KR20120096040A - 서열 의존 응집 - Google Patents

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KR20120096040A
KR20120096040A KR1020127016347A KR20127016347A KR20120096040A KR 20120096040 A KR20120096040 A KR 20120096040A KR 1020127016347 A KR1020127016347 A KR 1020127016347A KR 20127016347 A KR20127016347 A KR 20127016347A KR 20120096040 A KR20120096040 A KR 20120096040A
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본원에서 하기 단계를 포함하는 용액 중 면역글로불린의 응집 감소 방법이 보고된다: i) 항체의 중쇄의 제 4 골격부 영역의 아미노산 서열과 기준 또는 생식계열 서열을 비교하고, 하나 이상의 트레오닌 잔기 및/또는 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되어 있는지 여부를 측정하는 단계, 및 ii) 교환된 트레오닌 잔기 및/또는 세린 잔기를 다시 기준 또는 생식계열 서열의 트레오닌 또는 세린으로 복귀시킴으로써 면역글로불린의 아미노산 서열을 개질하여, 그리하여 용액 내 면역글로불린의 응집을 감소시키는 단계.

Description

서열 의존 응집 {SEQUENCE DEPENDENT AGGREGATION}
본원에서는 면역글로불린 중쇄의 제 4 골격부 (framework) 영역, 즉 J-요소 내 1 또는 2 개의 돌연변이(들)를 친수성 또는 천연 생식계열 (germline) 아미노산 잔기로 복귀 (revert) 시킴으로써 농축 용액 중 면역글로불린 응집을 감소시키는 방법을 보고한다.
분자량 및 제 2 개질을 비롯한 도메인 구조와 같은 화학적 및 물리적 특성으로 인해, 면역글로불린의 다운스트림 프로세싱은 매우 복잡하다. 제형화 약물에서뿐 아니라 다운스트림 프로세싱 (DSP) 내 중간체에 있어서 농축된 면역글로불린 용액은 경제적으로 취급 및 적용 보관되도록 저 체적이 요구된다.
또한 면역글로불린의 최종 제형물은 고농축된 용액을 요구한다. 예를 들어, 피하 적용을 위해서는 100　mg/ml 초과, 즉 약 150 mg/ml 의 면역글로불린 농도가 요구된다. 그러나, 적어도 일부 면역글로불린은 비생리학적으로 (unphysiologically) 고농도인 100　mg/ml 이상에서 응집되는 경향이 있다.
WO 2009/000098 에서, 단쇄 항체의 최적화 및 공학을 바탕으로 한 서열을 보고하였다.
본 발명의 개요
본원에서, 농축 용액 내 면역글로불린 응집의 감소 방법을 보고한다. 면역글로불린 중쇄의 제 4 골격부 영역 내 2 개, 심지어는 단일의 복귀 돌연변이가 응집물 형성을 감소시킬 수 있어 응집물 함량이 감소된 복귀 면역글로불린 변이체 고농축 용액의 제공이 가능해질 수 있다는 점이 발견되었다. 따라서, 본원에서 각 양태로서, 용액 내 면역글로불린의 응집 감소 방법, 면역글로불린의 개질 방법, 면역글로불린의 제조 방법 및 면역글로불린의 인간화 방법이 보고된다.
본원에서 보고된 모든 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 최대 수준의 아미노산 서열 상동성을 달성하도록, 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역의 아미노산 서열을 기준 아미노산 서열과 나란히 정렬시키는 단계,
b) 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열 및 기준 아미노산 서열에서 상이한 아미노산 잔기를 갖는 정렬된 아미노산 서열 위치를 동정하는 단계,
c) b) 에서 동정된 위치에서 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열 내 하나의 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를, 기준 아미노산 서열 내에 존재하는 각 트레오닌 또는 세린 잔기로 치환함으로써 면역글로불린 아미노산 서열을 개질하는 단계로서, 이때 치환된 위치에서의 아미노산 잔기는 기준 아미노산 서열에서는 트레오닌 또는 세린이고, 상기 아미노산 잔기는 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 잔기에서는 트레오닌 및 세린이 아닌 단계,
d) 임의로, 개질된 면역글로불린 아미노산 서열을 인코딩하는 (encoding) 핵산 서열을 제공하는 단계.
한 구현예에서는, 오로지 트레오닌 잔기의 차이만을 측정하여 변경한다. 또 다른 구현예에서, 면역글로불린의 제 4 골격부 영역에 대한 기준 아미노산 서열은 아미노산 서열 xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) 로, 이때 x 는 트레오닌 및 세린을 제외한 임의의 아미노산 잔기를 의미한다. 추가 구현예에서, 기준 아미노산 서열은, 아미노산 서열 xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) 로, 이때 위치 1, 2, 3, 4, 7 및 9 에서의 x 는 트레오닌 및 세린을 제외한 임의의 아미노산 잔기를, 위치 6 에서의 x 는 트레오닌을, 위치 10 및 11 에서의 x 는 세린을 의미하며, 면역글로불린 중쇄의 제 4 골격부 영역의 아미노산 서열에 대한 기준 아미노산 서열 내 위치 5 및/또는 8 에서의 트레오닌 잔기의 차이가 단계 b) 에서 동정되어 단계 c) 에서 개질된다. 한 구현예에서, 기준 아미노산 서열은 인간 생식계열 아미노산 서열이다. 본원에서 보고된 바 모든 측면의 한 구현예에서, 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 최대 수준의 아미노산 서열 상동성을 달성하도록, 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역의 아미노산 서열을, 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02), 또는 아미노산 서열 WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 03), 또는 아미노산 서열 WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 04), 또는 아미노산 서열 WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 05), 또는 아미노산 서열 WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 06) 과 나란히 정렬시키는 단계;
b) 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열 및 기준 아미노산 서열에서 상이한 아미노산 잔기를 갖는 정렬된 아미노산 위치를 동정하는 단계,
c) b) 에서 동정된 위치에서 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열 내 아미노산 잔기를 기준 아미노산 서열에 존재하는 각 트레오닌 또는 세린 잔기로 치환함으로써 면역글로불린을 개질하는 단계로서, 이때 상기 위치에서의 아미노산 잔기는 기준 아미노산 서열에서는 트레오닌 또는 세린이고, 상기 위치에서 아미노산 잔기는 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열에서는 트레오닌 및 세린이 아닌 단계,
d) 임의로, 개질된 면역글로불린 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계.
본원에서 보고된 바 측면의 한 구현예에서, 상기 방법은 제 1 단계로서, 면역글로불린 중쇄의 제 4 골격부 영역의 아미노산 서열을 제공 또는 결정하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 기준 서열은 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02) 이다. 또 다른 구현예에서, 기준 아미노산 서열은 xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) 이다. 한 구현예에서, 기준 아미노산 서열의 위치 5 및/또는 8 에서 트레오닌 잔기의 차이가 측정된다. 한 구현예에서, 오로지 트레오닌 잔기의 차이만이 측정 및 변경된다.
본원에서 보고된 바 한 측면에서, 방법은 하기 단계를 포함하는 면역글로불린의 제조 방법이다:
a) 최대 수준의 아미노산 서열 상동성을 달성하도록, 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역의 아미노산 서열을, 기준 아미노산 서열 xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) 또는 xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) 과 나란히 정렬시키는 단계,
b) 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열 및 기준 아미노산 서열 내 5 및/또는 6 및/또는 8 및/또는 10 및/또는 11 위치에서, 상이한 아미노산 잔기를 갖는 정렬된 아미노산 서열 위치를 동정하는 단계,
c) b) 에서 동정된 위치에서 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열 내 아미노산 잔기를 기준 아미노산 서열에서와 같은 각 트레오닌 또는 세린 잔기로 치환함으로써 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열을 개질하는 단계로서, 이때 상기 위치에서의 아미노산 잔기는 기준 아미노산 서열에서는 트레오닌 또는 세린이고, 상기 위치에서의 아미노산 잔기는 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열에서는 트레오닌 및 세린이 아닌 단계,
d) 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 발현을 위해 상기 개질된 면역글로불린 중쇄 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 및 상응하는 경쇄 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계,
e) 상기 포유동물 세포 또는 배양 배지로부터 면역글로불린을 회수하고 이로써 면역글로불린을 제조하는 단계.
한 구현예에서, 기준 아미노산 서열은 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02), 또는 아미노산 서열 WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 03), 또는 아미노산 서열 WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 04), 또는 아미노산 서열 WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 05), 또는 아미노산 서열 WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 06) 이다. 한 구현예에서, 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열을 개질하는 단계는, 기준 아미노산 서열에서는 트레오닌이고, 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열에서는 트레오닌이 아닌, b) 에서 동정된 위치에서의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열 내 아미노산 잔기를 기준 아미노산 서열내 존재하는 각 트레오닌 잔기로 치환하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 개질은 동정된 적어도 한 위치에서 일어난다. 한 구현예에서, 기준 아미노산 서열은 아미노산 서열 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02) 이다. 한 구현예에서, 면역글로불린은 인간 또는 인간화 면역글로불린이다. 또 다른 구현예에서, 포유동물 세포는 CHO 세포 또는 HEK 세포이다. 또 다른 구현예에서, 기준 아미노산 서열의 위치 5 및/또는 8 에서의 트레오닌 잔기의 차이가 측정된다.
본원에서 보고된 바 또 다른 측면은, 하기 단계를 포함하는 면역글로불린을 인간화하는 방법이다:
a) 최대 수준의 아미노산 서열 상동성을 달성하도록, 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역의 아미노산 서열을, 기준 아미노산 서열 xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) 또는 xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) 과 나란히 정렬시키는 단계,
b) 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열 및 기준 아미노산 서열 내 상이한 아미노산 잔기를 갖는 정렬된 아미노산 서열 위치를 동정하는 단계,
c) 기준 서열 내에서와 같은 각 트레오닌 또는 세린 잔기로, b) 에서 동정된 위치에서 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열 내 아미노산 잔기를 치환함으로써 면역글로불린을 인간화하는 단계로서, 이때 상기 위치에서의 아미노산 잔기는 기준 아미노산 서열에서는 트레오닌 또는 세린이고, 상기 위치에서 아미노산 잔기는 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역 아미노산 서열에서는 트레오닌 및 세린이 아닌 단계,
d) 임의로, 인간화 면역글로불린을 인코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계.
본 발명의 상세한 설명
제 4 면역글로불린 중쇄 골격부 영역의 아미노산 서열에서, 2 또는 심지어 단일의 트레오닌 및/또는 세린 아미노산 잔기의 소형 소수성 또는 무극성 아미노산 잔기, 예컨대 이소류신 또는 알라닌으로의 교환이, 면역글로불린의, 용액 내, 특히 고염 농도 및/또는 고 면역글로불린 농도를 갖는 용액 내 응집물 형성 경향을 증가시킨다는 점을 발견했다. 교환된 아미노산 잔기를 다시 천연 발생 트레오닌 및/또는 세린 잔기(들) 로 복귀시킴으로써, 용액 내, 특히 농축 용액 내 응집물 형성 경향을 뚜렷하게 감소시킨다.
한 구현예에서, 본원에서 보고된 방법은, 하기 단계를 포함하는 용액 내 면역글로불린의 응집을 감소시키는 방법이다:
- 면역글로불린의 중쇄의 제 4 골격부 영역 아미노산 서열 내 하나 이상의 트레오닌 및/또는 세린 잔기가 변경되어져 있는지 여부를, 상기 아미노산 서열과, 제 4 골격부 영역 아미노산 서열에 대한 기준 아미노산 서열과의 비교로써 측정하는 단계,
- 적어도 하나의 교환되어져 있는 트레오닌 및/또는 세린 잔기를 다시 기준 트레오닌 및/또는 세린 잔기로 개질하여 면역글로불린의 아미노산 서열을 복귀시켜, 용액 내 면역글로불린의 응집을 감소시키는 단계.
용어 "정렬" 이란, 최대 수준의 아미노산 서열 상동성 및 보존성을 달성하게 둘 이상의 아미노산 서열을 줄 세우는 프로세스를 나타낸다. 이는 상동 (homologous) 분자들 내 아미노산 또는 뉴클레오티드의 병렬을 비롯한, 분자 서열에 대한 위치적 상동성 측정을 포함한다. 그 결과, 비교되어진 서열들은 통계학적 유사성이 가장 큰 영역이 보여지는 형태로 제공된다.
기준 아미노산 서열에 대한 "최대 수준의 아미노산 서열 상동성" 이란, 서열을 정렬시키고 필요하다면 최고 퍼센트 서열 상동성을 달성하도록 갭을 도입한 후, 기준 아미노산 서열 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 아미노산 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로 정의되는데, 임의의 보존성 치환은 서열 상동성의 일부로서 여기지 않는다. 아미노산 서열 상동성을 측정하기 위한 정렬은 다양한 방식으로, 예를 들면 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 전장의 아미노산 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 아미노산 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 이를 위해, 본원에서는, 그러나 "%아미노산 서열 상동성" 값을, 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2 를 이용하여 만들어냈다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은, Genentech, Inc.에 의해 저술되어 있으며, 소스 코드는 U.S. Copyright Registration No. TXU510087 로 등록되어진 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559 에 사용자 문헌과 함께 제출된 바 있다. ALIGN-2 프로그램은 공공연하게 Genentech, Inc., South San Francisco, California 에서 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은, 디지탈 UNIX V4.0D 를 비롯한 UNIX 작동 시스템 상에서 사용되도록 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 세팅되고 변경하지 않는다.
ALIGN-2 가 아미노산 서열 비교에 활용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, B 와의, 또는 B 에 대항하는 주어진 아미노산 서열 A 의 % 아미노산 서열 상동성 (이는, 대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, B 와의, B 에 대항하는 특정 % 아미노산 서열 상동성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A 로서 표현될 수 있음) 은 하기와 같이 산출된다:
100 * 분수 X/Y
(식 중, X 는 A 및 B 의 프로그램 정렬에서, 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 개수이고, Y 는 B 에서 아미노산 잔기의 총 개수이다). 아미노산 서열 A 의 길이가 아미노산 서열 B 의 길이와 동일하지 않는 경우, B 에 대한 A 의 % 아미노산 서열 상동성은 A 에 대한 B 의 % 아미노산 서열 상동성과 동일하지 않을 것이라는 점은 이해될 것이다.
추가 측면에서, 본원에서 보고된 바 방법은 하기 단계를 포함하는 면역글로불린의 개질 방법이다:
- 면역글로불린의 중쇄의 제 4 골격부 영역 아미노산 서열 내 하나 이상의 트레오닌 및/또는 세린 잔기가 변경되어져 있는지 여부를, 상기 아미노산 서열을 제 4 골격부 영역 아미노산 서열에 대한 기준 아미노산 서열과 비교함으로써 측정하는 단계,
- 하나 이상의 교환되어져 있는 트레오닌 및/또는 세린 잔기를 다시 기준 트레오닌 및/또는 세린 잔기로 개질하여, 면역글로불린을 개질함으로써 면역글로불린의 아미노산 서열을 복귀하는 단계.
한 측면에서, 본원에서 보고된 방법은 하기 단계를 포함하는 면역글로불린의 인간화 방법이다:
- 키메라 면역글로불린의 중쇄의 제 4 골격부 영역의 아미노산 서열, CDR-그래프팅된 면역글로불린, T-세포 에피토프 감소 또는 결핍된 면역글로불린 또는 이의 변이체를, 제 4 골격부 영역에 대한 기준 아미노산 서열과 비교함으로써, 하나 이상의 트레오닌 및/또는 세린 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 대체되어져 있는지 여부를 측정하는 단계,
- 하나 이상의 교환되어져 있는 트레오닌 및/또는 세린 잔기를 다시 기준 아미노산 서열 내에서와 같은 트레오닌 및/또는 세린 잔기로 개질하여 면역글로불린의 아미노산 서열을 복귀하고, 이로써 면역글로불린을 인간화하는 단계.
"제 4 골격부 영역 아미노산 서열" 이란, 면역글로불린의 중쇄의 제 4 골격부 영역의 아미노산 서열을 지칭한다. 이 아미노산 서열은 면역글로불린 중쇄의 상보성 결정 영역 3 (CDR 3) 에 대한 바로 C-말단의 아미노산 잔기로부터 시작하고, 중쇄 가변 도메인의 마지막 아미노산 잔기로 끝마친다. 한 구현예에서, 면역글로불린 중쇄의 CDR 3 의 아미노산 잔기는 Kabat 에 의해 측정된다.
용어 "키메라 면역글로불린" 이란, 제 1 종의 면역글로불린으로부터 유래된 아미노산 잔기 및 제 1 종과 동일하지 않은 제 2 종으로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함하는 면역글로불린을 지칭한다. 수용자 종이 인간인 경우, 키메라 면역글로불린은 "인간화 면역글로불린" 이다. 대부분의 경우, 인간화 면역글로불린은 인간 면역글로불린 (수용체 또는 수용자 면역글로불린) 으로부터 유래되며, 이때 Kabat 및/또는 Chothia 및/또는 기타 넘버링 시스템에 따라 측정된 하나 이상의 고가변성 영역(들)의 아미노산 서열이 비(非)인간 종 (공여체 면역글로불린) 의 고가변성 영역의 아미노산 서열로 변경된다. Kabat 및/또는 Chothia 및/또는 인간 수용자 면역글로불린의 기타 넘버링 시스템에 따른 전체 고가역성 영역이 비인간 공여체 면역글로불린의 상응하는 아미노산 잔기로 대체되어 있는 인간화 면역글로불린은, "CDR-그래프팅된 면역글로불린"으로서 지시된다. 비인간 공여체 면역글로불린의 예는, 원하는 특이성 및 관심 항원에 대한 친화성을 갖는 마우스, 래트, 토끼, 개, 햄스터, 양 또는 비인간 영장류 면역글로불린이다 (예를 들어, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US　5,202,238; US　5,204,244 참고). 일부 경우, 인간 면역글로불린의 골격부 영역 (FR) 은 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 나아가, 인간화 면역글로불린은 추가의 개질물, 예를 들어 수용자 면역글로불린에서 또는 공여체 면역글로불린에서 발견되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 개질으로 수용체 또는 공여자 면역글로불린의 변이체가 도모되며, 이는 상응하는 모체 서열과 상동성이 있으나, 똑같지는 않다. 인간화 면역글로불린은 임의로는 또한 적어도 면역글로불린 불변 영역 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다.
한 구현예에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린, 또는 CDR-그래프팅된 면역글로불린, 또는 T-세포 에피토프 감소 또는 결핍된 면역글로불린 또는 이의 변이체이다. 한 구현예에서, 면역글로불린은 인간 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 포함한다. 추가 구현예에서, 인간 불변 영역은 IgG1 서브클래스, 또는 IgG4 서브클래스, 또는 IgG2 서브클래스, 또는 IgG3 서브클래스의 것이거나, 또는 SEQ ID NO: 07, 또는 SEQ ID NO: 08 이거나, 또는 이의 변이체이다.
한 구현예에서, 불변 영역은 하기 정의된 바와 같은 어떠한 Fcγ 수용체 (예,. FcγRIIIa) 결합 및/또는 어떠한 C1q 결합도 검출될 수 없는 방식으로 개질된다. 한 구현예에서, 불변 영역은 인간 불변 영역이고, 인간 IgG4 서브클래스이거나 또는 인간 IgG1 서브클래스로부터의 돌연변이화 Fc 부분이다. 또 다른 구현예에서, 불변 영역은 돌연변이 L234A 및 L235A (가변 도메인, 인간 IGG1 중쇄 아미노산 서열을 비롯한 전장에 따라 결정된 위치) 를 포함하는 인간 IgG1 서브클래스의 것이다. IgG4 는 감소된 Fcγ 수용체 (FcγRIIIa) 결합을 보이는 반면, 기타 IgG 서브클래스의 면역글로불린은 강한 결합을 보인다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물 소실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, 및/또는 His435 은, 변경시 또한 감소된 Fcγ 수용체 결합을 제공하는 잔기이다 (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP　0　307　434). 한 구현예에서, 불변 영역은 L234, L235, 및/또는 D265 돌연변이를 갖는, IgG4 서브클래스 또는 IgG1 또는 IgG2 서브클래스의 Fcγ 수용체 결합과 관련되며, 및/또는 PVA236 돌연변이를 포함한다. 한 구현예에서, 돌연변이는 S228P, L234A, L235A, L235E, 및/또는 PVA236 (PVA236 란, IgG1 의 아미노산 위치 233 내지 236 으로부터의 아미노산 서열 ELLG (1 자리수 문자 아미노산 코드로 나타냄) 또는 IgG4 의 EFLG 가 PVA 로 대체됨을 의미함) 이다. 추가 구현예에서, 돌연변이는 IgG4 의 S228P 및 IgG1 의 L234A 및 L235A 이다. 면역글로불린의 불변 영역은 ADCC (항체-의존 세포-매개 세포독성) 및 CDC (보체-의존 세포독성) 에 직접 관여한다. Fcγ 수용체 및/또는 보체 인자 C1q 와 결합하지 않는 면역글로불린은 항체-의존 세포 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존 세포독성 (CDC) 를 유도하지 않는다.
용어 "T-세포 에피토프 결핍된 면역글로불린" 이란, 인간 T 세포 에피토프 (MHC 부류 II 분자에 결합할 능력을 갖는 단백질 내의 펩티드 서열) 를 제거함으로써 면역원성을 제거 또는 감소시키도록 개질한 면역글로불린을 지칭한다. 이러한 방법에 의해, 펩티드의 아미노산 측쇄와 MHC 부류 II 결합 홈 (groove) 을 갖는 특이적 결합 포켓 간 상호작용이 동정된다. 동정된 면역원성 영역은 변경되어 면역원성이 제거된다. 이러한 방법이 일반적으로 예를 들면 WO 98/52976 또는 WO　98/08097 에 기재되어 있다.
용어 "이의 변이체"란, 보존성 서열 개질 또는 변경된 글리코실화 패턴을 포함하는 면역글로불린을 지칭한다. 용어 "보존성 서열 개질" 은, 아미노산 잔기가 유사 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것을 포함하는 아미노산 치환을 의미한다. 유사 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 무극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 를 갖는 아미노산을 포함한다. 면역글로불린의 변이체의 또다른 유형은 면역글로불린의 본래 글리코실화 패턴을 변경한다. 변경함으로써의 의미란, 면역글로불린 내에서 발견되는 하나 이상의 글리코실화 부위를 제거함 및/또는 면역글로불린 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입함이다. 면역글로불린의 글리코실화는 통상 N-연결된다. N-연결된이란, 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 부분이 부착함을 의미한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인 (여기서, X 는 임의의 아미노산임) 은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 부분의 효소적 부착의 인지 서열이다.
한 구현예에서, 기준 서열은 서열 SEQ ID NO: 02 내지 06, 또는 서열 SEQ ID NO: 01, 또는 서열 SEQ ID NO: 11 이다. 또 다른 구현예에서, 측정 및 복귀는 대체된 트레오닌 잔기의 것이다.
본 발명은 항-IL13Rα1 항체 및 항-OX40L 항체를 이용하여 예시한 하기 실시예에 있다. 상응하는 아미노산 서열 및 제조 방법은 WO　2006/072564 및 WO　2006/029879 (모두, 본원에서 참조 인용됨) 에 보고되어 있다. 이들 항체는 본원에 보고된 측면들을 예시하는데 사용되는 것이며 제한을 가하려고 하는 것은 아니다. 본 발명의 영역은 첨부된 청구항 세트에 기재된다.
항-IL13Rα1 항체는, 모 항체로서 하기에 나타내며, WGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 09) 의 제 4 중쇄 골격부 영역의 아미노산 서열을 갖는다. SEQ ID NO: 01 및 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 이용한 비교를 하기에 나타낸다.
Figure pct00001
아미노산 서열들 간 한 가지 차이점은 SEQ ID NO: 01 또는 SEQ ID NO: 11 내 트레오닌 잔기 대신에 SEQ ID NO: 09 의 8 번째 위치에서 이소류신 잔기인 점을 알 수 있다. 그리하여, 이소류신 잔기가 다시 트레오닌 잔기로 복귀된 변이체 항체가 제조되어졌다.
모체 항체가 고수준의 응집물 형성을 보이는 반면, 복귀된 변이체 항체는 분명히 응집물 형성 경향이 감소되었다. 도 1 에, 50　℃ 에서 30　mg/ml 의 항체 농도로, 모체 항-IL13Rα1 항체의 응집물의 크기 증가 속도 (nm/h) 및 다양한 이온 강도를 나타낸다. 또한 도 1 에는 제 4 골격부 영역의 중쇄 아미노산 서열에서 아미노산 위치 115 (SEQ ID NO: 01, 11 및 09 에서 8 번째 위치에 상응함) 에서 이소류신 잔기가 모체 항-IL13Rα1 항체와의 단일 및 단독 차이점으로서 트레오닌으로 복귀되어져 있는 변이체 항-IL13Rα1 항체로 수득된 속도를 나타낸다. 단일 복귀 돌연변이는 조사된 모든 이온 강도에서 응집물 크기 증가 속도를 감소시킨다.
도 2 에서, 동일한 제형으로 9 주 동안 40　℃ 에서 저장된 두 샘플의 분석학적 크기 배제 크로마토그램을 나타낸다. 각 데이타를 하기 표 1 에 열거한다.
9 주 동안 40℃ 에서 보관된 샘플의 분석 데이타
상대면적 단량체


[%]		 상대면적 저분자량 화합물 [%] 상대면적 고분자량 화합물[%] 상대 증가 HMWs

[%]
-80℃에서 보관된
모체 항-IL13Rα1 항체
(기준 값)		 98.6 0.04 1.4 -
9 주 동안 40℃에서 보관된 모체 항-IL13Rα1 항체 93.7 4.2 2.0 48.9
-80℃에서 보관된
변이체 항-IL13Rα1 항체 (기준값)		 97.3 0.1 2.5 -
9 주 동안 40℃에서
보관된 변이체 항-IL13Rα1 항체		 93.2 3.9 2.9 13.4
복귀된 변이체 항체의 응집물 형성 경향이 모체 항체와 비교시 50% 초과 감소된 점을 알 수 있다.
도 3 에, 모체 항-IL13Rα1 항체의 9 잔기의 평균 창 (averaging window) 또는 분석으로 중쇄 잔기 1 내지 130 의 Kyte-Doolittle 플롯 (plot) 을 나타낸다. 제 4 골격부 영역에서, 상기 플롯은 전체 중쇄에 대해 가장 큰 소수성 값을 보인다. 도 4 에, 변이체 항-IL13Rα1 항체의 중쇄의 Kyte-Doolittle 플롯을 나타낸다. 제 4 골격부 영역의 소수성 값은 복귀된 변이체 항체에서 뚜렷하게 감소된 점을 알 수 있다.
도 5 에, 항-OX40L 항체의 9 잔기의 분석/평균창으로 중쇄 잔기 1 내지 130 의 Kyte-Doolittle 플롯을 나타낸다. 이 경우에, 가장 큰 소수성 값이 제 4 중쇄 골격부 영역에 있다는 점 또한 알 수 있다. 제 4 중쇄 골격부 영역의 아미노산 서열을 분석함으로써, 아미노산 교환을 하기에 나타낸 바와 같이 결정할 수 있다.
Figure pct00002
상기 단일 아미노산 변경물을 다시 천연 발생 생식계열 트레오닌 잔기로의 복귀가 도 6 에서의 Kyte-Doolittle 플롯에서 나타낸 바와 같이 항체의 소수성을 감소시킨다.
본 발명의 이해를 돕고자 하기의 실시예, 서열 목록 및 도면을 제공하였는데, 이의 진정한 범위는 첨부된 청구항에 기재된다. 본 발명의 취지에 벗어나지 않고 기재된 절차에서 변경이 가능할 수 있다는 점은 이해된다.
서열 목록 기재
SEQ ID NO: 01 xxxxTTxTxSS - 기준 아미노산 서열
SEQ ID NO: 02 WGQGTLVTVSS - 부분 생식계열 FR4/J-요소 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 03 WGRGTLVTVSS - 부분 생식계열 FR4/J-요소 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 04 WGQGTMVTVSS - 부분 생식계열 FR4/J-요소 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 05 WGQGTTVTVSS - 부분 생식계열 FR4/J-요소 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 06 WGKGTTVTVSS - 부분 생식계열 FR4/J-요소 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 07 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 08 인간 IgG4 중쇄 불변 영역 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 09 WGQGTLVIVSS - 항-IL13Rα1 항체의 아미노산 서열
SEQ ID NO: 10 WGQGALVTVSS - 항-OX40L 항체의 아미노산 서열
SEQ ID NO: 11 xxxxTxxTxxx - 기준 아미노산 서열.
도면의 간단한 설명
도 1 동적 광 산란으로 측정된, 50　℃ 에서 0, 140 및 500 mM NaCl 와 함께 20　mM 히스티딘 버퍼, pH 6 중, 30　mg/ml 항-IL13Rα1 항체 (a) 및 복귀된 변이체 항체 (b) 의 용액 중 시간 단위 당 입자 크기 증가 속도.
도 2 10　℃ 에서 15 시간 동안 500 mM NaCl 의 존재 하에서 30　mg/ml 항-IL13Rα1 항체 및 이의 복귀 형태의 두 용액의 분석적 크기 배제 크로마토그램
도 3 모체 항-IL13Rα1 항체의 9 개 잔기의 분석창을 이용한 중쇄 잔기 1 내지 130 의 Kyte-Doolittle 플롯
도 4 변이체 항-IL13Rα1 항체의 9 개 잔기의 분석창을 이용한 중쇄 잔기 1 내지 130 의 Kyte-Doolittle 플롯
도 5 모체 항-OX40L 항체의 9 개 잔기의 분석창을 이용한 중쇄 잔기 1 내지 130 의 Kyte-Doolittle 플롯
도 6 변이체 항-OX40L 항체의 9 개 잔기의 분석창을 이용한 중쇄 잔기 1 내지 130 의 플롯.
재료 및 방법
분석적 크기 배제 크로마토그래피
고분자량 (HMW) 종, 항체 단량체 및 저분자량 (LMWs) 종의 함량을, TSK 3000S WXL 7.8 x 300 mm 컬럼 (Tosoh, Stuttgart, Germany) 을 이용하여 분석적 크기-배제 크로마토그래피로 측정하였다. 용리액으로서, 200 mM KH2PO4 및 250 mM KCl, pH 7.0 을 함유하는 버퍼 용액을 0.5 ml/min 의 유속으로 사용하였다. 150 ㎍ 의 단백질 양을 실시 (run) 마다 로딩하였다. 280 nm 에서 UV 흡수를 통해 검출을 달성했다.
동적 광 산란 (Dynamic light scattering; DLS)
DLS 는 입자 크기, 통상 1 미크론 미만의 크기 범위에서 입자 크기를 측정하기 위한 비절개식 (non-invasive) 기술이다. 현 발명에서, 온도 제어 석영 큐벳 (25　℃) 이 구비된 Zetasizer Nano S 기기 (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) 를, 1 nm 내지 6 ㎛ 크기 범위를 모니터링하기 위해 사용했다. 역 산란 (back scattered) 레이져 광의 강도를 173°의 각에서 검출하였다. 입자 확산 속도에 따르며, 결국 입자 크기에 좌우되는 속도로 강도는 변동을 거듭한다. 그리하여, 입자 크기 데이타를 산란 광 강도의 변동 분석으로 만들 수 있었다 (Dahneke, B.E. (ed), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983); Pecora, R., Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press (1985)). 강도에 의한 크기 분포를, 다중 협소 모드 (multiple narrow mode) 의 DTS 소프트웨어 (Malvern) 를 이용하여 산출하였다.
실시예 1
변이체 항-IL13Rα1 항체의 제조
항-IL13Rα1 항체 경쇄 및 중쇄 인코딩 유전자를 따로따로 포유동물 세포 발현 벡터에 어셈블링하였다. 이로써, 항-IL13Rα1 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 인간 k-경쇄 불변 영역 (CL) 을 인코딩하는 유전자 분절들을, 항-IL13Rα1 항체 중쇄 가변 영역 (VH) 및 인간 g1-중쇄 불변 영역에 대한 유전자 분절처럼 연결하였다 (CH1-Hinge-CH2-CH3). 코돈 용도 (codon usage) 가 제공되어진 인간 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전학적 정보가 하기에 제공된다: Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., 및 Foeller, C. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No. 91-3242 (1991). 항-IL13Rα1 항체 k-경쇄의 전사 단위는 하기 요소로 구성된다:
* 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 로부터의 전 초기 인핸서 (immediate early enhancer) 및 프로모터,
* Kozak 서열을 포함한 합성 5'-UT,
* 시그널 서열 인트론을 포함한 쥣과동물 면역글로불린 중쇄 시그널 서열,
* 5' 말단에서 독특한 BsmI 제한 부위 및 스플라이스 공여체 부위 및 3' 말단에서 독특한 NotI 제한 부위로 배열된 클로닝된 항-IL13Rα1 항체 가변 경쇄 cDNA,
* 인트론 2 마우스 Ig-κ 인핸서를 포함한, 게놈 인간 κ-유전자 불변 영역 (Picard, D., 및 Schaffner, W., Nature 307 (1984) 80-82), 및
* 인간 면역글로불린 κ-폴리아데닐화 ("폴리 A")시그널 서열.
항-IL13Rα1 항체 γ1-중쇄의 전사 단위는 하기 요소로 이루어진다:
* 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
* Kozak 서열을 포함한 합성 5'-UT,
* 시그널 서열 인트론을 포함한 개질된 쥣과동물 면역글로불린 중쇄 시그널 서열,
* 5' 말단에서 독특한 BsmI 제한 부위 및 스플라이스 공여체 부위 및 3' 말단에서 독특한 NotI 제한 부위로 배열된 클로닝된 항-IL13Rα1 항체 가변 중쇄 cDNA,
* 마우스 Ig μ-인핸서를 포함한, 게놈 인간 γ1-중쇄 불변 영역 (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378),
* 인간 γ1-면역글로불린 폴리아데닐화 ("폴리 A") 시그널 서열.
항-IL13Rα1 항체 κ-경쇄 또는 γ1-중쇄 발현 카세트를 제외하고, 이들 플라스미드는 하기를 포함한다:
* 히그로마이신 저항 유전자,
* Epstein-Barr 바이러스 (EBV) 의 복제 기원, oriP,
* E.coli 내 상기 플라스미드의 복제를 가능하게하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및
* E.coli 내 앰피실린 저항을 부여하는 β-락타마아제 유전자.
변이체 항-IL13Rα1 항체 γ1-중쇄를 인코딩하는 발현 플라스미드를, QuickChangeTM 부위-특이적 돌연변이 유발 (site directed mutagenesis) 키트 (Stratagene) 를 이용해, 모체 항체 발현 플라스미드의 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 제조하였다. 아미노산을 EU 넘버링에 따라 넘버링한다 (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., 및 Foeller, C., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No. 91-3242).
안정적으로 트랜스펙션된 CHO 클론은 변이체 항-IL13Rα1 항체를 130 mg/l 로 제조한다. 다운스트림 프로세싱을, 3 가지 연속적인 크로마토그래피 단계를 이용함으로써 실시하였다: 단백질 A 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피.
실시예 2
동적 광 산란을 통한 응집물 크기 증가의 속도 측정
시간 경과에 따른 응집 과정을 추적하기 위해, 동적 광 산란 (DLS) 측정을 규칙적인 시간 간격으로 수행하였다. 고염 농도는 소수성 상호작용을 안정화시킨다; 그리하여 소수성-관련 응집이 고염 농도에서 더 두드러질 것으로 예상된다. 평균 입자 크기 (Z-평균 반경) 의 변화를 단백질 응집물에 대한 측정치로서 모니터링하였다 (도 1). 30 mg/ml 의 단백질 농도에서 각종 양의 NaCl (20 mM His/His-HCl, pH 6.0 + 0/140/500 mM NaCl) 을 함유하는 버퍼 중에서 샘플을 투석하였다. DLS 측정을 50　℃ 의 온도에서 394-웰 마이크로 타이터 플레이트에서 Wyatt DynaPro 플레이트 판독기 상에서 실시하였다.
실시예 3
변이체 항-IL13Rα1 항체의 안정성 테스트
0 또는 500 mM NaCl 함유하는 20 mM His/His-HCl, pH 6.0 에 샘플을 투석한 후, 10　℃ 에서 15 시간 동안 인큐베이션함으로써 고분자량 화합물 (HMW) 의 도입을 수행하였다. 미처리된 샘플과 비교된 HMW 의 형성을 SEC HPLC 에 의해 모니터링하였다 (도 2).
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Sequence dependent aggregation <130> 26504 WO <150> EP09015832.0 <151> 2009-12-22 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reference amino acid sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Xaa denotes any amino acid residue except serine and threonine <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Xaa Thr Xaa Ser Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 8 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized anti IL13Ra1 antibody FR4 region <400> 9 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized anti OX40L antibody FR4 region <400> 10 Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reference amino acid sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> Xaa denotes any amino acid residue except serine and threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa denotes threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa denotes any amino acid residue except serine and threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa denotes any amino acid residue except serine and threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(11) <223> Xaa denotes serine <400> 11 Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa 1 5 10

Claims (11)

  1. 하기 단계를 포함하는 면역글로불린을 인코딩하는 핵산 서열을 제공하는 방법:
    a) 최대 수준의 아미노산 서열 상동성을 달성하도록, 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역의 아미노산 서열을 기준 서열 xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) 또는 xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) 과 나란히 정렬시키는 단계,
    b) 제 4 중쇄 골격부 영역 및 기준 서열에서 상이한 아미노산 잔기를 갖는 정렬된 아미노산 위치를 동정하는 단계,
    c) 기준 서열에서는 트레오닌 또는 세린이며, 제 4 중쇄 골격부 영역에서는 트레오닌 및 세린이 아닌 b) 에서 동정된 위치에서 제 4 중쇄 골격부 영역 내 아미노산 잔기를 기준 서열 내에서와 같은 각 트레오닌 또는 세린 잔기로 치환함으로써 면역글로불린을 개질하는 단계,
    d) 상기 면역글로불린을 인코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계.
  2. 하기 단계를 포함하는 면역글로불린을 인간화하는 방법:
    a) 최대 수준의 아미노산 서열 상동성을 달성하도록, 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역의 아미노산 서열을 기준 서열 xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) 또는 xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) 과 나란히 정렬시키는 단계,
    b) 제 4 중쇄 골격부 영역 및 기준 서열에서 상이한 아미노산 잔기를 갖는 정렬된 아미노산 위치를 동정하는 단계,
    c) 기준 서열에서는 트레오닌 또는 세린이고, 제 4 중쇄 골격부 영역에서는 트레오닌 및 세린이 아닌 b) 에서 동정된 위치에서 제 4 중쇄 골격부 영역 내 아미노산 잔기를 기준 서열 내에서와 같은 각 트레오닌 또는 세린 잔기로 치환함으로써 면역글로불린을 인간화하는 단계,
    d) 임의로는, 인간화 면역글로불린을 인코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계.
  3. 하기 단계를 포함하는 면역글로불린을 제조하는 방법:
    a) 최대 수준의 아미노산 서열 상동성을 달성하도록, 면역글로불린의 제 4 중쇄 골격부 영역의 아미노산 서열을 기준 서열 xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) 또는 xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) 과 나란히 정렬시키는 단계,
    b) 제 4 중쇄 골격부 영역 및 기준 서열에서 상이한 아미노산 잔기를 갖는 정렬된 아미노산 위치를 동정하는 단계,
    c) 기준 서열에서는 트레오닌 또는 세린이고, 제 4 중쇄 골격부 영역에서는 트레오닌 및 세린이 아닌 b) 에서 동정된 위치에서 제 4 중쇄 골격부 영역 내 아미노산 잔기를 기준 서열 내에서와 같은 각 트레오닌 또는 세린으로 치환함으로써 면역글로불린을 개질하는 단계,
    d) 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 발현을 위해 개질된 면역글로불린 중쇄 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 및 상응하는 경쇄 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계,
    e) 포유동물 세포 또는 배양 배지로부터 면역글로불린을 회수하고 이로써 면역글로불린을 제조하는 단계.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 아미노산 서열이 xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) 인 점을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 동정 및 개질이 기준 아미노산 서열의 위치 5 및/또는 8 에서 트레오닌 아미노산 잔기에 대한 것인 점을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 서열이 서열 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02), 또는 서열 WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 03), 또는 서열 WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 04), 또는 서열 WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 05), 또는 서열 WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 06) 인 점을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 개질 단계가
    기준 서열에서는 트레오닌이고, 제 4 중쇄 골격부 영역에서는 트레오닌이 아닌 이전 단계에서 동정된 위치에서 제 4 중쇄 골격부 영역 내 아미노산 잔기를 기준 서열 내에서와 같은 각 트레오닌 잔기로 치환함으로써 면역글로불린을 개질하는 것인 점을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 단계로서 하기를 포함하는 점을 특징으로 하는 방법:
    면역글로불린 중쇄의 제 4 골격부 영역의 아미노산 서열을 제공 또는 결정하는 단계.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린이 인간 또는 인간화 면역글로불린인 점을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린이 키메라 면역글로불린, 또는 CDR-그래프팅된 면역글로불린 또는 T-세포 에피토프 결핍된 면역글로불린, 또는 이의 변이체인 점을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포 또는 HEK 세포인 점을 특징으로 하는 방법.
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