7プロモーター
の下にPE遺伝子を担持するとともに、T7転写ターミネー
タとf1ファージオリジンとを含有している。また、PE遺
伝子は、PEの分泌に伴い開裂して周縁質となり、アミノ
末端で３個のアミノ酸（ala asn leu）が延長されるpmp
Aシグナル配列を含有している（チョーダリ等（Chaudha
ry et al）、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.、米国、85、2
939〜2943参照）。PCR変異誘発の場合、２つのオリゴヌ
クレオチドとpVC45f＋Ｔの1.0KbSalI−EcoRI断片を用い
た。一つのオリゴヌクレオチドは、PE遺伝子のヌクレオ
チド2216〜2236と同じであった〔グレー等（Gray et a
l）、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.、米国、81、2645〜26
49参照〕。他のオリゴヌクレオチドは、コード配列PE遺
伝子の３′端に相補的であり、所望の変異を含み、そし
て停止コドンの後にEcoRI部位を形成しているものであ
った。他の独自の制限部位も、アミノ酸を変異すること
なく形成して、変異株を同定した。94℃で２分間変性
し、55℃で１分間アニーリングし、そして72℃で３分間
重合する30サイクルPCRを行った。この際、遺伝子増幅
熱サイクラー（パーキン・エルマー・シータス（Perk i
n Elmer Cetus）を用いて１サイクル当たり10秒間の延
長を行った。PCR後、増幅された断片をEcoRIとBamHIで
切断し、低融点アガロースを用いて精製した。PCR断片
を、pVC45f＋Ｔの4.5Kb脱リン化EcoRI−BamHI断片で連
結した。変異株は、変異誘発中に形成された独自の制限
部位によって同定し、最終的に、セクアナーゼ（Sequan
ase）〔ユーエス・バイオケミカル・コーポレーション
（US Biochemical Corp.）を用いてスナガーのジデオキ
シ鎖終止法（Snager's dideoxy−chain termination pr
ocedure）により配列決定することにより確認した。
Chem.、263、13203〜13207及びジンノ等、1989、J.Bio
l.Chem.、264、15963〜15959に説明されているプラスミ
ドpVC45f＋Ｔを用いるか、以下で説明するポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）を用いて、オリゴヌクレオチド指向変
異誘発により生成した。pVC45f＋Ｔは、T7プロモーター
の下にPE遺伝子を担持するとともに、T7転写ターミネー
タとf1ファージオリジンとを含有している。また、PE遺
伝子は、PEの分泌に伴い開裂して周縁質となり、アミノ
末端で３個のアミノ酸（ala asn leu）が延長されるpmp
Aシグナル配列を含有している（チョーダリ等（Chaudha
ry et al）、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.、米国、85、2
939〜2943参照）。PCR変異誘発の場合、２つのオリゴヌ
クレオチドとpVC45f＋Ｔの1.0KbSalI−EcoRI断片を用い
た。一つのオリゴヌクレオチドは、PE遺伝子のヌクレオ
チド2216〜2236と同じであった〔グレー等（Gray et a
l）、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.、米国、81、2645〜26
49参照〕。他のオリゴヌクレオチドは、コード配列PE遺
伝子の３′端に相補的であり、所望の変異を含み、そし
て停止コドンの後にEcoRI部位を形成しているものであ
った。他の独自の制限部位も、アミノ酸を変異すること
なく形成して、変異株を同定した。94℃で２分間変性
し、55℃で１分間アニーリングし、そして72℃で３分間
重合する30サイクルPCRを行った。この際、遺伝子増幅
熱サイクラー（パーキン・エルマー・シータス（Perk i
n Elmer Cetus）を用いて１サイクル当たり10秒間の延
長を行った。PCR後、増幅された断片をEcoRIとBamHIで
切断し、低融点アガロースを用いて精製した。PCR断片
を、pVC45f＋Ｔの4.5Kb脱リン化EcoRI−BamHI断片で連
結した。変異株は、変異誘発中に形成された独自の制限
部位によって同定し、最終的に、セクアナーゼ（Sequan
ase）〔ユーエス・バイオケミカル・コーポレーション
（US Biochemical Corp.）を用いてスナガーのジデオキ
シ鎖終止法（Snager's dideoxy−chain termination pr
ocedure）により配列決定することにより確認した。
pVC4915f＋Ｔ このプラスミドは、コドン608、CCGと、コドン609、C
GCの２つの変異を含んでおり、これらを、それぞれCCC
とGGGに変異した。この変異は、アルギニンの代わりに6
09にグリシンが生じ、コドン608とコドン609との間にSm
aI部位を生成する。このプラスミドを用いて、PEの種々
のカルボキシル末端断片をクローニングした。pVC4975f
＋T:pVc8の1KbBamHI−PstI断片〔ボツニーク等（Woznia
k et al）、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.、米国、85、88
80〜8884参照〕をNarIで制限し、T4DNAポリメラーゼで
処理して平滑末端を作成後EcoRIで処理し、そして286bp
断片を、pVC4915f＋Ｔの4.9kb脱リン化SmaI−EcoRI断片
に連結した。pVC4985f＋T:pVc8の1KbBamHI−PstI断片を
HinfIで制限し、T4DNAポリメラーゼで処理後EcoRIで処
理し、そして237bp断片を、pVC45f＋Ｔの4.9kbSmaI Eco
RI断片に連結した。pVC4995f＋T:停止コドンとEcoRI適
合性３′端を有するPEのコドン598〜613を含む合成オリ
ゴヌクレオチド二重鎖VK192/193（図示していない）
を、pVC4915f＋Ｔの4.9KbSmaI−EcoRI断片に連結した。
pVC4715f＋T:このプラスミドは、PCR突然誘発により生
成したもので、PE遺伝子の３′端内に制限部位Stul、Nd
eI、SmaI、EcoRV及びEcoRIを含んでおり、そして608〜6
13にPREDLKの代わりにアミノ酸RPHMPGDILKをコードして
いる。これらの独自の部位は、後で、挿入を作成した
り、PEのカルボキシル末端部をコードしている種々のDN
Aセグメントを付着させるのに使用した。
GCの２つの変異を含んでおり、これらを、それぞれCCC
とGGGに変異した。この変異は、アルギニンの代わりに6
09にグリシンが生じ、コドン608とコドン609との間にSm
aI部位を生成する。このプラスミドを用いて、PEの種々
のカルボキシル末端断片をクローニングした。pVC4975f
＋T:pVc8の1KbBamHI−PstI断片〔ボツニーク等（Woznia
k et al）、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.、米国、85、88
80〜8884参照〕をNarIで制限し、T4DNAポリメラーゼで
処理して平滑末端を作成後EcoRIで処理し、そして286bp
断片を、pVC4915f＋Ｔの4.9kb脱リン化SmaI−EcoRI断片
に連結した。pVC4985f＋T:pVc8の1KbBamHI−PstI断片を
HinfIで制限し、T4DNAポリメラーゼで処理後EcoRIで処
理し、そして237bp断片を、pVC45f＋Ｔの4.9kbSmaI Eco
RI断片に連結した。pVC4995f＋T:停止コドンとEcoRI適
合性３′端を有するPEのコドン598〜613を含む合成オリ
ゴヌクレオチド二重鎖VK192/193（図示していない）
を、pVC4915f＋Ｔの4.9KbSmaI−EcoRI断片に連結した。
pVC4715f＋T:このプラスミドは、PCR突然誘発により生
成したもので、PE遺伝子の３′端内に制限部位Stul、Nd
eI、SmaI、EcoRV及びEcoRIを含んでおり、そして608〜6
13にPREDLKの代わりにアミノ酸RPHMPGDILKをコードして
いる。これらの独自の部位は、後で、挿入を作成した
り、PEのカルボキシル末端部をコードしている種々のDN
Aセグメントを付着させるのに使用した。
pVC47915f＋Ｔ これは、オリゴヌクレオチド二重鎖VK191/192を、pVC
4715f＋Ｔの4.9KbEcoRV−EcoRIに連結することにより生
成した。このPE変異株のカルボキシル末端部は、PEのア
ミノ酸608〜613（PREDLK）の代わりにアミノ酸RPHMPGDP
DYASQPGKPPREDLKを含んでいる。
4715f＋Ｔの4.9KbEcoRV−EcoRIに連結することにより生
成した。このPE変異株のカルボキシル末端部は、PEのア
ミノ酸608〜613（PREDLK）の代わりにアミノ酸RPHMPGDP
DYASQPGKPPREDLKを含んでいる。
PEのカルボキシル末端に受容体結合ドメインを挿入する
ためのプラスミド プラスミドpVC4715f＋Ｔは、アミノ酸１〜607からPE
をコードしているDNA配列と、それに続くStuI、NdeI、S
maI、EcoRV及びAflII部位を含み且つアミノ酸RPHMPGDIL
Kをコードしているポリリンカーから構成されている。
これらの配列は、T7プロモーターコントロール下であ
り、そして大腸菌のOmpA由来のシャイン−ダルガノ領域
とシグナル配列も含まれている。プラスミドpVC4715/4E
f＋Ｔは、pVC4715f＋Ｔと類似しているが、PE（ドメイ
ンＩ）の受容体結合ドメインに変異をも含んでいる。こ
れらの変異は、Lys57→Glu、His246,249→Glu及びArg
247→Gluである。
ためのプラスミド プラスミドpVC4715f＋Ｔは、アミノ酸１〜607からPE
をコードしているDNA配列と、それに続くStuI、NdeI、S
maI、EcoRV及びAflII部位を含み且つアミノ酸RPHMPGDIL
Kをコードしているポリリンカーから構成されている。
これらの配列は、T7プロモーターコントロール下であ
り、そして大腸菌のOmpA由来のシャイン−ダルガノ領域
とシグナル配列も含まれている。プラスミドpVC4715/4E
f＋Ｔは、pVC4715f＋Ｔと類似しているが、PE（ドメイ
ンＩ）の受容体結合ドメインに変異をも含んでいる。こ
れらの変異は、Lys57→Glu、His246,249→Glu及びArg
247→Gluである。
プラスミドpVC47195/f＋Ｔは、pVC4715f＋Ｔと類似し
ているが、アミノ酸RPHMPGIをコードしているStuI、Nde
I、SmaI部位を有するポリリンカーと、その後に、PDYAS
QPGKPPREDLKをコードしているPEの最後の16コドンを含
んでいる。プラスミドpVC47195/4＃ｆ＋Ｔは、プラスミ
ドpVC4715f＋Ｔと4715/4Ef＋ＴのNdeI部位に形質転換成
長因子αのインサーションを含んでいる。プラスミドpV
C47395f＋Ｔ及びpVC47195/4Ef＋Ｔは、47195f＋Ｔ及びp
VC47195f＋Ｔから、TGFα配列をNdeI部位に挿入するこ
とにより誘導したものである。プラスミドpVC47355/4Ef
＋Ｔは、pVC47395/4Ef＋Ｔから、６個のアミノ酸を削除
し、TGFαを挿入し、そしてそれに続いてPEカルボキシ
ル末端の10個のアミノ酸を挿入することにより誘導し
た。
ているが、アミノ酸RPHMPGIをコードしているStuI、Nde
I、SmaI部位を有するポリリンカーと、その後に、PDYAS
QPGKPPREDLKをコードしているPEの最後の16コドンを含
んでいる。プラスミドpVC47195/4＃ｆ＋Ｔは、プラスミ
ドpVC4715f＋Ｔと4715/4Ef＋ＴのNdeI部位に形質転換成
長因子αのインサーションを含んでいる。プラスミドpV
C47395f＋Ｔ及びpVC47195/4Ef＋Ｔは、47195f＋Ｔ及びp
VC47195f＋Ｔから、TGFα配列をNdeI部位に挿入するこ
とにより誘導したものである。プラスミドpVC47355/4Ef
＋Ｔは、pVC47395/4Ef＋Ｔから、６個のアミノ酸を削除
し、TGFαを挿入し、そしてそれに続いてPEカルボキシ
ル末端の10個のアミノ酸を挿入することにより誘導し
た。
pVC49415f＋Ｔ及びpVC47355/4Ef＋ｔは、米国のメリ
ーランド州ロックビルにあるATCCに1989年12月28日に寄
託されている（寄託番号:68198及び68199）。寄託物
は、生存維持され、特許の存続期間中か、寄託日から30
年間か、寄託のサンプルの要求の最後の日から５年間の
うちで最も長い期間中にもし非生存状態になったら交換
され、そして特許の発行にともない、法律の規定に従っ
て制限なく一般に入手できるようなされる。特許商標庁
長官は、請求のあり次第、寄託物にアクセスするものと
する。
ーランド州ロックビルにあるATCCに1989年12月28日に寄
託されている（寄託番号:68198及び68199）。寄託物
は、生存維持され、特許の存続期間中か、寄託日から30
年間か、寄託のサンプルの要求の最後の日から５年間の
うちで最も長い期間中にもし非生存状態になったら交換
され、そして特許の発行にともない、法律の規定に従っ
て制限なく一般に入手できるようなされる。特許商標庁
長官は、請求のあり次第、寄託物にアクセスするものと
する。
タンパク発現と精製 種々のプラスミドを含有している大腸菌BL21（λDE
3）株の培養物を、0.6〜0.8のOD650まで成長させ、1mM
イソプロピル−チオガラクトシドで37℃で90分間誘発さ
せた。上記のチョーダリ等（Chaudhary et al）により
記載されている方法により、ペリプラスミック画分を調
製した。OmpAシグナル配列を有しているので、90％を超
える各トキシン発現タンパクが、ペリプラズムに分泌さ
れた。これらのタンパクは、OmpAシグナル配列のプロセ
ッシング後、アミノ末端に残留ala asn leu配列が残さ
れている。ペリプラスミック画分を、ADPリボシル化活
性と細胞障害作用についてアッセイした。その後、PE変
異株を、ファルマシアFPLCシステムに付けたモノＱ（Mo
noQ）陰イオン交換カラム（HR5/5）を用いて精製した。
PE及び変異タンパクは、0.22〜0.26MのNaCl濃度で溶離
した。SDS−PAGE後のトキシンの純度は、90％を超えて
いた。タンパク濃度は、標準としてウシ血清アルブミン
を用いてブラッドフォード（Bradford）アッセイ試薬
（米国カルフォルニア州リッチモンドにあるバイオラッ
ド社製）により測定した。
3）株の培養物を、0.6〜0.8のOD650まで成長させ、1mM
イソプロピル−チオガラクトシドで37℃で90分間誘発さ
せた。上記のチョーダリ等（Chaudhary et al）により
記載されている方法により、ペリプラスミック画分を調
製した。OmpAシグナル配列を有しているので、90％を超
える各トキシン発現タンパクが、ペリプラズムに分泌さ
れた。これらのタンパクは、OmpAシグナル配列のプロセ
ッシング後、アミノ末端に残留ala asn leu配列が残さ
れている。ペリプラスミック画分を、ADPリボシル化活
性と細胞障害作用についてアッセイした。その後、PE変
異株を、ファルマシアFPLCシステムに付けたモノＱ（Mo
noQ）陰イオン交換カラム（HR5/5）を用いて精製した。
PE及び変異タンパクは、0.22〜0.26MのNaCl濃度で溶離
した。SDS−PAGE後のトキシンの純度は、90％を超えて
いた。タンパク濃度は、標準としてウシ血清アルブミン
を用いてブラッドフォード（Bradford）アッセイ試薬
（米国カルフォルニア州リッチモンドにあるバイオラッ
ド社製）により測定した。
ADPリボシル化及び細胞障害作用アッセイ ADPリボシル化活性を、特記しない限り4M尿素及び50m
M DTTでPE及び変異タンパクを活性化した後にアッセイ
した〔コリヤー等（Collier et al）、1971、J.Biol.Ch
em.、246、1496〜1503参照〕。PE変異株の細胞障害作用
は、上記のジンノ等、（1988）及び上記のジンノ等、
（1989）により記載されている方法準じて、ペリプラス
ミックタンパク又は精製タンパクの種々の希釈液を、24
〜2311プレートに入れた１×105個のスイス3T3細胞に添
加することにより測定した。組み換えPEと天然PE〔スイ
スのベルンにあるスイス・セラム・アンド・ワクチン・
インスティチュート（Swiss Serum and Vaccine Instit
ute）から入手〕のADP−リボシル化及び細胞障害活性
は、判別できなかった。
M DTTでPE及び変異タンパクを活性化した後にアッセイ
した〔コリヤー等（Collier et al）、1971、J.Biol.Ch
em.、246、1496〜1503参照〕。PE変異株の細胞障害作用
は、上記のジンノ等、（1988）及び上記のジンノ等、
（1989）により記載されている方法準じて、ペリプラス
ミックタンパク又は精製タンパクの種々の希釈液を、24
〜2311プレートに入れた１×105個のスイス3T3細胞に添
加することにより測定した。組み換えPEと天然PE〔スイ
スのベルンにあるスイス・セラム・アンド・ワクチン・
インスティチュート（Swiss Serum and Vaccine Instit
ute）から入手〕のADP−リボシル化及び細胞障害活性
は、判別できなかった。
トキシン活性と内在化 種々の変異PEタンパクについて、スイス細胞への3H標
識PEの結合に関する競合と、免疫螢光検査により検討さ
れる種々の変異PE誘導体の内在化に関する競合能力につ
いては、上記のジンノ等（Jinno et al）、（1989）が
記載している。
識PEの結合に関する競合と、免疫螢光検査により検討さ
れる種々の変異PE誘導体の内在化に関する競合能力につ
いては、上記のジンノ等（Jinno et al）、（1989）が
記載している。
標的特異的イムノトキシンの調製 選択的細胞障害分子を生成するためにPEのカルボキシ
ル末端にクローニング部位を有するPE発現ベクターを、
ここでは、EGF受容体担持細胞のみを認識する認識分子
であるTGFαを用いて説明する。これらのクローニング
部位を使用して、TGFαを、インサーションの後にPEの
最後の10個のアミノ酸（表Ａ参照）を続けたときに、EG
F受容体担持細胞を死滅させた極めて活性な分子を生成
したPEのカルボキシル末端付近に挿入した。この操作の
詳細を、以下に説明する。
ル末端にクローニング部位を有するPE発現ベクターを、
ここでは、EGF受容体担持細胞のみを認識する認識分子
であるTGFαを用いて説明する。これらのクローニング
部位を使用して、TGFαを、インサーションの後にPEの
最後の10個のアミノ酸（表Ａ参照）を続けたときに、EG
F受容体担持細胞を死滅させた極めて活性な分子を生成
したPEのカルボキシル末端付近に挿入した。この操作の
詳細を、以下に説明する。
結果 PEのカルボキシル末端での配列の役割を、１個、２
個、３個、７個、８個、11個、14個及び24個のアミノ酸
を除去した一連のカルボキシル末端欠失変異株を製造し
て決定した。２つ以上のアミノ酸の除去により、ADPリ
ボシル化活性に影響することなく細胞障害作用が消失し
た（表１、第１図参照）。実際に、11個のアミノ酸（60
3〜613）でさえも、ADPリボシル化活性の損失を生じる
ことなく除去できた。しかしながら、14個のアミノ酸
（600〜613）を除去したときには、低いが測定可能なAD
Pリボシル化活性を有するタンパクが生じ、そして24個
のアミノ酸（590〜613）を除去したときには、酵素的に
不活性なタンパクが生成した。これらの結果は、PEのカ
ルボキシル末端での特定の配列が、ADPリボシル化活性
には必要とされないトキシン作用において役割を果たし
ていることを示している。
個、３個、７個、８個、11個、14個及び24個のアミノ酸
を除去した一連のカルボキシル末端欠失変異株を製造し
て決定した。２つ以上のアミノ酸の除去により、ADPリ
ボシル化活性に影響することなく細胞障害作用が消失し
た（表１、第１図参照）。実際に、11個のアミノ酸（60
3〜613）でさえも、ADPリボシル化活性の損失を生じる
ことなく除去できた。しかしながら、14個のアミノ酸
（600〜613）を除去したときには、低いが測定可能なAD
Pリボシル化活性を有するタンパクが生じ、そして24個
のアミノ酸（590〜613）を除去したときには、酵素的に
不活性なタンパクが生成した。これらの結果は、PEのカ
ルボキシル末端での特定の配列が、ADPリボシル化活性
には必要とされないトキシン作用において役割を果たし
ていることを示している。
トキシンの作用におけるカルボキシル末端配列の役割
は、一連の内部欠失及び置換を生じさせることにより明
らかにした（表２参照）。これらの変異は、アミノ酸60
2で始まり、ADPリボキシル化活性には影響せず、そして
位置611まで延長された。アミノ酸601〜604と606〜608
を取り囲んでいるいくつかの小さな欠失は、細胞障害作
用を減少させなかった。さらに、アミノ酸603〜608を変
更した２つの置換だけでなく、PEのアミノ酸606〜608内
の２つの他の置換も、細胞障害作用を減少させなかっ
た。したがって、位置602〜608におけるアミノ酸の配列
は、細胞障害作用にとっては重要ではないと思われた。
しかしながら、609でアルギニンを除去した失失（pVC49
215及びpVC49255）では、PEの細胞障害作用が大きく減
少した。これらの結果を、アミノ酸612及び613の欠失が
細胞障害作用を無くしてしまうことを示している表１の
実験と考え合わせたとき、我々の注意は、PEのカルボキ
シル末端に位置しているアミノ酸609〜613に集まった。
は、一連の内部欠失及び置換を生じさせることにより明
らかにした（表２参照）。これらの変異は、アミノ酸60
2で始まり、ADPリボキシル化活性には影響せず、そして
位置611まで延長された。アミノ酸601〜604と606〜608
を取り囲んでいるいくつかの小さな欠失は、細胞障害作
用を減少させなかった。さらに、アミノ酸603〜608を変
更した２つの置換だけでなく、PEのアミノ酸606〜608内
の２つの他の置換も、細胞障害作用を減少させなかっ
た。したがって、位置602〜608におけるアミノ酸の配列
は、細胞障害作用にとっては重要ではないと思われた。
しかしながら、609でアルギニンを除去した失失（pVC49
215及びpVC49255）では、PEの細胞障害作用が大きく減
少した。これらの結果を、アミノ酸612及び613の欠失が
細胞障害作用を無くしてしまうことを示している表１の
実験と考え合わせたとき、我々の注意は、PEのカルボキ
シル末端に位置しているアミノ酸609〜613に集まった。
アルギニン609の役割は、それを欠失させるか、それ
をいくつかの異なるアミノ酸で置換させて検討した。ア
ルギニン609を別の塩基性アミノ酸であるリジンで置換
したところ、PEの細胞障害活性が保持された（表３参
照）。しかしながら、アルギニン609を欠失させたり（p
VC49115）、アルギニン609をグリシン、グルタミン酸又
はロイシンで置換したところ、細胞障害作用が約６〜10
倍減少した。このようなことから、位置609での塩基性
アミノ酸は重要であると思われる。
をいくつかの異なるアミノ酸で置換させて検討した。ア
ルギニン609を別の塩基性アミノ酸であるリジンで置換
したところ、PEの細胞障害活性が保持された（表３参
照）。しかしながら、アルギニン609を欠失させたり（p
VC49115）、アルギニン609をグリシン、グルタミン酸又
はロイシンで置換したところ、細胞障害作用が約６〜10
倍減少した。このようなことから、位置609での塩基性
アミノ酸は重要であると思われる。
PEの最後の５個のアミノ酸の配列特異性を検討するた
めに、次に、他の変異分子をいくつか構築した。これら
のうちの２つにおいては、位置610と611での酸性アミノ
酸の順序は逆であり、そしてリジン613は欠失していた
（表４、pVC49415及びpVC49425）。これらの分子は、位
置609がリジンであるかアルギニンであるかとは無関係
に、十分な活性を有していた。また、位置609にロイシ
ンを有し、位置612にアルギニンを有する分子（pVC4943
5）も生成したが、不活性であった。
めに、次に、他の変異分子をいくつか構築した。これら
のうちの２つにおいては、位置610と611での酸性アミノ
酸の順序は逆であり、そしてリジン613は欠失していた
（表４、pVC49415及びpVC49425）。これらの分子は、位
置609がリジンであるかアルギニンであるかとは無関係
に、十分な活性を有していた。また、位置609にロイシ
ンを有し、位置612にアルギニンを有する分子（pVC4943
5）も生成したが、不活性であった。
位置613の末端アミノ酸リジンの欠失は細胞障害作用
には影響しなかったが、この位置における他の変異は、
リガンドをPEのカルボキシル末端でのペプチド結合に配
置した種々のキメラトキシンが活性が低いことから、望
ましくない方法で細胞障害作用に影響を及ぼすものと思
われる。したがって、リジン613を、グルタミンか、ア
ルパラギンか、アスパラギン酸塩に転化した。これらの
変異では、全て、細胞障害作用がより小さい分子が生じ
た（表５参照）。PEのカルボキシル末端に６個か11個の
アミノ酸を追加したときも、細胞障害作用がより小さい
分子が生じた（データを示していない）。しかしなが
ら、lys613を塩基性アミノ酸であるアルギニンで置換し
たところ、細胞障害作用が減少しなかった。このような
ことから、位置609と613の両方には、十分な細胞障害活
性のために塩基性アミノ酸が必要である。PEのカルボキ
シル末端には、２つの他のリジン残基があり、これら
は、位置590及び606に位置している。これらのリジンは
両方とも、細胞障害作用に減少させることなく、非帯電
アミノ酸グルタミンに転化できた。このことは、位置59
0や606には、正に帯電したアミノ酸が必要ないことを示
している（表５参照）。
には影響しなかったが、この位置における他の変異は、
リガンドをPEのカルボキシル末端でのペプチド結合に配
置した種々のキメラトキシンが活性が低いことから、望
ましくない方法で細胞障害作用に影響を及ぼすものと思
われる。したがって、リジン613を、グルタミンか、ア
ルパラギンか、アスパラギン酸塩に転化した。これらの
変異では、全て、細胞障害作用がより小さい分子が生じ
た（表５参照）。PEのカルボキシル末端に６個か11個の
アミノ酸を追加したときも、細胞障害作用がより小さい
分子が生じた（データを示していない）。しかしなが
ら、lys613を塩基性アミノ酸であるアルギニンで置換し
たところ、細胞障害作用が減少しなかった。このような
ことから、位置609と613の両方には、十分な細胞障害活
性のために塩基性アミノ酸が必要である。PEのカルボキ
シル末端には、２つの他のリジン残基があり、これら
は、位置590及び606に位置している。これらのリジンは
両方とも、細胞障害作用に減少させることなく、非帯電
アミノ酸グルタミンに転化できた。このことは、位置59
0や606には、正に帯電したアミノ酸が必要ないことを示
している（表５参照）。
PEのカルボキシル末端での特定のアミノ酸の重要性が
示されたことから、５個のカルボキシル末端アミノ酸が
ADPリボシル化ドメインから分離されて活性トキシンを
再分化できたことが分かった。表６に示すように、無傷
PEのアミノ酸551〜613、567〜613又は598〜613をPE△60
9〜613のカルボキシル末端に付加することによって、十
分な活性のある細胞障害性分子を、PE△609〜613（細胞
障害性ではない）から生成できた。このようなことか
ら、アミノ酸600付近で終わるADPリボシル化ドメインと
位置609〜613での必須アミノ酸との間の距離は重要では
なく、そして細胞障害作用を減少させることなくかなり
増加できた。また、表６には、PREDLKの代わりにRPHMPG
DILKのカルボキシル末端を有するPE分子も示されてい
る。arg609及びasp611を変更したこの分子は、細胞障害
性ではなかった。しかしながら、無傷PE分子の最後の16
個のアミノ酸を付着させてRPHMPGDPDYASQPGKPPREDLKか
らなるカルボキシル末端を得ると、この分子の細胞障害
作用が復活した。
示されたことから、５個のカルボキシル末端アミノ酸が
ADPリボシル化ドメインから分離されて活性トキシンを
再分化できたことが分かった。表６に示すように、無傷
PEのアミノ酸551〜613、567〜613又は598〜613をPE△60
9〜613のカルボキシル末端に付加することによって、十
分な活性のある細胞障害性分子を、PE△609〜613（細胞
障害性ではない）から生成できた。このようなことか
ら、アミノ酸600付近で終わるADPリボシル化ドメインと
位置609〜613での必須アミノ酸との間の距離は重要では
なく、そして細胞障害作用を減少させることなくかなり
増加できた。また、表６には、PREDLKの代わりにRPHMPG
DILKのカルボキシル末端を有するPE分子も示されてい
る。arg609及びasp611を変更したこの分子は、細胞障害
性ではなかった。しかしながら、無傷PE分子の最後の16
個のアミノ酸を付着させてRPHMPGDPDYASQPGKPPREDLKか
らなるカルボキシル末端を得ると、この分子の細胞障害
作用が復活した。
さらに、cDNA TGFαを、不活性カルボキシル末端（表
Ａ、pVC47315/4Ef＋Ｔ）や活性カルボキシル末端（表
Ａ、pVC47355f＋Ｔ及びpVC47395f＋Ｔ）を有するPEのカ
ルボキシル末端に挿入した構築物を作成した。良好なカ
ルボキシル末端を有する構築物の、EGF受容体（TGFαは
EGF受容体に結合する）を有する細胞に対する細胞障害
作用は、不良のカルボキシル末端を有するものの50倍以
上であった。このことは、最も高い細胞障害作用を得る
には、適当なカルボキシル末端を有することが必須要件
であることを明らかに示している。
Ａ、pVC47315/4Ef＋Ｔ）や活性カルボキシル末端（表
Ａ、pVC47355f＋Ｔ及びpVC47395f＋Ｔ）を有するPEのカ
ルボキシル末端に挿入した構築物を作成した。良好なカ
ルボキシル末端を有する構築物の、EGF受容体（TGFαは
EGF受容体に結合する）を有する細胞に対する細胞障害
作用は、不良のカルボキシル末端を有するものの50倍以
上であった。このことは、最も高い細胞障害作用を得る
には、適当なカルボキシル末端を有することが必須要件
であることを明らかに示している。
ここでのデータ全体から、カルボキシル末端内の欠失
又は変更のために不活性であるPE分子の細胞障害活性
は、無傷カルボキシル末端を付着させることにより復活
できることが明らかである。したがって、TGFα等の結
合リガンドをPEのカルボキシル末端内の位置608に挿入
して、最後の５個のアミノ酸をREDLKとして保持するこ
とにより、活性キメラ分子を生成することが可能とな
る。
又は変更のために不活性であるPE分子の細胞障害活性
は、無傷カルボキシル末端を付着させることにより復活
できることが明らかである。したがって、TGFα等の結
合リガンドをPEのカルボキシル末端内の位置608に挿入
して、最後の５個のアミノ酸をREDLKとして保持するこ
とにより、活性キメラ分子を生成することが可能とな
る。
PEのドメインＩは細胞結合を生じさせる領域であるこ
とは既に明らかにされているが、細胞障害性を減少させ
たPEのカルボキシル末端での変異は、なぜ細胞結合を減
少しないのかを示すことが重要であった。これを試験す
るために、〔3H〕−PEの取り込みに関してPEの種々の変
異形態が競合する能力を評価した。第２図に示すよう
に、PEのカルボキシル末端での変異により細胞障害作用
を減少させたいくつかのPE変異株、真正の野生型PEと、
〔3H〕−PEの取り込み競合性がちょうど同じであった。
この競合アッセイにおいて、ドメインＩの欠失を有する
PE40とPeglu57は、上記したように不活性であった。
（上記のジンノ等（Jinno et al）参照）。
とは既に明らかにされているが、細胞障害性を減少させ
たPEのカルボキシル末端での変異は、なぜ細胞結合を減
少しないのかを示すことが重要であった。これを試験す
るために、〔3H〕−PEの取り込みに関してPEの種々の変
異形態が競合する能力を評価した。第２図に示すよう
に、PEのカルボキシル末端での変異により細胞障害作用
を減少させたいくつかのPE変異株、真正の野生型PEと、
〔3H〕−PEの取り込み競合性がちょうど同じであった。
この競合アッセイにおいて、ドメインＩの欠失を有する
PE40とPeglu57は、上記したように不活性であった。
（上記のジンノ等（Jinno et al）参照）。
これらの取り込みの結果は、PEや種々の変更PE分子の
内在化を測定する螢光アッセイを用いて確認した。この
アッセイは、細胞障害作用を種々のトキシンとともに30
分間培養して、内胞小水疱への結合及び内在化を行っ
た。ドメインＩにおける点変異（PEglu57）を有する分
子、即ち、PE40は、内在化しなかった。これに対して、
他の全てのPE分子は、ドメインIIIのカルボキシル末端
に変異を含んでいるかどうかとは無関係に、内胞小水疱
及び細胞の核周囲部におけるトランスゴルジ系における
他の要素への結合及び内在化することが判明した。これ
らの結果は、カルボキシル末端変異株の細胞障害作用の
減少は、PE分子の受容体結合や細胞取り込みの減少によ
るものではないことを明らかに示している。
内在化を測定する螢光アッセイを用いて確認した。この
アッセイは、細胞障害作用を種々のトキシンとともに30
分間培養して、内胞小水疱への結合及び内在化を行っ
た。ドメインＩにおける点変異（PEglu57）を有する分
子、即ち、PE40は、内在化しなかった。これに対して、
他の全てのPE分子は、ドメインIIIのカルボキシル末端
に変異を含んでいるかどうかとは無関係に、内胞小水疱
及び細胞の核周囲部におけるトランスゴルジ系における
他の要素への結合及び内在化することが判明した。これ
らの結果は、カルボキシル末端変異株の細胞障害作用の
減少は、PE分子の受容体結合や細胞取り込みの減少によ
るものではないことを明らかに示している。
ようするに、ここでの結果から、PEのカルボキシル末
端での変異及び特にPEの最後の５個のアミノ酸における
変異は、十分なADPリボシル化活性を有するが、細胞障
害作用が大きく減少した分子を生じることが明らかであ
る。データから、PEのカルボキシル末端でのアミノ酸配
列は、Arg、Glu、Asp、Leu、Lys（REDLK、表２）である
ことが明らかである。位置609でのアルギニンはリジン
で置換できるが、非塩基性アミノ酸は許容されない（表
３参照）。位置613のリジンは必須ではなく、そして欠
失しても細胞障害活性を失うことはない（表１参照）
が、非塩基性アミノ酸では置換できない（表５参照）。
即ち、ArgGluAspLeu又はLysGluAspLeuLysをカルボキシ
ル末端に有することにより、十分な細胞障害作用を有す
る分子が生成された（表４参照）。他の分子に存在し、
そして特異的生物学的作用を果たす同様な配列に関する
文献調査から、エンドプラスミック細網内の新たに形成
されたタンパクを保持する配列は、LysAspGluLeuである
ことが明らかになった。〔ムンロ等（Munro et al）、1
987、Cell、48、899〜907参照〕。したがって、他にい
くつかの変異分子を構築した。これらのうちの一つは、
エンドプラスミック細網のルーメンにおけるタンパクの
保持に寄与していると上記で説明した配列そのものを含
んでいるものである（表４参照）。LysAspGluLeu（KDE
L）で終結している分子は十分な細胞障害作用を有する
ことが判明した。また、LeuAspGluArg（LDER）ではなく
ArgAspGluLeu（RDEL）で終結している分子も、十分な活
性を有していた。これらの知見は、PEが内胞コパートメ
ントからサイトゾルにうまく侵入するには、エンドプラ
スミック細網内の細胞により製造されたタンパクを保持
するのに役立つ同様の細胞成分との相互作用が必要であ
ることを示している。また、これらの知見は、PEのカル
ボキシル末端での配列は、PEが内胞コンパートメントか
らサイトゾルに移行するのを促進するためのある種の認
識配列としての役割を果たすことも示唆している。同様
の機能を果たす他の配列も、同様に活性を増加させるで
あろう。
端での変異及び特にPEの最後の５個のアミノ酸における
変異は、十分なADPリボシル化活性を有するが、細胞障
害作用が大きく減少した分子を生じることが明らかであ
る。データから、PEのカルボキシル末端でのアミノ酸配
列は、Arg、Glu、Asp、Leu、Lys（REDLK、表２）である
ことが明らかである。位置609でのアルギニンはリジン
で置換できるが、非塩基性アミノ酸は許容されない（表
３参照）。位置613のリジンは必須ではなく、そして欠
失しても細胞障害活性を失うことはない（表１参照）
が、非塩基性アミノ酸では置換できない（表５参照）。
即ち、ArgGluAspLeu又はLysGluAspLeuLysをカルボキシ
ル末端に有することにより、十分な細胞障害作用を有す
る分子が生成された（表４参照）。他の分子に存在し、
そして特異的生物学的作用を果たす同様な配列に関する
文献調査から、エンドプラスミック細網内の新たに形成
されたタンパクを保持する配列は、LysAspGluLeuである
ことが明らかになった。〔ムンロ等（Munro et al）、1
987、Cell、48、899〜907参照〕。したがって、他にい
くつかの変異分子を構築した。これらのうちの一つは、
エンドプラスミック細網のルーメンにおけるタンパクの
保持に寄与していると上記で説明した配列そのものを含
んでいるものである（表４参照）。LysAspGluLeu（KDE
L）で終結している分子は十分な細胞障害作用を有する
ことが判明した。また、LeuAspGluArg（LDER）ではなく
ArgAspGluLeu（RDEL）で終結している分子も、十分な活
性を有していた。これらの知見は、PEが内胞コパートメ
ントからサイトゾルにうまく侵入するには、エンドプラ
スミック細網内の細胞により製造されたタンパクを保持
するのに役立つ同様の細胞成分との相互作用が必要であ
ることを示している。また、これらの知見は、PEのカル
ボキシル末端での配列は、PEが内胞コンパートメントか
らサイトゾルに移行するのを促進するためのある種の認
識配列としての役割を果たすことも示唆している。同様
の機能を果たす他の配列も、同様に活性を増加させるで
あろう。
さらに重要な知見として、細胞標的リガンドをPE分子
における２つのクローニング領域（上記したアミノ末端
又は本明細書に記載するアルボキシル末端付近）に挿入
できるので、同一又は異なる標的リガンドをこれらの２
つの領域に挿入して、細胞結合か細胞障害作用又はそれ
らの両方を増加できる。２つのクローニング領域の各々
での異なる標的分子により、キメラトキシンが同一細胞
上に存在する受容体の２つの異なる種類の受容体に結合
できる。標的細胞が十分に内在化せず、したがって、免
疫トキシンの標的としては不十分であるので、上記のこ
とは重要である。しかしながら、もしトキシンも十分な
内在化される別の抗原に結合するのであれば、特異的細
胞致死が大きく増加する。
における２つのクローニング領域（上記したアミノ末端
又は本明細書に記載するアルボキシル末端付近）に挿入
できるので、同一又は異なる標的リガンドをこれらの２
つの領域に挿入して、細胞結合か細胞障害作用又はそれ
らの両方を増加できる。２つのクローニング領域の各々
での異なる標的分子により、キメラトキシンが同一細胞
上に存在する受容体の２つの異なる種類の受容体に結合
できる。標的細胞が十分に内在化せず、したがって、免
疫トキシンの標的としては不十分であるので、上記のこ
とは重要である。しかしながら、もしトキシンも十分な
内在化される別の抗原に結合するのであれば、特異的細
胞致死が大きく増加する。
さらに、PEのカルボキシル末端の一時変異についての
検討中に、もしREDLK（単一文字アミノ酸コード）配列
をKDELで置換すると、得られる分子の活性がほぼ２倍増
加することが見出された。さらに印象的なことには、RE
DLKの代わりにKDELの３つの反復を有する分子は、活性
が３倍であることが見出された（表Ｂ参照）。このこと
は、KDEL又はそれと等価の反復配列を付加することによ
り、細胞障害性が増強されたキメラトキシンを生成でき
ることを示している。
検討中に、もしREDLK（単一文字アミノ酸コード）配列
をKDELで置換すると、得られる分子の活性がほぼ２倍増
加することが見出された。さらに印象的なことには、RE
DLKの代わりにKDELの３つの反復を有する分子は、活性
が３倍であることが見出された（表Ｂ参照）。このこと
は、KDEL又はそれと等価の反復配列を付加することによ
り、細胞障害性が増強されたキメラトキシンを生成でき
ることを示している。
要約すれば、本発明は、以下のことをはじめて明らか
にしたものである。
にしたものである。
1.PEの細胞障害作用には、適当なカルボキシル末端配列
が絶対に必要である。
が絶対に必要である。
2.PEのカルボキシル末端から２つの少ないアミノ酸を欠
失させると、ADPリボシル化及び受容体結合活性が十分
である分子が生じるが、標的細胞には非毒性である（表
１参照）。
失させると、ADPリボシル化及び受容体結合活性が十分
である分子が生じるが、標的細胞には非毒性である（表
１参照）。
3.変異分析から、PEは位置609に正に帯電したアミノ
酸、位置610と611には負に帯電したアミノ酸及び位置61
2にはロイシンを有していなければならないことが分か
った。
酸、位置610と611には負に帯電したアミノ酸及び位置61
2にはロイシンを有していなければならないことが分か
った。
4.位置613のリジンは欠失させてかまわないが、他のい
くつかのアミノ酸残基では置換できない。
くつかのアミノ酸残基では置換できない。
5.PEのカルボキシル末端に任意のアミノ酸残基を付加す
ると、比較的不活性な分子が生じる（データは示してい
ない）。
ると、比較的不活性な分子が生じる（データは示してい
ない）。
6.カルボキシル末端における変異のために細胞障害作用
がないPE分子にPEのカルボキシル末端アミノ酸を少なく
とも10個付加すると、十分な細胞障害活性が復活する
（表４参照）。
がないPE分子にPEのカルボキシル末端アミノ酸を少なく
とも10個付加すると、十分な細胞障害活性が復活する
（表４参照）。
7.異なる末端（アミノ及びカルボキシル）に異なる標的
リガンドがあると、結合及び細胞障害性PE分子を生じさ
せる柔軟性が提供される。
リガンドがあると、結合及び細胞障害性PE分子を生じさ
せる柔軟性が提供される。
8.反復「細胞障害性配列（cytotoxic sequence）」によ
り、適当な場合において細胞障害作用が何倍にもなる。
り、適当な場合において細胞障害作用が何倍にもなる。
TGFα−PE40等の変更組み換え体をはじめとした適当
な認識分子、トキシン及び細胞障害性配列を用いること
により、上記した方法と同様な他の標的特異的免疫トキ
シンが作成されることは言うまでもない。
な認識分子、トキシン及び細胞障害性配列を用いること
により、上記した方法と同様な他の標的特異的免疫トキ
シンが作成されることは言うまでもない。
本明細書中の実施例及び実施態様は本発明を説明する
目的のみで記載されているものであり、本発明の観点か
ら種々の修正及び変更が可能であり、それらの修正及び
変更が本願の精神及び範囲内並びに特許請求の範囲であ
ることは、理解されるところである。
目的のみで記載されているものであり、本発明の観点か
ら種々の修正及び変更が可能であり、それらの修正及び
変更が本願の精神及び範囲内並びに特許請求の範囲であ
ることは、理解されるところである。
備考： 変異PEタンパクは、T7プロモーターを主体としたベク
ター〔スタデア及びモファット（Studier and Moffat
t）、1986年〕を用いて大腸菌中で発現させ、ペリプラ
ズムから精製した。全てのタンパクは、OmpAシグナル配
列のプロセッシング後に残存しているアミノ末端に３個
の延長アミノ酸（ala asn leu）を含んでいる。これら
のアミノ酸は、上記の変異タンパクに残基番号を付する
ときには考慮しなかった。細胞障害作用は、スイス3T3
マウス細胞についてのタンパク合成の阻害をアッセイす
ることにより求めた。全ての結果は、組み換え全長PE分
子を用いて得られる活性の百分率で表されている。全て
のアッセイは、重複して行い、少なくとも２つの別個の
クローンを試験した。
ター〔スタデア及びモファット（Studier and Moffat
t）、1986年〕を用いて大腸菌中で発現させ、ペリプラ
ズムから精製した。全てのタンパクは、OmpAシグナル配
列のプロセッシング後に残存しているアミノ末端に３個
の延長アミノ酸（ala asn leu）を含んでいる。これら
のアミノ酸は、上記の変異タンパクに残基番号を付する
ときには考慮しなかった。細胞障害作用は、スイス3T3
マウス細胞についてのタンパク合成の阻害をアッセイす
ることにより求めた。全ての結果は、組み換え全長PE分
子を用いて得られる活性の百分率で表されている。全て
のアッセイは、重複して行い、少なくとも２つの別個の
クローンを試験した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 チョーダリー，ビジェイ アメリカ合衆国メリーランド州、ロック ビル、ナンバー 1207、ロックビル、パ イク、1001 (72)発明者 フィッツジェラルド，デイビッド アメリカ合衆国メリーランド州、シルバ ー、スプリング、ラッド、ストリート、 1731 (56)参考文献 米国特許4545985（ＵＳ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，264［26 ］Ｐ．15157−15160（1989) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，264［31 ］Ｐ．18818−18823（1989)
Claims (21)
- 【請求項１】シュードモナスエキソトキシン（PE）のア
ミノ酸残基１〜Ｘ（Ｘは603〜608のいずれかの整数を表
す）と、認識分子と、PEのカルボキシル末端の最後の10
個のアミノ酸残基を少なくとも有するアミノ酸配列と
を、アミノ末端からカルボキシル末端の方向において有
する、細胞障害性組み換えシュードモナスエキソトキシ
ン。 - 【請求項２】前記認識分子が前記標的細胞を認識する抗
体又は抗体の一部分である、請求項１に記載のPE。 - 【請求項３】前記認識分子が、成長因子、リンホカイ
ン、サイトカイン及びホルモンからなる群から選択され
るものである、請求項１に記載のPE。 - 【請求項４】Ｘが607である、請求項１に記載のPE。
- 【請求項５】シュードモナスエキソトキシン（PE）のア
ミノ酸残基１〜607と、認識分子と、PEのカルボキシル
末端の最後の10個のアミノ酸残基とを、アミノ末端から
カルボキシル末端の方向において有する、請求項１に記
載のPE。 - 【請求項６】シュードモナスエキソトキシン（PE）のア
ミノ酸残基１〜Ｘ（Ｘは603〜608のいずれかの整数を表
す）と、認識分子と、細胞障害性配列KEDL、RDELK又は
それの反復を含むアミノ酸配列とを、アミノ末端からカ
ルボキシル末端の方向において有する、細胞障害性組み
換えシュードモナスエキソトキシン。 - 【請求項７】シュードモナスエキソトキシン（PE）のア
ミノ酸残基１〜Ｘ（Ｘは603〜608のいずれかの整数を表
す）と、認識分子と、細胞障害性配列KDELKDELを含むア
ミノ酸配列とを、アミノ末端からカルボキシル末端の方
向において有する、細胞障害性組み換えシュードモナス
エキソトキシン。 - 【請求項８】シュードモナスエキソトキシン（PE）のア
ミノ酸残基１〜Ｘ（Ｘは603〜608のいずれかの整数を表
す）と、認識分子と、細胞障害性配列KDELKDELKDELを含
むアミノ酸配列とを、アミノ末端からカルボキシル末端
の方向において有する、細胞障害性組み換えシュードモ
ナスエキソトキシン。 - 【請求項９】反復細胞障害性配列が、反復配列のない分
子と比較して細胞障害作用が増強されたrPE分子を生じ
る、請求項６に記載のPE。 - 【請求項１０】細胞障害作用を生じる量の請求項１〜９
のいずれか一項に記載のPEと、薬学的に許容される担体
とを含む、組成物。 - 【請求項１１】死滅させるべき標的細胞と、細胞障害作
用を生じる量の請求項１〜９のいずれか一項に記載のPE
とを接触させることを含む、標的細胞を死滅させる方
法。 - 【請求項１２】シュードモナスエキソトキシン（PE）の
アミノ酸残基603〜608のいずれかの残基の後へ認識分子
を挿入し、その挿入部位の後のアミノ酸残基を欠失さ
せ、そしてPEのカルボキシル末端の最後の10個のアミノ
酸残基を少なくとも有するアミノ酸配列を付加すること
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞障害
性組み換えシュードモナスエキソトキシンの製造法。 - 【請求項１３】シュードモナスエキソトキシン（PE）の
アミノ酸残基603〜608のいずれかの残基の後へ認識分子
を挿入し、その挿入部位の後のアミノ酸残基を欠失さ
せ、そして細胞障害性配列を付加することを含む、請求
項６〜９のいずれか一項に記載の細胞障害性組み換えシ
ュードモナスエキソトキシンの製造法。 - 【請求項１４】シュードモナスエキソトキシン（PE）の
アミノ酸残基１〜Ｘ（Ｘは603〜608のいずれかの整数を
表す）と、標的細胞に結合する認識分子と、下記式のア
ミノ酸残基を含むカルボキシル末端配列とを、アミノ末
端からカルボキシル末端の方向において有する、組み換
えPE分子。 R1−R2−R3−R4−（R5）ｎ （上記式中、 R1が、ＲまたはＫであり、 R2は、ＥまたはＤであり、 R3は、ＤまたはＥであり、 R4は、Ｌであり、 R5は、ＫまたはＲであり、 ｎは、０または１である） - 【請求項１５】カルボキシル末端配列が、REDLK、KEDL
K、REDLR、REDLおよびKDELからなる群から選択される、
請求項14に記載の組み換えPE分子。 - 【請求項１６】カルボキシル末端配列がKDELKDELKDELで
ある、請求項14に記載の組み換えPE分子。 - 【請求項１７】認識分子が標的細胞を認識する抗体また
は抗体の一部である、請求項14に記載の組み換えPE分
子。 - 【請求項１８】認識分子が成長因子、リンホカイン、サ
イトカイン、およびホルモンからなる群から選択される
ものである、請求項14に記載の組み換えPE分子。 - 【請求項１９】認識分子がTGFαである、請求項14に記
載の組み換えPE分子。 - 【請求項２０】認識分子がPE分子の残基607の後に挿入
された、請求項14に記載の組み換えPE分子。 - 【請求項２１】薬学的に許容される担体と、請求項14〜
20のいずれか一項に記載の組み換えPE分子とを含む、細
胞障害性組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45963590A | 1990-01-02 | 1990-01-02 | |
| US459,635 | 1990-01-02 | ||
| PCT/US1990/007421 WO1991009949A1 (en) | 1990-01-02 | 1990-12-27 | Target-specific, cytotoxic, recombinant pseudomonas exotoxin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05502032A JPH05502032A (ja) | 1993-04-15 |
| JP2610740B2 true JP2610740B2 (ja) | 1997-05-14 |
Family
ID=23825594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3504333A Expired - Lifetime JP2610740B2 (ja) | 1990-01-02 | 1990-12-27 | 標的特異的細胞障害性組み換えシュードモナスエキソトキシン |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0509056A4 (ja) |
| JP (1) | JP2610740B2 (ja) |
| AU (1) | AU644139B2 (ja) |
| CA (1) | CA2072891C (ja) |
| WO (1) | WO1991009949A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU631200B2 (en) * | 1989-02-17 | 1992-11-19 | Merck & Co., Inc. | Production of modified pe40 |
| US5458878A (en) * | 1990-01-02 | 1995-10-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | P. exotoxin fusio proteins have COOHG220101al alterations which increase cytotoxicity |
| NZ237758A (en) * | 1990-04-17 | 1992-12-23 | Shell Int Research | (phenylalkyl) triphenylphosphonium salt derivatives and fungicidal compositions |
| DE69131449T2 (de) * | 1990-05-11 | 1999-11-25 | Us Health | Verbesserte exotoxine aus pseudomonas mit geringer toxität bei tieren und hoher zelltötender aktivität |
| PT2829283T (pt) | 2003-04-30 | 2017-09-08 | Univ Zuerich | Método para tratamento do cancro utilizando uma imunotoxina |
| US8932586B2 (en) | 2011-09-06 | 2015-01-13 | Intrexon Corporation | Modified forms of Pseudomonas exotoxin A |
| WO2016146833A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance |
| EP3184547A1 (en) | 2015-10-29 | 2017-06-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Anti-tpbg antibodies and methods of use |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4545985A (en) * | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
| US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
| US5458878A (en) * | 1990-01-02 | 1995-10-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | P. exotoxin fusio proteins have COOHG220101al alterations which increase cytotoxicity |
-
1990
- 1990-12-27 CA CA002072891A patent/CA2072891C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-27 JP JP3504333A patent/JP2610740B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-27 AU AU72424/91A patent/AU644139B2/en not_active Ceased
- 1990-12-27 EP EP19910904103 patent/EP0509056A4/en not_active Withdrawn
- 1990-12-27 WO PCT/US1990/007421 patent/WO1991009949A1/en not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６４［２６］Ｐ．１５１５７−１５１６０（１９８９） |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６４［３１］Ｐ．１８８１８−１８８２３（１９８９） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2072891C (en) | 1999-12-21 |
| EP0509056A4 (en) | 1993-02-17 |
| WO1991009949A1 (en) | 1991-07-11 |
| EP0509056A1 (en) | 1992-10-21 |
| AU7242491A (en) | 1991-07-24 |
| CA2072891A1 (en) | 1991-07-03 |
| JPH05502032A (ja) | 1993-04-15 |
| AU644139B2 (en) | 1993-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3188265B2 (ja) | 標的特異的細胞障害性組換えシュードモナスエキソトキシン | |
| Chaudhary et al. | Pseudomonas exotoxin contains a specific sequence at the carboxyl terminus that is required for cytotoxicity. | |
| EP0583794B1 (en) | Recombinant pseudomonas exotoxin: construction of an active immunotoxin with low side effects | |
| US5705156A (en) | Psuedomonas exotoxins of low animal toxicity and high cytocidal activity | |
| Pizza et al. | Subunit S1 of pertussis toxin: mapping of the regions essential for ADP-ribosyltransferase activity. | |
| AU665360B2 (en) | Epidermal growth factor receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis | |
| Theuer et al. | Immunotoxins made with a recombinant form of Pseudomonas exotoxin A that do not require proteolysis for activity | |
| JP2003508010A (ja) | 多数変異型ジフテリア毒素ワクチン | |
| Prior et al. | Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol | |
| JP2610740B2 (ja) | 標的特異的細胞障害性組み換えシュードモナスエキソトキシン | |
| JPH09503751A (ja) | 細胞毒性抱合体の単一起源性製剤 | |
| JP4007516B2 (ja) | 遺伝学的に操作されたグルタミナーゼ、および抗ウイルスと抗ガン治療におけるその使用 | |
| Chaudhary et al. | A proper amino terminus of diphtheria toxin is important for cytotoxicity | |
| JPH07507926A (ja) | サポリン含有タンパク質の組換え産生 | |
| Debinski et al. | An immunotoxin with increased activity and homogeneity produced by reducing the number of lysine residues in recombinant Pseudomonas exotoxin | |
| Nicholls et al. | The structure of Pseudomonas exotoxin A as a guide to rational design | |
| AU696349B2 (en) | Methods for peptide synthesis and purification | |
| RU2144957C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPINS07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА | |
| Debinski et al. | Substitution of foreign protein sequences into a chimeric toxin composed of transforming growth factor a and Pseudomonas exotoxin | |
| ETA | The Structure of Pseudomonas Exotoxin A as a Guide to Rational Design | |
| ETA | I. BASIC STRUCTURE AND MECHANISM OF ACTION | |
| Zhang et al. | Fusion protein of interleukin 4 and diphtherial toxin with high cytotoxicity to cancer cells | |
| West | Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A: Structure/function, production, and intoxication of eukaryotic cells |