BR112020001653A2 - anticorpos anti-sirp-alfa e métodos relacionados - Google Patents

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Abstract

Anticorpos anti-SIRPa, incluindo anticorpos multi-específicos anti-SIRPa, são fornecidos, assim como composições e métodos relacionados.Os anticorpos da divulgação se ligam a SIRPa e podem bloquear a interação de CD47 em uma célula com SIRPa em uma célula fagocítica.

Description

ANTICORPOS ANTI-SIRP-AFA E MÉTODOS RELACIONADOS REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US N° 62/537.207, depositado em 26 de julho de 2017, que é incorporado neste documento na sua totalidade por referência para todos os fins.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[0002] O pedido do momento contém uma Listagem de Sequência que foi submetida via EFS-Web e está incorporado em sua totalidade por este meio para referência. A referida cópia em ASCII, criada no mês XX, 20XX, é denominada XXXXXUS_sequencelisting.txt e tem Χ,ΧΧΧ,ΧΧΧ bytes de tamanho.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0003] A rotatividade das células começa com a indução de um programa apoptótico ou outras alterações celulares que as marcam para remoção e o subsequente reconhecimento de marcadores pelos fagócitos, incluindo macrófagos, células dendríticas e similares. Esse processo requer uma remoção específica e seletiva de células indesejadas. Diferentemente das células saudáveis, as células indesejadas/envelhecidas/moribundas exibem marcadores ou ligantes chamados sinais "eat me", ou seja, "altered self", que por sua vez podem ser reconhecidos pelos receptores nos fagócitos. As células saudáveis podem exibir sinais "don’t eat me" que inibem ativamente a fagocitose; esses sinais são desregulados nas células agonizantes, estão presentes em uma conformação alterada ou são substituídos pela regulação positiva dos sinais "eat me" ou pró-fagocitários. A proteína CD47 da superfície celular em células saudáveis e envolvimento dela com um receptor de fagócito, SIRP, constituem um sinal-chave "eat me" que pode desativar o envolvimento mediado por várias modalidades, incluindo depuração celular apoptótica e fagocitose mediada por FcR. O bloqueio do envolvimento mediado por CD47 de SIRP em um fagócito pode causar a remoção de células vivas que contêm sinais de "eat me".
[0004] CD47 é uma glicoproteína transmembranar amplamente expressa com um único domínio semelhante a Ig e cinco regiões abrangendo a membrana, que funciona como um ligante celular para SIRP com ligação mediada através do domínio semelhante a V do terminal NH2 de SIRP . SIRP é expresso principalmente em células mieloides, incluindo macrófagos, granulócitos, células dendríticas mieloides (DCs), mastócitos e seus precursores, incluindo células- tronco hematopoiéticas. Determinantes estruturais do SIRP que mediam a ligação ao CD47 são discutidos por Lee et al. (2007) J. Immunol. 179:7741-7750; Hatherley et al. (2007) JBC 282: 14567-75; e o papel da dimerização de SIRP cis na ligação a CD47 é discutido por Lee et al. (2010) J.B.C. 285:37953-63. De acordo com o papel do CD47 na inibição da fagocitose de células normais, há evidências de que ele é regulado transitoriamente em células-tronco hematopoiéticas (HSCs) e progenitores imediatamente antes e durante a fase migratória, e que o nível de CD47 nessas células determina a probabilidade de serem engolidos in vivo.
SUMÁRIO
[0005] É divulgado neste documento um anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado que: liga especificamente SIRP humano; não liga especificamente SIRP humano; e opcionalmente compreende uma região Fc humana compreendendo pelo menos uma modificação que reduz a ligação a um receptor Fc humano.
[0006] Em alguns aspectos, o anticorpo compreende: uma CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1; uma CDR-H2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma CDR-H3 compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3; uma CDR-L1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4; uma CDR-L2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5; e uma CDR-L3 compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6; ou uma CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 9; uma CDR-H2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10; uma CDR-H3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 11; uma CDR-L1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 12; uma CDR-L2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 13; e uma CDR-L3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 14.
[0007] Em alguns aspectos, o anticorpo compreende: uma sequência VH da SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 8; ou uma sequência VH da SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL da SEQ ID NO:16.
[0008] Em alguns aspectos, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 18; ou uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 20.
[0009] Também neste documento divulgado é um anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado, compreendendo: uma CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1; uma CDR-H2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma CDR-H3 compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3; uma CDR-L1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4; uma CDR-L2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5; e uma CDR-L3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6.
[0010] Também é divulgado neste documento um anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado, compreendendo: uma sequência VH da SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 8.
[0011] Também é divulgado neste documento um anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado, compreendendo: uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 18.
[0012] Também é divulgado neste documento um anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado, compreendendo: uma CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 9; uma CDR-H2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10; uma CDR-H3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 11; uma CDR-L1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 12; uma CDR-L2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 13; e uma CDR-L3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 14.
[0013] Também é divulgado neste documento um anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado, compreendendo: uma sequência VH da SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 16.
[0014] Também é divulgado neste documento um anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado, compreendendo: uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 20.
[0015] Em alguns aspectos, um anticorpo divulgado neste documento compreende uma região Fc humana compreendendo pelo menos uma modificação que reduz a ligação a um receptor Fc humano.
[0016] Em alguns aspectos, um anticorpo divulgado neste documento: (a) compete pela ligação ao SIRP humano com um anticorpo selecionado de 1H9 e 3C2; (b) não compete pela ligação ao SIRP humano com o anticorpo KWar; (c) compete parcialmente pela ligação ao SIRP humano com o anticorpo KWar; (d) inibe a ligação do CD47 humano ao SIRP humano; (e) inibe a ligação de SP-A humana ao SIRP humano; (f) inibe a ligação de SP-D humana ao SIRP humano; (g) liga-se ao SIRP de macaco Rhesus; (h) se liga ao SIRP de cinomolgo (i) aumenta a fagocitose em relação ao controle; ou (j) é capaz de qualquer combinação de (a)-(i).
[0017] Em alguns aspectos, um anticorpo divulgado neste documento é pan- específico para isotipos de SIRP humanos. Um anticorpo divulgado neste documento, como 1H9, pode se ligar a vários isotipos de SIRP humanos, incluindo um ou mais de V1, V2 e V1/V5. Um anticorpo divulgado neste documento pode se ligar a cada um dos isotipos humanos de SIRP V1 e V2. Um anticorpo divulgado neste documento pode se ligar ao isotipo SIRP humano V1, incluindo homozigoto. Um anticorpo divulgado neste documento pode se ligar ao isotipo SIRP humano V2, incluindo homozigoto. Um anticorpo divulgado neste documento pode se ligar aos isotipos SIRP humanos V1/V5 (heterozigotos). Um anticorpo divulgado neste documento, como 1H9, pode se ligar a vários isotipos de SIRP humanos, incluindo cada um de V1, V2 e V1/V5. Tais anticorpos podem incluir 1H9 e 3C2. A ligação às variantes de SIRP humanas pode ser medida utilizando ensaios conhecidos na técnica, incluindo PCR e/ou citometria de fluxo. Por exemplo, uma determinada amostra pode ser genotipada para determinar o status do SIRP e a ligação ao SIRP pode ser determinada usando citometria de fluxo.
[0018] Em alguns aspectos, um anticorpo divulgado neste documento é específico para um isotipo SIRP humano.
[0019] Em alguns aspectos, o SIRP humano é expresso em uma célula apresentadora de antígeno profissional. Em alguns aspectos, o SIRP humano é expresso em um macrófago.
[0020] Um anticorpo divulgado neste documento, como 1H9, pode se ligar ao SIRP humano na superfície celular. A ligação de um anticorpo divulgado neste documento ao SIRP pode ser estável, por exemplo, para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou superior a 24 horas. Um anticorpo divulgado neste documento pode evitar internalização substancial após a ligação ao SIRP . Tais anticorpos podem incluir 1H9 e 3C2, incluindo versões humanizadas e/ou modificadas por Fc de tais anticorpos. A ligação ao SIRP humano pode ser medida usando ensaios conhecidos na técnica, incluindo citometria de fluxo e/ou IHC.
[0021] Em alguns aspectos, o anticorpo é 1H9 ou 3C2.
[0022] Em alguns aspectos, a região Fc humana é IgG1 ou IgG4, opcionalmente modificada com uma modificação.
[0023] Em alguns aspectos, a glicosilação do anticorpo é reduzida por desglicosilação enzimática, expressão em um hospedeiro bacteriano ou modificação de um resíduo de aminoácido utilizado para a glicosilação. Em alguns aspectos, uma modificação divulgada neste documento reduz a glicosilação da região Fc humana. Em alguns aspectos, a modificação da região Fc humana compreende uma modificação na asparagina na posição de índice da UE 297. Em alguns aspectos, a modificação da região Fc humana compreende uma substituição de aminoácidos na asparagina na posição de índice da UE 297. Em alguns aspectos, a modificação da região Fc humana compreende uma substituição de aminoácidos N297A, numerada de acordo com o índice da UE. Em alguns aspectos, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em: N297A; L234A/L235A; C220S/C226S/C229S/P238S; C226S/C229S/E3233P/L234V/L235A; ou L234F/L235E/P331S, numeração de acordo com o índice da UE. Em alguns aspectos, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em: N297; L234/L235; C220/C226/C229/P238; C226/C229/E3233/L234/L235; ou L234/L235/P331, numeração de acordo com o índice da UE. Em alguns aspectos, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região CH2 nas posições de índice da EU 234, 235 e/ou 237. Em alguns aspectos, a modificação compreende uma ou ambas as substituições de aminoácidos L234A e L235A e, opcionalmente, P331S e/ou K322A e/ou G237A, numeradas de acordo com o índice da UE. Em alguns aspectos, a modificação compreende a substituição de aminoácidos K322A, numerada de acordo com o índice da UE. Em alguns aspectos, a modificação compreende E233P/L234V/L235A/G236 + A327G/A330S/P331S, numerada de acordo com o índice da UE.
[0024] Em alguns aspectos, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[0025] Em alguns aspectos, o anticorpo é multiespecífico. Em alguns aspectos, o anticorpo se liga a mais de um antígeno ou a mais de um epítopo em um único antígeno.
[0026] Em alguns aspectos, o anticorpo compreende a região constante de cadeia pesada de uma classe selecionada dentre IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada da classe IgG e uma subclasse selecionada de IgG1, IgG4, IgG2 e IgG3.
[0027] Em alguns aspectos, o anticorpo liga SIRP humano com um KD menor ou igual a cerca de 1, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 x10-9 M conforme medido pelo ensaio Biacore.
[0028] Em alguns aspectos, um anticorpo divulgado neste documento é para uso como um medicamento. Em alguns aspectos, um anticorpo divulgado neste documento é para uso no tratamento de um câncer ou infecção. Em alguns aspectos, um anticorpo divulgado neste documento é para uso no tratamento de um câncer, em que o câncer é selecionado a partir de um tumor sólido e um tumor hematológico. Em alguns aspectos, um anticorpo divulgado neste documento é para uso no aumento da fagocitose.
[0029] Também é divulgado neste documento um anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado que compete pela ligação ao SIRP humano com um anticorpo divulgado neste documento.
[0030] Também é divulgado neste documento um anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado que se liga ao epítopo SIRP humano ligado por um anticorpo divulgado neste documento.
[0031] Também é divulgado neste documento um polinucleotídeo isolado ou conjunto de polinucleotídeos que codificam um anticorpo isolado divulgado neste documento, uma VH deste, uma VL deste, uma cadeia leve deste, uma cadeia leve deste, uma cadeia pesada deste ou uma porção de ligação ao antígeno deste.
[0032] Também é divulgado neste documento um vetor ou conjunto de vetores compreendendo um polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos divulgados neste documento.
[0033] Também é divulgada neste documento uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos divulgados neste documento ou um vetor ou conjunto de vetores divulgados neste documento.
[0034] Também é divulgado neste documento um método de produção de um anticorpo que compreende expressar o anticorpo com uma célula hospedeira divulgada neste documento e isolar o anticorpo expresso.
[0035] Também é divulgada neste documento uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo divulgado neste documento e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0036] Também é divulgado neste documento um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição em um sujeito em necessidade deste, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um anticorpo divulgado neste documento ou de uma composição farmacêutica divulgada neste documento.
[0037] Em alguns aspectos, a doença ou condição é: câncer; infecção; uma infecção viral; uma infecção bacteriana; uma infecção fúngica; fibrose; arteriosclerose; uma infecção parasitária, opcionalmente malária; e depleção ou redução de células-tronco endógenas formadoras de sangue da medula óssea para permitir radiação e/ou quimioterapia - condicionamento livre ou reduzido para transplante de células-tronco formadoras de sangue, opcionalmente em combinação com o anticorpo anti-CKIT (CD117).
[0038] Em alguns aspectos, a doença ou condição é um câncer, e o câncer é selecionado a partir de um tumor sólido e um tumor hematológico.
[0039] Também é divulgado neste documento um método para aumentar a fagocitose em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo divulgado neste documento ou uma composição farmacêutica divulgada neste documento.
[0040] Também é divulgado neste documento um método de modular uma resposta imune em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo divulgado neste documento ou uma composição farmacêutica divulgada neste documento.
[0041] Em alguns aspectos, um método divulgado neste documento compreende ainda a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ao sujeito.
[0042] Em alguns aspectos, o agente terapêutico adicional é um anticorpo. Em alguns aspectos, o agente terapêutico adicional é um anticorpo que liga uma proteína ou proteínas na superfície celular de um tumor. Em alguns aspectos, o agente terapêutico adicional é um anticorpo que liga: HER2 (ERBB2/neu), CD52, PD-L1, VEGF, CD30, EGFR, CD38, RANKL (CD254), GD2 (gangliosídeo), SLAMF7 (CD319), CD20, EGFR, PDGFRa, VEGFR2, CD33, CD44, CD99, CD96, CD90, CD133, CKIT (CD117 para tumores CKIT positivos); CTLA-4, PD-1, PD-L1, CD40 (agonístico), LAG3 (CD223), 41BB (CD137 agonístico), OX40 (CD134, agonístico); e/ou CKIT (CD117) para depletar células-tronco formadoras de sangue para terapia de transplante. Em alguns aspectos, o agente terapêutico adicional é pelo menos um de: Rituximabe, Cetuximabe, Alemtuzumabe (CD52), Atezolizumabe (PD-L1), Avelumabe (PD-L1), Bevacizumabe (VEGF), Brentuximabe (CD30), Daratumumabe (CD38), Denosumabe (RANKL), Dinutuximabe (GD2), Elotuzumabe (SLAMF7), Ibritumomabe (CD20), Ipilimumabe (CTLA-4), Necitumumabe (EGFR), Nivolumabe (PD-1), Obinutuzumabe (CD20), Ofatumumabe (CD20), Olaratumabe (PDGFRa), Panitumumabe (EGFR), Pembrolizumabe (PD-1), Pertuzumabe (HER2), Ramucirumabe (VEGFR2), Tositumomabe (CD20), e Gemtuzumabe (CD33).
[0043] Em alguns aspectos, o agente terapêutico adicional é formulado na mesma composição farmacêutica que o anticorpo. Em alguns aspectos, o agente terapêutico adicional é formulado em uma composição farmacêutica diferente do anticorpo.
[0044] Em alguns aspectos, o agente terapêutico adicional é administrado antes da administração do anticorpo. Em alguns aspectos, o agente terapêutico adicional é administrado após a administração do anticorpo. Em alguns aspectos, o agente terapêutico adicional é administrado simultaneamente com o anticorpo.
[0045] Também é divulgado neste documento um kit compreendendo um anticorpo divulgado neste documento ou uma composição farmacêutica divulgada neste documento; e instruções de uso.
BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISTAS DAS FIGURAS
[0046] Estes e outros aspectos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão mais compreensíveis no tocante à descrição que se segue, e às figuras em anexo, onde:
[0047] Figura 1. Sequências de regiões variáveis de cadeia pesada (A) e leve (B) de 1H9. CDRs estão sublinhadas.
[0048] Figura 2. Sequências de região variável de cadeia pesada (A) e leve (B) de 3C2. CDRs estão sublinhadas.
[0049] Figura 3. 1H9 e 3C2 reconhecem epítopos distintos. (A) A proteína de fusão SIRPa-Fc foi revestida em uma placa de 96 poços e incubada com 1H9 ou 3C2 na ausência ou presença de quantidades 50 ou 100 vezes excessivas de Kwar de camundongo. (B) A proteína de fusão SIRPa-Fc foi revestida em uma placa de 96 poços e incubada com camundongo 1H9 na ausência ou presença de quantidades excessivas de 5, 10, 50 e 100 vezes de 1H9 ou 3C2. (C) A proteína de fusão SIRPa-Fc foi revestida em uma placa de 96 poços e incubada com camundongo 3C2 na ausência ou presença de quantidades excessivas de 5, 10, 50 e 100 vezes de 3C2 ou 1H9.
[0050] Figura 4. 1H9 e 3C2 sinergizam com o rituximabe para promover a fagocitose mediada por macrófagos das células Raji. Os macrófagos foram diferenciados dos monócitos do doador A (A) e doador B (B) na presença de soro humano por 7 dias. As células Raji foram marcadas com CFSE e incubadas com os macrófagos na presença de 10 µg/ml de rituximabe isoladamente ou em combinação com 10 µg/ml de 1H9-G4, 1H9-G1, 3C2-G4 ou 3C2-G1. Duas horas depois, a percentagem de fagocitose foi calculada por análise por citometria de fluxo, procurando GFP + macrófagos.
[0051] Figura 5. Sequências de regiões variáveis de cadeia pesada (A) e leve (B) de 1H9 humanizados. CDRs estão sublinhadas.
[0052] Figura 6. Sequências de região variável de cadeia pesada (A) e leve (B) de 3C2 humanizados. CDRs estão sublinhadas.
[0053] Figura 7. 1H9 e 3C2 humanizados possuem a mesma especificidade de ligação ao antígeno que seus anticorpos parentais. (A) A proteína de fusão
SIRPa-Fc foi revestida em uma placa de 96 poços e incubada com camundongo 1H9 na ausência ou presença de quantidades excessivas de 5, 10, 50 e 100 vezes de 1H9 humanizados. (B) A proteína de fusão SIRPa-Fc foi revestida em uma placa de 96 poços e incubada com camundongo 3C2 na ausência ou presença de quantidades excessivas de 5, 10, 50 e 100 vezes de 3C2 humanizados.
[0054] Figura 8. Medição de afinidade Biacore de 1H9 e 3C2 humanizado.
[0055] Figura 9. 1H9 e 3C2 humanizados sinergizam com anticorpos terapêuticos para promover fagocitose. (A) As células Raji foram marcadas com CFSE e incubadas com macrófagos derivados de monócitos humanos na presença de 10 µg/ml de rituximab3 isoladamente ou em combinação com 10 µg/ml de Hu1H9-G1 ou Hu3C2-G1. (B) as células HT29 foram marcadas com CFSE e incubadas com macrófagos derivados de monócitos humanos na presença de 0,1 µg/ml de cetuximabe isoladamente ou em combinação com 0,5 µg/ml, 5 µg/ml e 10 µg/ml de Hu1H9-G1 ou Hu3C2-G1. Duas horas depois, a percentagem de fagocitose foi calculada por análise por citometria de fluxo, procurando GFP + macrófagos.
[0056] Figura 10. Reatividade cruzada para SIRPB e SIRPG. (A) A ligação de Kwar, 1H9 e 3C2 à proteína de fusão SIRPB-His humana foi determinada por ELISA. (B) A ligação de Kwar, 1H9 e 3C2 à proteína de fusão SIRPG-His humana foi determinada por ELISA.
[0057] Figura 11. 9B11 e 7E11 sinergizam com o rituximabe para promover a fagocitose mediada por macrófagos das células Raji.
[0058] Figura 12. Ligação ao epítopo 7E11 e 9B11. 7E11 reconhece um epítopo sobreposto em comparação com Kwar (semelhante a 3C2) e 9B11 reconhece um epítopo muito semelhante ou idêntico em comparação com Kwar.
[0059] Figura 13. Hu1H9-G1 se liga a variantes V1 e V2 de SIRPa em células.
[0060] Figura 14. Hu1H9-G1 bloqueia a ligação de CD47 a monócitos de diferentes doadores.
[0061] Figura 15. Hu1H9-G1 sincroniza com Cetuximabe para promover a fagocitose em diferentes doadores.
DESCRIÇÃO DETALHADA Definições
[0062] Salvo indicação em contrário, todos os termos da técnica, notações e outros científicos ou terminologia utilizados neste documento são destinados a ter os significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica. Em alguns casos, termos com significados comumente compreendidos são definidos neste documento para fins de esclarecimento e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais definições neste documento necessariamente não deve ser interpretada para representar uma diferença sobre o que é geralmente entendido na técnica. As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados neste documento são geralmente bem entendidos e comumente empregados utilizando metodologias convencionais pelos versados na técnica, como, por exemplo, as metodologias de clonagem molecular amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed. (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Conforme apropriado, os procedimentos que envolvem o uso de kits e reagentes disponíveis no mercado geralmente são realizados de acordo com os protocolos e condições definidos pelo fabricante, a menos que indicado de outra forma.
[0063] Conforme usado neste documento, as formas singulares "um", "uma e "o(a)" incluem as formas do plural referentes, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Os termos "incluem", "tal como" e similares têm como objetivo transmitir inclusão sem limitação, a menos que seja indicado de outra forma.
[0064] Como usado neste documento, o termo "compreendendo" também inclui especificamente modalidades "consistindo em" e "consistindo essencialmente em" os elementos recitados, a menos que especificamente indicado de outra forma. Por exemplo, um anticorpo multiespecífico "compreendendo um diabody" inclui um anticorpo multiespecífico "consistindo em um diabody" e um anticorpo multiespecífico "consistindo essencialmente em um diabody."
[0065] O termo "cerca de" indica e abrange um valor indicado e um intervalo acima e abaixo desse valor. Em certas modalidades, o termo "cerca de" indica o valor designado ± 10%, ± 5% ou ± 1%. Em certas modalidades, quando aplicável, o termo "cerca de" indica o(s) valor(es) designado(s) ± um desvio padrão desse(s)
valor(es).
[0066] SIRPα1 (PTPNS1, SHPS1), é uma glicoproteína transmembranar, expressa principalmente em células mieloides e neuronais. SIRPα interage com a proteína de membrana amplamente distribuída CD47. Além do SIRP, existem duas proteínas estreitamente relacionadas na família SIRP: SIRP e SIRP. Todos os três têm três domínios de superfamília de imunoglobulina (IgSF) em sua região extracelular. Nos seres humanos, a proteína SIRPα é encontrada em duas formas principais. Uma forma, a variante 1 ou V1, tem a sequência de aminoácidos estabelecida como NCBI RefSeq NP_542970.1 (os resíduos 27-504 constituem a forma madura). Outra forma, a variante 2 ou V2, difere em 13 aminoácidos e tem a sequência de aminoácidos estabelecida no GenBank como CAA71403.1 (os resíduos 30-504 constituem a forma madura). Essas duas formas de SIRPα constituem cerca de 80% das formas de SIRPα presentes nos seres humanos, e ambas são adotadas neste documento pelo termo "SIRPα humano". Também adotadas pelo termo "SIRPα humano" estão as formas secundárias menores que são endógenas para os seres humanos e têm a mesma propriedade de desencadear a transdução de sinal através de CD47 após a ligação a elas. Sequências de variantes SIRPa humanos podem ser acessadas através de bancos de dados públicos, incluindo números de acesso ao Genbank: ref|NP_542970.1; gb|EAX10606.1; ref|XP_005260726.1; gb|EAX10606.1; XP_005260726.1; gb|EAX10611.1; gb|EAX10609.1; dbj|BAA12974.1; gb|AAH26692.1; ref|XP_011527475.1. Ver, por exemplo Lee et al. (2007) J. Immunol. 179(11):7741- 7750; especificamente neste documento incorporado por referência.
[0067] Anticorpos que se ligam especificamente ao SIRP humano são conhecidos e utilizados na técnica e podem ser adaptados pelo uso de uma região Fc manipulada como divulgado neste documento. Anticorpos exemplares incluem aqueles descritos no pedido de patente internacional WO 2015/138600; no pedido US publicado 2014/0242095 (University Health Networks); pedido publicado CN103665165 (JIANGSU KUANGYA BIOLOGICAL MEDICAL SCIENCE & TECHNOLOGY); Zhao XW et al. Proc Natl Acad Sci USA 108: 18342-7 (2011), cada um neste documento especificamente incorporado por referência. Um anticorpo anti-SIRP pode ser específico de pan, isto é, a ligação a duas ou mais isoformas SIRP humanas diferentes; ou pode ser específico para uma isoforma. Por exemplo, o anticorpo 1.23A descrito por Zhang et al., supra, é relatado como sendo específico para a variante SIRP1, enquanto o anticorpo 12C4 é específico de pan. Os anticorpos anti-SIRP também podem ser específicos para SIRP e não possuem ligação a SIRP e/ou SIRP. Os anticorpos anti-SIRPa podem ser específicos de pan em relação a SIRP e/ou SIRP
[0068] O termo "imunoglobulina" refere-se a uma classe de proteínas estruturalmente relacionadas, geralmente compreendendo dois pares de cadeias polipeptídicas: um par de cadeias leves (L) e um par de cadeias pesadas (H). Em uma "imunoglobulina intacta", todas as quatro dessas cadeias são interconectadas por ligações dissulfeto. A estrutura de imunoglobulina tem sido bem caracterizado. Ver, por exemplo, Paul, Fundamental Immunology, 7a ed., Cap. 5 (2013), Lippincott Williams; Wilkins, Filadélfia, PA. Resumidamente, cada cadeia pesada compreende tipicamente uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH). A região constante de cadeia pesada compreende tipicamente três domínios CH1, CH2, e CH3 abreviados. Cada cadeia leve compreende tipicamente uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende tipicamente um domínio CL abreviado.
[0069] O termo "anticorpo" é usado neste documento em seu sentido mais amplo e inclui certos tipos de moléculas de imunoglobulina compreendendo um ou mais domínios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a um antígeno ou epítopo. Um anticorpo inclui especificamente anticorpos intactos (por exemplo, imunoglobulinas intactas), fragmentos de anticorpos e anticorpos multiespecíficos. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma estrutura em andaime alternativo. Em algumas modalidades, o anticorpo consiste em uma estrutura de andaime alternativo. Em algumas modalidades, o anticorpo consiste essencialmente em uma estrutura de andaime alternativo. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo consiste de um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo consiste essencialmente em um fragmento de anticorpo. Um "anticorpo SIRP-ALPHA", "anticorpo anti-SIRP-ALPHA" ou "anticorpo específico para SIRP-ALPHA" é um anticorpo, conforme fornecido neste documento, que se liga especificamente ao antígeno SIRP-ALPHA. Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se ao domínio extracelular do SIRP-ALPHA. Em certas modalidades, um anticorpo SIRP-ALPHA fornecido neste documento se liga a um epítopo de SIRP-ALPHA que é conservado entre ou entre proteínas SIRP- ALPHA de diferentes espécies.
[0070] O termo "estrutura em andaime" refere-se a uma molécula na qual uma ou mais regiões podem ser diversificadas para produzir um ou mais domínios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a um antígeno ou epítopo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno liga o antígeno ou epítopo com especificidade e afinidade semelhantes à de um anticorpo. Exemplos de estruturas alternativas incluem aquelas derivadas de fibronectina (por exemplo, AdnectinsTM), β-sanduíche (por exemplo, iMab), lipocalina (por exemplo, Anticalins®), EETI-II/AGRP, BPTI/LACI-D1/ITI-D2 (por exemplo, Domínios de Kunitz), aptâmeros de peptídeos de tioredoxina, proteína A (por exemplo, Affibody®), repetições de anquirina (por exemplo, DARPins), gama-B-cristalina/ubiquitina (por exemplo, Affilins), CTLD3 (por exemplo, tetranectinas), Finômeros e (módulo LDLR- A) (por exemplo, Avimers). Informação adicional de estrutura em andaime alternativo é fornecida em Binz et al., Nat. Biotechnol., 2005 23:1257-1268; Skerra, Current Opin. in Biotech., 2007 18:295-304; e Silacci et al., J. Biol. Chem., 2014, 289: 14392-14398; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Uma estrutura em andaime alternativa é um tipo de anticorpo.
[0071] O termo "domínio de ligação ao antígeno" significa a porção de um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno ou epítopo. Um exemplo de um domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno formado por um dímero VH -VL de um anticorpo. Outro exemplo de um domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno formado pela diversificação de certos loops do décimo domínio da fibronectina tipo III de uma Adnectina. Um domínio de ligação ao antígeno pode incluir CDRs 1, 2 e 3 de uma cadeia pesada nessa ordem; e CDRs 1, 2 e 3 de uma cadeia leve nessa ordem.
[0072] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são utilizados neste documento indiferentemente para se referir a um anticorpo com uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo que ocorre naturalmente e com cadeias pesadas que compreendem uma região Fc. Por exemplo, quando usado para se referir a uma molécula de IgG, um "anticorpo de comprimento total" é um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves.
[0073] O termo "região Fc" ou "Fc" significa a região Terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina que, em anticorpos que ocorrem naturalmente, interage com os receptores Fc e certas proteínas do sistema complemento. As estruturas das regiões Fc de várias imunoglobulinas e os sítios de glicosilação nela contidos são conhecidos na técnica. Ver Schroeder e Cavacini, J. Allergy Clin. Immunol., 2010, 125: S41-52, incorporado por referência na sua totalidade. A região Fc pode ser uma região Fc de ocorrência natural ou uma região Fc modificada como descrito na técnica ou em qualquer outro local nesta divulgação.
[0074] As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade ("regiões hipervariáveis (HVRs)"; também chamadas "regiões determinantes de complementaridade" (CDRs)) intercaladas com regiões mais conservadas. As regiões mais conservadas são chamadas de regiões de framework (FRs). Cada VH e VL geralmente compreende três CDRs e quatro FRs, organizados na seguinte ordem (do terminal N ao terminal C): FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. As CDRs estão envolvidas na ligação ao antígeno e influenciam a especificidade do antígeno e a afinidade de ligação do anticorpo. Ver, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. (1991), Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, incorporado por referência na sua totalidade.
[0075] A cadeia leve de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um dos dois tipos, chamados kappa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de seu domínio constante.
[0076] A cadeia pesada de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a uma das cinco classes diferentes (ou isotipos): IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Essas classes também são designadas α, δ, ε, γ e µ, respectivamente. As classes IgG e IgA são divididas em subclasses com base nas diferenças de sequência e função. Os seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3,
IgG4, IgA1 e IgA2.
[0077] Os limites da sequência de aminoácidos de uma CDR podem ser determinados por um versado na técnica usando qualquer um de vários esquemas de numeração conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat et al., Supra (esquema de numeração "Kabat"); Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273: 927- 948 (esquema de numeração "Chothia"); MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262: 732-745 (esquema de numeração "Contact"); Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27: 55-77 (esquema de numeração "IMGT"); e Honegge e Plückthun, J. Mol. Biol., 2001, 309: 657-70 (esquema de numeração "AHo"); cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.
[0078] A Tabela 1 fornece as posições de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3, conforme identificadas pelos esquemas de Kabat e Chothia. Para CDR-H1, a numeração de resíduos é fornecida usando os esquemas de Numeração de Kabat e Chothia.
[0079] As CDRs podem ser atribuídas, por exemplo, usando o software de numeração de anticorpos, como Abnum, disponível em www.bioinf.org.uk/abs/abnum/, e descritas em Abhinandan e Martin, Immunology, 2008, 45: 3832-3839, incorporado por referência na sua totalidade. Tabela 1. Resíduos em CDRs de acordo com os esquemas de numeração de Kabat e Chothia. CDR Kabat Chothia L1 L24-L34 L24-L34 L2 L50-L56 L50-L56 L3 L89-L97 L89-L97 H1 (Numeração de H31-H35B H26-H32 ou H34* Kabat) H1 (Numeração de H31-H35 H26-H32 Chothia) H2 H50-H65 H52-H56 H3 H95-H102 H95-H102 *O terminal C de CDR-H1, quando numerado usando a convenção de Numeração de Kabat, varia entre H32 e H34, dependendo do comprimento da CDR.
[0080] O "esquema de numeração da UE " é geralmente usado quando se refere a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de anticorpos (por exemplo, conforme relatado em Kabat et al., Supra). Salvo indicação em contrário, o esquema de numeração EU é utilizado para se referir a resíduos nas regiões constantes de cadeia pesada de anticorpos descritas neste documento.
[0081] Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intacto, tal como de ligação ao antígeno ou região variável de um anticorpo intacto. Os fragmentos de anticorpo incluem, por exemplo, fragmentos Fv, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos scFv (sFv) e fragmentos scFv-Fc.
[0082] Os fragmentos "Fv" compreendem um dímero não covalentemente ligado de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve.
[0083] Os fragmentos "Fab" compreendem, além dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve, o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. Os fragmentos Fab podem ser gerados, por exemplo, por métodos recombinantes ou por digestão com papaína de um anticorpo completo.
[0084] Os fragmentos "F(ab')2" contêm dois fragmentos Fab' unidos, perto da região da dobradiça, por ligações dissulfeto. Os fragmentos F(ab')2 podem ser gerados, por exemplo, por métodos recombinantes ou por digestão com pepsina de um anticorpo intacto. Os fragmentos F(ab') podem ser dissociados, por exemplo, por tratamento com ß-mercaptoetanol.
[0085] Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "sFv" ou "scFv" compreendem um domínio VH e um domínio VL em uma única cadeia polipeptídica. A VH e a VL são geralmente ligadas por um ligante peptídico. Ver Plückthun A. (1994). Qualquer ligante peptídico adequado pode ser usado. Em algumas modalidades, o ligante peptídico é um (GGGGS)n (SEQ ID NO: 127). Em algumas modalidades, n=1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Ver, Anticorpos de Escherichia coli. Em Rosenberg M. & Moore GP (Eds.), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies Vol. 113 (pp. 269-315). Springer-Verlag, Nova York, incorporada por referência na sua totalidade.
[0086] Os fragmentos "scFv-Fc" compreendem um scFv anexado a um domínio Fc. Por exemplo, um domínio Fc pode ser anexado ao Terminal C do scFv. O domínio Fc pode seguir a VH ou VL, dependendo da orientação dos domínios variáveis no scFv (ou seja, VH-VL ou VL -VH). Qualquer domínio Fc adequado conhecido na técnica ou descrito neste documento pode ser usado. Em alguns casos, o domínio Fc compreende um domínio Fc de IgG4.
[0087] O termo "anticorpo de domínio único" refere-se a uma molécula na qual um domínio variável de um anticorpo se liga especificamente a um antígeno sem a presença do outro domínio variável. Anticorpos de domínio único e seus fragmentos são descritos em Arabi Ghahroudi et al., FEBS Letters, 1998, 414: 521- 526 e Muyldermans et al., Trends in Biochem. Sci., 2001, 26: 230-245, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Os anticorpos de domínio único também são conhecidos como sdAbs ou nanocorpos.
[0088] Um "anticorpo multiespecífico" é um anticorpo que compreende dois ou mais domínios diferentes de ligação ao antígeno que coletivamente se ligam especificamente a dois ou mais epítopos diferentes. Os dois ou mais epítopos diferentes podem ser epítopos no mesmo antígeno (por exemplo, uma única molécula de SIRP-ALPHA expressa por uma célula) ou em antígenos diferentes (por exemplo, moléculas de SIRP-ALPHA diferentes expressos pela mesma célula ou um SIRP-ALPHA molécula e uma molécula não SIRP-ALPHA). Em alguns aspectos, um anticorpo multiespecífico liga dois epítopos diferentes (isto é, um "anticorpo biespecífico"). Em alguns aspectos, um anticorpo multiespecífico liga três epítopos diferentes (isto é, um "anticorpo triespecífico").
[0089] Um "anticorpo monoespecífico" é um anticorpo que compreende um ou mais sítios de ligação que se ligam especificamente a um único epítopo. Um exemplo de um anticorpo monoespecífico é uma molécula de IgG de ocorrência natural que, embora divalente (isto é, tendo dois domínios de ligação ao antígeno), reconhece o mesmo epítopo em cada um dos dois domínios de ligação ao antígeno. A especificidade de ligação pode estar presente em qualquer valência adequada.
[0090] O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos. Uma população de anticorpos substancialmente homogêneos compreende anticorpos que são substancialmente semelhantes e que se ligam ao(s) mesmo(s) epítopo(s), exceto por variantes que normalmente podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal. Tais variantes estão geralmente presentes apenas em pequenas quantidades. Um anticorpo monoclonal é tipicamente obtido por um processo que inclui a seleção de um único anticorpo dentre uma pluralidade de anticorpos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um clone único de uma pluralidade de clones, como um agrupamento de clones de hibridoma, clones de fago, clones de levedura, clones bacterianos ou outros clones de DNA recombinante. O anticorpo selecionado pode ser alterado ainda mais, por exemplo, para melhorar a afinidade com o alvo ("maturação por afinidade"), humanizar o anticorpo, melhorar sua produção na cultura de células e/ou reduzir sua imunogenicidade em um sujeito.
[0091] O termo anticorpo "quimérico" diz respeito a um anticorpo no qual uma porção de cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie específica, enquanto o restante de cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.
[0092] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado é geralmente um anticorpo humano (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma ou mais CDRs são substituídos por resíduos de uma ou mais CDRs de um anticorpo não humano (anticorpo doador). O anticorpo doador pode ser qualquer anticorpo não humano adequado, como um anticorpo de camundongo, rato, coelho, galinha ou primata não humano com uma especificidade, afinidade ou efeito biológico desejado. Em alguns casos, os resíduos selecionados da região de framework do anticorpo receptor são substituídos pelos resíduos correspondentes da região de framework do anticorpo doador. Os anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Tais modificações podem ser feitas para refinar ainda mais a função do anticorpo. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature, 1986, 321: 522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332: 323-329; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992, 2: 593-596, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.
[0093] Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma sequência de aminoácidos correspondente à de um anticorpo produzido por um humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza um repertório de anticorpos humanos ou sequências que codificam anticorpos (por exemplo, obtido de fontes humanas ou projetado de novo). Os anticorpos humanos excluem especificamente anticorpos humanizados.
[0094] "Afinidade" se refere à força da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação simples de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno ou epítopo). A menos que indicado de outra forma, como usado neste documento, "afinidade" se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno ou epítopo). A afinidade de uma molécula X pelo seu parceiro Y pode ser representada pela constante de equilíbrio de dissociação (KD). Os componentes cinéticos que contribuem para a constante de equilíbrio de dissociação são descritos em mais detalhes abaixo. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo os descritos neste documento, como a tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (por exemplo, BIACORE®) ou interferometria de biolayer (por exemplo, FORTEBIO®).
[0095] No que diz respeito à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, os termos "ligar", "ligação específica", "liga-se especificamente a", "específico para", "liga-se seletivamente" e "seletivo" a um antígeno específico (por exemplo, um alvo polipeptídico) ou um epítopo em uma ligação média ao antígeno em particular que é mensurável diferente de uma interação não específica ou não seletiva (por exemplo, com uma molécula não alvo). A ligação específica pode ser medida, por exemplo, medindo a ligação a uma molécula alvo e comparando-a com a ligação a uma molécula não alvo. A ligação específica também pode ser determinada por competição com uma molécula de controle que imita o epítopo reconhecido na molécula alvo. Nesse caso, a ligação específica é indicada se a ligação do anticorpo à molécula alvo for inibida competitivamente pela molécula de controle. Em alguns aspectos, a afinidade de um anticorpo SIRP-ALPHA para uma molécula não alvo é inferior a cerca de 50% da afinidade para SIRP-ALPHA. Em alguns aspectos, a afinidade de um anticorpo SIRP-ALPHA para uma molécula não alvo é inferior a cerca de 40% da afinidade para SIRP-ALPHA. Em alguns aspectos, a afinidade de um anticorpo SIRP-ALPHA para uma molécula não alvo é inferior a cerca de 30% da afinidade para SIRP-ALPHA. Em alguns aspectos, a afinidade de um anticorpo SIRP-ALPHA para uma molécula não alvo é inferior a cerca de 20% da afinidade para SIRP-ALPHA. Em alguns aspectos, a afinidade de um anticorpo SIRP-ALPHA para uma molécula não alvo é inferior a cerca de 10% da afinidade para SIRP- ALPHA. Em alguns aspectos, a afinidade de um anticorpo SIRP-ALPHA para uma molécula não alvo é inferior a cerca de 1% da afinidade para SIRP-ALPHA. Em alguns aspectos, a afinidade de um anticorpo SIRP-ALPHA para uma molécula não alvo é inferior a cerca de 0,1% da afinidade para SIRP-ALPHA.
[0096] O termo "kd" (sec-1) como usado neste documento, refere-se à constante da taxa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno específica. Esse valor é também referido com o valor koff.
[0097] O termo "ka" (M-1×sec-1), como usado neste documento, refere-se à constante da taxa de associação de uma interação anticorpo-antigênio específica. Esse valor é também referido com o valor kon.
[0098] O termo "KD" (M), como usado neste documento, refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno específica. KD = kd/ka. Em algumas modalidades, a afinidade de um anticorpo é descrita em termos de KD para uma interação entre esse anticorpo e antígeno deste. Para maior clareza, como conhecido na técnica, um valor KD menor indica uma interação de afinidade mais alta, enquanto um valor KD maior indica uma interação de afinidade mais baixa.
[0099] O termo "KA" (M-1), como usado neste documento, refere-se à constante de equilíbrio de associação de uma interação anticorpo-antigênio específica. KA = ka/kd.
[00100] Um "imunoconjugado" é um anticorpo conjugado com uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), como um agente terapêutico (citocina, por exemplo) ou de diagnóstico.
[00101] "Funções efetoras" se referem às atividades biológicas mediadas pela região Fc de um anticorpo, cujas atividades podem variar dependendo do isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem ligação a C1q para ativar a citotoxicidade dependente do complemento (CDC), ligação ao receptor Fc para ativar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP).
[00102] Quando usado neste documento no contexto de dois ou mais anticorpos, o termo "compete com" ou "concorre com" indica que os dois ou mais anticorpos competem pela ligação a um antígeno (por exemplo, SIRP-ALPHA). Num ensaio exemplar, o SIRP-ALPHA é revestido numa superfície e contatado com um primeiro anticorpo SIRP-ALPHA, após o que é adicionado um segundo anticorpo SIRP-ALPHA. Noutro ensaio exemplar, um primeiro anticorpo SIRP- ALPHA é revestido numa superfície e contatado com SIRP-ALPHA e, em seguida, é adicionado um segundo anticorpo SIRP-ALPHA. Se a presença do primeiro anticorpo SIRP-ALPHA reduz a ligação do segundo anticorpo SIRP-ALPHA, em qualquer um dos ensaios, então os anticorpos competem entre si. O termo "compete com" também inclui combinações de anticorpos em que um anticorpo reduz a ligação de outro anticorpo, mas onde nenhuma competição é observada quando os anticorpos são adicionados na ordem inversa. No entanto, em algumas modalidades, o primeiro e o segundo anticorpos inibem a ligação um do outro, independentemente da ordem em que são adicionados. Em algumas modalidades, um anticorpo reduz a ligação de outro anticorpo ao antígeno deste em pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%. Um versado na técnica pode selecionar as concentrações dos anticorpos utilizados nos ensaios de competição com base nas afinidades dos anticorpos para SIRP-ALPHA e na valência dos anticorpos. Os ensaios descritos nesta definição são ilustrativos e um versado na técnica pode utilizar qualquer ensaio adequado para determinar se os anticorpos competem entre si. Os ensaios adequados são descritos, por exemplo, em Cox et al., "Immunoassay Methods," no Assay Guidance Manual [Internet], atualizado em 24 de dezembro de 2014 (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/; acessado 29 de setembro de 2015); Silman et al., Cytometry, 2001, 44:30-37; e Finco et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 2011, 54: 351-358; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.
[00103] O termo "epítopo" significa uma porção de um antígeno que se liga especificamente a um anticorpo. Os epítopos frequentemente consistem em resíduos de aminoácidos acessíveis à superfície e/ou cadeias laterais de açúcar e podem ter características estruturais tridimensionais específicas, bem como características específicas de carga. Os epítopos conformacionais e não conformacionais se distinguem na medida em que a ligação ao primeiro, mas não o último, pode ser perdida na presença de solventes desnaturantes. Um epítopo pode compreender resíduos de aminoácidos que estão diretamente envolvidos na ligação e outros resíduos de aminoácidos, que não estão diretamente envolvidos na ligação. O epítopo ao qual um anticorpo se liga pode ser determinado usando técnicas conhecidas para determinação de epítopos, como, por exemplo, teste para ligação de anticorpos a variantes de SIRP-ALPHA com diferentes mutações pontuais ou a variantes quiméricas de SIRP-ALPHA.
[00104] A "identidade" percentual entre uma sequência polipeptídica e uma sequência de referência é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica idêntica aos resíduos de aminoácidos na sequência de referência, após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a identidade de sequência percentual máxima. O alinhamento para fins de determinação do percentual de identidade da sequência de aminoácidos pode ser atingido de muitas formas no estado da técnica, por exemplo, usando software de computador livre, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, MEGALIGN (DNASTAR), CLUSTALW, CLUSTAL OMEGA, ou software MUSCLE. Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo sobre o comprimento total das sequências sendo comparadas.
[00105] Uma "substituição conservativa" ou uma "substituição conservativa de aminoácidos", refere-se à substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente ou funcionalmente semelhante. As tabelas de substituições conservativas que fornecem aminoácidos similares são conhecidas na técnica. A título de exemplo, os grupos de aminoácidos fornecidos nas Tabelas 2-4 são, em algumas modalidades, considerados substituições conservativas um do outro.
[00106] Tabela 2. Grupos selecionados de aminoácidos que são considerados substituições conservativas um do outro, em certas modalidades. Resíduos Ácidos DeE Resíduos Básicos K, R e H Resíduos não carregados hidrofílicos S, T, N e Q Resíduos alifáticos não carregados G, A, V, L e I Resíduos não polares não carregados C, M e P Resíduos Aromáticos F, Y, e W
[00107] Tabela 3. Grupos selecionados adicionais de aminoácidos que são considerados substituições conservativas um do outro, em certas modalidades. Grupo 1 A, S e T Grupo 2 DeE Grupo 3 NeQ Grupo 4 ReK Grupo 5 I, L e M Grupo 6 F, Y, e W
[00108] Tabela 4. Grupos selecionados adicionais de aminoácidos que são considerados substituições conservativas um do outro, em certas modalidades. Grupo A AeG Grupo B DeE Grupo C NeQ Grupo D R, K e H Grupo E I, L, M, V Grupo F F, Y, e W Grupo G SeT Grupo H CeM
[00109] Substituições conservativas adicionais podem ser encontradas, por exemplo, em Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, 2a ed. (1993), W. H. Freeman & Co., New York, NY. Um anticorpo gerado pela realização de uma ou mais substituições conservativas de resíduos de aminoácidos em um anticorpo parental é referido como uma "variante modificada conservativamente."
[00110] O termo "aminoácido" refere-se aos vinte aminoácidos de ocorrência natural comuns. Os aminoácidos de ocorrência natural incluem alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C); ácido glutâmico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), Glicina (Gly; G); histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tir; Y) e valina (Val; V).
[00111] O termo "vetor", como usado neste documento, se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácidos nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais estão operativamente ligados. Tais vetores são referidos neste documento como "vetores de expressão."
[00112] Os termos "célula hospedeira", "linhagem celular hospedeira", e "cultura celular hospedeira" são usados intercambiavelmente e se referem às células nas quais ácido nucleico exógeno foi introduzido, e a progênie dessas células. As células hospedeiras incluem "transformantes" (ou "células transformadas") e "transfectantes" (ou "células transfectadas"), cada uma incluindo a célula primária transformada ou transfectada e a progênie derivada delas. Tal progênie pode não ser completamente idêntica em teor de ácido nucleico para uma célula precursora, e pode conter mutações.
[00113] O termo "tratamento" (e suas variações, como "tratar" ou "tratamento") refere-se à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural de uma doença ou condição em um sujeito que dela necessite. O tratamento pode ser realizado para profilaxia e durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejáveis do tratamento incluem a prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão ou prognóstico aprimorado.
[00114] Como usado neste documento, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou composição farmacêutica fornecida neste documento que, quando administrada a um sujeito, é eficaz para tratar uma doença ou distúrbio.
[00115] Como usado neste documento, o termo "sujeito" significa um sujeito mamífero. Exemplos de sujeitos incluem seres humanos, macacos, cães, gatos, camundongos, ratos, vacas, cavalos, camelos, cabras, coelhos e ovelhas. Em modalidades específicas, o sujeito é um ser humano. Em algumas modalidades, o sujeito tem uma doença ou condição que pode ser tratada com um anticorpo fornecido neste documento. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um câncer. Em alguns aspectos, a doença ou condição é uma infecção viral.
[00116] O termo “bula” é usado para se referir às instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos ou de diagnóstico (por exemplo, kits) que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou avisos relativos à uso de tais produtos terapêuticos ou de diagnóstico.
[00117] O termo "agente citotóxico", como usado neste documento, se refere a uma substância que inibe ou impede uma função celular e/ou provoca a morte celular ou destruição.
[00118] Um "agente quimioterapêutico" se refere um composto químico útil no tratamento de câncer. Os agentes quimioterapêuticos incluem "agentes anti- hormonais" ou "terapêuticos endócrinos" que atuam para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimento do câncer.
[00119] O termo "agente citostático" se refere a um composto ou composição que detém o crescimento de uma célula in vitro ou in vivo. Em algumas modalidades, um agente citostático é um agente que reduz a percentagem de células na fase S. Em algumas modalidades, um agente citostático reduz a percentagem de células na fase S em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 80%.
[00120] O termo "tumor" se refere a todo crescimento e proliferação de células neoplásicas, malignas ou benignas, e a todas as células e tecidos pré- cancerosos e cancerosos. Os termos "câncer", "canceroso", "distúrbio proliferativo celular", "distúrbio proliferativo" e "tumor" não são mutuamente exclusivos, como referido neste documento. Os termos "distúrbio proliferativo celular" e "distúrbio proliferativo" referem-se a distúrbios que estão associados a um certo grau de proliferação celular anormal. Em algumas modalidades, o distúrbio proliferativo celular é um câncer. Em alguns aspectos, o tumor é um tumor sólido. Em alguns aspectos, o tumor é uma neoplasia hematológica.
[00121] O termo "composição farmacêutica" refere-se a uma preparação que é de forma a permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo nela contido seja eficaz no tratamento de um sujeito e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para o sujeito nas quantidades fornecidas na composição farmacêutica.
[00122] Os termos "coadministração", "coadministrador" e "em combinação com" incluem a administração de dois ou mais agentes terapêuticos simultaneamente, simultânea ou sequencialmente, sem limites de tempo específicos. Em uma modalidade, os agentes estão presentes na célula ou no corpo do sujeito ao mesmo tempo ou exercem o seu efeito biológico ou terapêutico ao mesmo tempo. Em uma modalidade, os agentes terapêuticos estão na mesma forma de composição ou dosagem unitária. Em outras modalidades, os agentes terapêuticos estão em composições separadas ou formas de dosagem unitária. Em certas modalidades, um primeiro agente pode ser administrado antes de (por exemplo, minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), concomitantemente ou após (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas após) administração de um segundo agente terapêutico.
[00123] Os termos "modular" e "modulação" se referem a reduzir ou inibir ou, alternativamente, ativar ou aumentar uma variável recitada.
[00124] Os termos "aumentar" e "ativar" se referem a um aumento de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais em uma variável recitada.
[00125] Os termos "reduzir" e "inibir" referem-se a uma diminuição de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais em uma variável recitada.
[00126] O termo "agonizar" refere-se à ativação da sinalização do receptor para induzir uma resposta biológica associada à ativação do receptor. Um "agonista" é uma entidade que se liga e agoniza um receptor.
[00127] O termo "antagonizar" refere-se à inibição da sinalização do receptor para inibir uma resposta biológica associada à ativação do receptor. Um "antagonista" é uma entidade que se liga e antagoniza um receptor. Anticorpos SIRP-ALPHA
[00128] São fornecidos neste documento anticorpos que se ligam especificamente ao SIRP-ALPHA. Em alguns aspectos, o SIRP-ALPHA é SIRP- ALPHA humano. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento se ligam especificamente ao domínio extracelular do SIRP-ALPHA. O SIRP-ALPHA pode ser expresso na superfície de qualquer célula alvo adequada. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula profissional de apresentação de antígenos. Em algumas modalidades, a célula alvo é um macrófago. Um anticorpo pode ser específico da panela para os isotipos humanos de SIRP. Um anticorpo pode ser específico para um isotipo SIRP humano.
[00129] Em certas modalidades, um anticorpo é 1H9. Em certas modalidades, um anticorpo é 3C2.
[00130] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento compreendem uma cadeia leve. Em alguns aspectos, a cadeia leve é uma cadeia leve kappa. Em alguns aspectos, a cadeia leve é uma cadeia leve lambda.
[00131] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento compreendem uma cadeia pesada. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgA. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgD. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgE. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgG. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgM. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgG1. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgG2. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgG3. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgG4. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgA1. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgA2.
[00132] Em algumas modalidades, um anticorpo liga SIRP humano com um KD menor ou igual a cerca de 1, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 x10- 9M conforme medido pelo ensaio Biacore.
[00133] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento compreendem um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento consistem em um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento consistem essencialmente em um fragmento de anticorpo. Em alguns aspectos, o fragmento de anticorpo é um fragmento de Fv. Em alguns aspectos, o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab. Em alguns aspectos, o fragmento de anticorpo é um fragmento F(ab')2. Em alguns aspectos, o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab'. Em alguns aspectos, o fragmento de anticorpo é um fragmento de scFv (sFv). Em alguns aspectos, o fragmento de anticorpo é um fragmento de scFv- Fc. Em alguns aspectos, o fragmento de anticorpo é um fragmento de um anticorpo de domínio único.
[00134] Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo fornecido neste documento é derivado de um anticorpo ilustrativo fornecido neste documento. Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo fornecido neste documento não é derivado de um anticorpo ilustrativo fornecido neste documento e pode, por exemplo, ser isolado de novo de acordo com os métodos fornecidos neste documento para obter fragmentos de anticorpo.
[00135] Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo fornecido neste documento retém a capacidade de antagonizar SIRP-ALPHA, conforme medido por um ou mais ensaios ou efeitos biológicos descritos neste documento. Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo fornecido neste documento retém a capacidade de impedir que SIRP-ALPHA interaja com um ou mais de seus ligantes, como descrito neste documento.
[00136] Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo fornecido neste documento compete pela ligação ao SIRP-ALPHA com 1H9 e/ou 3C2. Em algumas modalidades, um fragmento de um anticorpo fornecido neste documento se liga ao mesmo epítopo de SIRP-ALPHA que esse anticorpo.
[00137] Como uma alternativa ao uso de um anticorpo compreendendo uma região Fc humana com afinidade reduzida para um receptor Fcγ, um anticorpo pode ser modificado para não ter sequências Fc, por exemplo, produzindo um fragmento de anticorpo como um fragmento F(ab')2. Para gerar um fragmento F(ab)2, o anticorpo purificado é suspenso com pepsina de preparação Pierce F(ab')2 imobilizada em resina assentada, de acordo com as instruções do fabricante. A digestão com pepsina normalmente produz um fragmento F(ab')2 (~110kDa por SDS-PAGE sob condições não redutoras) e numerosos pequenos peptídeos da porção Fc. O fragmento F(ab')2 resultante é composto por um par de unidades Fab' conectadas por duas ligações dissulfeto. O fragmento Fc é extensivamente degradado e separado de F(ab')2 por diálise, filtração em gel ou cromatografia de troca iônica.
[00138] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento são anticorpos monoclonais. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento são anticorpos policlonais.
[00139] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento compreendem um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento consistem em um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento consistem essencialmente em um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento compreendem um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento consistem em um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento consistem essencialmente em um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento compreendem um anticorpo humano. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento consistem em um anticorpo humano. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento consistem essencialmente em um anticorpo humano.
[00140] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento compreendem uma estrutura de andaime alternativa. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento consistem em uma estrutura de andaime alternativa. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento consistem essencialmente em uma estrutura de andaime alternativa. Qualquer estrutura de andaime alternativa adequada pode ser usada. Em alguns aspectos, a estrutura de andaime alternativa é selecionada de um AdnectinTM, um iMab, um Anticalin®, um EETI-II/AGRP, um domínio Kunitz, um aptâmero de peptídeo de tioredoxina, um Affibody®, um DARPin, um Affilin, uma Tetranectina, um Fynomer e um Avimer.
[00141] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento inibe a ligação de SIRP-ALPHA a um ou mais ligantes de SIRP-ALPHA.
[00142] Em certos aspectos, um anticorpo não se liga ao SIRP-Gamma. Em certos aspectos, um anticorpo não se liga substancialmente ao SIRP-Gamma.
[00143] Em alguns aspectos, um anticorpo divulgado neste documento é pan-específico para isotipos de SIRP humanos. Um anticorpo divulgado neste documento, como 1H9, pode se ligar a vários isotipos de SIRP humanos, incluindo um ou mais de V1, V2 e V1/V5. Sequência V1 exemplar mostrada na SEQ ID NO:
48. Sequência V2 exemplar mostrada na SEQ ID NO: 49. Ver também Polymorphism in Sirpa modulates engraftment of human hematopoietic stem cells. Nature Immunology, 8; 1313, 2007. Um anticorpo divulgado neste documento pode se ligar a cada um dos isotipos humanos de SIRP V1 e V2. Um anticorpo divulgado neste documento pode se ligar ao isotipo V1 SIRP humano, incluindo homozigoto. Um anticorpo divulgado neste documento pode se ligar ao isotipo V2 SIRP humano, incluindo homozigoto. Um anticorpo divulgado neste documento pode se ligar aos isotipos SIRP humanos V1/V5 (heterozigotos). Um anticorpo divulgado neste documento, como 1H9, pode se ligar a vários isotipos de SIRP humanos, incluindo cada um de V1, V2 e V1/V5. Tais anticorpos podem incluir 1H9 e 3C2, incluindo versões humanizadas e/ou modificadas por Fc de tais anticorpos. 1H9 pode se ligar a cada um dos isotipos SIRP humanos V1 e V2. 1H9 pode se ligar ao isotipo SIRP humano V1, incluindo homozigoto. 1H9 pode se ligar ao isotipo SIRP humano V2, incluindo homozigoto. 1H9 pode se ligar aos isotipos SIRP humanos V1/V5 (heterozigotos). 1H9 pode se ligar a vários isotipos SIRP humanos incluindo cada um dos V1, V2 e V1/V5. A ligação às variantes SIRP humanas pode ser medida utilizando ensaios conhecidos na técnica, incluindo PCR e/ou citometria de fluxo. Por exemplo, uma determinada amostra pode ser genotipada para determinar o status do SIRP e a ligação ao SIRP pode ser determinada usando citometria de fluxo.
[00144] Em certos aspectos, um anticorpo compete pela ligação ao SIRP humano com um anticorpo selecionado de 1H9 e 3C2. Em certos aspectos, um anticorpo liga-se ao mesmo epítopo SIRP humano ligado pelo 1H9 ou 3C2. Em certos aspectos, um anticorpo se liga a um epítopo SIRP humano sobreposto como ligado por 1H9 ou 3C2. Em certos aspectos, um anticorpo liga-se a um epítopo SIRP humano distinto como ligado por 1H9 ou 3C2.
[00145] Em certos aspectos, um anticorpo não compete pela ligação ao SIRP humano com o anticorpo KWar.
[00146] Em certos aspectos, um anticorpo compete parcialmente pela ligação ao SIRP humano com o anticorpo KWar.
[00147] Em certos aspectos, um anticorpo inibe a ligação do CD47 humano ao SIRP humano.
[00148] Em certos aspectos, um anticorpo inibe a ligação de SP-A humana ao SIRP humano.
[00149] Em certos aspectos, um anticorpo inibe a ligação de SP-D humana ao SIRP humano.
[00150] Em certos aspectos, um anticorpo se liga ao SIRP de macaco Rhesus.
[00151] Em certos aspectos, um anticorpo se liga ao SIRP de cinomolgo
[00152] Em certos aspectos, um anticorpo aumenta a fagocitose em relação ao controle.
[00153] Também é divulgado neste documento um anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado que compete pela ligação ao SIRP humano com um anticorpo divulgado neste documento.
[00154] Também é divulgado neste documento um anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado que se liga ao epítopo SIRP humano ligado por um anticorpo divulgado neste documento.
[00155] Em certos aspectos, um anticorpo compreende uma região Fc humana compreendendo pelo menos uma modificação que reduz a ligação a um receptor Fc humano.
[00156] Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo que compete com um anticorpo ilustrativo fornecido neste documento, por exemplo, 1H9 e/ou 3C2. Em alguns aspectos, o anticorpo que compete com o anticorpo ilustrativo fornecido neste documento se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo ilustrativo fornecido neste documento.
[00157] Sabe-se que quando um anticorpo é expresso nas células, o anticorpo é modificado após a tradução. Exemplos da modificação pós-tradução incluem a clivagem da lisina no Terminal C de cadeia pesada por uma carboxipeptidase; modificação de glutamina ou ácido glutâmico no Terminal N de cadeia pesada e de cadeia leve em ácido piroglutâmico por piroglutamilação; glicosilação; oxidação; desamidação; e glicação, e sabe-se que essas modificações pós-traducionais ocorrem em vários anticorpos (Ver Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447, incorporado por referência na sua totalidade). Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo ou fragmento de ligação deste ao antígeno que passou por modificação pós-tradução. Exemplos de um anticorpo ou fragmento de ligação deste ao antígeno que foram submetidos a modificação pós-tradução incluem um anticorpo ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que foram submetidos a piroglutamilação no Terminal N de região variável de cadeia pesada e/ou deleção de lisina no Terminal C de cadeia pesada. Sabe-se na técnica que tal modificação pós-tradução devido à piroglutamilação no Terminal N e à deleção de lisina no Terminal C não tem nenhuma influência sobre a atividade do anticorpo ou fragmento deste (Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p 24-39, incorporado por referência na sua totalidade). Sequências de anticorpos SIRP-ALPHA
[00158] Um anticorpo pode compreender: uma CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1; uma CDR-H2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma CDR-H3 compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3; uma CDR-L1 compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 4; uma CDR-L2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5; e um CDR-L3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6.
[00159] Um anticorpo pode compreender: uma sequência VHda SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 8.
[00160] Um anticorpo pode compreender: uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 18.
[00161] Um anticorpo pode compreender: uma CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 9; uma CDR-H2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10; uma CDR-H3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 11; uma CDR-L1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 12; uma CDR-L2 compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 13; e uma CDR-L3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 14.
[00162] Um anticorpo pode compreender: uma sequência VH da SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 16.
[00163] Um anticorpo pode compreender: uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 20.
[00164] Um anticorpo pode compreender: uma CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 21; uma CDR-H2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 22; uma CDR-H3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 23; uma CDR-L1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 24; uma CDR-L2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 25; e uma CDR-L3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 26.
[00165] Um anticorpo pode compreender: uma sequência VH da SEQ ID NO: 27 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 28.
[00166] Um anticorpo pode compreender: uma CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 29; uma CDR-H2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 30; uma CDR-H3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 31; uma CDR-L1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 32; uma CDR-L2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 33; e uma CDR-L3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 34.
[00167] Um anticorpo pode compreender: uma sequência VH da SEQ ID NO: 35 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 36.
[00168] Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender uma ou mais CDRs de 1H9. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender todas as CDRs de 1H9. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender uma ou mais sequências variáveis de 1H9. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender cada sequência variável de 1H9. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia pesada de 1H9. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia leve de 1H9. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia pesada e a cadeia leve de 1H9. Em certos aspectos, um anticorpo é 1H9.
[00169] Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender uma ou mais CDRs de 3C2. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender todas as CDRs de 3C2. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender uma ou mais sequências variáveis de 3C2. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender cada sequência variável de 3C2. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia pesada de 3C2. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia leve de 3C2. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia pesada e a cadeia leve de 3C2. Em certos aspectos, um anticorpo é 3C2.
[00170] Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender uma ou mais CDRs de 9B11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender todas as CDRs de 9B11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender uma ou mais sequências variáveis de 9B11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender cada sequência variável de 9B11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia pesada de 9B11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia leve de 9B11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia pesada e a cadeia leve de 9B11. Em certos aspectos, um anticorpo é 9B11.
[00171] Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender uma ou mais
CDRs de 7E11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender todas as CDRs de 7E11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender uma ou mais sequências variáveis de 7E11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender cada sequência variável de 7E11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia pesada de 7E11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia leve de 7E11. Em certos aspectos, um anticorpo pode compreender a cadeia pesada e a cadeia leve de 7E11. Em certos aspectos, um anticorpo é 7E11.
[00172] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma sequência com pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade para uma sequência ilustrativa fornecida nas SEQ ID NOs: 1-36. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma sequência fornecida nas SEQ ID NOs: 1-36, com até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 substituições de aminoácidos. Em alguns aspectos, as substituições de aminoácidos são substituições conservativas de aminoácidos. Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste parágrafo são referidos neste documento como "variantes." Em algumas modalidades, essas variantes são derivadas de uma sequência fornecida neste documento, por exemplo, por maturação por afinidade, mutagênese direcionada ao sítio, mutagênese aleatória ou qualquer outro método conhecido na técnica ou descrito neste documento. Em algumas modalidades, essas variantes não são derivadas de uma sequência fornecida neste documento e podem, por exemplo, ser isoladas de novo de acordo com os métodos fornecidos neste documento para a obtenção de anticorpos. Anticorpos SIRP-ALPHA monoespecíficos e multiespecíficos
[00173] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento são anticorpos monoespecíficos.
[00174] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento são anticorpos multiespecíficos.
[00175] Em algumas modalidades, um anticorpo multiespecífico fornecido neste documento se liga a mais de um antígeno. Em algumas modalidades, um anticorpo multiespecífico liga 2 antígenos. Em algumas modalidades, um anticorpo multiespecífico liga 3 antígenos. Em algumas modalidades, um anticorpo multiespecífico liga 4 antígenos. Em algumas modalidades, um anticorpo multiespecífico liga 5 antígenos.
[00176] Em algumas modalidades, um anticorpo multiespecífico fornecido neste documento liga mais de um epítopo a um antígeno SIRP-ALPHA. Em algumas modalidades, um anticorpo multiespecífico liga 2 epítopos a um antígeno SIRP-ALPHA. Em algumas modalidades, um anticorpo multiespecífico se liga a 3 epítopos em um antígeno SIRP-ALPHA.
[00177] Muitos construtos de anticorpos multiespecíficos são conhecidos na técnica, e os anticorpos fornecidos neste documento podem ser fornecidos na forma de qualquer construto multiespecífico adequado.
[00178] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico compreende uma imunoglobulina compreendendo pelo menos duas regiões variáveis de cadeia pesada diferentes, cada uma emparelhada com uma região variável de cadeia leve comum (isto é, um "anticorpo comum de cadeia leve"). A região variável de cadeia leve comum forma um domínio de ligação ao antígeno distinto com cada uma das duas regiões variáveis de cadeia pesada diferentes. Ver Merchant et al., Nature Biotechnol., 1998, 16: 677-681, incorporado por referência na sua totalidade.
[00179] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico compreende uma imunoglobulina compreendendo um anticorpo ou um fragmento do mesmo ligado a um ou mais dos terminais N ou C das cadeias pesada ou leve dessa imunoglobulina. Ver Coloma e Morrison, Nature Biotechnol., 1997, 15: 159-163, incorporado por referência na sua totalidade. Em alguns aspectos, esse anticorpo compreende um anticorpo biespecífico tetravalente.
[00180] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico compreende uma imunoglobulina híbrida compreendendo pelo menos duas regiões variáveis de cadeia pesada diferentes e pelo menos duas regiões variáveis de cadeia leve diferentes. Ver Milstein e Cuello, Nature, 1983, 305: 537-540; e Staerz e Bevan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83: 1453-1457; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.
[00181] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico compreende cadeias de imunoglobulina com alterações para reduzir a formação de produtos colaterais que não possuem multiespecificidade. Em alguns aspectos, os anticorpos compreendem uma ou mais modificações de "knobs-into-holes", conforme descrito na Patente US N° 5.731.168, incorporada por referência na sua totalidade.
[00182] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico compreende cadeias de imunoglobulina com uma ou mais modificações eletrostáticas para promover a montagem de hetero-multímeros de Fc. Ver WO 2009/089004, incorporado por referência na sua totalidade.
[00183] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico compreende uma molécula de cadeia única biespecífica. Ver Traunecker et al., EMBO J., 1991, 10: 3655-3659; e Gruber et al., J. Immunol., 1994, 152: 5368-5374; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.
[00184] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve conectado por um ligante polipeptídico, em que o comprimento do ligante é selecionado para promover a montagem do anticorpo multiespecífico com a multiespecificidade desejada. Por exemplo, scFvs monoespecíficos geralmente se formam quando um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve são conectados por um ligante polipeptídico com mais de 12 resíduos de aminoácidos. Ver Pat. US N°s 4.946.778 e 5.132.405, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, a redução do comprimento do ligante polipeptídico para menos de 12 resíduos de aminoácidos impede o emparelhamento de domínios variáveis das cadeias pesada e leve na mesma cadeia polipeptídica, permitindo assim o emparelhamento dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve de uma cadeia com os domínios complementares em outra cadeia. O anticorpo resultante tem, portanto, multiespecificidade, com a especificidade de cada sítio de ligação contribuída por mais de uma cadeia polipeptídica. As cadeias polipeptídicas compreendendo domínios variáveis das cadeias pesada e leve que são unidas por ligantes entre 3 e 12 resíduos de aminoácidos formam predominantemente dímeros (denominados diabetes). Com ligantes entre 0 e 2 resíduos de aminoácidos, os trímeros (denominados triabodies) e os tetrâmeros (denominados tetrabodies) são os preferidos. No entanto, o tipo exato de oligomerização parece depender da composição do resíduo de aminoácido e da ordem do domínio variável em cade cadeia polipeptídica (por exemplo, VH-ligante-VL vs. VL-ligante-VH), além do comprimento do ligante. Um versado na técnica pode selecionar o comprimento apropriado do ligante com base na multiespecificidade desejada. Glicosilação e variantes relacionadas
[00185] Um anticorpo fornecido neste documento pode ser alterado para aumentar, diminuir ou eliminar a extensão em que é glicosilado. A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente "ligada por N" ou "ligada por O." Em alguns aspectos, a glicosilação do anticorpo é reduzida por desglicosilação enzimática, expressão em um hospedeiro bacteriano ou modificação de um resíduo de aminoácido utilizado para a glicosilação. Modificações como mutações podem ser usadas para alterar a glicosilação.
[00186] Glicosilação "ligada por N" se refere à ligação da fração carboidrato de uma cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da fração carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma dessas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial.
[00187] Glicosilação "ligada por O" refere-se à anexação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas.
[00188] A adição ou deleção de sítios de glicosilação ligada por N a (ou de) um anticorpo fornecido neste documento pode ser realizada alterando a sequência de aminoácidos de modo que uma ou mais das sequências de tripeptídeos descritas acima sejam criadas ou removidas. A adição ou deleção de sítios de glicosilação ligados por O pode ser realizada por adição, deleção ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na ou para (conforme o caso) a sequência de um anticorpo.
[00189] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende um motivo de glicosilação que é diferente de um anticorpo que ocorre naturalmente. Qualquer motivo de glicosilação de ocorrência natural adequado pode ser modificado no anticorpo fornecido neste documento. As propriedades estruturais e de glicosilação das imunoglobulinas, por exemplo, são conhecidas na técnica e resumidas, por exemplo, em Schroeder e Cavacini, J. Allergy Clin. Immunol., 2010, 125: S41-52, incorporado por referência na sua totalidade.
[00190] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região IgG1 Fc com modificação no oligossacarídeo anexado à asparagina 297 (Asn 297). Os anticorpos IgG1 de ocorrência natural produzidos por células de mamíferos compreendem tipicamente um oligossacarídeo biantenário ramificado que geralmente é ligado por uma ligação N ao Asn 297 do domínio CH2 da região Fc. Ver Wright et al., TIBTECH, 1997, 15:26-32, incorporado por referência na sua totalidade. O oligossacarídeo anexado a Asn 297 pode incluir vários carboidratos, tal como, manose, N-acetil glicosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc na "haste" da estrutura oligossacarídica biantenária.
[00191] Em algumas modalidades, o oligossacarídeo anexado ao Asn 297 é modificado para criar anticorpos com ADCC alterado. Em algumas modalidades, o oligossacarídeo é alterado para melhorar o ADCC. Em algumas modalidades, o oligossacarídeo é alterado para reduzir o ADCC.
[00192] Em alguns aspectos, um anticorpo fornecido neste documento compreende um domínio IgG1 com conteúdo de fucose reduzido na posição Asn 297 em comparação com um domínio IgG1 de ocorrência natural. Sabe-se que esses domínios Fc melhoraram o ADCC. Ver Shields et al., J. Biol. Chem., 2002, 277: 26733-26740, incorporado por referência na sua totalidade. Em alguns aspectos, esses anticorpos não compreendem fucose na posição Asn 297. A quantidade de fucose pode ser determinada usando qualquer método adequado, por exemplo, como descrito no documento WO 2008/077546, incorporado por referência na sua totalidade.
[00193] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende um oligossacarídeo bissectado, tal como um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo que é bissectado por GlcNAc. Tais variantes de anticorpos podem ter fucosilação reduzida e/ou função de ADCC melhorada. Exemplos de tais variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, no documento WO 2003/011878; Pat. US N° 6.602.684; e Pat. US Pub. 2005/0123546; cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade.
[00194] Outras variantes de glicosilação ilustrativas que podem ser incorporadas a um anticorpo fornecido neste documento são descritas, por exemplo, na Patente US Pub. N°s 2003/0157108, 2004/0093621, 2003/0157108, 2003/0115614, 2002/0164328, 2004/0093621, 2004/0132140, 2004/0110704, 2004/0110282, 2004/0109865; Pat. Internacional Pub. N°s 2000/61739, 2001/29246, 2003/085119, 2003/084570, 2005/035586, 2005/035778; 2005/053742, 2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol., 2004, 336:1239-1249; e Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 2004, 87: 614-622; cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade.
[00195] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo anexado à região Fc. Tais variantes de anticorpos podem ter função CDC melhorada. Exemplos de tais variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, no documento WO 1997/30087; WO 1998/58964; e WO 1999/22764; cada um dos quais incorporado por referência na sua totalidade.
[00196] Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpo desfucosilado incluem células Lec13 CHO, que são deficientes em fucosilação de proteínas (ver Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys., 1986, 249:533-545; Pat. U.S. Pub. 2003/0157108; WO 2004/056312; cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade) e linhagens celulares de nocaute, como o gene da alfa-1,6-fucosiltransferase ou células de nocaute CHO do FUT8 (ver Yamane- Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 2004, 87: 614-622; Kanda et al., Biotechnol. Bioeng., 2006, 94: 680-688; e WO 2003/085107; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade).
[00197] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é um anticorpo aglicosilado. Um anticorpo aglicosilado pode ser produzido usando qualquer método conhecido na técnica ou descrito neste documento. Em alguns aspectos, um anticorpo aglicosilado é produzido pela modificação do anticorpo para remover todos os sítios de glicosilação. Em alguns aspectos, os sítios de glicosilação são removidos apenas da região Fc do anticorpo. Em alguns aspectos, um anticorpo aglicosilado é produzido expressando o anticorpo em um organismo que não é capaz de glicosilação, como E. coli, ou expressando o anticorpo em uma mistura de reação livre de células.
[00198] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento tem uma região constante com função efetora reduzida em comparação com um anticorpo IgG1 nativo. Em algumas modalidades, a afinidade de uma região constante de uma região Fc de um anticorpo fornecido neste documento para o receptor Fc é menor que a afinidade de uma região constante IgG1 nativa para esse receptor Fc. Variantes e Região Fc
[00199] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc. Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc com uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos em comparação com uma região Fc que ocorre naturalmente. Em alguns aspectos, essas substituições, inserções ou deleções produzem anticorpos com estabilidade alterada, glicosilação ou outras características. Em alguns aspectos, essas substituições, inserções ou deleções produzem anticorpo aglicosilado.
[00200] Uma "região Fc variante" ou "região Fc manipulada" compreende uma sequência de aminoácidos que difere da de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, de preferência uma ou mais substituição(es) de aminoácidos. Preferencialmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc de um polipéptido de origem, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferencialmente de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo de origem. A região Fc variante, neste documento, preferencialmente terá pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região de sequência nativa de Fc e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo de origem e, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90% de homologia com esta, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de homologia com esta.
[00201] As sequências de Fc variantes para "Fc morto" pode incluir três substituições de aminoácidos na região CH2 para reduzir a ligação de FcRI às posições de índice da UE 234, 235 e 237 (ver Duncan et al., (1988) Nature 332: 563). Duas substituições de aminoácidos no sítio de ligação de C1q de complemento nas posições de índice EU 330 e 331 reduzem a fixação do complemento (ver Tao et al., J. Exp. Med. 178: 661 (1993) e Canfield e Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)). A substituição em IgG1 humana de resíduos de IgG2 nas posições 233-236 e resíduos de IgG4 nas posições 327, 330 e 331 reduz grandemente ADCC e CDC (ver, por exemplo, Armour KL. et al., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613-24; e Shields RL. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604).
[00202] Ligação de IgG para os FcRs ou C1q depende de resíduos localizados na região de dobradiça e o domínio CH2. Duas regiões do domínio CH2 são críticas para ligação Fc Rs e C1q, e têm sequências únicas em IgG2 e IgG4. Foi demonstrado que as substituições nos resíduos de IgG1 ou IgG2 humanas nas posições 233-236 e resíduos de IgG4 nas posições 327, 330 e 331 reduzem significativamente o ADCC e CDC. Inúmeras mutações foram feitas no domínio CH2 da IgG1 humana.
[00203] A substituição tripla de aminoácidos L234A, L235A e G237A elimina amplamente o FcR e complementa as funções efetoras (ver, por exemplo, US20100266505).
[00204] Em algumas modalidades, a região Fc foi modificada pela escolha do hospedeiro de expressão, tratamento enzimático de substituições de aminoácidos para ter glicosilação reduzida e ligação a FcR, em relação à proteína nativa. Mutações que reduzem a ligação ao FcR incluem, sem limitação, modificação da glicosilação na asparagina 297 do domínio Fc, que é conhecido por ser necessário para a interação ideal do FcR. Por exemplo, as substituições de aminoácidos conhecidas incluem N297A ou N297G, o que resulta na perda de um sítio de glicosilação na proteína. Domínios Fc enzimaticamente desglicosilados, anticorpos expressos de forma recombinante na presença de um inibidor de glicosilação e a expressão de domínios Fc em bactérias têm uma perda semelhante de glicosilação e consequente ligação a FcRs.
[00205] A variante LALA, L234A/L235A, também reduziu significativamente a ligação ao FcR; assim como E233P/L234V/L235A/G236 + A327G/A330S/P331S. Veja, por exemplo, Armour et al. (1999) Eur J Immunol. 29(8):2613-24. O conjunto de mutações: K322A, L234A e L235A são suficientes para abolir quase completamente a ligação de FcR e C1q. Um conjunto de três mutações, L234F/L235E/P331S (denominado TM), tem um efeito muito semelhante.
[00206] São possíveis outras variantes de Fc, incluindo, sem limitação, uma em que uma região capaz de formar uma ligação dissulfureto é deletada, ou na qual certos resíduos de aminoácidos são eliminados na extremidade do Terminal N de uma forma Fc nativa ou é adicionado um resíduo de metionina.
[00207] Fc pode estar na forma de cadeias de açúcar nativas, cadeias de açúcar aumentadas em comparação com uma forma nativa ou cadeias de açúcar diminuídas em comparação com a forma nativa, ou pode estar numa forma aglicosilada ou desglicosilada. O aumento, diminuição, remoção ou outra modificação das cadeias de açúcar pode ser alcançado por métodos comuns na técnica, como um método químico, um método enzimático ou expressando-as em uma linhagem de células de produção geneticamente modificada. Tais linhagens de célula incluem micro-organismos, por exemplo, Pichia Pastoris, e linhagem de célula de mamífero, por exemplo, células CHO, que naturalmente expressam enzimas que glicosilam. Além disso, microrganismos ou células podem ser projetados para expressar enzimas de glicosilação, ou podem ser tornados incapazes de expressar enzimas de glicosilação (ver por exemplo, Hamilton, et al, Science, 313:1441 (2006); Kanda, et al, J. Biotechnology, 130:300 (2007); Kitagawa, et al, J. Biol Chem., 269 (27): 17872 (1994); Ujita-Lee et al., J. Biol. Chem., 264 (23): 13848 (1989); Imai-Nishiya, et al, BMC Biotechnology 7:84 (2007); e WO 07/055916). Como um exemplo de uma célula manipulada para ter atividade de sialilação alterada, o gene da alfa-2,6-sialiltransferase 1 foi modificado em células do ovário de hamster chinês e em células sf9. Os anticorpos expressos por estas células manipuladas são assim sialilados pelo produto de gene exógeno. Um método adicional para a obtenção de moléculas de Fc, tendo uma quantidade modificada de resíduos de açúcar, em comparação a uma pluralidade de moléculas nativas inclui separar a referida pluralidade de moléculas em frações glicosiladas e não glicosiladas, por exemplo, usando cromatografia de afinidade de lectina (ver por exemplo, WO 07/117505). A presença de frações de glicosilação particulares, foi demonstrado, altera a função das imunoglobulinas. Por exemplo, a remoção de cadeias de açúcar de uma molécula de Fc resulta numa diminuição acentuada na afinidade de ligação à parte C1q do primeiro componente de complemento C1 e uma diminuição ou perda na citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC), desse modo não induzindo respostas imunes desnecessárias in vivo. Modificações importantes adicionais incluem sialilação e fucosilação: a presença de ácido siálico em IgG tem sido correlacionada com a atividade anti-inflamatória (veja por exemplo, Kaneko, et al, Science 313:760 (2006)), enquanto que a remoção de fucose de IgG leva a atividade ADCC aprimorada (ver por exemplo, Shoj-Hosaka, et al, J. Biochem., 140:777 (2006)).
[00208] O termo "anticorpo compreendendo a região Fc" refere-se a um anticorpo que compreende uma região Fc. A lisina do Terminal C (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do anticorpo ou por engenharia recombinante do ácido nucleico codificando o anticorpo. Consequentemente, um anticorpo possuindo uma região Fc pode compreender um anticorpo com ou sem K447.
[00209] Em alguns aspectos, a região Fc de um anticorpo fornecido neste documento é modificada para produzir um anticorpo com afinidade alterada para um receptor Fc ou um anticorpo que é mais imunologicamente inerte. Em algumas modalidades, as variantes de anticorpo fornecidas neste documento possuem algumas, mas não todas, funções efetoras. Tais anticorpos podem ser úteis, por exemplo, quando a meia-vida do anticorpo é importante in vivo, mas quando certas funções efetoras (por exemplo, ativação do complemento e ADCC) são desnecessárias ou deletérias.
[00210] Em algumas modalidades, a região Fc de um anticorpo fornecido neste documento é uma região IgG4 Fc humana compreendendo uma ou mais das mutações estabilizadoras de dobradiça S228P e L235E. Ver Aalberse et al., Immunology, 2002, 105: 9-19, incorporado por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, a região Fc de IgG4 compreende uma ou mais das seguintes mutações: E233P, F234V e L235A. Ver Armour et al., Mol. Immunol., 2003, 40: 585- 593, incorporado por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, a região Fc IgG4 compreende uma deleção na posição G236.
[00211] Em algumas modalidades, a região Fc de um anticorpo fornecido neste documento é uma região Fc de IgG1 humana compreendendo uma ou mais mutações para reduzir a ligação ao receptor Fc. Em alguns aspectos, as uma ou mais mutações estão nos resíduos selecionados de S228 (por exemplo, S228A), L234 (por exemplo, L234A), L235 (por exemplo, L235A), D265 (por exemplo, D265A) e N297 (por exemplo, N297A). Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma mutação PVA236. PVA236 significa que a sequência de aminoácidos ELLG, da posição de aminoácido 233 a 236 de IgG1 ou EFLG de IgG4, é substituída por PVA. Ver Pat. US N° 9.150.641, incorporado por referência na sua totalidade.
[00212] Em algumas modalidades, a região Fc de um anticorpo fornecido neste documento é modificada como descrito em Armour et al., Eur. J. Immunol., 1999, 29: 2613-2624; WO 1999/058572; e/ou Pat. U.K. App. N° 98099518; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.
[00213] Em algumas modalidades, a região Fc de um anticorpo fornecido neste documento é uma região humana de IgG2 Fc compreendendo uma ou mais das mutações A330S e P331S.
[00214] Em algumas modalidades, a região Fc de um anticorpo fornecido neste documento tem uma substituição de aminoácidos em uma ou mais posições selecionadas de 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329. Ver Pat. US N° 6.737.056, incorporada por referência na sua totalidade. Tais mutantes de Fc incluem mutantes de Fc com substituições em duas ou mais das posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o denominado mutante de Fc "DANA" com substituição de resíduos 265 e 297 com alanina. Ver Pat. US N° 7.332.581, incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma alanina na posição de aminoácido 265. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma alanina na posição de aminoácido 297.
[00215] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram o ADCC, como uma substituição em uma ou mais das posições 298, 333 e 334 da região Fc. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 239, 332 e 330, como descrito em Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103: 4005-4010, incorporado por referência na sua totalidade.
[00216] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma ou mais alterações que melhoram ou diminuem a ligação de C1q e/ou CDC. Ver Pat. US N° 6.194.551; WO 99/51642; e Idusogie et al., J. Immunol., 2000, 164: 4178-4184; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.
[00217] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma ou mais alterações para aumentar a meia-vida. Anticorpos com meia-vida aumentada e ligação melhorada ao receptor Fc neonatal (FcRn) são descritos, por exemplo, em Hinton et al., J. Immunol., 2006, 176: 346-356; e Pat. US Pub. 2005/0014934; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Essas variantes Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais resíduos da região Fc: 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 e 434 de uma IgG.
[00218] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma ou mais variantes da região Fc, conforme descrito na Pat. US N°s
7.371.826 5.648.260 e 5.624.821; Duncan e Winter, Nature, 1988, 322: 738-740; e WO 94/29351; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Nucleotídeos, vetores, células hospedeiras e métodos relacionados
[00219] Também são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codificam anticorpos SIRP-ALPHA, vetores compreendendo os ácidos nucleicos e células hospedeiras compreendendo os vetores e ácidos nucleicos, bem como técnicas recombinantes para a produção dos anticorpos.
[00220] Em algumas modalidades, é fornecida uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência com pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade para uma sequência ilustrativa fornecida nas SEQ ID NOs: 1-36. Em algumas modalidades, é fornecida uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência fornecida nas SEQ ID NOs: 1-36, com até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma sequência com pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade para uma sequência ilustrativa fornecida nas SEQ ID NOs: 37-44. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma sequência fornecida nas SEQ ID NOs: 37-44, com até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 mutações. Em alguns aspectos, as substituições de aminoácidos são substituições conservativas de aminoácidos. Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste parágrafo são referidos neste documento como "variantes." Em algumas modalidades, essas variantes são derivadas de uma sequência fornecida neste documento, por exemplo, por maturação por afinidade, mutagênese direcionada ao sítio, mutagênese aleatória ou qualquer outro método conhecido na técnica ou descrito neste documento. Em algumas modalidades, essas variantes não são derivadas de uma sequência fornecida neste documento e podem, por exemplo, ser isoladas de novo de acordo com os métodos fornecidos neste documento para a obtenção de anticorpos.
[00221] Para produção recombinante de um anticorpo, os ácidos nucleicos que o codificam podem ser isolados e inseridos em um vetor replicável para posterior clonagem (isto é, amplificação do DNA) ou expressão. Em alguns aspectos, o ácido nucleico pode ser produzido por recombinação homóloga, por exemplo, como descrito na Patente US N°. 5.204.244, incorporada por referência na sua totalidade.
[00222] Muitos dos diferentes vetores são conhecidos na técnica. Os componentes de vetor geralmente incluem um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição, por exemplo, como descrito na Patente US N°. 5.534.615, incorporado por referência na sua totalidade.
[00223] Exemplos ilustrativos de células hospedeiras adequadas são fornecidos abaixo. Estas células hospedeiras não pretendem limitar, e qualquer célula hospedeira adequada pode ser utilizada para produzir os anticorpos fornecidos neste documento.
[00224] As células hospedeiras adequadas incluem quaisquer células procarióticas (por exemplo, bacterianas), eucarióticas inferiores (por exemplo, leveduras) ou superiores (por exemplo, mamíferos). Os procariotas adequados incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae, tais como Escherichia (E. coli), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella (S. typhimurium), Serratia (S. marcescans), Shigella, Bacilli (B. subtilis and B. licheniformis), Pseudomonas (P. aeruginosa), e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem útil de E. coli é E. coli 294, embora outras cepas como E. coli B, E. coli X1776, e E. coli W3110 sejam também adequadas.
[00225] Além de procariontes, micróbios eucarióticos, como fungos filamentosos ou leveduras, também são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores de codificação de anticorpos SIRP-ALPHA. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é um micro-organismo hospedeiro eucariótico inferior comumente usado. No entanto, vários outros gêneros, espécies e linhagens estão disponíveis e são úteis, como Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus K. wickerhamii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thermotolerans, e K. marxianus), Yarrowia, Pichia pastoris, Candida (C. albicans), Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces (S. occidentalis), e filamentous fungi tal como, por exemplo Penicillium, Tolypocladium, and Aspergillus (A. nidulans and A. niger).
[00226] Células hospedeiras de mamífero úteis incluem células COS-7, células HEK293; células de rim de hamster bebê (BHK); ovário de hamster chinês (CHO); células de Sertoli de camundongo; células de rim de macaco verde africano (VERO-76) e semelhantes.
[00227] As células hospedeiras utilizadas para produzir um anticorpo SIRP- ALPHA podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis, tais como, por exemplo, F10 de Ham, Meio Essencial Mínimo (MEM), RPMI-1640 e Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em
Ham et al., Meth. Enz., 1979, 58:44; Barnes et al., Anal. Biochem., 1980, 102: 255; e Patentes US N°s. 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 e 5.122.469; ou WO 90/03430 e WO 87/00195 podem ser utilizados. Cada uma das referências anteriores é incorporada por referência na sua totalidade.
[00228] Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos, elementos traço (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na faixa do micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Todos os outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que serão conhecidas por aqueles versados na técnica.
[00229] As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são aquelas usadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para a expressão, e serão evidentes para a pessoa ordinariamente versada na técnica.
[00230] Ao se usar técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os detritos particulados, células hospedeiras ou fragmentos lisados, é removido, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Por exemplo, Carter et al. (Bio/Technology, 1992, 10: 163-167; incorporado por referência na sua totalidade) descreve um procedimento para isolar anticorpos que são secretados para o espaço periplásmico de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) por cerca de 30 min. Os detritos celulares podem ser removidos por centrifugação.
[00231] Em algumas modalidades, o anticorpo é produzido num sistema isento de células. Em alguns aspectos, o sistema sem células é um sistema de transcrição e tradução in vitro, conforme descrito em Yin et al., MAbs, 2012, 4: 217- 225, incorporado por referência na sua totalidade. Em alguns aspectos, o sistema livre de células utiliza um extrato livre de células de uma célula eucariótica ou de uma célula procariótica. Em alguns aspectos, a célula procariótica é E. coli. A expressão livre de células do anticorpo pode ser útil, por exemplo, onde o anticorpo se acumula em uma célula como um agregado insolúvel, ou onde os rendimentos da expressão periplásmica são baixos.
[00232] Quando o anticorpo é secretado no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados usando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon® ou Millipore® Pellcon®. Um inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios.
[00233] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatite, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo uma técnica de purificação particularmente útil. A adequabilidade da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que compreendem cadeias pesadas de 1, 2 ou 4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 1983, 62: 1-13, incorporado por referência na sua totalidade). A proteína G é útil para todos os isotipos de camundongo e para o γ3 humano (Guss et al., EMBO J., 1986, 5: 1567-1575, incorporado por referência na sua totalidade).
[00234] A matriz à qual o ligante de afinidade é ligado é muito frequentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poros controlados ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que é possível atingir com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina BakerBond ABX® é útil para purificação.
[00235] São também disponíveis outras técnicas para purificação de proteínas, tais como o fraccionamento numa coluna de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia sobre precipitação de heparina Sepharose®, cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amônio, e podem ser aplicadas por aquele versado na técnica.
[00236] Após qualquer(isquer) etapa(s) de purificação preliminar, a mistura que compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH usando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5 a cerca de 4,5, geralmente realizado a baixas concentrações de sal (por exemplo, de cerca de 0 a cerca de 0,25 M de sal). Métodos de Fabricação de Anticorpos SIRP-ALPHA Preparação do antígeno SIRP-ALPHA
[00237] O antígeno SIRP-ALPHA usado para isolamento ou criação dos anticorpos fornecidos neste documento pode ser SIRP-ALPHA intacto ou um fragmento de SIRP-ALPHA. O antígeno SIRP-ALPHA pode estar, por exemplo, na forma de uma proteína isolada ou de uma proteína expressa na superfície de uma célula.
[00238] Em algumas modalidades, o antígeno SIRP-ALPHA é uma variante de SIRP-ALPHA de ocorrência não natural, como uma proteína SIRP-ALPHA com uma sequência de aminoácidos ou modificação pós-traducional que não ocorre na natureza.
[00239] Em algumas modalidades, o antígeno SIRP-ALPHA é truncado pela remoção, por exemplo, de sequências intracelulares ou de extensão de membrana ou sequências de sinal. Em algumas modalidades, o antígeno SIRP-ALPHA é fundido no Terminal C deste a um domínio Fc de IgG1 humana ou a um tag de poli- histidina. Métodos de Fabricação de Anticorpos Monoclonais
[00240] Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos, por exemplo, usando o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 1975, 256: 495-497 (incorporado por referência na sua totalidade) e/ou por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente US N° 4.816.567, incorporada por referência na sua totalidade). Os anticorpos monoclonais também podem ser obtidos, por exemplo, utilizando bibliotecas com base em fagos ou leveduras. Ver, por exemplo, as Patentes US N°s 8.258.082 e 8.691.730, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade.
[00241] No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado é imunizado para provocar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma. Ver Goding J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3ª ed. (1986), Academic Press, San Diego, CA, incorporado por referência na sua totalidade.
[00242] As células de hibridoma assim são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado, um meio que contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma precursoras não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma precursoras não possuírem a enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), substâncias estas que evitam o crescimento de células deficientes em HGPRT.
[00243] As células úteis de mieloma são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a produção estável de alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são condições de mídia sensíveis, como a presença ou a ausência de meio HAT. Entre estas, as linhagens de células de mieloma preferidas são linhagens de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de camundongo MOP-21 e MC-11 (disponíveis a partir do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA) e células SP-2 ou X63-Ag8-653 (disponível a partir da American Type Culture Collection, Rockville, MD). Linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos. Ver, por exemplo, Kozbor, J. Immunol., 1984, 133: 3001, incorporado por referência na sua totalidade.
[00244] Após a identificação de células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade desejada, afinidade e/ou atividade biológica, os clones selecionados podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitantes e cultivados por métodos padrão. Ver Goding, supra. Os meios de cultura adequados para esse fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascites em um animal.
[00245] DNA que codifica o anticorpo monoclonal pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves dos anticorpos monoclonais). Assim, as células de hibridoma podem servir como uma fonte útil de anticorpos que codificam DNA com as propriedades desejadas. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, os quais são então transfectados para células hospedeiras tais como bactérias (por exemplo, E. coli), fermento (por exemplo, Saccharomyces ou Pichia Sp., células COS, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem anticorpos, para produzir os anticorpos monoclonais. Métodos de Fabricação de Anticorpos Quiméricos
[00246] Métodos ilustrativos para produzir anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente US N° 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81: 6851-6855; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, um anticorpo quimérico é produzido usando técnicas recombinantes para combinar uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, como um macaco) com uma região constante humana. Métodos de Fabricação de Anticorpos Humanizados
[00247] Os anticorpos humanizados podem ser gerados substituindo a maioria ou a totalidade das frações estruturais de um anticorpo monoclonal não humano com as correspondentes sequências de anticorpos humanos. Consequentemente, é gerada uma molécula híbrida em que apenas a variável específica do antígeno, ou CDR, é composta por uma sequência não humana. Os métodos para obter anticorpos humanizados incluem os descritos em, por exemplo, Winter e Milstein, Nature, 1991, 349: 293-299; Rader et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95:8910-8915; Steinberger et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:36073- 36078; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86:10029-10033; Patentes US N° 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Métodos de fabricação de anticorpos humanos
[00248] Os anticorpos humanos podem ser gerados por uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, por exemplo usando animais transgênicos (por exemplo, camundongos humanizados). Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 2551; Jakobovits et al., Nature, 1993, 362: 255-258; Bruggermann et al., Year in Immuno., 1993, 7:33; e Patentes US N°s. 5.591.669,
5.589.369 e 5.545.807; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Os anticorpos humanos também podem ser derivados de bibliotecas de exibição de fagos (Veja, por exemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 1991, 227:381-388; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597; e Pat. US N°s 5.565.332 e 5.573.905); cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade. Os anticorpos humanos também podem ser gerados por células B ativadas in vitro (Ver, por exemplo, Patente US N°s 5.567.610 e 5.229.275, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade). Os anticorpos humanos também podem ser derivados de bibliotecas baseadas em fermento (Veja, por exemplo, Patente US N° 8.691.730, incorporada por referência na sua totalidade). Métodos para fazer fragmentos de anticorpos
[00249] Os fragmentos de anticorpo fornecidos neste documento podem ser produzidos por qualquer método adequado, incluindo os métodos ilustrativos descritos neste documento ou aqueles conhecidos na técnica. Os métodos adequados incluem técnicas recombinantes e digestão proteolítica de anticorpos completos. Métodos ilustrativos para produzir fragmentos de anticorpos são descritos, por exemplo, em Hudson et al., Nat. Med., 2003, 9: 129-134, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir anticorpos scFv são descritos, por exemplo, em Plückthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore, Springer-Verlag, Nova York, pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; e Pat. US N°s 5.571.894 e 5.587.458; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Métodos de fabricação de andaimes alternativos
[00250] As estruturas em andaimes alternativas fornecidas neste documento podem ser feitas por qualquer método adequado, incluindo os métodos ilustrativos descritos neste documento ou aqueles conhecidos na técnica. Por exemplo, métodos de preparação de AdnectinsTM são descritos em Emanuel et al., mAbs, 2011, 3:38-48, incorporado por referência na sua totalidade. Métodos de preparação de iMabs são descritos na Pat. US Pub. N° 2003/0215914, incorporado por referência na sua totalidade. Métodos de preparação de Anticalins® são descritos em Vogt e Skerra, Chem. Biochem., 2004, 5: 191-199, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de preparação de domínios de Kunitz são descritos em Wagner et al., Biochem. & Biophys. Res. Comm., 1992, 186: 118-1145, incorporado por referência na sua totalidade. Métodos de preparação de aptâmeros de peptídeos de tiorretoxina são fornecidos em Geyer e Brent, Meth. Enzymol., 2000, 328: 171-208, incorporado por referência na sua totalidade. Métodos de preparação de Affibodies são fornecidos em Fernandez, Curr. Opinion in Biotech., 2004, 15: 364-373, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de preparação de DARPins são fornecidos em Zahnd et al., J. Mol. Biol., 2007, 369: 1015-1028, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de preparação de Affilins são fornecidos em Ebersbach et al., J. Mol. Biol., 2007, 372: 172-185, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de preparação de Tetranectinas são fornecidos em Graversen et al., J. Biol. Chem., 2000, 275: 37390-37396, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de preparação de Avimers são fornecidos em Silverman et al., Nature Biotech., 2005, 23: 1556-1561, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de preparação de Fynomers são fornecidos em Silacci et al., J. Biol. Chem., 2014, 289: 14392-14398, incorporado por referência na sua totalidade. Informações adicionais sobre estruturas em andaimes alternativas são fornecidas em Binz et al., Nat. Biotechnol., 2005 23:1257-1268; e Skerra, Current Opin. in Biotech., 2007 18:295- 304, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Métodos de fabricação de anticorpos multiespecíficos
[00251] Os anticorpos multiespecíficos alternativos fornecidos neste documento podem ser feitos por qualquer método adequado, incluindo os métodos ilustrativos descritos neste documento ou aqueles conhecidos na técnica. Os métodos para produzir anticorpos comuns de cadeia leve são descritos em Merchant et al., Nature Biotechnol., 1998, 16: 677-681, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos tetravalentes são descritos em Coloma e Morrison, Nature Biotechnol., 1997, 15: 159-163, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir imunoglobulinas híbridas são descritos em Milstein e Cuello, Nature, 1983, 305: 537-540; e Staerz e Bevan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83: 1453-1457; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de produção de imunoglobulinas com modificação de knobs-into-holes são descritos na Patente US N° 5.731.168, incorporada por referência na sua totalidade. Os métodos de produção de imunoglobulinas com modificações eletrostáticas são fornecidos no documento WO 2009/089004, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos de cadeia única são descritos em Traunecker et al., EMBO J., 1991, 10: 3655-3659; e Gruber et al., J. Immunol., 1994, 152: 5368-5374; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de produção de anticorpos de cadeia única, cujo comprimento do ligante pode variar, são descritos na Patente US N°s 4.946.778 e
5.132.405, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade. Os métodos de produção de diabéticos são descritos em Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 6444-6448, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de produção de triabodies e tetrabodies são descritos em Todorovska et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248: 47-66, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir derivados triespecíficos de F(ab')3 são descritos em Tutt et al. J. Immunol., 1991, 147: 60-69, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de produção de anticorpos reticulados são descritos na Patente US N° 4.676.980; Brennan et al., Science, 1985, 229: 81-83; Staerz et al. Nature, 1985, 314: 628-631; e EP 0453082; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir domínios de ligação ao antígeno montados por zíperes de leucina são descritos em Kostelny et al., J. Immunol., 1992, 148: 1547-1553, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de produção de anticorpos através da abordagem DNL são descritos na Patente US N°s 7.521.056; 7.550.143; 7.534.866; e 7.527.787; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir híbridos de moléculas de anticorpo e não-anticorpo são descritos no documento WO
93/08829, incorporado por referência na sua totalidade, para exemplos de tais anticorpos. Os métodos para produzir anticorpos DAF são descritos na Patente US Pub. 2008/0069820, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de produção de anticorpos através redução e oxidação são descritos em Carlring et al., PLoS One, 2011, 6: e22533, incorporado por referência em sua totalidade. Os métodos de produção de DVD-IgsTM são descritos na Patente US N° 7.612.181, incorporada por referência na sua totalidade. Os métodos para fabricar o ARTsTM são descritos em Moore et al., Blood, 2011, 117: 454-451, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para fabricar DuoBodies® são descritos em Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013, 110: 5145-5150; Gramer et al., mAbs, 2013, 5: 962-972; e Labrijn et al., Nature Protocols, 2014, 9: 2450-2463; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir anticorpos compreendendo scFvs fundidos ao terminal C de CH3 a partir de uma IgG são descritos em Coloma e Morrison, Nature Biotechnol., 1997, 15: 159-163, incorporados por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir anticorpos nos quais uma molécula Fab está ligada à região constante de uma imunoglobulina são descritos em Miler et al., J. Immunol., 2003, 170: 4854-4861, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de produção de corpos CovX são descritos em Doppalapudi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107: 22611-22616, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir anticorpos Fcab são descritos em Wozniak-Knopp et al., Protein Eng. Des. Sel., 2010, 23: 289-297, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir anticorpos TandAb® são descritos em Kipriyanov et al., J. Mol. Biol., 1999, 293: 41-56 e Zhukovsky et al., Blood, 2013, 122: 5116, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir Fabs em tandem são descritos no documento WO 2015/103072, incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos de produção de ZybodiesTM são descritos em LaFleur et al., mAbs, 2013, 5: 208-218, incorporado por referência na sua totalidade. Métodos de fazer variantes
[00252] Qualquer método adequado pode ser usado para introduzir variabilidade em uma sequência polinucleotídica que codifica um anticorpo, incluindo PCR propenso a erros, embaralhamento de cadeia e mutagênese direcionada a oligonucleotídeo, como mutagênese direcionada a trinucleotídeo (TRIM). Em alguns aspectos, vários resíduos de CDR (por exemplo, 4-6 resíduos de cada vez) são randomizados. Os resíduos de CDR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, usando mutagênese de escaneamento de alanina ou modelagem. CDR-H3 e CDR-L3 em particular são frequentemente direcionadas por mutação.
[00253] A introdução da diversidade nas regiões variáveis e/ou CDRs pode ser usada para produzir uma biblioteca secundária. A biblioteca secundária é então pesquisada para identificar variantes de anticorpos com afinidade aprimorada. A maturação por afinidade através da construção e resseleção de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology, 2001, 178: 1-37, incorporado por referência em sua totalidade. Ensaios
[00254] Uma variedade de ensaios conhecidos na técnica pode ser usada para identificar e caracterizar um anticorpo SIRP-ALPHA fornecido neste documento. Ensaios de ligação, competição e mapeamento de epítopos
[00255] A atividade específica de ligação ao antígeno de um anticorpo fornecido neste documento pode ser avaliada por qualquer método adequado, incluindo o uso de SPR, BLI, RIA e MSD-SET, conforme descrito em outras partes desta divulgação. Além disso, a atividade de ligação ao antígeno pode ser avaliada por ensaios ELISA e ensaios de Western blot.
[00256] Os ensaios para medir a competição entre dois anticorpos, ou um anticorpo e outra molécula (por exemplo, um ou mais ligantes de SIRP-ALPHA) são descritos em outras partes desta divulgação e, por exemplo, em Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, incorporado por referência na sua totalidade.
[00257] Os ensaios para mapear os epítopos aos quais um anticorpo fornecido neste documento se ligam são descritos, por exemplo, em Morris "Epitope Mapping Protocols", em Methods in Molecular Biology vol. 66, 1996, Humana Press, Totowa, NJ, incorporado por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por competição peptídica. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por espectrometria de massa. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por cristalografia. Ensaios para Funções Efetoras
[00258] A função efetora após o tratamento com um anticorpo fornecido neste documento pode ser avaliada usando uma variedade de ensaios in vitro e in vivo conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 1991, 9:457-492; U.S. Pat. Nºs 5.500.362 e 5.821.337; Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1986, 83:7059-7063; Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1985, 82:1499-1502; Bruggemann et al., J. Exp. Med., 1987, 166:1351-1361; Clynes et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1998, 95:652-656; WO 2006/029879; WO 2005/100402; Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 1996, 202:163-171; Cragg et al., Blood, 2003, 101:1045-1052; Cragg et al. Blood, 2004, 103: 2738-2743; e Petkova et al., Int'l. Immunol., 2006, 18: 1759-1769; cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Composições Farmacêuticas
[00259] Um anticorpo fornecido neste documento pode ser formulado em qualquer composição farmacêutica apropriada e administrado por qualquer via de administração adequada. Vias de administração adequadas incluem, mas não estão limitadas às vias intra-arterial, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, nasal, parenteral, pulmonar e subcutânea.
[00260] A composição farmacêutica pode compreender um ou mais excipientes farmacêuticos. Qualquer excipiente farmacêutico adequado pode ser utilizado, e aquele versado na técnica é capaz de selecionar excipientes farmacêuticos adequados. Consequentemente, os excipientes farmacêuticos fornecidos abaixo são destinados a ser ilustrativos e não limitativos. Excipientes farmacêuticos adicionais incluem, por exemplo, os descritos no Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al. (Eds.), 6ª Ed. (2009), incorporado por referência na sua totalidade.
[00261] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um agente antiespuma. Qualquer agente antiespuma adequado pode ser usado. Em alguns aspectos, o agente antiespuma é selecionado de um álcool, um éter, um óleo, uma cera, um silicone, um surfactante e combinações destes. Em alguns aspectos, o agente antiespuma é selecionado a partir de um óleo mineral, um óleo vegetal, etileno bis-estearamida, uma cera de parafina, uma cera de éster, uma cera de álcool graxo, um álcool graxo de cadeia longa, um sabão de ácido graxo, um éster de ácido graxo, um silício glicol, um fluorosilicone, um copolímero de polietilenoglicol-polipropilenoglicol, polidimetilsiloxano-dióxido de silício, éter, álcool octil, álcool caprílico, trioleato de sorbitano, álcool etílico, 2-etil-hexanol, dimeticona, álcool oleílico, simeticona, e combinações destes.
[00262] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um cossolvente. Exemplos ilustrativos de cossolventes incluem etanol, poli(etileno)glicol, butileno glicol, dimetilacetamida, glicerina, propilenoglicol e combinações destes.
[00263] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um tampão. Exemplos ilustrativos de tampões incluem acetato, borato, carbonato, lactato, malato, fosfato, citrato, hidróxido, dietanolamina, monoetanolamina, glicina, metionina, goma guar, glutamato monossódico e combinações destes.
[00264] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um carreador ou preenchedor. Exemplos ilustrativos de carreadores ou preenchedores incluem lactose, maltodextrina, manitol, sorbitol, quitosana, ácido esteárico, goma xantana e goma guar.
[00265] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um surfactante. Exemplos ilustrativos de surfactantes incluem d-alfa tocoferol, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, cetrimida, cloreto de cetilpiridínio, docusato de sódio, behenato de gliceril, monooleato de gliceril, ácido láurico, hidroxiestearato de macrogol 15, álcool miristílico, fosfolipídios, éteres de alquil de polioxietileno, ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, estearatos de polioxietileno, polioxilglicerídios, laurilsulfato de sódio, ésteres de sorbitano e succinato de polietileno (glicol) de vitamina E.
[00266] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um agente antiaglomerante. Exemplos ilustrativos de agentes antiaglomerantes incluem fosfato de cálcio (tribásico), hidroximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, óxido de magnésio e combinações destes.
[00267] Outros excipientes que podem ser utilizados com as composições farmacêuticas incluem, por exemplo, albumina, antioxidantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, polímeros bioabsorvíveis, agentes quelantes, agentes de liberação controlada, diluentes, agentes dispersantes, potencializadores de dissolução, agentes emulsionantes, agentes gelificantes, bases de pomada, potencializadores de penetração, conservantes, agentes solubilizantes, solventes, agentes estabilizantes, açúcares e combinações destes. Exemplos específicos de cada um desses agentes são descritos, por exemplo, no Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al. (Eds.), 6ª Ed. (2009), The Pharmaceutical Press, incorporado por referência na sua totalidade.
[00268] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um solvente. Em alguns aspectos, o solvente é solução salina, como solução salina isotônica estéril ou solução de dextrose. Em alguns aspectos, o solvente é água para injeção.
[00269] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas estão sob uma forma particulada, tal como uma micropartícula ou uma nanopartícula. Micropartículas e nanopartículas podem ser formadas a partir de qualquer material adequado, tal como um polímero ou um lipídio. Em alguns aspectos, as micropartículas ou nanopartículas são micelas, lipossomas ou polimerossomas.
[00270] São ainda fornecidas neste documento composições farmacêuticas anidras e formas de dosagem compreendendo um anticorpo, uma vez que a água pode facilitar a degradação de alguns anticorpos.
[00271] As composições farmacêuticas anidras e formas de dosagem fornecidas neste documento podem ser preparadas utilizando umidade anidra ou baixa contendo ingredientes e baixas condições de umidade ou baixa umidade. As composições farmacêuticas e formas de dosagem que compreendem lactose e pelo menos um ingrediente ativo que compreende uma amina primária ou secundária pode ser anidro se um contato substancial com a hidratação e/ou umidade durante a fabricação, embalagem e/ou armazenamento é esperado.
[00272] Uma composição farmacêutica anidra deve ser preparada e armazenada de tal forma que a sua natureza anidra seja mantida. Assim, as composições anidras podem ser embaladas utilizando materiais conhecidos para prevenir a exposição a água, tais que possam ser incluídas em kits de fórmulas apropriadas. Exemplos de embalagens adequadas incluem, mas não estão limitados às folhas hermeticamente seladas, plásticos, recipientes de dose unitária (por exemplo, frascos), embalagens Blister e embalagens de tiras.
[00273] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é formulado como formas de dosagem parenterais. As formas de dosagem parenterais podem ser administradas aos sujeitos por várias vias, incluindo, mas não se limitando a, subcutânea, intravenosa (incluindo infusões e injeções em bolus), intramuscular e intra-arterial. Porque a sua administração tipicamente ultrapassa as defesas naturais dos sujeitos contra contaminantes, as formas de dosagem parenterais são tipicamente estéreis ou capazes de serem esterilizadas antes da administração a um sujeito. Exemplos de formas de dosagem parenterais incluem, mas não estão limitados às soluções prontas para injeção, produtos secos (ou seja, liofilizados) prontos para serem dissolvidos ou suspensos num veículo farmaceuticamente aceitável para injeção, suspensões prontas para injeção e emulsões.
[00274] Os veículos adequados que podem ser utilizados para fornecer formas de dosagem parenterais são bem conhecidos dos versados na técnica. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: Água para Injeção USP; veículos aquosos tais como, mas não limitados a Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose, Injeção de Dextrose e Cloreto de Sódio, e Injeção de Ringer Lactada; veículos miscíveis em água tais como, mas não limitados ao álcool etílico, polietileno glicol, e polipropileno glicol; e veículos não aquosos tais como, mas não limitados ao óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de sésamo, oleato de etila, miristato de isopropil, e benzoato de benzil.
[00275] Os excipientes que aumentam a solubilidade de um ou mais dos anticorpos divulgados neste documento também podem ser incorporados nas formas de dosagem parenterais.
[00276] Em algumas modalidades, a forma de dosagem parenteral é liofilizada. Formulações liofilizadas exemplificativas são descritas, por exemplo, nas Patentes US Nºs 6.267.958 e 6.171.586; e WO 2006/044908; cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade.
[00277] Na terapêutica humana, o médico determinará a posologia que ele considera mais adequada de acordo com um tratamento preventivo ou curativo e de acordo com a idade, peso, condição e outros fatores específicos do sujeito a ser tratado.
[00278] Em certas modalidades, uma composição fornecida neste documento é uma composição farmacêutica ou uma única forma de dosagem unitária. As composições farmacêuticas e as formas de dosagem única fornecidas neste documento compreendem uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpos profiláticos ou terapêuticos.
[00279] A quantidade de anticorpo ou composição que será eficaz na prevenção ou tratamento de um distúrbio ou um ou mais sintomas deste variará com a natureza e gravidade da doença ou condição e com a via através da qual o anticorpo é administrado. A frequência e a dosagem também variam de acordo com os fatores específicos para cada sujeito, dependendo da terapia específica (por exemplo, agentes terapêuticos ou profiláticos) administrados, a gravidade do distúrbio, doença ou condição, a via de administração, bem como a idade, peso corporal, resposta e o histórico médico passado do sujeito. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou de modelo animal.
[00280] Diferentes quantidades terapeuticamente eficazes podem ser aplicáveis para diferentes doenças e condições, como será facilmente conhecido pelos versados na técnica. Da mesma forma, quantidades suficientes para a prevenção, administração, tratamento ou melhoria de tais distúrbios, mas insuficientes para causar ou suficientes para reduzir os efeitos adversos associados aos anticorpos fornecidos neste documento também são abrangidos pelas quantidades de dosagem e os esquemas de frequência de dose fornecidos neste documento. Além disso, quando um a sujeito são administradas várias dosagens de uma composição fornecida neste documento, nem todas as dosagens precisam ser as mesmas. Por exemplo, a dosagem administrada ao sujeito pode ser aumentada para melhorar o efeito profilático ou terapêutico da composição ou pode ser diminuída para reduzir um ou mais efeitos colaterais que um sujeito particular está experimentando.
[00281] Em certas modalidades, o tratamento ou a prevenção podem ser iniciados com uma ou mais doses de carga de um anticorpo ou composição fornecida neste documento, seguidas por uma ou mais doses de manutenção.
[00282] Em certas modalidades, uma dose de um anticorpo ou composição fornecida neste documento pode ser administrada para atingir uma concentração no estado estacionário do anticorpo no sangue ou no soro do sujeito. A concentração no estado estacionário pode ser determinada por medição de acordo com as técnicas disponíveis para os versados na técnica ou pode basear-se nas características físicas do sujeito, como altura, peso e idade.
[00283] Como discutido em mais detalhes em outra parte desta divulgação, um anticorpo fornecido neste documento pode opcionalmente ser administrado com um ou mais agentes adicionais úteis para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio. A quantidade eficaz desses agentes adicionais pode depender da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e dos outros fatores conhecidos na técnica ou descritos neste documento. Aplicações Terapêuticas
[00284] Para aplicações terapêuticas, os anticorpos da invenção são administrados a um mamífero, geralmente um ser humano, numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável tal como os conhecidos na técnica e os discutidos acima. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser administrados a um ser humano por via intravenosa como um bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intra- cerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal ou intratumoral. Os anticorpos também são adequadamente administrados por vias peritumorais, intralesionais ou perilesionais, para exercer efeitos terapêuticos locais e sistêmicos. A via intraperitoneal pode ser particularmente útil, por exemplo, no tratamento de tumores ovarianos.
[00285] Os anticorpos fornecidos neste documento podem ser úteis para o tratamento de qualquer doença ou condição envolvendo SIRP-ALPHA. Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doença ou condição que pode se beneficiar do tratamento com um anticorpo anti-SIRP-ALPHA. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um tumor. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um distúrbio proliferativo celular. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um câncer. Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma infecção.
[00286] Exemplos de sintomas, enfermidades e/ou doenças que podem ser tratadas com um anticorpo anti-SIRPα em questão incluem, mas não se limitam ao câncer (qualquer forma de câncer, incluindo mas não se limitando a: carcinomas, tumores de tecidos moles, sarcomas, teratomas, melanomas, leucemias, linfomas, cânceres cerebrais, tumores sólidos, mesotelioma (MSTO), etc.); infecção (por exemplo, infecção crônica); e uma doença ou distúrbio imunológico (por exemplo, uma doença inflamatória) (por exemplo, esclerose múltipla, artrite e similares, por exemplo, para terapia imunossupressora). Um anticorpo anti-SIRPα em questão também pode ser usado para condicionamento de transplantes (por exemplo, transplante de células-tronco, transplante de medula óssea etc.) (por exemplo, para destruir células malignas, para fornecer imunossupressão para impedir que o corpo do paciente rejeite as células tronco/do doador, etc.). Por exemplo, em alguns casos, uma combinação de anticorpos em questão ou anticorpo biespecífico (por exemplo, anti-SIRPα em combinação com anti-CD117) encontra uso para condicionamento de transplantes. Por exemplo, uma combinação de anticorpos em questão ou anticorpo biespecífico (por exemplo, anti-SIRPα em combinação com anti-CD117) pode ser usada para condicionamento de transplante de medula óssea. Em alguns casos, um anticorpo anti-SIRPα em questão (por exemplo, uma combinação de anticorpos) pode ser usado para terapia imunossupressora.
[00287] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento são fornecidos para uso como um medicamento. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento são fornecidos para uso na fabricação ou preparação de um medicamento. Em algumas modalidades, o medicamento é para o tratamento de uma doença ou condição que pode se beneficiar de um anticorpo anti-SIRP-ALPHA. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um tumor. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um distúrbio proliferativo celular. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um câncer. Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma infecção. Uma doença ou condição pode ser: câncer; infecção; uma infecção viral; uma infecção bacteriana; uma infecção fúngica; fibrose; arteriosclerose; uma infecção parasitária, opcionalmente malária; e/ou depleção ou redução de células-tronco endógenas formadoras de sangue da medula óssea para permitir radiação e/ou quimioterapia - condicionamento livre ou reduzido para transplante de células-tronco formadoras de sangue, opcionalmente em combinação com o anticorpo anti-CKIT (CD117).
[00288] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de tratamento de uma doença ou condição em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um câncer. Em alguns aspectos, a doença ou condição é uma infecção.
[00289] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de tratamento de uma doença ou condição em um sujeito em necessidade deste, através da administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito, em que a doença ou condição é um câncer e o câncer é selecionado a partir de um tumor sólido e um tumor hematológico.
[00290] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de aumento da fagocitose em um sujeito em necessidade deste, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo divulgado neste documento ou uma composição farmacêutica divulgada neste documento.
[00291] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de modulação de resposta imune em um sujeito em necessidade deste, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo divulgado neste documento ou uma composição farmacêutica divulgada neste documento.
[00292] Qualquer câncer adequado pode ser tratado com os anticorpos fornecidos neste documento.
[00293] Por exemplo, qualquer câncer, em que as células cancerígenas exibam expressão aumentada de CD47 em comparação com células não cancerígenas, é um câncer adequado para ser tratado pelos métodos e composições em questão. Conforme usado neste documento, "câncer" inclui qualquer forma de câncer, incluindo, mas não se limitando a cânceres sólidos de tumores (por exemplo, pulmão, próstata, mama, bexiga, cólon, ovário, pâncreas,
rim, fígado, glioblastoma, meduloblastoma, leiomiossarcoma, carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, melanomas, neuroendócrinos etc.) e cânceres líquidos (por exemplo, cânceres hematológicos); carcinomas; tumores de tecidos moles; sarcomas; teratomas; melanomas; leucemias; linfomas; e cânceres cerebrais, incluindo doença residual mínima e incluindo tumores primários e metastáticos. Qualquer câncer, em que as células cancerígenas expressem CD47 (por exemplo, em alguns casos, as células cancerígenas exibem expressão aumentada de CD47 em comparação com células não cancerígenas), é um câncer adequado para ser tratado pelos métodos e composições do sujeito (por exemplo, um anticorpo anti-SIRPα em questão).
[00294] Os carcinomas são doenças malignas que se originam nos tecidos epiteliais. As células epiteliais cobrem a superfície externa do corpo, revestem as cavidades internas e formam o revestimento dos tecidos glandulares. Exemplos de carcinomas incluem, mas não estão limitados a: adenocarcinoma (câncer que começa nas células glandulares (secretoras)), por exemplo, câncer de mama, pâncreas, pulmão, próstata e cólon podem ser adenocarcinomas; carcinoma adrenocortical; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células renais; carcinoma ovariano; carcinoma in situ; carcinoma ductal; carcinoma da mama; carcinoma basocelular; carcinoma de células escamosas; carcinoma de células de transição; carcinoma do cólon; carcinoma nasofaríngeo; carcinoma de células renais císticas multilocular; carcinoma de células do tipo grão de aveia; carcinoma de pulmão de células grandes; carcinoma de pulmão de células pequenas; carcinoma de pulmão de células não pequenas; e similares. Os carcinomas podem ser encontrados na próstata, pâncreas, cólon, cérebro (geralmente como metástases secundárias), pulmão, mama, pele, etc.
[00295] Os tumores de tecidos moles são um grupo altamente diversificado de tumores raros derivados do tecido conjuntivo. Exemplos de tumores de tecidos moles incluem, mas não estão limitados a: sarcoma alveolar de partes moles; histiocitoma fibroso angiomatoide; fibroma condromixoide; condrossarcoma esquelético; condrossarcoma mixoide extra-esquelético; sarcoma de células claras; tumor desmoplástico de pequenas células redondas; dermatofibrossarcoma protuberante; tumor estromal endometrial; Sarcoma de Ewing; fibromatose
(desmoide); fibrossarcoma infantil; tumor estromal gastrointestinal; tumor de células gigantes ósseas; tumor tenossinovial de células gigantes; tumor miofibroblástico inflamatório; leiomioma uterino; leiomiossarcoma; lipoblastoma; lipoma típico; lipoma de células fusiformes ou pleomórfico; lipoma atípico; lipoma condroide; lipossarcoma bem diferenciado; lipossarcoma mixoide/de células redondas; lipossarcoma pleomórfico; histiocitoma fibroso maligno mixoide; histiocitoma fibroso maligno de alto grau; mixofibrossarcoma; tumor maligno da bainha do nervo periférico; mesotelioma; neuroblastoma; osteocondroma; osteossarcoma; tumor neuroectodérmico primitivo; rabdomiossarcoma alveolar; rabdomiossarcoma embrionário; schwannoma benigno ou maligno; sarcoma sinovial; Tumor de Evan; fasciite nodular; fibromatose do tipo desmoide; tumor fibroso solitário; dermatofibrossarcoma protuberante (DFSP); angiossarcoma; hemangioendotelioma epitelioide; tumor tenossinovial de células gigantes (TGCT); sinovite vilonodular pigmentada (PVNS); displasia fibrosa; mixofibrossarcoma; fibrossarcoma; sarcoma sinovial; tumor maligno da bainha do nervo periférico; neurofibroma; e adenoma pleomórfico de tecidos moles; e neoplasias derivadas de fibroblastos, miofibroblastos, histiócitos, células vasculares/células endoteliais e células da bainha nervosa.
[00296] Um sarcoma é um tipo raro de câncer que surge em células de origem mesenquimal, por exemplo, nos ossos ou nos tecidos moles do corpo, incluindo cartilagem, gordura, músculo, vasos sanguíneos, tecido fibroso ou outro tecido conjuntivo ou de suporte. Diferentes tipos de sarcoma são baseados em onde o câncer se forma. Por exemplo, osteossarcoma se forma no osso, lipossarcoma se forma na gordura e rabdomiossarcoma se forma no músculo. Exemplos de sarcomas incluem, mas não estão limitados a: tumor de Askin; sarcoma botrioide; condrossarcoma; sarcoma de Ewing; hemangioendotelioma maligno; schwannoma maligno; osteossarcoma; sarcomas de tecidos moles (por exemplo, sarcoma alveolar de partes moles; angiossarcoma; cistossarcoma filoide; dermatofibrossarcoma protuberante (DFSP); tumor desmoide; tumor desmoplásico de pequenas células redondas; sarcoma epitelioide; condrossarcoma extraesquelético; osteossarcoma extraesquelético; fibrossarcoma; tumor estromal gastrintestinal (GIST); hemangiopericitoma; hemangiossarcoma (mais comumente referido como "angiossarcoma"); sarcoma de Kaposi; leiomiossarcoma; lipossarcoma; linfangiossarcoma; tumor maligno da bainha do nervo periférico (MPNST); neurofibrossarcoma; sarcoma sinovial; sarcoma pleomórfico indiferenciado e semelhantes).
[00297] Um teratoma é um tipo de tumor de célula germinativa que pode conter vários tipos diferentes de tecido (por exemplo, pode incluir tecidos derivados de qualquer e/ou de todas as três camadas germinativas: endoderma, mesoderma e ectoderma), incluindo, por exemplo, cabelos, músculo e osso. Os teratomas ocorrem com mais frequência nos ovários das mulheres, nos testículos nos homens e no cóccix nas crianças.
[00298] O melanoma é uma forma de câncer que começa nos melanócitos (células que produzem o pigmento melanina). Pode começar em uma verruga (melanoma da pele), mas também em outros tecidos pigmentados, como no olho ou no intestino.
[00299] As leucemias são cânceres que começam no tecido formador de sangue, como a medula óssea, e fazem com que um grande número de células sanguíneas anormais seja produzido e entrem na corrente sanguínea. Por exemplo, as leucemias podem se originar em células derivadas da medula óssea que normalmente amadurecem na corrente sanguínea. As leucemias são nomeadas pela rapidez com que a doença se desenvolve e progride (por exemplo, aguda versus crônica) e pelo tipo de glóbulo branco que é efetuado (por exemplo, mieloide versus linfoide). As leucemias mieloides também são chamadas de leucemias mielógenas ou mieloblásticas. As leucemias linfoides também são chamadas de leucemia linfoblástica ou linfocítica. As células da leucemia linfoide podem se acumular nos linfonodos, que podem ficar inchados. Exemplos de leucemias incluem, mas não estão limitados a: leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide crônica (CML) e leucemia linfocítica crônica (CLL).
[00300] Linfomas são cânceres que começam nas células do sistema imune. Por exemplo, os linfomas podem se originar em células derivadas da medula óssea que normalmente amadurecem no sistema linfático. Existem duas categorias básicas de linfomas. Um tipo é o linfoma de Hodgkin (HL), marcado pela presença de um tipo de célula chamada célula de Reed-Sternberg. Atualmente, existem 6 tipos reconhecidos de HL. Exemplos de linfomas de Hodgkin incluem: linfoma de Hodgkin clássico de esclerose nodular (CHL), CHL de celularidade mista, CHL de depleção de linfócitos, CHL rico em linfócitos e HL predominante de linfócitos nodulares.
[00301] A outra categoria de linfoma são os linfomas não-Hodgkin (NHL), que incluem um grupo grande e diversificado de cânceres de células do sistema imunológico. Os linfomas não-Hodgkin podem ser divididos em cânceres com curso indolente (de crescimento lento) e naqueles com curso agressivo (de crescimento rápido). Atualmente, existem 61 tipos reconhecidos de NHL. Exemplos de linfomas não Hodgkin incluem, mas não estão limitados a: linfomas relacionados à AIDS, linfoma anaplásico de células grandes, linfoma angioimunoblástico, linfoma de células NK blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma do tipo Burkitt (linfoma de células pequenas não clivadas), leucemia linfocítica crônica/linfoma linfocítico pequeno, linfoma cutâneo de células T, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células T do tipo enteropatia, linfoma folicular, linfomas de células T gama-delta hepatoesplênicos, leucemias de células T, linfoma linfoblástico, linfoma de células do manto, linfoma de zona marginal, linfoma de células T nasais, linfoma pediátrico, linfomas de células T periféricos, linfoma primário do sistema nervoso central, linfomas transformados, linfomas de células T relacionados ao tratamento e macroglobulinemia de Waldenstrom.
[00302] Os cânceres cerebrais incluem qualquer câncer dos tecidos cerebrais. Exemplos de câncer no cérebro incluem, mas não estão limitados a: gliomas (por exemplo, glioblastomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, ependimomas e similares), meningiomas, adenomas da hipófise, schwannomas vestibulares, tumores neuroectodérmicos primitivos (meduloblastomas), etc.
[00303] Conforme usado neste documento, o termo "infecção" refere-se a qualquer estado em pelo menos uma célula de um organismo (ou seja, um sujeito) que está infectada por um agente infeccioso (por exemplo, um sujeito tem uma infecção por patógeno intracelular, por exemplo, uma infecção por patógeno intracelular crônica). Conforme usado neste documento, o termo "agente infeccioso" refere-se a uma entidade biológica estranha (ou seja, um patógeno) que induz a expressão de CD47 (por exemplo, expressão aumentada de CD47) em pelo menos uma célula do organismo infectado. Por exemplo, agentes infecciosos incluem, mas não estão limitados a bactérias, vírus, protozoários e fungos. Os patógenos intracelulares são de particular interesse. As doenças infecciosas são distúrbios causados por agentes infecciosos. Alguns agentes infecciosos não causam sintomas reconhecíveis ou doença sob certas condições, mas têm o potencial de causar sintomas ou doenças sob condições alteradas. Os métodos em questão podem ser utilizados no tratamento de infecções patogênicas crônicas, por exemplo, incluindo mas não limitadas a infecções virais, por exemplo, retrovírus, lentivírus, vírus hepadna, vírus herpes, vírus pox, vírus do papiloma humano, etc.; infecções bacterianas intracelulares, por exemplo Mycobacterium, Chlamydophila, Ehrlichia, Rickettsia, Brucella, Legionella, Francisella, Listeria, Coxiella, Neisseria, Salmonella, Yersinia sp, etc.; e patógenos de protozoários intracelulares, por exemplo, Plasmodium sp, Trypanosoma sp., Giardia sp., Toxoplasma sp., Leishmania sp., etc.
[00304] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de antagonização do SIRP-ALPHA em uma célula alvo de um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00305] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de potencialização da resposta imune em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00306] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de retardamento do início de um tumor em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00307] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de prevenção da recorrência ou do início de um tumor em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00308] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de retardo do início de um câncer em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00309] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de prevenção da recorrência ou início de um câncer em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00310] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de redução do tamanho de um tumor em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00311] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de redução do número de metástases em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00312] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de retardo do início de uma infecção em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00313] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de prevenção da recorrência ou início de uma infecção em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00314] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de redução do título viral em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00315] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de eliminação de um vírus em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito.
[00316] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de extensão do período de sobrevida global, tempo médio de sobrevida ou sobrevida livre de progressão em um sujeito em necessidade deste, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito. Terapias de Combinação
[00317] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é administrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. Qualquer agente terapêutico adicional adequado pode ser administrado com um anticorpo fornecido neste documento. Em alguns aspectos, o agente terapêutico adicional é selecionado a partir de radiação, um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico, um agente citostático, um agente anti-hormonal, um inibidor de EGFR, um agente imunoestimulador, um agente antiangiogênico e combinações destes.
[00318] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional compreende um agente imunoestimulador.
[00319] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo.
[00320] Os anticorpos anti-SIRPα podem ser utilizados terapeuticamente em combinação com um segundo anticorpo ou agente que se liga seletivamente a uma célula alvo. O termo "célula alvo" pode ser usado de diferentes maneiras, dependendo do contexto. Normalmente, uma "célula alvo" é uma célula que será fagocitada por uma célula fagocítica (por exemplo, um fagócito), onde a fagocitose é potencializada como resultado da administração de um anticorpo anti-SIRPα em questão. Assim, o termo "célula alvo" pode se referir a uma célula que expressa CD47, porque um anticorpo anti-SIRPα em questão, ao inibir a interação entre a célula que expressa CD47 e a célula fagocítica que expressa SIRPα, facilita a fagocitose da célula que expressa CD47.
[00321] No entanto, em alguns casos, a célula alvo não precisa expressar altos níveis de CD47 (e, em alguns casos, não precisa expressar CD47) para que um anticorpo multiespecífico em questão induza a fagocitose da célula alvo. Por exemplo, no contexto de um anticorpo multiespecífico (por exemplo, biespecífico), a região de ligação ao SIRPα (a primeira região de ligação) de um anticorpo multiespecífico em questão (por exemplo, biespecífico) se liga ao SIRPα em uma célula fagocítica (por exemplo, um macrófago), que permite que o anticorpo multiespecífico funcione como um cordão para trazer a célula fagocítica para a vizinhança de uma célula que expressa um antígeno (por exemplo, um marcador de uma célula cancerígena) que é reconhecido por (especificamente ligado por) uma segunda região de ligação ao anticorpo multiespecífico (por exemplo, a segunda região de ligação a um anticorpo biespecífico). Portanto, no contexto de um anticorpo multiespecífico, uma célula alvo pode ser uma célula que não expressa altos níveis de CD47 (e também pode ser uma célula que não expressa CD47). Em algumas modalidades, uma célula alvo é uma célula de mamífero, por exemplo uma célula humana. Uma célula alvo pode ser de qualquer indivíduo (por exemplo, paciente, sujeito e similares), conforme descrito abaixo.
[00322] Em alguns casos, uma célula alvo é uma célula "infligida" (por exemplo, uma célula de um indivíduo "infligido"), onde o termo "infligido" é usado neste documento para se referir a um sujeito com sintomas, uma doença ou uma doença que pode ser tratada com um anticorpo anti-SIRPα em questão. Um sujeito "infligido" pode ter câncer, pode abrigar uma infecção (por exemplo, uma infecção crônica) e/ou pode ter outras condições hiperproliferativas, por exemplo, esclerose, fibrose, similares, etc. "Células infligidas" podem ser aquelas que causam sintomas, enfermidade ou doença. Como exemplos não limitativos, as células infligidas de um paciente infligido podem ser células cancerígenas, células infectadas, células inflamatórias, células imunes e semelhantes que expressam CD47. Uma indicação de que uma enfermidade ou doença pode ser tratada com um anticorpo anti-SIRPα em questão é que as células envolvidas (ou seja, as células infligidas, por exemplo, as células cancerígenas, as células infectadas, as células inflamatórias, as células imunes, etc.) expressam CD47 (por exemplo, em alguns casos, um nível aumentado de CD47 em comparação com células normais do mesmo tipo de célula).
[00323] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo que liga uma proteína ou proteínas na superfície celular de um tumor.
[00324] Para o tratamento do câncer, o anticorpo anti-SIRPα pode ser combinado com um ou mais anticorpos específicos para um antígeno tumoral. Destes, os antígenos associados ao tumor (TAAs) são relativamente restritos às células tumorais, enquanto os antígenos tumorais específicos (TSAs) são exclusivos das células tumorais. Os TSAs e TAAs são tipicamente porções de moléculas intracelulares expressas na superfície da célula como parte do complexo principal de histocompatibilidade.
[00325] Os antígenos de diferenciação específica de tecido são moléculas presentes nas células tumorais e em suas contrapartes celulares normais. Os antígenos associados a tumores que se sabe serem reconhecidos pelos mAbs terapêuticos estão em várias categorias diferentes. Antígenos de diferenciação hematopoiética são glicoproteínas que estão normalmente associadas a grupos de diferenciação (CD) e incluem CD20, CD30, CD33 e CD52. Os antígenos de diferenciação da superfície celular são um grupo diversificado de glicoproteínas e carboidratos que são encontrados na superfície de células normais e tumorais. Os antígenos que estão envolvidos na sinalização de crescimento e diferenciação são frequentemente fatores de crescimento e receptores do fator de crescimento. Fatores de crescimento que são alvos para anticorpos em pacientes com câncer incluem CEA, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR; também conhecido como ERBB1), ERBB2 (também conhecido como HER2), ERBB3, MET (também conhecido como HGFR), fator de crescimento semelhante à insulina 1 receptor (IGF1R), receptor de efrina A3 (EPHA3), receptor 1 de ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral (TNF) (TRAILR1; também conhecido como TNFRSF10A), TRAILR2 (também conhecido como TNFRSF10B) e ativador de receptor de ligante de fator-κB nuclear (RANKL; também conhecido como TNFSF11). Os antígenos envolvidos na angiogênese são geralmente proteínas ou fatores de crescimento que suportam a formação de nova microvasculatura, incluindo o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o receptor de VEGF (VEGFR), a integrina αVβ3 e a integrina α5β1. O estroma tumoral e a matriz extracelular são estruturas de suporte indispensáveis para um tumor. Os antígenos de matriz estromal e extracelular que são alvos terapêuticos incluem proteína de ativação de fibroblastos (FAP) e tenascina.
[00326] Exemplos de anticorpos terapêuticos úteis em configurações biespecíficas ou como terapia de combinação incluem, sem limitação, rituximabe; Ibritumomabe; tiuxetano; tositumomabe; Brentuximabe; vedotina; Gemtuzumabe; ozogamicina; Alemtuzumabe; IGN101; adecatumumabe; Labetuzumabe; huA33; Pemtumomabe; oregovomabe; CC49 (minetumomabe); cG250; J591; MOv18;
MORAb-003 (farletuzumabe); 3F8, ch14.18; KW-2871; hu3S193; lgN311; Bevacizumabe; IM-2C6; CDP791; Etaracizumabe; Volociximabe; Cetuximabe, panitumumabe, nimotuzumabe; 806; Trastuzumabe; pertuzumabe; MM-121; AMG 102, METMAB; SCH 900105; AVE1642, IMC-A12, MK-0646, R1507; CP 751871; KB004; IIIA4; Mapatumumabe (HGS-ETR1); HGS-ETR2; CS-1008; Denosumabe; Sibrotuzumabe; F19; e 81C6. Um anticorpo biespecífico pode usar a região Fc que ativa um receptor Fc.
[00327] Para o tratamento do câncer, o anticorpo anti-SIRP pode ser combinado com um ou mais anticorpos que inibem as proteínas do checkpoint imunológico. De particular interesse são as proteínas do ponto de checkpoint imunológico exibidas na superfície de uma célula tumoral. Os receptores do ponto de verificação imune que foram mais ativamente estudados no contexto da imunoterapia clínica contra o câncer, antígeno 4 associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA4; também conhecido como CD152) e proteína 1 de morte celular programada (PD1; também conhecida como CD279) - são ambos receptores inibitórios. A atividade clínica de anticorpos que bloqueiam qualquer um desses receptores implica que a imunidade antitumoral pode ser aumentada em múltiplos níveis e que as estratégias combinatórias podem ser inteligentemente projetadas, guiadas por considerações mecanicistas e modelos pré-clínicos.
[00328] Os dois ligantes para PD1 são o ligante 1 de PD1 (PDL1; também conhecido como B7-H1 e CD274) e PDL2 (também conhecido como B7-DC e CD273). A PDL1 é expressa em células cancerígenas e através da ligação ao seu receptor PD1 nas células T inibe a ativação/função das células T. Ver, por exemplo, Avelumabe como um anticorpo terapêutico.
[00329] Os agentes que agonizam uma molécula coestimulatória imune também são úteis nos métodos divulgados neste documento. Esses agentes incluem agonistas ou CD40 e OX40. O CD40 é uma proteína coestimuladora encontrada em células apresentadoras de antígenos (APCs) e é necessária para sua ativação. Estes APCs incluem fagócitos (macrófagos e células dendríticas) e células B. O CD40 faz parte da família de receptores de TNF. As principais moléculas sinalizadoras ativadoras do CD40 são o ligante IFNγ e CD40 (CD40L). Estimulação através do CD40 ativa macrófagos.
[00330] Os anticorpos anti-CCR4 (CD194) de interesse incluem anticorpos monoclonais humanizados dirigidos contra o receptor de quimiocina C-C 4 (CCR4) com atividades anti-inflamatórias e antineoplásicas em potencial.
[00331] Em alguns aspectos, o agente terapêutico adicional é um anticorpo que se liga: HER2 (ERBB2/neu), CD52, PD-L1, VEGF, CD30, EGFR, CD38, RANKL (CD254), GD2 (gangliosídeo), SLAMF7 (CD319), CD20, EGFR, PDGFRa, VEGFR2, CD33, CD44, CD99, CD96, CD90, CD133, CKIT (CD117 para tumores CKIT positivos); CTLA-4, PD-1, PD-L1, CD40 (agonístico), LAG3 (CD223), 41BB (CD137 agonístico), OX40 (CD134, agonístico); e/ou CKIT (CD117) para depletar células-tronco formadoras de sangue para terapia de transplante.
[00332] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é pelo menos um de: Rituximabe, Cetuximabe, Alemtuzumabe (CD52), Atezolizumabe (PD-L1), Avelumabe (PD-L1), Bevacizumabe (VEGF), Brentuximabe (CD30), Daratumumabe (CD38), Denosumabe (RANKL), Dinutuximabe (GD2), Elotuzumabe (SLAMF7), Ibritumomabe (CD20), Ipilimumabe (CTLA-4), Necitumumabe (EGFR), Nivolumabe (PD-1), Obinutuzumabe (CD20), Ofatumumabe (CD20), Olaratumabe (PDGFRa), Panitumumabe (EGFR), Pembrolizumabe (PD-1), Pertuzumabe (HER2), Ramucirumabe (VEGFR2), Tositumomabe (CD20), e Gemtuzumabe (CD33).
[00333] O agente terapêutico adicional pode ser administrado por qualquer meio adequado. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento e o agente terapêutico adicional são incluídos na mesma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento e o agente terapêutico adicional são incluídos em diferentes composições farmacêuticas.
[00334] Nas modalidades em que um anticorpo fornecido neste documento e o agente terapêutico adicional estão incluídos em diferentes composições farmacêuticas, a administração do anticorpo pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional. Em alguns aspectos, a administração de um anticorpo fornecido neste documento e o agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um mês um do outro. Em alguns aspectos, a administração de um anticorpo fornecido neste documento e o agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de uma semana um do outro. Em alguns aspectos, a administração de um anticorpo fornecido neste documento e o agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um dia um do outro. Em alguns aspectos, a administração de um anticorpo fornecido neste documento e o agente terapêutico adicional ocorrem dentro de doze horas um do outro. Em alguns aspectos, a administração de um anticorpo fornecido neste documento e o agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de uma hora um do outro. Métodos de Diagnóstico
[00335] Também são fornecidos métodos para detectar a presença de SIRP- ALPHA nas células de um sujeito. Tais métodos podem ser utilizados, por exemplo, para prever e avaliar a capacidade de resposta ao tratamento com um anticorpo fornecido neste documento.
[00336] Em algumas modalidades, uma amostra de sangue é obtida de um sujeito e a fração de células que expressam SIRP-ALPHA é determinada. Em alguns aspectos, a quantidade relativa de SIRP-ALPHA expressa por essas células é determinada. A fração de células que expressam SIRP-ALPHA e a quantidade relativa de SIRP-ALPHA expressa por essas células podem ser determinadas por qualquer método adequado. Em algumas modalidades, a citometria de fluxo é usada para fazer essas medições. Em algumas modalidades, a classificação de células assistidas por fluorescência (FACS) é usada para fazer essa medição. Ver Li et al., J. Autoimmunity, 2003, 21:83-92 para métodos de avaliação da expressão de SIRP-ALPHA no sangue periférico. Kits
[00337] Também são fornecidos kits compreendendo um anticorpo fornecido neste documento. Os kits podem ser utilizados para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de uma doença ou distúrbio, conforme descrito neste documento.
[00338] Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula no ou associado ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e bolsas de solução IV. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si só, ou quando combinada com outra composição, eficaz no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de uma doença ou distúrbio. O recipiente pode ter uma porta de acesso estéril. Por exemplo, se o recipiente for uma bolsa ou um frasco de solução intravenosa, ele pode ter uma porta que pode ser perfurada por uma agulha. Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo fornecido neste documento. O rótulo ou bula indica que a composição é usada para o tratamento da condição clínica selecionada.
[00339] Em algumas modalidades, o kit compreende (a) um primeiro recipiente com uma primeira composição nele contida, em que a primeira composição compreende um anticorpo fornecido neste documento; e (b) um segundo recipiente com uma segunda composição nele contida, em que a segunda composição compreende um outro agente terapêutico. O kit nesta modalidade pode compreender ainda uma bula que indica que as composições podem ser usadas para tratar uma condição específica.
[00340] Alternativamente, ou adicionalmente, o kit pode ainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em alguns aspectos, o excipiente é um tampão. O kit pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo filtros, agulhas e seringas.
EXEMPLOS
[00341] Estão descritos abaixo exemplos de modalidades específicas para a execução da presente invenção. Os exemplos são apresentados para fins ilustrativos apenas e não são destinados a impor limitações sobre o escopo da presente invenção, em qualquer hipótese. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão no que diz respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser, obviamente, considerados.
[00342] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, métodos convencionais da proteína da química, bioquímica, técnicas de recombinação de DNA e farmacológica, dentro do âmbito da técnica. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura. Ver por exemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook,
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edição (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey e Sundberg Advanced Organic Chemistry 3a Ed. (Plenum Press) Vols A e B (1992). Materiais e Métodos
[00343] Geração de anticorpos. Um fragmento de cDNA de SIRPa humano que codifica o domínio extracelular foi sintetizado e fundido ao Fc de camundongo para gerar uma proteína SIRPa-Fc de fusão, que foi usada para imunizar camundongos para produzir anticorpos CD47 anti-humanos monoclonais anti- humanos. Os hibridomas foram gerados usando protocolos padrão. Em resumo, os camundongos Balb/c com 4-6 semanas de idade foram imunizados com uma proteína SIRPa-Fc de fusão recombinante purificada duas vezes por semana durante um total de 4 semanas. Os títulos foram avaliados posteriormente e as células do baço foram fundidas com células SP2/0. Os hibridomas foram selecionados e os sobrenadantes dos clones resultantes foram triados por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).
[00344] Clonagem e sequenciamento do anticorpo V. A estratégia de clonagem usada neste documento envolveu um isolamento inicial de RNA a partir de células de hibridoma (Qiagen). As sequências de cDNA que codificam as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de anticorpos monoclonais 1H9 e 3C2 foram obtidas usando técnicas RACE-PCR 5' (Clontech) e foram sequenciadas usando técnicas padrão de sequenciamento de DNA.
[00345] Modelagem molecular e humanização de anticorpos. A humanização de 1H9 e 3C2 foi realizada instalando resíduos CDR de anticorpos de camundongo em frameworks de linhagem germinativa humana (FRs). Resumidamente, o camundongo 1H9 e 3C2 foi humanizado por recrutamento criterioso dos resíduos CDR correspondentes. As diferenças entre o camundongo 1H9 e 3C2 e os resíduos de FR humanos foram modeladas individualmente para investigar a sua possível influência na conformação da CDR.
[00346] Transfecção celular. As células 293F foram cultivadas em meio de expressão FreeStyle™ 293 (Invitrogen). A transfecção transitória foi realizada por cotransfecção de vetores de expressão que codificam cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo usando reagente de transfecção 293fectina (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Quatro a cinco dias depois, os sobrenadantes das células transfectadas foram coletados e testados quanto à secreção de anticorpos por ELISA. Resumidamente, placas de 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 1 g/ml de anticorpo gama Fc anti-humano de cabra em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 16 horas a 4C. Após bloqueio por 1 hora com BSA a 0,4% em PBS à temperatura ambiente, os sobrenadantes isolados foram adicionados em diluições sequenciais de 1/3 e incubados por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram subsequentemente lavadas três vezes e incubadas com anticorpo anti-humano de cabra específico de kappa conjugado com HRP por 1 hora à temperatura ambiente. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com TMB. A reação foi parada com 2M de H2SO4 e OD foi medida a 450 nM.
[00347] Purificação e caracterização de anticorpos. O sobrenadante da cultura foi aplicado às colunas de proteína A Sepharose (GE Healthcare). A coluna foi lavada com PBS e a proteína foi então eluída com tampão de eluição (tampão de citrato de sódio 0,1 M, pH 3,0). As frações coletadas foram neutralizadas com 1 M de Tris a pH 9,0. Finalmente, amostras purificadas foram dialisadas contra PBS. A pureza da fração de anticorpos eluídos foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) em géis a 10% sob condições redutoras ou não redutoras. As bandas foram visualizadas por coloração azul brilhante de Coomassie.
[00348] Medição de afinidade de anticorpos. A proteína de fusão SIRPa-His humana foi produzida fundindo o domínio extracelular do SIRPa humano à His-tag e usada para medir a afinidade de ligação monomérica a 1H9 e 3C2. As experiências de ligação foram realizadas em Biacore 3000 a 25°C. O anticorpo de captura anti-humano de cabra foi imobilizado (como indicado na tabela) na superfície do chip por imobilização direta usando química de acoplamento EDC/NHS na célula de fluxo 2, 3 e 4 do chip CM5. Os sítios desocupados foram bloqueados com etanolamina a 1M. A célula de fluxo 1 não foi tratada e usada como referência para subtração de qualquer ligação não específica do Ag à superfície do chip. Os Abs de teste foram capturados na célula de fluxo 2, 3 e 4 em uma RU, como indicado. O antígeno foi escoado sobre o chip na concentração de analito único. A ligação do antígeno ao ligante foi monitorada em tempo real para obter taxas de associação (ka) e de dissociação (kd). A constante de equilíbrio (KD) foi calculada a partir das ka e kd observadas. Para as interações da taxa de dissociação rápida, o KD foi determinado por análise cinética em estado estacionário.
[00349] Ensaio de fagocitose in vitro. As células cancerígenas Raji e HT29 foram lavadas e contadas e, em seguida, foram adicionados 25 µL contendo 1 x 105 células em IMDM sem soro a cada poço. Tratamento de anticorpos (em 25 µL) com uma concentração final de 10 µg/mL de 1H9, 3C2 (caso contrário indicado nas figuras), rituximabe ou 0,1 µg/mL de cetuximabe foi adicionado aos poços e incubado a 37°C por 30 minutos. Aos 30 minutos, os macrófagos que foram previamente coletados com TrypLE foram contados e plaqueados com 5 x 104 células em 50 µL de IMDM sem soro. As placas foram incubadas a 37°C por 2 horas (Efetor: Alvo = 1:2). A porcentagem de fagocitose foi calculada por análise por citometria de fluxo, procurando GFP + macrófagos.
[00350] Genotipagem de variantes de SIRPa. O DNA genômico foi isolado a partir de amostras de sangue de doadores humanos usando o kit de isolamento de DNA QIAamp (Qiagen). A PCR foi realizada usando o DNA genômico isolado e os primers de TAG AAT ACA GGC TCA TGT TGC AGG T e GCC TTC AGC AAA TAG CAT GAC GT. Os fragmentos de PCR foram purificados e sequenciados. Diferentes variantes de SIRPa foram analisadas e identificadas de acordo com as sequências de referência de SIRPa (Polymorphism in Sirpa modulates engraftment of human hematopoietic stem cells. Nature Immunology, 8; 1313, 2007).
[00351] Bloqueio da ligação de CD47 humana a monócitos isolados de doadores humanos. As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) foram isoladas do sangue humano usando Ficoll. 5x105 células foram incubadas com 1 ug/ml de proteína CD47-Fc de fusão humana conjugada com AF488 na ausência ou presença de concentrações crescentes de hHu1H9-G1. A ligação de CD47 nas células foi medida e analisada por citometria de fluxo.
[00352] Internalização de Hu1H9-G1. A internalização do 1H9 humanizado foi testada incubando 10 ug/ml do anticorpo com células de macrófagos diferenciadas do sangue humano normal a 37C. As células foram fixadas e permeabilizadas em cada momento (0, 20 min, 1h, 2h, 4h, 6h e 24h). O anticorpo IgG1 anti-humano rotulado com PE foi usado para detectar 1H9. DAPI foi usado para colorir núcleos. A incubação a 4C foi usada como controle para a coloração da superfície de 1H9. Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais anti-SIRPa e mapeamento de epítopos
[00353] Um fragmento de cDNA de SIRPa humano que codifica o domínio extracelular foi sintetizado e fundido ao Fc de camundongo para gerar uma proteína de fusão SIRPa-Fc (SEQ ID NO:45), que foi usada para imunizar camundongos para produzir anticorpos SIRPa de camundongo monoclonais anti-humanos. A especificidade de clones de hibridoma selecionados foi examinada por ligação de ELISA ao SIRPa humano. Dois dos clones positivos foram obtidos e designados como 1H9 e 3C2. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve foram clonadas e sequenciadas, e as sequências de VH e VL de 1H9 (Figura 1) e 3C2 (Figura 2) foram determinadas.
[00354] Para determinar os epítopos reconhecidos por 1H9 e 3C2, a proteína SIRPa-Fc de fusão humana foi revestida em uma placa de 96 poços. A ligação de SIRPa com 1H9 e 3C2 foi medida na ausência ou presença de concentrações crescentes de um anticorpo anti-SIRPa, KWar (divulgado no Pedido Internacional WO 2015/138600, incorporado neste documento especificamente por referência; sequências Vh e Vl mostradas nas SEQ ID NOs 46-47). Como mostrado na Figura 3A, Kwar não competiu com 1H9 pela ligação a SIRPa, indicando que o 1H9 reconhece um epítopo distinto de KWar. Em contraste, Kwar competiu em 3C2 pela ligação ao SIRPa; no entanto, a ligação de 3C2 ao SIRPa foi parcialmente bloqueada mesmo quando quantidades excessivas em 100 vezes de KWar foram usadas. Isso indica que 3C2 provavelmente reconhece um epítopo sobreposto, mas não idêntico, em comparação com KWar (Figura 3A). A ligação competitiva também foi realizada entre 1H9 e 3C2, e foi mostrado que a ligação de 1H9 com SIRPa era competida pelo próprio 1H9 de uma maneira dependente da dose, mas não por 3C2 (Figura 3B). Da mesma forma, o 3C2 competiu de maneira dependente da dose, mas não pelo 1H9 (Figura 3C). Como tal, 1H9 e 3C2 reconhecem epítopos distintos no SIRP-alfa. Exemplo 2: Seleção de isotipo de anticorpo para 1H9 e 3C2
[00355] 1H9 e 3C2 quiméricos foram construídos fundindo seus domínios variáveis de cadeia leve e pesada às regiões constantes de kappa humano, IgG4 humano ou IgG1 humano que possui uma mutação N297A para anular a interação com FcgR. Os anticorpos resultantes foram então testados em um ensaio de fagocitose in vitro em combinação com rituximabe (Rx). Os efeitos da variação do doador foram observados. O 1H9 sinergizou com o rituximabe para promover a fagocitose igualmente bem nos formatos de IgG4 (1H9-G4) e IgG1 N297A (1H9- G1) humano usando macrófagos diferenciados dos monócitos de alguns doadores (Figura 4A). Enquanto, usando macrófagos diferenciados de monócitos de diferentes doadores, o 1H9-G1 disparou uma melhor sinergia com o rituximabe do que o 1H9-G4 (Figura 4B). Resultados semelhantes também foram vistos com 3C2 (Figura 4A-B). É possível que diferentes variações alélicas em FcgRs expressas em macrófagos possam causar as variações observadas no ensaio de fagocitose in vitro. Esses resultados demonstram o benefício geral do construto Fc morto para anticorpos anti-SIRPα, na redução da variabilidade da responsividade, ou seja, na redução do número de indivíduos que não respondem no aprimoramento da fagocitose quando combinados com um anticorpo direcionado a células. Exemplo 3: Humanização 1H9 e 3C2
[00356] A humanização de 1H9 e 3C2 foi realizada por enxerto de CDR, e as sequências humanizadas de VH e VL de 1H9 e 3C2 são mostradas nas Figuras 5 e 6, respectivamente. Sequências completas são mostradas nas SEQ ID NOs 37-
40.
[00357] Para avaliar a especificidade de ligação ao antígeno de 1H9 e 3C2 humanizado, a ligação de competição entre 1H9 ou 3C2 de camundongo humanizado e parental foi realizada por ELISA. Demonstrou que 1H9 e 3C2 humanizado competiam com o 1H9 e 3C2 de camundongo pela ligação ao SIRPa de maneira dependente da dose, respectivamente (Figura 7). Assim, 1H9 e 3C2 humanizados possuem a mesma especificidade de ligação ao antígeno que seus anticorpos parentais. As afinidades de ligação ao antígeno de 1H9 e 3C2 humanizado foram então medidas usando ressonância plasmônica de superfície. O 1H9 humanizado ligou-se ao antígeno SIRPa humano monomérico com uma KD de 1,15x10-9 M e o 3C2 humanizado ligou-se ao SIRPa humano monomérico com uma KD de 5,53x10-9 M (Figura 8). Exemplo 4: 1H9 e 3C3 humanizado sinergizam com anticorpos terapêuticos para promover fagocitose mediada por macrófagos
[00358] Em seguida, investigamos a capacidade de 1H9 e 3C2 humanizado de permitir a fagocitose de células cancerígenas humanas por macrófagos periféricos derivados de sangue humano em combinação de anticorpos terapêuticos. O 1H9 ou 3C2 humanizado sozinho não induziu substancialmente a fagocitose; no entanto, quando combinados com o rituximabe (Rx), ambos os anticorpos induziram maior atividade fagocítica das células Raji do que a do rituximabe sozinho (Figura 9A). Além disso, 1H9 e 3C2 humanizados sinergizaram com cetuximabe (Cx) para induzir fagocitose de uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano HT-29 e a atividade sinérgica foi observada em uma gama de concentrações de 1H9 e 3C2 humanizados que foram testadas (Figura 9B). Exemplo 5: Reatividade cruzada de 1H9 e 3C2 para membros da família
SIRP
[00359] Além do SIRP alfa, existem duas proteínas intimamente relacionadas na família SIRP, a saber (SIRPB, número de acesso NM_001083910.3) e SIRP gama (SIRPG, número de acesso NM_001039508.1). O SIRPB, embora intimamente relacionado ao SIRPa, não parece se ligar ao CD47 e não possui ITIMs citoplasmáticos ou quaisquer outros motivos citosólicos reconhecíveis para sinalização. Em vez disso, o SIRPB contém uma região transmembrana com um resíduo de lisina carregado positivamente que medeia a associação com o DAP12, uma proteína adaptadora que carreia um ITAM. A fosforilação do DAP12 ITAM medeia o recrutamento da proteína tirosina quinase Syk e a consequente ativação da via MAPK que regula várias funções. O disparo do receptor SIRPB murino, por exemplo, que também se complexa com DAP12, promove a fagocitose em macrófagos. SIRPG, o terceiro membro da família SIRP humana, é expresso em células T e células NK ativadas. Ele pode se ligar ao CD47,
embora com uma afinidade 10 vezes menor em comparação com o SIRPa. Além disso, a interação SIRPg-CD47 medeia a adesão célula-célula e suporta o contato de células APC-T, potencializando a apresentação de antígenos, a consequente proliferação de células T e a secreção de citocinas. É improvável que o próprio SIRPG gere sinais intracelulares porque não possui motivos de sinalização conhecidos. Em vez disso, o SIRPG pode disparar a sinalização do CD47 nas APCs.
[00360] A proteína His-SIRPB e SIRPG de fusão foi gerada e a ligação de 1H9 e 3C2 ao SIRPB e SIRPG foi testada. Como mostrado na Figura 10, 1H9 e 3C2 se ligaram ao SIRPB em comparação com o Kwar (Figura 10A). Ao contrário de Kwar, nenhuma ligação de 1H9 ou 3C2 ao SIRPG foi detectada (Figura 10B). A falta de ligação ao SIRPG por 1H9 e 3C2 confere as seguintes vantagens potenciais a esses anticorpos em relação aos anticorpos anti-SIRPA do estado da técnica: (1) SIRPA tem expressão mais restrita em relação ao SIRPG, o que diminui o risco de efeitos fora do alvo (2) há um risco diminuído de toxicidade, por exemplo, dada a especificidade aumentada para SIRPA, (3) há um risco diminuído de desenvolver um fenômeno de "afundamento de antígeno" quando o anticorpo é dosado em um sujeito e (4) existe um diminuição do risco de interferência nas células T e/ou na função das células B pelo anticorpo. Exemplo 6: Geração e teste de anticorpos anti-SIRP-alfa adicionais
[00361] Anticorpos adicionais foram criados para SIRPa humano por imunização de camundongos como descrito acima. Dois clones de anticorpos monoclonais foram designados - 9B11 e 7E11, respectivamente. Ver SEQ ID NOs 21-36 e 41-44. As regiões variáveis do camundongo foram unidas como quimera à região IgG4 Fc humana (designada como 7E11-G4 ou 9B11-G4), ou a uma região IgG1 Fc humana compreendendo a mutação N297A para anular a interação com FcRs humanos (designados como 7E11-G1 ou 9B11-G1).
[00362] Como foi descoberto com 1H9 e 3C2, os anticorpos 9B11 e 7E11 mostraram uma resposta sinérgica na potencialização da fagocitose das células cancerígenas quando combinados com o Rituximabe. Mostrados na Figura 11, os macrófagos foram diferenciados dos monócitos do doador A (A) e doador B (B) na presença de soro humano por 7 dias. As células Raji foram rotuladas com CFSE e incubadas com os macrófagos na presença de 10 µg/ml de rituximabe (Rx)
sozinhas ou em combinação com 10 µg/ml de 9B11-G4, 9B11-G1, 7E11-G4, ou 7E11-G1. Duas horas depois, a porcentagem de fagocitose foi calculada por análise por citometria de fluxo, procurando GFP + macrófagos.
[00363] Os dados mostram que, embora os anticorpos no formato de IgG4 e os anticorpos no formato de IgG1 mutacionados possam fornecer uma resposta sinérgica, o formato de IgG1 mutacionado forneceu uma resposta mais consistente entre os doadores.
[00364] Para determinar os epítopos reconhecidos por 9B11 e 7E11, a proteína SIRPa-Fc de fusão humana foi revestida em uma placa de 96 poços. A ligação de SIRPa com 9B11 e 7E11 foi medida na ausência ou presença de concentrações crescentes de um anticorpo anti-SIRPa, KWar (divulgado no Pedido Internacional WO 2015/138600, incorporado neste documento especificamente por referência). Conforme mostrado na Figura 12, 7E11 reconhece um epítopo sobreposto em comparação com Kwar (semelhante a 3C2) e 9B11 reconhece um epítopo muito semelhante ou idêntico em comparação com Kwar. Exemplo 7: Ligação de Hu1H9-G1 a diferentes variantes de SIRP-alfa em células humanas primárias
[00365] O SIRP-α humano é altamente polimórfico no domínio IgV, no entanto, a maioria das variantes são a variante 1 (V1) e a variante 2 (V2).
[00366] 22 doadores humanos normais foram triados e genotipados e os doadores foram identificados com status V1 homozigoto, V2 homozigoto e V1/V5 heterozigoto para SIPR-alfa. (Polymorphism in Sirpa modulates engraftment of human hematopoietic stem cells. Nature Immunology, 8; 1313, 2007; Para referência: sequência V1 mostrada na SEQ ID NO: 48; Sequência V2 mostrada na SEQ ID NO: 49) O 1H9 humanizado foi testado e se ligou a cada um dos alelos V1, V2 e V1/V5 usando os monócitos e macrófagos dos doadores (Figura 13). Estes dados indicam que o 1H9 humanizado pode ser utilizado numa vasta gama de seres humanos, dada a sua capacidade de se ligar a múltiplas variantes distintas de SIRP-alfa em células primárias de dadores humanos. Exemplo 8: Hu1H9-G1 bloqueia a ligação de CD47 a monócitos de diferentes doadores
[00367] O 1H9-G1 humanizado foi testado em seguida para determinar se ele pode bloquear a interação de CD47 e SIRP-alfa que é expressa como variantes diferentes. Os monócitos foram isolados de doadores que expressam V1, V2 e V1/V5 e incubados com a proteína CD47-Fc de fusão na ausência ou na presença de concentrações crescentes de 1H9 humanizado (Figura 14). Os dados mostram que o 1H9 humanizado bloqueou a interação de CD47 e SIRP-alfa de maneira dependente da dose, e as atividades de bloqueio foram comparáveis entre as diferentes variantes de SIRP-alfa testadas. Exemplo 9: Hu1H9-G1 sincroniza com Cetuximabe para promover a fagocitose em diferentes doadores
[00368] Foram realizadas fagocitoses in vitro utilizando macrófagos diferenciados de diferentes doadores. O 1H9-G1 humanizado sinergizou com o cetuximab para promover a fagocitose em doadores com variantes V1, V2 e V1/V5 (Figura 15). Exemplo 10: Internalização de Hu1H9-G1
[00369] A internalização do 1H9 humanizado foi testada incubando 10 ug/ml do anticorpo com células de macrófagos diferenciadas do sangue humano normal a 37C. As células foram fixadas e permeabilizadas em cada momento (0, 20 min, 1h, 2h, 4h, 6h e 24h). O anticorpo IgG1 anti-humano rotulado com PE foi usado para detectar 1H9. DAPI foi usado para colorir núcleos. A incubação a 4C foi usada como controle para a coloração da superfície de 1H9.
[00370] Os dados mostram que o 1H9 humanizado não se internaliza nas células e a coloração da superfície do 1H9 foi detectável em cada momento, incluindo 24 horas (dados não mostrados). Estes dados indicam que o 1H9 humanizado é estável na superfície celular, o que pode ser indicativo de maior eficácia terapêutica in vivo.
[00371] Embora esta invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referências a uma modalidade preferida e várias modalidades alternativas, será compreendido por aqueles versados na técnica que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas sem que se parta do espírito e escopo da invenção.
[00372] Todas as referências, patentes emitidas e pedidos de patente citados no corpo do presente relatório descritivo são incorporados neste documento por referência na sua totalidade, para todos os fins. TABELA A - SEQUÊNCIAS SEQ ID Sequência
ID NO 1 1H9 CDR- SYWIT H1 2 1H9 CDR- DIYPGSGSTNHIEKFKS H2 3 1H9 CDR- GYGSSYGYFDY H3 4 1H9 CDR- RASENIYSYLA L1 5 1H9 CDR- TAKTLAE L2 6 1H9 CDR- QHQYGPPFT L3 7 1H9 VH QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT Humanizad SYWITWVKQA PGQGLEWIGD IYPGSGSTNH o IEKFKSKATL TVDTSISTAY MELSRLRSDD
TAVYYCATGY GSSYGYFDYW GQGTLVTVSS 8 1H9 VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY Humanizad SYLAWYQQKP GKAPKLLIYT AKTLAEGVPS o RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH
QYGPPFTFGQ GTKLEIK 9 3C2 CDR- SYWMH H1 10 3C2 CDR- NIDPSDSDTHYNQKFKD H2 11 3C2 CDR- GYSKYYAMDY H3 12 3C2 CDR- RSSQSIVHSYGNTYLE L1
13 3C2 CDR- KVSNRFS L2 14 3C2 CDR- FQGSHVPYT L3 15 3C2 VH QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT Humanizad SYWMHWVRQA PGQGLEWMGN IDPSDSDTHY o NQKFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED
TAVYYCARGY SKYYAMDYWG QGTLVTVSS 16 3C2 VL DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCRSSQSIV Humanizad HSYGNTYLEW YLQKPGQSPQ LLIYKVSNRF o SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV
YYCFQGSHVP YTFGQGTKLE IK 17 1H9 HC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITW Humanizad VKQAPGQGLEWIGDIYPGSGSTNHIEKFKSKATLTVD o TSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCATGYGSSYGYFDY (comprime WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL nto GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG completo) LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSLSLSPG 18 1H9 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYL Humanizad AWYQQKPGKAPKLLIYTAKTLAEGVPSRFSGSGSGT o DFTLTISSLQPEDFATYYCQHQYGPPFTFGQGTKLEIK (comprime RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA nto KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT completo) LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
19 3C2 HC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMH Humanizad WVRQAPGQGLEWMGNIDPSDSDTHYNQKFKDRVTM o TRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSKYYAM (comprime DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA nto ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS completo) SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK
KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSPG 20 3C2 LC DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSYGNTYL Humanizad EWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGT o DFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEI (comprime KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE nto AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL completo) TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 21 9B11 DYYIH CDR-H1 22 9B11 RIDPEDGETKYAPKFQG CDR-H2 23 9B11 GGFAY CDR-H3 24 9B11 ASSSVSSSYLY CDR-L1 25 9B11 STSNLAS CDR-L2 26 9B11 HQWSSHPYT CDR-L3
27 9B11 VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWV
KQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADT SSNTAYLQLNSLTSEDTAVYSCAKGGFAYWGQGTLV
TVSA 28 9B11 VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWY
QQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYS
LTISSMEAEDAASYFCHQWSSHPYTFGGGTKLEIK 29 7E11 SYWMH CDR-H1 30 7E11 NIDPSDSDTHYNQKFKD CDR-H2 31 7E11 SYGNYGENAMDY CDR-H3 32 7E11 RSSQSIVHSYGNTYLE CDR-L1 33 7E11 KVSNRFS CDR-L2 34 7E11 FQGSHVPFT CDR-L3 35 7E11 VH QVKLQESGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWMH
WVKQRPIQGLEWIGNIDPSDSDTHYNQKFKDKATLTV DNSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASYGNYGENAMD
YWGQGTSVTVSS 36 7E11 VL DILMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSYGNTYL
EWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGT DFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK
37 Ácido CAGGTTCAGTTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAA nucleico GAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGG 1H9 CTTCCGGCTACACCTTTACCAGCTACTGGATCACCT humanizad GGGTCAAGCAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAGTG o de GATCGGCGATATCTATCCTGGCTCCGGCTCCACCA cadeia ACCACATCGAGAAGTTCAAGTCCAAGGCTACCCTG pesada ACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGA
ACTGTCCCGGCTGAGATCTGACGACACCGCCGTGT ACTATTGCGCTACCGGCTACGGCTCCTCCTACGGC TACTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCAC CGTGTCCTCTGCTTCTACCAAGGGACCCAGCGTGT TCCCTCTGGCTCCTTCCAGCAAGTCTACCTCTGGC GGAACAGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACTCTG GCGCTCTGACATCTGGCGTGCACACATTCCCTGCT GTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCTC TGTCGTGACCGTGCCTTCCAGCTCTCTGGGAACCC AGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTTCC AACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTC CTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTG CTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTTCTG TTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCT CGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATG TGTCTCACGAGGACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGG TACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGA CCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACGCCTCCACCTAC AGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGG ATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAAAAGAC CATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCC CAGGTTTACACCCTGCCACCTAGCCGGGAAGAGAT GACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGA AGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCTGTGGAATGG GAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGAC AACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCT TTCTGTACTCCAAGCTGACTGTGGACAAGTCCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACACAGAAGT
CTCTGTCTCTGAGCCCCGGC 38 Ácido GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTC nucleico CGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTC 1H9 GGGCCTCCGAGAACATCTACTCCTACCTGGCCTGG humanizad TATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCT o de GATCTACACCGCTAAGACACTGGCCGAGGGCGTG cadeia leve CCCTCTAGATTTTCTGGCTCTGGAAGCGGCACCGA
CTTTACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGG ACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCACCAGTACGGC CCTCCATTCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGA AATCAAGCGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCA TCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGC ACAGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTA CCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGAC AATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGT GACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGC CTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTA CGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACC CATCAGGGCCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTT CAACCGGGGCGAGTGC
39 Ácido CAGGTTCAGTTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAA nucleico GAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGG 3C2 CTTCCGGCTACACCTTTACCAGCTACTGGATGCAC humanizad TGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAAGGCTTGGAGT o de GGATGGGCAACATCGACCCCTCTGACAGCGACAC cadeia CCACTACAACCAGAAATTCAAGGACCGCGTGACCA pesada TGACCAGAGACACCTCCACCAGCACCGTGTACATG
GAACTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGACACCGCCG TGTACTACTGTGCCAGAGGCTACTCCAAGTACTAC GCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTTA CCGTGTCCTCTGCTTCCACCAAGGGACCCTCTGTG TTCCCTCTGGCTCCTTCCAGCAAGTCTACCTCTGG CGGAACAGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC TACTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACTCT GGCGCTCTGACATCTGGCGTGCACACATTCCCTGC TGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCT CTGTCGTGACCGTGCCTTCCAGCTCTCTGGGAACC CAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTTC CAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGT CCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCT GCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTTCT GTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCT CTCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGA TGTGTCCCACGAAGATCCAGAAGTGAAGTTCAATT GGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAA GACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACGCCTCCACCT ACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAG GATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGT GTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAAAAGA CCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACC CCAGGTTTACACCCTGCCTCCAAGCCGGGAAGAGA TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTG AAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATG GGAGAGCAATGGCCAGCCAGAGAACAACTACAAGA CAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTC TTTCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAG ATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGA TGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAG
TCCCTGTCTCTGTCCCCTGGC 40 Ácido GACATCGTGATGACCCAGACACCTCTGAGCCTGAG nucleico CGTGACACCTGGACAGCCTGCCTCCATCTCCTGCA 3C2 GATCCTCTCAGTCCATCGTGCACTCCTACGGCAAC humanizad ACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCA o de GTCTCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACC cadeia leve GGTTCTCTGGCGTGCCCGACAGATTTTCCGGCTCT
GGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAG AGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGC TTCCAAGGCTCTCACGTGCCCTACACCTTTGGCCA GGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACAGTGGCC GCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGA GCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCC TGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTG CAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCA ACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAG GACAGCACCTACAGCCTGTCCAGCACACTGACCCT GTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTAC GCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGTCTAGCC CTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAGTGC
41 Ácido GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTG nucleico TGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACA 9B11 VH GCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATACAC
TGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGT GGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGGTGAAACT AAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTAT AACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGC AGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTC TATTCCTGTGCTAAGGGGGGGTTTGCTTACTGGGG
CCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA 42 Ácido CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCT nucleico GCATCTCCTGGGGAGAAGGTCACCTTGACCTGCAG 9B11 VL TGCCAGTTCAAGTGTAAGTTCCAGCTACTTGTACTG
GTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCT GGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTC CCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTC TTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAG ATGCTGCCTCTTATTTCTGCCATCAGTGGAGTAGTC ACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGA
AATAAAA 43 Ácido CAGGTCAAGCTGCAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGG nucleico TGAGGCCTGGGTCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAG 7E11 VH GCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCA
TTGGGTGAAGCAGAGGCCTATACAAGGCCTTGAAT GGATTGGTAACATTGACCCTTCTGATAGTGATACTC ACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGA CTGTGGACAACTCCTCCAGCACAGCCTACATGCAG CTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTA TTACTGTGCAAGCTATGGTAACTACGGGGAGAATG CTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACC GTCTCCTCA
44 Ácido GATATTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCT nucleico GTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAG 7E11 VL ATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTTATGGAAACAC
CTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGT CTCCAAAACTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGAT TTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGA TCAGGTACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTC AAGGTTCACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG
ACAAAGTTGGAAATAAAA 45 SIRPa EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQW
FRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDF SIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTEL
SVRA 46 KWar VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYIHWV
QQAPGKGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQDRATITADT STDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWGAYWGQGTLV
TVSS 47 KWar VL QIVLTQSPPTLSLSPGERVTLTCSASSSVSSSYLYWY
QQKPGQAPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYT
LTISSLQPEDFAVYFCHQWSSYPRTFGAGTKLEIK 48 SIRPa V1 EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQW
FRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDF SIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTEL
SVRA 49 SIRPa V2 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQW
FRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDF SISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELS VRA

Claims (63)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado caracterizado pelo fato de que: (a) liga-se especificamente a SIRPα humano; (b) liga cada um dos alelos SIRPα humanos V1 e V2; (c) não liga especificamente SIRPγ humano; e (d) opcionalmente compreende uma região Fc humana compreendendo pelo menos uma modificação que reduz a ligação a um receptor Fc humano.
2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1; uma CDR-H2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma CDR-H3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3; uma CDR-L1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4; uma CDR- L2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5; e uma CDR-L3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6; ou (b) uma CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 9; uma CDR-H2 compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 10; uma CDR-H3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 11; uma CDR-L1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 12; uma CDR-L2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 13; e uma CDR-L3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 14.
3. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que: (a) o anticorpo da reivindicação 2 (a) compreende uma sequência VH da SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL do SEQ ID NO: 8; ou (b) o anticorpo da reivindicação 2 (b) compreende uma sequência VH da SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 16.
4. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que: (a) o anticorpo da reivindicação 3 (a) compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 18; ou
(b) o anticorpo da reivindicação 3 (b) compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 20.
5. Anticorpo isolado humanizado, humano ou quimérico caracterizado pelo fato de que compreende: um CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1; uma CDR-H2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma CDR-H3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3; uma CDR-L1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4; uma CDR-L2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5; e uma CDR-L3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6.
6. Anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: uma sequência VH da SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 8.
7. Anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 18.
8. Anticorpo isolado humanizado, humano ou quimérico caracterizado pelo fato de que compreende: um CDR-H1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 9; uma CDR-H2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10; uma CDR-H3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 11; uma CDR-L1 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 12; uma CDR-L2 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 13; e uma CDR-L3 compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 14.
9. Anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: uma sequência VH da SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 16.
10. Anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 20.
11. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região Fc humana com função(ões) dependente(s) reduzida(s) de Fc, opcionalmente compreendendo pelo menos uma modificação que reduz a ligação a um receptor Fc humano.
12. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que: (a) compete pela ligação ao SIRPα humano com um anticorpo selecionado de 1H9 e 3C2; (b) não compete pela ligação ao SIRPα humano com o anticorpo KWar; (c) compete parcialmente pela ligação ao SIRPα humano com o anticorpo KWar; (d) inibe a ligação do CD47 humano ao SIRPα humano; (e) inibe a ligação de SP-A humana a SIRPα humano ; (f) inibe a ligação de SP-D humana a SIRPα humano ; (g) liga-se ao SIRPα de macaco rhesus; (h) liga-se ao SIRPα de cynomolgus (i) aumenta a fagocitose em relação ao controle; (j) liga cada um dos alelos SIRPα humanos V1 e V2; (k) liga cada um dos alelos SIRPα humanos V1, V2 e V1/V5; (l) liga o alelo SIRPα humano V1; (m) liga o alelo SIRPα humano V2; ou (n) é capaz de qualquer combinação de (a)-(m).
13. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é específico para pan para isotipos de SIRPα humano.
14. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é específico para um isotipo SIRPα humano.
15. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que SIRPα humano é expresso em uma célula apresentadora de antígeno profissional.
16. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que SIRPα humano é expresso em um macrófago.
17. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é 1H9 ou 3C2.
18. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não possui uma região Fc.
19. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a região Fc humana é IgG1 ou IgG4.
20. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a glicosilação do anticorpo é reduzida por desglicosilação enzimática, expressão em um hospedeiro bacteriano ou modificação de um resíduo de aminoácido utilizado para a glicosilação.
21. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a modificação reduz a glicosilação da região Fc humana.
22. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a modificação da região Fc humana compreende uma modificação na posição de índice da UE da asparagina 297.
23. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a modificação da região Fc humana compreende uma substituição de aminoácidos na posição do índice da UE da asparagina 297.
24. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a modificação da região Fc humana compreende uma substituição de aminoácidos N297A, numerada de acordo com o índice da UE.
25. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em: N297A; L234A/L235A; C220S/C226S/C229S/P238S; C226S/C229S/E3233P/L234V/L235A; ou L234F/L235E/P331S, numeração de acordo com o índice da UE.
26. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em: N297; L234/L235; C220/C226/C229/P238; C226/C229/E3233/L234/L235; or L234/L235/P331, numeração de acordo com o índice da UE.
27. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região CH2 nas posições de índice da UE 234, 235 e/ou 237.
28. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende uma ou ambas as substituições de aminoácidos L234A e L235A e, opcionalmente, P331S e/ou K322A e/ou G237A, numeradas de acordo com o índice da UE.
29. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a modificação da região Fc humana compreende uma substituição de aminoácidos K322A, numerada de acordo com o índice da UE.
30. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende E233P/L234V/L235A/G236 + A327G/A330S/P331S, numerada de acordo com o índice da UE.
31. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
32. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é multiespecífico.
33. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a mais de um antígeno ou a mais de um epítopo em um único antígeno.
34. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a região constante da cadeia pesada de uma classe selecionada dentre IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
35. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada da classe IgG e uma subclasse selecionada de IgG1, IgG4, IgG2 e IgG3.
36. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fatode que o anticorpo se liga ao SIRPα humano com um KD menor ou igual a cerca de 1, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 x10-9 M, conforme medido pelo ensaio Biacore.
37. Anticorpo isolado de qualquer uma das reivindicações acima caracterizado pelo fato de ser para uso como medicamento.
38. Anticorpo isolado de qualquer uma das reivindicações acima para uso no tratamento de um câncer ou infecção.
39. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de um câncer, em que o câncer é selecionado a partir de um tumor sólido e um tumor hematológico.
40. Anticorpo isolado de qualquer uma das reivindicações acima caracterizado pelo fato de ser para uso no aumento da fagocitose.
41. Anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado caracterizado pelo fato de que compete pela ligação ao SIRPα humano com o anticorpo isolado de qualquer uma das reivindicações acima.
42. Anticorpo humanizado, humano ou quimérico isolado caracterizado pelo fato de que liga o epitopo do SIRPα humano ligado ao anticorpo isolado de qualquer uma das reivindicações acima.
43. Polinucleotídeo isolado ou conjunto de polinucleotídeos que codificam o anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, um VH deste, um VL deste, uma cadeia leve deste, uma cadeia leve deste, uma cadeia pesada do mesmo ou uma porção de ligação ao antígeno deste.
44. Vetor ou conjunto de vetores caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 43.
45. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreendeo polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos da reivindicação 43 ou o vetor ou conjunto de vetores da reivindicação 44.
46. Método para produzir um anticorpo caracterizado pelo fato de que expressa o anticorpo com a célula hospedeira da reivindicação 45 e isola o anticorpo expresso.
47. Composição farmacêutica caracterizado pelo fato de que compreendeo anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-42 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
48. Método para tratar ou prevenir uma doença ou condição em um sujeito em necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-42 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 47.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é selecionada dentre: (a) câncer; (b) infecção; (c) uma infecção viral; (d) uma infecção bacteriana; (e) uma infecção fúngica; (f) fibrose; (g) arteriosclerose; (h) uma infecção parasitária, opcionalmente malária; e (i) depleção ou redução de células-tronco endógenas formadoras de sangue da medula óssea para permitir radiação e/ou quimioterapia - livre de, ou - reduzida para transplante de células-tronco formadoras de sangue, opcionalmente em combinação com anticorpo anti-CKIT (CD117).
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é um câncer, e o câncer é selecionado a partir de um tumor sólido e um tumor hematológico.
51. Método para tratar ou prevenir uma doença ou condição em um sujeito em necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-42 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 47.
52. Método para modular uma resposta imune em um sujeito em necessidade da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-42 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 47.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52, caracterizado pelo fato de compreender ainda a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ao sujeito.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um anticorpo que se liga,
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um anticorpo que liga uma proteína ou proteínas na superfície celular de um tumor.
56. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um anticorpo que se liga: (a) HER2 (ERBB2/neu), CD52, PD-L1, VEGF, CD30, EGFR, CD38, RANKL (CD254), GD2 (gangliosideo), SLAMF7 (CD319), CD20, EGFR, PDGFRa, VEGFR2, CD33, CD44, CD99, CD96, CD90, CD133, CKIT (CD117 para tumpres positivos CKIT); (b) CTLA-4, PD-1, PD-L1, CD40 (agonistico), LAG3 (CD223), 41BB (CD137 agonistico), OX40 (CD134, agonistico); e/ou (c) CKIT (CD117) para esgotar células-tronco formadoras de sangue para terapia de transplante.
57. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é pelo menos um dentre:Rituximab, Cetuximab, Alemtuzumab (CD52), Atezolizumab (PD-L1), Avelumab (PD-L1), Bevacizumab (VEGF), Brentuximab (CD30), Daratumumab (CD38), Denosumab (RANKL), Dinutuximab (GD2), Elotuzumab (SLAMF7), Ibritumomab (CD20), Ipilimumab (CTLA-4),
Necitumumab (EGFR), Nivolumab (PD-1), Obinutuzumab (CD20), Ofatumumab (CD20), Olaratumab (PDGFRa), Panitumumab (EGFR), Pembrolizumab (PD-1), Pertuzumab (HER2), Ramucirumab (VEGFR2), Tositumomab (CD20), e Gemtuzumab (CD33).
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 57, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é formulado na mesma composição farmacêutica que o anticorpo.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 57, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é formulado em uma composição farmacêutica diferente do anticorpo.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 57, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é administrado antes da administração do anticorpo.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 57, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é administrado após a administração do anticorpo.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 61, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é administrado contemporaneamente com o anticorpo.
63. Kit caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-42 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 47 e instruções de uso.
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