CN116323665A - 抗cd200r1抗体及其使用方法 - Google Patents

抗cd200r1抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了结合蛋白，如抗体和抗原结合片段，其特异性结合至人CD200R1受体蛋白(hu‑CD200R1)并且能够降低、抑制和/或完全阻断由hu‑CD200R1介导的免疫调节作用。本公开还提供了使用抗体(及其组合物)来治疗对降低、抑制和/或阻断由CD200与CD200R1结合介导的免疫调节功能或活性有应答的疾病和病状的方法。

Description

抗CD200R1抗体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月29日提交的美国临时申请第63/032,508号的优先权权益，该申请据此通过引用并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及与CD200R1受体蛋白结合的结合蛋白(如抗体和抗原结合片段)，以及使用此类结合蛋白的方法。
序列表引用
序列表的正式副本与说明书同时经由EFS-Web以ASCII格式的文本文件提交，文件名为“09402-007PV1_SeqList_ST25.txt”，创建日期为2020年5月29日，并且大小为85,869字节。经由EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文中。
背景技术
细胞表面跨膜糖蛋白CD200受体1(本文被称为“CD200R1”，并且在本领域中也被称为CD200受体1、CD200R、HCRTR2、OX2R和MOX2R)是在骨髓细胞和CD4+T细胞的表面上表达的人类蛋白。CD200R1是含有两个免疫球蛋白样结构域的细胞表面糖蛋白。CD200R及其结合配偶体CD200都是高度保守的I型配对膜糖蛋白，由两个属于Ig蛋白超家族的免疫球蛋白(Ig)样结构域(V和C)组成。CD200R主要在T细胞和髓系细胞的亚群上表达。然而，CD200在多种人类细胞(包含神经元、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和淋巴样细胞)上更广泛地表达。CD200R1用于调节促炎分子，如肿瘤坏死因子(TNF-α)和干扰素的表达。已经发现CD200R与其配体CD200的结合发出免疫抑制活性的信号，包含抑制T细胞免疫应答和自然杀伤(NK)细胞细胞毒性活性，促进巨噬细胞分泌吲哚胺-2,3双加氧酶(IDO)，以及触发调节性T细胞(Treg)扩增(参见，例如，Gorczynski，“CD 200:CD 200R介导的免疫调节(CD200:CD200R-mediated regulation of immunity)”，《ISRN免疫学(ISRN Immunol.)》，2012；2012)。CD200被理解为对树突细胞和淋巴样效应细胞具有免疫检查点功能，调节活化炎性免疫应答，并有助于维持自身耐受(参见例如Rygiel TP，Meyaard L.“肿瘤耐受和炎症中的CD200R信号传导：棘手的平衡(CD200R signaling in tumor tolerance and inflammation:atricky balance)”，《免疫学的当前观点(Curr Opin Immunol.)》，2012；24(2):233-8)。CD200在多种实体和血液肿瘤细胞类型中过表达，包含慢性淋巴细胞白血病(CLL)多发性骨髓瘤(MM)、急性髓细胞白血病(AML)和其他(参见例如McWhirter等人，“选自组合文库的抗体阻断了在免疫调节中起关键作用的肿瘤抗原(Antibodies selected fromcombinatorial libraries block a tumor antigen that plays a key role inimmunomodulation)”，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A.)》，2006；103(4):1041-6)。发现与侵袭性肿瘤进展相关的降低的抗肿瘤细胞毒性T细胞(CTL)应答以及降低的患者存活率与肿瘤细胞上CD200的过表达相关联并相关。因此，CD200已经被靶向用于癌症免疫疗法，包含开发人源化抗体沙马组单抗(Samalizumab)，其特异性地结合至CD200并阻断其与CD200R1的连接，并且其在用于降低患有晚期慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者的肿瘤负荷的临床试验中(参见，例如，Mahadevan等人，“沙马组单抗在慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤中的I期研究：免疫检查点CD200的阻断(Phase I study ofsamalizumab in chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma:blockade ofthe immune checkpoint CD200)”，《癌症免疫疗法杂志(J.Immunotherapy Cancer)》，7,227(2019))。
发明内容
本公开提供了以高亲和力特异性地结合人CD200R1的抗体。抗体能够降低、抑制和/或完全阻断由CD200R1介导的免疫调节作用。本公开还提供了用于治疗对由CD200R1介导的免疫调节功能或活性的降低、抑制和/或阻断有应答的疾病和病状的组合物和方法。
在至少一个实施例中，本公开提供了一种抗CD200R1抗体，其包括(i)第一轻链高变区(HVR-L1)、第二轻链高变区(HVR-L2)和第三轻链高变区(HVR-L3)，和/或(ii)第一重链高变区(HVR-H1)、第二重链高变区(HVR-H2)和第三重链高变区(HVR-H3)，其中：
(a)HVR-L1包括选自以下的氨基酸序列：RASESVDYSGNSFMH(SEQ ID NO:11)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO:19)、RASKSISKYLA(SEQ ID NO:27)、RASKSISKYLA(SEQ ID NO:35)、QASHTINLN(SEQ ID NO:43)、QASHTINLN(SEQ ID NO:51)、RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:59)和RASESVDYSGNSFMH(SEQ ID NO:77)；
(b)HVR-L2包括选自以下的氨基酸序列：RASNLES(SEQ ID NO:12)、LTSKLAS(SEQID NO:20)、SGSTLQS(SEQ ID NO:28)、SGSTLQS(SEQ ID NO:36)、GTSNLED(SEQ ID NO:44)、GTSNLED(SEQ ID NO:52)、LASNLES(SEQ ID NO:60)和RASNLES(SEQ ID NO:78)；
(c)HVR-L3包括选自以下的氨基酸序列：HQSNEDPPT(SEQ ID NO:13)、QQWSSYPLT(SEQ ID NO:21)、QQYNEYPWT(SEQ ID NO:29)、QQYNEYPWT(SEQ ID NO:37)、LQHTYLPWT(SEQID NO:45)、LQHTYLPWT(SEQ ID NO:53)、QHNRELLT(SEQ ID NO:61)和HQSNWDPPT(SEQ IDNO:79)；
(d)HVR-H1包括选自以下的氨基酸序列：TNYAVS(SEQ ID NO:15)、KDDYMH(SEQ IDNO:23)、KDDYMH(SEQ ID NO:31)、KDDYIH(SEQ ID NO:39)、KDDYIH(SEQ ID NO:47)、TSYWMH(SEQ ID NO:55)、TSYVMF(SEQ ID NO:63)、TNYRVS(SEQ ID NO:81)和TNYWVS(SEQ ID NO:85)；
(e)HVR-H2包括选自以下的氨基酸序列：VMWAGGGTNYNS(SEQ ID NO:16)、RIDPANDNTKYAP(SEQ ID NO:24)、RIDPENGNTKYGP(SEQ ID NO:32)、RIDPANGNTKYAP(SEQ IDNO:40)、RIDPANGNTKYAP(SEQ ID NO:48)、AIYPGNSDTNYNQ(SEQ ID NO:56)、YINPYNDDTKYNE(SEQ ID NO:64)、VMYAGGGTNYNS(SEQ ID NO:82)和TMWAGGGTNYNS(SEQ ID NO:86)；
(f)HVR-H3包括选自以下的氨基酸序列：ARERPLTGVMDY(SEQ ID NO:17)、TRVEGRTGTYFDY(SEQ ID NO:25)、TRQLGLRRVWYALDY(SEQ ID NO:33)、ARQLGLRRTWYSLDY(SEQID NO:41)、TRQLGLRRTWYAMDY(SEQ ID NO:49)、TTAVGSY(SEQ ID NO:57)、AREDYYGSRFVYW(SEQ ID NO:65)、ARERPLTGVMDN(SEQ ID NO:83)和ARERPLTGPMDY(SEQ ID NO:87)。
在本公开的抗CD200R1抗体的至少一个实施例中，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:11的HVR-L1、SEQ ID NO:12的HVR-L2和SEQ ID NO:13的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:15的HVR-H1、SEQ ID NO:16的HVR-H2和SEQ ID NO:17的HVR-H3；
(b)SEQ ID NO:19的HVR-L1、SEQ ID NO:20的HVR-L2和SEQ ID NO:21的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:23的HVR-H1、SEQ ID NO:24的HVR-H2和SEQ ID NO:25的HVR-H3；
(c)SEQ ID NO:27的HVR-L1、SEQ ID NO:28的HVR-L2和SEQ ID NO:29的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:31的HVR-H1、SEQ ID NO:32的HVR-H2和SEQ ID NO:33的HVR-H3；
(d)SEQ ID NO:35的HVR-L1、SEQ ID NO:36的HVR-L2和SEQ ID NO:37的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:39的HVR-H1、SEQ ID NO:40的HVR-H2和SEQ ID NO:41的HVR-H3；
(e)SEQ ID NO:43的HVR-L1、SEQ ID NO:44的HVR-L2和SEQ ID NO:45的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:47的HVR-H1、SEQ ID NO:48的HVR-H2和SEQ ID NO:49的HVR-H3；
(f)SEQ ID NO:51的HVR-L1、SEQ ID NO:52的HVR-L2和SEQ ID NO:53的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:55的HVR-H1、SEQ ID NO:56的HVR-H2和SEQ ID NO:57的HVR-H3；
(g)SEQ ID NO:59的HVR-L1、SEQ ID NO:60的HVR-L2和SEQ ID NO:61的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:63的HVR-H1、SEQ ID NO:64的HVR-H2和SEQ ID NO:65的HVR-H3；
(h)SEQ ID NO:77的HVR-L1、SEQ ID NO:78的HVR-L2和SEQ ID NO:79的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:81的HVR-H1、SEQ ID NO:82的HVR-H2和SEQ ID NO:83的HVR-H3；
(i)SEQ ID NO:11的HVR-L1、SEQ ID NO:12的HVR-L2和SEQ ID NO:13的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:85的HVR-H1、SEQ ID NO:86的HVR-H2和SEQ ID NO:87的HVR-H3；
(j)SEQ ID NO:11的HVR-L1、SEQ ID NO:12的HVR-L2和SEQ ID NO:13的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:81的HVR-H1、SEQ ID NO:82的HVR-H2和SEQ ID NO:83的HVR-H3；或者
(k)SEQ ID NO:77的HVR-L1、SEQ ID NO:78的HVR-L2和SEQ ID NO:79的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:85的HVR-H1、SEQ ID NO:86的HVR-H2和SEQ ID NO:87的HVR-H3。
在本公开的抗CD200R1抗体的至少一个实施例中，所述抗体包括与选自SEQ IDNO:10、18、26、34、42、50、58、66或76的序列具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列；和/或与选自SEQ ID NO:14、22、30、38、46、54、62、67、80或84的序列具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
在本公开的抗CD200R1抗体的至少一个实施例中，该抗体包括：
(a)与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO:18具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:30具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO:34具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:38具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO:42具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:46具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(f)与SEQ ID NO:50具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:54具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(g)与SEQ ID NO:58具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:62具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(h)与SEQ ID NO:66具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:67具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(i)与SEQ ID NO:76具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:80具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(j)与SEQ ID NO:66具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:84具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(k)所述抗体包括与SEQ ID NO:66具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:80具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；或者
(l)所述抗体包括与SEQ ID NO:76具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:84具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
在本公开的抗CD200R1抗体的至少一个实施例中，所述抗体包括与选自SEQ IDNO:68、71和74的序列具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与选自SEQ IDNO:69、70、72、73、75、88和89的序列具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列。
在本公开的抗CD200R1抗体的至少一个实施例中，该抗体包括：
(a)与SEQ ID NO:68具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:69具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO:68具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:70具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:88具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:72具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO:68具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:89具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(f)与SEQ ID NO:68具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:73具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(g)与SEQ ID NO:68具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:88具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(h)与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:89具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；或者
(i)与SEQ ID NO:74具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:75具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列。
在本公开的抗CD200R1抗体的至少一个实施例中，该抗体的特征在于以下性质中的一种或多种：
(a)以1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小、或1×10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:1、2、3和/或4的hu-CD200R1多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(b)以1x10-8M或更小、1x10-9M或更小、1x10-10M或更小或1x10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1-iso4和hu-CD200R1-iso1；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQID NO:1和/或2的hu-CD200R1-iso4多肽和SEQ ID NO:3和/或4的hu-CD200R1-iso1多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(c)以1x10-8M或更小、1x10-9M或更小、1x10-10M或更小、或1x10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1-iso4-Alt和hu-CD200R1-iso4-Ref；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:1的hu-CD200R1-iso4-Alt多肽和SEQ ID NO:2的hu-CD200R1-iso4-Ref多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(d)以1x10-8M或更小、1x10-9M或更小、1x10-10M或更小、或1x10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1-iso4-Alt、hu-CD200R1-iso4-Ref、hu-CD200R1-iso1-Alt和hu-CD200R1-iso1-Ref；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:1的hu-CD200R1-iso4-Alt多肽、SEQ ID NO:2的hu-CD200R1-iso4-Ref多肽、SEQ ID NO:3的hu-CD200R1-iso1-Alt多肽和SEQ ID NO:4的hu-CD200R1-iso1-Ref多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(e)以1x10-8M或更小、1x10-9M或更小、1x10-10M或更小、或1x10-11M或更小的结合亲和力结合至cyno-CD200R1；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:5的cyno-CD200R1多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(f)以1x10-8M或更小、1x10-9M或更小、1x10-10M或更小、或1x10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1和cyno-CD200R1；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:1、2、3和/或4的hu-CD200R1多肽和SEQ ID NO:5的cyno-CD200R1多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(g)阻断hu-CD200-Fc与hu-CD200R1-iso4-Alt(SEQ ID NO:1)、hu-CD200R1-iso4-Ref(SEQ ID NO:2)、hu-CD200R1-iso1-Alt(SEQ ID NO:3)和hu-CD200R1-iso1-Ref(SEQ IDNO:4)的结合，其通过ELISA测量，其中IC50为10nM或更小、7nM或更小、5nM或更小、2nM或更小或1nM或更小；
(h)阻断hu-CD200-Fc与在细胞上表达的hu-CD200R1结合，其中IC50为2.5nM或更小、1nM或更小、或0.5nM或更小；任选地，其中所述细胞为稳定地表达hu-CD200R1的U937细胞；
(i)与人T细胞结合，其中EC50为2.5nM或更小、1nM或更小、或0.5nM或更小；任选地，其中人T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞；
(j)在抗体浓度为100nM或更小、50nM或更小、或10nM或更小的情况下，将来自人类肿瘤细胞的IFNγ产量增加至少1.2倍、1.5倍、2倍或更多；任选地，其中肿瘤细胞类型选自结肠直肠、子宫内膜、肺、黑色素瘤、卵巢、胰腺或前列腺；
(k)相对于IgG对照，将来自hu-CD200-Fc包被的人T细胞的IFNγ和/或IL-2产量增加至少1.2倍、1.5倍、2倍或更多；
(l)将人CD4+T细胞或人Cd8+T细胞的活化增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍或更多；
(m)不使CD200R1信号转导激动；
(n)阻断在用可溶性hu-CD200-Fc处理的U937单核细胞系中pDok2活性的诱导；和/或
(o)阻断由hu-CD200结合hu-CD200R1表达细胞系诱导的NFkβ转录；任选地，其中所述细胞系是表达CD200R1的K562报告物细胞和表达CD200的293T细胞。
在一些实施例中，治疗有效量为至少约1mg/kg、至少约2mg/kg、至少约10mg/kg、至少约20mg/kg。在一些实施例中，治疗有效量为至少约0.3mg、至少约1.0mg、至少约3.0mg、至少约10mg、至少约30mg、至少约100mg、至少约300mg或至少约900mg。在一些实施例中，治疗有效量为至少约10mg/kg、至少约20mg/kg或至少约100mg/kg。在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体在所述治疗有效量下没有显著的脱靶标效应。在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体在不超过10mg/kg的剂量下没有显著的脱靶标效应。在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体在不超过20mg/kg的剂量下没有显著的脱靶标效应。
本公开还提供了抗CD200R1抗体的实施例，其中：(i)抗体是单克隆抗体；(ii)抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体；(iii)抗体是IgG类的全长抗体，任选地，其中IgG类抗体具有选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgG4 S228P和IgG4 S228P/L235E的同种型；(iv)抗体是Fc区变体，任选地是改变效应子功能的Fc区变体(例如，导致无效应子抗体的变体)，或改变抗体半衰期的Fc区变体，或改变效应子功能和抗体半衰期的Fc区变体，包含在其中Fc区可以含有或可以不含有c-末端赖氨酸的所有情况下；(v)抗体是抗体片段，任选地选自由F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、单结构域抗体(VHH)和scFv组成的组；(vi)所述抗体是免疫缀合物，任选地，其中所述免疫缀合物包括用于治疗CD200R1介导的疾病或病状的治疗剂；(vii)抗体是多特异性抗体，任选地是双特异性抗体；和(viii)抗体是合成抗体，其中HVR被接枝到不同于免疫球蛋白支架或框架的支架或框架上；任选地，选自备选蛋白质支架和人造聚合物支架的支架。
在其他实施例中，本公开提供了编码本文公开的抗CD200R1抗体的分离的核酸。
在一些实施例中，本公开还提供了一种宿主细胞，其包括编码如本文公开的抗CD200R1抗体的核酸。
本公开还提供了一种产生抗CD200R1抗体的方法，其中该方法包括培养包括编码抗CD200R1抗体的核酸(或载体)的宿主细胞，使得产生抗体。
在一些实施例中，本公开提供了一种药物组合物，其包括如本文公开的抗CD200R1抗体和药学上可接受的载剂。在一些实施例中，药物组合物进一步包括用于治疗CD200R1介导的疾病或病状的治疗剂。在一些实施例中，抗CD200R1抗体是药物组合物的唯一活性剂。在一些实施例中，药物组合物包括抗CD200R1抗体和额外的活性剂，如但不限于检查点抑制剂，如包括对作为免疫检查点分子的抗原的特异性的第二抗体；任选地，其中免疫检查点分子选自PD-1、PDL-1TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3、CRTAM、CTLA-4、BTLA、CD96、CD244、CD160、LIGHT、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD40、CD47、SIRPa、NKG2D、NKG2A、TNFRSF25、CD33、CEA、Epcam、GPC3、CD73、CD83、CD39、TRAIL、CD226、VEGF和VISTA。
在一些实施例中，本公开提供了一种在受试者中治疗CD200R1介导的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文公开的抗CD200R1抗体，或治疗有效量的如本文公开的抗CD200R1抗体的药物配方。在一些实施例中，抗CD200R1抗体是施用于受试者以治疗CD200R1介导的病状的唯一活性剂。在一些实施例中，受试者被施用多于一种活性剂，包含例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、或5种或更多种有效治疗受试者的CD200R1介导的病状的活性剂。在一些实施例中，施用于受试者的多于一种活性剂包含抗CD200R1抗体和至少一种额外的活性剂，如检查点抑制剂，例如包括对作为免疫检查点分子的抗原的特异性的抗体。
在一些实施例中，本公开提供了一种治疗由CD200与在受试者的细胞上表达的CD200R1结合所介导的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗CD200R1抗体，或治疗有效量的如本文所公开的抗CD200R1抗体的药物配方。在一些实施例中，抗CD200R1抗体是施用于受试者以治疗受试者的疾病的唯一活性剂，所述疾病由CD200与在受试者的细胞上表达的CD200R1结合介导。在一些实施例中，受试者施被用多种有效治疗受试者的活性剂，包含例如其中多种活性剂包含抗CD200R1抗体和额外的活性剂，如但不限于例如检查点抑制剂，如包括对作为免疫检查点分子的抗原的特异性的第二抗体。在至少一个实施例中，抗CD200R1抗体以1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小、或1×10-11M或更小的结合亲和力与hu-CD200R1结合；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:1、2、3和/或4的四种hu-CD200R1同工型中的任何一种或多种的平衡解离常数(KD)来测量。
在本文公开的用途和治疗方法的一些实施例，可以用本公开的抗CD200R1抗体或其药物组合物治疗的CD200R1介导的疾病和病状或由CD200介导的疾病包含癌症。在一些实施例中，癌症选自肾上腺癌、膀胱癌、肉瘤、微卫星不稳定性高(MSI-H)癌症(包含实体MSI-癌症)、TMB(肿瘤突变负荷)高肿瘤、错配修复缺陷(dMMR)癌症、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、EGJ腺癌、食道癌、胆囊癌、胃癌(例如，胃肠道类癌(GI类癌))、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤(例如胸膜间皮瘤)、非小细胞肺癌、卵巢癌、上皮性卵巢癌、子宫内膜癌、儿童实体癌、胰腺癌、前列腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌(例如甲状腺髓样癌或滤泡状甲状腺癌)、血癌(例如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肾细胞癌、透明细胞肾癌、神经内分泌肿瘤(例如恶性嗜铬细胞瘤和副神经节瘤)和子宫癌。在一些实施例中，癌症选自肺癌(例如小细胞肺癌)、皮肤癌(例如黑色素瘤)、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、间皮瘤和膀胱癌。
附图说明
图1A和图1B描绘了来自本公开的选定抗CD200R1抗体和商业抗体OX108的VL结构域和VH结构域序列的比对。HVR以灰色突出显示，并且位置基于Kabat编号进行编号。
图2描绘了鼠抗CD200R1抗体10F6的VL结构域和VH结构域序列与最接近的人种系序列以及10F6的人源化形式的序列的比对。基于Kabat编号进行编号的位置。
图3描绘了通过本公开的选定抗CD200R1抗体阻断hu-CD200-Fc与hu-CD200R1(同工型1或4和单倍体型Ref或Alt)结合的ELISA结果的图。将1μg/mL hu-CD200-Fc包被在板中。将含有hu-CD200R1(0.1μg/mL或0.4μg/mL)的抗体系列稀释溶液与板结合的hu-CD200-Fc一起温育。链霉亲和素多HRP抗体(赛默飞世尔科技公司(Thermo-Fisher))用于检测。
图4描绘了显示本公开的抗CD200R1抗体阻断hu-CD200-Fc与表达CD200R1的细胞结合的能力的测定结果的图。
图5A和图5B描绘了显示抗CD200R1抗体h10F6和h22.1与人或cynoT细胞结合的测定结果的图。
图6描绘了显示用抗CD200R1阻断抗体治疗导致从9名癌症患者收集的原代PBMC样本的免疫活化(增加的IFNγ分泌)的数据图。用100nM的抗CD200R1抗体h22.1或h10F6或无效应同种型对照处理PBMC，并如实例5中所述进行测定。
图7A、图7B、图7C和图7D描绘了显示相对于同种型对照(Lyso IgG)，可溶性抗CD200R1抗体h10F6和h22.1可以挽救来自健康供体的pan T细胞中被CD200-Fc抑制的IL-2和IFNγ分泌的图。使用100nM固定或最高剂量应答浓度测试抗体。显示的误差条代表来自一式三份样本的标准偏差或标准误差平均值。板结合的人源化CD200-Fc配体抑制pan T细胞功能。如实例5所述，通过ELISA测量IL-2和IFNγ水平。
图8A、图8B和图8C描绘了显示用抗CD200R1抗体h10F6和h22.1处理T细胞表面表达如何导致T细胞上的致耐受性树突细胞抑制或通过免疫原性树突细胞的活化的图。将CD8+T细胞上的早期T细胞活化标志物CD69(参见图8A)和CD4+T细胞上的增殖标志物Ki67(参见图8B)的表达在10μg/mL的固定的CD200R1抗体的情况下与同种型对照(标记为IgG E-)进行比较。图8C描绘了在MLR后4、5和6天，相对于同种型对照(在本文标记为Iso IgG E-)，在用10μg/mL固定的CD200R1抗体处理的情况下计算的IFNg释放。
图9描绘了在用可溶性人源化的22.1(在图中表示为sol 22.1IgG)、人源化的10F6(sol 10F6 IgG)、OX108(sol OX108 IgG)、CD200-Fc(sol CD200Fc)和同种型对照IgG(solIso IgG)处理30分钟后诱导的pDok2水平。稳定地表达CD200R1的U937在图中表示为“CD200R+”，并从200nM开始用6倍稀释液处理。用最高剂量200nM处理亲代细胞，并在图中表示为“WT”。顶行显示pDok2，并且底行显示总Dok2。
图10A和图10B描绘了显示可溶性抗CD200R1抗体h10F6和h22.1针对与表达CD200的细胞共培养的K562-CD200R1的拮抗作用的数据图。图10A：IgG形式的抗体；图10B：Fab形式的抗体。
图11描绘了如实例7中所述进行的抗CD200R1抗体h10F6和h22.1在大鼠中的药代动力学研究的数据图。
图12描绘了在2mg/kg剂量或20mg/kg剂量的h10F6之后，两只雄性和两只雌性猴子随时间的h10F6的血清浓度。
图13描绘了如实例10中所述进行的来自h10F6与T细胞亚型的结合的流式细胞术研究的数据图。
图14描绘了与生物素化的h10F6的系列稀释液一起温育并用链霉亲和素-PE和活/死染色剂染色的MoDC的结合的EC50值。
描绘了将来自食蟹猴、恒河猴、狨猴、比格犬、兔和Sprague-Dawley大鼠的PBMC与50nM或200nM的生物素化h10F6或同种型对照一起温育，并用链霉亲和素-PE和活/死染色剂染色。
图16描绘了h10F6与CHO细胞的结合，所述CHO细胞用来自人、兔、狨猴、恒河猴或食蟹猴的全长CD200-R1转染，并与生物素化的h10F6的系列稀释液一起温育，随后与链霉亲和素-PE和活/死染色剂一起温育。
图17描绘了癌症患者和健康对照中TIL和PBMC上CD200的表达。在来自肿瘤的免疫细胞亚群和来自癌症患者的PBMC和来自健康受试者的PBMC中评估CD200表达。基于CD45+T辅助细胞(CD3+CD4+)、细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)和B细胞(CD3-CD19+)对单细胞免疫亚群进行门控；骨髓细胞被鉴定为CD11b+(谱系阴性)。如通过MFI(平均荧光强度)测量的CD200表达在TIL亚群上与匹配的PBMC进行比较。
图18描绘了在源自肿瘤的免疫细胞亚群和来自癌症患者的PBMC和来自健康受试者的PBMC中评估的CD200R1表达。基于CD45+T辅助细胞(CD3+CD4+)、细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)和B细胞(CD3-CD19+)对单细胞免疫亚群进行门控；骨髓细胞被鉴定为CD11b+(谱系阴性)。如通过MFI(平均荧光强度)测量的CD200R1表达在TIL亚群上与匹配的PBMC进行比较。
图19描绘了经工程改造以表达预期代表高表达群体(总T细胞的约28％)的水平hCD200R1的U937细胞系。图A从U937-CD置换不同浓度的生物素化hCD200-Fc
图20描绘了作为允许结合至增加浓度的h10F6的体外单核细胞分化的DC的浓度的函数的结合。
图21描绘了在与表达CD200的HEK293细胞共培养的经工程改造以表达CD200R1和DOK2的人Jurkat细胞中阻断DOK2到CD200R1的诱导的募集。
图22描绘了h10F6对CD200-R1诱导的人髓系细胞系K562的特性的NFκB活化的影响，所述人髓系细胞系被工程改造以稳定地表达CD200R1和NFκB-荧光素酶报告物。图A描绘了表达CD200R1的K562细胞与表达CD200的HEK293T细胞的共培养物以细胞数量依赖性方式诱导NFκB报告物基因活性。图B描绘了通过将h10F6或同种型对照的系列稀释液应用于共培养的表达CD200R1的K562细胞和表达CD200的HEK293T细胞，h10F6阻断NFκB信号传导的能力。
图23描绘了通过与20ng/mL的GMCSF和20ng/mL的IL-4一起培养7天而分化成树突细胞的单核细胞。树突细胞被极化成致耐受性的DC(使用20ng/mL的IL-10和IFNα-2b)，或被极化成免疫原性的DC(使用100ng/mL的LPS和50ng/mL的TNF-α)。在极化3天后，pan-T细胞和成熟的DC以20:1(T:DC)的比率与10ug/mL h10F6或同种型对照混合在一起。在4、5和6天后收集条件培养基用于细胞因子测量。通过FACS分析(抗CD69、抗CD25和抗Ki67)测量T细胞活化标志物。测量细胞因子产生(图A；IFNγ、IL-12和IL-18)和T细胞活化标志物(图B，CD4+Ki67+和CD8+CD69+)；在第4、5和6天IFNγ分泌的时间进程(图C)说明了时间依赖性。
图24描绘了从健康PBMC供体分离的人类pan-T细胞，并在完全培养基中用2μg/mLPHA和4ng/mL人IL-2长期刺激持续7天。然后收获细胞，停止刺激物并用40ng/mL人IL-4引发持续24小时。在铺板细胞之前，用1μg/mL抗CD3克隆OKT3和15μg/mL hCD200-Fc或同种型匹配的Fc对照(被称为在PBS中稀释的对照涂层)在4℃下将板包被过夜。收获、洗涤细胞并用50nM抗体铺板持续24小时。收获细胞上清液并通过ELISA测量IL-2分泌。在图A中，为每个供体绘制了来自生物学一式三份的IL-2分泌水平的平均值和SEM。进行非配对t检验以确定与同种型对照相比的显著h10F6治疗效果(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。在图B中，h10F6挽救IFNγ分泌的剂量-应答曲线说明了来自一个供体的生物学一式三份。
图25描绘了与同种型对照处理的PBMC相比，通过用h10F6(内源性表达CD200的GFP+COV644肿瘤细胞)处理用SEB引发的PBMC加速肿瘤细胞杀伤。图A描绘了来自用指定浓度的h10F6或同种型对照处理的3个供体中的1个(RG1212)的细胞的生长曲线(通过每孔的绿色面积测量)。图B描绘了在图A(RG1212)中显示的来自同一供体的杀伤阶段时间范围期间，使用曲线下的绿色面积测量的肿瘤细胞GFP信号的剂量依赖性减少；数据被绘制为4到6次单独测量的平均值±SEM。
图26描绘了在3个独特的供体中h10F6以浓度依赖性方式增强的PBMC介导的肿瘤细胞杀伤(图A至C)。按h10F6浓度绘制来自n＝4个复制品中的杀伤的肿瘤细胞的平均百分比增加并按供体分离(图D)。将来自RG1939(N＝2)和RG1307(N＝3)中的重复实验的数据汇总并用三项非线性回归模型进行拟合。按供体绘制了个体和模型拟合相对于同种型对照的最大和最小肿瘤杀伤％，以评估h10F6效应的范围和供体与供体之间的变异性。
图27描绘了与生物素化的h10F6的系列稀释液一起温育并使用链霉亲和素-PE、活/死染色剂和荧光染料缀合的商业抗体的混合物染色的猴PBMC，所述商业抗体包含抗CD3克隆SK7、抗CD4克隆M-T466、抗CD8克隆BW135/80、抗CD20克隆2H7、抗CD11b克隆M1/70、抗CD14克隆TUK4和抗HLA-DR克隆REA-805。免疫细胞亚型被定义为T辅助细胞(CD3+CD4+)。与猴CD4+T细胞结合的EC50值使用3参数、log10[h10F6]相对于应答、非线性曲线拟合来确定。
图28描绘了如使用ELISA评估的h10F6阻断生物素化的MfCD200R1与固定的、Fc加标签的MfCD200结合的能力。将h10F6的4倍系列稀释液(范围为1μM至2.38x10-7μM)与hCD200R1(0.04ug/ml)或MfCD200R1(0.12ug/ml)一起预温育，然后加入到板固定的MfCD200中。通过与HRP-链霉亲和素和比色底物一起温育来评估结合，然后监测每个孔中的OD450。
图29描绘了人单核细胞系K562，其经工程改造以稳定地表达MfCD200R1。通过FACS证实了与非糖基化的hIgG1 Fc标签融合的重组MfCD200与表达MfCD200R1的K562细胞的结合。h10F6.V1以剂量依赖性方式抑制MfCD200-Fc与表达MfCD200R1的K562细胞的结合。
图30描绘了以半对数图绘制的平均和个体h10F6.V1血清浓度。该测定的定量下限(LLOQ)为0.06μg/mL。
具体实施方式
本公开提供了抗体，包含人源化抗体，其以高亲和力特异性地结合CD200R1，并且从而抑制、降低和/或完全阻断CD200R1作为参与免疫调节的细胞表面受体的功能，特别是CD200R1作为淋巴细胞(例如，T细胞和NK细胞)活化的抑制剂的功能。因此，预期包括本公开的抗CD200R1抗体的组合物或配方中的任何一种可以用作治疗剂，以用于治疗由CD200R1或其靶配体CD200的功能介导的疾病，如癌症和病毒感染。此外，预期本公开的抗CD200R1抗体可以用作与其他治疗剂组合的治疗剂，所述其他治疗剂如靶向免疫检查点分子的抗体，所述免疫检查点分子包含但不限于PD1、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3和CRTAM。在本公开所预期的治疗剂中是双特异性抗体，其包括本公开的抗体的抗CD200R1结合特异性和抗体对免疫检查点分子的另一种结合特异性，所述免疫检查点分子如PD1、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3和CRTAM。
术语和技术概述
对于在本文和所附权利要求书中的描述，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”包括多个指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多于一种蛋白质，并且提及“一种化合物”是指多于一种化合物。还应当注意，权利要求可以起草为排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在用作结合权利要求要素的叙述使用如“单独地”，“仅”等排他性术语或使用“负面”限制的先行基础。“包含(comprise/comprises/comprising)”、“包括(include/includes/including)”可互换使用并且并不意图是限制性的。应进一步理解，在各种实施例的描述使用所属领域的技术人员将在一些具体情形下所应理解的术语“包含”的情况下，可以使用语言“主要由……组成”或“由……组成”来替代性地描述实施例。
在提供值的范围时，除非上下文另外明确规定，否则应理解，除非上下文另外明确规定否则在那个范围的上限与下限之间的值的每个中介整数和值的每个中介整数的每个十分位以及那个所述范围中的任何其它所述或中介值涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括于较小范围中并且也涵盖于本发明内，在所述范围内受到任何特定排他性限制。在所述范围包括界限值中的一或两者的情况下，排除所包括的界限值中的任(i)一者或(ii)两者的范围也包括于本发明中。例如，“1到50”包括“2到25”、“5到20”、“25到50”、“1到10”等。
一般而言，本文使用的命名法和本文描述的技术和程序包含本领域的普通技术人员充分理解和通常采用的那些，如在以下中描述的常用技术和方法：Sambrook等人，《分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)》，(第2版)，第1-3卷，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor、N.Y.)，1989(以下简称“Sambrook”)；《分子生物学的当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)》，F.M.Ausubel等人编辑，当前方案(Current Protocols)，格林出版公司和约翰·威利父子公司的合资企业(joint venture between Greene PublishingAssociates、Inc.and John Wiley&Sons、Inc.)(补充至2011年)(以下简称“Ausubel”)；《抗体工程改造(Antibody Engineering)》，第1和2卷，R.Kontermann和S.Dubel编辑，Springer-Verlag，Berlin和Heidelberg(2010)；《单克隆抗体:方法和方案(Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols)》，V.Ossipow和N.Fischer编辑，第2版，Humana出版社(Humana Press)(2014)；《治疗性抗体:从工作台到临床(Therapeutic Antibodies: From Bench to Clinic)》，Z.An编辑，约翰威立出版公司(J.Wiley&Sons)，Hoboken，N.J.(2009)；和《噬菌体展示(Phage Display)》、Tim Clackson和Henry B.Lowman编辑、英国牛津大学出版社(2004)。
本公开中所参考的所有出版物、专利、专利申请和其它文献都以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的，其引用的程度就如同个别地指示将各个别出版物、专利、专利申请或其它文献以引用的方式并入以用于所有目的。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。出于解释本公开的目的，术语的以下描述将适用，并且在适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，并且反之亦然。
如本文所用，“CD200R1”是指细胞表面跨膜糖蛋白CD200受体1，并且涵盖人、食蟹猴(本文在一些情况下被称为“食蟹猴”)、恒河猴的CD200R1蛋白及其各种同工型。各种示例性CD200R1蛋白和同工型的氨基酸序列是本领域已知的并且在下表2和所附序列表中提供。
如本文所用，“CD200R1介导的病状”或“CD200R1介导的疾病”涵盖与CD200R1与配体(例如CD200)的特异性结合相关联的任何医学病状。例如，在细胞表面上表达的CD200与表达CD200R1受体的其他细胞的特异性结合可以影响表达CD200的细胞与其他免疫调节分子的结合，这可以改变淋巴细胞(例如，T细胞)的活化。因此，CD200R1介导的疾病可以包含但不限于由表达CD200R1或CD200的细胞之间的结合的拮抗剂或抑制剂介导和/或对其有应答的任何疾病或病状，和/或对免疫检查点抑制剂的抑制有应答的任何疾病或病状，包含但不限于癌症。具体的示例性癌症在本文别处提供。
如本文所用，“免疫检查点分子”是指起到调节免疫系统途径并由此防止其不必要地攻击细胞的功能的分子。许多免疫检查点分子(无论是抑制性的还是共刺激性的)都是癌症和病毒感染的治疗中免疫疗法(例如，用阻断抗体来阻断免疫抑制或用激动剂来促进免疫刺激)的靶标。靶向癌症免疫疗法的示例性免疫检查点分子包含但不限于PD1、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3、CRTAM、CTLA-4、BTLA、CD244、CD160、LIGHT、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD40、CD47、SIRPa、NKG2D、NKG2A、TNFRSF25、CD33、CEA、Epcam、GPC3、CD73、CD83、CD39、TRAIL、CD226和VISTA。
如本文所使用，“抗体”是指包含与特定抗原特异性结合或对特定抗原具有免疫应答性的一条或多条多肽链的分子。本公开的示例性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、多特异性(或异源缀合物)抗体(例如，双特异性抗体)、单价抗体(例如，单臂抗体)、多价抗体、抗原结合片段(例如，Fab'、F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)、抗体融合体和合成抗体(或抗体模拟物)。
“抗CD200R1抗体”或“结合CD200R1的抗体”是指以足够的亲和力结合CD200R1的抗体，使得该抗体可用作靶向CD200R1的诊断剂和/或治疗剂。在一些实施例中，抗CD200R1特异性抗体与不相关的非CD200R1抗原的结合程度小于抗体与CD200R1结合的约20％、小于约15％、小于约10％、或小于约5％，如通过例如放射免疫测定(RIA)或表面等离子体共振(SPR)测量的。在一些实施例中，结合至CD200R1的抗体具有解离常数(KD)of<1μΜ、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<1pM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”是指全长抗体的一部分，其能够结合与全长抗体相同的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单价或单臂抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，并且将其中几类进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的结构域，其涉及抗体与抗原的结合。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包括四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如，Kindt等人，《Kuby免疫学(Kuby Immunology)》，第6版编辑，WH Freeman and Co.，第91页)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体中分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库(参见例如Portolano等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，150:880-887(1993)；Clarkson等人，《自然(Nature)》，352:624-628(1991))。
如本文所用，“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区域，这些区域在序列上是高变的和/或形成结构上定义的环(“高变环”)。通常，天然抗体包含具有六个HVR的四个链；三个位于重链可变结构域VH(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)，并且三个位于轻链可变结构域VL(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基。许多高变区描述正在使用中并且涵盖在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性并且是最常用的(Kabat等人，免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第5版，公共卫生服务(Public HealthService)，美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)，马里兰州贝塞斯达(Bethesda、Md.)，(1991))。Chothia替代地是指结构环的位置(Chothia和Lesk，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并被牛津分子公司(Oxford Molecular)的AbM抗体建模软件使用。“接触”高变区基于对可用复杂晶体结构的分析。来自这些高变区中的每一个的残基在下表1中注明。
表1：CD200R1、CD200和相关联的序列
Figure BDA0003968761560000171
除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人(同上)编号。
如本文所用，高变区可以包含如下延伸的或替代的高变区：VL结构域中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)和VH结构域中的26-35或30-35(H1)、50-61、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基根据Kabat等人(同上)进行编号。
如本文所使用，“互补决定区”或“CDR”是指可变结构域的HVR内具有最高序列可变性和/或涉及抗原识别的区。通常，天然抗体包含具有六个CDR的四条链；三个位于重链可变结构域VH(H1、H2、H3)，并且三个位于轻链可变结构域VL(L1、L2、L3)。示例性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35、H2的50-61和H3的95-102。(根据Kabat等人(同上)进行编号)。
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在VH(或VL)中的以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“天然抗体”是指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键结的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N端到C端，每条重链都有一个可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端到C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可归属于两种类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。
如本文所使用，“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群获得的抗体，即，除了可能的变异体抗体(例如，变异体抗体含有突变，所述突变天然存在或在产生单克隆抗体的过程中产生，并且通常以少量存在)之外，包含所述群的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位。相对于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体配方，单克隆抗体配方的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，术语“单克隆”指示如从基本上均质的抗体群获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，所使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，用于制备单克隆抗体的此类方法和其它示例性方法描述于本文中。
“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种的一种抗体。
“人源化抗体”是指包含来自非人类HVR的氨基酸序列和来自人类FR的氨基酸序列的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将包括基本上所有的至少一个，并且通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR对应于非人抗体的那些HVR，以及所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体可任选地包含来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人类抗体)的“人源化形式”是指已经经历人源化的抗体。
“人类抗体”是指具有氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人类或人类细胞产生的或来源于利用人类抗体库或其它人类抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列。人类抗体的此定义尤其排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。
“人类共有构架”是一个构架，其表示在选择人类免疫球蛋白VL或VH构架序列中最常存在的氨基酸残基。通常，人类免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的子组是如在Kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》，第五版，NIH出版物91-3242，马里兰州贝塞斯达(1991)，第1-3卷中的子组。在一些实施例中，对于VL，子组是kappa I子组，如在Kabat等人(同上)中。在一些实施例中，对于VH，子组是如在Kabat等人(同上)中的子组III。
如本文所使用，“受体人类架构”是包含来源于人类免疫球蛋白架构或人类共有架构的轻链可变结构域(VL)架构或重链可变结构域(VH)架构的氨基酸序列的架构。“来源于”人类免疫球蛋白架构或人类共有架构的受体人类架构可包含其相同的氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列变化。在一些实施例中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些实施例中，VL受体人类构架在序列上与VL人类免疫球蛋白构架序列或人类共有构架序列相同。
“Fc区”是指包含免疫球蛋白重链的C端多肽序列的二聚体复合物，其中C端多肽序列是可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体而获得的。Fc区可包含天然或变异体Fc序列。尽管免疫球蛋白重链的Fc序列的边界可以变化，但人IgG重链Fc序列通常被定义为从约位置Cys226处的氨基酸残基或从约位置Pro230延伸至Fc序列的羧基末端。然而，Fc序列的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。免疫球蛋白的Fc序列通常包含两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域。
“Fc受体”或“FcR”是指与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施例中，FcR是天然人类FcR。在一些实施例中，FcR是结合IgG抗体(γ受体)的受体并且包含FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类，包含这些受体的等位基因变体和替代地剪接形式。FcγRII受体包含FcγRIIA(一种“活化受体”)和FcγRIIB(一种“抑制受体”)，其具有主要在其胞质结构域中不同的相似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，(参见，例如，Daeron，《免疫学年度综述(Annu.Rev.Immunol.)》，15:203-234(1997))。如本文所用，FcR还包含新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，《免疫学杂志》，1 17:587(1976)和Kim等人，《免疫学杂志》，24:249(1994))和免疫球蛋白稳态的调节(regulation of homeostasis of immunoglobulins)。FcR在例如Ravetch和Kinet，《免疫学年度综述》，9:457-92(1991)；Capel等人，《免疫方法(Immunomethods)》，4:25-34(1994)；和de Haas等人，《实验室和临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)》，126:330-41(1995)中综述。
如本文所使用，“多价抗体”是包含三个或更多个抗原结合位点的抗体。优选将多价抗体工程改造成具有三个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然序列IgM或IgA抗体。
“多特异性抗体”是具有至少两个不同结合位点的抗体，每个位点具有不同的结合特异性。多特异性抗体可以是全长抗体或抗体片段，并且不同的结合位点可以各自结合至不同的抗原，或者不同的结合位点可以结合至相同抗原的两个不同表位。
“Fv片段”是指含有完整的抗原识别和结合位点的抗体片段。此区由紧密缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成，所述二聚体在性质上，例如在scFv中可以是共价的。正是在此构型中，每个可变结构域的三个HVR相互作用以限定VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。共同地，这六个HVR或其子集赋予了抗体抗原结合特异性。然而，尽管单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)能够识别并结合抗原，但亲和力通常低于整个结合位点。
“Fab片段”是指含有轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。“F(ab')2片段”包含通常在其羧基端附近由其之间的铰链半胱氨酸共价连接的Fab片段对。抗体片段的其它化学偶联也是所属领域已知的。
如本文所使用，“抗原结合臂”是指具有特异性结合目标靶分子的能力的抗体的组分。通常，抗原结合臂是免疫球蛋白多肽序列的复合物，例如免疫球蛋白轻链和重链的HVR和/或可变结构域序列。
“单链Fv”或“scFv”是指包括抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽还包含位于VH结构域与VL结构域之间的多肽连接子，所述多肽连接子使scFv能够形成所需抗原结合结构。
“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含连接到相同多肽链中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许在相同链上的两个结构域之间配对的连接子，结构域被迫使与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。
“线性抗体”是指Zapata等人，《蛋白质工程(Protein Eng.)》，8(10)：1057-1062(1995)中描述的抗体。简而言之，这些抗体包括一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
“裸抗体”是指未与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射性标记缀合的抗体。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其结合配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以通过所属领域中已知的常见方法，包括本文所描述的那些方法来测量。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例描述如下。
“特异性地结合”或“特异性结合”是指抗体以不超过约1x10-7M的亲和力值与抗原结合。在一些实施例中，抗体可以对除了其特异性结合的抗原以外的抗原具有次级亲和力，其中“次级亲和力”通常是指抗体以大于如本文别处所述的约10nM的亲和力值与次级抗原的结合。在抗体可能对次级抗原具有次级亲和力的情况下，这种抗体将仍然特异性地结合至初级抗原。
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个HVR中具有一个或多个改变的抗体，此类改变造成抗体对抗原的亲和力的改善。
抗体的“功能性抗原结合位点”是能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不一定与衍生抗原结合位点的亲本抗体一样强，但结合抗原的能力必须使用已知用于评估抗体与抗原的结合的多种方法中的任一种测量。
“分离抗体”是指已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施例中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱方法(例如，离子交换或反相HPLC)所确定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人，《色谱杂志B(J.Chromatogr.B)》，848:79-87。
如本文所用，“基本上相似”或“基本上相同”是指两个数值(例如，一个数值与测试抗体相关联并且另一个数值与参考抗体相关联)之间足够高程度的相似性，使得本领域技术人员会认为这两个数值之间的差异在由所述数值(例如，KD值)测量的生物学特征的上下文中几乎没有或没有生物学和/或统计学意义。
如本文所用，“显著不同”是指两个数值(通常一个数值与分子相关联并且另一个数值与参考分子相关联)之间足够高程度的差异，使得本领域技术人员将认为这两个值之间的差异在由所述值(例如KD值)测量的生物学特征的上下文中具有统计学意义。
“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。
“免疫缀合物”是指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指试图改变被治疗的个体的病症的自然进程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学进程期间进行。所期望的治疗效果可以包括但不限于预防病症发生或复发、缓解症状、减少病症的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低进展速率、改善或缓和疾病状态和缓解或改善预后。例如，治疗可以包含向受试者施用治疗有效量的包括抗CD200R1抗体的药物配方以延缓由CD200R1介导的疾病或病状的发展或减慢其进展，或其中CD200R1可以在发病机制和/或进展中起作用的疾病或病状。
“医药调配物”是指以允许活性成分的生物活性有效的形式的配方，并且其不含有对施用调配物的受试者有毒的其它组分。药物配方可以包含一种或多种活性剂。例如，药物配方可以包含抗CD200R1抗体作为配方的唯一活性剂，或者可以包含抗CD200R1抗体和一种或多种额外的活性剂，如例如免疫检查点抑制剂。
如本文所用，“唯一活性剂”意指所指代的药剂是存在于配方中或用于疗法的唯一药剂，其提供或预期将提供治疗受试者的病状的相关药理学作用，与如本文所提供的“治疗”的描述一致。包括唯一活性剂的药物配方不排除在配方中存在一种或多种非活性药剂，如例如药学上可接受的载剂。“非活性剂”是预期不会提供或不以其他方式显著有助于旨在治疗受试者的病状的相关药理作用的药剂。
“药学上可接受的载剂”是指医药调配物中除活性成分以外的成分，所述成分对施用其的受试者无毒。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
“治疗有效量”是指达到期望的治疗或预防结果，例如治疗或预防受试者中的疾病、病症或病况的活性成分或药剂(例如，医药调配物)的量。在CD200R1介导的疾病或病状的情况下，治疗剂的治疗有效量是在一定程度上减少、预防、抑制和/或缓解与疾病、病症或病状相关的一种或多种症状的量。对于癌症治疗，体内疗效可以例如通过评估原发肿瘤的生长、继发性肿瘤的发生和/或生长、转移的发生和/或数量、症状的持续时间、严重程度和/或复发、应答率(RR)、应答的持续时间和/或生活质量来测量。
如本文所用，“同时”是指施用两种或更多种治疗剂，其中至少部分施用在时间上重叠。因此，同时施用包括当一种或多种药剂的施用在中止一种或多种其它药剂的施用之后继续时的给药方案。
“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物，如猴子)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。
各自实施方式的详细描述
I.CD200R1
人CD200R1(“hu-CD200R1”)是在细胞(特别是骨髓细胞和T细胞)的表面上表达的跨膜糖蛋白。hu-CD200R1 Uniprot序列Q8TD46-1编码325个氨基酸的同工型，被称为同工型1。hu-CD200R1 Uniprot序列Q8TD46-4编码348个氨基酸的同工型，被称为同工型1。然而，在人类群体中观察到的主要hu-CD200R1同工型是UniProt序列Q8TD46-4同工型4的348氨基酸序列变体，带有E335Q取代。同工型4的这种变体(Q8TD46-4+E335Q)代表两种主要单倍型中的一种，这两种主要单倍型占在1000基因组项目中观察到的所有个体的>99％(https:// www.internationalgenome.org/)。这种单倍型(在本文中被称为“Alt”)在欧洲血统的个体中最常观察到，其中频率为0.54。在欧洲血统的个体中以0.46的频率观察到其他主要的单倍型(在本文中被称为“Ref”)，并且与人类基因组参考序列相对应。Alt单倍型具有Q8TD46-4序列的胞外结构域(ECD，氨基酸1-266)和Q8TD46-4序列的带有E335Q取代的胞内结构域(ICD，氨基酸291-348)。Ref单倍型具有Q8TD46-4序列的带有三个取代R112K、P144T和Q200H的胞外结构域(ECD，氨基酸1-266)，以及Q8TD46-4序列的胞内结构域(ICD，氨基酸291-348)。
hu-CD200R1-iso4 Alt和Ref单倍型ECD序列的240个氨基酸区段(位置27-266)在本文中分别作为SEQ ID NO:1和2在下表2中列出。hu-CD200R1-iso1Alt和Ref单倍型ECD序列的215个氨基酸区段(位置29-243)在本文中分别作为SEQ ID NO:3和4在下表2中列出。
类似于hu-CD200R1同工型4，重组制备的cyno-CD200R1和恒河猴CD200R1的区段分别作为SEQ ID NO:5和6在下表2中列出。
hu-CD200R1受体靶标配体hu-CD200蛋白可以在Uniprot P41217中找到，并且在本文中作为SEQ ID NO:7列出。对应的cyno-CD200R1 CD200蛋白在本文中也作为SEQ ID NO:8提供。所有的CD200多肽都是与无效应子的人IgG Fc的C-末端融合物，如SEQ ID NO:9。
下面的表2提供了本公开的各种CD200R1和CD200多肽的序列及其序列标识符的概要描述。所述序列也包括在随附的序列表中。
表2：CD200R1、CD200和相关联的序列
Figure BDA0003968761560000251
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II.抗CD200R1抗体
在在一些实施例中，本公开提供了抗CD200R1抗体在各种熟知的免疫球蛋白特征(例如，HVR、FR、VH、VL结构域以及全长重链和轻链)的氨基酸和编码核苷酸序列方面的结构。下表3提供了本公开的抗CD200R1抗体序列及其序列标识符的概要描述。这些序列包含在随附的序列表中。
表3：抗CD200R1抗体序列
Figure BDA0003968761560000261
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Figure BDA0003968761560000271
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Figure BDA0003968761560000281
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Figure BDA0003968761560000291
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Figure BDA0003968761560000301
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Figure BDA0003968761560000311
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Figure BDA0003968761560000321
1.抗CD200R1抗体的结合亲和力、阻断和细胞信号传导抑制
在一些实施例中，本文提供的抗CD200R1抗体具有<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(例如，10-8M或更小、10-8M至10-13M、例如10-9M至10-13M)的用于结合至CD200R1的平衡解离常数(KD)。
在一些实施例中，结合亲和力通过对SEQ ID NO:1、2、3和/或4的hu-CD200R1同工型/单倍型多肽的平衡解离常数(KD)来测量。在一些实施例中，抗CD200R1能够以<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(例如，10-8M或更小、10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的结合至CD200R1的平衡解离常数(KD)的亲和力结合至SEQ ID NO:1、2、3和4的所有四种hu-CD200R1同工型/单倍型多肽。在至少一个实施例中，抗CD200R1能够以相当的(例如，在20％以内)或在10-8M或更小的范围内的等效亲和力结合至SEQ ID NO:1和2的hu-CD200R1多肽。
在至少一个实施例中，抗CD200R1抗体的特征在于以1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1x10-10M或更小、或1x10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1-iso4和hu-CD200R1-iso1。在一些实施例中，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:1和/或2的hu-CD200R1-iso4多肽和SEQ ID NO:3和/或4的hu-hu-CD200R1-iso1多肽的平衡解离常数(KD)来测量。
在至少一个实施例中，抗CD200R1抗体的特征在于以1×10-8M或更小、1×10-9或更小、1×10-10M或更小、或1×10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1-iso4-Alt和hu-CD200R1-iso4-Ref。在一些实施例中，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:1的hu-CD200R1-iso4-Alt多肽和SEQ ID NO:2的hu-CD200R1-iso4-Ref多肽的平衡解离常数(KD)来测量。
预期如本文所公开产生的各种抗-CD200R1抗体包含能够高亲和力结合至cyno-CD200R1和/或hu-CD200R1和cyno-CD200R1两者的抗体。更具体地说，在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体以1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小、或1×10-11M或更小的结合亲和力结合至cyno-CD200R1。在一些实施例中，结合亲和力被测量为用于结合至SEQ ID NO:5的hu-CD200R1多肽的平衡解离常数(KD)。在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体以1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小、或1×10-11M或较少的的结合亲和力结合至cyno-CD200R1。在一些实施例中，结合亲和力被测量为用于结合至SEQID NO:5的cyno-CD200R1多肽的平衡解离常数(KD)。在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体以1x10-8M或更小、1x10-9M或更小、1x10-10M或更小或1x10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1和cy-CD200R1两者。在一些实施例中，结合亲和力被测量为用于结合至SEQID NO:1、2、3或4的hu-CD200R1多肽和SEQ ID NO:5的cyno-CD200R1多肽的平衡解离常数(KD)。
通常，配体与其受体的结合亲和力可以使用多种分析方法中的任一种来测定，并且以在多种定量值表达。可用于确定抗体的亲和力的特定CD200R1结合测定在本文的实例中公开。此外，抗原结合测定是本领域已知的并且可以在本文中使用，包含但不限于使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹心”免疫测定、基于表面等离子体共振的测定(例如如在WO2005/012359中描述的BIAcore测定)、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定、流式细胞分析和荧光活化细胞分选(FACS)测定的技术的任何直接或竞争性结合测定。
因此，在一些实施例中，结合亲和力表达为KD值并且反映固有结合亲和力(例如，具有最小的亲合力作用)。本公开的抗CD200R1抗体对在人类中占优势的四种不同CD200R1同工型/单倍型组合的胞外结构域表现出强的结合亲和力：hu-CD200R1-iso4-Alt(SEQ IDNO:1)；hu-CD200R1-iso4-Ref(SEQ ID NO:2)；hu-CD200R1-iso1-Alt(SEQ ID NO:3)；和hu-CD200R1-iso1-Ref(SEQ ID NO:4)。SEQ ID NOs:1-4的这四种同工型的四种hu-CD200R1多肽的胞外结构域表现出在10nM和1pM之间的KD值。因此，本公开的抗CD200R1抗体可以与对CD200R1的相同或重叠表位具有较低亲和力的抗体竞争。
在一些实施例中，本文提供的抗CD200R1抗体减少、抑制和/或完全阻断CD200与CD200R1的结合，从而阻断由CD200R1介导的免疫调节和/或免疫信号传导，包含T细胞的活化。抗体抑制由表达CD200R1的细胞结合至表达CD200的细胞所介导的这些免疫调节和/或免疫信号传导途径的能力可以使用已知的基于细胞的测定(包含本公开的实例中描述的各种基于细胞的测定)在体外进行测定。因此，在一些实施例中，本公开的CD200R1抗体的特征在于基于降低、抑制和/或完全阻断由CD200R1与CD200结合介导的细胞信号传导途径的能力的一种或多种以下功能特性。
在至少一个实施例中，本公开的CD200R1抗体阻断hu-CD200-Fc与hu-CD200R1-iso4-Alt(SEQ ID NO:1)、hu-CD200R1-iso4-Ref(SEQ ID NO:2)、hu-CD200R1-iso1-Alt(SEQ ID NO:3)和hu-CD200R1-iso1-Ref(SEQ ID NO:4)的结合，其通过ELISA测量，其中IC50为10nM或更小、7nM或更小、5nM或更小、2nM或更小，或1nM或更小。
在至少一个实施例中，本公开的CD200R1抗体以2.5nM或更小、1nM或更小、或0.5nM或更小的IC50阻断hu-CD200-Fc与在细胞上表达的hu-CD200R1结合；任选地，其中所述细胞是稳定地表达hu-CD200R1的U937细胞。
在至少一个实施例中，本公开的CD200R1抗体以10nM或更小、5nM或更小、1nM或更小、或0.1nM或更小的IC50阻断CD200与在人T细胞上表达的CD200R1结合；任选地，其中所述细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
在至少一个实施例中，本公开的CD200R1抗体以2.5nM或更小、1nM或更小或0.5nM或更小的EC50与人T细胞结合；任选地，其中人T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在至少一个实施例中，本公开的CD200R1抗体以100nM或更小、50nM或更小、或10nM或更小的抗体浓度将来自人肿瘤细胞的IFNγ产量增加至少1.2倍、1.5倍、2倍或更多；任选地，其中所述肿瘤细胞类型选自结肠直肠、子宫内膜、肺、黑色素瘤、卵巢、胰腺或前列腺。
在至少一个实施例中，相对于IgG对照，CD200R1抗体使来自CD200-Fc包被的人T细胞的IFNγ和/或IL-2产量增加至少1.2倍、1.5倍、2倍或更多。
在至少一个实施例中，CD200R1抗体使CD4+T细胞和/或Cd8+T细胞的活化增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍或更多。
在至少一个实施例中，CD200R1抗体阻断由CD200和表达CD200R1的细胞系之间的结合所诱导的NFkβ转录；任选地，其中所述细胞系是表达CD200R1的K562报告物细胞和表达CD200的293T细胞。
在至少一个实施例中，本公开的CD200R1抗体能够阻断CD200R1介导的细胞信号传导并且不充当CD200R1活性的激动剂，或以其他方式无意地激动CD200R1信号传导。诱导CD200R1激动剂活性的一种实验性措施是诱导用CD200处理的细胞中的pDok2活性。因此，在至少一个实施例中，本公开的抗CD200R1抗体阻断在用可溶性CD200-Fc处理的U937单核细胞系中pDok2活性的诱导。
2.抗体片段
在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体可以是抗体片段。可用于本公开的结合决定簇的抗体片段包含但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、scFv片段、单价、单结构域抗体、一个臂或单臂抗体和本文描述的和本领域已知的其他片段。因此，在本公开的抗CD200R1抗体的一些实施例中，该抗体是选自由F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、单结构域抗体(VHH)、单臂抗体和scFv组成的组的抗体片段。
关于抗体片段的综述，参见例如Hudson等人，《自然医学(Nat.Med.)》，9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如，Pluckthun，在《单克隆抗体的药理学中(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)》、第113卷、Rosenburg和Moore编，(纽约施普林格出版社)、第269-315页(1994)；另见WO93/16185；和美国专利第5,571,894和5,587,458号。关于包含补救受体结合表位残基并且具有体内半衰期增加的Fab和F(ab')2片段的描述，参见美国专利第5,869,046号。其它单价抗体形式描述于例如WO2007/048037、WO2008/145137、WO2008/145138和WO2007/059782中。单价单臂抗体描述于例如WO2005/063816中。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的(参见例如EP0404097；WO93/01161；Hudson等人，《自然医学》，9：129-134(2003)；和Hollinger等人，《美国国家科学院院刊》，90:6444-6448(1993))。
在一些实施例中，抗体片段是单结构域抗体，其包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域。在一些实施例中，单结构域抗体是人类单结构域抗体(多曼蒂斯公司(Domantis，Inc.)，马萨诸塞州沃尔瑟姆；参见例如，美国专利第6,248,516号)。
抗体片段可以如本文所述通过各种技术制备，所述各种技术包含但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生。
3.嵌合和人源化抗体
在一些实施例，本公开的抗CD200R1抗体可以是嵌合抗体。(参见例如如在美国专利第4,816,567号；和Morrison等人，《美国国家科学院院刊》，81:6851-6855(1984)中描述的嵌合抗体)。在一个实施例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人类灵长类(如猴子)的可变区)和人类恒定区。在一些实施例中，嵌合抗体是“类别转换的：其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类改变的抗体。预期嵌合抗体可以包括其抗原结合片段。
在一些实施例，本公开的抗CD200R1抗体为人源化抗体。通常，将非人类抗体人源化，以减少对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包括一个或多个可变结构域，其中HVR、CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施例中，在人源化抗体中的一些FR残基被来自非人类抗体(例如CDR残基来源于其的抗体)的对应残基取代，以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在Almagro和Fransson，《生物科学前沿(Front.Biosci.)》，13:1619-1633(2008)中综述，并进一步描述于，例如，Riechmann等人，《自然》，332:323-329(1988)；Queen等人，《美国国家科学院院刊》，86:10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等人，《方法(Methods)》，36:25-34(2005)(描述SDR(a-HVR)移植)；Padlan，《分子免疫学(Mol.Immunol.)》，28:489-498(1991)(描述“表面重修”)；Dall'Acqua等人，《方法》，36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人，《方法》，36:61-68(2005)和Klimka等人，《英国癌症杂志(Br.J.Cancer)》，83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人类框架区包含但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人，《免疫学杂志》，151:2296(1993))；源自轻链或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人，《美国国家科学院院刊》，89:4285(1992)；和Presta等人，《免疫学杂志》，151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson，《生物科学前沿》，13:1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，272：10678-10684(1997)和Rosok等人，《生物化学杂志》，271:2261 1-22618(1996))。
4.人类抗体
在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体可以是人类抗体。人类抗体可以使用所属领域中已知的各种技术产生。人类抗体通常描述于van Dijk和van de Winkel，《药理学的当前观点(Curr.Opin.Pharmacol.)》，5:368-74(2001)和Lonberg，《免疫学的当前观点(Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。人类抗体可通过将免疫原施用到转基因动物来制备，所述转基因动物已经被修饰以产生完整人类抗体或具有响应抗原攻击的人类可变区的完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替代内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。关于从转基因动物中获得人类抗体的方法的综述，参见Lonberg、《自然·生物技术(Nat.Biotech.)》23:1117-1125(2005)。还参见例如、美国专利第6,075,181和6,150,584中的XENOMOUSETM技术；美国专利第5,770,429号中的
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技术；美国专利第7,041,870号中的K-M/>
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技术；和美国专利申请公开案第US 2007/0061900号中的/>
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技术。来自此类动物产生的完整抗体的人类可变区可被进一步修饰，例如，通过与不同的人类恒定区组合。
人类抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类异源骨髓瘤细胞系。参见，例如，Kozbor，《免疫学杂志》，133：3001(1984)；Brodeur等人，《单克隆抗体生产技术和应用(Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications)》，第51-63页(马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker、Inc.)，纽约，1987)；和Boerner等人，《免疫学杂志》，147：86(1991)。经由人B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体也描述于Li等人，《美国国家科学院院刊》，103:3557-3562(2006)中。额外的方法包含例如在美国专利第7,189,826号中描述的那些方法(描述了从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein、《组织学和组织病理学(Histology and Histopathology)》，20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein，《实验和临床药理学的方法和发现(Methods and Findings inExperimental and Clinical Pharmacology)》，27(3):185-91(2005)中。
人类抗体可能也可通过分离选自人源噬菌体展示库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可将此类可变结构域序列与所需人类恒定结构域组合。从抗体库中选择人类抗体的技术描述如下。
5.库来源的抗体
在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体可以通过筛选组合文库中具有期望的活性或多种活性的抗体来分离。例如，所属领域中已知多种方法用于产生噬菌体展示库和针对具有期望结合特征的抗体筛选此类库。在本文公开的实例中描述了噬菌体展示用于制备本公开的抗CD200R1抗体的人源化版本的亲和成熟变体的用途。产生此类库来源的抗体的其它方法可以发现于例如、Hoogenboom等人，《分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)》，178:1-37(O'Brien等人编辑，人类出版社(Human Press)，新泽西州托托瓦(Totowa,NJ)，2001)；McCafferty等人，《自然》，348:552-554；Clackson等人，《自然》，352:624-628(1991)；Marks等人，《分子生物学杂志》，222:581-597(1992)；Marks和Bradbury，《分子生物学方法》，248:161-175(Lo编辑，人类出版社，新泽西州托托瓦，2003)；Sidhu等人，《分子生物学杂志》，338(2):299-310(2004)；Lee等人，《分子生物学杂志》，340(5):1073-1093(2004)；Fellouse，《美国国家科学院院刊》，101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人，《免疫学方法杂志》，284(1-2)：1 19-132(2004)。
6.多特异性抗体
在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。在一些实施例中，多特异性抗体是具有至少两个不同的结合位点的单克隆抗体，每个结合位点对不同的抗原具有结合特异性，其中至少一个特异性地结合CD200R1。
在一些实施例中，多特异性抗体是包含对CD200R1的特异性和对介导免疫调节、免疫信号传导和/或在癌症或肿瘤细胞上表达的另一种抗原的特异性的双特异性抗体。在双特异性抗体的一些实施例中，其他特异性是针对抗原的，该抗原是选自以下的免疫检查点分子：PD1、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3、CRTAM、CTLA-4、BTLA、CD244、CD160、LIGHT、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD40、CD47、SIRPa、NKG2D、NKG2A、TNFRSF25、CD33、CEA、Epcam、GPC3、CD73、CD83、CD39、TRAIL、CD226和VISTA。在一些实施例中，抗CD200R1双特异性抗体、该抗体对其具有特异性的其他抗原选自PD1、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3和CRTAM。
在一些实施例中，至少一个结合位点特异性结合细胞毒性剂。在示例性的实施例中，本公开的抗CD200R1抗体是双特异性抗体并且可以用于将细胞毒性剂定位于表达CD200R1的细胞。
用于制备多特异性抗体的技术包含但不限于重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见例如Milstein和Cuello，《自然》，305：537(1983)，WO 93/08829，和Traunecker等人，EMBOJ.10：3655(1991))。“孔内旋钮”工程改造也可以用于产生可用于本公开的抗CD200R1抗体的双特异性抗体。用于孔内旋钮工程改造的技术在本领域中是已知的并且描述在例如美国专利第5,731,168号中。
多特异性抗体也可以通过以下来制备：工程改造“静电操纵”效应，该效应有利于形成Fc-异二聚体抗体分子而不是同二聚体(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利第4,676,980号，和Brennan等人，《科学(Science)》，229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人，《免疫学杂志》，148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等人，《美国国家科学院院刊》，90:6444-6448(1993))；使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如，Gruber等人，《免疫学杂志》，152:5368(1994))；或三特异性抗体(参见，例如，Tutt等人，《免疫学杂志》，147：60(1991)。
7.抗体变体
在一些实施例中，还预期了本公开的抗CD200R1抗体的变体。例如，可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰，或者通过肽合成，来制备具有改进的结合亲和力和/或抗体的其他生物学性质的抗体。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，前提是最终构建体具有期望的CD200R1抗原结合的特性。
A.取代、插入和删除变体
在一些实施例中，提供了除本文描述的那些之外具有一个或多个氨基酸取代的抗CD200R1抗体变体。诱变位点可以包括HVR和FR。典型的“保守”氨基酸取代和/或基于共同侧链类别或特性的取代在所属领域中是众所周知的，并且可以用于本公开的实施例中。本公开还考虑了基于非保守氨基酸取代的变异体，其中氨基酸侧链类别之一的成员与另一类别的氨基酸交换。
氨基酸侧链通常根据以下类别或共同性质进行分组：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Nor亮氨酸；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)链取向影响：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
用于将氨基酸取代到抗体中并随后筛选期望的功能(例如，保留的/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)的技术在本领域中是熟知的。
氨基酸取代变异体可以包括取代亲本抗体(例如，人源化或人类抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变异体的某些生物特性(例如亲和力增加、免疫原性降低)相对于亲本抗体将具有修饰，和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物特性。示例性取代变异体是亲和力成熟的抗体，所述抗体可方便地例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文实例中所描述的那些技术)产生。简单来说，使一个或多个HVR残基突变并且将变异体抗体展示在噬菌体上，并且针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
用于鉴定可以靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法是“丙氨酸扫描诱变”(参见例如，Cunningham和Wells(1989)，《科学》，244:1081-1085)。在此方法中，鉴别靶残基的残基或基团(例如带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且被中性或带负电氨基酸(例如Ala或聚丙氨酸)置换，以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可在表明对初始取代的功能灵敏性的氨基酸位置处引入其它取代。或者或另外，可以确定用于鉴别抗体与抗原之间的接触点的抗原-抗体复合物的晶体结构。此类接触残基和邻接残基可作为取代的候选物靶向或除去。可筛选变异体，以确定其是否含有所需特性。
氨基酸序列插入包括从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的长度范围内的氨基和/或羧基端融合，以及序列内部插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入型变异体包括增加抗体的血清半衰期的酶或多肽与抗体的N端或C端的融合。
取代可以在HVR中制成以提高抗体亲和力。此类改变可以在“热点”(即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基)中进行(参见，例如，Chowdhury，《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》，207:179-196(2008))，其中测试得到的变体VH或VL的结合亲和力。在一些实施例中，亲和力成熟可以通过构建二级文库并从二级文库中重新选择来进行(参见例如，在Hoogenboom等人，《分子生物学方法》，178：1-37(O'Brien等人编辑，人类出版社，新泽西州托托瓦，(2001))。另一种引入多样性的方法涉及HVR导向方法，其中几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)是随机的。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴别涉及抗原结合的HVR残基。特别是HVR-H3和HVR-L3经常成为攻击目标。
在一些实施例中，取代、插入或缺失可能发生在一或多个HVR内，只要此类改变基本上不会降低抗体结合抗原的能力。例如，可在HVR中进行基本上不会降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代)。此类改变可在HVR“热点”之外。在以上提供的变异体VH和VL序列的一些实施例中，每个HVR要么保持不变，要么含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
B.糖基化变异体
在一些实施例中，改变本公开的抗CD200R1抗体以增加或减少抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列对抗体进行糖基化位点的添加或删除，使得可以产生或去除一个或多个糖基化位点。
在抗体包含Fc区的实施例中，连接到Fc区的碳水化合物可以改变。通常，由哺乳动物细胞产生的天然抗体包括通过N键连接到Fc区的CH2结构域的大约位置297(“N297”)处的天冬酰胺的分支双触角寡糖(参见，例如，Wright等人，TIBTECH 15:26-32(1997))。寡糖可包括各种碳水化合物，如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接到双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，抗体的Fc区的寡糖的修饰可以产生具有某些改进的特性的变异体。
在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体可以是亲本抗体的变体，其中所述变体包括缺乏与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可为约1％至约80％、约1％至约65％、约5％至约65％或约20％至约40％。相对于如通过MALDI-TOF质谱法测量的与Asn 297连接的所有糖结构的总和(例如，复合物、杂种和高甘露糖结构)，通过计算N297处糖链中岩藻糖的平均量可以确定岩藻糖的量(参见例如WO2008/077546)。N297是指位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，由于抗体中的微小序列变异，N297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即位置294和300之间。
在一些实施例中，岩藻糖基化变异体可以具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公开案第US 2003/0157108或US 2004/0093621号。“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷”抗体的实例以及用于制备它们的相关方法公开于US2003/0157108；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2000/61739；WO2001/29246；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，《分子生物学杂志》，336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，《生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng.)》，87:614(2004)。
可用于产生去岩藻糖基化抗体的细胞系包含缺乏蛋白质岩藻糖基化的Led 3CHO细胞(参见例如Ripka等人，《生物化学和生物物理学档案(Arch.Biochem.Biophys.)》，249:533-545(1986)；US2003/0157108和WO2004/056312)，以及敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，《生物技术和生物工程》，87：614(2004)；Kanda,Y.等人，《生物技术和生物工程》，94(4)：680-688(2006)；和WO2003/085107)。
C.Fc区变异体
在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体可以在Fc区中包括一个或多个氨基酸修饰(即，Fc区变体)。Fc区变异体可包含在一个或多个氨基酸残基位置处包含氨基酸取代的人类Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。下文描述了本领域已知的可用于本公开的抗CD200R1抗体的宽范围的Fc区变体。
在一些实施例中，抗CD200R1抗体可以是具有改变的效应子功能的Fc区变体。在一些实施例中，具有改变的效应子功能的抗体可以具有亲本抗体的一些(但不是全部)效应子功能、降低的效应子功能或没有效应子功能(例如，无效应子)。对于其中效应子功能(如ADCC)是不必要或有害的和/或抗体的体内半衰期很重要的某些应用，可能更需要无效应子的Fc区变体。
具有降低的效应子功能或无效应子的Fc区变异体抗体可以包括在以下Fc区一个或多个位置处的氨基酸取代：238、265、269、270、297、327和329。(参见例如、美国专利第6,737,056号)。此类Fc区变异体可以在位置265、269、270、297和327处的两个或更多个处包括氨基酸取代。此类Fc区变异体还可以包括将残基265和297替换为丙氨酸(参见例如美国专利第7,332,581号)。在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体是无效子的Fc区变体。在一些实施例中，抗CD200R1抗体的无效子Fc区变体包括一个或多个选自以下的氨基酸取代：N297G(参见例如，Shields，R.等人，“用于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的人IgG1上结合位点的高分辨率绘图和具有改善的与FcγR*结合的IgG1变体的设计(High ResolutionMapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI、FcγRII、FcγRIII andFcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR*)”，《生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)》，276(9):6591-6604(2001)；N297A(参见，例如，Friend，P.J.等人，“肾移植排斥中工程改造的糖基化人源化CD3抗体的I期研究(“Phase I Study of an Engineered Aglycosylated Humanized CD3 Antibody inRenal Transplant Rejection)”，《移植(Transplantation)》，68(11):1632-7(1999))；P331S/K322A(参见，例如，Tawara，T.等人，“补体活化在猴子和大鼠中抗体诱导的输注毒性中起关键作用(Complement Activation Plays a Key Role in Antibody-InducedInfusion Toxicity in Monkeys and Rats)”，《免疫学杂志》，180(4):2294-8(2008))；S228P/L235E(参见，例如，Newman，R.等人，“针对人CD4的灵长类化IgG抗体的Fc区的修饰保留了其调节CD4受体的能力，但不耗尽黑猩猩中的CD4(+)T细胞(Modification of the FcRegion of a Primatized IgG Antibody to Human CD4 Retains Its Ability toModulate CD4 Receptors but Does Not Deplete CD4(+)T Cells iN Chimpanzees)”，《临床免疫学(Clin Immunol)》，98(2):164-74(2001)；或L234A/L235A/P329G(也被称为“LALAPG”)(参见，例如，Schlothauer，T.等人，“具有完全消除的免疫效应子功能的新型人IgG1和IgG4 Fc工程改造的抗体(Novel human IgG1 and IgG4 Fc-engineeredantibodies with completely abolished immune effector functions)”，《蛋白质工程设计与选择(Protein Eng.Des.Sel.)》，29(10)：457–466(2016)；Lo,M.等人，“维持抗体稳定性和降低小鼠毒性的效应子减弱取代(Effector-attenuating Substitutions ThatMaintain Antibody Stability and Reduce Toxicity in Mice)”，《生物化学杂志》，292(9):3900-3908(2017)。在其他实施例中，抗CD200R1抗体的无效应子Fc区变体包括氨基酸取代L234A/L235A(“LALA”)(Woodle,E.Steve等人，《移植》，68(5):608-616(1999))。
因此，在一些实施例中，抗CD200R1抗体的无效应子Fc区变体包括一个或多个选自N297A或N297G的氨基酸取代。在一些实施例中，抗CD200R1抗体的无效应子Fc区变体包括一对氨基酸取代P331S/K322A。在其他实施例中，抗CD200R1抗体的无效应子Fc区变体包括氨基酸取代L234A/L235A(LALA)或L234A/L235A/P329G(LALAPG)。在一些实施例中，其中抗CD200R1具有同种型IgG2或IgG4，抗CD200R1抗体包括氨基酸取代S228P和/或L235E。
具有改善的或减少的与FcR结合的Fc区变体公开于例如美国专利第6,737,056号；WO2004/056312；和Shields等人，《生物化学杂志》，9(2)：6591-6604(2001)中。具有改进的ADCC的Fc区变异体可以在例如Fc区的位置298、333和/或334处(基于EU编号)包含一个或多个氨基酸取代。具有改变的(即，改善的或减少的)Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的Fc区变体，如在例如美国专利第6,194,551号，WO99/51642和Idusogie等人，《免疫学杂志》，164：4178-4184(2000)中所述。在例如US2005/0014934A1(Hinton等人)中公开了具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的Fc区变体。此类Fc区变异体在以下一个或多个位置处包含氨基酸取代：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380，382、413、424和434。具有增加的半衰期的其他Fc区变体包含在例如US 7658921B2(Dall'Acqua等人)中所述的位置252、254和256处的一组YTE突变(即，M252Y/S254T/T256E)。Fc区变异体的其它实例可以在例如美国专利第5,648,260号和5,624,821；和WO94/29351中找到。
通常，可以进行体外和/或体内细胞毒性分析，以证实Fc区变异体中CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合分析，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞、NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利第5,500,362号(参见，例如，Hellstrom等人，《美国国家科学院院刊》，83:7059-7063(1986))和Hellstrom等人，《美国国家科学院院刊》，82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》，166:1351-1361(1987))。或者，可采用非放射性分析方法(参见例如、用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(加利福尼亚州山景城的细胞科技公司；和
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非放射性细胞毒性分析(美国威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司)。用于此类分析的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外，感兴趣的分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在动物模型中评估，如在Clynes等人，《美国国家科学院院刊》，95:652-656(1998)中公开的。还可进行Clq结合分析，以证实抗体不能够结合Clq并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中结合ELISA的Clq和C3c。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，《免疫学方法杂志》，202：163(1996)；Cragg、M.S.等人，《血液(Blood)》，101：1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,SW 103:2738-2743(2004))。可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期确定(参见例如Petkova等人，《国际免疫学(Intl.Immunol.)》，18(12)：1759-1769(2006))。
D.半胱氨酸工程改造的抗体变体
在一些实施例中，预期本文所述的抗CD200R1抗体可以在特定的非HVR位置被半胱氨酸残基取代以便产生反应性硫醇基团。如本文其它地方所描述，此类工程改造的“thioMAb”可以用于将抗体缀合到例如药物部分或接头-药物部分，从而产生免疫缀合物。半胱氨酸工程改造的抗体可以如例如美国专利第7,521,541号中所描述产生。在一些实施例中，以下抗体残基中的任一个或多个可以由半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。
E.抗体衍生物
在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体可以用非蛋白质部分进一步修饰(即衍生化)。适用于抗体衍生的非蛋白质部分包括(但不限于)水溶性聚合物，如：聚乙二醇(PEG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸均聚物或无规共聚物和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇和其混合物。在一些实施例中，抗体的修饰可以使用甲氧基-聚乙二醇丙醛进行。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支化的或非支化的。与抗体连接的聚合物的数量可变化，并且如果连接超过一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常来说，用于衍生作用的聚合物的数目和/或类型可以基于包括(但不限于)以下的考虑因素确定：抗体的具体特性或功能，例如抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
8.免疫缀合物
在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体也可以是免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包括缀合至一种或多种细胞毒性剂的抗CD200R1抗体。本公开考虑的合适的细胞毒性剂包括化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一些实施例，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中如本文所述的抗CD200R1抗体与一种或多种药物缀合。
在一些实施例中，本公开的免疫缀合物包括如本文所述的抗CD200R1抗体，其与用于治疗CD200R1介导的疾病或病状的药物或治疗剂缀合。
在一些在实施例中，如本文所述的抗CD200R1抗体可以缀合至酶促活性的毒素或其片段，包含但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。
在一些实施例中，本公开的免疫缀合物包括如本文所述的与放射性同位素(即放射性缀合物)缀合的抗CD200R1抗体。多种放射性同位素可用于生产此类放射性缀合物。实例包含但不限于64Cu、89Zr、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb和Lu的放射性同位素。在一些实施例中，放射性同位素可以是或包括18F，FDG。在一些实施例中，免疫缀合物可包含用于闪烁显像检测的放射性同位素，或用于NMR检测或MRI的自旋标记。合适的放射性同位素或自旋标记可以包括如123I、131I、111In、13C、19F、15N、17O、Gd、Mn和Fe的各种同位素。
抗CD200R1抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物可以使用多种熟知的适合于与蛋白质缀合的双功能l试剂和化学物质来制备。此类试剂包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如己二酸二甲酯HQ)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双-(对叠氮基苯甲酰基)-己二胺)、双-重氮衍生物(例如，双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯-2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
用于制备本公开的免疫缀合物的试剂还可包括可商购的“交联”试剂如：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB，和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)(参见例如、美国伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物技术有限公司)。
9.合成抗体
在一些实施例中，本公开的抗CD200R1抗体可以是合成抗体，其包括一组来自抗CD200R1免疫球蛋白(例如，HVR-L1等)的CDR或HVR，所述抗CD200R1免疫球蛋白被移植到除免疫球蛋白支架或框架之外的支架或框架上，例如替代的蛋白质支架或人工聚合物支架。
预期用于制备本公开的合成抗体的示例性替代蛋白质支架可以包含但不限于:纤连蛋白、新制癌菌素CBM4-2、脂质运载蛋白、T细胞受体、蛋白质-A结构域(蛋白质Z)、Im9、TPR蛋白质、锌指结构域、pVIII、禽胰多肽、GCN4、WW结构域Src同源结构域3、PDZ结构域、TEM-1β-内酰胺酶、硫氧还蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD-fmger结构域、CL-2、BPTI、APPI、HPSTI、大肠杆菌素、LACI-D1、LDTI、MTI-II、蝎毒素、昆虫防御素-A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、细胞色素b-562、Ldl受体结构域、γ-晶体蛋白、泛蛋白、转铁蛋白和/或C-型凝集素样结构域。
可用于合成抗体的示例性人工聚合物(非蛋白质)支架描述于例如，Fiedler等人,(2014)“作为替代治疗剂的非抗体支架(Non-Antibody Scaffolds as AlternativeTherapeutic Agents)”，载于治疗抗体手册(Handbook of Therapeutic Antibodies)(S.Dübel和JM Reichert编辑)，Wiley-VCH出版社有限公司(Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.)；Gebauer等人，《化学生物学当前观点(Curr.Opin.Chem.Biol)》，13:245-255(2009)；Binz等人，《自然生物技术(Nat.Biotech.)》，23(10):1257-1268(2005)。
IV.重组方法和组合物
本公开的抗CD200R1抗体可以使用抗体生产领域中熟知的重组方法和材料来生产。在一些实施例中，本公开提供了一种编码抗CD200R1抗体的分离的核酸。核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在一些实施例中，提供了包括编码本公开的抗CD200R1抗体的核酸序列的一种或多种载体(例如，表达载体)。在一些实施例中，提供了一种包括编码本公开的抗CD200R1抗体的核酸序列的宿主细胞。在一个实施例中，宿主细胞已经用包含核酸的载体转化，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列。在另一个实施例中，宿主细胞已经用第一载体和第二载体转化，所述第一载体包含核酸，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，所述第二载体包含核酸，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。
在一些重组方法的实施例中，所使用的宿主细胞是真核细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20)。在至少一个实施例中，提供了一种制备抗CD200R1抗体的方法，其中所述方法包括在适合于抗体表达的条件下培养包括编码如上所提供的抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
简要地，抗CD200R1抗体的重组生产通过分离编码抗体(例如，如本文所述)的核酸并将该核酸插入到一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达来进行。使用本领域熟知的常规程序(例如，通过使用能够特异性地结合至编码期望的抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此类核酸。用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞和培养方法是本领域熟知的并且包含原核或真核细胞。通常，在表达之后，抗体可以可溶部分从细胞糊中分离，并且进一步纯化。除了原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是用于编码抗体的载体的合适克的隆或表达宿主，所述载体包含其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体(参见例如，Gerngross，《自然生物技术》，22:1409-1414(2004)和Li等人，《自然生物技术》，24:210-215(2006))。
合适的用于表达本公开的糖基化抗CD200R1抗体的宿主细胞也可以来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴别出许多杆状病毒菌株，其可与昆虫细胞结合使用，确切地说，用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可以用作宿主(参见例如、美国专利第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号和第7,125,978号。
可用于产生本公开的抗CD200R1抗体的哺乳动物宿主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包含DHFR-CHO细胞(参见，例如，Urlaub等人，《美国国家科学院院刊》，77:4216(1980))；骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0；由SV40(COS-7)转化的猴肾CVl细胞系:人胚胎肾系(293或293细胞，如例如在Graham等人，《普通病毒学杂志(J.Gen Virol.)》，36:59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持细胞(TM4细胞，如在例如Mather，《生物学报告(Biol.Reprod.)》，23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TR1细胞(参见例如，在Mather等人，《纽约科学院年鉴(Annals N Y.Acad.Sci.)》，383:44-68(1982)和US 6,235,498中)；医学研究委员会5(MRC 5)细胞(如例如可从ATCC获得的细胞，并且也被称为CCL-171)；和Foreskin 4(FS-4)细胞(参见例如Vilcek等人，《纽约科学院年鉴》，284:703-710(1977)，Gardner&Vilcek.《普通病毒学杂志》，44:161-168(1979)和Pang等人，《美国国家科学院院刊》，77:5341-5345(1980))。对于适合于抗体生产的有用哺乳动物宿主细胞系的一般综述，参见例如Yazaki和Wu，《分子生物学方法》，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana出版社，新泽西州托托瓦)，第255-268页(2003)。
V.抗CD200R1抗体的药物组合物和配方
本公开还提供了包括抗CD200R1抗体的药物组合物和药物配方。在一些实施例中，本公开提供了一种药物配方，其包括如本文所述的抗CD200R1抗体和药学上可接受的载剂。在一些实施例中，抗CD200R1抗体是药物组合物的唯一活性剂。此类药物配方可以通过将具有期望的纯度的抗CD200R1抗体与一种或多种药学上可接受的载剂混合来制备。通常，此类抗体调配物可以制备成水溶液(参见例如美国专利第6,171,586号和WO2006/044908)或冻干调配物(参见例如美国专利第6,267,958号)。
药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下通常对受体无毒。广泛范围的此类药学上可接受的载剂在所属领域中是众所周知的(参见例如《雷明顿药物科学第16版(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition)》，Osol,A.编)(1980))。用于本公开的调配物的示例性药学上可接受的载剂可以包括但不限于：缓冲剂(如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸)；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂(如EDTA)；糖(如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)；成盐抗衡离子(如钠)；金属复合物(例如锌蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂(如聚乙二醇(PEG))。
用于本公开的调配物中的药学上可接受的载剂还可以包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)(参见例如美国专利公开案第2005/0260186和2006/0104968)，如人类可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白(例如rHuPH20或
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百特国际有限公司(Baxter International、Inc.)。
还预期本文公开的配方可以含有除抗-CD200R1之外的活性成分，如对于在施用该配方的受试者中正在治疗的特定适应症所必需的。优选地，任何额外的活性成分具有与抗CD200R1抗体活性互补的活性并且这些活性不相互不利地影响。
在一些实施例中，药物组合物包括抗CD200R1抗体和额外的活性剂，如但不限于检查点抑制剂。可用于此类实施例的检查点抑制剂包含但不限于包括对作为免疫检查点分子的抗原的特异性的第二抗体。在一些实施例中，第二抗体包括对选自PD1、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3、CRTAM、CTLA-4、BTLA、CD244、CD160、LIGHT、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD40、CD47、SIRPa、NKG2D、NKG2A、TNFRSF25、CD33、CEA、Epcam、GPC3、CD200、CD200R1、CD73、CD83、CD39、TRAIL、CD226和VISTA的免疫检查点分子的特异性。
在至少一个实施例中，药物组合物包括抗CD200R1抗体和额外的活性剂，其中额外的活性剂是包括对选自PD1、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3和CRTAM的免疫检查点分子的特异性的抗体。
在至少一个实施例中，所述药物组合物包括抗CD200R1抗体和额外的活性剂，其中所述额外的活性剂是包括对免疫检查点分子PD1的特异性的抗体。可用于本文公开的药物组合物实施方案的包括对PD1的特异性的示例性抗体包含但不限于多塔利单抗(dostarlimab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)和匹地利珠单抗(pidilizumab)。
活性成分可以被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或巨乳液中。此类技术公开于《雷明顿的药物科学第16版》、Osol,A.编(1980)。
在一些实施例中，调配物可以是抗体和/或其它活性成分的缓释配方。缓释配方的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质是成形制品，例如膜或微胶囊形式。
通常，待施用至受试者的本公开的调配物是无菌的。可使用众所周知的技术轻易地制备无菌调配物，例如通过无菌滤膜过滤。
IV.治疗的用途和方法
预期包括本公开的抗CD200R1抗体的组合物或配方中的任何一种可以用于任何方法或用途，如用于利用其特异性地结合至CD200R1的能力从而抑制、降低和/或完全阻断CD200R1作为参与免疫调节或信号传导的细胞表面受体的功能，特别是CD200R1在负调节(或抑制)T细胞或NK细胞活化中的功能的治疗方法。
细胞表面糖蛋白CD200是CD200R1的天然结合靶标。然而，CD200在包含神经元、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和淋巴细胞在内的多种人类细胞上更广泛地表达，并且已经发现CD200R1与其配体CD200的结合发出免疫抑制活性的信号。因此，预期抗CD200R1抗体可以用于涉及抑制、降低和/或完全阻断CD200R1与CD200的特异性结合的治疗方法。
通过抑制、降低和/或完全阻断CD200R1的免疫调节和/或免疫信号传导活性，特别是CD200R1对淋巴细胞活化的免疫抑制作用，可以潜在地治疗一系列疾病、病症和病状。疾病、病症和病状的范围包含但不限于癌症。
例如，阻断某些蛋白质(例如，PD1)的免疫抑制作用的药剂目前正在开发中，以治疗宽范围的癌症，包含肾上腺癌、膀胱癌、肉瘤、微卫星不稳定性高(MSI-H)癌症(包含实体MSI癌)、TMB(肿瘤突变负荷)高肿瘤、错配修复缺陷(dMMR)癌症、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、EGJ腺癌、食道癌、胆囊癌、胃癌(例如，胃肠道类癌(GI类癌))、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤(例如胸膜间皮瘤)、非小细胞肺癌、卵巢癌、上皮性卵巢癌、子宫内膜癌、儿童实体癌、胰腺癌、前列腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌(例如甲状腺髓样癌或滤泡状甲状腺癌)、血癌(例如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肾细胞癌、透明细胞肾癌、神经内分泌肿瘤(例如恶性嗜铬细胞瘤和副神经节瘤)和子宫癌。在一些实施例中，癌症选自肺癌(例如小细胞肺癌)、皮肤癌(例如黑色素瘤)、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、间皮瘤和膀胱癌。因此，预期包括本公开的抗CD200R1抗体的组合物或配方中的任何一种可以用于治疗上述癌症中的任何一种的方法或用途。在一些实施例中，癌症选自肺癌(例如小细胞肺癌)、皮肤癌(例如黑色素瘤)、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、间皮瘤和膀胱癌。在一些实施例中，本公开提供了一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗CD200R1抗体或向受试者施用治疗有效量的包括本公开的抗CD200R1抗体和药学上可接受的载剂的药物组合物。
如本文所公开，包含在以下实例中，本公开的抗CD200R1抗体具有降低、抑制和/或阻断CD200R1与CD200结合的能力，从而改变免疫抑制信号通路。因此，在一些实施例中，本公开提供了一种在受试者中治疗CD200R1介导的疾病或病状的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗CD200R1抗体或向有此需要的受试者施用治疗有效量的包括本公开的抗CD200R1抗体和药学上可接受的载剂的药物组合物。类似地，在一些实施例中，本公开提供了一种在受试者中治疗通过与细胞上表达的CD200结合介导的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的抗CD200R1抗体或向有此需要的受试者施用治疗有效量的包括本公开的抗CD200R1抗体和药学上可接受的载剂的药物组合物。
治疗有效量的药物组合物可以包括至少约1mg/kg的抗CD200R1抗体或至少约10mg/kg的抗CD200R1抗体。治疗有效量的药物组合物可以包括至少约2mg/kg的抗CD200R1抗体或至少约20mg/kg的抗CD200R1抗体。治疗有效量的药物组合物可以包括至少约0.3mg的抗CD200R1抗体、至少约1.0mg的抗CD200R1抗体、至少约3.0mg的抗CD200R1抗体、至少约10mg的抗CD200R1抗体，至少约30mg的抗CD200R1抗体，至少约100mg的抗CD200R1抗体，至少约300mg的抗CD200R1抗体，至少约900mg的抗CD200R1抗体，或至少约1400mg的抗CD200R1抗体。治疗有效量的药物组合物可以包括至少约10mg/kg的抗CD200R1抗体、至少约20mg/kg的抗CD200R1抗体或至少约100mg/kg的抗CD200R1抗体。在一些实施例中，治疗有效量的药物组合物可以包括在任意两个上述值之间的范围内的量的抗CD200R1抗体。
在一些实施例中，治疗有效量的药物组合物不会引起显著的脱靶标效应。例如，在一些情况下，在不超过10mg/kg的剂量下，抗CD200R1抗体可以没有显著的脱靶标效应。作为另一实例，在一些情况下，在不超过20mg/kg的剂量下，或在不超过100mg/kg的剂量下，抗CD200R1抗体可以没有显著的脱靶标效应。在一些实施例中，脱靶标效应可以包含在人体组织中的非特异性结合(例如，如通过BV ELISA测量的)或交叉反应性。在一些药物组合物中，在本文提供的另一种治疗有效量下，或在本文提供的任何两种治疗有效量的范围内，抗CD200R1抗体可以没有显著的脱靶标效应。
根据治疗的方法施用抗CD200R1抗体、组合物或药物配方提供抗体诱导的治疗效果，其保护受试者免受CD200R1介导的疾病和/或在受试者中治疗CD200R1介导的疾病的进展。在一些实施例中，治疗的方法可以进一步包括施用本领域技术人员已知的一种或多种额外的治疗剂或治疗以预防和/或治疗CD200R1介导的疾病或病状。包含施用一种或多种额外药剂的此类方法可以涵盖组合施用(其中在相同或单独的调配物中包括两种或更多种治疗剂)和单独施用，在这种情况下，抗体组合物或调配物的施用可以先于、同时和/或在施用额外治疗剂之后。
在本公开的治疗的方法的一些实施例中，抗CD200R1抗体或包括抗CD200R1抗体的药物配方通过全身递送药剂的任何施用模式被施用于受试者，或施用于期望的靶组织。全身施用通常是指将抗体在除直接进入期望靶位点、组织或器官之外的位点施用到受试者的任何方式，使得抗体或其调配物进入受试者的循环系统，并且因此经历代谢和其它类似过程。
因此，在本公开的治疗方法中有用的施用方式可以包括但不限于注射、输注、滴注和吸入。通过注射施用可以包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。
在一些实施例中，抗CD200R1抗体的药物配方被配制使得抗体在肠道中免受失活。因此，治疗方法可以包含口服调配物。
在一些实施例中，还提供了包括本公开的抗CD200R1抗体的组合物或配方作为药物的用途。此外，在一些实施例中，本公开还提供了包括抗CD200R1抗体的组合物或配方在制造或制备药物，特别是用于治疗、预防或抑制CD200R1介导的疾病的药物中的用途。在另外的实施例中，药物用于治疗、预防或抑制CD200R1介导的疾病的方法中，该方法包括向患有CD200R1介导的疾病的个体施用有效量的药物。在某些实施例中，药物进一步包括有效量的至少一种额外治疗剂或治疗。可以用于此类药物的示例性额外的治疗剂或治疗可以包含但不限于包括对免疫检查点分子的特异性的抗体，所述免疫检查点分子如PD1、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3、CRTAM、CTLA-4、BTLA、CD244、CD160、LIGHT、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD40、CD47、SIRPa、NKG2D、NKG2A、TNFRSF25、CD33、CEA、Epcam、GPC3、CD73、CD83、CD39、TRAIL、CD226和VISTA。在至少一个实施例中，存在于本公开的药物中的额外的治疗剂或治疗是包括对免疫检查点分子PD1的特异性的抗体，包含但不限于选自多塔利单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗和匹地利珠单抗的抗体。
在另外的实施例中，所述药物用于在受试者中治疗、抑制或预防CD200R1介导的的疾病，包括向所述受试者施用有效量的药物以治疗、抑制或预防CD200R1介导的疾病。
为了预防或治疗CD200R1介导的疾病或病状，在本公开的组合物和配方中含有的抗CD200R1抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种额外的治疗剂组合使用时)将取决于所治疗的具体疾病或病状、疾病的严重程度和病程、施用抗体是用于预防还是治疗目的、先前对患者施用的疗法、患者的临床病史和对抗体的应答以及主治医师的判断。包含在本文所述的组合物和配方中的抗CD200R1抗体可以一次或在一系列治疗中适当地施用于患者。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各种时间点团注上的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
取决于疾病的类型和严重程度，本公开的配方中约1μg/kg至20mg/kg的抗CD200R1抗体是用于施用于人类受试者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次单独施用，还是通过连续输注。通常，抗体的施用的剂量可以在约0.05mg/kg至约20mg/kg的范围内。在一些实施例中，约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或任意两个前述值(或其任意组合)之间的范围的一个或多个剂量可以被施用于人类受试者。在一些实施例中，施用于人类受试者的剂量可以大于约20mg/kg。
在一些实施例中，可以将治疗有效量施用于受试者，例如人类受试者。治疗有效量可以是至少约1mg/kg、至少约10mg/kg、至少约在约1mg/kg和约10mg/kg之间的剂量。治疗有效量可以是至少约2mg/kg、至少约20mg/kg、或至少约在约2mg/kg和约20mg/kg之间的剂量。治疗有效量可以是至少约0.3mg、至少约1.0mg、至少约3.0mg、至少约10mg、至少约30mg、至少约100mg、至少约300mg、至少约900mg，至少约1400mg/kg，或至少约在任意两个上述值之间的范围内的剂量。治疗有效量可以是至少约10mg/kg、至少约20mg/kg、至少约100mg/kg，或至少约在任何两个上述值之间的范围内的剂量。
剂量施用可以维持几天或更长时间，这取决于受试者的状况，例如，施用可以持续直到CD200R1介导的疾病被充分治疗，如通过本领域已知的方法所确定的。在一些实施例中，可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量(例如，一个或多个维持剂量)。然而，其它剂量给药方案可以是有用的。剂量施用的治疗作用的进展可以通过常规技术和分析进行监测。
因此，在本公开的方法的一些实施例中，抗CD200R1抗体的施用包括约1mg/kg至约100mg/kg的日剂量。在一些实施例中，抗CD200R1抗体的剂量包括至少约1mg/kg、至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约20mg/kg或至少约30mg/kg的日剂量。
实例
本公开的各种特征和实施例在以下代表性实例中说明，所述代表性实例意图是说明性的而并非限制性的。所属领域的技术人员将容易地了解，这些具体实例仅是对本发明的说明，如在随后的权利要求中更充分地描述。本申请中所描述的每个实施例和特征应理解为可与其内所含有的每个实施例互换和组合的。
实例1：CD200R1多肽的产生
本实例说明了在引发和筛选本公开的抗CD200R1抗体中用作抗原的各种CD200R1多肽构建体的制备。
A.CD200R1生产
将四种hu-CD200R1同工型的胞外结构域，hu-CD200R1-iso4-Alt(SEQ ID NO:1)、hu-CD200R1-iso4-Ref(SEQ ID NO:2)、hu-CD200R1-iso1-Alt(SEQ ID NO:3)、hu-CD200R1-iso1-Ref(SEQ ID NO:4)，以及食蟹猴CD200R1(SEQ ID NO:5)和恒河猴CD200R1(SEQ IDNO:6)的类似胞外结构域区段克隆到带有CMV启动子的哺乳动物表达载体中以用于表达。构建体含有C末端纯化标签GGGSGLNDIFEAQKIEWHEGSGGHHHH HHHH(SEQ ID NO:90)和N末端小鼠IgG1重链分泌信号MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:91)。重组CD200R1多肽使用Expi293系统(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA,USA))按照标准说明书进行表达。通过以300g离心来澄清上清液培养基，随后用0.22微米过滤器过滤。使用连接到Akta纯化器系统(通用电气医疗)的Histrap FF柱(通用电气医疗，美国伊利诺伊州芝加哥(Chicago、IL、USA))通过固定化金属亲和色谱法从过滤介质中纯化重组CD200R1。Histrap柱的洗脱液在1x PBS缓冲液中通过尺寸排阻色谱法被进一步纯化，其中Superdex 200连接到Akta纯化器系统(通用电气医疗)。将纯化的蛋白质的主要级分浓缩并通过0.22微米过滤器过滤。
B.CD200生产
将人CD200(SEQ ID NO:7)和食蟹猴CD200(SEQ ID NO:8)的胞外结构域克隆到具有CMV启动子的哺乳动物表达载体中以用于表达。构建体含有N-末端小鼠IgG1重链分泌信号(SEQ ID NO:91)和具有N297G突变的C-末端人IgG片段可结晶(Fc)区(SEQ ID NO:9)。CD200-Fc多肽使用Expi293系统(赛默飞世尔科技公司)按照标准说明书进行表达。通过以300g离心来澄清上清液培养基，随后用0.22微米过滤器过滤。重组CD200-Fc通过亲和色谱法从过滤的介质中纯化，其中MabSelect SuRe柱(通用电气医疗)连接到Akta纯化器系统(通用电气医疗)。用100mM柠檬酸钠，pH 3.0从MabSelect SuRe至洗脱纯化的CD200-Fc，并立即用100mM Tris pH8.8中和。MabSelect SuRe的洗脱液在1x PBS缓冲液中通过尺寸排阻色谱法进一步纯化，其中Superdex 200连接到Akta纯化器系统(通用电气医疗)。将纯化的蛋白质的主要级分浓缩并通过0.22微米过滤器过滤。
实例2：使用杂交瘤方法产生抗CD200R1抗体、筛选和表征
本实例举例说明了使用小鼠杂交瘤技术来产生抗CD200R1抗体的方法，以及筛选和选择抗体以用于进一步表征的方法。
A.免疫接种运动
用内部生产的hu-CD200R1-iso4-Alt多肽(SEQ ID NO:1)和hu-CD200R1-iso4-Ref单倍型多肽(SEQ ID NO:2)的重组胞外结构域对BalbC(对于22.1)或Swiss Webster小鼠(对于10F6)进行免疫。Sigma佐剂系统(Millipore Sigma St.Louis,MO)用于所有免疫接种。如下所描述通过ELISA确定滴度。基于其滴度而选择的小鼠在没有佐剂的情况下进行最终的融合前增强。一天后，收获脾脏并根据标准方案进行处理。使用PEG并遵循标准方案将脾细胞与骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653细胞(美国典型培养物保藏中心CRL 1580)融合，并使用标准技术以大约50,000个骨髓瘤细胞/孔接种到96孔板中，以将所得集落的克隆性最大化。使用补充有AH(重氮丝氨酸+次黄嘌呤)的选择培养基选择亲本杂交瘤。
B.杂交瘤上清液的ELISA筛选
在培养12至14天后，收集上清液并通过ELISA用包被有人CD200R1的96孔板进行初步筛选。96孔
Figure BDA0003968761560000561
平底板(赛默飞世尔科技公司，目录号439454)在4℃下用50μl/孔的蛋白质在包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6或磷酸盐缓冲盐水，PBS)中以1μg/mL的浓度包被过夜。在去除包被溶液后，通过加入200μL的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4(ELISA稀释剂)中含有1％牛血清白蛋白(BSA)的测定/阻断溶液，并在室温下温育1小时，来阻断非特异性结合。
C.杂交瘤测序
在T75烧瓶中，在标准杂交瘤培养基(DMEM/F12，10％ FBS，1％ Glutamax，1％pen/strep)中，在7-10天内将单克隆抗CD200R1杂交瘤细胞株生长至1-3X105的密度，其中存活率>80％。来自培养物的1-3百万个细胞在15ml falcon管中以300g沉淀5分钟。通过在5ml冰冷的PBS中重悬细胞来洗涤沉淀的细胞。除去PBS并将细胞重新悬浮在1ml的TRIZOL试剂(Life Technologies)中。使裂解物穿过带有20G1规格针(BD 305175)的1ml注射器20次以确保细胞的裂解。TRIZOL/细胞悬浮液立即在干冰上冷冻并储存在-80℃直到加工。
使用Direct-zol RNA Miniprep Plus试剂盒(Zymo Research)从裂解物中分离总RNA，并使用SMARTer RACE 5'试剂盒(Takara)，将5ug的总RNA用于生成5'-RACE-ready杂交瘤cDNA。为了从cDNA中扩增重链和轻链特异性基因片段，在5'-RACE PCR反应中，将下列引物与试剂盒中提供的通用引物结合使用：
(a)小鼠VH家族特异性可变区引物TCTTGTCCACCTTGGTGCTGCTGGCCGG(SEQ ID NO:92)、TTTGTCCACCGTGGTGCTGCTGGCTGGT(SEQ ID NO:93)；
(b)小鼠Vkappa家族特异性可变区引物:GATCAGTCCAACTGTTCAGGACGCC(SEQ IDNO:94)；或
(c)小鼠Vlambda家族特异性可变区引物:ACACTCAGCACGGGACAAACTCTTCTCCACAGT(SEQ ID NO:95)、ACACTCTGCAGGAGACAGACTCTTTTCCACAGT(SEQ ID NO:96)、ACACTCAGCACGGGACAAACTCTTCTCCACATG(SEQ ID NO:97)。
使用In-Fusion克隆试剂盒(Takara)纯化PCR产物并克隆到pRACE中，并使用带有M13正向和M13反向引物的桑格测序仪对两条链进行测序。在表2中总结了七种抗CD200R1杂交瘤(10F6、9B8、5D1、10A2、1F3、11E4、22.1)的VL结构域、VH结构域和高变区(HVR)序列。为图1A中的VL结构域和图1B中的VH结构域提供了10F6、9B8、5D1、10A2、1F3、11E4、22.1和商品抗体OX108的序列比对。
D.10F6和22.1的人性化
将鼠10F6抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列与人种系抗体序列进行比对，并且人种系κ轻链(Gene ID:IGKJ4.02)和人种系重链(Gene ID:IGHJ4.03)被鉴定为最接近的人类框架(图2中显示的比对)。将鼠10F6轻链和重链的互补决定区(CDR)分别移植到已鉴定的最接近的人类框架中以产生人源化抗体克隆。在该过程中，鼠10F6 VL的CDR-L1中的位置24-34、CDR-L2中的位置50-56和CDR-L3中的位置89-97被移植到人κ轻链框架受体上，并且鼠10F6 VH的CDR-H1中的位置31-35、CDR-H2中的位置50-61和CDR-H3中的位置93-102被移植到人重链框架受体上。10F6的人源化版本“h10F6”的所得VH结构域、VL结构域和HVR序列总结在表3中。h10F6的全长重链和轻链序列也在表3中提供。类似地对22.1抗体进行人源化以提供h22.1抗体。h22.1的相关序列也总结在表3中。
E.h10F6和h22.1的表达和纯化
合成人源化10F6(h10F6)和人源化22.1的重链和轻链可变结构域并克隆到pRK质粒中。根据提供的说明，使用Expi293F表达系统(Life Technologies)进行重组人源化10F6IgG和22.1IgG的表达。转染反应的重链和轻链质粒比例保持在1:1，并且转染细胞在收获前培养6天。使用以下方案纯化重组IgG分子。通过以300g离心10分钟以去除细胞并通过用0.22微米过滤器过滤来澄清上清液培养基。澄清的上清液培养基与用PBS缓冲液平衡的POROS MabCapture A树脂(赛默飞世尔科技公司)混合，并在室温下在轻轻旋转下温育1.5小时。在温育后，将浆液装入柱中，并且用20柱体积的含有0.5M NaCl的PBS缓冲液洗涤树脂，然后用3柱体积的0.1M乙酸、0.15M NaCl洗脱。用1M MOPS、pH7.0将洗脱液快速中和至pH5.2，并用PD-10柱(通用电气医疗(GE Healthcare))将缓冲液更换为PBS缓冲液。
实例3：抗CD200R1抗体的结合亲和力、表位作图和阻断能力
本实例说明了实例1和2中制备的抗CD200R1抗体的结合和表位特征的研究。
A.CD200R1结合亲和力测量
为了确定人源化抗CD200R1、h10F6与各种人CD200R1同工型(Iso1和Iso4，替代的或参考单倍型)和与cyno CD200R1的结合亲和力，使用BIACORETM8K仪器进行SPR测量。简而言之，将Biotin CAPture试剂(GE)在HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mMEDTA、0.005％表面活性剂P20)中的1:4稀释液以2μL/min的流速施加至芯片。对于动力学测量，3nM生物素化人CD200R1。接着，在37℃下注射了(流速:30μL/min)在HBS-P缓冲液(0.01MHEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20)中从低(0.27nM)到高(200nM)中的抗体h10F6的3倍系列稀释液。在通过
Figure BDA0003968761560000581
8K评估软件(版本1.1.1.7442)评估之前，记录传感图并进行参考和缓冲液扣除。使用简单的一对一Langmuir结合模型来计算缔合率(kon)和解离率(koff)。平衡解离常数(KD)被计算为koff/kon的比率。h10F6与cyno-CD200R1的结合亲和力用相同的方案，使用6nM生物素化的cyno-CD200R1确定。h10F6与各种hu-CD200R1同工型的结合亲和力数据总结在下表4中。
表4：h10F6和OX108与四种不同hu-CD200R1同工型的结合亲和力
Figure BDA0003968761560000591
结果：如表4所示，h10F6与hu-CD200R1结合的亲和力比市售抗体OX108高100倍至1000倍。亲和力取决于结合测定中使用的特定hu-CD200R1同工型和单倍型。由于长CD200R1同工型4(iso4)是主要形式(根据预测分析，同工型4预计在86％的健康个体中，并且同工型1预计在14％的健康个体中，所述预测分析使用用于剪接事件的基因组引导预测和量化的方法进行，所述剪接事件来自在干扰素-β治疗之前和之后来自ALS、T1D、脓毒症和多发性硬化患者的健康和患病样本的RNA-seq数据(参见，例如，Linsley P.S.等人，《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》，9(10):e109760(2014))，其中于参考和替代单倍型频率在群体中基本上是分开的(参考46％和Alt 54％)，抗-CD200R1治疗剂应该以高亲和力结合至主要同工型4的参考和替代单倍型，以便适应患者异质性并允许治疗最广泛的群体。h10F6以比OX108高1000倍的亲和力结合同工型4alt和同工型4ref。相比之下，OX108与不太常见的同工型1的结合亲和力比其与主要同工型4的结合亲和力高10倍，这使其不太适合作为治疗剂。h10F6对cyno-CD200R1的亲和力>1000nM。
B.通过ELISA测量的hu-CD200R1阻断
如下通过ELISA测定h10F6和6种其他人源化抗CD200R1抗体(h22.1、h9B8、h5D1、h10A2、h1F3和h11E4)对hu-CD200R1的阻断。96孔
Figure BDA0003968761560000601
平底板(赛默飞世尔科技公司，目录号439454)在4℃下用PBS中的1μg/mL人CD200-Fc包被过夜。在去除包被溶液后，用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS阻断非特异性结合，并在室温下温育1小时。然后将板在含有0.05％/>
Figure BDA0003968761560000602
(洗涤缓冲液)的PBS中洗涤五次。在阻断期期间，60μl/孔的0.1nM或0.4nM生物素化人CD200R1，在室温下用含0.5％BSA和0.05％ Tween 20(ELISA缓冲液)的PBS在NUNC F板(赛默飞世尔科技公司，目录号269620)中以60ul/孔(起始于0.3uM，1:4稀释度)进行一小时的抗体系列稀释。然后在室温下将抗原-抗体混合溶液以100ul/孔转移到huCD200-Fc包被的孔中持续15分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤板，并在室温下加入在ELISA缓冲液中以1:5000稀释的50μl/孔的链霉亲和素poly-HRP(赛默飞世尔科技公司，目录号21140)持续1小时。用洗涤缓冲液洗涤板并通过添加50μL/孔的四甲基联苯胺(TMB)微孔过氧化物酶底物(VWR、Cat#95059-156)显色15分钟。用50μL/孔的TMB终止溶液(VWR，目录号95059-200)终止酶促显色。用SpectraMax i3X板读取器(Molecular Devices)在450nm处分析板。
结果：描绘h10F6、h22.1、h9B8、h5D1、h10A2、h1F3、h11E4针对各种hu-CD200R1同工型的ELISA阻断数据的图显示在图3中。如图所示，人源化的抗-CD200R1，h10F6比其他测试的抗-CD200R1抗体更好地阻断了hu-CD200:hu-CD200R1相互作用。
阻断IC50代表抑制50％的生物素化hu-CD200R1与包被的hu-CD200-Fc结合的h10F6的浓度。如表5中总结的IC50值所示，h10F6阻断hu-CD200:hu-CD200R1相互作用，其中IC50在1.7nM至6.6nM之间，这取决于阻断测定中使用的特定hu-CD200R1同工型和单倍型。
表5：CD200阻断h10F6对hu-CD200R1的IC50。
Figure BDA0003968761560000611
C.表位分箱分析
对如实例2所述制备的六种人源化的抗CD200R1抗体h10F6、h9B8、h5D1、h10A2、h1F3、h11E4和h22.1进行表位分箱实验。通过在SAV Octet传感器(ForteBio)上捕获生物素化的人CD200R1，结合抗体1，然后用抗体2探测，使用OctetRed96进行表位分箱测量。如果抗体2能够结合抗体1结合的CD200R1，则将两种抗体分配到不同的箱中。如果抗体2不能结合抗体1结合的CD200R1，则将两种抗体分配到相同的表位箱中。
结果：在表6中总结了表位分箱实验的结果。所测量的六种抗CD200R1抗体通过表位分箱确定，以识别CD200R1上的3个不同表位。h10F6和h22.1被确定为结合CD200R1上重叠的CD200阻断表位。抗体h9B8、h10A2、h5D1和h1F3共享表位箱，而h11E4结合CD200R上的不同表位。
表6：抗CD200R1抗体的表位分箱。
抗体 h9B8 h5D1 h10F6 h10A2 h11E4 h1F3 h22.1
h9B8 - - + - + - +
h5D1 - - + - + - +
h10F6 + + - + + + -
h10A2 - - + - + - +
h11E4 + + + + - + +
h1F3 - - + - + - +
h22.1 + + - + + + -
D.抗体阻断hu-CD200R1的基于细胞的测定
人源化的抗-CD200R1抗体的阻断活性在基于细胞的测定中进行如下测试。将稳定地表达hu-CD200R1(UNQ#Q8TD46)的U937细胞与人TruStain FcX(Biolegend，目录号422302)在4℃下温育持续10分钟，然后在4℃下添加抗CD200R1抗体持续20分钟。洗涤细胞，然后与55nM huCD200-Fc-Flag在4℃下温育持续20分钟。洗涤细胞，然后通过与抗Flag-PE克隆L5(Biolegend Catalog#637310)在4℃下温育持续20分钟来检测huCD200-Fc-Flag结合。使用CytoFLEX(Beckman Coulter)通过流式细胞术分析细胞结合。基于平均荧光强度(MFI)计算结合曲线。
结果：如图4所示，BinA抗体h10F6表现出对hu-CD200R1的阻断比另外两种BinA抗体OX108和h22.1强10倍和6倍(即，较低的IC50值)。四种人源化BinB抗体h9B8、h5D1、h10A2和h1F3具有弱于h10F6的不同水平的CD200R1阻断活性，而单独的Bin C人源化克隆h11E4不阻断CD200Fc结合。
E.h10F6和h22.1与人和食蟹猴T细胞的结合
使用从健康供体(StemCell Technologies，目录号70500.2)和食蟹猴外周血单核细胞(WorldWide Primates)分离的人Pan T细胞测量人源化抗CD200R1抗体结合至内源性抗原的能力。对于人类，使用Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，目录号130-095-535)分离T细胞。将细胞与人TruStain FcX(Biolegend，目录号422302)在4℃下温育持续10分钟，然后与生物素标记的抗CD200R1抗体(h10F6或h22.1)或同种型对照在4℃下温育持续20分钟。洗涤细胞并使用链霉亲和素-PE(BD Biosciences)检测抗CD200R1结合。用抗CD4克隆OKT4和抗CD8克隆RPA-T8(Biolegend)标记人类免疫细胞类型。用抗CD3克隆10D12、抗CD4克隆M-T466和抗CD8克隆BW135/80(Miltenyi Biotec)标记Cyno免疫细胞。使用CytoFLEX(Beckman Coulter)通过流式细胞术分析细胞结合。基于几何平均荧光强度计算结合曲线。
结果：如图5A所示，h10F6对人T细胞的亲和力高于h22.1和OX108；然而，如图5B所示，h10F6和OX108都不显示与食蟹猴T细胞的交叉反应性。
实例4：抗CD200R1抗体的体外和体内功能测定
该实例说明了用于表征本公开的抗CD200R1抗体的功能活性的体外基于细胞的测定和体内研究。
A.通过抗CD200R1抗体对来自肿瘤患者的PBMC的免疫活化
在原代外周血单核细胞(PBMC)上测试了抗CD200R1抗体的功能活性。来自九名肿瘤患者的PBMC购自Discovery Life Sciences(加利福尼亚卢斯奥斯斯(Los Osos、California))。每孔将2-4x104个细胞一式三份接种到384孔板中，其中含有100nM选定的抗CD200R1抗体。然后用0.1ng/mL葡萄球菌肠毒素B(SEB)(毒素技术目录号BT202)刺激细胞，并在37℃下培养3天。使用从赛默飞世尔科技公司商购的试剂盒通过ELISA确定上清液的IFNγ水平。将生物学三次重复的平均值归一化为同种型对照，并进行多重T检验以确定显著差异。
结果：如图6所示，人源化的抗CD200R1抗体h10F6和h22.1增加了来自患有各种癌症类型的患者的样本中IFNγ的产生量。具体来说，图6显示了在用100nM的h10F6或h22.1处理的样本中IFNγ产生量的倍数变化，其被归一化为同种型对照。当用h10F6治疗时，9名肿瘤患者中的6名肿瘤患者的细胞具有统计学上显著增加的IFNγ产生量。9名患者中的4名患者当用h22.1治疗时具有显著的治疗效果。
B：原代人Pan-T细胞测定
在板结合的CD200-Fc的存在下测量抗CD200R1抗体在拯救IFNγ分泌中的功能活性。在完全培养基中，用2μg/mL PHA(Sigma，目录号11082132001)和4ng/mL人IL-2(Roche，目录号24951700)长期刺激从健康PBMC供体(Stem Cell，目录号70500.2)中分离的原代人类Pan-T细胞持续7天。然后收获细胞并用40ng/mL人IL-4(Peprotech，目录号200-04)引发24小时。在铺板细胞之前，用1μg/mL抗CD3克隆OKT3(Biolegend，目录号317326)和15μg/mL人CD200Fc或在PBS中稀释的同种型对照(克宁(Corning)，目录号21-040-CM)在4℃下包被板过夜。收获、洗涤细胞并用抗CD200R1抗体铺板持续24小时。收获细胞上清液并通过ELISA测量细胞因子人IFNγ(英杰公司(Invitrogen)，目录#88-7025-88)和人IL-2(英杰公司，包被的88-7316-88)的分泌。
结果：如图7A和图7B所示，用h10F6 IgG的处理显示在两个不同的健康供体(供体203和供体538)中IL-2分泌的功能性拯救，而通过用h22.1处理的拯救仅在一个供体中观察到。如图7C和图7D所示，与同种型对照相比，用h10F6的处理在IL-2分泌中也显示出更好的剂量依赖性应答效力(图7C)，并且在IFNγ分泌中显示出比商业抗体OX108更好的效力(图7D)。
D.原代人混合淋巴细胞反应测定
在同种异体混合的淋巴细胞反应测定中，使用Pan-T细胞和极化的树突细胞来测量人源化的抗CD200R1抗体的功能活性。通过离心和使用ACK裂解缓冲液(Gibco，目录号A10492-01)的红细胞裂解，从来自Stemcell Technologies，目录号70500.1的健康供体白细胞制备PBMC。使用pan单核细胞分离试剂盒(Miltenyi，目录号130-096-537)从PBMC中分离单核细胞。使用Miltenyi的Pan-T细胞分离试剂盒(Miltenyi，目录号130-096-535)分离Pan-T细胞。然后将单核细胞以100万/mL接种于含有20ng/mL GM-CSF(Fisher Scientific，目录号215GM010)和IL-4(Fisher Scientific，目录号204IL010)的完全培养基中持续7天。然后使用100ng/mL LPS(Sigma，目录号L-4391)和50ng/mL TNFα(Fisher Scientific，目录号210TA020CF)将树突细胞进一步极化成免疫原性DC，或者使用20ng/mL IL-10(FisherScientific，目录号217IL010)和20ng/mL IFNa-2b(Fisher Scientific，目录号111051)将树突细胞耐受化3天。在极化后，将Pan-T细胞和成熟DC以1:20panT:DC细胞比率与10μg/mL抗CD200R1抗体或同种型对照在完全培养基中混合在一起。在第4、5和6天收获MLR上清液和细胞以评估T细胞的活化。使用IFNγHuman Luminex Procartaplex试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号EPX01A-10228-901)测量细胞因子分泌。为了评估T细胞活化，将细胞与人TruStain FcX(Biolegend，目录#422302)在4℃下温育持续10分钟，然后进行细胞外染色抗CD3克隆UCHT1、抗CD4克隆OKT4、抗CD8克隆RPA-T8、抗-CD86克隆BU63，抗CD11c克隆BU15。此外，为测量T细胞活化而添加的活化标志物是抗CD69克隆FN50、抗CD25克隆BC96和抗HLA-DR克隆L243。将细胞在4℃下染色20分钟并洗涤以准备细胞内染色。Foxp3/转录因子染色缓冲液组(Transcription Factor Staining Buffer Set)(赛默飞世尔科技公司，目录号00-5523-00)用于固定和透化细胞，以用于在4℃下用抗Ki67克隆B56进行细胞内染色持续45分钟。在细胞内染色后，再次洗涤细胞并重新悬浮在PBS+2％ FBS中。使用CytoFLEX(BeckmanCoulter)通过流式细胞术分析表达。
结果：如图8A、图8B和图8C所示，用人源化的抗CD200R抗体处理，h10F6增加CD8T细胞中的活化(图8A)、CD4T细胞中的增殖(图8B)和大于h22.1 IgG的IFNγ分泌(图8C)并且明显超出同种型对照。
E.抗CD200R1抗体的Phospho-Dok2诱导测定
在与CD200接合后，经由将Dok2激酶募集到CD200R1的磷酸酪氨酸结合识别基序来启动CD200R1抑制信号传导(参见例如Mihrshahi 2009和Mihrshahi 2010)。通过在U937单核细胞细胞系(ATCC#CRL-1593.2)和稳定地表达hu-CD200R1细胞系的U937中诱导磷酸Dok2来评估人源化的抗CD200R1抗体h10F6和h22.1的激动活性。一旦血清饥饿持续18小时，用各种浓度的可溶性人源化的抗CD200R1或同种型对照或CD200-Fc处理亲代或CD200R1过表达细胞持续60分钟。细胞在1xSDS+蛋白酶和磷酸酶抑制剂中裂解。在非还原条件下，在NuPAGE4-12％ Bis-Tris MES SDS(BioRad)上分离裂解物。使用抗pDok2 Y351(Cell SignalingTechnology，目录号3911S)和抗Dok2(Santa Cruz Biotechnology，目录号sc-17830)进行蛋白质印迹。
结果：如图9所示，与野生型(WT)U937细胞系相比，pDok2在用200nM最高剂量的可溶性CD200-Fc、33nM的OX108和低至5.6nM的h22.1处理时被诱导。相比之下，与WT相比，用h10F6的治疗未能诱导pDok2，这表明h10F6缺乏CD200R1激动特性。h10F6阻断CD200与CD200R1结合的能力，同时不会无意地激动CD200R1信号传导(如通过pDok2表达测量的)，相对于h22.1和OX108，大大增强了h10F6的治疗能力，h22.1和OX108都表现出无意的CD200R1激动活性。
F.针对K562-CD200R1的拮抗活性测定NFKb-Luc报告物细胞系
先前报道了当CD200当与表达CD200R1的细胞系共培养时，CD200诱导NFkB转录(参见例如，Wang等人，《自然医学》，25：656-666(2019))。K562单核细胞系(ATCC CCL-243)被工程改造成具有CD200R1和NFkB荧光素酶报告物的稳定表达，以便测量人源化的抗CD200R1抗体h10F6和h22.1的拮抗活性。在37℃下，将二价和单价Fab形式的抗CD200R1克隆h22.1和h10F6以不同浓度添加到K562报告物细胞和稳定表达CD200的293T(UNQ#P41217)的共培养物中持续6小时。培养物被补充有20ng/mL的TNFα(RnD Systems，目录号210-TA)。
结果：如图10A和图10B所示，与表达CD200-的细胞相比，通过表达CD200+的细胞来诱导NFkB转录。在向共培养物中添加阻断抗体后，h10F6和h22.1之间的拮抗功能的差异变得明显。二价(图10A)和单价h10F6(图10B)都可以将CD200驱动的NFkB转录阻断至基线水平。然而，CD200+与h22.1 IgG共培养仅部分阻断NFkB诱导，而单价h22.1 Fab没有效果。
实例5：人源化的抗CD200R1抗体h10F6的亲和力成熟
本实例说明了用于人源化的抗CD200R1抗体h10F6的亲和力成熟的噬菌体文库构建和淘选技术，以改善与hu-CD200R1和cyno-CD200R1的结合。
A.h10F6亲和力成熟NNK文库构建和淘选
为了鉴定抗CD200R1抗体克隆h10F6的亲和成熟变体序列，以Fab-amber格式构建噬菌体文库，用于单价Fab噬菌体展示，其中重链和轻链残基使用NNK简并密码子随机化，所述简并密码子用32个密码子编码所有20个氨基酸(Brenner等人，1992)。文库被设计成允许在三个轻链或重链HVR中的每一个中都有一个NNK突变。然后使用Kunkel诱变，将合成的诱变寡核苷酸用于构建重链和轻链文库(Kunkel等人，1987)。将得到的文库DNA电穿孔到大肠杆菌XL1细胞中，产生大约6.5x108至4.3x109转化体。
噬菌体文库在SUPERBLOCKTMPBS缓冲液(Pierce)和0.05％
Figure BDA0003968761560000661
20中温育30分钟，然后施加于hu-CD200R1(iso4、Alt和Ref单倍型)和cyno-CD200R1包被的板上进行第一轮淘选。在随后的两到三轮中，噬菌体文库与降低浓度的生物素化的hu-CD200R1或cyno-CD200R1抗原一起温育。洗脱的噬菌体用log-phase XL-1感染并在37℃下在LB羧苄青霉素板上过夜以进行进一步的亲和力筛选。
为了使用NGS从亲和力成熟文库中提取序列，从携带来自初始噬菌体文库(未分类文库)以及第一轮和第二轮溶液选择(分类文库)的噬菌粒的大肠杆菌XL-1细胞中分离出噬菌粒双链DNA。纯化的DNA用作模板，以使用Illumina 16s文库制备方案生成VH和VL区的扩增子。使用Illumina Nextera XT索引试剂盒添加测序适配器和双l索引条形码。在准备在Illumina MiSeq上进行测序时，使用MiSeq Reagent Kit v3(600个循环)对接头连接的扩增子进行标准Illumina文库变性和样本加载方案。进行配对末端测序以覆盖插入物大小为200bp到300bp的扩增子的全长。
首先使用配对末端装配器PANDAseq(Masella等人，2012)组装配对末端测序数据，以获得完整的扩增子。然后对已鉴别的扩增子进行质量控制(QC)，其中检查每个扩增子的序列的插入或缺失和终止密码子，允许每个CDR序列最多只能携带一个NNK突变，并且不能携带非NNK突变。通过计算每个随机位置的所有突变的频率产生位置权重矩阵。通过将分选的样本中给定位置处给定突变的频率除以未分选的样本中非常相同突变的频率来计算每个突变的富比率，如前所述(Koenig等人，2015)。
结果：支持所得h10F6变体与hu-CD200R1和cyno-CD200R1的增加结合的富集的HVR突变总结在表7中。
表7：VH和VL结构域中的h10F6突变支持增加的hu-CD200R1和cyno-CD200R1结合亲和力
Figure BDA0003968761560000671
/>
Figure BDA0003968761560000681
实例6：h10F6的纯化的亲和力改善的变体的表征
本实例说明了hu-CD200R1和cyno-CD200R1结合亲和力以及通过如实例6中所述的亲和力成熟制备的所选h10F6变体h10F6.V1、h10F6.V2、h10F6.V3和h10F6.V4的阻断。
A.Biacore结合
合成h10F6变体用于克隆到哺乳动物表达构建体中以产生IgG1蛋白。在表3中总结了变体IgG1蛋白的LC和HC序列。h10F6.V1具有SEQ ID NO:71的LC和SEQ ID NO:88的HC。h10F6.V2具有SEQ ID NO:68的LC(与h10F6和h10F6.V3相同)和SEQ ID NO:89的HC(与h10F6.V4相同)。h10F6.V3具有SEQ ID NO:68的LC(与h10F6和h10F6.V2相同)，以及SEQ IDNO:88的HC(相同h10F6.V1)。h10F6.V4具有SEQ ID NO:71的LC(与h10F6.V1相同)和SEQ IDNO:89的HC(与h10F6.V2相同)。
如实例2所述表达和纯化编码重链或轻链的质粒。为了确定所选的h10F6亲和力提高的变体与hu-CD200R1-iso4(Alt和Ref单倍型)和cyno-CD200R1结合的结合动力学，如实例3.A中那样使用BIACORETM8K仪器进行SPR测量。简而言之，h10F6变体在HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20)中以0.5μg/mL稀释，并且在流动池2(FC2)中以30μL/min的流速应用于蛋白A芯片持续60秒。然后，在37℃下，将在300nM的HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20)中的人或犬-CD200R1的流动的3倍系列稀释液注射(流速：30μL/min)到流动池1(FC1)和流动池2(FC2)中。在通过
Figure BDA0003968761560000691
8K评估软件(版本1.1.1.7442)评估之前，记录传感图并进行参考和缓冲液扣除。使用简单的一对一Langmuir结合模型来计算缔合率(kon)和解离率(koff)。平衡解离常数(KD)被计算为koff/kon的比率，其被总结在表8中
表8：h10F6变体对人hu-CD200R1和cyno-CD200R1的结合亲和力
Figure BDA0003968761560000692
结果：如表8中总结的结合亲和力值所示，四种变体h10F6.V1、h10F6.V2、h10F6.V3和h10F6.V4被鉴定为表现出与hu-CD200R1和cyno-CD200R1的结合交叉反应性。
B.阻断测定
测定四种h10F6变体h10F6.V1、h10F6.V2、h10F6.V3和h10F6.V4在如实施例3.B中所述进行的人CD200:CD200R1阻断ELISA测定中的性能。测定阻断IC50值，其代表抑制50％的生物素化hu-CD200R1或生物素化cyno-CD200R1与包被的hu-CD200-Fc或cyno-CD200-Fc结合的抗CD200R1变体IgG1的浓度。
结果：如表9中总结的，四种h10F6变体表现出与h10F6.V1的交叉反应性阻断活性，表现出对hu-CD200R1和cyno-CD200R1两者的最强阻断。
表9：h10F6变体的CD200:CD200R1阻断IC50。
Figure BDA0003968761560000693
实例7：抗CD200R1抗体的大鼠药代动力学研究
本实例说明了人源化的抗CD200R1抗体h10F6和h22.1在大鼠中的体内药代动力学(PK)研究。
材料和方法：人源化的抗CD200R1抗体h10F6和h22.1在Sprague-Dawley大鼠中静脉内给药。每个给药组给予2只雄性和2只雌性大鼠单剂量的10mg/kg或1mg/kg。在注射后5分钟、2小时、6小时、24小时、3天、7天、10天、14天、17天和21天采集血液。血清中的抗CD200R1水平使用通用ELISA方法进行定量，该方法用羊抗人IgG1捕获人IgG抗体，并用生物素标记的山羊抗人IgG(H+L)和链霉亲和素-HRP进行检测。非隔室分析用于计算PK参数，其中时间范围为3至21天。
如图11所示，药代动力学举例说明了非靶向介导的消耗概况。在1mg/kg和10mg/kg给药组中，h10F6的半衰期分别在11.4至14.8天的范围内。在两个剂量组中，h22.1的半衰期为约12天。与同一组中的其他3只大鼠相比，10mg/kg h22.1组中的一只动物具有更快的清除概况，因此从分析中省略。
大鼠中h10F6的平均PK参数总结在下表10中。在向Sprague-Dawley大鼠单次IV推注1mg/kg或10mg/kg后，h10F6血清浓度以双相方式下降。h10F6的PK与剂量成比例，并且在雄性和雌性中相似。对于1mg/kg和10mg/kg的剂量，在Sprague-Dawley大鼠中h22.1的平均终末半衰期分别为11.4和14.8天。
表10：在大鼠中单剂量IV施用后h10F6的PK参数
Figure BDA0003968761560000701
实例8：h10F6在猴子中的单剂量药代动力学
在食蟹猴(一种非结合物种)中进行h10F6的单剂量PK研究，以表征其PK性质和耐受性。
初始食蟹猴(N＝8、4M/4F)通过分别以2mg/kg和20mg/kg(每组2M/2F)单次IV推注被施用h10F6。给药后35天监测血清中h10F6的浓度、临床化学参数、血液学参数以及猴子的一般健康和外观。在给药前和给药后15分钟、2小时、8小时和1、2、4、7、10、14、21、28和35天收集用于PK分析的血液样本。在给药前和给药后第1天和第35天收集用于临床病理学的样本。猴子血清样本中h10F6的浓度是使用ELISA确定的，该ELISA已开发并有资格测量h10F6的浓度，其至定量下限(LLOQ)为0.06μg/mL。h10F6在猴子中的浓度-时间PK概况显示在图12中。
在下表11中总结了猴子中h10F6的平均PK参数。在向食蟹猴单次IV推注2mg/kg或20mg/kg的h10F6后，h10F6血清浓度以双相方式下降。对于2mg/kg和20mg/kg组，h10F6的平均终末半衰期(T1/2)分别为11.5和13.3天。h10F6的PK与剂量成比例，并且在2mg/kg至20mg/kg的研究剂量范围内未观察到性别差异。8只猴子中的两只(20mg/kg组中的一只雄性和一只雌性)在第14天和第21天之间显示出h10F6的血清浓度的急剧下降。这一发现归因于可能形成的抗药物抗体(ADA)。因此，怀疑受ADA影响的PK参数从h10F6汇总数据中排除，并且部分AUC(AUC0-14D)被包含在PK分析中。从汇总平均数据中排除两只具有疑似ADA的动物的数据不影响h10F6剂量比例或性别差异的结论。
10F6在猴子中具有线性PK，在雄性和雌性中具有相似的PK，并且在稳态时清除率和估计的分布体积的平均值与在猴子中具有线性PK的人源化IgG的典型值一致(Betts等人，2018)。如对非结合物种所预期的，h10F6的PK概况表明线性、非饱和、非特异性清除机制是猴子中h10F6的主要消除途径。基于临床观察以及对血清化学和血液学参数的评估，h10F6到第35天耐受性良好。
表11：在单剂量IV施用于猴子后h10F6的PK参数
Figure BDA0003968761560000711
实例9：h10F6在人体内的药代动力学
h10F6的PK在食蟹猴中在2mg/kg至20mg/kg范围内和在Sprague-Dawley大鼠中在1mg/kg至10mg/kg范围内的单剂量研究中进行了评估。h10F6暴露与剂量大致成比例，并且在雄性和雌性之间没有观察到差异。PK概况不表明靶标介导的处置或ADA效应的证据，除了2只猴子以20mg/kg给药，其具有提示ADA形成的PK概况。这些结果支持，异速生长方法可以适用于预测h10F6的人类PK。
从猴子的非临床数据计算人类PK参数如清除率和分布的体积，如下表12所示。简而言之，猴子中的h10F6血清浓度在以双相方式施用后下降。因此，来自N＝8只猴子的剂量为2mg/kg或20mg/kg的h10F6的浓度-时间数据(其中排除ADA可疑数据)同时符合双隔室模型。基于分布项(V1和V2)的体积按异速生长指数＝1的比例变化并且清除项(CL和Q)按指数＝0.85的比例变化的假设，来自该模型的猴子PK参数按异速生长比例变化，以获得人类PK参数(Deng等人，2011)。对于猴子和人的体重分别采用2.4kg的体重(单剂量PK研究中猴子的平均体重，h10F6-VIV-01)和70kg。对于70kg体重的人，按比例缩放的人类PK参数属于人源化的IgG单克隆抗体的典型范围。
由于h10F6对来自人类的CD200R1具有特异性，因此无法在临床前评估靶向介导的药物处置。然而，可以针对TMDD评估来自GLP h10F6.V1危害识别研究的毒代动力学(TK)数据，并且如果发现TMDD是h10F6.V1在猴子中的主要清除途径，则来自该研究的结果可以用于h10F6人类PK预测提供信息或对其进行潜在改进。基于这些PK参数，可以计算出h10F6消除半衰期为19.4天。
表12：h10F6在人类中的预测的PK参数
Figure BDA0003968761560000721
h10F6在人体中的预测的PK参数用于估计健康志愿者和患者中的h10F6 PK，以分别为起始剂量和预期的治疗剂量范围的选择提供信息。
可以假设人类中h10F6的PK在剂量范围内是线性的。然而，当靶介导的药物处置可能是人类总清除率的因素时，消除半衰期可能比低剂量时预测的要短。因此，在健康志愿者和患者中，h10F6的AUC可能被过度预测，尤其是在低剂量时。因此，假设整个剂量范围内的线性导致剂量选择的保守方法，特别是在低剂量时。
下表13中呈现的剂量可以是在健康志愿者中评估的最大剂量，假设起始剂量为0.3mg并且最大剂量增加为半对数(约3倍)。可以通过危险识别研究(如h10F6.V1中的危险识别研究和h10F6离体组织交叉反应性研究)获知这些剂量，并且如有必要，可以基于对数据的综述修改这些剂量。在SRC的剂量升级决定中，将仔细考虑来自先前队列的安全性、PK和PD数据的整体。
表13：健康志愿者中h10F6的预测的暴露
Figure BDA0003968761560000731
预测的人PK参数也用于估计患者中的h10F6 PK，以告知预期的治疗剂量范围。以下假设用于估计患者中的h10F6 PK，包括线性PK、Q3W给药或10％的血清与肿瘤分配系数，或其任何组合。
待用于患者的实际剂量频率可以从含有晚期癌症的患者的h10F6V1的多剂量研究的安全性、PK和PD数据中获得。与健康志愿者相比，患者可能具有更高水平的CD200R1表达(例如，TIL)，并且CD200R1的存在可以导致h10F6的更快清除和更低的暴露，例如在靶标介导的清除未完全饱和时的低剂量。虽然CD200R1是低密度表面受体，但它可以在骨髓谱系细胞(例如嗜中性粒细胞)上以其最高水平表达，其快速周转可以在低剂量下主导h10F6的消除。例如，由于CD200R1在肿瘤中的TIL上表达，因此与h10F6在健康志愿者中实现线性PK的剂量相比，可以施用同等或更高剂量的h10F6以在患者中实现线性PK。实体瘤中抗体的浓度可以平均为血清浓度的10％至30％。可以使用10％的保守方法来告知对于每个队列正在考虑的最大剂量。
实例10：抗CD200R1抗体与原代人细胞的结合
为了证实h10F6与在人类细胞上表达的内源性CD200R1结合，使用来自健康供体的人类PBMC通过流式细胞术确定h10F6与外周免疫细胞亚群的结合。
在从3个供体分离的PBMC中，h10F6与免疫亚群的结合与文献中报道的预期的CD200R1表达相匹配(Wright等人，2003；Rijkers等人，2008；Czarnowicki等人，2017)；CD4+T细胞表达最高水平的CD200R1，在CD8+T细胞上观察到略低的表达。相比之下，在B细胞上观察到显著较低的CD200R1表达水平；B细胞的染色分布是双峰的，表明总B细胞的亚群(约16％)表达CD200R1。h10F6显示与来自3名健康供体的外周单核细胞的有限的结合。这些结果与使用商业抗CD200R1抗体和来自其他3名健康供体的新鲜分离的单核细胞的研究一致(数据未显示)。通过测试h10F6的系列稀释液来评估与T细胞亚型的结合(图13)；与这些外周免疫亚群结合的EC50值在0.30至0.40nM范围内的3个测试的供体中是一致的，如下表14所示。
表14：h10F6与T细胞结合的效力
Figure BDA0003968761560000741
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为了概括组织常驻DC表型，使用单核细胞分离试剂盒分离来自健康供体PBMC的单核细胞，然后用20ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和20ng/mL的IL-4在体外分化持续1周。h10F6在所评估的3个个体供体中显示出与单核细胞来源的树突细胞(MoDC)的结合，并获得了相似的剂量-应答曲线(图14)。供体之间的结合EC50值(0.45nM至0.60nM)总结在下表15中。
表15：抗CD200R1抗体对单核细胞衍生的树突细胞(MoDC)的效力
供体编号 样本类型 细胞类型 EC50(平均荧光强度，MFI)
RG2052 分化的单核细胞 MoDC 0.45nM
RG1802 分化的单核细胞 MoDC 0.60nM
RG1549 分化的单核细胞 MoDC 0.60nM
实例11：抗CD200-R1抗体不结合至原代大鼠、兔、狗、狨猴、恒河猴和食蟹猴PBMC
还评估了h10F6与来自其他物种的免疫细胞结合的能力。选择与人CD200R1具有≥50％序列同源性的常见物种进行评估，并且包含大鼠CD200R1(54％细胞外结构域，ECD，相似性)、狗CD200R1(50％ ECD相似性)、兔CD200R1(61％ ECD相似性)、狨猴(82％ ECD相似性)、恒河猴(91％ ECD相似性)和食蟹猴(89％ ECD相似性)。来自每个相应物种的PBMC的流式细胞术分析的结果表明，h10F6不与大鼠、兔或狗的原代免疫细胞结合。尽管具有高度序列同源性，h10F6也未显示出与恒河猴、狨猴或食蟹猴细胞的结合，如图15所示。
通过测量h10F6与用这些物种的全长CD200R1共有序列转染的CHO细胞的结合来证实对兔、狨猴、恒河猴和食蟹猴CD200R1缺乏交叉反应性，其中人CD200R1用作阳性对照(图16)。与用原代细胞观察到的结果一致，h10F6仅识别人类CD200R1。
实例12：CD200R1在外周和肿瘤浸润免疫细胞上的表达
在来自冷冻保存的解离肿瘤组织的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和来自透明细胞肾癌、乳腺癌、黑色素瘤、子宫内膜腺癌和卵巢癌患者的匹配PBMC上评估CD200和CD200R1的表达，以了解与肿瘤微环境相比，它们在外周免疫细胞上的分布(CD200，IND书中的图5；CD200R1，IND书的图6)。虽然在癌症患者和健康供体之间外周免疫细胞上的CD200水平相似，但在测试的所有5名癌症患者中，CD200表达水平在肿瘤浸润性免疫细胞(包含CD4+T细胞、CD8+T细胞)中上调。与来自外周的匹配样本相比，5名癌症患者中有4名的肿瘤浸润CD11b+骨髓细胞也表现出升高的CD200表达(图17)。患者PBMC亚群上的CD200R1表达与健康对照表达水平相当(图18)。然而，在5名癌症患者中的4名癌症患者中，与匹配的外周样本相比，CD200R1在CD4+和CD8+TILT细胞上具有较高的表达。在测试的所有5个患者样本中，与匹配的外周样本相比，TIL B细胞和CD11b+骨髓细胞表现出升高的CD200R1表达。该数据证实了肿瘤微环境中CD200和CD200R1上调的文献报道(Zheng等人，2017；Thommen等人，2018；Cassetta等人，2019)，并且表明CD200R1抑制性受体及其配体的升高的表达可能有助于免疫抑制性肿瘤微环境。
实例13：通过抗CD200-R1抗体阻断CD200/CD200R1相互作用
A.通过抗CD200-R1抗体从表达CD200R1的细胞中置换预结合的CD200
在肿瘤和肿瘤浸润性免疫细胞的情况下，在肿瘤细胞和/或血管上的内皮细胞上表达的一定比例的CD200预期与在免疫细胞上表达的CD200R1预结合。为了评估h10F6从CD200R1中置换预先结合的CD200的能力，将U937细胞系工程改造为表达hCD200R1(U937-CD200R1)，并且在与h10F6温育之前与不同浓度的hCD200-Fc预温育。通过监测由h10F6从U937-CD200R1置换生物素化的hCD200-Fc(图19，图A)或监测在不同浓度的hCD200-Fc存在下生物素化的h10F6与U937-CD200R1细胞的结合(图19，图B)来进行该测定。在两种测定形式中，h10F6从细胞表面表达的hCD200R1中有效置换hCD200-Fc，导致h10F6阻断IC50值在0.16nM至1.28nM的范围内，这取决于存在的hCD200-Fc的浓度。如所预期的，与当表达CD200R1的细胞与h10F6预温育时相比，预先结合的CD200的置换的h10F6 IC50值显著更高(效力更低)(IC50＝0.08nM)。
B.通过Anto-CD200-R1抗体阻断CD200与内源性表达CD200R1的原代树突细胞的结 合
由于h10F6的生物学作用机制的关键属性是有效地阻止CD200与表达CD200R1的细胞结合，我们评估了h10F6阻断可溶性重组CD200与体外分化并表达高水平内源性CD200R1的树突细胞结合的能力。h10F6以浓度依赖性方式阻断了100％的CD200与表达CD200R1的树突细胞的结合，其中IC50值为0.08nM(图20)。在本文中，允许体外单核细胞分化的DC与增加浓度的h10F6结合。在加入500nM的CD200-Fc-FLAG融合蛋白之前，通过洗涤两次去除未结合的抗体。在4℃下温育20分钟后，加入抗Flag PE抗体以用于检测CD200结合。用于结合的EC50值使用3参数、log10[h10F6]相对于应答、非线性曲线拟合来确定；拟合线是基于此模型外推的。结合CD200R1但不阻断CD200R1-CD200结合的对照抗体(非阻断剂)不抑制CD200结合；事实上，它似乎增强了结合。总之，这些结果表明h10F6可以阻止CD200与原代免疫细胞上的CD200R1结合。
实例14：通过抗CD200R1抗体对CD200R1信号传导的抑制
h10F6对下游CD200R1介导的信号传导的影响在体外使用2种不同的基于细胞的测定系统进行表征。一种评估了h10F6阻止DOK2募集到CD200R1受体细胞内结构域的能力。另一种使用NFκB报告物基因评估了CD200R1介导的核因子κB(NFκB)的下游活化。
CD200R1信号传导通路始于CD200诱导的CD200R1的Y302的磷酸化，然后是DOK2的募集(Zhang等人，2004；Mihrshahi等人，2009；Mihrshahi和Brown，2010)。因此，我们使用市售的CD200R1特异性DOK2募集测定(EuroFins DiscoverX)评估了h10F6阻断DOK2的下游募集的能力。在这个体外基于细胞的测定系统中，人类Jurkat细胞系被工程改造为表达CD200R1和DOK2，每一个在c末端都用单独且互补的β-半乳糖苷酶片段进行修饰。当DOK2非常接近CD200R1的细胞内结构域时，2个工程改造的酶片段将相互补充，以形成功能性酶，该功能性酶能够水解专有底物以产生化学发光信号。因此，将人类Jurkat细胞与表达CD200的HEK293细胞共培养诱导反映CD200R1信号传导的剂量依赖性化学发光信号(图21)。向共培养物中添加可溶性h10F6的系列稀释液以浓度依赖性方式阻断了CD200配体诱导的DOK2向CD200R1的募集(IC50＝0.03nM)。没有CD200内源性表达的HEK293T细胞用于确定信号的基线水平。随着信号恢复到基线水平(由HEK293T对照细胞刺激指示)，随着抗体浓度的增加，抑制完成。
临床前研究表明，经典的NFκB通路可以在卵巢癌、结肠炎相关癌症、肝细胞癌和胶质母细胞瘤小鼠模型中发挥肿瘤促进作用。文献报道表明，免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞(TAM)M2表型和髓源性抑制细胞(MDSC)可能依赖于NFκB(Hagemann等人，2008；Li等人，2020)。此外，破坏骨髓细胞中的经典NFκB通路可以减缓肿瘤生长，将抗炎M2复极化为促炎M1免疫浸润，支持CD8+T细胞和肿瘤细胞凋亡的增加(Achyut等人，2017)。人类单核细胞系K562被工程改造以表达CD200R1和NFκB-荧光素酶报告物，以探索CD200-CD200R1信号传导对NFκB通路的影响以及h10F6阻断这种作用的能力。
用板结合的CD200(数据未示出)或与表达CD200的HEK293T细胞的共培养物处理表达CD200R1的K562细胞以细胞数量依赖性方式诱导NFκB报告物基因活性(图22，图A)。向该K562 HEK293-CD200+共培养物中添加可溶性h10F6的系列稀释液有效并完全阻断膜结合的CD200依赖性NFκB应答，其中IC50值为2.31nM(图22，图B)，并且当CD200是板结合的时，IC50为3.38nM(数据未示出)。这些数据表明h10F6在2个独立的基于细胞的系统中有效地阻断CD200/CD200R1信号传导。
实例15：通过抗CD200R1抗体增强免疫细胞活化
A.抗CD200R1抗体在混合淋巴细胞测定中的作用
在混合淋巴细胞测定中评估了h10F6在同种异体T细胞共培养物的情况下逆转致耐受性DC的抑制作用的能力。测量了细胞因子产生和T细胞活化标志物两者。简而言之，通过与GMCSF和IL-4一起培养7天，单核细胞被分化成树突细胞。树突细胞被极化成致耐受性，或被极化成免疫原性DC，以用作免疫刺激阳性对照。在极化3天后，pan-T细胞和成熟的DC在h10F6或同种型对照抗体的存在下混合在一起。随后在共培养4至6天后分析细胞因子产生和T细胞活化标志物。致耐受性DC混合淋巴细胞测定中的h10F6处理导致T细胞活化，如由包含IFNγ、IL-12p70和IL-18的促炎细胞因子的2至3倍的时间依赖性诱导所证明的(图23，图A和C)。还观察到T细胞活化标志物CD69和增殖标志物Ki67的显著增加，其达到了最大活化的40-70％，如免疫原性DC共培养物所示(图23，图B)。总之，这些数据证明了h10F6在存在致耐受性DC的情况下拯救T细胞功能的能力。
B.抗CD200R1抗体在评估IL-2的分泌和INFγ的产生的Pan-T细胞测定中的作用
h10F6拯救T细胞功能的潜力也在pan-T细胞测定中在板结合的CD200-Fc存在下进行了评估(图24，图A)。在完全培养基中用植物血凝素和IL-2慢性刺激从健康PBMC供体中分离的人类pan-T细胞持续7天。然后收获细胞，停止刺激物并用IL-4引发24小时。这种预处理增加了pan-T细胞上的CD200R1表达，使它们对配体(CD200)更敏感。用50nM h10F6处理pan-T细胞显示在板结合的CD200-Fc存在下对IL-2分泌的功能性拯救。h10F6还以剂量依赖性方式挽救了IFNγ的产生(EC50为0.07nM，如图24，图B所示)。因此，h10F6也直接调节T细胞功能，而与骨髓细胞无关。
实例16：抗CD200R1抗体以剂量依赖性方式实时增强PBMC介导的肿瘤细胞杀伤
靶标肿瘤细胞(表达内源性CD200的COV644细胞)被工程改造以表达绿色荧光蛋白(GFP)。GFP标记的COV644肿瘤细胞与健康供体PBMC一起温育。还向培养基中添加了刺激物(SEB)以活化免疫细胞。通过测量每个孔中荧光强度随时间的损失来量化PBMC介导的肿瘤细胞杀伤。
通过目测来确认免疫介导的肿瘤细胞杀伤，以确保荧光信号的损失与肿瘤细胞杀伤一致。通过未标记的免疫细胞的聚集证明了成功的引发和活化。免疫细胞杀伤通过GFP标记的细胞膜破裂和靶肿瘤细胞的收缩被证实。h10F6在实时IncuCyte肿瘤生长测定中用3个不同的供体进行了测试。在进行的24项研究中的15项中，h10F6促进了抗肿瘤杀伤活性，如通过与同种型对照相比每孔GFP信号的减少来量化。h10F6以剂量依赖性方式加速SEB引发的PBMC介导的肿瘤细胞死亡(图25)
在图25中，显示h10F6效应的来自15IncuCyte PBMC介导的肿瘤杀伤实验的杀伤阶段的GFP信号的曲线下面积(AUC)拟合非线性抑制剂应答回归模型，并且评估数据的优度适合。3名个体供体中的6个实验通过了R2≥0.40的接受阈值。来自这6个实验的数据被转换为相对于同种型对照的％PBMC介导的肿瘤杀伤。计算肿瘤杀伤百分比的各个值(每个浓度n＝4个复制品)并转换为平均肿瘤杀伤％。平均肿瘤杀伤百分比(其被报告为相对于同种型对照被杀死的肿瘤细胞的百分比增加)按h10F6浓度绘制，并且来自重复实验的供体特异性数据被汇总以报告通过供体的测定中h10F6的EC50，如图26所示。
3个供体的PBMC介导的肿瘤细胞杀伤值被报告在表16中。h10F6以浓度依赖性方式增加PBMC介导的肿瘤细胞杀伤，导致平均EC50为1.37nM(或0.20μg/mL，范围：0.17nM至2.38nM)。相对于同种型对照，h10F6将PBMC介导的肿瘤细胞杀伤增加了高达52.9％(个体)，并且在3名供体中具有35.2％的平均最大效应(0％为通过同种型对照实现的杀伤，并且100％是如果肿瘤细胞在整个杀伤期不发射GFP信号)。
表16：相对于同种型对照，h10F6对PBMC介导的肿瘤细胞杀伤的效力和最大效应的总结
RG1939 RG1212 RG1307 平均值
N＝2 N＝1 N＝3 NA
EC50(nM) 0.17 2.38 1.56 1.37
增加的杀伤最大值％ 29.8 52.9 22.8 35.2
在SEB刺激的供体PBMC的存在下，h10F6有效地增强了PBMC介导的CD200+癌细胞死亡。
实例17：使用h10F6.V1的毒理学研究
h10F6的非临床安全性评估包含评估体外药理学数据、来自体内PK研究的耐受性数据，以评估h10F6的潜在脱靶标结合、体外细胞因子释放和组织交叉反应性，以及替代抗体h10F6.V1的耐受性和GLP毒理学研究。
在大鼠和食蟹猴中单剂量IV团注施用h10F6后，评估了h10F6.V1的耐受性和脱靶标结合和毒性的可能性。还评估了h10F6.V1诱导通过外周人免疫细胞的细胞因子释放的潜力。
A.Sprague-Dawley大鼠的耐受性
h10F6.V1在大鼠中在单次IV推注(1至2mL/kg)至10mg/kg(2/性别/组；1mg/kg和10mg/kg)的剂量后良好地耐受。在每个给药或样本收集时间点观察动物的显著临床体征、濒死状态和死亡率。在给药时和第7、14和21天记录体重。没有早期死亡或濒死，并且也没有与测试制品相关的临床体征或体重的变化。总之，没有观察到明显的毒性，这表明例如在大鼠中在单次IV给药高达10mg/kg后h10F6.V1的脱靶标结合。
B.食蟹猴的耐受性
在单次IV推注(2mL/kg)至20mg/kg的剂量后，h10F6.V1在食蟹猴(2/性别/组，2mg/kg和20mg/kg)中良好地耐受。在到达研究地点后，由经过认证的兽医人员对动物进行一般健康筛查。仅将临床病理参数与菌落特异性参考数据一致的健康状况良好的动物置于研究中。在给药日，在给药后第一个6小时的每个样本采集时间点之前和之后观察动物并且在样本采集的每个后续时间点再次观察动物。在给药后，每天至少两次观察动物的显著临床体征、死亡率以及疼痛和痛苦的迹象，并且每天至少一次观察动物的一般健康和外观。在给药前、在给药时和在给药后至少每周记录体重。在给药前、给药后24小时和给药后35天收集血液以评估血液学和血清化学的变化。没有早期死亡或濒死状态，并且没有与测试制品相关的临床体征、体重、血液学或临床化学的变化。总之，在单次IV给药高达20mg/kg后，没有观察到将表明h10F6在食蟹猴中的脱靶标结合的明显毒性。
C.细胞因子释放测定
评估了在暴露于h10F6后通过PBMC的细胞因子释放的可能性，并且发现没有影响。将来自10名健康人类供体的全血和PBMC样本对用h10F6.V1治疗的应答与抗CD3抗体或SEB治疗(分别为用于PBMC和全血测定的阳性对照)、具有N297G Fc-结构域突变同种型对照治疗的人源化的抗鸡溶菌酶IgG1(同种型阴性对照)以及无治疗对照进行比较。全血样本以可溶形式处理，并且PBMC以板结合的湿包被的形式处理。两种处理形式中，在0.002、0.02、0.2、2和20μg/ml下检查了h10F6.V1的浓度依赖性应答。在单个时间点(即治疗后24小时)评估细胞因子释放以用于诱导IL-2、IL-6TNFα和IFNγ。
在任何测试的浓度或条件下，h10F6.V1处理均未诱导任何显著的IL-2、TNFα和IFNγ细胞因子释放。h10F6.V1处理在全血可溶形式中没有诱导任何显著的IL-6释放。在h10F6处理后，所有供体在PBMC板结合的湿包被的形式中具有低至中等水平的IL-6。在用h10F6.V1处理的样本中观察到的IL-6水平与同种型IgG1阴性对照抗体处理相当，并且当以相同浓度使用时低于抗CD3阳性对照。在h10F6.V1的浓度和测量的IL-6水平之间没有观察到相关性。当在来自10名健康人类供体的全血(例如，可溶性处理形式)或PBMC(例如，板结合的湿包被处理形式)中进行测试时，h10F6未显示IL-2、IL-6、TNFα或IFNγ的体外细胞因子释放超过阴性对照的证据。
实例18：示例性替代抗体的药理学
A.在Expi-HEK293细胞中生产替代抗体非临床测试材料
h10F6不与在测试的非临床物种中表达的CD200R1发生交叉反应，所述非临床物种包含小鼠、大鼠、兔、狗和非人类灵长类动物(恒河猴、狨猴和食蟹猴)。因此，开发了与食蟹猴CD200R1结合的完全人源化的替代抗体h10F6.V1，以评估与CD200R1抑制相关的潜在危害。h10F6.V1是h10F6的变体，并且除了重链互补性决定区(CDR)区中的3个氨基酸和轻链CDR区中的1个氨基酸之外，共有相同的初级序列。
h10F6.V1是在Expi-HEK293表达系统中使用与针对h10F6所述相同的工艺产生的。h10F6.V1的特性在下表17中提供。
表17：h10F6.V1材料的特性
Figure BDA0003968761560000801
B.替代抗体与从食蟹猴分离的PBMC的结合
为了证实h10F6.V1与在食蟹猴细胞上表达的内源性CD200R1结合，使用来自食蟹猴的PBMC通过流式细胞术来确定h10F6.V1与外周免疫细胞亚群的结合。
在从3只猴子分离的PBMC中，h10F6.V1显示出预期的与CD4+T细胞的结合(图27)。通过测试h10F6.V1的系列稀释液来评估与T细胞的结合。观察到剂量依赖性结合，其中EC50值在0.34至1.54nM的范围内。
C.通过替代抗体阻断MfCD200/MfCD200R1相互作用
使用ELISA进行h10F6.V1阻断MfCD200R1与固定化的MfCD200结合的能力。替代抗体阻断了MfCD200R1:MfCD200相互作用，其中阻断IC50值为2.45nM，如图28所示。
人单核细胞系K562被工程改造以稳定地表达MfCD200R1。MfCD200R1序列是通过生物信息学分析和使用从来自2个供体的猴子食道中提取的RNA进行的实验序列确认明确确定的。通过FACS证实了与非糖基化的hIgG1 Fc标签融合的MfCD200与表达MfCD200R1的K562细胞的结合。这种结合被h10F6.V1有效阻断(IC50＝0.50nM)，而非MfCD200R1结合剂h10F6没有阻断这种相互作用。(图29)。
D.替代抗体在食蟹猴体内的单剂量药代动力学
h10F6.V1是h10F6的替代物，对来自食蟹猴的CD200R1具有高的结合亲和力。由于h10F6不与主要毒理学物种食蟹猴的CD200R1结合，因此对h10F6.V1进行了单剂量PK研究，以评估其在食蟹猴中的PK性质和耐受性，并确定其是否适合用于GLP危害识别研究。h10F6.V1在猴子中的浓度-时间PK概况在图30中示出。
猴子中h10F6.V1的平均PK参数总结在下表18中。在向食蟹猴单次IV推注20mg/kg后，h10F6.V1血清浓度以双相方式下降。h10F6.V1的消除与时间呈线性关系，这表明在长达35天内没有ADA或其他非线性消除行为的证据(例如，靶标介导的药物处置；TMDD)。平均终末半衰期为10.2天，并且稳态清除率和估计的分布体积的平均值与在猴子中可以具有线性PK的人源化IgG的典型值一致。
表18：在向食蟹猴单剂量IV施用后替代抗体的PK参数
Figure BDA0003968761560000811
h10F6.V1在猴子中具有线性PK，表明线性、非饱和、非特异性清除机制是在猴子中在20mg/kg研究剂量下消除h10F6.V1的主要因素。基于临床观察和血清化学和血液学参数的评估，h10F6.V1到第35天良好地耐受(参见第14.2.3.1节)。因此，h10F6.V1在猴子中的PK和耐受性支持其作为h10F6的替代物的适用性及其在GLP毒理学研究中的用途。
实例19：使用替代抗体的毒理学研究
对h10F6与在其他物种中表达的CD200R1结合的评估表明，它不与在用于评估非临床安全性的物种中表达的CD200R1发生交叉反应。因此，不可能评估h10F6在药理学相关动物物种中的潜在毒性，并开发了与来自食蟹猴的CD200R1结合的替代抗体h10F6.V1，以评估非临床安全性以用于危险识别的目的。
A.在食蟹猴中的单剂量研究中的耐受性
在单次IV推注(2mL/kg，20mg/kg)后，h10F6.V1在食蟹猴(3只雄性)中良好地耐受。在到达研究地点后，由经过认证的兽医人员对动物进行一般健康筛查。仅将临床病理参数与菌落特异性参考数据一致的健康状况良好的动物置于研究中。在给药日，在给药后第一个6小时的每个样本采集时间点之前和之后观察动物并且在样本采集的每个后续时间点再次观察动物。在给药后，每天至少两次观察动物的显著临床体征、死亡率以及疼痛和痛苦的迹象，并且每天至少一次观察动物的一般健康和外观。在给药前、在给药时和在给药后至少每周记录体重。在给药前、给药后24小时和给药后35天收集血液以评估血液学和血清化学的变化。没有早期死亡或濒死状态，并且没有与测试制品相关的临床体征、体重、血液学或临床化学的变化。没有观察到明显的毒性，这可以表明在20mg/kg的单次IV剂量后对食蟹猴中CD200/CD200R1相互作用的抑制是危险的。
B.在食蟹猴中重复给药研究中的毒理学和安全药理学
重复剂量GLP研究可以确定h10F6.V1在每周一次通过缓慢推注IV注射(例如持续4周)对雄性和雌性食蟹猴给药时的潜在毒性，以用于危险鉴定与CD200/CD200R1相互作用的破坏潜在相关的毒性。本研究还可以评估6周恢复期后任何发现的潜在可逆性。此外，还可以评估TK特征和探索性生物标志物。可以基于非GLP单剂量PD研究选择剂量，如上文所述。基于RO预测，100mg/kg/剂量可以提供更长的靶标饱和期。10mg/kg/剂量水平不会产生可观察到的适应症，并且可以在每周一次的给药间隔内提供约99％的RO。在下表19中提供了研究设计。
表19：食蟹猴通过静脉输注替代抗体的4周GLP毒理学研究的研究设计
Figure BDA0003968761560000821
可以评估测试制品对标准毒理学终点的相关影响，包含临床观察、体重、体重变化、食物消耗、眼科、血液学、临床化学、凝血、尿液分析、器官重量、宏观和微观组织病理学。此外，可以监测对安全药理学参数(神经行为、心电图、心率、血压或呼吸频率)的影响。除了标准参数外，例如使用经过验证的测定可以监测对外周血免疫表型参数(CD3、FoxP3、CD25、CD159a、CD20、CD4、Ki67和CD8)和细胞因子(IL-2、IL-6、IL-8、MCP-1、IFNγ和TNFα)水平的影响。可以收集用于TK和探索性生物标志物分析的样本进行评估。也可以评估局部耐受性。
在本研究中评估了以下参数和终点：死亡率、临床观察、体重、定性食物消耗、眼科、定性心电图、体温、神经系统检查、呼吸频率、临床病理学参数(血液学、凝血、临床化学和尿液分析)、生物分析和毒代动力学参数、抗药物抗体参数、免疫表型分析、受体占据分析、细胞因子分析、探索性血浆加工、探索性全血RNA、器官重量以及宏观和显微镜检查。
每周一次通过静脉推注向食蟹猴施用10mg/kg或100mg/kg的h10F6.V1持续4周与临床观察、食物消耗、体重、眼科检查、心电学、体温、神经学检查、呼吸率、血液学、凝血、临床化学、尿液分析参数或骨髓细胞学的变化无关。
对于免疫表型分析，h10F6.V1相关变化仅限于在10mg/kg和100mg/kg组中在给药前第15天和第29天观察到的T淋巴细胞、CD25+T淋巴细胞和NK细胞上Ki67表达的增加。在第1天：给药后48小时和给药前第8天在10mg/kg时，并且在第1天：给药后48小时至第63天恢复期结束在100mg/kg时，h10F6.V1的施用导致嗜中性粒细胞上的游离受体的百分比的降低和受体占据百分比(RO％)的增加。在第22天：给药后48小时，对于两个剂量组，T辅助淋巴细胞上的总受体％也增加，并且在第1天：给药后48小时至第29天，对于两个剂量组，T淋巴细胞上的RO％增加。这些增加到第50天恢复到接近基线。在两个剂量组的任何其他测试的细胞群体或活化标记物中均未存在与h10F6.V1相关的变化。
细胞因子评估显示，与研究前和对照范围相比，所有给药的动物在任何时间点，血浆IL-2、IL-6、IL-8、MCP-1、IFN-γ和TNF-α浓度均无变化，这可能归因于h10F6.V1施用。
对于显微镜评估，在终末安乐死时，在一只施用100mg/kg的雌性的大脑(轻度)和眼睛(轻度)、施用≥10mg/kg的动物的肾上腺(最小)和施用100mg/kg的雄性的脑垂体(最小)中观察到单核细胞浸润的较高发生率和/或严重程度。在恢复安乐死时，在一名施用100mg/kg的雄性的大脑(轻度)、一名施用100mg/kg的雌性的肾上腺(最小)和施用100mg/kg的雄性的脑垂体(最小)中观察到单核细胞浸润的较高发生率和/或严重程度。单核细胞浸润可以作为背景发现或与生物制剂的施用相关联地观察。在给药的动物中观察到的较高发生率和/或严重程度、不同性别之间发生率的不一致性以及严重程度差异的低幅度表明，这些浸润最有可能代表与生物制剂的施用相关的非特异性类效应，而不是与h10F6.V1相关的直接效应；然而，不能完全排除与h10F6.V1相关的促成和/或直接效应。在终末期和恢复期安乐死中，未观察到与h10F6.V1相关的器官重量差异或宏观发现。
总之，在第1、8、15和22天每周一次通过静脉内(缓慢推注)注射施用在≤100mg/kg水平的h10F6.V1在食蟹猴中良好地耐受性。组织病理学变化包含脑、眼(仅终末安乐死)以及垂体(100mg/kg)和肾上腺(≥10mg/kg)中的单核细胞浸润。这些变化可能与来自抗药物抗体的免疫复合物有关并且被认为是无害的。基于这些结果，未观察到的不利影响水平被认为是100mg/kg。
实例20：h10F6和替代抗体的比较药理学总结
使用在Expi-293HEK细胞中产生的材料产生的初步数据表明h10F6.V1与重组MfCD200R1以2.63nM的KD结合，证明其对MfCD200R1的结合亲和力可以与h10F6对hCD200R1的结合亲和力相当(在约20倍以内)，如下表20所示。与重组蛋白结合研究的结果一致，测试的替代抗体可以与表达CD200R1的原代食蟹猴CD4+T细胞结合，具有与h10F6与人T细胞结合相当的亲和力(在约4倍以内；表20)。此外，体外阻断研究的结果表明，在ELISA和基于MfCD200R1过度表达细胞的系统中，h10F6.V1能够阻断MfCD200R1和MfCD200之间的相互作用，其效力与h10F6对人hCD200R1和hCD200的效力相当，在约6至7倍之内；表20)。
表20：h10F6和替代抗体的比较药理学
Figure BDA0003968761560000841
总之，这些结果表明替代抗体h10F6.V1可以以与h10F6对hCD200R1:hCD200结合的抑制相当的方式抑制MfCD200R1:MfCD200的结合。
h10F6和h10F6.V1的比较药代动力学
当在食蟹猴中以20mg/kg的单剂量通过IV推注施用时，h10F6V1和h10F6的PK性质相似。h10F6.V1和h10F6的平均终末半衰期分别为10.2天和11.5至13.3天，并且它们的暴露量相当(如通过Cmax和AUClast测量的在1.5倍以内)。CHO-K1细胞中产生的h10F6.V1的PK将在GLP危害识别研究中进行评估。h10F6是一种hCD200R1特异性、非糖基化和中性带电荷的IgG抗体，因此当h10F6在CHO-K1细胞或Expi-HEK293细胞中产生时，预计具有相似的PK性质。
尽管出于清楚和理解的目的通过实例和说明的方式对本发明的前述公开进行了详细描述，但是包括本文所描述的实例、说明和实施例的本公开仅出于说明性目的，意图为示例性的并且不应将其解释为限制本公开。对于所属领域技术人员将显而易见的是，可以对本文所描述的实例、说明和实施例进行各种修改或改变，并且将其包括在本公开和随附权利要求书的精神和范围内。此外，本领域技术人员将认识到与本文所述的那些方法和程序相当的许多方法和程序。所有这些等同物应理解所有此类等效物应被理解为在本公开的范围内并且由随附权利要求书覆盖。
在随附权利要求书中阐述了本发明的另外的实施例。
这此处提及的所有出版物、专利申请、专利或其他文件的公开内容出于所有目的明确通过引用整体并入，其程度与每个此类单独的出版物、专利、专利申请或其他文件单独明确指出出于所有目的，通过引用将其整体并入本文，并且在本文中对其进行了整体阐述。如果冲突，将以本说明书(包括指定术语)为准。
参考文献
1.Mihrshahi等人，(2009)“Dok2和RasGAP在CD200受体介导的人类骨髓细胞的调节中的重要作用(Essential Roles for Dok2 and RasGAP in CD200 Receptor-MediatedRegulation of Human Myeloid Cells)”，《免疫学杂志》，183:4879-4886。
2.Mihrshahi等人，(2010)“酪氨酸激酶1和2的下游在CD200受体信号传导中起相反的作用(Downstream of Tyrosine Kinase 1and 2Plays Opposing Roles in CD200Receptor Signaling)”，《免疫学杂志》，185:7216-7222
3.Wang等人，(2019)“Siglec-15作为免疫抑制剂和归一化癌症免疫疗法的潜在靶点(Siglec-15as an immune suppressor and potential target for normalizationcancer immunotherapy)”，《自然医学》，第25卷：656-666。
4.Woodle,E.Steve等人，(1999)，“人源化的Fc受体非结合OKT3抗体huOKT3Yγ1(Ala-Ala)在治疗急性肾同种异体移植排斥的1期试验(Phase 1Trial of a Humanized、FcReceptor Nonbinding OKT3 Antibody、huOKT3Yγ1(Ala-Ala)in the Treatment ofAcute Renal Allograft Rejection)”，《移植》，68(5)：608-616(1999))。
5.Linsley P.S.等人，“黑色素瘤中干扰素基因簇的拷贝数丢失与减少的T细胞浸润和不良的患者预后有关(Copy Number Loss of the Interferon Gene Cluster inMelanomas Is Linked to Reduced T Cell Infiltrate and Poor PatientPrognosis)”，《公共科学图书馆·综合》，9(10)：e109760(2014)。
序列表
<110> 23和我公司
Y•陈
J•B•芬诺
G•福-凯利
Y-M•黄
W-J•钟
E•E•卡尔
C•蕾
S•J•皮茨
L•肖夫
<120> 抗CD200R1抗体及其使用方法
<130> 09402.007PV1
<160> 97
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
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<213> 智人（Homo sapiens）
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<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
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130 135 140
Val Ser Leu His Tyr Lys Tyr Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Ile Phe Trp Lys Val Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Phe Glu Asn Ser Thr Val Thr Gln Ser His Pro Asn Gly Thr
180 185 190
Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Val Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val
195 200 205
Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp
210 215 220
Phe Lys Gln Thr Phe Asp Lys Gly
225 230
<210> 9
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
100 105 110
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Pro Gly
225
<210> 10
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Ser
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Leu Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Ser Gly Asn Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
His Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr
1 5
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Val Phe Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Pro Leu Thr Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Thr Asn Tyr Ala Val Ser
1 5
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
Val Met Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
Ala Arg Glu Arg Pro Leu Thr Gly Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Thr Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
Leu Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Val Glu Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
Lys Asp Asp Tyr Met His
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro
1 5 10
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Thr Arg Val Glu Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Gln Gln Tyr Asn Glu Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 30
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Leu Gly Leu Arg Arg Val Trp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Lys Asp Asp Tyr Met His
1 5
<210> 32
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Gly Pro
1 5 10
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Thr Arg Gln Leu Gly Leu Arg Arg Val Trp Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Gln Gln Tyr Asn Glu Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 38
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Tyr Ile Lys Asp Asp
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Gly Leu Arg Arg Thr Trp Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Lys Asp Asp Tyr Ile His
1 5
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro
1 5 10
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 41
Ala Arg Gln Leu Gly Leu Arg Arg Thr Trp Tyr Ser Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 42
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 42
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Lys Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser His Thr Ile Asn Leu Asn
20 25 30
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly
35 40 45
Thr Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp Glu Asp
65 70 75 80
Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Trp Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 43
Gln Ala Ser His Thr Ile Asn Leu Asn
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 44
Gly Thr Ser Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 45
Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 46
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 46
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Tyr Ile Lys Asp Asp
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Leu Gly Leu Arg Arg Thr Trp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 47
Lys Asp Asp Tyr Ile His
1 5
<210> 48
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 48
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro
1 5 10
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 49
Thr Arg Gln Leu Gly Leu Arg Arg Thr Trp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 50
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 50
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Lys Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser His Thr Ile Asn Leu Asn
20 25 30
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly
35 40 45
Thr Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp Glu Asp
65 70 75 80
Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Trp Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 51
Gln Ala Ser His Thr Ile Asn Leu Asn
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 52
Gly Thr Ser Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 53
Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 54
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 54
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Ser Ala
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 55
Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 56
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 56
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gln
1 5 10
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 57
Thr Thr Ala Val Gly Ser Tyr
1 5
<210> 58
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 58
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Val
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asn Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 60
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 61
Gln His Asn Arg Glu Leu Leu Thr
1 5
<210> 62
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 62
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met Phe Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 63
Thr Ser Tyr Val Met Phe
1 5
<210> 64
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 64
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1 5 10
<210> 65
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 65
Ala Arg Glu Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Phe Val Tyr Trp
1 5 10
<210> 66
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 66
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Ser
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Gly Asn Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asn
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Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 67
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
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35 40 45
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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 68
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val
20 25 30
Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
35 40 45
Asp Tyr Ser Gly Asn Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
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Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu
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Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 69
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Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
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180 185 190
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195 200 205
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Gly
465
<210> 70
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<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 70
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Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
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Gly Lys
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<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 71
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<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 72
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Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
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<223> 合成多肽
<400> 73
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Gly Lys
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<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 74
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 75
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<220>
<223> 合成多肽
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<220>
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 78
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<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 79
His Gln Ser Asn Trp Asp Pro Pro Thr
1 5
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<211> 118
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<213> 人工（Artificial）
<220>
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<400> 80
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Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Pro Leu Thr Gly Val Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 81
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
Thr Asn Tyr Arg Val Ser
1 5
<210> 82
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 82
Val Met Tyr Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser
1 5 10
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 83
Ala Arg Glu Arg Pro Leu Thr Gly Val Met Asp Asn
1 5 10
<210> 84
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 84
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Thr Met Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Val Phe Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Pro Leu Thr Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
Thr Asn Tyr Trp Val Ser
1 5
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 86
Thr Met Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser
1 5 10
<210> 87
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 87
Ala Arg Glu Arg Pro Leu Thr Gly Pro Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 88
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 88
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Asn Tyr Arg Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Met Tyr Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Val Phe Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Pro Leu Thr Gly Val Met Asp Asn Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly
465
<210> 89
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 89
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Asn Tyr Trp Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Thr Met Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Val Phe Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Pro Leu Thr Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly
465
<210> 90
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 90
Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu
1 5 10 15
Trp His Glu Gly Ser Gly Gly His His His His His His His His
20 25 30
<210> 91
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 91
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 92
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 92
tcttgtccac cttggtgctg ctggccgg 28
<210> 93
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 93
tttgtccacc gtggtgctgc tggctggt 28
<210> 94
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 94
gatcagtcca actgttcagg acgcc 25
<210> 95
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 95
acactcagca cgggacaaac tcttctccac agt 33
<210> 96
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 96
acactctgca ggagacagac tcttttccac agt 33
<210> 97
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 97
acactcagca cgggacaaac tcttctccac atg 33

Claims (20)

1.一种抗CD200R1抗体，其包括(i)第一轻链高变区(HVR-L1)、第二轻链高变区(HVR-L2)和第三轻链高变区(HVR-L3)，和/或(ii)第一重链高变区(HVR-H1)、第二重链高变区(HVR-H2)和第三重链高变区(HVR-H3)，其中：
(a)HVR-L1包括选自以下的氨基酸序列：RASESVDYSGNSFMH(SEQ ID NO:11)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO:19)、RASKSISKYLA(SEQ ID NO:27)、RASKSISKYLA(SEQ ID NO:35)、QASHTINLN(SEQ ID NO:43)、QASHTINLN(SEQ ID NO:51)、RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:59)和RASESVDYSGNSFMH(SEQ ID NO:77)；
(b)HVR-L2包括选自以下的氨基酸序列：RASNLES(SEQ ID NO:12)、LTSKLAS(SEQ IDNO:20)、SGSTLQS(SEQ ID NO:28)、SGSTLQS(SEQ ID NO:36)、GTSNLED(SEQ ID NO:44)、GTSNLED(SEQ ID NO:52)、LASNLES(SEQ ID NO:60)和RASNLES(SEQ ID NO:78)；
(c)HVR-L3包括选自以下的氨基酸序列：HQSNEDPPT(SEQ ID NO:13)、QQWSSYPLT(SEQID NO:21)、QQYNEYPWT(SEQ ID NO:29)、QQYNEYPWT(SEQID NO:37)、LQHTYLPWT(SEQ ID NO:45)、LQHTYLPWT(SEQ ID NO:53)、QHNRELLT(SEQ ID NO:61)和HQSNWDPPT(SEQ ID NO:79)；
(d)HVR-H1包括选自以下的氨基酸序列：TNYAVS(SEQ ID NO:15)、KDDYMH(SEQ ID NO:23)、KDDYMH(SEQ ID NO:31)、KDDYIH(SEQ ID NO:39)、KDDYIH(SEQ ID NO:47)、TSYWMH(SEQID NO:55)、TSYVMF(SEQ ID NO:63)、TNYRVS(SEQ ID NO:81)和TNYWVS(SEQ ID NO:85)；
(e)HVR-H2包括选自以下的氨基酸序列：VMWAGGGTNYNS(SEQ ID NO:16)、RIDPANDNTKYAP(SEQ ID NO:24)、RIDPENGNTKYGP(SEQ ID NO:32)、RIDPANGNTKYAP(SEQ IDNO:40)、RIDPANGNTKYAP(SEQ ID NO:48)、AIYPGNSDTNYNQ(SEQ ID NO:56)、YINPYNDDTKYNE(SEQ ID NO:64)、VMYAGGGTNYNS(SEQ ID NO:82)和TMWAGGGTNYNS(SEQ ID NO:86)；
(f)HVR-H3包括选自以下的氨基酸序列：ARERPLTGVMDY(SEQ ID NO:17)、TRVEGRTGTYFDY(SEQ ID NO:25)、TRQLGLRRVWYALDY(SEQ ID NO:33)、ARQLGLRRTWYSLDY(SEQID NO:41)、TRQLGLRRTWYAMDY(SEQ ID NO:49)、TTAVGSY(SEQ ID NO:57)、AREDYYGSRFVYW(SEQ ID NO:65)、ARERPLTGVMDN(SEQ ID NO:83)和ARERPLTGPMDY(SEQ ID NO:87)。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包括：
(a)SEQ ID NO:11的HVR-L1、SEQ ID NO:12的HVR-L2和SEQ ID NO:13的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:15的HVR-H1、SEQ ID NO:16的HVR-H2和SEQ ID NO:17的HVR-H3；
(b)SEQ ID NO:19的HVR-L1、SEQ ID NO:20的HVR-L2和SEQ ID NO:21的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:23的HVR-H1、SEQ ID NO:24的HVR-H2和SEQ ID NO:25的HVR-H3；
(c)SEQ ID NO:27的HVR-L1、SEQ ID NO:28的HVR-L2和SEQ ID NO:29的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:31的HVR-H1、SEQ ID NO:32的HVR-H2和SEQ ID NO:33的HVR-H3；
(d)SEQ ID NO:35的HVR-L1、SEQ ID NO:36的HVR-L2和SEQ ID NO:37的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:39的HVR-H1、SEQ ID NO:40的HVR-H2和SEQ ID NO:41的HVR-H3；
(e)SEQ ID NO:43的HVR-L1、SEQ ID NO:44的HVR-L2和SEQ ID NO:45的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:47的HVR-H1、SEQ ID NO:48的HVR-H2和SEQ ID NO:49的HVR-H3；
(f)SEQ ID NO:51的HVR-L1、SEQ ID NO:52的HVR-L2和SEQ ID NO:53的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:55的HVR-H1、SEQ ID NO:56的HVR-H2和SEQ ID NO:57的HVR-H3；}
(g)SEQ ID NO:59的HVR-L1、SEQ ID NO:60的HVR-L2和SEQ ID NO:61的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:63的HVR-H1、SEQ ID NO:64的HVR-H2和SEQ ID NO:65的HVR-H3；
(h)SEQ ID NO:77的HVR-L1、SEQ ID NO:78的HVR-L2和SEQ ID NO:79的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:81的HVR-H1、SEQ ID NO:82的HVR-H2和SEQ ID NO:83的HVR-H3；}
(i)SEQ ID NO:11的HVR-L1、SEQ ID NO:12的HVR-L2和SEQ ID NO:13的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:85的HVR-H1、SEQ ID NO:86的HVR-H2和SEQ ID NO:87的HVR-H3；
(j)SEQ ID NO:11的HVR-L1、SEQ ID NO:12的HVR-L2和SEQ ID NO:13的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:81的HVR-H1、SEQ ID NO:82的HVR-H2和SEQ ID NO:83的HVR-H3；或者
(k)SEQ ID NO:77的HVR-L1、SEQ ID NO:78的HVR-L2和SEQ ID NO:79的HVR-L3；和/或SEQ ID NO:85的HVR-H1、SEQ ID NO:86的HVR-H2和SEQ ID NO:87的HVR-H3。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括与选自SEQ ID NO:10、18、26、34、42、50、58、66或76的序列具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列；和/或与选自SEQ ID NO:14、22、30、38、46、54、62、67、80或84的序列具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中
(a)所述抗体包括与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(b)所述抗体包括与SEQ ID NO:18具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(c)所述抗体包括与SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:30具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(d)所述抗体包括与SEQ ID NO:34具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:38具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(e)所述抗体包括与SEQ ID NO:42具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:46具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(f)所述抗体包括与SEQ ID NO:50具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:54具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(g)所述抗体包括与SEQ ID NO:58具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:62具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(h)所述抗体包括与SEQ ID NO:66具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:67具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(i)所述抗体包括与SEQ ID NO:76具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:80具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(j)所述抗体包括与SEQ ID NO:66具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:84具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
(k)所述抗体包括与SEQ ID NO:66具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:80具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；或者
(l)所述抗体包括与SEQ ID NO:76具有至少90％同一性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:84具有至少90％同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，所述抗体包括与选自SEQ ID NO:68、71和74的序列具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与选自SEQ ID NO:69、70、72、73、75、88和89的序列具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中：
(a)与SEQ ID NO:68具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:69具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO:68具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:70具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:88具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:72具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO:68具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:89具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(f)与SEQ ID NO:68具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:73具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(g)与SEQ ID NO:68具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:88具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；
(h)与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:89具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；或者
(i)与SEQ ID NO:74具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与SEQ IDNO:75具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中所述抗体的特征在于具有以下性质中的一种或多种：
(a)以1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小、或1×10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:1、2、3和/或4的hu-CD200R1多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(b)以1x 10-8M或更小、1x 10-9M或更小、1x 10-10M或更小或1x 10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1-iso4和hu-CD200R1-iso1；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQID NO:1和/或2的hu-CD200R1-iso4多肽和SEQ ID NO:3和/或4的hu-CD200R1-iso1多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(c)以1x 10-8M或更小、1x 10-9M或更小、1x 10-10M或更小、或1x 10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1-iso4-Alt和hu-CD200R1-iso4-Ref；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:1的hu-CD200R1-iso4-Alt多肽和SEQ ID NO:2的hu-CD200R1-iso4-Ref多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(d)以1x 10-8M或更小、1x 10-9M或更小、1x 10-10M或更小、或1x 10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1-iso4-Alt、hu-CD200R1-iso4-Ref、hu-CD200R1-iso1-Alt和hu-CD200R1-iso1-Ref；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:1的hu-CD200R1-iso4-Alt多肽、SEQ ID NO:2的hu-CD200R1-iso4-Ref多肽、SEQ ID NO:3的hu-CD200R1-iso1-Alt多肽和SEQ ID NO:4的hu-CD200R1-iso1-Ref多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(e)以1x 10-8M或更小、1x 10-9M或更小、1x 10-10M或更小、或1x 10-11M或更小的结合亲和力结合至cyno-CD200R1；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:5的cyno-CD200R1多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(f)以1x 10-8M或更小、1x 10-9M或更小、1x 10-10M或更小、或1x 10-11M或更小的结合亲和力结合至hu-CD200R1和cyno-CD200R1；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:1、2、3和/或4的hu-CD200R1多肽和SEQ ID NO:5的cyno-CD200R1多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(g)阻断hu-CD200-Fc与hu-CD200R1-iso4-Alt(SEQ ID NO:1)、hu-CD200R1-iso4-Ref(SEQ ID NO:2)、hu-CD200R1-iso1-Alt(SEQ ID NO:3)和hu-CD200R1-iso1-Ref(SEQ IDNO:4)的结合，其通过ELISA测量，其中IC50为10nM或更小、7nM或更小、5nM或更小、2nM或更小或1nM或更小；
(h)阻断hu-CD200-Fc与在细胞上表达的hu-CD200R1结合，其中IC50为2.5nM或更小、1nM或更小、或0.5nM或更小；任选地，其中所述细胞为稳定地表达hu-CD200R1的U937细胞；
(i)与人T细胞结合，其中EC50为2.5nM或更小、1nM或更小、或0.5nM或更小；任选地，其中人T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞；
(j)在抗体浓度为100nM或更小、50nM或更小、或10nM或更小的情况下，将来自人类肿瘤细胞的IFNγ产量增加至少1.2倍、1.5倍、2倍或更多；任选地，其中肿瘤细胞类型选自结肠直肠、子宫内膜、肺、黑色素瘤、卵巢、胰腺或前列腺；
(k)相对于IgG对照，将来自hu-CD200-Fc包被的人T细胞的IFNγ和/或IL-2产量增加至少1.2倍、1.5倍、2倍或更多；
(l)将人CD4+T细胞或人Cd8+T细胞的活化增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍或更多；
(m)不使CD200R1信号转导激动；
(n)阻断在用可溶性hu-CD200-Fc处理的U937单核细胞系中pDok2活性的诱导；和/或
(o)阻断由hu-CD200结合hu-CD200R1表达细胞系诱导的NFkβ转录；任选地，其中所述细胞系是表达CD200R1的K562报告物细胞和表达CD200的293T细胞。
8.一种抗CD200R1抗体，其与权利要求1至7中任一项所述的抗体特异性地结合至相同的表位；任选地，其中所述抗体与选自10F6、h10F6、22.1或h22.1的抗体结合至相同的表位。
9.一种编码根据权利要求1至8中任一项所述的抗体的分离的多核苷酸或载体。
10.一种分离的宿主细胞，其包括根据权利要求9所述的寡核苷酸或载体；任选地，其中所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞(例如Y0、NS0、Sp2/0)、猴肾细胞(COS-7)、人胚肾细胞(293)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠睾丸支持细胞(例如，TM4)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞、TR1细胞、医学研究委员会5(MRC 5)细胞和FS4细胞。
11.一种产生抗体的方法，其包括培养根据权利要求10所述的宿主细胞以便产生抗体。
12.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至8中任一项所述的抗CD200抗体和药学上可接受的载剂；任选地，其中所述组合物进一步包括化疗剂或抗体，所述抗体包括对免疫检查点分子的特异性；或任选地，其中所述抗CD200R1抗体是所述组合物的唯一活性剂。
13.一种在受试者中治疗CD200R1介导的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，或向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求12所述的药物组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗有效量为至少约1mg/kg、至少约2mg/kg、至少约10mg/kg、至少约20mg/kg。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗有效量为至少约0.3mg、至少约1.0mg、至少约3.0mg、至少约10mg、至少约30mg、至少约100mg、至少约300mg，或至少约900mg。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗有效量为至少约10mg/kg、至少约20mg/kg或至少约100mg/kg。
17.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中根据权利要求1至8中任一项所述的抗体在所述治疗有效量下没有显著的脱靶标效应。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中根据权利要求1至8中任一项所述的抗体在不超过10mg/kg的剂量下没有显著的脱靶标效应。
19.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中根据权利要求1至8中任一项所述的抗体在不超过20mg/kg的剂量下没有显著的脱靶标效应。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述疾病是癌症；任选地，其中所述癌症选自所述癌症选自肾上腺癌、膀胱癌、肉瘤、微卫星不稳定性高(MSI-H)癌症(包含实体MSI癌)、TMB(肿瘤突变负荷)高肿瘤、错配修复缺陷(dMMR)癌症、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、EGJ腺癌、食道癌、胆囊癌、胃癌(例如胃肠道类癌(GI类癌))、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤(例如胸膜间皮瘤)、非小细胞肺癌、卵巢癌、上皮性卵巢癌、子宫内膜癌、儿童实体癌、胰腺癌、前列腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌(例如甲状腺髓样癌或滤泡状甲状腺癌)、血癌(例如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肾细胞癌、透明细胞肾癌、神经内分泌肿瘤(例如恶性嗜铬细胞瘤和副神经节瘤)和子宫癌。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202400651A (zh) * 2022-05-19 2024-01-01 中國商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 抗cd200r1抗體

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
KR101018134B1 (ko) * 1999-05-13 2011-02-25 쉐링 코포레이션 Ｏｘ2 수용체 동족체
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US7658921B2 (en) 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
AU2003236020B2 (en) 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
PL1718677T3 (pl) 2003-12-19 2012-09-28 Genentech Inc Jednowartościowe fragmenty przeciwciała stosowane jako środki lecznicze
AU2005230848B9 (en) 2004-03-31 2011-06-02 Genentech, Inc. Humanized anti-TGF-beta antibodies
ES2403055T3 (es) 2004-04-13 2013-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-P-selectina
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
WO2006034488A2 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2007042573A2 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Innate Pharma Compositions and methods for treating proliferative disorders
TW200732350A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
KR20080090406A (ko) 2005-11-28 2008-10-08 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
US8212008B2 (en) * 2006-12-22 2012-07-03 Schering Corporation Antibodies to CD200R
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008145138A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Recombinant fucose modified monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering
WO2008145137A2 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Recombinant non glycosylated monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
JP2011516840A (ja) * 2008-04-04 2011-05-26 トリリウム セラピューティクス インコーポレーティッド 可溶性ｃｄ２００に関するアッセイ法
WO2015057906A1 (en) * 2013-10-16 2015-04-23 Janssen Biotech, Inc. Cd200 receptor 1 agonists
CA2874083C (en) * 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases

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