CN111448210B - 抗SIRP-α抗体及相关方法 - Google Patents

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Abstract

提供了抗SIRPα抗体，包括多特异性抗SIRPα抗体，以及相关的组合物和方法。本公开的抗体与SIRPα结合，并且能够阻断一个细胞上的CD47与吞噬细胞上的SIRPα的相互作用。

Description

抗SIRP-α抗体及相关方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年7月26日提交的美国临时申请号62/537,207的权益，其出于所有的目的特此通过引用以其全文并入。
序列表
本申请包含通过EFS-Web提交并特此通过引用以其全文并入的序列表。2018年8月31日创建的所述ASCII副本命名为40754WO_CRF_sequencelist ing.txt并且大小为47,668字节。
背景技术
细胞的周转始于凋亡程序的诱导或标志细胞去除的其他细胞变化，以及随后吞噬细胞(包括巨噬细胞、树突细胞等)对标志物的识别。这个过程需要特定和选择性地去除不想要的细胞。与健康细胞不同，不想要的/老化的/濒死的细胞显示称为“吃我”信号的标志物或配体，即“改变的自身”，这进而可以被吞噬细胞上的受体识别。健康细胞可能显示“不要吃我”信号，其积极抑制吞噬作用；这些信号要么在濒死细胞中下调，以改变的构象存在，要么被“吃我”或前吞噬细胞信号的上调所取代。健康细胞上的细胞表面蛋白CD47及其与吞噬细胞受体SIRPα的接合构成了一个关键的“不要吃我”信号，它可以关闭由多种方式介导的吞食，所述方式包括凋亡细胞清除和FcR介导的吞噬。阻断CD47介导的吞噬细胞上SIRPα的接合可以导致携带“吃我”信号的活细胞的去除。
CD47是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，其具有单个Ig样结构域和五个跨膜区，它作为SIRPα的细胞配体，通过SIRPα的NH2-末端V样结构域介导结合。SIRPα主要在骨髓细胞上表达，包括巨噬细胞、粒细胞、髓样树突细胞(DC)、肥大细胞及其前体，包括造血干细胞。介导CD47结合的SIRPα上的结构决定因素由Lee等人(2007)J.Immunol.179:7741-7750；Hatherley等人(2007)J.B.C.282:14567-75讨论；并且SIRPα顺式二聚化在CD47结合中的作用由Lee等人(2010)J.B.C.285:37953-63讨论。与CD47抑制正常细胞吞噬的作用一致，有证据表明，就在迁移阶段之前和期间，造血干细胞(HSC)和祖细胞上瞬时上调了CD47，并且CD47在这些细胞上的水平决定了它们在体内被吞食的可能性。
发明内容
本文公开了一种分离的人源化、人或嵌合抗体，其：特异地结合人SIRPα；不特异地结合人SIRPγ；并且任选地包含人Fc区，所述人Fc区包含至少一种减少与人Fc受体的结合的修饰。
在一些方面，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:1中所列序列的CDR-H1；包含SEQ IDNO:2中所列序列的CDR-H2；包含SEQ ID NO:3中所列序列的CDR-H3；包含SEQ ID NO:4中所列序列的CDR-L1；包含SEQ ID NO:5中所列序列的CDR-L2；和包含SEQ ID NO:6中所列序列的CDR-L3；或包含SEQ ID NO:9中所列序列的CDR-H1；包含SEQ ID NO:10中所列序列的CDR-H2；包含SEQ ID NO:11中所列序列的CDR-H3；包含SEQ ID NO:12中所列序列的CDR-L1；包含SEQ ID NO:13中所列序列的CDR-L2；和包含SEQ ID NO:14中所列序列的CDR-L3。
在一些方面，所述抗体包含：SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:8的VL序列；或SEQID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
在一些方面，所述抗体包含：SEQ ID NO:17的重链和SEQ ID NO:18的轻链；或SEQID NO:19的重链和SEQ ID NO:20的轻链。
本文还公开了一种分离的人源化、人或嵌合抗体，其包含：包含SEQ ID NO:1中所列序列的CDR-H1；包含SEQ ID NO:2中所列序列的CDR-H2；包含SEQ ID NO:3中所列序列的CDR-H3；包含SEQ ID NO:4中所列序列的CDR-L1；包含SEQ ID NO:5中所列序列的CDR-L2；和包含SEQ ID NO:6中所列序列的CDR-L3。
本文还公开了一种分离的人源化、人或嵌合抗体，其包含：SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:8的VL序列。
本文还公开了一种分离的人源化、人或嵌合抗体，其包含：SEQ ID NO:17的重链和SEQ ID NO:18的轻链。
本文还公开了一种分离的人源化、人或嵌合抗体，其包含：包含SEQ ID NO:9中所列序列的CDR-H1；包含SEQ ID NO:10中所列序列的CDR-H2；包含SEQ ID NO:11中所列序列的CDR-H3；包含SEQ ID NO:12中所列序列的CDR-L1；包含SEQ ID NO:13中所列序列的CDR-L2；和包含SEQ ID NO:14中所列序列的CDR-L3。
本文还公开了一种分离的人源化、人或嵌合抗体，其包含：SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
本文还公开了一种分离的人源化、人或嵌合抗体，其包含：SEQ ID NO:19的重链和SEQ ID NO:20的轻链。
在一些方面，本文公开的抗体包含人Fc区，所述人Fc区包含至少一种减少与人Fc受体结合的修饰。
在一些方面，本文公开的抗体：(a)与选自1H9和3C2的抗体竞争与人SIRPα的结合；(b)不与KWar抗体竞争与人SIRPα的结合；(c)部分地与KWar抗体竞争与人SIRPα的结合；(d)抑制人CD47与人SIRPα的结合；(e)抑制人SP-A与人SIRPα的结合；(f)抑制人SP-D与人SIRPα的结合；(g)与恒河猴SIRPα结合；(h)与猕猴SIRPα结合；(i)相对于对照增加吞噬作用；或(j)能够是(a)-(i)的任何组合。
在一些方面，本文公开的抗体对人SIRPα同种型是泛特异性的。本文公开的抗体，如1H9，可以结合多种人SIRPα同种型，包括V1、V2和V1/V5中的一种或多种。本文公开的抗体可以结合人SIRPα同种型V1和V2中的每一种。本文公开的抗体可以结合人SIRPα同种型V1，包括纯合子。本文公开的抗体可以结合人SIRPα同种型V2，包括纯合子。本文公开的抗体可以结合人SIRPα同种型V1/V5(杂合子)。本文公开的抗体，如1H9，可以结合多种人SIRPα同种型，包括V1、V2和V1/V5中的每一种。此类抗体可以包括1H9和3C2。可以使用本领域已知的测定，包括PCR和/或流式细胞术，来测量与人SIRPα变体的结合。例如，可以对给定的样品进行基因分型以确定SIRP状态，并且可以使用流式细胞术来确定与SIRP的结合。
在一些方面，本文公开的抗体对人SIRPα同种型是特异性的。
在一些方面，人SIRPα在专职抗原呈递细胞上表达。在一些方面，人SIRPα在巨噬细胞上表达。
本文公开的抗体，如1H9，可以与细胞表面上的人SIRPα结合。本文公开的抗体与SIRPα的结合可以是稳定的，例如持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或大于24小时。本文公开的抗体可以避免在与SIRPα结合时大量内化。此类抗体可以包括1H9和3C2，包括此类抗体的人源化和/或Fc工程化形式。可以使用本领域已知的测定，包括流式细胞术和/或IHC，来测量与人SIRPα的结合。
在一些方面，所述抗体是1H9或3C2。
在一些方面，人Fc区是IgG1或IgG4，任选地用修饰进行修饰。
在一些方面，所述抗体的糖基化通过酶促去糖基化、在细菌宿主中表达或用于糖基化的氨基酸残基的修饰而降低。在一些方面，本文公开的修饰减少了人Fc区的糖基化。在一些方面，人Fc区修饰包括在EU索引位置天冬酰胺297处的修饰。在一些方面，人Fc区修饰包括在EU索引位置天冬酰胺297处的氨基酸取代。在一些方面，人Fc区修饰包括N297A氨基酸取代，根据EU索引编号。在一些方面，所述修饰包括在以下处的一个或多个氨基酸取代：N297A；L234A/L235A；C220S/C226S/C229S/P238S；C226S/C229S/E3233P/L234V/L235A；或L234F/L235E/P331S，根据EU索引编号。在一些方面，所述修饰包括在以下处的一个或多个氨基酸取代：N297；L234/L235；C220/C226/C229/P238；C226/C229/E3233/L234/L235；或L234/L235/P331，根据EU索引编号。在一些方面，所述修饰包括在EU索引位置234、235和/或237处的CH2区域中的一个或多个氨基酸取代。在一些方面，所述修饰包括一个或两个氨基酸取代L234A和L235A，以及任选的P331S和/或K322A和/或G237A，根据EU索引编号。在一些方面，所述修饰包括氨基酸取代K322A，根据EU索引编号。在一些方面，所述修饰包括E233P/L234V/L235A/G236+A327G/A330S/P331S，根据EU索引编号。
在一些方面，所述抗体是单克隆抗体。
在一些方面，所述抗体是多特异性的。在一些方面，所述抗体结合多于一个的抗原或单个抗原上的多于一个的表位。
在一些方面，所述抗体包含选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的类的重链恒定区。在一些方面，所述抗体包含IgG类和选自IgG1、IgG4、IgG2和IgG3的亚类的重链恒定区。
在一些方面，所述抗体结合人SIRPα，其KD小于或等于约1、1-6、1-5、1-4、1-3、2、3、4、5、6、7、8、9或10x10-9 M，如通过Biacore测定所测量。
在一些方面，本文公开的抗体用作药剂。在一些方面，本文公开的抗体用于治疗癌症或感染。在一些方面，本文公开的抗体用于治疗癌症，其中所述癌症选自实体肿瘤和血液肿瘤。在一些方面，本文公开的抗体用于增加吞噬作用。
本文还公开了一种分离的人源化、人或嵌合抗体，其与本文公开的抗体竞争与人SIRPα的结合。
本文还公开了一种分离的人源化、人或嵌合抗体，其结合由本文公开的抗体结合的人SIRPα表位。
本文还公开了一种编码本文公开的分离抗体、其VH、其VL、其轻链、其重链或其抗原结合部分的分离的多核苷酸或多核苷酸组。
本文还公开了一种包含本文公开的多核苷酸或多核苷酸组的载体或载体组。
本文还公开了一种包含本文公开的多核苷酸或多核苷酸组或者本文公开的载体或载体组的宿主细胞。
本文还公开了一种生产抗体的方法，其包括用本文公开的宿主细胞表达所述抗体并分离表达的抗体。
本文还公开了一种包含本文公开的抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文还公开了一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或疾患的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或本文公开的药物组合物。
在一些方面，所述疾病或疾患是：癌症；感染；病毒感染；细菌感染；真菌感染；纤维化；动脉粥样硬化；寄生虫感染，任选疟疾；以及来自骨髓的内源性血液形成干细胞的耗尽或减少，以允许用于血液形成干细胞移植的无放射和/或化疗或放射和/或化疗减少的调理，任选地与抗CKIT(CD117)抗体组合。
在一些方面，所述疾病或疾患是癌症，并且所述癌症选自实体肿瘤和血液肿瘤。
本文还公开了一种在有需要的受试者中增加吞噬作用的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或本文公开的药物组合物。
本文还公开了一种在有需要的受试者中调节免疫应答的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或本文公开的药物组合物。
在一些方面，本文公开的方法进一步包括向受试者施用一种或多种额外的治疗剂。
在一些方面，所述额外的治疗剂是抗体。在一些方面，所述额外的治疗剂是结合肿瘤细胞表面上的一种或多种蛋白质的抗体。在一些方面，所述额外的治疗剂是抗体，其结合：HER2(ERBB2/neu)、CD52、PD-L1、VEGF、CD30、EGFR、CD38、RANKL(CD254)、GD2(神经节苷脂)、SLAMF7(CD319)、CD20、EGFR、PDGFRa、VEGFR2、CD33、CD44、CD99、CD96、CD90、CD133、CKIT(用于CKIT阳性肿瘤的CD117)；CTLA-4、PD-1、PD-L1、CD40(激动性的)、LAG3(CD223)、41BB(CD137激动性的)、OX40(CD134，激动性的)；和/或CKIT(CD117)，用以耗尽血液形成干细胞以进行移植疗法。在一些方面，所述额外的治疗剂是以下中的至少一种：利妥昔单抗、西妥昔单抗、阿仑单抗(CD52)、阿特珠单抗(PD-L1)、阿维鲁单抗(PD-L1)、贝伐单抗(VEGF)、本妥昔单抗(CD30)、达雷木单抗(CD38)、地诺单抗(RANKL)、达妥昔单抗(GD2)、埃罗妥珠单抗(SLAMF7)、替伊莫单抗(CD20)、伊匹单抗(CTLA-4)、耐昔妥珠单抗(EGFR)、纳武单抗(PD-1)、奥滨尤妥珠单抗(CD20)、奥法木单抗(CD20)、奥拉单抗(PDGFRa)、帕尼单抗(EGFR)、派姆单抗(PD-1)、帕妥珠单抗(HER2)、雷莫芦单抗(VEGFR2)、托西莫单抗(CD20)和吉妥珠单抗(CD33)。
在一些方面，所述额外的治疗剂与所述抗体配制在相同的药物组合物中。在一些方面，所述额外的治疗剂与所述抗体配制在不同的药物组合物中。
在一些方面，所述额外的治疗剂在施用所述抗体之前施用。在一些方面，所述额外的治疗剂在施用所述抗体之后施用。在一些方面，所述额外的治疗剂与所述抗体同时施用。
本文还公开了一种试剂盒，其包括本文公开的抗体或本文公开的药物组合物；和使用说明。
附图说明
参考以下描述和附图，本发明的这些和其他特征、方面和优点将变得更好理解，其中：
图1. 1H9的重(A)(SEQ ID NO:55)链和轻(B)(SEQ ID NO:56)链可变区序列。CDR加下划线。
图2. 3C2的重(A)(SEQ ID NO:57)链和轻(B)(SEQ ID NO:58)链可变区序列。CDR加下划线。
图3. 1H9和3C2识别不同的表位。(A)将SIRPa-Fc融合蛋白包被在96孔板中，并在不存在或存在过量50倍或100倍的小鼠Kwar的情况下与1H9或3C2孵育。(B)将SIRPa-Fc融合蛋白包被在96孔板中，并在不存在或存在过量5倍、10倍、50倍和100倍的1H9或3C2的情况下与小鼠1H9孵育。(C)将SIRPa-Fc融合蛋白包被在96孔板中，并在不存在或存在过量5倍、10倍、50倍或100倍的3C2或1H9的情况下与小鼠3C2孵育。
图4. 1H9和3C2与利妥昔单抗协同促进巨噬细胞介导的对Raji细胞的吞噬作用。在人血清存在下，由供体A(A)和供体B(B)的单核细胞分化巨噬细胞7天。用CFSE标记Raji细胞，并在10ug/ml利妥昔单抗单独存在或与10ug/ml 1H9-G4、1H9-G1、3C2-G4或3C2-G1组合存在下与巨噬细胞一起孵育。两小时后，通过流式细胞术分析寻找GFP+巨噬细胞，计算吞噬作用百分比。
图5.人源化1H9的重(A)(SEQ ID NO:7)链和轻(B)(SEQ ID NO:8)链可变区序列。CDR加下划线。
图6.人源化3C2的重(A)(SEQ ID NO:15)链和轻(B)(SEQ ID NO:16)链可变区序列。CDR加下划线。
图7.人源化1H9和3C2具有与其亲本抗体相同的抗原结合特异性。(A)将SIRPa-Fc融合蛋白包被在96孔板中，并在不存在或存在过量5倍、10倍、50倍或100倍的人源化1H9的情况下与小鼠1H9孵育。(B)将SIRPa-Fc融合蛋白包被在96孔板中，并在不存在或存在过量5倍、10倍、50倍或100倍的人源化3C2的情况下与小鼠3C2孵育。
图8.人源化1H9和3C2的Biacore亲和力测量。
图9.人源化1H9和3C2与治疗性抗体协同作用，以促进吞噬作用。(A)用CFSE标记Raji细胞，并在10ug/ml利妥昔单抗单独存在或与10ug/ml Hu1H9-G1或Hu3C2-G1组合存在下与人单核细胞来源的巨噬细胞一起孵育。(B)用CFSE标记HT29细胞，并在0.1ug/ml西妥昔单抗单独存在或与0.5ug/ml、5ug/ml和10ug/ml Hu1H9-G1或Hu3C2-G1组合存在下与人单核细胞来源的巨噬细胞一起孵育。两小时后，通过流式细胞术分析寻找GFP+巨噬细胞，计算吞噬作用百分比。
图10.与SIRPB和SIRPG的交叉反应。(A)通过ELISA测定Kwar、1H9和3C2与人SIRPB-His融合蛋白的结合。(B)通过ELISA测定Kwar、1H9和3C2与人SIRPG-His融合蛋白的结合。
图11. 9B11和7E11与利妥昔单抗协同促进巨噬细胞介导的对Raji细胞的吞噬作用。
图12. 7E11和9B11表位结合。7E11与Kwar相比识别重叠的表位(类似于3C2)，并且9B11与Kwar相比识别非常相似或相同的表位。
图13.Hu1H9-G1与细胞上的SIRPa的V1和V2两种变体结合。
图14.Hu1H9-G1阻断CD47与来自不同供体的单核细胞的结合。
图15.在不同供体间，Hu1H9-G1与西妥昔单抗协同促进吞噬作用。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语、注释和其他科学术语意在具本领域技术人员通常所理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义未必被解释为表示与本领域通常理解的差异。本领域普通技术人员通常很好地理解和使用常规方法一般地采用本文所描述或引用的技术和程序，例如像，在Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual第4版(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中所述的广泛使用的分子克隆方法。如果合适，除非另有说明，否则涉及使用可商购获得的试剂盒和试剂的程序通常按照制造商定义的方案和条件进行。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。除非另有特别规定，否则术语“包括”、“如”等旨在传达包含而非限制。
如本文所用，术语“包含”还具体地包括实施方案“由”和“基本上由”所述元素组成，除非另有特别规定。例如，“包含双抗体”的多特异性抗体包括“由双抗体组成”的多特异性抗体和“基本上由双抗体组成”的多特异性抗体。
术语“约”指示并涵盖指示值和所述值上下的范围。在某些实施方案中，术语“约”指示指定值±10％、±5％或±1％。在某些实施方案中，在适用的情况下，术语“约”指示一个或多个指定值±所述一个或多个值的一个标准偏差。
SIRPα1(PTPNS1，SHPS1)是一种跨膜糖蛋白，主要在髓细胞和神经元细胞上表达。SIRPα与广泛分布的膜蛋白CD47相互作用。除了SIRPα之外，SIRP家族中还有两种密切相关的蛋白质：SIRPβ和SIRPγ。这三种蛋白质在其细胞外区中都具有三个免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域。在人中，SIRPα蛋白有两种主要形式。一种形式，变体1或V1形式，具有如NCBIRefSeq NP_542970.1所示的氨基酸序列(残基27-504构成成熟形式)。另一种形式，变体2或V2形式，相差13个氨基酸并且具有在GenBank中如CAA71403.1所示的氨基酸序列(残基30-504构成成熟形式)。这两种形式的SIRPα占人中存在的SIRPα形式的约80％，并且二者在本文中均被术语“人SIRPα”所包含。术语“人SIRPα”还包含其次要形式，其对人是内源性的，并且具有在结合CD 47时通过其触发信号转导的相同特性。人SIRPa变体的序列可以通过公共数据库访问，包括Genbank登录号：ref|NP_542970.1；gb|EAX10606.1；ref|XP_005260726.1；gb|EAX10606.1；XP_005260726.1；gb|EAX10611.1；gb|EAX10609.1；dbj|BAA12974.1；gb|AAH26692.1；ref|XP_011527475.1。参见，例如Lee等人(2007)J.Immunol.179(11):7741-7750，其通过引用具体地并入本文。
特异地结合人SIRPα的抗体是本领域已知和使用的，并且可以通过使用如本文公开的工程化Fc区进行改造。示例性抗体包括描述于以下中的那些：国际专利申请WO 2015/138600；公布的美国申请2014/0242095(University Health Networks)；公布的申请CN103665165(JIANGSU KUANGYA BIOLOGICAL MEDICAL SCIENCE&TECHNOLOGY)；Zhao XW等人Proc Natl Acad Sci U S A 108:18342-7(2011)，各自通过引用具体地并入本文。抗SIRPα抗体可以是泛特异性的，即与两种或更多种不同的人SIRPα亚型结合；或者可以对一种亚型是特异的。例如，由Zhang等人,同上描述的抗体1.23A据报道对SIRPα1变体是特异性的，而12C4抗体是泛特异性的。抗SIRPα抗体还可以对SIRPα是特异的，并且缺乏与SIRPβ和/或SIRPγ的结合。抗SIRPa抗体可以对于SIRPβ和/或SIRPγ是泛特异性的。
术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的蛋白质，其通常包含两对多肽链：一对轻(L)链和一对重(H)链。在“完整免疫球蛋白”中，所有这四条链都通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已被充分表征。参见例如，Paul,Fundamental Immunology第7版,第5章(2013)Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。简而言之，各重链通常包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区通常包含三个结构域，缩写为CH1、CH2和CH3。各轻链通常包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区通常包含一个结构域，缩写为CL。
术语“抗体”在本文中以其最广泛的意义使用，并且包括某些类型的免疫球蛋白分子，其包含一个或多个特异地结合抗原或表位的抗原结合结构域。抗体具体地包括完整的抗体(例如，完整的免疫球蛋白)、抗体片段和多特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含可替代支架。在一些实施方案中，所述抗体由可替代支架组成。在一些实施方案中，所述抗体基本上由可替代支架组成。在一些实施方案中，所述抗体包含抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体由抗体片段组成。在一些实施方案中，所述抗体基本上由抗体片段组成。“SIRP-α抗体”、“抗SIRP-α抗体”或“SIRP-α特异性抗体”是如本文提供的抗体，其特异地结合抗原SIRP-α。在一些实施方案中，所述抗体结合SIRP-α的胞外结构域。在某些实施方案中，本文提供的SIRP-α抗体结合SIRP-α的表位，所述表位在来自不同物种的SIRP-α蛋白质之间或之中是保守的。
术语“可替代支架”是指其中一个或多个区域可以多样化以产生一个或多个特异地结合抗原或表位的抗原结合结构域的分子。在一些实施方案中，抗原结合结构域以与抗体相似的特异性和亲和力结合抗原或表位。示例性可替代支架包括源自以下的那些：纤连蛋白(例如AdnectinsTM)、β-夹心(例如iMab)、脂质运载蛋白(例如)、EETI-II/AGRP、BPTI/LACI-D1/ITI-D2(例如Kunitz结构域)、硫氧还蛋白肽适体、蛋白A(例如)、锚蛋白重复序列(例如DARPin)、γ-B-晶体蛋白/泛素(例如Affilin)、CTLD3(例如，四连接素(Tetranectin))、Fynomer和(LDLR-A模块)(例如Avimer)。关于可替代支架的额外的信息在Binz等人,Nat.Biotechnol.,2005 23:1257-1268；Skerra,CurrentOpin.in Biotech.,2007 18:295-304；和Silacci等人,J.Biol.Chem.,2014,289:14392-14398中提供；其各自通过引用以其全文并入。可替代支架是一种类型的抗体。
术语“抗原结合结构域”意指抗体能够特异地结合抗原或表位的部分。抗原结合结构域的一个实例是由抗体的VH-VL二聚体形成的抗原结合结构域。抗原结合结构域的另一个实例是通过Adnectin的第十个纤连蛋白III型结构域的某些环的多样化形成的抗原结合结构域。抗原结合结构域可以依次包括来自重链的CDR 1、2和3；和来自轻链的CDR 1、2和3。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用来指具有与天然存在的抗体结构大致上类似的结构或具有包含Fc区的重链的抗体。例如，当用于指IgG分子时，“全长抗体”是包含两条重链和两条轻链的抗体。
术语“Fc区”或“Fc”意指免疫球蛋白重链的C-末端区，在天然存在的抗体中，所述区与Fc受体和补体系统的某些蛋白质相互作用。各种免疫球蛋白的Fc区的结构以及其中包含的糖基化位点是本领域已知的。参见Schroeder和Cavacini,J.Allergy Clin.Immunol.,2010,125:S41-52，其通过引用以其全文并入。Fc区可以是天然存在的Fc区，或者如本领域或本公开其他地方所描述的那样被修饰的Fc区。
VH和VL区可以进一步细分为高变异性区域(“高变区(HVR)”)也称为“互补决定区”(CDR))，其间散布着更保守的区域。更保守的区域称为框架区域(FR)。每个VH和VL通常包含三个CDR和四个FR，以如下顺序排列(从N-末端到C-末端)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。CDR参与抗原结合，并影响抗原特异性和抗体的结合亲和力。参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版(1991)Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD，其通过引用以其全文并入。
来自任何脊椎动物物种的轻链可以基于其恒定结构域的序列指定为两种类型(称为κ和λ)中的一者。
来自任何脊椎动物物种的重链可以指定为五个不同的类别(或同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中的一者。这些类别还分别命名为α、δ、ε、γ和μ。IgG和IgA类别根据序列和功能的不同进一步分为亚类。人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
CDR的氨基酸序列边界可以由本领域技术人员使用许多已知编号方案中的任一种来确定，包括由Kabat等人,同上(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案)；以及Honegge和Plückthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)描述的那些；其各自通过引用以其全文并入。
表1提供了如由Kabat和Chothia方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的位置。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia编号方案二者提供了残基编号。
例如，可以使用抗体编号软件(如Abnum)来分配CDR，所述软件可在www.bioinf.org.uk/abs/abnum/获得，并描述于Abhinandan和Martin,Immunology,2008,45:3832-3839中，其通过引用以其全文并入。
表1.根据Kabat和Chothia编号方案，CDR中的残基
CDR Kabat Chothia
L1 L24-L34 L24-L34
L2 L50-L56 L50-L56
L3 L89-L97 L89-L97
H1(Kabat编号) H31-H35B H26-H32或H34*
H1(Chothia编号) H31-H35 H26-H32
H2 H50-H65 H52-H56
H3 H95-H102 H95-H102
*当使用Kabat编号规则编号时，CDR-H1的C-末端在H32与H34之间变化，这取决于CDR的长度。
当提及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，如Kabat等人,同上中所报告的)。除非另有说明，否则EU编号方案用于指本文所述抗体重链恒定区中的残基。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段包括例如，Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、scFv(sFv)片段和scFv-Fc片段。
“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接的二聚体。
除了重链和轻链可变结构域之外，“Fab”片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段可以例如通过重组方法或通过木瓜蛋白酶消化全长抗体来产生。
“F(ab’)2”片段含有两个Fab’片段，它们在铰链区附近通过二硫键连接。F(ab’)2片段可以例如通过重组方法或通过胃蛋白酶消化完整抗体来产生。例如，通过用β-巯基乙醇处理，可以解离F(ab’)片段。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段在单个多肽链中包含VH结构域和VL结构域。VH和VL通常由肽接头连接。参见Plückthun A.(1994)。可以使用任何合适的接头。在一些实施方案中，所述接头是(GGGGS)n(SEQ ID NO:50)。在一些实施方案中，n＝1、2、3、4、5或6。参见来自大肠杆菌(Escherichia coli)的抗体。在Rosenberg M.和Moore G.P.(编),ThePharmacology of Monoclonal Antibodies第113卷(第269-315页).Springer-Verlag,NewYork中，其通过引用以其全文并入。
“scFv-Fc”片段包含连接到Fc结构域的scFv。例如，Fc结构域可以连接到scFv的C-末端。根据scFv中可变结构域的取向(即，VH-VL或VL-VH)，Fc结构域可以遵循VH或VL。可以使用本领域已知或本文所述的任何合适的Fc结构域。在一些情况下，所述Fc结构域包含IgG4Fc结构域。
术语“单结构域抗体”是指其中抗体的一个可变结构域特异地结合抗原而不存在另一个可变结构域的分子。单结构域抗体及其片段描述于Arabi Ghahroudi等人,FEBSLetters,1998,414:521-526和Muyldermans等人,Trends in Biochem.Sci.,2001,26:230-245中，其各自通过引用以其全文并入。单结构域抗体也被称为sdAb或纳米抗体。
“多特异性抗体”是包含两个或更多个不同抗原结合结构域的抗体，所述结构域共同特异地结合两个或更多个不同表位。所述两个或更多个不同表位可以是同一抗原(例如，由细胞表达的单个SIRP-α分子)或不同抗原(例如，由同一细胞表达的不同SIRP-α分子，或SIRP-α分子和非SIRP-α分子)上的表位。在一些方面，多特异性抗体结合两个不同的表位(即，“双特异性抗体”)。在一些方面，多特异性抗体结合三个不同的表位(即，“三特异性抗体”)。
“单特异性抗体”是包含一个或多个结合位点的抗体，所述结合位点特异地结合单个表位。单特异性抗体的实例是天然存在的IgG分子，其虽然是二价的(即具有两个抗原结合结构域)，但在两个抗原结合结构域的每一个处识别相同表位。结合特异性可以任何合适的化合价存在。
术语“单克隆抗体”是指来自基本上同质抗体群体的抗体。除了在单克隆抗体生产过程中通常可能出现的变体之外，基本上同质抗体的群体包括基本上相似并且结合一个或多个相同表位的抗体。此类变体通常仅以少量存在。单克隆抗体通常通过包括从多种抗体中选择单个抗体的方法获得。例如，选择方法可以是从多个克隆(如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、酵母克隆、细菌克隆或其他重组DNA克隆的池)中选择独特的克隆。可以进一步改变所选择抗体，例如，以提高对靶的亲和力(“亲和力成熟”)、使抗体人源化、提高其在细胞培养中的产量和/或降低其在受试者中的免疫原性。
术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。
“人源化”形式的非人抗体是含有源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体通常是人抗体(受体抗体)，其中来自一种或多种CDR的残基被来自非人抗体(供体抗体)的一种或多种CDR的残基替代。供体抗体可以是任何合适的非人抗体，如具有所希望特异性、亲和力或生物效应的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类抗体。在一些情况下，受体抗体的所选择框架区残基被来自供体抗体的对应框架区残基替代。人源化抗体还可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可以进行此类修饰以进一步改善抗体功能。对于进一步的细节，参见Jones等人,Nature,1986,321:522-525；Riechmann等人,Nature,1988,332:323-329；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992,2:593-596，其各自通过引用以其全文并入。
“人抗体”是具有以下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或源自利用人抗体库或人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列(例如，从人来源获得或从头设计)。人抗体特别地排除人源化抗体。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原或表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原或表位)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可以由解离平衡常数(KD)表示。有助于解离平衡常数的动力学组分在以下更详细地描述。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法，如表面等离子共振(SPR)技术(例如，)或生物层干涉测量法(例如，)。
关于抗体与靶分子的结合，术语对特定抗原(例如多肽靶)或特定抗原上的表位“结合”、“特异性结合”、“特异地结合”、“具有特异性”、“选择性结合”和“具有选择性”意味着与非特异性或非选择性相互作用(例如与非靶分子)明显不同的结合。特异性结合可以例如通过测量与靶分子的结合并将其和与非靶分子的结合进行比较来测量。特异性结合还可以通过与模拟靶分子上识别的表位的对照分子竞争来确定。在那种情况下，如果抗体与靶分子的结合被对照分子竞争性抑制，则表明特异性结合。在一些方面，SIRP-α抗体对非靶分子的亲和力小于对SIRP-α的亲和力的约50％。在一些方面，SIRP-α抗体对非靶分子的亲和力小于对SIRP-α的亲和力的约40％。在一些方面，SIRP-α抗体对非靶分子的亲和力小于对SIRP-α的亲和力的约30％。在一些方面，SIRP-α抗体对非靶分子的亲和力小于对SIRP-α的亲和力的约20％。在一些方面，SIRP-α抗体对非靶分子的亲和力小于对SIRP-α的亲和力的约10％。在一些方面，SIRP-α抗体对非靶分子的亲和力小于对SIRP-α的亲和力的约1％。在一些方面，SIRP-α抗体对非靶分子的亲和力小于对SIRP-α的亲和力的约0.1％。
如本文所用，术语“kd(sec-1)”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。这个值也称为koff值。
如本文所用，术语“ka(M-1×sec-1)”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。这个值也称为kon值。
如本文所用，术语“KD(M)”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。KD＝kd/ka。在一些实施方案中，抗体的亲和力是根据这种抗体与其抗原之间相互作用的KD来描述的。为了清楚起见，如本领域已知的，较小的KD值指示较高的亲和力相互作用，而较大的KD值指示较低的亲和力相互作用。
如本文所用，术语“KA(M-1)”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数。KA＝ka/kd。
“免疫缀合物”是抗体缀合至一个或多个异源分子，如治疗剂(例如细胞因子)或诊断剂。
“效应功能”是指由抗体的Fc区介导的那些生物学活性，所述活性可以根据抗体同种型而变化。抗体效应功能的实例包括C1q结合以激活补体依赖细胞毒性(CDC)、Fc受体结合以激活抗体依赖细胞毒性(ADCC)和抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP)。
当在本文中用于两种或更多种抗体的情形中时，术语“与……竞争”或“与……交叉竞争”指示两种或更多种抗体竞争结合抗原(例如SIRP-α)。在一个示例性测定中，将SIRP-α被包被在表面上并与第一SIRP-α抗体接触，之后添加第二SIRP-α抗体。在另一个示例性测定中，将第一SIRP-α抗体被包被在表面上并与SIRP-α接触，并且然后添加第二SIRP-α抗体。如果第一SIRP-α抗体的存在降低了第二SIRP-α抗体的结合，则在任一测定中，所述抗体相互竞争。术语“与……竞争”还包括抗体的组合，其中一种抗体减少另一种抗体的结合，但当抗体以相反的顺序加入时没有观察到竞争。然而，在一些实施方案中，第一和第二抗体抑制彼此结合，而不管它们的添加顺序如何。在一些实施方案中，一种抗体将另一种抗体与其抗原的结合降低至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。熟练的技术人员可以基于抗体对SIRP-α的亲和力和抗体的化合价来选择在竞争测定中使用的抗体浓度。此定义中描述的测定是说明性的，并且熟练的技术人员可以利用任何合适的测定来确定抗体是否相互竞争。合适的测定描述于例如Cox等人,“Immunoassay Methods,”在Assay Guidance Manual[Internet]中,更新于2014年12月24日(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/；2015年9月29日访问)；Silman等人,Cytometry,2001,44:30-37；和Finco等人,J.Pharm.Biomed.Anal.,2011,54:351-358中，其各自通过引用以其全文并入。
术语“表位”意指抗原的特异地结合抗体的部分。表位通常由表面可及的氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可能具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于：在变性溶剂存在下，可以失去与前者的结合，但不失去与后者的结合。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基，以及不直接参与结合的其他氨基酸残基。抗体结合的表位可以使用已知的表位确定技术来确定，例如像测试抗体与具有不同点突变的SIRP-α变体或与嵌合SIRP-α变体的结合。
多肽序列与参考序列之间的“同一性”百分比被定义为在对序列进行比对并引入间隙(如果需要)，以实现最大的序列同一性百分比之后，多肽序列中与参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的多种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN(DNASTAR)、CLUSTALW、CLUSTAL OMEGA或MUSCLE软件。本领域技术人员可以确定适用于比对序列的参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大对准所需的任何算法。
“保守取代”或“保守氨基酸取代”是指用化学或功能上相似的氨基酸取代氨基酸。提供相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。举例来说，在一些实施方案中，表2-4中提供的氨基酸组被认为是彼此的保守取代。
表2.在某些实施方案中，被认为是彼此的保守取代的所选择氨基酸组。
酸性残基 D和E
碱性残基 K、R和H
亲水性不带电残基 S、T、N和Q
脂族不带电残基 G、A、V、L和I
非极性不带电残基 C、M和P
芳香族残基 F、Y和W
表3.在某些实施方案中，被认为是彼此的保守取代的另外的所选择氨基酸组。
表4.在某些实施方案中，被认为是彼此的保守取代的其他所选择氨基酸组。
第A组 A和G
第B组 D和E
第C组 N和Q
第D组 R、K和H
第E组 I、L、M、V
第F组 F、Y和W
第G组 S和T
第H组 C和M
另外的保守取代可以在例如Creighton,Proteins:Structures and MolecularProperties第2版(1993)W.H.Freeman&Co.,New York,NY中找到。通过对亲本抗体中的氨基酸残基进行一次或多次保守取代而产生的抗体称为“保守修饰的变体”。
术语“氨基酸”是指二十种常见的天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
如本文所用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入了其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，和此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”(或“转化细胞”)和“转染体”(或“转染细胞”)，它们各自包括初级转化或转染细胞及其衍生的后代。这种后代在核酸内含物方面可能不完全与母细胞相同，并且可能含有突变。
术语“治疗”(及其变型，如“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)是指试图改变有需要的受试者中的疾病或疾患的自然病程的临床干预。可以进行用于预防的治疗和临床病理过程中的治疗二者。希望的治疗效果包括防止疾病发生或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态以及缓和或改善预后。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指本文提供的抗体或药物组合物的量，当向受试者施用时，其有效治疗疾病或病症。
如本文所用，术语“受试者”意指哺乳动物受试者。示例性受试者包括人、猴子、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、骆驼、山羊、兔子和绵羊。在某些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者患有可以用本文提供的抗体治疗的疾病或疾患。在一些方面，所述疾病或疾患是癌症。在一些方面，所述疾病或疾患是病毒感染。
术语“包装插页”用于指惯常包括在治疗或诊断产品(例如，试剂盒)的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗或诊断产品的使用的警告的信息。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。
“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其作用是调节、减少、阻断或抑制可以促进癌症生长的激素的作用。
术语“细胞抑制剂”是指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。在一些实施方案中，细胞抑制剂是降低S期细胞的百分比的药剂。在一些实施方案中，细胞抑制剂将S期细胞的百分比降低至少约20％、至少约40％、至少约60％或至少约80％。
术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性或良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。如本文提及的术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在并不相互排斥。术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”是指与某种程度的异常细胞增殖相关的病症。在一些实施方案中，所述细胞增殖性病症是癌症。在一些方面，所述肿瘤是实体肿瘤。在一些方面，所述肿瘤是血液系统恶性肿瘤。
术语“药物组合物”是指以下制剂：其呈允许其中所含的活性成分的生物活性在治疗受试者方面有效的形式，并且不含以所述药物组合物中提供的量对所述受试者具有不可接受毒性的额外组分。
术语“共同施用(co-administration)”、“共同施用(co-administer)”和“与……组合”包括在没有特定时间限制的情况下同时、并行或顺序施用两种或更多种治疗剂。在一个实施方案中，药剂同时存在于细胞或受试者体内，或同时发挥其生物或治疗作用。在一个实施方案中，所述治疗剂在同一组合物或单位剂型中。在其他实施方案中，所述治疗剂在分开的组合物或单位剂型中。在某些实施方案中，可以在施用第二治疗剂之前(例如，之前分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、伴随、或之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用第一药剂。
术语“调节(modulate)”和“调节(modulation)”是指减少或抑制，或者可替代地激活或增加所列举变量。
术语“增加”和“激活”是指所列举变量增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更大。
术语“减少”和“抑制”是指所列举变量减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更大。
术语“激动”是指激活受体信号传导以诱导与受体激活相关的生物应答。“激动剂”是一种结合受体并使其激动的实体。
术语“拮抗”是指抑制受体信号传导以抑制与受体激活相关的生物应答。“拮抗剂”是一种结合受体并使其拮抗的实体。
SIRP-α抗体
本文提供了特异地结合SIRP-α的抗体。在一些方面，SIRP-α是人SIRP-α。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异地结合SIRP-α的胞外结构域。SIRP-α可以在任何合适的靶细胞表面上表达。在一些实施方案中，所述靶细胞是专职抗原呈递细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是巨噬细胞。抗体可以对人SIRPα同种型具有泛特异性。抗体可以对人SIRPα同种型具有特异性。
在某些实施方案中，抗体是1H9。在某些实施方案中，抗体是3C2。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含轻链。在一些方面，所述轻链是κ轻链。在一些方面，所述轻链是λ轻链。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含重链。在一些方面，所述重链是IgA。在一些方面，所述重链是IgD。在一些方面，所述重链是IgE。在一些方面，所述重链是IgG。在一些方面，所述重链是IgM。在一些方面，所述重链是IgG1。在一些方面，所述重链是IgG2。在一些方面，所述重链是IgG3。在一些方面，所述重链是IgG4。在一些方面，所述重链是IgA1。在一些方面，所述重链是IgA2。
在一些实施方案中，抗体结合人SIRPα，其KD小于或等于约1、1-6、1-5、1-4、1-3、2、3、4、5、6、7、8、9或10x10-9 M，如通过Biacore测定所测量。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含抗体片段。在一些实施方案中，本文提供的抗体由抗体片段组成。在一些实施方案中，本文提供的抗体基本上由抗体片段组成。在一些方面，所述抗体片段是Fv片段。在一些方面，所述抗体片段是Fab片段。在一些方面，所述抗体片段是F(ab’)2片段。在一些方面，所述抗体片段是Fab’片段。在一些方面，所述抗体片段是scFv(sFv)片段。在一些方面，所述抗体片段是scFv-Fc片段。在一些方面，所述抗体片段是单结构域抗体的片段。
在一些实施方案中，本文提供的抗体片段源自本文提供的说明性抗体。在一些实施方案中，本文提供的抗体片段不是源自本文提供的说明性抗体，并且可以例如根据本文提供的用于获得抗体片段的方法从头分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体片段保留了拮抗SIRP-α的能力，如通过本文所述的一种或多种测定或生物效应所测量。在一些实施方案中，如本文所述，本文提供的抗体片段保留了防止SIRP-α与其一个或多个配体相互作用的能力。
在一些实施方案中，本文提供的抗体片段与1H9和/或3C2竞争结合SIRP-α。在一些实施方案中，本文提供的抗体的片段与这种抗体结合SIRP-α的相同表位。
作为使用包含对Fcγ受体的亲和力降低的人Fc区的抗体的替代方案，可以将抗体工程化成缺乏Fc序列，例如通过产生抗体片段，如F(ab’)2片段。为了产生F(ab)2片段，根据制造商的说明，将纯化的抗体用固定在沉淀树脂上的Pierce F(ab’)2制备胃蛋白酶悬浮。胃蛋白酶消化通常产生F(ab’)2片段(在非还原条件下通过SDS-PAGE测得约110kDa)和许多Fc部分的小肽。所得F(ab’)2片段由一对通过两个二硫键连接的Fab’单元构成。通过透析、凝胶过滤或离子交换色谱将Fc片段广泛降解并从F(ab’)2中分离出来。
在一些实施方案中，本文提供的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，本文提供的抗体是多克隆抗体。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包括嵌合抗体。在一些实施方案中，本文提供的抗体由嵌合抗体组成。在一些实施方案中，本文提供的抗体基本上由嵌合抗体组成。在一些实施方案中，本文提供的抗体包括人源化抗体。在一些实施方案中，本文提供的抗体由人源化抗体组成。在一些实施方案中，本文提供的抗体基本上由人源化抗体组成。在一些实施方案中，本文提供的抗体包括人抗体。在一些实施方案中，本文提供的抗体由人抗体组成。在一些实施方案中，本文提供的抗体基本上由人抗体组成。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含可替代支架。在一些实施方案中，本文提供的抗体由可替代支架组成。在一些实施方案中，本文提供的抗体基本上由可替代支架组成。可以使用任何合适的可替代支架。在一些方面，可替代支架选自AdnectinTM、iMab、EETI-II/AGRP、Kunitz结构域、硫氧还蛋白肽适体、/>DARPin、Affilin、四连接素、Fynomer和Avimer。
在一些实施方案中，本文提供的抗体抑制SIRP-α与SIRP-α的一个或多个配体的结合。
在某些方面，抗体不与SIRP-γ结合。在某些方面，抗体基本上不与SIRP-γ结合。
在一些方面，本文公开的抗体对人SIRPα同种型是泛特异性的。本文公开的抗体，如1H9，可以结合多种人SIRPα同种型，包括V1、V2和V1/V5中的一种或多种。示例性V1序列以SEQ ID NO:48示出。示例性V2序列以SEQ ID NO:49示出。还参见Polymorphism in Sirpamodulates engraftment of human hematopoietic stem cells.Nature Immunology,8；1313,2007。本文公开的抗体可以结合人SIRPα同种型V1和V2中的每一种。本文公开的抗体可以结合人SIRPα同种型V1，包括纯合子。本文公开的抗体可以结合人SIRPα同种型V2，包括纯合子。本文公开的抗体可以结合人SIRPα同种型V1/V5(杂合子)。本文公开的抗体，如1H9，可以结合多种人SIRPα同种型，包括V1、V2和V1/V5中的每一种。此类抗体可以包括1H9和3C2，包括此类抗体的人源化和/或Fc工程化形式。1H9可以结合人SIRPα同种型V1和V2中的每一种。1H9可以结合人SIRPα同种型V1，包括纯合子。1H9可以结合人SIRPα同种型V2，包括纯合子。1H9可以结合人SIRPα同种型V1/V5(杂合子)。1H9可以结合多种人SIRPα同种型，包括V1、V2和V1/V5中的每一种。可以使用本领域已知的测定，包括PCR和/或流式细胞术来测量与人SIRPα变体的结合。例如，可以对给定的样品进行基因分型以确定SIRP状态，并且可以使用流式细胞术来确定与SIRP的结合。
在某些方面，抗体与选自1H9和3C2的抗体竞争结合人SIRPα。在某些方面，抗体与如由1H9或3C2结合的相同人SIRPα表位结合。在某些方面，抗体与如由1H9或3C2结合的重叠人SIRPα表位结合。在某些方面，抗体与如由1H9或3C2结合的不同人SIRPα表位结合。
在某些方面，抗体不与KWar抗体竞争与人SIRPα的结合。
在某些方面，抗体部分地与KWar抗体竞争与人SIRPα的结合。
在某些方面，抗体抑制人CD47与人SIRPα的结合。
在某些方面，抗体抑制人SP-A与人SIRPα的结合。
在某些方面，抗体抑制人SP-D与人SIRPα的结合。
在某些方面，抗体结合恒河猴SIRPα。
在某些方面，抗体结合猕猴SIRPα。
在某些方面，抗体相对于对照增加吞噬作用。
本文还公开了一种分离的人源化、人或嵌合抗体，其与本文公开的抗体竞争与人SIRPα的结合。
本文还公开了一种分离的人源化、人或嵌合抗体，其结合由本文公开的抗体结合的人SIRPα表位。
在某些方面，抗体包含人Fc区，所述人Fc区包含至少一种减少与人Fc受体结合的修饰。
在一些实施方案中，抗体是与本文提供的说明性抗体例如1H9和/或3C2竞争的抗体。在一些方面，与本文提供的说明性抗体竞争的抗体与本文提供的说明性抗体结合相同的表位。
已知的是，当抗体在细胞中表达时，所述抗体在翻译后被修饰。翻译后修饰的实例包括通过羧肽酶在重链的C末端处裂解赖氨酸；通过焦谷氨酰化将重链和轻链的N末端处的谷氨酰胺或谷氨酸修饰成焦谷氨酸；糖基化；氧化；脱酰胺作用；和糖化；并且已知此类翻译后修饰发生在各种抗体中(参见Journal of Pharmaceutical Sciences,2008,第97卷,第2426-2447页，其通过引用以其全文并入)。在一些实施方案中，抗体是经历翻译后修饰的抗体或其抗原结合片段。经历翻译后修饰的抗体或其抗原结合片段的实例包括经历了重链可变区的N末端处的焦谷氨酰化和/或重链C末端处的赖氨酸缺失的抗体或其抗原结合片段。本领域已知，由于N末端处的焦谷氨酰化和C末端处的赖氨酸缺失而导致的这种翻译后修饰对抗体或其片段的活性没有任何影响(Analytical Biochemistry,2006,第348卷,第24-39页，其通过引用以其全文并入)。
SIRP-α抗体的序列
抗体可以包含：包含SEQ ID NO:1中所列序列的CDR-H1；包含SEQ ID NO:2中所列序列的CDR-H2；包含SEQ ID NO:3中所列序列的CDR-H3；包含SEQ ID NO:4中所列序列的CDR-L1；包含SEQ ID NO:5中所列序列的CDR-L2；和包含SEQ ID NO:6中所列序列的CDR-L3。
抗体可以包含：SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:8的VL序列。
抗体可以包含：SEQ ID NO:17的重链和SEQ ID NO:18的轻链。
抗体可以包含：包含SEQ ID NO:9中所列序列的CDR-H1；包含SEQ ID NO:10中所列序列的CDR-H2；包含SEQ ID NO:11中所列序列的CDR-H3；包含SEQ ID NO:12中所列序列的CDR-L1；包含SEQ ID NO:13中所列序列的CDR-L2；和包含SEQ ID NO:14中所列序列的CDR-L3。
抗体可以包含：SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
抗体可以包含：SEQ ID NO:19的重链和SEQ ID NO:20的轻链。
抗体可以包含：包含SEQ ID NO:21中所列序列的CDR-H1；包含SEQ ID NO:22中所列序列的CDR-H2；包含SEQ ID NO:23中所列序列的CDR-H3；包含SEQ ID NO:24中所列序列的CDR-L1；包含SEQ ID NO:25中所列序列的CDR-L2；和包含SEQ ID NO:26中所列序列的CDR-L3。
抗体可以包含：SEQ ID NO:27的VH序列和SEQ ID NO:28的VL序列。
抗体可以包含：包含SEQ ID NO:29中所列序列的CDR-H1；包含SEQ ID NO:30中所列序列的CDR-H2；包含SEQ ID NO:31中所列序列的CDR-H3；包含SEQ ID NO:32中所列序列的CDR-L1；包含SEQ ID NO:33中所列序列的CDR-L2；和包含SEQ ID NO:34中所列序列的CDR-L3。
抗体可以包含：SEQ ID NO:35的VH序列和SEQ ID NO:36的VL序列。
在某些方面，抗体可以包含1H9的一个或多个CDR。在某些方面，抗体可以包含1H9的所有CDR。在某些方面，抗体可以包含1H9的一个或多个可变序列。在某些方面，抗体可以包含1H9的每个可变序列。在某些方面，抗体可以包含1H9的重链。在某些方面，抗体可以包含1H9的轻链。在某些方面，抗体可以包含1H9的重链和轻链。在某些方面，抗体是1H9。
在某些方面，抗体可以包含3C2的一个或多个CDR。在某些方面，抗体可以包含3C2的所有CDR。在某些方面，抗体可以包含3C2的一个或多个可变序列。在某些方面，抗体可以包含3C2的每个可变序列。在某些方面，抗体可以包含3C2的重链。在某些方面，抗体可以包含3C2的轻链。在某些方面，抗体可以包含3C2的重链和轻链。在某些方面，抗体是3C2。
在某些方面，抗体可以包含9B11的一个或多个CDR。在某些方面，抗体可以包含9B11的所有CDR。在某些方面，抗体可以包含9B11的一个或多个可变序列。在某些方面，抗体可以包含9B11的每个可变序列。在某些方面，抗体可以包含9B11的重链。在某些方面，抗体可以包含9B11的轻链。在某些方面，抗体可以包含9B11的重链和轻链。在某些方面，抗体是9B11。
在某些方面，抗体可以包含7E11的一个或多个CDR。在某些方面，抗体可以包含7E11的所有CDR。在某些方面，抗体可以包含7E11的一个或多个可变序列。在某些方面，抗体可以包含7E11的每个可变序列。在某些方面，抗体可以包含7E11的重链。在某些方面，抗体可以包含7E11的轻链。在某些方面，抗体可以包含7E11的重链和轻链。在某些方面，抗体是7E11。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含与SEQ ID NO:1-36中提供的说明性序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含在SEQ ID NO:1-36中提供的序列，具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，此段落中描述的抗体在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体源自本文提供的序列，例如，通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域已知或本文所述的任何其他方法。在一些实施方案中，此类变体不是源自本文提供的序列，并且可以例如根据本文提供的用于获得抗体的方法从头分离。
单特异性和多特异性SIRP-α抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体是单特异性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体结合多于一种抗原。在一些实施方案中，多特异性抗体结合2种抗原。在一些实施方案中，多特异性抗体结合3种抗原。在一些实施方案中，多特异性抗体结合4种抗原。在一些实施方案中，多特异性抗体结合5种抗原。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体结合SIRP-α抗原上的多于一个表位。在一些实施方案中，多特异性抗体结合SIRP-α抗原上的2个表位。在一些实施方案中，多特异性抗体结合SIRP-α抗原上的3个表位。
许多多特异性抗体构建体是本领域已知的，并且本文提供的抗体可以以任何合适的多特异性合适构建体的形式提供。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含免疫球蛋白，其包含至少两个不同的重链可变区，每个重链可变区与共同的轻链可变区配对(即“共同的轻链抗体”)。共同的轻链可变区与两个不同的重链可变区中的每一个形成不同的抗原结合结构域。参见Merchant等人,Nature Biotechnol.,1998,16:677-681，其通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含免疫球蛋白，其包含连接至这种免疫球蛋白的重链或轻链的N-或C-末端中的一个或多个的抗体或其片段。参见Coloma和Morrison,Nature Biotechnol.,1997,15:159-163，其通过引用以其全文并入。在一些方面，这种抗体包含四价双特异性抗体。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含混合免疫球蛋白，其包含至少两个不同的重链可变区，和至少两个不同的轻链可变区。参见Milstein和Cuello,Nature,1983,305:537-540；以及Staerz和Bevan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83:1453-1457；其各自通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含具有改变减少不具有多特异性的副产物的形成的免疫球蛋白链。在一些方面，所述抗体包含一种或多种如美国专利号5,731,168所述的“杵入臼”修饰，所述专利通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含具有一个或多个静电修饰以促进Fc异源多聚体的装配的免疫球蛋白链。参见WO 2009/089004，其通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含双特异性单链分子。参见Traunecker等人,EMBO J.,1991,10:3655-3659；和Gruber等人,J.Immunol.,1994,152:5368-5374；其各自通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含通过多肽接头连接的重链可变结构域和轻链可变结构域，其中选择接头的长度以促进具有希望的多特异性的多特异性抗体的组装。例如，当重链可变结构域和轻链可变结构域通过具有多于12个氨基酸残基的多肽接头连接时，通常形成单特异性scFv。参见美国专利号4,946,778和5,132,405，其各自通过引用以其全文并入。在一些实施方案中，将多肽接头长度减少至少于12个氨基酸残基防止同一多肽链上的重链和轻链可变结构域配对，从而使来自一条链的重链和轻链可变结构域与另一个链上的互补结构域配对。因此，所得抗体具有多特异性，其中每个结合位点的特异性由多于一个的多肽链贡献。包含通过3至12个氨基酸残基的接头连接的重链和轻链可变结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双抗体)。具有0至2个氨基酸残基的接头，三聚体(称为三抗体)和四聚体(称为四抗体)是有利的。然而，寡聚化的确切类型似乎取决于氨基酸残基的组成和每个多肽链中可变结构域的顺序(例如，VH-接头-VL与VL-接头-VH)以及接头长度。技术人员可以基于希望的多特异性选择适当的接头长度。
糖基化及相关变体
本文提供的抗体可以被改变以增加、减少或消除其糖基化的程度。多肽的糖基化通常是“N-连接”或“O-连接”的。在一些方面，所述抗体的糖基化通过酶促去糖基化、在细菌宿主中的表达或用于糖基化的氨基酸残基的修饰而降低。修饰如突变可以用于改变糖基化。
“N-连接的”糖基化是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列中的任一者的存在产生潜在的糖基化位点。
“O-连接的”糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
可以通过改变氨基酸序列使得产生或去除上述三肽序列中的一个或多个来完成向本文提供的抗体添加或从本文提供的抗体缺失N-连接的糖基化位点。可以通过在抗体序列中或向抗体序列(视情况而定)添加、缺失或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来完成O-连接的糖基化位点的添加或缺失。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含与天然存在的抗体不同的糖基化基序。可以在本文提供的抗体中修饰任何合适的天然存在的糖基化基序。例如，免疫球蛋白的结构和糖基化特性是本领域已知的，并且例如总结于Schroeder和Cavacini,J.AllergyClin.Immunol.,2010,125:S41-52中，其通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含IgG1 Fc区，其具有对连接至天冬酰胺297(Asn 297)的寡糖的修饰。由哺乳动物细胞产生的天然存在的IgG1抗体通常包含一般通过N-键连接至Fc区的CH2结构域的Asn 297的分支双触角寡糖。参见Wright等人,TIBTECH,1997,15:26-32，其通过引用以其全文并入。连接至Asn 297的寡糖可以包括各种碳水化合物，如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸、以及连接至双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。
在一些实施方案中，修饰连接至Asn 297的寡糖以产生具有改变的ADCC的抗体。在一些实施方案中，改变寡糖以改善ADCC。在一些实施方案中，改变寡糖以减少ADCC。
在一些方面，本文提供的抗体包含与天然存在的IgG1结构域相比在位置Asn 297处具有降低的岩藻糖含量的IgG1结构域。已知此类Fc结构域具有改善的ADCC。参见Shields等人,J.Biol.Chem.,2002,277:26733-26740，其通过引用以其全文并入。在一些方面，此类抗体在位置Asn 297处不包含任何岩藻糖。岩藻糖的量可以使用任何合适的方法来确定，例如，如WO 2008/077546中所述，其通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含二等分的寡糖，如连接至被GlcNAc二等分的抗体的Fc区的双触角寡糖。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改进的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；和美国专利公布号2005/0123546中；其各自通过引用以其全文并入。
可以掺入本文提供的抗体中的其他示例性糖基化变体描述于例如美国专利公布号2003/0157108、2004/0093621、2003/0157108、2003/0115614、2002/0164328、2004/0093621、2004/0132140、2004/0110704、2004/0110282、2004/0109865；国际专利公布号2000/61739、2001/29246、2003/085119、2003/084570、2005/035586、2005/035778；2005/053742、2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.,2004,336:1239-1249；和Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.,2004,87:614-622中；其各自通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含Fc区，其寡糖中的至少一个半乳糖残基连接至Fc区。此类抗体变体可以具有改进的CDC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764中；其各自通过引用以其全文并入。
能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括Lec13 CHO细胞，其缺乏蛋白质岩藻糖基化作用(参见Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.,1986,249:533-545；美国专利公布号2003/0157108；WO 2004/056312；其各自通过引用以其全文并入)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因或FUT8敲除CHO细胞(参见Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.,2004,87:614-622；Kanda等人,Biotechnol.Bioeng.,2006,94:680-688；和WO 2003/085107；其各自通过引用以其全文并入)。
在一些实施方案中，本文提供的抗体是无糖基化抗体。可以使用本领域已知的或本文描述的任何方法来产生无糖基化抗体。在一些方面，通过修饰抗体以去除所有糖基化位点来产生无糖基化抗体。在一些方面，仅从抗体的Fc区去除糖基化位点。在一些方面，通过在不能够糖基化的生物体如大肠杆菌中表达抗体或通过在无细胞反应混合物中表达抗体来产生无糖基化抗体。
在一些实施方案中，与天然IgG1抗体相比，本文提供的抗体具有恒定区，所述恒定区具有降低的效应功能。在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区的恒定区对Fc受体的亲和力小于天然IgG1恒定区对这种Fc受体的亲和力。
Fc区和变体
在某些实施方案中，本文提供的抗体包含Fc区。在某些实施方案中，本文提供的抗体包含与天然存在的Fc区相比具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的Fc区。在一些方面，此类取代、插入或缺失产生具有改变的稳定性、糖基化或其他特征的抗体。在一些方面，此类取代、插入或缺失产生无糖基化抗体。
“变体Fc区”或“工程化Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰、优选一个或多个氨基酸取代而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如，约一至约十个氨基酸取代，并且优选约一至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区优将选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，并且最优选与其具有至少约90％的同源性，更优选与其具有至少约95％的同源性。
“死Fc”的变体Fc序列可以在CH2区中包括三个氨基酸取代，以减少在EU索引位置234、235和237处的FcγRI结合(参见Duncan等人,(1988)Nature 332:563)。在EU索引位置330和331处的补体C1q结合位点中的两个氨基酸取代减少了补体固定(参见Tao等人,J.Exp.Med.178:661(1993)以及Canfield和Morrison,J.Exp.Med.173:1483(1991))。将位置233-236处的IgG2残基和位置327、330和331处的IgG4残基取代入人IgG1中大大降低ADCC和CDC(例如参见，Armour KL等人,1999Eur J Immunol.29(8):2613-24；和Shields RL.等人,2001.J Biol Chem.276(9):6591-604)。
IgG与FcγR或C1q的结合取决于位于铰链区和CH2结构域的残基。CH2结构域的两个区域对于FcγR和C1q结合至关重要，并且在IgG2和IgG4中具有独特的序列。已显示在位置233-236处的人IgG1或IgG2残基和在位置327、330和331处的IgG4残基取代大大降低ADCC和CDC。在人IgG1的CH2结构域中已进行了许多突变。
三个氨基酸取代L234A、L235A和G237A在很大程度上消除了FcγR和补体效应功能(参见例如，US20100266505)。
在一些实施方案中，相对于天然蛋白，通过选择表达宿主、氨基酸取代的酶促处理来修饰Fc区，以具有降低的糖基化和与FcγR的结合。减少与FcγR结合的突变包括但不限于对Fc结构域的天冬酰胺297上的糖基化的修饰，已知这是最佳FcR相互作用所需的。例如，已知的氨基酸取代包括N297A或N297G，其导致蛋白质上糖基化位点的损失。酶促去糖基化的Fc结构域、在糖基化抑制剂存在下重组表达的抗体以及细菌中Fc结构域的表达具有类似的糖基化损失，和因此与FcγR的结合的损失。
LALA变体L234A/L235A也具有显著降低的FcγR结合；以及E233P/L234V/L235A/G236+A327G/A330S/P331S也具有显著降低的FcγR结合。参见例如，Armour等人(1999)EurJ Immunol.29(8):2613-24。突变组：K322A、L234A和L235A足以几乎完全消除FcγR和C1q结合。一组三个突变L234F/L235E/P331S(称为TM)具有非常相似的效果。
其他Fc变体是可能的，包括但不限于其中缺失了能够形成二硫键的区域，或者其中某些氨基酸残基在天然Fc形式的N-末端处被消除或蛋氨酸残基被添加到其中的变体。
Fc可以是具有天然糖链的形式、与天然形式相比增加的糖链或与天然形式相比减少的糖链的形式，或者可以是无糖基化或去糖基化形式。糖链的增加、减少、去除或其他修饰可以通过本领域常用的方法来实现，如化学方法、酶促方法或通过在基因工程生产细胞系中表达。此类细胞系可以包括微生物，例如巴斯德毕赤酵母和哺乳动物细胞系，例如天然表达糖基化酶的CHO细胞。此外，可以工程化微生物或细胞以表达糖基化酶，或可以使其不能表达糖基化酶(参见例如，Hamilton等人,Science,313:1441(2006)；Kanda等人,J.Biotechnology,130:300(2007)；Kitagawa等人,J.Biol.Chem.,269(27):17872(1994)；Ujita-Lee等人,J.Biol.Chem.,264(23):13848(1989)；Imai-Nishiya等人,BMCBiotechnology 7:84(2007)；和WO 07/055916)。作为工程化的唾液酸化活性改变的细胞的一个实例，已将α-2,6-唾液酸转移酶1基因工程化到了中国仓鼠卵巢细胞和sf9细胞中。因此，由这些工程化细胞表达的抗体被外源基因产物唾液酸化。用于获得与多个天然分子相比具有修饰的糖残基量的Fc分子的另一种方法包括，例如使用凝集素亲和色谱法将所述多个分子分为糖基化和非糖基化级分(参见例如，WO 07/117505)。已显示特定糖基化部分的存在会改变免疫球蛋白的功能。例如，从Fc分子中除去糖链导致与第一补体组分C1的C1q部分的结合亲和力急剧下降，以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的减少或损失，从而不在体内诱导不必要的免疫响应。另外重要的修饰包括唾液酸化和岩藻糖基化：IgG中唾液酸的存在与抗炎活性相关(参见例如，Kaneko等人,Science313:760(2006))，而从IgG中去除岩藻糖导致增强的ADCC活性(参见例如，Shoj-Hosaka等人,J.Biochem.,140:777(2006))。
术语“含Fc区的抗体”是指包含Fc区的抗体。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，根据EU编号系统)可以例如在抗体纯化期间或通过重组工程化编码抗体的核酸而去除。因此，具有Fc区的抗体可以包含具有或不具有K447的抗体。
在一些方面，本文提供的抗体的Fc区被修饰以产生对Fc受体具有改变的亲和力的抗体，或在免疫学上更惰性的抗体。在一些实施方案中，本文提供的抗体变体具有一些但不是全部效应功能。例如，当抗体的半衰期在体内很重要，但某些效应功能(例如补体激活和ADCC)是不必要或有害的时，此类抗体可能有用。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区是人IgG4 Fc区，其包含铰链稳定突变S228P和L235E中的一个或多个。参见Aalberse等人,Immunology,2002,105:9-19，其通过引用以其全文并入。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含以下突变中的一个或多个：E233P、F234V和L235A。参见Armour等人,Mol.Immunol.,2003,40:585-593，其通过引用以其全文并入。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含位置G236处的缺失。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区是人IgG1 Fc区，其包含一个或多个突变以降低Fc受体结合。在一些方面，所述一个或多个突变在选自S228(例如，S228A)、L234(例如，L234A)、L235(例如，L235A)、D265(例如，D265A)和N297(例如，N297A)的残基中。在一些方面，所述抗体包含PVA236突变。PVA236意指来自IgG1的氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(SEQ ID NO:51)或IgG4的EFLG(SEQ ID NO:52)被PVA替代。参见美国专利号9,150,641，其通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区如Armour等人,Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624；WO 1999/058572；和/或/美国专利公布号98099518中所述进行修饰；其各自通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区是人IgG2 Fc区，其包含突变A330S和P331S中的一个或多个。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区在选自238、265、269、270、297、327和329的一个或多个位置处具有氨基酸取代。参见美国专利号6,737,056，其通过引用以其全文并入。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体。参见美国专利号7,332,581，其通过引用以其全文并入。在一些实施方案中，所述抗体在氨基酸位置265处包含丙氨酸。在一些实施方案中，所述抗体在氨基酸位置297处包含丙氨酸。
在某些实施方案中，本文提供的抗体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代(如在Fc区的位置298、333和334中的一个或多个处的取代)的Fc区。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含具有一个或多个在位置239、332和330处的氨基酸取代的Fc区，如在Lazar等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2006,103:4005-4010中所述，其通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含一个或多个改变，其改善或减少C1q结合和/或CDC。参见美国专利号6,194,551；WO 99/51642；和Idusogie等人,J.Immunol.,2000,164:4178-4184；其各自通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含一个或多个改变以增加半衰期。具有增加的半衰期和改善的与新生Fc受体(FcRn)的结合的抗体描述于例如，Hinton等人,J.Immunol.,2006,176:346-356；和美国专利公布号2005/0014934中；其各自通过引用以其全文并入。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些变体：IgG的238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428和434。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含如描述于美国专利号7,371,8265,648,260和5,624,821；Duncan和Winter,Nature,1988,322:738-740；和WO 94/29351中的一种或多种Fc区变体；所述参考文献各自通过引用以其全文并入。
核苷酸、载体、宿主细胞和相关方法
还提供了编码SIRP-α抗体的分离的核酸、包含所述核酸的载体和包含所述载体和核酸的宿主细胞，以及用于产生所述抗体的重组技术。
在一些实施方案中，提供了一种核酸序列，其编码与SEQ ID NO:1-36中提供的说明性序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，提供了一种编码在SEQ ID NO:1-36中提供的序列的核酸序列，具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含与SEQ ID NO:37-44中提供的说明性序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含在SEQ ID NO:37-44中提供的序列，具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个突变。在一些方面，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，此段落中描述的抗体在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体源自本文提供的序列，例如，通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域已知或本文所述的任何其他方法。在一些实施方案中，此类变体不是源自本文提供的序列，并且可以例如根据本文提供的用于获得抗体的方法从头分离。
为了重组产生抗体，可以分离编码抗体的一种或多种核酸并且将其插入可复制载体中以进一步克隆(即扩增DNA)或表达。在一些方面，核酸可以通过同源重组来产生，例如如美国专利号5,204,244中所述，所述专利通过引用以其全文并入。
许多不同的载体是本领域已知的。载体组分通常包括以下中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，例如如美国专利号5,534,615中所述，所述专利通过引用以其全文并入。
以下提供合适的宿主细胞的说明性实例。这些宿主细胞并不意味着是限制性的，并且任何合适的宿主细胞均可以用于产生本文提供的抗体。
合适的宿主细胞包括任何原核(例如细菌)、低等真核(例如酵母)或高等真核(例如哺乳动物)细胞。合适的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，如埃希氏杆菌属(Escherichia)(大肠杆菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(粘质沙雷氏菌(S.marcescans))、志贺氏菌属(Shigella)、芽孢杆菌属(Bacilli)(枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))、假单胞菌属(Pseudomonas)(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))和链霉菌属(Streptomyces)。一种有用的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294，尽管其他菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776和大肠杆菌W3110也是合适的。
除了原核生物之外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)也是SIRP-α抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是常用的低等真核宿主微生物。然而，许多其他属、种和菌株也是可用的和有用的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)(乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)、魏氏克鲁维酵母(K.wickerhamii)、K.waltii、K.drosophilarum、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus))、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(C.albicans))、里氏木霉(Trichoderma reesia)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、许旺酵母属(Schwanniomyces)(西方许旺酵母(S.occidentalis))，和丝状真菌，例如像青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属真菌(Aspergillus)(构巢曲酶(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger))。
有用的哺乳动物宿主细胞包括COS-7细胞、HEK293细胞；幼仓鼠肾(BHK)细胞；中国仓鼠卵巢(CHO)；小鼠睾丸支持细胞；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)等。
用于产生SIRP-α抗体的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购获得的培养基，例如像Ham's F10、最低必需培养基(MEM)、RPMI-1640和杜氏改良依格氏培养基(DMEM)适用于培养宿主细胞。此外，可以使用Ham等人,Meth.Enz.,1979,58:44；Barnes等人,Anal.Biochem.,1980,102:255；和美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655和5,122,469；或WO 90/03430和WO 87/00195中所述的培养基中的任一种。前述参考文献各自通过引用以其全文并入。
必要时这些培养基中的任一种均可补充有激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素(定义为通常以在微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等效能量来源。还可包含本领域技术人员所已知的适当浓度的任何其他必需补充剂。
培养条件，如温度、pH等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对普通技术人员将是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，则作为第一步骤，例如通过离心或超滤去除微粒状碎片(宿主细胞或裂解的片段)。例如，Carter等人(Bio/Technology,1992,10:163-167，其通过引用以其全文并入)描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的程序。简而言之，在约30min内，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下使细胞糊解冻。可以通过离心去除细胞碎片。
在一些实施方案中，所述抗体在无细胞系统中产生。在一些方面，所述无细胞系统是体外转录和翻译系统，如Yin等人,mAbs,2012,4:217-225中所述，其通过引用以其全文并入。在一些方面，所述无细胞系统利用来自真核细胞或原核细胞的无细胞提取物。在一些方面，原核细胞是大肠杆菌。抗体的无细胞表达可能是有用的，例如，在抗体以不溶性聚集体形式在细胞中积累或周质表达的产量较低的情况下。
在将抗体分泌到培养基中的情况下，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩滤器，例如或/>超滤单元对来自此类表达系统的上清液进行浓缩。任何前述步骤中可以包括蛋白酶抑制剂(如PMSF)以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
从细胞制备的抗体组合物可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法纯化，其中亲和色谱法是特别有用的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化包含人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.,1983,62:1-13，其通过引用以其全文并入)。蛋白G可用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人,EMBO J.,1986,5:1567-1575，其通过引用以其全文并入)。
亲和配体所连接的基质最常为琼脂糖，但其他基质也是可用的。在机械上稳定的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖可以实现的更快的流速和更短的处理时间。在所述抗体包含CH3结构域的情况下，BakerBond树脂可用于纯化。
蛋白质纯化的其他技术，如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、肝素色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的，并且可以由本领域技术人员应用。
在一个或多个任何初步纯化步骤之后，可以使用洗脱缓冲液在约2.5至约4.5之间的pH下对包含感兴趣的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱法，通常在低盐浓度下进行(例如，约0至约0.25M的盐)。
制备SIRP-α抗体的方法
SIRP-α抗原制备
用于分离或产生本文提供的抗体的SIRP-α抗原可以是完整的SIRP-α或SIRP-α的片段。SIRP-α抗原可以是例如分离的蛋白质或在细胞表面上表达的蛋白质的形式。
在一些实施方案中，SIRP-α抗原是SIRP-α的非天然存在的变体，如具有自然界中不存在的氨基酸序列或翻译后修饰的SIRP-α蛋白。
在一些实施方案中，通过去除例如细胞内或跨膜序列或信号序列来截短SIRP-α抗原。在一些实施方案中，SIRP-α抗原在其C-末端处与人IgG1 Fc结构域或聚组氨酸标签融合。
制备单克隆抗体的方法
单克隆抗体可以例如使用首先由Kohler等人,Nature,1975,256:495-497(通过引用以其全文并入)描述的杂交瘤方法和/或通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567，其通过引用以其全文并入)获得。单克隆抗体还可以例如使用噬菌体或基于酵母的文库获得。参见例如，美国专利号8,258,082和8,691,730，其各自通过引用以其全文并入。
在杂交瘤方法中，使小鼠或其他适当的宿主动物免疫以引发产生或能够产生将特异地结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。可替代地，可以体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞。参见Goding J.W.,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice第3版(1986)AcademicPress,San Diego,CA，其通过引用以其全文并入。
将杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并使其生长，所述培养基含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
有用的骨髓瘤细胞是有效融合，支持通过所选择的抗体产生细胞的稳定高水平抗体产生，并且是敏感培养基条件(如是否存在HAT培养基)的那些骨髓瘤细胞。在这些中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠类骨髓瘤细胞系，如源自MOP-21和MC-11小鼠肿瘤的细胞系(获自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,CA)和SP-2或X63-Ag8-653细胞(获自American Type Culture Collection,Rockville,MD)。还已描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体。参见例如，Kozbor,J.Immunol.,1984,133:3001，其通过引用以其全文并入。
在鉴定出产生具有希望的特异性、亲和力和/或生物学活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过有限的稀释程序将所选择的克隆亚克隆，并通过标准方法使其生长。参见Goding,同上。用于此目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为动物体内的腹水肿瘤在体内生长。
编码单克隆抗体的DNA可以容易地分离并且使用常规程序(例如，通过使用能够特异地结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来测序。因此，杂交瘤细胞可以用作编码具有所希望特性的抗体的DNA的有用来源。一旦分离，则可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞(如细菌(例如，大肠杆菌)、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces)或毕赤酵母属种(Pichia sp.))、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或原本不产生抗体的骨髓瘤细胞)中，以产生单克隆抗体。
制备嵌合抗体的方法
制备嵌合抗体的说明性方法描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984,81:6851-6855中；其各自通过引用以其全文并入。在一些实施方案中，通过使用重组技术组合非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(如猴)的可变区)与人恒定区来制备嵌合抗体。
制备人源化抗体的方法
可以通过用对应的人抗体序列替代非人单克隆抗体的大部分或全部结构部分来产生人源化抗体。因此，产生了杂合分子，其中仅抗原特异性变量或CDR由非人序列构成。获得人源化抗体的方法包括描述于例如Winter和Milstein,Nature,1991,349:293-299；Rader等人,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95:8910-8915；Steinberger等人,J.Biol.Chem.,2000,275:36073-36078；Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1989,86:10029-10033；以及美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370中的那些；其各自通过引用以其全文并入。
制备人抗体的方法
人抗体可以通过本领域已知的多种技术产生，例如通过使用转基因动物(例如，人源化小鼠)。参见例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,90:2551；Jakobovits等人,Nature,1993,362:255-258；Bruggermann等人,Year in Immuno.,1993,7:33；以及美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807；其各自通过引用以其全文并入。人抗体也可以源自噬菌体展示文库(参见例如，Hoogenboom等人,J.Mol.Biol.,1991,227:381-388；Marks等人,J.Mol.Biol.,1991,222:581-597；以及美国专利号5,565,332和5,573,905；其各自通过引用以其全文并入)。人抗体也可以通过体外激活的B细胞产生(参见例如，美国专利号5,567,610和5,229,275，其各自通过引用以其全文并入)。人抗体也可以源自基于酵母的文库(参见例如，美国专利号8,691,730，其通过引用以其全文并入)。
制备抗体片段的方法
本文提供的抗体片段可以通过任何合适的方法制备，包括本文描述的说明性方法或本领域已知的那些。合适的方法包括重组技术和整个抗体的蛋白水解消化。制备抗体片段的说明性方法描述于例如Hudson等人,Nat.Med.,2003,9:129-134中，其通过引用以其全文并入。制备scFv抗体的方法描述于例如Plückthun,The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458中；其各自通过引用以其全文并入。
制备可替代支架的方法
本文提供的可替代支架可以通过任何合适的方法制备，包括本文描述的说明性方法或本领域已知的那些。例如，制备AdnectinsTM的方法描述于Emanuel等人,mAbs,2011,3:38-48中，所述文献通过引用以其全文并入。制备iMab的方法描述于美国专利公布号2003/0215914中，所述专利通过引用以其全文并入。制备的方法描述于Vogt和Skerra,Chem.Biochem.,2004,5:191-199中，所述文献通过引用以其全文并入。制备Kunitz结构域的方法描述于Wagner等人,Biochem.&Biophys.Res.Comm.,1992,186:118-1145中，所述文献通过引用以其全文并入。制备硫氧还蛋白肽适体的方法提供于Geyer和Brent,Meth.Enzymol.,2000,328:171-208中，所述文献通过引用以其全文并入。制备Affibody的方法提供于Fernandez,Curr.Opinion in Biotech.,2004,15:364-373中，所述文献通过引用以其全文并入。制备DARPin的方法提供于Zahnd等人,J.Mol.Biol.,2007,369:1015-1028中，所述文献通过引用以其全文并入。制备Affilin的方法提供于Ebersbach等人,J.Mol.Biol.,2007,372:172-185中，所述文献通过引用以其全文并入。制备四连接素的方法提供于Graversen等人,J.Biol.Chem.,2000,275:37390-37396中，所述文献通过引用以其全文并入。制备Avimer的方法提供于Silverman等人,Nature Biotech.,2005,23:1556-1561中，所述文献通过引用以其全文并入。制备Fynomer的方法提供于Silacci等人,J.Biol.Chem.,2014,289:14392-14398中，所述文献通过引用以其全文并入。关于可替代支架的其他信息在Binz等人,Nat.Biotechnol.,2005 23:1257-1268；和Skerra,CurrentOpin.in Biotech.,200718:295-304中提供，所述文献各自通过引用以其全文并入。
制备多特异性抗体的方法
本文提供的多特异性抗体可以通过任何合适的方法制备，包括本文描述的说明性方法或本领域已知的那些。制备普通轻链抗体的方法描述于Merchant等人,NatureBiotechnol.,1998,16:677-681中，所述文献通过引用以其全文并入。制备四价双特异性抗体的方法描述于Coloma和Morrison,Nature Biotechnol.,1997,15:159-163中，所述文献通过引用以其全文并入。制备杂合免疫球蛋白的方法描述于Milstein和Cuello,Nature,1983,305:537-540；以及Staerz和Bevan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83:1453-1457中；所述文献各自通过引用以其全文并入。制备具有杵入臼修饰的免疫球蛋白的方法描述于美国专利号5,731,168中，所述专利通过引用以其全文并入。制备具有静电修饰的免疫球蛋白的方法提供于WO 2009/089004中，其通过引用以其全文并入。制备双特异性单链抗体的方法描述于Traunecker等人,EMBO J.,1991,10:3655-3659；和Gruber等人,J.Immunol.,1994,152:5368-5374中；所述文献各自通过引用以其全文并入。制备其接头长度可以改变的单链抗体的方法描述于美国专利号4,946,778和5,132,405中，其各自通过引用以其全文并入。制备双体的方法描述于Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:6444-6448中，所述文献通过引用以其全文并入。制备三抗体和四抗体的方法描述于Todorovska等人,J.Immunol.Methods,2001,248:47-66中，所述文献通过引用以其全文并入。制备三特异性F(ab’)3衍生物的方法描述于Tutt等人J.Immunol.,1991,147:60-69中，所述文献通过引用以其全文并入。制备交联抗体的方法描述于美国专利号4,676,980；Brennan等人,Science,1985,229:81-83；Staerz等人Nature,1985,314:628-631；和EP 0453082中；所述文献各自通过引用以其全文并入。制备由亮氨酸拉链组装的抗原结合结构域的方法描述于Kostelny等人,J.Immunol.,1992,148:1547-1553中，所述文献通过引用以其全文并入。通过DNL方法制备抗体的方法描述于美国专利号7,521,056；7,550,143；7,534,866；和7,527,787中；所述专利各自通过引用以其全文并入。例如，制备此类抗体的抗体和非抗体分子的杂合体的方法描述于WO 93/08829中，所述专利通过引用以其全文并入。制备DAF抗体的方法描述于美国专利公布号2008/0069820中，所述专利通过引用以其全文并入。通过还原和氧化制备抗体的方法描述于Carlring等人,PLoS One,2011,6:e22533中，所述文献通过引用以其全文并入。制备DVD-IgsTM的方法描述于美国专利号7,612,181中，所述专利通过引用以其全文并入。制备DARTsTM的方法描述于Moore等人,Blood,2011,117:454-451中，所述文献通过引用以其全文并入。制备的方法描述于Labrijn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2013,110:5145-5150；Gramer等人,mAbs,2013,5:962-972；和Labrijn等人,Nature Protocols,2014,9:2450-2463中；所述文献各自通过引用以其全文并入。从IgG制备包含与CH3的C-末端融合的scFv的抗体的方法描述于Coloma和Morrison,Nature Biotechnol.,1997,15:159-163中，所述文献通过引用以其全文并入。制备其中Fab分子连接至免疫球蛋白的恒定区的抗体的方法描述于Miler等人,J.Immunol.,2003,170:4854-4861中，所述文献通过引用以其全文并入。制备CovX-Bodies的方法描述于Doppalapudi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2010,107:22611-22616中，所述文献通过引用以其全文并入。制备Fcab抗体的方法描述于Wozniak-Knopp等人,ProteinEng.Des.Sel.,2010,23:289-297中，所述文献通过引用以其全文并入。制备/>抗体的方法描述于Kipriyanov等人,J.Mol.Biol.,1999,293:41-56和Zhukovsky等人,Blood,2013,122:5116中，所述文献各自通过引用以其全文并入。制备串联Fab的方法描述于WO2015/103072中，所述专利通过引用以其全文并入。制备ZybodiesTM的方法描述于LaFleur等人,mAbs,2013,5:208-218中，所述文献通过引用以其全文并入。/>
制备变体的方法
可以使用任何合适的方法将可变性引入编码抗体的一种或多种多核苷酸序列中，所述方法包括易错PCR、链改组和寡核苷酸定向诱变，如三核苷酸定向诱变(TRIM)。在一些方面，几个CDR残基(例如一次4-6个残基)是随机的。参与抗原结合的CDR残基可以使用例如丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定。具体地，CDR-H3和CDR-L3通常是突变的靶标。
将多样性引入可变区和/或CDR可以用于产生二级文库。然后筛选所述二级文库以鉴定具有改善亲和力的抗体变体。通过构建和从二级文库中重新选择来进行亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology,2001,178:1-37中，所述文献通过引用以其全文并入。
测定
本领域已知的多种测定可以用于鉴定和表征本文提供的SIRP-α抗体。
结合、竞争和表位作图测定
本文提供的抗体的特异性抗原结合活性可以通过任何合适的方法来评估，包括使用SPR、BLI、RIA和MSD-SET，如本公开中其他地方所述。另外，可以通过ELISA测定和蛋白质印迹测定评估抗原结合活性。
用于测量两种抗体或一种抗体与另一种分子(例如，SIRP-α的一个或多个配体)之间的竞争的测定在本公开的其他地方描述，并且例如，描述于Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual ch.14,1988,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y中，所述文献通过引用以其全文并入。
用于对本文提供的抗体结合的表位作图的测定描述于例如Morris“EpitopeMapping Protocols,”Methods in Molecular Biology第66卷,1996,Humana Press,Totowa,N.J.中，所述文献通过引用以其全文并入。在一些实施方案中，通过肽竞争确定所述表位。在一些实施方案中，通过质谱确定所述表位。在一些实施方案中，通过晶体学确定所述表位。
效应功能的测定
用本文提供的抗体治疗后的效应功能可以使用本领域已知的多种体外和体内测定来评估，包括描述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,1991,9:457-492；美国专利号5,500,362、5,821,337；Hellstrom等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,1986,83:7059-7063；Hellstrom等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,1985,82:1499-1502；Bruggemann等人,J.Exp.Med.,1987,166:1351-1361；Clynes等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,1998,95:652-656；WO 2006/029879；WO 2005/100402；Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods,1996,202:163-171；Cragg等人,Blood,2003,101:1045-1052；Cragg等人Blood,2004,103:2738-2743；和Petkova等人,Int’l.Immunol.,2006,18:1759-1769中的那些；所述文献各自通过引用以其全文并入。
药物组合物
本文提供的抗体可以配制成任何适当的药物组合物，并通过任何合适的施用途径施用。合适的施用途径包括但不限于动脉内、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、鼻内、肠胃外、肺部和皮下途径。
药物组合物可以包含一种或多种药物赋形剂。可以使用任何合适的药物赋形剂，并且本领域普通技术人员能够选择合适的药物赋形剂。因此，以下提供的药物赋形剂旨在是说明性的，而不是限制性的。额外的药物赋形剂包括，例如，描述于Handbook ofPharmaceutical Excipients,Rowe等人(编)第6版(2009)中的那些，所述文献通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，药物组合物包含消泡剂。可以使用任何合适的消泡剂。在一些方面，消泡剂选自醇、醚、油、蜡、硅酮、表面活性剂及其组合。在一些方面，消泡剂选自矿物油、植物油、乙烯双硬脂酰胺、石蜡、酯蜡、脂肪醇蜡、长链脂肪醇、脂肪酸皂、脂肪酸酯、硅二醇、氟硅酮、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物、聚二甲基硅氧烷-二氧化硅、醚、辛醇、癸醇、脱水山梨糖醇三油酸酯、乙醇、2-乙基己醇、二甲硅油(dimethicone)、油醇、二甲基硅油(simethicone)及其组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含助溶剂。助溶剂的说明性实例包括乙醇、聚乙二醇、丁二醇、二甲基乙酰胺、甘油、丙二醇及其组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的说明性实例包括乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、氢氧化物、二乙醇胺、单乙醇胺、甘氨酸、蛋氨酸、瓜尔胶、谷氨酸一钠及其组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含载体或填充剂。载体或填充剂的说明性实例包括乳糖、麦芽糖糊精、甘露醇、山梨醇、壳聚糖、硬脂酸、黄原胶、瓜尔胶及其组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含表面活性剂。表面活性剂的说明性实例包括d-α生育酚、苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶、多库酯钠、山嵛酸甘油酯、单油酸甘油酯、月桂酸、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、肉豆蔻醇、磷脂、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯甘油酸酯、月桂基硫酸钠、山梨糖醇酐酯、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯及其组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含抗结块剂。抗结块剂的说明性实例包括磷酸钙(三元)、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、氧化镁及其组合。
可以与药物组合物一起使用的其他赋形剂包括例如白蛋白、抗氧化剂、抗细菌剂、抗真菌剂、生物可吸收聚合物、螯合剂、控释剂、稀释剂、分散剂、溶解增强剂、乳化剂、胶凝剂、软膏基质、渗透增强剂、防腐剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、糖及其组合。这些剂中的每一种的具体实例描述于例如Handbook of Pharmaceutical Excipients,Rowe等人(编)第6版(2009),The Pharmaceutical Press中，所述文献通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，药物组合物包含溶剂。在一些方面，溶剂是盐溶液，如无菌等渗盐溶液或葡萄糖溶液。在一些方面，溶剂是注射用水。
在一些实施方案中，药物组合物为颗粒形式，如微粒或纳米颗粒。微粒和纳米颗粒可以由任何合适的材料(如聚合物或脂质)形成。在一些方面，微粒或纳米颗粒是胶束、脂质体或聚合物囊泡。
本文进一步提供包含抗体的无水药物组合物和剂型，这是因为水可以促进一些抗体的降解。
本文提供的无水药物组合物和剂型可以使用无水或低含水量成分以及低水分或低湿度条件进行制备。如果在制造、包装和/或储存过程中预期与水分和/或湿气充分接触，则包含乳糖和至少一种包含伯胺或仲胺的活性成分的药物组合物和剂型可以是无水的。
无水药物组合物应经制备和储存使得保持其无水性质。因此，可以使用已知防止暴露于水的材料来包装无水组合物，使得其可以包括在合适的处方试剂盒(formularykit)中。合适的包装的实例包括但不限于经气密密封的箔、塑料、单位剂量容器(例如，小瓶)、泡罩包装以及条形包装。
在某些实施方案中，本文提供的抗体被配制为肠胃外剂型。肠胃外剂型可以通过各种途径施用至受试者，所述途径包括但不限于皮下、静脉内(包括输注和推注)、肌内和动脉内。因为它们的施用通常绕过受试者对污染物的天然防御，因此肠胃外剂型通常是无菌的，或者能够在施用至受试者之前灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于，注射用溶液、待溶解或悬浮在药学上可接受的注射用媒介物中的干燥(例如冻干)产品、注射用悬浮液和乳剂。
可以用于提供肠胃外剂型的合适媒介物是本领域技术人员熟知的。实例包括但不限于：注射用水USP；水性媒介物，如但不限于，氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer'sInjection)、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格氏注射液；水混溶性媒介物，如但不限于，乙醇、聚乙二醇、以及聚丙二醇；以及非水性媒介物，如但不限于，玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯以及苯甲酸苄酯。
增加本文公开的一种或多种抗体溶解度的赋形剂也可以掺入肠胃外剂型中。
在一些实施方案中，肠胃外剂型是冻干的。示例性冻干制剂描述于例如美国专利号6,267,958和6,171,586；和WO 2006/044908中，所述专利各自通过引用以其全文并入。
在人治疗学中，医生将根据预防性或治疗性治疗，并根据年龄、体重、疾患和特定于待治疗受试者的其他因素，确定他认为最适当的剂量。
在某些实施方案中，本文提供的组合物是药物组合物或单一单位剂型。本文提供的药物组合物和单一单位剂型包含预防或治疗有效量的一种或多种预防或治疗抗体。
将有效预防或治疗病症或其一种或多种症状的抗体或组合物的量将随疾病或疾患的性质和严重性以及施用抗体的途径而变化。频率和剂量还将根据每个受试者的特定因素而变化，这取决于施用的特定疗法(例如治疗剂或预防剂)，病症、疾病或疾患的严重性，施用途径以及受试者的年龄、体重、反应和既往病史。可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推出有效剂量。
如本领域普通技术人员将容易知道的，不同的治疗有效量可以适用于不同的疾病和疾患。类似地，足以预防、控制、治疗或改善此类病症，但不足以引起或足以减少与本文提供的抗体相关的副作用的量也由本文提供的剂量和剂量频率计划表涵盖。此外，当向受试者施用多剂量的本文提供的组合物时，并非所有剂量都需要相同。例如，可以增加施用至受试者的剂量以改善组合物的预防或治疗效果，或者可以减少剂量以减少特定受试者正在经历的一种或多种副作用。
在某些实施方案中，治疗或预防可以用一种或多种本文提供的抗体或组合物的负荷剂量开始，随后是一种或多种维持剂量。
在某些实施方案中，可以施用本文提供的抗体或组合物的剂量，以实现受试者血液或血清中抗体的稳态浓度。稳态浓度可以根据技术人员可用的技术通过测量，或者可以基于受试者的身体特征(如身高、体重和年龄)来确定。
如本公开其他地方更详细讨论的，本文提供的抗体可以任选地与一种或多种可用于预防或治疗疾病或病症的额外的剂一起施用。此类额外的剂的有效量可以取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型以及本领域已知或本文所述的其他因素。
治疗性应用
对于治疗性应用，抗体以药学上可接受的剂型(如本领域已知和以上讨论的那些剂型)施用至哺乳动物，通常是人。例如，抗体可以作为丸剂或通过一段时间内的连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊液内、皮下、关节内、脊髓内、鞘内或瘤内途径静脉内施用至人。抗体还适于通过瘤周、病灶内或病灶周围途径施用，以发挥局部以及全身治疗效果。腹膜内途径可能特别有用，例如在卵巢肿瘤的治疗中。
本文提供的抗体可以用于治疗涉及SIRP-α的任何疾病或疾患。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是可以受益于用抗SIRP-α抗体治疗的疾病或疾患。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是细胞增殖性病症。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是癌症。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是感染。
可以用主题抗SIRPα抗体治疗的症状、病和/或疾病的实例包括但不限于癌症(任何形式的癌症，包括但不限于：癌、软组织肿瘤、肉瘤、畸胎瘤、黑素瘤、白血病、淋巴瘤、脑癌、实体肿瘤、间皮瘤(MSTO)等)；感染(例如，慢性感染)；和免疫疾病或病症(例如炎性疾病)(例如多发性硬化、关节炎等，例如用于免疫抑制疗法)。主题抗SIRPα抗体还可以用于移植调理(例如，干细胞移植、骨髓移植等)(例如，以破坏恶性细胞、提供免疫抑制以防止患者身体排斥供体细胞/干细胞等)。例如，在一些情况下，主题抗体组合或双特异性抗体(例如，抗SIRPα与抗CD117的组合)可用于移植调理。例如，受试者抗体组合或双特异性抗体(例如，抗SIRPα与抗CD117的组合)可以用于骨髓移植调理。在一些情况下，主题抗SIRPα抗体(例如抗体组合)可以用于免疫抑制疗法。
在一些实施方案中，提供本文提供的抗体用作药剂。在一些实施方案中，提供本文提供的抗体用于制造或制备药剂。在一些实施方案中，所述药剂用于治疗可以受益于抗SIRP-α抗体的疾病或疾患。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是细胞增殖性病症。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是癌症。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是感染。疾病或疾患可以是癌症；感染；病毒感染；细菌感染；真菌感染；纤维化；动脉粥样硬化；寄生虫感染，任选疟疾；和/或来自骨髓的内源性血液形成干细胞的耗尽或减少，以允许血液形成干细胞移植的无放射和/或化疗或放射和/或化疗减少的调理，任选地与抗CKIT(CD117)抗体组合。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来治疗所述受试者的疾病或疾患的方法。在一些方面，所述疾病或疾患是癌症。在一些方面，所述疾病或疾患是感染。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来治疗所述受试者的疾病或疾患的方法，其中所述疾病或疾患是癌症，并且所述癌症选自实体肿瘤和血液肿瘤。
在一些实施方案中，本文提供了一种在有需要的受试者中增加吞噬作用的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或药物组合物。
在一些实施方案中，本文提供了一种在有需要的受试者中调节免疫应答的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或药物组合物。
任何合适的癌症都可以用本文提供的抗体治疗。
例如，与非癌细胞相比，癌细胞表现出CD47表达增加的任何癌症都是待通过主题方法和组合物治疗的合适的癌症。如本文所用的“癌症”包括任何形式的癌症，包括但不限于实体肿瘤癌症(例如，肺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、平滑肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、黑素瘤、神经内分泌；等)和液体癌症(例如血液癌症)；癌；软组织肿瘤；肉瘤；畸胎瘤；黑素瘤；白血病；淋巴瘤；和脑癌，包括最小残留疾病，并包括原发性和转移性肿瘤二者。癌细胞表达CD47的任何癌症(例如，在一些情况下，与非癌细胞相比，癌细胞表现出CD47的表达增加)，都是待通过主题方法和组合物(例如，主题抗SIRPα抗体)治疗的合适的癌症。
癌是起源于上皮组织的恶性肿瘤。上皮细胞覆盖身体的外表面，排列内腔，并形成腺组织的内衬。癌的实例包括但不限于：腺癌(始于腺(分泌)细胞的癌症)，例如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌和结肠癌可以是腺癌；肾上腺皮质癌；肝细胞癌；肾细胞癌；卵巢癌；原位癌；导管癌；乳腺癌；基底细胞癌；鳞状细胞癌；移行细胞癌；结肠癌；鼻咽癌；多房囊性肾细胞癌；燕麦细胞癌；大细胞肺癌；小细胞肺癌；非小细胞肺癌；等。癌可以在前列腺、胰腺、结肠、脑(通常为继发性转移瘤)、肺、乳腺、皮肤等中发现。
软组织肿瘤是来源于结缔组织的一组高度多样化的罕见肿瘤。软组织肿瘤的实例包括但不限于：肺泡软组织肉瘤；血管瘤样纤维组织细胞瘤；软骨粘液样纤维瘤；骨骼软骨肉瘤；骨外粘液样软骨肉瘤；透明细胞肉瘤；促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤；隆突性皮肤纤维肉瘤；子宫内膜间质肿瘤；尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)；纤维瘤病(硬纤维)；婴儿纤维肉瘤；胃肠道间质瘤；骨巨细胞瘤；腱鞘巨细胞瘤；炎性肌纤维母细胞瘤；子宫平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；脂肪母细胞瘤；典型脂肪瘤；梭形细胞或多形性脂肪瘤；非典型脂肪瘤；软骨样脂肪瘤；分化良好的脂肪肉瘤；粘液样/圆形细胞脂肪肉瘤；多形性脂肪肉瘤；粘液样恶性纤维组织细胞瘤；高级恶性纤维组织细胞瘤；粘液纤维肉瘤；恶性周围神经鞘肿瘤；间皮瘤；神经母细胞瘤；骨软骨瘤；骨肉瘤；原始神经外胚层肿瘤；肺泡横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；良性或恶性神经鞘瘤；滑膜肉瘤；埃文肿瘤(Evan’s tumor)；结节性筋膜炎；韧带样型纤维瘤病；孤立性纤维肿瘤；隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)；血管肉瘤；上皮样血管内皮瘤；腱鞘巨细胞瘤(TGCT)；色素绒毛结节性滑膜炎(PVNS)；纤维发育不良；粘液纤维肉瘤；纤维肉瘤；滑膜肉瘤；恶性周围神经鞘肿瘤；神经纤维瘤；和软组织的多形性腺瘤；和来源于成纤维细胞、肌成纤维细胞、组织细胞、血管细胞/内皮细胞和神经鞘细胞的肿瘤。
肉瘤是一种罕见类型的癌症，其发生在间充质来源的细胞中，例如在骨骼或身体的软组织(包括软骨、脂肪、肌肉、血管、纤维组织或其他结缔组织或支持组织)中。不同类型的肉瘤基于癌症的形成部位。例如，骨肉瘤在骨骼中形成，脂肪肉瘤在脂肪中形成，并且横纹肌肉瘤在肌肉中形成。肉瘤的实例包括但不限于：阿斯金肿瘤(askin's tumor)；葡萄状肉瘤；软骨肉瘤；尤因氏肉瘤(ewing's sarcoma)；恶性血管内皮瘤；恶性神经鞘瘤；骨肉瘤；和软组织肉瘤(例如，肺泡软组织肉瘤；血管肉瘤；叶状囊肉瘤；隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)；韧带样肿瘤；韧带样小圆细胞肿瘤；上皮样肉瘤；骨外软骨肉瘤；骨外骨肉瘤；纤维肉瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；血管外皮细胞瘤；血管内皮瘤(更通常称为“血管肉瘤”)；卡波西肉瘤(kaposi's sarcoma)；平滑肌肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；恶性周围神经鞘肿瘤(MPNST)；神经纤维肉瘤；滑膜肉瘤；未分化的多形性肉瘤等)。
畸胎瘤是一种类型的生殖细胞肿瘤，其可以含有几种不同类型的组织(例如，可以包括来源于以下三个胚层中的任一个和/或全部的组织：内胚层、中胚层和外胚层)，包括例如毛发、肌肉和骨骼。畸胎瘤最常发生在女性卵巢、男性睾丸和儿童尾骨中。
黑素瘤是一种始于黑色素细胞(制造黑色素的细胞)的癌症形式。它可能始于痣(皮肤黑素瘤)，但也可能始于其他色素组织，如眼睛或肠道。
白血病是始于血液形成组织(如骨髓)的癌症，并且导致大量异常血细胞产生并进入血流。例如，白血病可以起源于骨髓来源的细胞，这些细胞正常地在血流中成熟。白血病是根据疾病发展和进展的速度(例如急性和慢性)以及受影响的白细胞类型(如髓样和淋巴样)来命名的。髓性白血病也称为骨髓性或成髓性白血病。淋巴性白血病也称为淋巴母细胞性或淋巴细胞性白血病。淋巴性白血病细胞可能聚集在淋巴结中，淋巴结可能会肿胀。白血病的实例包括但不限于：急性髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
淋巴瘤是始于免疫系统细胞的癌症。例如，淋巴瘤可以起源于骨髓来源的细胞，这些细胞正常地在淋巴系统中成熟。存在淋巴瘤的两种基本类别。一种是霍奇金淋巴瘤(HL)，其特征是存在一种叫做里德-斯德伯格氏细胞(Reed-Sternberg cell)的细胞。目前有6种公认的HL类型。霍奇金淋巴瘤的实例包括：结节性硬化经典霍奇金淋巴瘤(CHL)、混合细胞性CHL、淋巴细胞耗竭CHL、淋巴细胞丰富CHL和结节性淋巴细胞占优势的HL。
淋巴瘤的另一种类型是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，其包括一大组不同的免疫系统细胞癌症。非霍奇金淋巴瘤可以进一步分为具有惰性(生长缓慢)过程的癌症和具有侵袭性(生长迅速)过程癌症。目前有61种公认的NHL类型。非霍奇金淋巴瘤的实例包括但不限于：AIDS相关淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、伯基特样淋巴瘤(小非分裂细胞淋巴瘤)、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、肝脾γ-δT细胞淋巴瘤、T细胞白血病、淋巴母细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、鼻T细胞淋巴瘤、儿科淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、转化性淋巴瘤、与治疗有关的T细胞淋巴瘤和华氏巨球蛋白血症。
脑癌包括脑组织的任何癌症。脑癌的实例包括但不限于：胶质细胞瘤(例如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤等)、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤(髓母细胞瘤)等。
如本文所用，术语“感染”是指生物体(即，受试者)的至少一个细胞中被感染因子感染的任何状态(例如，受试者具有细胞内病原体感染，例如，慢性细胞内病原体感染)。如本文所用，术语“感染因子”是指在受感染生物体的至少一个细胞中诱导CD47表达(例如CD47表达增加)的外来生物实体(即病原体)。例如，感染因子包括但不限于细菌、病毒、原生动物和真菌。细胞内病原体尤其令人关注。感染性疾病是由感染因子引起的病症。在某些条件下，一些感染因子不会引起可识别的症状或疾病，但在变化的条件下有可能引起症状或疾病。主题方法可以用于治疗慢性病原体感染，例如包括但不限于病毒感染，例如逆转录病毒、慢病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、痘病毒、人乳头瘤病毒等；细胞内细菌感染，例如分枝杆菌属(Mycobacterium)、衣原体属(Chlamydophila)、埃立克体属(Ehrlichia)、立克次体(Rickettsia)、布鲁氏菌属(Brucella)、军团菌属(Legionella)、弗朗西斯菌属(Francisella)、李斯特菌属(Listeria)、柯克斯体属(Coxiella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、沙门氏菌属(Salmonella)、耶尔森氏菌属种(Yersinia sp)、幽门螺杆菌等；和胞内原生动物病原体，例如疟原虫属种(Plasmodium sp)、锥虫属种(Trypanosoma sp.)、贾第鞭毛虫属种(Giardia sp.)、弓形虫属种(Toxoplasma sp.)、利什曼原虫属种(Leishmania sp.)等。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来拮抗所述受试者靶细胞中的SIRP-α的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来增强所述受试者的免疫应答的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来延迟所述受试者的肿瘤发作的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来防止所述受试者的肿瘤复发或发作的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来延迟所述受试者的癌症发作的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来防止所述受试者的癌症复发或发作的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来减小所述受试者中肿瘤尺寸的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来减少所述受试者中转移瘤的数量的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来延迟所述受试者的感染发作的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来防止所述受试者的感染复发或发作的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来减小所述受试者的病毒滴度的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来消除来自所述受试者的病毒的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供抗体来延长所述受试者的总生存期、中位生存时间或无进展生存期的方法。
组合疗法
在一些实施方案中，本文提供的抗体与至少一种额外的治疗剂一起施用。任何合适的额外的治疗剂可以与本文提供的抗体一起施用。在一些方面，所述额外的治疗剂选自辐射、细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞抑制剂、抗激素剂、EGFR抑制剂、免疫刺激剂、抗血管生成剂及其组合。
在一些实施方案中，所述额外的治疗剂包括免疫刺激剂。
在一些实施方案中，所述额外的治疗剂是抗体。
抗SIRPα抗体可以与选择性结合靶细胞的第二种抗体或药剂在治疗上组合使用。术语“靶细胞”可以根据上下文以不同的方式使用。通常，“靶细胞”是将被吞噬细胞(例如吞噬细胞)吞噬的细胞，其中吞噬作用由于施用主题抗SIRPα抗体而增强。因此，术语“靶细胞”可以指表达CD47的细胞，因为主题抗SIRPα抗体通过抑制表达CD47的细胞与表达SIRPα的吞噬细胞之间的相互作用，促进表达CD47的细胞的吞噬。
然而，在一些情况下，靶细胞不需要表达高水平的CD47(并且在一些情况下根本不需要表达CD47)，以便主题多特异性抗体诱导靶细胞的吞噬作用。例如，在多特异性(例如，双特异性)抗体的情况下，主题多特异性(例如，双特异性)抗体的SIRPα结合区(第一结合区)结合吞噬细胞(例如，巨噬细胞)上的SIRPα，这允许多特异性抗体起到系绳的作用，以将吞噬细胞带到表达抗原(例如，癌细胞的标记物)的细胞附近，所述抗原由多特异性抗体的第二结合区(例如，双特异性抗体的第二结合区)识别(特异地结合)。因此，在多特异性抗体的情况下，靶细胞可以是不表达高水平CD47的细胞(并且还可以是不表达CD47的细胞)。在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。如下所述，靶细胞可以来自任何个体(例如，患者、受试者等)。
在一些情况下，靶细胞是“遭受疾病”的细胞(例如，来自“遭受疾病”的个体的细胞)，其中术语“遭受疾病”在本文中用于指具有可以用主题抗SIRPα抗体治疗的症状、病或疾病的受试者。“遭受疾病”的受试者可能患有癌症，可能患有感染(例如慢性感染)，和/或可能患有其他高增殖性疾患，例如硬化、纤维化，诸如此类等。“遭受疾病的细胞”可以是引起症状、病或疾病的那些细胞。作为非限制性实例，遭受疾病的患者的遭受疾病的细胞可以是表达CD47的癌细胞、受感染细胞、炎性细胞、免疫细胞等。可以用主题抗SIRPα抗体治疗的病或疾病的一个指示是，所涉及的细胞(即，遭受疾病的细胞，例如癌细胞、受感染细胞、炎性细胞、免疫细胞等)表达CD47(例如，在一些情况下，与相同细胞类型的正常细胞相比，CD47水平增加)。
在一些实施方案中，所述额外的治疗剂是结合肿瘤细胞表面上的一种或多种蛋白质的抗体。
为了治疗癌症，抗SIRPα抗体可以与一种或多种对肿瘤抗原特异的抗体组合。其中，肿瘤相关抗原(TAA)相对局限于肿瘤细胞，而肿瘤特异性抗原(TSA)是肿瘤细胞独有的。TSA和TAA通常是在细胞表面上表达的细胞内分子的部分，作为主要组织相容性复合物的一部分。
组织特异性分化抗原是存在于肿瘤细胞及其正常细胞对应物上的分子。已知可被治疗性mAb识别的肿瘤相关抗原分为几个不同类别。造血分化抗原是糖蛋白，其通常与分化簇(CD)分组相关，并且包括CD20、CD30、CD33和CD52。细胞表面分化抗原是在正常细胞和肿瘤细胞二者表面上发现的一组不同的糖蛋白和碳水化合物。参与生长和分化信号传导的抗原通常是生长因子和生长因子受体。为癌症患者抗体中抗体的靶标的生长因子包括CEA、表皮生长因子受体(EGFR；也称为ERBB1)、ERBB2(也称为HER2)、ERBB3、MET(也称为HGFR)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、ephrin受体A3(EPHA3)、肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体受体1(TRAILR1；也称为TNFRSF10A)、TRAILR2(也称为TNFRSF10B)和核因子κB配体的受体激活剂(RANKL；也称为TNFSF11)。参与血管生成的抗原通常是支持新微血管形成的蛋白质或生长因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(VEGFR)、整合素αVβ3和整合素α5β1。肿瘤基质和细胞外基质是肿瘤不可缺少的支持结构。作为治疗靶标的基质和细胞外基质抗原包括成纤维细胞激活蛋白(FAP)和腱生蛋白。
可用于双特异性构型或作为组合疗法的治疗性抗体的实例包括但不限于利妥昔单抗；替伊莫单抗；tiuxetan；托西莫单抗；本妥昔单抗；vedotin；吉妥珠单抗；ozogamicin；阿仑单抗；IGN101；阿德木单抗；拉贝珠单抗；huA33；培妥莫单抗；奥戈伏单抗；CC49(明瑞莫单抗)；cG250；J591；MOv18；MORAb-003(farletuzumab)；3F8，ch14.18；KW-2871；hu3S193；IgN311；贝伐单抗；IM-2C6；CDP791；埃达珠单抗；伏洛昔单抗；西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗；806；曲妥珠单抗；帕妥珠单抗；MM-121；AMG 102、METMAB；SCH 900105；AVE1642、IMC-A12、MK-0646、R1507；CP 751871；KB004；IIIA4；马帕木单抗(HGS-ETR1)；HGS-ETR2；CS-1008；地诺单抗；西罗珠单抗；F19；和81C6。双特异性抗体可以使用激活Fcγ受体的Fc区。
为了治疗癌症，抗SIRPα抗体可以与一种或多种抑制免疫检查点蛋白的抗体组合。特别令人感兴趣的是在肿瘤细胞表面上展示的免疫检查点蛋白。已在临床癌症免疫疗法的情形中最积极研究的免疫检查点受体，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4；也称为CD152)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1；也称为CD279)-二者都是抑制性受体。阻断这两种受体的抗体的临床活性意味着可以在多个水平上增强抗肿瘤免疫，并且可以在机械因素和临床前模型的指导下智能地设计组合策略。
PD1的两个配体是PD1配体1(PDL1；也称为B7-H1和CD274)和PDL2(也称为B7-DC和CD273)。PDL1在癌细胞上表达，并通过结合其在T细胞上的受体PD1抑制T细胞激活/功能。参见例如，将阿维鲁单抗作为治疗性抗体。
使免疫共刺激分子痛苦的剂也可用于本文公开的方法。此类剂包括激动剂或CD40和OX40。CD40是一种在抗原呈递细胞(APC)上发现的共刺激蛋白，并且是其激活所需的。这些APC包括吞噬细胞(巨噬细胞和树突细胞)和B细胞。CD40是TNF受体家族的一部分。CD40的主要激活信号传导分子是IFNγ和CD40配体(CD40L)。通过CD40的刺激激活巨噬细胞。
感兴趣的抗CCR4(CD194)抗体包括针对具有潜在抗炎和抗肿瘤活性的C-C趋化因子受体4(CCR4)的人源化单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述额外的治疗剂是抗体，其结合：HER2(ERBB2/neu)、CD52、PD-L1、VEGF、CD30、EGFR、CD38、RANKL(CD254)、GD2(神经节苷脂)、SLAMF7(CD319)、CD20、EGFR、PDGFRa、VEGFR2、CD33、CD44、CD99、CD96、CD90、CD133、CKIT(用于CKIT阳性肿瘤的CD117)；CTLA-4、PD-1、PD-L1、CD40(激动性的)、LAG3(CD223)、41BB(CD137激动性的)、OX40(CD134，激动性的)；和/或CKIT(CD117)，用以耗尽血液形成干细胞以进行移植疗法。
在一些实施方案中，所述额外的治疗剂是以下中的至少一种：利妥昔单抗、西妥昔单抗、阿仑单抗(CD52)、阿特珠单抗(PD-L1)、阿维鲁单抗(PD-L1)、贝伐单抗(VEGF)、本妥昔单抗(CD30)、达雷木单抗(CD38)、地诺单抗(RANKL)、达妥昔单抗(GD2)、埃罗妥珠单抗(SLAMF7)、替伊莫单抗(CD20)、伊匹单抗(CTLA-4)、耐昔妥珠单抗(EGFR)、纳武单抗(PD-1)、奥滨尤妥珠单抗(CD20)、奥法木单抗(CD20)、奥拉单抗(PDGFRa)、帕尼单抗(EGFR)、派姆单抗(PD-1)、帕妥珠单抗(HER2)、雷莫芦单抗(VEGFR2)、托西莫单抗(CD20)和吉妥珠单抗(CD33)。
所述额外的治疗剂可以通过任何合适的方式施用。在一些实施方案中，本文提供的抗体和所述额外的治疗剂包含在相同药物组合物中。在一些实施方案中，本文提供的抗体和所述额外的治疗剂包含在不同药物组合物中。
在本文提供的抗体和所述额外的治疗剂包含在不同药物组合物中的实施方案中，抗体的施用可以在所述额外的治疗剂施用之前、同时和/或之后进行。在一些方面，本文提供的抗体和所述额外的治疗剂的施用发生在彼此约一个月内。在一些方面，本文提供的抗体和所述额外的治疗剂的施用发生在彼此约一周内。在一些方面，本文提供的抗体和所述额外的治疗剂的施用发生在彼此约一天内。在一些方面，本文提供的抗体和所述额外的治疗剂的施用发生在彼此约十二小时内。在一些方面，本文提供的抗体和所述额外的治疗剂的施用发生在彼此约一小时内。
诊断方法
还提供了用于检测来自受试者的细胞上SIRP-α的存在的方法。此类方法可以用于例如预测和评估对用本文提供的抗体进行治疗的响应性。
在一些实施方案中，从受试者获得血液样品，并测定表达SIRP-α的细胞比例。在一些方面，确定由此类细胞表达的SIRP-α的相对量。表达SIRP-α的细胞比例和由此类细胞表达的SIRP-α的相对量可以通过任何合适的方法确定。在一些实施方案中，将流式细胞术用于进行此类测量。在一些实施方案中，将荧光辅助细胞分选(FACS)用于进行此类测量。关于用于评估外周血中SIRP-α的表达的方法，参见Li等人,J.Autoimmunity,2003,21:83-92。
试剂盒
还提供了包含本文提供的抗体的试剂盒。如本文所述，试剂盒可以用于疾病或病症的治疗、预防和/或诊断。
在一些实施方案中，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相连的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和IV溶液袋。所述容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。所述容器装有一种组合物，所述组合物本身或当与另一种组合物组合时，对治疗、预防和/或诊断疾病或病症有效。所述容器可以具有无菌入口。例如，如果容器是静脉注射溶液袋或小瓶，则它可能具有可以被针头刺穿的口。组合物中的至少一种活性剂是本文提供的抗体。所述标签或包装插页指示所述组合物用于治疗所选择疾患。
在一些实施方案中，试剂盒包括(a)其中含有第一组合物的第一容器，其中所述第一组合物包含本文提供的抗体；和(b)其中含有第二组合物的第二容器，其中所述第二组合物包含另外的治疗剂。此实施方案中的试剂盒可以进一步包括指示所述组合物可以用于治疗具体疾患的包装插页。
可替代地或另外地，试剂盒可以进一步包括含有药学上可接受的赋形剂的第二(或第三)容器。在一些方面，赋形剂是缓冲剂。试剂盒可以进一步包括在商业和使用者看来可取的其他材料，包括过滤器、针头和注射器。
实施例
以下是用于实行本发明的具体实施方案的实施例。所述实施例仅出于说明目的而提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。对于所使用的数字(例如量、温度等)，已尽力确保精确度，但当然应允许一些实验误差和偏差。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技能范围内的常规的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药学方法。此类技术在文献中有充分说明。参见例如,T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers Inc.,currentaddition)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989年)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990年)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A和B卷(1992)。
材料和方法
抗体产生。合成编码胞外结构域的人SIRPa的cDNA片段，并将其与小鼠Fc融合以产生SIRPa-Fc融合蛋白，将所述融合蛋白用于免疫小鼠以产生单克隆小鼠抗人CD47抗体。使用标准方案产生杂交瘤。简而言之，用纯化的重组SIRPa-Fc融合蛋白免疫4-6周龄Balb/c小鼠，每周两次持续总共4周。此后评估滴度，并将脾细胞与SP2/0细胞融合。选择杂交瘤，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选来自所得克隆的上清液。
抗体V克隆和测序。这里使用的克隆策略包括从杂交瘤细胞(Qiagen)中初步分离RNA。使用5’RACE-PCR技术(Clontech)获得编码1H9和3C2单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列，并使用标准DNA测序技术进行测序。
分子建模和抗体人源化。通过将来自小鼠抗体的CDR残基安装到人种系框架(FR)上，进行1H9和3C2的人源化。简而言之，通过明智地募集对应的CDR残基将小鼠1H9和3C2人源化。分别模拟小鼠1H9和3C2与人FR残基之间的差异，以研究它们对CDR构象的可能影响。
细胞转染。在FreeStyleTM 293表达培养基(Invitrogen)下培养293F细胞。根据制造商的说明，通过使用293fectin转染试剂(Invitrogen)共转染编码抗体重链和轻链的表达载体来进行瞬时转染。在4至5天后，收获来自转染细胞的上清液，并通过ELISA测试抗体分泌。简而言之，将96孔板(Nunc,Roskilde,Denmark)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1μg/ml山羊抗人Fcγ抗体于4℃下包被16小时。在室温下用于PBS中的0.4％BSA封闭1小时后，将分离的上清液以1/3的顺序稀释加入，并在室温下孵育1小时。随后将板洗涤三次，并与HRP缀合的山羊抗人κ特异性抗体在室温下孵育1小时。在洗涤后，将板用TMB显影。用2M H2SO4终止反应，并测量450nM处的OD。
抗体纯化和表征。将培养上清液施加于蛋白A琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare)。用PBS洗涤柱，并且然后用洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 3.0)洗脱蛋白质。用1M TrispH 9.0中和收集的级分。最后，将纯化的样品用PBS透析。在还原或非还原条件下，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在10％凝胶上分析洗脱抗体级分的纯度。通过考马斯亮蓝染色使条带可视化。
抗体亲和力测量。通过将人SIRPa的胞外结构域与His标签融合来制备人SIRPa-His融合蛋白，并且用于测量与1H9和3C2的单体结合亲和力。在25℃下在Biacore 3000上进行结合实验。通过使用EDC/NHS偶联化学试剂直接固定在CM5芯片的流动池2、3和4上，将山羊抗人捕获抗体固定(如表中所示)在芯片表面上。用1M乙醇胺阻断未占据的位点。流动池1未经处理，并且用作参考用于减去Ag与芯片表面的任何非特异性结合。如所示，在RU的流动池2、3和4上捕获测试Ab。使抗原以单一分析物浓度流过芯片。实时监测抗原与配体的结合，以获得结合(ka)和解离(kd)速率。由观察到的ka和kd计算平衡常数(KD)。对于快停速率相互作用(fast off rate interaction)，由稳态动力学分析确定KD。
体外吞噬作用测定。洗涤并计数Raji和HT29癌细胞，然后向每个孔中加入25μL含有1x105个细胞的无血清IMDM。向孔中加入最终浓度为10μg/mL 1H9、3C2(图中另有说明)、利妥昔单抗或0.1μg/mL西妥昔单抗的抗体处理(25μL)，并在37℃下孵育30分钟。在30分钟时，计数先前已用TrypLE收获的巨噬细胞，并在50μL无血清IMDM中接种5x104个细胞。将板在37℃下孵育2小时(效应子:靶＝1:2)。通过流式细胞术分析寻找GFP+巨噬细胞，计算吞噬作用百分比。
基因分型SIRPa变体。使用QIAamp DNA分离试剂盒(Qiagen)从人供体血液样品中分离基因组DNA。通过使用分离的基因组DNA以及引物TAG AAT ACA GGC TCA TGT TGC AGGT(SEQ ID NO:53)和GCC TTC AGC AAA TAG CAT GAC GT(SEQ ID NO:54)进行PCR。纯化PCR片段并进行测序。根据SIRPa参考序列分析和鉴定不同的SIRPa变体(Polymorphism inSirpa modulates engraftment of human hematopoietic stem cells.NatureImmunology,8；1313,2007)。
阻断人CD47在从人供体分离的单核细胞上的结合。使用Ficoll从人血液中分离人外周血单核细胞(PBMC)。在不存在或存在增加浓度的hHu1H9-G1的情况下，将5x105个细胞与1ug/ml的AF488缀合的人CD47-Fc融合蛋白孵育。通过流式细胞术测量和分析CD47在细胞上的结合。
Hu1H9-G1的内化。通过在37℃下将10ug/ml抗体与从正常人血液分化的巨噬细胞孵育来测试人源化1H9的内化。然后在每个时间点(0、20分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时)固定并透化细胞。将PE标记的抗人IgG1抗体用于检测1H9。将DAPI用于染色细胞核。将在4℃下的孵育用作1H9表面染色的对照。
实施例1：抗SIRPa单克隆抗体产生和表位定位
将编码胞外结构域的人SIRPa的cDNA片段与小鼠Fc融合以产生SIRPa-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:45)，将所述融合蛋白用于免疫小鼠以产生单克隆小鼠抗人SIRPa抗体。通过ELISA结合人SIRPa检查所选择杂交瘤克隆的特异性。获得两个阳性克隆，并命名为1H9和3C2。克隆并测序重链和轻链的可变区，并且确定1H9(图1)和3C2(图2)的VH和VL的序列。
为了确定由1H9和3C2识别的表位，将人SIRPa-Fc融合蛋白包被在96孔板中。在不存在或存在增加浓度的抗SIRPa抗体KWar的情况下，测量SIRPa与1H9和3C2的结合(公开于国际申请WO 2015/138600中，通过引用具体地并入本文；Vh和Vl序列在SEQ ID NO 46-47中示出)。如图3A所示，KWar没有与1H9竞争SIRPa结合，这表明1H9与Kwar相比识别不同的表位。相比之下，Kwar竞争3C2的SIRPa结合；然而，即使在使用100倍过量的KWar时，3C2与SIRPa的结合也仅被部分阻断。这表明与KWar相比，3C2可能识别重叠但不相同的表位(图3A)。竞争性结合也在1H9与3C2之间进行，并且显示1H9与SIRPa的结合是由1H9本身而不是由3C2以剂量依赖的方式进行竞争(图3B)。类似地，3C2本身而不是由1H9以剂量依赖的方式进行竞争(图3C)。因此，1H9和3C2识别SIRP-α上不同的表位。
实施例2：1H9和3C2的抗体同种型选择
嵌合1H9和3C2是通过将它们的轻链和重链可变结构域与人κ、人IgG4或人IgG1的恒定区融合而构建的，所述恒定区具有N297A突变以消除与FcgR的相互作用。然后将所得抗体与利妥昔单抗(Rx)组合在体外吞噬测定中进行测试。观察供体变异的影响。1H9与利妥昔单抗协同作用，以使用从一些供体的单核细胞分化的巨噬细胞，同样很好地促进人IgG4(1H9-G4)和IgG1N297A(1H9-G1)形式的吞噬作用(图4A)。同时，使用从不同供体单核细胞分化的巨噬细胞，1H9-G1触发的与利妥昔单抗的协同作用优于1H9-G4(图4B)。对于3C2也看到类似的结果(图4A-B)。可能的是，巨噬细胞上表达的FcgR的不同等位基因变异可能导致体外吞噬测定中观察到的变异。这些结果证明了抗SIRPα抗体的死Fc构建体在降低响应性可变性方面的总体益处，即当与靶向细胞的抗体组合时，减少了在增强吞噬作用方面为无响应者的个体的数量。
实施例3：1H9和3C2人源化
通过CDR移植进行1H9和3C2的人源化，并且1H9和3C2的VH和VL的人源化序列分别在图5和6中示出。全长序列在SEQ ID NO 37-40中示出。
为了评估人源化1H9和3C2的抗原结合特异性，通过ELISA进行人源化与亲代小鼠1H9或3C2之间的竞争结合。证明了人源化1H9和3C2以剂量依赖的方式分别与小鼠1H9和3C2竞争SIRPa结合(图7)。因此，人源化1H9和3C2具有与其亲本抗体相同的抗原结合特异性。然后使用表面等离子体共振测量人源化1H9和3C2的抗原结合亲和力。人源化1H9以1.15x10-9M的KD结合单体人SIRPa抗原，并且人源化3C2以5.53x10-9 M的KD结合单体人SIRPa(图8)。
实施例4：人源化1H9和3C3与治疗性抗体协同促进巨噬细胞介导的吞噬作用
接下来，我们研究了人源化1H9和3C2与治疗性抗体组合使人外周血来源的巨噬细胞发挥对人癌细胞的吞噬作用。单独的人源化1H9或3C2基本上不诱导吞噬作用；然而，当与利妥昔单抗(Rx)组合时，两种抗体诱导对Raji细胞的吞噬活性高于单独的利妥昔单抗的吞噬活性(图9A)。此外，人源化1H9和3C2与西妥昔单抗(Cx)协同诱导人结肠直肠腺癌细胞系HT-29的吞噬作用，并且在测试的人源化1H9和3C2的浓度范围内观察到协同活性(图9B)。
实施例5：1H9和3C2对SIRP家族成员的交叉反应性
除了SIRPα之外，SIRP家族中还有两种密切相关的蛋白质，即(SIRPB，登记号NM_001083910.3)和SIRPγ(SIRPG，登记号NM_001039508.1)。SIRPB虽然与SIRPa密切相关，但似乎不结合CD47，并且缺乏细胞质ITIM或任何其他可识别的细胞溶质基序来进行信号传导。相反，SIRPB含有带正电荷赖氨酸残基的跨膜区，其介导与携带ITAM的衔接蛋白DAP12的缔合。DAP12ITAM的磷酸化介导蛋白质酪氨酸激酶Syk的募集和随后调节各种功能的MAPK途径的激活。例如，鼠SIRPB受体的触发也与DAP12复合，促进巨噬细胞的吞噬作用。人SIRP家族的第三个成员SIRPG在T细胞和激活的NK细胞上表达。它可以结合CD47，尽管亲和力与SIRPa相比低10倍。此外，SIRPg-CD47相互作用介导细胞-细胞粘附并支持APC-T细胞接触，从而增强抗原呈递、随之发生的T细胞增殖和细胞因子分泌。SIRPG本身不太可能产生细胞内信号，因为它不具有任何已知的信号传导基序。相反，SIRPG可能触发APC中CD47的信号传导。
产生SIRPB和SIRPG His融合蛋白，并测试1H9和3C2与SIRPB和SIRPG的结合。如图10所示，与Kwar相比，1H9和3C2与SIRPB结合(图10A)。与Kwar不同，未检测到1H9或3C2与SIRPG的结合(图10B)。相对于现有技术的抗SIRPA抗体，1H9和3C2缺乏SIRPG结合赋予这些抗体以下潜在优势：(1)相对于SIRPG，SIRPA具有更受限制的表达，这降低了脱靶效应的风险，(2)降低了毒性风险，例如，鉴于对SIRPA的特异性增加，(3)当将抗体给药于受试者时，发展“抗原沉降”现象的风险降低，以及(4)降低了抗体干扰T细胞和/或B细胞功能的风险。
实施例6：额外的抗SIRP-α抗体的产生和测试
如上所述，通过免疫小鼠，产生对人SIRPa的额外的抗体。将两个单克隆抗体克隆分别命名为-9B11和7E11。参见SEQ ID NO 21-36和41-44。将小鼠可变区作为嵌合体连接到人IgG4 Fc区(命名为7E11-G4或9B11-G4)，或者连接到包含N297A突变的人IgG1 Fc区，以消除与人FcγR的相互作用(命名为7E11-G1或9B11-G1)。
正如在1H9和3C2中发现的，当与利妥昔单抗组合时，9B11和7E11抗体在增强癌细胞的吞噬作用方面显示出协同响应。如图11所示，在人血清存在下，由供体A(A)和供体B(B)的单核细胞分化巨噬细胞7天。用CFSE标记Raji细胞，并在10μg/ml利妥昔单抗(Rx)单独存在或与10μg/ml 9B11-G4、9B11-G1、7E11-G4或7E11-G1组合存在下与巨噬细胞一起孵育。两小时后，通过流式细胞术分析寻找GFP+巨噬细胞，计算吞噬作用百分比。
数据显示，虽然IgG4形式的抗体和突变的IgG1形式的抗体二者都能提供协同响应，但突变的IgG1形式在供体之间提供了更一致的响应。
为了确定由9B11和7E11识别的表位，将人SIRPa-Fc融合蛋白包被在96孔板中。在不存在或存在增加浓度的抗SIRPa抗体KWar的情况下，测量SIRPa与9B11和7E11的结合(公开于国际申请WO 2015/138600中，通过引用具体地并入本文)。如图12所示，7E11与Kwar相比识别重叠的表位(类似于3C2)，并且9B11与Kwar相比识别非常相似或相同的表位。
实施例7：Hu1H9-G1与原代人细胞上的不同SIRP-α变体结合
人SIRP-α在IgV结构域中高度多态，然而，大多数变体是变体1(V1)和变体2(V2)。
对22名正常人供体进行筛选和基因分型，并将供体鉴定为SIPR-α的V1纯合、V2纯合和V1/V5杂合状态。(Polymorphism in Sirpa modulates engraftment of humanhematopoietic stem cells.Nature Immunology,8；1313,2007；供参考：在SEQ ID NO:48中示出的V1序列；在SEQ ID NO:49中示出的V2序列)。使用供体单核细胞和巨噬细胞测试并发现人源化1H9结合了V1、V2和V1/V5等位基因中的每个(图13)。此数据表明，人源化1H9具有与原代人供体细胞上的多个不同SIRP-α变体结合的能力，因此可以在广泛的人中使用。
实施例8：Hu1H9-G1阻断CD47与来自不同供体的单核细胞的结合
接下来测试人源化1H9-G1，以确定其是否可以阻断CD47和作为不同变体表达的SIRP-α的相互作用。将单核细胞从表达V1、V2和V1/V5的供体中分离出来，并且在不存在或存在增加浓度的人源化1H9的情况下，与CD47-Fc融合蛋白一起孵育(图14)。数据显示，人源化1H9以剂量依赖的方式阻断CD47和SIRP-α的相互作用，并且阻断活性在测试的不同SIRP-α变体之间是可比较的。
实施例9：Hu1H9-G1与西妥昔单抗协同促进不同供体的吞噬作用
使用从不同供体分化的巨噬细胞进行体外吞噬。人源化1H9-G1与西妥昔单抗协同促进具有V1、V2和V1/V5变体的供体的吞噬作用(图15)。
实施例10：Hu1H9-G1的内化
通过在37C下将10ug/ml抗体与从正常人血液分化的巨噬细胞孵育来测试人源化1H9的内化。然后在每个时间点(0、20分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时)固定并透化细胞。将PE标记的抗人IgG1抗体用于检测1H9。将DAPI用于对细胞核染色。将在4C下的孵育用作1H9的表面染色的对照。
数据显示，人源化1H9不内化到细胞中，并且在包括24小时的每个时间点都可以检测到1H9的表面染色(数据未示出)。此数据表明，人源化1H9在细胞表面上是稳定的，这可能表明体内治疗效果更好。
尽管已参照优选实施方案和各种可替代实施方案具体示出和描述了本发明，但相关领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中的形式和细节上进行各种改变。
出于所有目的，在本说明书正文中引用的所有参考文献、已发布的专利和专利申请都特此通过引用以其全文并入。
表A-序列
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Claims (30)

1.一种分离的人源化抗SIRPα抗体，其包含：
包含重链可变区(VH)的重链，所述VH包含三个重链CDR序列，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和
包含轻链可变区(VL)的轻链，所述VL包含三个轻链CDR序列，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
其中所述CDR-H1由SEQ ID NO:1中所列的序列组成；所述CDR-H2由SEQ ID NO:2中所列的序列组成；所述CDR-H3由SEQ ID NO:3中所列的序列组成；所述CDR-L1由SEQ ID NO:4中所列的序列组成；所述CDR-L2由SEQ ID NO:5中所列的序列组成；和所述CDR-L3由SEQ IDNO:6中所列的序列组成。
2.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:7中所列的VH序列，和所述VL包含SEQ ID NO:8中所列的VL序列。
3.如权利要求2所述的分离的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:17中所列的重链序列，和所述轻链包含SEQ ID NO:18中所列的轻链序列。
4.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包含具有减少的Fc依赖性功能的人Fc区。
5.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体：
(a)不与KWar抗体竞争与人SIRPα的结合；
(b)抑制人CD47与人SIRPα的结合；
(c)抑制人SP-A与人SIRPα的结合；
(d)抑制人SP-D与人SIRPα的结合；
(e)与恒河猴SIRPα结合；
(f)与猕猴SIRPα结合
(g)相对于对照增加吞噬作用；
(h)结合人SIRPα等位基因V1和V2中的每一种；
(i)结合人SIRPα等位基因V1、V2和V1/V5中的每一种；
(j)结合人SIRPα等位基因V1；
(k)结合人SIRPα等位基因V2；或者
(l)能够是(a)-(l)的任何组合。
6.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体对人SIRPα同种型是泛特异性的。
7.如权利要求4所述的分离的抗体，其中所述人Fc区是IgG1或IgG4。
8.如权利要求4所述的分离的抗体，其中所述具有减少的Fc依赖性功能的人Fc区包含至少一种减少与人Fc受体的结合的修饰。
9.如权利要求8所述的分离的抗体，其中所述人Fc区修饰包括N297A氨基酸取代，根据EU索引编号。
10.如权利要求8所述的分离的抗体，其中所述人Fc区是IgG1，并且所述人Fc区修饰包括在EU索引位置天冬酰胺297处的修饰。
11.如权利要求10所述的分离的抗体，其中所述人IgG1的Fc区修饰包括N297A氨基酸取代，根据EU索引编号。
12.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体结合多于一个的抗原或单个抗原上的多于一个的表位。
13.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述VH由SEQ ID NO:7中所列的VH序列组成和所述VL由SEQ ID NO:8中所列的VL序列组成。
14.如权利要求2所述的分离的抗体，其中所述重链由SEQ ID NO:17中所列的序列组成和所述轻链由SEQ ID NO:18中所列的序列组成。
15.如权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含具有减少的Fc依赖性功能的人Fc区。
16.如权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含具有在EU索引位置天冬酰胺297处的修饰的人IgG1的Fc区。
17.如权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含具有N297A氨基酸取代的人IgG1的Fc区，根据EU索引编号。
18.如权利要求3所述的分离的抗体，其中所述抗体包含具有减少的Fc依赖性功能的人Fc区。
19.如权利要求3所述的分离的抗体，其中所述抗体包含具有在EU索引位置天冬酰胺297处的修饰的人IgG1的Fc区。
20.如权利要求3所述的分离的抗体，其中所述抗体包含具有N297A氨基酸取代的人IgG1的Fc区，根据EU索引编号。
21.一种分离的多核苷酸或多核苷酸组，其编码如权利要求1-20中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分。
22.一种载体或载体组，其包含如权利要求21所述的多核苷酸或多核苷酸组。
23.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求21所述的多核苷酸或多核苷酸组。
24.一种产生抗体的方法，所述方法包括用如权利要求23所述的宿主细胞表达所述抗体并分离所述表达的抗体。
25.一种药物组合物，其包含如权利要求1-20中任一项所述的分离的抗体和药学上可接受的赋形剂。
26.如权利要求1-20中任一项所述的分离的抗体在制备用于在有需要的受试者中治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)的药物中的用途，其中所述药物进一步联合利妥昔单抗。
27.一种药物组合物，其包含如权利要求2所述的分离的抗体和药学上可接受的赋形剂。
28.一种药物组合物，其包含如权利要求3所述的分离的抗体和药学上可接受的赋形剂。
29.一种药物组合物，其包含如权利要求13所述的分离的抗体和药学上可接受的赋形剂。
30.一种药物组合物，其包含如权利要求16所述的分离的抗体和药学上可接受的赋形剂。
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