BR112012012873B1

BR112012012873B1 - Método para fornecer uma sequência de ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina e método para produzir uma imunoglobulina

Info

Publication number: BR112012012873B1
Application number: BR112012012873-6A
Authority: BR
Inventors: Hubert Kettenberger; Sebastian Neumann; Stefan Klostermann; Ulrich Kohnert
Original assignee: F.Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2021-08-31
Also published as: US20130065277A1; RU2012129732A; CA2782578C; BR112012012873A2; HUE025190T2; KR20120096040A; IL219629A0; SG181893A1; US10047162B2; SI2516460T1; KR101593262B1; MX2012006626A; CN102666582B; US9150641B2; JP5686817B2; HK1174340A1; CN102666582A; IL219629A; NZ599840A; DK2516460T3

Abstract

MÉTODO PARA FORNECER UMA SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UMA IMUNOGLOBULINA, MÉTODO PARA HUMANIZAR UMA IMUNOGLOBULINA E MÉTODO PARA PRODUZIR UMA IMUNOGLOBULINA. Neste documento é relatado um método para reduzir a agregação de uma imunoglobulina em solução compreendendo as etapas de i) comparação da sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada de um anticorpo com uma sequência de referência ou da linhagem germinativa; e determinar se um ou mais resíduos de treonina e/ou resíduos de serina foram substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, e ii) modificação da sequência de aminoácidos da imunoglobulina pela reversão dos resíduos de treonina e/ou resíduos de serina trocados de volta para treonina ou para serina como na sequência de referência ou da linhagem germinativa e, dessa forma, reduzindo a agregação de uma imunoglobulina em solução.

Description

[001] Na presente invenção é relatado um método para reduzir a agregação de imunoglobulinas em soluções concentradas pela reversão de uma ou duas mutação(ões) na quarta região de estrutura (fourth framework region - FR4), ou seja, no elemento J, de uma cadeia pesada de imunoglobulina pelo resíduo de aminoácido hidrofílico ou da linhagem germinativa natural.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Devido à suas propriedades químicas e físicas, como peso molecular e arquitetura de domínio incluindo as modificações secundárias, o processamento downstream (downstream processing - (DSP)) das imunoglobulinas é muito complicado. Soluções concentradas de imunoglobulinas são necessárias não apenas para medicamentos formulados como também para intermediários no processamento downstream para se atingir baixos volumes para o manuseio econômico e armazenamento.

[003] Além disso, a formulação final da imunoglobulina requer uma solução altamente concentrada. Por exemplo, uma solução altamente concentrada é necessária para a aplicação subcutânea de imunoglobulina em concentrações superiores a 100 mg/ml, ou seja, cerca de 150 mg/ml. Porém, pelo menos algumas imunoglobulinas tendem a agregar em altas concentrações não fisiológicas de 100 mg/ml ou mais.

[004] No documento WO 2009/000098 é descrita uma sequência baseada na engenharia e otimização de anticorpos de cadeia simples.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[005] Na presente invenção é descrito um método para reduzir a agregação de imunoglobulina em uma solução concentrada. Verificou-se que duas ou mesmo uma única mutação de reversão na quarta região de estrutura de uma cadeia pesada de imunoglobulina pode reduzir a formação de agregados permitindo o fornecimento de uma solução altamente concentrada de imunoglobulina variante revertida com reduzido teor agregado. Portanto, no presente são relatados como aspectos individuais: um método para reduzir a agregação de uma imunoglobulina em solução, um método para modificar uma imunoglobulina, um método para produzir uma imunoglobulina, e um método para humanizar uma imunoglobulina.

[006] Todos os métodos relatados no presente compreendem as seguintes etapas:a) alinhamento da sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada de uma imunoglobulina com uma sequência de aminoácido de referência para atingir o nível máximo de identidade de aminoácidos;b) identificação das posições da sequência de aminoácidos alinhadas com diferentes resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura (framework) da cadeia pesada da imunoglobulina e da sequência de aminoácido de referência;c) modificação da sequência de aminoácidos de imunoglobulina pela substituição de, pelo menos de, um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada de imunoglobulina em uma posição identificada em b) pelo respectivo resíduo de treonina ou serina como presente na sequência de aminoácidos de referência, em que na posição substituída o resíduo de aminoácido é treonina ou serina na sequência de aminoácido de referência, e em que o resíduo de aminoácido não é treonina e não é serina na sequência de aminoácido da quarta região de estrutura (framework) da cadeia pesada da imunoglobulina;d) opcionalmente, o fornecimento de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de imunoglobulina modificada.

[007] Em um exemplo de realização apenas a diferença de resíduos de treonina é determinada e alterada. Em outro exemplo de realização a sequência de aminoácidos para a quarta região de estrutura da imunoglobulina é a sequência de aminoácidos xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) com x denotando qualquer resíduo de aminoácido exceto treonina e serina. Em um exemplo de realização adicional a sequência de aminoácidos de referência é a sequência de aminoácidos xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) com x nas posições 1, 2, 3, 4, 7 e 9 que denotam qualquer resíduo de aminoácido exceto serina e treonina e o x na posição 6 denotando treonina e o x na posição 10 e 11 denotando serina, em que a diferença de resíduos treonina na posição 5 e/ou 8 na sequência de aminoácidos de referência para a sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada de imunoglobulina é identificada na etapa b) e modificada na etapa c). Em um exemplo de realização a sequência de aminoácidos de referência é uma sequência de aminoácidos da linhagem germinativa humana. Em um exemplo de realização de todos os aspectos divulgados no presente os métodos compreendem as seguintes etapas:a) alinhamento da sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada de imunoglobulina com a sequência de aminoácidos WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02), ou sequência de aminoácidos WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 03), ou a sequência de aminoácidos WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 04), ou a sequência de aminoácidos WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 05), ou a sequência de aminoácidos WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 06) para atingir o nível máximo de identidade de aminoácidos;b) identificação das posições de aminoácidos alinhadas com diferentes resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura (framework) da cadeia pesada da imunoglobulina e da sequência de aminoácido de referência; c) modificação da imunoglobulina pela substituição de um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada de imunoglobulina em uma posição identificada em b) pelo respectivo resíduo de treonina ou serina presente na sequência de aminoácidos de referência, em que o resíduo de aminoácido na posição é treonina ou serina na sequência de aminoácido de referência, e em que o resíduo de aminoácido na posição não é treonina e não é serina na sequência de aminoácido da quarta região de estrutura da cadeia pesada de imunoglobulina;d) opcionalmente, o fornecimento de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de imunoglobulina modificada.

[008] Em um exemplo de realização dos aspectos divulgados na presente invenção os métodos compreendem como a primeira etapa a etapa de fornecimento ou determinação da sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada de imunoglobulina. Em um exemplo de realização a sequência de referência é a sequência de aminoácidos WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02). Em outro exemplo de realização a sequência de aminoácidos de referência é a xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11). Em um exemplo de realização a diferença dos resíduos de treonina na posição 5 e/ou 8 da sequência de aminoácido de referência é determinada. Em um exemplo de realização apenas a diferença de resíduos de treonina é determinada e alterada.

[009] Em um aspecto, conforme divulgado na presente invenção, o método é um método para produzir uma imunoglobulina compreendendo as seguintes etapas:a) alinhamento da sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada da imunoglobulina com a sequência de aminoácido de referência xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) ou xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) para atingir o nível máximo de identidade de aminoácidos;b) identificação das posições da sequência de aminoácidos alinhadas com diferentes resíduos de aminoácidos na posição 5 e/ou 6 e/ou 8 e/ou 10 e/ou 11 na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada da imunoglobulina e na sequência de aminoácidos de referência, c) modificação da sequência de aminoácidos da região de estrutura da cadeia pesada da imunoglobulina pela substituição de um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada de imunoglobulina em uma posição identificada em b) pelo respectivo resíduo de treonina ou serina como na sequência de aminoácidos de referência, em que o resíduo de aminoácido na posição substituída é treonina ou serina na sequência de aminoácido de referência, e em que o resíduo de aminoácido na posição não é treonina e não é serina na sequência de aminoácido da quarta região de estrutura da cadeia pesada de imunoglobulina;d) cultivo de uma célula de mamífero compreendendo o ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de imunoglobulina modificada e de um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos da cadeia leve correspondente para a expressão da cadeia pesada e leve de imunoglobulina;e) recuperação da imunoglobulina a partir da célula de mamífero ou do meio de cultura e, desse modo, produzindo uma imunoglobulina.

[010] Em um exemplo de realização a sequência de aminoácidos de referência é a sequência de aminoácidos WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02), ou a sequência de aminoácidos WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 03), ou a sequência de aminoácidos WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 04), ou a sequência de aminoácidos WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 05), ou a sequência de aminoácidos WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 06). Em um exemplo de realização, a etapa de modificação da sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada da imunoglobulina é a substituição de um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada na posição identificada na etapa b), que é treonina na sequência de aminoácido de referência e que não é treonina na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada, pelo respectivo resíduo de treonina, tal como presente na sequência de aminoácido de referência. Em outro exemplo de realização, a modificação é de pelo menos uma posição identificada. Em um exemplo de realização a sequência de aminoácidos de referência é a sequência de aminoácidos WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02). Em um exemplo de realização a imunoglobulina é uma imunoglobulina humana ou humanizada. Em outro exemplo de realização a célula de mamífero é uma célula CHO ou uma célula HEK. Em outro exemplo de realização a diferença dos resíduos de treonina na posição 5 e/ou 8 da sequência de aminoácido de referência é determinada.

[011] Outro aspecto, tal como divulgado no presente é um método para humanização de uma imunoglobulina compreendendo as seguintes etapas: a) alinhamento da sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada da imunoglobulina com a sequência de aminoácido de referência xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) ou xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) para atingir o nível máximo de identidade de aminoácidos;b) identificação das posições da sequência de aminoácidos alinhadas com diferentes resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada da imunoglobulina e da sequência de aminoácido de referência;c) humanização da imunoglobulina pela substituição de um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada em uma posição identificada em b) pelo respectivo resíduo de treonina ou serina presente na sequência de aminoácidos de referência, em que o resíduo de aminoácido na posição é treonina ou serina na sequência de aminoácido de referência, e em que o resíduo de aminoácido na posição não é treonina e não é serina na sequência de aminoácido da quarta região de estrutura da cadeia pesada da imunoglobulina;d) opcionalmente, o fornecimento de uma sequência de ácido nucleico que codifica a imunoglobulina humanizada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[012] Verificou-se que a troca de dois ou mesmo de um único resíduo de aminoácido treonina e/ou serina por um resíduo de aminoácido pequeno hidrofóbico ou apolar, tal como isoleucina ou alanina, na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada da imunoglobulina aumenta a tendência da imunoglobulina de formar agregados em solução, especialmente em soluções com alta concentração de sal e/ou alta concentração de imunoglobulina. Ao reverter os resíduos de aminoácido trocados de volta para o(s) resíduo(s) de treonina e/ou serina de ocorrência natural, a tendência de formar agregados em solução, especialmente em soluções concentradas, é distintamente reduzida.

[013] Em um aspecto, o método conforme divulgado na presente invenção é um método para a redução da agregação de uma imunoglobulina em solução compreendendo as seguintes etapas:- determinar se um ou mais resíduos de treonina e/ou serina na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada da imunoglobulina foi(foram) alterado(s) pela utilização da comparação de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácido de referência para a sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura;- reverter a sequência de aminoácidos da imunoglobulina pela modificação de pelo menos um dos resíduos de treonina e/ou serina trocados de volta para o resíduo treonina e/ou serina de referência, reduzindo assim a agregação de uma imunoglobulina em solução.

[014] O termo “alinhando” representa o processo de alinhar duas ou mais sequências de aminoácidos para atingir o nível máximo de identidade de sequência de aminoácidos e de conservação. Ele compreende a determinação da homologia posicional para sequências moleculares, envolvendo a justaposição de aminoácidos ou nucleotídeos de moléculas homólogas. Como resultado as sequências comparadas são apresentadas em uma forma que as regiões de maior similaridade estatística são mostradas.

[015] “Nível máximo de identidade de sequência de aminoácidos” com relação a uma sequencia de aminoácido de referencia é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos candidata que é idêntica aos resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos de referencia, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos (gaps), se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequência, sem considerar qualquer substituição conservadora como parte da identidade de sequência. O alinhamento para os propósitos de determinar a identidade de sequências de aminoácidos pode ser conseguido de várias formas, por exemplo, utilizando softwares de computador como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências de aminoácidos, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências de aminoácidos que estão sendo comparadas. Para os propósitos da presente invenção, no entanto, os valores de “% de identidade da sequência de aminoácido” são gerados usando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 é de autoria da Genentech, Inc., e o código fonte foi depositado com a documentação no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559, Estados Unidos, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais: TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível pela Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o “digital UNIX V4.0D”. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

[016] Em situações onde o ALIGN-2 é empregado para a comparação de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de aminoácidos A que contém ou compreende uma certa % de identidade de sequência de aminoácidos com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma:100 vezes a fração X/Yno qual, X é a quantidade de resíduos de aminoácidos avaliados como coincidências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento de A e B naquele programa e em que Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Apreciar-se-á que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos de A para B não seja igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos de B para A.

[017] Em um aspecto adicional, o método conforme divulgado no presente é um método para a modificação de uma imunoglobulina compreendendo as seguintes etapas:- determinar se um ou mais resíduos de treonina e/ou serina na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada da imunoglobulina foi(foram) alterado(s) pela utilização da comparação de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácido de referência para a sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura;- reverter a sequência de aminoácidos da imunoglobulina pela modificação de pelo menos um dos resíduos de treonina e/ou serina trocados de volta para o resíduo treonina e/ou serina de referência, e dessa forma modificar um imunoglobulina.

[018] Em um aspecto, o método conforme divulgado na presente invenção é um método para humanizar uma imunoglobulina compreendendo as seguintes etapas:- determinar pela comparação de sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada de uma imunoglobulina quimérica, uma imunoglobulina com uma CDR enxertada, uma imunoglobulina depletada ou reduzida de um epítopo de célula T, ou um variante deste com uma sequência de aminoácido de referência para a região de estrutura se um ou mais resíduos de treonina e/ou serina foram substituídos por um resíduo de aminoácido diferente,- reverter a sequência de aminoácidos da imunoglobulina pela modificação de pelo menos um dos resíduos de treonina e/ou serina trocados de volta para o resíduo treonina e/ou serina na sequência de aminoácidos de referência e dessa forma humanizar uma imunoglobulina.

[019] O termo “sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura (fourth framework region)” denota a sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada de uma imunoglobulina. Esta sequência de aminoácidos começa com o resíduo de aminoácido diretamente C-terminal para a região determinante de complementaridade 3 (CDR3) da cadeia pesada de imunoglobulina e termina com o último resíduo de aminoácido do domínio variável de cadeia pesada. Em um exemplo de realização os resíduos de aminoácidos da CDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina são determinados de acordo com Kabat.

[020] O termo “imunoglobulina quimérica” denota uma imunoglobulina compreendendo os resíduos de aminoácidos derivados de uma imunoglobulina de uma primeira espécie e os resíduos de aminoácidos derivados de uma segunda espécie não idêntica à primeira espécie. Se a espécie aceptora é humana, então a imunoglobulina quimérica é uma “imunoglobulina humanizada”. Para a maior parte, uma imunoglobulina humanizada é derivada de uma imunoglobulina humana (imunoglobulina receptora ou aceptora), na qual a sequência de aminoácidos de uma ou mais região(ões) hipervariável(eis) determinada(s) de acordo com Kabat e/ou Chothia e/ou outros sistemas de numeração são alteradas para a sequência de aminoácidos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (imunoglobulina doadora). Uma imunoglobulina humanizada cuja as regiões hipervariáveis inteiras, de acordo com a numeração de Kabat e/ou Chothia e/ou outros sistemas de numeração, de uma imunoglobulina aceptora humana são substituídas pelos resíduos de aminoácidos correspondentes de uma imunoglobulina doadora não humana é denominada de “imunoglobulina com uma CDR enxertada”. Exemplos de imunoglobulinas doadoras não humanas são imunoglobulinas de camundongos, rato, coelho, cão, hamster, ovelhas, ou primatas não humanos, tendo a especificidade e afinidade desejada para um antígeno de interesse (vide, por exemplo, Morrison, S.L., et al., Proc. Na tl.Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5.202.238; US 5.204.244). Em alguns casos, resíduos da região de estrutura (ou região estrutural - framework region (FR)) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, as imunoglobulinas humanizadas podem compreender modificações adicionais, por exemplo, resíduos de aminoácidos que não são encontrados na imunoglobulina aceptora ou imunoglobulina doadora. Tais modificações resultam em variantes de tal imunoglobulina aceptora ou doadora, que são homólogas, mas não idênticas, à sequência parental (de origem) correspondente. Uma imunoglobulina humanizada opcionalmente compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente de uma imunoglobulina humana.

[021] Em um exemplo de realização a imunoglobulina é uma imunoglobulina quimérica, ou uma imunoglobulina com a CDR enxertada, ou uma imunoglobulina depletada ou reduzida de um epítopo de célula T, ou uma variante deste. Em um exemplo de realização a imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada humana ou uma variante desta. Em um exemplo de realização adicional a região constante humana é da subclasse IgG1, ou subclasse IgG4, ou subclasse IgG2, ou subclasse IgG3, ou da SEQ ID NO: 07, ou da SEQ ID NO: 08, ou é uma variante destes.

[022] Em um exemplo de realização a região constante é modificada de tal maneira que nenhuma ligação ao receptor FCY (por exemplo FcyRIIIa) e/ou nenhuma ligação ao C1q, tal como definido abaixo, pode ser detectada. Em um exemplo de realização a região constante é uma região constante humana e é da subclasse IgG4 humana ou é uma parte Fc mutada a partir da subclasse IgG1 humana. Em outro exemplo de realização a região constante é da subclasse IgG1 humana compreendendo as mutações L234A e L235A (posições determinadas de acordo com o comprimento total, ou seja, incluindo o domínio variável, sequência de aminoácidos da cadeia pesada da IgG1 humana). Enquanto a IgG4 exibe uma ligação ao receptor FCY (FcyRIIIa) reduzida, as imunoglobulinas das outras subclasses de IgG exibem forte ligação. No entanto os resíduos Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (perda de carboidratos Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gli236, Gli237, Ile253, Ser254, Lis288, Tre307, Gln311, Asn434, e/ou His435 são resíduos que, se alterados, também fornecem ligação reduzida ao receptor Fcy (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0307434). Em um exemplo de realização a região constante é em relação à ligação ao receptor FCY da subclasse IgG4 ou subclasse IgG1 ou IgG2, com uma mutação no L234, L235, e/ou D265, e/ou contém a mutação PVA236. Em um exemplo de realização a mutação é S228P, L234A, L235A, L235E e/ou PVA236 (PVA236 significa que a sequência de aminoácidos ELLG (dado como o código de aminoácido de uma letra) a partir da posição de aminoácido 233 até 236 da IgG1 ou EFLG de IgG4 é substituído por PVA). Em um exemplo de realização adicional a mutação é S228P da IgG4, e L234A e L235A da IgG1. A região constante de uma imunoglobulina está diretamente envolvida na ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo) e CDC (citotoxicidade dependente de complemento). Uma imunoglobulina que não se liga ao receptor FCY e/ou ao fator C1q do sistema complemento não suscita a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[023] O termo “imunoglobulina depletada de epítopo de célula T” denota uma imunoglobulina que foi modificada para remover ou reduzir a imunogenicidade pela remoção de epítopos de células T humanas (sequências peptídicas dentro de proteínas com a capacidade de se ligarem às moléculas MHC de classe II). Por este método são identificadas as interações entre as cadeias laterais de aminoácidos do peptídeo e bolsos de ligação específicos com a fenda de ligação MHC de classe II. As regiões imunogênicas identificadas são alteradas para eliminar a imunogenicidade. Tais métodos são descritos em geral, por exemplo, no documento WO 98/52976 ou documento WO 98/08097.

[024] O termo “variante deste” denota uma imunoglobulina compreendendo modificações conservadoras na sequência ou um padrão de glicosilação alterado. O termo “modificações conservadoras na sequência” denota substituições de aminoácidos, incluindo aqueles nos quais o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes foram definidas no estado da técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico) e cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e as cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Outro tipo de variante da imunoglobulina altera o padrão de glicosilação original da imunoglobulina. “Alteração” significa a deleção de um ou mais sítios de glicosilação encontrados na imunoglobulina, e/ou a introdução de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes na imunoglobulina. A glicosilação de imunoglobulinas é tipicamente N-ligada. N-ligada refere-se à ligação da unidade de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina e asparagina-X-cisteína, em que X pode ser qualquer aminoácido, são as sequências de reconhecimento para o acoplamento enzimático da molécula de carboidrato à cadeia lateral da asparagina.

[025] Em um exemplo de realização a sequência de referência é a sequência SEQ ID NO: 02 a 06, ou a sequência SEQ ID NO: 01, ou a sequência SEQ ID NO: 11. Em outro exemplo de realização, a determinação e reversão é dos resíduos de treonina substituídos.

[026] A invenção é a seguir exemplificada com um anticorpo anti- IL13Rα1 e um anticorpo anti-OX40L. As sequências de aminoácidos correspondentes e os métodos de produção estão descritos nos documentos WO 2006/072564 e WO 2006/029879 (que são incorporados ao presente pela referência). Estes anticorpos são utilizados apenas para ilustrar os aspectos conforme divulgado no presente e não constituem qualquer limitação. O escopo da invenção é estabelecido no conjunto de reivindicações anexas.

[027] O anticorpo anti-IL13Rα1 é a seguir denominado como anticorpo parental e tem uma sequência de aminoácidos da quarta região estrutural da cadeia pesada WGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 09). A comparação com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 01 e SEQ ID NO: 11 é mostrada abaixo.11 0xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01), ouxxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) atéWGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 09)

[028] Pode ser observado que uma diferença entre as sequências de aminoácidos é um resíduo de isoleucina na oitava posição da SEQ ID NO: 09 em vez do resíduo de treonina na SEQ ID NO: 01 ou SEQ ID NO: 11. Portanto, um anticorpo variante foi produzido em que o resíduo isoleucina é revertido de volta para um resíduo de treonina.

[029] Enquanto o anticorpo parental mostra níveis elevados de formação de agregados, o anticorpo variante revertido tem uma tendência claramente reduzida de formar agregados. Na Figura 1 são exibidas as relações de aumento de tamanho (nm/h) de agregados do anticorpo parental anti-IL13Rα1 em uma concentração de anticorpo de 30 mg/ml a 50°C e em forças iônicas variantes. Também são mostradas na Figura 1 as relações obtidas com um anticorpo anti-IL13Rα1 variante, no qual o resíduo isoleucina na posição de aminoácido 115 (correspondente à posição 8 na SEQ ID NO: 01, 11 e 09) na sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada foi revertida para treonina como uma diferença única e exclusiva em relação ao anticorpo parental anti-IL13Rα1. A mutação de reversão reduz a relação de aumento de tamanho dos agregados em todos as forças iônicas examinadas.

[030] Na Figura 2 são exibidos cromatogramas analíticos da cromatografia de exclusão por tamanho de duas amostras armazenadas durante 9 semanas a 40°C na mesma formulação. Os respectivos dados estão listados na Tabela 1 abaixo.TABELA 1DADOS ANALÍTICOS DE AMOSTRAS ARMAZENADAS DURANTE 9 SEMANAS A 40°C.

[031] Pode se observar que a tendência de formar agregados do anticorpo variante revertido é reduzida em mais de 50% em comparação com o anticorpo parental.

[032] Na Figura 3 é mostrado o gráfico de Kyte-Doolittle dos resíduos de 1-130 da cadeia pesada com uma análise ou janela de cálculo de médias de 9 resíduos do anticorpo parental anti-IL13Rα1. Na região da quarta região de estrutura o gráfico mostra os mais altos valores de hidrofobicidade para toda a cadeia pesada. Na Figura 4 é mostrado um gráfico de Kyte-Doolittle da cadeia pesada do anticorpo variante anti-IL13Rα1. Pode ser observado que os valores de hidrofobicidade da quarta região de estrutura estão distintamente reduzidos no anticorpo variante revertido.

[033] Na Figura 5 é mostrado o gráfico de Kyte-Doolittle dos resíduos 1 a 130 da cadeia pesada com uma análise ou janela de cálculo de médias de 9 resíduos de um anticorpo anti-OX40L. Pode ser visto que também neste caso que o valor mais elevado de hidrofobicidade está na quarta região de estrutura da cadeia pesada. Pela análise da sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada uma troca de aminoácidos pode ser determinada conforme mostrado abaixo.11 0xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01), ouxxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11), ouWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02) atéWGQGALVTVSS (SEQ ID NO: 10).

[034] A reversão desta alteração de um único aminoácido de volta para o resíduo de treonina que ocorre naturalmente na linha germinativa reduz a hidrofobicidade do anticorpo conforme mostrado no gráfico de Kyte-Doolittle na Figura 6.

[035] Os exemplos, listagem de sequências e figuras a seguir são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, o verdadeiro escopo é estabelecido nas reivindicações anexas. Deve-se compreender que modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos sem se afastar do espírito da presente invenção.

DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[036] SEQ ID NO: 01 xxxxTTxTxSS - Sequência de aminoácidos de referência.

[037] SEQ ID NO: 02 WGQGTLVTVSS - Sequência de aminoácidos parcial do elemento FR4/J da linhagem germinativa.

[038] SEQ ID NO: 03 WGRGTLVTVSS - Sequência de aminoácidos parcial do elemento FR4/J da linhagem germinativa.

[039] SEQ ID NO: 04 WGQGTMVTVSS - Sequência de aminoácidos parcial do elemento FR4/J da linhagem germinativa.

[040] SEQ ID NO: 05 WGQGTTVTVSS - Sequência de aminoácidos parcial do elemento FR4/J da linhagem germinativa.

[041] SEQ ID NO: 06 WGKGTTVTVSS - Sequência de aminoácidos parcial do elemento FR4/J da linhagem germinativa.

[042] SEQ ID NO: 07 Sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada da IgG1 humana.

[043] SEQ ID NO: 07 Sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada da IgG4 humana.

[044] SEQ ID NO: 09 WGQGTLVIVSS - Sequência de aminoácidos de um anticorpo anti-IL13Rα1.

[045] SEQ ID NO: 10 WGQGALVTVSS - Sequência de aminoácidos de um anticorpo anti-OX40L.

[046] SEQ ID NO: 11 xxxxTxxTxxx - Sequência de aminoácidos de referência.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[047] Figura 1: Aumento da relação tamanho de partícula por unidade de tempo em uma solução de 30 mg/ml de anticorpo anti-IL13Rα1 (a) e anticorpo variante revertido (b) ambos em tampão histidina 20 mM, pH 6, com 0,140 e 500 mM de NaCI a 50°C, determinado por dispersão dinâmica de luz.

[048] Figura 2: Cromatogramas analíticos a partir da cromatografia de exclusão por tamanho de duas soluções de 30 mg/mL de anticorpo 30 anti-IL13Rα1 e da forma revertida, ambos na presença de 500 mM de NaCI durante 15 horas a 10°C.

[049] Figura 3: Gráfico de Kyte-Doolittle dos resíduos 1 a 130 da cadeia pesada com uma janeIa de anáIise de 9 resíduos do anticorpo parentaI anti-IL13Rα1.

[050] Figura 4: Gráfico de Kyte-DooIittIe dos resíduos 1 a 130 da cadeia pesada com uma janeIa de anáIise de 9 resíduos do anticorpo variante anti-IL13Rα1.

[051] Figura 5: Gráfico de Kyte-DooIittIe dos resíduos 1 a 130 da cadeia pesada com uma janeIa de anáIise de 9 resíduos do anticorpo parentaI anti-OX40L.

[052] Figura 6: Gráfico de Kyte-DooIittIe dos resíduos 1 a 130 da cadeia pesada com uma janeIa de anáIise de 9 resíduos do anticorpo variante anti-OX40L.

MATERIAIS E MÉTODOS CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO ANALÍTICA

[053] O teor de espécies de aIto peso moIecuIar (HMWs), monômeros de anticorpos e espécies de baixo peso moIecuIar (LMWs) foi determinado por cromatografia de excIusão por tamanho anaIítica usando uma coIuna TSK 3000S WXL 7,8 x 300 mm (Tosoh, Stuttgart, AIemanha). Como eIuente foi utiIizada uma soIução tampão contendo 200 mM de KH2 PO4 e 250 mM de KCI, em pH 7,0 a uma veIocidade de fIuxo de 0,5 mI/min. Uma quantidade de 150 μg de proteína foi carregada para cada corrida. A detecção foi realizada peIa Ieitura a absorbância UV a 280 nm.

DISPERSÃO DINÂMICA DE LUZ (DLS)

[054] A DLS é uma técnica não invasiva para a medição do tamanho de partícula, tipicamente na faixa de tamanho de sub-mícrons. Na presente invenção o aparelho “Zetasizer Nano S” (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) com uma cuveta de quartzo de temperatura controlada (25°C) foi utilizado para o monitoramento de um intervalo de tamanho entre 1 nm e 6 μm. A intensidade de luz laser dispersa de volta foi detectada em um ângulo de 173°. A intensidade varia em uma taxa que é dependente da velocidade de difusão das partículas, que por sua vez é governada pelo tamanho de partícula. Portanto, os dados de tamanho de partículas podem ser gerados a partir de uma análise da flutuação na intensidade da luz dispersa (Dahneke, BE (ed), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983); Pecora, R., Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press (1985)). A distribuição de tamanho pela intensidade foi calculada usando o modo “multiple narrow” do software DTS (Malvern).

EXEMPLO 1 PRODUÇÃO DE ANTICORPO VARIANTE ANTI-IL13RA1

[055] Os genes que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo anti-IL13Rα1 foram separadamente montados em vetores de expressão de células de mamíferos. Desse modo os segmentos de genes que codificam a região variável da cadeia leve (VL) e a região constante da cadeia leve K (CL) do anticorpo anti-IL13Rα1 foram unidos, assim como os segmentos de genes para a região variável da cadeia pesada (VH) e a região constante da cadeia pesada Y1 humana (CH1-Dobradiça-CH2-CH3) do anticorpo anti-IL13Rα1. Informações gerais sobre as sequências de nucleotídeos das cadeias leve e pesada humanas na utilização preferencial de códon (codon usage) são dadas em: E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., e Foeller, C. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Ed., Publicação no NIH N° 91-3242 (1991). A unidade de transcrição da cadeia leve K do anticorpo anti-IL13Rα1 é composta pelos seguintes elementos:- o facilitador (enhancer) e promotor do antígeno precoce imediato do citomegalovírus humano (HCMV),- um 5'-UT sintética incluindo uma sequência de Kozak,- uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina, incluindo o íntron da sequência sinal,- o cDNA da cadeia leve do anticorpo variável anti-IL13Rα1 clonado arranjado com um sítio de restrição único Bsml na extremidade 5’ e um sítio doador de splicing e um sítio de restrição único Notl na extremidade 3’,- a região constante do gene k humano genômico, incluindo o íntron 2 do facilitador (enhancer) da Ig-k de camundongo (Picard, D., e Schaffner, W., Nature 307 (1984) 80-82), e- a sequência sinal de poliadenilação (“poli A”) da k de imunoglobulina humana.

[056] A unidade de transcrição da cadeia pesada Y1 do anticorpo anti-IL13Rα1 é composta pelos seguintes elementos:- o facilitador (enhancer) e promotor do antígeno precoce imediato do citomegalovírus humano (HCMV),- uma 5'-UT sintética incluindo uma sequência de Kozak,- uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina modificada, incluindo o íntron da sequência sinal,- o cDNA da cadeia pesada do anticorpo variável anti-IL13Rα1 clonado arranjado com um sítio de restrição único Bsml na 5’ e um sítio doador de splicing e um sítio de restrição único Notl na extremidade 3’,- a região constante do gene da cadeia pesada Y1humano genômico, incluindo o facilitador (enhancer)-μ da Ig de camundongo (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378),- a sequência sinal de poliadenilação (“poli A”) da Y1de imunoglobulina humana.

[057] Além dos cassetes de expressão da cadeia leve-K ou cadeia pesada—Yl do anticorpo anti-IL13Rα1 estes plasmídeos contêm:- um gene de resistência à higromicina,- uma origem de replicação, oriP, do vírus Epstein-Barr (EBV),- uma origem de replicação do vetor pUC18 que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli, e- um gene β-lactamase que confere resistência a ampicilina em E. coli.

[058] Um plasmídeo de expressão que codifica a cadeia pesada-Y1 do anticorpo variante anti-IL13Rα1 foi criado por mutagênese sítio-dirigida dos plasmídeos de expressão dos anticorpos parentais utilizando o kit de mutagênese sítio-dirigida “QuickChangeTM” (Stratagene). Os aminoácidos são numerados de acordo com a numeração EU (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K.S., e Foeller, C., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Ed., Publicação NIH 91-3242).

[059] Um clone CHO estavelmente transfectado produz o anticorpo variante anti-IL13Rα1 a 130 mg/litro. O processamento downstream foi realizado empregando três etapas cromatográficas sequenciais: cromatografia em proteína A, cromatografia de troca catiônica e cromatografia de troca aniônica.

EXEMPLO 2 DETERMINAÇÃO DA TAXA DE AUMENTO DO TAMANHO DOS AGREGADOS PELA DISPERSÃO DINÂMICA DE LUZ

[060] A fim de acompanhar a agregação ao longo do tempo, medições da dispersão dinâmica de luz (DLS) foram realizadas a intervalos de tempo regulares. Elevadas concentrações de sal estabilizam interações hidrofóbicas, portanto espera-se que a agregação relacionada com a hidrofobicidade seja mais acentuada em concentrações salinas elevadas. A mudança da média de tamanho de partícula (raio Z-médio) foi monitorada como uma métrica para a agregação de proteína (Figura 1). As amostras foram dialisadas em tampão contendo quantidades variadas de NaCl (20 mM de His/His-HCl em pH 6,0 + 0/140/500 mM de NaCl) a uma concentração proteica de 30 mg/ml. As medições DLS foram realizados em um leitor de placas DynaPro Wyatt em placas de micro titulação de 394 poços, a uma temperatura de 50°C.

EXEMPLO 3 TESTANDO A ESTABILIDADE DO ANTICORPO VARIANTEANTi-IL13Rα1

[061] A indução de compostos de alto peso molecular (HMWs) foi realizada pela diálise de amostras em 20 mM de His/His-HCl a pH 6,0, contendo 0 ou 500 mM de NaCl, seguido pela incubação a 10°C durante 15 h. A formação de HMWs em comparação com as amostras não tratadas foi monitorada por SEC-HPLC (Figura 2).

Claims

1. MÉTODO PARA FORNECER UMA SEQUÊNCIA DEÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UMA IMUNOGLOBULINA, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) alinhamento da sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura (framework) da cadeia pesada de uma imunoglobulina com a sequência de referência xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) para atingir nível máximo de identidade da sequência de aminoácidos;(b) identificação das posições de aminoácidos alinhadas com resíduos de aminoácidos pequenos hidrofóbicos ou apolares na posição 5 e/ou 8 na quarta região de estrutura da cadeia pesada;(c) modificação da imunoglobulina pela substituição de um resíduo de aminoácido na quarta região de estrutura da cadeia pesada em uma posição identificada em (b), que é treonina na sequência de referência, e que não é treonina na quarta região de estrutura da cadeia pesada, pelo respectivo resíduo de treonina como na sequência de referência;(d) fornecimento de uma sequência de ácido nucleico que codifica a imunoglobulina.

2. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA IMUNOGLOBULINA,caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) alinhamento da sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura (framework) da cadeia pesada da imunoglobulina com a sequência de referência xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) para atingir nível máximo de identidade da sequência de aminoácidos;(b) identificação das posições de aminoácidos alinhadas com resíduos de aminoácidos pequenos hidrofóbicos ou apolares na posição 5 e/ou 8 na quarta região de estrutura da cadeia pesada;(c) modificação da imunoglobulina pela substituição de um resíduo de aminoácido na quarta região de estrutura da cadeia pesada em uma posição identificada em (b), que é treonina na sequência de referência, e que não é treonina na quarta região de estrutura da cadeia pesada, pelo respectivo resíduo de treonina como na sequência de referência;(d) fornecimento de uma sequência de ácido nucleico que codifica a imunoglobulina;(e) cultivo de uma célula de mamífero compreendendo o ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada da imunoglobulina modificada e um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos da cadeia leve correspondente para a expressão da cadeia pesada e leve de imunoglobulina;(f) recuperação da imunoglobulina a partir da célula de mamífero ou do meio de cultura e, desse modo, produzindo uma imunoglobulina.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de referência é a sequência WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02), ou a sequência WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 03), ou a sequência WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 04), ou a sequência WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 05), ou a sequência WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 06).

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 3, caracterizado pelo fato de que o método compreende como primeira etapa:fornecimento ou determinação da sequência de aminoácidos da quarta região de estrutura da cadeia pesada de imunoglobulina.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 4, caracterizado pelo fato de que a imunoglobulina é uma imunoglobulina humana ou humanizada.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 5, caracterizado pelo fato de que a imunoglobulina é uma imunoglobulina quimérica, ou imunoglobulina com uma CDR enxertada, ou uma imunoglobulina depletada de epítopo de célula T, ou variantes destes.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações3 a 6, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula CHO ou uma célula HEK.