MX2012006626A

MX2012006626A - Agregacion dependiente de secuencia.

Info

Publication number: MX2012006626A
Application number: MX2012006626A
Authority: MX
Inventors: Ulrich Kohnert; Sebastian Neumann; Hubert Kettenberger; Stefan Klostermann
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2012-06-25
Also published as: EP2516460A1; PL2516460T3; BR112012012873A2; US20160068602A1; WO2011076684A1; IL219629A; SI2516460T1; BR112012012873B1; CA2782578C; ES2535393T3; KR20120096040A; JP2013514794A; DK2516460T3; EP2516460B1; KR101593262B1; RU2567804C2; HK1174340A1; AU2010335283A1; HUE025190T2; SG181893A1

Abstract

En la presente se reporta un método para reducir la agregación de una inmunoglobulina en solución que comprende los pasos de i) comparar la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de un anticuerpo con una secuencia de referencia o línea germinal y determinar si uno o más residuos de treonina y/o residuos de serina han sido reemplazados por un diferente residuo de aminoácido, y ii) modificar la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina al revertir los residuos de treonina y/o residuos de serina intercambiados de nuevo a treonina o serina de la secuencia de referencia o línea germinal y reducir así la agregación de una inmunoglobulina en solución.

Description

AGREGACION DEPENDIENTE DE SECUENCIA Campo de la Invención Aquí se reporta un método para reducir la agregación de inmunoglobulina en soluciones concentradas por reversión de una o dos mutaciones en la región del cuarto marco de trabajo, es decir, en el elemento J, de una cadena pesada de inmunoglobulina para el residuo de aminoácido de línea germinal hidrofílico o natural.

Antecedentes de la Invención Debido a sus propiedades químicas y físicas, tales como el peso molecular y la arquitectura de dominio que incluyen modificaciones secundarias, el procesamiento en dirección 3' de las inmunoglobulinas es muy complicado. Las soluciones concentradas de inmunoglobulina son necesarias no sólo para los fármacos formulados, sino también para los intermediarios en el procesamiento en dirección 3' (DSP, por sus siglas en inglés) para lograr volúmenes bajos para el manejo económico y almacenamiento de la aplicación.

También la formulación final de la inmunoglobulina requiere una solución altamente concentrada. Por ejemplo, para aplicación subcutánea, se requieren concentraciones de inmunoglobulina de más de 100 mg/ml , es decir, aproximadamente 150 mg/ml. Pero al menos algunas Ref. 220530 inmunoglobulinas tienden a agregarse a concentraciones no fisiológicamente altas de 100 mg/ml o más.

En el documento WO 2009/000098, se reporta una ingeniería y optimización basada en secuencia de anticuerpos de cadena sencilla.

Sumario de la Invención Aquí se reporta un método para reducir la agregación de inmunoglobulina en una solución concentrada. Se ha encontrado que dos o incluso una sola mutación reversión en la cuarta región de marco de trabajo de una cadena pesada de inmunoglobulina puede reducir la formación de agregados que permiten la provisión de una solución altamente concentrada de la variante de inmunoglobulina revertida con contenido de agregado reducido. Por lo tanto, aquí se reportan como aspectos individuales: un método para reducir la agregación de una inmunoglobulina en solución, un método para modificar una inmunoglobulina, un método para producir una inmunoglobulina, y un método para la humanización de una inmunoglobulina.

Todos los métodos, como se reporta en la presente, comprenden los siguientes pasos: a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco trabajo de cadena pesada de una inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos de referencia para lograr el máximo nivel de identidad de secuencia de aminoácidos, b) identificar las posiciones de la secuencia de aminoácidos alineadas con diferentes residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina y de la secuencia de aminoácidos de referencia, c) modificar la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina al sustituir uno o por lo menos un residuo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina en una posición identificada en b) para el residuo de treonina o residuo de serina respectivo como está presente en la secuencia de aminoácidos de referencia, por lo que en la posición sustituida el residuo de aminoácido es treonina o serina en la secuencia de aminoácidos de referencia, y por lo que el residuo de aminoácido no es treonina ni serina en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina, d) opcionalmente proveer una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina modificada.

En una modalidad, sólo la diferencia de residuos de treonina se determinó y se cambió. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de referencia a la cuarta región de marco de trabajo de la inmunoglobulina es la secuencia de aminoácidos xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) en donde x denota cualquier residuo de aminoácido excepto treonina y serina. En una modalidad adicional la secuencia de aminoácidos de referencia es la secuencia de aminoácidos xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) en donde x en las posiciones 1, 2, 3, 4, 7 y 9 denota cualquier residuo de aminoácido excepto treonina y serina y x en la posición 6 denota treonina y x en la posición 10 y 11 denota serina, por lo que la diferencia de residuos de treonina en la posición 5 y/u 8 en la secuencia de aminoácidos de referencia a la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de inmunoglobulina es identificada en el paso b) y modificada en el paso c) . En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de referencia es una secuencia de aminoácidos de línea germinal humana. En una modalidad, de todos los aspectos como se reporta en la presente, los métodos comprenden los siguientes pasos : a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02), o la secuencia de aminoácidos WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 03), o la secuencia de aminoácidos GQGT VTVSS (SEQ ID NO: 04), o la secuencia de aminoácidos WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 05), o la secuencia de aminoácidos WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 06) para lograr nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos, b) identificar posiciones de aminoácidos alineadas con diferentes residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina y la secuencia de aminoácidos de referencia, c) modificar la inmunoglobulina al sustituir un residuo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada en una posición identificada en b) para el residuo de treonina o residuo de serina respectivo presente en la secuencia de aminoácidos de referencia, por lo que el residuo de aminoácido en la posición es treonina o serina en la secuencia de aminoácidos de referencia y por lo que el residuo de aminoácido en la posición no es treonina ni serina en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina, d) opcionalmente proveer una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina modificada.

En una modalidad de los aspectos como se reporta en la presente, los métodos comprenden como primer paso, el paso de proveer o determinar la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de inmunoglobulina . En una modalidad, la secuencia de referencia es la secuencia de aminoácidos GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02) . En otra modalidad la secuencia de aminoácidos de referencia es xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) . En una modalidad, se determina la diferencia de los residuos de treonina en la posición 5 y/o 8 de la secuencia de aminoácidos de referencia. En una modalidad, sólo la diferencia of residuos de treonina se determina y se cambia.

En un aspecto como se reporta en la presente, el método es un método para producir una inmunoglobulina que comprende los siguientes pasos: a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos de referencia xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) o xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) para lograr nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos , b) identificar las posiciones de la secuencia de aminoácidos con diferentes residuos de aminoácidos en la posición 5 y/o 6 y/u 8 y/o 10 y/u 11 en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina y la secuencia de aminoácidos de referencia, c) modificar la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina al sustituir un residuo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada en una posición identificada en b) para el residuo de treonina o residuo de serina respectivo as en la secuencia de aminoácidos de referencia, por lo que el residuo de aminoácido en la posición és treonina o serina en la secuencia de aminoácidos de referencia, and por lo que el residuo de aminoácido en la posición no es treonina ni serina en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina, d) cultivar una célula de mamífero que comprende el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la inmunoglobulina modificada y un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera correspondiente para la expresión de la cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina, e) recuperar la inmunoglobulina de la célula de mamífero o el medio de cultivo y por lo tanto producir una inmunoglobulina .

En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de referencia es la secuencia de aminoácidos WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02) , o la secuencia de aminoácidos WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 03) , o la secuencia de aminoácidos WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 04) , o la secuencia de aminoácidos WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 05) , o la secuencia de aminoácidos WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 06) . En una modalidad, el paso de modificar la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina es al sustituir un residuo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada en una posición identificada en b) , que es treonina en la secuencia de aminoácidos de referencia y que no es treonina en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada, para el residuo de treonina respectivo como está presente en la secuencia de aminoácidos de referencia. En otra modalidad, la modificación es de por lo menos una posición identificada. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de referencia es la secuencia de aminoácidos WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02) . En una modalidad, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana o humanizada. En otra modalidad, la célula de mamífero es una célula de CHO o una célula de HEK. En otra modalidad, la diferencia de los residuos de treonina en la posición 5 y/o 8 de la secuencia de aminoácidos de referencia se determina.

Otro aspecto, como se reporta en la presente, es un método para la humanización de una inmunoglobulina que comprende los siguientes pasos: a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos de referencia xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) o xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) para lograr nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos , b) identificar las posiciones de la secuencia de aminoácidos con diferentes residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina y la secuencia de aminoácidos de referencia, c) humanizar la inmunoglobulina al sustituir un residuo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada en una posición identificada en b) para el residuo de treonina o residuo de serina respectivo como en la secuencia de referencia, por lo que el residuo de aminoácido en la posición es treonina o serina en la secuencia de aminoácidos de referencia, y por lo que el residuo de aminoácido en la posición no es treonina ni serina en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina, d) opcionalmente proveer una secuencia de ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina humanizada.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 Incremento de la tasa de tamaño de partícula por unidad de tiempo en una solución de 30 mg/ml de anticuerpo anti-IL13Ral (a) y la variante de anticuerpo revertida (b) ambos en 20 mM de amortiguador de pH de histidina, pH 6, con 0, 140 y 500 mM de NaCl a 50°C, determinado por dispersión dinámica de la luz.

Figura 2 Cromatogramas de exclusión por tamaño analíticos de dos soluciones de 30 mg/ml de anticuerpo anti-IL13Rocl y la forma revertida ambas en presencia de 500 mM de NaCl durante 15 he a 10°C.

Figura 3 Gráfica de Kyte-Doolittle de los residuos l a 130 de cadena pesada con una ventana de análisis de 9 residuos de anticuerpo anti-IL13Ral progenitor.

Figura 4 Gráfica de Kyte-Doolittle de los residuos 1 a 130 de cadena pesada con una ventana de análisis de 9 residuos de variante de anticuerpo anti-IL13Rocl .

Figura 5 Gráfica de Kyte-Doolittle de los residuos 1 a 130 de cadena pesada con una ventana de análisis de 9 residuos de anticuerpo anti-OX40L progenitor.

Figura 6 Gráfica de Kyte-Doolittle de los residuos 1 a 130 de cadena pesada con una ventana de análisis de 9 residuos de variante de anticuerpo anti-OX40L.

Breve Descripción del Listado de Secuencias SEQ ID NO: 01 xxxxTTxTxSS - secuencia de aminoácidos de referencia.

SEQ ID NO: 02 WGQGTLVTVSS - secuencia de aminoácidos de elemento FR4/J de línea germinal parcial.

SEQ ID NO: 03 WGRGTLVTVSS - secuencia de aminoácidos de elemento FR4/J de línea germinal parcial.

SEQ ID NO: 04 GQGTMVTVSS - secuencia de aminoácidos de elemento FR4/J de línea germinal parcial.

SEQ ID NO: 05 WGQGTTVTVSS - secuencia de aminoácidos de elemento FR4/J de línea germinal parcial.

SEQ ID NO: 06 GKGTTVTVSS - secuencia de aminoácidos de elemento FR4/J de línea germinal parcial.

SEQ ID NO: 07 secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgGl humana.

SEQ ID NO: 08 secuencia de aminoácidos de la región constante, de cadena pesada de IgG4 humana.

SEQ ID NO: 09 WGQGTLVIVSS - secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti- IL13R011.

SEQ ID NO: 10 WGQGALVTVSS - secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-OX40L.

SEQ ID NO: 11 xxxxTxxTxxx - secuencia de aminoácidos de referencia.

Descripción Detallada de la Invención Se ha encontrado que el intercambio de dos o incluso un solo residuo de aminoácido de treonina y/o serina a un residuo de aminoácido hidrofóbico o no polar pequeño, tal como isoleucina o alanina, en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina aumenta la tendencia de la inmunoglobulina a formar agregados en solución, especialmente en soluciones con alta concentración de sal y/o alta concentración de inmunoglobulina. Al revertir los residuos de aminoácidos intercambiados de nuevo al residuo (s) de treonina y/o serina que ocurre naturalmente, la tendencia a formar agregados en solución, especialmente en soluciones concentradas, se reduce marcadamente .

En un aspecto, el método, como se reporta en la presente, es un método para reducir la agregación de una inmunoglobulina en solución que comprende los siguientes pasos : - determinar si uno o más residuos de treonina y/o serina en la cuarta región de marco de trabajo secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la inmunoglobulina ha sido cambiado al comparar la secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia para la cuarta región de marco de trabajo secuencia de aminoácidos, - revertir la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina al modificar por lo menos uno de los residuos de treonina y/o serina intercambiados de nuevo al residuo de treonina y/o serina de referencia y al reducir así la agregación de una inmunoglobulina en solución.

El término "alineación" significa el proceso de alinear dos o más secuencias de aminoácidos para lograr el máximo nivel de identidad de secuencia de aminoácidos y de conservación. Comprende la determinación de homología posicional para las secuencias moleculares, que implica la yuxtaposición de aminoácidos o nucleótidos en moléculas homologas. Como resultado, las secuencias comparadas se presentan en una forma tal que se muestran las regiones de mayor similitud estadística.

"Nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos candidatos que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, par lograr el por ciento de identidad de secuencia máximo, y sin considerar algunas sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinar la identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias formas, por ejemplo, mediante el uso de software de computadora públicamente disponible, tal como software BLAST, BLAST-2 , ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear las secuencias de aminoácidos, que incluyen cualesquiera algoritmos necesarios para conseguir el alineamiento máximo sobre toda la longitud de las secuencias de aminoácidos que se comparan. A efectos de la presente, sin embargo, los valores de "% de secuencias de aminoácidos de identidad" se generan mediante el uso del programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2 fue autorizado por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de E.U.A., Washington D.C., 20559, en el que está registrado bajo el N° de registro de Derechos de Autor de E.U.A. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible de Genentech, Inc., Sur de San Francisco, California, o puede ser compilado del código fuente. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para su uso en un sistema operativo UNIX, que incluye UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde ALIGN-2 se utiliza para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos de A a, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (que alternativamente se puede expresar como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos a, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos calificados como concordancias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de ese programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B . Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencias de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencias de aminoácidos de B a A.

En un aspecto adicional, el método como se reporta en° la presente es un método para modificar una inmunoglobulina que comprende los siguientes pasos: - determinar si uno o más residuos de treonina y/o serina en la cuarta región de marco de trabajo secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la inmunoglobulina ha sido cambiado al comparar la secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia para la cuarta región de marco de trabajo secuencia de aminoácidos, revertir la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina al modificar por lo menos uno de los residuos de treonina y/o serina intercambiados de nuevo al residuo de treonina y/o serina de referencia y al modificar así una inmunoglobulina.

En un aspecto, el método como se reporta en la presente es un método para la humanización de una inmunoglobulina que comprende los siguientes pasos: - determinar mediante comparación la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de una inmunoglobulina quimérica, una inmunoglobulina injertada con CDR, una inmunoglobulina reducida o agotada de epítopo de célula T, o una variante de la misma con una secuencia de aminoácidos de referencia para la cuarta región de marco de trabajo si uno o más residuos de treonina y/o serina han sido reemplazados por un residuo de aminoácido diferente, revertir la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina al modificar por lo menos uno de los residuos de treonina y/o serina intercambiados de nuevo al residuo de treonina y/o serina como en la secuencia de aminoácidos de referencia y al humanizar así una inmunoglobulina.

El término "cuarta región de marco de trabajo secuencia de aminoácidos" denota la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de una inmunoglobulina. Esta secuencia de aminoácidos empieza con el residuo de aminoácido directamente C-terminal a la región determinante de complementariedad 3 (CDR 3) de la cadena pesada de inmunoglobulina y termina con el último residuo de aminoácido del dominio variable de cadena pesada.

En una modalidad, los residuos de aminoácidos de la CDR' 3 de la cadena pesada de inmunoglobulina se determinan de conformidad con Kabat .

El término "inmunoglobulina quimérica" denota una inmunoglobulina que comprende residuos de aminoácidos derivados de una inmunoglobulina de una primera especie y residuos de aminoácidos derivados de una segunda especie no idéntica con la primera especie. Si la especie aceptora es humana, entonces la inmunoglobulina quimérica es una "inmunoglobulina humanizada" . Para la mayor parte, una inmunoglobulina inmunizada se deriva de una inmunoglobulina humana (inmunoglobulina receptora o aceptora) , en la cual la secuencia de aminoácidos de una o más región (es) hipervariables se determina de conformidad con Kabat y/o Chothia y/o otros sistemas de numeración son cambiados a la secuencia de aminoácidos de una región hipervariable de una especie no humana (inmunoglobulina donadora) . Una inmunoglobulina humanizada en la cual las regiones hipervariables enteras de conformidad con Kabat y/o Chothia y/o otros sistemas de numeración de una inmunoglobulina aceptora humana son reemplazados por el residuo de aminoácidos correspondiente de una inmunoglobulina donadora no humana se denotan como "inmunoglobulina injertada con CDR" . Las inmunoglobulinas donadoras no humanas ilustrativas son inmunoglobulinas de ratón, rata, conejo, perro, hámster, oveja o primate no humano, que tienen la especificidad y afinidad deseadas hacia un antígeno de interés (véase, v.gr., Morrison, S.L., et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 81 (1984) 685 1-6855; US 5,202,238; US 5,204,244). En algunos casos, los residuos de región de marco de trabajo (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, las inmunoglob linas humanas pueden comprender modificaciones adicionales, v.gr. , residuos dé aminoácidos que no se encuentran en la inmunoglobulina aceptora o en la inmunoglobulina donadora. Esas modificaciones dan por resultado variantes de la inmunoglobulina¦ receptora o donadora, que son homologas pero no idénticas a la secuencia progenitora correspondiente. Una inmunoglobulina humanizada opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana.

En una modalidad, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica, o una inmunoglobulina injertada con CDR, o un epítopo de células T inmunoglobulina reducida o agotada, o una variante de las mismas. En una modalidad, la inmunoglobulina comprende una región constante de cadena pesada humana o una variante de la misma. En una modalidad, la región constante humana es de la subclase IgGl, o de la subclase IgG4, o de la subclase IgG2 , o de la subclase IgG3 , o de SEQ ID NO: 07, o SEQ ID NO: 08, o es una variante de las mismas.

En una modalidad, la región constante es modificada de tal manera que no se puede detectar unión a receptor Fey (v.gr. , FcyRIIIa) y/o unión a Clq como se define más adelante. En una modalidad la región constante es una región constante humana y es ya sea de la subclase IgG4 humana o es una parte de Fe mutada de la subclase IgGl humana. En otra modalidad, la región constante es de la subclase IgGl humana que comprende las mutaciones L234A y L235A (posiciones determinadas de conformidad con la longitud completa, es decir, que incluye la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de IgGl humana de dominio variable) . Aunque IgG4 muestra unión a receptor Fcy (FcyRIIIa) reducida, las inmunoglobulinas de otras subclases de IgG muestran unión fuerte. Sin embargo, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida de carbohidrato de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, y/o His435 son residuos que, si son alterados, también proveen unión a receptor Fcy reducida (Shields, R.L., et al, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al, FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al, Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434) . En una modalidad, la región constante es con respecto a unión a receptor Fcy de la subclase IgG4 o de las subclases IgGl o IgG2 , con una mutación en L234, L235, y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. En una modalidad, la mutación es S228P, L234A, L235A, L235E, y/o PVA236 (PVA236 significa que la secuencia de aminoácidos ELLG (dados en un código de aminoácido de una letra) de una posición de aminoácido 233 a 236 de IgGl o EFLG de IgG4 es reemplazada por PVA) . En una modalidad adicional, la mutación es S228P de IgG4 , y L234A y L235A de IgGl. La región constante de una inmunog1obulina está directamente implicada en la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo) y CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) . Una inmunog1obulina que no se une al receptor Fcy y/o factor de complemento Clq no provoca citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés) .

El término "inmunoglobul ina agotada de epítopo de células T" denota una inmunoglobul ina que fue modificada para remover o reducir inmunogenicidad mediante la eliminación de epítopos de células T humanas (secuencias de péptidos dentro de las proteínas con la capacidad de unirse a moléculas MHC Clase II) . Por este método, las interacciones entre cadenas laterales de aminoácidos del péptido y bolsas de unión específicas con la ranura de unión a MHC de clase II son identificadas. Las regiones inmunogénicas identificadas son cambiadas para eliminar la inmunogenicidad. Esos métodos se describen en general en, v.gr., O 98/52976 o en WO 98/08097.

El término "variante del mismo denota una inmunoglobulina que comprende modificaciones de secuencia conservativas o un patrón de glicosilación alterado. El término "modificaciones de secuencia conservativas" denota sustituciones de aminoácidos que incluyen aquellas en las cuales el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido identificadas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.gr . , lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (v.gr., ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (v.gr. glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano) , cadenas laterales no polares (v.gr., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina , metionina) , cadenas laterales beta-ramificadas (v.gr., treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (v.gr., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Otro tipo de variante de la inmunoglobulina altera el patrón de glicosilación original de la inmunoglobulina. Por alteración se entiende suprimir uno o más sitios de glicosilación encontrados en la inmunoglobulina, y/o introducir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la inmunoglobulina. La glicosilación de inmunoglobulinas es generalmente N-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión de la porción del carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina y asparagina-X-cisteína , en donde X puede ser cualquier aminoácido, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral de asparagina.

En una modalidad, la secuencia de referencia es la secuencia de SEQ ID NO: 02 a 06, o la secuencia de SEQ ID NO: 01, o la secuencia de SEQ ID NO: 11. En otra modalidad, la determinación y reversión es de los residuos de treonina reemplazados.

La invención a continuación se ilustra con un anticuerpo ant i - I Ll3Ral y un anticuerpo anti-OX40L. Las secuencias de aminoácidos correspondientes y métodos de producción se reportan en O 2006/072564 y WO 2006/029879 (que son incorporadas aquí por referencia) . Estos anticuerpos solo se usan para ilustrar los aspectos como se reporta en la presente y no para presentar alguna limitación. El alcance de la invención se expone en el juego de reivindicaciones anexo.

El anticuerpo anti-IL13Ral a continuación se denota como anticuerpo progenitor y tiene una secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de WGQGTLVIVSS (SEQ ID NO: 09) . La comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 y SEQ ID NO: 11 se muestra a continuación. 1 1 0 xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) , o xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) a GQGTLVIVSS (SEQ ID NO : 09) Se puede ver que una diferencia entre las secuencias de aminoácidos es un residuo de isoleucina en la 8a posición de SEQ ID NO: 09 en lugar del residuo de treonina en la SEQ ID NO: 01 o SEQ ID NO: 11. Por lo tanto, se ha producido un anticuerpo variante en el que el residuo isoleucina se revierte de nuevo a un residuo de treonina.

En tanto que el anticuerpo progenitor muestra un alto nivel de formación de agregados, la variante de anticuerpo revertida tiene una tendencia claramente reducida a formar agregados. En la figura 1, se muestran las tasas de aumento del tamaño (nm/hr) de los agregados del anticuerpo anti-IL13Ral progenitor a una concentración de anticuerpo de 30 mg/ml a 50°C y concentración iónica variable. También, en la figura 1 se muestran las tasas obtenidas con una variante de anticuerpo anti-IL13Ral en el cual el residuo de isoleucina en la posición de aminoácido 115 (correspondiente a la 8a posición en SEQ ID NO: 01, 11 y 09) en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada secuencia de aminoácidos ha sido revertida a treonina como una sola y única diferencia al anticuerpo anti-IL13R0C1 progenitor. La mutación de reversión única reduce la tasa de aumento de tamaño del agregado a todas las concentraciones iónicas examinadas .

En la figura 2, se muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño analíticos de dos muestras almacenadas durante 9 semanas a 40°C en la misma formulación. Los datos respectivos se listan en la siguiente tabla 1.

Tabla 1: Datos analíticos de muestras almacenadas durante 9 semanas a 40 °C Se puede ver que la tendencia a formar · agregados de la variante anticuerpo revertida se reduce en más del 50% en comparación con el anticuerpo progenitor.

En la figura 3, se muestra la gráfica de Kyte-Doolittle de los residuos de la cadena pesada de 1 a 130 con un análisis o ventana de promedio de 9 residuos del anticuerpo anti-IL13Rai progenitor. En la cuarta región de marco de trabajo, la gráfica muestra los valores más altos de carácter hidrofóbico para la cadena pesada entera. En la figura 4, se muestra la gráfica de Kyte-Doolittle de la cadena pesada de la variante de anticuerpo anti - IL13Rocl . Se puede observar que los valores de carácter hidrofóbico de la cuarta región de marco de trabajo son claramente reducidos en la variante de anticuerpo revertida.

En la figura 5, se muestra la gráfica de Kyte-Doolittle de los residuos 1 a 130 de la cadena pesada con un análisis/ventana de promedio de 9 residuos de un anticuerpo anti-OX40L. Se puede observar que también en este caso el valor más alto de carácter hiidrofóbico está en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada. Al analizar la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada, un intercambio de aminoácido se puede determinar como se muestra a continuación. 1 1 O xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01), o xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) , o WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO : 02) a WGQGALVTVSS (SEQ ID NO : 10) .

Al revertir este cambio de aminoácidos único de Nuevo al residuo de treonina de línea germinal que ocurre de manera natural, se reduce el carácter hidrofóbico del anticuerpo como se muestra en la gráfica de Kyte-Doolittle en la figura 6.

Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proveen para ayudar a entender la presente invención, cuyo alcance verdadero se expone en las reivindicaciones anexas. Cabe entender que las modificaciones se pueden hacer en los procedimientos expuestos sin apartarse de la esencia de la invención.

Materiales y métodos Cromatografía de exclusión por tamaño analítica El contenido de especies de peso molecular alto (HMWs, por sus siglas en inglés) , monómeros de anticuerpos y especies de peso molecular bajo (LM s, por sus siglas en inglés) se determinó por cromatografía de exclusión por tamaño analítica usando una columna de TSK 3000S WXL 7.8 x 300 mm (Tosoh, Stuttgart, Alemania) . Como eluyente, una solución reguladora de pH que contenía 200 mM de KH2P0 y 250 mM de KCl a pH 7.0 se usó a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. Una cantidad de 150 pg de proteína se cargo por operación. La detección se logró mediante absorción de UV a 280 nm.

Dispersión dinámica de la luz (DLS) La dispersión dinámica de la luz (DLS, por sus siglas en inglés) es una técnica no invasiva para medir el tamaño de partícula, generalmente en el intervalo de tamaño de sub-micras. En la presente invención, el aparato Zetasizer Nano S (Malvern Instruments, Worcestershire , R.U.) con un tuvo de cuarzo con temperatura controlada (25°C) se usó para monitorear un intervalo entre 1 nm y 6 µ??. La intensidad de la luz de láser dispersada fue detectada a un ángulo de 173°. La intensidad fluctúa a una velocidad que es dependiente de la velocidad de difusión de partículas, que a su vez es regulada por el tamaño de partícula. Los datos de tamaño de partícula por lo tanto se pueden generar a partir de un análisis de la fluctuación en intensidad de luz dispersada (Dahneke, B.E. (ed) , Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, iley Inc. (1983) ; Pécora, R., Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscop , Plenum Press (1985)) . La distribución de tamaño por intensidad se calculó mediante el uso del modo estrecho múltiple del software DTS (Malvern) Ejemplo 1 Producción de variante de anticuerpo anti-IL13Rocl Los genes que codifican la cadena ligera y pesada del anticuerpo anti-IL13Ral fueron ensamblados por separado en vectores de expresión en células de mamífero. Por lo tanto, los segmentos de genes que codifican la región variable (VL, por sus siglas en inglés) de cadena ligera de anticuerpo anti-IL13Rccl y la región constante (CL, por sus siglas en inglés) de cadena te-ligera humana se unieron como los segmentos de genes para la región variable (VH, por sus siglas en inglés) de cadena pesada del anticuerpo anti-IL13Ral y la región constante de cadena pesada ?? humana (C-gozne-Cm-CHs) . Información general referente a las secuencias de nucleótido de cadenas ligera y pesada humana de las cuales se da el uso de codón en: Kabat, E.A. , u, T.T., Perry, H. ., Gottesman, K.S., y Foeller, C. Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed. , Publicación de NIH No. 91-3242 (1991) . La unidad de transcripción de la cadena -ligera del anticuerpo anti-IL13Ral está compuesta de los siguientes elementos: • El incrementador temprano inmediato y promotor del citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés) , • un 5'-UT sintético que incluye una secuencia de Kozak, • una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina de murino que incluye el intrón de la secuencia de señal, • el ADNc de cadena ligera variable de anticuerpo anti-IL13Roíl clonado dispuesto con un sitio de restricción de Bsml único en el extremo 5' y un sitio de donador de corte y empalme y un sitio de restricción de Notl único en el extremo 3' , • la región constante de -gen humano genómico, que incluye el incrementador de Ig-K de ratón de intrón 2 (Picard, D. , y Schaffner, W. , Nature 307 (1984) 80-82), y • la secuencia de señal de -poliadenilación ("poli A") de inmunoglobulina humana.

La unidad de transcripción de la cadena pesada ?? del anticuerpo anti - IL13Ral compuesta de los siguientes elementos : • el incrementador temprano inmediato y promotor del citomegalovirus humano (HCMV) , • un 5'-UT sintético que incluye una secuencia de Kozac 5'-UT, • una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina de murino modificada que incluye el intrón de secuencia de señal, • el ADNc de cadena pesada del anticuerpo anti-IL13Ral variable clonado dispuesto con un sitio de restricción de Bsml único en el extremo 5' y un sitio donador de corte y empalme y un sitio de restricción de Notl único en el extremo 3 ' , • la región constante del gen ?-pesada humano genómico, que incluye el µ- incrementador de Ig de ratón (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), • la secuencia dé señal de poliadenilación ("poli A") de ??-inmunoglobulina humana.

Además del cadete de expresión de cadena ?-ligera o ??-pesada de anticuerpo anti-IL13R l, estos plásmidos contienen • un gen resistente a higromicina, • un origen de replicación, oriP, de virus de Epstein-Barr (EBV, por sus siglas en inglés) , · un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli, y • un gen de ß-lactamasa que confiere Resistencia a ampicilina en E. coli.

Un plásmido de expresión que codifica la cadena ??-pesada de la variante de anticuerpo anti-IL13Ral fue creado por mutagénesis dirigida al sitio de los plásmidos de expresión del anticuerpo progenitor mediante el uso del kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange™ (Stratagene) . Los aminoácidos se numeran de conformidad con la numeración europea (Edelman, G.M., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K.S., y Foeller, C, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed., publicación de IH No. 91-3242) .

Un clon de CHO establemente transfectado produce la variante de anticuerpo anti-IL13Ral a 130 mg/litro. El procesamiento en dirección 3' fue conducido mediante el uso de tres pasos cromatográficos secuenciales : cromatografía de proteína A, cromatografía de intercambio de cationes y cromatografía de intercambio de aniones.

Ejemplo 2 Determinación de la tasa de incremento de tamaño de agregado por dispersión dinámica de la luz Para seguir la agregación con el tiempo, se condujeron mediciones de dispersión dinámica de la luz (DLS) a intervalos de tiempo regulares. Las concentraciones altas de sal estabilizan las interacciones hidrofóbicas ; por lo tanto, se espera que la agregación relacionada con el carácter hidrofóbico sea más pronunciada a concentraciones altas de sal. El cambio de tamaño de partícula promedio (radio Z-promedio) fue monitoreado como una métrica para agregación de proteína (figura 1) . Las muestras se dializaron en amortiguador de pH que contenía varias cantidades de NaCl (20 mM de His/His-HCl a pH 6.0 + 0/140/500 mM de NaCl) a una concentración de proteína de 30 mg/ml . Las. mediciones de DLS se llevaron a cabo en un lector de placa de Wyatt DynaPro en microplacas de titulación de 394 pozos a una temperatura de 50°C.

Ejemplo 3 Prueba de estabilidad de variante de anticuerpo anti-IL13Rgl La inducción de compuestos de peso molecular alto (H Ws) se realizó al dializar muestras en 20 mM de His/His-HC1 a pH 6.0, que contenían 0 o 500 mM de NaCl, seguido por la incubación a 10°C durante 15 hr. La formación de HMWs comparada con las muestras no tratadas fue monitoreada por SEC HPLC (figura 2) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente .descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para proveer una secuencia de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de una inmunoglobulina con la secuencia de referencia xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) o xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) para lograr nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos, b) identificar las posiciones de aminoácidos alineadas con diferentes residuos de aminoácidos en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada y la secuencia de referencia, c) modificar la inmunoglobulina al sustituir un residuo de aminoácido en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada en una posición identificada en b) , que es treonina o serina en la secuencia de referencia y que no es treonina ni serina en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada, para el residuo de treonina o residuo de serina respectivo como en la secuencia de referencia, d) proveer una secuencia de ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina.

2. Un método para la humanización de una inmunoglobulina, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina con la secuencia de referencia xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) o xxxxTxxTxxx (SEQ ID^ NO: 11) para lograr nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos, b) identificar las posiciones de aminoácidos alineadas con diferentes residuos de aminoácidos en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada y la secuencia de referencia, c) humanizar la inmunoglobulina al sustituir un residuo de aminoácido en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada en una posición identificada en b) , que es treonina o serina en la secuencia de referencia y que no es treonina ni serina en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada, para el residuo de treonina o residuo de serina respectivo como en la secuencia de referencia, d) opcionalmente proveer una secuencia de ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina humanizada.

3. - Un método para producir una inmunoglobulina, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de la inmunoglobulina con la secuencia de referencia xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO: 01) o xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) para lograr nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos, b) identificar las posiciones de aminoácidos alineadas con diferentes residuos de aminoácidos en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada y la secuencia de referencia, c) modificar la inmunoglobulina al sustituir un residuo de aminoácido en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada en una posición identificada en b) , que es treonina o serina en la secuencia de referencia y que no es treonina ni serina en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada, para el residuo de treonina o residuo de serina respectivo como en la secuencia de referencia, d) cultivar una célula de mamífero que comprende el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la inmunoglobulina modificada y un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera correspondiente para la expresión de la cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina, e) recuperar la inmunoglobulina de la célula de mamífero o el medio de cultivo y producir así una inmunoglobulina .

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de referencia es xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO: 11) .

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la identificación y la modificación son del residuo de aminoácido treonina en la posición 5 y/o 8 de la secuencia de aminoácidos de referencia.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia de referencia es la secuencia GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 02), o la secuencia WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 03), o la secuencia GQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 04), o la secuencia WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 05) , o la secuencia WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 06) .

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso de modificación es modificar la inmunoglobulina al sustituir un residuo de aminoácido en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada en una posición identificada en el paso anterior que es treonina en la secuencia de referencia y que no es treonina en la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada para el residuo de treonina respectivo como en la secuencia de referencia.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el método comprende como primer paso : proveer o determinar la secuencia de aminoácidos de la cuarta región de marco de trabajo de cadena pesada de inmunoglobulina .

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana o humanizada.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica, o una inmunoglobulina injertada con CDR, o una inmunoglobulina agotada de epítopo de células T, o una variante de la misma.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula CHO o una célula HEK.