KR20230018475A - 암 치료용 저메틸화제를 포함하는 병용 요법 - Google Patents

암 치료용 저메틸화제를 포함하는 병용 요법 Download PDF

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KR20230018475A
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자움 폰즈
훙 완
소피아 랜돌프
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알렉소 온콜로지 인크.
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Abstract

SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘)와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 암(예를 들어, 골수이형성 증후군과 같은 혈액암)을 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 관련 키트가 제공된다.

Description

암 치료용 저메틸화제를 포함하는 병용 요법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 6월 1일자로 출원된 미국 가출원 제63/033,074호; 2020년 10월 27일자로 출원된 미국 가출원 제63/106,285호; 2020년 11월 3일자로 출원된 미국 가출원 제63/109,083호; 2020년 11월 17일자로 출원된 미국 가출원 제63/114,959호; 및 2021년 2월 4일자로 출원된 미국 가출원 제63/145,925호의 우선권 이익을 주장하며, 이들의 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일의 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일의 하기 제출 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형식(CRF; computer readable form)(파일 명칭: 757972001240SEQLIST.TXT, 기록 날짜: 2021년 5월 28일, 크기: 297KB).
발명의 분야
본 발명은 CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제를 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘)와 조합하여 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.
많은 암은 이용가능한 치료제로 치료하더라도, 예후가 좋지 않다. 예를 들어, 미국에는 대략 70,000명의 사람들이 골수이형성 증후군(MDS; myelodysplastic syndrome) 진단을 받고 살고 있다. MDS를 갖는 환자는 그들의 개정된 국제 예후 점수 시스템, 또는 IPSS-R(Revised International Prognostic Scoring System) 위험 범주에서 추정될 수 있는 광범위한 예상 결과를 갖는다. 매우 낮은 IPSS-R을 갖는 환자는 8.8년의 평균 전체 생존기간(median overall survival)을 갖는 반면, 매우 높은 IPSS-R을 갖는 환자는 10개월 미만의 평균 전체 생존기간을 갖는다. 고위험 MDS(중등도, 고도 및 초고도 IPSS-R)를 갖는 환자의 경우, 표준 치료(standard of care treatment)는 줄기 세포 이식(SCT; stem cell transplant), 고강도 및 저강도 화학요법 레지멘(chemotherapy regimen) 및 저메틸화제(또는 HMA)를 포함한다. SCT는 잠재적으로 치유력이 있는 유일한 요법이지만; 특히 고령 환자의 경우, 절차가 견디기 어려우며, MDS를 갖는 모든 환자의 200일 기준 비-재발 사망률은 대략 40%이다.
환자의 거의 75%가 70세 이상에서 진단되기 때문에, 예후에서 환자의 연령과 삶의 질에 대한 잠재적인 치료-관련 영향 사이의 균형은 치료 옵션을 고려하는 데 중요하다. 연령에 관계없이, MDS를 갖는 환자의 치료 목표는 개선된 생존, 증상 완화 및 삶의 질 사이의 균형이다. 추가적인 치료 옵션을 제공하고 고위험 MDS를 갖는 환자를 포함하여, 골수이형성 증후군(MDS)을 갖는 환자에 대한 결과를 개선하기 위한 신규한 치료가 기술분야에서 요구된다.
종양 세포는 골수 구획(myeloid compartment)을 조작하여 항-종양 숙주 면역 반응을 회피할 수 있다(Gabrilovich 등, Nat Rev Immunol (2012) 12(4):253-68). 예를 들어, 정상 세포의 표면 상에 발현된 CD47은 대식세포 상의 SIRPα에 결합하여 "나를 먹지 마시오(don't eat me)" 신호를 제공하지만, 종양 세포는 면역 감시의 대식세포 성분을 회피하기 위해 CD47을 과발현하는 것으로 밝혀졌다(Oldenborg, ISRN Hematol (2013) 614619).
암 세포의 대식세포-매개 파괴는 "나를 먹지 마시오" 신호(예를 들어, CD47-SIRPα)의 동시 파괴 및 "나를 먹으시오(eat me)" 신호의 활성화에 의해 최적화된다. 어떤 성분도 단독으로 종양 세포에 대한 최대 포식 반응을 촉발하기에 충분하지 않다. 상기에서 기재된 바와 같이, CD47은 대식세포 상의 SIRPα와 상호작용하여 근본적인 "나를 먹지 마시오" 신호를 제공한다. 포식-촉진(pro-phagocytic) "나를 먹으시오" 신호가 그것의 활성화 Fc 감마 수용체에 결합하여 동일한 대식세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, 포식-촉진 "나를 먹으시오" 신호는 대식세포 상의 Fc 수용체에 대한 항-종양 항체의 Fc 도메인의 결합으로 제공될 수 있다. 포식-촉진 신호전달은 종양 세포 표면 상의 단백질 칼레티쿨린이 대식세포 상의 LRP 수용체에 결합하는 것과 같은, 다른 자극에 의해 제공될 수도 있다.
골수이형성 증후군(MDS) 및 급성 골수성 백혈병(AML; acute myeloid leukemia)에서, CD47의 과발현 및 비정상 발현이 형성이상 세포(dysplastic cell) 상에서 보고되었으며 생존과 역 상관관계가 있는 것으로 제안되었다(Majeti 등 2009; Jiang 등 2013; Galli 등 2015).
특허 출원, 특허 간행물, 및 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호를 포함하여, 본원에 인용된 모든 참고문헌은 마치 각각의 개별적인 참고문헌이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것처럼 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 구현예에 있어서, (a) SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 (b) 저메틸화제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암(예를 들어, 골수이형성 증후군(MDS) 또는 급성 골수성 백혈병(AML))을 치료하는 방법이 제공되며; 여기서 융합 폴리펩티드의 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 Fc-도메인 변이체의 N-말단에 연결된다. 일부 구현예에 있어서, (a) SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 (b) 저메틸화제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암(예를 들어, AML)을 치료하는 방법이 제공되며; 여기서 융합 폴리펩티드의 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 Fc-도메인 변이체의 N-말단에 연결된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드의 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하고; 및 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 변이체는 하기이다: (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수(EU index of Kabat)에 따른 것임; (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는 (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임. 일부 구현예에 있어서, 암은 골수이형성 증후군(MDS)이다. 일부 구현예에 있어서, MDS는 고위험 MDS이다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 MDS에 대한 사전 요법을 받았다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 MDS에 대한 사전 요법을 받지 않았다. 일부 구현예에 있어서, MDS에 대한 치료는 유도 단계 및 유지 단계를 포함하며, 여기서 유도 단계는 (a) SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 (b) 저메틸화제를 투여하는 것을 포함하고, 상기 유지 단계는 저메틸화제 없이 SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML)이다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 약 60 mg/kg 이하의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 4주마다 1회(q4w) 약 60 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML)이다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 WHO 2016 분류에 따라 재발성/불응성 또는 신규하게 진단된 AML의 하위세포학적(subcytologically) 또는 조직학적으로 확인된 진단을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 재발성/불응성이거나 집중 유도 요법에 적합하지 않은 것으로 간주되는 환자에서 이전에 치료되지 않은 AML을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 HMA-기반 레지멘을 이용한 사전 치료 후 재발성/불응성인 AML을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 이전에 치료되지 않은 AML을 가지며 집중 유도 요법에 적합한 후보로 간주되지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 적절한 신장 및 간 기능을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 18세 이상이다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 적절한 수행 상태(performance status)를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 사전 동종이계-조혈모 세포 이식(HSCT; hematopoietic stem cell transplantation)을 받지 않았다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 제어되지 않는 이식편대숙주 질환(GVHD; graft-versus-host disease) 없이, HCST 적어도 3개월 후이다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 사전 동종이계-HSCT를 받지 않았다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 AML에 대한 2019년 미국 종합 암 네트워크(NCCN; National Comprehensive Cancer Network) 가이드라인 버전 3에 따라 t(8;21), inv(16), 또는 t(16;16)와 같은 유리한 위험 세포유전학(risk cytogenetics)을 갖는 신규하게 진단된 AML을 갖지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 급성 전골수성 백혈병(APL; acute promyelocytic leukemia)을 갖지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 임의의 항-CD47 또는 항-SIRPα(신호 조절 단백질 알파) 제제를 이용한 사전 치료를 받지 않았다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 B형 및 C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV; human immunodeficiency virus), 후천성 면역결핍 증후군(AIDS; acquired immunodeficiency syndrome) 관련 질병, 또는 sars-cov-2(중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2)를 포함하는, 공지된 활성 바이러스 감염을 갖지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 약 60 mg/kg 이하의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 4주마다 1회(q4w) 약 60 mg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 저메틸화제는 아자시티딘(azacitidine), 데시타빈(decitabine), 5-플루오로-2'-데옥시시티딘, 제불라린(zebularine), CP-4200, RG108, 나나오마이신 A(nanaomycin A), 구아데시타빈(guadecitabine), RX-3117, EPI01, 안트로퀴노놀, CC-486, 또는 ASTX727이다. 일부 구현예에 있어서, 저메틸화제는 아자시티딘이다. 일부 구현예에 있어서, 아자시티딘은 1회 이상의 28일 주기로 개체에게 투여되며, 여기서 아자시티딘은 28일 주기마다 7일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 개체에게 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 아자시티딘은 1회 이상의 28일 주기로 투여되며, 여기서 아자시티딘은 각 28일 주기 중 5일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 개체에게 투여되고, 이어서 2일 동안 아자시티딘이 투여되지 않으며, 및 이후 추가적인 2일 동안 75 mg/m2의 용량으로 개체에게 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 아자시티딘은 정맥내 또는 피하 투여된다.
일부 구현예에 있어서, Bcl-2 억제제는 베네토클락스(venetoclax), ABT-737, 나비토클락스(navitoclax), BCL201, 또는 AZD-0466이다. 일부 구현예에 있어서, Bcl-2 억제제는 베네토클락스이다. 일부 구현예에 있어서, 베네토클락스는 1일차에 100 mg의 용량으로, 2일차에 200 mg의 용량으로, 및 2일차 이후 매일 400 mg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 베네토클락스는 1일차에 100 mg의 용량으로, 2일차에 200 mg의 용량으로, 및 3일차에 400mg의 용량으로, 및 3일차 이후 매일 600 mg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 베네토클락스는 경구 투여된다.
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 Fc 도메인 변이체의 N-말단에 융합되고, 융합 폴리펩티드는 약 60 mg/kg 이하의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 약 60 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 4주마다 1회(q4w) 약 60 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 약 45 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 3주마다 1회(q3w) 약 45 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 암은 혈액암이다. 일부 구현예에 있어서, 암은 고형 종양이다.
일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드의 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하고; 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 변이체는 하기이다: (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는 (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임.
본원에 제공된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이며, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 동종이량체(homodimer)를 형성한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 정맥내 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에 있어서, 필요로 하는 개체에서 암을 치료하기 위해 아자시티딘과 조합하여 사용하기 위한, 약제학적으로 허용가능한 담체에 융합 폴리펩티드를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 융합 폴리펩티드는 SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하고, SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 Fc 도메인 변이체의 N-말단에 융합되며, SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하고; Fc 도메인 변이체는 하기이며: (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는 (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 및 개체는 인간이다. 일부 구현예에 있어서, 암은 골수이형성 증후군(MDS) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)이다. 일부 구현예에 있어서, 암은 MDS이다. 일부 구현예에 있어서, MDS는 고위험 MDS이다.
일부 구현예에 있어서, 필요로 하는 개체에서 암을 치료하기 위해 아자시티딘 및 베네토클락스와 조합하여 사용하기 위한, 약제학적으로 허용가능한 담체에 융합 폴리펩티드를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 융합 폴리펩티드는 SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하고, SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 Fc 도메인 변이체의 N-말단에 융합되며, SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하고; Fc 도메인 변이체는 하기이며: (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는 (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 및 개체는 인간이다. 일부 구현예에 있어서, 암은 AML이다.
일부 구현예에 있어서, 키트는 아자시티딘을 1회 이상의 28일 주기로 IV 주입에 의해 또는 피하 투여하기 위한 지침을 추가로 포함하며, 여기서 아자시티딘은 각 28일 주기의 7일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 개체에게 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 키트는 아자시티딘을 1회 이상의 28일 주기로 IV 주입에 의해 또는 피하 투여하기 위한 지침을 추가로 포함하며, 여기서 아자시티딘은 각 28일 주기 중 5일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 개체에게 투여되고, 이어서 2일 동안 아자시티딘이 투여되지 않으며, 및 이후 추가적인 2일 동안 75 mg/m2의 용량으로 개체에게 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 키트는 베네토클락스를 1일차에 100 mg, 2일차에 200 mg, 및 2일차 이후 매일 400 mg의 용량으로 경구 투여하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 키트는 베네토클락스를 1일차에 100 mg, 2일차에 200 mg, 및 3일차에 400 mg, 및 3일차 이후 매일 600 mg의 용량으로 경구 투여하기 위한 지침을 추가로 포함한다.
키트의 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이며, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 동종이량체를 형성한다. 일부 구현예에 있어서, 키트는 융합 폴리펩티드를 60 mg/kg 이하의 용량으로 개체에게 투여하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 키트는 융합 폴리펩티드를 4주마다 1회(q4w) 60 mg/kg의 용량으로 개체에게 투여하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 키트는 융합 폴리펩티드를 IV 주입에 의해 투여하기 위한 지침을 추가로 포함한다.
도 1a는 대식세포에 의한 인간 HL60 세포의 포식작용에 대한 약물 A, 아자시티딘, 및 약물 A + 아자시티딘의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다. 도 1b는 대식세포에 의한 인간 OCI-AML3 세포의 포식작용에 대한 약물 A, 아자시티딘, 및 약물 A + 아자시티딘의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험 결과를 제공한다.
도 2는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC; peripheral blood mononuclear cell) 배양물에서 CD11c+ 수지상 세포의 생존능에 대한 약물 A, 아자시티딘, 및 약물 A + 아자시티딘의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 3a는 HL60, OCI-AML3, 및 MV4-11 인간 급성 골수성 백혈병 세포주의 표면 상의 칼레티쿨린 발현에 대한 아자시티딘의 효과를 평가하기 위해 수행된 시험관내 실험의 결과를 제공한다. 도 3b는 MV4-11 인간 급성 골수성 백혈병 세포주 및 2명의 인간 공여자의 1차 AML 모세포의 표면 상의 칼레티쿨린 발현에 대한 아자시티딘 또는 베네토클락스의 효과를 평가하기 위해 수행된 시험관내 실험의 결과를 제공한다. 도 3c는 MV4-11 인간 급성 골수성 백혈병 세포주 및 2명의 인간 공여자의 1차 AML 모세포의 표면 상의 CD47 발현에 대한 아자시티딘 또는 베네토클락스의 효과를 평가하기 위해 수행된 시험관내 실험의 결과를 제공한다.
도 4a는 HL60 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 종양 성장에 대한 약물 A, 아자시티딘, 및 약물 A + 아자시티딘의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다. 도 4b는 OCI-AML3 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 종양 성장에 대한 약물 A, 아자시티딘, 및 약물 A + 아자시티딘의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다. 도 4c는 MV4-11 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 종양 성장에 대한 약물 A, 아자시티딘, 및 약물 A + 아자시티딘의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다. 도 4d는 종양 퇴행을 나타낸 각 처리 군에서 MV4-11 이종이식된 마우스의 수를 나타낸다.
도 5a는 꼬리 정맥 주사를 통해 7.5E6개 세포/마우스의 농도로 HL60-LUC2가 이종이식된 마우스에서 종양 성장에 대한 약물 A, 아자시티딘, 및 약물 A + 아자시티딘의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험 결과를 제공한다. 도 5b는 접종 후 3, 8, 11, 14, 18, 및 22일차에 영상화된 마우스에서의 총 플럭스(발광) 대 시간(즉, 종양 크기 대 시간)에 관한 데이터를 제공한다. 처리는 IV 접종 후 4일차에 시작하였다. 도 5c는 147일차의 연구 종료까지 HL60-LUC2가 이종이식된 마우스에서 종양 성장에 대한 약물 A, 아자시티딘, 또는 약물 A + 아자시티딘의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다. 도 5d는 이미 14회 용량의 약물 A + 아자시티딘(예를 들어, 유도 요법)을 투여받은 HL60-LUC2가 이종이식된 마우스에서 종양 성장에 대한 약물 A 단독요법(예를 들어, 유지 요법)의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다
도 6a는 꼬리 정맥 주사를 통해 10 x 106개 세포/마우스 농도로 HL60-LUC2가 이종이식된 마우스에서 종양 성장에 대한 약물 A, 아자시티딘, 베네토클락스, 아자시티딘 + 베네토클락스, 또는 약물 A + 아자시티딘 + 베네토클락스의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다. 도 6b는 PBS(대조군), 아자시티딘, 베네토클락스, 약물 A, 아자시티딘 + 베네토클락스, 또는 아자시티딘 + 베네토클락스 + 약물 A를 이용하여 처리된 이종이식된 인간 HL-60LUC2 종양을 보유하는 마우스의 생존 확률(일수)을 나타낸다.
도 7a는 인간 단핵구-유래 대식세포에 의한 AML 세포의 포식작용에 대한 약물 A, 아자시티딘, 및 약물 A + 아자시티딘의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다. 도 7b는 인간 단핵구-유래 대식세포에 의한 AML 세포의 포식작용에 대한 약물 A, 베네토클락스, 및 약물 A + 베네토클락스의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 8은 80일 평가 기간 동안 HL60-LUC2가 이종이식된 마우스에서 종양 성장에 대한 약물 A, 베네토클락스, 또는 약물 A + 베네토클락스의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
하기 설명은 예시적인 방법, 파라미터 등을 제시한다. 그러나, 이러한 설명은 본 개시내용의 범위에 대한 제한으로서가 아니라 예시적인 구현예의 설명으로서 제공된다는 점을 인식해야 한다.
정의
용어 "약" 또는 "대략"은 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대해 허용가능한 오차 범위 이내를 의미하며, 이는 어떻게 값이 측정 또는 결정되는지, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 기술분야의 관행에 따라, 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 값의 10배(an order of magnitude) 이내, 바람직하게는 5배 이내, 및 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용가능한 오차 범위 이내를 의미하는 것으로 가정해야 한다.
본원에서 사용된 용어는 단지 특정 경우를 기재하기 위한 목적을 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 용어 "포함하는", "포함하다", "갖는", "갖는다", "~와", 또는 이들의 변형은 상세한 설명 또는 청구범위에서 사용되는 한, 이러한 용어는 용어 “포함하는”과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료", "치료하는" 등은 효과를 수득하기 위한 목적으로 제제를 투여하거나, 절차를 수행하는 것을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, 효과는 질환 또는 그것의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지한다는 점에서 예방적이다. 일부 구현예에 있어서, 효과는 질환 또는 질환의 증상에 대한 부분적 또는 완전한 치유에 영향을 미친다는 점에서 치료적이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "링커"는 2개의 요소, 예를 들어, 단백질 도메인 사이의 연결을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, 링커는 공유 결합 또는 스페이서일 수 있다. 용어 "스페이서"는 두 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 사이에 공간 또는 유연성(또는 공간 및 유연성 모두)을 제공하기 위해 두 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 사이에서 발생하는 모이어티(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG; polyethylene glycol) 중합체) 또는 아미노산 서열(예를 들어, 1-200의 아미노산 서열)을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, 아미노산 스페이서는 폴리펩티드의 1차 서열의 일부이다(예를 들어, 폴리펩티드 골격을 통해 이격된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인에 접합됨).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유효량"은, 예를 들어, 암, 예를 들어, 고형 종양 또는 혈액암과 같은 질환을 갖는 환자를 치료하는 데 있어서 목적하는 치료 효과를 달성하는데 충분하고 효과적인, SIRPα D1 도메인 또는 이의 변이체를 갖는 폴리펩티드와 같은, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 함유하는 약제학적 조성물의 양을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, 유효량의 폴리펩티드는 유해 부작용을 피할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적 조성물"은 활성 성분뿐만 아니라 부형제 또는 희석제(또는 부형제 및 희석제 모두)를 포함하고 활성 성분이 적합한 투여 방법에 의해 투여될 수 있도록 하는 의약 또는 약제학적 제형을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 폴리펩티드와 상용성인 약제학적으로 허용가능한 성분을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 약제학적 조성물은 경구 투여를 위한 정제 또는 캡슐 형태이거나, 예를 들어, 주사에 의한 정맥내 또는 피하 투여를 위한 수성 형태이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체", "개체", 및 "환자"는 척추동물, 예를 들어, 포유동물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 포유동물은 쥐과, 유인원, 인간, 가축, 스포츠 동물(sport animal), 및 애완 동물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 생체내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 실체(biological entity)의 조직, 세포, 및 이들의 자손 또한 포함된다. 어떤 용어도 의료 전문가의 감독을 수반하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "친화도" 또는 "결합 친화도"는 두 분자 사이의 결합 상호작용의 강도를 지칭한다. 일반적으로, 결합 친화도는 분자와 SIRPα D1 도메인 변이체 및 CD47과 같은, 그것의 결합 파트너 사이의 비-공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 결합 친화도는 결합 쌍의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는, 고유 결합 친화도를 지칭한다. 두 분자 사이의 결합 친화도는 통상적으로 해리 상수(dissociation constant)(KD) 또는 회합 상수(association constant)(KA)로 기재된다. 서로에 대한 결합 친화도가 낮은 두 분자는 일반적으로 서서히 결합하고, 쉽게 해리되는 경향이 있으며, 및 큰 KD를 나타낸다. 서로에 대해 높은 친화도를 갖는 두 분자는 일반적으로 용이하게 결합하고, 보다 오래 결합된 상태로 유지되는 경향이 있으며, 및 작은 KD를 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 두 상호작용하는 분자의 KD는 공지된 방법 및 기술, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR; surface plasmon resonance)을 사용하여 결정된다. KD는 koff/kon의 비율로 계산될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 " ~ 보다 작은 KD"는 인용된 KD 값에 대해 수치적으로 더 작은 KD 값 및 증가하는 결합 친화도를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "~ 보다 큰 KD"는 인용된 KD 값에 대해 수치적으로 더 큰 KD 값 및 감소하는 결합 친화도를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "~와 함께(in conjunction with)"는 또 다른 치료 양식(treatment modality)에 더하여 한 치료 양식의 시행을 지칭한다. 이와 같이, "~와 함께"는 개체에게 다른 치료 양식을 시행하기 전, 시행하는 동안, 또는 시행한 후에 한 치료 양식을 시행하는 것을 지칭한다.
개요
(a) CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제 및 (b) 저메틸화제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체(예를 들어, 인간 개체)에서 암(예를 들어, 골수이형성 증후군("MDS")과 같은 골수암)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에 있어서, 급성 골수성 백혈병("AML")을 치료하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제는 CD47-SIRPα 경로의 소분자 억제제(예를 들어, RRX-001 및 기타)이다. 예를 들어, Miller 등 (2019) “Quantitative high-throughput screening assays for the discovery and development of SIRPα-CD47 interaction inhibitors.” PLoS ONE 14(7): e0218897 및 Sasikumar 등 ACR-NCI-EORTC International Conference: Molecular Targets and Cancer Therapeutics; October 26-30, 2017; Philadelphia, PA; Abstract B007을 참조한다.
일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제는 CD47(예를 들어, hCD47)과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 제제는 약 10 nM 또는 더 나은(better) KD(예컨대, 적어도 약 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 750 pM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 20 pM 10 pM 또는 10 pM 미만 중 임의의 하나)로 CD47(예를 들어, hCD47)과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 결합하는 제제는 인간 대상체에서 적어도 약 50%의 CD47 수용체 점유율(receptor occupancy)(예를 들어, 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 약 100% 중 임의의 하나)을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 결합하는 제제는 약 80 ng/ml 이하, 예를 들어, 약 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5 ng/ml의 EC50을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 결합하는 제제는 항-CD47 항체(예를 들어, 치료적 항-CD47 항체) 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에 있어서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, scFv, 외팔 항체(one-armed antibody), 또는 디아바디(diabody)이다. 일부 구현예에 있어서, 항-CD47 항체는 단일특이적 항체이다. 일부 구현예에 있어서, 항-CD47 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체이다. 일부 구현예에 있어서, 용어 "항-CD47 항체"는 트리오맙(triomab), DART(즉, 이중-친화도 재-표적화 항체), TandAb(즉, 탠덤 디아바디), 탠덤 scFv, CrossMab, DNL(즉, 도크 앤 록 항체(dock and lock antibody)), DVD-Ig(즉, 이중 가변 도메인 면역글로불린), 4가 이중특이적 IgG, 나노바디, 이중 표적화 도메인, 및 ART-Ig(즉, 비대칭 재조작 기술-면역글로불린)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 항체-기반 작제물(예컨대, 다중특이적 작제물)을 포함한다. 예시적인 항체 작제물(단일특이적 및 다중특이적 모두)에 관한 추가적인 세부사항은 Husain 등 (2018) Biodrugs 32(5): 441-464 및 Spiess 등 (2015) Molecular Immunology 67(2): 95-106에 제공되어 있다. 일부 구현예에 있어서, 항-CD47 항체는 Hu5F9-G4, B6H12.2, BRIC126, CC-90002, SRF231, 또는 IBI188(Innovent Biologics로부터)이다(예를 들어, Zhao 등 (2011), PNAS USA 108:18342-18347; Chao 등 (2010) Cell 142:699-713, Kim 등 (2012) Leukemia 26:2538-2545; Chao 등 (2011) Blood 118:4890-4891; Goto 등 (2014) Eur J. Cancer 50:1836-1846; 및 Edris 등 (2012) PNAS USA 109:6656-61에서 이러한 항-CD47 항체에 대한 추가적인 정보를 참조한다).
일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제는 SIRPα(예를 들어, hSIRPα)와 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 제제는 약 10 nM 또는 더 나은 KD(예컨대, 적어도 약 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 750 pM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 20 pM 10 pM 또는 10 pM 미만 중 임의의 하나)로 SIRPα(예를 들어, hSIRPα)와 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα(예를 들어, hSIRPα)와 결합하는 제제는 인간 대상체에서 적어도 약 50%의 SIRPα 수용체 점유율(예를 들어, 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 약 100% 중 임의의 하나)을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα(예를 들어, hSIRPα)와 결합하는 제제는 약 80 ng/ml 이하, 예를 들어, 약 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5 ng/ml의 EC50을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα(예를 들어, hSIRPα)와 결합하는 제제는 항-SIRPα 항체(예를 들어, 치료적 항-SIRPα 항체) 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에 있어서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, scFv, 외팔 항체, 또는 디아바디이다. 일부 구현예에 있어서, 항-SIRPα 항체는 단일특이적 항체 또는 단일특이적 항체 작제물(상기 기재된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)이다. 일부 구현예에 있어서, 항-SIRPα 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체 또는 다중특이적 항체 작제물(상기 기재된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)이다. 일부 구현예에 있어서, 항-SIRPα 항체는 KWAR23, SE12C3, 040, 또는 MY-1(예를 들어, Ring 등 (2017) PNAS USA 114(49): E10578-E10585); Murata 등 (2018) Cancer Sci 109(5):1300-1308; 및 Yanigata 등 (2017) JCI Insight 2:e89140에서 이러한 항-SIRPα 항체에 대한 추가적인 정보를 참조한다). 일부 구현예에 있어서, 항-SIRPα 항체는 WO 2018/057669; US-2018-0105600-A1; US20180312587; WO2018107058; WO2019023347; US20180037652; WO2018210795; WO2017178653; WO2018149938; WO2017068164; 및 WO2016063233에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제는 항-SIRPβ 항체 또는 항-SIRPγ 항체(예를 들어, SIRPα와 결합할 수 있는 항-SIRPβ 항체 또는 항-SIRPγ 항체), 또는 이들의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에 있어서, 제제는 SIRPα, SIRPβ, 및 SIRPγ 중 둘 이상과 결합할 수 있는 항체(또는 이들의 항원 결합 단편)이다. 일부 구현예에 있어서, 이러한 항체는 약 10 nM 또는 더 나은 KD(예컨대, 적어도 약 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 750 pM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 20 pM 10 pM 또는 10 pM 미만 중 임의의 하나)로 SIRPα(예를 들어, hSIRPα)와 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 항체는 인간 대상체에서 적어도 약 50%의 SIRPα 수용체 점유율(예를 들어, 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 약 100% 중 임의의 하나)을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 항체는 약 80 ng/ml 이하, 예를 들어, 약 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5 ng/ml의 EC50을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, scFv, 외팔 항체, 또는 디아바디이다. 일부 구현예에 있어서, 항체는 단일특이적 항체 또는 단일특이적 항체 작제물(상기 기재된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)이다. 일부 구현예에 있어서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체 또는 다중특이적 항체 작제물(상기 기재된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)이다.
일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제는 CD47과 결합하는 모이어티를 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 항체 Fc 영역 및 CD47과 결합하는 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 결합하는 융합 폴리펩티드의 부분은 약 10 nM 또는 더 나은 KD(예컨대, 적어도 약 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 750 pM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 20 pM 10 pM 또는 10 pM 미만 중 임의의 하나)로 CD47(예를 들어, hCD47)과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 인간 대상체에서 적어도 약 50%의 CD47 수용체 점유율(예를 들어, 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 약 100% 중 임의의 하나)을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 약 80 ng/ml 이하, 예를 들어, 약 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5 ng/ml 중 임의의 하나의 EC50을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 WT 인간 항체 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 WT Fc 영역과 비교하여 감소된(예를 들어, 예컨대, 제거된(ablated)) 효과기 기능(effector function)을 나타내는 Fc 변이체(예를 들어, WT 인간 항체 Fc 영역의 변이체)를 포함한다. 예시적인 Fc 변이체는 WO 2017/027422 및 US 2017/0107270에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 결합하는 모이어티는 WT SIRPα(예를 들어, hSIRPα), 또는 WT SIRPγ(예를 들어, hSIRPγ)이다. 일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 결합하는 모이어티는 WT SIRPα(예를 들어, hSIRPα), 또는 WT SIRPγ(예를 들어, hSIRPγ)의 CD47-결합 단편(예를 들어, d1 도메인)이다. 일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 결합하는 모이어티는 SIRPα 변이체, SIRPγ 변이체, SIRPβ 변이체, 또는 이들의 CD47-결합 단편(예를 들어, d1 도메인)이다. 예시적인 SIRPγ 변이체, SIRPβ1 변이체, 및 SIRPβ2 변이체는, 예를 들어, WO 2013/109752; US 2015/0071905; USP 9,944,911; WO 2016/023040; WO 2017/027422; US 2017/0107270; USP 10,259,859; US9845345; WO2016187226; US20180155405; WO2017177333; WO2014094122; US2015329616; US20180312563; WO2018176132; WO2018081898; WO2018081897; PCT/US2019/048921; US20180141986A1; 및 EP3287470A1에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제는 항체 Fc 영역 및 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα 변이체는 약 10 nM 또는 더 나은 KD(예컨대, 적어도 약 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 750 pM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 20 pM 10 pM 또는 10 pM 미만 중 임의의 하나)로 CD47(예를 들어, hCD47)과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 인간 대상체에서 적어도 약 50%의 CD47 수용체 점유율(예를 들어, 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 약 100% 중 임의의 하나)을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 약 80 ng/ml 이하, 예를 들어, 약 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5 ng/ml 중 임의의 하나의 EC50을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 WT 인간 항체 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 WT Fc 영역, 예컨대, 본원에 인용된 참고문헌에 기재된 것들과 비교하여 감소된(예를 들어, 에컨대, 제거된) 효과기 기능을 나타내는 Fc 변이체(예를 들어, WT 인간 항체 Fc 영역의 변이체)를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 WO 2013/109752; US 2015/0071905; WO 2016/023040; WO 2017/027422; US 2017/0107270; USP 10,259,859; US9845345; WO2016187226; US20180155405; WO2017177333; WO2014094122; US2015329616; US20180312563; WO2018176132; WO2018081898; WO2018081897; US20180141986A1; 및 EP3287470A1에 기재된 SIRPα 변이체를 포함하며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에 있어서, 항체 Fc 영역 및 SIRPα 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드는 TTI-621, TTI-622, 또는 IMM01이다(예를 들어, Petrova 등 (2017) Clin Cancer Res 23:1086-1079; Russ 등 (2018) Blood Rev S0268-960X(17)30093-0; Zhang, X, Chen, W, Fan, J 등 Disrupting CD47-SIRPα axis alone or combined with autophagy depletion for the therapy of glioblastoma. Carcinogenesis 2018; 39: 689-99를 참조한다).
일부 구현예에 있어서, CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제는 SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 SIRPα D1 도메인 변이체) 및 Fc 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 Fc 도메인 변이체)를 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 이용한 치료 방법에 관한 추가 세부사항은 하기에 기재되어 있다. 또한 WO 2017/027422 및 미국 특허 번호 제10,259,859호를 참조하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
또한, SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 4주마다 1회(q4w) 약 60 mg/kg의 용량으로 투여된다. 또한, SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 3주마다 1회(q3w) 약 45 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 적어도 하나의 추가적인 항암제와 조합하여 투여된다.
신호-조절 단백질 α(SIRPα) D1 도메인 및 이의 변이체
일부 구현예에 있어서, 야생형 SIRPα D1 도메인(예를 들어, 서열번호 1 또는 2에 제시된 야생형 SIRPα D1 도메인)에 대해 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66, 및 잔기 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기에서 야생형 SIRPα D1 도메인(예를 들어, 서열번호 1 또는 2에 제시된 야생형 SIRPα D1 도메인)에 대해 적어도 하나의 추가적인 아미노산 돌연변이를 포함하는, SIRPα D1 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 신호-조절 단백질 α(SIRP-α) D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시된다.
또한, 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시되며, 여기서 Fc 도메인 변이체 이량체는 2개의 Fc 도메인 변이체를 포함하고, 각각의 Fc 도메인 변이체는 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A, 및 N297A로 이루어진 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 이루어진 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역으로부터 독립적으로 선택된다.
신호-조절 단백질 α("SIRP-α" 또는 "SIRP-알파")는 골수 세포의 막 상에서 광범위하게 발현되는 Ig 수퍼패밀리에 속하는 막관통 당단백질이다. SIRPα는 신체의 많은 세포 유형 상에서 널리 발현되는 단백질인 CD47과 상호작용한다. SIRPα와 CD47의 상호작용은 다르게는 면역계에 의해 인식될 수 있는, "자기(self)" 세포의 탐식(engulfment)을 방지한다. 종양 세포에 대한 높은 CD47 발현은, 급성 골수성 백혈병 및 여러 고형 종양 암에서, 생존에 대한 부정적인 예후 인자로 작용할 수 있는 것으로 관찰되었다.
천연 SIRPα는 3개의 고도로 상동성인 면역글로불린(Ig)-유사 세포외 도메인-D1, D2, 및 D3을 포함한다. SIRPα D1 도메인("D1 도메인")은 SIRPα의 막 원위, 세포외 도메인을 지칭하며 CD47에 대한 SIRPα의 결합을 매개한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "SIRPα 폴리펩티드"는 CD47에 결합할 수 있는 임의의 SIRPα 폴리펩티드 또는 이의 단편을 지칭한다. 야생형 인간 SIRPα에는 적어도 10개의 변이체가 존재한다. 표 1 은 천연 발생 야생형 인간 SIRPα D1 도메인 변이체의 D1 도메인의 아미노산 서열(서열번호 1 및 2)을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα 폴리펩티드는 SIRPα D1 도메인을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα 폴리펩티드는 서열번호 1 및 2에 제공된 것들과 같은, 야생형 D1 도메인을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα 폴리펩티드는 야생형 인간 SIRPα의 D2 또는 D3 도메인(또는 D2 및 D3 도메인 모두)을 포함한다(표 3 참조).
Figure pct00001
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "SIRPα D1 도메인 변이체"는 야생형 SIRPα보다 CD47에 대해 더 높은 친화도를 갖는 SIRPα D1 도메인 또는 SIRPα 폴리펩티드의 CD47-결합 부분을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. SIRPα D1 도메인 변이체는 야생형 SIRPα에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입(또는 이들의 조합)을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 SIRPα D1 도메인 변이체는 SIRPα D1 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 1 및 2에 나타낸 야생형 D1 도메인에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 포함한다. 표 2 는 각각의 SIRPα D1 도메인 변이체(서열번호 13-14)에서의 예시적인 아미노산 치환을 열거한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 폴리펩티드 또는 SIRPα D1 도메인 변이체는 D1 도메인의 단편을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα 폴리펩티드 단편 또는 SIRPα D1 도메인 변이체 단편은 10개 미만의 아미노산 길이, 약 10개 아미노산 길이, 약 20개 아미노산 길이, 약 30개 아미노산 길이, 약 40개 아미노산 길이, 약 50개 아미노산 길이, 약 60개 아미노산 길이, 약 70개 아미노산 길이, 약 80개 아미노산 길이, 약 90개 아미노산 길이, 약 100개 아미노산 길이, 또는 약 100개 초과의 아미노산 길이의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 단편은 CD47에 결합하는 능력을 보유한다.
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 본 개시내용의 폴리펩티드는 야생형 인간 SIRPα D1 도메인보다 CD47에 대해 더 높은 결합 친화도로 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 천연 발생 D1 도메인의 친화도보다 적어도 1배(예를 들어, 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배 또는 5배 초과)의 친화도로 인간 CD47에 결합한다, 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 천연 발생 D1 도메인의 친화도보다 적어도 1배(예를 들어, 적어도 10배, 100배, 1000배 또는 1000배 초과)의 친화도로 인간 CD47에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "최적화된 친화도" 또는 "최적화된 결합 친화도"는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 본원에 개시된 폴리펩티드와 CD47 사이의 결합 상호작용의 최적화된 강도를 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 암 세포 상의 CD47에 주로 또는 더 높은 친화도로 결합하고 비-암 세포 상의 CD47에 실질적으로 결합하지 않거나 더 낮은 친화도로 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드와 CD47 사이의 결합 친화도는 상호작용이 최대 친화도로 결합하는 변이체와 비교하여 임상적으로 관련된 독성을 유발하지 않거나 독성을 감소시키도록 최적화된다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 제공된 폴리펩티드와 CD47 사이의 최적화된 결합 친화도를 달성하기 위해, SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 최대로 달성가능한 것보다 CD47에 대해 더 낮은 결합 친화도를 갖도록 개발된다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 SIRPα D1 도메인 변이체는 설치류, 비-인간 영장류(NHP; non-human primate), 및 인간 CD47과 교차 반응한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "면역원성"은 마치 그것이 외래 항원인 것처럼 숙주에서 면역 반응을 유발하는 단백질(예를 들어, 치료적 단백질)의 특성을 지칭한다. 단백질의 면역원성은 시험관내 T-세포 증식 검정과 같은, 다양한 상이한 방식으로 시험관내 검정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "최소 면역원성"은 아미노산 치환이 도입되기 전(예를 들어, 비변형된 단백질)의 면역원성보다 더 낮게(예를 들어, 적어도 10%, 25%, 50%, 또는 100% 더 낮게), 예를 들어, 아미노산 치환을 통해 변형된 단백질(예를 들어, 치료적 단백질)의 면역원성을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, 단백질(예를 들어, 치료적 단백질)은 최소 면역원성을 갖도록 변형되고 그것이 외래 항원이더라도 숙주 면역 반응을 전혀 또는 거의 유발하지 않는다.
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 최소 면역원성을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 대상체에게 투여된 본 개시내용의 SIRPα 폴리펩티드는 SIRPα D1 도메인 변이체의 친화도를 증가시키는 아미노산 변화를 제외하고, 대상체의 생물학적 샘플에서 SIRPα 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 폴리펩티드 변이체는 항-CD47 항체 또는 야생형 SIRPα와 비교하여 부작용의 위험을 낮춘다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 폴리펩티드 변이체는 항-CD47 항체 또는 야생형 SIRPα와 비교하여 빈혈의 위험을 낮춘다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 폴리펩티드 변이체는 설치류 또는 비-인간 영장류(NHP) 연구에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다.
표 2 는 각각의 D1 도메인 서열에 대한 SIRPα D1 도메인 변이체의 특정 아미노산 치환을 열거한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 표 2 에 열거된 치환 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 그 이상)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 야생형 D1 도메인에 대해 최대 14개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 야생형 D1 도메인에 대해 최대 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 야생형 D1 도메인에 대해 최대 7개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 SIRPα D1 도메인 변이체는 야생형 D1 도메인의 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 95%, 97% 또는 97% 초과)의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 둘 이상의 야생형 D1 도메인 또는 이의 변이체의 일부(예를 들어, 하나의 야생형 D1 도메인 또는 이의 변이체의 일부 및 또 다른 야생형 D1 도메인 또는 이의 변이체의 일부)를 포함하는 키메라 SIRPα D1 도메인 변이체이다. 일부 구현예에 있어서, 키메라 SIRPα D1 도메인 변이체는 야생형 D1 도메인 또는 이의 변이체의 적어도 두 부분(예를 들어, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 부분)을 포함하며, 여기서 부분의 각각은 상이한 야생형 D1 도메인으로부터 유래된다. 일부 구현예에 있어서, 키메라 SIRPα D1 도메인 변이체는 표 2 에 열거된 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
Figure pct00002
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 하기 서열을 포함하는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하며:
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 13), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는 I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이며; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이며; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이며; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이며; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이며; X13은 F, L, 또는 V이고; 및 X14는 F 또는 V이며; 및 여기서 변이체는 서열번호 1의 서열을 포함하는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 13의 서열을 포함하는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X2는 V, L, 또는, I이다. 일부 구현예에 있어서, X3은 A 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X4는 A, I, 또는 L이다. 일부 구현예에 있어서, X5는 I, T, S, 또는 F이다. 일부 구현예에 있어서, X6은 E, V, 또는 L이다. 일부 구현예에 있어서, X7은 K 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X8은 E 또는 Q이다. 일부 구현예에 있어서, X9는 H, P, 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X10은 L, T, 또는 G이다. 일부 구현예에 있어서, X11은 K 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X12는 V 또는 I이다. 일부 구현예에 있어서, X13은 F, L, V이다. 일부 구현예에 있어서, X14는 F 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 포함하는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 6개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 포함하는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 포함하는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 포함하는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 1000배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 M 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 내지 100 nM, 약 100 nM 내지 50 nM, 약 50 nM 내지 10 nM, 약 10 nM 내지 5 nM, 약 5 nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 500 pM, 약 500 pM 내지 100 pM, 약 100 pM 내지 50 pM, 또는 약 50 pM 내지 10 pM의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 하기 서열을 포함하는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 14), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이며; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이며; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이며; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이며; X11은 K 또는 R이고; X12는 V 또는 I이며; X13은 F, L, 또는 V이고; 및 X14는 F 또는 V이며; 및 여기서 변이체는 서열번호 2의 서열을 포함하는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 14의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X2는 V, L, 또는, I이다. 일부 구현예에 있어서, X3은 A 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X4는 V, I, 또는 L이다. 일부 구현예에 있어서, X5는 I, T, S, 또는 F이다. 일부 구현예에 있어서, X6은 E, V, 또는 L이다. 일부 구현예에 있어서, X7은 K 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X8은 E 또는 Q이다. 일부 구현예에 있어서, X9는 H, P, 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X10은 S, T, 또는 G이다. 일부 구현예에 있어서, X11은 K 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X12는 V 또는 I이다. 일부 구현예에 있어서, X13은 F, L, 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X14는 F 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 포함하는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 6개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 1000배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 M 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 내지 100 nM, 약 100 nM 내지 50 nM, 약 50 nM 내지 10 nM, 약 10 nM 내지 5 nM, 약 5 nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 500 pM, 약 500 pM 내지 100 pM, 약 100 pM 내지 50 pM, 또는 약 50 pM 내지 10 pM의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 하기 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하며:
EEEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23NITPADAGTYYCX24KX25RKGSPDX26X27EX28KSGAGTELSVRX29KPS(서열번호 23), 여기서 X1은 E 또는 G이고; X2는 L, I, 또는 V이며; X3은 V, L, 또는 I이고; X4는 S 또는 F이며; X5는 L 또는 S이고; X6은 S 또는 T이며; X7은 A 또는 V이고; X8은 I 또는 T이며; X9는 H 또는 R이고; X10은 A, V, I, 또는 L이며; X11은 I, T, S, 또는 F이고; X12는 A 또는 G이며; X13은 E, V, 또는 L이고; X14는 K 또는 R이며; X15는 E 또는 Q이고; X16은 H, P, 또는 R이며; X17은 D 또는 E이고; X18은 S, L, T, 또는 G이며; X19는 K 또는 R이고; X20은 E 또는 D이며; X21은 S 또는 P이고; X22는 S 또는 R이며; X23은 S 또는 G이고; X24는 V 또는 I이며; X25는 F, L, V이고; X26은 D이거나 부재하며; X27은 T 또는 V이고; X28은 F 또는 V이며; 및 X29는 A 또는 G이고; 및 여기서 변이체는 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시내용의 이러한 측면의 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X2는 L, I, 또는 V이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X3은 V, L, 또는 I이다. 일부 구현예에 있어서, X4는 S 또는 F이다. 일부 구현예에 있어서, X5는 L 또는 S이다. 일부 구현예에 있어서, X6은 S 또는 T이다. 일부 구현예에 있어서, X7은 A 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X8은 I 또는 T이다. 일부 구현예에 있어서, X9는 H 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X10은 A, V, I, 또는 L이다. 일부 구현예에 있어서, X11은 I, T, S, 또는 F이다. 일부 구현예에 있어서, X12는 A 또는 G이다. 일부 구현예에 있어서, X13은 E, V, 또는 L이다. 일부 구현예에 있어서, X14는 K 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X15는 E 또는 Q이다. 일부 구현예에 있어서, X16은 H, P, 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X17은 D 또는 E이다. 일부 구현예에 있어서, X18은 S, L, T, 또는 G이다. 일부 구현예에 있어서, X19는 K 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X20은 E 또는 D이다. 일부 구현예에 있어서, X21은 S 또는 P이다. 일부 구현예에 있어서, X22는 S 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X23은 S 또는 G이다. 일부 구현예에 있어서, X24는 V 또는 I이다. 일부 구현예에 있어서, X25는 F, L, V이다. 일부 구현예에 있어서, X26은 D이거나 부재하다. 일부 구현예에 있어서, X27은 T 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X28은 F 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X29는 A 또는 G이다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 6개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 1000배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 M 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 내지 100 nM, 약 100 nM 내지 50 nM, 약 50 nM 내지 10 nM, 약 10 nM 내지 5 nM, 약 5 nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 500 pM, 약 500 pM 내지 100 pM, 약 100 pM 내지 50 pM, 또는 약 50 pM 내지 10 pM의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 본 개시내용의 폴리펩티드는 표 3 에 나타낸 바와 같이 야생형 인간 SIRPα의 서열번호 24의 서열을 갖는 D2 도메인, 서열번호 25의 서열을 갖는 D3 도메인, 또는 서열번호 24의 서열을 갖는 D2 도메인 및 서열번호 25의 서열을 갖는 D3 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 D2 도메인의 단편 또는 변이체 또는 D3 도메인의 단편 또는 변이체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 D2 도메인의 단편 또는 변이체 및 D3 도메인의 단편 또는 변이체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 링커를 통해 D2 또는 D3 도메인에 접합된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 링커를 통해 D2 및 D3 도메인에 접합된다.
Figure pct00003
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 본 개시내용의 폴리펩티드는 폴리펩티드의 약동학적 특성을 개선하기 위해, 예를 들어, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 Fc 도메인 변이체에 부착된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 이량체화(dimerism)할 수 없는 Fc 도메인 변이체에 부착된다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 본원에 기재된 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 본 개시내용의 폴리펩티드는 표 4 에 나타낸 서열번호 26-36 중 임의의 하나의 서열을 포함하지 않는다.
Figure pct00004
일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 폴리펩티드 및 폴리펩티드 작제물은 면역 검정과 같은, 결합 검정을 위해 시험관내에서 활용된다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 폴리펩티드 및 폴리펩티드 작제물은 액상으로 활용되거나 고상 담체에 결합된다. 일부 구현예에 있어서, 면역검정에 활용되는 폴리펩티드는 다양한 방식으로 검출가능하게 표지된다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 폴리펩티드 및 폴리펩티드 작제물은 다양한 담체에 결합되고 특정 항원 발현 세포의 존재를 검출하기 위해 사용된다. 담체의 예는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 및 자철석을 포함한다. 담체의 성질은 용해성 또는 불용성일 수 있다.
다양한 상이한 표지 및 표지 방법이 공지되어 있다. 표지의 예는 효소, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 콜로이드 금속, 화학발광 화합물, 및 생물-발광 화합물을 포함한다. 본원에 개시된 폴리펩티드에 표지를 결합하기 위한 다양한 기술이 이용가능하다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 저분자량 합텐(hapten)에 커플링된다. 이러한 합텐은 제2 반응을 통해 구체적으로 검출된다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 합텐 비오틴(hapten biotin)이 아비딘(avidin)과 함께 사용되거나 합텐 디니트로페닐, 피리독살, 또는 플루오레세인이 특정 항-합텐 항체(예를 들어, 각각 항-디니트로페닐 항체, 항-피리독살 항체, 및 항-플루오레세인 항체)와 함께 검출된다.
변경된 글리코실화 패턴을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체
일부 구현예에 있어서, 야생형 SIRPα D1 도메인(예를 들어, 서열번호 1 또는 2에 제시된 야생형 SIRPα D1 도메인)에 대해 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66, 및 잔기 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기에서 야생형 SIRPα D1 도메인(예를 들어, 서열번호 1 또는 2에 제시된 야생형 SIRPα D1 도메인)에 대해 적어도 하나의 추가적인 아미노산 돌연변이를 갖는, SIRPα D1 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 신호-조절 단백질 α(SIRP-α) D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시된다.
또한, 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시되며, 여기서 Fc 도메인 변이체 이량체는 2개의 Fc 도메인 변이체를 포함하고, 각각의 Fc 도메인 변이체는 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A, 및 N297A로 이루어진 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 이루어진 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 조성물 중 폴리펩티드는 글리코실화가 감소되거나 최소인 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다. 표 1 의 서열번호 1 및 2의 D1 도메인은 각각 서열 N80ITP의 아미노산 N80에서 단일의 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위를 함유한다. 차이니즈 햄스터 난소(CHO; Chinese Hamster Ovary) 세포에서 SIRPα D1 도메인의 발현은 16 kDa의 메이저 밴드(비-글리코실화됨) 및 Endo Hf에 의해 제거된 고분자량의 마이너 밴드를 생성한다. Endo Hf는 엔도글리코시다제 H 및 말토스 결합 단백질의 재조합 단백질 융합이다. Endo Hf는 고만노스의 키토비오스 코어(chitobiose core) 내에서 N-연결 당단백질로부터 일부 하이브리드 올리고당을 절단한다. 이는 아미노산 위치 83의 프롤린이 글리코실화 효율을 감소시켜, 글리코실화 정도가 상이하고 따라서 이질성을 갖는 단백질로 이어질 수 있음을 의미한다. 약물 개발의 경우, 이질성으로 인해 공정 개발에서 문제가 발생할 수 있다. 따라서, 균질하고, 비-글리코실화된 형태의 SIRPα D1 도메인 변이체를 생성할 가능성을 조사하기 위해, 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 변이체의 아미노산 N80이 Ala로 돌연변이된다. 일부 구현예에 있어서, 비-글리코실화된 SIRPα D1 도메인 변이체를 제조하기 위해, SIRPα D1 도메인 변이체의 아미노산 N80이 임의의 천연 및 비-천연 발생 아미노산, 예를 들어, N80A 및 N80Q를 포함하는, 임의의 아미노산으로 대체된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 N80A 돌연변이 및 적어도 1개의 추가적인 돌연변이(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 이상의 추가적인 돌연변이)를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 추가적인 돌연변이는 CD47 결합 부위에 있다. 일부 구현예에 있어서, 추가적인 돌연변이는 D1 도메인의 소수성 코어에 있다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 조성물 중 폴리펩티드는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 글리코실화가 증가된 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다. 최종 생성물의 균질성을 증가시키는 또 다른 옵션은 아미노산 N80에서 글리코실화의 효율을 향상시키고 야생형에 대해 글리코실화가 증가된 SIRPα D1 도메인 변이체를 생성하는 것이다. 일부 구현예에 있어서, 서열 NITP83의 아미노산 P83은 아미노산 N80에서의 글리코실화 정도에 영향을 미친다. 일부 구현예에 있어서, P83을 임의의 아미노산으로 변화시키는 것은 N80에서의 글리코실화 효율을 증가시킨다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체의 아미노산 P83은 천연 및 비-천연 아미노산, 예를 들어, P83V, P83A, P83I, 및 P83L을 포함하는, 임의의 아미노산으로 대체된다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 폴리펩티드는, 예를 들어, 세포주의 유전자 조작(예를 들어, 유전자 조작된 효모 또는 포유동물 숙주) 또는 키푸넨신(kifunensine)의 첨가와 같은 세포 배양 조건의 변형 또는 원핵생물(대장균 등)과 같은 천연적 비-글리코실화 숙주를 사용함으로써, 이러한 세포에 의해 발현되는 단백질을 글리코실화하지 않도록 최적화된 세포에서 발현된다.
표 5 는 각각의 D1 도메인 변이체 서열에 대한 SIRPα D1 도메인 변이체의 특정 아미노산 치환을 열거한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 표 5 에 열거된 치환 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 그 이상)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 글리코실화되지 않거나 최소한으로 글리코실화된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 완전히 글리코실화되거나 거의 완전히 글리코실화된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 야생형 D1 도메인에 대해 최대 14개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 야생형 D1 도메인에 대해 최대 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 야생형 D1 도메인에 대해 최대 7개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 SIRPα D1 도메인 변이체는 야생형 D1 도메인의 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 95%, 97% 또는 97% 초과)의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 둘 이상의 야생형 D1 도메인 또는 이들의 변이체의 일부(예를 들어, 하나의 야생형 D1 도메인 또는 이의 변이체의 일부 및 또 다른 야생형 D1 도메인 또는 이의 변이체의 일부)를 포함하는 키메라 SIRPα D1 도메인 변이체이다. 일부 구현예에 있어서, 키메라 SIRPα D1 도메인 변이체는 야생형 D1 도메인 또는 이의 변이체의 적어도 두 부분(예를 들어, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 부분)을 포함하며, 여기서 부분의 각각은 상이한 야생형 D1 도메인으로부터 유래된다. 일부 구현예에 있어서, 키메라 SIRPα D1 도메인 변이체는 표 5 에 열거된 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 하기 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 37), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이며; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이며; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이며; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이며; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이며; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이며; X15는 F, L, 또는 V이고; 및 X16은 F 또는 V이며; 및 여기서 변이체는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 37의 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X2는 V, L, 또는, I이다. 일부 구현예에 있어서, X3은 A 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X4는 A, I, 또는 L이다. 일부 구현예에 있어서, X5는 I, T, S, 또는 F이다. 일부 구현예에 있어서, X6은 E, V, 또는 L이다. 일부 구현예에 있어서, X7은 K 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X8은 E 또는 Q이다. 일부 구현예에 있어서, X9는 H, P, 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X10은 L, T, 또는 G이다. 일부 구현예에 있어서, X11은 K 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 일부 구현예에 있어서, X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 일부 구현예에 있어서, X14는 V 또는 I이다. 일부 구현예에 있어서, X15는 F, L, V이다. 일부 구현예에 있어서, X16은 F 또는 V이다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 제공된 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 10개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 제공된 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 7개 이하의 아미노산 치환을 포함한다
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 1000배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 M 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 내지 100 nM, 약 100 nM 내지 50 nM, 약 50 nM 내지 10 nM, 약 10 nM 내지 5 nM, 약 5 nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 500 pM, 약 500 pM 내지 100 pM, 약 100 pM 내지 50 pM, 또는 약 50 pM 내지 10 pM의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 하기 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다:
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 38), 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이며; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이며; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이며; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이며; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이며; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이며; X15는 F, L, 또는 V이고; 및 X16은 F 또는 V이며; 및 여기서 변이체는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시내용의 이러한 측면의 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 38의 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X2는 V, L, 또는, I이다. 일부 구현예에 있어서, X3은 A 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X4는 V, I, 또는 L이다. 일부 구현예에 있어서, X5는 I, T, S, 또는 F이다. 일부 구현예에 있어서, X6은 E, V, 또는 L이다. 일부 구현예에 있어서, X7은 K 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X8은 E 또는 Q이다. 일부 구현예에 있어서, X9는 H, P, 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X10은 S, T, 또는 G이다. 일부 구현예에 있어서, X11은 K 또는 R이다. 일부 구현예에 있어서, X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 일부 구현예에 있어서, X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 일부 구현예에 있어서, X14는 V 또는 I이다. 일부 구현예에 있어서, X15는 F, L, 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X16은 F 또는 V이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 7개 이하의 아미노산 치환을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 1000배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 M 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 내지 100 nM, 약 100 nM 내지 50 nM, 약 50 nM 내지 10 nM, 약 10 nM 내지 5 nM, 약 5 nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 500 pM, 약 500 pM 내지 100 pM, 약 100 pM 내지 50 pM, 또는 약 50 pM 내지 10 pM의 KD로 CD47에 결합한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 개시내용은 하기 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다:
EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS(서열번호 47); 여기서 X1은 E 또는 G이고; X2는 L, I, 또는 V이며; X3은 V, L, 또는 I이고; X4는 S 또는 F이며; X5는 L 또는 S이고; X6은 S 또는 T이며; X7은 A 또는 V이고; X8은 I 또는 T이며; X9는 H, R, 또는 L이고; X10은 A, V, I, 또는 L이며; X11은 I, T, S, 또는 F이고; X12는 A 또는 G이며; X13은 E, V, 또는 L이고; X14는 K 또는 R이며; X15는 E 또는 Q이고; X16은 H, P, 또는 R이며; X17은 D 또는 E이고; X18은 S, L, T, 또는 G이며; X19는 K 또는 R이고; X20은 E 또는 N이며; X21은 S 또는 P이고; X22는 S 또는 R이며; X23은 S 또는 G이고; X24는 임의의 아미노산이며; X25는 임의의 아미노산이고; X26은 V 또는 I이며; X27은 F, L, V이고; X28은 D이거나 부재하며; X29는 T 또는 V이고; X30은 F 또는 V이며; 및 X31은 A 또는 G이고; 및 여기서 변이체는 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 47의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 E 또는 G이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X2는 L, I, 또는 V이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X3은 V, L, 또는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X4는 S 또는 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X5는 L 또는 S이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X6은 S 또는 T이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A 또는 V이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 I 또는 T이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X9는 H 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X10은 A, V, I, 또는 L이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X11은 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X12는 A 또는 G이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X13은 E, V, 또는 L이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X14는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X15는 E 또는 Q이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서 X16은 H, P, 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X17은 D 또는 E이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X18은 S, L, T, 또는 G이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X19는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X20은 E 또는 N이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X21은 S 또는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X22는 S 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X23은 S 또는 G이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X24는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X25는 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X26은 V 또는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X27은 F, L, V이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X28은 D이거나 부재한다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X29는 T 또는 V이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X30은 F 또는 V이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X31은 A 또는 G이다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 10개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 7개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 1000배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 M 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 내지 100 nM, 약 100 nM 내지 50 nM, 약 50 nM 내지 10 nM, 약 10 nM 내지 5 nM, 약 5 nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 500 pM, 약 500 pM 내지 100 pM, 약 100 pM 내지 50 pM, 또는 약 50 pM 내지 10 pM의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 하기 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다:
EEELQX1IQPDKSVX2VAAGEX3AX4LX5CTX6TSLX7PVGPIQWFRGAGPX8RX9LIYNQX10X11GX12FPRVTTVSX13X14TKRX15NMDFSIX16IX17X18ITPADAGTYYCX19KFRKGX20X21X22DX23EFKSGAGTELSVRAKPS(서열번호 48), 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 L 또는 S이며; X3은 T 또는 S이고; X4는 T 또는 I이며; X5는 R 또는 H이고; X6은 A, V, 또는 I이며; X7은 I, R, Y, K 또는 F이고; X8은 G 또는 A이며; X9는 E 또는 V이고; X10은 K 또는 R이며; X11은 E, D 또는 Q이고; X12는 H 또는 P이며; X13은 D 또는 E이고; X14는 S, L 또는 T이며; X15는 N 또는 E이고; X16은 R 또는 S이며; X17은 G 또는 S이고; X18은 N 또는 A이며; X19는 V 또는 I이고; X20은 S, I 또는 M이며; X21은 P이거나 부재하고; X22는 D 또는 P이며; 및 X23은 V 또는 T, 또는 이의 단편이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 개시내용은 하기 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함 하는 폴리펩티드를 특징으로 하며:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9ITPADAGTYYCX10KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS(서열번호 49), 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, I, V, 또는 L이며; X3은 I, F, S, 또는 T이고; X4는 E, V, 또는 L이며; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이며; X7은 H, P, 또는 R이고; X8은 L, T, S, 또는 G이며; X9는 A이고; 및 X10은 V 또는 I이며; 및 여기서 변이체는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 49의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 V, L 또는 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X2는 A, I, V, 또는 L이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X3은 I, F, S, 또는 T이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X4는 E, V, 또는 L이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X5는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X6은 E 또는 Q이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 H, P, 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 L, T, S 또는 G이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X9는 A이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X10은 V 또는 I이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 49에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 SIRPα D1 도메인을 포함하며, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10의 각각은 야생형 아미노산이 아니다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 1 중 임의의 하나의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 10개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 1 중 임의의 하나의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 7개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 1000배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 M 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 내지 100 nM, 약 100 nM 내지 50 nM, 약 50 nM 내지 10 nM, 약 10 nM 내지 5 nM, 약 5 nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 500 pM, 약 500 pM 내지 100 pM, 약 100 pM 내지 50 pM, 또는 약 50 pM 내지 10 pM의 KD로 CD47에 결합한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 개시내용은 하기 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 하며:
EEELQX1IQPDKSVSVAAGESAILHCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPARX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSEX8TKRENMDFSISISX9ITPADAGTYYCX10KFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS, (서열번호 50), 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 V 또는 I이며; X3은 I 또는 F이고; X4는 E 또는 V이며; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이며; X7은 H 또는 P이고; X8은 S 또는 T이며; X9는 N 또는 A이고; 및 X10은 V 또는 I이며; 및 여기서 변이체는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 50의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 V 또는 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X2는 V 또는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X3은 I 또는 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X4는 E 또는 V이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X5는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X6은 E 또는 Q이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 H 또는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 S 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X9는 N 또는 A이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X10은 V 또는 I이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 50에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 SIRPα D1 도메인을 포함하며, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10의 각각은 야생형 아미노산이 아니다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 10개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 7개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 1000배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 M 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 내지 100 nM, 약 100 nM 내지 50 nM, 약 50 nM 내지 10 nM, 약 10 nM 내지 5 nM, 약 5 nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 500 pM, 약 500 pM 내지 100 pM, 약 100 pM 내지 50 pM, 또는 약 50 pM 내지 10 pM의 KD로 CD47에 결합한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 개시내용은 하기 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 하며:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5EGX6FPRVTTVSDX7TKRNNMDFSIRIGX8ITPADAGTYYCX9KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS(서열번호 51), 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 A 또는 I이며; X3은 I 또는 F이고; X4는 E 또는 V이며; X5는 K 또는 R이고; X6은 H 또는 P이며; X7은 L 또는 T이고; X8은 N 또는 A이며; 및 X9는 V 또는 I이고; 및 여기서 변이체는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 51의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 V 또는 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X2는 A 또는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X3은 I 또는 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X4는 E 또는 V이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X5는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X6은 H 또는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 L 또는 T이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 N 또는 A이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X9는 V 또는 I이다. 일부 구현예에 있어서, X4는 V가 아니다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 51의 서열을 포함하며, 여기서 X8은 A이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X1은 V 또는 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X2는 A 또는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X3은 I 또는 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X4는 E 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, X4는 V가 아니다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X5는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X6은 H 또는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X7은 A 또는 V이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X9는 V 또는 I이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 51의 서열을 포함하며, 여기서 X8은 A이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X1은 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X2는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X3은 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X4는 V이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X5는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X6은 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X7은 T이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X8은 A이고 X9는 I이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 51에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 SIRPα D1 도메인을 포함하며, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, 및 X9의 각각은 야생형 아미노산이 아니다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 10개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 7개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 1000배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 M 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 내지 100 nM, 약 100 nM 내지 50 nM, 약 50 nM 내지 10 nM, 약 10 nM 내지 5 nM, 약 5 nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 500 pM, 약 500 pM 내지 100 pM, 약 100 pM 내지 50 pM, 또는 약 50 pM 내지 10 pM의 KD로 CD47에 결합한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 개시내용은 하기 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 하며:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRELIYNQX4EGX5FPRVTTVSDX6TKRNNMDFSIRIGX7ITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS(서열번호 222), 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, I, 또는 L이며; X3은 I, T, S, 또는 F이고; X4는 K 또는 R이며; X5는 H 또는 P이고; X6은 L, T, 또는 G이며; X7은 N 또는 A이고; 및 여기서 변이체는 서열번호 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 222의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X2는 A, I, 또는 L이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X3은 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X4는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X5는 H 또는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X6은 L, T, 또는 G이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 N 또는 A이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 222의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 V 또는 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X2는 A 또는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X3은 I 또는 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X4는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X5는 H 또는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X6은 L 또는 T이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 N 또는 A이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 222의 서열을 포함하며, 여기서 X7은 A이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X1은 V 또는 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X2는 A 또는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X3은 I 또는 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X4는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X5는 H 또는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X6은 L 또는 T이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 222의 서열을 포함하며, 여기서 X7은 A이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X1은 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X2는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X3은 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X4는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X5는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X6은 T이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 222에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 SIRPα D1 도메인을 포함하며, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7의 각각은 야생형 아미노산이 아니다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 10개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 7개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 1000배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 10개 미만의 아미노산 길이, 약 10개 아미노산 길이, 약 20개 아미노산 길이, 약 30개 아미노산 길이, 약 40개 아미노산 길이, 약 50개 아미노산 길이, 약 60개 아미노산 길이, 약 70개 아미노산 길이, 약 80개 아미노산 길이, 약 90개 아미노산 길이, 약 100개 아미노산 길이, 또는 약 100개 초과의 아미노산 길이의 폴리펩티드를 포함한다. 단편은 CD47에 결합하는 능력을 보유한다. 바람직하게는, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 및 이의 단편은 SIRPα 폴리펩티드가 CD47에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 CD47에 결합한다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 M 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 내지 100 nM, 약 100 nM 내지 50 nM, 약 50 nM 내지 10 nM, 약 10 nM 내지 5 nM, 약 5 nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 500 pM, 약 500 pM 내지 100 pM, 약 100 pM 내지 50 pM, 또는 약 50 pM 내지 10 pM의 KD로 CD47에 결합한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 개시내용은 하기 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 하며:
EEELQX1IQPDKSVSVAAGESAILHCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPARELIYNQX4EGX5FPRVTTVSEX6TKRENMDFSISISX7ITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS(서열번호 212), 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 V, I, 또는 L이며; X3은 I, T, S, 또는 F이고; X4는 K 또는 R이며; X5는 H, P, 또는 R이고; X6은 S, T, 또는 G이며; X7은 N 또는 A이고; 및 여기서 변이체는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 212의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 V, L, 또는 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X2는 V, I, 또는 L이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X3은 I, T, S, 또는 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X4는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X5는 H 또는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X6은 S, T, 또는 G이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 N 또는 A이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 212의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 V 또는 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X2는 V 또는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X3은 I 또는 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X4는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X5는 H 또는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X6은 S 또는 T이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 N 또는 A이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 212의 서열을 포함하며, 여기서 X7은 A이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X1은 V 또는 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X2는 V 또는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X3은 I 또는 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X4는 K 또는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X5는 H 또는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X6은 S 또는 T이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 212의 서열을 포함하며, 여기서 X7은 A이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X1은 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X2는 I이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X3은 F이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X4는 R이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X5는 P이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X7은 A이고 X6은 T이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 212에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 SIRPα D1 도메인을 포함하며, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, 및 X7의 각각은 야생형 아미노산이 아니다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 10개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 이러한 측면의 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 7개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 10배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인보다 적어도 1000배 더 큰 결합 친화도로 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 10개 미만의 아미노산 길이, 약 10개 아미노산 길이, 약 20개 아미노산 길이, 약 30개 아미노산 길이, 약 40개 아미노산 길이, 약 50개 아미노산 길이, 약 60개 아미노산 길이, 약 70개 아미노산 길이, 약 80개 아미노산 길이, 약 90개 아미노산 길이, 약 100개 아미노산 길이, 또는 약 100개 초과의 아미노산 길이의 폴리펩티드를 포함한다. 단편은 CD47에 결합하는 능력을 보유한다. 바람직하게는, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 및 이의 단편은 SIRPα 폴리펩티드가 CD47에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 CD47에 결합한다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 M 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 약 500 nM 내지 100 nM, 약 100 nM 내지 50 nM, 약 50 nM 내지 10 nM, 약 10 nM 내지 5 nM, 약 5 nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 500 pM, 약 500 pM 내지 100 pM, 약 100 pM 내지 50 pM, 또는 약 50 pM 내지 10 pM의 KD로 CD47에 결합한다.
일부 구현예에 있어서, 하기에 따른 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 기재되어 있으며:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9X10X11X12ADAGTYYCX13KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS(서열번호 218), 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, V, L, 또는 I이며; X3은 I, S, T, 또는 F이고; X4는 E, L, 또는 V이며; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이며; X7은 H, R, 또는 P이고; X8은 S, G, L, 또는 T이며; X9는 임의의 아미노산이고; X10은 임의의 아미노산이며; X11은 임의의 아미노산이고; X12는 임의의 아미노산이며; 및 X13은 V 또는 I이고; 및 여기서 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 212의 서열을 포함하며, 여기서 X1, 여기서 X9는 A이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X9는 N이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X10은 I이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X9는 N이고 X10은 P이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X9는 N이고 X11은 S, T, 또는 C 이외의 임의의 아미노산이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X11은 T이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X11은 T 이외의 아미노산이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X12는 P이다. 본 개시내용의 이러한 측면에서 전술한 구현예 중 임의의 것에 있어서, X9는 N이고 X12는 P 이외의 임의의 아미노산이다.
일부 구현예에 있어서, 하기에 따른 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 기재되어 있으며:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6GX7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9ITX10ADAGTYYCX11KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS(서열번호 219), 여기서 X1은 V, L, 또는 I이고; X2는 A, V, L, 또는 I이며; X3은 I, S, T, 또는 F이고; X4는 E, L, 또는 V이며; X5는 K 또는 R이고; X6은 E 또는 Q이며; X7은 H, R, 또는 P이고; X8은 S, G, L, 또는 T이며; X9는 N이고; X10은 P 이외의 임의의 아미노산이며; 및 X11은 V 또는 I이고; 및 여기서 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 1에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에 있어서, 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 SIRPα 폴리펩티드가 CD47에 결합하는 것과 비교하여 더 높은 친화도로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드는 1 x 10-8 M 미만, 또는 1 x 10-9 M 미만, 1 x 10-10 M 미만 또는 1 x 10-11 미만의 KD로 CD47에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 상기-언급된 SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 부착되거나 융합된다. 일부 구현예에 있어서, 제2 폴리펩티드는 Fc 폴리펩티드, Fc 변이체 또는 전술한 것의 단편을, 제한 없이, 포함한다.
전술한 것을 제한하지 않고, 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드는 표 6 에 나타낸 서열번호 53-87 및 213 중 임의의 하나로부터 선택된다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 표 6 에 제공된 임의의 변이체에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 표 6 에 제공된 서열번호 80, 81, 또는 85에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 SIRPα D1 도메인을 포함한다.
Fc 도메인 변이체 및 이를 포함하는 융합 폴리펩티드
일부 구현예에 있어서, 야생형 SIRPα D1 도메인(예를 들어, 서열번호 1 또는 2에 제시된 야생형 SIRPα D1 도메인)에 대해 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66, 및 잔기 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기에서 야생형 SIRPα D1 도메인(예를 들어, 서열번호 1 또는 2에 제시된 야생형 SIRPα D1 도메인)에 대해 적어도 하나의 추가적인 아미노산 돌연변이를 갖는, SIRPα D1 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 신호-조절 단백질 α(SIRP-α) D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시된다.
또한, 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체 이량체가 본원에 개시되며, 여기서 Fc 도메인 변이체 이량체는 2개의 Fc 도메인 변이체를 포함하고, 각각의 Fc 도메인 변이체는 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A, 및 N297A로 이루어진 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 이루어진 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역으로부터 독립적으로 선택된다.
세포 표면 항원을 표적으로 하는 항체는 면역 세포에 대한 Fc 수용체(FcR; Fc receptor) 연계(engagement)와 연관된 면역자극 및 효과기 기능을 유발할 수 있다. IgG(감마 수용체), IgE(에타 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)을 포함하여, 특정 부류의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 결합은 항체-코팅된 입자의 포식작용(항체-의존성 세포-매개 포식작용, 또는 ADCP(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)), 면역 복합체의 소거(clearance), 살해 세포에 의한 항체-코팅된 세포의 용해(항체-의존성 세포-매개 세포독성, 또는 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)) 및, 염증 매개체(inflammatory mediator)의 방출, 태반 통과(placental transfer), 및 면역글로불린 생성의 제어를 포함하는 다수의 생물학적 반응을 유발할 수 있다. 또한, 항체에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체계를 활성화할 수 있다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 용해에 중요할 수 있다. 그러나, 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극할 수 있으며 자가면역 과민증 또는 기타 면역학적 장애에 관여할 수도 있다. 특정한 Fc 수용체에 결합하는 능력이 감소되거나 제거된 변이체 Fc 영역은 국소 세포 또는 조직을 손상시키거나 파괴하지 않으면서 리간드 기능을 표적화, 활성화, 또는 중화함으로써 작용하는 치료적 항체 및 Fc-융합 폴리펩티드 작제물의 개발에 유용하다.
일부 구현예에서, SIRPα D1 폴리펩티드 작제물은 제거되거나 감소된 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인을 형성하는 Fc 도메인 변이체에 연결된 비-천연 발생 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 제2 및 제3 항체 불변 도메인(예를 들어, CH2 및 CH3)을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 또한 힌지 도메인(hinge domain)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 IgG, IgE, IgM, IgA, 및 IgD를 포함하는, 임의의 면역글로불린 항체 동형(isotype)이다. 또한, 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 임의의 IgG 아형(subtype)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, 및 IgG4)이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 Fc 도메인과 Fc 수용체 사이의 상호작용을 변경하는 야생형 Fc 도메인 단량체 서열에 대해 10개 만큼 많은 아미노산 변형(예를 들어, 삽입, 결실 및/또는 치환)(예를 들어, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4개의 아미노산 치환, 부가 또는 삽입, 결실, 또는 이들의 조합)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 도메인 이량체"는 2개의 Fc 도메인의 이량체를 지칭한다. 야생형 Fc 도메인 이량체에서, 2개의 CH3 항체 불변 도메인 사이의 상호작용에 의한 2개의 야생형 Fc 도메인 이량체화뿐만 아니라 2개의 이량체화된 Fc 도메인의 힌지 도메인 사이에 형성되는 하나 이상의 이황화 결합.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "Fc 도메인 이량체 변이체"는 적어도 하나의 Fc 도메인 변이체를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체는 효과기 기능이 결여되도록 돌연변이된 Fc 도메인 변이체, 예를 들어, "사멸된 Fc 도메인 이량체 변이체"를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체 내의 Fc 도메인의 각각은 CH2 항체 불변 도메인 내 아미노산 치환을 포함하여 Fc 도메인 이량체 변이체와 Fc 수용체, 예컨대, Fcγ 수용체(FcγR), Fcα 수용체(FcαR), 또는 Fcε(FcεR) 사이의 상호작용 또는 결합을 감소시킨다.
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 표 2, 5, 및 6에 기재된 변이체 중 임의의 것)는 면역글로불린의 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 변이체의 단편에 융합된다. 일부 구현예에 있어서, 면역글로불린의 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 변이체의 단편은 또 다른 Fc 도메인 변이체와 Fc 도메인 이량체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 면역글로불린의 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 변이체의 단편은 또 다른 Fc 도메인 변이체와 Fc 도메인 이량체를 형성할 수 없다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 변이체의 단편은 본 개시내용의 폴리펩티드에 융합되어 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킨다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 폴리펩티드에 융합된 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 변이체의 단편은 제2 Fc 도메인 변이체와 이량체화하여 Fc 수용체와 결합하는 Fc 도메인 이량체 변이체를 형성하거나, 또는 대안적으로, Fc 수용체와 결합하는 Fc 도메인 변이체를 형성한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 폴리펩티드에 융합된 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 변이체의 단편은 임의의 면역계-관련 반응을 유도하지 않는다.
일부 구현예에 있어서, 본원에서 제공되는 SIRPα 폴리펩티드 또는 작제물은 제1 Fc 도메인 변이체에 접합된 SIRPα D1 도메인 또는 이의 변이체 및 제2 Fc 도메인 변이체에 접합된 항체 가변 도메인을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Fc 도메인 변이체는 조합하여 Fc 도메인 이량체 변이체(예를 들어, 이종이량체성(heterodimeric) Fc 도메인 이량체 변이체)를 형성한다. Fc 도메인 이량체는 면역글로불린의 C-말단에서 발견되는 단백질 구조이다. Fc 도메인 이량체는 CH3 항체 불변 도메인 사이의 상호작용에 의해 이량체화된 2개의 Fc 도메인을 포함한다. 야생형 Fc 도메인 이량체는 Fc 수용체, 예를 들어, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb, 및 FcγRIV에 결합하는 최소 구조를 형성한다.
Fc 도메인 이량체는 항체를 그것의 표적에 결합시키는 데 직접적으로 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여와 같은, 다양한 효과기 기능에 관여할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 SIRPα 폴리펩티드 또는 작제물의 Fc 도메인은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 감소, 보체-의존성 세포용해(CDC) 감소, 항체-의존성 세포-매개 포식작용(ADCP) 감소, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 효과기 기능 감소로 이어지는, 아미노산 치환, 부가 또는 삽입, 결실, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 SIRPα 폴리펩티드 또는 작제물은 인간 Fc 수용체에 대한 결합 감소(예를 들어, 최소의 결합 또는 결합 부재) 및 보체 단백질 C1q에 대한 결합 감소(예를 들어, 최소의 결합 또는 결합 부재)를 특징으로 한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 SIRPα 작제물은 인간 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIB, 또는 이들의 임의의 조합, 및 C1q에 대한 결합 감소(예를 들어, 최소의 결합 또는 결합 부재)를 특징으로 한다. ADCC, CDC, ADCP, 또는 이들의 임의의 조합과 같은, 항체-의존성 효과기 기능을 변경 또는 감소시키기 위해, 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 SIRPα 작제물의 Fc 도메인은 IgG 클래스이며 E233, L234, L235, G236, G237, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331, 또는 P329(Kabat의 EU 지수에 따른 넘버링(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)))에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 비-천연 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물은 천연 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 Fcγ 수용체 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, 및 CD64 중 적어도 하나에 대해 감소되거나 제거된 결합을 나타낸다. 일부 경우에 있어서, 본원에 기재된 폴리펩티드 작제물은 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, 및 CD64 Fcγ 수용체에 대해 감소되거나 제거된 결합을 나타낸다.
CDC는 보체 캐스케이드(complement cascade)가 항체 Fc 도메인에 결합하는 보체 성분 C1q에 의해 활성화되는 세포독성 형태를 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 비-천연 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 C1q 결합의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타낸다. 일부 경우에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 비-천연 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 감소된 CDC를 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 비-천연 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 CDC에서 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타낸다. 일부 경우에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 비-천연 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 무시할만한 CDC를 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체는 야생형 서열에 대해 최소한으로 글리코실화되거나 글리코실화가 감소된다. 일부 구현예에 있어서, 탈글리코실화는 N297A의 돌연변이로, 또는 N297을 N이 아닌 임의의 아미노산으로 돌연변이화함으로써 달성된다. 일부 구현예에 있어서, 탈글리코실화는 모티프 N-Xaa1-Xaa2-Xaa3을 파괴함으로써 달성되며, 여기서 N = 아스파라긴; Xaa1 = P(프롤린)를 제외한 임의의 아미노산; Xaa2 = T(트레오닌), S(세린) 또는 C(시스테인); 및 Xaa3 = P(프롤린)를 제외한 임의의 아미노산이다. 일 구현예에 있어서, N-Xaa1-Xaa2-Xaa3 모티프는 Kabat 등, 1991에 따라 지정된 바와 같은 잔기 297-300을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, N, Xaa1, Xaa2, 또는 Xaa3 중 임의의 하나 이상에 대한 돌연변이는 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체의 탈글리코실화를 초래한다.
일부 구현예에 있어서, 항체 IgG 불변 영역의 변이체(예를 들어, Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체)는 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 능력이 감소되거나 포식작용을 유도하는 능력이 감소된다. 일부 구현예에 있어서, 항체 IgG 불변 영역의 변이체(예를 들어, Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체)는 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 능력이 감소되고 포식작용을 유도하는 능력이 감소된다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 "사멸된" Fc 도메인 변이체의 전형적인 효과기 기능이 결여되도록 돌연변이된다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 Fc 도메인 이량체와 Fcγ 수용체 사이의 상호작용을 최소화하는 것으로 공지된 특정 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 IgG1 항체로부터 유래되고 아미노산 치환 L234A, L235A, G237A, 및 N297A(Kabat 등, 1991에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정됨) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 하나 이상의 추가적인 돌연변이가 이러한 IgG1 Fc 도메인 변이체에 포함된다. 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체에 대한 이러한 추가적인 돌연변이의 비-제한적 예는 E318A 및 K322A를 포함한다. 일부 예에 있어서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 IgG1 서열과 비교하여 최대 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개 또는 그 이하의 총 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 하나 이상의 추가적인 결실이 이러한 IgG1 Fc 도메인 변이체에 포함된다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 표 7 의 서열번호 88에 제공된 Fc 도메인 IgG1 중쇄 불변 영역의 C-말단 리신이 결실되어, 예를 들어, 박테리아 또는 포유동물 세포에서 폴리펩티드가 생성될 때 폴리펩티드의 균질성을 증가시킨다. 일부 예에 있어서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 IgG1 서열과 비교하여 최대 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개 또는 그 이하의 총 결실을 갖는다(예를 들어, 하기 서열번호 161 참조). 일부 구현예에 있어서, IgG1 Fc 도메인 변이체는 서열번호 135, 서열번호 136 또는 서열번호 137 중 임의의 하나에 따른 서열을 갖는다.
서열번호 161:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 IgG2 또는 IgG4 항체로부터 유래되며 아미노산 치환 A330S, P331S, 또는 A330S 및 P331S 모두를 포함한다. 앞서 언급한 아미노산 위치는 Kabat 등 (1991)에 따라 정의된다. 아미노산 잔기의 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링된 서열을 갖는 항체 서열의 상동성 영역에서 정렬에 의해 제공된 항체에 대해 결정될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 A330S, P331S 및 N297A 아미노산 치환(Kabat 등 (1991)에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정된 바와 같음) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG2 Fc 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 하나 이상의 추가적인 돌연변이가 이러한 IgG2 Fc 도메인 변이체에 포함된다. 인간 IgG2 Fc 도메인 변이체에 대한 이러한 추가적인 돌연변이의 비-제한적인 예는 V234A, G237A, P238S, V309L 및 H268A(Kabat 등 (1991)에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정된 바와 같음)를 포함한다. 일부 예에 있어서, 인간 IgG2 Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 IgG2 서열과 비교하여 최대 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 또는 그 이하의 총 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 하나 이상의 추가적인 결실이 이러한 IgG2 Fc 도메인 변이체에 포함된다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 표 7 의 서열번호 89에 제공된 Fc 도메인 IgG2 중쇄 불변 영역의 C-말단 리신이 결실되어, 예를 들어, 박테리아 또는 포유동물 세포에서 폴리펩티드가 생성될 때 폴리펩티드의 균질성을 증가시킨다. 일부 예에 있어서, 인간 IgG2 Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 IgG2 서열과 비교하여 최대 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개 또는 그 이하의 총 결실을 갖는다(예를 들어, 하기 서열번호 162 참조).
서열번호 162:
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fc 도메인 변이체가 IgG4 Fc 도메인 변이체일 때, 일부 구현예에 있어서, 이러한 Fc 도메인 변이체는 S228P 돌연변이(Kabat 등 (1991)에 따라 지정되는 바와 같음)를 포함한다. 일부 예에 있어서, 인간 IgG4 Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 IgG4 서열과 비교하여 최대 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 돌연변이(들)를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 아미노산 치환(Kabat 등 (1991)에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정된 바와 같음) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG4 Fc 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 아미노산 치환(Kabat 등 (1991)에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라 지정된 바와 같음) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG4 Fc 서열을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 IgG1 Fc 영역의 돌연변이 L234A, L235A, G237A 또는 N297A 중 적어도 하나 또는 IgG2 Fc 영역의 돌연변이 A330S, P331S 또는 N297A 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 IgG1 Fc 영역의 돌연변이 L234A, L235A, G237A 또는 N297A 중 적어도 둘 또는 IgG2 Fc 영역의 돌연변이 A330S, P331S 또는 N297A 중 적어도 둘을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 IgG1 Fc 영역의 돌연변이 L234A, L235A, G237A 또는 N297A 중 적어도 셋을 포함하거나 또는 IgG2 Fc 영역의 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 이루어진다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 돌연변이 L234A, L235A, G237A 및 N297A로 이루어진다.
일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 대상체의 Fc 수용체에 대해 감소된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 대상체의 Fc 수용체에 대해 제거된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 포식작용의 감소를 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 제거된 포식작용을 나타낸다.
서열번호 88 및 서열번호 89는 Fc 도메인 IgG1 및 IgG2 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 제공한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 표 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 90-95의 임의의 변이체이다.
Figure pct00013
Figure pct00014
본원에서 ADCC라고도 지칭되는, 항체-의존성 세포-매개 세포독성은 분비된 Ig가 특정한 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK; Natural Killer) 세포 및 호중구) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 상으로 결합되어 이러한 세포독성 효과기 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 후속적으로 표적 세포를 사멸할 수 있도록 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 본원에서 ADCP로도 지칭되는, 항체-의존성 세포-매개 포식작용은 분비된 Ig가 특정한 포식 세포(예를 들어, 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 상으로 결합되어 이러한 포식 효과기 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 후속적으로 표적 세포를 탐식하며 소화할 수 있도록 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 표적 세포의 표면에 대한 리간드-특이적 고-친화도 IgG 항체는 세포독성 또는 포식 세포를 자극할 수 있으며 이러한 사멸에 사용될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 감소된 ADCC 또는 ADCP를 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 ADCC 또는 ADCP에서 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 제거된 ADCC 또는 ADCP를 나타낸다.
본원에서 CDC로도 지칭되는, 보체-지향 세포독성은 보체 캐스케이드가 항체 Fc 도메인에 결합하는 보체 성분 C1q에 의해 활성화되는 세포독성 형태를 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 C1q 결합에서 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타낸다. 일부 경우에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 감소된 CDC를 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 CDC에서 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타낸다. 일부 경우에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 작제물과 비교하여 무시할만한 CDC를 나타낸다.
본원에서 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 Fcγ 수용체에 대해 감소된 결합을 나타내는 것들을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체는 실시예에 기재된 바와 같이, Fcγ 수용체에 대해 야생형 인간 IgG Fc 영역이 나타내는 결합보다 적은 Fcγ 수용체에 대한 결합을 나타낸다. 일부 예에 있어서, Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체는 Fcγ 수용체에 대한 결합을 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(완전히 제거된 효과기 기능)만큼 감소시켰다. 일부 구현예에 있어서, 감소된 결합은 임의의 하나 이상의 Fcγ 수용체, 예를 들어, CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, 또는 CD64에 대한 것이다.
일부 예에 있어서, 본원에 개시된 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체는 그것의 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 포식작용의 감소를 나타낸다. 이러한 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체는 그것의 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 포식작용의 감소를 나타내며, 여기서 포식작용 활성의 감소는, 예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 만큼이다. 일부 예에 있어서, Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체는 그것의 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 제거된 포식작용을 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체는 하나 이상의 융합 파트너에 커플링된다. 일부 경우에 있어서, 융합 파트너는 치료적 모이어티이다. 일부 경우에 있어서, 융합 파트너는 발현된 단백질의 표적화, 정제, 스크리닝, 디스플레이 등을 가능하게 하도록 선택된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 파트너는 또한 Fc 수용체에 대한 결합 정도 또는 포식작용 감소의 정도에 영향을 미친다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체가 융합 파트너에 커플링될 때, 이는 하기에 기재된 바와 같이 폴리펩티드 작제물을 형성한다.
일부 구현예에 있어서, 융합 파트너는 링커 서열을 통해 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체 서열에 연결된다. 일부 구현예에 있어서, 링커 서열은 일반적으로 10개 미만의 아미노산과 같은 적은 수의 아미노산을 포함하지만, 더 긴 링커 또한 활용된다. 일부 경우에 있어서, 링커는 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5개 미만 또는 그 이하의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 경우에 있어서, 링커는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 또는 35개 아미노산 또는 그 이상의 길이를 갖는다. 선택적으로, 일부 구현예에 있어서, 절단가능한 링커가 이용된다.
일부 구현예에 있어서, 융합 파트너는 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체 단백질 및 임의의 연관된 융합 파트너를 목적하는 세포 위치 또는 세포외 배지로 지향시키는 표적화 또는 신호 서열이다. 일부 구현예에 있어서, 특정한 신호전달 서열은 세포의 내막과 외막 사이에 위치한, 원형질외극(periplasmic space) 또는 성장 배지로 분비되는 단백질을 표적으로 한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 파트너는 정제 또는 스크리닝을 가능하게 하는 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 서열이다. 이러한 융합 파트너는 폴리히스티딘 태그(His-태그)(예를 들어, His6(서열번호 223) 및 His10(서열번호 224)) 또는 고정 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC; Immobilized Metal Affinity Chromatography) 시스템(예를 들어, Ni+2 친화성 컬럼(affinity column)), GST 융합, MBP 융합, Strep-태그, 박테리아 효소 BirA의 BSP 비오틴화 표적 서열, 및 항체에 의해 표적화된 에피토프 태그(예를 들어, c-myc 태그, 플래그-태그 등)와 사용하기 위한 기타 태그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에 있어서, 이러한 태그는 정제, 스크리닝, 또는 이들 모두에 유용하다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체는 His-태그를 Ni+2 친화성 컬럼에 고정함으로써 이를 사용하여 정제되고, 정제 후 동일한 His-태그를 사용하여 항체를 Ni+2 코팅된 플레이트에 고정하여 ELISA 또는 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 기타 결합 검정을 수행한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 파트너는 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체를 스크리닝하기 위한 선택 방법의 사용을 가능하게 한다.
다양한 선택 방법을 가능하게 하는 다양한 융합 파트너가 이용가능하다. 예를 들어, Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체 라이브러리의 구성원을 유전자 III 단백질에 융합함으로써, 파지 디스플레이(phage display)가 이용될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 융합 파트너는 표지되는 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체이다. 대안적으로, 일부 구현예에 있어서, 융합 파트너는 발현 벡터 상의 특정 서열에 결합하여, 융합 파트너 및 연관 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체가 이들을 암호화하는 핵산과 공유적 또는 비공유적으로 연결될 수 있도록 한다.
일부 구현예에 있어서, 융합 파트너가 치료적 모이어티일 때, 치료적 모이어티는, 예를 들어, 펩티드, 단백질, 항체, siRNA, 또는 소분자이다. 본 개시내용의 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체에 커플링된 치료적 항체의 비-제한적 예는 CD47을 인식하는 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용의 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체에 커플링되는 치료적 폴리펩티드의 비-제한적 예는 SIRPα 폴리펩티드를 포함하는, CD47 결합 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 예에 있어서, CD47 결합 폴리펩티드는 본 개시내용의 Fc 도메인 변이체 또는 Fc 도메인 이량체 변이체에 부착되거나 융합된다. CD47 결합 폴리펩티드의 예는 항-CD47 항체 또는 이의 단편, 및 CD47의 리간드, 예컨대, SIRPα 또는 이의 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. CD47 결합 폴리펩티드의 추가적인 예는 천연-발생 형태의 SIRPα뿐만 아니라 이의 돌연변이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시되며, 여기서 Fc 도메인 이량체 변이체는 2개의 Fc 도메인 변이체를 포함하고, 각각의 Fc 도메인 변이체는 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A, 및 N297A로 이루어진 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 이루어진 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 동일하다(즉, 동종이량체). 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 상이하다(즉, 이종이량체). 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체의 Fc 도메인 변이체 중 적어도 하나는 돌연변이 L234A, L235A, G237A, 및 N297A로 이루어진 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체의 Fc 도메인 변이체 중 적어도 하나는 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 이루어진 인간 IgG2 Fc 영역이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 Fcγ 수용체에 대해 제거되거나 감소된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, 및 CD64 Fcγ 수용체에 대해 제거되거나 감소된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체는 인간 IgG Fc 융합의 야생형 버전과 비교하여 C1q에 대해 제거되거나 감소된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체의 Fc 도메인 변이체 중 적어도 하나는 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc 영역과 비교하여 Fcγ 수용체에 대해 제거되거나 감소된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체는 그것의 인간 IgG4 Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 CD16a 및 CD32b Fcγ 수용체에 대해 제거되거나 감소된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체는 약 5 x 10-6 M 초과의 KD로 Fcγ 수용체에 결합한다.
일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체는 CD47 결합 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체 변이체는 인간 IgG Fc 영역의 야생형 버전과 비교하여 Fcγ 수용체에 대해 제거되거나 감소된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, CD47 결합 폴리펩티드는 설치류 및 비-인간 영장류에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다. 일부 구현예에 있어서, CD47 결합 폴리펩티드는 인간에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다.
일부 구현예에 있어서, CD47 결합 폴리펩티드는 신호-조절 단백질 α(SIRP-α) 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα 폴리펩티드는 아미노산 서열, EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5EGX6FPRVTTVSDX7TKRNNMDFSIRIGX8ITPADAGTYYCX9KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS(서열번호 221)를 포함하며, 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 A 또는 I이며; X3은 I 또는 F이고; X4는 E 또는 V이며; X5는 K 또는 R이고; X6은 H 또는 P이며; X7은 L 또는 T이고; X8은 N 이외의 임의의 아미노산이며; 및 X9는 V 또는 I이다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα 폴리펩티드는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하며, 여기서 X1은 V 또는 I이고; X2는 A 또는 I이며; X3은 I 또는 F이고; X4는 E이며; X5는 K 또는 R이고; X6은 H 또는 P이며; X7은 L 또는 T이고; X8은 N이 아니며; 및 X9는 V이다.
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시되며, 여기서 SIRPα D1 도메인 변이체는 비-천연 발생 고친화도 SIRPα D1 도메인이고, SIRPα D1 도메인 변이체는 천연 발생 D1 도메인의 친화도보다 적어도 10배 더 큰 친화도로 인간 CD47에 결합하며; Fc 도메인 변이체는 제2 Fc 도메인 변이체를 포함하는 제2 폴리펩티드에 연결되어 Fc 도메인 이량체 변이체를 형성하고, Fc 도메인 이량체 변이체는 제거되거나 감소된 효과기 기능을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 비-천연 발생 고친화도 SIRPα D1 도메인은 잔기 80에 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체가 본원에 개시되며, 여기서 SIRPα D1 도메인 변이체는 250 nM 미만의 KD로 제1 종의 CD47과 결합하고; SIRPα D1 도메인 변이체는 250 nM 미만의 KD로 제2 종의 CD47과 결합하며; 제1 종의 CD47에 대한 KD 및 제2 종의 CD47에 대한 KD는 서로 100배 이내이고; 및 제1 종 및 제2 종은 인간, 설치류, 및 비-인간 영장류로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 적어도 3개의 상이한 종의 CD47과 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 비-인간 영장류는 시노몰구스 원숭이이다.
일부 구현예에 있어서, (a) 250 nM 미만의 KD로 인간 CD47과 결합하는 SIRPα D1 도메인; 및 (b) SIRPα D1 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 연결된 Fc 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시되며, 여기서 폴리펩티드는 설치류 및 비-인간 영장류에서 급성 빈혈을 유발하지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 인간 SIRP-α의 비-천연 발생 변이체이다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드의 생체내 투여는 투여 후 첫 주 동안 50% 미만으로 헤모글로빈 감소를 초래한다. 일부 구현예에 있어서, 인간에서 폴리펩티드의 투여는 투여 후 첫 주 동안 50% 미만으로 헤모글로빈 감소를 초래한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 Fc 도메인 이량체 변이체를 추가로 포함하며, 여기서 Fc 도메인 이량체 변이체는 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A, 및 N297A로 이루어진 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 이루어진 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역으로부터 선택되는 Fc 도메인 변이체를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 돌연변이 L234A, L235A, G237A, 및 N297A로 이루어진 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 이루어진 인간 IgG2 Fc 영역이다.
본 개시내용의 SIRPα 작제물은 통상적인 유전적 또는 화학적 수단, 예를 들어, 화학적 컨주게이션을 사용하여 링커를 통해 Fc 도메인 또는 이의 변이체의 N-말단에 접합된 그것의 C-말단을 갖는 SIRPα 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 링커(예를 들어, 스페이서)는 폴리펩티드와 Fc 도메인 또는 이의 변이체 사이에 삽입된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 본 개시내용의 폴리펩티드는 이량체를 형성할 수 없는 Fc 도메인 변이체에 융합된다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 또 다른 Fc 도메인 또는 이의 변이체와 이량체, 예를 들어, 이종이량체를 형성할 수 있는 Fc 도메인 또는 이의 변이체에 융합된다. 일부 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드는 Fc 도메인 또는 이의 변이체에 융합되고 이러한 융합 단백질은 동종이량체를 형성한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체에 융합되고 상이한 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 항체 가변 영역)는 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체에 융합된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 또는 이의 변이체는 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체에 접합되고 치료적 단백질(예를 들어, 사이토카인, 인터류킨, 항원, 스테로이드, 항-염증제, 또는 면역조절제)은 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체에 접합된다. 일부 구현예에 있어서, 제1 및 제2 Fc 도메인 또는 이들의 변이체는 이종이량체를 형성한다.
전술한 것을 제한하지 않고, 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드(예를 들어, 표 2, 5, 및 6에 기재된 변이체 중 임의의 것)는 Fc 도메인 또는 이의 변이체와 같은, Fc 폴리펩티드 또는 Fc 변이체 폴리펩티드에 융합된다. SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 및 융합된 Fc 도메인 변이체 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 예는 표 8 에 나타낸 서열번호 96-137, 214, 및 216을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 표 8 에 제공된 임의의 변이체에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 SIRPα D1 변이체 도메인을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 표 8 의 서열번호 98-104, 107-113, 116-122, 또는 135-137에 대해 적어도 85%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 (a) 신호-조절 단백질 α(SIRP-α) D1 변이체를 포함하며, 여기서 SIRPα D1 도메인 변이체는 아미노산 서열 EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS(서열번호 47)를 포함하고, 여기서 X1은 E, 또는 G이고; X2는 L, I, 또는 V이며; X3은 V, L, 또는 I이고; X4는 S, 또는 F이며; X5는 L, 또는 S이고; X6은 S, 또는 T이며; X7은 A, 또는 V이고; X8은 I, 또는 T이며; X9는 H, R, 또는 L이고; X10은 A, V, I, 또는 L이며; X11은 I, T, S, 또는 F이고; X12는 A, 또는 G이며; X13은 E, V, 또는 L이고; X14는 K, 또는 R이며; X15는 E 또는 Q이고; X16은 H, P, 또는 R이며; X17은 D, 또는 E이고; X18은 S, L, T, 또는 G이며; X19는 K, 또는 R이고; X20은 E, 또는 N이며; X21은 S, 또는 P이고; X22는 S, 또는 R이며; X23은 S, 또는 G이고; X24는 임의의 아미노산이며; X25는 임의의 아미노산이고; X26은 V, 또는 I이며; X27은 F, L, 또는 V이고; X28은 D이거나 부재하며; X29는 T, 또는 V이고; X30은 F, 또는 V이며; 및 X31은 A, 또는 G이고; 및 여기서 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 1 내지 10 중 임의의 하나에 따른 서열을 갖는 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 2개의 아미노산 치환; 및 (b) 2개의 Fc 도메인 변이체를 갖는 Fc 도메인 이량체 변이체를 포함하며, 각각의 Fc 도메인 변이체는 독립적으로 하기이다: (i) N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) L234A, L235A, 및 G237A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (iii) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역; (iv) N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (v) A330S 및 P331S 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (vi) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역; (vii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역; 또는 (viii) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하며, 여기서 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 47에 따른 아미노산 서열; 2개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 도메인 이량체를 포함하고, Fc 도메인 중 하나는 L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 Fc 도메인 변이체이다.
Fc 도메인의 이량체화
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드(예를 들어, 표 2, 5, 및 6에 기재된 변이체 중 임의의 것)는 N-말단 또는 C-말단에서 제1 Fc 도메인(예를 들어, Fc 도메인 변이체)에 융합된다. 일부 구현예에 있어서, 제1 Fc 도메인은 이량체를 형성할 수 없는 변이체이다. 일부 구현예에 있어서, 제1 Fc 도메인은 제2 Fc 도메인과 이량체를 형성한다. 일부 구현예에 있어서, 제1 및 제2 Fc 도메인은 제1 및 제2 도메인 Fc 도메인 사이의 이종이량체화를 촉진하는 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 이량체의 2개의 Fc 도메인 각각은 2개의 단량체의 이종이량체화를 촉진하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα 작제물은, 예를 들어, 제1 Fc 도메인에 융합된 SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드를 포함하는 제1 아단위(subunit) 및 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 아단위(예를 들어, SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드 또는 임의의 다른 폴리펩티드 불포함)로부터 형성된다. 일부 구현예에 있어서, 작제물은 Fc 도메인 이량체(예를 들어, 단일 팔)에 연결된 단일 SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 작제물은 Fc 도메인 이량체(예를 들어, 이중 팔)에 연결된 2개의 SIRPα D1 도메인 변이체 폴리펩티드를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 약 500 nM의 KD를 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체는 이중 팔 작제물에서 특히 유용하다. 일부 구현예에 있어서, 약 50 nM의 KD를 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체는 이중 팔 작제물에서 특히 유용하다. 일부 구현예에 있어서, 약 5 nM의 KD를 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체는 이중 팔 작제물 및 단일 팔 작제물에서 유용하다. 일부 구현예에 있어서, 약 500 pM의 KD를 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체는 이중 팔 작제물 및 단일 팔 작제물에서 유용하다. 일부 구현예에 있어서, 약 100 pM의 KD를 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체는 이중 팔 작제물 및 단일 팔 작제물에서 유용하다. 일부 구현예에 있어서, 약 50 pM의 KD를 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체는 이중 팔 작제물 및 단일 팔 작제물에서 유용하다. 일부 구현예에 있어서, 약 10 pM의 KD를 갖는 SIRPα D1 도메인 변이체는 이중 팔 작제물 및 단일 팔 작제물에서 유용하다.
일부 구현예에 있어서, Fc 도메인의 이종이량체화는 "노브-인투-홀(knob-into-hole)" 잔기 쌍 및 전하 잔기 쌍과 같은, 2개의 Fc 도메인에 상이하지만, 양립가능한, 치환을 도입함으로써 촉진된다. 노브 및 홀 상호작용은 이종이량체 형성을 선호하는 반면, 노브-노브 및 홀-홀 상호작용은 입체 충돌(steric clash) 및 유리한 상호작용의 결실로 인해 동종이량체 형성을 방해한다. 홀은 단백질의 원래의 아미노산이 더 작은 측쇄 부피를 갖는 상이한 아미노산으로 대체될 때 생성되는 빈 공간을 지칭한다. 노브는 단백질의 원래의 아미노산이 더 큰 측쇄 부피를 갖는 상이한 아미노산으로 대체될 때 생성되는 범프(bump)를 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 대체되는 아미노산은 Fc 도메인의 CH3 항체 불변 도메인에 있고 2개의 Fc 도메인의 이량체화에 관여한다. 일부 구현예에 있어서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 홀은 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 노브를 수용하도록 생성되어, 노브 및 홀 아미노산은 2개의 Fc 도메인의 이종이량체화를 촉진하거나 선호하도록 작용한다. 일부 구현예에 있어서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 홀은 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산을 더 잘 수용하도록 생성된다. 일부 구현예에 있어서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 노브는 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산과 추가적인 상호작용을 형성하도록 생성된다.
일부 구현예에 있어서, 홀은 티로신 또는 트립토판과 같은 더 큰 측쇄를 갖는 아미노산을 알라닌, 발린, 또는 트레오닌과 같은 더 작은 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 CH3 항체 불변 도메인의 Y407V 돌연변이로 대체함으로써 작제된다. 유사하게, 일부 구현예에 있어서, 노브는 더 작은 측쇄를 갖는 아미노산을 더 큰 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어, CH3 항체 불변 도메인의 T366W 돌연변이로 대체함으로써 작제된다. 일부 구현예에 있어서, 한 Fc 도메인은 노브 돌연변이 T366W를 포함하고 다른 Fc 도메인은 홀 돌연변이 T366S, L358A, 및 Y407V를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체를 포함하는 본 개시내용의 폴리펩티드는 노브 돌연변이 T366W를 포함하는 Fc 도메인에 융합되어 원치 않는 노브-노브 동종이량체 형성을 제한한다. 노브-인투-홀 아미노산 쌍의 예는 표 9 에, 제한 없이, 포함되며 노브-인투-홀 Fc 도메인 변이체 및 SIRPα-Fc 융합의 예는 표 10 에 제공되어 있다.
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
노브-인투-홀 전략에 더하여, 일부 구현예에 있어서, 정전기 스티어링(electrostatic steering)이 또한 Fc 도메인의 이량체화를 제어하는 데 사용된다. 정전기 스티어링은 펩티드, 단백질 도메인, 및 단백질에서 반대로 하전된 아미노산 사이의 유리한 정전기 상호작용을 활용하여 고차 단백질 분자의 형성을 제어하는 것을 지칭한다. 특히, 정전기 스티어링을 사용하여 Fc 도메인의 이량체화를 제어하기 위해, CH3-CH3 계면을 구성하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 양으로-하전된 또는 음으로-하전된 아미노산 잔기로 대체되어 상호작용이 도입된 특정 하전된 아미노산에 따라 정전기적으로 유리하거나 불리하게 된다. 일부 구현예에 있어서, 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘과 같이, 계면에서 양으로-하전된 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 음으로-하전된 아미노산으로 대체된다. 일부 구현예에 있어서, 계면에서 음으로-하전된 아미노산은 양으로-하전된 아미노산으로 대체된다. 일부 구현예에 있어서, 하전된 아미노산은 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인 중 하나, 또는 둘 모두에 도입된다. 일부 구현예에 있어서, 2개의 Fc 도메인의 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인에 하전된 아미노산을 도입하는 것은 하전된 아미노산 사이의 상호작용으로부터 야기되는 정전기 스티어링 효과에 의해 제어되는 바와 같이 Fc 도메인의 이종이량체의 선택적 형성을 촉진한다. 정전기 스티어링 아미노산 쌍의 예는 표 11 에, 제한 없이, 포함된다.
Figure pct00026
특히 이중특이적 항체를 작제한다는 맥락에서, Fc 도메인의 이종이량체화를 제어하는 데 사용되는 다른 방법이 이용가능하다.
일부 구현예에 있어서, 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 각각 인간 IgG1의 서열에 대해, 하기 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, 및 K409I.
일부 구현예에 있어서, Fc 도메인은 (a) 야생형 인간 IgG1에 대해 하기 아미노산 치환 중 하나: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, 또는 K409I; 또는 (b) (i) 인간 IgG1 Fc 영역에 대한 N297A 돌연변이; (ii) 인간 IgG1 Fc 영역에 대한 L234A, L235A, 및 G237A 돌연변이; (iii) 인간 IgG1 Fc 영역에 대한 L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이; (iv) 인간 IgG2 Fc 영역에 대한 N297A 돌연변이; (v) 인간 IgG2 Fc 영역에 대한 A330S 및 P331S 돌연변이; (vi) 인간 IgG2 Fc 영역에 대한 A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이; (vii) 인간 IgG4 Fc 영역에 대한 S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이; 또는 (viii) 인간 IgG4 Fc 영역에 대한 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 (a) 야생형 인간 IgG1에 대해 하기 아미노산 치환 중 하나: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, 또는 K409I를 포함하고; 및 (b)(i) 인간 IgG1 Fc 영역에 대한 N297A 돌연변이; (ii) 인간 IgG1 Fc 영역에 대한 L234A, L235A, 및 G237A 돌연변이; (iii) 인간 IgG1 Fc 영역에 대한 L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이; (iv) 인간 IgG2 Fc 영역에 대한 N297A 돌연변이; (v) 인간 IgG2 Fc 영역에 대한 A330S 및 P331S 돌연변이; (vi) 인간 IgG2 Fc 영역에 대한 A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이; (vii) 인간 IgG4 Fc 영역에 대한 S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이; 또는 (viii) 인간 IgG4 Fc 영역에 대한 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 제1 및 제2 Fc 도메인은 상이한 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 제1 Fc 도메인은 T366W를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 제2 Fc 도메인은 T366S, L368A, 및 Y407V를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 제1 Fc 도메인은 D399K를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 제2 Fc 도메인은 K409D를 포함한다.
링커
일부 구현예에 있어서, 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66, 및 잔기 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기에서 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 추가적인 아미노산 돌연변이를 갖는, SIRPα D1 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 신호-조절 단백질 α(SIRP-α) D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시된다.
또한, 일부 구현예에 있어서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시되며, 여기서 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 변이체를 포함하는 Fc 도메인 이량체를 포함하고, 각각의 Fc 도메인 변이체는 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A, 및 N297A로 이루어진 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 이루어진 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역으로부터 독립적으로 선택된다.
본 개시내용에서, 링커는 폴리펩티드 또는 단백질 도메인 또는 연관된 비-단백질 모이어티 사이의 연결(linkage) 또는 연접(connection)을 기재하는 데 사용된다. 일부 구현예에 있어서, 링커는 Fc 도메인(또는 이의 변이체)과 SIRPα D1 도메인 변이체 사이의 연결 또는 연접이다. 일부 구현예에 있어서, 링커는 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단과 Fc 도메인 변이체의 N-말단을 연접하여, 2개의 폴리펩티드가 탠덤 직렬로(in tandem series) 서로 접합된다.
일부 구현예에 있어서, 링커는 단순 공유 결합, 예를 들어, 펩티드 결합, 합성 중합체, 또는 화학 반응, 예를 들어, 화학적 컨주게이션으로부터 생성된 임의의 결합 종류이다. 링커가 펩티드 결합일 때, 일부 구현예에 있어서, 한 단백질 도메인의 C-말단에 있는 카르복실산 기는 축합 반응에서 또 다른 단백질 도메인의 N-말단에 있는 아미노 기와 반응하여 펩티드 결합을 형성한다. 일부 구현예에 있어서, 펩티드 결합은 통상적인 유기 화학 반응을 통해 합성 수단으로부터, 또는 숙주 세포로부터의 천연 생성에 의해 형성되며, 여기서 탠덤 직렬로 두 단백질(예를 들어, Fc 도메인 변이체 및 SIRPα 도메인 변이체)의 DNA 서열을 암호화하는 핵산 분자는 숙주 세포에서 필수적인 분자 기구(molecular machinery)(예를 들어, DNA 폴리머라제 및 리보솜)에 의해 두 단백질을 암호화하는 인접 폴리펩티드로 직접 전사 및 번역될 수 있다.
링커가 합성 중합체일 때, 일부 구현예에 있어서, 중합체는 각각의 단부에서 반응성 화학 작용기로 작용화되어 두 단백질의 연접 단부에서 말단 아미노산과 반응한다.
링커(상기 언급된 펩티드 결합 제외)가 화학 반응으로부터 제조될 때, 일부 구현예에 있어서, 화학적 작용기(예를 들어, 아민, 카르복실산, 에스테르, 아지드, 또는 기타 작용기)는 각각, 한 단백질의 C-말단 및 또 다른 단백질의 N-말단에 합성적으로 부착된다. 일부 구현예에 있어서, 두 작용기는 합성 화학 수단을 통해 반응하여 화학 결합을 형성하고, 이에 따라 두 단백질을 함께 연접한다.
스페이서
본 개시내용에서, 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 Fc 도메인 단량체와 SIRPα D1 변이체 폴리펩티드 사이의 링커는 약 1-200개의 아미노산을 포함하는 아미노산 스페이서이다. 적합한 펩티드 스페이서는 글리신 및 세린과 같은 유연한 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 링커를 포함한다. 링커 서열의 예는 표 12 에 제공되어 있다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서는 GS, GG, GGS, GGG, GGGGS(서열번호 163), GGSG(서열번호 164), 또는 SGGG(서열번호 165)의 모티프, 예를 들어, 다중 또는 반복 모티프를 함유한다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서는 GS, 예를 들어, GS, GSGS(서열번호 166), GSGSGS(서열번호 167), GSGSGSGS(서열번호 168), GSGSGSGSGS(서열번호 169), 또는 GSGSGSGSGSGS(서열번호 170)의 모티프를 포함하는 2 내지 12개의 아미노산을 함유한다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서는 GGS, 예를 들어, GGS, GGSGGS(서열번호 171), GGSGGSGGS(서열번호 172), 및 GGSGGSGGSGGS(서열번호 173)의 모티프를 포함하는 3 내지 12개의 아미노산을 함유한다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서는 GGSG(서열번호 164), 예를 들어, GGSG(서열번호 164), GGSGGGSG(서열번호 174), 또는 GGSGGGSGGGSG(서열번호 175)의 모티프를 포함하는 4 내지 12개의 아미노산을 함유한다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서는 GGGGS(서열번호 163), 예를 들어, GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 176)의 모티프를 함유한다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서는 글리신 및 세린 이외의 아미노산, 예를 들어, AAS(서열번호 177), AAAL(서열번호 178), AAAK(서열번호 179), AAAR(서열번호 180), EGKSSGSGSESKST(서열번호 181), GSAGSAAGSGEF(서열번호 182), AEAAAKEAAAKA(서열번호 183), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 184), GGGGAGGGG(서열번호 185), GENLYFQSGG(서열번호 186), SACYCELS(서열번호 187), RSIAT(서열번호 188), RPACKIPNDLKQKVMNH(서열번호 189), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG(서열번호 190), AAANSSIDLISVPVDSR(서열번호 191), 또는 GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS(서열번호 192)를 함유한다.
일부 구현예에 있어서, 스페이서는 EAAAK(서열번호 193)의 모티프, 예를 들어, 다중 또는 반복 모티프를 함유한다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서는 (XP)n과 같은 프롤린-풍부 서열의 모티프, 예를 들어, 다중 또는 반복 모티프를 함유하며, 여기서 X는 임의의 아미노산(예를 들어, A, K, 또는 E)이고 n은 1-5, 및 PAPAP(서열번호 194)이다.
Figure pct00027
Figure pct00028
일부 구현예에 있어서, 사용된 펩티드 스페이서 및 아미노산의 길이는 관여된 두 단백질 및 최종 단백질 융합 폴리펩티드의 목적하는 유연성 정도에 따라 조정된다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서의 길이는 적절한 단백질 폴딩(protein folding)을 보장하고 응집체 형성을 피하도록 조정된다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서는 A 또는 AAAL(서열번호 178)이다.
벡터, 숙주 세포, 및 단백질 생성
일부 구현예에 있어서, 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 잔기 80에서 아미노산 돌연변이; 및 잔기 6, 잔기 27, 잔기 31, 잔기 47, 잔기 53, 잔기 54, 잔기 56, 잔기 66, 및 잔기 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기에서 야생형 SIRPα D1 도메인에 대해 적어도 하나의 추가적인 아미노산 돌연변이를 갖는, SIRPα D1 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 신호-조절 단백질 α(SIRP-α) D1 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시된다.
또한, 일부 구현예에 있어서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 개시되며, 여기서 Fc 변이체는 2개의 Fc 도메인 단량체를 갖는 Fc 도메인 이량체를 포함하고, 각각의 Fc 도메인 단량체는 (i) 돌연변이 L234A, L235A, G237A, 및 N297A로 이루어진 인간 IgG1 Fc 영역; (ii) 돌연변이 A330S, P331S 및 N297A로 이루어진 인간 IgG2 Fc 영역; 또는 (iii) 돌연변이 S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 숙주 세포로부터 생성된다. 숙주 세포는 그것의 상응하는 핵산으로부터 본원에 기재된 폴리펩티드 및 융합 폴리펩티드를 발현하는 데 필요한, 필수적인 세포 성분, 예를 들어, 세포 기관(organelle)을 포함하는 비히클을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, 핵산은 형질전환, 형질감염, 전기천공, 인산칼슘 침전, 직접 현미주사, 감염 등에 의해 숙주 세포 내로 도입된 핵산 벡터에 포함된다. 일부 구현예에 있어서, 핵산 벡터의 선택은 사용되는 숙주 세포에 의존한다. 일부 구현예에 있어서, 숙주 세포는 원핵생물(예를 들어, 박테리아) 또는 진핵생물(예를 들어, 포유동물) 기원이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드, 예를 들어, SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 표 2, 5, 및 6에 제공된 임의의 변이체) 및 Fc 변이체와 같은 융합 파트너를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 폴리펩티드 작제물의 발현을 유도하거나 유발하기 위한 적절한 조건 하에서 폴리펩티드 작제물(예를 들어, Fc 변이체, 링커, 및 융합 파트너)을 암호화하는 핵산을 함유하는 핵산, 바람직하게는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 일부 구현예에 있어서, 발현에 적절한 조건은 발현 벡터 및 선택된 숙주 세포에 따라 변화한다. 일부 구현예에 있어서, 포유동물 세포, 박테리아, 곤충 세포, 및 효모를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 매우 다양한 적절한 숙주 세포가 사용된다. 예를 들어, 본 개시내용에서 사용되는 다양한 세포주는 American Type Culture Collection에서 이용가능한 ATCC® 세포주 카탈로그에 기재되어 있다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 Fc 도메인 변이체는 세포주의 유전자 조작 또는 키푸넨신의 첨가와 같은 세포 배양 조건의 변형 또는 원핵생물(대장균 등)과 같은 천연 비-글리코실화 숙주를 사용함으로써, 이러한 세포에 의해 발현되는 단백질을 글리코실화하지 않도록 최적화된 세포에서 발현되며, 및 일부 경우에 있어서, Fc에서 글리코실화 서열의 변형은 필요하지 않다.
핵산 벡터 작제물 및 숙주 세포
본 개시내용의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 올리고뉴클레오티드-매개(또는 부위-지정) 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 표준 기술, 예를 들어, 유전자 합성을 사용하여 수득된다. 대안적으로, 야생형 SIRPα D1 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 표준 기술, 예를 들어, QuikChangeTM 돌연변이유발을 사용하여 특정 아미노산 치환을 포함하도록 돌연변이된다. 일부 경우에 있어서, 핵산 분자가 뉴클레오티드 합성기(nucleotide synthesizer) 또는 PCR 기술을 사용하여 합성된다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드 작제물, 예를 들어, SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 표 2, 5, 및 6에 제공된 임의의 변이체) 및 Fc 변이체와 같은 융합 파트너를 포함하는 폴리펩티드 작제물을 암호화하는 핵산은 발현 벡터에 혼입되어 단백질을 발현한다. 다양한 발현 벡터가 단백질 발현에 활용될 수 있다. 발현 벡터는 자가-복제, 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈으로 혼입되는 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 다양한 성분 또는 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 벡터 성분은 전사 및 번역 조절 서열, 예컨대, 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 신호 서열, 전사 개시 및 정지 서열, 번역 개시 및 정지 서열, 3' 및 5' 비번역 영역(UTR; untranslated region), 및 인핸서(enhancer) 또는 활성화 서열; 복제 원점(origin of replication); 선택 마커 유전자; 및 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열, 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 제어 또는 조절 서열, 선택가능한 마커, 임의의 융합 파트너, 추가적인 요소, 또는 이들의 임의의 조합과 작동가능하게 연결된 단백질을 포함한다. 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 핵산이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓이는 것을 의미한다. 일반적으로, 이러한 발현 벡터는 Fc 변이체를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 전사 및 번역 조절 핵산을 포함하고, 전형적으로 단백질을 발현하는 데 사용되는 숙주 세포에 적절하다. 항생제 내성 유전자 또는 형광 단백질 유전자와 같지만, 이에 제한되지 않는, 선택 유전자 또는 마커를 사용하여, 예를 들어, 항생제 또는 형광 발현에 의해 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택할 수 있다. 다양한 선택 유전자가 이용가능하다.
일부 구현예에 있어서, 벡터의 성분 또는 요소는 발현 벡터가 숙주 세포 유형과 양립할 수 있도록 최적화된다. 본 개시내용에서 사용되는 발현 벡터는 포유동물 세포, 박테리아, 곤충 세포, 효모, 및 시험관내 시스템에서 단백질 발현을 가능하게 하는 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에 있어서, 포유동물 세포는 본 개시내용의 폴리펩티드를 생성하기 위한 숙주 세포로서 사용된다. 포유동물 세포 유형의 예는 인간 배아 신장(HEK; human embryonic kidney)(예를 들어, HEK293, HEK 293F), 차이니즈 햄스터 난소(CHO), HeLa, COS, PC3, Vero, MC3T3, NS0, Sp2/0, VERY, BHK, MDCK, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0(임의의 면역글로불린 사슬을 내생적으로 생성하지 않는 쥐과 골수종 세포주), CRL7O3O, 및 HsS78Bst 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 대장균 세포는 본 개시내용의 폴리펩티드를 생성하기 위한 숙주 세포로서 사용된다. 대장균 균주의 예는 대장균 294(ATCC® 31,446), 대장균 λ 1776(ATCC® 31,537, 대장균 BL21(DE3)(ATCC® BAA-1025), 및 대장균 RV308(ATCC® 31,608)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
상이한 숙주 세포는 번역 후 처리(posttranslational processing) 및 단백질 산물의 변형(예를 들어, 글리코실화)에 대한 특징적이고 특정한 기전을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 폴리펩티드의 정확한 변형 및 처리를 보장하도록 선택된다. 벡터가 단백질 생성을 위해 숙주 세포 내로 도입되면, 숙주 세포는 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 목적하는 서열을 암호화하는 유전자 증폭에 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드 작제물, 예를 들어, SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 표 2, 5, 및 6에 제공된 임의의 변이체) 및 Fc 변이체와 같은 융합 파트너를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 발현 작제물이 레트로바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스를 사용하여 포유동물 세포 내로 도입되는 시스템을 포함하는, 포유동물 발현 시스템에서 발현된다. 일부 구현예에 있어서, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 또는 영장류 세포가 활용된다. 적합한 세포는 또한 Jurkat T 세포, NIH3T3, CHO, COS, 및 293 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 공지된 연구 세포를 포함한다. 대안적으로, 일부 구현예에 있어서, 단백질은 박테리아 세포에서 발현된다. 박테리아 발현 시스템은 기술분야에 공지되어 있으며, 대장균(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토코커스 크레모리스(Streptococcus cremoris), 및 스트렙토코커스 리비단스(Streptococcus lividans)를 포함한다. 일부 경우에 있어서, Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 Sf9 및 Sf21 세포와 같지만 이에 제한되지 않는 곤충 세포 또는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 한세눌라(Hansenula) 및 야로위아(Yarrowia) 속의 유기체와 같지만 이에 제한되지 않는 효모 세포에서 생성된다. 일부 경우에 있어서, Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드 작제물은 무세포 번역 시스템을 사용하여 시험관내에서 발현된다. 원핵생물(예를 들어, 대장균) 및 진핵생물(예를 들어, 밀 배아(wheat germ), 토끼 망상적혈구(rabbit reticulocyte)) 세포 모두로부터 유래된 시험관내 번역 시스템이 이용가능하며, 일부 구현예에 있어서, 이는 관심 단백질의 발현 수준 및 기능적 특성에 기반하여 선택된다. 예를 들어, 통상의 기술자가 인식하는 바와 같이, 일부 디스플레이 기술, 예를 들어, 리보솜 디스플레이에는 시험관내 번역이 필요하다. 또한, 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 액상 펩티드 합성 및 고상 펩티드 합성과 같지만, 이에 제한되지 않는, 화학적 합성 방법에 의해 생성된다. 박테리아 추출물과 같은 비-글리코실화 시스템을 사용하는 시험관내 전사의 경우, Fc는 천연 글리코실화 부위가 존재하더라도 글리코실화되지 않으므로 Fc의 불활성화가 동등하게 수득될 것이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드 작제물은 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체, 아미노산 모방체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 천연적으로 암호화된 아미노산은 일반적으로 20개의 공통 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린) 및 피롤리신 및 셀레노시스테인을 지칭한다. 아미노산 유사체는, 예를 들어, 수소에 결합된 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄과 같이 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서, 이러한 유사체는 변형된 R 기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 일반적으로 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다.
단백질 생성, 회수, 및 정제
일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 폴리펩티드를 생성하는 데 사용되는 숙주 세포는 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장된다. 포유동물 숙주 세포에 적합한 배지의 예는 최소 필수 배지(MEM; Minimal Essential Medium), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), Expi293™ 발현 배지, 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)이 보충된 DMEM, 및 RPMI-1640을 포함한다. 박테리아 숙주 세포에 적합한 배지의 예는 루리아 브로쓰(LB; Luria broth)와 선택제(selection agent), 예를 들어, 암피실린(ampicillin)과 같은 필수 보충제를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 숙주 세포는 적합한 온도, 예컨대, 약 20℃ 내지 약 39℃, 예를 들어, 약 25℃ 내지 약 37℃, 바람직하게는 37℃, 및 CO2 수준, 예컨대, 약 5% 내지 10%에서 배양된다. 일부 구현예에 있어서, 배지의 pH는, 주로 숙주 유기체에 따라, 약 pH 6.8 내지 pH 7.4, 예를 들어, pH 7.0이다. 발현 벡터에서 유도성 프로모터가 사용되는 경우, 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 단백질 발현이 유도될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 단백질 회수는, 예를 들어, 삼투압 쇼크(osmotic shock), 초음파처리, 또는 용해에 의해 숙주 세포를 파괴하는 것을 수반한다. 세포가 파괴되면, 세포 파편(cell debris)이 원심분리 또는 여과를 통해 제거된다. 이어서, 단백질은 추가로 정제될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 단백질 정제의 다양한 방법, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 및 크기-배제 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 분별 용해도법(differential solubility)에 의해, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제된다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 단백질은 단백질 A 컬럼(예를 들어, POROS 단백질 A 크로마토그래피)과 같은 친화성 컬럼을 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, POROS HS-50 양이온 교환 크로마토그래피), 여과, 한외 여과(ultra-filtration), 탈염 및 투석 절차와 적절히 선택하고 조합함으로써 단백질이 단리 및 정제된다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하기 위해 펩티드와 같은 마커 서열에 컨주게이션된다. 마커 아미노산 서열의 예는 헥사-히스티딘 펩티드(His6-tag)이며, 이는 마이크로몰 친화도로 니켈-작용화된 아가로스 친화성 컬럼에 결합할 수 있다. 대안으로, 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유래된 에피토프에 해당하는 혈구응집소(hemagglutinin) "HA" 태그가 사용될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시내용의 폴리펩티드, 예를 들어, SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 표 2, 5, 및 6에 제공된 임의의 변이체) 및 Fc 변이체와 같은 융합 파트너를 포함하는 폴리펩티드 작제물은, 예를 들어, 유전자 요법의 맥락에서, 본 개시내용의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터(poxviral vector)(예를 들어, 변형된 백시니아 앙카라(MVA; Modified Vaccinia Ankara)와 같은, 백시니아 바이러스 벡터), 아데노-연관 바이러스 벡터, 및 알파바이러스 벡터)와 같은 벡터를 투여함으로써 대상체(예를 들어, 인간)의 세포에 의해 생성된다. 벡터는, 일단 대상체의 세포 내부로 진입하면(예를 들어, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 인산칼슘 침전, 직접 현미주사, 감염 등에 의해) 본원에 개시된 폴리펩티드의 발현을 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 폴리펩티드는 세포로부터 분비된다. 일부 구현예에 있어서, 질환 또는 장애의 치료가 목적하는 결과인 경우, 추가 조치가 필요하지 않다. 일부 구현예에 있어서, 단백질의 수집을 목적하는 경우, 혈액은 대상체로부터 수집되고 단백질은 다양한 방법에 의해 혈액으로부터 정제된다.
암 치료 방법
골수암 치료 방법
일부 구현예에 있어서, (a) CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제 및 (b) 저메틸화 제제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체(예를 들어, 인간 개체)에서 암(예를 들어, 골수이형성 증후군(MDS) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)과 같은 골수암)을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에 있어서, 암은 AML이다. 일부 구현예에 있어서, 암은 TP53-돌연변이된 AML 및/또는 FLT3-돌연변이된 AML이다. 일부 구현예에 있어서, 암은 MDS이다. 일부 구현예에 있어서, 방법은 유도 단계 및 유지 단계를 포함하며, 여기서 유도 단계는 (a) CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제 및 (b) 저메틸화제의 투여를 포함하고, 및 유지 단계는 저메틸화제 없이 CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제의 투여를 포함한다(예를 들어, CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제를 이용한 단독요법).
일부 구현예에 있어서, (a) CD47(예를 들어, hCD47)과 SIRPα(예를 들어, hSIRPα) 사이의 상호작용을 차단하는 제제, (b) 저메틸화제, 및 (c) Bcl-2 억제제(예를 들어, 선택적 Bcl-2 억제제)의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체(예를 들어, 인간 개체)에서 암(예를 들어, 골수이형성 증후군(MDS) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)과 같은 골수암)을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에 있어서, 암은 AML이다. 일부 구현예에 있어서, 암은 TP53-돌연변이된 AML 및/또는 FLT3-돌연변이된 AML이다. 일부 구현예에 있어서, 암은 MDS이다.
MDS는 비정상적인 세포 성숙(골수이형성증) 및/또는 특징적인 세포유전학적 이상을 동반하는 만성 혈구감소증(cytopenia)(예를 들어, 빈혈, 호중구감소증(neutropenia), 혈소판감소증(thrombocytopenia))을 특징으로 하는 일련의 혈액학적 병태를 포함한다. 결과적으로, MDS를 갖는 개체는 증상성 빈혈, 감염, 및 출혈의 위험이 있을 뿐만 아니라 종종 표준 치료에 불응성인 급성 골수성 백혈병(AML)으로 진행될 위험이 있다. MDS를 갖는 개체들 사이에서 가장 통상적인 사망 원인은 AML으로의 변형보다는, 골수 부전(bone marrow failure)이다. 일부 구현예에 있어서, MDS는 고위험 MDS이다. 일부 구현예에 있어서, 개체가 3 초과의 개정된 국제 예후 점수 시스템(IPSS-R) 점수를 갖는 경우 MDS는 위험이 더 높은 것으로 간주된다. 일부 구현예에 있어서, 개체가 3.5 초과의 개정된 국제 예후 점수 시스템(IPSS-R) 점수를 갖는 경우 MDS는 위험이 더 높은 것으로 간주된다. IPSS-R은 하기 5가지 인자를 기반으로 하는 검증된 예후 도구이다: (1) 개체의 골수 내 모세포(혈액 세포의 매우 초기 형태)의 비율; (2) 세포유전학적 이상(존재하는 경우)의 유형 및 수; (3) 개체의 혈액 내 적혈구(헤모글로빈으로 측정됨) 수준; (4) 개체의 혈액 내 혈소판 수준; 및 (5) 개체의 혈액 내 호중구 수준. 각각의 인자에 점수가 부여되며, 점수가 3 이하인 개체는 유리한 예후 전망을 가질 가능성이 더 높다. 예를 들어, Greenberg 등 (2012). “Revised international prognostic scoring system for myelodysplastic syndromes.” Blood, 120 (12), 2454-2465; 및 Schanz 등 (2012)를 참조한다. IPSS-R 및 개체의 MDS 위험 상태를 결정하기 위해 점수를 계산하는 방법에 관한 세부사항은 “New comprehensive cytogenetic scoring system for primary myelodysplastic syndromes (MDS) and oligoblastic acute myeloid leukemia after MDS derived from an international database merge.” J Clin Oncol, 30 (8), 820-829를 참조한다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 약 3 이상 또는 약 3.5 이상의 IPSS-R 점수를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 약 3 미만 또는 약 3.5 미만의 IPSS-R 점수를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 MDS에 대한 사전 치료를 받았다. MDS에 대한 현재 표준 치료는, 예를 들어, 조혈모 세포-이식 및 아자시티딘을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 MDS에 대한 사전 치료를 받지 않았다.
AML은 증식성, 클론성, 비정상적으로 분화, 및 때때로 제대로 분화되지 않은 조혈계 세포에 의한 골수, 혈액, 및 기타 조직의 침윤을 특징으로 하는 암의 한 형태이다. 이는 성인들 사이에서 가장 통상적인 형태의 급성 백혈병 중 하나이다. 매년 의사들은 미국에서 약 19,520명의 사람들을 AML로 진단한다. 이 질환으로 인해 매년 10,670명이 사망하는 것으로 추산된다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 WHO 2016 분류에 따라 재발성/불응성 또는 신규하게 진단된 AML의 하위세포학적 또는 조직학적으로 확인된 진단을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 재발성/불응성이거나 집중 유도 요법에 적합하지 않은 것으로 간주되는 환자에서 이전에 치료되지 않은 AML을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 HMA-기반 레지멘을 이용한 사전 치료 후 재발성/불응성인 AML을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 이전에 치료되지 않은 AML을 가지며 집중 유도 요법에 적합한 후보로 간주되지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 적절한 신장 및 간 기능을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 18세 이상이다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 적절한 수행 상태를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 사전 동종이계-HSCT를 받지 않았다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 제어되지 않는 이식편대숙주 질환(GVHD) 없이, HCST 적어도 3개월 후이다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 사전 동종이계-HSCT를 받지 않았다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 AML에 대한 2019년 NCCN 가이드라인 버전 3에 따라 t(8;21), inv(16), 또는 t(16;16)과 같은 유리한 위험 세포유전학을 갖는 신규하게 진단된 AML을 갖지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 급성 전골수성 백혈병(APL)을 갖지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 임의의 항-CD47 또는 항-SIRPα(신호 조절 단백질 알파) 제제로 사전 치료를 받지 않았다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 B형 및 C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 관련 질병, 또는 sars-cov-2(중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2)를 포함하는, 공지된 활성 바이러스 감염을 갖지 않는다.
일부 구현예에 있어서, CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 차단하는 제제는 SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 SIRPα D1 도메인 변이체) 및 Fc 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 Fc 도메인 변이체)를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)이다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드의 SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 SIRPα D1 도메인 변이체)의 C-말단은 Fc 도메인 변이체의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)는 서열번호 81 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는 (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임(예를 들어, 여기서 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 Fc 도메인 변이체의 N-말단에 융합됨). 일부 구현예에 있어서, 개체에게 투여된 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)는 서열번호 136 또는 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)는 동종이량체를 형성한다.
저메틸화제
저메틸화제는 항종양 활성의 하기의 두 가지 주요 기전을 갖는 것으로 지금까지 밝혀진 항암제 부류이다: (i) DNA 손상 반응의 유도로 이어지는, RNA 및/또는 DNA로의 혼입으로 인한 세포독성 및 (ii) DNA 메틸트랜스퍼라제의 억제를 통한 DNA 저메틸화로 정상적인 세포 성장 및 분화의 회복을 가능하게 함. 저메틸화제에 관한 추가적인 세부사항은, 예를 들어, Diesch 등 (2016) “A clinical-molecular update on azanucleoside-based therapy for the treatment of hematologic cancers.” Clin Epigenet, 8: 71; Sato 등 (2017) “DNA Hypomethylating Drugs in Cancer Therapy.” Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 7(5), a026948; 및 Datta 등 (2012) “Novel Insights into the Molecular Mechanism of Action of DNA Hypomethylating Agents: Role of Protein Kinase C δ in Decitabine-Induced Degradation of DNA Methyltransferase 1.” Genes & cancer, 3(1), 71-81을 참조한다.
일부 구현예에 있어서, 저메틸화제는 아자시티딘(5-아자-2'-데옥시시티딘, 5-아자시티딘, 아자시티딘, 라다카마이신, 4-아미노-1-β-D-리보푸라노실-s-트리아진-2(1H)-온, 및 U-18496으로도 공지됨)이다. 시티딘의 피리미딘 뉴클레오시드 유사체인 아자시티딘은 실험식 C8H12N4O5 및 244.2 g/mol의 분자량을 갖는 백색 결정성 분말이다. 아자시티딘은 화학적으로 4-아미노-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-디하이드록시-5-(하이드록시메틸)옥솔란-2-일]-1,3,5-트리아진-2-온으로 기재되며 하기 화학 구조를 갖는다:
Figure pct00029
아자시티딘의 CAS 등록 번호는 320-67-2이다. 아자시티딘은 피하 또는 정맥내 투여되며 PREMIERPRO RX AZACITIDINE®, VIDAZA®, AZACITIDINE NOVAPLUS® 등의 상품명으로 판매된다. 아자시티딘 제조, 분배, 투여량, 및 투여 일정에 대한 완전한 정보는 현지 패키지 삽입물에서 찾을 수 있다(미국의 경우, 예를 들어, www(dot)accessdata.fda(dot)gov/drugsatfda_docs/label/2008/050794s011lbl(dot)pdf 참조; 유럽의 경우, 예를 들어, www(dot)ema(dot)Europa(dot)eu/en/documents/product-information/vidaza-epar-product-information_en(dot)pdf 참조). 일부 구현예에 있어서, 아자시티딘은 현지 패키지 삽입물에서 권장하는 용량 및 빈도에 따라 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 저메틸화제는 데시타빈(5-아자-2'-데옥시시티딘, 4-아미노-1-(2-데옥시-β-D-에리트로-펜토푸라노실)-s-트리아진-2(1H)-온, 및 5-아자데옥시시티딘으로도 공지됨)이다. 데시타빈은 또한 시티딘의 피리미딘 뉴클레오시드 유사체이다. 데시타빈은 C8H12N4O4의 실험식 및 218.21 g/mol의 분자량을 갖는다. 데시타빈은 화학적으로 4-아미노-1-[(2R,4S,5R)-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)옥솔란-2-일]-1,3,5-트리아진-2-온으로 기재되며 하기 화학 구조를 갖는다:
Figure pct00030
데시타빈의 CAS 등록 번호는 2353-33-5이다. 데시타빈은 정맥내 투여되며 DACOGEN®(및 기타) 상표명으로 판매된다. 데시타빈 제조, 분배, 투여량, 및 투여 일정에 대한 완전한 정보는 현지 패키지 삽입물에서 찾을 수 있다(미국의 경우, 예를 들어, www(dot)accessdata(dot)fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/021790s006lbl(dot)pdf 참조; 유럽의 경우, 예를 들어, www(dot)ema(dot)europa(dot)eu/en/documents/product-information/dacogen-epar-product-information_en(dot)pdf 참조). 일부 구현예에 있어서, 데시타빈은 현지 패키지 삽입물에서 권장하는 용량 및 빈도에 따라 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 저메틸화제는 FdCyd(5-플루오로-2'-데옥시시티딘), 제불라린, CP-4200(즉, 아자시티딘의 엘라이드산 유도체), RG108, 나나오마이신 A, 구아데시타빈, RX-3117, EPI01, 안트로퀴노놀, CC-486, 또는 ASTX727(예를 들어, astx(dot)com/research-development/clinical-pipeline/astx727-oral-dnmt-inhibitor-hematological-malignancies/참조)이다. 본 방법에서 사용되는 다른 예시적인 저메틸화제는, 예를 들어, Sato 등 (2017). “DNA Hypomethylating Drugs in Cancer Therapy.” Cold Spring Harbor perspectives in medicine, 7(5), a026948 및 Duchmann 등 (2019). “Clinical update on hypomethylating agents.” Int J Hematol 110, 161-169에 기재되어 있다.
Bcl-2 억제제
Bcl-2 억제제는 항아폽토시스 패밀리 구성원의 표면 상에서 BH3 도킹 그루브(docking groove)를 점유하기 위해 프로아폽토시스 Bcl2와 경쟁함으로써 그 세포독성 효과를 발휘하는 것으로 여겨지는 항암제의 부류이다. 하나 이상의 Bcl2 패밀리 구성원에 결합함으로써, 이러한 억제제는 BCL-2 및 기타 관련 단백질의 천연 길항제의 활성을 모방함으로써 아폽토시스를 유도하고 종양 세포에서 아폽토시스를 회복시킨다.
일부 구현예에 있어서, Bcl-2 억제제는 베네토클락스(GDC-0199, ABT-199, 및 RG7601로도 공지됨)이며 이는 본원에 기재된 방법에 사용되는 예시적인 선택적 Bcl2 억제제이다. 베네토클락스는 실험식 C45H50ClN7O7S 및 868.44 g/mol의 분자량을 갖는 옅은 황색 내지 짙은 황색의 고체이다. 베네토클락스는 수용성이 매우 낮다. 베네토클락스는 화학적으로 4-(4-{[2-(4-클로로페닐)-4,4디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일]메틸}피페라진-1-일)-N-({3-니트로-4-[(테트라하이드로-2H-피란-4일메틸)아미노]페닐}설포닐)-2-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-일옥시)벤즈아미드)로 기재되며 하기 화학 구조를 갖는다:
Figure pct00031
베네토클락스의 CAS 등록 번호는 1257044-40-8이다. 베네토클락스는 경구 투여되며 Venclexta 및 Venclyxto의 상표명으로 판매된다. 베네토클락스 제조, 분배, 투여량, 및 투여 일정에 대한 완전한 정보는 현지 패키지 삽입물에서 찾을 수 있다(미국의 경우, 예를 들어, www(dot)accessdata(dot)fda(dot)gov/drugsatfda_docs/label/2016/208573s000lbl(dot)pdf 참조; 유럽의 경우, 예를 들어, www(dot)ema(dot)europa(dot)eu/en/medicines/human/EPAR/venclyxto#product-information-section 참조). 일부 구현예에 있어서, 베네토클락스는 현지 패지지 삽입물에서 권장하는 용량 및 빈도에 따라 투여된다.
일부 구현예에 있어서, Bcl-2 억제제는 ABT-737이다. ABT-737은 본원에 기재된 방법에서 사용되는 또 다른 예시적인 선택적 Bcl2 억제제이다. Bcl2 및 Bcl-xL 모두를 억제하는 ABT-737은 실험식 C42H45ClN6O5S2 및 813.43 g/mol의 분자량을 갖는다. ABT-737의 CAS 등록 번호는 852-808-04-9이다. ABT-737은 화학적으로 4-{4-[(4'-클로로-2-바이페닐릴)메틸]-1-피페라지닐}-N-[(4-{[(2R)-4-(디메틸아미노)-1-(페닐설파닐)-2-부타닐]아미노}-3-니트로페닐)설포닐]벤즈아미드로 기재되며 하기 화학 구조를 갖는다:
Figure pct00032
일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 방법에서 사용된 Bcl-2 억제제는 나비토클락스이다. Bcl2, Bcl-xL 모두, 및 Bcl-w를 억제하는 나비토클락스(ABT-263으로도 공지됨)는 실험식 C47H55ClF3N5O6S3 및 974.6 g/mol의 분자량을 갖는다. 나비토클락스의 CAS 등록 번호는 923564-51-6이다. ABT-737은 화학적으로 4-[4-[[2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸사이클로헥센-1-일]메틸]피페라진-1-일]-N-[4-[[(2R)-4-모르폴린-4-일-1-페닐설파닐부탄-2-일]아미노]-3-(트리플루오로메틸설포닐) 페닐]설포닐벤즈아미드로 기재되며 하기 제공된 화학 구조를 갖는다. 나비토클락스에 관한 추가적인 세부사항은, 예를 들어, Tse 등 (2008) Cancer Res. 68(9): 3421-3429에 제공되어 있다.
Figure pct00033
일부 구현예에 있어서, 본원에 기재된 방법에서 사용된 Bcl2 억제제는 S55746(BCL201 및 Servier-1로도 공지됨)이다. S55746은 BCL-2의 소수성 그루브를 점유한다. 그것의 선택성 프로파일은 MCL-1, BFL-1에 대한 유의미한 결합을 나타내지 않는다. S55746은 BCL-2의 소수성 그루브를 점유한다. 그것의 선택성 프로파일은 MCL-1, BFL-1(BCL2A1/A1)에 대한 유의미한 결합을 나타내지 않으며 BCL-XL에 대한 열악한 친화도를 나타낸다. S55746은 혈소판과 같은, BCL-XL-의존성 세포에 대한 세포독성 활성을 갖지 않는다(예를 들어, Casara 등 (2008) Oncotarget. 9(28): 29975-20088 참조). S55746은 실험식 C43H42N4O6 및 710.82 g/mol의 분자량을 갖는다. S55746의 CAS 등록 번호는 1448584-12-0이다. S55746은 화학적으로 (S)-N-(4-하이드록시페닐)-3-(6-(3-(모르폴리노메틸)-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-2-카르보닐)벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-N-페닐-5,6,7,8-테트라하이드로인돌리진-1-카르복스아미드로 기재되며 하기 화학 구조를 갖는다:
Figure pct00034
일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드) 및 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘)는 동시에(simultaneously), 동시발생적으로(concurrently), 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드), 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘), 및 Bcl-2 억제제(예를 들어, 베네토클락스)는 동시에, 동시발생적으로, 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 정맥내 주입을 통해 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 60 mg/kg 이하의 용량으로 (예를 들어, 정맥내 주입을 통해) 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 4주마다 1회(즉, q4w) 또는 28일마다 1회 60 mg/kg의 용량으로 (예를 들어, 정맥내 주입을 통해) 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘)는 정맥내 주입을 통해 또는 피하 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 아자시티딘은 1회 이상의 28일 주기로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 아자시티딘은 각 28일 주기의 7일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 아자시티딘은 각 28일 주기 중 5일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 개체에게 투여되고, 이어서 2일 동안 아자시티딘이 투여되지 않으며, 및 이후 추가적인 2일 동안 75 mg/m2의 용량으로 개체에게 투여된다. 일부 구현예에 있어서, Bcl-2 억제제(예를 들어, 베네토클락스)는 경구 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 베네토클락스는 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 베네토클락스는 치료 1일차에 100 mg, 치료 2일차에 200 mg, 및 치료 3일차 이후 매일 400 mg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 베네토클락스는 치료 1일차에 100 mg, 치료 2일차에 200 mg, 치료 3일차에 400 mg, 및 3일차 이후 매일 600 mg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 베네토클락스는 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘 또는 데시타빈)와 조합되어 각 28일 주기 동안 매일 1회 400 mg 경구 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 20 mm 테플론 코팅된 고무 격막 마개(rubber septum stopper) 및 알루미늄 시일(aluminum seal)로 밀봉된 100 mg/5 ml 유형 I 투명 유리 바이알에서 사용(예를 들어, 정맥내 투여)을 위해 공급된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 20 mm 테플론 코팅된 고무 격막 마개 및 알루미늄 시일로 밀봉된 400 mg/20 ml 유형 I 투명 유리 바이알에서 사용(예를 들어, 정맥내 투여)을 위해 공급된다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드는 사용(예를 들어, 정맥내 투여) 전까지 2-8℃(36-46℉)에서 그것의 원래의 용기에 보관된다.
암 치료를 위한 병용 요법
일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 SIRPα D1 도메인 변이체) 및 Fc 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 Fc 도메인 변이체)를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체(예를 들어, 인간 개체)에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)는 약 60 mg/kg 이하(예를 들어, 예컨대, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60 mg/kg 중 임의의 하나, 이러한 값들 사이의 임의의 범위 포함)의 용량으로 개체에게 (예를 들어, 정맥내 주입을 통해) 투여된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 SIRPα D1 도메인 변이체) 및 Fc 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 Fc 도메인 변이체)를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체(예를 들어, 인간 개체)에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)는 약 60 mg/kg의 용량으로 개체에게 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)는 약 60 mg/kg의 용량으로 (예를 들어, 정맥내 주입을 통해) 4주마다 1회(예를 들어, q4w), 또는 28일마다 1회 투여된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 SIRPα D1 도메인 변이체) 및 Fc 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 Fc 도메인 변이체)를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체(예를 들어, 인간 개체)에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)는 약 45 mg/kg의 용량으로 (예를 들어, 정맥내 주입을 통해) 개체에게 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)는 3주마다 1회(예를 들어, q3w), 또는 21일마다 1회 약 45 mg/kg의 용량으로 (예를 들어, 정맥내 주입을 통해) 개체에게 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)의 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 Fc 도메인 변이체의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)는 서열번호 81 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα D1 도메인 변이체를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 하기이다: (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는 (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임(예를 들어, 여기서 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 Fc 도메인 변이체의 N-말단에 융합됨). 일부 구현예에 있어서, 개체에게 투여된 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)는 서열번호 136 또는 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)는 동종이량체를 형성한다. 일부 구현예에 있어서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에 있어서, 방법은 SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 SIRPα D1 도메인 변이체) 및 Fc 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 Fc 도메인 변이체)를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 적어도 하나의 추가적인 제제(예를 들어, 항암제), 예컨대, 적어도 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 추가적인 제제(예를 들어, 항암제)와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본원의 방법에서 사용되는 예시적인 항암제(들)는 치료적 항체, 항체-약물 컨주게이트(ADC; antibody-drug conjugate), 소분자 억제제, 펩티드 억제제, 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트, 면역조절제, 항-종양 항생제, 면역치료제, 항암 백신, 종양용해성 바이러스(oncolytic virus), 사이토카인, 또는 화학요법제(예를 들어, 토포이소머라제 억제제, 항대사물질, 항-유사분열 약물, 저메틸화제, 백금-기반 화합물, 안트라사이클린(anthracycline), 알킬화제, 식물 알칼로이드, 및 기타), 및 이들의 조합을, 제한 없이, 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에 있어서, 방법은 SIRPα D1 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 SIRPα D1 도메인 변이체) 및 Fc 도메인 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 Fc 도메인 변이체)를 포함하는 폴리펩티드를 적어도 하나의 추가적인 요법의 모드와 함께 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 폴리펩티드의 투여와 함께 수행되는 요법의 예시적 모드(들)는 입양 세포 요법(adoptive cell therapy)(예를 들어, 키메라 항원 수용체 T-세포 요법(CAR-T; chimeric antigen receptor T-cell), 종양 침윤 림프구(TIL; tumor infiltrating lymphocyte), TCR 조작된 T 세포, TCR 조작된 NK 세포, 및 대식세포 산물), 동종 줄기 세포(autologous stem cell) 이식, 동종이계 줄기 세포 이식, 방사선, 수술, 유전자 요법, 동결절제(cryoablation), 및 골수 이식을, 제한 없이, 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 제공된 방법에 의해 치료되는 암은 고형 종양이다. 본원에 제공된 방법에 의해 치료되는 예시적인 암은, 예를 들어, 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 폐의 선암종(adenocarcinoma of the lung), 편평 세포 폐암(squamous cell lung cancer), 소세포 폐암(SCLC; small cell lung cancer), 비-소세포 폐암(NSCLC; non-small cell lung cancer), 두경부암(head and neck cancer), 중피종(mesothelioma), 뇌암(brain cancer), 뇌종양(brain tumor), 복부암(abdominal cancer), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 식도암(esophageal cancer), 부인두암(parapharyngeal cancer), 위장관암(gastrointestinal cancer), 신경교종(glioma), 간암(liver cancer), 위암(gastric cancer), 구강암(oral cancer), 설암(tongue cancer), 신경모세포종(neuroblastoma), 골육종(osteosarcoma), 난소암(ovarian cancer), 신장암(renal cancer), 방광암(urinary bladder cancer), 요로암(urinary tract cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 망막모세포종(retinoblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁암(uterine cancer), 빌름스종양(Wilm’s tumor), 다발성 골수종(multiple myeloma), 피부암(skin cancer), 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 혈액암(blood cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 골암(bone cancer), 선낭성 종양(adenocystic tumor), 연골육종(chondrosar-coma), 췌장 소도 세포 종양(pancreatic islet cell tumor), 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor), 전립선암(prostate cancer), 교모세포종(glioblastoma), 자궁내막 암종(endometrial carcinoma), 자궁내막암(endometrial cancer), 평활근육종(leiomyosarcoma), 담낭암(gall bladder cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 흑색종(melanoma), 또는 기타 고형 종양을, 제한 없이, 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 제공된 방법에 의해 치료되는 암은 혈액암(hematological cancer)이다. 본원에 제공된 방법에 의해 치료되는 예시적인 암은, 예를 들어, 급성 또는 만성 골수성 백혈병 급성 또는 만성 림프모구 백혈병(lymphoblastic leukemia), 급성 림프구성 백혈병(ALL; acute lymphocytic leukemia) 만성 림프구성 백혈병(CLL; chronic lymphocytic leukemia), 소림프구성 림프종(SLL; small lymphocytic lymphoma), 급성 골수성 백혈병(AML; acute myeloid leukemia), 골수이형성 증후군(MDS; myelodysplastic syndrome), 만성 골수성 백혈병(CML; chronic myeloid leukemia), 모양 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML; chronic myelomonocytic leukemia), 소아 골수단핵구성 백혈병(JMML; Juvenile myelomonocytic leukemia), 거대 과립 림프구성(LGL; large granular lymphocytic) 백혈병, 형질세포종(plasmacytoma), 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(BPDCN; blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm), B-세포 전림프구성 백혈병(B-PLL; B-cell prolymphocytic leukemia), T-세포 전림프구성 백혈병(T-PLL; T-cell prolymphocytic leukemia), 다발성 골수종(MM; multiple myeloma), 및 비-호지킨 림프종(Non-Hodgkin lymphoma)(예컨대, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL; diffuse large B-cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt lymphoma), 맨틀 세포 림프종(MCL; mantle cell lymphoma), 말초 T-세포 림프종(PTCL; peripheral T-cell lymphoma), 림프형질세포성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma), 발덴스트룀 고분자글로불린혈증(
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), 변연부 림프종(MZL; marginal zone lymphoma) 및 여포성 림프종(FL; follicular lymphoma)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 예를 들어, 다발성 골수종 또는 백혈병을, 제한 없이, 포함한다.
키트 및 제조 물품
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 융합 폴리펩티드)를 포함하는 제조 물품 또는 키트가 제공된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 개체(예를 들어, 인간 개체)에서 골수이형성 장애(MDS) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료를 위해 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘)와 조합하여 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 개체(예를 들어, 인간 개체)에서 AML의 치료를 위해 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘) 및 Bcl-2 억제제(예를 들어, 베네오클락스)와 조합하여 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81 및 서열번호 85로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 하기이다: (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는 (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 135 또는 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 동종이량체를 형성한다. 일부 구현예에 있어서, 키트 또는 제조 물품은 본원에 제공된 치료 방법에 따라 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에 있어서, 키트 또는 제조 물품은 저메틸화제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 저메틸화제는 아자시티딘이다. 일부 구현예에 있어서, 키트는 개체(예컨대, 인간 개체)에서 암(예를 들어, 골수이형성 증후군(MDS) 또는 급성 골수성 백혈병(AML)과 같은 골수암)을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘)와 조합하여 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 사용하기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물 또는 표지를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 키트 또는 제조 물품은 AML, 예를 들어, TP53-돌연변이 AML 및/또는 FLT3-돌연변이 AML의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 키트 또는 제조 물품은 MDS, 예를 들어, 고위험 MDS의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드) 및 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘)가 키트에 함께 제공된다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드) 및 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘)는 동일한 용기 또는 별도의 용기에 제공된다.
일부 구현예에 있어서, 키트 또는 제조 물품은 Bcl-2 억제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Bcl-2 억제제는 베네토클락스이다. 일부 구현예에 있어서, 키트는 개체(예컨대, 인간 개체)에서 암(예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML)과 같은 골수암)을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘) 및 Bcl-2 억제제(예를 들어, 베네토클락스)와 조합하여 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 사용하기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물 또는 표지를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 키트 또는 제조 물품은 AML, 예를 들어, TP53-돌연변이 AML 및/또는 FLT3-돌연변이 AML의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드), 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘), 및 Bcl-2 억제제(예를 들어, 베네토클락스)가 키트에 함께 제공된다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드), 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘), 및 Bcl-2 억제제(예를 들어, 베네토클락스)는 동일한 용기 또는 별도의 용기에 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 융합 폴리펩티드)를 포함하는 제조 물품 또는 키트가 제공된다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81 및 서열번호 85로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 하기이다: (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는 (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임. 일부 구현예에 있어서, Fc 도메인 변이체는 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 135 또는 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 동종이량체를 형성한다. 일부 구현예에 있어서, 키트는 개체(예컨대, 인간 개체)에서 암(예를 들어, 본원의 다른 곳에서 기재된 암)의 치료를 위해 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 사용하기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물 또는 표지를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 패키지 삽입물 또는 표지는 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 이를 필요로 하는 개체에게 60 mg/kg 이하의 용량으로 투여하기 위한 지침을 제공한다. 일부 구현예에 있어서, 패키지 삽입물 또는 표지는 4주마다 1회(q4w), 또는 28일마다 1회 60 mg/kg의 용량으로 개체에게 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 투여하기 위한 지침을 제공한다. 일부 구현예에 있어서, 패키지 삽입물 또는 표지는 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 3주마다 1회(q3w), 또는 21일마다 1회 45 mg/kg의 용량으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여하기 위한 지침을 제공한다. 일부 구현예에 있어서, 키트는 적어도 하나의 추가적인 항암제(예를 들어, 본원의 다른 곳에서 기재된 항암제)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 키트는 개체(예컨대, 인간 개체)에서 암(예를 들어, 본원에 기재된 암)을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 적어도 하나의 추가적인 항암제와 조합하여 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 사용하기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물 또는 표지를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드) 및 적어도 하나의 추가적인 항암제는 동일한 용기 또는 별도의 용기에 제공된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에 있어서, 키트는 적어도 하나의 추가적인 요법의 모드(예를 들어, 본원에 기재된 요법의 모드)와 함께 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 사용하기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물 또는 표지를 포함한다.
적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 주사기를 포함한다. 용기는 유리, 플라스틱(예컨대, 폴리염화비닐 또는 폴리올레핀), 또는 금속 합금(예컨대, 스테인리스 스틸 또는 하스텔로이(hastelloy))과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 용기는 제형을 보유하며 용기 상의, 또는 이와 연관된 표지는 사용법을 나타낼 수 있다. 제조 물품 또는 키트는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침이 포함된 패키지 삽입물을 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 제조 물품은 하나 이상의 또 다른 제제(예를 들어, 화학요법제, 항-종양제, 치료적 항체 등)를 추가로 포함한다. 하나 이상의 제제에 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 주사기를 포함한다.
본 명세서는 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 간주된다. 본원에 도시되고 기재된 것 외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백할 것이며 첨부된 청구범위의 범위 내에 속할 것이다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
본 개시내용은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 실시예는 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시적 목적을 위한 것이고, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변경이 통상의 기술자에게 제안될 것이며, 이는 본 출원의 사상 및 영역 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예 1: 실시예 2A-2E에 대한 재료 및 방법
말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 단리
태평양 혈액 센터(Blood Centers of the Pacific) 또는 혈소판분리반출 백혈구감소 필터(plateletpheresis leukoreduction filter)(LRS 챔버)(Vitalant)의 트리마 잔류물(Trima residual)을 PBS(Life Technologies)로 희석하였다. 희석된 혈액을 두 개의 튜브로 분할하고 15 mL의 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)를 바닥에 첨가하였다(underlayed). 튜브를 400 x g에서 30분 동안 원심분리하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 계면으로부터 수집하고, 40 mL의 PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 400 xg에서 10분 동안 원심분리하고, 및 MACS 완충액(0.5% BSA가 포함된 PBS(Thermo Fisher Scientific), 2 mM EDTA(Teknova))에 재현탁하였다.
포식작용을 위한 인간 단핵구-유래 대식세포의 유래 및 배양
CD14+ 단핵구를 제조업체의 프로토콜에 따라 고전 단핵구 단리 키트, 인간(Classical Monocytes Isolation Kit, human)(Miltenyi Biotec) 및 LS 컬럼(Miltenyi Biotec)을 사용하여 음성 선택(negative selection)에 의해 정제하였다. CD14+ 단핵구를 50 ng/mL의 M-CSF(Miltenyi Biotec), 10% FBS(Thermo Fisher Scientific), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 1% GlutaMAX가 보충된, RPMI 완전 배지로 구성된 25 mL의 배지에 접시당 6백만개 세포로 150 mm의 조직 배양 접시(Corning)에 시딩하였다. 세포를 7일 내지 11일 동안 배양하였다.
시험관내 포식작용 검정
표적 세포인 HL60 및 OCI-AML3 세포를 PBS에서 1회 세척하고 제조업체의 지침에 따라 300 nM의 CFSE(카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르)가 포함된 현탁액에서 Celltrace CFSE 세포 증식 키트(Thermo Fisher Scientific)로 표지하고 RPMI 완전 배지에 재현탁하였다. 표적 세포를 RPMI 완전 배지에서 39 nM 내지 2.5 μM의 아자시티딘의 2배 연속 희석액과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 대식세포와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포를 RPMI에 재현탁하였다. PBS로 1회 세척하고 TrypLE Select에서 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하여 대식세포를 배양 플레이트에서 분리시켰다. 세포를 세포 스크래퍼(cell scraper)(Corning)로 제거하고, PBS로 세척하고, 및 RPMI에 재현탁하였다.
아자시티딘으로 48시간 동안 처리된 CFSE-표지된 표적 세포를 회전시키고 웰당 100,000개 세포로 초-저 부착 U-바닥 96 웰 플레이트(Corning)에 첨가하였다. 이어서, 약물 A를 첨가하였다. 플레이트를 5% 이산화탄소가 포함된 가습 인큐베이터에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 50,000개의 대식세포를 첨가하였다. 플레이트를 5% 이산화탄소가 포함된 가습 인큐베이터에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 400 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화하고 PBS 중 1:4000으로 희석된 고정가능한 생존능 염료(Fixable Viability Dye) eFluor 780(ebioscience)에서 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 세포를 FACS 완충액(0.5% BSA가 포함된 PBS)으로 세척하고 인간 FcR 차단 시약(Miltenyi Biotec), BV421 항-CD33(Biolegend), APC 항-CD14(Biolegend) 및 PE-시아닌7 항-CD11b(Invitrogen)를 함유하는 FACS 완충액에서 4℃에서 45분 동안 염색하였다. 세포를 FACS 완충액에서 2회 세척하고 PBS 중 희석된 0.5% 파라포름알데히드에서 4℃에서 밤새 고정시켰다. 세포를 FACS Canto II(BD Biosciences) 상에서 분석한 이후, Flowjo 10.6.1(Becton Dickinson & Company)에 의해 데이터를 분석하였다. 사멸된 세포는 e780-음성 집단에 대한 게이팅(gating)에 의해 배제하였다. 대식세포는 계통 마커(lineage marker) CD33, CD11b 및 CD14에 대해 세포 양성인 것으로 확인되었다. 이러한 집단 중, 종양 세포를 포식한 대식세포는 CFSE에 대해 세포 양성인 것으로 확인되었다.
인간 PBMC 생존능 검정
PBMC를 계수하고 완전 RPMI에 플레이팅하였다. 약물 A 단독 또는 아자시티딘과 조합하여 PBMC에 첨가하였다. 37℃에서의 72시간 또는 5일 인큐베이션 후, 세포를 고정가능한 생존능 염료로 염색한 후, 세포 표면 마커인 CD3, CD19, CD14, CD56, CD16, CD11c, 및 HLADR(Biolegend)로 염색하였다. 세포를 Attune NxT에 의한 유세포 분석을 위해 처리하고 FlowJo 10.3에 의해 분석하였다. 생존능 게이팅 전략은 FSC 높이 및 FSC 너비에 의한 이중 단일항 배제에 이어 세포 유형 표면 마커, 이어서 생존능 게이트를 포함하였다. CD11c DC는 계통 음성(CD3, CD19, CD14, CD16 및 CD56) HLADR+ CD11c+로 확인되었다. GraphPad Prism 8을 사용하여 생존가능한 세포의 백분율을 표로 작성하였다.
칼레티쿨린 발현의 분석
인간 급성 골수성 백혈병 세포주 HL60, OCI-AML3 및 MV4-11에서 칼레티쿨린 발현 수준의 변화를 검출하기 위해, 세포를 37℃ 5% CO2 인큐베이터의 완전 성장 배지(RPMI1640, 10% FBS)에서 2.5 μM 또는 75 nM의 아자시티딘(Selleckchem)과 72시간 동안 인큐베이션하였다. 완전 성장 배지에서 성장된 세포를 칼레티쿨린 기준선 발현에 대한 대조군으로 사용하였다. 인큐베이션 후, 세포를 수확하고 염색 완충액(PBS, 2% FBS)에서 1회 세척하고, 고정가능한 live/dead 스테인(Invitrogen)으로 PBS에서 4℃에서 1시간 동안 염색하고, 염색 완충액에서 1회 세척하고 및 500 ng/mL의 칼레티쿨린-AF647(클론 1G6A7, Novus)과 인큐베이션하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 염색 완충액으로 2회 세척하고 0.5% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 세포를 Attune(ThermoScientific) 상에서 분석한 이후, Flowjo 10.6을 사용하여 데이터를 분석하였다.
생체내 항-종양 활성
HL60(ATCC), MV4-11(ATCC), OCI-AML3(DSMZ) 급성 골수성 백혈병 세포를 NOD-SCID 암컷 마우스의 오른쪽 옆구리에 1:1 matrigel(Corning) 및 RPMI 1640 비율을 사용하여 5 x 106개 세포의 농도로 주사하여 피하 종양 이종이식을 유도하였다. 모든 종양의 평균 크기가 HL60의 경우 105 mm3, MV4-11의 경우 75 mm3 및 OCI-AML3의 경우 112 mm3에 도달할 때까지 종양을 모니터링하였다. 마우스를 PBS, 아자시티딘(Selleckchem), 약물 A 및 아자시티딘 + 약물 A 조합 코호트로 무작위 배정하였으며, HL60 및 OCI-AML3의 경우 코호트당 4-5마리의 마우스 및 MV4-11의 경우 코호트당 10마리의 마우스를 이용하였다. HL60 및 OCI-AML3 종양 모델의 마우스는 아자시티딘의 경우 3일 간격으로 5 mg/kg으로 5회, 및 약물 A의 경우 3일 간격으로 10 mg/kg으로 6회 복강내(IP; intraperitoneally) 투여되었다. MV4-11 종양 보유 마우스는 아자시티딘의 경우 5 mg/kg 및 약물 A의 경우 10 mg/kg으로 주당 3회 IP 투여되었다. 종양을 캘리퍼스를 이용하여 2차원으로 측정하고 종양 체적을 길이 x 너비 x 너비 x 0.5로 계산하였으며, 여기서 길이는 두 측정값 중 더 큰 값이었다. 종양이 ~2000 mm3의 체적에 도달했을 때 동물을 희생시켰다.
전신성 백혈병 모델의 연속 BLI 영상화
HL60LUC2(ATCC) 세포주를 RPMI 1640당 7.5 x 106개 세포의 농도로 NOD-SCID 암컷 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. IVIS 스펙트럼(Perkin Elmer)을 사용하여 생체발광 영상화(BLI; Bioluminescence imaging) 획득 및 분석을 수행하여 종양 성장을 모니터링하였다. 반딧불이 D-루시페린(Firefly D-luciferin)(Regis Technologies)을 인산염-완충 식염수에서 15 mg/ml의 스톡으로 희석하고 사용 전에 여과하였다. 마우스 그룹을 표본 챔버에 두고 200 μl의 D-루시페린을 복강내(IP) 주사하였다. BLI 전신 신호는 주사 대략 10분 후에 획득하였다. BLI 플럭스 값은 마우스 접종 3일 후에 획득한 초기 스캔으로 일주일에 2회 연속적으로 모니터링하였다. Living Image Software(Perkin Elmer)를 사용하여 마우스 신체 전체에 대해 관심 영역을 수동으로 구성한 후 BLI 평균 총 플럭스 값(광자/초, p/s)을 정량화하였다. 평균 2.6E6의 총 플럭스(광자/초)에서, 마우스를 PBS, 아자시티딘(Selleckchem), 약물 A 및 약물 A와 조합된 아자시티딘 코호트로 무작위 배정하였으며, 코호트당 10마리의 마우스를 이용하였다. 아자시티딘의 제형은 PBS 중 2% DMSO였다. 아자시티딘-처리된 마우스는 5 mg/kg의 아자시티딘이 3일 간격으로 총 5회 IP 주사로 투여되었다. 약물 A-처리된 마우스는 3일 간격으로 총 5회 30 mg/kg으로 IP 주사에 의해 투여되었다. 총 플럭스가 1E11에 도달하거나 20% 초과의 체중 감소에 도달하면 동물을 희생시켰다.
실시예 2A: 시험관내 모델에서 대식세포에 의한 포식작용에 대한 아자시티딘과 조합된 약물 A의 효과
이 실시예에서, 대식세포에 의한 HL60 및 OCI-AML3 인간 급성 골수성 백혈병 세포의 포식작용에 대한 약물 A 단독, 아자시티딘 단독, 및 아자시티딘과 조합된 약물 A의 효과를 시험관내 검정에서 평가하였다(세부사항은 실시예 1 참조). HL60은 TP53null FLT3wt 세포주이고, OCI-AML3은 TP53wt 및 FLT3wt이다.
간략하게, HL60 세포 및 OCI-AML3 세포(즉, "표적 세포")를 CFSE(카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르)로 표지하고 48시간 동안 아자시티딘(aza)으로 처리하였다. 이어서, 표적 세포를 회전시키고 웰당 100,000개 세포로 96 웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 이어서, 약물 A를 첨가하였다. 미처리 대조군 표적 세포뿐만 아니라 아자시티딘 단독 또는 약물 A 단독으로 처리된 대조군 표적 세포를 병행하여 제조하였다. 대식세포를 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 대식세포를 펠릿화하고, 염색하고, 및 유세포 분석을 통해 분석하였다. 사멸된 세포는 e780-음성 집단에 대한 게이팅에 의해 배제하였다. 대식세포는 계통 마커 CD33, CD11b 및 CD14에 대해 세포 양성인 것으로 확인되었다. 이러한 집단 중, 종양 세포를 포식한 대식세포는 CFSE에 대해 세포 양성인 것으로 확인되었다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 단일 제제로서 아자시티딘(aza)은 HL60 세포의 대식세포-매개 포식작용을 약간 자극한 반면, 단일 제제로서 약물 A는 포식작용에 거의 영향을 미치지 않았다. (약물 A 처리된 세포를 미처리된 세포의 그것과 비교한다.) 1.6 nM 약물 A 및 156 nM aza의 조합은 약물 A 단독 또는 aza 단독보다 더 큰 정도로 대식세포에 의한 HL60 세포의 포식작용을 자극하였다. OCI-AML3 세포에서 40 nM 약물 A 및 2.5 μM aza를 이용하여 유사한 결과가 관찰되었다. 도 1b를 참조한다.
실시예 2B: 인간 PBMC 배양물에서 CD11c + 수지상 세포의 생존능에 대한 아자시티딘과 조합된 약물 A의 효과
이 실시예에서, 인간 말초 혈액 단핵 세포 배양물에서 CD11c+ 수지상 세포의 생존능에 대한 약물 A 단독, 아자시티딘 단독, 및 아자시티딘과 조합된 약물 A의 효과를 시험관내 검정에서 평가하였다(세부사항은 실시예 1 참조). 수지상 세포(DC)는 포유동물 면역계의 항원-제시 세포(보조 세포(accessory cell)로도 공지됨)이다. 이는 선천 면역계와 적응 면역계 사이에서 메신저 역할을 한다고 여겨진다.
1.25 μM 아자시티딘(aza) 단독을 이용한 PMBC 세포의 인큐베이션은 CD11c+ 수지상 세포의 생존능이 약 40% 감소한 반면, 200 nM 약물 A 단독을 이용한 PBMC의 인큐베이션은 CD11c+ 수지상 세포의 생존능이 약 40% 증가하였다. 도 2를 참조한다. 1.25 μM aza 및 200 nM 약물 A 모두와 인큐베이션된 PBMC 배양물에서 CD11c+ 수지상 세포의 생존능은 약물 A 단독으로 인큐베이션된 PBMC 배양물에서의 CD11c+ 수지상 세포의 생존능과 거의 비슷하였다. 도 2를 참조한다. 이러한 결과는 약물 A가 CD11c+ 수지상 세포에 대한 아자시티딘의 효과를 구제함을 나타낸다.
실시예 2C: 인간 급성 골수성 백혈병 세포주에 대한 칼레티쿨린 발현에 대한 아자시티딘 또는 베네토클락스의 효과
이 실시예에서, HL60, OCI-AML3, 및 MV4-11 인간 급성 골수성 백혈병(AML) 세포의 세포 표면에 대한 칼레티쿨린의 발현 수준에 대한 아자시티딘의 효과를 시험관내 검정에서 평가하였다(세부사항은 실시예 1 참조). HL60은 TP53null FLT3wt 세포주이고; OCI-AML3은 TP53wt 및 FLT3wt이며; 및 MV4-11은 TP53wt 및 FLT3-ITD이다.
칼레티쿨린은 소포체(endoplasmic reticulum)에서 발견되는 Ca2+ 결합 및 저장에 관여하는 다기능 단백질이다. 칼레티쿨린은 또한 이전에 급성 골수성 백혈병(AML)에서 기재된 세포-표면 포식-촉진 마커이다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, HL60, OCI-AML3, 및 MV4-11 세포의 표면 상에서 칼레티쿨린의 발현은 아자시티딘의 농도 증가에 따라 증가하였다. 기준선 세포-표면 칼레티쿨린 발현은 배지 단독에서 인큐베이션된 세포에서 나타난다.
2명의 상이한 인간 환자의 MV4-11 및 1차 AML 세포의 세포 표면에 대한 칼레티쿨린의 발현 수준에 대한 아자시티딘 또는 베네토클락스의 효과를 또한 테스트하였다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 아자시티딘 및 베네토클락스 모두 MV411 AML 세포주 및 1차 AML 모세포 모두에서 포식-촉진 신호 칼레티쿨린의 발현을 증가시킨다.
또 다른 검정 세트에서, 2명의 상이한 인간 환자의 MV4-11 및 1차 AML 세포의 세포 표면에 대한 CD47의 발현 수준에 대한 아자시티딘 또는 베네토클락스의 효과를 테스트하였다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, 아자시티딘 및 베네토클락스 모두 MV411 AML 세포주 및 1차 AML 모세포 모두에서 항-포식 신호 CD47의 발현을 증가시킨다.
실시예 2D: 시험관내 AML 세포주 및 1차 AML 모세포의 포식작용에 대한 아자시티딘 또는 베네토클락스와 조합된 약물 A의 효과
AML 세포(인간 공여자의 HL60, OCIAML3, 또는 1차 AML 모세포)를 아자시티딘 또는 베네토클락스와 24-48시간 동안 인큐베이션한 후, 약물 A의 존재 또는 부재 하에 인간 단핵구-유래 대식세포와 2시간 동안 공동-배양하였다. AML 세포의 포식작용은 AML 세포(CFSE +)를 탐식한 대식세포 대 총 대식세포의 수로서 유세포 분석에 의해 결정하였다. 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, 아자시티딘(7a) 또는 베네토클락스(7b)와 조합된 약물 A는 약물 A, 아자시티딘, 또는 베네토클락스를 이용한 단일 제제 처리와 비교하여 인간 대식세포에 의한 AML 세포의 포식 제거를 향상시켰다.
실시예 2E: 백혈병 이종이식 모델에서 아자시티딘과 조합된 약물 A의 항-종양 활성.
이 실시예에서, 아자시티딘(aza)과 조합된 약물 A의 항-종양 활성은 HL60, OCI-AML3 및 MV4-11 인간 백혈병 종양 이종이식편을 보유하는 마우스를 평가하였다. (실험 세부사항은 실시예 1 참조.) HL60은 TP53null FLT3wt 세포주이고; OCI-AML3은 TP53wt 및 FLT3wt이며; 및 MV4-11은 TP53wt 및 FLT3-ITD이다.
HL60 이종이식된 종양을 보유하는 마우스를 각각 4-5마리의 마우스의 4개 그룹으로 무작위 배정하였다. 한 그룹의 마우스에는 (a) 10 mg/kg IP의 약물 A(Q3D, 총 6회 용량), (b) 5 mg/kg IP의 aza(Q3D, 총 5회 용량), (c) 약물 A 및 aza 모두(각각의 단일 제제에 대한 용량 및 투여 일정으로), 또는 (d) 비히클이 제공되었다. OCI-AML3 이종이식편을 보유하는 마우스를 유사하게 무작위 배정하고 처리하였다.
MV4-11 이종이식편을 보유하는 마우스를 각각 9-10마리의 4개 그룹으로 무작위 배정하였다. 한 그룹의 마우스에는 10 mg/kg IP(주당 3회)의 약물 A가 제공되었고, 제2 그룹의 마우스에는 5 mg/kg IP(주당 3회)의 aza가 제공되었으며, 제3 그룹에는 약물 A 및 aza 모두(각각의 단일 제제에 대한 용량 및 투여 일정으로)가 제공되었고, 및 제4 그룹에는 비히클이 제공되었다.
종양 성장 억제(TGI; tumor growth inhibition) %는 하기와 같이 계산하였다: (1 - (처리된 종양의 평균 부피)/(대조군 종양의 평균 부피)) x 100%. 20일차에서, 단일 제제 aza로 처리된 마우스에서 HL60 종양 성장은 최소한으로 억제된 반면(즉, 비히클 대조군이 제공된 마우스와 비교하여), 약물 A를 이용한 처리는 마우스에서 종양 성장의 유의미한 효과를 갖지 않았다(즉, 비히클을 이용한 처리와 비교하여). 도 4a를 참조한다. 약물 A와 조합된 aza를 이용한 처리는 약물 단독보다 마우스에서 HL60 종양 성장을 더 큰 정도로 지연시켰다. 20일차에서, aza 단독으로 처리된 마우스에서 42% TGI가 관찰되었고; 약물 A 단독으로 처리된 마우스에서 10% TGI가 관찰되었으며, 및 aza와 조합된 약물 A로 처리된 마우스에서 67% TGI가 관찰되었다. OCI-AML3 모델에서 약물 A와 조합된 aza를 이용한 처리가 두 약물 단독보다 마우스에서 OCI-AML3 종양 성장을 더 큰 정도로 지연시켰다는 점에서 유사한 결과가 관찰되었다. 도 4b를 참조한다(* p < 0.05, Tukey의 일원배치 분산분석(Ordinary one-way ANOVA)). 20일차에서, aza 단독으로 처리된 마우스에서 33% TGI가 관찰되었고; 약물 A 단독으로 처리된 마우스에서 -3.7% TGI가 관찰되었으며, 및 aza와 조합된 약물 A로 처리된 마우스에서 69% TGI가 관찰되었다.
5 mg/kg의 아자시티딘과 조합된 10 mg/kg의 약물 A의 투여는 각각의 단일 제제 또는 비히클 대조군을 이용한 처리와 비교할 때 MV4-11 이종이식편에서 종양 성장을 근절시켰다. 26일차에서, aza 단독으로 처리된 마우스에서 49% TGI가 관찰되었고, 약물 A 단독으로 처리된 마우스에서 35% TGI가 관찰되었으며, 및 aza와 조합된 약물 A로 처리된 마우스에서 86% TGI가 관찰되었다. 도 4c를 참조한다(*** p = 0.001, 26일차에서의 Tukey의 일원배치 분산분석). 약물 A + aza로 처리된 5/10 마우스는 완전한 종양 근절을 나타냈다. 도 4d를 참조한다.
실시예 2F: 전신성 백혈병 모델에서 아자시티딘과 조합된 약물 A의 항-종양 활성
약물 A 단독 및 아자시티딘과 조합된 이의 항-종양 활성을 파종성(disseminated) HL60-LUC2 급성 골수성 백혈병 모델에서 테스트하였다. 면역결핍 NSG 마우스(7.5E6개 세포/동물)에 정맥내 꼬리 주사로 HL60-LUC2 세포를 이식한 후, 생착(engraftment)을 생물발광 영상화에 의해 확인하고 마우스를 4개 그룹(10마리 마우스/그룹)으로 무작위 배정하였다. 하기 표 A 에 나타낸 바와 같이 처리를 수행하였다.
Figure pct00036
마우스를 3일차부터 생물발광 신호에 대해 주 2회 영상화하였다. 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, 5 mg/kg의 아자시티딘과 조합된 30 mg/kg의 약물 A의 투여는 각각의 단일 제제 또는 비히클 대조군을 이용한 처리와 비교할 때 종양 성장을 제거하였다.
마우스가 14회 용량의 단일 제제 약물 A, 단일 제제 아자시티딘, 또는 아자시티딘과 조합된 약물 A를 투여받을 때까지 처리를 계속하였다. 약물 A 단독요법 및 아자시티딘 단독요법은 중간 정도의 종양 성장 억제를 나타내었지만, 약물 A 단독요법 또는 아자시티딘 단독요법이 제공된 모든 마우스는 처리 85일차 이전에 질환으로 사망하였다(succumbed). 도 5c를 참조한다. 대조적으로, 약물 A와 아자시티딘의 조합은 147일차 연구 종료까지 100% 동물 생존으로 종양 성장을 완전히 제거하였다. 도 5c를 참조한다.
파종성 HL60-LUC2 급성 골수성 백혈병 모델에서 수행된 제2 실험 세트에서, 아자시티딘 및 약물 A 요법은 생착 4일 후에 개시되었고 총 14회 용량에 대해 3일마다 복강내 투여되었다. 하기 표 A2 를 참조한다.
Figure pct00037
약물 A + 아자시티딘을 투여받은 마우스의 절반에서, 약물 A 단독요법을 추가적인 16회 용량 동안 계속하였다. 도 5d에 나타낸 바와 같이, 단일 제제 아자시티딘으로 처리된 모든 마우스는 약 85일차 이전에 질환으로 사망하였다. 14회 용량의 약물 A + 아자시티딘으로 처리된 마우스에서, 종양 억제가 105일차까지 관찰되었다. 대조적으로, 14회 용량의 약물 A + 아자시티딘에 이어 16회의 추가적인 용량의 약물 A 단독요법으로 처리된 4마리 중 3마리의 마우스에서 연구 종료(147일차)까지 종양 억제가 관찰되었다. 도 5d를 참조한다.
실시예 3: 전신성 백혈병 모델에서 베네토클락스와 조합된 약물 A의 항-종양 활성
약물 A 단독 및 베네토클락스와 조합된 이의 항-종양 활성을 실시예 2에 기재된 바와 같이, 파종성 HL60-LUC2 급성 골수성 백혈병 모델에서 테스트하였다. 베네토클락스 및 약물 A 요법은 생착 4일 후에 개시되었으며 총 5회 용량에 대해 3일마다 투여되었다. 하기 표 B 를 참조한다.
Figure pct00038
베네토클락스 단독요법 및 약물 A 단독요법은 각각 중간 정도의 종양 성장 억제를 나타냈지만, 지속적인 반응을 유지하지 못하였다. 베네토클락스 단독요법 또는 약물 A 단독요법이 제공된 모든 마우스는 40일차 이전에 질환으로 사망하였다. 도 8을 참조한다. 대조적으로, 종양 성장은 80일 평가 기간 내에 약물 A와 조합된 베네토클락스로 처리된 8마리 중 6마리의 마우스에서 완전히 제거되었다.
실시예 4: 전신성 백혈병 모델에서 아자시티딘 및 베네토클락스와 조합된 약물 A의 항-종양 활성
이종이식된 인간 HL-60Luc2 백혈병 종양을 보유하는 마우스에서 종양 성장 억제에 대한 아자시티딘 및 베네토클락스와 조합된 약물 A의 효과. 6주령의 암컷 NODSCID(Charles River) 마우스를 이종이식 실험에 사용하였다. HL-60Luc2 세포(마우스당 10×106개 세포)를 각각의 마우스의 꼬리 정맥에 정맥 주사하였다. 접종 후 4일차부터 IVIS Caliper(Perkin Elmer)를 사용하여 종양 진행을 모니터링하였다. 백혈병 부하(leukemia burden)가 약 1 × 106 광자/초에 도달했을 때, 마우스를 무작위로 그룹화하고 (a) PBS(대조군), (b) 아자시티딘, (c) 베네토클락스, (d) 약물 A, (e) 아자시티딘 + 베네토클락스, 또는 (f) 아자시티딘 + 베네토클락스 + 약물 A로 복강내 투여하였다. 아자시티딘은 총 5회 용량에 대해 3일마다 5 mg/kg의 용량으로 복강내 투여되었고; 약물 A는 총 5회 용량에 대해 3일마다 30 mg/kg의 용량으로 복강내 투여되었으며; 및 베네토클락스는 14일 동안 매일 경구 위관영양법으로 100 mg/kg의 용량으로 투여되었다. 치료 시작 후 3-4일마다, 마우스에 D-루시페린(Regis)을 주사하고, 소동물 생체내 영상화 시스템(IVIS; in vivo imaging system)을 사용하여 종양 생물발광을 측정하고 기록하였다. 관심 영역을 IVIS 소프트웨어(Caliper Life Sciences)를 통해 전체 마우스에 대해 게이팅하였고 방사휘도(광자/s/cm2/스테라디안)로 정의되는, 면적 플럭스(area flux)(광자/초)로 기록하였다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, 약물 A는 베네토클락스 및 아자시티딘과 조합되어 약물 A 단독, 아자시티딘 단독, 베네토클락스 단독, 또는 베네토클락스와 조합된 아자시티딘보다 더 큰 정도로 종양 성장을 억제하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 베네토클락스 및 아자시티딘과 조합된 약물 A로 처리된 마우스는 아자시티딘 단독, 베네토클락스 단독, 또는 베네토클락스와 조합된 아자시티딘으로 처리된 마우스보다 증가된 생존을 나타냈다. 베네토클락스 및 아자시티딘과 조합된 약물 A는 80일 평가 기간 내에 9마리 중 7마리의 마우스에서 종양 성장을 완전히 제거하였다. 도 6b를 참조한다.
실시예 5: 약물 A는 다발성 급성 골수성 백혈병 요법에 대한 반응의 정도 및 지속성을 향상시킴
급성 골수성 백혈병(AML)은 대부분의 환자에서 표준 요법 후에도 재발하는 공격적인 혈액학적 악성 종양이다. 최근 치료의 발전에도 불구하고, 효과적인 신규 치료의 개발은 충족되지 않은 요구로 남아 있다.
CD47은 숙주 면역 반응을 회피하기 위해 종양 세포에 의해 상향조절되는 골수성 체크포인트이며, 이의 차단은 항-종양 면역을 향상시킨다(Weiskopf (2017) Eur J Cancer, 76:100-109). 약물 A는 비활성 인간 면역글로불린 Fc 영역에 연결된 고친화도 CD47 차단제로 구성된 조작된 융합 단백질이다. 전임상 연구에서, 약물 A는 대식세포 포식작용, 수지상 세포 활성화 및 종양-연관 대식세포의 염증성 표현형으로의 이동을 촉진함으로써 선천 면역과 적응 면역을 연결하여 다양한 항암 치료제와 조합될 때 항-종양 활성 증가로 이어진다(Kauder 등 (2018) PLoS ONE 13(8): e0201832). 약물 A는 이전에 고형 종양을 갖는 환자뿐만 아니라 혈액학적 악성 종양을 갖는 환자에서 내약성이 우수한 것으로 나타났다. 약물 A를 항암 치료제와 조합하여 항-종양 반응을 촉진하는 것이 보고되었다(Kim 등 Abstract #EP1247, poster presented at the 25th Congress of the European Hematology Association (EHA) 2020 및 Chow 등 Abstract #3056, poster presented at 2020 American Society of Clinical Oncology Virtual Scientific Program). 최근, AML을 갖는 환자에서 아자시티딘과 BCL2 억제제인 베네토클락스의 조합이 아자시티딘 단독과 비교하여 증가된 효능을 나타냈다(DiNardo 등 (2019) Blood, 133 (1): 7-17. 아자시티딘 또는 베네토클락스를 이용한 시험관내 치료는 백혈병 악성 종양에서, CD47 및 포식-촉진 마커인 칼레티쿨린 모두의 세포 표면 발현을 증가시켰다.
약물 A를 아자시티딘 또는 베네토클락스와 조합하면 AML에 대한 치료적 효능이 향상될 것이라는 가설을 테스트하기 위해 실험을 수행하였다. 약물 A를 이용한 시험관내 처리는 단독 처리와 비교하여, TP53 및 FLT3 돌연변이를 보유하는 것들을 포함하는, 아자시티딘 또는 베네토클락스로 처리된 다수의 AML 세포주에서 인간 단핵구-유래 대식세포에 의한 포식 탐식 향상으로 이어졌다. 실시예 2B-2C 를 참조한다. 시험관내 결과는 여러 쥐과 AML 이종이식 모델에서 향상된 생체내 항백혈병 활성과 상관관계가 있었다. 실시예 2C-2D 를 참조한다. 마우스에 AML 세포를 꼬리 정맥을 통해 접종하거나 피하 이식하고, 종양이 기하급수적으로 성장했을 때, 마우스를 무작위 배정하여 비히클 대조군, 아자시티딘, 베네토클락스, 약물 A 단독 또는 화학요법제와 조합된 약물 A를 투여받도록 하였다. 약물 A 조합 요법을 투여받은 코호트는 종양 근절의 증거와 함께 종양 진행의 상당히 더 큰 억제를 나타내어 어떤 단일 제제 요법보다 현저하게 향상된 생존으로 이어졌다.
실시예 6: 고위험 골수이형성 증후군(MDS)을 갖는 인간 환자에서 아자시티딘과 조합된 약물 A의 안전성, 내약성, 및 효능을 평가하기 위한 예시적인 임상 시험
고위험 골수이형성 증후군(MDS)을 갖는 환자에서 약물 A와 아자시티딘(aza) 조합의 안전성, 내약성, 및 효능을 평가하기 위해 1/2상 임상 시험을 수행한다. 1상은 표준 용량 aza와 조합된 약물 A의 용량 증량을 포함하여 안전성을 평가하고 2상 권장 용량을 확인하며, 2상은 고위험 MDS를 갖는 환자에서 약물 A + aza 조합의 효능을 평가한다.
약 63명의 환자가 등록되어 있다. 예시적인 포함 기준은 하기이다: (a) 1상: 이전에 치료되지 않았거나 재발성/불응성인 고위험 MDS의 진단; 2상: 이전에 치료되지 않은 고위험 MDS의 진단; (b) 적절한 신장 및 간 기능; (c) 18세 이상; 및 (d) 적절한 수행 상태(예를 들어, 동부 종양학 협력 그룹(Eastern Cooperative Oncology Group; ECOG) 척도에 따라, ecog-acrin(dot)org/resources/ecog-performance-status 참조). 예시적인 배제 기준은 하기이다: (a) MDS 또는 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 이전의 동종이계 조혈모 세포 이식(allo-HSCT); (b) 항-CD47 또는 항-SIRPα 제제를 이용한 사전 치료; (c) B형 및 C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 관련 질병, 또는 SARS-CoV-2를 포함하는, 공지된 활성 바이러스 감염.
1상에서, 약물 A는 aza와 조합되어, 60 mg/kg 이하, 예를 들어, 4주마다 1회(Q4W) 60 mg/kg으로 투여된다. Aza는 각 28일 주기의 7일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 정맥내 또는 피하 투여되거나(전형적으로 "7-0 레지멘"으로 지칭됨) 또는 각 28일 주기에서 5일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 투여되고, 이어서 2일 동안 치료가 없으며(즉, 아자시티딘 투여가 없음), 및 이후 2일 동안 매일 75 mg/m2가 투여된다(전형적으로 "5-2-2 레지멘"으로 지칭됨). 2상의 경우, 약물 A는 aza와 조합되어 2상 권장 용량으로 투여된다(각 28일 주기의 처음 7일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 정맥내 또는 피하 투여됨).
1상에 대한 1차 결과 측정은 용량 제한 독성(DLT; dose limiting toxicity)을 갖는 연구 참가자의 수이다. 2상에 대한 1차 결과 측정은 객관적 반응률(ORR; objective response rate)이며, 이는 국제 실무 그룹(International Working Group; IWG) 기준에 따른 반응(예를 들어, 완전 반응 "CR; complete response) 또는 부분 반응 "PR; partial response)을 달성한 연구 참가자의 수이다. (예를 들어, Cheson 등 Blood. 2000; 96: 3671 3674 및 Cheson 등 Blood. 2006; 108: 419-425 참조).
실시예 7: 급성 골수성 백혈병(AML)을 갖는 인간 환자에서 베네토클락스 및 아자시티딘과 조합된 약물 A의 안전성, 내약성, 및 효능을 평가하기 위한 예시적인 임상 시험 .
급성 골수성 백혈병(AML)을 갖는 환자에서 약물 A, 베네토클락스 및 아자시티딘(Aza) 조합의 안전성, 내약성, 및 효능을 평가하기 위해 1/2상 임상 시험을 수행한다. 1a상에서, 참가자는 베네토클락스 및 아자시티딘과 조합된 약물 A의 용량 증량을 투여받는다. 1상의 1차 결과 측정은 용량-제한 독성을 경험하는 참가자의 수이다. 1b/2상에서, 참가자는 베네토클락스 및 아자시티딘과 조합되어 권장 2상 용량으로 약물 A를 투여받는다. 1b/2상의 1차 결과 측정은 유럽 백혈병 네트(European Leukemia Net; ELN) 2017 기준에 따라 완전 관해(CR; complete remission) 및 불완전한 혈액학적 회복을 동반한 완전 관해(CRi; complete remission with incomplete hematologic recovery)를 달성한 참가자의 수이다. 이러한 연구는 조합의 안전성 및 효능, 및 권장 용량을 확인한다.
예시적인 포함 기준은 하기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: (a) WHO 2016 분류에 따라 재발성/불응성 또는 신규하게 진단된 AML의 세포학적 또는 조직학적으로 확인된 진단; (b) 1a상의 경우: 재발성/불응성이거나 집중 유도 요법에 적합하지 않은 것으로 간주되는 환자에서 이전에 치료되지 않은 AML; (c) 1b상의 경우: HMA-기반 레지멘을 이용한 사전 치료 후 재발성/불응성인 AML; (d) 2상의 경우: 집중 유도 요법에 적합한 후보로 간주되지 않는 환자에서 이전에 치료되지 않은 AML; (e) 적절한 신장 및 간 기능; (f) 18세 이상; 및 (g) 적절한 수행 상태.
예시적인 배제 기준은 하기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: (a) 1a상 및 1b상의 경우, 사전 동종이계-HSCT를 받은 환자는 제어되지 않는 이식편대숙주 질환(GVHD) 없이, HCST 적어도 3개월 후이어야 함; (b) 2상의 경우, 사전 동종이계-HSCT를 받은 환자는 배제됨; (c) AML에 대한 2019년 NCCN 가이드라인 버전 3에 따라 t(8;21), inv(16), 또는 t(16;16)와 같은 유리한 위험 세포유전학을 갖는 신규하게 진단된 AML을 갖는 환자; (d) 급성 전골수구성 백혈병(APL)을 갖는 환자; (e) 임의의 항-CD47 또는 항-SIRPα(신호 조절 단백질 알파) 제제를 이용한 사전 치료; (f) B형 및 C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 관련 질병, 또는 sars-cov-2(중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2)를 포함하는, 공지된 활성 바이러스 감염.
선행하는 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 나타내고 기재된 것 외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백할 것이며 첨부된 청구범위의 범위 내에 속할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> ALX ONCOLOGY INC. <120> COMBINATION THERAPIES COMPRISING A HYPOMETHYLATION AGENT FOR TREATING CANCER <130> 75797-20012.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/145,925 <151> 2021-02-04 <150> US 63/114,959 <151> 2020-11-17 <150> US 63/109,083 <151> 2020-11-03 <150> US 63/106,285 <151> 2020-10-27 <150> US 63/033,074 <151> 2020-06-01 <160> 222 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <400> 6 000 <210> 7 <400> 7 000 <210> 8 <400> 8 000 <210> 9 <400> 9 000 <210> 10 <400> 10 000 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = E or G <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = S or F <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = L or S <220> <221> VARIANT <222> 20 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<222> 94 <223> Xaa = F, L, or V <220> <221> VARIANT <222> 104 <223> Xaa = F or V <400> 13 Glu Glu Glu Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Xaa Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Xaa Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = L, I, or V <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V, L, or I <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa = A or V <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = V, I, or L <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I, T, S, or F <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = E, V, or L <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = E or Q <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H, P, or R <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = S, T, or G <220> <221> VARIANT <222> 68 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V or I <220> <221> VARIANT <222> 94 <223> Xaa = F, L, or V <220> <221> VARIANT <222> 103 <223> Xaa = F or V <400> 14 Glu Glu Glu Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Xaa Ile Leu His Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Xaa Thr Xaa Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <400> 16 000 <210> 17 <400> 17 000 <210> 18 <400> 18 000 <210> 19 <400> 19 000 <210> 20 <400> 20 000 <210> 21 <400> 21 000 <210> 22 <400> 22 000 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = E or G <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = L, I, or V <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V, L, or I <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = S or F <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = L or S <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = S or T <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa = A or V <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa = I or T <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = H or R <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A, V, I, or L <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I, T, S, or F <220> <221> VARIANT <222> 45 <223> Xaa = A or G <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = E, V, or L <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = E or Q <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H, P, or R <220> <221> VARIANT <222> 65 <223> Xaa = D or E <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = S, L, T, or G <220> <221> VARIANT <222> 68 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 70 <223> Xaa = E or D <220> <221> VARIANT <222> 75 <223> Xaa = S or P <220> <221> VARIANT <222> 77 <223> Xaa = S or R <220> <221> VARIANT <222> 79 <223> Xaa = S or G <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V or I <220> <221> VARIANT <222> 94 <223> Xaa = F, L, or V <220> <221> VARIANT <222> 101 <223> Xaa = D or absent <220> <221> VARIANT <222> 102 <223> Xaa = T or V <220> <221> VARIANT <222> 104 <223> Xaa = F or V <220> <221> VARIANT <222> 116 <223> Xaa = A or G <400> 23 Glu Glu Xaa Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Xaa Val Xaa Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Xaa Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Xaa Xaa Thr Xaa Arg Xaa Asn Met Asp Phe Xaa Ile Xaa Ile Xaa Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Xaa Xaa Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Xaa Lys Pro Ser 115 <210> 24 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Thr 1 5 10 15 Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr 20 25 30 Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn 35 40 45 Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala 50 55 60 Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser Gln Val Ile Cys Glu 65 70 75 80 Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn 85 90 95 Leu Ser Glu Thr Ile Arg 100 <210> 25 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Val Pro Pro Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn 1 5 10 15 Gln Val 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<220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Glu Glu Glu Ile Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Val Ile Ile His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Arg Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Gly Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Val Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Val Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Glu Glu Glu Val Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ile Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Arg Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Gly Thr Arg Arg Glu 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VARIANT <222> 66 <223> Xaa = L, T, or G <220> <221> VARIANT <222> 68 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, or Y <220> <221> VARIANT <222> 83 <223> Xaa = P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, or Y <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V or I <220> <221> VARIANT <222> 94 <223> Xaa = F, L, or V <220> <221> VARIANT <222> 104 <223> Xaa = F or V <400> 37 Glu Glu Glu Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Xaa Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Xaa Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 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V <400> 38 Glu Glu Glu Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Xaa Ile Leu His Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Xaa Thr Xaa Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 39 <400> 39 000 <210> 40 <400> 40 000 <210> 41 <400> 41 000 <210> 42 <400> 42 000 <210> 43 <400> 43 000 <210> 44 <400> 44 000 <210> 45 <400> 45 000 <210> 46 <400> 46 000 <210> 47 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = E or G <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = L, I, or V <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V, L, or I <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = S or F <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = L or S <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = S or T <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa = A or V <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa = I or T <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = H, R, or L <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A, V, I, or L <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I, T, S, or F <220> <221> VARIANT <222> 45 <223> Xaa = A or G <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = E, V, or L <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = E or Q <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H, P, or R <220> <221> VARIANT <222> 65 <223> Xaa = D or E <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = S, L, T, or G <220> <221> VARIANT <222> 68 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 70 <223> Xaa = E or N <220> <221> VARIANT <222> 75 <223> Xaa = S or P <220> <221> VARIANT <222> 77 <223> Xaa = S or R <220> <221> VARIANT <222> 79 <223> Xaa = S or G <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <221> VARIANT <222> 83 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V or I <220> <221> VARIANT <222> 94 <223> Xaa = F, L, or V <220> <221> VARIANT <222> 101 <223> Xaa = D or absent <220> <221> VARIANT <222> 102 <223> Xaa = T or V <220> <221> VARIANT <222> 104 <223> Xaa = F or V <220> <221> VARIANT <222> 116 <223> Xaa = A or G <400> 47 Glu Glu Xaa Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Xaa Val Xaa Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Xaa Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Xaa Xaa Thr Xaa Arg Xaa Asn Met Asp Phe Xaa Ile Xaa Ile Xaa Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Xaa Xaa Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Xaa Lys Pro Ser 115 <210> 48 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V or I <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = L or S <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = T or S <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa = T or I <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = R or H <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A, V, or I <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I, R, Y, K, or F <220> <221> VARIANT <222> 45 <223> Xaa = G or A <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = E or V <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = E, D, or Q <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H or P <220> <221> VARIANT <222> 65 <223> Xaa = D or E <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = S, L, or T <220> <221> VARIANT <222> 70 <223> Xaa = N or E <220> <221> VARIANT <222> 77 <223> Xaa = R or S <220> <221> VARIANT <222> 79 <223> Xaa = G or S <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = N or A <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V or I <220> <221> VARIANT <222> 98 <223> Xaa = S, I , or M <220> <221> VARIANT <222> 99 <223> Xaa = P or absent <220> <221> VARIANT <222> 100 <223> Xaa = D or P <220> <221> VARIANT <222> 102 <223> Xaa = V or T <400> 48 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Xaa Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Xaa Ala Xaa Leu Xaa Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Xaa Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Xaa Xaa Thr Lys Arg Xaa Asn Met Asp Phe Ser Ile Xaa Ile Xaa Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 49 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V, I, or L <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A, I, V, or L <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I, F, S, or T <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = E, V, or L <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = E or Q <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H, P, or R <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = L, T, S, or G <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = A <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V or I <400> 49 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 50 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V or I <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = V or I <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I or F <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = E or V <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = E or Q <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H or P <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = S or T <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = N or A <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V or I <400> 50 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Xaa Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 51 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V or I <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A or I <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I or F <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = E or V <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H or P <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = L or T <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = N or A <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V or I <400> 51 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Glu Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 52 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V, L, or I <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A, I, or L <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I, T, S, or F <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H, P, or R <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = L, T, or G <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = N or A <400> 52 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Glu Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 53 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 53 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 54 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 55 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 56 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 56 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 57 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 57 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 58 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 59 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 59 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 60 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 60 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp 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Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 211 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 211 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Arg Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Asp Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ile Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 115 120 125 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 130 135 140 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 145 150 155 160 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 165 170 175 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 180 185 190 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 195 200 205 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 210 215 220 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 225 230 235 240 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 245 250 255 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 260 265 270 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 275 280 285 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 290 295 300 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 305 310 315 320 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 325 330 335 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 340 345 <210> 212 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V, L, or I <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = V, I, or L <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I, T, S, or F <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H, P, or R <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = S, T, or G <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = N or A <400> 212 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Glu Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Xaa Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 213 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 213 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Val Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 214 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 214 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Cys Pro 115 120 125 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 145 150 155 160 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 165 170 175 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 180 185 190 Glu Glu Gln Phe Ala Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 195 200 205 Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 210 215 220 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 225 230 235 240 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 245 250 255 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 260 265 270 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 275 280 285 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 290 295 300 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 305 310 315 320 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 325 330 335 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 340 345 <210> 215 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Any Amino Acid except P <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Any Amino Acid except T, S, or C <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Any Amino Acid except P <400> 215 Asn Xaa Xaa Xaa 1 <210> 216 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 216 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 115 120 125 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 130 135 140 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 145 150 155 160 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 165 170 175 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 180 185 190 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 195 200 205 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 210 215 220 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 225 230 235 240 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 245 250 255 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 260 265 270 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 275 280 285 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 290 295 300 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 305 310 315 320 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 325 330 335 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 <210> 217 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 217 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Lys Thr His Thr Cys Pro Glu Cys 115 120 125 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 130 135 140 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 145 150 155 160 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 165 170 175 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 180 185 190 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 195 200 205 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 210 215 220 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 225 230 235 240 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 245 250 255 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr 260 265 270 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 275 280 285 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 290 295 300 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 305 310 315 320 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 325 330 335 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 <210> 218 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V, L, or I <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A, V, L, or I <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I, S, T, or F <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = E, L, or V <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = E or Q <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H, R, or P <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = S, G, L, or T <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <221> VARIANT <222> 81 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <221> VARIANT <222> 82 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <221> VARIANT <222> 83 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V or I <400> 218 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 219 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V, L, or I <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A, V, L, or I <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I, S, T, or F <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = E, L, or V <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = E or Q <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H, R, or P <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = S, G, L, or T <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = N <220> <221> VARIANT <222> 83 <223> Xaa = Any Amino Acid except P <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V or I <400> 219 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 220 <400> 220 000 <210> 221 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V or I <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A or I <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I or F <220> <221> VARIANT <222> 47 <223> Xaa = E or V <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H or P <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = L or T <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = Any Amino Acid except N <220> <221> VARIANT <222> 92 <223> Xaa = V or I <400> 221 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Glu Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 222 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = V, L, or I <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = A, I, or L <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa = I, T, S, or F <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Xaa = K or R <220> <221> VARIANT <222> 56 <223> Xaa = H or P <220> <221> VARIANT <222> 66 <223> Xaa = L, T, or G <220> <221> VARIANT <222> 80 <223> Xaa = N or A <400> 222 Glu Glu Glu Leu Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Glu Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115

Claims (58)

  1. (a) SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 (b) 저메틸화제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법으로서;
    여기서 상기 융합 폴리펩티드의 상기 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 상기 Fc-도메인 변이체의 N-말단에 연결되는 것인, 방법.
  2. (a) SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드, (b) 저메틸화제, 및 (c) Bcl-2 억제제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법으로서;
    상기 융합 폴리펩티드의 상기 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 상기 Fc-도메인 변이체의 N-말단에 연결되는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드의 상기 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 융합 폴리펩티드의 상기 Fc 도메인 변이체는 하기인, 방법:
    (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임;
    (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임;
    (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는
    (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 암은 골수이형성 증후군(MDS)인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 MDS는 고위험 MDS인, 방법.
  6. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 MDS에 대한 사전 요법을 받은 것인, 방법.
  7. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 MDS에 대한 사전 요법을 받지 않은 것인, 방법.
  8. 제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 유도 단계 및 유지 단계를 포함하며, 여기서 상기 유도 단계는 (a) SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 상기 융합 폴리펩티드, 및 (b) 상기 저메틸화제를 투여하는 것을 포함하고, 상기 유지 단계는 상기 저메틸화제 없이 SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 상기 융합 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병(AML)인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 개체는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 것인, 방법:
    (a) 재발성/불응성 또는 신규하게 진단된 AML의 세포학적 또는 조직학적으로 확인된 진단;
    (b) 재발성/불응성이거나 또는 이전에 치료되지 않았고 집중 유도 요법에 적합하지 않은 것으로 간주되는 AML;
    (c) HMA-기반 레지멘을 이용한 사전 치료 후 재발성/불응성인 AML;
    (d) 이전에 치료되지 않은 AML 및 집중 유도 요법에 적합한 후보로 간주되지 않음; 및
    (e) 적절한 신장 및 간 기능.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저메틸화제는 아자시티딘, 데시타빈, 5-플루오로-2'-데옥시시티딘, 제불라린, CP-4200, RG108, 나나오마이신 A, 구아데시타빈, RX-3117, EPI01, 안트로퀴노놀, CC-486, 또는 ASTX727인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 저메틸화제는 아자시티딘인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 아자시티딘은 1회 이상의 28일 주기로 상기 개체에게 투여되고, 및 상기 아자시티딘은 28일 주기마다 7일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 상기 개체에게 투여되는 것인, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 아자시티딘은 1회 이상의 28일 주기로 투여되고, 및 상기 아자시티딘은 각 28일 주기 중 5일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 상기 개체에게 투여되고, 이어서 2일 동안 아자시티딘이 투여되지 않으며, 및 이후 추가적인 2일 동안 75 mg/m2의 용량으로 상기 개체에게 투여되는 것인, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아자시티딘은 정맥내 또는 피하 투여되는 것인, 방법.
  16. 제2항 내지 제3항 및 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Bcl-2 억제제는 베네토클락스, ABT-737, 나비토클락스, BCL201, 또는 AZD-0466인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 Bcl-2 억제제는 베네토클락스인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 베네토클락스는 1일차에 100 mg의 용량으로, 2일차에 200 mg의 용량으로, 및 2일차 이후 매일 400 mg의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 베네토클락스는 1일차에 100 mg의 용량으로, 2일차에 200 mg의 용량으로, 및 3일차에 400 mg의 용량으로, 및 3일차 이후 매일 600 mg의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베네토클락스는 경구 투여되는 것인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 약 60 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 4주마다 1회(q4w) 약 60 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  23. SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서 상기 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 상기 Fc 도메인 변이체의 N-말단에 융합되고
    상기 융합 폴리펩티드는 약 60 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 약 60 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 4주마다 1회(q4w) 약 60 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 약 45 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 3주마다 1회(q3w) 약 45 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인, 방법.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드의 상기 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 융합 폴리펩티드의 상기 Fc 도메인 변이체는 하기인, 방법:
    (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임;
    (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임;
    (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는
    (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 혈액암인, 방법.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 고형 종양인, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인 변이체는 L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이고, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 Fc 도메인 변이체는 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  35. 제1항 내지 제31항 및 제33항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  36. 제1항 내지 제30항 및 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 동종이량체를 형성하는 것인, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 정맥내 투여되는 것인, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 인간인, 방법.
  40. 암 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하기 위해 아자시티딘과 조합하여 사용하기 위한, 약제학적으로 허용가능한 담체에 융합 폴리펩티드를 포함하는 키트로서,
    여기서 상기 융합 폴리펩티드는 SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하고, 상기 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 상기 Fc 도메인 변이체의 N-말단에 융합되며,
    상기 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 Fc 도메인 변이체는 하기이며:
    (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임;
    (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임;
    (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는
    (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임;
    상기 개체는 인간인, 키트.
  41. 제40항에 있어서, 상기 암은 골수이형성 증후군(MDS)인, 키트.
  42. 제41항에 있어서, 상기 MDS는 고위험 MDS인, 키트.
  43. 암 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하기 위해 아자시티딘 및 베네토클락스와 조합하여 사용하기 위한, 약제학적으로 허용가능한 담체에 융합 폴리펩티드를 포함하는 키트로서,
    여기서 상기 융합 폴리펩티드는 SIRPα D1 도메인 변이체 및 Fc 도메인 변이체를 포함하고, 상기 SIRPα D1 도메인 변이체의 C-말단은 상기 Fc 도메인 변이체의 N-말단에 융합되며,
    상기 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 Fc 도메인 변이체는 하기이며:
    (i) L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임;
    (ii) A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임;
    (iii) S228P, E233P, F234V, L235A, 및 delG236 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임; 또는
    (iv) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것임;
    상기 개체는 인간인, 키트.
  44. 제43항에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병(AML)인, 키트.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 아자시티딘을 1회 이상의 28일 주기로 IV 주입에 의해 또는 피하 투여하기 위한 지침을 추가로 포함하며, 여기서 상기 아자시티딘은 각 28일 주기의 7일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 상기 개체에게 투여되는 것인, 키트.
  46. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 아자시티딘을 1회 이상의 28일 주기로 IV 주입에 의해 또는 피하 투여하기 위한 지침을 추가로 포함하며, 여기서 상기 아자시티딘은 각 28일 주기 중 5일 동안 매일 75 mg/m2의 용량으로 상기 개체에게 투여되고, 이어서 2일 동안 아자시티딘이 투여되지 않으며, 및 이후 추가적인 2일 동안 75 mg/m2의 용량으로 상기 개체에게 투여되는 것인, 키트.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 베네토클락스를 1일차에 100 mg, 2일차에 200 mg, 및 2일차 이후 매일 400 mg의 용량으로 경구 투여하기 위한 지침을 추가로 포함하는 것인, 키트.
  48. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 베네토클락스를 1일차에 100 mg, 2일차에 200 mg, 및 3일차에 400 mg, 및 3일차 이후 매일 600 mg의 용량으로 경구 투여하기 위한 지침을 추가로 포함하는 것인, 키트.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키트.
  50. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SIRPα D1 도메인 변이체는 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키트.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인 변이체는 L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이고, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 지수에 따른 것인, 키트.
  52. 제51항에 있어서, 상기 Fc 도메인 변이체는 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키트.
  53. 제40항 내지 제49항 및 제51항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키트.
  54. 제40항 내지 제48항 및 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키트.
  55. 제40항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 동종이량체를 형성하는 것인, 키트.
  56. 제40항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드를 60 mg/kg 이하의 용량으로 상기 개체에게 투여하기 위한 지침을 추가로 포함하는 것인, 키트.
  57. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드를 4주마다 1회(q4w) 60 mg/kg의 용량으로 상기 개체에게 투여하기 위한 지침을 추가로 포함하는 것인, 키트.
  58. 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드를 IV 주입에 의해 투여하기 위한 지침을 추가로 포함하는 것인, 키트.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2740672C2 (ru) 2015-08-07 2021-01-19 ЭйЭлЭкс Онколоджи Инк. Конструкции, имеющие sirp-альфа домен или его вариант
WO2020243338A1 (en) * 2019-05-31 2020-12-03 ALX Oncology Inc. Methods of treating cancer with sirp alpha fc fusion in combination with an immune checkpoint inhibitor

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE050875T2 (hu) 2012-01-17 2021-01-28 Univ Leland Stanford Junior Nagy affinitású SIRP-alfa reagensek
WO2014094122A1 (en) 2012-12-17 2014-06-26 Trillium Therapeutics Inc. Treatment of cd47+ disease cells with sirp alpha-fc fusions
CN106535914B (zh) 2014-08-08 2021-08-27 Alx 肿瘤生物技术公司 SIRP-α变体构建体及其用途
EP3012271A1 (en) 2014-10-24 2016-04-27 Effimune Method and compositions for inducing differentiation of myeloid derived suppressor cell to treat cancer and infectious diseases
CN106146670B (zh) 2015-04-24 2019-01-15 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司 一种新的重组双功能融合蛋白及其制备和应用
CN107849143B (zh) 2015-05-18 2021-12-10 起源生物医药公司 Sirp多肽组合物和使用方法
RU2740672C2 (ru) 2015-08-07 2021-01-19 ЭйЭлЭкс Онколоджи Инк. Конструкции, имеющие sirp-альфа домен или его вариант
EP4186927A1 (en) 2015-10-21 2023-05-31 Ose Immunotherapeutics Methods and compositions for modifying macrophage polarization into pro-inflammatory cells to treat cancer
WO2017178653A2 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Ose Immunotherapeutics NEW ANTI-SIRPa ANTIBODIES AND THEIR THERAPEUTIC APPLICATIONS
CA3020026A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Trillium Therapeutics Inc. Macrophage stimulation in cd47 blockade therapy
US10611842B2 (en) 2016-08-03 2020-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Disrupting FC receptor engagement on macrophages enhances efficacy of anti-SIRPα antibody therapy
JOP20190009A1 (ar) 2016-09-21 2019-01-27 Alx Oncology Inc أجسام مضادة ضد بروتين ألفا منظم للإشارات وطرق استخدامها
EP3534964A4 (en) 2016-11-03 2020-07-15 Trillium Therapeutics Inc. IMPROVEMENT OF CD47 BLOCKING THERAPY BY PROTEASOME INHIBITORS
EP3534965A4 (en) 2016-11-03 2020-06-24 Trillium Therapeutics Inc. IMPROVEMENTS IN CD47 BLOCKADERAPY THROUGH HDAC INHIBITORS
CA3044684A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Alector Llc Anti-sirp-alpha antibodies and methods of use thereof
BR112019016356A2 (pt) 2017-02-17 2020-04-07 Ose Immunotherapeutics anticorpo anti-sirpg humano ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou mimético de anticorpo de ligação de antígeno, produto de combinação, método in vitro ou ex vivo, uso de pelo menos um anticorpo anti-sirpg de humano ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou mimético de anticorpo de ligação ao antígeno, e, método in vitro de prever a resposta de um sujeito a um tratamento
EP3600424A4 (en) 2017-03-28 2020-12-23 Trillium Therapeutics Inc. CD47 BLOCKED THERAPY
US10851164B2 (en) 2017-04-13 2020-12-01 Aduro Biotech Holdings, Europe B.V. Anti-SIRPα antibodies
WO2018210793A2 (en) 2017-05-16 2018-11-22 Synthon Biopharmaceuticals B.V. ANTI-SIRPα ANTIBODIES
SG11202000658PA (en) 2017-07-26 2020-02-27 Forty Seven Inc Anti-sirp-alpha antibodies and related methods
JP2021534769A (ja) * 2018-08-31 2021-12-16 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド デコイポリペプチド
AU2020365113A1 (en) * 2019-10-18 2022-04-07 Forty Seven, Inc. Combination therapies for treating myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia

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