BR112020009336A2

BR112020009336A2 - receptor quimérico de antígenos de alvejamento de bcma, receptor quimérico de antígenos de alvejamento de cd19 e terapias de combinação

Info

Publication number: BR112020009336A2
Application number: BR112020009336-0A
Authority: BR
Inventors: Alfred Garfall; Adam David Cohen; Michael C. Milone; Gabriela Plesa; Edward A. Stadtmauer; Carl H. June
Original assignee: Novartis Ag; The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2018-11-15
Publication date: 2020-10-27
Also published as: RU2020119365A; EP3710040A1; CA3088095A1; US20200360431A1; MX2020004948A; KR20200089285A; TW201922774A; IL274617A; SG11202004512XA; AU2018369883A1; JP2021502979A; WO2019099639A1; CN111787938A; WO2019099639A8

Abstract

A presente invenção refere-se a composições e métodos para tratar doenças associadas à expressão de BCMA. A invenção também se refere a um método de administração de uma terapia com receptor quimérico de antígenos de alvejamento de BCMA (CAR) e um agente terapêutico adicional.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECEP- TOR QUIMÉRICO DE ANTÍGENOS DE ALVEJAMENTO DE BCMA,

RECEPTOR QUIMÉRICO DE ANTÍGENOS DE ALVEJAMENTO DE CD19 E TERAPIAS DE COMBINAÇÃO".

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do nº de Série U.S. 62/586.834 depositado em 15 de novembro de 2017 e nº de Série U.S. 62/588.836 depositado em 20 de novembro de 2017, cujo conteúdo de cada um é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e está incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade. A dita cópia de ASCII, criada em 8 de novembro de 2018, é denominada N2067-7145WO0 SL.txt e tem 676.612 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se, em geral, ao uso de células geneticamente manipuladas para expressar um receptor quimérico de antígenos de alvejamento de proteína de antígeno de maturação das células B (BCMA), opcionalmente em combinação com um agente te- rapêutico adicional, para tratar uma doença associada à expressão de BCMA. A invenção descreve adicionalmente biomarcadores prognósti- cos para terapias alvejadas para BCMA.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] BCMA é um membro do receptor da família de necrose tu- moral (TNFR) expresso em células da linhagem de células B. A ex- pressão de BCMA é a mais alta em células B terminalmente diferenci- adas que assumem o destino de células plasmáticas de vida longa, incluindo células plasmáticas, plasmoblastos e uma subpopulação de células B ativadas e células B de memória. BOCMA está envolvido na mediação da sobrevivência de células plasmáticas para manter imuni- dade humoral de longa duração. A expressão de BCMA foi recente- mente associada a vários cânceres, doenças autoimunes e doenças infecciosas. Os cânceres com expressão aumentada de BCMA inclu- em alguns cânceres hematológicos, como mieloma múltiplo (MM), lin- foma de Hodgkin e não Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), várias leucemias (por exemplo, leucemia linfocítica crônica (LLC)), e glioblastoma.

[0005] Dada a necessidade contínua de estratégias aprimoradas para alvejar doenças como câncer, são altamente desejáveis novas composições e métodos para aprimorar os agentes terapêuticos que alvejam BCMA, por exemplo, terapias com receptores quiméricos de antígenos (CAR) anti-BCMA.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A descrição apresenta, pelo menos em parte, um método de tratamento de uma doença ou distúrbio associado à expressão de antígeno de maturação das células B (BCMA), que compreende admi- nistrar ao indivíduo uma terapia com células que expressam CAR de BCMA.

[0007] Em um aspecto, é descrito no presente documento um mé- todo de tratamento de um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que o indivíduo tem mieloma múltiplo de alto risco de estágio Ill (por exemplo, mieloma múltiplo de alto risco de estágio Ill baseado no Re- vised International Staging System), tratando, assim, o indivíduo.

[0008] Em uma modalidade, o indivíduo recebeu terapia de primei- ra linha (por exemplo, terapia de indução, por exemplo, terapia de in- dução que compreende um, dois ou todos dentre: lenalidomida, borte- zomibe ou dexametasona) antes da administração da terapia com cé-

lulas que expressam CAR de BCMA. Em uma modalidade, o indivíduo respondeu ou está respondendo à terapia de primeira linha (por exem- plo, terapia de indução, por exemplo, terapia de indução que compre- ende um, dois ou todos dentre: lenalidomida, bortezomibe ou dexame- tasona). Em uma modalidade, o indivíduo mostrou uma resposta com- pleta, resposta parcial muito satisfatória ou resposta parcial após rece- ber a terapia de primeira linha (por exemplo, terapia de indução, por exemplo, terapia de indução que compreende um, dois ou todos den- tre: lenalidomida, bortezomibe ou dexametasona).

[0009] Em um aspecto, é descrito no presente documento um mé- todo de tratamento de um indivíduo que tem uma doença associada à expressão de BCMA (por exemplo, mieloma múltiplo de alto risco de estágio Ill, por exemplo, mieloma múltiplo de alto risco de estágio Ill baseado no Revised International Staging System), que compreende administrar ao indivíduo uma terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que a terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada após a terapia de primeira linha (por exemplo, terapia de indução, por exemplo, terapia de indução que compreende um, dois ou todos dentre: lenalidomida, bortezomibe ou dexametaso- na), em que o indivíduo respondeu ou está respondendo à terapia de primeira linha (por exemplo, terapia de indução, por exemplo, terapia de indução que compreende um, dois ou todos dentre: lenalidomida, bortezomibe ou dexametasona), por exemplo, o indivíduo mostrou uma resposta completa, resposta parcial muito satisfatória ou resposta parcial após receber a terapia de primeira linha (por exemplo, terapia de indução, por exemplo, terapia de indução que compreende um, dois ou todos dentre: lenalidomida, bortezomibe ou dexametasona).

[0010] Em algumas modalidades, o método descrito no presente documento compreende adicionalmente administrar ao indivíduo uma terapia com células que expressam CAR de CD19. Sem se ater à teo-

ria, mieloma múltiplo pode ser mediado, pelo menos em parte, por um subconjunto menor de células do mieloma múltiplo com propriedades de células-tronco cancerígenas, que se assemelham a linfócitos B e expressam CD19. Uma terapia com células que expressam CAR de CD19 pode aumentar a eficácia de uma terapia com células que ex- pressam CAR de BCMA alvejando células cancerígenas de linhagem inicial, por exemplo, células-tronco cancerígenas, modulando a respos- ta imunológica, depletando as células B reguladoras e/ou melhorando o microambiente tumoral. Em algumas modalidades, a terapia com cé- lulas que expressam CAR de CD19 é administrada antes, simultanea- mente ou após a administração da terapia com células que expressam CAR de BCMA. Em algumas modalidades, a terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada simultaneamente com a ad- ministração da terapia com células que expressam CAR de BCMA.

[0011] Em algumas modalidades, a terapia com células que ex- pressam CAR de BCMA é administrada em uma única infusão ou uma infusão de dose dividida. Em algumas modalidades, a terapia com cé- lulas que expressam CAR de BCMA é administrada em uma única in- fusão. Em algumas modalidades, a terapia com células que expres- sam CAR de BCMA é administrada em uma dosagem de cerca de 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5x 108, 6 x 108, 7 x 10º, 8 x 108 ou 9 x 10º células (por exemplo, células viáveis que expressam CAR), por exemplo, cerca de 5 x 108 células (por exemplo, células viáveis que expressam CAR), por exemplo, cerca de 5 x 10º células (por exemplo, células viáveis que expressam CAR) em uma única infusão.

[0012] Em algumas modalidades, a terapia com células que ex- pressam CAR de CD19 é administrada em uma única infusão ou uma infusão de dose dividida. Em algumas modalidades, a terapia com cé- lulas que expressam CAR de CD19 é administrada em uma única infu- são. Em algumas modalidades, a terapia com células que expressam

CAR de CD19 é administrada em uma dosagem de cerca de 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 10º ou 9 x 10º célu- las (por exemplo, células viáveis que expressam CAR), por exemplo, cerca de 5 x 10º células (por exemplo, células viáveis que expressam CAR), por exemplo, cerca de 5 x 10º células (por exemplo, células viá- veis que expressam CAR) em uma única infusão.

[0013] Em algumas modalidades, o método descrito no presente documento compreende adicionalmente administrar ao indivíduo um agente condicionador (por exemplo, um agente de linfodepleção, por exemplo, uma quimioterapia por linfodepleção, por exemplo, ciclofos- famida e/ou fludarabina) antes da administração da terapia com célu- las que expressam CAR de BCMA ou da terapia com células que ex- pressam CAR de CD19. Em algumas modalidades, a terapia com célu- las que expressam CAR de BCMA e/ou a terapia com células que ex- pressam CAR de CD19 são administradas 2, 3 ou 4 dias, por exemplo, 3 dias após a administração do agente condicionador ser concluída (por exemplo, após a administração de uma última dose do agente de linfodepleção, por exemplo, uma última dose da quimioterapia por lin- fodepleção, por exemplo, uma última dose de ciclofosfamida e/ou flu- darabina). Em algumas modalidades, o método descrito no presente documento compreende adicionalmente antes da administração do agente condicionador (por exemplo, o agente de linfodepleção, por exemplo, a quimioterapia por linfodepleção, por exemplo, ciclofosfami- da e/ou fludarabina), obter uma amostra (por exemplo, uma amostra de aférese) do indivíduo e produzir a terapia com células que expres- sam CAR de BCMA e/ou a terapia com células que expressam CAR de CD19 usando a amostra.

[0014] Em algumas modalidades, o método descrito no presente documento compreende adicionalmente administrar um agente de manu- tenção (por exemplo, lenalidomida) após a administração da terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou a terapia com células que expressam CAR de CD19, por exemplo, 28, 29, 30, 31 ou 32 dias após a administração da terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou a terapia com células que expressam CAR de CD129.

[0015] Em um aspecto, é descrito no presente documento um mé- todo de avaliar a eficácia de uma terapia com células que expressam CAR em um indivíduo que tem uma doença associada à expressão de BCMA (por exemplo, mieloma múltiplo de alto risco de estágio Ill, por exemplo, mieloma múltiplo de alto risco de estágio Ill baseado no Re- vised International Staging System), em que o indivíduo recebeu ou está recebendo a terapia com células que expressam CAR, e em que a terapia com células que expressam CAR compreende uma combina- ção de uma terapia com células que expressam CAR de BCMA e uma terapia com células que expressam CAR de CD19, compreendendo: (i) adquirir um primeiro valor do nível de resposta imunoló- gica anti-SOX2 (por exemplo, resposta de anticorpos anti-SOX2 ou resposta de células T) no indivíduo, por exemplo, em uma amostra do indivíduo, e/ou (ii) adquirir um segundo valor de nível ou atividade de SOX2 (por exemplo, nível de expressão de SOX2) no indivíduo, por exemplo, em uma amostra do indivíduo, pelo menos um ponto no tempo após o indivíduo começar a receber a terapia com células que expressam CAR, em que: (1) um aumento no primeiro valor, em comparação com um primeiro valor de referência, e/ou uma redução no segundo valor, em comparação com um segundo valor de referência, indica que a terapia com células que expressam CAR é eficaz no indivíduo (por exemplo, o indivíduo responde à terapia com células que expressam CAR); e (2) uma redução no primeiro valor, em comparação com um primeiro valor de referência, e/ou um aumento no segundo valor, em comparação com um segundo valor de referência, indica que a terapia com células que expressam CAR é ineficaz ou minimamente eficaz no indivíduo (por exemplo, o indivíduo não responde ou responde apenas minimamente à terapia com células que expressam CAR); em que

(i) o primeiro valor de referência é:

o nível de resposta imunológica anti-SOX2 (por exemplo, resposta de anticorpos anti-SOX2 ou resposta de células T) no indiví- duo antes do pelo menos um ponto no tempo (por exemplo, antes de o indivíduo começar a receber a terapia com células que expressam CAR, ou após o indivíduo começar a receber a terapia com células que expressam CAR, porém antes do pelo menos um ponto no tem- Po);

o nível de resposta imunológica anti-SOX2 (por exemplo, resposta de anticorpos anti-SOX2 ou resposta de células T) em um indivíduo diferente que tem a doença associada à expressão de BCMA; ou um nível médio de resposta imunológica anti-SOX2 (por exemplo, resposta de anticorpos anti-SOX2 ou resposta de células T) em uma população de indivíduos que tem a doença associada à ex- pressão de BCMA; e

(ii) o segundo valor de referência é:

o nível ou atividade de SOX2 (por exemplo, nível de ex- pressão de SOX2) no indivíduo antes do pelo menos um ponto no tempo (por exemplo, antes de o indivíduo começar a receber a terapia com células que expressam CAR, ou após o indivíduo começar a re- ceber a terapia com células que expressam CAR, porém antes do pelo menos um ponto no tempo);

o nível ou atividade de SOX2 (por exemplo, nível de ex- pressão de SOX2) em um indivíduo diferente que tem a doença asso- ciada à expressão de BCMA; ou um nível ou atividade média de SOX2 (por exemplo, nível de expressão de SOX2) em uma população de indivíduos que tem a doença associada à expressão de BCMA; avaliando assim a eficácia de uma terapia com células que expressam CAR.

[0016] Em um aspecto, é descrito no presente documento um mé- todo de tratamento de um indivíduo que tem uma doença associada à expressão de BCMA (por exemplo, mieloma múltiplo de alto risco de estágio Ill, por exemplo, mieloma múltiplo de alto risco de estágio Ill baseado no Revised International Staging System), que compreende: em resposta à determinação que o indivíduo, após a admi- nistração de uma terapia com células que expressam CAR que com- preende uma combinação de uma terapia com células que expressam CAR de BCMA e uma terapia com células que expressam CAR de CD19, não obteve, ou não foi identificado como tendo obtido, um au- mento no nível de resposta imunológica anti-SOX2 (por exemplo, res- posta de anticorpos anti-SOX2 ou resposta de células T) e/ou uma re- dução no nível ou atividade de SOX2 (por exemplo, nível de expressão de SOX2) no indivíduo, por exemplo, em uma amostra do indivíduo, administrar uma segunda terapia ou procedimento ao indivíduo, tra- tando, assim, o indivíduo.

[0017] Em algumas modalidades, a segunda terapia ou procedi- mento é escolhido a partir de um ou mais dentre quimioterapia, uma terapia anticâncer alvejada, um fármaco oncolítico, um agente citotóxi- co, uma terapia com base imunológica, uma citocina, procedimento cirúrgico, um procedimento de radiação, um ativador de uma molécula coestimulante, um inibidor de uma molécula inibidora, uma vacina ou uma imunoterapia celular.

[0018] Em determinadas modalidades dos métodos precedentes, a terapia com células que expressam CAR de BCMA compreende uma célula (por exemplo, uma população de células) que expressa um CAR de BCMA, em que o CAR de BCMA compreende uma ou mais dentre (por exemplo, todas as três dentre) a região determinante complemen- tar de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2 e HCDR3 de qualquer se- quência de aminoácidos de domínio de scFv de BCMA listada na Ta- bela 2 ou 3 e/ou uma ou mais dentre (por exemplo, todas as três den- tre) a região determinante complementar de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3 de qualquer sequência de aminoácidos de domínio de scFv de BCMA listada na Tabela 2 ou 3, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade com a mesma.

[0019] Em determinadas modalidades dos métodos precedentes, a terapia com células que expressam CAR de BCMA compreende uma célula (por exemplo, uma população de células) que expressa um CAR de BCMA, em que o CAR de BCMA compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) listada na Tabela 2 ou 3 e/ou uma região vari- ável de cadeia leve (VL) listada na Tabela 2 ou 3, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma.

[0020] Em determinadas modalidades dos métodos precedentes, a terapia com células que expressam CAR de BCMA compreende uma célula (por exemplo, uma população de células) que expressa um CAR de BCMA, em que o CAR de BCMA compreende uma sequência de aminoácidos de domínio de scFv de BCMA listada na Tabela 2 ou 3 (por exemplo, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145,

SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, e SEQ ID NO: 149), ou uma sequência com 95 a 99% de identidade com a mesma.

[0021] Em determinadas modalidades dos métodos precedentes, a terapia com células que expressam CAR de BCMA compreende uma célula (por exemplo, uma população de células) que expressa um CAR de BCMA, em que o CAR de BCMA compreende uma sequência de aminoácidos de CAR de BCMA de comprimento total listada na Tabela 2 ou 3 (por exemplo, a sequência de aminoácidos do CAR de BCMA imaturo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, e SEQ ID NO: 233), ou uma se- quência com 95 a 99% de identidade com a mesma.

[0022] Em determinadas modalidades dos métodos precedentes, a terapia com células que expressam CAR de BCMA compreende uma célula (por exemplo, uma população de células) que expressa um CAR de BCMA, em que o CAR de BCMA é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos listada na Tabela 2 ou 3 (por exemplo, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159,

SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170), ou uma sequên- cia com 95 a 99% de identidade com a mesma.

[0023] Em determinadas modalidades dos métodos precedentes, a terapia com células que expressam CAR de CD19 compreende uma célula (por exemplo, uma população de células) que expressa um CAR de CD19, em que o CAR de CD19 compreende uma ou mais dentre (por exemplo, todas as três dentre) a região determinante de comple- mentaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2 e HCDR3 listada na Tabela 6 ou 7 e/ou uma ou mais dentre (por exemplo, todas as três dentre) a região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3 listada na Tabela 6 ou 8, ou uma sequên- cia com 95 a 99% de identidade com a mesma.

[0024] Em determinadas modalidades dos métodos precedentes, a terapia com células que expressam CAR de CD19 compreende uma célula (por exemplo, uma população de células) que expressa um CAR de CD19, em que o CAR de CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) de qualquer sequência de aminoácidos de domí- nio de scFv de CD19 listada na Tabela 6 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) de qualquer sequência de aminoácidos de domínio de scFv de CD19 listada na Tabela 6, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade com a mesma.

[0025] Em determinadas modalidades dos métodos precedentes, a terapia com células que expressam CAR de CD19 compreende uma célula (por exemplo, uma população de células) que expressa um CAR de CD19, em que o CAR de CD19 compreende uma sequência de aminoácidos de domínio de scFv de CD19 listada na Tabela 6, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade com a mesma.

[0026] Em determinadas modalidades dos métodos precedentes, a terapia com células que expressam CAR de CD19 compreende uma célula (por exemplo, uma população de células) que expressa um CAR de CD19, em que o CAR de CD19 compreende uma sequência de aminoácidos de CAR de CD19 de comprimento total listada na Tabela 6, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade com a mesma.

[0027] Em determinadas modalidades dos métodos precedentes, a terapia com células que expressam CAR de CD19 compreende uma célula (por exemplo, uma população de células) que expressa um CAR de CD19, em que o CAR de CD19 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos listada na Tabela 6, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade com a mesma.

[0028] Em determinadas modalidades dos métodos precedentes, o indivíduo é um paciente humano.

[0029] Em um aspecto, é descrito no presente documento um mé- todo de tratamento de um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que o indivíduo tem mieloma múltiplo, em que: (1) o indivíduo tem mieloma múltiplo de alto risco de estágio Ill, por exemplo, mieloma múltiplo de alto risco estágio Ill baseado no Revised International Staging System, (ii) o indivíduo mostra beta-2-microglobulina 2 5,5 mg/l e características de FISH de alto risco: deleção 17p, t(14;16), t(14;20), t(4;14); (iii) o indivíduo mostra beta-2-microglobulina > 5,5 mg/l e LDH maior que o limite superior de normalidade; (iv) o indivíduo mostra cariótipo metafásico com > 3 anor- malidades estruturais, exceto hiperdiploidia; (v) o indivíduo tem leucemia de células plasmáticas, por exemplo, o indivíduo mostra > 20% de células plasmáticas no sangue periférico;

(vi) o indivíduo não consegue obter uma resposta parcial ou melhor (por exemplo, com base nos critérios do IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5) a uma combinação de Imid/PI (talidomida, lenalidomida ou pomalidomida em combinação com borte- zomibe, ixazomibe ou carfilzomibe); ou (vii) o indivíduo progride na terapia de primeira linha com uma combinação de Imid/PI| seis meses após o início da terapia, tra- tando, assim, o indivíduo.

[0030] Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada após a terapia de pri- meira linha (por exemplo, terapia de indução, por exemplo, terapia de indução que compreende um, dois ou todas dentre: lenalidomida, bor- tezomibe ou dexametasona) ou terapia de segunda linha, por exemplo, pelo menos três ciclos da terapia de primeira linha ou terapia de se- gunda linha, em que o indivíduo respondeu ou está respondendo à te- rapia de primeira linha ou terapia de segunda linha, por exemplo, o in- divíduo mostrou pelo menos uma resposta mínima, por exemplo, o in- divíduo mostrou uma resposta completa, uma resposta parcial muito satisfatória, uma resposta parcial ou uma resposta mínima após rece- ber a terapia de primeira linha ou terapia de segunda linha, por exem- plo, com base nos critérios de IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5.

[0031] Em um aspecto, é descrito no presente documento um mé- todo de tratamento de um indivíduo que tem uma doença associada à expressão de BCMA, que compreende administrar ao indivíduo uma primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA é adminis- trada após a terapia de primeira linha (por exemplo, terapia de indu- ção, por exemplo, terapia de indução que compreende um, dois ou to- das dentre: lenalidomida, bortezomibe ou dexametasona) ou terapia de segunda linha, por exemplo, pelo menos três ciclos da terapia de primeira linha ou terapia de segunda linha, em que o indivíduo respon- deu ou está respondendo à terapia de primeira linha ou terapia de se- gunda linha, por exemplo, o indivíduo mostrou pelo menos uma res- posta mínima, por exemplo, o indivíduo mostrou uma resposta comple- ta, uma resposta parcial muito satisfatória, uma resposta parcial ou uma resposta mínima após receber a terapia de primeira linha ou tera- pia de segunda linha, por exemplo, com base nos critérios de IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5.

[0032] Em algumas modalidades, o indivíduo não mostrou ou não está mostrando uma resposta completa ou uma resposta completa restrita à terapia de primeira linha ou terapia de segunda linha, por exemplo, com base nos critérios do IMWG 2016, por exemplo, confor- me descrito na Tabela 5.

[0033] Em algumas modalidades, o indivíduo mostrou ou está mostrando uma resposta completa ou uma resposta completa restrita à terapia de primeira linha ou terapia de segunda linha, em que o indi- víduo mostrou ou está mostrando doença residual mínima, por exem- plo, conforme medida por citometria de fluxo de medula óssea, por exemplo, células plasmáticas clonais são detectáveis na medula óssea por citometria de fluxo, por exemplo, com base nos critérios de IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5.

[0034] Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada após a terapia de se- gunda linha, em que o indivíduo avançou para a terapia de segunda linha devido à progressão da doença durante a terapia de primeira |i- nha, em que a progressão da doença ocorreu seis meses após o início da terapia de primeira linha.

[0035] Em algumas modalidades, o indivíduo não recebeu altas doses de melfalano ou transplante autólogo ou alogênico de células-

tronco.

[0036] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente administrar ao indivíduo uma primeira terapia com células que expressam CAR de CD19.

[0037] Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada antes, simultaneamente ou após a administração da primeira terapia com células que expres- sam CAR de BCMA.

[0038] Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada no mesmo dia que a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, opcio- nalmente em que a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada pelo menos uma hora após o término da ad- ministração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA.

[0039] Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada após a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que se o indivíduo de- senvolver reação de infusão aguda após a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada até 48 ho- ras (por exemplo, 24, 36 ou 48 horas) após a administração da primei- ra terapia com células que expressam CAR de BCMA.

[0040] Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma única infusão ou uma infusão de dose dividida. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma única infusão. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma dosa- gem de cerca de 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x

108, 8 x 10º ou 9 x 108 células viáveis que expressam CAR, por exem- plo, cerca de 5 x 108 células viáveis que expressam CAR, por exem- plo, cerca de 5 x 108 células viáveis que expressam CAR em uma úni- ca infusão, por exemplo, por via intravenosa.

[0041] Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma única infusão ou uma infusão de dose dividida. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma única infusão. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma dosa- gem de cerca de 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 10º ou 9 x 108 células viáveis que expressam CAR, por exem- plo, cerca de 5 x 108 células viáveis que expressam CAR, por exem- plo, cerca de 5 x 10º células viáveis que expressam CAR em uma úni- ca infusão, por exemplo, por via intravenosa.

[0042] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente administrar ao indivíduo um primeiro agente condicionador (por exemplo, um agente de linfodepleção, por exemplo, uma quimio- terapia por linfodepleção, por exemplo, ciclofosfamida e/ou fludarabi- na) antes da administração da primeira terapia com células que ex- pressam CAR de BCMA e/ou da primeira terapia com células que ex- pressam CAR de CD19. Em algumas modalidades, o método compre- ende administrar ao indivíduo ciclofosfamida e fludarabina antes da administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou da primeira terapia com células que expressam CAR de CD19, opcionalmente em que: (i) ciclofosfamida é administrada em 300 mg/m? por via in- travenosa diariamente durante três dias; e (ii) fludarabina é administrada em 30 mg/m? por via intrave- nosa diariamente durante três dias.

[0043] Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 são administradas 2, 3 ou 4 dias, por exem- plo, 3 dias após a administração do primeiro agente condicionador ser concluída (por exemplo, após a administração de uma última dose do agente de linfodepleção, por exemplo, uma última dose da quimiotera- pia por linfodepleção, por exemplo, uma última dose de ciclofosfamida e/ou fludarabina).

[0044] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente antes da administração do primeiro agente condicionador (por exemplo, o agente de linfodepleção, por exemplo, a quimioterapia por linfodepleção, por exemplo, ciclofosfamida e/ou fludarabina), obter uma primeira amostra (por exemplo, uma amostra de aférese) do indi- víduo e produzir a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 usando a amostra.

[0045] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente, antes da administração do primeiro agente condicionador (por exemplo, o agente de linfodepleção, por exemplo, a quimioterapia por linfodepleção, por exemplo, ciclofosfamida e/ou fludarabina) e após obter a primeira amostra, obter uma segunda amostra (por exemplo, células-tronco) do indivíduo para preparar o transplante autó- logo de células-tronco.

[0046] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente administrar ao indivíduo um agente de manutenção (por exemplo, lenalidomida) após a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA e /ou a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19, por exemplo, após: (i) 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 dias, por exemplo, 28 dias, após a administração da primeira terapia com células que expressam

CAR de BCMA e/ou da primeira terapia com células que expressam CAR de CD19; ou (ii) resolução de grau < 2 de toxicidade relacionada ao tra- tamento.

[0047] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente administrar ao indivíduo uma segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA após a administração do agente de manutenção, em que: (i) cerca de 80 a 100 dias (por exemplo, cerca de 90 dias) decorreram desde a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA; (ii) o mieloma múltiplo do indivíduo progrediu após a admi- nistração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA; ou (iii) o indivíduo exibiu ou está exibindo evidência objetiva de mieloma múltiplo residual após a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA.

[0048] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente administrar ao indivíduo uma segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 após a administração do agente de ma- nutenção, em que > 3% de linfócitos do sangue periférico do indivíduo são CD19+ após a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de CD19, por exemplo, 7 a 28 dias após a adminis- tração da primeira terapia com células que expressam CAR de CD19.

[0049] Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada antes, simultaneamente ou após a administração da segunda terapia com células que expres- sam CAR de BCMA.

[0050] Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada no mesmo dia que a se-

gunda terapia com células que expressam CAR de BCMA, opcional- mente em que a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada pelo menos uma hora após o término da admi- nistração da segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA.

[0051] Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada após a segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que se o indivíduo de- senvolver reação de infusão aguda após a administração da segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada até 48 ho- ras (por exemplo, 24, 36 ou 48 horas) após a administração da segun- da terapia com células que expressam CAR de BCMA.

[0052] Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma única infusão ou uma infusão de dose dividida. Em algumas modalidades, a segun- da terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma única infusão. Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma dosagem de cerca de 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 10º ou 9 x 10º células viáveis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 10º células viáveis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 108 células viáveis que expressam CAR em uma única infusão, por exemplo, por via intravenosa.

[0053] Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma única infusão ou uma infusão de dose dividida. Em algumas modalidades, a segun- da terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma única infusão. Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma dosagem de cerca de 1 x 10%, 2 x 10%, 3 x 108, 4 x 108, 5x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108 ou 9 x 108 células viáveis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 108 células viáveis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 108 células viáveis que expressam CAR em uma única infusão, por exemplo, por via intravenosa.

[0054] Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA é igual à primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA.

[0055] Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é igual à primeira terapia com células que expressam CAR de CD19.

[0056] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente administrar ao indivíduo um segundo agente condicionador (por exemplo, um agente de linfodepleção, por exemplo, uma quimio- terapia por linfodepleção, por exemplo, ciclofosfamida e/ou fludarabi- na) antes da administração da segunda terapia com células que ex- pressam CAR de BCMA e/ou da segunda terapia com células que ex- pressam CAR de CD19. Em algumas modalidades, o método compre- ende administrar ao indivíduo ciclofosfamida e fludarabina antes da administração da segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou da segunda terapia com células que expressam CAR de CD19, opcionalmente em que: (i) ciclofosfamida é administrada em 300 mg/m? por via in- travenosa diariamente durante três dias; e (ii) fludarabina é administrada em 30 mg/m? por via intrave- nosa diariamente durante três dias. Em algumas modalidades, o mé- todo compreende administrar ao indivíduo ciclofosfamida, por exem- plo, a 1,5 gym? antes da administração da segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou da segunda terapia com células que expressam CAR de CD19.

[0057] Em um aspecto, é descrito no presente documento um mé- todo de tratamento de um indivíduo que tem uma doença associada à expressão de BCMA, que compreende administrar ao indivíduo uma primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que o indivíduo tem mieloma múltiplo de alto risco, por exemplo, mieloma múltiplo de alto risco de estágio Ill baseado no Revised International Staging System. Em um aspecto, é descrito no presente documento um método de tratamento de um indivíduo que tem uma doença asso- ciada à expressão de BCMA, que compreende administrar ao indiví- duo uma primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que o indivíduo está recebendo ou recebeu uma terapia de primei- ra linha (por exemplo, terapia de indução, por exemplo, terapia de in- dução compreendendo um, dois ou todos dentre: lenalidomida, borte- zomibe ou dexametasona) ou uma terapia de segunda linha, por exemplo, pelo menos três ciclos da terapia de primeira linha ou terapia de segunda linha, por exemplo, com base nos critérios do IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5, e o indivíduo não progre- diu da terapia de primeira linha ou segunda linha. Em um aspecto, é descrito no presente documento um método de tratamento de um indi- víduo que tem uma doença associada à expressão de BCMA, que compreende administrar ao indivíduo uma primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que o indivíduo mostrou pelo me- nos uma resposta mínima, por exemplo, o indivíduo mostrou uma res- posta parcial muito satisfatória, uma resposta parcial ou uma resposta mínima a uma terapia mais recente recebida pelo indivíduo (por exem- plo, a terapia de primeira linha ou a terapia de segunda linha), por exemplo, com base nos critérios do IMWG 2016, por exemplo, confor- me descrito na Tabela 5.

[0058] Em um aspecto, é descrito no presente documento um mé- todo de tratamento de um indivíduo que tem uma doença associada à expressão de BCMA, que compreende administrar ao indivíduo uma primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que: (i) o indivíduo tem mieloma múltiplo de alto risco, por exemplo, mielo- ma múltiplo de alto risco de estágio Ill baseado no Revised Internatio- nal Staging System; (ii) o indivíduo está recebendo ou recebeu uma terapia de primeira linha (por exemplo, terapia de indução, por exem- plo, terapia de indução compreendendo um, dois ou todos dentre: le- nalidomida, bortezomibe ou dexametasona) ou uma terapia de segun- da linha, por exemplo, pelo menos três ciclos da terapia de primeira linha ou terapia de segunda linha, por exemplo, com base nos critérios do IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5, e o indi- víduo não progrediu da terapia de primeira linha ou segunda linha; e (iii) o indivíduo mostrou pelo menos uma resposta mínima, por exem- plo, o indivíduo mostrou uma resposta parcial muito satisfatória, uma resposta parcial ou uma resposta mínima a uma terapia mais recente recebida pelo indivíduo (por exemplo, a terapia de primeira linha ou a terapia de segunda linha), por exemplo, com base nos critérios do IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5, tratando, assim, o indivíduo.

[0059] Em algumas modalidades, o indivíduo está recebendo ou recebeu uma terapia de primeira linha e não recebeu uma terapia de segunda linha. Em algumas modalidades, o indivíduo não progrediu da terapia de primeira linha. Em algumas modalidades, o indivíduo está recebendo ou recebeu uma terapia de segunda linha e não recebeu uma terapia de terceira linha, em que o indivíduo avançou para a tera- pia de segunda linha devido à progressão da doença durante ou após receber uma terapia de primeira linha, em que a progressão da doença ocorreu um ano após o início da terapia de primeira linha ou seis me- ses após o término da terapia de primeira linha. Em algumas modali- dades, o indivíduo não progrediu da terapia de segunda linha.

[0060] Em algumas modalidades, o indivíduo não mostrou ou não está mostrando uma resposta completa ou uma resposta completa restrita à terapia mais recente recebida pelo indivíduo (por exemplo, a terapia de primeira linha ou a terapia de segunda linha), por exemplo, com base nos critérios do IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5.

[0061] Em algumas modalidades, o indivíduo não recebeu quimio- terapia citotóxica (por exemplo, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposi- de ou cisplatina) com as seguintes exceções: (a) o indivíduo recebeu ciclofosfamida semanalmente em baixa dose (por exemplo, < 500 mg/m?/semana), ou (b) o indivíduo recebeu um único ciclo de infusão contínua de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, as células T são isoladas do indivíduo para fabricar a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA antes de o indivíduo receber quimiote- rapia citotóxica. Em algumas modalidades, o indivíduo não recebeu transplante autólogo ou alogênico de células-tronco. Em algumas mo- dalidades, o indivíduo iniciou a terapia sistêmica para mieloma múltiplo dentro de um ano.

[0062] Em algumas modalidades, o indivíduo mostra beta-2- microglobulina 2 5,5 mg/l e características de FISH de alto risco: dele- ção 17p, t(14;16), t(14;20), t(4;14). Em algumas modalidades, o indiví- duo mostra beta-2-microglobulina 2 5,5 mg/l e LDH maior que o limite superior de normalidade. Em algumas modalidades, o indivíduo mostra cariótipo metafásico com > 3 anormalidades estruturais, exceto hiper- diploidia. Em algumas modalidades, o indivíduo tem leucemia de célu- las plasmáticas, por exemplo, o indivíduo mostra > 20% de células plasmáticas no sangue periférico. Em algumas modalidades, o indiví- duo não consegue obter uma resposta parcial ou melhor (por exemplo, com base nos critérios do IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5) a uma combinação de Imid/PI (talidomida, lenalidomida ou pomalidomida em combinação com bortezomibe, ixazomibe ou car- filzomibe). Em algumas modalidades, o indivíduo progride em uma te- rapia de primeira linha com uma combinação de Imid/PI dentro de um ano (por exemplo, dentro de seis meses) após o início da terapia de primeira linha; ou dentro de seis meses após o término da terapia de primeira linha.

[0063] Em um aspecto, é descrito no presente documento um mé- todo de tratamento de um indivíduo que tem uma doença associada à expressão de BCMA, que compreende administrar ao indivíduo uma primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que o indivíduo tem mieloma múltiplo de alto risco. Em um aspecto, é des- crito no presente documento um método de tratamento de um indiví- duo que tem uma doença associada à expressão de BCMA, que com- preende administrar ao indivíduo uma primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que o mieloma múltiplo do indivíduo recidivou ou foi refratário a pelo menos dois regimes, por exemplo, um inibidor de proteassoma e/ou talidomida ou seu análogo (por exemplo, talidomida, lenalidomida ou pomalidomida). Em um aspecto, é descrito no presente documento um método de tratamento de um indivíduo que tem uma doença associada à expressão de BCMA, que compreende administrar ao indivíduo uma primeira terapia com células que expres- sam CAR de BCMA, em que o indivíduo mostrou pelo menos uma resposta mínima, por exemplo, o indivíduo mostrou uma resposta par- cial muito satisfatória, uma resposta parcial ou uma resposta mínima a uma terapia mais recente recebida pelo indivíduo (por exemplo, uma terapia de terceira linha, por exemplo, uma terapia de resgate, por exemplo, uma terapia de resgate padrão), por exemplo, com base nos critérios do IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5.

[0064] Em um aspecto, é descrito no presente documento um mé- todo de tratamento de um indivíduo que tem uma doença associada à expressão de BCMA, que compreende administrar ao indivíduo uma primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que: (i) o indivíduo tem mieloma múltiplo de alto risco, (ii) o mieloma múlti- plo do indivíduo recidivou ou foi refratário a pelo menos dois regimes, por exemplo, um inibidor de proteassoma e/ou talidomida ou seu aná- logo (por exemplo, talidomida, lenalidomida ou pomalidomida), e (iii) o indivíduo mostrou pelo menos uma resposta mínima, por exemplo, o indivíduo mostrou uma resposta parcial muito satisfatória, uma respos- ta parcial ou uma resposta mínima a uma terapia mais recente recebi- da pelo indivíduo (por exemplo, uma terapia de terceira linha, por exemplo, uma terapia de resgate, por exemplo, uma terapia de resgate padrão), por exemplo, com base nos critérios do IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5, tratando, assim, o indivíduo.

[0065] Em algumas modalidades, o indivíduo não mostrou ou não está mostrando uma resposta completa ou uma resposta completa restrita à terapia mais recente recebida pelo indivíduo (por exemplo, por exemplo, uma terapia de terceira linha, uma terapia de resgate, por exemplo, uma terapia de resgate padrão), por exemplo, com base nos critérios do IMWG 2016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 5. Em algumas modalidades, o indivíduo mostra doença residual detec- tável após receber a terapia mais recente (por exemplo, uma terapia de terceira linha, por exemplo, uma terapia de resgate, por exemplo, uma terapia de resgate padrão).

[0066] Em algumas modalidades, o indivíduo não recebeu uma terapia com células anti-BCMA, por exemplo, uma terapia com células que expressam CAR de BCMA. Em algumas modalidades, o indivíduo progrediu dentro de um ano após o recebimento do transplante de melfalano e células-tronco (por exemplo, transplante autólogo de célu- las-tronco).

[0067] Em algumas modalidades, o método compreende adicio-

nalmente administrar ao indivíduo uma primeira terapia com células que expressam CAR de CD19. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada an- tes, simultaneamente ou após a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é adminis- trada no mesmo dia que a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, opcionalmente em que a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada pelo menos uma hora após o término da administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA. Em algumas modalidades, a primeira tera- pia com células que expressam CAR de CD19 é administrada após a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que se o indivíduo desenvolver reação de infusão aguda após a adminis- tração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é admi- nistrada até 48 horas (por exemplo, 24, 36 ou 48 horas) após a admi- nistração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA.

[0068] Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma única infusão ou uma infusão de dose dividida. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma única infusão. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma infusão de dose dividida, por exemplo, em que o indivíduo recebe cerca de 10% de uma dose total em uma primeira data de infusão, cerca de 30% de uma dose total em uma segunda data de infusão e cerca de 60% de uma dose total em uma terceira data de infusão. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de

BCMA é administrada em uma dosagem de cerca de 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108 ou 9 x 108 células viá- veis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 108 células viá- veis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 10º células viá- veis que expressam CAR, por exemplo, em uma única infusão, por exemplo, por via intravenosa.

[0069] Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma única infusão ou uma infusão de dose dividida. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma única infusão. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma infusão de dose dividida, por exemplo, em que o indivíduo recebe cerca de 10% de uma dose total em uma primeira data de infusão, cerca de 30% de uma dose total em uma segunda data de infusão e cerca de 60% de uma dose total em uma terceira data de infusão. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma dosagem de cerca de 1 x 108, 2x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 10º ou 9 x 10º células viá- veis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 108 células viá- veis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 10º células viá- veis que expressam CAR, por exemplo, em uma única infusão, por exemplo, por via intravenosa.

[0070] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente administrar ao indivíduo um primeiro agente condicionador (por exemplo, um agente de linfodepleção, por exemplo, uma quimio- terapia por linfodepleção, por exemplo, ciclofosfamida e/ou fludarabi- na) antes da administração da primeira terapia com células que ex- pressam CAR de BCMA e/ou da primeira terapia com células que ex- pressam CAR de CD19. Em algumas modalidades, o método compre-

ende administrar ao indivíduo ciclofosfamida e fludarabina antes da administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou da primeira terapia com células que expressam CAR de CD19. Em algumas modalidades, ciclofosfamida é administrada em 300 mg/m? por via intravenosa diariamente durante três dias. Em al- gumas modalidades, fludarabina é administrada em 30 mg/m? por via intravenosa diariamente durante três dias. Em algumas modalidades, a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 são admi- nistradas 2, 3 ou 4 dias, por exemplo, 3 dias após a administração do primeiro agente condicionador ser concluída (por exemplo, após a ad- ministração de uma última dose do agente de linfodepleção, por exemplo, uma última dose da quimioterapia por linfodepleção, por exemplo, uma última dose de ciclofosfamida e/ou fludarabina). Em al- gumas modalidades, o método compreende adicionalmente antes da administração do primeiro agente condicionador (por exemplo, o agen- te de linfodepleção, por exemplo, a quimioterapia por linfodepleção, por exemplo, ciclofosfamida e/ou fludarabina), obter uma primeira amostra (por exemplo, uma amostra de aférese) do indivíduo e produ- zir a primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19 usando a amostra. Em algumas modalidades, o método compreende adicional- mente, antes da administração do primeiro agente condicionador (por exemplo, o agente de linfodepleção, por exemplo, a quimioterapia por linfodepleção, por exemplo, ciclofosfamida e/ou fludarabina) e após obter a primeira amostra, obter uma segunda amostra (por exemplo, células-tronco) do indivíduo para preparar o transplante autólogo de células-tronco.

[0071] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente administrar ao indivíduo um agente de manutenção (por exemplo, lenalidomida) após a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA e /ou a primeira terapia com células que expressam CAR de CD19, por exemplo, após: (i) 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 dias, por exemplo, 28 dias, após a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou da primeira terapia com células que expressam CAR de CD19; ou (ii) re- solução de grau < 2 de toxicidade relacionada ao tratamento.

[0072] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente administrar ao indivíduo uma segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA após a administração do agente de manutenção, em que 80 a 100 dias (por exemplo, 90 dias) decorreram desde a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA. Em algumas modalidades, o método compreende adi- cionalmente administrar ao indivíduo uma segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA após a administração do agente de manutenção, em que o mieloma múltiplo do indivíduo progrediu após a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA. Em algumas modalidades, o método compreende adicional- mente administrar ao indivíduo uma segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA após a administração do agente de manu- tenção, em que o indivíduo exibiu ou está exibindo evidência objetiva de mieloma múltiplo residual após a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA.

[0073] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente administrar ao indivíduo uma segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 após a administração do agente de ma- nutenção, em que > 3% de linfócitos do sangue periférico do indivíduo são CD19+ após a administração da primeira terapia com células que expressam CAR de CD19, por exemplo, 7 a 28 dias após a adminis- tração da primeira terapia com células que expressam CAR de CD129.

Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expres- sam CAR de CD19 é administrada antes, simultaneamente ou após a administração da segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA. Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada no mesmo dia que a segun- da terapia com células que expressam CAR de BCMA, opcionalmente em que a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada pelo menos uma hora após o término da administração da segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA. Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada após a segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA, em que se o indivíduo desenvolver reação de infusão aguda após a administração da segunda terapia com célu- las que expressam CAR de BCMA, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada até 48 horas (por exemplo, 24, 36 ou 48 horas) após a administração da segunda terapia com cé- lulas que expressam CAR de BCMA.

[0074] Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma única infusão ou uma infusão de dose dividida. Em algumas modalidades, a segun- da terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma única infusão. Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma infusão de dose dividida, por exemplo, em que o indivíduo recebe cer- ca de 10% de uma dose total em uma primeira data de infusão, cerca de 30% de uma dose total em uma segunda data de infusão e cerca de 60% de uma dose total em uma terceira data de infusão. Em algu- mas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada em uma dosagem de cerca de 1 x 108º, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5x 108, 6 x 108, 7 x 10º, 8 x 108 ou 9 x 108 células viáveis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 10º células viáveis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 108 células viáveis que expressam CAR em uma única infusão, por exemplo, por via intravenosa.

[0075] Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma única infusão ou uma infusão de dose dividida. Em algumas modalidades, a segun- da terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma única infusão. Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma infusão de dose dividida, por exemplo, em que o indivíduo recebe cer- ca de 10% de uma dose total em uma primeira data de infusão, cerca de 30% de uma dose total em uma segunda data de infusão e cerca de 60% de uma dose total em uma terceira data de infusão. Em algu- mas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é administrada em uma dosagem de cerca de 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5x 108, 6 x 108, 7 x 10º, 8 x 108 ou 9 x 108 células viáveis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 10º células viáveis que expressam CAR, por exemplo, cerca de 5 x 10º células viáveis que expressam CAR em uma única infusão, por exemplo, por via intravenosa.

[0076] Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA é igual à primeira terapia com células que expressam CAR de BCMA. Em algumas modalidades, a segunda terapia com células que expressam CAR de CD19 é igual à primeira terapia com células que expressam CAR de CD19.

[0077] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente administrar ao indivíduo um segundo agente condicionador (por exemplo, um agente de linfodepleção, por exemplo, uma quimio- terapia por linfodepleção, por exemplo, ciclofosfamida e/ou fludarabi-

na) antes da administração da segunda terapia com células que ex- pressam CAR de BCMA e/ou da segunda terapia com células que ex- pressam CAR de CD19. Em algumas modalidades, o método compre- ende administrar ao indivíduo ciclofosfamida e fludarabina antes da administração da segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou da segunda terapia com células que expressam CAR de CD19. Em algumas modalidades, ciclofosfamida é administrada em 300 mg/m? por via intravenosa diariamente durante três dias. Em al- gumas modalidades, fludarabina é administrada em 30 mg/m? por via intravenosa diariamente durante três dias. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo ciclofosfamida, por exemplo, a 1,5 gym? antes da administração da segunda terapia com células que expressam CAR de BCMA e/ou da segunda terapia com células que expressam CAR de CD19.

[0078] Em algumas modalidades dos métodos precedentemente mencionados, a primeira ou segunda terapia com células que expres- sam CAR de BCMA compreende uma célula (por exemplo, uma popu- lação de células) que expressa um CAR de BCMA, em que: (i) o CAR de BCMA compreende uma ou mais dentre (por exemplo, todas as três dentre) a região determinante complementar de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2 e HCDR3 de qualquer sequência de aminoácidos de domínio de scFv de BCMA listada na Tabela 2 ou 3 e/ou uma ou mais dentre (por exemplo, todas as três dentre) a região determinante complementar de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3 de qualquer sequência de aminoácidos de domínio de scFv de BCMA listada na Tabela 2 ou 3, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade com a mesma; (ii) o CAR de BCMA compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) listada na Tabela 2 ou 3 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) listada na Tabela 2 ou 3, ou uma sequência com

95 a 99% de identidade com a mesma;

(iii) o CAR de BCMA compreende uma sequência de ami- noácidos de domínio de scFv de BCMA listada na Tabela 2 ou 3 (por exemplo, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, e SEQ ID NO: 149), ou uma sequência com 95 a 99% de identidade com a mesma;

(iv) o CAR de BCMA compreende uma sequência de ami- noácidos de CAR de BCMA de comprimento total listada na Tabela 2 ou 3 (por exemplo, a sequência de aminoácidos do CAR de BCMA imaturo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, e SEQ ID NO: 233), ou uma se- quência com 95 a 99% de identidade com a mesma; ou

(v) o CAR de BCMA é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos listada na Tabela 2 ou 3 (por exemplo, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58,

SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170), ou uma sequên- cia com 95 a 99% de identidade com a mesma.

[0079] Em algumas modalidades dos métodos precedentemente mencionados, a primeira ou segunda terapia com células que expres- sam CAR de CD19 compreende uma célula (por exemplo, uma popu- lação de células) que expressa um CAR de CD19, em que: (i) o CAR de CD19 compreende uma ou mais dentre (por exemplo, todas as três dentre) a região determinante complementar de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2 e HCDR3 listada na Tabela 6 ou 7 e/ou uma ou mais dentre (por exemplo, todas as três dentre) a região determinante complementar de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDRS3 listada na Tabela 6 ou 8, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade com a mesma; (ii) o CAR de CD19 compreende uma região variável de ca- deia pesada (VH) de qualquer sequência de aminoácidos de domínio de scFv de CD19 listada na Tabela 6 e/ou uma região variável de ca- deia leve (VL) de qualquer sequência de aminoácidos de domínio de scFv de CD19 listada na Tabela 6, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma; (iii) o CAR de CD19 compreende uma sequência de amino- ácidos de domínio de scFv de CD19 listada na Tabela 6, ou uma se- quência com 95 a 99% de identidade com a mesma; (iv) o CAR de CD19 compreende uma sequência de amino-

ácidos de CAR de CD19 de comprimento total listada na Tabela 6, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma; ou (v) o CAR de CD19 é codificado por uma sequência de áci- dos nucleicos listada na Tabela 6, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade com a mesma.

[0080] Em algumas modalidades dos métodos precedentemente mencionados, o indivíduo é um paciente humano.

[0081] A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos no presente documento usados têm o mesmo significado do comumente compreendido pelos entendidos na técnica à qual esta invenção pertence. Apesar de métodos e materiais simila- res ou equivalentes a esses no presente documento descritos pode- rem ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pe- didos de patentes, patentes e outras referências mencionados no pre- sente documento são incorporados por referência na sua totalidade. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos. Títulos, subtítulos ou elementos numerados ou marcados com letras, por exemplo, (a), (b), (i) etc., são apresentados meramente para facilidade de leitura. O uso de títulos ou elementos numerados ou marcados com letras neste documento não requer que os passos ou elementos sejam realizados por ordem alfa- bética ou que os passos ou elementos sejam necessariamente discre- tos entre si.

[0082] Outras características, objetos e vantagens da invenção serão aparentes a partir da descrição e desenhos e a partir das reivin- dicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0083] A seguinte descrição detalhada de modalidades preferenci- ais da invenção será mais bem entendida quando lida em conjunção com as figuras adjuntas. Para o propósito de ilustrar a invenção, são mostradas nas figuras modalidades que presentemente são preferen- ciais. No entanto, deve ser entendido que a invenção não está limitada aos arranjos e aspectos instrumentais precisos das modalidades mos- tradas nas figuras.

[0084] A Figura 1 é um esquema de teste clínico. PR = resposta parcial. Cy/Flu = ciclofosfamida + fludarabina.

DESCRIÇÃO Definições

[0085] A menos que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que é habitualmente entendido por uma pessoa de habili- dade comum na técnica à qual pertence a invenção.

[0086] Como usado no presente documento, o termo "BCMA" se relaciona com o antígeno de maturação de células B. BCMA (também conhecido como TNFRSF17, BOM ou CD269) é um membro da família do receptor de necrose tumoral (TNFR) e é predominantemente ex- presso em células B terminalmente diferenciadas, por exemplo, células B de memória, e células plasmáticas. O seu ligante é denominado ati- vador de células B da família TNF (BAFF) e um ligante indutor da proli- feração (APRIL). BCMA está envolvido na mediação da sobrevivência de células plasmáticas para manter imunidade humoral de longa dura- ção. O gene de BCMA é codificado no cromossomo 16 produzindo um transcrito de mRNA primário de 994 nucleotídeos de comprimento (NCBI acesso NM 001192,2) que codifica uma proteína com 184 ami- noácidos (NP 001183,2). Um segundo transcrito antissentido derivado do locus BCMA foi descrito, que pode desempenhar um papel na regu- lação da expressão de BCMA. (Laabi Y. et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22:1147-1154). Variantes de transcritos adicionais foram descri- tas com importância desconhecida (Smirnova AS et al. Mol Immunol.,

2008, 45(4):1179-1183). Uma segunda isoforma, também conhecida como TVA, foi identificada (Uniprot identificador Q02223-2). Como usado no presente documento, "BCMA!" inclui proteínas compreenden- do mutações, por exemplo, mutações pontuais, fragmentos, inserções, deleções e variantes de encadeamento de BCMA de tipo selvagem completo.

[0087] Como usado no presente documento, o termo "CD19" se refere à proteína 19 de Grupamento de Diferenciação que é um de- terminante antigênico detectável em células precursoras de leucemia. As sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos humanas e mu- rinas podem ser encontradas em uma base de dados pública, tal como GenBank, UniProt e Swiss-Prot. Por exemplo, a sequência de aminoá- cidos de CD19 humana pode ser encontrada em UniProt/Swiss-Prot Nº de Acesso P15391 e a sequência de nucleotídeos codificando a CD19 humana pode ser encontrada no Nº de Acesso NM 001178098. Como usado no presente documento, "CD19" inclui proteínas compreenden- do mutações, por exemplo, mutações pontuais, fragmentos, inserções, eliminações e variantes de splicing de CD19 de tipo selvagem de comprimento total. CD19 é expresso na maioria dos cânceres de |i- nhagem B, incluindo, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda, leu- cemia linfocítica crônica e linfoma não Hodgkin. Outras células que expressam CD19 são proporcionadas abaixo na definição de "doença associada a expressão de CD19". Também é um marcador inicial de progenitores de células B. Ver, por exemplo, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). Em um aspecto, a porção de ligação a antígenos do CART reconhece e se liga a um antígeno no domínio extracelular da proteína CD19. Em um aspecto, a proteína CD19 é expressa em uma célula cancerígena.

[0088] O termo "uma" e "um" refere-se a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento.

[0089] O termo "cerca de", quando se refere a um valor mensurá- vel, como uma quantidade, uma duração temporal e similares, preten- de abranger variações de + 20% ou, em alguns casos, + 10%, ou em alguns casos + 5%, ou em alguns casos + 1%, ou em alguns casos t+ 0,1% do valor especificado, uma vez que tais variações são adequa- das para realizar os métodos descritos.

[0090] O termo "Receptor de Antígeno Quimérico" ou alternativa- mente um "CAR" se refere a um construto de polipeptídeo recombinan- te compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno ex- tracelular, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização citoplasmático (também referido no presente documento como "domí- nio de sinalização intracelular") compreendendo um domínio de sinali- zação funcional derivado de uma molécula estimuladora como definido abaixo. Em algumas modalidades, os domínios no construto de poli- peptídeo CAR estão na mesma cadeia polipeptídica, por exemplo, compreendem uma proteína de fusão quimérica. Em algumas modali- dades, os domínios no construto de polipeptídeo CAR não são contí- guos uns aos outros, por exemplo, estão em diferentes cadeias poli- peptídicas, por exemplo, como proporcionado em um RCAR como descrito neste documento.

[0091] Em um aspecto, a molécula estimuladora do CAR é a ca- deia zeta associada ao complexo do receptor de células T. Em um as- pecto, o domínio de sinalização citoplasmático compreende um domí- nio de sinalização primário (por exemplo, um domínio de sinalização primário de CD3 zeta). Em um aspecto, o domínio de sinalização cito- plasmático compreende adicionalmente um ou mais domínios de sina- lização funcional derivados de pelo menos uma molécula coestimula- dora como definida abaixo. Em um aspecto, a molécula coestimulado- ra é escolhida dentre 4 1BB (isto é, CD137), CD27, ICOS e/ou CD28.

Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domínio de reconhecimento de antígeno extrace- lular, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intrace- lular compreendendo um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimuladora. Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domínio de reconhe- cimento de antígeno extracelular, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização funcional de uma molécula coestimuladora e um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimuladora. Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domínio de reconhecimento de antígeno extrace- lular, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intrace- lular compreendendo dois domínios de sinalização funcional derivados de uma ou mais moléculas coestimuladoras e um domínio de sinaliza- ção funcional derivado de uma molécula estimuladora. Em um aspec- to, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreen- dendo um domínio de reconhecimento de antígeno extracelular, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo pelo menos dois domínios de sinalização funcional derivados de uma ou mais moléculas coestimuladoras e um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimuladora. Em um aspecto, o CAR compreende uma sequência líder opcional no ter- minal amino (N-ter) da proteína de fusão com CAR. Em um aspecto, o CAR compreende ainda uma sequência líder no terminal N do domínio de reconhecimento de antígeno extracelular, em que a sequência líder é opcionalmente clivada a partir do domínio de reconhecimento de an- tígeno (por exemplo, um scFv) durante o processamento celular e lo- calização do CAR na membrana celular.

[0092] Um CAR que compreende um domínio de ligação ao antí-

geno (por exemplo, um scFv, um anticorpo de domínio único ou TOR (por exemplo, um domínio de ligação alfa de TOR ou domínio de liga- ção beta de TCR)) que alveja um marcador tumoral específico X, em que X pode ser um marcador tumoral conforme descrito no presente documento, também é chamado de XCAR. Por exemplo, um CAR que compreende um domínio de ligação a antígeno que tem como alvo BCMA é denominado BCMACAR. O CAR pode ser expresso em qual- quer célula, por exemplo, uma célula imunoefetora conforme descrito no presente documento (por exemplo, uma célula T ou uma célula NK).

[0093] O termo "domínio de sinalização" se refere à porção funcio- nal de uma proteína que atua por transmissão de informação dentro da célula para regular a atividade celular através de vias de sinalização definidas por geração de segundos mensageiros ou funcionamento como efetores por resposta a tais mensageiros.

[0094] O termo "anticorpo", conforme usado no presente docu- mento, refere-se a uma proteína ou sequência de polipeptídeos deri- vada de uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclionais, de cadeia múltipla ou simples, ou imunoglobulinas intactas, e podem ser derivados de fontes naturais ou de fontes recombinantes. Os anti- corpos podem ser tetrâmeros de moléculas de imunoglobulinas.

[0095] O termo "fragmento de anticorpo" se refere a pelo menos uma porção de um anticorpo intacto, ou suas variantes recombinantes, e se refere ao domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, uma regi- ão variável determinante antigênica de um anticorpo intacto, que é su- ficiente para conferir reconhecimento e ligação específica do fragmen- to de anticorpo a um alvo, tal como um antígeno. Exemplos de frag- mentos de anticorpo incluem, mas não se limitam a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, fragmentos de anticorpo scFv, anticorpos lineares,

anticorpos de domínio único tais como sdAb (VL ou VH), domínio de VHH camelídeos e moléculas multiespecíficas formados a partir de fragmentos de anticorpo tais como um fragmento bivalente compreen- dendo dois ou mais, por exemplo, dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça, ou dois ou mais, por exemplo, dois CDRs isolados ou outros fragmentos de ligação ao epí- topo de um anticorpo ligado. Um fragmento de anticorpo pode também ser incorporado em anticorpos de domínio único, maxicorpos, minicor- pos, nanocorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v- NAR e bis-scFv (ver, por exemplo, Hollinger and Hudson, Nature Bio- technology 23:1126-1136, 2005). Fragmentos de anticorpo podem também ser enxertados em moldes baseados em polipeptídeos como uma fibronectina tipo Ill (Fn3) (ver Patente U.S. Nº: 6,703,199, que descreve minicorpos de polipeptídeo de fibronectina).

[0096] O termo "scFv" se refere a uma proteína de fusão compre- endendo pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia leve e pelo menos um fragmento de an- ticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia pesada em que as regiões variáveis de cadeia pesada e leve são ligadas de forma contígua através de um ligante de polipeptídeo flexível curto e capaz de ser expresso como um polipeptídeo de cadeia única, e em que o scFv retém a especificidade do anticorpo intacto do qual deriva. A me- nos que seja especificado, como usado no presente documento, um scFv pode ter as regiões variáveis VL e VH em qualquer ordem, por exemplo, relativamente às extremidades N-terminal e C-terminal do polipeptídeo, o scFv pode compreender VL-ligador-VH ou pode com- preender VH-ligador-VL.

[0097] Os termos "região determinante de complementaridade" ou "CDR", conforme usado no presente documento, se referem às se- quências de aminoácidos dentro de regiões variáveis de anticorpos que conferem especificidade e afinidade de ligação a antígeno.

Por exemplo, em geral existem três CDRs em cada região variável de ca- deia pesada (por exemplo, HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e três CDRs em cada região variável de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3). As fronteiras precisas de sequências de aminoácidos de uma dada CDR podem ser determinadas com o uso de qualquer um dentre diversos esquemas bem conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5.º edi- ção.

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração de "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeração de "Chothia"), ou uma combi- nação dos mesmos.

Sob o esquema de numeração de Kabat, em al- gumas modalidades, os resíduos de aminoácidos de CDR no domínio variável de cadeia pesada (VH) são numerados de 31 a 35 (HCDR1), 50 a 65 (HCDR2) e 95 a 102 (HCDR3); os resíduos de aminoácidos de CDR no domínio variável de cadeia leve (VL) são numerados de 24 a 34 (LCDR1), 50 a 56 (LCDR2) e 89 a 97 (LCDR3). Sob o esquema de numeração de Chothia, em algumas modalidades, os aminoácidos de CDR no VH são numerados de 26 a 32 (HCDR1), 52 a 56 (HCDR2) e 95 a 102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácidos de CDR no VL são numerados de 26 a 32 (LCDR1), 50 a 52 (LCDR2) e 91 a 96 (LCDR3). Em um esquema de numeração combinado de Kabat e Chothia, em algumas modalidades, as CDRs correspondem aos resíduos de ami- noácidos que são parte de uma CDR de Kabat, uma CDR de Chothia ou ambas.

Por exemplo, em algumas modalidades, os CDRs corres- pondem a resíduos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3) em um VH, por exemplo, um VH de mamífero, por exemplo, um VH humano; e resíduos de aminoácidos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) em um VL, por exemplo, um VL de mamífero, por exemplo, um VL humano.

[0098] A porção da composição de CAR da invenção que compre- ende um anticorpo ou seu fragmento de anticorpo pode existir em uma variedade de formas, por exemplo, nas quais o domínio de ligação a antígeno é expresso como parte de uma cadeia polipeptídica incluindo, por exemplo, um fragmento de anticorpo de domínio único (sdAb), um anticorpo de cadeia simples (scFv) ou, por exemplo, um anticorpo hu- manizado (Harlow et a/., 1999, Em: "Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Em: Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, Nova lor- que; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et a/l., 1988, Science 242:423-426). Em um aspecto, o domínio de ligação a antígeno de uma composição de CAR da invenção compre- ende um fragmento de anticorpo. Em um aspecto adicional, o CAR compreende um fragmento de anticorpo que compreende um scFv.

[0099] Como usado no presente documento, o termo "domínio de ligação" ou "molécula de anticorpo" (também chamado no presente documento de domínio de ligação "anti-alvo (por exemplo, "BCMA") se refere a uma proteína, por exemplo, uma cadeia de imunoglobulina ou seu fragmento, compreendendo pelo menos uma sequência de domí- nio variável de imunoglobulina. O termo "domínio de ligação" ou "mo- lécula de anticorpo" abrange anticorpos e fragmentos de anticorpos. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo multiespecífica, por exemplo, compreende uma pluralidade de sequências de domínio variável de imunoglobulina, em que uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina da plurali- dade tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina da plurali- dade tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo multiespecífica é uma molécu- la de anticorpo biespecífica. Um anticorpo biespecífico tem especifici-

dade para não mais do que dois antígenos. Uma molécula de anticor- po biespecífica é caracterizada por uma primeira sequência de domí- nio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. O termo "cadeia pesada de anticorpo" se refere ao maior dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes em moléculas de anti- corpos em suas conformações de ocorrência natural, e que normal- mente determina a classe à qual o anticorpo pertence.

[00100] O termo "cadeia leve de anticorpo" se refere ao menor dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes em moléculas de anti- corpos em suas conformações de ocorrência natural. Cadeias leves kappa (K) e lambda (A) se relacionam com os dois principais isótipos de cadeias leves de anticorpo.

[00101] O termo "anticorpo recombinante" se refere a um anticorpo que é gerado usando tecnologia de DNA recombinante, tal como, por exemplo, um anticorpo expresso por um sistema de expressão de bac- teriófago ou levedura. Também deve ser considerado que o termo sig- nifica um anticorpo que foi gerado pela síntese de uma molécula de DNA codificando o anticorpo e tal molécula de DNA expressa uma pro- teína de anticorpo ou uma sequência de aminoácidos especificando o anticorpo, em que o DNA ou sequência de aminoácidos foram obtidos usando tecnologia de DNA recombinante ou sequência de aminoáci- dos que está disponível e é bem conhecida na técnica.

[00102] O termo "antígeno" ou "Ag" se refere a uma molécula que provoca uma resposta imune. Esta resposta imune pode envolver a produção de anticorpos ou a ativação de células imunologicamente competentes específicas ou ambas. O perito na técnica compreenderá que qualquer macromolécula, incluindo virtualmente todas as proteí- nas ou peptídeos, pode servir como um antígeno. Além disso, os antí-

genos podem ser derivados de DNA recombinante ou genômico. O versado na técnica compreenderá que qualquer DNA, que compreen- de sequências de nucleotídeos, ou uma sequência de nucleotídeos parcial, que codifica uma proteína que produz uma resposta imune co- difica, portanto, um "antígeno", tal como o termo é usado no presente documento. Além disso, o versado na técnica compreenderá que um antígeno não precisa ser codificado apenas por uma sequência de nu- cleotídeos completa de um gene. É evidente que a presente invenção inclui, porém sem limitação, o uso de sequências de nucleotídeos par- ciais de mais de um gene e que essas sequências de nucleotídeos es- tão dispostas em várias combinações para codificar polipeptídeos que produzem a resposta imunológica desejada. Além disso, um perito na técnica compreenderá que um antígeno não precisa ser codificado por um "gene" de modo algum. É prontamente aparente que um antígeno pode ser gerado, sintetizado ou pode ser derivado de uma amostra biológica, ou pode ser uma macromolécula diferente de um polipeptí- deo. Tal amostra biológica pode incluir, porém sem limitação, uma amostra de tecido, uma amostra tumoral, uma célula ou um fluido com outros componentes biológicos.

[00103] O termo "efeito antitumoral" refere-se a um efeito biológico que pode ser manifestado de várias formas, incluindo, mas não se limi- tando a, por exemplo, uma redução no volume tumoral, uma redução do número de células tumorais, uma redução do número de metásta- ses, um aumento da esperança de vida, redução da proliferação de células tumorais, redução da sobrevivência de células tumorais ou me- lhoria de vários sintomas fisiológicos associados à condição cancerí- gena. Um "efeito antitumoral" também pode ser manifestado pela ca- pacidade dos peptídeos, polinucleotídeos, células e anticorpos da in- venção na prevenção da ocorrência de tumor em primeiro lugar.

[00104] O termo "efeito anticancerígeno" refere-se a um efeito bio-

lógico que pode ser manifestado de várias formas, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, uma redução no volume tumoral, uma re- dução do número de células cancerígenas, uma redução do número de metástases, um aumento da esperança de vida, redução da prolife- ração de células cancerígenas, redução da sobrevivência de células cancerígenas ou melhoria de vários sintomas fisiológicos associados à condição cancerígena. Um "efeito anticancerígeno" também pode se manifestar pela capacidade dos peptídeos, polinucleotídeos, células e anticorpos para prevenir a ocorrência de câncer logo de início. O termo "efeito antitumoral" se relaciona com um efeito biológico que pode se manifestar por vários meios, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, um decréscimo do volume tumoral, um decréscimo do núme- ro de células tumorais, um decréscimo da proliferação de células tu- morais ou um decréscimo da sobrevivência de células tumorais. O termo "autólogo" se refere a qualquer material derivado do mesmo in- divíduo, o qual será posteriormente reintroduzido no indivíduo.

[00105] O termo "alogeneico" se refere a qualquer material derivado de um animal diferente da mesma espécie do indivíduo no qual o ma- terial é introduzido. Dois ou mais indivíduos são considerados aloge- neicos um ao outro quando os genes em um ou mais /oci não são idênticos. Em alguns aspectos, material alogeneico de indivíduos da mesma espécie pode ser geneticamente bastante diferente para inte- ragir antigenicamente.

[00106] O termo "xenogeneico" se relaciona com um enxerto deri- vado de um animal de uma espécie diferente.

[00107] O termo "aférese" como usado no presente documento re- fere-se ao processo extracorpóreo reconhecido pela técnica pelo qual o sangue de um doador ou paciente é removido do doador ou paciente e passado através de um aparelho que separa o(s) constituinte(s) es- pecífico(s) selecionado(s) e retorna o restante à circulação do doador ou paciente, por exemplo, por retransfusão. Dessa forma, no contexto de "uma amostra de aférese" refere-se a uma amostra obtida usando aférese.

[00108] O termo "combinação" se relaciona com uma combinação fixa em uma forma unitária de dosagem ou uma administração combi- nada em que um composto da presente invenção e um parceiro de combinação (por exemplo, outro fármaco conforme explicado abaixo, também denominado "agente terapêutico" ou "coagente") pode ser administrado independentemente ao mesmo tempo ou separadamente dentro de intervalos de tempo, especialmente quando estes intervalos de tempo permitem que os parceiros de combinação exibam um efeito cooperativo, por exemplo, sinérgico. Os componentes únicos podem ser embalados em um kit ou separadamente. Um ou ambos os com- ponentes (por exemplo, pós ou líquidos) podem ser reconstituídos ou diluídos até uma dose desejada antes da administração. Os termos "coadministração" ou "administração combinada" ou similares, como usados no presente documento, pretendem abranger a administração do parceiro de combinação selecionado a um único indivíduo em sua necessidade (por exemplo, um paciente) e pretendem incluir os regi- mes de tratamento em que os agentes não são necessariamente ad- ministrados pela mesma via de administração ou ao mesmo tempo. O termo "combinação farmacêutica", como usados no presente docu- mento, significa um produto que resulta da mistura ou combinação de mais de um ingrediente ativo e inclui tanto combinações fixas como não fixas dos ingredientes ativos. O termo "combinação fixa" significa que os ingredientes ativos, por exemplo, um composto da presente invenção e um parceiro de combinação, são ambos administrados a um paciente simultaneamente na forma de uma entidade ou dosagem única. O termo "combinação não fixa" significa que os ingredientes ati- vos, por exemplo, um composto da presente invenção e um parceiro de combinação, são ambos administrados a um paciente como entida- des separadas simultânea, concomitante ou sequencialmente sem |i- mites de tempo específicos, em que tal administração fornece níveis terapeuticamente eficazes dos dois compostos no corpo do paciente. O último também se aplica à terapia de coquetel, por exemplo, a ad- ministração de três ou mais ingredientes ativos.

[00109] O termo "câncer" se refere a uma doença caracterizada pe- lo crescimento rápido e descontrolado de células aberrantes. As célu- las cancerosas podem se disseminar localmente ou através da corren- te sanguínea e sistema linfático para outras partes do corpo. Exemplos de vários cânceres são descritos no presente documento e incluem, porém, sem limitação, câncer da mama, câncer da próstata, câncer do ovário, câncer cervical, câncer da pele, câncer pancreático, câncer co- lorretal, câncer renal, câncer do fígado, câncer do cérebro, linfoma, leucemia, câncer do pulmão e similares. Os cânceres preferenciais tratados pelos métodos descritos no presente documento incluem mi- eloma múltiplo, linfoma de Hodgkin ou linfoma não Hodgkin.

[00110] Os termos "tumor" e "câncer" são usados alternadamente no presente documento, por exemplo, os dois termos abrangem tumo- res sólidos e líquidos, por exemplo, difusos ou em circulação. Confor- me usado no presente documento, o termo "câncer" ou "tumor" inclui cânceres e tumores pré-malignos, bem como malignos.

[00111] "“Derivado de", conforme esse termo é usado no presente documento, indica uma relação entre uma primeira e uma segunda molécula. Geralmente refere-se à semelhança estrutural entre a pri- meira molécula e uma segunda molécula e não é conotado nem inclui uma limitação de processo ou fonte numa primeira molécula que é de- rivada de uma segunda molécula. Por exemplo, no caso de um domí- nio de sinalização intracelular que é derivado de uma molécula CD3zeta, o domínio de sinalização intracelular retém estrutura sufici-

ente de CD3zeta de modo que tenham a função requerida, a saber, a capacidade para gerar um sinal sob as condições apropriadas. Não é conotado nem inclui uma limitação a um processo particular de produ- ção do domínio de sinalização intracelular, por exemplo, não significa que, para proporcionar o domínio de sinalização intracelular, se deva começar com uma sequência CD3zeta e deletar sequência indeseja- da, ou impor mutações, para chegar ao domínio de sinalização intrace- lular.

[00112] A frase "doença associada a expressão de BCMA'" inclui, mas não se limita a, uma doença associada a uma célula que expres- sa BCMA (por exemplo, BCMA de tipo selvagem ou mutante) ou afec- ção associada a uma célula que expressa BCMA (por exemplo, BCMA de tipo selvagem ou mutante) incluindo, por exemplo, doenças prolife- rativas tais como um câncer ou malignidade ou uma afecção pré- cancerosa tal como uma mielodisplasia, uma síndrome mielodisplásica ou uma pré-leucemia; ou uma indicação não relacionada com câncer associada a uma célula que expressa BCMA (por exemplo, BCMA de tipo selvagem ou mutante). Para evitar dúvidas, uma doença associa- da a expressão de BCMA pode incluir uma afecção associada a uma célula que presentemente não expressa BCMA, por exemplo, porque a expressão de BCMA foi sub-regulada, por exemplo, devido a tratamen- to com uma molécula visando BCMA, por exemplo, um inibidor de BCMA descrito no presente documento, mas que em um momento ex- pressou BCMA. Em um aspecto, um câncer associado a expressão de BCMA (por exemplo, BCMA de tipo selvagem ou mutante) é um cân- cer hematológico. Em um aspecto, o câncer hematológico é uma leu- cemia ou um linfoma. Em um aspecto, um câncer associado a expres- são de BCMA (por exemplo, BCMA de tipo selvagem ou mutante) é uma malignidade de células B plasmáticas diferenciadas. Em um as- pecto, um câncer associado a expressão de BCMA (por exemplo,

BCMA de tipo selvagem ou mutante) inclui cânceres e malignidades incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, uma ou mais leucemi- as agudas incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, Leucemia Linfoide aguda de células B ("BALL"), Leucemia Linfoide aguda de cé- lulas T ("TALL"), leucemia linfoide aguda (ALL); uma ou mais leucemi- as crônicas incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, leucemia mielógena crônica (CML), Leucemia Linfoide Crônica (CLL). Cânceres ou afecções hematológicas adicionais associados a expressão de BMCA (por exemplo, BCMA de tipo selvagem ou mutante) compreen- dem, mas não se limitam a, por exemplo, leucemia pró-linfocítica de células B, neoplasma blástico de células dendríticas plasmacitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de grandes células B, Linfoma folicu- lar, Leucemia de células pilosas, linfoma folicular de pequenas células ou grandes células, afecções linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células do manto, Linfoma da zona marginal, mielo- ma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma não de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de células dendríticas plasmacitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom, e "pré-leucemia" que são um conjunto diversificado de afecções hematológicas unidas pela produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides e similares.

Em algumas modalidades, o câncer é mieloma múltiplo, linfoma de Hodgkin, linfoma não de Hodgkin ou glioblastoma.

Em mo- dalidades, uma doença associada a expressão de BCMA inclui um dis- túrbio proliferativo de células plasmáticas, por exemplo, mieloma as- sintomático (mieloma múltiplo assintomático ou mieloma indolente), gamapatia monoclonal de importância indeterminada (MGUS), macro- globulinemia de Waldenstrom, plasmacitomas (por exemplo, discrasia de células plasmáticas, mieloma solitário, plasmacitoma solitário, plas- macitoma extramedular e plasmacitoma múltiplo), amiloidose de ca- deia leve amiloide sistêmica e síndrome de POEMS (também conheci-

do como síndrome de Crow-Fukase, doença de Takatsuki e síndrome de PEP). Outras doenças associadas a expressão de BCMA (por exemplo, BCMA de tipo selvagem ou mutante) incluem, mas não se limitam a, por exemplo, cânceres atípicos e/ou não clássicos, maligni- dades, afecções pré-cancerosas ou doenças proliferativas associadas a expressão de BCMA (por exemplo, BCMA de tipo selvagem ou mu- tante), por exemplo, um câncer descrito no presente documento, por exemplo, um câncer da próstata (por exemplo, câncer da próstata re- sistente a castração ou resistente a terapia ou câncer da próstata me- tastático), câncer pancreático ou câncer do pulmão.

[00113] —Afecções não relacionadas com câncer que estão associa- das a BCMA (por exemplo, BCMA de tipo selvagem ou mutante) inclu- em infecções virais; por exemplo, HIV, infecções fúngicas, por exem- plo, C. neoformans; doença autoimune; por exemplo, artrite reumatoi- de, lúpus eritematoso sistêmico (SLE ou lúpus), pênfigo vulgar e sín- drome de Sjogren; doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa; imunidade aloespecífica relacionada com transplante distúrbios relaci- onados com imunidade de mucosas; e respostas imunes indesejadas a agentes biológicos (por exemplo, Fator VIII) onde a imunidade humo- ral é importante. Em modalidades, uma indicação não relacionada com câncer associada a expressão de BCMA inclui, mas não se limita a, por exemplo, doença autoimune (por exemplo, lúpus), distúrbios infla- matórios (alergia e asma) e transplantação. Em algumas modalidades, a célula expressando um antígeno tumoral expressa, ou em qualquer momento expressou, mRNA codificando o antígeno tumoral. Em uma modalidade, a célula expressando um antígeno tumoral produz a pro- teína do antígeno tumoral (por exemplo, de tipo selvagem ou mutante), e a proteína do antígeno tumoral pode estar presente em níveis nor- mais ou níveis reduzidos. Em uma modalidade, a células que expressa um antígeno tumoral produziu níveis detectáveis de uma proteína do antígeno tumoral em um momento e subsequentemente produziu substancialmente nenhuma proteína do antígeno tumoral detectável.

[00114] O termo "modificações conservativas de sequências" se refere a modificações de aminoácidos que não afetam nem alteram significativamente as características de ligação do anticorpo ou frag- mento de anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. Tais modi- ficações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. Modificações podem ser introduzidas em um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção por técnicas comuns conheci- das na técnica, tais como mutagênese dirigida a sítios e mutagênese mediada por PCR. Substituições conservativas são tais que um resí- duo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famí- lias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cis- teína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, tripto- fano, histidina). Assim, um ou mais resíduos de aminoácidos em um CAR da invenção podem ser substituídos por outros resíduos de ami- noácidos da mesma família de cadeias laterais e o CAR alterado pode ser testado usando os ensaios funcionais descritos no presente docu- mento.

[00115] O termo "estimulação" refere-se a uma resposta primária induzida pela ligação de uma molécula estimulante (por exemplo, um complexo TCR/CD3) com o seu ligante cognato, mediando assim um evento de transdução de sinal, como, porém sem limitação, transdu- ção de sinal através do complexo TCR/CD3. A estimulação pode me- diar expressão alterada de certas moléculas, tal como regulação para baixo de TGF-B e/ou reorganização de estruturas do citoesqueleto e similares.

[00116] O termo "molécula estimuladora" refere-se a uma molécula expressa por uma célula T que proporciona a(s) sequência(s) de sina- lização citoplasmática(s) que regula(m) a ativação primária do comple- xo de TCR de maneira estimuladora para pelo menos algum aspecto da via de sinalização de células T. Em algumas modalidades, o domí- nio contendo ITAM dentro do CAR recapitula a sinalização do TOR primário independentemente de complexos de TCR endógenos. Em um aspecto, o sinal primário é iniciado, por exemplo, por ligação de um complexo TCR/CD3 a uma molécula MHC carregada com peptídeo e que conduz a mediação de uma resposta de células T, incluindo, mas não se limitando a, proliferação, ativação, diferenciação e similares. Uma sequência de sinalização citoplasmática primária (também referi- da como "domínio de sinalização primário") que atua de um modo es- timulador pode conter um motivo de sinalização que é conhecido como motivo de ativação baseado em tirosina do imunorreceptor ou ITAM. Exemplos de um ITAM contendo uma sequência de sinalização cito- plasmática primária que têm uso particular na invenção incluem, po- rém sem limitação, os derivados de TCR zeta, FCcR gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (também conhecido como "ICOS"), FceRI e CD66d, DAP10 e DAP12. Em um CAR específico da invenção, o domínio de sinalização intracelular em qualquer um ou mais CARs da invenção compreende uma sequência de sinalização intracelular, por exemplo, uma sequên- cia de sinalização primária de CD3-zeta.

[00117] O termo "célula apresentadora de antígeno" ou "APC" se refere a uma célula do sistema imune, tal como uma célula acessória (por exemplo, uma célula B, uma célula dendrítica e similares), que exibe um antígeno estranho complexado com complexos de histocom- patibilidade principal (MHCs) na sua superfície. Células T podem reco- nhecer estes complexos usando seus receptores de células T (TCRs). APCs processam antígenos e apresentam estes a células T.

[00118] Um "domínio de sinalização intracelular", tal como o termo é usado no presente documento, se refere a uma porção intracelular de uma molécula. Nas modalidades, o domínio de sinalização intrace- lular transduz o sinal da função efetora e direciona a célula a desem- penhar uma função especializada. Embora o domínio de sinalização intracelular inteiro possa ser empregado, em muitos casos não é ne- cessário usar toda a cadeia. Até o ponto em que uma porção truncada do domínio de sinalização intracelular é usada, tal porção truncada pode ser usada em vez da cadeia intacta desde que proceda à trans- dução do sinal da função efetora. Assim, o termo domínio de sinaliza- ção intracelular inclui qualquer porção truncada do domínio de sinali- zação intracelular suficiente para proceder à transdução do sinal da função efetora.

[00119] O domínio de sinalização intracelular gera um sinal que promove uma função efetora imune da célula contendo o CAR, por exemplo, uma célula CART. Exemplos da função efetora imune, por exemplo, em uma célula CART, incluem atividade citolítica e atividade auxiliadora, incluindo a secreção de citocinas.

[00120] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio de sinalização intracelular primário. Os domínios de sinalização intracelulares primários exemplificativos inclu- em aqueles derivados das moléculas responsáveis pelo estímulo pri- mário ou estímulo dependente de antígeno. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio in-

tracelular coestimulador. Os domínios de sinalização intracelulares co- estimulantes exemplificativos incluem aqueles derivados de moléculas responsáveis por sinais coestimulantes ou estímulo independente de antígeno. Por exemplo, no caso de um CART, um domínio de sinaliza- ção intracelular primário pode compreender uma sequência citoplas- mática de um receptor de células T, e um domínio de sinalização intra- celular coestimulador pode compreender sequência citoplasmática de molécula correceptora ou coestimuladora.

[00121] Um domínio de sinalização intracelular primário pode com- preender um motivo de sinalização que é conhecido como motivo de ativação baseado em tirosina do imunorreceptor ou ITAM. Exemplos de ITAMs contendo sequências de sinalização citoplasmáticas primárias in- cluem, mas não se limitam a, os derivados de CD3 zeta, FCR gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (também conhecido como "ICOS"), FceRI, CD66d, DAP10 e DAP12.

[00122] O termo "zeta" ou alternativamente "cadeia zeta", "CD3-zeta" ou "TCR-zeta" refere-se a CD247. O número de acesso Swiss-Prot P20963 fornece sequências de aminoácidos CD3 zeta humanas exemplificativas. Um "domínio estimulador zeta" ou, alternativamente, um "domínio estimulador CD3-zeta" ou um "domínio estimulador TCR- zeta" refere-se a um domínio estimulador do CD3-zeta ou uma varian- te do mesmo (por exemplo, uma molécula que tem mutações, por exemplo, mutações pontuais, fragmentos, inserções ou deleções). Em uma modalidade, o domínio citoplasmático de zeta compreende resí- duos 52 a 164 de nº de acesso no GenBank BAG36664,1 ou uma va- riante do mesmo (por exemplo, uma molécula que tem mutações, por exemplo, mutações pontuais, fragmentos, inserções ou deleções). Em uma modalidade, o "domínio estimulador de zeta" ou um "domínio es- timulador de CD3-zeta" é a sequência proporcionada como SEQ ID

NO: 18 ou 20 ou uma variante do mesmo (por exemplo, uma molécula que tem mutações, por exemplo, mutações pontuais, fragmentos, in- serções ou deleções).

[00123] O termo "molécula coestimuladora" se refere ao parceiro de ligação cognato em uma célula T que se liga especificamente a um ligante coestimulador, desse modo mediando uma resposta coestimu- ladora pela célula T, tal como, mas não se limitando a, proliferação. Moléculas coestimuladoras são moléculas da superfície celular dife- rentes de receptores de antígenos ou seus ligantes que são necessá- rias para uma resposta imunológica eficiente. As moléculas coestimu- ladoras incluem, porém sem limitação, uma molécula de classe | de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares à imunoglobu- lina, receptores de citocina, integrinas, moléculas de ativação linfocíti- ca de sinalização (proteínas SLAM), receptores de célula NK de ativa- ção, BTLA, receptor de ligante Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1) NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, ILPR gamma, IL7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGAA, IM, CD49D, ITGA6, VLA-S6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11I, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMFA4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMFB8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a e um ligante que se liga especificamente a CD83.

[00124] Um domínio de sinalização intracelular coestimulador refe- re-se a uma porção intracelular de uma molécula coestimuladora.

[00125] O domínio de sinalização intracelular pode compreender a porção intracelular inteira, ou o domínio de sinalização intracelular na- tivo inteiro, da molécula da qual é derivado ou um fragmento funcional do mesmo.

[00126] O termo "4-1BB" refere-se a CD137 ou membro da super- família de receptores de Fator de necrose tumoral 9. O número de acesso Swiss-Prot P20963 fornece sequências de aminoácidos 4-1BB humanas exemplificativas. Um "domínio coestimulador 4-1BB" refere- se a um domínio coestimulador de 4-1BB ou uma variante do mesmo (por exemplo, uma molécula que tem mutações, por exemplo, muta- ções pontuais, fragmentos, inserções ou deleções). Em uma modali- dade, o "domínio coestimulador 4-1BB" é a sequência fornecida como SEQ ID NO: 14 ou uma variante do mesmo (por exemplo, uma molé- cula que tem mutações, por exemplo, mutações pontuais, fragmentos, inserções ou deleções).

[00127] —A"célula imunoefetora", como tal termo é usado no presen- te documento, se refere a uma célula que está envolvida em uma res- posta imunológica, por exemplo, na promoção de uma resposta imu- noefetora. Exemplos de células efetoras imunes incluem células T, por exemplo, células T alfa/beta e células T gama/delta, células B, células matadoras naturais (NK), células T matadoras naturais (NKT), mastóci- tos e fagócitos derivados da linhagem mieloide.

[00128] A "função imunoefetora" ou "resposta imunoefetora", como tal termo é usado no presente documento, se refere à função ou res- posta, por exemplo, de uma célula imunoefetora, que intensifica ou promove um ataque imune de uma célula-alvo. Por exemplo, uma fun- ção ou resposta efetora imune se refere a uma propriedade de uma célula T ou NK que promove o extermínio ou a inibição do crescimento ou proliferação de uma célula-alvo. No caso de uma célula T, a estimu- lação e a coestimulação primárias são exemplos de função ou respos-

ta efetora imune.

[00129] O termo "função efetora" se refere a uma função especiali- zada de uma célula. A função efetora de uma célula T, por exemplo, pode ser uma atividade citolítica ou uma atividade auxiliadora incluindo a secreção de citocinas.

[00130] O termo "codificação" refere-se à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir como moldes para a sín- tese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos tendo uma sequência definida de nucleotídeos (por exemplo, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as pro- priedades biológicas daí resultantes. Assim, um gene, cDNA ou RNA codifica uma proteína se a transcrição e tradução do mMRNA corres- pondente a esse gene produz a proteína em uma célula ou em outro sistema biológico. Tanto a fita codificadora, cuja sequência de nucleo- tídeos é idêntica à sequência de mRNA e é habitualmente fornecida em listagens de sequências, como a fita não codificadora, usada como modelo para a transcrição de um gene ou cDNA, podem ser denomi- nadas como codificando a proteína ou outro produto desse gene ou cCcDNA.

[00131] Anão ser que especificado de outro modo, uma "sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos" inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. O sintagma "sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou um RNA" também pode incluir íntrons na medida em que a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína pode, em algumas versões, conter íntron (ou íntrons).

[00132] Os termos "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeutica- mente eficaz" são no presente documento usados indistintamente, e se relacionam com uma quantidade de um composto, formulação, ma- terial ou composição, como no presente documento descrito, eficaz para alcançar um resultado biológico particular.

[00133] O termo "endógeno" refere-se a qualquer material de ou produzido dentro de um organismo, célula, tecido ou sistema.

[00134] O termo "exógeno" refere-se a qualquer material introduzi- do de ou produzido fora de um organismo, célula, tecido ou sistema.

[00135] O termo "expressão" refere-se à transcrição e/ou tradução de uma sequência particular de nucleotídeos acionada por um promo- tor.

[00136] O termo "vetor de transferência" refere-se a uma composi- ção de matéria que compreende um ácido nucleico isolado e que pode ser utilizado para distribuir o ácido nucleico isolado no interior de uma célula. Numerosos vetores são conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos e vírus. Assim, o termo "vetor de transferência" inclui um plasmídeo ou um vírus de replicação autônoma. O termo também deve ser entendido como incluindo adici- onalmente compostos não plasmídicos e não virais que facilitam a transferência de ácido nucleico para células, tal como, por exemplo, um composto de polilisina, lipossomo e similares. Exemplos de vetores de transferência virais incluem, mas não estão limitados a, vetores adenovirais, vetores de vírus adenoassociados, vetores retrovirais, ve- tores lentivirais e similares.

[00137] O termo "vetor de expressão" refere-se a um vetor que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende se- quências de controle da expressão operativamente ligadas a uma se- quência de nucleotídeos a ser expressa. Um vetor de expressão com- preende elementos de atuação cis suficientes para expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedei-

ra ou em um sistema de expressão in vitro. Vetores de expressão inclu- em todos os conhecidos na técnica, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomos) e vírus (por exemplo, len- tivírus, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados) que incorpo- ram o polinucleotídeo recombinante.

[00138] O termo "lentivífus" se refere a um gênero da família Retro- viridae. Os lentivírus são únicos entre os retrovírus por serem capazes de infectar células não se dividindo; podendo fornecer uma quantidade significativa de informação genética ao DNA da célula hospedeira, de modo que são um dos métodos mais eficientes de um vetor de transfe- rência genética. HIV, SIV e FIV são todos exemplos de lentivírus.

[00139] O termo "vetor lentiviral" se refere a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de um lentivírus, incluindo es- pecialmente um vetor lentiviral autoinativador como o proporcionado por Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1,453 a 1,464 (2009). Outros exem- plos de vetores de lentivírus que podem ser usados na clínica incluem, mas não se limitam a, por exemplo, a tecnologia de transferência ge- nética LENTIVECTORO da Oxford BioMedica, o sistema de vetores LENTIMAXTY da Lentigen e similares. Tipos não clínicos de vetores lentivirais também estão disponíveis e serão conhecidos do perito na técnica.

[00140] O termo "homólogo" ou "identidade" se relaciona com a identidade de sequências de subunidades entre duas moléculas poli- méricas, por exemplo, entre duas moléculas de ácido nucleico, tais como duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas polipeptídicas. Quando uma posição de subunidade em ambas as moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomé- rica; por exemplo, quando uma posição em cada uma de duas molécu- las de DNA é ocupada por adenina, então são homólogas ou idênticas nessa posição. A homologia entre duas sequências é uma função dire-

ta do número de posições correspondentes ou homólogas; por exem- plo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero com dez subunidades de comprimento) das posições em duas sequências fo- rem homólogas, as duas sequências são 50% homólogas; se 90% das posições (por exemplo, 9 de 10) forem correspondentes ou homólo- gas, as duas sequências são 90% homólogas.

[00141] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imu- noglobulinas ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação a antígenos de anticorpos) que con- têm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na sua maior parte, anticorpos humanizados e fragmentos de anticor- pos dos mesmos são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor ou fragmento de anticorpo) em que resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resí- duos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de fra- mework (FR) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Adicionalmente, um anticor- po/fragmento de anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não se encontram no anticorpo recebedor nem nas sequências de framework ou CDR importadas. Estas modificações podem adicional- mente refinar e otimizar o desempenho de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado ou seu fragmento de anticorpo compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que a totalidade ou substan- cialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglo- bulina não humana e a totalidade ou uma porção significativa das regi- ões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anti-

corpo ou fragmento de anticorpo humanizado também pode compre- ender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imu- noglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, consultar Jones et al., Nature, 321: 522 a 525, 1986; Reich- mann et al., Nature, 332: 323 a 329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593 a 596, 1992.

[00142] "Totalmente humana" se refere a uma imunoglobulina, tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo, na qual toda a molécu- la é de origem humana ou consiste em uma sequência de aminoácidos idêntica a uma forma humana do anticorpo ou imunoglobulina.

[00143] O termo "isolado" significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucléico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não é "isolado", mas o mesmo ácido nu- cléico ou peptídeo parcialmente ou completamente separado dos ma- teriais coexistentes de seu estado natural é "isolado". Um ácido nuclei- co ou proteína isolados podem existir em forma substancialmente puri- ficada, ou podem existir em um ambiente não nativo, tal como, por exemplo, uma célula hospedeira.

[00144] No contexto da presente invenção, as seguintes abreviatu- ras para as bases de ácidos nucleicos de ocorrência comum são usa- das. "A" se refere à adenosina, "C" se refere à citosina, "G" se refere à guanosina, "T" se refere à timidina, e "U" se refere à uridina.

[00145] O termo "operacionalmente ligado" ou "controle de transcri- ção" refere-se à ligação funcional entre uma sequência reguladora e uma sequência de ácido nucleico heteróloga resultando na expressão da última. Por exemplo, uma primeira sequência de ácido nucleico es- tá operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nuclei- co quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afetar a transcrição ou expressão da se- quência de codificação. Sequências de DNA ligadas operativamente podem ser contíguas entre si e, por exemplo, quando for necessário unir duas regiões codificadoras de proteínas, estão no mesmo quadro de leitura.

[00146] O termo administração "parentérica" de uma composição imunogênica inclui, por exemplo, técnicas de injeção subcutânea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) ou intraesterno, intratumoral ou de infusão.

[00147] O termo "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" refere-se a ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA) e seus polímeros em forma de fita simples ou dupla. Salvo quando especifi- camente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos que contêm aná- logos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares às do ácido nucleico de referência e são metaboliza- dos de maneira similar em nucleotídeos de ocorrência natural. A me- nos que indicado de outro modo, uma sequência de ácido nucleico particular também abrange implicitamente suas variantes conservati- vamente modificadas (por exemplo, substituições de códons degene- rados, por exemplo, substituições conservativas), alelos, ortólogos, SNP e sequências complementares, assim como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, podem ser obtidas substituições de códons degenerados, por exemplo, substituições conservativas geran- do sequências em que a terceira posição de um ou mais (ou todos) códons selecionados é substituída por resíduos de bases mistas e/ou desoxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsu- ka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

[00148] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são utili- zados de forma intercambiável e referem-se a um composto constituí-

do por resíduos de aminoácidos ligados covalentemente por ligações peptídicas. Uma proteína ou peptídeo deve conter, pelo menos, dois aminoácidos, e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos que uma sequência de proteína ou peptídeo pode com- preender. Polipeptídeos incluem qualquer peptídeo ou proteína que compreende dois ou mais aminoácidos ligados uns aos outros por |i- gações peptídicas. Conforme usado no presente documento, o termo se refere a cadeias curtas, que também são vulgarmente referidas na técnica como peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, e a cadeias mais longas, que geralmente são denominadas na técnica como proteínas, das quais há muitos tipos. "Polipeptídeos" incluem, por exemplo, fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos subs- tancialmente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodíme- ros, variantes de polipeptídeos, polipeptídeos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusão, entre outros. Um polipeptídeo inclui um peptídeo natural, um peptídeo recombinante ou uma combinação des- tes.

[00149] O termo "promotor" se refere a uma sequência de DNA re- conhecida pela maquinaria sintética da célula ou uma maquinaria sin- tética introduzida, requerida para iniciar a transcrição específica de uma sequência polinucleotídica.

[00150] O termo "sequência promotora/reguladora" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que é necessária para expressão de um produto genético operativamente ligado à sequência promoto- ra/reguladora. Em alguns casos, essa sequência pode ser a sequência principal do promotor e, em outros casos, essa sequência pode tam- bém incluir uma sequência intensificadora e outros elementos regula- dores que são necessários para a expressão do produto genético. À sequência promotora/reguladora pode, por exemplo, ser aquela que expressa o produto genético de um modo específico para tecidos.

[00151] O termo promotor "constitutivo" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que, quando operativamente ligada a um polinucleotí- deo que codifica ou específica um produto genético, faz com que o produto genético seja produzido em uma célula na maioria ou em to- das as condições fisiológicas da célula.

[00152] O termo promotor "induzível" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que, quando operativamente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou específica um produto genético, faz com que o produto genético seja produzido em uma célula substancialmente apenas quando um indutor que corresponde ao promotor está presente na cé- lula.

[00153] O termo promotor "tecido específico" refere-se a uma se- quência nucleotídica que, quando operativamente ligada a um polinu- cleotídeo codifica ou específica um gene, faz com que o produto do gene seja produzido numa célula substancialmente apenas se a célula for uma célula do tipo de tecido correspondente ao promotor.

[00154] Os termos "antígeno associado a câncer" ou "antígeno tu- moral" se relacionam indistintamente com uma molécula (tipicamente uma proteína, carboidrato ou lipídeo) que é expressa na superfície de uma célula cancerígena, quer inteiramente quer como um fragmento (por exemplo, MHC/peptídeo), e que é útil para o direcionamento pre- ferencial de um agente farmacológico para a célula cancerígena. Em algumas modalidades, um antígeno tumoral é um marcador expresso tanto por células normais como por células cancerígenas, por exem- plo, um marcador de linhagem, por exemplo, CD19 em células B. Em algumas modalidades, um antígeno tumoral é uma molécula de super- fície celular que está sobre-expressa em uma célula cancerígena em comparação com uma célula normal, por exemplo, sobre-expressão de 1 vez, sobre-expressão de 2 vezes, sobre-expressão de 3 vezes ou mais em comparação com uma célula normal. Em algumas modalida-

des, um antígeno de tumor é uma molécula de superfície celular que é inadequadamente sintetizada na célula de câncer, por exemplo, uma molécula que contém deleções, adições ou mutações em comparação com a molécula expressada em uma célula normal. Em algumas mo- dalidades, um antígeno tumoral será expresso exclusivamente na su- perfície celular de uma célula cancerígena, inteiramente ou como um fragmento (por exemplo, MHC/peptídeo), e não sintetizado ou expres- so na superfície de uma célula normal. Em algumas modalidades, os CARs da presente invenção incluem CARs compreendendo um domí- nio de ligação a antígenos (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) que se liga a um peptídeo apresentado em MHC. Normal- mente, peptídeos derivados de proteínas endógenas enchem as bol- sas de moléculas de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe | e são reconhecidos por receptores de células T (TCRs) em linfócitos T CD8+. Os complexos de MHC de classe | são constitutivamente expressos por todas as células nucleadas. No cân- cer, complexos de peptídeo/MHC específicos para vírus e/ou específi- cos para tumor representam uma classe única de alvos de superfície celular para imunoterapia. Foram descritos anticorpos tipo TCR visan- do peptídeos derivados de antígenos virais ou tumorais no contexto de antígeno de leucócitos humanos (HLA)-A1 ou HLA-A2 (ver, por exem- plo, Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935 a 1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4,262 a 4,272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2,156 a 2,165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21) :1,601 a 1,608; Dao et al., Sci Trans! Med 2013 5(176) :176ra33; Tassev et al. Cancer Gene Ther 2012 19(2):84 a 100). Por exemplo, o anticorpo tipo TCR pode ser identificado a partir da triagem de uma biblioteca, tal como uma biblioteca com exibição de fagos de scFv humano.

[00155] O termo "antígeno suportando um tumor" ou "antígeno su- portando um câncer" se relaciona indistintamente com uma molécula

(tipicamente uma proteína, carbo-hidrato ou lipídeo) que é expressa na superfície de uma célula que é, ela própria, não cancerígena, mas que suporta as células cancerígenas, por exemplo, por promoção do seu crescimento ou sobrevivência, por exemplo, resistência a células imu- nes. Células exemplificativas deste tipo incluem células estromais e células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs). O próprio antíge- no suportando um tumor não necessita de desempenhar um papel no suporte das células tumorais desde que o antígeno esteja presente em uma célula que suporta células cancerígenas.

[00156] O termo "ligante polipeptídico flexível" ou "ligante", confor- me usado no contexto de um scFv, se refere a um ligante peptídico que consiste em aminoácidos tais como resíduos glicina e/ou serina usados isoladamente ou em combinação, para ligar em conjunto regi- ões de cadeia pesada variável e leve variável. Em uma modalidade, o ligador polipeptídico flexível é um ligador Gly/Ser e compreende a se- quência de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser),, em que n é um número inteiro positivo igual a ou maior do que 1. Por exemplo, n= 1,n=2,n =3,n=4,n=5en=6,n=7,n=8,n=9en=10(SEQID NO: 28). Em uma modalidade, os ligantes polipeptídicos flexíveis incluem, mas não se limitam a, (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 29) ou (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 30). Em outra modalidade, os ligantes incluem múltiplas repetições de (Gly2Ser), (GlySer) ou (Gly3Ser) (SEQ ID NO: 31). Também estão incluídos no escopo da invenção ligantes descritos em WO2012/138475 incorporado no presente documento por referência.

[00157] “Conforme usado no presente documento, um cap 5' (tam- bém denominado cap de RNA, cap 7-metilguanosina de RNA ou cap m7G de RNA) é um nucleotídeo de guanina modificado que foi adicio- nado à "frente" ou na extremidade 5' de um RNA mensageiro eucarió- tico logo após o início da transcrição. O cap 5' consiste em um grupo terminal que está ligado ao primeiro nucleotídeo transcrito. Sua pre-

sença é crucial para o reconhecimento pelo ribossomo e proteção de RNases. A adição de cap está acoplada à transcrição e ocorre de mo- do cotranscricional, de tal forma que cada um influencia o outro. Logo após o início da transcrição, a extremidade 5' do MRNA sendo sinteti- zado é ligada por um complexo sintetizador de cap associado a RNA polimerase. Este complexo enzimático catalisa as reações químicas que são necessárias para o capping de mMRNA. A síntese prossegue como uma reação bioquímica de múltiplas etapas. A fração de capping pode ser modificada para modular a funcionalidade de mRNA, tal co- mo a sua estabilidade ou a eficiência da tradução.

[00158] Como usado no presente documento, "RNA transcrito in vitro" se relaciona com RNA, preferencialmente mRNA, que foi sinteti- zado in vitro. Geralmente, o RNA transcrito in vitro é gerado a partir de um vetor de transcrição in vitro. O vetor de transcrição in vitro compre- ende um molde que é utilizado para gerar o RNA transcrito in vitro.

[00159] Conforme usado no presente documento, uma "poli(A)" é uma série de adenosinas ligadas por poliadenilação ao mMRNA. Na modalidade preferencial de um construto para expressão transiente, a poliA tem entre 50 e 5000 (SEQ ID NO: 32), de preferência superior a 64, mais preferencialmente superior a 100, mais preferencialmente su- perior a 300 ou 400. As sequências poli(A) podem ser modificadas química ou enzimaticamente para modular a funcionalidade do mRNA, tais como localização, estabilidade ou eficiência da tradução.

[00160] Como no presente documento utilizado, "poliadenilação" refere-se à ligação covalente de uma fração poliadenilila, ou a sua varian- te modificada, a uma molécula de RNA mensageiro. Em organismos eu- carióticos, a maioria das moléculas de RNA mensageiro (mMRNA) são poliadeniladas na extremidade 3'. A cauda 3' poli(A) é uma longa se- quência de nucleotídeos adenina (muitas vezes várias centenas) adi- cionada ao pré-mRNA através da ação de uma enzima, poliadenilato polimerase. Em eucariotas superiores, a cauda poli(A) é adicionada a transcritos que contêm uma sequência específica, o sinal de poliadeni- lação. A cauda poli(A) e a proteína ligada a ela ajudam a proteger o MRNA da degradação por exonucleases. A poliadenilação também é importante para a terminação da transcrição, exportação do mMRNA do núcleo e tradução. A poliadenilação ocorre no núcleo imediatamente após a transcrição do DNA em RNA, mas adicionalmente também po- de ocorrer mais tarde no citoplasma. Após a terminação da transcri- ção, a cadeia de mRNA é clivada pela ação de um complexo de endo- nuclease associado a RNA polimerase. O sítio de clivagem é geral- mente caracterizado pela presença da sequência de base AAUAAA perto do sítio de clivagem. Após a clivagem do mRNA, os resíduos de adenosina são adicionados à extremidade 3' livre no sítio de clivagem.

[00161] Conforme usado no presente documento, "transiente" refe- re-se a uma expressão de um transgene não integrado durante um período de horas, dias ou semanas, em que o período de tempo da expressão é menor do que o período de tempo para a expressão do gene se integrado no genoma ou contido dentro de um replicon de plasmídeo estável na célula hospedeira.

[00162] Como usado no presente documento, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" referem-se à redução ou melhoria da pro- gressão, gravidade e/ou duração de uma doença proliferativa, ou a melhoria de um ou mais sintomas (preferencialmente, um ou mais sin- tomas discerníveis) de uma doença proliferativa resultante da adminis- tração de uma ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes te- rapêuticos, tal como um CAR da invenção). Em modalidades especiífi- cas, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" referem-se à melhoria de pelo menos um parâmetro físico mensurável de um distúrbio prolife- rativo, tal como o crescimento de um tumor, não necessariamente dis- cernível pelo paciente. Em outras modalidades, os termos "tratar", "tra-

tamento" e "tratando" se referem à inibição da progressão de uma dis- função proliferativa, seja fisicamente por, por exemplo, estabilização de um sintoma discernível, fisiologicamente por, por exemplo, estabili- zação de um parâmetro físico ou ambos. Em outras modalidades, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" referem-se à redução ou es- tabilização do tamanho tumoral ou contagem de células cancerosas.

[00163] O termo "trajetória de transdução de sinal" refere-se à rela- ção bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que exercem um papel na transmissão de um sinal de uma por- ção de uma célula para outra porção de uma célula. A expressão "re- ceptor da superfície celular" inclui moléculas e complexos de molécu- las capazes de receber um sinal e transmitir o sinal através da mem- brana de uma célula.

[00164] O termo "indivíduo" pretende incluir organismos vivos nos quais uma resposta imune pode ser desencadeada (por exemplo, mamíferos, humano).

[00165] O termo uma célula "substancialmente purificada" se refere a uma célula que está essencialmente desprovida de outros tipos de células. Uma célula substancialmente purificada também se refere a uma célula que foi separada de outros tipos de células com os quais está normalmente associada no seu estado de ocorrência natural. Em alguns casos, uma população de células substancialmente purificadas refere-se a uma população homogênea de células. Em outros casos, este termo refere-se simplesmente a células que foram separadas das células com as quais estão naturalmente associadas em seu estado natural. Em alguns aspectos, as células são cultivadas in vitro. Em ou- tros aspectos, as células não são cultivadas in vitro.

[00166] O termo "terapêutico" como usado no presente documento significa um tratamento. Um efeito terapêutico é obtido pela redução, supressão, remissão ou erradicação de um estado de doença.

[00167] O termo "profilaxia" como no presente documento utilizado significa a prevenção ou tratamento protetor para uma doença ou es- tado de doença.

[00168] No contexto da presente invenção, "antígeno tumoral" ou "antígeno de distúrbio hiperproliferativo" ou "antígeno associado a um distúrbio hiperproliferativo" se refere a antígenos que são comuns a distúrbios hiperproliferativos específicos. Em determinados aspectos, os antígenos de distúrbio hiperproliferativo da presente invenção são derivados de cânceres incluindo, porém sem limitação, melanoma pri- mário ou metastático, timoma, linfoma, sarcoma, câncer de pulmão, câncer de fígado, linfoma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, câncer uterino, câncer cervical, câncer de bexiga, câncer de rim e adenocarcinomas, como câncer de mama, câncer de próstata (por exemplo, câncer de próstata resistente à castração ou resistente à te- rapia ou câncer de próstata metastático), câncer de ovário, câncer de pâncreas e similares, ou um distúrbio proliferativo de célula plasmáti- ca, por exemplo, mieloma assintomático (mieloma múltiplo latente ou mieloma indolente), gamopatia monoclonal de significado indetermina- do (MGUS), macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmacitomas (por exemplo, discrasia de células plasmáticas, mieloma solitário, plasmoci- toma solitário, plasmocitoma extramedular e plasmocitoma múltiplo), amiloidose amiloide sistêmica de cadeia leve e síndrome POEMS (também conhecida como síndrome de Crow-Fukase, doença de Ta- katsuki e síndrome de PEP).

[00169] O termo "transfectado", "transformado" ou "transduzido" se refere a um processo pelo qual ácido nucleico exógeno é transferido ou introduzido na célula hospedeira. Uma célula "transfectada", "trans- formada" ou "transduzida" é tal que foi transfectada, transformada ou transduzida com ácido nucleico exógeno. A célula inclui a célula prin- cipal em questão e sua descendência.

[00170] O termo "se liga especificamente a" se relaciona com um anticorpo, ou um ligante, que reconhece e se liga a uma proteína de parceiro de ligação cognato (por exemplo, uma molécula estimuladora e/ou coestimuladora presente em uma célula T) presente em uma amostra, porém cujo anticorpo ou ligante não reconhece nem se liga substancialmente a outras moléculas da amostra.

[00171] “Receptor de antígeno quimérico regulável (RCAR)", como usado no presente documento, se refere a um conjunto de polipeptí- deos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, que, quando em uma célula efetora imune, dota a célula de especificidade para uma célula-alvo, tipicamente uma célula cancerígena, e de geração de sinal intracelular. Em algumas modalidades, um RCAR compreende pelo menos um domínio de ligação a antígeno extracelular, um domí- nio transmembranar e um domínio de sinalização citoplasmático (tam- bém referido no presente documento como "um domínio de sinalização intracelular") compreendendo um domínio de sinalização funcional de- rivado de uma molécula estimuladora e/ou molécula coestimuladora como definido no presente documento no contexto de uma molécula CAR. Em algumas modalidades, o conjunto de polipeptídeos no RCAR não são contíguos entre si, por exemplo, estão em diferentes cadeias polipeptídicas. Em algumas modalidades, o RCAR inclui um interruptor de dimerização que, na presença de uma molécula de dimerização, pode acoplar os polipeptídeos entre si, por exemplo, pode acoplar um domínio de ligação a antígenos a um domínio de sinalização intracelu- lar. Em algumas modalidades, o RCAR é expresso em uma célula (por exemplo, uma célula efetora imune) como descrita neste documento, por exemplo, uma célula expressando RCAR (também no presente documento referida como "célula RCARX"). Em uma modalidade, a célula RCARX é uma célula T e é referida como uma célula ROCART. Em uma modalidade, a célula RCARX é uma célula NK e é referida como uma célula RCARN. O RCAR pode proporcionar a célula ex- pressando RCAR com especificidade para uma célula alvo, tipicamen- te uma célula cancerígena, e com geração ou proliferação de sinal in- tracelular regulável, o que pode otimizar uma propriedade efetora imu- ne da célula expressando RCAR. Em modalidades, uma célula ROCAR se baseia, pelo menos em parte, em um domínio de ligação ao antíge- no para proporcionar especificidade para uma célula-alvo que compre- ende o antígeno ligado pelo domínio de ligação ao antígeno.

[00172] "Âncora de membrana" ou "domínio de fixação de membra- na", tal como o termo é usado no presente documento, se refere a um polipeptídeo ou fração, por exemplo, um grupo miristoíla, suficiente para ancorar um domínio extracelular ou intracelular à membrana plasmática.

[00173] “Domínio de interruptor", tal como o termo é usado no pre- sente documento, por exemplo, quando se refere a um RCAR, se rela- ciona com uma entidade, tipicamente uma entidade à base de um po- lipeptídeo, que, na presença de uma molécula de dimerização, se as- socia a outro domínio de interruptor. A associação resulta em um aco- plamento funcional de uma primeira entidade ligada, por exemplo, fun- dida, a um primeiro domínio de interruptor, e uma segunda entidade ligada, por exemplo, fundida, a um segundo domínio de interruptor. Um primeiro e segundo domínios de interruptor são coletivamente re- feridos como interruptor de dimerização. Em modalidades, o primeiro e segundo domínios de interruptor são iguais entre si, por exemplo, são polipeptídeos tendo a mesma sequência primária de aminoácidos, e são referidos coletivamente como interruptor de homodimerização. Em modalidades, o primeiro e segundo domínios de interruptor são dife- rentes entre si, por exemplo, são polipeptídeos tendo diferentes se- quências primárias de aminoácidos, e são referidos coletivamente co- mo interruptor de heterodimerização. Em modalidades, o interruptor é intracelular. Em modalidades, o interruptor é extracelular. Em modali- dades, o domínio de interruptor é uma entidade baseada em um poli- peptídeo, por exemplo, baseada em FKBP ou FRB, e a molécula de dimerização é uma molécula pequena, por exemplo, um rapálogo. Em modalidades, o domínio de interruptor é uma entidade baseada em um polipeptídeo, por exemplo, um scFv que se liga a um peptídeo myc, e a molécula de dimerização é um polipeptídeo, um seu fragmento ou um multímero de um polipeptídeo, por exemplo, um ligante de myc ou multímeros de um ligante de myc que se ligam a um ou mais scFvs de myc. Em modalidades, o domínio de interruptor é uma entidade base- ada em um polipeptídeo, por exemplo, receptor de myc, e a molécula de dimerização é um anticorpo ou seus fragmentos, por exemplo, anti- corpo para myc.

[00174] “Molécula de dimerização", tal como o termo é usado no presente documento, por exemplo, quando se referindo a um RCAR, se refere a uma molécula que promove a associação de um primeiro domínio de interruptor a um segundo domínio de interruptor. Em mo- dalidades, a molécula de dimerização não ocorre naturalmente no in- divíduo, ou não ocorre em concentrações que irão originar dimerização significativa. Em modalidades, a molécula de dimerização é uma mo- lécula pequena, por exemplo, rapamicina ou um rapálogo, por exem- plo, RADO01.

[00175] O termo "bioequivalente" refere-se a uma quantidade de um agente diferente do composto de referência (por exemplo, RADO01), necessária para produzir um efeito equivalente ao efeito produzido pe- la dose de referência ou quantidade de referência do composto de re- ferência (por exemplo, RADO01). Em uma modalidade, o efeito é o ní- vel de inibição de MTOR, por exemplo, como medido por inibição de quinase P70 S6, por exemplo, como avaliado em um ensaio in vivo ou in vitro, por exemplo, como medido por um ensaio no presente docu-

mento descrito, por exemplo, o ensaio de Boulay, ou medição de ní- veis de S6 fosforilados por transferência de western. Em uma modali- dade, o efeito é alteração da proporção de células T PD-1 positi- vas/PD-1 negativas, como medido por separação celular. Em uma modalidade, uma quantidade ou dose bioequivalente de um inibidor de mMTOR é a quantidade ou dose que alcança o mesmo nível de inibição de cinase P70 S6 da dose de referência ou quantidade de referência de um composto de referência. Em uma modalidade, uma quantidade ou dose bioequivalente de um inibidor de mMTOR é a quantidade ou dose que alcança o mesmo nível de alteração da proporção de células T PD-1 positivas/PD-1 negativas da dose de referência ou quantidade de referência de um composto de referência.

[00176] O termo "dose baixa intensificadora de imunidade" quando usado em conjunto com um inibidor de mMTOR, por exemplo, um mMTOR alostérico, por exemplo, RADOO01 ou rapamicina, ou um inibidor de mTOR catalítico, refere-se a uma dose de inibidor de MTOR que inibe parcial, mas não totalmente, a atividade de MTOR, por exemplo, como medida pela inibição de atividade de quinase P70 S6. São no presente documento discutidos métodos para avaliar a atividade de mMTOR, por exemplo, por inibição de cinase P70 S6. A dose é insufici- ente para resultar em supressão imunológica completa, mas é sufici- ente para intensificar a resposta imunológica. Em uma modalidade, a dose baixa intensificadora de imunidade de inibidor de MTOR resulta em uma redução do número de células imunoefetoras PD-1 positivas, por exemplo, células T ou células NK, e/ou um aumento do número de células imunoefetoras PD-1 negativas, por exemplo, células T ou célu- las NK, ou um aumento na razão de células imunoefetoras PD-1 nega- tivas (por exemplo, células T ou células NK)/células imunoefetoras PD- 1 positivas (por exemplo, células T ou células NK).

[00177] Em uma modalidade, a dose baixa intensificadora de imu-

nidade de inibidor de MTOR resulta em um aumento do número de células T sem tratamento prévio. Em uma modalidade, a dose baixa intensificadora de imunidade de inibidor de mMTOR resulta em um ou mais dos seguintes: um aumento da expressão de um ou mais dos seguintes marcadores: CD62Lelevado, CD127elevado, CD27+ e BCL2, por exemplo, em célu- las T de memória, por exemplo, precursores de células T de memória; uma redução na expressão de KLRG1, por exemplo, em células T de memória, por exemplo, precursores de células T de memória; e um aumento no número de precursores de células T de memória, por exemplo, células com qualquer uma ou uma combinação das seguin- tes características: CD62Lelevado aumentado, CD127elevado aumen- tado, CD27+ aumentado, KLRG1 reduzido e BCL2 aumentado; em que qualquer uma das alterações descritas acima ocorre, por exemplo, pelo menos transitoriamente, por exemplo, em comparação com um indivíduo não tratado.

[00178] "“Refratário”, como no presente documento usado, se rela- ciona com uma doença, por exemplo, câncer, que não responde a um tratamento. Em modalidades, um câncer refratário pode ser resistente a um tratamento antes ou no início do tratamento. Em outras modali- dades, o câncer refratário pode se tornar resistente durante um trata- mento. Um câncer refratário também é designado como câncer resis- tente.

[00179] "“Recidivado" ou uma "recaída" como no presente documen- to utilizado refere-se ao reaparecimento de uma doença (por exemplo, câncer) ou aos sinais e sintomas de uma doença, tal como um câncer após um período de melhoria ou responsividade, por exemplo, após tratamento prévio de uma terapia, por exemplo, terapia contra o cân- cer. Por exemplo, o período de capacidade de resposta pode envolver o nível de células cancerígenas se situando abaixo de um certo limiar,

por exemplo, abaixo de 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%. O reaparecimento pode envolver o nível de células cancerígenas subindo acima de um certo limiar, por exemplo, acima de 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%.

[00180] Faixas: ao longo desta descrição, vários aspectos da inven- ção podem ser apresentados em um formato de faixa. Deve ser en- tendido que a descrição em formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limi- tação inflexível no âmbito da invenção. Consequentemente, a descri- ção de uma faixa deve ser considerada como tendo especificamente descrito todas as subfaixas possíveis assim como valores numéricos individuais nesta faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa, tal co- mo de 1 a 6, deve ser considerada como tendo subfaixas especifica- mente descritas, tal como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1a 5, de 2a4,de 2a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 e 6. Como outro exemplo, uma faixa, tal como 95 a 99% de identidade, inclui algo com 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade e inclui subintervalos como 96 a 99%, 96 a 98%, 96 a 97%, 97 a 99%, 97 a 98% e 98 a 99% de identidade. Isso se apli- ca independentemente da amplitude do intervalo.

[00181] Um "sistema de edição genética", como o termo é usado no presente documento, se relaciona com um sistema, por exemplo, uma ou mais moléculas, que dirigem e efetuam uma alteração, por exem- plo, uma deleção, de um ou mais ácidos nucleicos no sítio ou próximo de um sítio de DNA genômico visado pelo referido sistema. Sistemas de edição genética são conhecidos na técnica e são descritos de mo- do mais completo abaixo.

[00182] As definições de grupos funcionais específicos e termos químicos são descritas em mais detalhes abaixo. Os elementos quími- cos são identificados de acordo com a Tabela Periódica dos Elemen-

tos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75.º Ed., capa interna, e os grupos funcionais específicos são geralmente definidos conforme ali descritos. Além disso, os princípios gerais da química or- gânica, assim como porções químicas funcionais específicas e reativi- dade, são descritos em Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith e March, March's Advanced Organic Chemistry, 5.º Edição, John Wiley & Sons, Inc., Nova lorque, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publis- hers, Inc., Nova lorque, 1989; e Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3.º Edição, Cambridge University Press, Cambrid- ge, 1987.

[00183] O termo "alquila|" como usado no presente documento, re- fere-se a um hidrocarboneto saturado monovalente de cadeia linear ou ramíificada como um grupo linear ou ramificado de 1 a 12, 1a 10 ou 1 a 6 átomos de carbono, chamada no presente documento de C1-C12 alquila, C1-C10 alquila e alquila C1-Cs, respectivamente. Exemplos de grupos alquila incluem, porém sem limitação, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, iso-butila, sec-butila, sec-pentila, iso-pentila, terc- butila, n-pentila, neopentila, n-hexila, sec-hexila e similares.

[00184] Os termos "alqguenila" e "alquinila" como usado no presente documento referem-se a grupos alifáticos insaturados análogos em comprimento e possíveis substituições às alquilas descritas acima, po- rém que contêm pelo menos uma ligação dupla ou ligação tripla, res- pectivamente. Grupos alquenila exemplificativos incluem, porém sem limitação, -CH=CH2 e -CH2CH=CH>.

[00185] O termo "arila" como usado no presente documento refere- se a um sistema de anel hidrocarboneto monocíclico, bicíclico ou poli- Cíclico, em que pelo menos um anel é aromático. Os grupos arila re- presentativos incluem sistemas de anéis completamente aromáticos, como fenila (por exemplo, (Cs) arila), naftila (por exemplo, (C10) arila) e antracenila (por exemplo, (C11) arila), e sistemas de anéis em que um anel de carbono aromático é fundido com um ou mais anéis de carbo- no não aromáticos, como indanila, ftalimidila, naftimidila ou tetraidro- naftila e similares.

[00186] O termo "carbociclila" como usado no presente documento refere-se a um sistema de anel hidrocarboneto monocíclico, ou fundi- do, espiro-fundido e/ou em ponte ou policíclico contendo 3 a 18 áto- mos de carbono, em que cada anel é completamente saturado ou con- tém uma ou mais unidades de insaturação, porém em que nenhum anel é aromático. Os grupos carbociclila representativos incluem gru- pos cicloalquila (por exemplo, ciclopentila, ciclobutila, ciclopentila, ci- cloexila e similares), e grupos cicloalquenila (por exemplo, ciclopente- nila, cicloexenila, ciclopentadienila e similares).

[00187] O termo "carbonila", como usado no presente documento, refere-se a —-C=O.

[00188] O termo "ciano", conforme usado no presente documento, refere-se a —-CN.

[00189] Os termos "halo" ou "halogênio" como usado no presente documento se referem a fluorado (flúor, -F), clorado (cloro, -CI), bro- mado (bromo, —Br) ou iodado (iodo, -I).

[00190] O termo "heteroalquila" como usado no presente documen- to refere-se a uma cadeia alquila saturada monovalente linear ou rami- ficada em que pelo menos um átomo de carbono na cadeia é substitu- ído por um heteroátomo, como O, S ou N, desde que mediante substi- tuição, a cadeia compreenda pelo menos um átomo de carbono. Em algumas modalidades, um grupo heteroalquila pode compreender, por exemplo, 1 a 12, 1 a 10, ou 1 a 6 átomos de carbono, chamado de no presente documento de C1-C12 heteroalquila, C1-C10 heteroalquila e C1-C6 heteroalquila. Em determinados casos, um grupo heteroalquila com- preende 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos independentemente selecionados no lugar de 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono individuais na cadeia de alquila. Grupos heteroalquila representativos incluem -CHaNHC(O)CHs3, -CH2CHa OCH, -CHCCHaNHCH3, -CH2CHaN(CH3)CH; e similares.

[00191] O termo "heteroarila" como usado no presente documento refere-se a um sistema de anel monocíclico, bicíclico ou policíclico em que pelo menos um anel é aromático e compreende um heteroátomo; e em que nenhum outro anel é heterociclila (como definido abaixo). Os grupos heteroarila representativos incluem sistemas de anel em que (i) cada anel compreende um heteroátomo e é aromático, por exemplo, imidazolila, oxazolila, tiazolila, triazolila, pirrolila, furanila, tiofenila, pira- zolila, piridinila, pirazinila, piridazinila, pirimidinila, indolizinila, purinila, naftiridinila e pteridinila; (ii) cada anel é aromático ou carbociclila, pelo menos um anel aromático compreende um heteroátomo e pelo menos um outro anel é um anel hidrocarboneto ou, por exemplo, indolila, isoindolila, benzotienila, benzofuranila, dibenzofuranila, indazolila, ben- zimidazolila, benztiazolila, quinolila, isoquinolila, cinolinila, ftalazinila, qui- nazolinila, quinoxalinila, carbazolila, acridinila, fenazinila, fenotiazinila, fenoxazinila, pirido[2,3-b]-1,4-0xazin-3(4H)-ona, tiazolo-[4,5-c]-piridinila, 4,5,6,7-tetraidrotieno[2,3-c]piridinila, 5,6-di-hidro-4H-tieno[2,3-c]pirroli- la, 4,5,6,7,8-tetraidroquinolinila e 5,6,7,8-tetraidroisoquinolinila; e (iii) cada anel é aromático ou carbociclila, e pelo menos um anel aromático compartilha um heteroátomo de ponte com outro anel aromático, por exemplo, 4H-quinolizinila. Em determinadas modalidades, a heteroarila é um anel monocíclico ou bicíclico, em que cada um dos ditos anéis contém 5 ou 6 átomos no anel em que 1, 2, 3 ou 4 dos ditos átomos no anel são um heteroátomo independentemente selecionado dentre N, O es.

[00192] O termo "heterociclila" como usado no presente documento refere-se a sistemas de anéis monocíclicos ou fundidos, espiro-fundi- dos e/ou bicíclico e policíclicos em ponte em que pelo menos um anel é saturado ou parcialmente insaturado (porém, não aromático) e com- preende um heteroátomo. Uma heterociclila pode ser ligada a seu gru- po pendente em qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que re- sulta em uma estrutura estável e qualquer um dos átomos no anel po- de ser opcionalmente substituído. As heterociclilas representativas in- cluem sistemas de anéis em que (i) cada anel é não aromático e pelo menos um anel compreende um heteroátomo, por exemplo, tetraidro- furanila, tetraidrotienila, pirrolidinila, pirrolidonila, piperidinila, pirrolinila, decaidroquinolinila, oxazolidinila, piperazinila, dioxanila, dioxolanila, diazepinila, oxazepinila, tiazepinila, morfolinila e quinuclidinila; (ii) pelo menos um anel é não aromático e compreende um heteroátomo e pelo menos um outro anel é um anel de carbono aromático, por exemplo, 1,2,3 4-tetraidroquinolinila; e (iii) pelo menos um anel é não aromático e compreende um heteroátomo e pelo menos um outro anel é aromático e compreende um heteroátomo, por exemplo, 3,4-di-hidro-1H-pirano [4,3-c]piridinila, e 1,2,3,4-tetraidro-2,6-naftiridinila. Em determinadas modalidades, a heterociíclila é um anel monocíclico ou bicíclico, em que cada um dos ditos anéis contém 3 a 7 átomos no anel em que 1, 2, 3 ou 4 dos ditos átomos no anel são um heteroátomo independen- temente selecionado dentre N,/ O e S.

[00193] Conforme descrito no presente documento, os compostos da invenção podem conter porções "opcionalmente substituídas". Em geral, o termo "substituído", seja precedido ou não pelo termo "opcio- nalmente", significa que um ou mais hidrogênios da porção designada são substituídos por um substituinte adequado. A menos que seja indi- cado em contrário, um grupo "opcionalmente substituído" pode ter um substituinte adequado em cada posição substituível do grupo, e quan- do mais de uma posição em qualquer dada estrutura puder ser substi- tuída por mais de um substituinte selecionado dentre um grupo especí- fico, o substituinte pode ser igual ou diferente em cada posição. Com-

binações de substituintes previstas sob esta invenção são, de prefe- rência, aquelas que resultam na formação de compostos estáveis ou quimicamente viáveis. O termo "estável", como usado no presente do- cumento, refere-se a compostos que são substancialmente alterados quando submetidos a condições para permitir sua produção, detecção e, em certas modalidades, sua recuperação, purificação e uso para um ou mais dos propósitos descritos no presente documento.

[00194] O termo "oxo", como usado no presente documento, refere- seaz=o.

[00195] O termo "tiocarbonila", como usado no presente documen- to, refere-se a C=S.

[00196] Conforme usado no presente documento, o termo "sal far- maceuticamente aceitável" refere-se àqueles sais que são, dentro do escopo do julgamento médico sólido, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais inferiores sem toxicidade indevida, irritação, resposta alérgica e similares e são proporcionais a uma relação risco/benefício razoável. Sais farmaceuticamente aceitá- veis são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, Berge et al. des- crevem sais farmaceuticamente aceitáveis em detalhes em J. Pharma- ceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, incorporado no presente documento por referência. Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção incluem aqueles derivados de ácidos e bases inorgâni- cos e orgânicos adequados. Exemplos de sais de adição ácidos não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis são sais de um grupo amino formado por ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, ácido bromídri- co, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico ou por ácidos or- gânicos como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartári- co, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malônico ou usando outros métodos conhecidos na técnica como troca iônica. Outros sais farma- ceuticamente aceitáveis incluem adipato, alginato, ascorbato, asparta-

to, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodeci- Isulfato, etanossulfonato, formato, fumarato, gluco-heptonato, glicero- fosfato, gluconato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, hidroiodeto, 2-hidroxi-etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, per- sulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, esteara- to, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, p-toluenossulfonato, unde- canoato, sais de valerato e similares. Sais derivados de bases ade- quadas incluem metal alcalino, metal alcalino-terroso, amônio e sais N*(C14 alquila).”. Os sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos re- presentativos incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e simila- res. Sais farmaceuticamente aceitáveis adicionais incluem, quando adequado, cátions de amônio não tóxico, amônio quaternário e amina formados usando contraíons como haleto, hidróxido, carboxilato, sulfa- to, fosfato, nitrato, alquil sulfonato inferior e aril sulfonato.

[00197] O termo "solvato" refere-se a formas do composto que es- tão associadas a um solvente, geralmente por uma reação de solvóli- se. Essa associação física pode incluir a ligação de hidrogênio. Os solventes convencionais incluem água, metanol, etanol, ácido acético, DMSO, THF, éter dietílico e similares. Os compostos de Fórmula (I), Fórmula (I-a) e/ou Fórmula (Il) podem ser preparados, por exemplo, em forma cristalina, e podem ser solvatados. Os solvatos adequados incluem solvatos farmaceuticamente aceitáveis e incluem adicional- mente tanto solvatos estequiométricos como solvatos não estequiomé- tricos. Em certos casos, o solvato será capaz de isolamento, por exemplo, quando uma ou mais moléculas de solvente forem incorpo- radas na retícula de um cristal do sólido cristalino. "Solvato" engloba tanto solvatos de fase de solução como isoláveis. Os solvatos repre-

sentativos incluem hidratos, etanolatos e metanolatos.

[00198] O termo "hidrato" refere-se a um composto que está asso- ciado à água. Tipicamente, o número das moléculas de água contidas em um hidrato de um composto está em uma razão definida para o número das moléculas de composto no hidrato. Portanto, um hidrato de um composto pode ser representado, por exemplo, pela fórmula geral R-x H2O, em que R é o composto e em que x é um número maior que 0. Um determinado composto pode formar mais de um tipo de hi- dratos, incluindo, por exemplo, monoidratos (x é 1), hidratos inferiores (x é um número maior que O e menor que 1, por exemplo, hemi- hidratos (R-0,5 H2O)) e poli-hidratos (x é um número maior que 1, por exemplo, di-hidratos (R-2 H2O) e hexa-hidratos (R-6 H2O)).

[00199] Será entendido que os compostos que têm a mesma fórmu- la molecular, porém se diferenciam na natureza ou sequência de liga- ção de seus átomos ou na disposição de seus átomos no espaço são denominados "isômeros". Os isômeros que se diferem na disposição de seus átomos no espaço são denominados "estereoisômeros".

[00200] Os estereoisômeros que não são imagens espelhadas uns dos outros são denominados "diastereômeros" e aqueles que são ima- gens espelhadas não sobreponíveis uns dos outros são denominados "enantiômeros". Quando um composto tiver um centro assimétrico, por exemplo, é ligado a quatro grupos diferentes, e um par de enantiôme- ros é possível. Um enantiômero pode ser caracterizado pela configu- ração absoluta de seu centro assimétrico e é descrito pelas regras de sequenciamento R e S de Cahn e Prelog, ou pela maneira na qual a molécula gira o plano de luz polarizada e designado como dextrorrota- tório ou levorrotatório (ou seja, como isômeros (+) ou (-) respectiva- mente). Um composto quiral pode existir tanto como um enantiômero individual quanto como uma mistura do mesmo. Uma mistura contendo proporções iguais dos enantiômeros é denominada uma "mistura ra-

cêmica".

[00201] O termo "tautômeros" refere-se a compostos que são for- mas intercambiáveis de uma estrutura de composto particular e que variam no deslocamento de átomos de hidrogênio e elétrons. Assim, duas estruturas podem estar em equilíbrio através do movimento de elétrons mr e um átomo (geralmente H). Por exemplo, enóis e cetonas são tautômeros porque são rapidamente interconvertidos por trata- mento com ácido ou base. Outro exemplo de tautomerismo são as formas aci e nitro do fenilnitrometano, que são igualmente formadas por tratamento com ácido ou base.

[00202] As formas tautoméricas podem ser relevantes para a ob- tenção da reatividade química e atividade biológica ideais de um com- posto de interesse.

[00203] A menos que seja definido o contrário, as estruturas repre- sentadas no presente documento também devem incluir todas as for- mas isoméricas (por exemplo, enantioméricas, diastereoméricas e ge- ométricas (ou conformacional)) da estrutura; por exemplo, as configu- rações de R e S para cada centro assimétrico, isômeros de ligação dupla Z e E, e isômeros conformacionais Z e E. Portanto, os únicos isômeros estereoquímicos assim como misturas enantioméricas, dias- terioméricas e geométricas (ou conformacionais) dos compostos pre- sentes estão dentro do escopo da invenção. A menos que seja defini- do o contrário, todas as formas tautoméricas dos compostos da inven- ção estão dentro do escopo da invenção. Adicionalmente, a menos que seja definido o contrário, as estruturas representadas no presente documento também se destinam a incluir compostos que diferem ape- nas na presença de um ou mais átomos isotopicamente enriquecidos. Por exemplo, os compostos que têm as presentes estruturas que in- cluem a substituição de hidrogênio por deutério ou trítio, ou a substitui- ção de um carbono por um carbono enriquecido por 1ºC- ou 1ºC estão dentro do escopo desta invenção. Tais compostos são úteis, por exemplo, como ferramentas analíticas, como sondas em ensaios bio- lógicos ou como agentes terapêuticos de acordo com a presente in- venção.

[00204] Quando um enantiômero específico for preferencial, o mesmo pode, em algumas modalidades, ser fornecido substancial- mente livre do enantiômero correspondente e também pode ser referi- do como "opticamente enriquecido". "Opticamente enriquecido", con- forme usado no presente documento, significa que o composto é cons- tituído de uma proporção significativamente maior de um enantiômero. Em determinadas modalidades, o composto é constituído de pelo me- nos cerca de 90% em peso de um enantiômero preferencial. Em ou- tras modalidades, o composto é constituído de pelo menos cerca de 95%, 98% ou 99% em peso de um enantiômero preferencial. Os enan- tiômeros preferenciais podem ser isolados de misturas racêmicas por qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica, incluindo cromatografia líquida de alta pressão quiral (HPLC) e a formação e cristalização de sais quirais ou preparados por sínteses assimétricas. Consultar, por exemplo, Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, Nova lorque, 1981); Wilen, et al., Tet- rahedron 33:2,725 (1977); Eliel, E.L. Stereochemistry of Carbon Com- pounds (McGraw-Hill, NY, 1962); Wilen, S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions página 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972).

[00205] Vários aspectos das composições e métodos no presente documento são descritos em maiores detalhes abaixo. As definições adicionais são apresentadas ao longo do relatório descritivo. Descrição Detalhada

[00206] A presente invenção fornece, pelo menos em parte, um mé- todo de tratamento de um indivíduo que tem uma doença associada à expressão de BCMA, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma célula (por exemplo, uma população de cé- lulas) que expressa uma molécula de CAR que se liga a BCMA (uma "célula que expressa CAR de BCMA"). Em algumas modalidades, a doença associada à expressão de BCMA é um câncer hematológico, por exemplo, ALL, CLL, DLBCL, ou mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o indivíduo tem mieloma múltiplo de alto risco de estágio Il (por exemplo, mieloma múltiplo de alto risco estágio Ill baseado no Revised International Staging System), tratando, assim, o indivíduo. Em algumas modalidades, a terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada com base na no presente documentosição de um nível de um biomarcador de uma amostra de paciente. Em al- gumas modalidades, a terapia com células que expressam CAR de BCMA é administrada ao indivíduo em combinação com uma segunda terapia. Em algumas modalidades, a terapia com células que expres- sam CAR de BCMA e a segunda terapia são administradas simultânea ou sequencialmente. Em algumas modalidades, a segunda terapia é uma terapia com células que expressam CAR de CD19.

Receptor de antígeno quimérico (CAR)

[00207] Em um aspecto, são descritos no presente documento mé- todos que usam uma célula (por exemplo, uma população de células) que expressa uma molécula de CAR. Em um aspecto, um construto CAR exemplificativo compreende uma sequência líder opcional (por exemplo, uma sequência líder no presente documento descrita), um domínio de ligação a antígenos (por exemplo, um domínio de ligação a antígenos no presente documento descrito), uma dobradiça (por exemplo, uma região de dobradiça no presente documento descrita), um domínio transmembrana (por exemplo, um domínio transmembra- na no presente documento descrito) e um domínio estimulador intrace- lular (por exemplo, um domínio estimulador intracelular no presente documento descrito). Em um aspecto, um construto de CAR exemplifi- cativo compreende uma sequência líder opcional (por exemplo, uma sequência líder no presente documento descrita), um domínio de liga- ção a antígenos extracelular (por exemplo, um domínio de ligação a antígenos no presente documento descrito), uma dobradiça (por exemplo, uma região de dobradiça no presente documento descrita), um domínio transmembrana (por exemplo, um domínio transmembra- na no presente documento descrito), um domínio de sinalização coes- timulador intracelular (por exemplo, um domínio de sinalização coesti- mulador no presente documento descrito) e/ou um domínio de sinali- zação primário intracelular (por exemplo, um domínio de sinalização primário no presente documento descrito).

[00208] “Sequências de exemplos não limitadores de vários compo- nentes que podem fazer parte de uma molécula CAR descrita no pre- sente documento são listadas na Tabela 1, onde "aa" significa aminoá- cidos, e "na" significa ácidos nucleicos que codificam o peptídeo cor- respondente.

Tabela 1. Sequências de vários componentes de CAR (aa — sequência de aminoácidos, na — sequência de ácidos nu- cleicos).

SEQ ID NO: SEQIDNO: 1 | Promotor de EF-1 CGTGAGGCTCCGGTEGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGG

GGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGAT GTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCC GTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGC GGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTAC GTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGG AGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTEGECECTEGEGCCGCCGCGTECGAATC

TGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGAC CTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTAT 8 TTCGGTTTTTGGGGCCECEGECEGCGACGGEGCCCEGTECETCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGG 3 CEGEGEGGCCTECEAGCGCEGCCACCEGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTC = TGGTGCCTGGCCTCECECCGCCGTETATCEGCCCeGCEeTEGECEGCAAGGCTEGCCEGETCEGC

ACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGA CEGCEGCECTCEGEAGAGCGGECEGETEGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTC AGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGA GCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTG AGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTT TGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGG

TGTCGTGA SEQIDNO:2 | Líder (aa) MALPVTALLLPLALLLHAARP SEQIDNO:3 | Líder (na) ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTECCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC SEQIDNO:33 | Líder (na) ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCEGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGEGCCE SEQIDNO:4 | Dobradiça de CD8(aa) | TTTPAPRPPTPAPTIASOPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

SEQ ID NO: 5 Dobradiça de CD8 (na) ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCE

TGCGCCCAGAGGCGETECCGGCCAGCGGCEGGEGEGCECAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCG

CCTGTGAT SEQ ID NO: 6 Dobradiça de Ig4 (aa) ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN

AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF

SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM SEQ ID NO: 7 Dobradiça de Ig4 (na) GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCOTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGT

GTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTG TGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGETCCG

TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAG GGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGG o TGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTG Ss AAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTA o

CAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGG ACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAC

CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG SEQ ID NO: 8 Dobradiça de IgD (aa) RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQ

PLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRL TLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPOQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPN ILLMWLEDOQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRS

LEVSYVTDH SEQ ID NO: 9 Dobradiça de IgD (na) AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGG

CAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCEGGGAGGAGA AGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCC CATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAG GCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCC GGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAG CCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCT AAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAG TTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCG

AAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACA CCAGCGGCTTCEGCTCCAGCCCGGCCCocACCCcAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGT

GTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAA

GATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT SEQ ID NO: 10 | Dobradiça/ligante de GS | GGGGSGGGGS (aa) SEQ ID NO: 11 Dobradiça/ligante de GS | GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (na) e SEQ ID NO: 12 | CD8TM (aa) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC = o SEQ ID NO: 13 | CD8 TM (na) ATCTACATCTGGGCGCCCTTGEGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTT -

TACTGC SEQ ID NO: 34º | CD8 TM (na) ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTT

ACTGT SEQ ID NO: 14º | Domínio intracelular de 4- | KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 1BB (aa) SEQ ID NO: 15. | Domínio intracelular de 4- | AMACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTC 1BB (na) AAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG SEQ ID NO: 35. | Domínio intracelular de 4- | AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACT 1BB (na) CAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG SEQ ID NO: 16 | CD27 (aa) OQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP

SEQ ID NO: 17 CD27 (na) AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCcGGGCE

CACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC SEQ ID NO: 18 CD3-zeta (aa) RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK

MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 19 CD3-zeta (na) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAA

CGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTG AGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGAT AAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACG ATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCC

TGCCCCCTCGC SEQ ID NO: 36 CD3-zeta (na) CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAA

CGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCA GAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGA 8 TAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACG 3 ACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCC =

CTGCCGCCTCGG SEQ ID NO: 20 CD3-zeta (aa) RVKFSRSADAPAY QQGQANQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK

MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 21 CD3-zeta (na) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCEGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAA

TGCCCCCTCGC SEQ ID NO: 23 ligante = GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC

SEQ ID NO: 24 | Domínio extracelular de | Pawfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftesfsntsesfvinwyrmspsngtdklaafpedrsapgadcrfrvtglpngrdfhmsvvrarrnds PD-1 (aa) gtylcgaislapkagikeslraelrvterraevptahpspsprpagafativ SEQ ID NO: 25. | Domínio extracelular de | Cceggatggtttetagactetecggategecegtggaatececcaacetictcaceggcactettggttgtaactgagggcgataatgcgacctticac PD-1 (na) gtgctegttetecaacaccetecgaateattegtgctgaactggtaccgcatgagcecegicaaaccagacegacaagcetegecgcegtttecggaaga teggtegcaacegggacaggattgteggtticegegigactcaactgcegaatggcagagacttccacatgagegtggtcegegetaggegaaac gactcegggacctaccetgtgcggagecatctegetagegectaaggeccaaatraaagagagcetigagggccegaactigagagigaccgageg cagagctgaggtgccaactgcacatccatccecategecteggectacagagcagtttragaccctagte

SEQ ID NO: 26 | CAR PD-1 (aa) com sinal | Malpvtalliplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcesfsntsesfvinwyrmspsngtdklaafpedrsqapgqgdcrfrvtal pngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkagikeslraelrvterraevptahpspsprpagafatlvtttpaprpptpaptiasqplIslrpeacrpaa ggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvllislvitlyckrgrkkllyifkgpfmrpvagttgeedgescrfipeeeeggcelrvkfsrsadapaykgggnglyn elnigrreeydvidkrrgrdpemggkprrknpgeglynelgkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglygglstatkdtydalhmgalppr

SEQ ID NO: 27º | CAR PD-1 (na) Atggcccteccetgteactgecetgcettetececetegeactectgetecacgecegetagaccacecggatggtttetagactetecggategecegtigg aatcccecaaccetteteaceggcactettggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctegttctecaacacetecgaatcattegtacta 8 aactggtaccgcatgagccegtcaaaccagacegacaagcetegecgcegttteeggaagateggtegcaacegggacaggattgteggttcege FS gtgactcaactgccegaatggcagagacttccacatgagegtggtcegegctaggegaaacgactecgggacctacctatacggagecatetege = tggcgcctaaggcccaaatraaagagagcettgagggcegaactgagagtgaccgagegcagagcetgaggtgccaactgcacatccateecca tegecteggectacgggagcagtttcagacectagteacgaccactecggegecgegeceacegactecggececaactategegagecagece ctgtegctgaggceggaagcatgcegecetacegecggagatactatgcatacccegggagattggacttegcatgcgacatctacatttgggctecte tegecggaactigtggcgtgctecttctgtecetagteateacectgtactacaageggggtcggaaaaagcttctgtacattttraagcagcccttcat gaggccegtgcaaaccaccecaggaggaggacggttgctectgceggtteccegaagaggaagaaggaggttgcgagctacgacgatgaagttct ceeggagegecgacgececegectataagecagggecagaaccagcetgtacaacgaactgaacctgggacggegggaagagtacgatgtact ggacaagcggegeggecgggacceegaaataggegggaagectagaagaaagaacccteaggaaggcctatataacgagctgcagaagg acaagatggccegaggcctactcegaaatigggataaagggagageggeggaggggaaaggggcacgacggcectataccaaggactgteca cegecaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggeccettececetege

SEQ ID NO: 28 ligante = (Gly-Gly-Gly-Ser)n, em que n = 1-10 sEQIDNO:28 [gate — = (ease sEQIDNO:31 [ante = = [(chssen SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 37 | CAR PD1 (aa) Pawfldspdrpwnpptfíspallvvtegdnatftesfsntsesfvinwyrmspsnagtdklaafpedrsapgadcrfrvtalpngrdfhmsvvrarrnds gtylegaislapkagikeslraelrvterraevptahpspsprpagafatlvtttpaprpptpaptiasqpIslrpeacrpaaggavhtrgaldfacdiyiwa plagtcgvilislvitlyckrgrkkllyifkgpfmrpvagttgaeedgescripeeeeggcelrvkfsrsadapaykggqgnaqlynelnigrreeydvidkrrgr dpemggkprrknpgeglynelgkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglygglstatkdtydalhmgalppr SEQ ID NO: 38 | Domínio intracelular de | TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL ICOS (aa) SEQ ID NO: 271 | Domínio intracelular de | ACAMAMAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGA ICOS (na) ACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA SEQ ID NO: 272 | Domínio TM de ICOS (aa) | TITPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWL SEQ ID NO: 273 | Domínio TM de ICOS (na) | ACCACGACGCCAGCEGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATEGCGTCGCAGCCCCOTGTCCCO R TGCGCCCAGAGGCETEGCCGEGCCAGEGGCEGEGEGCECAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCG Ss CCTSGTGATTTCTGGTTACCCATAGGATGTGCAGCCTTTGTTGTAGTCTGCATTTTGGGATGCATACT -

TATTTGTTGGCTT SEQ ID NO: 274 | Domínio intracelular de | RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 (aa) SEQ ID NO: 275 | Domínio intracelular de | AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCcoesece CD28 (na) CACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC

Domínio de Ligação ao Antígeno de CAR

[00209] Em um aspecto, a porção do CAR que compreende o do- mínio de ligação a antígenos compreende um domínio de ligação a antígenos que alveja um antígeno tumoral, por exemplo, um antígeno tumoral descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno se liga a: CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1; molécula-1 tipo lectina tipo C, CD33; variante Ill de re- ceptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRvII!); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3; membro de família de receptor de TNF; an- tígeno de maturação de célula B (BCMA); antígeno de Tn ((Tn Ag) ou (GalNAca-Ser/Thr)); antígeno de membrana específica da próstata (PSMA); Receptor 1 órfão tipo receptor tirosina quinase (ROR1); tirosi- na cinase 3 tipo Fms (FLT3); glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72); CD38; CD44v6; antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécu- la de adesão de célula epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de Interleucina-13; Mesoteli- na; Receptor alfa de Interleucina 11 (IL-11Ra); antígeno de célula- tronco de próstata (PSCA); Serina 21 de protease; receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); antígeno de Lewis(Y); CD24; Receptor beta de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR-beta); antígeno-4 embrionário de estágio específico (SSEA- 4); CD20; receptor alfa de folato; quinase de proteína de tirosina re- ceptora ERBB2 (Her2/neu); mucina 1, associada à superfície celular (MUC1); receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécu- la de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator 2 de alongamento mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 tipo insulina (receptor de IGF-I), anidrase carbônica IX (CAIX); subunidade de proteassomo (prossomo, macropaína), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de onco-

gênio consistindo na região de agrupamento de ponto de ruptura (BCR) e homólogo 1 de oncogênio viral de leucemia murina de Abel- son (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor 2 tipo A de efrina (EphA2); GM1 de Fucosila; molécula de adesão de Lewis de sialila (sLe); gangliosí- deo GM3; transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado ao mela- noma de alto peso molecular (HMWMAA); gangliosídeo de o-acetil- GD2 (OAcGD2); receptor beta de folato; marcador 1 endotelial de tu- mor (TEM1/CD248); marcador 7 relacionado ao tumor endotelial (TEM7R); claudina 6 (CLDNG6); receptor de hormônio estimulante de tiroide (TSHR); grupo 5 classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberto 61 do cromossomo X (CXORF61); CD97; CD179a; cinase de linfoma anaplásico (ALK); áci- do polissiálico; específico de placenta 1 (PLAC1); porção de hexassa- carídeo de glicoceramida de globoH (GloboH); antígeno de diferencia- ção de glândula mamária (NY-BR-1); uroplacina 2 (UPK2); receptor celular 1 de vírus de hepatite A (HAVCR1); adenorreceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno 6 de linfócito, locus K 9 (LY6K); re- ceptor olfativo 51E2 (OR51E2); proteína de quadro de leitura alternado de TCR gama (TARP); proteína de tumor de Wilms (WT1); antígeno 1 de câncer/testículos (NY-ESO-1); antígeno 2 de câncer/testículos (LAGE-1a); antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); gene 6 variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 de espermatozoide (SPA17); família de antí- geno X, membro 1A (XAGE1); receptor 2 de superfície celular de liga- ção de angiopoietina (Tie 2); antígeno-1 de testículos de câncer de melanoma (MAD-CT-1); antígeno-2 de testículos de câncer de mela- noma (MAD-CT-2); antígeno 1 Fos-relacionado; proteína de tumor p53 (p53); p53 mutante; prosteína; sobrevivente; telomerase; antígeno-1 de tumor de carcinoma de próstata, antígeno de melanoma reconheci-

do por células T 1; sarcoma de rato (Ras) mutante; transcriptase re- versa de telomerase humana (hTERT); pontos de ruptura de translo- cação de sarcoma; inibidor de melanoma de apoptose (ML-IAP); ERG (gene de fusão de ETS de protease transmembranar, serina 2 (TMPRSS?2)); glucosaminil-transferase V de N-acetila (NA17); proteína de caixa emparelhada Pax-3 (PAX3); receptor de androgênio; ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogênio viral de mielo- citomatose aviária de v-myc (MYCN); membro C de família homóloga de Ras (RhoC); proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2); citocromo P450 1B1 (CYP1B1); fator de ligação de CCCTC tipo (proteína de dedo de zinco), antígeno de carcinoma de célula escamosa reconhecido por células T 3 (SART3); proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAXS5); pro- teína de ligação de proacrosina sp32 (OY-TES1); tirosina cinase de pro- teína específica de linfócito (LCK); proteína 4 de âncora de cinase A(AKAP-4); sarcoma sinovial, ponto de ruptura de X 2 (SSX2); Receptor para endoprodutos de glicação avançada (RAGE-1); renal ubiquitoso 1 (RU1); renal ubiquitoso 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); esterase de car- boxila intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; receptor 1 tipo imunoglobulina associada ao leu- cócito (LAIR1); fragmento de Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); membro 2 de subfamília A de receptor tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); membro f de família tipo molécula de CD300 (CD300LF); membro A de família 12 de domínio de lectina tipo C (CLEC12A); antí- geno 2 de célula estromal de medula óssea (BST2); tipo receptor 2 de hormônio tipo mucina contendo módulo tipo EGF (EMR2); antígeno 75 de linfócito (LY75); glipicano-3 (GPC3); tipo receptor de Fc 5 (FCRL5); ou polipeptídeo 1 tipo imunoglobulina lambda (IGLL1).

[00210] O domínio de ligação de antígeno pode ser qualquer domí- nio que se liga a um antígeno incluindo, mas sem limitações, um anti-

corpo monoclilonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinan- te, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado e um fragmento funcional do mesmo, incluindo, mas sem limitações, um anticorpo de domínio único como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável (VHH) de nanocorpo derivado de camelídeo, e a um arcabouço alternativo co- nhecido na especialidade por funcionar como o domínio de ligação de antígeno, como um domínio de fibronectina recombinante, um receptor de célula T (TOR) ou um fragmento dos mesmos, por exemplo, TOR de cadeia única e similares. Em alguns casos, é benéfico que o domí- nio de ligação ao antígeno seja derivado da mesma espécie na qual o CAR será em última instância usado. Por exemplo, para uso em hu- manos, poderá ser benéfico que o domínio de ligação ao antígeno do CAR compreenda resíduos humanos ou humanizados para o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Domínio transmembranar de CAR

[00211] Em relação ao domínio transmembrana, em várias modali- dades, um CAR pode ser concebido para compreender um domínio transmembrana que está ligado ao domínio extracelular do CAR. Um domínio transmembrana pode incluir um ou mais aminoácidos adicio- nais adjacentes à região transmembrana, por exemplo, um ou mais aminoácidos associados à região extracelular da proteína de onde a transmembrana foi derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 até 15 aminoácidos da região extracelular) e/ou um ou mais aminoáci- dos adicionais associados à região intracelular da proteína de onde a proteína transmembrana é derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7,8, 9, 10 até 15 aminoácidos da região intracelular). Em um aspecto, o domínio transmembranar é aquele que está associado a um dos ou- tros domínios do CAR. Em alguns casos, o domínio transmembrana pode ser selecionado ou modificado por substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais domínios aos domínios transmembrana das mesmas ou de diferentes proteínas de membrana de superfície, por exemplo, para minimizar interações com outros membros do com- plexo do receptor. Em um aspecto, o domínio transmembrana é capaz de homodimerização com outro CAR na superfície celular de uma cé- lula expressando CAR. Em um aspecto diferente, a sequência de ami- noácidos do domínio transmembranar pode ser modificada ou substitu- ída de modo a minimizar interações com os domínios de ligação do parceiro de ligação nativo presente no mesmo CART.

[00212] O domínio transmembranar pode ser derivado de uma fonte natural ou de uma fonte recombinante. Quando a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada a membrana ou transmembrana. Em um aspecto, o domínio transmembrana é capaz de sinalizar ao ou aos domínios intracelulares sempre que o CAR se liga a um alvo. Um domínio transmembrana de uso particular nesta in- venção pode incluir pelo menos a(s) região(ões) transmembrana, por exemplo, da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD27, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Em algumas moda- lidades, um domínio transmembranar pode incluir pelo menos a(s) regi- âao(ões) transmembranar(es) de, por exemplo, KIR2DS2, OX40, CD?2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R a, ITGAJ1, VLA1, CD49a, ITGAA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11I, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMAA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108),, SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME

(SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C.

[00213] Em alguns casos, o domínio transmembranar pode ser |i- gado à região extracelular do CAR, por exemplo, o domínio de ligação a antígeno do CAR, através de uma região de dobradiça, por exemplo, uma região de dobradiça de uma proteína humana. Por exemplo, em uma modalidade, a dobradiça pode ser uma dobradiça de Ig (imuno- globulina) humana, por exemplo, uma dobradiça de IgG4 ou uma do- bradiça de CD8a. Em uma modalidade, a dobradiça ou espaçador compreende (por exemplo, consiste em) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em um aspecto, o domínio transmembranar com- preende (por exemplo, consiste em) um domínio transmembranar de SEQ ID NO: 12.

[00214] Em um aspecto, a dobradiça ou espaçador compreende uma dobradiça de IgG4. Por exemplo, em uma modalidade, a dobradi- ça ou espaçador compreendem uma dobradiça da sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a dobradiça ou espaçador compreende uma região de dobradiça codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7.

[00215] Em um aspecto, a dobradiça ou espaçador compreende uma dobradiça de IgD. Por exemplo, em uma modalidade, a dobradiça ou espaçador compreendem uma dobradiça da sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a dobradiça ou es- paçador compreende uma região de dobradiça codificada por uma se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9.

[00216] Em um aspecto, o domínio transmembranar pode ser re- combinante, em tal caso compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos, como leucina e valina. Em um aspecto, um tripleto de fe- nilalanina, triptofano e valina pode ser encontrado em cada extremida- de de um domínio transmembranar recombinante.

[00217] —Opcionalmente, um ligante oligo ou polipeptídico curto, com entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação entre o domínio transmembranar e a região citoplasmática do CAR. Um du- pleto glicina-serina proporciona um ligante particularmente adequado. Por exemplo, em um aspecto, o ligante compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o ligador é codificado por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11.

[00218] Em um aspecto, a dobradiça ou espaçador compreende uma dobradiça de KIR2DS2. Domínio citoplasmático

[00219] — O domínio ou região citoplasmática do CAR inclui um domí- nio de sinalização intracelular. Um domínio de sinalização intracelular é, de modo geral, responsável pela ativação de pelo menos uma das fun- ções efetoras normais da célula imune em que o CAR foi introduzido.

[00220] Os exemplos de domínios de sinalização intracelulares para uso em um CAR descrito no presente documento incluem as sequên- cias citoplasmáticas do receptor de células T (TOR) e correceptores que atuam em conjunto para iniciar a transdução do sinal após engate do receptor de antígeno, bem como qualquer derivado ou variante dessas sequências e qualquer sequência recombinante que tenha a mesma capacidade funcional.

[00221] É conhecido que sinais gerados através do TCR isolada- mente são insuficientes para a ativação total da célula T e que também é necessário um sinal secundário e/ou coestimulador. Assim, pode ser afirmado que a ativação de células T é mediada por duas classes dis- tintas de sequências de sinalização citoplasmática: as que iniciam a ativação primária dependente de antígenos através do TOR (domínios de sinalização intracelular primários) e as que atuam de um modo in- dependente de antígenos para proporcionar um sinal secundário ou coestimulador (domínio citoplasmático secundário, por exemplo, um domínio coestimulador).

[00222] "Um domínio de sinalização primário regula a ativação pri- mária do complexo de TCR de um modo estimulador ou de um modo inibidor. Domínios de sinalização intracelulares primários que atuam de um modo estimulador podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação baseados em tirosina do imu- norreceptor ou ITAMs.

[00223] Os exemplos de domínios de sinalização intracelular primá- rios contendo ITAMs que têm uso particular na invenção incluem os de TCR zeta, Fc2R gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (também conhecido como "ICOS"), FceRI, DAP10, DAP12 e CD66d. Em uma modalidade, um CAR da in- venção compreende um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um domínio de sinalização primário de CD3-zeta, por exem- plo, uma sequência de CD3-zeta descrita no presente documento.

[00224] Em uma modalidade, um domínio de sinalização primário compreende um domínio de ITAM modificado, por exemplo, um domí- nio de ITAM mutado que tem atividade alterada (por exemplo, aumen- tada ou decrescida) em comparação com o domínio de ITAM nativo. Em uma modalidade, um domínio de sinalização primário compreende um domínio de sinalização intracelular primário contendo ITAM modifi- cado, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário contendo ITAM otimizado e/ou truncado. Em uma modalidade, um domínio de sinalização primário compreende um, dois, três, quatro ou mais motivos ITAM. Domínio de Sinalização Coestimuladora

[00225] O domínio de sinalização intracelular do CAR pode com- preender o domínio de sinalização de CD3-zeta por si só ou pode ser combinado com qualquer outro domínio (ou domínios) de sinalização intracelular desejado útil no contexto de um CAR da invenção. Por exemplo, o domínio de sinalização intracelular do CAR pode compre-

ender uma porção de cadeia CD3 zeta e um domínio de sinalização coestimulador. O domínio de sinalização coestimulador se refere a uma porção do CAR que compreende o domínio intracelular de uma molécula coestimuladora. Em uma modalidade, o domínio intracelular é projetado de modo a compreender o domínio de sinalização de CD3- zeta e o domínio de sinalização de CD28. Em um aspecto, o domínio intracelular é projetado de modo a compreender o domínio de sinaliza- ção de CD3-zeta e o domínio de sinalização de ICOS.

[00226] A molécula coestimuladora pode ser uma molécula da su- perfície celular, que não um receptor de antígenos ou seus ligantes, que é necessária para uma resposta eficiente de linfócitos a um antí- geno. Os exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno associado à fun- ção de linfócitos-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 e um ligante que se liga especificamente a CD83 e similares. Por exemplo, foi demonstrado que a coestimulação com CD27 intensifica a expan- são, a função efetora e a sobrevivência de células CART humanas in vitro e aumenta a persistência e a atividade antitumoral de células T humanas in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706). Os exem- plos adicionais de tais moléculas coestimulantes incluem CDS, ICAM- 1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp30, NKp44, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGAA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, NKG2D, NKG2C e PAG/Cbp .

[00227] As sequências de sinalização intracelular dentro da porção citoplasmática do CAR podem ser ligadas entre si de um modo aleató- rio ou em uma ordem especificada. Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, por exemplo, com entre 2 e 10 aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos) de comprimento, pode formar a ligação entre sequências de sinalização intracelular. Em uma modalidade, um dupleto glicina-serina pode ser usado como um ligante adequado. Em uma modalidade, um único aminoácido, por exemplo, uma alanina, uma glicina, pode ser usado como ligante adequado.

[00228] Em um aspecto, o domínio de sinalização intracelular é pro- jetado para compreender dois ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais, domínios de sinalização coestimuladores. Em uma modalidade, os dois ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais domínios de sinaliza- ção coestimuladores são separados por uma molécula ligante, por exemplo, uma molécula ligante no presente documento descrita. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende dois domínios de sinalização coestimuladores. Em algumas modalida- des, a molécula ligante é um resíduo glicina. Em algumas modalida- des, o ligante é um resíduo alanina.

[00229] Em um aspecto, o domínio de sinalização intracelular é pro- jetado para compreender o domínio de sinalização de CD3-zeta e o domínio de sinalização de CD28. Em um aspecto, o domínio de sinali- zação intracelular é projetado para compreender o domínio de sinali- zação de CD3-zeta e o domínio de sinalização de 4-1BB. Em um as- pecto, o domínio de sinalização de 4-1BB é um domínio de sinalização de SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, o domínio de sinalização de CD3- zeta é um domínio de sinalização de SEQ ID NO: 18.

[00230] Em um aspecto, o domínio de sinalização intracelular é pro- jetado para compreender o domínio de sinalização de CD3 zeta e o domínio de sinalização de CD27. Em um aspecto, o domínio de sinali-

zação de CD27 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em um aspecto, o domínio de sinalização de CD27 é codi- ficado por uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 17.

[00231] Em um aspecto, a célula que expressa CAR descrita no presente documento pode compreender adicionalmente um segundo CAR, por exemplo, um segundo CAR que inclui um domínio de ligação a antígeno diferente, por exemplo, para o mesmo alvo ou um alvo dife- rente (por exemplo, um alvo diferente de um antígeno associado a câncer descrito no presente documento ou um antígeno associado a câncer diferente descrito no presente documento, por exemplo, CD19, CD33, CLL-1, CD34, FLT3 ou receptor de folato beta). Em uma moda- lidade, o segundo CAR inclui um domínio de ligação a antígeno para um alvo expresso no mesmo tipo de célula cancerosa que o antígeno associado a câncer. Em uma modalidade, a célula que expressa CAR compreende um primeiro CAR que tem como alvo um primeiro antíge- no e inclui um domínio de sinalização intracelular que tem um domínio de sinalização coestimulador, mas não um domínio de sinalização pri- mário, e um segundo CAR que tem como alvo um segundo antígeno diferente e inclui um domínio de sinalização intracelular que tem um domínio de sinalização primário, mas não um domínio de sinalização coestimulador. Sem se ater à teoria, a colocação de um domínio de sinalização coestimulador, por exemplo, 4-1BB, CD28, ICOS, CD27 ou OX-40, no primeiro CAR, e do domínio de sinalização primário, por exemplo, CD3 zeta, no segundo CAR pode limitar a atividade de CAR a células em que ambos os alvos são expressos. Em uma modalidade, a célula expressando CAR compreende um primeiro CAR para um an- tígeno associado a câncer que inclui um domínio de ligação a antíge- nos que se liga a um antígeno-alvo descrito no presente documento, um domínio transmembrana e um domínio coestimulador, e um se- gundo CAR que visa um antígeno-alvo diferente (por exemplo, um an-

tígeno expresso nesse mesmo tipo de células cancerígenas do primei- ro antígeno-alvo) e inclui um domínio de ligação a antígenos, um do- mínio transmembrana e um domínio de sinalização primário. Em outra modalidade, a célula expressando CAR compreende um primeiro CAR que inclui um domínio de ligação a antígenos que se liga a um antígeno- alvo descrito no presente documento, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização primário, e um segundo CAR que visa um antíge- no diferente do primeiro antígeno-alvo (por exemplo, um antígeno ex- presso no mesmo tipo de células cancerígenas das do primeiro antígeno- alvo) e inclui um domínio de ligação a antígenos para o antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização coestimulador.

[00232] Em outro aspecto, a descrição apresenta uma população de células que expressam CAR, por exemplo, células CART. Em al- gumas modalidades, a população de células que expressa CAR com- preende uma mistura de células que expressa diferentes CARs. Por exemplo, em uma modalidade, a população de células CART pode in- cluir uma primeira célula expressando um CAR tendo um domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer descrito no presente documento, e uma segunda célula expressando um CAR tendo um domínio de ligação a antígenos diferente, por exemplo, um domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer diferente descrito no presente documento, por exemplo, um domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer descrito no presente documento que difere do antígeno associado a câncer |i- gado pelo domínio de ligação a antígenos do CAR expresso pela pri- meira célula. Como outro exemplo, a população de células que ex- pressam CAR pode incluir uma primeira célula que expressa um CAR que inclui um domínio de ligação a antígeno para um antígeno associ- ado a câncer descrito no presente documento e uma segunda célula que expressa um CAR que inclui um domínio de ligação a antígeno para um alvo diferente de um antígeno associado a câncer conforme descrito no presente documento. Em uma modalidade, a população de células expressando CAR inclui, por exemplo, uma primeira célula ex- pressando um CAR que inclui um domínio de sinalização intracelular primário, e uma segunda célula expressando um CAR que inclui um domínio de sinalização secundário.

[00233] Em outro aspecto, a presente descrição apresenta uma po- pulação de células em que pelo menos uma célula da população ex- pressa um CAR que tem um domínio de ligação a antígeno para um antígeno associado a câncer descrito no presente documento e uma segunda célula que expressa outro agente, por exemplo, um agente que intensifica a atividade de uma célula que expressa CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agente pode ser um agente que inibe uma molécula inibidora. Moléculas inibidoras, por exemplo, PD-1, po- dem, em algumas modalidades, diminuir a capacidade de uma célula expressando CAR para montar uma resposta imune efetora. Os exemplos de moléculas inibidoras incluem PD-1, PD-L1, CTLAA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7- H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 ou CD270), KIR, A2aR, MHC de classe |, MHC de classe Il, GAL9, adenosina e TGF (por exemplo, TGF beta). Em uma modalidade, o agente que inibe uma molécula ini- bidora compreende um primeiro polipeptídeo, por exemplo, uma molé- cula inibidora, associado a um segundo polipeptídeo que fornece um sinal positivo à célula, por exemplo, um domínio de sinalização intrace- lular descrito no presente documento. Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptídeo, por exemplo, de uma molécula inibidora, tal como PD-1, PD-L1, CTLAA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGF beta, ou um fragmento de qualquer um dos mes-

mos, e um segundo polipeptídeo que é um domínio de sinalização in- tracelular descrito no presente documento (por exemplo, que compre- ende um domínio coestimulador (por exemplo, 41BB, CD27, OX40 ou CD28, por exemplo, conforme descrito no presente documento) e/ou um domínio de sinalização primário (por exemplo, um domínio de sina- lização de CD3 zeta descrito no presente documento). Em uma moda- lidade, o agente compreende um primeiro polipeptídeo de PD-1 ou um seu fragmento e um segundo polipeptídeo de um domínio de sinalização intracelular descrito no presente documento (por exemplo, um domínio de sinalização de CD28 descrito no presente documento e/ou um domí- nio de sinalização de CD3 zeta descrito no presente documento). CAR de BCMA

[00234] Em um aspecto, o CAR descrito no presente documento se liga a BCMA. Os CARs de BCMA exemplificativos podem incluir se- quências descritas na Tabela 1 ou 16 do documento WO2016/014565, incorporado no presente documento a título de referência. O construto de CAR de BCMA pode incluir uma sequência líder opcional; um do- mínio de dobradiça opcional, por exemplo, um domínio de dobradiça de CD8; um domínio transmembranar, por exemplo, um domínio trans- membranar de CD8; um domínio intracelular, por exemplo, um domínio intracelular de 4-1BB; e um domínio de sinalização funcional, por exemplo, um domínio de CD3 zeta. Em certas modalidades, os domí- nios são contíguos e estão no mesmo quadro de leitura para formar uma única proteína de fusão. Em outras modalidades, os domínios es- tão em polipeptídeos separados, por exemplo, tal como em uma molé- cula RCAR como descrito no presente documento.

[00235] As sequências de moléculas de CAR de BCMA exemplifica- tivas ou fragmentos das mesmas são descritos nas Tabelas 2 e 3. Em determinadas modalidades, a molécula de CAR de BCMA de compri- mento total inclui uma ou mais CDRs, VH, VL, scFv ou sequências de comprimento total de BCMA-1, BOCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BOCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BOCMA-10, BOCMA-11, BOMA- 12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA EBB-C1978-A4, BCMA EBB-C1978-G1, BCMA EBB-C1979-C1, BCMA EBB-C1978- C7, BCMA EBB-C1978-D10, BCMA EBB-C1979-C12, BCMA EBB- C1980-G4, BCMA EBB-C1980-D2, BCMA EBB-C1978-A10, BCMA- EBB-C1978-D4, —BCMA EBB-C1980-A2, BCMA EBB-C1981-C3, BCMA EBB-C1978-G4, A7D12,2, C11D5,3, C12A3,2, ou C13F12,1, conforme descrito nas Tabelas 2 e 3, ou uma sequência substancial- mente (por exemplo, 95 a 99%) idêntica à mesma.

[00236] As sequências de alvejamento de BOCMA exemplificativas adicionais que podem ser usadas nos construtos de CAR anti-<BCMA são descritas nos documentos nº WO 2017/021450, WO 2017/011804, WO 2017/025038, WO 2016/090327, WO 2016/130598, WO 2016/ 210293, WO 2016/090320, WO 2016/014789, WO 2016/094304, WO 2016/154055, WO 2015/166073, WO 2015/188119, WO 2015/ 158671, US 9,243,058, US 8,920,776, US 9,273,141, US 7,083,785, US 9,034,324, US 2007/0049735, US 2015/0284467, US 2015/0051266, US 2015/0344844, US 2016/0131655, US 2016/0297884, US 2016/ 0297885, US 2017/0051308, US 2017/0051252, US 2017/0051252, WO 2016/020332, WO 2016/087531, WO 2016/079177, WO 2015/ 172800, WO 2017/008169, US 9,340,621, US 2013/0273055, US 2016/0176973, US 2015/0368351, US 2017/0051068, US 2016/0368988 e US 2015/0232557, incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, construtos de CAR BCMA exemplificativos adicionais são gerados usando as se- quências VH e VL da Publicação PCT WO2012/0163805 (cujo conteú- do é deste modo incorporado por referência na sua totalidade).

Tabela 2. Sequências de Aminoácidos e de Ácidos Nucleicos de domínios scFv anti-BCMA exemplificativos e molécu- las de CAR de BCMA. As sequências de aminoácidos das sequências de cadeia pesada variável e cadeia leve variá- vel para cada scFv também são proporcionadas.

A a E RT O O | 139109- aa Domínio scFv EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTI

SRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIALT

QSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIVAASSLAOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIK = 139109- nt Domínio scFv 64 GAAGTGCAATTGGTGGAATCAGGGGGAGGACTTGTGCAGCCTGGAGGATCGCTGAGACTGTCATGT Ss GCCGTGTCCGGCTTTGCCCTGTCCAACCACGGGATGTCCTGGGTCEGCCGCGCGCCTEGGAAAGGEG o

CCTCGAATGGGTGTCGGGTATTGTGTACAGCGGTAGCACCTACTATGCCGCATCCGTGAAGGGGAG ATTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAGGAACACTCTGTACCTCCAAATGAATTCGCTGAGGCCAGAG GACACTGCCATCTACTACTGCTCCGCGCATGGCGGAGAGTCCGACGTCTGGGGACAGGGGACCACC GTGACCGTGTCTAGCGCETCEGGCEGAGECEGCAGCGEGGEGTCGGGCATCAGEGGGCGGCGGAT CGGACATCCAGCTCACCCAGTCCCCGAGCTCGCTEGTCEGCCTCEGTGGGAGATCGGGTCACCATCA CEGTGCCGCGCCAGCCAGTCGATTTCCTCCTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGGAAAAGCCC CGAAGCTTCTCATCTACGCCGCCTCGAGCCTGCAGTCAGGAGTGCCCTCACGGTTCTCCGGCTCCG GTTCCGGTACTGATTTCACCCTGACCATTTCCTCCCTGCAACCGGAGGACTTCGCTACTTACTACTGC

CAGCAGTCGTACTCCACCCCCTACACTTTCEGGACAAGGCACCAAGGTCGAAATCAAG a o PSFN TOSTES 139109- aa VL 94 DIQLTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLASGVPSRFSGSGSGTDF

A E 139109- aa CAR completo 109 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWYV

SGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIY YCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASG GGGSGGRASGGGGSDIQLTOASPSSLSASVGDRVTITCRASQOSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQOSYSTPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPL SLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQOTTO EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGK

PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 139109- nt CAR completo 124 ATGGCCCTCCCTGTCACCEGCCCOTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAA a GTGCAATTGGTGGAATCAGGGGGAGGACTTGTGCAGCCTGGAGGATCGCTGAGACTGTCATGTGCC = GTGTCCGGCTTTGCCCTGTCCAACCACGGGATGTCCTGGGTCCGCCGCGCGCCTEGAAAGGGCCTC Ss GAATGGGTGTCGGGTATTGTGTACAGCGGTAGCACCTACTATGCCGCATCCGTGAAGGGGAGATTCA ?

CCATCAGCCGGGACAACTCCAGGAACACTCTGTACCTCCAAATGAATTCGCTGAGGCCAGAGGACAC TGCCATCTACTACTGCTCCGCGCATGGCGGAGAGTCCGACGTCTGGGGACAGGGGACCACCGTGAC CGTSGTCTAGCGCETCCGGCGEGAGGCEGCAGCGGGGGTCGGGCATCAGGEGGGCGGCGGATCGGAC ATCCAGCTCACCCAGTCCCCGAGCTCGCTGTCCGCCTCCEGTGGGAGATCGGGTCACCATCACGTGC CGCEGCCAGCCAGTCGATTTCCTCCTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGGAAAAGCCCCGAAG CTTCTCATCTACGCCGCCTCGAGCCTGCAGTCAGGAGTGCCCTCACGGTTCTCCGGCTCCGGTTCE GGTACTGATTTCACCCTGACCATTTCCTCCCTGCAACCGGAGGACTTCGCTACTTACTACTGCCAGCA

GTCGTACTCCACCCCCTACACTTTEGGACAAGGCACCAAGGTCGAAATCAAGACCACTACCCCAGCA CCEGAGGCCACCCACCCoGGCTCCTACCATEGCCTCCCAGCCOTCOTGTCCOTGCGTCCGGAGGCATGT

AGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGG GCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCG GTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGA GGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAG CCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGT CGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCC GCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTA TAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACT

CAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG E O | 139103- aa Domínio scFv 39 QVQOLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLGWVSGISRSGENTYYADSVKGRF a

TISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARSPAHYYGGMDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGG S GSDIVLTAOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSG Ss TDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQYHSSPSWTFGQGTKLEIK ? 139103- nt Domínio scFv 54 CAAGTGCAACTCGTGGAATCTGGTGGAGGACTCGTGCAACCCGGAAGATCGCTTAGACTGTCGTGTG

CCGCCAGCGGGTTCACTTTCTCGAACTACGCGATGTCCTGGGTCCGCCAGGCACCCGGAAAGGGAC TCGGTTGGGTGTCCGGCATTTCCCGGTCCGGCGAAAATACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCC GCTTCACCATCTCAAGGGACAACAGCAAAAACACCCTGTACTTGCAAATGAACTCCCTGCGGGATGA AGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTCGCCTGCCCATTACTACGGCGGAATGGACGTCTGGGG ACAGGGAACCACTGTGACTGTCAGCAGCGCGTCGGGTEGCGGCGGCTCAGGGGGTCGGGCCTCEG GGGGGGGAGGGTCCGACATCGTGCTGACCCAGTCCCCGGGAACCCTGAGCCTGAGCCCGGGAGAG CGCGCGACCCTGTCATGCCGGGCATCCCAGAGCATTAGCTCCTCCTTTCTEGCCTGGTATCAGCAGA AGCCCGGACAGGCCCCGAGGCTGCTGATCTACGGCGCTAGCAGAAGGGCTACCGGAATCCCAGAC CGGTTCTCCEGGCTCCGGTTCCGGGACCGATTTCACCCTTACTATCTEGCGCCTGGAACCTGAGGACT CCGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTACCACTCATCCCCGTCGTGGACGTTCGGACAGGGCACCAAGC

TGGAGATTAAG 139103- aa VH QVQOLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLGWVSGISRSGENTYYADSVKGRF CS [rsmnseramsnsEonvonsmcaoneaemeves “ “SS 139103- aa VL 84 DIVLTAOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSGTD essa |, TasrEers mca meamTcaomaa “SS 139103- aa CAR completo MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLGWV

SGISRSGENTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARSPAHYYGGMDVWGQGTTVT

VSSASGGGGSGGRASGGGGSDIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSFLAWYQQKPGQAPRLLI YGASRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQYHSSPSWTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTP a APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPF - MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGR Ss DPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL ?

PPR 139103- nt CAR completo 114 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCOTGCTGCTTCCEGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCAA

GTGCAACTCGTGGAATCTGGTGGAGGACTCGTGCAACCCGGAAGATCGCTTAGACTGTCGTGTGCC GCCAGCGGGTTCACTTTCTCGAACTACGCGATGTCCTGGGTCCGCCAGGCACCCGGAAAGGGACTC GGTTGGGTGTCCGGCATTTCCCGGTCCGGCGAAAATACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGC TTCACCATCTCAAGGGACAACAGCAAAAACACCCTGTACTTGCAAATGAACTCCCTGCGGGATGAAG ATACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTCGCCTGCCCATTACTACGGCGGAATGGACGTCTGGGGAC AGGGAACCACTGTGACTGTCAGCAGCGCGTCGGGTEGGCEGGCGGCTCAGGGGGTCGGGCCTCCGG GGGGGGAGGGTCCGACATCGTGCTGACCCAGTCCCCGGGAACCCTGAGCCTGAGCCCGGGAGAGC GCGCGACCCTGTCATGCCGGGCATCCCAGAGCATTAGCTCCTCCTTTCTCEGCCTGGTATCAGCAGAA GCCCGGACAGGCCCCGAGGCTGCTGATCTACGGCGCTAGCAGAAGGGCTACCGGAATCCCAGACC GGTTCTCCEGGCTCCGGTTCCEGGGACCGATTTCACCCTTACTATCTOGCGCCTGGAACCTGAGGACTC CGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTACCACTCATCCCCGTCGTGGACGTTCGGACAGGGCACCAAGCT GGAGATTAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATEGCCTCCCAGCC TCTGTCCCTGCETCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGA CTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCOTGCTGCTTTCACTC GTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAG GCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCG

GCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACC AGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGAC a

GGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTC R CAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAA Ss GGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATG ?

CAGGCCCTGCCGCCTCGG | 139105- aa Domínio scFv QVQOLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRF

TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCSVHSFLAYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIVMT QTPLSLPVTPGEPASISCRSSQOSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGESNRASGVPDRFSGSGSGTD

FTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKVEIK 139105- nt Domínio scFv 55 CAAGTGCAACTCGTCGAATCCGGTGGAGGTCTGGTCCAACCTGGTAGAAGCCTGAGACTGTCGTGT

GCGGCCAGCGGATTCACCTTTGATGACTATGCTATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGAAAGGGC CTGGAATGGGTGTCGGGAATTAGCTGGAACTCCGGGTCCATTGGCTACGCCGACTCCGTGAAGGGC

CGCTTCACCATCTCCoGCGACAACGCAAAGAACTCCCTGTACTTGCAAATGAACTCGCTCAGGGCTG

AGGATACCGCGCTGTACTACTGCTCCGTGCATTCCTTCCTGGCCTACTGGGGACAGGGAACTCTGGT CACCGTGTCGAGCGCCTCEGGCGGCGGGGGCTCGGETEGACGGGCCTCGGGCGGAGGGGGGETCÇCÇ GACATCGTGATGACCCAGACCCCGCTGAGCTTGCCCGTGACTCCCGGAGAGCCTGCATCCATCTCC TGCCGGTCATCCCAGTCCCOTTCTCCACTCCAACGGATACAACTACCTCGACTGGTACCTCCAGAAGC CGGGACAGAGCCCTCAGCTTCTGATCTACCTGGGGTCAAATAGAGCCTCAGGAGTGCCGGATCGGT TCAGCGGATCTGGTTCGGGAACTGATTTCACTCTGAAGATTTCCCGCGTGGAAGCCGAGGACGTGG GCGTCTACTACTGTATGCAGGCGCTGCAGACCCCCTATACCTTCEGGCCAAGGGACGAAAGTGGAGAT

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SRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIY YCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSEIVLT QSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSTNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPDRFSGGGSGTDFTLT

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139107- aa CAR completo 107 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVETGGGVVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWV

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GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 139107- nt CAR completo 122 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCOTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAA

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139108- aa VH 78 QVQOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTI re TS [someone ommornsccaDecmess o 139108- aa VL 93 DIQMTQOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRFSGSGSGTD

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GCAGTACGAATCCCTCCCGCTCACATTCEGGCGGGGGAACCAAGGTCGAGATTAAG 139112-aa VH 81 QVQALVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFT E S Dsensmmams ron asmaassaraaams 139112-aa VL DIRLTOSPSPLSASVGDRVTITCQASEDINKFLNWYHQTPGKAPKLLIYDASTLAOTGVPSRFSGSGSGTDF <Q [DF cpa pras 139112-aa CAR completo 111 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWV ?

SGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIY YCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASG GGGSGGRASGGGGSDIRLTAOSPSPLSASVGDRVTITCQASEDINKFLNWYHQTPGKAPKLLIYDASTLOT GVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDIGTYYCQQYESLPLTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLS LRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKAQPFMRPVQTTQE EDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP

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139113- nt CAR completo 127 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCOTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAA

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GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 149362-nt CAR completo 234 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCOTGCTGCTTCCEGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCAA

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GCAATATGGCCACTCTCACCATCTCGGGAGTGCAGGCCGGAGATGAAGCCGACTTCTACTGCCAAGT CTGGGACTCAGACTCCGAGCATGTGGTGTTCGGGGGCGGAACCAAGCTGACTGTGCTC a VH 149365-aa 174 EVOQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTI g VL 149365-aa 195 SYVLTOSPSVSAAPGYTATISCGGNNIGTKSVHWYQQKPGQAPLLVIRDDSVRPSKIPGRFSGSNSGNMA ? rm 1, TooarDemrcamDsssemeaaetara “““=“ "SUS CAR completo 149365-aa 216 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVS

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GCAGGCCCTGCCGCCTCGG BCMA EBB-C1978-A4 - aa 137 EVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF Leomar É [nseonsanvtamsumesTAm ONGs os MicaoruvmvesaasosacosocoosEr |

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GTCCTGCCGCGCTTCCCAATCCGTEGTCCTCCGCGTACTTGGCGTGGTACCAGCAGAAGCCGGGACA GCCCCCTEGECTEGCTEATCAGEGGGGCCAGCACCCGGGCAACCGGAATCCCAGACAGATTCGGGG a GTTCCGGCAGCGGCACAGATTTCACCCTGACTATTTCGAGGTTGGAGCCCGAGGACTTTGCGGTGTA 2 TTACTGTCAGCACTACGGGTCGTCCTTTAATGGCTCCAGCCTGTTCACGTTCGGACAGGGGACCCGC 3 CTGGAAATCAAG ? BCMA EBB-C1978-A4-aa —|179 EVOLVESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF Pv TssoNsamOLOMSLMEDTAN TCM EOSAMONMEAÊTITISS BCMA EBB-C1978-A4-aa | 200 EIVMTOQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSAYLAWYQAKPGAPPRLLISGASTRATGIPDRFGGSGSCT uu CrTemereDrACONESSMESSLEIRGAEE BCMA EBB-C1978-A4-aa [227 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVOLVESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV CART completo SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVEGSGSLDYWGQGTLVTVS

SEGECESCEGESCECEESEIVMTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSAYLAWYQQKPGQPPRLLISGA STRATGIPDRFGGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSFNGSSLFTFGQGTRLEIKTTTPAPRPPT PAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQP FMRPVQOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRG RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ

ALPPR BCMA EBB-C1978-A4 - nt 242 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCOTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAA CART completo GTGCAGCTCGTGGAGTCAGGAGGCGGCCTGGTCCAGCCGGGAGGGTCCCTTAGACTGTCATGCGC CGCAAGCGGATTCACTTTCTCCTCCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCCCCoGGAAAGGGACT

GGAATGGGTGTCCGCCATCTCGGGGTCTGGAGGCTCAACTTACTACGCTGACTCCGTGAAGGGACG GTTCACCATTAGCCGCGACAACTCCAAGAACACCCTCTACCTCCAAATGAACTCCCTGCGGGCCGAG GATACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAAGTGGAAGGTTCAGGATCGCTGGACTACTGGGGACAGGGT

ACTCTCGTGACCGTGTCATCGGGCGGAGGAGGTTCCGGCGGTEGGCGGCTCCGGCGGCGGAGEGTC GGAGATCGTGATGACCCAGAGCCCTGGTACTCTGAGCCTTTCGCCGGGAGAAAGGGCCACCCTGTC a CTGCCGCGCTTCCCAATCCGTGTCCTCCGCGTACTTGGCGTGGTACCAGCAGAAGCCGGGACAGCC 8 CCCTCGGCTGCTGATCAGCGGGGCCAGCACCCGGGCAACCGGAATCCCAGACAGATTCGGGGGTT Ss CCGGCAGCGGCACAGATTTCACCCTGACTATTTCGAGGTTGGAGCCCGAGGACTTTGCGGTGTATTA ?

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CTGCCAGCAGTTCGGTACTTCCTCCGGCCTGACTTTCEGGAGGCGGCACGAAGCTCGAAATCAAG BCMA EBB-C1978-G1 - aa 180 EVOLVETGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSRYPMSWVRQAPGKGLEWVSGISDSGVSTYYADSAKGRFT o see LT ereNsamAONSsLroEoTA Vo TRcSEMomMG amas BCMA EBB-C1978-G1 - aa 201 EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSNSLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDF e EREMOTACDARETESGITRGEE o [| BCMA EBB-C1978-G1 - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSRYPMSWVRQAPGKGLEWVS CART completo GISDSGVSTYYADSAKGRFTISRDNSKNTLFLQOMSSLRDEDTAVYYCVTRAGSEASDIWGQGTMVTVSSG

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PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR BCMA EBB-C1978-G1 - nt 243 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCOTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAA CART completo GTGCAACTGGTGGAAACCGGTGGCGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCATTGAGGCTGTCATGCGCG GCCAGCGGTATTACCTTCTCCCGGTACCCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCCCCGGGGAAAGGGCTT a

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G BCMA EBB-C1979-C1 - aa 139 QVQALVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF Domínio scFv TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAIY YCARATYKRELRYYYGMDVWGQGTMVTVSSGGGGSCGGESSCGÇ a GGSEIVMTOSPGTVSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSG a SGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQYHSSPSWTFGQGTRLEIK Ss BCMA EBB-C1979-C1 - nt 160 CAAGTGCAGCTCGTGGAATCGGGTGGCGGACTGGTGCAGCCGGGGGGCTCACTTAGACTGTCCTGC ? Domínio scFv GCGGCCAGCGGATTCACTTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCCCCTGGAAAGGGC

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GGCCAGCGGATTCACTTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCCCCTGGAMAGGGCCT GGAATGGGTGTCCGCAATCAGCGGCAGCGGCGGCTCGACCTATTACGCGGATTCAGTGAAGGGCAG ATTCACCATTTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCTTGTACCTTCAAATGAACTCCCTCCGCGCGGAA GATACCGCAATCTACTACTGCGCTCGGGCCACTTACAAGAGGGAACTGCGCTACTACTACGGGATGG ACGTCTGGGGCCAGGGAACCATGGTCACCGTGTCCAGCGGAGGAGGAGGATCGGGAGGAGGCGGT AGCGGGGGTGGAGGGTCGGAGATCGTGATGACCCAGTCCCCCGECACTGTGTCGCTGTCCCCCGG CGAACGGGCCACCCTGTCATGTCGGGCCAGCCAGTCAGTGTCGTCAAGCTTCCTCGCCTGGTACCA GCAGAAACCGGGACAAGCTCCCCGCCTGCTGATCTACGGAGCCAGCAGCCGGGCCACCGGTATTCC TGACCGGTTCTCCGGTTCGGGGETCCGGGACCGACTTTACTCTGACTATCTCTCGCCTCGAGCCAGAG GACTCCGCCGTGTATTACTGCCAGCAGTACCACTCCTCCCCGTCCTGGACETTCGGACAGGGCACAA GGCTGGAGATTAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCC AGCCTCTGTCCCTGCGETCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGET CTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTT CACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTC ATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAA GGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCA

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CCAAAGTGGAAATCAAG BCMA EBB-C1978-C7 - aa 182 EVOLVETGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF era. TSSATamTUDEo TATTOO BCMA EBB-C1978-C7 - aa 203 EIVLTOSPSTLSLSPGESATLSCRASQSVSTTFLAWYQQKPGQAPRLLIYGSSNRATGIPDRFSGSGSGTD a el Pane remmecanesremTaaanes SOS a BCMA EBB-C1978-C7 - aa 224 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV Ss CART completo SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLKAEDTAVYYCARATYKRELRYYYGMDVWGQOG ?

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QALPPR BCMA EBB-C1978-C7 - nt 245 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCOTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAG CART completo GTGCAGCTTGTGGAAACCGGTGGCGGACTGGTGCAGCCCGGAGGAAGCCTCAGGCTGTCCTGCGC CGCETCCGGCTTCACCTTCTCCOTCGTACGCCATGTCCTGGGTCCEGCCAGGCCCCoGGAAAGGGCCT

GGAATGGGTGTCCGCCATCTCTGGAAGCGGAGGTTCCACGTACTACGCGGACAGCGTCAAGGGAAG GTTCACAATCTCCCGCGATAATTCGAAGAACACTCTGTACCTTCAAATGAACACCCTGAAGGCCGAGG ACACTGCTGTGTACTACTGCGCACGGGCCACCTACAAGAGAGAGCTCCGGTACTACTACGGAATGGA CGTCTGGGGCCAGGGAACTACTGTGACCGTGTCCTCGGGAGGGGGTEGCTCCGGEGGGEGCEGC TCCGGCGGAGGCGGTTCEGAGATTGTGCTGACCCAGTCACCTTCAACTCTGTCGCTGTCCCCGGGA GAGAGCGCTACTCTGAGCTGCCGGGCCAGCCAGTCCGTGTCCACCACCOTTCCOTCGCCTGGTATCAG CAGAAGCCGGGGCAGGCACCACGGCTCTTGATCTACGGGTCAAGCAACAGAGCGACCGGAATTCCT GACCGCTTCTCGGGGAGCGGTTCAGGCACCGACTTCACCCTGACTATCCGGCGCCTGGAACCCGAA GATTTCGCCGTGTATTACTGTCAACAGTACCACTCCTCGCCGTCCTGGACCTTTGGCCAAGGAACCA

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Es To ESFERA OST, BCMA EBB-C1978-D10 - nt 246 ATGGCCCTCCCTGTCACCEGCCCOTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAA CART completo GTGCAGCTCGTGGAAACTGGAGGTGGACTCGTGCAGCCTGGACGGTCGCTEGCGGCTGAGCTGCGC

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BCMA EBB-C1979-C12- aa 142 EVOLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFDDYAMHWVRQRPGKGLEWVASINWKGNSLAYGDSVKGR Domínio scFv FAISRDNAKNTVFLQMNSLRTEDTAVYYCASHQGVAYYNYAMDVWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSCGÇ

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GGGGSGGGGSCGGGGSEIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQRPGQAPRLLIYGAS SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSPSWTFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTI a ASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRP 3 VQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE Ss MGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR ? BCMA EBB- C1980-D2- nt 249 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCOTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAA CART completo GTGCAGCTGCTGGAGTCCGGCGGTGGATTGGTGCAACCGGGGGGATCGCTCAGACTGTCCTGTGC

GGCGTCAGGCTTCACCTTCTCGAGCTACGCCATGTCATGGGTCAGACAGGCCCCTGGAAAGGGTCT GGAATGGGTGTCCGCCATTTCCGGGAGCGGGGGATCTACATACTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCG CTTCACCATTTCCCGGGACAACTCCAAGAACACTCTCTATCTGCAAATGAACTCCCTCCGCGCTGAGG ACACTGCCGTGTACTACTGCGCCAAAATCCCTCAGACCGGCACCTTCGACTACTGGGGACAGGGGA CTCTGGTCACCGTCAGCAGCGGTGGCGGAGGTTCGGGGGGAGGAGGAAGCGGCGGCGGAGGGTC CGAGATTGTGCTGACCCAGTCACCCGGCACTTTGTCCCTGTCGCCTGGAGAAAGGGCCACCCTTTCC TGCCGGGCATCCCAATCCGTGTCCTCCTCGTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAGGCCCGGACAGGCC CCACGGCTTCTGATCTACGGAGCAAGCAGCCGCGCGACCGGTATCCCGGACCGGTTTTCGGGCTCGE GGCTCAGGAACTGACTTCACCCTCACCATCTCCCGCCTGGAACCCGAAGATTTCGCTGTGTATTACT GCCAGCACTACGGCAGCTCCCCGTCCTGGACGTTCGGCCAGGGAACTCGGCTGGAGATCAAGACCA CTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTC CGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGECCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATA TCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTEGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTITAC TGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTA CTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGEC GTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAA

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SSGGEGESCEGESCEGGESEIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSLSSNFLAWYQQKPGQAPGLLIYGA SNWATGTPDRFSGSGSGTDFTLTITRLEPEDFAVYYCQYYGTSPMYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFM RPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRD PEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP

PR BCMA EBB- C1978-D4- nt 251 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCOTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAA CART completo GTGCAGCTGCTCGAAACCGGTGGAGGGCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCCCTGAGGCTTTCATGCGC

CGCTAGCGGATTCTCCTTCTCCTCTTACGCCATGTCGTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGAAAAGGCCTG GAATGGGTGTCCGCGATTTCCGGGAGCGGAGGTTCGACCTATTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGC TTTACCATCTCCCGGGATAACTCCAAGAACACTCTGTACCTCCAAATGAACTCGCTGAGAGCCGAGG ACACCGCCGTGTATTACTGCGCGAAGGCGCTGGTCGGCGCGACTGGGGCATTCGACATCTGGGGAC

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TACTACTGCCAGTACTACGGCACCTCCCCCATGTACACATTCGGACAGGGTACCAAGGTCGAGATTA AGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATEGCCTCCCAGCCOTCTGTCCCO TGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCT GCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCAC TCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGC AGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAAC TGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACA ACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCA GAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGAT AAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGAC GGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTG

CCGCCTCGG BCMA EBB- C1980-A2- aa 147 EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF Domínio scFv TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLWFGEGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGCGGGSGGGGSDIVL

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E Ty ESPARTA BCMA EBB- C1980-A2- aa 231 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVOQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWYV CART completo SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLWFGEGFDPWGQGTLVTVSS

GGGGSCGGECSCGGGESDIVLTASPLSLPVYTPGEPASISCRSSOSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQOSPQLLIY LGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVDIKTTTPAPRPPTPA PTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPF MRPVQOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGR DPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR BCMA EBB- C1980-A2- nt 252 ATGGCCCTCCCTGTCACCEGCCCOTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAA CART completo GTGCAGCTGCTTGAGAGCGGTGGAGGTCTGGTGCAGCCCGGGGGATCACTGCGCCTGTCCTGTGC a

CGCEGTCCGGTTTCACTTTCTCCTCGTACGCCATGTCGTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGACT R GGAATGGGTGTCAGCCATTTCGGGTTCGGGGGGCAGCACCTACTACGCTGACTCCGTGAAGGGCCG Ss GTTCACCATTTCCCGCGACAACTCCAAGAACACCTTGTACCTCCAAATGAACTCCCTGCGGGCCGAA ?

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TGTACTACTGCATGCAGGCGCTCCAGACTCCCCTGACCTTCEGGAGGAGGAACGAAGGTCGACATCAA GACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCoGGCTCCTACCATEGCCTCCCAGCCOTCTGTCCCT

GCGTCCGEGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGETGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCOT GCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCAC TCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGC AGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAAC TGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACA ACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCA GAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGAT AAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGAC GGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTG

CCGCCTCGG BCMA EBB- C1981-C3- aa 148 QVQALVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF a Domínio scFv TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVGYDSSGYYRDYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSCGCGGÇE & SGGGGSEIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGTSSRATGISDRFS Ss GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGNSPPKFTFGPGTKLEIK ? BCMA EBB- C1981-C3- nt 169 CAAGTGCAGCTCGTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGGGGCTCCCTGAGACTTTCCTG Domínio scFv CGCGGCATCGGGTTTTACCTTCTCCTCCTATGCTATGTCCETGGGTEGCEGCCAGGCCCCGGGAAAGGG

ACTGGAATGGGTGTCCGCAATCAGCGGTAGCGGGGGCTCAACATACTACGCCGACTCCGTCAAGGG TCGCTTCACTATTTCCCGGGACAACTCCAAGAATACCCTGTACCTCCAAATGAACAGCCTCAGGGCC GAGGATACTGCCGTGTACTACTGCGCCAAAGTCGGATACGATAGCTCCGGTTACTACCGGGACTACT ACGGAATGGACGTGTGGGGACAGGGCACCACCGTGACCGTGTCAAGCGGCGGAGGCGGTTCAGGA GGGGGAGGCTCCEGCEGTEGAGGGTCCGAAATCGTCCTGACTCAGTCGCCTGGCACTCTGTCGTTG TCCCCGGGGGAGCGCGCTACCOTGTCGTEGTCGGGCGTCGCAGTCCGTGTCGAGCTCCTACCTCGC GTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCTAGACTTCTGATCTACGGCACTTCTTCACGCGCCAC CGGGATCAGCGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCTCCGGGACCGACTTCACCCTGACCATTAGCCGGCT GGAGCCTGAAGATTTCGCCGTGTATTACTGCCAACACTACGGAAACTCGCCGCCAAAGTTCACGTTC

GGACCCGGAACCAAGCTGGAAATCAAG BCMA EBB- C1981-C3- aa 190 QVQALVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF rs rm lo TSeNSemame META MONO Des rRmaMameaETAA BCMA EBB- C1981-C3- aa 211 EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGTSSRATGISDRFSGSGSGT ld PrusneEnmaTaEmeres — “SS BCMA EBB- C1981-C3- aa 232 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV CART completo SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVGYDSSGYYRDYYGMDVWG

QGTTVTIVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGOA PRLLIYGTSSRATGISDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGNSPPKFTFGPGTKLEIKTTTPAP a RPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLY| s FKQPFMRPVQOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLD Ss KRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL ?

HMQALPPR BCMA EBB- C1981-C3- nt 253 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCOTGCTGCTTCCEGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCAA CART completo GTGCAGCTCGTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGGGGCTCCCTGAGACTTTCCTGCGC

GGCATCGGGTTTTACCTTCTCCTCCTATGCTATGTCCTGGGTGCGCCAGGCCCCGGGAAAGGGACT GGAATGGGTGTCCGCAATCAGCGGTAGCGGGGGCTCAACATACTACGCCGACTCCGTCAAGGGTCG CTTCACTATTTCCCGGGACAACTCCAAGAATACCCTGTACCTCCAAATGAACAGCCTCAGGGCCGAG GATACTGCCGTGTACTACTGCGCCAAAGTCGGATACGATAGCTCCGGTTACTACCGGGACTACTACG GAATGGACGTGTGGGGACAGGGCACCACCGTGACCGTGTCAAGCGGCGGAGGCGGTTCAGGAGGG GGAGGCTCCGGCGGTGGAGGGTCCGAAATCGTCCTGACTCAGTCGCCTGGCACTCTGTCGTTGTCC CCGGGGGAGCGCGCTACCCTGTCGTETCGGGCGTCGCAGTCCGTGTCGAGCTCCTACCTCGCGTG GTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCTAGACTTCTGATCTACGGCACTTCTTCACGCGCCACOGG GATCAGCGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCTCCGGGACCGACTTCACCCTGACCATTAGCCGGCTGGA GCCTGAAGATTTCGCCGTGTATTACTGCCAACACTACGGAAACTCGCCGCCAAAGTTCACGTTCGGA CCCGGAACCAAGCTGGAAATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCO ATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCAT ACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCO TGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAG CAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAG

GAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAG CAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGAC a AAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCT 8 GTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGC 3 AGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGAC ?

GCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG BCMA EBB- C1978-G4- aa 149 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF Domínio scFv TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMGWSSGYLGAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSCGGESCSEG

GSEIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVASSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASGRATGIPDRFSGSGS

GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGGSPRLTFGGGTKVDIK BCMA EBB- C1978-G4- nt 170 GAAGTCCAACTGGTGGAGTCCGGGGGAGGGCTCETECAGCCCGGAGGCAGCCTTCGGCTGTCGTE Domínio scFv CGCCGCCTCCGGGTTCACGTTCTCATCCTACGCGATGTCGTGGGTCAGACAGGCACCAGGAAAGGG

ACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGCTCCGGCGGTAGCACCTACTATGCCGACTCAGTGAAGGG AAGGTTCACTATCTCCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTCCAAATGAACTCTCTGCGGGCC GAGGATACCGCGGTGTACTATTGCGCCAAGATGGGTTGGTCCAGCGGATACTTGGGAGCCTTCGAC ATTTGGGGACAGGGCACTACTGTGACCGTGTCCTCCGGGGGCTEGCEGATCGGGAGGCGGCGGCTC GGGTGGAGGGGGTTCCGAAATCGTGTTGACCCAGTCACCGGGAACCCTCTCGCTGTCCCCGGGAGA ACGGGCTACACTGTCATGTAGAGCGTCCCAGTCCGTGGCTTCCTCGTTCCTGGCCTGGTACCAGCAG AAGCCGGGACAGGCACCCCGCCTGCTCATCTACGGAGCCAGCGGCCGGGCGACCGGCATCCCTGA CCGCTTCTCEGGTTCCEGGCTCGGGCACCGACTTTACTCTGACCATTAGCAGGCTTGAGCCCGAGGAT TTTGCCGTGTACTACTGCCAACACTACGGGGGGAGCCCTCGCCTGACCTTCGGAGGCGGAACTAAG

GTCGATATCAAAA BCMA EBB- C1978-G4- aa 191 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF re TSSATameLMESTACNMONSSE SAMBAS BCMA EBB- C1978-G4- aa 212 EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVASSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASGRATGIPDRFSGSGSGT & o me La Poema naamtacma BCMA EBB- C1978-G4- aa 233 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV ? CART completo SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMGWSSGYLGAFDIWGQGTT

VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVASSFLAWYQQKPGQAPRLLI YGASGRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGGSPRLTFGGGTKVDIKTTTPAPRPPTP APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPF MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGR DPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR BCMA EBB- C1978-G4- nt 254 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCOTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAA Lenmvempms o | [STocueToTonoTcosoGooMoGCoTooTaMAGoosooMoGEAGcorTGDGEToTESTaSo |

CGCCTCCGGGTTCACGTTCTCATCCTACGCGATGTCGTGGGTCAGACAGGCACCAGGAAAGGGACT GGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGCTCEGGCGGTAGCACCTACTATGCCGACTCAGTGAAGGGAAG GTTCACTATCTCCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTCCAAATGAACTCTCTGCGGGCCGAG GATACCGCGGTGTACTATTGCGCCAAGATGGGTTGGTCCAGCGGATACTTGGGAGCCTTCGACATTT GGGGACAGGGCACTACTGTGACCGTGTCCTCCGGEGETEGCEGATCGGGAGECEGCEGCTCEGGE TGGAGGGGGTTCCGAAATCGTGTTGACCCAGTCACCGGGAACCCTCTCGCTGTCCCCGGGAGAACG GGCTACACTGTCATGTAGAGCGTCCCAGTCCGTGGCTTCCTCGTTCCTGECCTGGTACCAGCAGAAG CCGGEACAGGCACCCCGCCTGCTCATCETACGGAGCCAGCGECCGGECEACCGGCATCCCTGACCG CTTCTCCGEGTTCCEGGCTCGGGCACCGACTTTACTCTGACCATTAGCAGGCTTGAGCCCGAGGATTTT

GCCGTGTACTACTGCCAACACTACGGGGGGAGCCCTCGCCTGACCTTCEGGAGGCGGAACTAAGGTC GATATCAAAACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTC a TGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACT 8 TCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGT Ss GATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGC ?

CTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCT GCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGC TCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGG ACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAA AGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCC ACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGG

CCCTGCCECCTCEG Tabela 3. Sequências CAR BCMA exermplificativas adicionais

VH A7D12,2 QIQLVOSGPDLKKPGETVKLSCKASGYTFTNFGMNWVKQAPGKGFKWMAWINTYTGESYFADDFKGRF | 255 ja SYETSTATONMUTESTTTOAEEMENDSAERSTAAA VL A7D12,2 DVVMTQSHRFMSTSVGDRVSITCRASQDVNTAVSWYQQKPGQSPKLLIFSASYRYTGVPDRFTGSGSGA | 259 AC a ATD12,2 domínio scFv QIQLVOSGPDLKKPGETVKLSCKASGYTFTNFGMNWVKQAPGKGFKWMAWINTYTGESYFADDFKGRF | 263

AFSVETSATTAYLQINNLKTEDTATYFCARGEIYYGYDGGFAYWGQGTLVTVSAGGGGSCGGGGESCSEGÇS SDVVMTOSHRFMSTSVGDRVSITCRASQDVNTAVSWYQQKPGQSPKLLIFSASYRYTGVPDRFTGSGSG

ADFTLTISSVOQAEDLAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKLDIK ATD12,2 QIQLVOSGPDLKKPGETVKLSCKASGYTFTNFGMNWVKQAPGKGFKWMAWINTYTGESYFADDFKGRF | 267 CART completo AFSVETSATTAYLQINNLKTEDTATYFCARGEIYYGYDGGFAYWGQGTLVTVSAGGGGSCGGGGESCSEGÇS SDVVMTOSHRFMSTSVGDRVSITCRASQDVNTAVSWYQQKPGQSPKLLIFSASYRYTGVPDRFTGSGSG a ADFTLTISSVQOAEDLAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKLDIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAG 8 GAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKAQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPE Ss EEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY ?

NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR VH C11D5,3 QIQLVOSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAF | 256 ma STRSTOTaNIEoTAmTa araras VL C11D5,3 DIVLTASPASLAMSLGKRATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSG | 260 [Es C11D5,3 QIQLVOSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAF | 264 domínio scFv SLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSCECGESCGEGESAIALVA

SGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSA STAYLOQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS

C11D5,3 QIQALVASGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAF | 268 CART completo SLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSCECEGESCGEGESAIALVA

SGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSA STAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTAQEEDGCSCRF PEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEG

LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR VH C12A3,2 QIQALVASGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFA | 257 a PPETSASTAVNIOE TETE SDMEATNE VL C12A3,2 DIVLTAOSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSR | 261 [mma TER C12A3,2 domínio scFv QIQALVASGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFA | 265 8 FSVETSASTAYLVINNLKDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALTVSSGGGGSCSGGSCGGGGESDIVLTA Ss SPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVOTGVPARFSGSGSRTDFTL ?

TIDPVEEDDVAVYYCLOQSRTIPRTFGGGTKLEIK C12A3,2 CART completo | QIQLVOSGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFA | 269

FSVETSASTAYLVINNLKDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALTVSSGGGGSCSGGSCGGGGESDIVLTA SPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVOTGVPARFSGSGSRTDFTL TIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTR GLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGC ELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK

MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR gg EESTI VL C13F12,1 DIVLTAOSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSR | 262 [pers mmeser) I97TTEPVESDOVAIASTPFSSTE C13F12,1 domínio scFv QIQALVASGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTETGEPLYADDFKGRFA | 266

FSLETSASTAYLVINNLKNEDTATFFCSNDYLYSCDYWGQGTTLTVSSSGGGESCGSGESGGGESDIVLTA SPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVOTGVPARFSGSGSRTDFTL

TIDPVEEDDVAVYYCLOQSRTIPRTFGGGTKLEIK C13F12,1 QIQALVASGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTETGEPLYADDFKGRFA | 270 CART completo FSLETSASTAYLVINNLKNEDTATFFCSNDYLYSCDYWGQGTTLTVSSSGGGESCGSGESGGGESDIVLTA

SPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVOTGVPARFSGSGSRTDFTL TIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTR a

GLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGC S ELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK Ss MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR ?

Transfecção de RNA

[00237] São descritos no presente documento métodos para produ- zir um CAR de RNA transcrito in vitro. A presente invenção também inclui um construto de RNA codificando CAR que pode ser diretamente transfectado em uma célula. Um método para gerar mMRNA para uso em transfecção pode envolver transcrição in vitro (IVT) de um modelo com iniciadores especialmente planejados, seguido de adição de po- liA, para produzir um construto contendo sequências 3' e 5' não tradu- zidas ("UTR"), um "cap" 5' e/ou Sítio Interno de Entrada do Ribossomo (IRES), o ácido nucleico a ser expresso e uma cauda poliA, tipicamen- te com 50 a 2000 bases (SEQ ID NO: 276) de comprimento. O RNA produzido deste modo pode transfectar eficientemente diferentes tipos de células. Em um aspecto, o modelo inclui sequências para o CAR.

[00238] Em um aspecto, o CAR anti-BCMA é codificado por um RNA mensageiro (mMRNA). Em um aspecto, o mMRNA codificando o CAR anti-BCMA é introduzido em uma célula imunoefetora, por exem- plo, uma célula T ou uma célula NK, para produção de uma célula que expressa CAR (por exemplo, uma célula CART ou uma célula NK que expressa CAR).

[00239] Em uma modalidade, o RNA CAR transcrito in vitro pode ser introduzido em uma célula como uma forma de transfecção transi- ente. O RNA é produzido por transcrição in vitro usando um modelo gerado por reação em cadeia de polimerase (PCR). O DNA de interes- se de qualquer fonte pode ser diretamente convertido por PCR em um modelo para síntese de mRNA in vitro usando iniciadores apropriados e RNA polimerase. A fonte do DNA pode ser, por exemplo, DNA ge- nômico, DNA plasmídico, DNA fágico, cDNA, sequência de DNA sinté- tica ou qualquer outra fonte apropriada de DNA. O modelo desejado para a transcrição in vitro é um CAR da presente invenção. Por exem- plo, o modelo para o CAR de RNA compreende uma região extracelu-

lar que compreende um domínio variável de cadeia única de um anti- corpo antitumoral; uma região de dobradiça, um domínio transmem- branar (por exemplo, um domínio transmembranar de CD8a); e uma região citoplasmática que inclui um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, que compreende o domínio de sinalização de CD3-zeta e o domínio de sinalização de 4-1BB.

[00240] Em uma modalidade, o DNA a ser usado para PCR contém um quadro de leitura aberto. O DNA pode provir de uma sequência de DNA de ocorrência natural do genoma de um organismo. Em uma mo- dalidade, o ácido nucleico pode incluir algumas ou todas as regiões 5' e/ou 3' não traduzidas (UTRs). O ácido nucleico pode incluir éxons e íntrons. Em uma modalidade, o DNA a ser usado para PCR é uma se- quência de ácidos nucleicos humana. Em outra modalidade, o DNA a ser usado para PCR é uma sequência de ácidos nucleicos humana incluindo as 5' e 3! UTRs. O DNA pode alternativamente ser uma se- quência de DNA artificial que não é normalmente expressa em um or- ganismo de ocorrência natural. Uma sequência de DNA artificial exemplificativa é tal que contém porções de genes que são ligadas em conjunto para formar um quadro de leitura aberto que codifica uma proteína de fusão. As porções de DNA que são ligadas em conjunto podem provir de um único organismo ou de mais do que um organis- mo.

[00241] PCR é usada para gerar um modelo para transcrição in vi- tro de MRNA que é usado para transfecção. Métodos para realizar PCR são bem conhecidos na técnica. Iniciadores para uso em PCR são projetados de modo a terem regiões que são substancialmente complementares a regiões do DNA a ser usado como modelo para a PCR. "Substancialmente complementares", conforme usado no pre- sente documento, refere-se a sequências de nucleotídeos nas quais a maioria ou todas as bases da sequência iniciadora são complementa-

res, ou uma ou mais bases não são complementares ou emparelham de modo defeituoso. Sequências substancialmente complementares têm a capacidade para anelar ou hibridar com o alvo de DNA pretendi- do sob condições de anelamento usadas para PCR. Os iniciadores podem ser projetados de modo a serem substancialmente complemen- tares a qualquer porção do modelo de DNA. Por exemplo, os iniciado- res podem ser projetados para amplificarem a porção de um ácido nu- cleico que é normalmente transcrita em células (o quadro de leitura aberto), incluindo 5' e 3' UTRs. Os iniciadores também podem ser pro- jetados para amplificarem uma porção de um ácido nucleico que codi- fica um domínio de interesse particular. Em uma modalidade, os inici- adores são projetados para amplificarem a região codificadora de um cCDNA humano, incluindo a totalidade ou porções das 5' e 3' UTRs. Ini- ciadores úteis para PCR podem ser gerados por métodos sintéticos que são bem conhecidos na técnica. "Iniciadores diretos" são iniciado- res que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares aos nucleotídeos no modelo de DNA que estão a montante da sequência de DNA que deve ser amplificada. "A montan- te" é usado no presente documento para referência a uma localização 5' à sequência de DNA a ser amplificada relativamente à fita de codifi- cação. "Iniciadores reversos" são iniciadores que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares a um mo- delo de DNA de fita dupla que estão a jusante da sequência de DNA que deve ser amplificada. "A jusante" é usado no presente documento para referir uma localização 3' à sequência de DNA a ser amplificada relativamente à fita de codificação.

[00242] “Qualquer DNA polimerase útil para POR pode ser usada nos métodos descritos no presente documento. Os reagentes e poli- merase são disponibilizados comercialmente por algumas fontes.

[00243] Estruturas químicas com capacidade para promover a es-

tabilidade e/ou eficiência da tradução também podem ser usadas. O RNA tem preferencialmente 5' e 3! UTRs. Em uma modalidade, a 5' UTR tem entre um e 3000 nucleotídeos de comprimento. O compri- mento das sequências de 5' e 3' UTR a serem adicionadas à região codificadora pode ser alterado por diferentes métodos, incluindo, po- rém sem limitação, projetar iniciadores para POR que anelam a dife- rentes regiões das UTRs. Com o uso desta abordagem, a pessoa de habilidade comum na técnica pode modificar os comprimentos das 5' e 3' UTR requeridos para se obter uma eficiência ótima da tradução após transfecção do RNA transcrito.

[00244] As5'e3 UTRs podem ser as 5' e 3' UTRs endógenas de ocorrência natural para o ácido nucleico de interesse. Alternativamen- te, sequências UTR que não são endógenas ao ácido nucleico de inte- resse podem ser adicionadas por incorporação das sequências UTR nos iniciadores diretos e reversos ou por quaisquer outras modifica- ções do modelo. O uso de sequências UTR que não são endógenas ao ácido nucleico de interesse pode ser útil para modificar a estabili- dade e/ou eficiência da tradução do RNA. Por exemplo, sabe-se que elementos ricos em AU em sequências 3' UTR podem diminuir a esta- bilidade de mMRNA. Em consequência, 3' UTRs podem ser seleciona- das ou projetadas para aumentar a estabilidade do RNA transcrito com base em propriedades de UTRs que são bem conhecidas na técnica.

[00245] Em uma modalidade, a 5' UTR pode conter a sequência de Kozak do ácido nucleico endógeno. Alternativamente, quando uma 5' UTR que não é endógena ao ácido nucleico de interesse está sendo adicionada por PCR como descrito acima, uma sequência de consen- so de Kozak pode ser reprojetada adicionando-se a sequência de 5' UTR. Sequências de Kozak podem aumentar a eficiência da tradução de alguns transcritos de RNA, mas não parecem ser exigidas para to- dos os RNAs para permitir uma tradução eficiente. O requisito de se-

quências de Kozak para muitos mMRNAs é conhecido na técnica. Em outras modalidades, a 5' UTR pode ser SUTR de um vírus RNA cujo genoma de RNA é estável em células. Em outras modalidades, vários análogos de nucleotídeos podem ser usados na 3' ou 5' UTR para im- pedir a degradação do mRNA por exonucleases.

[00246] Para permitir a síntese de RNA a partir de um modelo de DNA sem a necessidade de clonagem de genes, um promotor da transcrição deve ser adicionado ao modelo de DNA a montante da se- quência a ser transcrita. Quando uma sequência que atua como um promotor para uma RNA polimerase é adicionada à extremidade 5' do iniciador direto, o promotor de RNA polimerase se torna incorporado ao produto de PCR a montante do quadro de leitura aberto que deve ser transcrito. Em uma modalidade preferencial, o promotor é um pro- motor de polimerase de T7, como descrito no presente documento noutro local. Outros promotores úteis incluem, porém sem limitação, promotores de RNA polimerase de T3 e SP6. Sequências de nucleotí- deos de consenso para promotores de T7, T3 e SP6 são conhecidas na técnica.

[00247] Em uma modalidade preferencial, o MRNA tem um cap na extremidade 5' e uma cauda 3' poli(A) que determinam a ligação de ribossomos, iniciação da tradução e estabilidade do mMRNA na célula. Em um modelo de DNA circular, por exemplo, DNA plasmídico, RNA polimerase origina um produto concatamérico longo que não é ade- quado para expressão em células eucarióticas. A transcrição de DNA plasmídico linearizado na extremidade da 3' UTR origina mRNA de tamanho normal que não é eficaz em transfecção eucariótica mesmo que seja poliadenilado após a transcrição.

[00248] Em um modelo de DNA linear, RNA polimerase do fago T7 pode prolongar a extremidade 3' do transcrito para além da última ba- se do modelo (Schenborn e Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6,223 a

6,236 (1985); Nacheva e Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1,485- 65 (2003)).

[00249] O método convencional de integração de extensões poliA/T em um modelo de DNA é clonagem molecular. No entanto, uma se- quência poliA/T integrada em DNA plasmídico pode causar instabilida- de do plasmídeo, motivo pelo qual modelos de DNA plasmídico obti- dos de células bacterianas são muitas vezes altamente contaminados com deleções e outras aberrações. Isso torna os procedimentos de clonagem não apenas trabalhosos e demorados, mas muitas vezes não confiáveis. É por isso que é altamente desejável um método que permita a construção de modelos de DNA com extensão 3' poliA/T sem clonagem.

[00250] — O segmento poliA/T do modelo de DNA de transcrição pode ser produzido durante PCR por uso de um iniciador reverso contendo uma cauda poliT, como cauda 100T (SEQ ID NO: 277) (o tamanho po- de ser 50 a 5,000 T (SEQ ID NO: 278)), ou após PCR por qualquer outro método, incluindo, porém sem limitação, ligação de DNA ou re- combinação in vitro. Caudas poli(A) também fornecem estabilidade a RNAs e reduzem a sua degradação. Geralmente, o comprimento de uma cauda poli(A) está positivamente correlacionado com a estabili- dade do RNA transcrito. Em uma modalidade, a cauda poli(A) tem en- tre 100 e 5000 adenosinas (SEQ ID NO: 279).

[00251] —“Caudas poli(A) de RNAs podem ser adicionalmente esten- didas após transcrição in vitro com o uso de uma poli(A) polimerase, tal como poliA polimerase de E. coli (E-PAP). Em uma modalidade, o aumento do comprimento de uma cauda poli(A) de 100 nucleotídeos para entre 300 e 400 nucleotídeos (SEQ ID NO: 280) resulta em um aumento de cerca de duas vezes da eficiência da tradução do RNA. Adicionalmente, a ligação de diferentes grupos químicos à extremida- de 3' pode aumentar a estabilidade do mMRNA. Tal ligação pode conter nucleotídeos modificados/artificiais, aptâmeros e outros compostos. Por exemplo, análogos de ATP podem ser incorporados na cauda po- Ili(A) usando poli(A) polimerase. Análogos de ATP podem aumentar adicionalmente a estabilidade do RNA.

[00252] Caps 5' também fornecem estabilidade a moléculas de RNA. Em uma modalidade preferencial, RNAs produzidos pelos méto- dos descritos no presente documento incluem um cap 5'. O cap 5' é fornecido com o uso de técnicas conhecidas na arte e descritas no presente documento (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436 a 444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1,468 a 1,495 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958 a 966 (2005)).

[00253] Os RNAs produzidos pelos métodos descritos no presente documento também podem conter uma sequência de sítio interno de entrada do ribossomo (IRES). A sequência IRES pode ser qualquer sequência viral, cromossômica ou artificialmente planejada que inicia ligação do ribossomo independente de cap a mRNA e facilita a inicia- ção da tradução. Podem ser incluídos quaisquer solutos adequados para a eletroporação de células, que podem conter fatores que facili- tam a permeabilidade e viabilidade celulares, tais como açúcares, pep- tídeos, lipídeos, proteínas, antioxidantes e surfactantes.

[00254] — RNA pode ser introduzido em células-alvo usando qualquer um dentre vários métodos diferentes, por exemplo, métodos comerci- almente disponíveis que incluem, porém sem limitação, eletroporação (Amaxa Nucleofector-ll (Amaxa Biosystems, Colônia, Alemanha)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) ou o Gene Pul- ser Il (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendort, Hamburgo, Alemanha), transfecção mediada por lipossomas catiônicos usando lipofecção, encapsulação de polímeros, transfecção mediada por pep- tídeos ou sistemas de administração biolística de partículas como "ar- mas de genes" (consultar, por exemplo, Nishikawa, et al. Hum Gene

Ther., 12(8):861-870 (2001). Métodos de administração não virais

[00255] Em alguns aspectos, métodos não virais podem ser usados para administrar um ácido nucleico que codifica um CAR descrito no presente documento em uma célula ou tecido ou um indivíduo.

[00256] Em algumas modalidades, o método não viral inclui o uso de um transpóson (também denominado elemento de transposição). Em algumas modalidades, um transpóson é um pedaço de DNA que pode se inserir em uma localização em um genoma, por exemplo, um pedaço de DNA que tem a capacidade para se autorreplicar e inserir a sua cópia em um genoma, ou um pedaço de DNA que pode ser remo- vido por splicing de um ácido nucleico mais longo e inserido em outro lugar em um genoma. Por exemplo, um transpóson compreende uma sequência de DNA constituída por repetições invertidas flanqueando genes para transposição.

[00257] Os métodos exemplificativos de administração de ácidos nucleicos com o uso de um transpóson incluem um sistema de trans- póson Bela Adormecida (SBTS) e um sistema de transpóson PiggyBac (PB). Ver, por exemplo, Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011): R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580 a 589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010): 1,200 a 1,209; Kebriaei et al. Blood. 122,21(2013):166; Williams. Mo- lecular Therapy 16,9(2008):1,515 a 1,516; Bell et al. Nat. Protoc. 2,12 (2007):3,153 a 3,165; e Ding et al. Cell. 122,3(2005):473 a 483, todos os quais estão incorporados no presente documento a título de refe- rência.

[00258] O SBTS inclui dois componentes: 1) um transpóson con- tendo um transgene e 2) uma fonte de enzima transposase. A transpo- sase pode efetuar transposição do transpóson de um plasmídeo car- reador (ou outro DNA doador) para um DNA-alvo, tal como cromosso-

mo/genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, a transposase se liga ao plasmídeo carreador/DNA doador, corta o transpóson (incluindo transgene(s)) removendo-o do plasmídeo, e insere-o no genoma da célula hospedeira. Ver, por exemplo, Aronovich et al. supra.

[00259] Os transpósons exemplificativos incluem um transpóson à base de pT2. Ver, por exemplo, Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41,3(2013):1829-47; e Singh et al. Cancer Res. 68,8(2008): 2,961 a 2,971, todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência. Transposases exemplificativas incluem uma transposa- se do tipo Tc1/mariner, por exemplo, a transposase SB10 ou a trans- posase SB11 (uma transposase hiperativa que pode ser expressa, por exemplo, a partir de um promotor de citomegalovírus). Ver, por exem- plo, Aronovich et al.; Kebriaei et al.; e Grabundzija et al., todos os quais são incorporados no presente documento por referência.

[00260] O uso do SBTS permite integração e expressão eficientes de um transgene, por exemplo, um ácido nucleico codificando um CAR descrito no presente documento. São proporcionados no presente do- cumento métodos de geração de uma célula, por exemplo, célula T ou célula NK, que expressa de modo estável um CAR descrito no presen- te documento, por exemplo, usando um sistema de transpóson tal co- mo SBTS.

[00261] De acordo com métodos descritos no presente documento, em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos, por exemplo, plasmídeos, contendo os componentes de SBTS são administrados a uma célula (por exemplo, célula T ou NK). Por exemplo, o(s) ácido(s) nucleico(s) é(são) administrado(s) por métodos padrão de administra- ção de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA plasmídico), por exemplo, métodos descritos no presente documento, por exemplo, eletropora- ção, transfecção ou lipofecção. Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico contém um transpóson compreendendo um transgene, por exemplo, um ácido nucleico codificando um CAR descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o ácido nucleico contém um transpóson compreendendo um transgene (por exemplo, um ácido nu- cleico codificando um CAR descrito no presente documento) bem co- mo uma sequência de ácido nucleico codificando uma enzima trans- posase. Em outras modalidades é proporcionado um sistema com dois ácidos nucleicos, por exemplo, um sistema plasmídico dual, por exem- plo, em que um primeiro plasmídeo contém um transpóson compreen- dendo um transgene, e um segundo plasmídeo contém uma sequência de ácido nucleico codificando uma enzima transposase. Por exemplo, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são coadministrados em uma célula hospedeira.

[00262] Em algumas modalidades, células, por exemplo, células T ou NK, são geradas que expressam um CAR descrito no presente do- cumento por uso de uma combinação de inserção de genes usando o SBTS e edição genética usando uma nuclease (por exemplo, nuclea- ses dedos de Zinco (ZFNs), Nucleases Efetoras do Tipo Ativador da Transcrição (TALENs), o sistema CRISPR/Cas ou endonucleases de endereçamento remanipuladas por meganuclease manipulada).

[00263] Em algumas modalidades, o uso de um método não viral de administração permite a reprogramação de células, por exemplo, célu- las T ou NK, e infusão direta das células em um indivíduo. As vanta- gens de vetores não virais incluem, porém sem limitação, facilidade e custo relativamente baixo da produção de quantidades suficientes exi- gidas para satisfazer uma população de pacientes, estabilidade duran- te a armazenagem e ausência de imunogenicidade. Construtos de Ácido Nucleico que Codificam um CAR

[00264] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam um ou mais construtos de CAR descritos no presente documento. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico é fornecida como um transcrito de RNA mensageiro. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico é fornecida como um construto de DNA.

[00265] —Consequentemente, em um aspecto, a invenção pertence a uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação a antígenos, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular que compreende um domínio estimulador, por exemplo, um domínio de sinalização coestimulador e/ou um domínio de sinalização primária, por exemplo, cadeia zeta.

[00266] As sequências de ácido nucleico codificando as moléculas desejadas podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhe- cidos na técnica, tais como, por exemplo, por rastreio de bibliotecas de células expressando o gene, por derivação do gene a partir de um ve- tor que é conhecido incluir o mesmo, ou por isolamento diretamente a partir de células e tecidos contendo o mesmo, usando técnicas co- muns. Alternativamente, o gene de interesse pode ser produzido de modo sintético, em vez de ser clonado.

[00267] A presente invenção também fornece vetores nos quais é inserido um DNA da presente invenção. Vetores derivados de retroví- rus, como o lentivírus, são ferramentas adequadas para alcançar transferência genética de longa duração uma vez que permitem uma integração estável de longa duração de um transgene e a sua propa- gação em células filhas. Os vetores lentivirais têm a vantagem adicio- nal em relação a vetores derivados de onco-retrovírus, tais como vírus de leucemia murina, de poderem transduzir células não proliferativas, tais como hepatócitos. Os mesmos também têm a vantagem adicional de possuírem baixa imunogenicidade. Um vetor retroviral pode tam- bém ser, por exemplo, um vetor gamarretroviral. Um vetor gamarretro- viral pode incluir, por exemplo, um promotor, um sinal de empacota- mento (yu), um local de ligação de iniciador (PBS), uma ou mais (por exemplo, duas) repetições terminais longas (LTR) e um transgene de interesse, por exemplo, um gene codificando um CAR. Um vetor ga- marretroviral pode não ter genes estruturas virais como gag, pol e env. Os vetores gamarretrovirais exemplificativos incluem Vírus da Leuce- mia Murina (MLV), Vírus de Formação com Foco no Baço (SFFV) e Vírus do Sarcoma Mieloproliferativo (MPSV) e vetores derivados dos mesmos. Outros vetores gamarretrovirais são descritos, por exemplo, em Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Techno- logy and Application" Viruses. Junho de 2011; 3(6): 677 a 713.

[00268] Em outra modalidade, o vetor compreendendo o ácido nu- cleico codificando o CAR desejado da invenção é um vetor adenoviral (A5/35). Em outra modalidade, a expressão de ácidos nucleicos codifi- cando CARs pode ser alcançada usando transpósons como sleeping beauty, CRISPR, CAS9 e nucleases de dedo de zinco. Consultar abai- xo June et al. 2009Nature Reviews Immunology 9,10: 704 a 716, que é incorporado ao presente documento a título de referência.

[00269] Em um breve sumário, a expressão de ácidos nucleicos na- turais ou sintéticos que codificam CARs é tipicamente alcançada |i- gando-se operativamente um ácido nucleico que codifica o polipeptí- deo CAR, ou suas porções, a um promotor e incorporando o construto em um vetor de expressão. Os vetores podem ser adequados para replicação e integração em eucariotas. Os vetores de clonagem típicos contêm terminadores da transcrição e tradução, sequências de inicia- ção e promotores úteis para regulação da expressão da sequência de ácidos nucleicos desejada.

[00270] Os construtos de expressão da presente invenção podem também ser usados para imunização de ácido nucleico e terapia gené- tica, usando protocolos padrão de transferência genética. Métodos de transferência genética são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. Nos. 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466, incor-

poradas por referência no presente documento na sua totalidade. Em outra modalidade, a invenção proporciona um vetor de terapia genéti- ca.

[00271] O ácido nucleico pode ser clonado em alguns tipos de veto- res. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser clonado em um vetor in- cluindo, mas não se limitando a, um plasmídeo, um fagemídeo, um derivado de fago, um vírus animal e um cosmídeo. Vetores de interes- se particular incluem vetores de expressão, vetores de replicação, ve- tores de geração de sondas e vetores de sequenciamento.

[00272] Além disso, o vetor de expressão pode ser fornecido a uma célula na forma de um vetor viral. A tecnologia de vetores virais é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 a 4, Cold Spring Harbor Press, NY), e em outros manuais de virolo- gia e biologia molecular. Vírus úteis como vetores incluem, mas não se limitam a, retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus herpes e lentivírus. Em geral, um vetor adequado contém uma origem de re- plicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência pro- motora, locais de endonuclease de restrição conveniente e um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; e Pat. U.S. No. 6,326,193).

[00273] Alguns sistemas de base viral foram desenvolvidos para transferência genética em células de mamífero. Por exemplo, retroví- rus fornecem uma plataforma conveniente para sistemas de transfe- rência genética. Um gene selecionado pode ser inserido em um vetor e encapsulado em partículas retrovirais com o uso de técnicas conhe- cidas na técnica. O vírus recombinante pode então ser isolado e admi- nistrado em células do indivíduo in vivo ou ex vivo. Alguns sistemas retrovirais são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, veto- res de adenovírus são usados. Alguns vetores de adenovírus são co-

nhecidos na técnica. Em uma modalidade, vetores de lentivírus são usados.

[00274] Elementos promotores adicionais, por exemplo, intensifica- dores, regulam a frequência da iniciação da transcrição. Tipicamente, estes estão localizados na região 30 a 110 pb a montante do sítio de início, apesar de ter sido mostrado que alguns promotores também contêm elementos funcionais a jusante do sítio de início. O espaça- mento entre elementos promotores é frequentemente flexível, de modo que a função promotora seja conservada quando elementos são inver- tidos ou deslocados uns em relação aos outros. No promotor de timidi- na quinase (tk), o espaçamento entre elementos promotores pode ser aumentado até um afastamento de 50 pb antes de a atividade come- çar a declinar. Dependendo do promotor, aparentemente elementos individuais podem atuar cooperativa ou independentemente para ativar a transcrição.

[00275] Um exemplo de um promotor capaz de expressar um trans- gene de CAR em uma célula T de mamífero é o promotor de EF1a. O promotor EFi1a nativo conduz a expressão da subunidade alfa do complexo do fator de alongamento-1, que é responsável pela adminis- tração enzimática de aminoacil-RNAs no ribossomo. O promotor EF1a foi amplamente usado em plasmídeos de expressão de mamíferos e demonstrou-se que é eficaz para dirigir a expressão de CAR a partir de transgenes clonados em um vetor lentiviral. Consultar, por exemplo, Milone et a/., Mol. Ther. 17(8): 1,453 a 1,464 (2009).

[00276] Outro exemplo de um promotor é a sequência promotora inicial imediata de citomegalovírus (CMV). Esta sequência promotora é uma sequência promotora constitutiva forte com a capacidade para acionar níveis elevados de expressão de qualquer sequência polinu- cleotídica operativamente ligada à mesma. No entanto, outras sequên- cias de promotores constitutivos também podem ser usadas, incluindo,

mas não se limitando ao, promotor inicial do vírus símio 40 (SVA40), vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor de repeti- ções terminais longas (LTR) do vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor de MoMuLV, um promotor do vírus da leucemia aviá- ria, um promotor inicial imediato do vírus Epstein-Barr, um promotor do vírus do sarcoma de Rous, bem como promotores de genes humanos tais como, mas não se limitando a, o promotor da actina, o promotor de miosina, o promotor do fator de alongamento-1a, o promotor de hemoglobina e o promotor de creatina quinase. Além disso, a invenção não deve ser limitada ao uso de promotores constitutivos. Promotores induzíveis também são contemplados como parte da invenção. O uso de um promotor induzível fornece um interruptor molecular com capa- cidade para ativar a expressão da sequência polinucleotídica, que é operacionalmente ligada quando tal expressão é desejada, ou para desativar a expressão, quando a expressão não é desejada. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não se limitam a, um promotor de metalotioneína, um promotor de glicocorticoides, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina.

[00277] — Outro exemplo de um promotor é o promotor de fosfoglice- rato cinase (PGK). Em modalidades, pode ser desejado um promotor de PGK truncado (por exemplo, um promotor de PGK com uma ou mais, por exemplo, 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300 ou 400 eliminações de nucleotídeo quando comparado com a sequência promotora de PGK de tipo selvagem). As sequências de nucleotídeos de promotores de PGK exemplificativos são fornecidas abaixo. Promotor de PGK TS

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGG CTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCC GTCCTTGTCCCGGGTEGTGATGGCGGGGTETEGGGCGGAGGGCGÇ TGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTC GTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGT AACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCA

CGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCT TGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGOGGCCCcceo6s

GGTGTTCCCATCEGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTG CACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGG CCTTGGTGCGGGTCTCEGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCG

ACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT (SEQ ID NO: 281) Promotores de PGK truncados exemplificativos: PGK100:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGG CTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCC

GTCCTTGTCCCGGGTEGTGATGGCGGGGTGE (SEQ ID NO: 282) PGK200:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGG CTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCC GTCCTTGTCCCGGGTEGTGATGGCGGGGTETEGGGCGGAGGGCGÇ TGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTC GTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGT

AACG (SEQ ID NO: 283) PGK300:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGG CTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCC GTCCTTGTCCCGGGTEGTGATGGCGGGGTETEGGGCGGAGGGCGÇ TGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTC GTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGT AACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCA CGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCT

TGGAAGGGCTGAATCCCCG (SEQ ID NO: 284) PGK400:

GGTGTTCCCATCEGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTG

CACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG (SEQ ID NO: 285)

[00278] Um vetor também pode incluir, por exemplo, uma sequên- cia sinal para facilitar a secreção, um sinal de poliadenilação e termi- nador da transcrição (por exemplo, do gene do Hormônio de Cresci- mento Bovino (BGH)), um elemento permitindo replicação epissômica e replicação em procariotas (por exemplo, origem do SV40 e ColE1 ou outros conhecidos na técnica) e/ou elementos para permitir a seleção (por exemplo, gene de resistência à ampicilina e/ou marcador de zeo- cina).

[00279] Para avaliar a expressão de um polipeptídeo CAR ou suas porções, o vetor de expressão a ser introduzido em uma célula tam- bém pode conter um gene marcador selecionável ou um gene repórter ou ambos para facilitar a identificação e seleção de células de expres- são a partir da população de células que se pretende transfectar ou infectar através de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador se- lecionável pode estar contido em uma porção separada de DNA e ser usado em um procedimento de cotransfecção. Marcadores selecioná- veis e genes repórter podem ser flanqueados com sequências regula- doras apropriadas para permitir a expressão nas células hospedeiras. Marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes de resis- tência a antibióticos, tais como neo e similares.

[00280] Genes repórter são usados para identificar células potenci- almente transfectadas e para avaliar a funcionalidade de sequências reguladoras. Em geral, um gene repórter é um gene que não está pre- sente no nem é expresso pelo organismo ou tecido recebedor e que codifica um polipeptídeo cuja expressão é manifestada por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A expressão do gene repórter é avaliada em um momento adequado depois de o DNA ter sido introduzido nas células recebedoras. Genes repórter adequados podem incluir genes codificando luciferase, beta- galactosidase, cloranfenicol acetil-transferase, fosfatase alcalina secre- tada ou o gene da proteína verde fluorescente (por exemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79 a 82). Sistemas de expressão adequa- dos são bem conhecidos e podem ser preparados usando técnicas conhecidas ou obtidos comercialmente. Em geral, o construto com a região flanqueadora 5' mínima exibindo o nível mais elevado de ex- pressão do gene repórter é identificado como o promotor. Tais regiões promotoras podem ser ligadas a um gene repórter e usadas para ava- liar agentes quanto à capacidade de modular a transcrição conduzida por promotores.

[00281] Em uma modalidade, o vetor pode ainda compreender um ácido nucleico codificando um segundo CAR. Em uma modalidade, o segundo CAR inclui um domínio de ligação a antígeno para um alvo expresso em células de leucemia mieloide aguda, como, por exemplo, CD123, CD34, CLL-1, receptor beta de folato ou FLT3; ou um alvo ex- presso em uma célula B, por exemplo, CD10, CD19, CD20, CD22,

CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b ou CD79a.

Em uma modalidade, o vetor compreende uma sequência de ácidos nucleicos codificando um primeiro CAR que se liga especificamente a um primei- ro antígeno e inclui um domínio de sinalização intracelular tendo um domínio de sinalização coestimulador, mas não um domínio de sinali- zação primário, e um ácido nucleico codificando um segundo CAR que se liga especificamente a um segundo antígeno diferente e inclui um domínio de sinalização intracelular tendo um domínio de sinalização primário, mas não um domínio de sinalização coestimulador.

Em uma modalidade, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um primeiro CAR de BCMA que inclui um domínio de ligação de BCMA, um domínio transmembranar e um domínio coestimulador e um ácido nucleico que codifica um segundo CAR que visa um antígeno que não BCMA (por exemplo, um antígeno expresso em células AML, por exemplo, CD123, CD34, CLL-1, receptor beta de folato ou FLT3; ou um antígeno expresso em uma célula B, por exemplo, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b ou CD79a) e inclui um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização primário.

Em outra mo- dalidade, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um pri- meiro CAR de BCMA que inclui um domínio de ligação de BCMA, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização primária e um ácido nucleico que codifica um segundo CAR que se liga especifica- mente a um antígeno que não BCMA (por exemplo, um antígeno ex- presso em células AML, por exemplo, CD123, CD34, CLL-1, receptor beta de folato ou FLT3; ou um antígeno expresso em uma célula B, por exemplo, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b ou CD79a) e inclui um domínio de ligação ao antíge- no para o antígeno, um domínio transmembranar e um domínio de si- nalização coestimulador.

[00282] Em uma modalidade, o vetor compreende um ácido nuclei- co que codifica um CAR de BCMA descrito no presente documento e um ácido nucleico que codifica um CAR inibidor. Em uma modalidade, o CAR inibidor compreende um domínio de ligação a antígenos que liga um antígeno encontrado em células normais, mas não células cancerígenas, por exemplo, células normais que também expressam BCMA. Em uma modalidade, o CAR inibidor compreende o domínio de ligação a antígenos, um domínio transmembrana e um domínio intra- celular de uma molécula inibidora. Por exemplo, o domínio intracelular do CAR inibidor pode ser um domínio intracelular de PD1, PD-L1, PD- L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (e.g., CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEA- CAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CDB80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1I), HVEM (TNFRSF14 ou CD270), KIR, A2aR MHC de classe |, MHC de classe Il, GAL9, adeno- sina e TGFR beta.

[00283] Nas modalidades, o vetor pode compreender duas ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam um CAR, por exemplo, um CAR de BCMA descrito no presente documento e um segundo CAR, por exemplo, um CAR inibitório ou um CAR que se liga especifi- camente a um antígeno, que não BCMA (por exemplo, um antígeno expresso em células de AML, por exemplo, CD123, CLL-1, CD34, FLT3 ou receptor beta folato; ou células B de expressão de antígenos, por exemplo, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b ou CD79a). Em tais modalidades, as duas ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam o CAR são codificadas por uma única molécula de ácido nucleico na mesma estrutura e como uma única cadeia de polipeptídeo. Neste aspecto, os dois ou mais CARs podem, por exemplo, estar separados por um ou mais sítios de clivagem de peptídeos (por exemplo, um sítio de autoclivagem ou um substrato para uma protease intracelular). Exemplos de sítios de cliva-

gem de peptídeos incluem os seguintes, nos quais os resíduos GSG são opcionais: T2A: (GSGJEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQID NO: 286) P2A: (GSGJATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 287) E2A: (GSG)JQCTNYALLKLAGDVESNP6GP(SEQID NO: 288) F2A: (GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQID NO: 289)

[00284] Os métodos de introdução e expressão de genes em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expres- são, o vetor pode ser prontamente introduzido em uma célula hospe- deira, por exemplo, célula de mamífero, bacteriana, levedura ou inseto por qualquer método da técnica. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por meios físicos, químicos ou biológicos.

[00285] Métodos físicos para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem precipitação com fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeamento de partículas, microinjeção, eletropora- ção e similares. Métodos para produzir células que compreende veto- res e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLO- NING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY). Um método preferencial para a introdução de um polinu- cleotídeo em uma célula hospedeira é transfecção com fosfato de cál- cio.

[00286] “Métodos biológicos para introduzir um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Vetores virais, e especialmente vetores retrovirais, se tornaram no método mais amplamente usado para inserir genes em células de mamífero, por exemplo, humanas. Outros vetores virais podem ser de- rivados de lentivírus, poxvírus, vírus herpes simplex |, adenovírus e vírus adenoassociados e similares. Consultar, por exemplo, as Paten- tes nºº U.S. 5,350,674 e 5,585,362.

[00287] Meios químicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, tais como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, esférulas e sistemas à base de lipídeos incluindo emulsões óleo-em-água, micé- lios, micélios mistos e lipossomos. Um sistema coloidal exemplificativo para uso como um veículo de administração in vitro e in vivo é um li- possoma (por exemplo, uma vesícula membranar artificial). Outros mé- todos de administração alvejada de ácidos nucleicos comuns na técni- ca estão disponíveis, tais como administração de polinucleotídeos com nanopartículas direcionadas ou outro sistema de administração ade- quado à escala de submícrones.

[00288] No caso de ser utilizado um sistema de administração não viral, um veículo de administração exemplificativo é um lipossomo. O uso de formulações lipídicas é contemplado para a introdução dos áci- dos nucleicos em uma célula hospedeira (in vitro, ex vivo ou in vivo). Em outro aspecto, o ácido nucleico pode ser associado a um lipídeo. O ácido nucleico associado a um lipídeo pode ser encapsulado no interi- or aquoso de um lipossomo, intercalado na bicamada lipídica de um lipossomo, ligado a um lipossomo via uma molécula de ligação que está associada ao lipossomo e ao oligonucleotídeo, encerrado em um lipossomo, complexado com um lipossomo, disperso em uma solução contendo um lipídeo, misturado com um lipídeo, combinado com um lipídeo, contido como uma suspensão em um lipídeo, contido ou com- plexado com um micélio ou associado de qualquer outro modo a um lipídeo. Composições associadas a lipídeos, lipídeo/DNA ou lipí- deo/vetor de expressão não se limitam a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo, podem estar presentes em uma estrutura de bicamada, como micélios ou com uma estrutura "colapsada". Também podem ser simplesmente intercaladas em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes no tamanho ou forma.

Lipídeos são substâncias graxas que podem ser lipídeos de ocorrência natural ou sintéticos. Por exemplo, lipídeos incluem as gotículas gra- xas que ocorrem naturalmente no citoplasma bem como a classe de compostos que contêm hidrocarbonatos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, tais como ácidos graxos, álcoois, aminas, aminoálco- ois e aldeídos.

[00289] —Lipídeos adequados para uso podem ser obtidos a partir de fontes comerciais. Por exemplo, dimiristil-fosfatidilcolina ("DMPC") po- de ser obtida junto à Sigma, St. Louis, MO; fosfato de dicetila ("DCP") pode ser obtido junto à K & K Laboratories (Plainview, NY); colesterol ("Choi") pode ser obtido junto à Calbiochem-Behring; dimiristil- fosfatidilglicerol ("DMPG") e outros lipídeos podem ser obtidos junto à Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Soluções de estoque de lipídeos em clorofórmio ou clorofórmio/metanol podem ser armazena- das a cerca de -20 ºC. Clorofórmio é usado como o único solvente uma vez que é mais prontamente evaporado do que metanol. "Lipos- somo" é um termo genérico que abrange uma variedade de veículos lipídicos uni e multilamelares formados pela geração de bicamadas ou agregados lipídicos encerrados. Os lipossomos podem ser caracíteri- zados como tendo estruturas vesiculares com uma membrana de bi- camada fosfolipídica e um meio aquoso interno. Lipossomos multila- melares têm múltiplas camadas lipídicas separadas por meio aquoso. Os mesmos se formam espontaneamente quando fosfolipídeos são suspensos em um excesso de solução aquosa. Os componentes lipí- dicos sofrem autorrearranjo antes da formação de estruturas fechadas e encerram água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipídicas (Ghosh et a/., 1991 Glycobiology 5: 505 a 510). No entanto, composi- ções que têm diferentes estruturas em solução relativamente à estrutu- ra vesicular normal também estão abrangidas. Por exemplo, os lipí- deos podem assumir uma estrutura micelar ou existir meramente como agregados não uniformes de moléculas lipídicas. Também são con- templados complexos lipofectamina-ácido nucleico.

[00290] — Independentemente do método usado para introduzir áci- dos nucleicos exógenos em uma célula hospedeira ou expor de qual- quer outro modo uma célula ao inibidor da presente invenção, para confirmar a presença da sequência DNA recombinante na célula hos- pedeira, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de "biologia molecular" bem conhecidos dos peritos na técnica, tais como transferência Southern e Northern, RT-PCR e PCR; ensaios "bioquímicos", tais como detecção da pre- sença ou ausência de um peptídeo particular, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e transferências Western) ou por ensaios des- critos no presente documento para identificar agentes que caem no escopo da invenção.

[00291] A presente invenção proporciona ainda um vetor compre- endendo uma molécula de ácido nucleico codificando CAR. Em um aspecto, um vetor de CAR pode ser diretamente transduzido para uma célula, por exemplo, uma célula T ou célula NK. Em um aspecto, o ve- tor é um vetor de clonagem ou de expressão, por exemplo, um vetor incluindo, mas não se limitando a, um ou mais plasmídeos (por exem- plo, plasmídeos de expressão, vetores de clonagem, minicírculos, mi- nivetores, cromossomos "double minute"), construtos de vetor retrovi- ral e lentiviral. Em um aspecto, o vetor é capaz de expressar o constru- to de CAR em células T ou células NK de mamíferos. Em um aspecto, a célula T de mamífero é uma célula T humana. Em um aspeto, a célu- la NK de mamífero é uma célula NK humana. Fontes de células

[00292] Antes da expansão e modificação genética, uma fonte de células, por exemplo, células imunoefetoras (por exemplo, células T ou células NK), é obtida de um indivíduo. É pretendido que o termo "indi-

víduo" inclua organismos vivos nos quais pode ser induzida uma res- posta imune (por exemplo, mamíferos). Exemplos de sujeitos incluem humanos, cães, gatos, camundongos, ratos e suas espécies transgê- nicas. As células T podem ser obtidas dentre várias fontes, incluindo células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido de linfonodos, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um sítio de infecção, ascites, efusão pleural, tecido do baço e tumores.

[00293] Em determinados aspectos da presente descrição pode ser usado qualquer número de linhagens de células imunoefetoras (por exemplo, célula T ou célula NK) disponíveis na técnica. Em certos as- pectos da presente invenção, células T podem ser obtidas de uma unidade de sangue recolhido de um indivíduo usando quaisquer técni- cas conhecidas do perito, tais como separação com Ficoll"“. Em um aspecto preferencial, células do sangue em circulação de um indivíduo são obtidas por aférese. O produto de aférese contém tipicamente lin- fócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e plaquetas. Em um aspecto, as células recolhidas por aférese podem ser lavadas para remover a fração do plasma e para colocar as células em um tampão ou meio apropriado para passos de processamento subsequentes. Em um aspecto da invenção, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em um aspecto alternativo, a solução de lavagem está desprovida de cálcio e pode estar desprovida de magnésio ou pode estar desprovida de muitos se não de todos os cá- tions divalentes.

[00294] As etapas de ativação inicial na ausência de cálcio podem levar a uma ativação amplificada. Como será prontamente apreciado pelos peritos na técnica, uma etapa de lavagem pode ser efetuada por métodos conhecidos dos peritos na técnica, tais como por uso de um centrifugador de "fluxo contínuo" semiautomatizado (por exemplo, o processador de células Cobe 2991, o Baxter CytoMate ou o Haemone- tics Cell Saver 5) de acordo com as instruções do fabricante. Após a lavagem, as células podem ser ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis, tais como, por exemplo, PBS sem Ca, sem Mg, PlasmaLyte A, ou outra solução salina com ou sem tampão. Alter- nativamente, os componentes indesejáveis da amostra da aférese po- dem ser removidos e as células podem ser diretamente ressuspensas em meio de cultura.

[00295] — É reconhecido que os métodos do pedido podem empregar condições de meio de cultura compreendendo 5% ou menos, por exemplo, 2%, de soro AB humano, e empregar condições e composi- ções do meio de cultura conhecidas, por exemplo, as descritas em Smith et al/., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive imu- notherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Repla- cement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi: 10,1038/cti.2014,31.

[00296] Em um aspecto, células T são isoladas de linfócitos do sangue periférico por lise dos eritrócitos e depleção dos monócitos, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente de PERCOLLTM ou por elutriação centrífuga contracorrente. Uma subpopulação espe- cífica de células T, como células T CD3+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e/ou CD45RO+, pode ser adicionalmente isolada por técnicas de sele- ção positiva ou negativa. Por exemplo, em um aspecto, células T são isoladas por incubação com esférulas conjugadas a anti-CD3/anti- CD28 (por exemplo, 3x28), tais como T CD3/CD28 DYNABEADSO M- 450, durante um período de tempo suficiente para a seleção positiva das células T desejadas. Em um aspecto, o período de tempo é cerca de 30 minutos. Em um aspecto adicional, o período de tempo varia desde 30 minutos até 36 horas ou mais e todos os valores inteiros en- tre aqueles. Em um aspecto adicional, o período de tempo é pelo me-

nos de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas. Ainda em outro aspecto preferencial, o período de tempo é 10 até 24 horas. Em um aspecto, o período de tempo de incubação é 24 horas. Tempos de incubação mais longos podem ser usados para isolar células T em qualquer situação em que haja poucas células T em comparação com outros tipos de células, tais como no isolamento de linfócitos infiltrantes em tumores (TIL) de tecido tumoral ou de indivíduos imunocomprometidos. Além disso, o uso de tempos de incubação mais longos pode aumentar a eficiência da captura de células T CD8+. Assim, simplesmente encurtando ou prolongando o tempo, células T são deixadas se ligar às microesferas CD3/CD28 e/ou aumentando ou decrescendo a razão entre microesfe- ras e células T (como adicionalmente descrito no presente documen- to), subpopulações de células T podem ser preferencialmente selecio- nadas positiva ou negativamente na iniciação da cultura ou em outros momentos durante o processo. Adicionalmente, aumentando ou de- crescendo a razão de anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28 nas micro- esferas ou outra superfície, subpopulações de células T podem ser preferencialmente selecionadas positiva ou negativamente na iniciação da cultura ou em outros momentos desejados. O perito reconhecerá que múltiplas rondas de seleção também podem ser usadas no con- texto desta invenção. Em certos aspectos, pode ser desejável conduzir o procedimento de seleção e usar as células "não selecionadas" no processo de ativação e expansão. Células "não selecionadas" também podem ser sujeitas a rondas adicionais de seleção.

[00297] O enriquecimento de uma população de células T por sele- ção negativa pode ser alcançado com uma combinação de anticorpos dirigidos para marcadores de superfície únicos às células negativa- mente selecionadas. Um método consiste em triagem e/ou seleção de células via imunoaderência magnética negativa ou citometria de fluxo que usa um coquetel de anticorpos monoclonais dirigidos para marca-

dores da superfície celular presentes nas células negativamente sele- cionadas. Por exemplo, para enriquecimento quanto a células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais tipica- mente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CDB8. Em certos aspectos, pode ser desejável enriquecer ou selecionar positivamente quanto a células T reguladoras que tipicamente expres- sam CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ e FoxP3+. Em determinados as- pectos, pode ser desejável enriquecer as células que têm CD127baixo. Alternativamente, em certos aspectos, células T reguladoras são de- pletadas por esférulas conjugadas a anti-C25 ou outro método de se- leção similar.

[00298] Os métodos descritos no presente documento podem inclu- ir, por exemplo, seleção de uma subpopulação específica de células imunoefetoras, por exemplo, células T, que são uma população deple- tada de células T reguladoras, células depletadas de CD25+, usando, por exemplo, uma técnica de seleção negativa, por exemplo, descrita no presente documento. Preferencialmente, a população de células depletadas de T reguladoras contém menos de 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% de células CD25+.

[00299] Em uma modalidade, células reguladoras T, por exemplo, células T CD25+, são removidas da população usando um anticorpo anti-CD25, ou seu fragmento, ou um ligando de ligação de CD25, IL-2. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD25, ou um seu fragmento, ou ligando de ligação de CD25 é conjugado com um substrato, por exem- plo, uma esfera, ou é de outra forma revestido em um substrato, por exemplo, uma esfera. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD25, ou seu fragmento, é conjugado com um substrato como descrito neste documento.

[00300] Em uma modalidade, as células reguladoras T, por exem- plo, células T CD25+, são removidas da população usando reagente de depleção de CD25 da Miltenyi"". Em uma modalidade, a razão en- tre as células e o reagente de depleção de CD25 é 1e7 células para 20 ul, ou 1e7 células para 15 ul, ou 1e7 células para 10 ul, ou 1e7 células para 5 ul, ou 1e7 células para 2,5 ul ou 1e7 células para 1,25 ul. Em uma modalidade, por exemplo, para depleção de células T regulado- ras, por exemplo, CD25+, mais de 500 milhões de células/ml são usa- dos. Em um aspecto adicional, uma concentração de células de 600, 700, 800 ou 900 milhões de células/ml é usada.

[00301] Em uma modalidade, a população de células imunoefeto- ras a ser depletada inclui cerca de 6 x 10º células T CD25+. Em outros aspectos, a população de células imunoefetoras a ser depletada inclui cerca de 1 x 10º a 1 x 10º células T CD25+ e qualquer valor inteiro intermédio. Em uma modalidade, a população resultante depletada de células T reguladoras tem 2 x 10º células T reguladoras, por exemplo, células CD25+, ou menos (por exemplo, 1 x 10º, 5 x 108, 1 x 108, 5 x 107, 1 x 107 ou menos células CD25+).

[00302] Em uma modalidade, as células T reguladoras, por exem- plo, células CD25+, são removidas da população com o uso do siste- ma CIiniMAC com um conjunto de tubagem de depleção, como, por exemplo, tubagem 162-01. Em uma modalidade, o sistema CIiniMAC é operado em um ambiente de depleção como, por exemplo, DEPLE- TION2, 1.

[00303] Sem pretender ficar restringido por uma teoria particular, o decréscimo do nível de reguladores negativos de células imunes (por exemplo, decréscimo do número de células imunes indesejadas, por exemplo, células Tree) em um indivíduo antes da aférese ou durante a fabricação de um produto de células expressando CAR pode reduzir o risco de recidiva do indivíduo. Por exemplo, métodos de depleção de células Tree são conhecidos na técnica. Métodos de decréscimo de células Trec incluem, mas não se limitam a, ciclofosfamida, anticorpo anti-GITR (um anticorpo anti-GITR descrito no presente documento), depleção de CD25 e suas combinações.

[00304] Em algumas modalidades, os métodos de fabricação com- preendem redução do número (por exemplo, depleção) de células Tree antes da fabricação da célula expressando CAR. Por exemplo, méto- dos de fabricação compreendem contatar a amostra, por exemplo, a amostra da aférese, com um anticorpo anti-GITR e/ou um anticorpo anti-CD25 (ou seu fragmento ou um ligante de ligação a CD25), por exemplo, para depletar células Tregc antes da fabricação do produto de célula expressando CAR (por exemplo, célula T, célula NK).

[00305] Em uma modalidade, um indivíduo é pré-tratado com uma ou mais terapias que reduzem células Trec antes da recolha de células para fabrico de produto de célula expressando CAR, reduzindo assim oO risco de recaída do indivíduo no tratamento com células expressan- do CAR. Em uma modalidade, os métodos de decréscimo de células Trec incluem, porém sem limitação, administração ao indivíduo de um ou mais dentre ciclofosfamida, anticorpo anti-GITR, depleção de CD25 ou uma combinação dos mesmos. A administração de um ou mais dentre ciclofosfamida, anticorpo anti-GITR, depleção de CD25 ou uma combinação dos mesmos pode ocorrer antes, durante ou após uma infusão do produto de célula que expressa CAR.

[00306] Em uma modalidade, um indivíduo é pré-tratado com ciclo- fosfamida antes da recolha de células para a fabricação do produto de células expressando CAR, desse modo reduzindo o risco de recidiva do indivíduo ao tratamento com células expressando CAR. Em uma modalidade, um indivíduo é pré-tratado com um anticorpo anti-GITR antes da recolha de células para a fabricação do produto de células expressando CAR, desse modo reduzindo o risco de recidiva do indi- víduo ao tratamento com células expressando CAR.

[00307] Em uma modalidade, a população de células a ser removi-

da não consiste nas células T reguladoras nem em células tumorais, mas nas células que afetam negativamente de qualquer outro modo a expansão e/ou função das células CART, por exemplo, células que expressam CD14, CD11b, CD33, CD15 ou outros marcadores expres- sos por células potencialmente imunossupressoras. Em uma modali- dade, é contemplado que tais células sejam removidas concomitante- mente com células T reguladoras e/ou células tumorais, ou após a da- da depleção, ou em outra ordem.

[00308] Os métodos descritos no presente documento podem incluir mais do que um passo de seleção, por exemplo, mais do que um pas- so de depleção. O enriquecimento de uma população de células T por seleção negativa pode ser alcançado, por exemplo, com uma combi- nação de anticorpos dirigidos para marcadores de superfície únicos às células negativamente selecionadas. Um método consiste em triagem e/ou seleção de células via imunoaderência magnética negativa ou citometria de fluxo que usa um coquetel de anticorpos monoclonais dirigidos para marcadores da superfície celular presentes nas células negativamente selecionadas. Por exemplo, para enriquecimento quan- to a células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais pode incluir anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8.

[00309] Os métodos descritos no presente documento podem adici- onalmente incluir remover células da população que expressam um antígeno tumoral, por exemplo, um antígeno tumoral que não compre- ende CD25, por exemplo, CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 ou CD11b, para assim proporcionar uma população depletada de T reguladoras, por exemplo, depletada de CD25+, e células depletadas de antígenos tumorais que são adequadas para expressão de um CAR, por exemplo, um CAR descrito no presente documento. Em uma modalidade, as células que expressam antígenos tumorais são remo-

vidas simultaneamente com as células T reguladoras, por exemplo, CD25+. Por exemplo, um anticorpo anti-CD25, ou seu fragmento, e um anticorpo de antígeno antitumoral, ou seu fragmento, podem ser ane- xados ao mesmo substrato, por exemplo, esférula, que pode ser usado para remover as células ou um anticorpo anti-CD25, ou seu fragmento, ou o anticorpo de antígeno antitumoral, ou seu fragmento, podem ser anexados para separar esférulas, uma mistura das quais pode ser usada para remover as células. Em outras modalidades, a remoção de células reguladoras T, por exemplo, células CD25+, e a remoção das células que expressam antígeno tumoral é sequencial e pode ocorrer, por exemplo, em qualquer ordem.

[00310] Também são proporcionados métodos que incluem remo- ver células da população que expressam um inibidor de pontos de ve- rificação, por exemplo, um inibidor de pontos de verificação descrito no presente documento, por exemplo, um ou mais de células PD1+, célu- las LAG3+ e células TIM3+, para desse modo proporcionar uma popu- lação depletada de células T reguladoras, por exemplo, depletada de CD25+, e depletada de células com um inibidor de pontos de verifica- ção, por exemplo, depletada de células PD1+, LAG3+ e/ou TIM3+. Ini- bidores de ponto de verificação exemplificativos incluem PD1, PD-L1, PD-L2, CTLAA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM- 3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 ou CD270), KIR, A2aR, MHC de classe |, MHC de classe Il, GAL9, ade- nosina e TGFR beta. Nas modalidades, o inibidor de ponto de verifica- ção é PD1 ou PD-L1. Em uma modalidade, células expressando inibi- dor de pontos de verificação são removidas simultaneamente com as células T reguladoras, por exemplo, CD25+. Por exemplo, um anticor- po anti-CD25 ou seu fragmento, e um anticorpo anti-inibidor de pontos de verificação ou seu fragmento, podem ser ligados à mesma microes-

fera que pode ser usada para remover as células, ou um anticorpo an- ti-CD25 ou seu fragmento, e o anticorpo anti-inibidor de pontos de veri- ficação ou seu fragmento, podem ser ligados a microesferas separa- das, uma mistura das quais pode ser usada para remover as células. Em outras modalidades, a remoção de células T reguladoras, por exemplo, células CD25+, e a remoção das células expressando inibi- dor de pontos de verificação são sequenciais, e podem ocorrer, por exemplo, em qualquer ordem.

[00311] Em uma modalidade, pode ser selecionada uma população de células T que expressa um ou mais de IFN-y, TNFa, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, I1L-10, I1L-13, granzima B e perforina, ou outras mo- léculas apropriadas, por exemplo, outras citocinas. Métodos de ras- treio da expressão de células podem ser determinados, por exemplo, pelos métodos descritos na Publicação PCT No.: WO 2013/126712.

[00312] Para isolamento de uma população de células por seleção positiva ou negativa, a concentração de células e superfície (por exemplo, partículas como esférulas) pode variar. Em certos aspectos, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual esfé- rulas e células são misturadas em conjunto (por exemplo, aumentar a concentração de células), para assegurar contato máximo de células e esférulas. Por exemplo, em um aspecto, uma concentração de 2 bi- lhões de células/mL é usada. Em um aspecto, uma concentração de 1 bilhões de células/mL é usada. Em um aspecto adicional, mais de 100 milhões de células/ml são usadas. Em um aspecto adicional, uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 mi- lhões de células/ml é usada. Ainda em um aspecto, uma concentração de células desde 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/ml é usada. Em aspectos adicionais, concentrações de 125 ou 150 milhões de células/ml podem ser usadas. O uso de concentrações elevadas pode resultar em rendimento de células, ativação de células e expan-

são de células aumentados. Além disso, o uso de elevadas concentra- ções de células permite uma captura mais eficiente de células que po- dem expressar fracamente antígenos-alvo de interesse, tais como cé- lulas T negativas para CD28, ou de amostras onde estão presentes muitas células tumorais (por exemplo, sangue leucêmico, tecido tumo- ral, etc.). Tais populações de células podem ter valor terapêutico e se- rá desejável obter as mesmas. Por exemplo, o uso de uma concentra- ção elevada de células permite uma seleção mais eficiente de células T CD8+ que normalmente têm expressão mais fraca de CD28.

[00313] Em um aspecto relacionado, pode ser desejável usar con- centrações menores de células. Ao diluir significativamente a mistura de células T e superfície (por exemplo, partículas tais como esférulas), interações entre as partículas e células são minimizadas. Tal seleciona células que expressam quantidades elevadas de antígenos desejados a serem ligados às partículas. Por exemplo, células T CD4+ expres- sam níveis mais elevados de CD28 e são mais eficientemente captu- radas do que células T CD8+ em concentrações diluídas. Em um as- pecto, a concentração de células usada é 5 X 10e6/ml. Em outros as- pectos, a concentração usada pode ir desde cerca de 1 X 10º/ml até 1 X 106/ml, e qualquer valor inteiro entre aqueles.

[00314] Em outros aspectos, as células podem ser incubadas em um rotador durante extensões de tempo variáveis, a velocidades vari- áveis, a uma temperatura de 2 a 10 ºC ou à temperatura ambiente.

[00315] CélulasT para estimulação também podem ser congeladas após uma etapa de lavagem. Sem pretender ficar restringido pela teo- ria, a etapa de congelamento e descongelamento subsequente fornece um produto mais uniforme por remoção de granulócitos e, em alguma extensão, monócitos da população de células. Após a etapa de lava- gem, que remove plasma e plaquetas, as células podem ser suspen- sas em uma solução de congelação. Embora muitas soluções e parà-

metros de congelamento sejam conhecidos na técnica e sejam úteis nesse contexto, um método envolve usar PBS contendo DMSO a 20% e albumina do soro humano a 8%, ou meio de cultura contendo Dex- trano 40 a 10% e Dextrose a 5%, Albumina de Soro Humano a 20% e DMSO a 7,5% ou Plasmalyte-A a 31,25%, Dextrose a 5%, NaCl a 0,45%, Dextrano 40 a 10% e Dextrose a 5%, Albumina do Soro Hu- mano a 20%, e DMSO a 7,5% ou outro meio de congelação de células adequado contendo, por exemplo, Hespan e PlasmaLyte A, as células são então congeladas a uma temperatura de -80 ºC a uma velocidade de 1 º por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido. Outros métodos de congelação controlada podem ser usados, bem como congelamento descontrolado imediatamente a -20 ºC ou em nitrogênio líquido.

[00316] Em certos aspectos, células criopreservadas são desconge- ladas e lavadas conforme descrito no presente documento e deixadas repousar durante uma hora à temperatura ambiente antes da ativação com o uso dos métodos da presente invenção.

[00317] Também é contemplada, no contexto da invenção, a coleta de amostras de sangue ou produto de aférese de um indivíduo em um período de tempo antes de poderem ser necessárias as células ex- pandidas conforme descrito no presente documento. Como tal, a fonte das células a serem expandidas pode ser coletada em qualquer ponto no tempo necessário, e células desejadas, como células imunoefeto- ras, por exemplo, células T ou células NK isoladas e congeladas para uso posterior em terapia com células, por exemplo, terapia com células T, para quaisquer doenças ou afecções que beneficiem da terapia com células, por exemplo, terapia com células T, como as descritas no pre- sente documento. Em um aspecto, uma amostra de sangue ou uma aférese é recolhida de um indivíduo geralmente saudável. Em certos aspectos, uma amostra de sangue ou uma aférese é recolhida de um indivíduo geralmente saudável que está em risco de desenvolver uma doença, mas que ainda não desenvolveu uma doença, e as células de interesse são isoladas e congeladas para uso posterior. Em certos as- pectos, as células imunoefetoras (por exemplo, células T ou células NK) podem ser expandidas, congeladas e usadas em um instante pos- terior. Em certos aspectos, amostras são coletadas de um paciente pouco tempo após o diagnóstico de uma doença particular como des- crito no presente documento, mas antes de quaisquer tratamentos. Em um aspecto adicional, as células são isoladas de uma amostra de san- gue ou uma aférese de um indivíduo antes de quaisquer modalidades de tratamento relevantes, incluindo, mas não se limitando a, tratamen- to com agentes tais como natalizumab, efalizumab, agentes antivirais, quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, tais como ci- closporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato e FK506, anticorpos ou outros agentes de imunoablação tais como CAMPATH, anticorpos anti-CD3, citoxano, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiação.

[00318] Em um aspecto adicional da presente invenção, células T são obtidas de um paciente diretamente após tratamento que deixa o indivíduo com células T funcionais. Nesse sentido, foi observado que, após determinados tratamentos para câncer, em particular tratamentos com fármacos que danificam o sistema imune, pouco tempo após o tratamento e durante o período no qual pacientes estão normalmente se recuperando do tratamento, a qualidade de células T obtidas pode ser ideal ou melhorada quanto à sua capacidade de expansão ex vivo. De igual modo, após manipulação ex vivo com o uso dos métodos descritos no presente documento, essas células podem estar em um estado preferencial para enxertia e expansão in vivo intensificadas. Assim, é contemplado, no contexto da presente invenção, recolher cé- lulas sanguíneas, incluindo células T, células dendríticas, ou outras células da linhagem hematopoiética, durante esta fase de recupera- ção. Além disso, em certos aspectos, regimes de mobilização (por exemplo, mobilização com GM-CSF) e condicionamento podem ser usados para criar uma condição em um indivíduo em que a repopula- ção, recirculação, regeneração e/ou expansão de tipos de células par- ticulares são favorecidos, especialmente durante uma janela de tempo definida após terapia. Tipos de células ilustrativos incluem células T, células B, células dendríticas e outras células do sistema imune.

[00319] Em uma modalidade, as células imunoefetoras que expres- sam uma molécula CAR, por exemplo, uma molécula CAR descrita no presente documento, são obtidas a partir de um indivíduo que recebeu uma dose baixa intensificadora de imunidade de um inibidor de MTOR. Em uma modalidade, a população de células imunoefetoras, por exemplo, células T, a ser geneticamente manipulada para expressar um CAR, é coletada após um tempo suficiente ou após dosagem sufi- ciente de baixa dose de intensificação imune de um inibidor de MTOR, de modo que o nível de células efetoras imunes negativas para PD1, por exemplo, células T, ou a razão de células efetoras imunes negati- vas para PD1, por exemplo, células T/células efetoras imunes positi- vas para PD1, por exemplo, células T, no indivíduo ou coletadas do indivíduo foi, pelo menos temporariamente, aumentada.

[00320] Em outras modalidades, a população de células efetoras imunes, por exemplo, células T, que foi ou será manipulada para ex- pressar um CAR, pode ser tratada ex vivo por contato com uma quan- tidade de um inibidor de MTOR que aumenta o número de células efe- toras imunes negativas para PD1, por exemplo, células T, ou aumenta a razão de células efetoras imunes negativas para PD1, por exemplo, células T/células efetoras imunes positivas para PD1, por exemplo, células T.

[00321] Em uma modalidade, a população de células T é deficiente em diaglicerol quinase (DGK). Células deficientes em DGK incluem células que não expressam RNA ou proteína de DGK, ou têm ativida- de de DGK reduzida ou inibida. Células deficientes em DGK podem ser geradas por abordagens genéticas, por exemplo, administração de agentes de interferência de RNA, por exemplo, siRNA, shRNA, miR- NA, para reduzir ou prevenir a expressão de DGK. Alternativamente, células deficientes em DGK podem ser geradas por tratamento com inibidores de DGK descritos no presente documento.

[00322] Em uma modalidade, uma população de células T é defici- ente em lkaros. Células deficientes em lkaros incluem células que não expressam RNA ou proteína de lkaros, ou têm atividade de lkaros re- duzida ou inibida, células deficientes em Ikaros podem ser geradas por abordagens genéticas, por exemplo, administração de agentes de in- terferência de RNA, por exemplo, siRNA, shRNA, miRNA, para reduzir ou prevenir a expressão de lkaros. Alternativamente, células deficien- tes em lkaros podem ser geradas por tratamento com inibidores de lkaros, por exemplo, lenalidomida.

[00323] Em modalidades, uma população de células T é deficiente em DGK e deficiente em lkaros, por exemplo, não expressa DGK nem lkaros, ou tem atividade de DGK e Ilkaros reduzida ou inibida. Tais cé- lulas deficientes em DGK e Ilkaros podem ser geradas por quaisquer dos métodos descritos no presente documento.

[00324] Em uma modalidade, as células NK são obtidas do indiví- duo. Em outra modalidade, as células NK são uma linhagem de célu- las NK, por exemplo, linhagem de células NK-92 (Conkwest). Modificações de células de CAR, incluindo células de CAR alogê- nico

[00325] Nas modalidades descritas no presente documento, a célu- la imunoefetora pode ser uma célula imunoefetora alogênica, por exemplo, célula T ou célula NK. Por exemplo, a célula pode ser uma célula T alogeneica, por exemplo, uma célula T alogeneica desprovida de expressão de um receptor de células T (TCR) e/ou antígeno leuco- citário humano (HLA) funcionais, por exemplo, HLA de classe | e/ou HLA de classe || e/ou microglobulina beta-2 (Bam). As composições de CAR alogênico e métodos do mesmo foram descritos, por exemplo, nas páginas 227-237 do documento WO 2016/014565, incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00326] Em algumas modalidades, uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, é modificada para reduzir a expressão de um TCR, e/ou HLA, e/ou Bam, e/ou uma molécula inibidora descrita no presente documento (por exemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLAA, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 ou CD270), KIR, A2aR, MHC classe |, MHC classe Il, GAL9, adenosina e TGFR beta), usando, por exemplo, um método descrito no presente documento, por exem- plo, siRNA, shRNA, repetições palindrômicas curtas regularmente es- paçadas aglomeradas (CRISPR), nuclease com efetor do tipo ativador de transcrição (TALEN) ou endonuclease de dedo de zinco (ZFN).

[00327] Em algumas modalidades, uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK é geneticamente manipulada para expres- sar uma subunidade de telomerase, por exemplo, a subunidade catalí- tica de telomerase, por exemplo, TERT, por exemplo, hTERT. Em uma modalidade, tal modificação melhora a persistência da célula em um paciente. Ativação e Expansão de Células T

[00328] As células T podem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos como descrito, por exemplo, nas Patentes nº U.S. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843;

5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; e Publicação do Pedido de Patente U.S. nº 20060121005.

[00329] Geralmente, as células T da invenção podem ser expandi- das por contato com uma superfície tendo ligado um agente que esti- mula um sinal associado ao complexo CD3/TCR e um ligante que es- timula uma molécula coestimuladora na superfície das células T. Em particular, populações de células T podem ser estimuladas como des- crito no presente documento, tal como por contato com um anticorpo anti-CD3, ou seu fragmento de ligação a antígenos, ou um anticorpo anti-CD2 imobilizado em uma superfície, ou por contato com um ativa- dor de proteína quinase C (por exemplo, briostatina) em conjunção com um ionóforo de cálcio. Para a coestimulação de uma molécula acessória na superfície das células T é usado um ligante que se liga à molécula acessória. Por exemplo, uma população de células T pode ser contatada com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, sob condições apropriadas para estimular a proliferação das células T. Para estimular a proliferação de células T CD4+ ou células T CD8+, podem ser usados um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28. Os exemplos de um anticorpo anti-CD28 incluem 9,3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besançon, França) que podem ser usados, bem como ou- tros métodos habitualmente conhecidos na técnica (Berg et al., Trans- plant Proc. 30(8):3,975 a 3,977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et a/., J. Immunol Meth. 227(1-2):53 a 63, 1999).

[00330] Em certos aspectos, o sinal estimulador primário e o sinal coestimulador para a célula T podem ser fornecidos por protocolos di- ferentes. Por exemplo, os agentes que fornecem cada sinal podem estar em solução ou acoplados a uma superfície. Quando acoplados a uma superfície, os agentes podem estar acoplados à mesma superfí- cie (isto é, em formação "cis") ou a superfícies separadas (isto é, em formação "trans"). Alternativamente, um agente pode estar acoplado a uma superfície e o outro agente em solução. Em um aspecto, o agente que fornece o sinal coestimulador está ligado a uma superfície celular e o agente que fornece o sinal de ativação primário está em solução ou aco- plado a uma superfície. Em certos aspectos, os dois agentes podem estar em solução. Em um aspecto, os agentes podem estar em forma solúvel e, então, ser reticulados a uma superfície, tal como uma célula que expressa receptores de Fc ou um anticorpo ou outro agente de liga- ção que irá se ligar aos agentes. Nesse sentido, consultar, por exemplo, as Publicações dos Pedidos de Patentes nºº U.S. 20040101519 e 20060034810 quanto a células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs) que são contempladas para uso na ativação e expansão de células T na presente invenção.

[00331] Em um aspecto, os dois agentes são imobilizados em mi- croesferas, na mesma microesfera, isto é, "cis", ou em microesferas separadas, isto é, "trans". A título exemplificativo, o agente que fornece o sinal de ativação primário é um anticorpo anti-CD3 ou um seu frag- mento de ligação a antígenos e o agente que fornece o sinal coestimu- lador é um anticorpo anti-CD28 ou seu fragmento de ligação a antíge- nos; e os dois agentes são coimobilizados na mesma microesfera em quantidades moleculares equivalentes. Em um aspecto é usada uma razão 1:1 de cada anticorpo ligado às microesferas para expansão de células T CD4+ e crescimento de células T. Em certos aspectos da presente invenção, é usada uma razão de anticorpos anti-CD3:CD28 ligados às microesferas de modo a ser observado um aumento da ex- pansão de células T em comparação com a expansão observada usando uma razão de 1:1. Em um aspecto particular, um aumento de cerca de 1 a cerca de 3 vezes é observado em comparação com a ex- pansão observada usando uma razão de 1:1. Em um aspecto, a razão de anticorpos CD3:CD28 ligados às microesferas está na faixa 100:1 a

1:100 e todos os valores inteiros entre estes. Em um aspecto da pre- sente invenção, mais anticorpo anti-CD28 é ligado às partículas do que anticorpo anti-CD3, isto é, a razão de CD3:CD28 é menor do que um. Em certos aspectos da invenção, a razão de anticorpo anti-CD28 para anticorpo anti-CD3 ligado às esférulas é maior do que 2:1. Em um aspecto particular, é usada uma razão 1:100 de CD3:CD28 de anticor- po ligado a esférulas. Em um aspecto, é usada uma razão 1:75 de CD3:CD28 de anticorpo ligado a microesferas. Em um aspecto adicio- nal, é usada uma razão 1:50 de CD3:CD28 de anticorpo ligado a mi- croesferas. Em um aspecto, é usada uma razão 1:30 de CD3:CD28 de anticorpo ligado a microesferas. Em um aspecto preferencial, é usada uma razão 1:10 de CD3:CD28 de anticorpo ligado a esférulas. Em um aspecto, é usada uma razão 1:3 de CD3:CD28 de anticorpo ligado às esférulas. Ainda em um aspecto, é usada uma razão 3:1 de CD3:CD28 de anticorpo ligado às esférulas.

[00332] Razões entre partículas e células de 1:500 a 500:1 e quais- quer valores inteiros entre estes podem ser usadas para estimular cé- lulas T ou outras células-alvo. Como aqueles de habilidade comum na técnica podem entender prontamente, a razão entre partículas e célu- las pode depender do tamanho das partículas relativamente à célula- alvo. Por exemplo, microesferas de pequeno tamanho podem ligar somente algumas células, ao passo que microesferas maiores podem ligar muitas. Em certos aspectos, a razão entre células e partículas está na faixa desde 1:100 a 100:1 e quaisquer valores inteiros entre estes e, em aspectos adicionais, a razão que compreende 1:9 até 9:1 e quaisquer valores inteiros entre estes também pode ser usada para estimular células T. A razão de partículas acopladas a anti-CD3 e anti- CD28 para células T que pode resultar em estimulação de células T pode variar como notado acima, no entanto, certos valores preferenci- ais incluem 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5,

1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, e 15:1 com uma razão preferencial sendo pelo menos 1:1 partículas por célula T. Em um aspecto, é usada uma razão entre partículas e células de 1:1 ou menos. Em um aspecto particular, uma razão preferencial partícu- la:célula é 1:5. Em aspectos adicionais, a razão entre partículas e célu- las pode ser variada dependendo do dia da estimulação. Por exemplo, em um aspecto, a razão entre partículas e células é de 1:1 a 10:1 no primeiro dia e partículas adicionais são adicionadas às células todos Os dias ou em dias alternados daí em diante durante um período até dias, a razões finais de 1:1 a 1:10 (com base em contagens de cé- lulas no dia da adição). Em um aspecto particular, a razão entre partí- culas e células é 1:1 no primeiro dia da estimulação e ajustada para 1:5 no terceiro e quinto dias da estimulação. Em um aspecto, partícu- las são adicionadas em uma base diária ou de dias alternados para uma razão final de 1:1 no primeiro dia e 1:5 no terceiro e quinto dias da estimulação. Em um aspecto, a razão entre partículas e células é 2:1 no primeiro dia da estimulação e ajustada para 1:10 no terceiro e quinto dias da estimulação. Em um aspecto, partículas são adiciona- das em uma base diária ou de dias alternados em uma razão final de 1:1 no primeiro dia e 1:10 no terceiro e quinto dias da estimulação. O versado na técnica entenderá que uma variedade de outras razões podem ser adequadas para uso na presente invenção. Em particular, as razões irão variar dependendo do tamanho das partículas e do ta- manho e tipo de células. Em um aspecto, as razões mais típicas para uso se encontram nas proximidades de 1:1, 2:1 e 3:1 no primeiro dia.

[00333] Em aspectos adicionais da presente invenção, as células, tais como células T, são combinadas com esférulas revestidas com agentes, as esférulas e as células são subsequentemente separadas, e então as células são cultivadas. Em um aspecto alternativo, antes da cultura, as microesferas revestidas com agentes e células não são se-

paradas, mas são cultivadas em conjunto. Em um aspecto adicional, as microesferas e células são primeiramente concentradas por aplica- ção de uma força, tal como uma força magnética, resultando em liga- ção acrescida de marcadores da superfície celular, desse modo indu- zindo estimulação de células.

[00334] A título de exemplo, as proteínas da superfície celular po- dem ser ligadas permitindo-se que microesferas paramagnéticas às quais estão ligadas o anti-CD3 e anti-CD28 (3x28 microesferas) façam contato com as células T. Em um aspecto, as células (por exemplo, 10º a 10º células T) e microesferas (por exemplo, microesferas para- magnéticas T CD3/CD28 DYNABEADSO M-450 a uma razão de 1:1) são combinadas em um tampão, por exemplo, PBS (sem cátions diva- lentes, tais como cálcio e magnésio). Mais uma vez, os versados na técnica podem entender prontamente que qualquer concentração de células pode ser usada. Por exemplo, a célula-alvo pode ser muito rara na amostra e compreender somente 0,01% da amostra ou a totalidade da amostra (isto é, 100%) pode compreender a célula-alvo de interes- se. Em conformidade, qualquer número de células está dentro do con- texto da presente invenção. Em certos aspectos, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual partículas e células são misturadas em conjunto (isto é, aumentar a concentração de células), para assegurar o contato máximo entre as células e as partículas. Por exemplo, em um aspecto, é usada uma concentração de cerca de 10 bilhões de células/ml, 9 bilhões/ml, 8 bilhões/ml, 7 bilhões/ml, 6 bi- lhões/ml, 5 bilhões/ml ou 2 bilhões/ml. Em um aspecto, são usadas mais de 100 milhões de células/ml. Em um aspecto adicional, uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 mi- lhões de células/ml é usada. Ainda em um aspecto, uma concentração de células desde 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/ml é usada. Em aspectos adicionais, concentrações de 125 ou 150 milhões de células/ml podem ser usadas. O uso de concentrações elevadas pode resultar em rendimento de células, ativação de células e expan- são de células aumentados. Além disso, o uso de concentrações ele- vadas de células permite uma captura mais eficiente de células que podem expressar fracamente antígenos-alvo de interesse, tais como células T negativas para CD28. Tais populações de células podem ter valor terapêutico e será desejável obtê-las em certos aspectos. Por exemplo, o uso de uma concentração elevada de células permite uma seleção mais eficiente de células T CD8+ que normalmente têm ex- pressão mais fraca de CD28.

[00335] Em uma modalidade, células transduzidas com um ácido nucleico codificando um CAR, por exemplo, um CAR descrito no pre- sente documento, são expandidas, por exemplo, por um método des- crito no presente documento. Em uma modalidade, as células são ex- pandidas em cultura durante um período de várias horas (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 horas) até cerca de 14 dias (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias). Em uma modalidade, as células são expandidas durante um período de 4 até 9 dias. Em uma modalidade, as células são expandidas durante um período de 8 dias ou menos, por exemplo, 7, 6 ou 5 dias. Em uma modalidade, as células, por exemplo, uma célula de CAR de BCMA descrita no presente documento, são expandidas em cultura durante 5 dias, e as células resultantes são mais potentes do que as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condi- ções de cultura. A potência pode ser definida, por exemplo, por várias funções de células T, por exemplo, proliferação, morte de células-alvo, produção, ativação, migração de citocinas, ou suas combinações. Em uma modalidade, as células, por exemplo, uma célula de CAR de BCMA descrita no presente documento, expandidas durante 5 dias exibem um aumento de pelo menos uma, duas, três ou quatro vezes em duplicações de células por estimulação com antígenos em compa- ração com as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condições de cultura. Em uma modalidade, as células, por exemplo, as células expressando um CAR de BCMA descrito no presente documento, são expandidas em cultura durante 5 dias, e as células resultantes exibem produção mais elevada de citocinas pró- inflamatórias, por exemplo, níveis de IFN-y e/ou GM-CSF, em compa- ração com as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condições de cultura. Em uma modalidade, as células, por exemplo, uma célula de CAR de BCMA descrita no presente do- cumento, expandidas durante 5 dias exibem um aumento de pelo me- nos uma, duas, três, quatro, cinco, dez vezes ou mais em pg/ml de produção de citocinas pró-inflamatórias, por exemplo, níveis de IFN-y e/ou GM-CSF, em comparação com as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condições de cultura.

[00336] Em um aspecto da presente invenção, a mistura pode ser cultivada durante várias horas (cerca de 3 horas) até cerca de 14 dias ou qualquer valor horário inteiro entre os mesmos. Em um aspecto, a mistura pode ser cultivada durante 21 dias. Em um aspecto da inven- ção, as esférulas e as células T são cultivadas em conjunto durante cerca de oito dias. Em um aspecto, as esférulas e células T são culti- vadas em conjunto durante 2-3 dias. Também podem ser desejados vários ciclos de estimulação, de modo que o tempo de cultura de célu- las T possa ser de 60 dias ou mais. Condições apropriadas para cultu- ra de células T incluem um meio apropriado (por exemplo, Meio Míni- mo Essencial ou meio RPMI 1640 ou X-vivo 15 (Lonza)) que pode con- ter fatores necessários para a proliferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, soro fetal de bovino ou humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-y, IL-4, IL-7, GM-CSF, I1L-10, 11-12, 11-15, TGFB e TNF-a ou quaisquer outros aditivos para o crescimento de células conhecidos do perito. Outros aditivos para o crescimento de células incluem, po- rém sem limitação, tensoativo, plasmanato e agentes redutores, tais como N-acetil-cisteína e 2-mercaptoetanol. Os meios podem incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 e X-Vivo 20, Optimizer, com aminoácidos adicionados, piruvato de sódio e vita- minas, sem soro ou suplementados com uma quantidade apropriada de soro (ou plasma) ou um conjunto definido de hormônios e/ou uma quantidade de citocina (ou citocinas) suficiente para o crescimento e expansão de células T. Antibióticos, por exemplo, penicilina e estrep- tomicina, são incluídos somente em culturas experimentais, não em culturas de células a serem infundidas em um indivíduo. As células- alvo são mantidas sob condições necessárias para suportar o cresci- mento, por exemplo, uma temperatura (por exemplo, 37 ºC) e atmosfe- ra (por exemplo, ar mais 5% de CO») apropriadas.

[00337] Em uma modalidade, as células são expandidas em um meio apropriado (por exemplo, meio descrito no presente documento) que inclui uma ou mais interleucinas que resulte em pelo menos um aumento de 200 vezes (por exemplo, 200 vezes, 250 vezes, 300 ve- zes, 350 vezes) em células ao longo de um período de expansão de 14 dias, por exemplo, medido por um método descrito no presente do- cumento tal como citometria de fluxo. Em uma modalidade, as células são expandidas na presença de IL-15 e/ou IL-7 (por exemplo, IL-15 e IL-7).

[00338] Em modalidades, métodos descritos no presente documen- to, por exemplo, métodos de fabricação de células expressando CAR, compreendem remover células T reguladoras, por exemplo, células CD25+ T, de uma população de células, por exemplo, usando um anti- corpo anti-CD25, ou seu fragmento, ou um ligante de ligação a CD25, IL-2. Métodos para remover células T reguladoras, por exemplo, célu- las T CD25+, de uma população de células são descritos no presente documento. Em modalidades, os métodos, por exemplo, métodos de fabricação, compreendem adicionalmente contatar uma população de células (por exemplo, uma população de células na qual células T re- guladoras, tal como células CD25+ T, foram esgotadas; ou uma popu- lação de células que foi previamente contatada com um anticorpo anti- CD25, seu fragmento, ou ligando de ligação a CD25) com IL-15 e/ou IL-7. Por exemplo, a população de células (por exemplo, que foi previ- amente contatada com um anticorpo anti-CD25, seu fragmento, ou |li- gando de ligação a CD25) é expandida na presença de IL-15 e/ou IL-7.

[00339] Em algumas modalidades, uma célula expressando CAR descrita no presente documento é contatada com uma composição compreendendo um polipeptídeo de interleucina-15 (IL-15), um poli- peptídeo do receptor de interleucina-15 alfa (IL-15Ra), ou uma combi- nação de um polipeptídeo de IL-15 e um polipeptídeo de IL-15Ra, por exemplo, hetlL-15, durante a preparação da célula expressando CAR, por exemplo, ex vivo. Nas modalidades, uma célula que expressa CAR descrita no presente documento é contatada com uma composição que compreende um polipeptídeo de IL-15 durante a preparação da célula que expressa CAR, por exemplo, ex vivo. Em modalidades, a célula expressando CAR descrita no presente documento é contatada com uma composição compreendendo uma combinação de um poli- peptídeo de IL-15 e um polipeptídeo de IL-15 Ra durante a fabricação da célula expressando CAR, por exemplo, ex vivo. Em modalidades, a célula expressando CAR descrita no presente documento é contatada com uma composição compreendendo hetlL-15 durante a fabricação da célula expressando CAR, por exemplo, ex vivo.

[00340] Em uma modalidade, a célula que expressa CAR descrita no presente documento é contatada com uma composição que com- preende hetlL-15 durante a expansão ex vivo. Em uma modalidade, a célula que expressa CAR descrita no presente documento é contatada com uma composição que compreende um polipeptídeo de IL-15 du- rante a expansão ex vivo. Em uma modalidade, a célula que expressa CAR descrita no presente documento é contatada com uma composi- ção que compreende um polipeptídeo de IL-15 e um polipeptídeo de IL-15Ra durante a expansão ex vivo. Em uma modalidade, o contato resulta na sobrevivência e proliferação de uma subpopulação de linfó- citos, por exemplo, células T CD8+.

[00341] Células T que foram expostas a tempos de estimulação va- riados podem exibir diferentes características. Por exemplo, produtos típicos de sangue ou células mononucleares do sangue periférico submetidas a aférese têm uma população de células T auxiliadoras (TH, CD4+) que é maior do que a população de células T citotóxicas ou supressoras. A expansão ex vivo de células T por estimulação dos receptores CD3 e CD28 produz uma população de células T que, an- tes de cerca de 8 a 9 dias, consiste predominantemente em células TH, ao passo que, passados cerca de 8 a 9 dias, a população de célu- las T compreende uma população cada vez maior de células TC. Em conformidade, dependendo do propósito do tratamento, a infusão de um indivíduo com uma população de células T que compreende pre- dominantemente células TH pode ser vantajosa. Similarmente, se um subconjunto de células TC específicas para antígeno tiver sido isolado, pode ser benéfico expandir este subconjunto em um grau maior.

[00342] Ademais, adicionalmente aos marcadores de CD4 e CDB8, outros marcadores fenotípicos variam significativamente, mas, em grande parte, de modo reproduzível durante o processo da expansão celular. Assim, tal caráter reproduzível permite personalizar um produ- to de células T ativadas para propósitos específicos.

[00343] Uma vez que um CAR de BCMA é construído, vários en- saios podem ser usados para avaliar a atividade da molécula, tais co- mo mas não se limitando à, capacidade de expandir células T após estimulação por antígenos, sustentar a expansão de células T na au- sência de reestimulação e atividades anticancerígenas em modelos in vitro e animais adequados. Os ensaios para avaliar os efeitos de um CAR de BCMA são descritos em mais detalhes abaixo.

[00344] A análise por transferência Western da expressão de CAR em células T primárias pode ser usada para detectar a presença de monômeros e dímeros. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular The- rapy 17(8): 1,453 a 1,464 (2009). Muito brevemente, as células T (mis- tura 1:1 de células T CD4* e CD8*) que expressam os CARs são ex- pandidas in vitro por mais de 10 dias, seguido de lise e SDS-PAGE sob condições de redução. CARs contendo o domínio citoplasmático de TCR-6 completo e a cadeia TOR-6 endógena são detectados por transferência Western com o uso de um anticorpo para a cadeia TOR- CT. Os mesmos subconjuntos de células T são usados para análise SDS-PAGE sob condições não redutoras para permitir a avaliação da formação de dímeros covalentes.

[00345] A expansão in vitro de células T CAR* após a estimulação de antígeno pode ser medida por citometria de fluxo. Por exemplo, uma mistura de células T CD4* e CD8* é estimulada com aAPCs aCD3/aCD28 seguidos por transdução com vetores lentivirais que ex- pressam GFP sob o controle dos promotores a serem analisados. Promotores exemplificativos incluem os promotores do gene IE do CMV, EF-1a, ubiquitina C ou fosfoglicerocinase (PGK). A fluorescência de GFP é avaliada no dia 6 de cultura nos subconjuntos de células T CD4* e/ou CD8* por citometria de fluxo. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1,453 a 1,464 (2009). Alternativamente, uma mistura de células T CD4* e CD8* é estimulada com microesferas magnéticas revestidas com aCD3/aCD28 no dia O e transduzida com CAR no dia 1 com o uso de um vetor lentiviral bicistrônico que expres- sa CAR juntamente com eGFP com o uso de sequência de omissão ribossômica 2A. As culturas são reestimuladas com células que ex- pressam BCMA, como linhagens celulares de mieloma múltiplo ou K562-BCMA, após a lavagem. IL-2 exógena é adicionada às culturas em dias alternados a 100 IU/ml. As células T GFP* são enumeradas por citometria de fluxo com o uso de contagem baseada em microesfe- ra. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453 a 1,464 (2009).

[00346] A expansão sustentada de células T CAR* na ausência de reestimulação também pode ser medida. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1,453 a 1,464 (2009). Em resumo, o vo- lume médio de células T (fl) é medido no dia 8 da cultura usando um contador de partículas Coulter Multisizer Ill, um Nexcelom Cellometer Vision ou Millipore Scepter, após estimulação com esférulas magnéti- cas revestidas com aCD3/aCD28 no dia O e transdução com o CAR indicado no dia 1.

[00347] Modelos de animal podem ser também usados para medir uma atividade de CART. Por exemplo, um modelo de xenoenxerto com o uso de células CAR* específicas para BCMA humanas para tra- tar um mieloma múltiplo humano primário em camundongos com imu- nodeficiência pode ser usado. Ver, por exemplo, Milone et a/., Molecu- lar Therapy 17(8): 1,453 a 1,464 (2009). Muito brevemente, após esta- belecimento de MM, os camundongos são randomizados quanto aos grupos de tratamento. Números diferentes de células CART de BCMA podem ser injetados em camundongos com imunodeficiência portado- res de MM. Os animais são avaliados quanto à progressão da doença e carga tumoral em intervalos semanais. As curvas de sobrevida para os grupos são comparadas com o uso do teste de log-rank. Adicional- mente, contagens absolutas de células T CD4* e CD8* de sangue peri- férico 4 semanas após a injeção de células T nos camundongos com imunodeficiência podem ser também analisadas. Os camundongos recebem por injeção células de mieloma múltiplo e 3 semanas depois recebem por injeção células T manipuladas para expressarem CAR de BCMA, por exemplo, por um vetor lentiviral bicistrônico que codifica o CAR ligado a eGFP. As células T são normalizadas para 45-50% de células T GFP* de entrada por mistura com células com transdução simulada antes da injeção e confirmadas por citometria de fluxo. Os animais são avaliados quanto a leucemia em intervalos de 1 semana. As curvas de sobrevida para os grupos de células T CAR* são compa- radas com o uso do teste de log-rank.

[00348] A avaliação de proliferação celular e produção de citocinas foi anteriormente descrita, por exemplo, em Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1,453 a 1,464 (2009). Resumidamente, a avaliação da proliferação mediada por CAR é realizada em placas de microtitulação, misturando células T lavadas com células K562 que expressam BCMA ou outras células de mieloma que expressam BCMA são irradiadas com radiação gama antes do uso. Anticorpos monoclionais anti-CD3 (clone OKT3) e anti-CD28 (clone 9,3) são adicionados a culturas com células KT32-BBL para servir como um controle positivo para estimular a proliferação de células T visto que esses sinais suportam expansão de células T CD8* a longo prazo ex vivo. As células T são enumeradas em culturas com o uso de microesferas fluorescentes CountBrightTv (Invitrogen, Carlsbad, CA) e citometria de fluxo, conforme descrito pelo fabricante. As células T CAR* são identificadas por expressão de GFP com o uso de células T que são manipuladas com vetores lentivirais que expressam CAR ligados a eGFP-2A. Para células T CAR+ que não expressam GFP, as células T CAR+ são detectadas com proteína de BCMA recombinante biotinilada e um conjugado de avidina-PE se- cundário. A expressão de CD4+ e CD8* em células T é também simul- taneamente detectada com anticorpos monoclonais específicos (BD Biosciences). As medições de citocinas são realizadas em sobrena-

dantes recolhidos 24 horas após nova estimulação usando o kit de ar- ranjo de esférulas citométricas de citocinas TH1/TH2 humanas (BD Biosciences, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabrican- te. A fluorescência é avaliada usando um citômetro de fluxo FACScali- bur e os dados são analisados de acordo com as instruções do fabri- cante.

[00349] A citotoxicidade pode ser avaliada por um ensaio de libera- ção de 51Cr padrão. Ver, por exemplo, Milone et a/., Molecular The- rapy 17(8): 1,453 a 1,464 (2009). Resumidamente, as células-alvo (por exemplo, linhagens K562 que expressam BCMA e células de mieloma múltiplo primárias) são carregadas com 51Cr (como NaCrO4, New En- gland Nuclear, Boston, MA) a 37 ºC por 2 horas com agitação frequen- te, lavadas duas vezes em RPMI completo e colocadas em placas de microtitulação. As células T efetoras são misturadas com células-alvo nos poços em RPMI completo em razões variáveis de célula efeto- ra:célula-alvo (E:T). Poços adicionais contendo meio apenas (liberação espontânea, SR) ou uma solução a 1% de detergente triton-X 100 (li- beração total, TR) são também preparados. Após 4 horas de incuba- ção a 37 ºC, o sobrenadante de cada poço é coletado. O 51Cr liberado é, então, medido com o uso de um contador de partículas gama (Packard Instrument Co., Waltham, MA). Cada condição é realizada pelo menos em triplicado, e a percentagem de lise é calculada com o uso da fórmula: % de Lise = (ER - SR) / (TR — SR), em que ER repre- senta o 51Cr médio liberado para cada condição experimental. Alter- nativamente, a citotoxicidade também pode ser avaliada usando um Ensaio de Luciferase Bright-Glo'Y.

[00350] “Tecnologias de imagiologia podem ser usadas para avaliar o tráfego específico e a proliferação de CARs em modelos de animais portadores de tumor. Tais ensaios foram descritos, por exemplo, em Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011). Em resumo,

os camundongos NOD/SCID/yc""" (NSG) ou outros com imunodefici- ência receberam por injeção IV células de mieloma múltiplo seguidas de células CART de BCMA depois 7 dias 4 horas após eletroporação com os construtos CAR. As células T são transfectadas estavelmente com um construto lentiviral para expressar luciferase de vagalume, e os camundongos são visualizados quanto à bioluminescência. Alterna- tivamente, a eficácia e a especificidade terapêutica de uma única inje- ção de células T CAR* em modelo de xenoenxerto de mieloma múlti- plo podem ser medidas do modo seguinte: Os camundongos NSG re- cebem por injeção células de mieloma múltiplo transduzidas para ex- pressar estavelmente luciferase de vagalume, seguido por uma injeção única na veia da cauda de células T eletroporadas com o construto CAR de BCMA dias depois. Os animais são visualizados em vários momentos após a injeção. Por exemplo, podem ser gerados mapas térmicos de densidade de fótons de tumores positivos para luciferase de vagalume em camundongos representativos no dia 5 (2 dias antes do tratamento) e no dia 8 (24 horas após PBLs de CAR*).

[00351] —Alternativamente, ou em combinação com os métodos des- critos no presente documento, métodos e composições para um ou mais dentre: detecção e/ou quantificação de células que expressam CAR (por exemplo, in vitro ou in vivo (por exemplo, monitoramento clí- nico)); expansão e/ou ativação de célula imune; e/ou seleção específi- ca para CAR, que envolvem o uso de um ligante de CAR, são descri- tos. Em uma modalidade exemplificativa, o ligante de CAR é um anti- corpo que se liga à molécula de CAR, por exemplo, se liga ao domínio de ligação a antígeno extracelular de CAR (por exemplo, um anticorpo que se liga ao domínio de ligação a antígeno, por exemplo, um anti- corpo anti-idiotípico; ou um anticorpo que se liga a uma região cons- tante do domínio de ligação extracelular). Em outras modalidades, o ligante de CAR é uma molécula de antígeno de CAR (por exemplo,

uma molécula de antígeno de CAR conforme descrito no presente do- cumento).

[00352] Em um aspecto, um método para detectar e/ou quantificar células que expressam CAR é descrito. Por exemplo, o ligante de CAR pode ser usado para detectar e/ou quantificar células que expressam CAR in vitro ou in vivo (por exemplo, monitoramento clínico de células que expressam CAR em um paciente ou dosagem de um paciente). O método inclui: fornecer o ligante de CAR (opcionalmente, um ligante de CAR identificado, por exemplo, um ligante de CAR que inclui uma eti- queta, uma microesfera, uma identificação radioativa ou fluorescente); adquirir a célula que expressa CAR (por exemplo, adquirir uma amostra contendo células que expressam CAR, como uma amos- tra de fabricação ou uma amostra clínica); colocar a célula que expressa CAR em contato com o ligan- te de CAR sob condições em que a ligação ocorre, detectando, assim, o nível (por exemplo, a quantidade) das células que expressam CAR presentes. A ligação da célula que expressa CAR ao ligante de CAR pode ser detectada com o uso de técnicas-padrão, como FACS, ELISA e similares.

[00353] Em outro aspecto, é descrito um método para expandir e/ou ativar células (por exemplo, células imunoefetoras). O método inclui: fornecer uma célula que expressa CAR (por exemplo, uma primeira célula que expressa CAR ou uma célula de CAR de expres- são temporária); colocar a dita célula que expressa CAR em contato com um ligante de CAR (por exemplo, um ligante de CAR conforme descrito no presente documento), sob condições em que a proliferação e/ou ex- pansão de células imunes ocorrem, produzindo, assim, a população de células ativadas e/ou expandidas.

[00354] Em certas modalidades, o ligante de CAR está presente em um substrato (por exemplo, é imobilizado ou ligado a um substrato, por exemplo, um substrato de ocorrência não natural). Em algumas moda- lidades, o substrato é um substrato não celular. O substrato não celu- lar pode ser um suporte sólido escolhido dentre, por exemplo, uma placa (por exemplo, uma placa de microtitulação), uma membrana (por exemplo, uma membrana de nitrocelulose), uma matriz, um chip ou uma microesfera. Nas modalidades, o ligante de CAR está presente no substrato (por exemplo, na superfície de substrato). O ligante de CAR pode ser imobilizado, ligado ou associado covalente ou não covalen- temente (por exemplo, reticulado) ao substrato. Em uma modalidade, o ligante de CAR é ligado (por exemplo, covalentemente ligado) a uma microesfera. Nas modalidades anteriormente mencionadas, a popula- ção de células imunes pode ser expandida in vitro ou ex vivo. O méto- do pode incluir adicionalmente cultivar a população de células imunes na presença do ligante da molécula de CAR, por exemplo, com o uso de qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

[00355] Em outras modalidades, o método para expandir e/ou ativar as células compreende, ainda, a adição de uma segunda molécula es- timuladora, por exemplo, CD28. Por exemplo, o ligante de CAR e a segunda molécula estimuladora podem ser imobilizados a um substra- to, por exemplo, uma ou mais microesferas, fornecendo, assim, ex- pansão e/ou ativação de células aumentadas.

[00356] Em ainda outro aspecto, um método para selecionar ou en- riquecer uma célula que expressa CAR é fornecido. O método inclui colocar a célula que expressa CAR em contato com um ligante de CAR conforme descrito no presente documento; e selecionar a célula com base na ligação do ligante de CAR.

[00357] Em ainda outras modalidades, um método para depletar, reduzir e/ou exterminar uma célula que expressa CAR é fornecido. O método inclui colocar a célula que expressa CAR em contato com um ligante de CAR conforme descrito no presente documento; e alvejar a célula com base na ligação do ligante de CAR, reduzindo, assim, o número e/ou exterminando a célula que expressa CAR. Em uma mo- dalidade, o ligante de CAR é acoplado a um agente tóxico (por exem- plo, uma toxina ou um fármaco de ablação de célula). Em outra moda- lidade, o anticorpo anti-idiotípico pode causar atividade de célula efeto- ra, por exemplo, atividades de ADCC ou ADC.

[00358] Os anticorpos anti-cCAR exemplificativos que podem ser usados nos métodos descritos no presente documento são descritos, por exemplo, no documento nº WO 2014/190273 e por Jena et al., "Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials", PLOS março de 2013 8:3 e57838, cujo conteúdo está incorporado a título de referência. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-idiotípico reconhece uma molécula de anticorpo anti-CD19, por exemplo, um scFv anti- CD19. Por exemplo, a molécula de anticorpo anti-idiotípico pode com- petir pela ligação com o clone de mAb de CAR específico para CD19 nº 136,20,1 descrito em Jena et al., PLOS março de 2013 8:3 e57838; pode ter as mesmas CDRs (por exemplo, um ou mais dentre, por exemplo, todas dentre, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de CH, CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL, usando a definição de Ka- bat, a definição de Chothia, ou uma combinação das definições de Ka- bat e Chothia) como o clone de mAb de CAR específico para CD19 nº 136,20,1; pode ter uma ou mais regiões variáveis (por exemplo, 2) como o clone de mAb e CAR específico para CD19 nº 136,20,1, ou pode compreender o clone de mAb de CAR específico para CD19 nº 136,20,1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotípico foi pro- duzido de acordo com um método descrito em Jena et al. Em uma ou- tra modalidade, a molécula de anticorpo anti-idiotípico é uma molécula de anticorpo anti-idiotípico descrita no documento WO 2014/190273. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-idiotípico tem as mesmas CDRs (por exemplo, uma ou mais dentre, por exemplo, todas dentre, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de CH, CDR1 de VL, CDR?2 de VL e CDR3 de VL) como uma molécula de anticorpo do do- cumento WO 2014/190273 como 136,20,1; pode ter uma ou mais regi- ões variáveis (por exemplo, 2) de uma molécula de anticorpo do do- cumento WO 2014/190273, ou pode compreender uma molécula de anticorpo do documento WO 2014/190273 como 136,20,1. Em outras modalidades, o anticorpo anti-CAR se liga a uma região constante do domínio de ligação extracelular da molécula de CAR, por exemplo, conforme descrito no documento WO 2014/190273. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo anti-CAR se liga a uma região constante do domínio de ligação extracelular da molécula de CAR, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada (por exemplo, uma região de dobradiça de CH2-CH3) ou região constante de cadeia leve. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo anti-CAR compete pe- la ligação com o anticorpo monoclional 2D3 descrito no documento WO 2014/190273, tem as mesmas CDRs (por exemplo, uma ou mais den- tre, por exemplo, todas dentre, CDR1 de VH , CDR2 de VH, CDR3 de CH, CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL) que 2D3, ou tem uma ou mais (por exemplo, 2) regiões variáveis de 2D3, ou compreende 2D3 conforme descrito no documento WO 2014/190273.

[00359] Em alguns aspectos e modalidades, as composições e mé- todos no presente documento são otimizadas para um subconjunto específico de células T, por exemplo, conforme descrito no documento de número de série 62/031,699 depositado em 31 de julho de 2014, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento a título de re- ferência em sua totalidade. Em algumas modalidades, os subconjuntos otimizados de células T exibem uma persistência aumentada em com-

paração com uma célula T de controle, por exemplo, uma célula T de um tipo diferente (por exemplo, CD8* ou CD4*) que expressa o mesmo construto.

[00360] Em algumas modalidades, uma célula T CD4* compreende um CAR descrito no presente documento, tal CAR compreende um domínio de sinalização intracelular adequado para (por exemplo, oti- mizado para, por exemplo, levando à persistência aumentada em) uma célula T CD4*, por exemplo, um domínio ICOS. Em algumas modali- dades, uma célula T CD8* compreende um CAR descrito no presente documento, tal CAR compreende um domínio de sinalização intracelu- lar adequado para (por exemplo, otimizado para, por exemplo, levando à persistência aumentada de) uma célula T CD8*, por exemplo, um domínio de 4-1BB, um domínio de CD28, ou outro domínio coestimu- lador diferente de domínio ICOS. Em algumas modalidades, o CAR descrito no presente documento compreende um domínio de ligação a antígeno descrito no presente documento, por exemplo, um CAR que compreende um domínio de ligação a antígenos que alveja BCMA).

[00361] Em um aspecto, é descrito no presente documento um mé- todo para tratar um indivíduo, por exemplo, um indivíduo que tem cân- cer. O método inclui administrar ao dito indivíduo uma quantidade efi- caz de: 1) uma célula T CD4* que compreende um CAR (o CARCP**) que compreende:

[00362] Um domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, um do- mínio de ligação ao antígeno descrito no presente documento, por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno que alveja BCMA; um domínio transmembranar; e um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um primeiro domínio coestimulador, por exemplo, um domínio ICOS; e 2) uma célula T CD8* que compreende um CAR (o CARCºPº*)

que compreende:

[00363] “Um domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, um do- mínio de ligação ao antígeno descrito no presente documento, por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno que alveja BCMA; um domínio transmembranar; e um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um segundo domínio coestimulador, por exemplo, um domínio 4-1BB, um domínio CD28 ou outro domínio coestimulador diferente do domínio ICOS; em que o CARCºP** e o CARCP* diferem um do outro.

[00364] —Opcionalmente, o método inclui adicionalmente administrar: 3) uma segunda célula T CD8+ que compreende um CAR (o segundo CARCP8*) que compreende: Um domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, um do- mínio de ligação ao antígeno descrito no presente documento, por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno que se liga especifica- mente a BCMA; um domínio transmembranar; e um domínio de sinalização intracelular, em que o segundo CARCP* compreende um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um domínio de sinalização coestimulador, não presente no CARCºP* e, opcionalmente, não compreende um domínio de sinaliza- ção de ICOS.

[00365] Outros ensaios, inclusive aqueles que são conhecidos na técnica também podem ser usados para avaliar os construtos de CAR de BCMA da invenção.

Aplicação Terapêutica Doenças e/ou Distúrbios Associados a BCMA

[00366] Em um aspecto, a invenção apresenta métodos para tratar uma doença associada à expressão de BCMA. Em um aspecto, a in-

venção apresenta métodos para tratar uma doença em que parte do tumor é negativa para BCMA e parte do tumor é positiva para BCMA. Por exemplo, o CAR da invenção é útil para tratar indivíduos que são submetidos a tratamento de uma doença associada à expressão ele- vada de BCMA, em que o indivíduo foi submetido a tratamento com níveis elevados de BOCMA exibe uma doença associada a níveis ele- vados de BCMA. Nas modalidades, o CAR da invenção é útil para tra- tar indivíduos que foram submetidos a tratamento de uma doença as- sociada à expressão de BCMA, em que o indivíduo foi submetido a tratamento relacionado à expressão de BCMA exibe uma doença as- sociada à expressão de BCMA.

[00367] Em uma modalidade, a invenção apresenta métodos para tratar uma doença em que BCMA é expresso tanto em células normais como em células cancerígenas, porém é expresso em níveis mais bai- xos em células normais. Em uma modalidade, o método também com- preende selecionar um CAR da invenção que se liga com uma afinida- de que permite que o CAR de BCMA se ligue e extermine as células cancerígenas que expressam BCMA, porém menos do que 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou menos das células normais que expressam BCMA são exterminadas, por exemplo, como determinado por um en- saio descrito no presente documento. Por exemplo, pode ser usado um ensaio de extermínio como citometria de fluxo baseado em CTL de Cr51. Em uma modalidade, o CAR de BCMA tem um domínio de liga- ção a antígenos que tem uma afinidade de ligação KD de 10º M até 10º M, por exemplo, 10º M até 107 M, por exemplo, 10º M ou 107 M, para o antígeno-alvo. Em uma modalidade, o domínio de ligação a an- tígenos de BCMA tem uma afinidade de ligação que é pelo menos cin- co vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou 1 000 vezes menor do que a de um anticorpo de referência, por exemplo, um anticorpo descrito no presente documento.

[00368] Em um aspecto, a invenção diz respeito a um vetor com- preendendo um CAR de BCMA ligada de maneira funcional a um pro- motor para expressão em células imunoefetoras de mamífero, por exemplo, células T ou células NK. Em um aspecto, a invenção apre- senta uma célula imunoefetora recombinante, por exemplo, célula T ou célula NK, que expressa o CAR de BCMA para uso no tratamento de tumores que expressam BCMA, em que a célula imunoefetora recom- binante (por exemplo, célula T ou célula NK) que expressa o CAR de BCMA é denominada uma célula que expressa CAR de BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou NK que expressa CAR de BCMA). Em um aspecto, a célula que expressa CAR de BCMA (por exemplo, célula CART de BOCMA ou NK que expressa CAR de BCMA) da inven- ção pode colocar uma célula tumoral em contato com pelo menos um CAR de BCMA da invenção expresso em sua superfície, de modo que a célula que expressa CAR de BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou NK que expressa CAR de BCMA) alveje a célula tumoral, e o crescimento do tumor é inibido.

[00369] Em um aspecto, a invenção pertence a um método para inibir o crescimento de uma célula tumoral que expressa BCMA, que compreende colocar a célula tumoral em contato com uma célula que expressa CAR de BCMA (por exemplo, célula CART de BOCMA ou NK que expressa CAR de BCMA) da presente invenção, de modo que a célula que expressa CAR de BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou NK que expressa CAR de BCMA) seja ativada em resposta ao antígeno e alveje a célula de câncer, em que o crescimento do tu- mor é inibido.

[00370] Em um aspecto, a invenção diz respeito a um método de tratamento de câncer em um indivíduo. O método compreende admi- nistrar ao indivíduo uma célula que expressa CAR de BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou NK que expressa CAR de BCMA)

da presente invenção, de modo que o câncer seja tratado no indivíduo. Um exemplo de um câncer que é tratável pela célula que expressa CAR de BCMA (por exemplo, célula CART de BOCMA ou NK que ex- pressa CAR de BCMA) da invenção é um câncer associado à expres- são de BCMA.

[00371] A invenção inclui um tipo de terapia celular no qual células imunoefetoras (por exemplo, células T ou células NK) são genetica- mente modificadas para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR) e a célula que expressa CAR de BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou NK que expressa CAR de BCMA) é infundida em um receptor necessitado. A célula infundida é capaz de matar células tumorais no recebedor. Ao contrário de terapias com anticorpos, célu- las T modificadas com CAR, por exemplo, célula T ou células NK, são capazes de se replicar in vivo, resultando em persistência de longa duração que pode levar a controle tumoral sustentado. Em vários as- pectos, as células (por exemplo, célula T ou células NK) administradas ao paciente, ou sua progênie, persistem no paciente durante pelo me- nos quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, treze meses, qua- torze meses, quinze meses, dezesseis meses, dezessete meses, de- zoito meses, dezenove meses, vinte meses, vinte e um meses, vinte e dois meses, vinte e três meses, dois anos, três anos, quatro anos ou cinco anos após a administração da célula (por exemplo, célula T ou célula NK) ao paciente.

[00372] Ainvenção também inclui um tipo de terapia celular no qual células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK) são modificadas, por exemplo, por RNA transcrito in vitro, para expressa- rem de modo transiente um receptor de antígenos quimérico (CAR) e a célula imunoefetora (por exemplo, célula T ou célula NK) é infundida em um receptor necessitado. A célula infundida é capaz de matar célu-

las tumorais no recebedor. Assim, em vários aspectos, as células efe- toras imunes (por exemplo, células T ou células NK) administradas ao paciente estão presentes durante menos de um mês, por exemplo, três semanas, duas semanas, uma semana, após a administração da célula imunoefetora (por exemplo, célula T ou célula NK) ao paciente.

[00373] Sem se ater a qualquer teoria específica, a resposta de imunidade antitumoral induzida pelas células imunoefetoras modifica- das com CAR (por exemplo, células T ou células NK) pode ser uma resposta imunológica ativa ou passiva, ou alternativamente pode se dever a uma resposta imunológica direta versus indireta. Em um as- pecto, as células imunoefetoras transduzidas com CAR (por exemplo, células T ou células NK) exibem secreção de citocinas pró- inflamatórias específicas e atividade citolítica potente em resposta a células cancerígenas humanas que expressam o BCMA, resistem a inibição de BOCMA solúvel, medeiam a morte de espectadores e me- deiam a regressão de um tumor humano estabelecido. Por exemplo, células tumorais sem antígenos em um campo heterogêneo de tumor que expressa BCMA podem ser suscetíveis à destruição indireta por células imunoefetoras redirecionadas para BCMA (por exemplo, célu- las T ou células NK) que previamente reagiram contra células cancerí- genas positivas para antígenos adjacentes.

[00374] Em um aspecto, as células efetoras imunes modificadas com CAR totalmente humanas (por exemplo, células T ou células NK) da invenção podem ser um tipo de vacina para imunização ex vivo e/ou terapia in vivo em um mamífero. Em um aspecto, o mamífero é um humano.

[00375] No que se refere a imunização ex vivo, pelo menos um dos seguintes ocorre in vitro antes da administração da célula a um mamí- fero: i) expansão das células, ii) introdução nas células de um ácido nucleico codificando um CAR ou iii) crioconservação das células.

[00376] Procedimentos ex vivo são bem conhecidos na técnica e são discutidos mais completamente abaixo. Em resumo, células são isoladas de um mamífero (por exemplo, um humano) e geneticamente modificadas (isto é, transduzidas ou transfectadas in vitro) com um ve- tor expressando um CAR descrito no presente documento. A célula modificada com CAR pode ser administrada a um recebedor mamífero para proporcionar um benefício terapêutico. O recebedor mamífero pode ser um humano e a célula modificada com CAR pode ser autólo- ga relativamente ao recebedor. Alternativamente, as células podem ser alogeneicas, singeneicas ou xenogeneicas relativamente ao rece- bedor.

[00377] O procedimento para expansão ex vivo de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras é descrito na Patente U.S. nº 5,199,942, incorporada no presente documento por referência, e pode ser aplicado às células da presente invenção. Outros métodos ade- quados são conhecidos na técnica, consequentemente a presente in- venção não está limitada a qualquer método de expansão ex vivo par- ticular das células. Em resumo, cultura e expansão ex vivo de células T compreendem: (1) recolher células-tronco hematopoiéticas e proge- nitoras CD34+ de um mamífero a partir de recolha de sangue periféri- co ou explantes de medula óssea; e (2) expandir tais células ex vivo. Para além dos fatores de crescimento celular descritos na Pat. nº U.S. 5,199,942, outros fatores, tais como fIt3-L, IL-1, IL-3 e ligante de c-kit, podem ser usados para a cultura e expansão das células.

[00378] Para além do uso de uma vacina à base de células em ter- mos de imunização ex vivo, a presente invenção também proporciona composições e métodos para imunização in vivo para induzir uma res- posta imune dirigida contra um antígeno em um paciente.

[00379] Geralmente, as células ativadas e expandidas como des- crito no presente documento podem ser utilizadas no tratamento e prevenção de doenças que surgem em indivíduos que estão imu- nocomprometidos. Em particular, as células imunoefetoras modifica- das com CAR (por exemplo, células T ou células NK) da invenção são usadas no tratamento de doenças, distúrbios e condições associadas à expressão de BCMA. Em certos aspectos, as células da invenção são usadas no tratamento de pacientes em risco de desenvolver do- enças, distúrbios e condições associadas à expressão de BCMA. As- sim, a presente invenção fornece métodos para o tratamento ou pre- venção de doenças, distúrbios e condições associadas à expressão de BCMA que compreendem administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz das células imu- noefetoras modificadas com CAR (por exemplo, células T ou células NK) da invenção.

[00380] Em um aspecto, as células que expressam CAR (por exemplo, células CART ou células NK que expressam CAR) das in- venções podem ser usadas para tratar uma doença proliferativa, tal como um câncer ou malignidade, ou que é uma afecção pré-cancerosa tal como uma mielodisplasia, uma síndrome mielodisplásica ou uma pré-leucemia. Em um aspecto, o câncer é um câncer hematólico. As condições de câncer hematológico são os tipos de câncer como leu- cemia e condições linfoproliferativas malignas que afetam o sangue, a medula óssea e o sistema linfático. Em um aspecto, o câncer hemato- lógico é uma leucemia ou um hematológico. Um exemplo de uma do- ença ou distúrbio associado a BCMA é mieloma múltiplo (também co- nhecido como MM) (Consultar Claudio et al., Blood. 2002, 100(6): 2175-86; e Novak et al., Blood. 2004, 103(2):689-94). Mieloma múltiplo também conhecido como mieloma de células plasmáticas ou doença de Kahler, é um câncer caracterizado por um acúmulo de células B plasmáticas anormais ou malignas na medula óssea. Frequentemente, as células cancerígenas invadem ossos adjacentes, destroem as es-

truturas esqueléticas e resultam em dor e fraturas ósseas. A maioria dos casos de mieloma também apresenta a produção de uma parapro- teína (também conhecida como proteínas M ou proteínas do mieloma), que é uma imunoglobulina anormal produzida em excesso pela prolife- ração clonal das células plasmáticas malignas. Níveis séricos de para- proteína no sangue maiores que 30g/Il são diagnósticos de mieloma múltiplo, de acordo com os critérios diagnósticos do International Myeloma Working Group (IMWG) (Consultar, Kyle et al. (2009), Leuke- mia. 23:3-9). Outros sintomas ou sinais de mieloma múltiplo incluem função renal reduzida ou insuficiência renal, lesões ósseas, anemia, hipercalcemia e sintomas neurológicos.

[00381] Os critérios para distinguir mieloma múltiplo de outros dis- túrbios proliferativos de células plasmáticas foram estabelecidos pelo International Myeloma Working Group (Consultar Kyle et al. (2009), Leukemia. 23:3-9). Todos os três dos seguintes critérios devem ser cumpridos: - —Células plasmáticas clonais da medula óssea 2 10% - — Presença de proteína monoclonal sérica e/ou urinária (exceto em pacientes com mieloma múltiplo não secretor verdadeiro) - — Evidência de dano ao órgão-alvo atribuível ao distúrbio proliferativo das células plasmáticas subjacente, especificamente: o Hipercalcemia: cálcio sérico 2 11,5 mg/100 ml o Insuficiência renal: creatinina sérica > 1,73 mmol/l o Anemia: normocrômico, normocítico com um valor de hemoglobina > 2 g/100 ml abaixo do limite inferior de normalidade ou um valor de hemoglobina < 10 g/100ml o Lesões ósseas: lesões líticas, osteopenia severa ou fra- turas patológicas.

[00382] Outros distúrbios proliferativos de células plasmáticas que podem ser tratados pelas composições e métodos descritos no pre-

sente documento incluem, porém sem limitação, mieloma assintomáti- co (mieloma múltiplo latente ou mieloma indolente), gamapatia mono- clonal de importância indeterminada (MGUS), macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmacitomas (por exemplo, discrasia de células plas- máticas, mieloma solitário, plasmacitoma solitário, plasmacitoma ex- tramedular e plasmacitoma múltiplo), amiloidose de cadeia leve ami- loide sistêmica e síndrome de POEMS (também conhecido como sín- drome de Crow-Fukase, doença de Takatsuki e síndrome de PEP).

[00383] Dois sistemas de estadiamento são usados no estadiamen- to do mieloma múltiplo: o Sistema de Estadiamento Internacional (ISS) (Consultar Greipp et al. (2005), J. Clin. Oncol. 23 (15):3412-3420, in- corporado no presente documento a título de referência em sua totali- dade) e o sistema de Estadiamento de Durie-Salmon (DSS) (Consultar Durie et al. (1975), Cancer 36 (3): 842-854, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Os dois sistemas de estadiamento estão resumidos na tabela abaixo:

Tabela 4. Sistemas de estadiamento para o estadiamento de mieloma múltiplo Sistema de Estadiamento Internacional Sistema de Estadiamento de Durie-Salmon Sobrevivênci: mediana B 2M < 3,5 mg/l e albumina | 62 meses Todos os seguintes: IA: 62 meses sérica 2 3,5 g/dl Nível de hemoglobina > 10g/dl IB: 22 meses Cálcio sérico, normal ou < 12 mg/dl Raio x ósseo, normal ou apenas 1 plasmocitoma Baixa produção de proteína monoclonal (IgG < 5g/dl, IgA < 3g/dl, proteína de Bence Jones < 49g/dl por 24 horas Nem o estágio | nem o estágio | 44 meses Nem o estágio | nem o estágio Ill 1IA: 58 meses N mm 1IB: 354 meses o B2M 2 5,5 mg/l 29 meses Um ou mais dos seguintes: IA: 45 meses 3 Nível de hemoglobina > 8,5g/dl IIIB: 24 meses o Cálcio sérico, normal ou > 12 mg/dl Lesões osteolíticas avançadas Alta produção de proteína monoclional (I9G > 79/dl, IgA > 5g/dl, proteína de Bence Jones > 12g/dl por 24 horas *O sistema de Estadiamento de Durie-Salmon também inclui uma subclassificação que designa a situação da função renal.

A designação de "A" ou "B" é adicionada após o número do estágio, em que "A" indica função renal relativamen- te normal (valor de creatinina sérica < 2,0 mg/dl), e B indica função renal anormal (valor de creatinina sérica > 2,0 mg/dl).

[00384] Um terceiro sistema de estadiamento para mieloma múltiplo é chamado de Sistema de Estadiamento Internacional Revisado (R- ISS) (consultar Palumbo A, Avet-Loiseau H, Oliva S, et al. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 2015;33:2863-9, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). O R-ISS de estágio | inclui ISS de estágio | (nível sérico de B2-microglobulina < 3,5 mg/l e nível sérico de albumina > 3,5 g/dl), sem CA de alto risco [del(17p) e/ou t(4;14) e/ou t(14;16)], e nível de LDH normal (menor que o limite superior de faixa normal). O R-ISS de estágio Ill inclui ISS de estágio Ill (nível sérico de B2-microglobulina > 5,5 mg/l) e CA de alto risco ou alto nível de LDH. O R-ISS de estágio Il inclui todas as outras combinações possíveis.

[00385] A resposta de pacientes pode ser determinada com base nos critérios de IMWG 2016, conforme descrito em Kumar S, et al. In- ternational Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):e328-e346, incorporado no presente do- cumento a título de referência em sua totalidade. A Tabela 5 fornece os critérios de IMWG 2016 para avaliação de resposta.

Tabela 5. Critérios de IMWG para avaliação de resposta incluindo critérios para doença resposta mínima (MRD) E erários ge resposir O rDÔaaae Negativo para MRD sustentada Negatividade de MRD na medula (NGF ou NGS, ou ambos) e por imageamento con- forme definido abaixo, intervalo mínimo confirmado de 1 ano.

Avaliações subsequen- tes podem ser usadas para especificar adicionalmente a duração de negatividade (por exemplo, negativo para MRD em 5 anos)T Negativo para MRD de fluxo Ausência de células plasmáticas clonais fenotipicamente aberrantes por NGF*+ em as- pirados de medula óssea usando o procedimento de operação padrão EuroFlow para detecção de MRD em mieloma múltiplo (ou método equivalente validado) com uma NM sensibilidade mínima de 1 em 10º células nucleadas ou superior & Sequenciamento negativo para MRD Ausência de células plasmáticas clonais pelo NGS no aspirado de medula óssea em & que a presença de um clone é definida como menos de duas leituras de sequencia- mento idênticas obtidas após o sequenciamento de DNA de aspirados de medula ós- sea usando a plataforma LymphoSIGHT (ou método equivalente validado) com sensi- bilidade mínima de 1 em 10º células nucleadas$ ou superior Imageamento mais negativo para MRD | Negatividade para MRD definida por NGF ou NGS mais desaparecimento de todas as áreas de absorção aumentada de sinalizador encontradas na linha de base ou um PET/CT anterior ou redução para menos que SUV de acúmulo de sangue mediastinal ou redução para menos que aquele do tecido normal circundante Resposta completa restrita Resposta completa conforme definido abaixo mais razão de FLC normal** e ausência de células clonais na biópsia de medula óssea por imunoistoquímica (razão K/A < 4:1 ou 2 1:2 para o [pas xet ressecvamenio aptsaconagem a toocóvias pasátest — |

Resposta completa Imunofixação negativa no soro e urina e desaparecimento de quaisquer plasmocito- mas de tecido mole e < 5% de células plasmáticas em aspirados de medula óssea

Resposta parcial muito satisfatória Proteína M no soro e urina detectável por imunofixação, porém não por eletroforese ou redução 2 90% da proteína M no soro mais níveis de proteína M na urina < 100 mg por 24h

Resposta parcial 2 50% de redução de proteína M no soro mais redução de proteína M na urina em 24 h por 2 90% ou a < 200 mg por 24 h; Se a proteína M no soro e na urina for imensurável, uma redução 2 50% na diferença entre os níveis de FLC envolvidos e não envolvidos será necessária, em vez dos crité- Ns rios de proteína M; Ss Se a proteína M no soro e na urina for imensurável, e o teste com luz isento de soro o também for imensurável, uma redução 2 50% nas células plasmáticas será necessária em vez da proteína M, desde que a porcentagem de células plasmáticas da medula óssea de linha de base seja > 30%. Além desses critérios, se presente na linha de ba- se, uma redução 2 50% no tamanho (SPD) $$ de plasmocitomas de tecidos moles também é necessária

Resposta mínima 2 25%, porém < 49% de redução de proteína M no soro e redução de proteína M na urina em 24 h por 50 a 89%. Além dos critérios listados acima, se presente na linha de base, uma redução 2 50% no tamanho (SPD) $$ de plasmocitomas de tecidos moles também é necessária é melhor descrita, fornecendo as estimativas de tempo até a progressão.

Não cumpre os critérios de resposta completa, resposta parcial muito satisfatória, resposta parcial, resposta mínima ou doença progressiva

Doença progressiva 119, //|| Qualquer um ou mais dos seguintes critérios: Aumento de 25% a partir do valor de resposta mais baixo confirmado em um ou mais dos seguintes critérios: Proteína M no soro (o aumento absoluto deve ser > 0,5 g/dl); Aumento de proteína M no soro 2 1 g/dl, se o componente M mais baixo fosse > 5 g/dl; Proteína M na urina (o aumento absoluto deve ser > 200 mg/24 h); Em pacientes sem níveis mensuráveis de proteína M no soro e na urina, a diferença entre os níveis de FLC envolvidos e não envolvidos (o aumento absoluto deve ser > 10 DS mg/dl); Ss Em pacientes sem níveis mensuráveis de proteína M no soro e na urina e sem níveis 2 mensuráveis de FLC envolvidos, a porcentagem de células plasmáticas da medula óssea independentemente da situação de linha de base (o aumento absoluto deve ser 210%); Aparecimento de uma nova lesão(ões), = 50% de aumento de nadir em SPDSS de le- são > 1, ou aumento 2 50% no diâmetro mais longo de uma lesão anterior > 1 cm no eixo curto; Aumento 2 50% em células plasmáticas de circulação (mínimo de 200 células por ul) se esta for a única medição de doença

Recidiva clínica A recidiva clínica exige um ou mais dos seguintes critérios: Indicadores diretos de aumento da doença e/ou disfunção de órgãos-alvo (característi-

cas de CRAB) relacionados ao distúrbio proliferativo de células plasmáticas clonais subjacentes.

Não é usado no cálculo do tempo até a progressão ou sobrevida livre de progressão, porém é listado como algo que pode ser relatado opcionalmente ou para uso na prática clínica; Desenvolvimento de novos plasmocitomas de tecido mole ou lesões ósseas (fraturas osteoporóticas não constituem progressão); Aumento definido no tamanho de plasmocitomas ou lesões ósseas existentes.

Um aumento definido é definido como um aumento de 50% (e 2 1 cm) conforme medido serialmente pelo SPDSS da lesão mensurável; Hipercalcemia (> 11 mg/dl); Redução na hemoglobina > 2 g/dl não relacionada à terapia ou outras condições não Nm relacionadas a mieloma; s Aumento na creatinina sérica de 2 mg/dl ou mais a partir do início da terapia e atribuí- & vel a mieloma; Hiperviscosidade relacionada à paraproteína sérica

Recidiva de resposta completa (que | Qualquer um ou mais dos seguintes critérios:

será usada apenas se o desfecho for | Reaparecimento de proteína M no soro ou urina por imunofixação ou eletroforese;

sobrevida livre de doenças) Desenvolvimento de > 5% de células plasmáticas na medula óssea; Aparecimento de qualquer outro sinal de progressão (ou seja, novo plasmocitoma, le- são óssea lítica ou hipercalcemia, consultar acima)

Recidiva de negatividade para MRD | Qualquer um ou mais dos seguintes critérios:

(que será usada apenas se o desfecho | Perda de estado negativo para MRD (evidência de células plasmáticas clonais em for sobrevivência isenta de doenças) | NGF ou NGS, ou estudo de imageamento positivo para recorrência de mieloma);

Reaparecimento de proteína M no soro ou urina por imunofixação ou eletroforese; Desenvolvimento de > 5% de células plasmáticas clonais na medula óssea; Aparecimento de qualquer outro sinal de progressão (ou seja, novo plasmocitoma, le- são óssea lítica ou hipercalcemia) Para avaliação da MRD, o primeiro aspirado de medula óssea deve ser enviado à MRD (não para morfologia) e essa amostra deve ser coletada com um volume mínimo de 2 ml (para obter células suficientes), porém no máximo 4 a 5 ml para evitar hemo- diluição.

IMWG2=International Myeloma Working Group.

MRD=doença residual mínima.

NGF=fluxo de próxima geração.

NGS=sequenciamento de próxima geração.

FLC=cadeia leve livre.

Proteína M=Proteína do mieloma.

SPD=soma dos produtos dos diâmetros perpendiculares máximos de lesões medidas.

Características de CRAB =elevação de cálcio, insuficiência renal, anemia, lesões ósseas líticas.

FOM=citometria de fluxo.

SUVmax=valor de absorção padronizado máximo.

MFC=citometria de fluxo multiparâmetros. **F-FDG PET="ºF-fluorodesoxiglicose PET.

ASCT=transplante de células-tronco autólogas.

Nm *Todas as categorias de resposta requerem duas avaliações consecutivas feitas a qualquer momento antes de iniciar qualquer Sn nova terapia; para MRD não há a necessidade de duas avaliações consecutivas, porém informações sobre MRD após cada es- & tágio do tratamento são recomendadas (por exemplo, após indução, terapia com altas doses/ASCT, consolidação, manuten- ção). Os testes de MRD devem ser iniciados apenas no momento da suspeita de resposta completa.

Todas as categorias de resposta e MRD não exigem evidência conhecida de lesões ósseas progressivas ou novas se estudos radiográficos forem realizados.

Entretanto, estudos radiográficos não são necessários para cumprir esses requisitos de respos- ta, exceto o requisito de FDG PET, se um estado de imageamento negativo para MRD for relatado.

TNegatividade para MRD sustentada, quando relatada, também deve anotar o método usado (por exemplo, fluxo sustentado negativo para MRD, se- quenciamento sustentado negativo para MRD). tMFC da medula óssea deve seguir as diretrizes de NGF (Paiva B, Gutierrez NC, Rosinol L, et a/, Blood 2012; 119: 687-91). O método NGF de referência é uma abordagem de dois tubos de oito cores, que foi amplamente validada.

A abordagem de dois tubos melhora a confiabilidade, consistência e sensibilidade devido à aquisição de um número maior de células.

A tecnologia de oito cores está amplamente disponível globalmente e o método NGF já foi ado- tado em muitos laboratórios de fluxo em todo o mundo.

O método completo de oito cores é mais eficiente usando uma mistura liofilizada de anticorpos que reduz erros, tempo e custos. 5 milhões de células devem ser avaliadas.

O método FCM empregue deve ter uma sensibilidade de detecção de pelo menos 1 em 10º células plasmáticas.

O ensaio de sequenciamento de SDNA no aspirado de medula óssea deve usar um ensaio validado como LymphoSIGHT (Sequenta). 1JOs critérios usados por Zamagni e colegas (Zamagni E, Nanni C, Mancuso K, et al.

Clin Cancer Res 2015; 21: 4384-—90), e painel de especialistas (IMPetUs; Italian Myeloma criteria for PET Use) (Usmani SZ, Mitchell A, Waheed S, et a/. Blood 2013; 121: 1819—23; Nanni C, Zamagni E, Versari A, et al.

Eur J Nucl Med Mol Imaging 2015; 43: 414-21.). As lesões positivas de linha de base foram identificadas pela presença de áreas focais de absorção óssea aumentada, com ou sem lesão subjacente identificada por TC e presente em pelo menos duas fatias consecutivas.

Alternativamente, um SUVmax=2,5 dentro de áreas osteolíticas CT > 1 cm de tamanho, ou SU- Vmax=1,5 dentro de áreas osteolíticas CT < 1 cm de tamanho foi considerado positivo.

O imageamento deve ser realizado uma vez que a negatividade para MRD é determinada por MFC ou NGS. ||Derivado de critérios de resposta uniforme internacionais para mieloma múltiplo (Durie BG, Harousseau JL, Miguel JS, et al, Leukemia 2006; 20: 1467-73). Definição de resposta menor e clarificações derivadas de Rajkumar e colegas (Rajkumar SV, Harousseau JL, Durie B, et a/, Blood 2011; 117: 4691-95). Quan- s do o único método para medir a doença é realizado por níveis séricos de FLC: a resposta completa pode ser definida como uma 38 razão normal de FLC de 0,26 a 1,65, além dos critérios de resposta completa listados anteriormente.

Uma resposta parcial mui- 2 to satisfatória nesses pacientes exige uma redução 2 90% na diferença entre os níveis de FLC envolvidos e não envolvidos.

Todas as categorias de resposta exigem duas avaliações consecutivas feitas a qualquer momento antes da instituição de qual- quer nova terapia; todas as categorias também não requerem evidência conhecida de lesões ósseas progressivas ou novas ou plasmocitomas extramedulares se estudos radiográficos forem realizados.

Não são necessários estudos radiográficos para sa- tisfazer esses requisitos de resposta.

As avaliações de medula óssea não precisam ser confirmadas.

Cada categoria, exceto para doença estável, será considerada não confirmada até que o teste confirmatório seja realizado.

A data do teste inicial é considerada como a data de resposta para avaliação de resultados dependentes do tempo como a duração da resposta. **Todas as recomendações referentes a usos clínicos relacionados aos níveis séricos de FLC ou razão de FLC são baseadas nos resultados obtidos com o teste Freelite validado (Binding Site, Birmingham, UK). TTA presença/ausência de células clonais em imunoistoquímica baseia-se na razão K/Ml.

Uma razão anormal K/A por imunoistoquímica exige um mínimo de 100 células plasmáticas para análise. Uma razão anormal que reflete a presença de um clone anormal é K/A de > 4:1 ou < 1:2. H+fYAtenção especial deve ser dada ao surgimento de uma proteína monoclonal diferente após o tratamento, especialmente no cenário de pacientes que obtiveram uma resposta completa convencional, frequentemente relacionada à reconstituição oligoclonal do sis- tema imunológico. Essas bandas geralmente desaparecem com o tempo e, em alguns estudos, foram associadas a um melhor resultado. Além disso, o aparecimento de k em IgG monoclonal em pacientes que recebem anticorpos monoclonais deve ser diferenciado do anticorpo terapêutico. SSAs medições de plasmocitoma devem ser realizadas a partir da porção CT das varre- duras de PET/CT ou MRI, ou varreduras de TC dedicadas, quando aplicável. Para pacientes com apenas envolvimento cutâ- neo, as lesões cutâneas devem ser medidas com uma régua. A medição de tamanho de tumor será determinada pela SPD.

A imunofixação positiva individualmente em um paciente anteriormente classificado como obtendo uma resposta completa não será considerada progressão. Para propósitos de cálculo do tempo até a progressão e sobrevida isenta de progressão, os paci- entes que obtiveram uma resposta completa e são negativos para MRD devem ser avaliados usando os critérios listados para doença progressiva. Os critérios para recidiva de uma resposta completa ou recidiva de MRD devem ser usados apenas no cál- à culo da sobrevida livre de doença. ||||No caso em que um valor é considerado um resultado falso por critério médico (por exem- Ss plo, um possível erro de laboratório), esse valor não será considerado ao determinar o valor mais baixo. =

[00386] O tratamento padrão para mieloma múltiplo e doenças as- sociadas inclui quimioterapia, transplante de células-tronco (autólogas ou alogênicas), radioterapia e outras terapias medicamentosas. Os fármacos antimieloma frequentemente usados incluem agentes alqui- lantes (por exemplo, bendamustina, ciclofosfamida e melfalano), inibi- dores de proteassoma (por exemplo, bortezomibe), corticosteroides (por exemplo, dexametasona e prednisona) e imunomoduladores (por exemplo, talidomida e lenalidomida ou Revlimid&) ou qualquer combi- nação dos mesmos. Os fármacos com bifosfonato também são fre- quentemente administrados em combinação com os tratamentos anti- MM padrão para evitar a perda óssea. Pacientes com idade entre 65 e 70 anos são candidatos improváveis para o transplante de células- tronco. Em alguns casos, transplantes autólogos duplos de células- tronco são opções para pacientes com menos de 60 anos de idade com resposta abaixo do ideal ao primeiro transplante. As composições e métodos da presente invenção podem ser administrados em combi- nação com qualquer um dos tratamentos atualmente prescritos para mieloma múltiplo.

[00387] A primeira fase de tratamento para mieloma múltiplo é tera- pia de indução. O objetivo da terapia de indução é reduzir o número de células plasmáticas na medula óssea e as moléculas (por exemplo, proteínas) produzidas pelas células plasmáticas. A terapia de indução geralmente compreende uma combinação de 2 ou 3 dos seguintes ti- pos de fármacos: terapia direcionada, quimioterapia ou corticosteroi- des. Terapia de indução para pacientes que podem ser submetidos a um transplante de células-tronco

[00388] Os pacientes submetidos a um transplante de células- tronco geralmente têm 70 anos ou menos e geralmente têm boa saú- de. Os pacientes podem ser submetidos à terapia de indução seguida de quimioterapia em altas doses e transplante de células-tronco. A te- rapia de indução é geralmente administrada em vários ciclos e pode incluir um ou mais dos seguintes fármacos: Regime de CyBorD -— ciclo- fosfamida (Cytoxan, Procytox), bortezomibe (Velcade) e dexametaso- na (Decadron, Dexasone); regime de VRD — bortezomibe, lenalidomi- da (Revlimid) e dexametasona; talidomida (Thalomid) e dexametaso- na; lenalidomida e dexametasona em baixa dose; bortezomibe e de- xametasona; regime de VTD — bortezomibe, talidomida e dexametaso- na; bortezomibe, ciclofosfamida e prednisona; bortezomibe, doxorrubi- cina (Adriamycin) e dexametasona; dexametasona; ou doxorrubicina lipossomal (Caelyx, Doxil), vincristina (Oncovin) e dexametasona Terapia de indução para pacientes que não podem ser submetidos a um transplante de células-tronco

[00389] Os pacientes que não podem ser submetidos a um trans- plante de células-tronco podem ter ser submetidos à terapia de indu- ção usando um ou mais dos seguintes fármacos: Regime de CyBorD — ciclofosfamida, bortezomibe e dexametasona; lenalidomida (Revlimid) e dexametasona em baixa dose; regime de MPT — melfalano, predni- sona e talidomida; regime de VMP — bortezomibe, melfalano e predni- sona; regime de MPL — melfalano, prednisona e lenalidomida; melfala- no e prednisona; bortezomibe e dexametasona; dexametasona; doxor- rubicina lipossomal, vincristina e dexametasona; talidomida e dexame- tasona; regime de VAD -— vincristina, doxorrubicina e dexametasona; ou regime de VRD — bortezomibe, lenalidomida e dexametasona.

[00390] “Um outro exemplo de uma doença ou distúrbio associado a BCMA é linfoma de Hodgkin e linfoma não Hodgkin (Consultar Chiu et al., Blood. 2007, 109(2):729-39; He et al., J Immunol. 2004, 172(5): 3268-79).

[00391] —Olinfoma de Hodgkin (HL), também conhecido como doen- ça de Hodgkin, é um câncer do sistema linfático que se origina de gló-

bulos brancos ou leucócitos. As células anormais que compreendem o linfoma são chamadas de células de Reed-Sternberg. No linfoma de Hodgkin, o câncer se espalha de um grupo de linfonodos para outro. O linfoma de Hodgkin pode ser subclassificado em quatro subtipos pato- lógicos com base na morfologia de células de Reed-Sternberg e na composição celular em torno das células de Reed-Sternberg (confor- me determinado por biópsia de linfonodo): HL esclerosante nodular, subtipo de celularidade mista, rico em linfócitos ou predominância de linfócitos, depleção linfocitária. Alguns linfomas de Hodgkin também podem ser linfoma de Hodgkin predominante em linfócitos nodulares ou podem ser não especificados. Os sintomas e sinais do linfoma de Hodgkin incluem inchaço indolor nos linfonodos do pescoço, axilas ou virilha, febre, sudorese noturna, perda de peso, fadiga, prurido ou dor abdominal.

[00392] O linfoma não Hodgkin (NHL) compreende um grupo diver- so de cânceres sanguíneos que incluem qualquer tipo de linfoma exce- to linfoma de Hodgkin. Os subtipos de linfoma não Hodgkin são classi- ficados principalmente por morfologia celular, aberrações cromossômi- cas e marcadores de superfície. Os subtipos de NHL (ou cânceres as- sociados a NHL) incluem linfomas de células B, como, porém sem limi- tação, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crônica de células B (B- CLL), leucemia prolinfocítica de células B (B-PLL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) (por exemplo, linfoma intravascular de grandes células B e linfoma primário de células B mediastinal), linfoma folicular (por exemplo, linfoma do centro folicular, célula pequena clivada folicular), leucemia de células ciliadas, linfoma de células B de alto grau (semelhante a Burkitt), lin- foma linfoplasmocítico (macroglobulinemia de Waldenstrom), linfoma de células do manto, linfomas de células B da zona marginal (por exemplo, linfoma de células B da zona marginal extranodal ou linfoma de tecido linfoide associado à mucosa (MALT), linfoma de células B da zona marginal nodal e linfoma de células B esplênicas da zona margi- nal), plasmocitoma/mieloma, leucemia/linfoma linfoblástico precursor B (PB-LBL/L), linfoma do sistema nervoso central primário (SNC), linfo- ma intraocular primário, linfoma linfocítico pequeno (SLL); e linfomas de células T, como, porém sem limitação, linfoma anaplásico de gran- des células (ALCL), linfoma/leucemia de células T adultas (por exem- plo, latente, crônico, agudo e linfomatoso), linfoma angiocêntrico, lin- foma de células T angioimunoblástico, linfomas cutâneos de células T (por exemplo, micose fungoide, síndrome de Sezary, etc.), linfoma de células exterminadoras naturais/T (tipo nasal), linfoma de células T in- testinal do tipo enteropatia, leucemia de grandes linfócitos granulares, linfoma/leucemia linfoblástico T precursor (T-LBL / L ), leucemia linfocí- tica crônica de células T/leucemia prolinfocítica (T-CLL/PLL) e linfoma de células T periféricas não especificado. Os sintomas e sinais do lin- foma de Hodgkin incluem inchaço indolor nos linfonodos do pescoço, axilas ou virilha, febre, sudorese noturna, perda de peso, fadiga, pruri- do, dor abdominal, tosse ou dor no peito.

[00393] O estadiamento é o mesmo para o linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin e refere-se à extensão do espalhamento das células can- cerígenas no corpo. No estágio |, as células do linfoma estão em um grupo de linfonodos. No estágio Il, as células do linfoma estão presen- tes em pelo menos dois grupos de linfonodos, porém ambos os grupos estão no mesmo lado do diafragma, ou em uma parte de um tecido ou órgão e os linfonodos próximos a esse órgão no mesmo lado do dia- fragma. No estágio Ill, as células do linfoma estão nos linfonodos em ambos os lados do diafragma, ou em uma parte de um tecido ou órgão próximo a esses grupos de linfonodos ou no baço. No estágio |V, as células do linfoma são encontradas em várias partes de pelo menos um órgão ou tecido, ou as células do linfoma estão em um órgão e nos linfonodos do outro lado do diafragma. Além da designação do estadi- amento em números romanos, os estágios também podem ser descri- tos pelas letras A, B/ Ee S, em que A se refere a pacientes sem sin- tomas, B se refere a pacientes com sintomas, E se refere a pacientes em que o linfoma é encontrado em tecidos fora do sistema linfático e S se refere a pacientes em que o linfoma é encontrado no baço.

[00394] O linfoma de Hodgkin é comumente tratado com radiotera- pia, quimioterapia ou transplante de célula-tronco hematopoiéticas. À terapia mais comum para linfoma não Hodgkin é R-CHOP, que consis- te em quatro quimioterapias diferentes (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prenisolona) e rituximabe (RituxanO). Outras terapias co- mumente usadas para tratar o NHL incluem outros agentes quimiote- rapêuticos, radioterapia, transplante de células-tronco (transplante au- tólogo ou alogênico de medula óssea) ou terapia biológica, como imu- noterapia. Outros exemplos de agentes terapêuticos biológicos inclu- em, porém sem limitação, rituximabe (RituxanO), tositumomabe (BexxarO), epratuzumabe (LymphoCideO) e alemtuzumabe (Mab- CampathO). As composições e métodos da presente invenção podem ser administrados em combinação com qualquer um dos tratamentos atualmente prescritos para linfoma de Hodgkin ou linfoma não Hod- gkin.

[00395] A expressão de BCMA também foi associada à macroglo- bulinemia de Waldenstrom (WM), também conhecida como linfoma linfoplasmocítico (LPL). (Consultar Elsawa et al., Blood. 2006, 107(7): 2882-8). A macroglobulinemia de Waldenstrom foi anteriormente con- siderada relacionada ao mieloma múltiplo, porém mais recentemente foi classificada como um subtipo de linfoma não-Hodgkin. A WM é ca- racterizada pela proliferação descontrolada de linfócitos de células B, resultando em anemia e produção de quantidades excessivas de pa- raproteína ou imunoglobulina M (IgM), que espessa o sangue e resulta em síndrome de hiperviscosidade. Outros sintomas ou sinais de WM incluem febre, sudorese noturna, fadiga, anemia, perda de peso, linfa- denopatia ou esplenomegalia, visão turva, tontura, sangramento nasal, sangramento gengival, hematomas incomuns, disfunção ou insuficiên- cia renal, amiloidose ou neuropatia periférica.

[00396] O tratamento padrão de WM consiste em quimioterapia, especificamente com rituximabe (RituxanO&). Outros fármacos quimio- terápicos podem ser usados em combinação, como clorambucila (LeukeranO), ciclofosfamida (Neosar&), fludarabina (FludaraO), cladri- bina (LeustatinO), vincristina e/ou talidomida. Corticosteroides, como prednisona, também podem ser administrados em combinação com a quimioterapia. A plasmaférese, ou troca plasmática, é comumente usada durante o tratamento do paciente para aliviar alguns sintomas, removendo a paraproteína do sangue. Em alguns casos, o transplante de células-tronco é uma opção para alguns pacientes.

[00397] “Um outro exemplo de uma doença ou distúrbio associado a BCMA é câncer no cérebro. Especificamente, a expressão de BCMA foi associada a astrocitoma ou glioblastoma (Consultar Deshayes et al, Oncogene. 2004, 23(17):3005-12, Pelekanou et al., PLoS One. 2013, 8(12):283250). Astrocitomas são tumores que surgem de astrócitos, que são um tipo de célula glial no cérebro. O glioblastoma (também conhecido como glioblastoma multiforme ou GBM) é a forma mais ma- ligna de astrocitoma e é considerado o estágio mais avançado de cân- cer no cérebro (estágio IV). Há duas variantes de glioblastoma: glioblastoma de células gigantes e gliossarcoma. Outros astrocitomas incluem astrocitoma pilocítico juvenil (JPA), astrocitoma fibrilar, xantro- astrocitoma pleomórfico (PXA), tumor neuroepitelial desembrioplásico (DNET) e astrocitoma anaplásico (AA).

[00398] Os sintomas ou sinais associados ao glioblastoma ou as- trocitoma incluem aumento da pressão no cérebro, dores de cabeça,

convulsões, perda de memória, alterações de comportamento, perda de movimento ou sensação de um lado do corpo, disfunção da lingua- gem, comprometimento cognitivo, comprometimento visual, náusea, vômito e fraqueza nos braços ou pernas.

[00399] A remoção cirúrgica do tumor (ou ressecção) é o tratamen- to padrão para a remoção do máximo de glioma possível, sem danifi- car ou com danos mínimos ao cérebro circundante normal. A terapia de radiação e/ou quimioterapia são frequentemente usadas após a ci- rurgia para suprimir e retardar a doença recorrente de quaisquer célu- las cancerígenas remanescentes ou lesões satélites. A radioterapia inclui radioterapia no cérebro inteiro (radiação por feixe externo con- vencional), radioterapia conformal tridimensional direcionada e radio- nuclídeos direcionados. Os agentes quimioterápicos comumente usa- dos para tratar o glioblastoma incluem temozolomida, gefitinibe ou er- lotinibe e cisplatina. Inibidores da angiogênese, como o Bevacizumabe (Avastin&O), também são comumente usados em combinação com quimioterapia e/ou radioterapia.

[00400] O tratamento de apoio também é frequentemente usado para aliviar sintomas neurológicos e melhorar a função neurológica e é administrado em combinação com qualquer uma das terapias para câncer descritas no presente documento. Os agentes de apoio primá- rios incluem anticonvulsivos e corticosteroides. Dessa forma, as com- posições e métodos da presente invenção podem ser usados em combinação com qualquer um dos tratamentos padrão ou de apoio para tratar um glioblastoma ou astrocitoma.

[00401] As doenças e distúrbios não relacionados ao câncer asso- ciados à expressão de BCMA também podem ser tratados pelas com- posições e métodos descritos no presente documento. Exemplos de doenças e distúrbios não relacionados a câncer associados à expres- são de BCMA incluem, porém sem limitação: infecções virais; por exemplo, HIV, infecções fúngicas, por exemplo, C. neoformans; doen- ça do intestino irritável; colite ulcerativa, e distúrbios relacionados à imunidade da mucosa.

[00402] As células efetoras imunes (por exemplo, células T ou célu- las NK) modificadas com CAR da presente invenção podem ser admi- nistradas isoladamente ou como uma composição farmacêutica em combinação com diluentes e/ou com outros componentes tais como |IL- 2 ou outras citocinas ou populações de células.

[00403] A presente invenção proporciona composições e métodos para o tratamento de câncer. Em um aspecto, o câncer é um câncer hematológico, incluindo, mas não se limitando a, o câncer hematológi- co é uma leucemia ou um linfoma. Em um aspecto, as células que ex- pressam CAR (por exemplo, células CART ou células NK que expres- sam CAR) da invenção podem ser usadas para tratar cânceres e ma- lignidades tais como, mas não se limitando a, por exemplo, leucemias agudas incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, leucemia lin- foide aguda de células B ("BALL"), leucemia linfoide aguda de células T ("TALL"), leucemia linfoide aguda (ALL); uma ou mais leucemias crônicas incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, leucemia mielógena crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL); cânceres hematológicos ou afecções hematológicas adicionais incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, leucemia pró-linfocítica de células B, neoplasma blástico de células dendríticas plasmacitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de grandes células B, Linfoma folicular, Leuce- mia de células pilosas, linfoma folicular de pequenas células ou gran- des células, afecções linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfo- ma de células do manto, Linfoma da zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma não de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de células dendríticas plasmacitoi- des, macroglobulinemia de Waldenstrom e "pré-leucemia" que são um conjunto diversificado de afecções hematológicas unidas pela produ- ção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides e similares. Além disso, uma doença associada à expressão de BCMA inclui, po- rém sem limitação, por exemplo, cânceres atípicos e/ou não clássicos, malignidades, afecções pré-cancerosas ou doenças proliferativas que expressam BCMA.

[00404] Nas modalidades, uma composição descrita no presente documento pode ser usada para tratar uma doença incluindo, porém sem limitação, um distúrbio proliferativo de células plasmáticas, por exemplo, mieloma assintomático (mieloma múltiplo assintomático ou mieloma indolente), gamapatia monoclonal de importância indetermi- nada (MGUS), macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmacitomas (por exemplo, discrasia de células plasmáticas, mieloma solitário, plasmacitoma solitário, plasmacitoma extramedular e plasmacitoma múltiplo), amiloidose de cadeia leve amiloide sistêmica e síndrome de POEMS (também conhecido como síndrome de Crow-Fukase, doença de Takatsuki e síndrome de PEP).

[00405] Nas modalidades, uma composição descrita no presente documento pode ser usada para tratar uma doença incluindo, porém sem limitação, um câncer, por exemplo, um câncer descrito no presen- te documento, por exemplo, um câncer de próstata (por exemplo, cân- cer de próstata resistente à castração ou resistente à terapia, ou cân- cer de próstata metastático), câncer de pâncreas ou câncer de pul- mão.

[00406] A presente invenção também fornece métodos para inibir a proliferação ou reduzir uma população de células que expressam BCMA, sendo que os métodos compreendem colocar uma população de células que compreende uma célula que expressa BCMA em conta- to com uma célula que expressa CAR de BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou célula NK que expressa CAR de BCMA) da inven-

ção que se liga à célula que expressa BCMA. Em um aspecto especí- fico, a presente invenção fornece métodos para inibir a proliferação ou reduzir a população de células cancerígenas que expressam BCMA, sendo que os métodos compreendem colocar a população de células cancerígenas que expressam BCMA em contato com uma célula que expressa CAR anti-BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou célula NK que expressa CAR de BCMA) da invenção que se liga à cé- lula que expressa BCMA. Em um aspecto, a presente invenção forne- ce métodos para inibir a proliferação ou reduzir a população de células cancerígenas que expressam BCMA, sendo que os métodos compre- endem colocar a população de células cancerígenas que expressam BCMA em contato com uma célula que expressa CAR anti-BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou célula NK que expressa CAR de BCMA) da invenção que se liga à célula que expressa BCMA. Em de- terminados aspectos, a célula que expressa CAR anti-BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou célula NK que expressa CAR de BCMA) da invenção reduz a quantidade, o número ou porcentagem de células e/ou células cancerígenas em pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 65%, pelo me- nos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em um indivíduo com ou modelo animal para leucemia mieloide ou outro câncer associado às células que expressam BCMA em relação a um controle negativo. Em um aspecto, o indivíduo é um humano.

[00407] A presente invenção também fornece métodos para preve- nir, tratar e/ou gerenciar uma doença associada às células que ex- pressam BCMA (por exemplo, um câncer hematológico ou câncer atí- pico que expressa BCMA), em que os métodos compreendem admi- nistrar a um indivíduo em necessidade uma célula que expressa CAR anti-BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou célula NK que ex- pressa CAR de BCMA) da invenção que se liga à célula que expressa

BCMA. Em um aspecto, o indivíduo é um ser humano. Exemplos não limitadores de distúrbios associados a células que expressam BCMA incluem infecções virais ou fúngicas, e distúrbios relacionados à imu- nidade mucosal.

[00408] A presente invenção também fornece métodos para preve- nir, tratar e/ou gerenciar uma doença associada às células que ex- pressam BCMA, sendo que os métodos compreendem administrar a um indivíduo em necessidade uma célula que expressa CAR anti- BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou célula NK que expres- sa CAR de BCMA) da invenção que se liga à célula que expressa BCMA. Em um aspecto, o indivíduo é um humano.

[00409] A presente invenção fornece métodos para prevenir a reci- diva de câncer associada às células que expressam BCMA, sendo que os métodos compreendem administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma célula que expressa CAR anti-BCMA da invenção que se liga à célula que expressa BCMA. Em um aspecto, os métodos com- preendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma cé- lula que expressa CAR anti-BCMA (por exemplo, célula CART de BCMA ou célula NK que expressa CAR de BCMA) descrita no presen- te documento que se liga à célula que expressa BCMA em combina- ção com uma quantidade eficaz de outra terapia. Métodos de uso de Biomarcadores para Avaliar a Eficácia de CAR, Adequabilidade do Indivíduo ou Adequabilidade da Amostra

[00410] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de avaliar ou monitorar a eficácia de uma terapia com células que expres- sam CAR (por exemplo, uma terapia com CAR de BCMA), em um in- divíduo (por exemplo, um indivíduo portador de um câncer, por exem- plo, um câncer hematológico), ou a adequabilidade de uma amostra (por exemplo, uma amostra de aférese) para uma terapia com CAR (por exemplo, uma terapia com CAR de BCMA). O método inclui ad-

quirir um valor de eficácia para a terapia com CAR, adequabilidade do indivíduo ou adequabilidade da amostra, em que o dito valor é indicati- vo da eficácia ou adequabilidade da terapia com células que expres- sam CAR.

[00411] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, a terapia com células que expres- sam CAR compreende uma pluralidade (por exemplo, uma população) de células imunoefetoras que expressam CAR, por exemplo, uma plu- ralidade (por exemplo, uma população) de células T ou células NK, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a terapia com células que expressam CAR é uma terapia com BCMACAR.

[00412] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o indivíduo é avaliado antes de re- ceber, durante ou após receber, a terapia com células que expressam CAR.

[00413] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, um respondedor (por exemplo, um respondedor completo) tem, ou é identificado como tendo, um maior nível ou atividade de um, dois ou mais (todos) dentre GZMK, PPF1BP2, ou células T naive em comparação com um não respondedor.

[00414] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, um não respondedor tem, ou é iden- tificado como tendo, um maior nível ou atividade de uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais (por exemplo, todas) dentre 1122, IL- 2RA, 1L-21, IRF8, IL8, CCL17, CCL22, células T efetoras ou células T reguladoras, em comparação com um respondedor.

[00415] Em uma modalidade, um recidivador é um paciente que tem, ou que é identificado como tendo, um nível de expressão aumen- tado de um ou mais dentre (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos dentre) os seguintes genes, em comparação com não recidivadores: MIR1I99A1,

MIR1203, uc0210vp, ITM2C e HLA-DQB1 e/ou níveis de expressão reduzidos de um ou mais dentre (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou todos dentre) os seguintes genes, em comparação com não recidiva- dores: PPIAL4D, TTITY10, TXLNG2P, MIR4650-1, KDM5D, USP9Y, PRKY, RPS4Y2, RPS4Y1, NCRNAOO0185, SULT1IE1 e EIFIAY.

[00416] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, um não respondedor tem, ou é iden- tificado como tendo, uma porcentagem mais alta de um marcador de exaustão de células imunes, por exemplo, um, dois ou mais inibidores de ponto de verificação imunes (por exemplo, PD-1, PD-L1, TIM-3 e/ou LAG-3). Em uma modalidade, um não respondedor tem, ou é identifi- cado como tendo, uma porcentagem mais alta de células imunoefeto- ras que expressam PD-1, PD-L1 ou LAG-3 (por exemplo, células T CD4+ e/ou células T CD8+) (por exemplo, células T CD4+ e/ou células T CD8+ que expressam CAR) em comparação com a porcentagem de células imunoefetoras que expressam PD-1 ou LAG-3 de um respon- dedor.

[00417] Em uma modalidade, um não respondedor tem, ou é identi- ficado como tendo, uma porcentagem mais alta de células imunes com um fenótipo esgotado, por exemplo, células imunes que coexpressam pelo menos dois marcadores de exaustão, por exemplo, coexpressam PD-1, PD-L1 e/ou TIM-3. Em outras modalidades, um não responde- dor tem, ou é identificado como tendo, uma porcentagem mais alta de células imunes com um fenótipo esgotado, por exemplo, células imu- nes que coexpressam pelo menos dois marcadores de exaustão, por exemplo, coexpressam PD-1 e LAG-3.

[00418] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, um não respondedor tem, ou é iden- tificado como tendo, uma porcentagem mais alta de células PD-1/ PD- L1+/LAG-3+ na população de células que expressam CAR (por exem-

plo, uma população de células BOMACAR+) em comparação com um respondedor (por exemplo, um respondedor completo) à terapia com células que expressam CAR.

[00419] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, um respondedor parcial tem, ou é identificado como tendo, uma porcentagem mais alta de células PD-1/ PD-L1+/LAG-3+ do que um respondedor, na população de células que expressa CAR (por exemplo, uma população de células BCMACAR+).

[00420] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, um não respondedor tem, ou é iden- tificado como tendo, um fenótipo esgotado de PD1/ PD-L1+ CAR+ e coexpressão de LAG3 na população de células que expressam CAR (por exemplo, uma população de células BCOMACAR +).

[00421] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, um não respondedor tem, ou é iden- tificado como tendo, uma porcentagem mais alta de células PD-1/ PD- L1+/TIM-3+ na população de células que expressam CAR (por exem- plo, uma população de células BCOMACAR+) em comparação com o respondedor (por exemplo, um respondedor completo).

[00422] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, um respondedor parcial tem, ou é identificado como tendo, uma porcentagem mais alta de células PD-1/ PD-L1+/TIM-3+ do que respondedores, na população de células que expressa CAR (por exemplo, uma população de células BCMACAR+).

[00423] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, a presença de células T CD8+ CD27+ CD45RO- em uma amostra de aférese é um preditor positivo da resposta do indivíduo a uma terapia com células que expressam CAR (por exemplo, uma terapia com BCMACAR).

[00424] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, uma alta porcentagem de células T PD1+ CAR+ e LAG3+ ou TIM3+ em uma amostra de aférese é um preditor de prognóstico insatisfatório da resposta do indivíduo a uma terapia com células que expressam CAR (por exemplo, uma terapia com BCMACAR).

[00425] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o respondedor (por exemplo, o res- pondedor completo ou parcial) tem um, dois, três ou mais (ou todos) dos seguintes perfis: (i) tem um número maior de células imunoefetoras CD27+ em compa- ração com um valor de referência, por exemplo, um número não res- pondedor de células imunoefetoras CD27+; (ii) (1) tem um número maior de células T CD8+ em comparação com um valor de referência, por exemplo, um número não respondedor de células T CD8+; (iii) tem um número menor de células imunes que expressam um ou mais inibidores de ponto de verificação, por exemplo, um inibidor de ponto de verificação selecionado dentre PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 ou KLRG-1, ou em uma combinação, em comparação com um valor de referência, por exemplo, um número não respondedor de células que expressam um ou mais inibidores de ponto de verificação; ou (iv) tem um número maior de uma, duas, três, quatro ou mais (todas) células Terr em repouso, células Tree em repouso, células CD4 naive, células de memória não-estimuladas ou células T de memória iniciais, ou uma combinação dos mesmos, em comparação com um valor de referência, por exemplo, um número não respondedor de células TerF em repouso, células Tree em repouso, células CD4 naive, células de memória números ou células T de memória iniciais.

[00426] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o nível ou atividade de citocina de

(vi) é escolhido dentre uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais dentre (ou todas) a citocina CCL20/MIP3a, ILI7A, IL6, GM- CSF, IFN-y, IL10, I1L13, IL2, I1L21, ILA, IL5, IL9 ou TNFa, ou uma com- binação dos mesmos. A citocina pode ser escolhida dentre um, dois, três, quatro ou mais (todos) dentre IL-17a, CCL20, IL2, IL6 ou TNFa. Em uma modalidade, um nível ou atividade aumentado de uma citoci- na é escolhido dentre um ou ambos IL-17a e CCL20, é indicativo de aumento da capacidade de resposta ou redução da recidiva.

[00427] Nas modalidades, o respondedor, um não respondedor, um recidivador ou um não recidivador identificado pelos métodos no pre- sente documento pode ser adicionalmente avaliado de acordo com critérios clínicos. Por exemplo, um respondedor completo tem ou é identificado como, um indivíduo que tem uma doença, por exemplo, um câncer, que exibe uma resposta completa, por exemplo, uma re- missão completa, a um tratamento. Uma resposta completa pode ser identificada, por exemplo, usando as NCCN Guidelinesº, ou Cheson et al, J Clin Oncol 17:1244 (1999) e Cheson et al., "Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma", J Clin Oncol 25:579-586 (2007) (ambas no presente documento incorporadas a título de referência na sua totalidade), como descrito neste documento. Um respondedor par- cial tem ou é identificado como, um indivíduo que tem uma doença, por exemplo, um câncer, que exibe uma resposta parcial, por exemplo, uma remissão parcial, a um tratamento. Uma resposta parcial pode ser identificada, por exemplo, usando NCCN Guidelinesº ou os critérios de Cheson, como descrito no presente documento. Um "não responde- dor" tem ou é identificado como, um indivíduo que tem uma doença, por exemplo, um câncer, que não exibe uma resposta a um tratamen- to, por exemplo, o paciente tem doença estável ou doença progressi- va. Um não respondedor pode ser identificado, por exemplo, usando NCCN Guidelines? ou os critérios de Cheson, como descrito no pre-

sente documento.

[00428] —Alternativamente, ou em combinação com os métodos des- critos no presente documento, responsivo ao dito valor, realizando um, dois, três quatro ou mais dos seguintes: administrar, por exemplo, a um respondedor ou um não re- cidivador, uma terapia com células que expressam CAR; administrar uma dosagem alterada de uma terapia com cé- lulas que expressam CAR; alterar o programa ou curso do tempo de uma terapia com células que expressam CAR; administrar, por exemplo, a um não respondedor ou um respondedor parcial, um agente adicional em combinação com uma terapia com células que expressam CAR, por exemplo, um inibidor de ponto de verificação, por exemplo, um inibidor de ponto de verificação descrito no presente documento; administrar a um não respondedor ou respondedor parcial uma terapia que aumenta o número de células T mais jovens no indi- víduo antes do tratamento com uma terapia com células que expres- sam CAR; modificar um processo de fabricação de uma terapia com células que expressam CAR, por exemplo, enriquecer as células T mais jovens antes da introdução de um ácido nucleico que codifica um CAR ou aumentar a eficiência da transdução, por exemplo, para um indivíduo identificado como um não respondedor ou um respondedor parcial; administrar uma terapia alternativa, por exemplo, para um não respondedor ou respondedor parcial ou recidivador; ou se o indivíduo for, ou é identificado como, um não respon- dedor ou um recidivador, diminuir a população de células Tree e/ou assinatura gênica Tree, por exemplo, por um ou mais dentre depleção de CD25, administração de ciclofosfamida, anticorpo anti-GITR, ou uma combinação dos mesmos.

[00429] Em determinadas modalidades, o indivíduo é pré-tratado com um anticorpo anti-GITR. Em determinadas modalidades, o indiví- duo é tratado com um anticorpo anti-GITR antes da infusão ou reinfu- são. Terapias de Combinação

[00430] Uma célula que expressa CAR descrita no presente docu- mento pode ser usada em combinação com outros agentes e terapias conhecidos. Administrado "em combinação", como usado no presente documento, significa que dois (ou mais) tratamentos diferentes são administrados ao indivíduo durante a aflição do indivíduo com o distúr- bio, por exemplo, os dois ou mais tratamentos são administrados de- pois de o indivíduo ter sido diagnosticado com o distúrbio e antes de o distúrbio ter sido curado ou eliminado ou o tratamento ter cessado por outros motivos. Em algumas modalidades, a administração de um tra- tamento ainda está ocorrendo quando a administração do segundo começa, de modo que ocorre sobreposição em termos da administra- ção. Tal é por vezes referido no presente documento como "adminis- tração simultânea" ou "concorrente". Em outras modalidades, a admi- nistração de um tratamento termina antes de a administração do outro tratamento começar. Em algumas modalidades de qualquer um dos casos, o tratamento é mais eficaz devido à administração combinada. Por exemplo, o segundo tratamento é mais eficaz, por exemplo, é ob- servado um efeito equivalente com menos do segundo tratamento, ou o segundo tratamento reduz sintomas em maior extensão, do que se- ria observado se o segundo tratamento fosse administrado na ausên- cia do primeiro tratamento, ou a situação análoga é observada com o primeiro tratamento. Em algumas modalidades, a administração é tal que a redução em um sintoma, ou outro parâmetro relacionado com o distúrbio, é maior do que seria observado com um tratamento adminis- trado na ausência do outro. O efeito dos dois tratamentos pode ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo ou mais do que aditivo. A ad- ministração pode ser tal que um efeito do primeiro tratamento adminis- trado ainda é detectável quando o segundo é administrado.

[00431] Uma célula expressando CAR descrita no presente docu- mento e o pelo menos um agente terapêutico adicional podem ser ad- ministrados simultaneamente, na mesma composição ou em composi- ções separadas ou sequencialmente. Para administração sequencial, a célula expressando CAR descrita no presente documento pode ser administrada em primeiro lugar, e o agente adicional pode ser adminis- trado em segundo lugar, ou a ordem da administração pode ser inver- tida.

[00432] A terapia com CAR e/ou outros agentes, procedimentos ou modalidades terapêuticos podem ser administrados durante períodos de disfunção ativa ou durante um período de remissão ou doença me- nos ativa. A terapia com CAR pode ser administrada antes do outro tratamento, em simultâneo com o tratamento, pós-tratamento ou du- rante remissão da disfunção.

[00433] “Quando administrados em combinação, a terapia com CAR e o agente adicional (por exemplo, segundo ou terceiro agente) ou to- dos, podem ser administrados em uma quantidade ou dose que é mai- or, menor ou igual à quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em certas mo- dalidades, a quantidade ou dosagem administrada da terapia com CAR, do agente adicional (por exemplo, segundo ou terceiro agente), ou todos, é menor (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50%) do que a quantidade ou dosa- gem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em outras modalidades, a quantidade ou dosagem da terapia com CAR, do agente adicional (por exemplo, segundo ou ter- ceiro agente) ou todos, que resulta em um efeito desejado (por exem- plo, tratamento de câncer) é menor (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% menor) do que a quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia, requerida para alcançar o mesmo efeito terapêutico. CAR de CD19

[00434] Em algumas modalidades, a terapia com células que ex- pressam CAR de BCMA é administrada em combinação com uma te- rapia com células que expressam CAR de CD129.

[00435] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno do CAR de CD19 tem uma especificidade de ligação idêntica ou seme- lhante ao fragmento FMC63 scFv descrito em Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno do CAR de CD19 inclui o fragmento scFv des- crito em Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997).

[00436] Em algumas modalidades, o CAR de CD19 inclui um domí- nio de ligação ao antígeno (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno humanizado) de acordo com a Tabela 3 do documento nº WO?2014/153270, incorporado ao presente documento a título de refe- rência. A WO2014/153270 também descreve métodos de avaliar a li- gação e eficácia de vários construtos CAR.

[00437] Em um aspecto, a sequência scFv murina parental é o construto de CAR19 fornecido na Publicação PCT WO2012/079000 (incorporada no presente documento a título de referência). Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 é um scFv descrito no documento no documento nº WO2012/079000.

[00438] Em uma modalidade, a molécula CAR compreende a se- quência de polipeptídeos de fusão fornecida como a SEQ ID NO: 12 na publicação PCT WO2012/079000, que fornece um fragmento scFv de origem murina que se liga especificamente a CD19 humano.

[00439] Em uma modalidade, o CAR CD19 compreende uma se- quência de aminoácidos fornecida como SEQ ID NO: 12 na publicação PCT WO?2012/079000. Em uma modalidade, a sequência de aminoá- cidos é (MALPVTALLLPLALLLHAARP )digmtattssIsaslgdrvtiscrasqdiskylInwygq kpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnlegediatyfegggntlpytfgggtkleitagg gsggggsgagggasevklgesgpalvapsaslisvtctvsgvs|pdygvswirgpprkglewlgviw gsettyynsalksritikdnsksqvflkmnslgtddtaiyycakhyyyggsyamdywgagtsvtv sstttpaprpptpaptiasqplIslrpeacrpaaggavhtraldfacdiyiwaplagtegvllislvitlye krgrkkllyifkgpfmrpvattgeedgcscripeeeeggcelrvkfsrsadapaykgggnaglyneln Igrreeydvidkrrgrdpemggkprrknpgeglynelgkdkmaeayseigmkgerrrgkghdgl yaglstatkdtydalhmgalppr (SEQ ID NO: 290), ou uma sequência substan- cialmente homóloga à mesma. A sequência opcional do peptídeo de sinalização é mostrada em letras maiúsculas e parênteses.

[00440] Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos é: DiqgmtaqttssIsaslgdrvtiscrasqdiskyInwyqgqgkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgasgt dysltisnlegediatyfcgggntlpytfaggatkleitagggsaggagsagggsevkligesgpalvap sqaslsvtctvsgvslpdygvswiragpprkglewlgviwgsettyynsalksritikdnsksqvflkm nslgtddtaiyycakhyyyggsyamdywgagtsvtvsstttpaprpptpaptiasqgplslrpeacr paaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkgpfmrpvagttgeedgese rípeeeeggcelrvkfsrsadapaykqggqgnglynelnigrreeydvidkrrgrdpemggkprrkn paeglynelgkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglygglstatkdtydalhmgalppr (SEQ ID NO: 291), ou uma sequência substancialmente homóloga à mesma.

[00441] Em uma modalidade, o CAR CD19 tem a designação USAN TISAGENLECLEUCEL-T. Em modalidades, CTLO19 é feito por uma modificação de genes de células T mediada por inserção estável via transdução com um vetor lentiviral (LV) deficiente em replicação autoinativador contendo o transgene CTLO19 sob o controle do promo- tor EF-1 alfa. CTLO19 pode ser uma mistura de células T positivas e negativas quanto ao transgene que são administradas ao indivíduo com base na percentagem de células T positivas quanto ao transgene.

[00442] Em outras modalidades, o CAR CD19 compreende um do- mínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno humanizado) de acordo com a Tabela 3 de WO2014/153270, incorporada no presente documento por referência.

[00443] A humanização de anticorpo CD19 murino pode ser dese- jada para o ambiente clínico, onde os resíduos específicos de camun- dongo podem induzir uma resposta de antígeno humano-anti-camun- dongo (HAMA) em pacientes que receberam tratamento CART19, ou seja, tratamento com células T transduzidas com o construto de CAR19. A produção, caracterização e eficácia de sequências de CAR CD19 humanizadas é descrita no Pedido Internacional WO2014/153270 o qual é incorporado no presente documento por referência na sua tota- lidade, incluindo os Exemplos 1 a 5 (p. 115-159).

[00444] Em algumas modalidades, construtos CAR CD19 são des- critos na publicação PCT nº WO 2012/079000, incorporada ao presen- te documento a título de referência, e a sequência de aminoácidos dos construtos murinos CAR CD19 e scFv é mostrada na Tabela 6 abaixo, ou uma sequência substancialmente idêntica a qualquer uma das se- quências mencionadas anteriormente (por exemplo, pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica a qualquer uma das sequências descritas no presente documento).

Tabela 6. Construtos de CAR CD19 FO RR TERRE E ówICDSIDITICDDOOA FE ps SEQ ID NO: 292 sequência de amino-ácidos | MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTOQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTV completa de CTLO19 KLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGG

GESCEGESCEGESEVKLQESGPGLVAPSQOSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWL GVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQ GTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG VLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKOPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA PAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY

SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR VB SEQ ID NO: 293 sequência de núcleo-tíideos | ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGE S completa de CTLO19 CCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCA 2

CCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA GATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAG GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAA GATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGA CCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTEGCTCEGECEGTEGTEGETCEGETEGCEGCEG ATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTC CGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAG CCTCCACGAAMAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATA ATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTA AAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTAC

GGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCA CGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCEGCGTCGCAGCCCCeTGTCCO

CTGCGCCCAGAGGCGTECCGGCCAGCEGGCEGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTEG ACTTCGCCTGTGATATCTACATCETGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCT GTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAAC AACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCA GAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCC GCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAG TACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGG AAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACA

GTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAG N GGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCeT 8 cec Ss $ SEQ ID NO: 294 Domínio scFv CTLO19 DIQMTQOTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGS

GSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCAQGNTLPYTFGGGTKLEITGEGGGESCGGESCGGGESEVKLQE SGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTII

KDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS PE ns SEQ ID NO: 295 scFv mCAR1 QVQLLESGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNG

KFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYSCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTGGGSGCGG GSGGGSGGGSELVLTAOSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQOSPKPLIYSAT

YRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVOSKDLADYFCQYNRYPYTSFFFTKLEIKRRS completa de MCAR1 KFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYSCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTGGGSGCGG

GSGGGSGGGSELVLTAOSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQOSPKPLIYSAT YRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVOSKDLADYFCQYNRYPYTSFFFTKLEIKRRSKIEVMYPP PYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSR LLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLG RREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDG

LYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR FER uu nus SEQ ID NO: 297 scFvy mCAR2 DIQMTQOTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGS

GSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCAQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKL QESGPGLVAPSQOSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRL NM

TIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSE E SEQ ID NO: 298 sequência de amino-ácidos | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGS Ss de mCAR2 GSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCAQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKL ?

QESGPGLVAPSQOSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRL TIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSESKYGPPCPP CPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVOQTTQEEDGCSCRFEE EEGGCELRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP

QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRL SEQ ID NO: 299 sequência de amino-ácidos | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGS completa de MCAR2 GSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCAQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKL

QESGPGLVAPSQOSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRL TIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSESKYGPPCPP CPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVOQTTQEEDGCSCRFEE EEGGCELRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRLEGG GEGRGSLLTCGDVEENPGPRMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIK HFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLE IRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIIS NRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENS ECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHV

CHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM FER un nu SEQ ID NO: 300 scFvy mCAR3 DIQMTQOTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGS NM GSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCAQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKL & QESGPGLVAPSQOSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRL Ss TIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS ? SEQ ID NO: 301 sequência de amino-ácidos | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGS completa de MCAR3 GSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCAQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKL

QESGPGLVAPSQOSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRL TIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPP YLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLL HSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGR REEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL YQOGLSTATKDTYDALHMQALPPR FR IJ LI LL LL EEE

SEQ ID NO: 302 Sequência de VH SSJ25-C1 | QVOLLESGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNG a o igreavttADSSTAnMOL SoLTsEoaScaeSSMDRTMGAST SEQ ID NO: 303 VL SSJ25-C1 ELVLTOSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQOSPKPLIYSATYRNSGVPDRFT ss o JessserormmasaTOamATSSSTERS

EE E SEQ ID NO: 304 Domínio scFv CAR1 EIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGS

GSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCOAQQGNTLPYTFGAGTKLEIKBGGGSCSCGESCSCGESAVALA ESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTIS

KDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 305 CAR 1 — Completo - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAP

RLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLAPEDFAVYFCAQQAGNTLPYTFGQGTKLEIKGG NM GGSCCGECSCSCESQVALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIG Ss VIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQ Ss GTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG ?

VLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKAQPFMRPVQOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA PAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

EE FE SEQ ID NO: 306 Domínio scFv CAR2 - aa (o | ENMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGS ligante está sublin-hado) GSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCOAQQGNTLPYTFGAGTKLEIKBGGGSCSGGESCEGESAVALA

ESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTI

SKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS ctcettagececttteacceggtgagegegeaaccectatetigcagageecteccaagacatctcaaaataccttaatiggtattcaacagaage ceggacaggctectegoecttctgatetaccacaccageeggctecattetagaatecctgccaggttecageggtageggatctgggace gactacaccctcactatcagcteactgcagecagaggacttcgctatetatttetateagcaagggaacaccctgcececetacaccttigga cagggcaccaagctegagattaaaggtggaggtagcageggaggaggtaggatecggeggtagaggaagecaggtecaacteca agaaagcggaccgggtettgataaagecatcagaaactcttiteactgacttgtactataageggagtgtctetececgattacggagtatect tggatcagacagccaceggggaaggagtetagaatgagattggagigatttagggctctgagactacttactaccaatcatcccteaagte acgcgtcaccatcteaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgteatcetataaccgcageegacacegecgtatactatt gegcetaagcattactattatagegggagctacgcaatggattactagggacagggtactctagtcaccegtgtccagecaccaccatcat caccatcaccat SEQ ID NO: 308 CAR 2 - Completo - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAP

RLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLAPEDFAVYFCAQQAGNTLPYTFGQGTKLEIKGG NM GGSCCGECSCSCESQVALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIG 8 VIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQ 3 GTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG ?

VLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKAQPFMRPVQOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA PAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY

SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 309 CAR 2 - Completo - nt atggccetecetgteacegecetgetacettecgetagetettetgctecacgecgeteggecegaaattgtgatgacccagtcaceegeca ctcettagececttteacceggtgagegegeaaccectatetigcagageecteccaagacatctcaaaataccttaatiggtattcaacagaage ceggacaggctectegecttetgatetaccacaccagecggetecattetagaatecetaccaggtteageggtageggatetaggace gactacaccctcactatcagcteactgcagecagaggacttcgctatetatttetateagcaagggaacaccctgcececetacaccttigga cagggcaccaagctegagattaaaggtggaggtagcageggaggaggtaggatecggeggtagaggaagecaggtecaacteca agaaagcggaccgggtettgataaagecatcagaaactcttiteactgacttgtactataageggagtgtctetececgattacggagtatect tggatcagacagccaceggggaaggagtetagaatgagattggagigatttagggctctgagactacttactaccaatcatcccteaagte acgcgtcaccatcteaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgteatcetataaccgcageegacacegecgtatactatt gegcetaagcattactattatagegggagctacgcaatggattactagggacagggtactctagtcacegtgtecagcaccactacecea gcacegaggecacecaceceggcetectaceategecteccagectetgtecetacgtecggaggcatgtagaccegcagectagtigagg gcecegtgcatacceggggtettgacttegectacgatatetacatttaggeccectetagetagtactigcggggtectactacttteactegtga tcactctttactgtaagegeggteggaagaagcetgactatacatctttaagcaaccctticatgaggcctgtacagactactcaagaggagg acggctatticatgceggtteccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagcegcagegcagatgctecagec tacaagcaggggcagaaccagctetacaacgaactcaatcttagteggagagaggagtacgacgtgciggacaageggagagga cgggacccagaaatgggegggaagecgegcagaaagaatccccaagagggcectatacaacgagctecaaaaggataagatgg cagaagcctatagcgagattggtatygaaaggggaacgcagaagaggcaaaggecacgacggactataccagggactcageace gccaccaaggacacctatgacgctettecacatgcaggecetgcegectegg NM SEQ ID NO: 310 CAR?2 - scFv solúvel - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPeivmtaspatls|spgeratlscrasqdiskylInwyggkpggapriliyhtsrihsgiparfs S8 gsgsgtdytitisslgpedfavyfcgggntlpytfgagtkleikggggsggggasgggagsavalgesgpalvkpsetisltetvsgvsl!pdyg Ss vswirgppgkglewigviwgsettyyasslksrvtiskdnsknqvslkIssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgagtlvtvssh ? hhhhhhh [FREE Ns SEQ ID NO: 311 Domínio scFvy CAR3 QVOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLK

SRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRL

HSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCAQQAGNTLPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 312 CAR 3 — Completo — aa MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGK

GLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAM DYWGQGTLVTVSSGGGGSCGSGGGSGGGGSEIVMTOASPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLN WYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCQQGNTLPYTF GQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTC GVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKAQPFMRPVOQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

EE SEQ ID NO: 313 Domínio scFv CAR4 QVOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSL

KSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSR

LHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 314 CAR 4 — Completo - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGK NM GLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAM 8 DYWGQGTLVTVSSGGGGSCGSGGGSGGGGSEIVMTOASPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLN Ss WYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCQQGNTLPYTF ?

GQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTC GVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKAQPFMRPVOQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA

YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR EA uv SEQ ID NO: 315 Domínio scFvy CARS EIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGS

GSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGAGTKLEIKBGGGSCCGESCGCGESCSGES QVOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLK SRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 316 CAR 5 — Completo - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAP

RLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLAPEDFAVYFCAQQAGNTLPYTFGQGTKLEIKGG GGSCCCGESCSECESCSGESQAVALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGK GLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAM DYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAP LAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVOQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKF SRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKD

KMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR EEE uv ss SEQ ID NO: 317 CAR6 EIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGS domínio scFv GSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGAGTKLEIKBGGGSCCGESCGCGESCSGES & QVOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSL 38 KSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS Ss SEQ ID NO: 318 CAR6 — MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAP ? Completo — aa RLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLAPEDFAVYFCAQQAGNTLPYTFGQGTKLEIKGG

GGSCCCGESCSECESCSGESQAVALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGK GLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAM DYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAP LAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVOQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKF SRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKD

KMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR EE a

SRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSCGGGGSCGGGGSEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIY

HTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 320 CAR 7 Completo - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGK

GLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAM DYWGQGTLVTVSSGGGGSCSCSEGSCESGGGSGGGESEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQD ISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLAPEDFAVYFCQQGNT LPYTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPL AGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKAQPFMRPVQTTQAEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFS

RSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR ow EE uu a SEQ ID NO: 321 Domínio scFvy CAR8 QVOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSL Ss KSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGS ?

GGGGSGGGGSCGGGGSEIVMTOASPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLL

IYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 322 CAR 8 — Completo - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGK

GLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAM DYWGQGTLVTVSSGGGGSCSCSEGSCESGGGSGGGESEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQD ISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLAPEDFAVYFCQQGNT LPYTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPL AGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKAQPFMRPVQTTQAEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFS RSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK

Es LL FF TOSTATONDRAARARR — EA uv A SEQ ID NO: 323 Domínio scFvy CAR9 EIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGS

GSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGAGTKLEIKBGGGSCCGESCGCGESCSGES QVOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLK

SRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 324 CAR 9 — Completo - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAP

RLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLAPEDFAVYFCAQQAGNTLPYTFGQGTKLEIKGG GGSCCCGESCSECESCSGESQAVALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGK

GLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAM DYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAP & LAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVOQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKF Ss SRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKD Ss KMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR ?

EE SEQ ID NO: 325 Domínio scFv CAR1I0 QVOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLK

HTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 326 CAR 10 Completo - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAP

RLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLAPEDFAVYFCAQQAGNTLPYTFGQGTKLEIKGG GGSCCCGESCSECESCSGESQAVALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGK GLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAM DYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAP LAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVOQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKF SRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKD

KMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR EE] uv ss SEQ ID NO: 327 Domínio scFv CAR11 EIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGS

GSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCOAQQGNTLPYTFGAGTKLEIKBGGGSCSCGESCSCGESAVALA ESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTI

SKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 328 CAR 11 Completo - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGK GLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAM o DYWGQGTLVTVSSGGGGSCSCSEGSCESGGGSGGGESEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQD 8 ISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLAPEDFAVYFCQQGNT Ss LPYTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPL ?

AGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKAQPFMRPVQTTQAEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFS RSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK

MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR AEE O o SEQ ID NO: 329 CAR12 QVOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLK domínio scFv SRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSG

GGGSGGGGSEIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRL HSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLOPEDFAVYFCAQQAGNTLPYTFGQGTKLEIK RLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLAPEDFAVYFCAQQAGNTLPYTFGQGTKLEIKGG GGSCCGECSCSCESQVALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIG VIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQ GTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG VLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKAQPFMRPVQOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA PAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY

SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR FREE TO O k»éE«»>»>ICIIMEOODODDO

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[00445] Os construtos CAR CD19 contendo domínios scFv anti- CD19 humanizados são descritos na publicação PCT nº WO 2014/ 153270, incorporada ao presente documento a título de referência.

[00446] As sequências de sequências CDR murinas e humanizadas dos domínios scFv anti-CD19 são mostradas na Tabela 7 para os do- mínios variáveis de cadeia pesada e na Tabela 8 para os domínios variáveis de cadeia leve. As SEQ ID NOs referem-se àquelas encon- tradas na Tabela 6. Tabela 7. SEQ ID NOs CDR (Kabat) de Domínio Variável de Cadeia Pesada de Anticorpo de CD19 Tabela 8. SEQ ID NOs CDR (Kabat) de Domínio Variável de Cadeia Leve de Anticorpo de CD19

[00447] “Qualquer CAR CD19 conhecido, por exemplo, o domínio de ligação ao antígeno CD19 de qualquer CAR CD19 conhecido, na téc- nica pode ser usado de acordo com a presente descrição. Por exem- plo, LG-740; CAR CD19 descrito na Patente nº US 8,399,645; Patente nº US 7,446,190; Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255 a 260 (2012); Cruz et a/l., Blood 122(17):2,965 a 2,973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4,817 a 4,828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116 (20):4,099 a 4,102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25): 4,129 a 4,139(2013); e 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (AS-

GCT) (15 a 18 de maio, Salt Lake City) 2013, Abst 10.

[00448] Os CARs CD19 exemplificativos incluem CARs CD19 des- critos no presente documento, por exemplo, em uma ou mais tabelas descritas no presente documento, ou um CAR anti-CD19 descrito em Xu et al. Blood 123,24(2014):3750-9; Kochenderfer et al. Blood 122,25(2013):4129-39, Cruz et al. Blood 122,17(2013):2965-73, NCTOOS586391, NCTO108/294, NCTO2456350, NCTOO0840853, NCTO02659943, NCTO2650999, NCTO02640209, NCTO1747486, NCTO2546739, NCTO2656147, NCTO02772198, NCTOO0709033, NCTO02081937, NCTO0924326, NCTO02735083, NCTO02794246, NCTO02746952, NCTO1593696, NCTO02134262, NCTO1853631, NCTO2443831, NCTO02277522, NCTO02348216, NCTO2614066, NCTO2030834, NCTO02624258, NCTO2625480, NCTO02030847, NCTO2644655, “NCTO02349698, NCTO02813837, NCTO02050347, NCTO1683279, NCTO2529813, NCTO02537977, NCTO2799550, NCTO2672501, NCTO2819583, NCTO02028455, NCTO1840566, NCTO1318317, NCTO1864889, NCTO2706405, NCTO1475058, NCTO1430390, NCTO2146924, NCTO2051257, NCTO2431988, NCTO1815749, NCTO2153580, NCTO1865617, NCTO02208362, NCTO2685670, NCTO2535364, NCTO2631044, NCTO02728882, NCTO02735291, NCTO1860937, NCTO02822326, NCTO02737085, NCTO2465983, NCTO02132624, NCTO02782351, NCTO1493453, NCTO02652910, NCTO02247609, NCTO01029366, NCTO1626495, NCTO02721407, NCTO1044069, NCTO0422383, NCTO1680991, NCTO02794961, ou NCTO2456207, cada um dos quais está incorpora- do no presente documento a título de referência em sua totalidade. Agentes Quimioterápicos

[00449] Em algumas modalidades, a terapia com células que ex- pressam CAR de BCMA é administrada em combinação com um agente quimioterápico. Agentes quimioterapêuticos exemplificativos incluem uma antraciclina (por exemplo, doxorrubicina (por exemplo, doxorrubicina lipossômica)), um alcaloide de vinca (por exemplo, vin- blastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), um agente alquilante (por exemplo, ciclofosfamida, dacarbazina, melfalano, ifosfamida, te- mozolomida), um anticorpo para células imunes (por exemplo, alen- tuzumabe, gentuzumabe, rituximabe, tositumomabe), um antimetabóli- to (incluindo, por exemplo, antagonistas do ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores de adenosina desaminase (por exemplo, fludarabina)), um inibidor de MTOR, um agonista da pro- teína relacionada com o TNFR induzida por glicocorticoides (GITR) TNFR, um inibidor de proteassomos (por exemplo, aclacinomicina A, gliotoxina ou bortezomibe), um imunomodulador tal como talidomida ou um derivado de talidomida (por exemplo, lenalidomida).

[00450] — Agentes quimioterapêuticos gerais considerados para uso em terapias de combinação incluem anastrozol (ArimidexO), bicaluta- mida (CasodexO), sulfato de bleomicina (BlenoxaneO), bussulfano (MyleranO), injeção de bussulfano (BusulfexO), capecitabina (Xelo- daO), N4-pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatina (Para- platin&O), carmustina (BICNUG), clorambucil (LeukeranO), cisplatina (PlatinolO), cladribina (LeustatinO), ciclofosfamida (CytoxanO ou Ne- osarO), citarabina, citosina arabinosídeo (Cytosar-UG), injeção de |i- possomo de citarabina (DepoCytO), dacarbazina (DTIC-DomeGO), dac- tinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), hidrocloreto de daunorrubicina (CerubidineO), injeção de lipossomo de citrato de daunorrubicina (DaunoXomeGO), dexametasona, docetaxel (TaxotereO), hidrocloreto de doxorrubicina (AdriamycinO, RubexO), etoposida (VepesidO), fosfa- to de fludarabina (FludaraO), 5-fluorouracila (AdrucilO, EfudexO), flu- tamida (EulexinO), tezacitibina, Gencitabina (difluorodesoxicitidina) hidroxiureia (HydreaO), Idarrubicina (IdamycinO), ifosfamida (IFEXO) irinotecano (CamptosarO), L-asparaginase (ELSPARGO), leucovorina cálcica, melfalano (AlkeranO), 6-mercaptopurina (PurinetholO), meto- trexato (FolexO), mitoxantrona (NovantroneO), milotarg, paclitaxel (Ta- xolO), fênix (Ítrio90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosano 20 com im- plante de carmustina (GliadelO), citrato de tamoxifeno (NolvadexO) teniposida (VumonGO), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (TirazoneO) hidrocloreto de topotecano para injeção (HycamptinO), vinblastina (VelbanO), vincristina (OncovinO) e vinorrelbina (NavelbineO).

[00451] — Agentes alquilantes exemplificativo incluem, sem limitação, mostardas de nitrogênio, derivados etilenimina, alquilsulfonatos, nitro- soureias e triazenos: mostarda de uracila (Aminouracil MustardO, ChlorethaminacilO, Demethyldopan&, Desmethyldopano, Haeman- thamina&, NordopanO, Uracil nitrogen mustardO, UracillostO, Uracil- mostazaO, UramustinO, UramustineO), clormetino (MustargenO), ciclo- fosfamida (CytoxanO, NeosarO, ClafenO, EndoxanO, ProcytoxO, Re- vimmune”), ifosfamida (Mitoxana€O), melfalano (Alkeran&O), Clorambu- cil (LeukeranO), pipobromano (AmedelO, VercyteO), trietilenomelamina (HemelO, HexalenO, HexastatO), trietilenotiofosforamina, Temozolo- mida (TemodarO), tiotepa (Thioplex&), bussulfano (BusilvexO, Myle- ranO), carmustina (BICNUG), lomustina (CeeNUGO), estreptozocina (ZanosarO) e Dacarbazina (DTIC-DomeO). Os agentes alquilantes exemplificativos adicionais incluem, sem limitação, Oxaliplatina (Eloxa- tin&); Temozolomida (TemodarO e TemodalO); Dactinomicina (tam- bém conhecida como actinomicina-D, CosmegenGO); Melfalano (tam- bém conhecido como L-PAM, L-sarcolisina, e mostarda de fenilalanina, AlkeranO); Altretamina (também conhecida como hexametilmelamina (HMM), HexalenO); Carmustina (BICNUG); Bendamustina (TreandaO); Busulfano (Busulfex& e MyleranO); Carboplatina (Paraplatin&O); Lo- mustina (também conhecida como CCNU, CeeNUG); Cisplatina (tam- bém conhecida como CDDP, Platinol& e PlatinolO-AQ); Clorambucila (LeukeranO); Ciclofosfamida (Cytoxank e NeosarO); Dacarbazina

(também conhecida como DTIC, DIC e imidazol carboxamida, DTIC- Dome6); Altretamina (também conhecida como hexametilmelamina (HMM), HexalenO); Ifosfamida (Ifex&); Prednumustina; Procarbazina (MatulaneG&); Mecloretamina (também conhecida como mostarda de nitrogênio, mustina e cloridrato de mecloroetamina, MustargenO); Es- treptozocina (ZanosarO); Tiotepa (também conhecida como tiofosfoa- mida, TESPA e TSPA, ThioplexO); Ciclofosfamida (EndoxanO, Cyto- xanO, NeosarO, ProcytoxO, RevimmuneO); e HCl de Bendamustina (TreandaO).

[00452] Exemplos de inibidores de mMTOR incluem, por exemplo, temsirolimo; ridaforolimo (anteriormente conhecido como deferolimo, dimetilfosfinato de (1R,2R4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,128S,15R,16E,18R, 19R,21R, 23S,24E,26E,287,30S,32S,35R)-1,18-di-hidróxi-19,30-dime- tóxi-15,17,21,23, 29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa- 4-azatriciclo[30,3,1,0ºº] hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]- 2-metóxicicloexila, também conhecido como AP23573 e MK8669, e descrito na Publicação PCT Nº WO 03/064383); everolimo (Afinitor& ou RADOO01); rapamicina (AY22989, SirolimusO); simapimod (CAS 164301-51-3); emsirolimo, (5-(2,4-Bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3- qd] pirimidin-7-il)-2-metóxifenil)metanol (AZD8055); 2-Amino-8-[trans-4-(2- hidroxietóxi)cicloexil]-6-(6-metóxi-3-piridinil)-4-metil-pirido[2,3-apirimi- din-7(8H)-ona (PFO4691502, CAS 1013101-36-4); e Nº-[1,4-dioxo-4- [[4-(4-0x0-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il)morfolínio-4-il]metóxi]butil]-L-ar- ginilglicil-L-a-aspartil-serina-, (SEQ ID NO: 355), sal interno (SF1126, CAS 936487-67-1), e XL765.

[00453] “Exemplos de imunomoduladores incluem, por exemplo, afu- tuzumab (comercializado pela RocheG); pegfilgrastim (NeulastaO); le- nalidomida (CC-5013, RevlimidO); talidomida (ThalomidO), actimida (CC4047); e IRX-2 (mistura de citocinas humanas incluindo interleuci- na 1, interleucina 2 e interferon y, CAS 951209-71-5, comercializado pela IRX Therapeutics).

[00454] Exemplos de antraciclinas incluem, por exemplo, doxorrubi- cina (AdriamycinO e RubexO); bleomicina (lenoxaneO); daunorrubicina (cloridrato de daunorrubicina, daunomicina e cloridrato de rubidomici- na, CerubidineG&); daunorrubicina lipossômica (lipossomo de citrato de daunorrubicina, DaunoXome6); mitoxantrona (DHAD, NovantroneO); epirrubicina (EllenceT“); idarrubicina (IdamycinO, Idamycin PFSO); mi- tomicina C (MutamycinO); geldanamicina; herbimicina; ravidomícina; e desacetilravidomíicina.

[00455] Exemplos de alcaloides da vinca incluem, por exemplo, tar- tarato de vinorelbina (NavelbineO&), Vincristina (OncovinO) e Vindesina (Eldisine&); vinblastina (também conhecida como sulfato de vinblasti- na, vincaleucoblastina e VLB, Alkaban-AQGO e VelbanO); e vinorelbina (NavelbineO).

[00456] Exemplos de inibidores de proteassomas incluem borte- zomibe (VelcadeO); carfizomib (PX-171-007, (S)-4-Metil-N-((S)-1- (((S)-4-metil-1-((R)-2-metiloxiran-2-il)-1-oxopentan-2-il)amino)-1-0x0-3- fenilpropan-2-il)-2-((S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4-fenilbutanamido)- pentanamida); marizomib (NPI-0052); citrato de ixazomib (MLN-9708); delanzomib (CEP-18770); e O-Metil-N-[(2-metil-5-tiazolil)carbonil]-L- seril-O-metil-N-[(1S)-2-[(2R)-2-metil-2-oxiranil]-2-0x0-1-(fenilmetil)etil]- L-serinamida (ONX-0912). Métodos de entrega de biopolímero

[00457] Em algumas modalidades, uma ou mais células que ex- pressam CAR, conforme descrito no presente documento, podem ser administradas ou distribuídas ao indivíduo por meio de um arcabouço de biopolímero, por exemplo, um implante de biopolímero. Os arca- bouços de biopolímero podem sustentar ou intensificar a entrega, a expansão e/ou a dispersão das células que expressam CAR descritas no presente documento. Um arcabouço de biopolímero compreende um polímero biocompatível (por exemplo, não induz substancialmente uma resposta inflamatória ou imunológica) e/ou biodegradável que po- de ser de ocorrência natural ou sintético.

[00458] Os exemplos de biopolímeros adequados incluem, porém sem limitação, ágar, agarose, alginato, alginato/cimento de fosfato de cálcio (CPC), beta-galactosidase (B-GAL), (1 ,2,3,4,6-penta-acetil-a-D- galactose), celulose, quitina, quitosana, colágeno, elastina, gelatina, colágeno de ácido hialurônico, hidroxiapatita, poli(3-hidroxibutirato-co- 3-hidroxi-hexanoato) (PHBHHx), poli(láctido), polifcaprolactona) (PCL), poli(láctido-co-glicólido) (PLG), óxido de polietileno (PEO), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), óxido de polipropileno (PPO), álcool poli- vinílico (PVA), seda, proteína de soja e isolado de proteína de soja, sozinhos ou em combinação com qualquer outra composição polimérica, em qualquer concentração e em qualquer razão. O biopolímero pode ser aumentado ou modificado com moléculas promotoras de adesão ou migração, por exemplo, peptídeos miméticos de colágeno que se ligam ao receptor de colágeno de linfócitos e/ou moléculas estimulado- ras para intensificar a distribuição, a expansão ou a função, por exem- plo, atividade anticancerígena, das células a serem distribuídas. O ar- cabouço de biopolímero pode ser um injetável, por exemplo, um gel ou uma composição semissólida ou sólida.

[00459] Em algumas modalidades, as células que expressam CAR descritas no presente documento são inoculadas no arcabouço de bi- opolímero antes da distribuição ao indivíduo. Em modalidades, o arca- bouço de biopolímero compreende, ainda, um ou mais agentes tera- pêuticos adicionais descritos no presente documento (por exemplo, outra célula que expressa CAR, um anticorpo ou uma molécula pe- quena) ou agentes que intensificam a atividade de uma célula que ex- pressa CAR, por exemplo, incorporados ou conjugados nos biopolímeros do arcabouço. Em modalidades, o arcabouço de biopolímero é injetado,

por exemplo, por via intratumoral, ou cirurgicamente implantado no tumor ou dentro de uma proximidade do tumor suficiente para mediar um efeito antitumoral. Exemplos adicionais de composições de biopolíme- ros e métodos para sua administração são descritos em Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101; e WO2014/110591. Composições farmacêuticas e tratamentos

[00460] “Composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender uma célula expressando CAR, por exemplo, uma plurali- dade de células expressando CAR, como descrito no presente docu- mento, em combinação com um ou mais transportadores, diluentes ou excipientes farmacêutica ou fisiologicamente aceitáveis. Tais composi- ções podem compreender tampões, como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e similares; carboidra- tos, tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; prote- íÍnas; polipeptídeos ou aminoácidos como glicina; antioxidantes; agen- tes quelantes, tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições da presente invenção são em um aspecto formuladas para administração intrave- nosa.

[00461] As composições farmacêuticas da presente invenção po- dem ser administradas de uma maneira apropriada à doença a ser tra- tada (ou prevenida). A quantidade e a frequência da administração se- rão determinadas por fatores como a condição do paciente e o tipo e a gravidade da doença do paciente, embora dosagens apropriadas pos- sam ser determinadas por ensaios clínicos.

[00462] Em uma modalidade, a composição farmacêutica está substancialmente desprovida, por exemplo, não há níveis detectáveis de um contaminante, por exemplo, selecionado do grupo consistindo em endotoxina, micoplasma, lentivírus competente para replicação (RCL), p24, ácido nucleico de VSV-G, HIV gag, esférulas revestidas com anti-CD3/anti-CD28 residual, anticorpos de camundongo, soro humano reunido, albumina de soro bovino, soro bovino, componentes do meio de cultura, componentes de células de empacotamento ou plasmídeos de vetores, uma bactéria e um fungo. Em uma modalida- de, a bactéria é, pelo menos, uma selecionada a partir do grupo que consiste em Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aerugi- nosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e Strepto- coccus pyogenes do grupo A.

[00463] “Quando é indicada "uma quantidade imunologicamente efi- caz", "uma quantidade eficaz antitumoral", "uma quantidade eficaz ini- bidora de tumores" ou "quantidade terapêutica", a quantidade precisa das composições da presente invenção a ser administrada pode ser determinada por um médico considerando diferenças individuais na idade, peso, tamanho do tumor, extensão da infecção ou metástase, e afecção do paciente (indivíduo). Pode ser geralmente afirmado que uma composição farmacêutica compreendendo as células T descritas no presente documento pode ser administrada a uma dosagem de 10º até 10º células/kg de peso do corpo, em alguns casos 10º até 10º célu- las/kg de peso do corpo, incluindo todos os valores inteiros nesses in- tervalos. Composições de células T também podem ser administradas múltiplas vezes nessas dosagens. As células podem ser administradas usando técnicas de infusão que são habitualmente conhecidas em imunoterapia (ver, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).

[00464] Em certos aspectos, pode ser desejado administrar células T ativadas a um indivíduo e então subsequentemente retirar sangue (ou realizar uma aférese), ativar células T a partir daí de acordo com a presente invenção, e reinfundir no paciente estas células T ativadas e expandidas. Esse processo pode ser realizado múltiplas vezes a cada período de algumas semanas. Em certos aspectos, células T podem ser ativadas de recolhas de sangue desde 10 cc até 400 cc. Em certos aspectos, células T são ativadas de recolhas de sangue de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc ou 100 cc.

[00465] A administração das composições em questão pode ser efetuada de qualquer maneira conveniente, incluindo por inalação de aerossol, injeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplantação. As composições no presente documento descritas podem ser adminis- tradas a um paciente transarterialmente, subcutaneamente, intrader- micamente, intratumoralmente, intranodalmente, intramedularmente, intramuscularmente, por injeção intravenosa (i.v.) ou intraperitoneal- mente. Em um aspecto, as composições de células T da presente in- venção são administradas a um paciente por injeção intradérmica ou subcutânea. Em um aspecto, as composições de células que expres- sam CAR (por exemplo, célula T ou célula NK) da presente invenção são administradas por injeção i.v. As composições de células que ex- pressam CAR (por exemplo, células T ou células NK) podem ser inje- tadas diretamente em um tumor, linfonodo ou sítio da infecção.

[00466] Em um aspecto particular exemplificativo, sujeitos podem ser submetidos a leucaférese, em que leucócitos são recolhidos, enri- quecidos ou depletados ex vivo para selecionar e/ou isolar as células de interesse, por exemplo, células efetoras imunes (por exemplo, célu- las T ou células NK). Estes isolados de célula imunoefetora (por exemplo, célula T ou célula NK) podem ser expandidos por métodos conhecidos na técnica e tratados de modo que um ou mais construtos de CAR da invenção possam ser introduzidos, criando assim uma cé- lula que expressa CAR (por exemplo, célula T de CAR ou célula NK que expressa CAR) da invenção. Os sujeitos necessitados podem ser subsequentemente submetidos a tratamento padrão com quimiotera- pia de dose elevada seguido de transplantação de células-tronco do sangue periférico. Em certos aspectos, após ou de modo concorrente com o transplante, os indivíduos recebem uma infusão das células que expressam CAR expandidas (por exemplo, células T ou células NK de CAR) da presente invenção. Em um aspecto adicional, células expan- didas são administradas antes ou após cirurgia.

[00467] Nas modalidades, linfodepleção é realizada em um indiví- duo, por exemplo, antes de administrar uma ou mais células que ex- pressam um CAR descrito no presente documento, por exemplo, um CAR de ligação a BCMA descrito no presente documento. Nas moda- lidades, a linfodepleção compreende administrar um ou mais dentre melfalano, citoxano, ciclofosfamida e fludarabina.

[00468] A dosagem dos tratamentos acima a ser administrada a um paciente irá variar com a natureza precisa da afecção sendo tratada e o recebedor do tratamento. O escalamento de dosagens para adminis- tração humana pode ser realizado de acordo com práticas aceites na técnica. A dose para CAMPATH, por exemplo, irá geralmente se situar na gama de 1 até cerca de 100 mg para um paciente adulto, habitual- mente administrada diariamente durante um período entre 1 e 30 dias. A dose diária preferencial é 1 até 10 mg por dia apesar de, em alguns casos, doses maiores até 40 mg por dia poderem ser usadas (descrito na Patente U.S. No. 6,120,766).

[00469] Em uma modalidade, o CAR é introduzido em células imu- noefetoras (por exemplo, células T ou células NK), por exemplo, usan- do transcrição in vitro, e o indivíduo (por exemplo, humano) recebe uma administração inicial de células imunoefetoras (por exemplo, célu- las T ou células NK) CAR da invenção, e uma ou mais administrações subsequentes das células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK) CAR da invenção, em que a uma ou mais administrações subsequentes são administradas menos de 15 dias, por exemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 dias após a administração anteri-

or. Em uma modalidade, mais do que uma administração das células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR da invenção são administradas ao indivíduo (por exemplo, humano) por semana, por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações das células imunoefetoras (por exemplo, células T ou células NK) CAR da invenção são administradas por semana. Em uma modalidade, o indivíduo (por exemplo, indivíduo humano) recebe mais do que uma administração das células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK) CAR por semana (por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações por semana) (também referido no presente documento como ciclo), seguido de uma semana sem admi- nistrações de células imunoefetoras (por exemplo, células T ou células NK) CAR, e então uma ou mais administrações adicionais das células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR (por exem- plo, mais de uma administração das células imunoefetoras (por exem- plo, células T ou células NK) CAR por semana) são administradas ao indivíduo. Em outra modalidade, o indivíduo (por exemplo, indivíduo humano) recebe mais do que um ciclo de células imunoefetoras (por exemplo, células T ou células NK) CAR, e o tempo entre cada ciclo é menor do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3 dias. Em uma modalidade, as células imunoefetoras (por exemplo, células T ou células NK) CAR são administradas em dias alternados para 3 administrações por semana. Em uma modalidade, as células imunoefetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK) CAR da invenção são administradas durante pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais semanas.

[00470] Em um aspecto, as células que expressam CAR de BCMA (por exemplo, CARTs de BCMA ou células NK que expressam BCMA) são geradas usando vetores virais lentivirais, como lentivírus. As célu- las que expressam CAR (por exemplo, CARTs ou células NK que ex- pressam CAR) geradas desse modo terão expressão de CAR estável.

[00471] Em um aspecto, células que expressam CAR, por exemplo,

CARTs, são geradas usando um vetor viral tal como um vetor gama- retroviral, por exemplo, um vetor gama-retroviral descrito no presente documento. CARTs geradas usando estes vetores podem ter expres- são estável de CAR.

[00472] Em um aspecto, as células que expressam CAR (por exemplo, CARTs ou células NK que expressam CAR) expressa transi- entemente vetores CAR durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 dias após a transdução. A expressão transiente de CARs pode ser efe- tuada por administração de vetores RNA CAR. Em um aspecto, o RNA CAR é transduzido na célula, por exemplo, célula T ou célula NK, por eletroporação.

[00473] “Uma questão potencial que pode surgir em pacientes sendo tratados usando células que expressam CAR de expressão transitória (por exemplo, CARTs ou células NK que expressam CAR) (particular- mente com células que expressam CAR contendo scFv murino) (por exemplo, CARTs ou células NK que expressam CAR) é anafilaxia após múltiplos tratamentos.

[00474] Sem ficar restringido por esta teoria, acredita-se que tal resposta anafilática poderá ser causada pelo fato de um paciente de- senvolver uma resposta anti-CAR humoral, isto é, anticorpos anti-CAR tendo um isótipo anti-lgE. Se crê que células produtoras de anticorpos em um paciente sofrem uma troca de classe do isótipo IgG (que não causa anafilaxia) para o isótipo IgE quando há uma pausa de dez até quatorze dias de exposição ao antígeno.

[00475] Se um paciente estiver em risco elevado de gerar uma res- posta de anticorpos anti-CAR durante a terapia com CAR transiente (como aquelas geradas por transduções de RNA), pausas na infusão da célula expressando CAR (por exemplo, célula NK expressando CART ou CAR) não devem durar mais do que dez até quatorze dias.

EXEMPLOS

[00476] A invenção é adicionalmente descrita em detalhes com re- ferência aos exemplos experimentais a seguir. Esses exemplos são fornecidos somente para propósitos ilustrativos e não se destinam a serem limitadores salvo se especificado de outro modo. Assim, a in- venção não deve de modo nenhum ser considerada como estando |i- mitada aos seguintes exemplos, ao invés disso, deve ser considerada como abrangendo quaisquer e todas as variações que se tornarem evidentes em resultado dos ensinamentos fornecidos no presente do- cumento.

[00477] Sem descrição adicional, se crê que o perito na técnica po- de, usando a descrição precedente e os seguintes exemplos ilustrati- vos, preparar e utilizar as composições da presente invenção e prati- car os métodos reivindicados. Os seguintes exemplos de trabalho sali- entam especificamente vários aspectos da presente invenção, e não devem ser considerados limitadores de modo nenhum do restante da descrição. Exemplo 1: Estudo de Fase 1 de CART-BCMA Com ou Sem hu- CART19 como Consolidação da Terapia Padrão de Primeira ou Segunda Linha para Mieloma Múltiplo de Alto Risco

[00478] Projeto experimental: A Figura 1 ilustra o projeto geral do estudo de fase 1 que combina células T CAR anti-CD19 e células T CAR anti-BCMA como consolidação da terapia de primeira linha em pacientes com mieloma múltiplo (MM) de alto risco. Nesse estudo de células T CAR de combinação, CART-BCMA será coadministrado com CART19 (também conhecido como CTL119) após terapia de primeira linha para MM de alto risco; este estudo substitui um estudo aberto anteriormente que administra CART19 individualmente após a terapia de primeira linha para MM que foi encerrada antecipadamente a uma combinação baseada em CART-BCMA (NCT 02794246).

[00479] Para este estudo de fase 1 de CART-BCMA + CART19, a população-alvo são pacientes com mieloma múltiplo de alto risco defi- nido como estágio 3 no Sistema Internacional de Estadiamento Revi- sado (Palumbo A, Avet-Loiseau H, Oliva S, et al.

Journal of clinical on- cology: official journal of the American Society of Clinical Oncology 2015; 33: 2863-9, incorporado no presente documento a título de refe- rência em sua totalidade) que estão respondendo à terapia de primeira linha.

Supõe-se que as células T CAR neste cenário (em comparação com o cenário recidivado/refratário) sejam mais eficazes, pois as célu- las T usadas na fabricação serão menos funcionalmente comprometi- das pela alta carga de doença e muitas linhas de terapia com MM pre- cedentes; também supõe-se que as células T CAR neste cenário se- jam mais seguras devido a uma carga de doença mais baixa, o que deve levar a uma proliferação inicial de células T CAR menos pronun- ciada in vivo.

Em comparação com o presente estudo de fase 1, este estudo também contribui para o regime de condicionamento de pré- infusão de fludarabina, que tem sido usado na maioria dos outros es- tudos com células T CAR e provavelmente promove a sobrevivência prolongada de células T CAR in vivo (Turtle CJ, Hanafi L-A, Berger C, et al.

Science translational medicine 2016;8:355ra116-355ra116), e administra CART-BCMA como uma única infusão em vez de uma infu- são de dose dividida.

Por fim, os indivíduos sem excesso de toxicidade dias após a infusão receberão terapia de manutenção com lenali- domida padrão.

Dados esses novos aspectos do regime de infusão, o estudo começará com uma fase inicial de segurança de 3 pacientes com CART-BCMA individualmente, a uma dose de 5 x 108 células T CAR, a dose segura estabelecida do presente estudo de fase 1. Se não for observado excesso de toxicidade, mais 3 pacientes serão re- crutados recebendo CART-BCMA e CART19, também na dose celular de 5 x 108 células.

A dose de CART19 neste estudo será 10 vezes maior que a usada no estudo piloto de CART19 + ASCT, em que a do- se de células era baixa devido a questões sobre a toxicidade de CART19 com ASCT; isso foi projetado para aumentar a probabilidade de benefício da adição de CART19. Se não for observado excesso de toxicidade com o regime de combinação, o estudo prosseguirá para uma fase de randomização em que os indivíduos receberão CART- BCMA individualmente ou CART-BCMA + CART19 até que um total de indivíduos tenha sido tratado, 10 cada um com a monoterapia com CART-BCMA e terapia de combinação com CART-BCMA + CART19. O desfecho primário do estudo é a segurança desta abordagem. Embora haja a hipótese de que a adição de CART19 melhore a sobrevida isenta de progressão, o estudo não é desenvolvido para essa comparação. Em vez disso, a porção randomizada permitirá a comparação de desfechos correlatos entre a monoterapia e terapia combinada para avaliar evi- dências de que CART19 eliminou células de MM de BCMAºti" desdife- renciadas que resistem a CART-BCMA (a ser analisado por citometria de fluxo em células da medula óssea (BM) obtidas pós-tratamento) e se CART189 está alvejando as células da medula com MM (MMSC).

[00480] A possibilidade de CART19 estar alvejando MMSC pode ser analisada ao (1) determinar se CART19 induz resposta imunológica (por exemplo, resposta de anticorpos e/ou resposta de células T) contra o an- tígeno de células-tronco Sox2; e/ou (2) avaliar a expressão de Sox2 co- mo um biomarcador clínico de MMSC em amostras de pacientes. Exemplo 2: Estudo de Fase 1 de CART-BCMA Com ou Sem hu- CART19 como Consolidação da Terapia Padrão de Primeira ou Segunda Linha para Mieloma Múltiplo de Alto Risco Sumário do estudo Projeto do Estudo

[00481] Esteé um estudo aberto de fase 1 para avaliar a segurança e a farmacodinâmica de células T autólogas que expressam recepto-

res de antígeno quiméricos específicos para BCMA (antígeno de matu- ração de células B) com domínios coestimuladores de TOCRÇ e 4-1BB (TCRC/4-1BB) em conjunto (denominado "CART-BCMA'"), com ou sem hucART19 (também conhecido como CTL119), como consolidação em pacientes que respondem à terapia de primeira ou segunda linha para mieloma múltiplo de alto risco.

[00482] O regime avaliado neste estudo baseia-se na segurança estabelecida de CART-BCMA demonstrada na UPCC 14415/IRB * 822756 na dose de 5 x 10º células, administradas como infusões divi- didas, seguido de ciclofosfamida 1,5 g/m? em pacientes com mieloma recidivado/refratário. Este estudo testa o CART-BCMA (1) como con- solidação da terapia inicial para mieloma múltiplo, (2) como uma única infusão, em vez de dose dividida, (3) com adição de fludarabina ao re- gime quimioterápico com linfodepleção, (4) em combinação com hu- CART19 e (5) com reinfusão planejada em indivíduos que progridem ou não conseguem obter resposta completa restrita (Kumar S, Paiva B, Anderson KC, et al. International Myeloma Working Group consen- sus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. The Lancet Oncology;17(8):e328-e346).

[00483] O recrutamento do estudo consistirá em duas fases de es- tudo : a). Fase Inicial de Segurança, e b). Fase de Randomização. Dentro de cada fase do estudo, os indivíduos serão recrutados para uma das duas coortes:

1. Coorte 1: Monoterapia com CART-BCMA - administrada como uma única infusão de 5 x 10º células CART-BCMA, 3 dias (+/- 1 dia) após quimioterapia com ciclofosfamida + fludarabina

2. Coorte 2: CART-BCMA + huCART19- administradas co- mo uma única infusão de 5 x 10º células CART-BCMA + uma única infusão separada de 5 x 10º células huCART19, 3 dias (+/- 1 dia) após quimioterapia com ciclofosfamida + fludarabina

Fase de Randomização

[00484] Na fase de randomização, os indivíduos serão randomiza- dos (razão 1:1) para receber CART-BCMA individualmente (Coorte 1) ou CART-BCMA + huCART19 (Coorte 2). Após a terapia com células T CAR, os indivíduos serão elegíveis para receber terapia de manu- tenção padrão a critério do investigador responsável pelo tratamento, após a primeira avaliação de resposta formal 28 dias após a infusão ou após a resolução de grau < 2 de toxicidade relacionada ao regime, o que ocorrer por último.

[00485] Avaliações clínicas padrão serão realizadas quanto à toxi- cidade e resposta de mieloma. Análises correlativas serão realizadas para avaliar a farmacocinética/farmacodinâmica de expansão/persis- tência e depleção de CART-BCMA e huCART19 de células que ex- pressam antígeno-alvo, efeitos em subconjuntos de mieloma múltiplo clonogênico e imunidade anti-mieloma (incluindo imunidade contra an- tígenos de células-tronco do mieloma). Infusões de células T CAR adicionais

[00486] Os indivíduos serão elegíveis para doses de células T CAR adicionais após a infusão inicial se as seguintes condições forem cum- pridas:

1. O indivíduo não experimentou uma toxicidade limitante de dose (DLT) a qualquer infusão inicial de células T CAR.

2. Eventos adversos que estão provavelmente/definitiva- mente relacionados às células T CAR e/ou quimioterapia com linfode- pleção se recuperaram para a linha de base ou grau < 2.

3. Decorreram 90 dias desde a infusão inicial de células T CAR ou o mieloma múltiplo do indivíduo progrediu após a última infu- são de células T CAR.

4. No discernimento do investigador, o indivíduo tem evi- dência objetiva de mieloma múltiplo residual. A determinação para ve-

rificar se um indivíduo tem evidência objetiva de mieloma múltiplo resi- dual será feita pelo investigador.

5. No discernimento do investigador, os riscos e benefícios da infusão adicional de células T CAR são equilibrados.

6. Uma dose mínima aceitável de células T CAR permane- ce da fabricação inicial.

7. Apenas indivíduos da Coorte 2: > 3% de linfócitos de sangue periférico são CD19+. Se < 3% de linfócitos de sangue perifé- rico forem CD19+ e o indivíduo cumprir todos os outros critérios acima, o indivíduo pode receber uma infusão adicional de CART-BCMA indi- vidualmente a critério do investigador.

[00487] Os indivíduos podem receber apenas até duas infusões adicionais de células T CAR se os critérios acima forem satisfeitos e enquanto o estudo permanecer aberto.

Objetivos Objetivos Principais:

[00488] 1) Avaliar a segurança de CART-BCMA como uma dose única de 5 x 10º células CAR* como a consolidação de terapia padrão de mieloma múltiplo de primeira ou segunda linha após a linfodepleção com ciclofosfamida + fludarabina.

[00489] 2) Avaliar a segurança de huCART1I9 administrada com CART-BCMA neste ambiente clínico.

Objetivos Secundários:

[00490] 1) Avaliar os resultados clínicos após cada regime com cé- lulas T CAR (monoterapia com CART-BCMA ou CART-BCMA + hu- CART19 em combinação).

a. Avaliar os critérios de resposta convencionais, obtenção de negatividade mínima para doença residual (MRD) (de acordo com os critérios do IMWG 2016 (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17 (8): e328-e346)) e obtenção de resposta negativa para PET

(ausência de doença FDG-avid detectável por PET/CT).

i. Resposta à primeira dose li. Resposta a doses subsequentes b. Duração de resposta, sobrevida livre de progressão, e sobrevida geral c. MRD molecular por sequenciamento de ig

[00491] 2) Avaliar a cinética de expansão e persistência de CART- BCMA e huCART19 neste ambiente clínico. O grau de expansão e persistência, e bioatividade após infusão inicial serão comparados com infusões subsequentes.

[00492] 3) Avaliar os efeitos de huCART19 sobre parâmetros corre- latos de resistência a CART-BCMA e células clonogênicas de mieloma múltiplo, como os seguintes: a. Persistência de células plasmáticas BCMAm/nes ou CD19* conforme medido por citometria de fluxo e imunoistoquímica b. Depleção de clonogenicidade de mieloma múltiplo como medida usando ensaios de formação de colônia in vitro em amostras da medula óssea c. Indução de anti-Sox2 e outras respostas imunológicas anti-mieloma d. Depleção de células B CD19* clonais

[00493] 4) Avaliara composição celular de produto de aférese e cé- lulas CART-BCMA/huCART19.

[00494] 5) Avaliar os efeitos de terapia de manutenção pós-infusão sobre a persistência de células T CAR e fenótipo, e eventos adversos relacionados a CAR.

[00495] 6) Caracterizar o fenótipo (imunofenótipo de superfície celu- lar, perfil de expressão gênica) de células do mieloma múltiplo que persistem após CART-BCMA +/- huCART19.

Diagnóstico e Critérios de Inclusão Principais

[00496] Pacientes adultos com mieloma múltiplo de alto risco que não obtiveram uma resposta completa restrita após a terapia de pri- meira ou segunda linha. Agentes de Investigação, Dose e Regime Agente(s) de Investigação:

[00497] e Células CART-BCMA: Células T autólogas que expres- sam BCMA (antígeno de maturação de células B)-receptores de antí- geno quiméricos específicos com domínios coestimuladores TORCÇ e 4- 1BB em conjunto (TCRC /4-1BB).

[00498] e Células hucART19: Células T autólogas transduzidas com vetor lentiviral para expressar TORC:4-1BB de scFV anti-CD19. Também conhecidas como células CTL119.

[00499] e Ciclofosfamida/Fludarabina: Agentes citotóxicos de quimioterapia usados para linfodepleção antes da administração do produto das células T CAR. Dose e Via de Administração:

[00500] e Células CART-BCMA: 5 x 10º células por infusão intra- venosa; Dose aceitável mínima para infusão é 1 x 10º.

[00501] e Células hucART19: 5 x 108 células por infusão intrave- nosa; Dose aceitável mínima para infusão é 1 x 10º.

[00502] e Ciclofosfamida e Fludarabina: Ciclofosfamida 300 mg/m? e Fludarabina 30 mg/m? por infusão intravenosa. Regime:

[00503] e Células CART-BCMA: Infusão única no Dia O.

[00504] e Células hucART19: Infusão única no Dia O após o tér- mino de infusão de CART-BCMA (em indivíduos aplicáveis).

[00505] e Ciclofosfamida/Fludarabina: Administrado durante 3 di- as; Programado para que o último dia da quimioterapia seja 3 dias (+/- 1 dia) antes da primeira infusão de células T CAR (Dia 0).

Infusões de células T CAR adicionais:

[00506] Doses adicionais de células T CAR podem ser opcional- mente infundidas em intervalos de pelo menos três meses ou após a progressão da doença em indivíduos que cumprem os critérios de ele- gibilidade necessários.

[00507] —Paraa segunda e subsequente infusão de células T CAR, o regime padrão (CART-BCMA individualmente vs CART-BCMA + hu- CART19) será o regime que o indivíduo recebeu com sua infusão ini- cial. Entretanto, CART-BCMA pode ser infundida individualmente a um indivíduo que recebeu anteriormente CART-BCMA e huCART19, se restarem células huCART19 insuficientes para formular uma dose aceitável e/ou <3% de linfócitos do sangue periférico forem CD19 +. Entretanto, os indivíduos da coorte 2 para os quais não permanece uma dose suficiente de CART-BCMA não serão elegíveis para infu- sões adicionais com huCART19 individualmente. Introdução Fundamentação das células T CAR como Terapia de Consolidação para Mieloma Múltiplo

[00508] "Terapia de consolidação" refere-se ao tratamento após a resposta à terapia anterior para prolongar a resposta e/ou reduzir o risco de recidiva/progressão. Em mieloma múltiplo, a terapia de primei- ra linha padrão com regimes como lenalidomida, bortezomibe e dexa- metasona é geralmente consolidada com altas doses de melfalano e transplante autólogo de célula-tronco (ASCT). Este estudo envolve o uso de terapia com células T CAR em vez de ASCT como a consolida- ção de terapia de primeira linha.

[00509] Este estudo recrutará indivíduos que responderam à terapia de primeira ou segunda linha e coletará células T para fabricação de células T CAR antes de exposição extensa à quimioterapia citotóxica. Espera-se que as células T coletadas neste ambiente clínico levem a um produto de células T CAR clinicamente mais ativo em comparação com as células coletadas no ambiente recidivado/refratário. Essa ex- pectativa está enraizada nas constatações de pacientes com CLL tra- tados com CART19, mostrando que o resultado clínico está fortemente correlacionado com a presença de fenótipos de células T de memória inicial (Fraietta JA, Lacey SF, Wilcox NS, et al. Biomarkers of Re- sponse to Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy in Patients with Chronic Lymphocytic Leukemia. Blood. 2016;128(22): 57). A progressão de mieloma múltiplo é acompanhada pelo desenvol- vimento de fenótipos de células T esgotados (Chung DJ, Pronschinske KB, Shyer JA, et al. T-cell Exhaustion in Multiple Myeloma Relapse af- ter Autotransplant: Optimal Timing of Immunotherapy. Cancer Immunol Res. 2016;4(1):61-71). À medida que os pacientes progridem através de múltiplas linhas de terapia, o repertório de células T provavelmente se torna progressivamente prejudicado à medida que a carga da do- ença aumenta e os pacientes recebem terapias cada vez mais agres- sivas, geralmente com mecanismos de ação amplamente citotóxicos.

[00510] Um desafio na avaliação da eficácia das terapias de conso- lidação é como distinguir a resposta à terapia em investigação da res- posta à terapia anterior. Para evitar essa limitação, este protocolo res- tringe o recrutamento de indivíduos que obtiveram pelo menos uma resposta menor, porém não uma resposta completa à terapia anterior, apesar de terem recebido pelo menos três ciclos, em tal ponto as res- postas normalmente "estabilizam" (ou seja, não conseguem melhorar consideravelmente com terapia adicional). Além disso, os indivíduos adiarão a consolidação padrão com altas doses de melfalano e ASCT para uma linha de terapia posterior e receberão ciclofosfamida e fluda- rabina, que se espera que os mesmos não devam efetuar uma respos- ta anti-mieloma significativa nessa população, como quimioterapia com linfedema. Portanto, com este projeto de estudo, espera-se poder atri-

buir quaisquer respostas de mieloma múltiplo observadas à atividade clínica das células T CAR. Terapia de combinação de células T CAR

[00511] A seleção A seleção e crescimento de subconjuntos alvo- negativos raros do clone neoplásico é um mecanismo documentado de resistência à terapia com células T CAR. O alvejamento simultâneo de dois antígenos pode contornar esse mecanismo de resistência e au- mentar a probabilidade de eliminar todos os subconjuntos imunofeno- típicos do clone com uma dose única. Em alguns indivíduos que rece- beram CART-BCMA, houve enriquecimento de células de mieloma múltiplo que expressam BCMA-dim e CD19 após resposta inicial, su- gerindo que a coadministração de huCART19 pode impedir a progres- são após CART-BCMA. Infusões Seriais de células T CAR

[00512] A doença residual pode persistir após uma infusão inicial de células T CAR devido à perda da capacidade funcional in vivo de célu- las T CAR infundidas antes que toda a doença seja erradicada. Muitos indivíduos que responderam inicialmente a CART-BCMA progrediram posteriormente, apesar da persistência de baixo nível in vivo de célu- las CART-BCMA Esta constatação sugere a perda de potência de cé- lulas T CAR após a onda inicial de expansão in vivo. Visto que a ex- pressão de BCMA ainda estava presente na recidiva em todos os pa- cientes analisados, a doença residual pode ser sensível à reinfusão de doses de CART-BCMA adicionais. Portanto, este protocolo inclui a provisão de infusões seriais de células T CAR, desde que doses sufi- cientes permaneçam do produto fabricado inicial. Espera-se que esta provisão gere dados de segurança, farmacocinéticos e farmacodinâ- micos, juntamente com dados preliminares de resposta clínica, em in- fusões seriais de CART-BCMA e huCART19 nesse ambiente clínico. Essa disposição também é impulsionada pelo crescente reconheci-

mento de que níveis muito baixos de mieloma residual são clinicamen- te importantes e provavelmente devem ser alvejados. Mesmo indiví- duos em respostas completas definidas convencionalmente diferem em seu prognóstico com base na persistência de doença residual mí- nima (MRD) (Munshi NC, Avet-Loiseau H, Rawstron AC, et al. Asso- ciation of Minimal Residual Disease With Superior Survival Outcomes in Patients With Multiple Myeloma: A Meta-analysis. JAMA Oncol. 2017;3 (1):28-35). Seleção de indivíduos Critérios de Inclusão

[00513] 1. Os indivíduos devem ter um diagnóstico de mieloma múltiplo de acordo com os critérios de IMWG 2014 (Rajkumar SV, Di- mopoulos MA, Palumbo A, et al. International Myeloma Working Group updated criteria for the diagnosis of multiple myeloma. The lancet on- cology. 2014;15(12):2538-548) com qualquer uma das seguintes ca- racterísticas de alto risco: a. Beta-2-microglobulina 2 5,5 mg/l e LDH maior que o limi- te superior de normalidade. Nota: indivíduos nos quais a Beta-2- microglobulina não foi medida antes do início da terapia sistêmica po- dem se qualificar com base nas medições obtidas após o início da te- rapia sistêmica.

b. Recursos de FISH de alto risco: deleção 17p, t(14;16), t(14;20), t(4;14) em conjunto com Beta-2-microglobulina 2 5,5 mg/l (ISS revisado estágio 3). Nota :indivíduos os indivíduos nos quais a Beta-2-microglobulina não foi medida antes do início da terapia sistê- mica podem se qualificar com base nas medições obtidas após o início da terapia sistêmica.

c. Cariótipo metafásico com >3 anormalidades estruturais, exceto hiperdiploidia.

d. Leucemia de células plasmáticas (>20% de células plas-

máticas no sangue periférico) a qualquer momento antes do recruta- mento.

e. Não conseguem obter resposta parcial ou melhor (por critérios de IMWG 2016 (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):2328-e346)) a uma combinação de "imid/PI" (talidomida, lenali- domida ou pomalidomida em combinação com bortezomibe, ixazomibe ou carfilzomibe).

f. Progressão (de acordo com os critérios de IMWG 2016 (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):e328-e346)) em terapia de primeira linha com uma combinação de "imid/PI" dentro de seis meses após o início da terapia.

[00514] 2.Os indivíduos devem cumprir os seguintes em relação à terapia para mieloma anterior: a. Os indivíduos devem estar em sua primeira linha de te- rapia para mieloma múltiplo, com a seguinte exceção: indivíduos que tenham avançado para terapia de segunda linha devido à progressão da doença durante a terapia de primeira linha são elegíveis se tal pro- gressão ocorrer dentro de seis meses após o início da terapia de pri- meira linha. As linhas de terapia são definidas pelos critérios de IMWG 2016 (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):e328-e346).

b. Os indivíduos não devem ter sido submetidos a trans- plante autólogo ou alogênico de células-tronco.

c. Os indivíduos devem ter iniciado terapia sistêmica para mieloma múltiplo <1 ano antes do recrutamento.

d. Os indivíduos devem ter recebido pelo menos 3 ciclos completos de seu regime atual e obtido pelo menos uma resposta mí- nima (conforme definido pelos critérios de IMWG 2016 (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):e328-e346)) geral à terapia anterior.

e. Os indivíduos não devem ter recebido quimioterapia cito- tóxica (por exemplo, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposide, cisplati-

na) com as seguintes exceções: i. Ciclofosfamida semanal em baixa dose (<500 mg/m?/se- mana) ii. Infusão contínua de ciclofosfamida, se limitada a um úni- co ciclo.

[00515] 3.Os indivíduos não devem ter obtido uma resposta com- pleta ou restrita de acordo com os critérios de IMWG 2016 (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):e328-e346) no momento do recrutamento, a menos que células plasmáticas clonais sejam detectá- veis na medula óssea por citometria de fluxo. (Ou seja, os indivíduos em resposta completa ou completa restrita são elegíveis se a doença residual mínima puder ser documentada por citometria de fluxo da medula óssea).

[00516] 4.Os indivíduos devem ter assinado um consentimento in- formado por escrito.

[00517] 5.Os indivíduos devem ter > 18 anos de idade.

[00518] 6.Os indivíduos devem ter função de órgãos vitais adequa- da: a. Creatinina sérica < 2,5 ou depuração de creatinina > 30 ml/min (medida ou estimada de acordo com CKD-EPI) e não depen- dente de diálise.

b. Contagem absoluta de neutrófilos > 1000/ul e contagem de plaquetas > 50,000/ul (> 30,000/Ul se as células plasmáticas da medula óssea forem 2 50% da celularidade).

c. SGOT < 3x o limite superior de normalidade e bilirrubina total < 2,0 mg/dl (exceto para pacientes em que a hiperbilirrubinemia é atribuída à síndrome de Gilbert).

d. Fração de ejeção do ventrículo esquerdo (LVEF) > 45%. A avaliação de LVEF deve ter sido realizada dentro de 8 semanas após o recrutamento.

[00519] 7.As toxicidades de terapias precedentes/em andamento, com exceção de neuropatia periférica atribuível à terapia para mieloma múltiplo, devem ter se recuperado para grau < 2 de acordo com os cri- térios do CTCAE 4,03 ou com a linha de base anterior do indivíduo.

[00520] 8.Os indivíduos devem ter um status de desempenho de ECOG de 0 a 2.

[00521] 9. Os indivíduos devem estar dispostos a renunciar ao ASCT de primeira linha.

[00522] 10. Os indivíduos de potencial reprodutivo deve concordar em usar métodos aceitáveis de controle de natalidade.

Critérios de Exclusão

[00523] 1. Mulheres grávidas ou lactantes

[00524] 2. Acesso venoso inadequado ou contraindicações à leuca- férese.

[00525] 3. Hepatite ativa B, hepatite C, ou infecção por HIV ou outra infecção ativa não controlada.

[00526] 4. Qualquer distúrbio médico ou psiquiátrico não controlado que poderia inviabilizar a participação, conforme descrito.

[00527] 5. Insuficiência cardíaca classe Ill ou IV de NYHA, angina instável ou um histórico de infarto do miocárdio recente (dentro de 6 meses) ou taquicardia ventricular sustentada (>30 segundos).

[00528] 6.Têm doença autoimune ativa, incluindo doença do tecido conjuntivo, uveite, sarcoidose, doença inflamatória intestinal ou escle- rose múltipla, ou têm um histórico de doença autoimune grave (con- forme julgado pelo investigador) que exige terapia imunossupressora prolongada.

[00529] 7. Têm envolvimento prévio ou ativo do sistema nervoso central (SNC) (por exemplo, doença leptomeníngea, massas paren- quimatosas) com mieloma. A triagem para isso (por exemplo, com punção lombar) não é necessária, a menos que sintomas suspeitos ou achados radiográficos estejam presentes. Os indivíduos com doença calvarial que se estende intracranialmente e envolve a dura-máter se- rão excluídos, mesmo que o CSF seja negativo para mieloma. Fármacos de estudo Células CART-BCMA

[00530] As células CART-BCMA são células T autólogas que foram manipuladas para expressar um anticorpo extracelular de cadeia única (scFv) com especificidade para BCMA associada a uma molécula de sinalização intracelular que consiste em domínios de sinalização em tandem, compreendidos do módulo de sinalização TORC, associado ao domínio estimulador 4-1BB. As células CART-BCMA são criopreser- vadas em criomeios infusíveis, e dispensadas em um saco de infusão. As células CART-BCMA serão administradas como uma infusão única. A dose-alvo de CART-BCMA será 5 x 10º células transduzidas, com uma dose de infusão mínima aceitável de 1 x 10º células transduzidas. As doses serão formuladas para atingir o número máximo de doses contendo 5 x 10º células T CAR; ou seja, as doses não serão reduzi- das abaixo do alvo de 5 x 10º células T CAR com o propósito de au- mentar a quantidade de doses disponíveis. Células huCART19

[00531] As células huCART19 são células T autólogas que foram manipuladas para expressar um anticorpo extracelular de cadeia única (scFv) com especificidade para CD19 associada a uma molécula de sinalização intracelular que consiste em domínios de sinalização em tandem, compreendidos do módulo de sinalização TORC, associado ao domínio estimulador 4-1BB. As células CTL119 foram criopreservadas em criomeios infusíveis e dispensadas em um saco de infusão. As cé- lulas huCART19 serão administradas como uma infusão única. A do- se-alvo de huCART19 será 5 x 108 células transduzidas, com uma do- se de infusão mínima aceitável de 1 x 10º células transduzidas. As do-

ses serão formuladas para atingir o número máximo de doses conten- do 5 x 10º células T CAR; ou seja, as doses não serão reduzidas abai- xo do alvo de 5 x 108 células T CAR com o propósito de aumentar a quantidade de doses disponíveis. Infusão de CART-BCMA e hucART19

[00532] Os produtos serão administrados de maneira sequencial, com as células CART-BCMA descongeladas e infundidas primeiro, se- guido do descongelamento e infusão de célula huCART19, que deve ocorrer pelo menos uma hora após o término da infusão de CART- BCMA. O produto de huCART19 deve permanecer em gelo seco du- rante esse período. Quimioterapia de linfodepleção antes da infusão inicial de células T

CAR

[00533] Antes da(s) infusão(ões) inicial(s) de células T CAR, a qui- mioterapia de linfodepleção será administrada como um regime de ci- clofosfamida 300 mg/m? + fludarabina 30 mg/mºdiariamente por três dias. A quimioterapia de linfodepleção deve ser programada de modo que o último dia de terapia seja 3 dias (+/- 1 dia) antes da infusão de células T CAR.

[00534] Embora administradas para fins de pesquisa como parte deste estudo, a ciclofosfamida e a fludarabina são agentes aprovados pela FDA e serão preparadas e infundidas de acordo com seus rótulos aprovados pela FDA e com a prática institucional padrão. A pré- medicação antiemética preferida para este regime é ondansetrona 16 mg e dexametasona 12 mg, cada uma administrada diariamente antes de cada infusão quimioterápica; esse regime pode ser alterado a crité- rio do investigador responsável pelo tratamento. Antieméticos padrão adicionais podem ser prescritos pelo investigador para o uso conforme necessário (por exemplo, ondansetrona, proclorperazina, lorazepam). A dose de fludarabina pode ser reduzida para indivíduos com GFR es-

timado < 80 ml/min a critério do investigador. Quimioterapia de linfodepleção antes de infusões subsequentes de células T CAR

[00535] Antes das infusões subsequentes de células T CAR, a qui- mioterapia de linfodepleção será administrada como o regime de ciclo- fosfamida + fludarabina (como descrito acima) ou uma infusão única de ciclofosfamida 1,5 g/ym?. A escolha entre essas duas opções para quimioterapia de linfodepleção será a critério dos investigadores, guia- da pela tolerância à quimioterapia de linfodepleção administrada antes da primeira infusão de células T CAR e da condição clínica geral. À quimioterapia de linfodepleção será programada de modo que o último dia de terapia seja 3 dias (+/- 1 dia) antes da infusão de células T CAR.

[00536] Para ciclofosfamida 1,5 gym?, a pré-medição antiemética preferida é a ondansetrona 24 mg e a dexametasona 12 mg, seguido de ondansetrona 8 mg duas vezes ao dia nos dois dias após a ciclo- fosfamida. Os indivíduos que recebem ciclofosfamida 1,5 g/m? também receberão pré-hidratação intravenosa com 11 de solução salina normal. Procedimentos de estudo

[00537] O estudo consiste em (1) uma fase de triagem, (2) uma fa- se de fabricação que consiste em aférese e preparação do(s) produ- to(s) de células T, (3) uma fase de tratamento que consiste em quimio- terapia de linfodepleção e infusão de células T CAR e (4) acompa- nhamento. Avaliações Pré-Entrada/Triagem

[00538] “Durante o período de avaliação pré-entrada, será solicitado que os indivíduos forneçam um consentimento informado e um aspira- do de medula óssea e biópsia central para estudos correlatos de pes- quisa. Esta biópsia pode ser realizada enquanto o indivíduo ainda está recebendo a terapia de primeira linha. As amostras também podem ser enviadas para patologia anatômica padrão ou análises genéticas (FISH, citogenética, sequenciamento de próxima geração, etc.), a cri- tério do investigador.

Aférese

[00539] “Um procedimento de aférese de grande volume é realizado no hospital do centro de aférese da Universidade da Pensilvânia. As PBMC são obtidas para células T CAR durante esse procedimento.

Mobilização e coleta de células-tronco autólogas

[00540] — Indivíduos para os quais altas doses de melfalano e trans- plante de células-tronco autólogas poeriam ser considerados em uma futura linha de terapia podem ser submetidos à mobilização e coleta de células-tronco autólogas após o recrutamento, porém antes da infu- são de células T CAR, desde que as restrições à quimioterapia pré- aférese e ao uso de fator de crescimento mieloide sejam respeitadas.

Prevê-se (porém não necessário) que a mobilização e coleta autôno- ma de células-tronco autólogas ocorram após a leucaférese para a fa- bricação de células T CAR.

Avaliação Pré-infusão

[00541] Os indivíduos serão submetidos a avaliações dentro de 7 dias antes da infusão de células T CAR e antes da quimioterapia de linfodepleção, para obter o estado clínico e o mieloma de linha de base pré-infusão e avaliar a elegibilidade para prosseguir com a infusão de células T CAR.

Quimioterapia de Linfodepleção

[00542] A quimioterapia de linfodepleção será programada de modo que o último dia de quimioterapia de linfodepleção seja 3 dias +/- 1 dia antes da infusão de células T CAR.

Infusão de células T CAR

[00543] A infusão de células T CAR começará 3 dias (+/- 1 dia) após o término de quimioterapia. Cada produto de células T CAR

(CART-BCMA e huCART19) será administrado como infusões únicas separadas. Para indivíduos que recetem CART-BCMA e huCART19, CART-BCMA serão administradas primeiro e a infusão de huCART19 começará imediatamente após o término da infusão de CART-BCMA.

[00544] — No caso improvável de que uma reação aguda à infusão se desenvolva em CART-BCMA antes da infusão de huCART19, a infu- são de huCART19 pode demorar até 48 horas, a critério do investiga- dor. Se> 4 horas decorrerem entre a pré-medicação e a infusão de huCART19, a pré-medicação será readministrada. Se a infusão de huCART19 for retardada e o indivíduo não se estabilizar para permitir a infusão de huCART19 dentro de 48 horas após o horário de infusão inicialmente programado, a dose de huCART19 será cancelada, a me- nos que outro atraso seja aprovado pelo patrocinador. Avaliações pós-infusão

[00545] Os indivíduos retornarão à clínica nos dias +2, +4, +7, +10, +14 e +21 (+/- 1 dia) e +28 (+/- 3 dias) para avaliações. Terapia de Manutenção

[00546] A terapia de manutenção pode ser administrada começan- do após a avaliação do dia 28 ou depois que os eventos adversos pro- vavelmente/definitivamente relacionados às células T CAR e/ou quimi- oterapia de linfodepleção se recuperarem para a linha de base ou grau < 2, o que ocorrer por último. Além dessas restrições, a decisão sobre a possibilidade e o momento de iniciar a terapia de manutenção será baseada no critério do investigador. A escolha do regime de manuten- ção também está a critério do investigador. A monoterapia com lenali- domida é a terapia de manutenção preferida, e regimes contendo este- roides devem ser evitados se possível. Avaliações mensais (+/- 7 dias) e avaliações trimestrais

[00547] Os indivíduos retornarão à clínica para avaliações mensais (+/- 7 dias) até seis meses depois da infusão de células T CAR para avaliações. Após a avaliação de seis meses, os indivíduos serão sub- metidos a avaliações trimestrais (+/- 14 dias) até um ano após a infu- são. Avaliação de Estudos Correlatos de Pesquisa

[00548] A coleta de sangue periférico para pesquisa padrão consis- tirá nos seguintes:

1. -25 ml de sangue periférico em tubos de EDTA (ou seja, tubos de parte superior roxa) para PBMC e isolamento de ácidos nu- cleicos

2. -5 ml de sangue periférico em tubos plásticos lisos (ou seja, tubos de parte superior vermelha) para isolamento de soro

[00549] O volume de coleta alvo para aspirados de medula óssea será 10 a 20 ml. Para amostras de aspirado de medula óssea desig- nadas para patologia anatômica padrão e estudos correlatos, - 2a 5 ml serão alocados para patologia anatômica padrão e o restante para estudos correlatos. O aspirado disponível para estudos correlatos será dividido da seguinte forma: -1 a 3 ml em tubo plástico (ou seja, tubo de parte superior vermelha) para isolamento sérico e o restante em tubos de EDTA (ou seja, tubos de parte superior roxa) para isolamento de PBMC e ácido nucleico.

[00550] O comprimento alvo das biópsias do núcleo da medula ós- sea é de 1 cm cada para a patologia anatômica padrão (quando apli- cável) e estudos correlatos. Esse comprimento pode ser obtido em bi- Ópsias separadas ou divisão de uma única biópsia, a critério do clínico que está realizando o procedimento.

[00551] A seguir, são apresentados ensaios correlatos que serão planejados para sangue periférico e (quando aplicável) aspirados de medula óssea:

1. Citometria de fluxo e qPCR para detecção de células huCART19 e CART-BCMA.

2. Citometria de fluxo para expressão de antígeno alvo em células de mieloma múltiplo (aspirados de medula óssea) e detec- ção/caracterização de doença residual mínima.

3. Fenotipagem de subconjuntos de células T por citometria de fluxo e/ou métodos moleculares.

4. Detecção/caracterização molecular de doença residual mínima por sequenciamento de cadeia pesada de imunoglobulina.

5. Análise imunoistoquímica em biópsias do núcleo da me- dula óssea para expressão do antígeno-alvo e caracterização de célu- las T e outros componentes celulares da medula óssea.

6. SBCMA/BAFF/APRIL ELISA para marcadores solúveis. Exemplo 3: Estudo de Fase 1 de CART-BCMA Com ou Sem hu- CART19 como Consolidação da Terapia Padrão de Primeira ou Segunda Linha para Mieloma Múltiplo de Alto Risco Sumário do estudo Projeto do Estudo

[00552] Este é um estudo aberto de fase 1 para avaliar a seguran- ça, farmacodinâmica e efeitos anti-mieloma de CART-BCMA, com ou sem huCART19, em pacientes que respondem à terapia de primeira ou segunda linha para mieloma múltiplo de alto risco e em pacientes com mieloma múltiplo recidivados/refratários que respondem à terapia de resgate.

[00553] O regime avaliado neste estudo baseia-se na segurança estabelecida de CART-BCMA demonstrada na UPCC 14415/IRB * 822756 na dose de 5 x 10º células, administradas como infusões divi- didas, seguido de ciclofosfamida 1,5 g/m? em pacientes com mieloma recidivado/refratário. Este estudo testa CART-BCMA (1) como consoli- dação da terapia inicial para mieloma múltiplo e como consolidação da terapia de resgate padrão para mieloma múltiplo recidivado/refratário, (2) com adição de fludarabina ao regime de quimioterapia de linfode-

pleção (3) em combinação com huCART19 e (4) como uma infusão única, em vez de dose dividida.

[00554] O estudo introduzirá essas alterações no regime com CART-BCMA de maneira gradual em três fases de recrutamento: * FaseA: Fase Inicial de Segurança para testar a segu- rança de CART-BCMA + huCART19 como infusões de dose dividida após a quimioterapia de linfodepleção com ciclofosfamida + fludarabi- na em pacientes que têm mieloma recidivado/refratário após dois re- gimes precedentes, porém que estão respondendo à sua terapia atual.

* "Expansão de Fase A: Expansão da coorte da Fase A para aumentar a compreensão de segurança, farmacodinâmica e efei- tos anti-mieloma do regime combinado de CART-BCMA/hucCART19 como uma abordagem de consolidação no cenário recidiva- dorrefratário. O recrutamento na Expansão de Fase A pode ocorrer simultaneamente com a Fase B.

* Fase B: Fase de randomização na qual os pacientes que respondem à terapia de primeira ou segunda linha receberão CART-BCMA individualmente (coorte 1) ou CART-BCMA + huCART19 (coorte 2) como infusões de dose dividida após quimioterapia de linfo- depleção com ciclofosfamida + fludarabina.

* Fase C: Fase de infusão de dose única para testar a segurança de infusão de dose única de CART-BCMA individualmente (Coorte 1) e CART-BCMA + huCART19 (Coorte 2) como infusões de dose única após quimioterapia de linfodepleção com ciclofosfamida + fludarabina em pacientes que responderam à terapia de primeira ou segunda linha.

[00555] — Ao longo do estudo, a dose-alvo para CART-BCMA e hu- CART189 será de 5 x 10º células que expressam CAR para cada produ- to. "Coorte 1" refere-se ao grupo de indivíduos atribuídos para receber CART-BCMA individualmente; "Coorte 2" refere-se ao grupo de indiví-

duos atribuídos para receber CART-BCMA + huCART19. As infusões de dose dividida consistem em uma dose de 10% (de um ou ambos os produtos) no primeiro dia de infusão, dose de 30% (de um ou ambos os produtos) no segundo dia de infusão ou dose de 60% (de um ou ambos os produtos) no terceiro dia de infusão. Os dias de infusão po- dem se estender por 7 dias consecutivos devido a restrições de pro- gramação ou para permitir a observação de suspeita de síndrome de liberação precoce de citocinas ou outra toxicidade. As infusões come- çarão 3 dias (+/- 1 dia) após o término da quimioterapia de linfodeple- ção com ciclofosfamida + fludarabina. Fase Inicial de Segurança (Fase A)

[00556] Para testar a segurança dessa nova abordagem de células T CAR de combinação, a fase inicial de segurança recrutará indivíduos com mieloma múltiplo de alto risco que são recidivados/refratários a duas linhas precedentes de terapia, porém que respondem à terapia atual. Três indivíduos receberão CART-BCMA + huCART19 a partir de 3 dias (+/- 1 dia) após a quimioterapia de linfodepleção com ciclodefos- famida + fludarabina. Um período de espera de 21 dias será instituído entre o início do regime de cada indivíduo (ou seja o primeiro dia da quimioterapia de linfodepleção). Uma pausa de segurança ocorrerá até que todos os três indivíduos tenham completado 28 dias de acompa- nhamento e uma avaliação formal de DLT seja realizada pelo Diretor Médico e pelo Investigador Principal. Se ocorrer um DLT entre os três primeiros indivíduos infundidos, recrutamentos/infusões adicionais se- rão adiados até que uma análise formal de segurança seja realizada pelo Diretor Médico Patrocinador e Investigador Principal, e quaisquer alterações de protocolo recomendadas tenham sido implementadas e aprovadas pelos órgãos de supervisão adequados. A fase inicial de segurança será, então, adicionalmente expandida para recrutar até seis indivíduos avaliáveis.

[00557] Se um DLT não foi identificado por avaliação do Diretor Médico e do Investigador Principal, os dados cumulativos de seguran- ça serão enviados para a FDA para análise e confirmação de que o estudo pode prosseguir para a Fase de Randomização (Fase B).

[00558] Se um bDLT foi identificado por avaliação do diretor médico e do Investigador Principal e a fase inicial de Segurança foi expandida para recrutar até seis indivíduos avaliáveis, uma reunião do Data and Safety Monitoring Board (DSMB) ocorrerá no final da Fase Inicial de Segurança (após todos os indivíduos planejados terem atingido o pon- to no tempo Dia +28) para avaliar se o estudo pode progredir para a Fase de Randomização (Fase B). Simultaneamente, os dados de se- gurança cumulativos serão enviados para a FDA para análise e con- firmação do avanço da coorte. Fase de Expansão de Fase A

[00559] Uma vez que a segurança da terapia de combinação de CART-BCMA/huCART19 é estabelecida na Fase Inicial de Segurança de Fase A (ou seja, nenhum DLT identificado pela avaliação do Diretor Médico e do Investigador Principal), ocorrerá uma expansão da Fase À em que a população-alvo da Fase A (pacientes com mieloma múltiplo recidivados/refratários que respondem a um regime padrão de terapia de resgate) receberão CART-BCMA e huCART19. O recrutamento na Expansão de Fase A pode ocorrer simultaneamente com a Fase B uma vez aberto. Fase de Randomização (Fase B)

[00560] Após o término da fase inicial de segurança, os indivíduos com mieloma de alto risco que respondem à terapia de primeira ou se- gunda linha serão randomizados (1:1) para receber CART-BCMA indi- vidualmente (coorte 1) ou CART-BCMA + huCART19 (Coorte 2) inici- ando 3 dias (+/- 1 dia) após a quimioterapia com ciclofosfamida + flu- darabina. O recrutamento continuará até que um total de 20 indivíduos seja infundido, com uma meta de 10 indivíduos avaliáveis por coorte (randomização 1:1). Durante a fase de randomização, não haverá pe- ríodos de espera necessários entre os indivíduos.

[00561] Uma reunião do DSMB ocorrerá no final da Fase de Ran- domização (depois que todos os indivíduos atingirem o ponto no tem- po do Dia + 28) para avaliar se o estudo pode progredir para a Fase de Infusão de Dose Única (Fase C). Simultaneamente, os dados de segu- rança cumulativos serão enviados para a FDA para análise e confir- mação do avanço da coorte. Fase de Infusão de Dose única (Fase C)

[00562] Estafase avaliará a segurança da infusão de dose única da monoterapia com CART-BCMA e da combinação de CART-BCMA + huCART19. Esta Fase recrutará indivíduos com mieloma múltiplo de alto risco que respondem à terapia de primeira ou segunda linha. Pri- meiro, três indivíduos receberão monoterapia com CART-BCMA como uma infusão de dose única (Coorte 1), 3 dias (+/- 1 dia) após a quimio- terapia com ciclofosfamida + fludarabina. Uma pausa de segurança ocorrerá até que todos os 3 indivíduos tenham completado 28 dias de acompanhamento. Em seguida, três indivíduos receberão CART- BCMA + huCART19 como infusões sequenciais de dose única no mesmo dia (Coorte 2), 3 dias (+/- 1 dia) após a quimioterapia com ci- clofosfamida + fludarabina. Um período de espera de 21 dias será ins- tituído entre o início do regime de cada indivíduo (ou seja o primeiro dia da quimioterapia de linfodepleção). No caso de um DLT, recruta- mentos/infusões adicionais serão adiados até que uma análise formal de segurança seja realizada pelo Diretor Médico Patrocinador e Inves- tigador Principal, e quaisquer alterações de protocolo recomendadas tenham sido implementadas e aprovadas pelos órgãos de supervisão adequados. Até 6 indivíduos avaliáveis participarão da Fase C (3 em cada coorte).

[00563] Após a terapia com células T CAR, os indivíduos em todas as fases serão elegíveis para receber terapia de manutenção padrão a critério do investigador responsável pelo tratamento, após a primeira avaliação de resposta formal 28 dias após a infusão ou após a resolu- ção de grau < 2 de toxicidade relacionada ao regime, o que ocorrer por último.

[00564] Avaliações clínicas padrão serão realizadas quanto à toxi- cidade e resposta de mieloma. Análises correlativas serão realizadas para avaliar a farmacocinética/farmacodinâmica de expan- são/persistência e depleção de CART-BCMA e huCART19 de células que expressam antígeno-alvo, efeitos em subconjuntos de mieloma múltiplo clonogênico e imunidade anti-mieloma (incluindo imunidade contra antígenos de células-tronco do mieloma). Objetivos Objetivos principais

[00565] 1) Avaliara segurança de CART-BCMA como a consolida- ção de terapia padrão de mieloma múltiplo de primeira ou segunda |i- nha após a linfodepleção com ciclofosfamida + fludarabina.

[00566] 2) Avaliar a segurança de huCART19 administrada com CART-BCMA como consolidação da terapia de primeira ou segunda linha em pacientes com mieloma múltiplo diagnosticado recentemente e como consolidação da terapia de resgate em pacientes com mieloma múltiplo recidivado/refratário. Objetivos Secundários

[00567] 1) Avaliar os resultados clínicos após cada regime com células T CAR (monoterapia com CART-BCMA ou CART-BCMA + hu- CART19 em combinação).

a. Avaliar os critérios de resposta convencionais, obtenção de negatividade para MRD (de acordo com os critérios do IMWG 2016 (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17 (8): e328-e346)) e ob-

tenção de resposta negativa para PET (ausência de doença FDG-avid detectável por PET/CT).

b. Duração de resposta, sobrevida livre de progressão, e sobrevida geral c. MRD molecular por sequenciamento de IgH

[00568] 2) Avaliara cinética de expansão e persistência de CART- BCMA e huCART189 neste ambiente clínico.

[00569] 3) Avaliar os efeitos de huCART19 sobre parâmetros cor- relatos de resistência a CART-BCMA e células clonogênicas de mi- eloma múltiplo, como os seguintes: a. Persistência de células plasmáticas BCMAdim/neg ou CD19+ conforme medido por citometria de fluxo e imunoistoquímica b. Depleção de clonogenicidade de mieloma múltiplo como medida usando ensaios de formação de colônia in vitro em amostras da medula óssea c. Indução de anti-Sox2 e outras respostas imunológicas anti-mieloma d. Depleção de células B CD19+ clonais

[00570] 4) Avaliar a composição celular de produto de aférese e células CART-BCMA/huCART19.

[00571] 5) Avaliaros efeitos de terapia de manutenção pós-infusão sobre a persistência de células T CAR e fenótipo, e eventos adversos relacionados a CAR.

[00572] 6) Caracterizar o fenótipo (imunofenótipo de superfície ce- lular, perfil de expressão gênica) de células do mieloma múltiplo que persistem após CART-BCMA +/- huCART19. Diagnóstico e Critérios de Inclusão Principais

[00573] Fase A (Fase Inicial de Segurança): Pacientes adultos com mieloma múltiplo de alto risco recidivado/refratário a duas linhas de terapia precedentes, mas que respondem à terapia atual.

[00574] Expansão de Fase A: Adultos com mieloma múltiplo de alto risco recidivado/refratário a duas linhas de terapia precedentes, mas que respondem à terapia atual.

[00575] Fase B (Fase de Randomização) e fase C (Fase de Infusão de Dose Única): Pacientes adultos com mieloma múltiplo de alto risco que não obtiveram uma resposta completa restrita após a terapia de primeira ou segunda linha. Agentes de Investigação, Dose e Regime Agente(s) de Investigação: * “Células CART-BCMA: Células T autólogas que expres- sam BCMA (antígeno de maturação de células B)-receptores de antí- geno quiméricos específicos com domínios coestimuladores TORCÇ e 4- 1BB em conjunto (TCRC /4-1BB).

* “Células hucCART19: Células T autólogas transduzidas com vetor lentiviral para expressar TORC:4-1BB de scFV anti-CD19. Também conhecidas como células CTL119.

* —Ciclofosfamida e Fludarabina: Agentes citotóxicos de quimioterapia usados para linfodepleção antes da administração do produto das células T CAR.

Dose e Via de Administração: * “Células CART-BCMA: 5 x 10º células por infusão intra- venosa; Dose aceitável mínima para infusão é 0,5 x 10º.

* “Células hucART19: 5 x 108 células por infusão intrave- nosa; Dose aceitável mínima para infusão é 0,5 x 10º.

* Ciclofosfamida e Fludarabina: Ciclofosfamida 300 mg/m? e Fludarabina 30 mg/m? por infusão intravenosa.

Regime: * “Células CART-BCMA: Infusão de dose dividida e dose única * “Células huCART19: Infusão de dose dividida e dose única.

* —Ciclofosfamida/Fludarabina: Administrado durante 3 di- as; programado para que o último dia da quimioterapia seja 3 dias (+/- 1 dia) antes da primeira infusão de células T CAR (Dia 0).

Duração de administração

[00576] Com base no volume total que será infundido e na taxa de infusão recomendada de 10 a 20 ml por minuto.

Sumário de fases de estudo

[00577] Fase A: a população-alvo (N=3-6) inclui pacientes que (1) têm mieloma múltiplo de alto risco, (2) recidivaram após ou refratários a 2 regimes precedentes, e (3) mostram resposta mínima ou melhor ao regime atual. CART-BCMA e huCART19 são administradas em infu- sões de dose dividida: * Dose1:0,5x10º CART-BCMA + 0,5 x 10º hucCART19 * Dose2:1,5x108º CART-BCMA + 1,5 x 10º hucCART19 * Dose3:3,0x10º CART-BCMA + 3,0 x 10º hucART19

[00578] “Expansão de Fase A: a população-alvo (N=7) inclui pacien- tes que (1) recidivaram após ou refratários a 2 regimes precedentes e (2) mostram resposta mínima ou melhor ao regime atual. CART-BCMA e hucART19 são administradas em infusões de dose dividida: * Dose1:0,5x10º CART-BCMA + 0,5 x 10º hucCART19 * Dose2:1,5x10º CART-BCMA + 1,5 x 10º hucCART19 * Dose3:3,0x10º CART-BCMA + 3,0 x 10º hucART19

[00579] Fase B:a população-alvo (N=20) inclui pacientes que (1) têm mieloma múltiplo de alto risco, (2) estão respondendo à terapia de primeira ou segunda linha, e (3) mostram resposta mínima ou melhor ao regime atual. Os pacientes são randomizados em duas coortes.

[00580] Na Coorte 1, os pacientes recebem CART-BCMA individu- almente em infusões de dose dividida: * Dose1:0,5x108 CART-BCMA

* Dose2:1,5x108 CART-BCMA * Dose3:3,0x108 CART-BCMA No Coorte 2, CART-BCMA e huCART19 são administradas em infu- sões de dose dividida: * Dose1:0,5x10º CART-BCMA + 0,5 x 10º hucCART19 * Dose2:1,5x108º CART-BCMA + 1,5 x 10º hucCART19 * Dose3:3,0x10º CART-BCMA + 3,0 x 10º hucCART19

[00581] Fase C: a população-alvo (N=3-6) inclui pacientes que (1) têm mieloma múltiplo de alto risco, (2) estão respondendo à terapia de primeira ou segunda linha, e (3) mostram resposta mínima ou melhor ao regime atual. Os pacientes são randomizados em duas coortes. Os pacientes na Coorte 1 (N=3) recebem 5 x 10º células CART-BCMA em uma infusão de dose única. Os pacientes na Coorte 2 (N=3) recebem x 108º células CART-BCMA e 5 x 10º células huCART19 em uma in- fusão de dose única.

Introdução

[00582] Esteé um estudo de fase 1 para avaliar CART-BCMA com ou sem huCART19 como terapia de consolidação em pacientes com mieloma múltiplo. Este estudo baseia-se nos resultados do estudo de fase 1 de CART-BCMA, patrocinado pela Penn, em pacientes com mi- eloma múltiplo recidivado/refratário (UPCCH14415/IRBH822756). Em comparação com UPCCtH14415/Penn IRBH822756, este estudo é de- signado para avaliar a segurança das seguintes modificações na ad- ministração de CART-BCMA que os investigadores supõem aumentar a taxa de resposta e a duração da resposta a CART-BCMA e simplifi- car sua administração: * — Administração de CART-BCMA no início do curso da doença dos pacientes: A fundamentação para essa modificação é que a eficácia clínica de CART-BCMA em indivíduos com doença recidiva- da/refratária é provavelmente limitada por deficiências funcionais do repertório de células T pré-tratamento impostas por alta carga de do- ença e terapia inicial extensa. Os indivíduos que respondem à terapia de primeira ou segunda linha terão menor carga da doença e serão expostos à quimioterapia menos citotóxica.

* Administração de células T CAR como uma terapia de consolidação: Em pacientes com mieloma múltiplo avançado, iniciar a fabricação de células T CAR enquanto os pacientes respondem, em vez de progredir, à terapia mais recente pode aumentar a potência dos produtos das células T CAR e reduzir a probabilidade de que compli- cações relacionadas à doença se desenvolvam enquanto espera a fa- bricação de células T CAR.

* Uso de fludarabina além de ciclofosfamida no regime de quimioterapia de linfodepleção: Espera-se que a adição de fludarabina aumente a probabilidade de expansão e persistência de células T CAR in vivo, que acredita-se serem necessárias para eficácia sustentada.

* Administração como uma infusão de dose única em vez de dividida: Pretende-se simplificar o esquema de infusão e permitir a coadministração de huCART19 (consultar abaixo).

* Coadministrar huCART19: A fundamentação para a adi- ção de huCART19 é a evidência de que as células de mieloma múlti- plo que expressam CD19 são clonogênicas e medeiam a resistência a CART-BCMA.

[00583] As coortes de Fase A e expansão de Fase A têm como alvo uma população de pacientes recidivados/refratários, em que as terapi- as padrão permitem apenas o controle da doença a curto prazo. Em- bora as Fases B e C deste estudo acarretem uma intervenção de alto risco em uma linha de terapia inicial, a população do estudo consiste em pacientes com mieloma múltiplo de alto risco que não conseguiram obter uma resposta completa à terapia de primeira linha; o prognóstico insatisfatório com a terapia padrão nessa população justifica os riscos associados a essa abordagem inovadora. Fundamentação das células T CAR como Terapia de Consolidação para Mieloma Múltiplo

[00584] "Terapia de consolidação" refere-se ao tratamento após a resposta à terapia anterior para prolongar a resposta e/ou reduzir o risco de recidiva/progressão. Este estudo avaliará as células T CAR como consolidação em dois ambientes clínicos diferentes: (1) em pa- cientes com mieloma múltiplo recidivado/refratário que estão respon- dendo à terapia de resgate padrão (Fase A e expansão de Fase A), e (2) em pacientes com mieloma múltiplo de alto risco recentemente di- agnosticados que estão respondendo à terapia de primeira ou segun- da linha (Fase B e Fase C).

[00585] — No cenário recidivado/refratário, alguns pacientes evoluíram com complicações decorrentes de mieloma múltiplo a fabricação de células T CAR que impossibilitavam a administração de CART-BCMA. Para reduzir a probabilidade de progressão da doença mórbida duran- te a fabricação de células T CAR e potencialmente aumentar a proba- bilidade de resposta durável, a Fase A e a expansão da Fase A deste estudo se concentrarão em pacientes com mieloma múltiplo recidiva- do/refratário que estão respondendo à terapia de resgate padrão. Pa- cientes que respondem à terapia de resgate padrão, porém que ainda têm doença residual detectável, ainda têm um mau prognóstico e são adequados para ensaios clínicos de agentes de investigação.

[00586] Em mieloma múltiplo, a terapia de primeira linha padrão com regimes como lenalidomida, bortezomibe e dexametasona é ge- ralmente consolidada com altas doses de melfalano e transplante au- tólogo de célula-tronco (ASCT). Consolidação com A consolidação com a ASCT prolonga a sobrevida global de pacientes com mieloma múltiplo60-62. O momento ideal de ASCT no curso da terapia moderna para mieloma múltiplo é incerto. Historicamente, o ASCT foi realizado após a resposta à terapia de primeira linha. Este estudo envolve o uso de terapia com células T CAR em vez de ASCT como a consolidação de terapia de primeira linha. Dois grandes estudos randomizados em andamento estão comparando ASCT após terapia de primeira linha versus ASCT após terapia de uma linha posterior. Os resultados inici- ais indicam que não há diferença de sobrevida global entre os dois braços, indicando que o ASCT diferido produz resultados a longo pra- zo comparáveis a ASCT como consolidação de terapia de primeira li- nha. Dessa forma, com o adiamento de ASCT em favor da consolida- ção experimental da terapia de primeira linha com terapia com células T CAR, espera-se não comprometer os resultados para os indivíduos.

[00587] As Fases Be C deste estudo recrutarão indivíduos que responderam à terapia de primeira ou segunda linha e coletará células T para fabricação de células T CAR antes de exposição extensa à quimioterapia citotóxica. Espera-se que as células T coletadas neste ambiente clínico levem a um produto de células T CAR clinicamente mais ativo em comparação com as células coletadas no ambiente re- cidivado/refratário. Essa expectativa está enraizada nos achados de pacientes com CLL tratados com CART19, mostrando que o resultado clínico se correlacionou fortemente com a presença de fenótipos de células T de memória iniciais63. A progressão de mieloma múltiplo é acompanhada de desenvolvimento de fenótipos de células T esgota- das64. À medida que os pacientes progridem através de múltiplas li- nhas de terapia, o repertório de células T provavelmente se torna pro- gressivamente prejudicado à medida que a carga da doença aumenta e os pacientes recebem terapias cada vez mais agressivas, geralmen- te com mecanismos de ação amplamente citotóxicos. Esses fatores - carga de doença aumentada e terapia imunossupressora - provavel- mente limitam a eficácia clínica da terapia com células T CAR em pa- cientes com doença recidivada/refratária.

[00588] Há precedentes em estudos precedentes realizados pela Penn para avaliação de terapias celulares inovadoras como consolida- ção de terapia inicial para mieloma múltiplo. Vários estudos investiga- ram a infusão de células T autólogas após ASCT padrão de atendi- mento após ativação e expansão ex vivo usando a mesma tecnologia que está subjacente à fabricação de células T CAR. Nestes estudos, as células T foram coletadas para fabricação após resposta à terapia de primeira linha, porém antes de ASCT. Os estudos iniciais desta abordagem demonstraram que a reconstituição imune pós-ASCT po- deria ser aumentada pela combinação de vacinação com infusão autó- loga de células T65-70. Em UPCC 01411, células T geneticamente modificadas foram utilizadas pela primeira vez neste cenário. Neste estudo, as células T foram transduzidas com receptores de células T com afinidade aumentada contra antígenos câncer-testículos (NY- ESO1 ou MAGE-A3, dependendo do tipo de HLA do indivíduo). Na co- orte que recebeu células T que alvejam NY-ESO1, 9/10 indivíduos exi- biram persistência de células manipuladas no sangue periférico 22 anos após a infusão, indicando que as células T manipuladas fabrica- das a partir dessa população de pacientes podem obter persistência in vivo a longo prazo71.

[00589] Um desafio na avaliação da eficácia das terapias de conso- lidação é como distinguir a resposta à terapia em investigação da res- posta à terapia anterior. Por exemplo, em UPCC 01411, as células T foram administradas imediatamente após altas doses de melfalano e ASCT, tornando difícil distinguir a resposta clínica ao melfalano da resposta clínica às células T geneticamente modificadas. Para evitar essa limitação, este protocolo restringe o recrutamento de indivíduos que obtiveram pelo menos uma resposta menor, porém não uma res- posta completa à terapia anterior, apesar de terem recebido pelo me- nos três ciclos, em tal ponto as respostas normalmente "estabilizam"

(ou seja, não conseguem melhorar consideravelmente com terapia adicional). Além disso, os indivíduos adiarão a consolidação padrão com altas doses de melfalano e ASCT para uma linha de terapia pos- terior e receberão ciclofosfamida e fludarabina, que espera-se que os mesmos não devam efetuar uma resposta anti-mieloma significativa nessa população, como quimioterapia com linfedema. Portanto, com este projeto de estudo, espera-se poder atribuir quaisquer respostas de mieloma múltiplo observadas à atividade clínica das células T CAR. Seleção de indivíduos Critérios de Inclusão

[00590] 1. Os indivíduos podem ter um diagnóstico de mieloma múltiplo de acordo com os critérios de IMWG 2014 (Rajkumar SV, et al. The lancet oncology. 2014;15(12):2538-548) com qualquer uma das seguintes características de alto risco. Não é necessário que os indiví- duos na Expansão de Fase A tenham quaisquer características de alto risco: a. Beta-2-microglobulina 2 5,5 mg/l e LDH maior que o li- mite superior de normalidade. Nota: indivíduos os indivíduos nos quais LDH e/ou Beta-2-microglobulina não foi medida antes do início da te- rapia sistêmica podem se qualificar com base nas medições obtidas após o início da terapia sistêmica.

b. Recursos de FISH de alto risco: deleção 17p, t(14;16), t(14;20), t(4;14) em conjunto com Beta-2-microglobulina 2 5,5 mg/l (ou seja, ISS revisado estágio 3). Nota :indivíduos os indivíduos nos quais a Beta-2-microglobulina não foi medida antes do início da terapia sis- têmica podem se qualificar com base nas medições obtidas após o início da terapia sistêmica.

c. Cariótipo metafásico com >3 anormalidades estruturais, exceto hiperdiploidia d. Leucemia de células plasmáticas (>20% de células plasmáticas no sangue periférico) a qualquer momento antes do recru- tamento e. Não conseguem obter resposta parcial ou melhor (by IMWG 2016 criteria (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):2328-e346)) à terapia inicial com uma combinação de "imid/PI" (talidomida, lenalidomida ou pomalidomida em combinação com borte- zomibe, ixazomibe ou carfilzomibe).

f. Progressão inicial em terapia de primeira linha, definida como progressão (de acordo com os critérios de IMWG 2016 (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):e328-e346)) i. Dentro de um ano após o início de terapia de primeira linha com uma combinação de "imid/PI" i. Dentro de seis meses após o término da terapia de pri- meira linha com uma combinação de "imid/PI" (ou seja, um paciente que recebe uma combinação de "imid/PI", transita para a terapia de observação ou manutenção e progride dentro de seis meses após es- sa transição) iii. Dentro de um ano após a administração de melfalano em altas doses e transplante autólogo de células-tronco (apenas os indivíduos da Fase A)

[00591] 2. Os indivíduos devem cumprir os seguintes em relação à terapia para mieloma anterior: a. Fase A e expansão de Fase A: a. Os indivíduos devem ter uma doença que recidivou ou foi refratária a pelo menos dois regimes, incluindo um inibidor de pro- teassoma e análogo de talidomida (talidomida, lenalidomida, pomali- domida). A refratariedade é definida como progressão da doença em terapia ou dentro de 60 dias após a interrupção da terapia.

b. Os indivíduos devem ter obtido pelo menos uma respos- ta mínima (conforme definido pelos critérios de IMWG 2016 (Kumar S,

et al. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):e328-e346)) a seu regime atual.

c. Os indivíduos não devem ter recebido tratamento ante- rior com terapia celular anti-BCMA. Os indivíduos podem ter recebido tratamento com outros agentes direcionados a BCMA (por exemplo, conjugados de anticorpo-fármaco anti-BCMA ou anticorpos biespeciífi- cos).

b. Fases BeC: a. Os indivíduos devem estar em sua primeira linha de te- rapia para mieloma múltiplo, com a seguinte exceção: indivíduos que tenham avançado para terapia de segunda linha devido à progressão da doença durante a terapia de primeira linha são elegíveis se tal pro- gressão ocorrer dentro de seis meses após o início da terapia de pri- meira linha. As linhas de terapia são definidas pelos critérios de IMWG 2016 (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):e328-e346).

b. Os indivíduos não devem ter recebido quimioterapia ci- totóxica (por exemplo, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposide, cispla- tina) com as seguintes exceções: i. Ciclofosfamida semanal em baixa dose (<500 mg/m?/ semana) ii. Infusão contínua de ciclofosfamida, se limitada a um único ciclo.

c. Os indivíduos não devem ter sido submetidos a trans- plante autólogo ou alogênico de células-tronco.

d. Os indivíduos devem ter iniciado terapia sistêmica para mieloma múltiplo <1 ano antes do recrutamento.

e. Os indivíduos devem ter recebido pelo menos 3 ciclos completos de seu regime atual e obtido pelo menos uma resposta míií- nima (conforme definido pelos critérios de IMWG 2016 (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):e328-e346)) à linha de terapia mais recente.

[00592]3. Os indivíduos não devem ter obtido uma res- posta completa ou restrita de acordo com os critérios de IMWG 2016 (Kumar S, et al. The Lancet Oncology; 2016; 17(8):e328-e346) no momento do recrutamento, a menos que células plasmáticas clonais sejam detectáveis na medula óssea por citometria de fluxo. (Ou seja, os indivíduos em resposta completa ou completa restrita são elegíveis se a doença residual mínima puder ser documentada por citometria de fluxo da medula óssea).

[00593] 4. Os indivíduos devem ter assinado um consentimento informado por escrito.

[00594] 5. Os indivíduos devem ter > 18 anos de idade.

[00595] 6. Os indivíduos devem ter função de órgãos vitais ade- quada: a. Creatinina sérica < 2,5 ou depuração de creatinina >= 30 ml/min (medida ou estimada de acordo com CKD-EPI) e não depen- dente de diálise.

b. Contagem absoluta de neutrófilos = 1000/4l e contagem de plaquetas > 50,000/ul (> 30,000/Ul se as células plasmáticas da medula óssea forem 2 50% da celularidade).

[00596] 7. As toxicidades de terapias precedentes/em andamento, com exceção de neuropatia periférica atribuível à terapia para mieloma múltiplo, devem ter se recuperado para grau < 2 de acordo com os cri- térios do CTCAE 5,0 ou com a linha de base anterior do indivíduo.

[00597] 8. Os indivíduos devem ter um status de desempenho de ECOG de 0 a 2.

[00598] 9. Os indivíduos devem estar dispostos a renunciar ao ASCT de primeira linha.

[00599] 10.Os indivíduos de potencial reprodutivo devem concordar em usar métodos aceitáveis de controle de natalidade, conforme des- crito na Seção de protocolo 4,3.

Critérios de Exclusão

[00600] 1. Mulheres grávidas ou lactantes

[00601] 2. Acesso venoso inadequado ou contraindicações à leu- caférese.

[00602] 3. Hepatite ativa B, hepatite C, ou infecção por HIV ou ou- tra infecção ativa não controlada.

[00603] 4. Qualquer distúrbio médico ou psiquiátrico não controla- do que poderia inviabilizar a participação, conforme descrito.

[00604] 5. Insuficiência cardíaca classe Ill ou IV de NYHA (consul- tar, Apêndice 2) , angina instável ou um histórico de infarto do miocár- dio recente (dentro de 6 meses) ou taquiarritmia ventricular sustentada (>30 segundos).

[00605] 6. Têm doença autoimune ativa, incluindo doença do teci- do conjuntivo, uveíite, sarcoidose, doença inflamatória intestinal ou es- clerose múltipla, ou têm um histórico de doença autoimune grave (con- forme julgado pelo investigador) que exige terapia imunossupressora prolongada.

[00606] 7. Têm envolvimento prévio ou ativo do sistema nervoso central (SNC) (por exemplo, doença leptomeníngea, massas paren- quimatosas) com mieloma. A triagem para isso (por exemplo, com punção lombar) não é necessária, a menos que sintomas suspeitos ou achados radiográficos estejam presentes. Os indivíduos com doença calvarial que se estende intracranialmente e envolve a dura-máter se-

rão excluídos, mesmo que o CSF seja negativo para mieloma. Fármacos de estudo Células CART-BCMA

[00607] As células CART-BCMA são células T autólogas que foram manipuladas para expressar um anticorpo extracelular de cadeia única (scFv) com especificidade para BCMA associada a uma molécula de sinalização intracelular que consiste em domínios de sinalização em tandem, compreendidos do módulo de sinalização TORC, associado ao domínio estimulador 4-1BB. As células CART-BCMA são criopreser- vadas em criomeios infusíveis, e dispensadas em um saco de infusão. As células CART-BCMA serão administradas como infusões de dose dividida nas Fases A e B (10% de dose no dia O, 30% de dose no dia 1, e 60% de dose no dia 2) ou na Fase C (como uma infusão única no dia 0). A dose-alvo de CART-BCMA será 5 x 10º células transduzidas, com uma dose de infusão mínima aceitável de 0,5 x 108 células trans- duzidas. As doses serão formuladas para obter pelo menos a dose mínima aceitável para 10% da dose. As doses subsequentes serão formuladas dependendo de quantas células estão disponíveis. Células huCART19

[00608] As células hucART19 são células T autólogas que foram manipuladas para expressar um anticorpo extracelular de cadeia única (scFv) com especificidade para CD19 associada a uma molécula de sinalização intracelular que consiste em domínios de sinalização em tandem, compreendidos do módulo de sinalização TORC, associado ao domínio estimulador 4-1BB. As células huCART19 são criopreserva- das em criomeios infusíveis, e dispensadas em um saco de infusão. As células huCART19 serão administradas como infusões de dose di- vidida nas Fases A e B (10% de dose no dia 0, 30% de dose no dia 1, e 60% de dose no dia 2) como uma infusão única no dia O (Fase C). À dose-alvo de huCART19 será 5 x 108 células transduzidas, com uma dose de infusão mínima aceitável de 0,5 x 10º células transduzidas. As doses serão formuladas para obter pelo menos a dose mínima aceitá- vel para 10% da dose. As doses subsequentes serão formuladas de- pendendo de quantas células estão disponíveis. Fase A, Expansão de Fase A e Apenas Fase B: Elegibilidade para Re- ceber Infusões de células T CAR Subsequentes (doses de 30% + 60%):

[00609] 1. Os pacientes não devem experimentar uma mudança significativa no desempenho ou no estado clínico em comparação com a visita de estudo anterior que, na opinião do médico responsável pelo tratamento ou IP, poderia aumentar o risco de infusão celular experi- mental.

[00610] 2. Pacientes com novas anormalidades laboratoriais que, na opinião do investigador responsável pelo tratamento ou IP, podem afetar adversamente a segurança do paciente ou a capacidade de o indivíduo receber infusões adicionais de células T CAR pode retardar sua infusão até que o investigador responsável pelo tratamento e o IP determinem que é clinicamente adequado prosseguir com a infusão de células CART-BCMA.

[00611] 3. Seomédico responsável pelo tratamento e/ou IP sentir que o paciente pode estar apresentando sinais/sintomas da síndrome de liberação de citocinas (SRC) ou outras toxicidades graves relacio- nadas a CART, as infusões de 30% e 60% podem ser preventivamen- te adiadas para permitir observação e monitoramento mais longos an- tes de cada infusão subsequente. Uma única elevação de temperatura isolada não define por si só o SRC, porém o investigador deve consi- derar adiar a infusão por 24 horas para observar o indivíduo nesses casos. Se ocorrer um adiamento preventivo, todas as infusões devem ser concluídas até o final do dia +7.

Quimioterapia de linfodepleção

[00612] Antes da(s) infusão(ões) inicial(s) de células T CAR, a qui- mioterapia de linfodepleção será administrada como um regime de ci- clofosfamida 300 mg/m? + fludarabina 30 mg/mºdiariamente por três dias. A quimioterapia de linfodepleção deve ser programada para que o último dia da quimioterapia seja 3 dias (+/- 1 dia) antes da primeira infusão de células T CAR.

[00613] Embora administradas para fins de pesquisa como parte deste estudo, a ciclofosfamida e a fludarabina são agentes aprovados pela FDA e serão preparadas e infundidas de acordo com seus rótulos aprovados pela FDA e com a prática institucional padrão. A pré-medi- cação antiemética preferida para este regime é ondansetrona 16 mg e dexametasona 12 mg, cada uma administrada diariamente antes de cada infusão quimioterápica; esse regime pode ser alterado a critério do investigador responsável pelo tratamento. Antieméticos padrão adi- cionais podem ser prescritos pelo investigador para o uso conforme necessário (por exemplo, ondansetrona, proclorperazina, lorazepam). A dose de fludarabina pode ser reduzida para indivíduos com GFR es- timado < 80 ml/min a critério do investigador.

EQUIVALENTES

[00614] As descrições de cada e todas as patentes, pedidos de pa- tentes e publicações citados no presente documento são, deste modo, incorporadas ao presente documento a título de referência em sua to- talidade. Embora esta invenção tenha sido descrita com referência a aspectos específicos, é evidente que outros aspectos e variações des- ta invenção podem ser concebidos por outros versados na técnica sem se afastar do verdadeiro espírito e escopo da invenção. As reivindica- ções anexas destinam-se a ser interpretadas de modo a incluir todos esses aspectos e variações equivalentes.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um açúcar selecionado a partir de lactose, frutose e rafinose, caracterizado pelo fato de que é para aumentar a expres- são de serpina na cepa de Bifidobacterium longum CNCM 1-2618.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa de B. longum CNCM 1-2618 é cultivada em um meio que compreende o açúcar selecionado a partir de lactose, frutose e rafinose em uma concentração de 0,02 a 0,5% em peso.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o meio compreende o açúcar selecionado a partir de lacto- se, frutose e rafinose a uma concentração de 0,05 a 0,15% em peso, 0,08 a 0,12% em peso, ou cerca de 0,1% em peso.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o açúcar é lactose.

5. Método para aumentar a expressão de serpina na cepa de B. longum CNCM 1-2618, caracterizado pelo fato de que compreen- de o cultivo da cepa de B. longum CNCM 1-2618 em um meio de cultu- ra, sendo que o dito meio de cultura compreende um açúcar selecio- nado a partir de lactose, frutose e rafinose.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende o açúcar em uma con- centração de 0,02 a 0,5% em peso.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteri- zado pelo fato de que o meio de cultura compreende açúcar a uma concentração de 0,05 a 0,15% em peso, 0,08 a 0,12% em peso ou cerca de 0,1% em peso.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações a 7, caracterizado pelo fato de que o açúcar é lactose.

9. Cepa de B. longum CNCM 1-2618, caracterizada pelo fa- to de que é produzida por um método de cultivo da cepa de B. longum

CNCM 1-2618 em um meio de cultura, sendo que o dito meio de cultu- ra compreende um açúcar selecionado a partir de lactose, frutose e rafinose.

10. Cepa de B. longum CNCM 1-2618, produzida por um método, como definido na reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o meio de cultura compreende o açúcar a uma concentração de 0,02 a 0,5% em peso.

11. Cepa de B. longum CNCM 1-2618 produzida por um mé- todo, como definido na reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que o meio de cultura compreende o açúcar em uma concentração de 0,05 a 0,15% em peso, 0,08 a 0,12% em peso, ou cerca de 0,1% em peso.

12. Cepa de B. longum CNCM 1-2618, produzida por um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizada pelo fato de que o açúcar é lactose.

13. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de a cepa de B. longum CNCM 1-2618, como definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 12.

14. Cepa de B. longum CNCM 1-2618, caracterizada pelo fato de que é produzida de acordo com qualquer um dos métodos, como definidos em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, ou a com- posição, como definida na reivindicação 13 para uso no tratamento ou prevenção de doença inflamatória intestinal, doença celíaca, sensibili- dade não celíaca ao glúten, ataxia por glúten, dermatite herpetiforme ou alergia ao trigo.

15. Combinação de (i) cepa de B. longum CNCM 1-2618 e (ii) um açúcar selecionado a partir de lactose, frutose e rafinose, carac- terizada pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de doença inflamatória intestinal, doença celíaca, sensibilidade não celía- ca ao glúten, ataxia por glúten, dermatite herpetiforme ou alergia ao trigo.

14. Use de uma cepa de B. longum CNCM 1-2618 produzi- da de acordo com qualquer um dos métodos, como definidos em qual- quer uma das reivindicações 9 a 12, ou a composição, como definida na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para a prepara- ção de uma composição, kit ou medicamento para tratamento ou pre- venção de doença inflamatória intestinal, doença celíaca, sensibilidade não celíaca ao glúten, ataxia por glúten, dermatite herpetiforme ou alergia ao trigo.

15. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concreti- zações ou quaisquer categorias de reivindicação aplicáveis, por exem- plo, produto, processo ou uso, englobadas pela matéria inicialmente revelada, descrita ou ilustrada no pedido de patente.

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