RS51157B - Baff receptor (bcma), imunoregulatorni agens - Google Patents

Baff receptor (bcma), imunoregulatorni agens

Info

Publication number
RS51157B
RS51157B YUP-106/02A YUP10602A RS51157B RS 51157 B RS51157 B RS 51157B YU P10602 A YUP10602 A YU P10602A RS 51157 B RS51157 B RS 51157B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
baff
cells
amino acid
cell
mice
Prior art date
Application number
YUP-106/02A
Other languages
English (en)
Inventor
Fabienne Mackay
Jeffrey Browning
Christine Ambrose
Jurg Tschopp
Pascal Schneider
Jeffrey Thompson
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
Apotech R. & D.S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27386828&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS51157(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Ma Inc., Apotech R. & D.S.A. filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of YU10602A publication Critical patent/YU10602A/sh
Publication of RS51157B publication Critical patent/RS51157B/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

(a) Antitelo usmereno protiv Sekvence sa ID br.: 1; ili(b) polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu od aminokiseline 8 doaminokiseline 41 u Sekvenci sa ID br.: 1za upotrebu kao lek.Prijava sadrži još 1 nezavisan i 7 zavisnih patentnih zahteva.

Description

PODRUČJE PRONALASKA
Predmetni pronalazak odnosi se na upotrebu BAFF receptora, aktivirajućeg faktora (3-ćelije koji pripada porodici faktora nekrozisa tumora ("TNF") i njegovim blokirajućim agensima, bilo da stimulišu ili inhibiraju ekspresiju B-ćelija i imunoglobulina. Ovaj receptor ima ant-kancer i imunoregulatorne primene, a takođe i upotrebe za tretman imunosupresivnih bolesti kao što je HIV. Sem toga, receptor i njegovi blokirajući agensi igraju ulogu u razvitku hipertenzije i srodnih poremećaja. Dalje, ćelije transfektovane sa genom za ovaj receptor mogu biti upotrebljene u genskoj terapiji da se tretiraju tumori, limfomi, autoimune bolesti ili nasledni genetički poremećaji koji uključuju B-ćelije. Blokirajući agensi, kao što su rekombinantne varijante ili antitela specifična za receptor, imaju takođe imunoregulatorne primene. Takođe su uzeti u obzir upotreba receptora za BAFF kao stimulatora B-ćelija za imuno supresivne bolesti uključujući, na primer, upotrebu kod pacijenata koji prolaze kroz transplantaciju organa (npr., transplante koštane srži) kao" i oporavljanje od tretmana kancera da se stimuliše produkcija B ćelija. Upotreba receptora za BAFF kao pomoćnog sredstva i ili kostimulatora za pobuđivanje i/ili nadoknađivanja nivoa B ćelija do približno normalnih nivoa su takođe uzeti u obzir. Rastvorljivi oblici receptora za BAFF k<j>ji blokiraju funkciju B ćelija mogu takođe biti upotrebljeni da se inhibiraju bolesti posredovane B-ćelijama.
POZADINA PRONALASKA
Predmetni pronalazak odnosi se na novi receptor u TNF porodici. Identifikovan je novi receptor BAFF-R (ili "BCMA").
TNF porodica sastoji se od parova veznika i njihovih specifičnih receptora označenih kao TNF porodica veznika i TNF porodica receptora (Bazzoni i Beutler, 1966). Porodica je uključena u regulaciju imunog sistema i verovatno u druge ne-imunološke sisteme. Regulacija je često na nivou "glavni prekidač" tako da signaliranje TNF porodice može rezultirati velikim brojem naknadnih događaja najbolje okarakterisanih sa TNF. TNF može inicirati opši zaštitni inflamatorni odgovor organizma na stranu invaziju koja uključuje listu izmenjenih adhezionih molekula uključenih u promet ćelija, produkciju hemokina da se dovedu specifične ćelije u specifične odeljke i aktiviranje različitih efektor ćelija. Kao takva, regulacija ovih puteva ima klinički potencijal.
Indukcija različitih ćelijskih odgovora posredovanih takvim citokinima TNF porodice smatra se da je započeta njihovim vezivanjem za specifične receptore. Identifikovana su najmanje dva različita TNF receptora od približno 55 kDa (TNFR1) i 75 kDa (TNFR2) [Hohman i sar., J. Biol. Chem. 264:14927-14934 (1989) i Brockhaus i sar., PNAS, 87: 3127-3131 (1990)]. Velika raznovrsnost je vezana i sa genima TNF receptora. i TNFR-ovi dele tipičnu strukturu receptora površine ćelija uključujući izvanćelijske, transmembrane i unutarćelijske domene. Izvanćelijski deo tipa 1 i tipa 2 TNFR-ova sadrži repetitivne oblike sekvence amino kiselina od četiri domena bogata cisteinom (CDR-ovi). Sličan repetitivni tip CDR-ova postoji kod nekoliko drugih površinskih ćelijskih proteina uključujući p75 receptor faktora rasta nerva, CD-40 antigen B-ćelije među ostalima.
Receptori su snažna oruđa da se razjasne biološki putevi zbog lakoće njihove konverzije u fuzione proteine imunoglobulina. Ovi dimerni rastvorljivi oblici receptora su dobri inhibitori događaja posredovanih sa izlučenim ili za površinu vezanim veznicima. Vezujući se za ove veznike oni sprečavaju veznik da interreaguje sa receptorima vezanim sa ćelijom koja može signalirati. Ne samo što su ovi receptor-lg fuzioni proteini korisni u eksperimentalnom smislu, nego su uspešno upotrebljavani klinički u slučajevima TNF-R-lg da se tretira inflamatorna bolest creva, reumatoidni artritis i akutni klinički sindrom koji prati davanje OKT3 (Eason i sar., 1996; Feldmann i sar., 1966; van Dullemen i sar., 1995). Može se zamisliti da će manipulisanje mnogih događaja posredovanih signaliranjem putem TNF porodice receptora imati široku primenu u tretmanu imuno zasnovanih bolestii i takođe širok raspon bolesti čoveka koje imaju patološke posledice zahvaljujući uključivanju imunog sistema. Rastvorljiv oblik nedavno opisanog receptora, osteoprotegerina, može blokirati gubitak mase kostiju i prema tome, događaji kontrolisani sa signaliranjem TNF porodice receptora nisu neophodno ograničeni na regulaciju imunog sistema. Antitela za receptor mogu blokirati vezivanje veznika i otud mogu takođe imati kliničku primenu. Takva antitela su često dugo živeća i mogu imati prednosti u odnosu na rastvorljive receptror-lg fuzione proteine koji imaju kraće polu-živote u krvi.
Dok inhibicija puteva posredovanih receptorima predstavlja najviše eksploatisanu terapeutsku primenu ovih receptora, originalno je aktivacija TNF receptora bila ta koja je bila klinički obećavajuća (Aggarwal i Natarjan, 1996). Aktivacija TNF receptora može inicirati smrt ćelije u ciljnoj ćeliji i otud je primenjivost za tumore bila i još uvek je atraktivna (Eggermont i sar., 1996). Receptor može biti aktiviran bilo davanjem veznika, tj., prirodnim putem ili su neka antitela koja se unakrsno vezuju sa receptorm takođe potencijalni agonisti. Antitela će imati prednost u onkologiji s obzirom da mogu opstati u krvi duge periode dok veznici generalno imaju kraći životni vek u krvi. Pošto se mnogi od ovih receptora mogu više selektivno eksprimirati u tumorima ili mogu samo signalirati smrt ćelije ili diferencijaciju u tumorima, antitela agonisti mogu biti dobro oružje u tretmanu kancera. Slično tome, mnogi pozitivni imunološki događaji su posredovani preko receptora TNF porodice, npr., inflamatornih reakcija domaćina, produkcije antitela itd. i prema tome agonistička antitela mogu imati korisne efekte u drugim, ne-onkološkim primenama.
Paradoksalno, inhibiranje puteva može imati kliničke koristi u tretmanu tumora. Na primer, Fas veznik se eksprimira u nekim tumorima i ova ekspresija može voditi do smrti Fas pozitivnih limfocita olakšavajući tako sposobnost tumora da izbegne imuni sistem. U ovom slučaju, inhibicija Fas sistema može onda omogućiti imunom sistemu da reaguje na tumor na druge načine sada kada je pristup moguć (Green i VVare, 1997).
OPIS PRONALASKA
Praktičari su identifikovali cDNK klon koji kodira polipeptid, označen u predmetnoj prijavi kao "BAFF-R" ili "BCMA", koji vezuje faktor nekroze tumora, BAFF, faktor aktiviranja B-ćelija, koji pripada porodici faktora nekrozisa tumora ('TNF"). BAFF je isti molekul prethodno opisan u VVO/9912964, koji je ovde inkorporiran referencom.
U jednom obliku, pronalazak obezbeđuje metode uzimanja BAFF-R. U ove metode su uključeni metodi inhibiranja rasta B-ćelija, dendronske ćelije uključuju rast B-ćelije i maturaciju ili produkciju imunoglobulina kod životinje koristeći BAFF-R polipeptid. Takođe su uključeni metodi stimulisanja rasta B-ćelija, rasta dendrita indukovanog B-ćelijama i sazrevanje ili produkciju imunoglobulina kod životinje koristeći BAFF-R polipeptid ili ko-stimulišući rast B-ćelije, rast dendrita indukovanog B-ćelijama i sazrevanje iii produkciju imunoglobulina kod životinje koristeći BAFF-R polipeptid i anti-T antitelo, CD40 veznik ili anti-CD40 veznik.
U drugom obliku, pronalazak obezbeđuje metode za upotrebu BAFF-R u tretmanu autoimunih bolesti, hipertenzije, kardiovaskularnih poremećaja, bubrežnih poremećaja, poremećaja limfo-proliferativnih B-ćelija, imunosupresivnih bolesti, transplantacije organa, i HlV-a. Takođe su uključeni metodi korišćenja agensa za tretiranje, supresovanje ili menjanje imunih odgovora koji uključuju signaliranje puteva između BAFF-R i njegovih veznika i metode inhibiranja zapaljenja davanjem antitela specifičnog za BAFF-R ili njegov epitop.
Metodi predmetnog pronalaska se poželjno obavljaju davanjem terapeutski efektivne količine BAFF-R polipeptida, himeričnog molekula koji sadrži BAFF-R polipeptid fuzionisan za sekvencu heterologe amino kiseline ili za homolog anti-BAFF-R antitela.
U jednom obliku pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže BAFF-R polipeptid i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
U drugom obliku, pronalazak obezbeđuje himerične molekule koji sadrže BAFF-R polipeptid fuzionisan za sekvencu heterologog peptida ili amino kiseline. Primer takvog himeričnog molekula sadrži BAFF-R fuzionisan za Fc region imunoglobulina ili epitopnu tag sekvencu.
U drugom obliku pronalazak obezbeđuje antitelo koje se specifično vezuje za BAFF-R polipeptid. Po porebi, antitelo je monoklonalno antitelo.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 pokazuje sekvencu nukleinske kiseline (SEQ ID br.:2) cDNK za humani BAFF-R (BCMA) i njegovu izvedenu sekvencu amino kiseline (SEQ ID br.:1). Potencijalni početak translacije na bilo kojem ostatku nukleinske kiseline 219 ili 228; cistein bogati domen (CRD) na ostacima nukleinske kiseline 240-341 SEQ ID br.:2 (ostaci amino kiseline 8-41 SEQ ID br:1; i potencijalni transmembranski region na ostacima nukleinske kiseline 375-459 SEQ ID br :2.
Slika 2 pokazuje sekvencu nukleinske kiseline (SEQ ID br.:4) i njenu izvedenu sekvencu amino kiseline (SEQ ID br.:3) od pJST538, plazmid koji kodira BAFF-R-Fc: ostatke nukleinske kiseline 1-69, mišju IgG-kappa signalnu sekvencu; ostatke nukleinske kiseline 70-222, BAFF-R (ostatci nukleinske kiseline 1-153); ostaci nukleinske kiseline 223-906, humani IgG.
Slika 3 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline pJST535, plazmida koji kodira punu dužinu humanog BAFF-R i njegove izvedene skvence amino kiseline.
j
Slika 4 prikazuje poređenje strukture između TNF-R55 i BAFF-R.
Slika 5 prikazuje 293EBNA ćelije transfektovane ili sa (a) CH269 (1.0 ug) ili (b) pJST535 (0.1 ug), plazmid koji eksprimira punu dužinu BAFF-R i obojen je sa 0.5 ug/ml fiag-hBAFF u ogledu formata ploče.
Slika 6(a) prikazuje FACS preklapanje 293EBNA transfektovanog sa pJST535 i obojenog na sledeći način: ne veznik (crni histogram), 1 ug/ml flag-hCD40L (roze) ili flag-hBAFF (zeleno). Svi uzorci su obojeni sa anti-flag M2 praćenom sa magarećim anti-miš IgG kao što je opisano u metodima u primeru 2.
Slika 6(b) prikazuje FACS histogram sa statistikom nekog eksperimenta. Bojenje je sledeće: (1) neobojeno, (2) 7AAD samo, (3) 2. korak i 7AAD samo, (4) 9ug/ml flag-hBAFF, (5) 3ug/ml fiag-hBAFF, (6) 1 ug/ml flag-hBAFF, (7) 033ug/ml flag-hBAFF, (8) 0.11 ug/ml flag-hBAFF, (9) flag-hCD40L 1 ug/ml.
Slika 7 prikazuje imunotaloženje sa BAFF-R-Fc kao što je opisano u metodima u primeru 4. Standardi molakularne težine u kDa su obeleženi sa leve strane slike. Putić (1) 12.5 ng flag-hTWEAK, (2) 12.5ng flag-hBAFF, (3) imunotaloženje flag-hBAFF sa 0.5mi BAFF-R-Fc kondicionim medijumom, (4) imunotaloženje flag-hTVVEAK sa 0.5ml BAFF-R-Fc kondicionim medijumom, (5) imunotaloženje ne veznika sa 0.5ml BAFF-R-Fc kondicionim medijumom, (6) imunotaloženje flag-hBAFF sa kondicionim medijumom iz netransfektovanog 293EBNA, (7) imunotaloženje flag-hTVVEAK sa 0.5ml kondicionim medijumom iz netransfektovanog 293EBNA.
Slika 8 prikazuje krivu rezultata ogleda proliferacije splenocita inkorporiranih u ćelije splenocite miša brojanja po minutu (CPM), su plotovane u odnosu na količinu dodanog humanog BAFF (ug/ml).
Slika 9 prikazuje krivu rezultata ogleda blokiranja BAFF analiziranja vezivanja BAFF za Raji ćelije u kojem MFI (srednje vrednost intenziteta fluorescencije) očitavanja su plotovana u odnosu na količinu R:hlgG1 (ng/mi).
Slika 10(a) prikazuje plotove ekspresije IgM u odnosu na CD1 u FACS analizi za Baff Tg miševe koji su dobili h-lg (srednji panel) ili hBCMA-lg (donji panel) i za divlji tip kontrole iz legla koje su primile PBS injekcije (gornji panel), kao što je prikazano u primeru 11.
Slika 10(b) prikazuje plotove ekspresije CD21 u odnosu na IgM u FACS analizi propuštanjem IgD pozitivne populacije za Baff Tg miševe koji su dobili h-lg (srednji panel) ili hBCMA-lg (donji panel) i za divlji tip kontrole koje su primile PBS injekcije (gornji panel), kao što je prikazano u primeru 11.
Slika 10(c) prikazuje plotove ekspresije CD21 u odnosu na IgM u FACS analizi propuštanjem IgD negativne populacije za Baff Tg miševe koji su dobili h-lg (srednji panel) ili hBCMA-lg (donji panel) i za divlji tip kontrole koje su primile PBS injekcije (gornji panel), kao što je prikazano u primeru 11.
Slika 11 prikazuje težine slezine za sve grupe Baff Tg miševa (date kao težine u mg +/standardna devijacija).
Slika 12 prikazuje krivu proteinuree (mg/dL) u odnosu na broj injekcije za Baff Tg miševe tretirane sa PBS, hlg, BCMA-lg i za kontrole iz legla.
Slika 13 prikazuje krivu srednje vrednosti arterijskog pritiska (mmHg) kod Baff Tg miševa i kontorla divljeg tipa.
Slika 14 prikazuje plot individualne srednje vrednosti arterijskog pritiska (mmHg) kod Baff Tg miševa i kontorla divljeg tipa.
Slika 15 prikazuje grafikon sa barovima procenata SNF1 miševa koji pokazuju jak nefritis nakon tretmana sa BAFF-R-lg (BCMA-lg), HulgG ili PBS.
Slika 16 prikazuje grafikon ukupnog CD11c+DC broja ćelija (u milionima) za miševe tretiranein vivosa 20 ug BCMA-lg, 50 ug BCMA-lg, HulgG ili PBS. CDUc+DC ispitane populacije ćelija bile su: (1) CD8a-CD4-, (2) CD8a+CD4, i (3) CD8a-CD4.
DETALJNIOPIS
Definicije
Termini "BAFF-R" i "BCMA" kada se koristi ovde obuhvataju prirodne sekvence BAFF-R i varijante BAFF-R (koji su dalje definisani ovde). BAFF-R može biti izolovan iz mnogih izvora, kao što su mišji ili humani tipovi tkiva ili iz drugog izvora, ili pripremljeni rekombinantnim ili sintetičkim metodima.
"Prirođene sekvence BAFF-R" sadrže polipeptid koji ima istu sekvencu amino kiseline kao BAFF-R izveden iz prirode. Takva prirodna sekvenca BAFF-R može biti izolovana iz prirode ili može biti produkovana rekombinantnim ili sintetičkim načinima. Odsečeni ili izlučeni oblici BAFF-R koji se javljaju prirodno (npr., rastvorljivi oblici koji sadrže, na primer, sekvencu izvanćelijskog domena), varijantni oblici koji se prirodno javljaju (npr., alternativno upleteni oblici) i alelske varijante BAFF-R koje se javljaju prirodno. U jednom obliku pronalaska, prirodna sekvenca BAFF-R je zrela ili prirodna sekvenca pune dužine polipeptida BAFF-R koja sadrži amino kiseline 1 do 184 SEQ ID br.:1 ili njegov fragment.
"Izvanćelijski domen BAFF-R" ili "BAF.<P->R ECD" odnosi se na oblik BAFF-R koji je u osnovi bez transmembrane i citoplazmatičnih domena BAFF-R. Obično će izvanćelijski domen BAFF-R imati manje od 1% takve transmembrane i citoplazmatičnih domena i poželjno će imati manje od 0.5% takvih domena. Po poterbi, BAFF-R ECD će sadržati ostatke amino kiseline 8 do 41 od SEQ ID br.:1, ili ostatke amino kiseline 4 do 51 od SEQ ID br.:1, ili ostatke amino kiseline 1 do 53 od SEQ ID br.:1. U drugom poželjnom obliku predmetnog pronalaska BAFF-R ECD sadrži ostatke amino kiseline od 1 do 50 SEG ID br.:1. U poželjnom obliku predmetnog pronalaska BAFF-R ECD sadrži ostatke amino kiseline 1 do 51 od SEQ ID br.:1. Iskusni praktičar shvatiće da domen transmembrane identifikovan za BAFF-R polipeptid predmetnog pronalaska je identifikovan shodno kriterijumima koji se rutinski koriste u praksi za identifikovanje tog tipa hidrofobnog domena. Prave granice domana transmembrane mogu varirati ali najverovatnije ne više od 5 amino kiselina na bilo kom od krajeva domena posebno pomenutih ovde. Shodno tome, BAFF-R ECD može po potrebi sadržati amino kiseline 8-41 (SEQ ID br.:1).
"Varijanta BAFF-R" znači aktivni BAFF-R kao što je dole definisano koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence amino kiseline sa BAFF-R koji ima izvedenu sekvencu amino kiseline pokazanu u SEQ ID br.:1 za punu dužinu prirodne sekvence BAFF-R ili sa BAFF-R ECD sekvencom. Takve varijante BAFF-R uključuju, na primer, BAFF-R polipeptide gde su dodati ostatci jedne ili više amino kiselina, ili delecirani na kraju ili C-terminus sekvence SEQ ID br.:1. Uobičajeno, BAFF-R varijanta imaće najmanje oko' 80% ili 85% identičnosti sekvence amino kiseline, još poželjnije najmanje oko 90% identičnosti sekvence amino kiseline, i čak još poželjnije najmanje 95% identičnosti sekvence amino kiseline sa sekvencom amino kiseline SEQ ID br.:1.
"Procenat (%) identičnosti amino kiseline" u odnosu na sekvence BAFF-R identifikovan ovde je definisan kao procenat ostataka amino kiseline u sekvenci kandidatu koje su identične sa ostacima amino kiseline BAFF-R sekvence, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja prekida, ako je neophodno, da se dostigne maksimalan procenat identičnosti sekvence, i ne uzimajući u obzir ni jednu konzervativnu supstituciju kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje za svrhu
.određivanja procenta identičnosti sekvence amino kiseline može biti dostignuto različitim
načinima koji su u okviru iskustva u praksi, na primer, koristeći javno dostupan kompjuterski softver kao što su BLAST, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Oni sa iskustvom u praksi mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnavanja, uključujući bilo koji algoritam potreban da se dostigne maksimum poravnavanja u odnosu na punu dužinu sekvence koja je poređena.
Termin "označeni epitop" kada se koristi ovde odnosi se na himerni polipeptid koji sadrže BAFF-R, ili domen njegove sekvence, fuzionisane na "obeleženi polipeptid". Obeleženi polipeptid ima dovoljno ostataka da obezbedi epitop protiv kojeg može biti napravljeno antitelo, ili koji može biti identifikovan nekim drugim agensom, a koji je još uvek dovoljno kratak tako da se ne preklapa sa aktivnosti BAFF-R. Obeleženi polipeptid je prilično jedinstven tako da se antitelo u potpunosti ne preklapa sa drugim epitopima. Pogodni obeleženi polipeptidi obično imaju najmanje 6 ostataka amino kiselina i obično između oko 8 do oko 50 ostataka amino kiselina (poželjno oko 10 do oko 20 ostataka).
"Izolovani" kada se koristi da se opišu različiti polipeptidi obelodanjeni ovde znači polipeptid koji je bio identifikovan i odvojen i/ili obnovljen iz komponente njegove prirodne sredine. Zagađujuće komponente njegove prirodne sredine su materijali koji će se obično preklapati sa dijagnostičkim ili terapeutskim upotrebama polipeptida i mogu uključiti enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvore. U poželjnim oblicima polipeptid će biti prečišćen (1) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje sekvence amino kiseline upotrebom spining kup sekvencera, ili (2) u homogenosti SDSPAGE pod ne-redukujućim ili redukujućim uslovima koristeći Coomassie plavo ili poželjno, bojenje srebrom. Izolovani polipeptid uključuje polipeptidin situunutar rekombinantnih ćelija, pošto najmanje jedna komponenta prirodne sredine BAFF-R-ova neće biti prisutna. Međutim, obično će izolovani polipeptid biti pripremljen najmanje jednim korakom prečišćavanja.
Termin "antitelo" je upotrebljen u najširem smislu i specifično pokriva pojedinačno BAFF-R monoklonalna antitela (uključujući agonist, antagonist i neutralizujuća antitela) i anti-BAFF-R antitelo preparate sa poliepitopnom specifičnosti. Termin "monoklonalno antitelo" onako kako se koristi ovde odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije potpuno homogenih antitela, tj., individualnih antitela koja sadrže populaciju i identičnost sem mogućih mutacija koje se prirodno javljaju koje mogu biti prisutne u malim količinama.
"Prečišćena preparacija" ili "potpuno čista preparacija" polipeptida onako kako se ovde koristi znači polipeptid koji je odvojen od drugih proteina, masti i nukleinskih kiselina sa kojima se javlja u prirodi. Poželjno je da je polipeptid takođe razdvojen od drugih supstanci, npr., antitela, matrica itd., koje se koriste da ga prečiste.
Termin "tretiranje", "tretman" i "terapija" kako se ovde koriste odnose se na lekovitu terapiju, profilaktičku terapiju i preventivnu terapiju.
Termin "peptidi", "proteini" i "polipeptidi" se ovde koriste naizmenično.
"Biološki aktivan" kako se ovde koristi znači da ima aktivnost in vivo ili in vitro koja može biti obavljena direktno ili idirektno. Biološki aktivni fragmenti BAFF-R mogu imati, na primer, 70% homologije amino kiseline sa aktivnim mestom receptora, još poželjnije najmanje 80% i najpoželjnije najmanje 90% homologije. Identičnost ili homologija u odnosu na receptor je ovde definisana kao procenat ostataka amino kiseline u kandidatskoj sekvenci koje su identične sa BAFF-R ostatcima u SEQ ID br.:1, ili koje su identične za definisani deo ostataka amino kiseline u SEQ ID br:1.
Termin "sisar" onako kako se koristi ovde odnosi se na bilo koju životinju koja je klasifikovana kao sisar uključujući ljude, krave, konje, pse, miševe i mačke. U poželjnom obliku pronalaska sisar je čovek.
Praksa predmetnog pronalaska će upotrebiti, sem ako je drugačije naglašeno, konvencionalne tehnike biologije ćelije, kulture ćelije, molekularne biologije, transgene biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK i imunologije, koje su u okviru prakse. Takve tehnike su opisane u literaturi.
Sada će biti napravljene detaljne napomene u odnosu na poželjne oblike pronalaska. Pronalazak se odnosi na upotrebu BAFF-R i molekula srodnih sa BAFF-R da se deluje na rast i sazrevanje B-ćelija i sekreciju imunoglobulina. Pronalazak se odnosi na upotrebu BAFF-R i molekula srodnih sa BAFF-R da deluju na odgovore imunog sistema, koji su traženi od imuno-vezanih bolesti. Sem toga, ovaj pronalazak uključuje tretman kancera i imunih bolesti kroz upotrebu BAFF-R ili BAFF-R srodnih gena putem metoda genske terapije.
BARFF-R i njegovi homologzi produkovani od strane domaćina transformisanih sa sekvencama pronalaska, kao i prirodni BAFF-R prečišćeni procesom poznatim u praksi, ili produkovani iz poznatih sekvenci amino kiselina, korisni su u mnoštvu metoda za antikancer, antitumor i imunoregulatorne primene. Oni su takođe korisni u terapiji i metodima usmerenim na druge bolesti.
Drugi aspekt pronalaska odnosi se na upotrebu polipeptida kodiranih izolovanom nukleinskom kiselinom koja kodira BAFF-R u "antisens" terapiji. Onako kako se ovde koristi "antisens" terapija odnosi se na davanje ili generisanjein situoligonukleotida ili njihovih derivata koji specifično hibridizuju pod ćelijskim uslovima sa ćelijskom mRNK i/ili DNK koja kodira veznik od interesa, tako da se inhibira ekspresija kodiranog proteina, tj., putem inhibicije transkripcije i/ili translacije. Vezivanje može biti putem konvencionalne komplementarnosti para baza ili, na primer, u slučaju vezivanjaza dupleks DNK preko specifičnih interakcija u glavnom udubljenju dvostrukog heliksa. Generalno se "antisens" terapija odnosi na raspon tehnika koje se generalno upotrebljavaju u praksi i uključuju bilo koju terapiju koja je potpomognuta specifičnim vezivanjem za sekvence oligonukleotida.
Antisens konstrukt predmetnog pronalaska može biti isporučen, na primer, kao ekspresioni plazmid, koji kada je transkribovan u ćeliji, produkuje RNK koja je komplementarna najmanje delu ćelijske mRNK koja kodira BAFF-veznik. Alternativno, antisens konsturkt može biti oligonukleotidna proba koja je nastalaex vivo.Takve oligonukleotidne probe su poželjno modifikovani oligonukleotidi koji su otporni na endogene nukleaze, i prema tome stabilnein vivo.Primemi molekuli nukleinskih kiselina za upotrebu kao antisens oligonukleotida su fosforamidi, fosfotioat i analozi metilfosfonata DNK (vidi, npr., 5,176,996; 5,264,564 i 5,256,775). Dodatno, generalni pristupi da se konstruišu oligomeri korisni u antisens terapiji su sumarizovani, na primer, od strane Van Der Krol i sar., (1988) Biotechniques 6:958-976; i Stein i sar., (1988) Cancer Res 48: 2659-2668, specifično ovde inkorporiranih referencom.
BAFF-R pronalaska, kao što je gore diskutovano, je član porodice TNF receptora. Protein, fragmenti ili njegovi homolozi mogu imati široke terapeutske ili dijagnostičke primene.
Polipeptidi pronalaska specifično reaguju sa BAFF, polipeptidom prethodno opisanim u VV099/12964 inkorporiranim ovde referencom. Međutim, peptidi i metodi otkriveni ovde omogućuju identifikovanje molekula koji specifično intereaguju sa BAFF-R ili njegovim fragmentima.
Zaštićeni pronalazak u određenim oblicima uključuje metode korlšćenja peptida izvedenih iz BAFF-R koji imaju sposobnost da se vezuju za BAFF. Fragmenti BAFF-R-ova mogu biti produkovani na nekoliko načina, npr., rekombinantno, putem PCR-a, proteolitičkom digestijom ili hemijskom sintezom. Unutrašnji ili terminalni fragmenti polipeptida mogu biti generisani uklanjanjem jednog ili više nukleotida sa jednog kraja ili oba kraja nukleinske kiseline koja kodira polipeptid. Ekspresija mutirane DNK produkuje polipeptidne fragmente.
Himerični molekuli za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu takođe biti produkovani tehnikama poznatim u praksi. Predmetni pronalazak uključuje upotrebu himeričnih molekula koji sadrže BAFF-R polipeptid (ili njegovu varijantu) fuzionisanu za heterologu sekvencu amino kiseline, kao što je IgG Fc domen imunoglobulina. Poželjno takvi himerični molekuli su rastvorljivi i sadrže rastvorljivi BAFF-R polipeptid. U poželjnom obliku, himerični molekul sadrži ostatke amino kiseline 1 do 50 SEQ ID br.:1 fuzionisane za Fc domen.
Polipeptidni fragmenti mogu takođe biti sintetizovani hemijski koristeći tehnike poznate u praksi kao što je konvencionalna Merrifield čvrsta faza f-moc ili t-boc hernije. Na primer, peptidi i sekvence DNK predmetnog pronalaska mogu biti arbitrarno podeljene u fragmente željene dužine bez preklapanja fragmenata, ili podeljeni u fragmete koji se preklapaju željene dužine. Metodi kao što su ti su opisani niže.
Generisanje rastvorljivih oblika BAFF-R
Rastvorljivi oblici BAFF-R mogu često signalirati efektivno i otud mogu biti davani kao lekovi koji sada mimikriraju oblike prirodne membrane. Moguće je da su BAFF-R, zaštićeni ovde, prirodno izlučeni kao rastvorljivi citokini, međutim ako nisu, neko može rekonstruisati gen da se forsira izlučivanje. Da se kreiraju rastorljivi izlučujući oblici BAFF-R potrebno je ukloniti na nivou DNK N-terminus regiona transmembrane i neki deo stalk regiona, i da ih zameni sa liderom tipa I ili alternativno lider sekvencom tipa II što će omogućiti efikasno proteolitičko isecanje u izabranom ekspresionom sistemu. Iskusni praktičar može varirati količinu stalk regiona sačuvanu u sekrecionom ekspresionom konstruktu da se optimizuju i karakteristike vezivanja veznika i efikasnost sekrecije. Na primer, konstrukt koji sadrži sve moguće dužine stalk-a, tj. odsecanje N-terminala, može biti pripremljen tako da mogu nastati proteini koji započinju na aminokiselinama 1-51. Optimalna dužina stalk sekvence rezultiraće iz ovakovog tipa analize.
U poželjnim oblicima predmetnog pronalaska, rastvorljivi BAFF-R polipeptid je: izolovana prirodna sekvenca BAFF-R polipeptida, koja sadrži ostatke aminokiseline 1 do 51 SEQ ID br.:1 ili njegov fragment; izolovani BAFF-R polipeptid koji ima najmanje 80% (i još poželjnije 90%) identičnosti sekvence aminokiseline sa sekvencom prirodnog BAFF-R polipeptida koji sadrži ostatke aminokiseline 1 do 51 SEQ ID br.:1 ili njegov fragment; izolovanu prirodnu sekvencu BAFF-R polipeptida koji sadrži ostatke aminokiseline 1 do 50 SEQ ID br.:1 ili njegov fragment; ili izolovani BAFF-R polipeptid, koji sadrži ostatke aminokiseline 8 do 41 SEQ ID br.:1 ili njegov fragment.
Generisanje antitela reaktivnih sa BAFF- R
Pronalazak takođe uključuje antitela specifično reaktivna sa zaštićenim BAFF-R ili njegovim ko-receptorima. Anti-protein/anti-peptid antserum ili monoklonalana antitela mogu biti napravljena standardnim protokolima (vidi na primer,Antitela: Laboratorijski praktikumizd. Harlow Hane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Sisar kao što su miš, hrčak ili zec može biti imunizovan sa imunogenim oblicima peptida. Tehnike za davanje imunogenosti proteinu ili peptidu uključuju konjugaciju za nosače, ili druge tehnike dobro poznate u praksi.
Imunogeni deo BAFF-R ili njegovih ko-receptora može biti davan u prisustvu pomoćnog sredstva. Napredovanje imunizacije može biti praćeno detektovanjem titara antitela u plazmi ili serumu. Standardni ELISA ili drugi imunoogledi rnogu biti korišćeni sa imunogenomkao antigenom da se utvrde nivoi antitela.
U poželjnom obliku, predmetna antitela su imunospecifična za antigene determinante BAFF-R ili njegove ko-receptore, npr. antigene determinante polipeptida SEQ ID br.:1, ili blisko srodni humani ili ne humani sisarski homolog (npr. 70, 80 ili 90 procenata homologije, još poželjnije najmanje 95 procenata homologije). U još poželjnijem obliku predmetnog pronalaska anti-BAFF-R ili anti-BAFF-ko-receptor antitela ne reaguju unakrsno u potpunosti (tj. reaguju specifično) sa proteinom koji je npr., najmanje 80 procenata homolog SEQ ID br.:1; poželjno najmanje 90 procenata homolog sa SEQ ID br.:1; i najpoželjnije najmanje 95 procenata homolog sa SEQ ID br.:1. Pod "ne u potpunosti unakrsno reagujući" podrazumeva se da antitelo ima afinitet vezivanja za ne-homologi protein koji je manje od 10 procenata, još poželjnije manje od 5 procenata i čak još poželjnije manje od 1 procenat od afiniteta vezivanja za protein SEQ ID br.:1.
Termin antitelo, onako kako se koristi ovde, ima nameru da uključuje njegove fragmente koji su takođe specifiično reaktivni sa BAFF-R ili njegovim receptorima. Antitela mogu biti fragmentirana koristeći konvencionalne tehnike i fragmenti skrinovani za sposobnost na isti način kao što je opisano gore za cela antitela. Na primer, F(ab')2fragmenti mogu biti generisani tretiranjem antitela sa pepsinom. Nastali F(ab% fragment može biti tretiran da se redukuju disulfidni mostovi, da se produkuju Pab' fragmenti. Antitela predmetnog pronalaska su dalje namenjena da uključe biospecifične i himerične molekule, koji imaju anti-BAFF-R ili anti-BAFF-ko-receptor aktivnost. Prema tome i monoklonalana i poliklonalan antitela (Ab) usmerena protiv BAFF-R i njegovih ko-receptora i fragmenata antitela, kao što su Fab' i F(ab')2mogu biti upotrebljena da blokiraju delovanje BAFF-R i njegovih odgovarajućih ko-receoptora.
Različiti oblici antitela mogu takođe biti napravljeni koristeći standarne tehnike rekombinantne DNK. (Vinter i Milstein, Nature 349:293-299 (1991) specifično inkorporirane ovde referencom). Na primer, mogu biti konstruisana himerična antitela, kod kojih domen vezivanja antigena iz životinjskog antitela je vezan za humani konstantni domen (npr. Cabillv i sar., U.S. 4,816,567, inkorporiran ovde referencom). Himerična antitela mogu redukovati zapažene imunogene odgovore izazvane antitelima životinja kada se koriste u kliničkim tretmanima ljudi.
Sem toga može biti sintetizovano rekombinantno "humanizovano antitelo", koje prepoznaje BAFF-R ili njefove ko-receptore. Humanizovana antitela su himere koje sadrže uglavnom humane IgG sekvence u koje su ubačeni regioni odgovorni za specifično vezivanje antigena. Životinje su imunizovane sa željenim antigenom, odgovarajuća antitela su izolovana i deo sekvenci varijabilnog regiona odgovoran za vezivanje specifičnog antigena je uklonjen. Regioni vezivanja antigena izvedeni iz životinje su zatim klonirani na odgovarajuću poziciju u humanim genima antitela u kojima su regioni vezivanja antigena delecirani. Humanizovana antitela minimizuju upotrebu heterologih (tj., unutrašnjih tipova) sekvenci u humanim antitelima, i tako je manje verovatno da izazovu imune odgovore kod tretiranog subjekta.
Konstrukcija različitih klasa rekombinantnih antitela može se takođe obaviti pravljenjem himeričnih ili humanizovanih antitela koja sadrže različite domene i humane konstantne domene (CH1, CH2, CH3) izolovane iz različitih klasa imunoglobulina. Na primer, antitela sa povećanim valencama mesta za vezivanje antigena mogu biti produkovana rekombinantno kloniranjem mesta vezivanja antigena u vektore koji nose humani: lanac konstantnih regiona. (Arulandam i sar., J. Exp.Med., 177:1439-1450 (1993), inkorporiran ovde referencom).
Sem toga se mogu upotrebiti standardne tehnike rekombinantne DNK da se izmene afiniteti vezivanja rekombinantnih antitela sa njihovim antigenima putem menjenja ostataka amino kiselina u blizini mesta vezivanja antigena. Afinitet vezivanja antigena humanizovanog antitela može biti povećan mutagenezom zasnovanom na molekularnom modeliranju. (Oueen i sar., Proc. Nati. Acad. Sci. 86:10029-33 (1989) inkcrporirna ovde referencom).
Generisanje analoga: produkcija izmenjene DNK i peptidnih sekvenci
Analozi BAFF-R mogu se razlikovati od BAFF-R koji se prirodno javljaju u sekvenci amino kiseline, ili na način koji ne uključuje sekvencu, ili oba. Modifikacije bez-sekvence uključujuin vivoiliin vitrohemijsku derivatizaciju BAFF-R. Modifikacije bez-sekvence uključuju, ali nisu ograničene na, promene u acetilaciji, metilaciji, fosforilaciji, karboksilaciji ili giikozilaciji..
Poželjni analozi uključuju biološki aktivne fragmente BAFF-R, čije sekvence se razlikuju od sekvence date u SEQ ID br.:1, za jednu ili više konzervativnih supstitucija amino kiseline, ili za jednu ili više ne-konzervativnih supstitucija amino kiseline, delecije ili insercije koje ne ukidaju aktivnost BAFF-R-veznika. Konzervativne supstitucije tipično uključuju supstituciju jedne amino kiseline sa drugom sličnih karakteristika, npr., supstituciju unutar sledećih grupa: valin, glicin; glicin, alanin; valin, izoleucin, leucin; asparginska kiselina, glutaminska kiselina; asparagin, glutamin; serin, treonin; lizin, arginin i fenilalanin, tirozin.
Upotrebe
Gen BAFF-R pune dužine (SEQ ID br.:2) ili njegovi delovi mogu biti upotrebljeni kao hibridizacione probe za cDNK biblioteku, da se izoluju, na primer, drugi geni koji imaju identičnost željene sekvence sa sekvencom BAFF-R obelodanjenom u SEQ ID br.:2. Nukleotidne sekvence koje kodiraju BAFF-R mogu se takođe upotrebiti da se konstruišu hibridizacione probe za mapiranje gena koji kodira BAFF-R i za genetičku analizu individua sa genetičkim poremećajima. Skrining ogled može biti dizajniran da se nađu vodeća jedinjenja koja mimikriraju biološku aktivnost BAFF-R. Takav skrining ogled će uključiti oglede pogodne za skrining visoke propusne moći hemijskih biblioteka, čineći ih posebno pogodnim za identifikovanje malih molekula kandidata lekova. Mali molekuli koji su u vidu uključuju sintetička i organska jedinjenja. Nukleinske kiseline koje kodiraju BAFF-R ili njegove modifikovane oblike mogu se takođe upotrebiti da se generišu bilo transgene životinje ili "knock out" životinje koje su povratno korisne u razvitku i skriningu terapeutski korisnih reagensa.
Kao što je opisano ovde, u jednom obliku pronalaska, obezbeđeni su metodi stimulisanja rasta B-ćelija, rasta i sazrevanja B-ćelije indukovanog dendritskom ćelijom ili produkcije imunoglobulina kod životinje koristeći BAFF-R polipeptid ili ko-stimulušući rast B-ćelije, rast i sazrevanje B-ćelije indukovanih dendritskom ćelijom ili produkciju imunoglobulina kod životinje koristeći BAFF-R polipeptid i anti-T antitelo, CD40 veznik ili anti-CD4-0 veznik. Takođe su uključeni metodi inhibiranja rasta i sazrevanja B-ćelije indukovanog dendritskom ćelijom ili produkcije imunoglobulina kod životinja koristeći BAFF-R polipeptid.
U drugom obliku pronalazak obezbeđuje metode upotrebe BAFF-R u tretmanu autoimunih bolesti, hipertenzije, kardiovaskularnih poremećaja, bubrežnih poremećaja, limfoproliferativnog poremećaja B-ćelija, imunosupresivne bolesti, transplantacije organa, zapaljenja i HlV-a. Takođe su uključeni metodi korišćenja agensa za tretiranje, supresiju ili izmenu imunog odgovora uključujući put signaliranja između BAFF-R i njegovog veznika.
U jednom obliku pronalazak obezbeđuje farmaceutski preparat koji sadrži BAFF-R polipeptid i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. Pogodni nosači za BAFF-R polipeptid, na primer, i njegovu formulaciju opisani su u Remington' Pharmaceuticai Sciences, 16. izd., 1980, Mack Publishing Co., izd. Oslo i sar. Obično se u formulaciji koristi odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli da se formulacija učini izotoničnom. Primeri nosača uključuju pufere kao što je slani, Ringer-ov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8 i još poželjnije od oko 7.4 do oko 7.8. Dalji nosači uključuju preparacije za potpomaganje oslobađanja kao što su polupropustljive matrice od čvrstih hidrofobnih polimera, koje su u obliku oblikovanih predmeta, npr., lipozoma, filmova ili mikrodelića. Onima sa iskustvom u praksi biće očigledno da određeni nosači mogu biti više poželjni u zavisnosti od slučaja načina davanja i koncentracije BAFF-R polipeptida koji se daje.
Davanje može biti praćeno injekcijom (npr., intravenski, intraperitonealno, subkutano, intramuskulamo) ili drugim metodima kao što je infuzija koja obezbeđuje isporuku strujanja krvi u efektivnom obliku.
Praktikovanje predmetnog pronalaska će upotrebiti, sem ako nije naznačeno drugačije, konvencionalne tehnike biologije ćelije, kulture ćelija, molekularne biologije, mikrobiologije, rekombinanntne DNK, hernije proteina i imunologije, koje su u okviru iskustva u praksi. Takve tehnike su opisane u literaturi. Vidi na primer, Molekularno kloniranje: Laboratorijski praktikum, 2. izdanje. (Sambrook, Fritsch i Maniatis, izd.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kloniranje DNK, volumeni I i II (D.N. Glover, izd.), 1985; Sinteza oligonukleotida, (M.J. Gait, izd.') 1984; U.S. patent br. 4,683,195 (Mullis i sar.,); Hibridizacija nukleinskih kiselina (B.D. Hames i S.J. Higgins, izd.), 1984; Transkripcija i translacija (B.D. Hames i S.J. Higgis, izd.), 1984; Kultura životinjskih ćelija (R.l. Freshney, izd.), Alan R. Liss, Inc., 1987; lmobilizirane ćelije i enzimi, IRL Press, 1986; Praktični vodič za molekularno kloniranje (B. Perbal), 1984; Metodi u enzimologiji, volumeni 154 i 155 (VVu i sar., izd.) Academic Press, New York; Transfer vektori gena za sisarske ćelije (J.H. Miller i M.P. Calos, izd.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratorv; Imunohemijski metodi u ćeliji i molekularnoj biologiji (Mayer i VValker, izd.), Academic Press, London, 1987; Priručnik eksperimentalne imunologije, volumeni I-IV (D.M. VVeir i C.C. Blackwell, izd.), 1986; Manipulisanje embriona miša, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1986.
Sledeći primeri su obezbeđeni da ilustruju predmetni pronalazak, i ne treba da se protumače kao njegova ograničenja.
PRIMERI:
Primer 1: Detekcija vezivanja BAFF za BAFF-R korišćenjem ogleda ploče
U ovom primeru opisano je vezivanje BAFF za BAFF-R transfektovanih ćelija korišćenjem ogleda ploče.
Humani BAFF-R pune dužine je generisan iz BJAB poliA+ RNK koristeći Superscriptll preamplifikacioni kit (Life Technologies) da se generiše cDNK šablon i amplifikovan sa Pfu1 koristeći prajmere komplementarne sa 5' i 3' kodirajućim sekvencama BAFF-R. PCR produkt je kloniran u CH269, derivat pCEP4 (Invitrogen). Nastali klon je nazvan pJST535. Bubrežne ćelije humanog embriona koje su sadržale EBNA-1 gen (293EBNA) su zasejane na ploču sa 6 bunarčića obavijenu sa fibronektinom i transfektovane sa lipofektaminom (Life Technologies) sa pJST535 u različitim razblaženjima ili CH269 kao kontrola pozadine. 48 časova nakon transfekcije, transfektovane ćelije su ispitane na sposobnost da vezuju rastvorljivi flag-hBAFF(amino kiseline L83-L285) kako sledi. Sve inkubacije bile su na sobnoj temperaturi. Kondicioni medijum je usisan iz bunarčića i ćelije su isprane sa BHA puferom (20mfvi HEPES pH 7.0, 0.5mg/ml BSA, 0.1% NaN3) i inkubirane sa 0.5ug/ml FLAG-hBAFF razblaženom u PBS koji je sadržao 1mM MgCI2, 1mM CaCI2i 0.1%NaN3. Nakon 1 č. inkubiranja BAFF rastvor je uklonjen i ćelije su isprane sa BHA. Ćelije su zatim inkubirane tokom 30 minuta u PBS rastvoru koji je sadržao 1 ug/ml anti-FLAG monokionalnog antitela, M2 (Sigma). Rastvor je usisan i ćelije su isprane sa BHA. Ćelije su zatim inkubirane 30 minuta u 1:3000 razblaženju alkalne fosfataze konjugovanom koza anti-miš IgG F(ab)'2(Jackson ImmunoResearch). Ovaj rastvor je usisan i ćelije su isprane sa BHA. Da se redukuje količina bojenja pozadine zbog endogene alkalne fosfataze, ćelije su inkubirane 15 minuta u 2.5mM levamisola (Vector Laboratories) razblažene u 100mM NaCI, 100mM Tris-HCI pH 9.5 i 5mM MgCI2. Za hromogenu detekciju alkalne fosfataze, inhibitorski rastvor je usisan i ćelije su inkubirane sa rastvorom fast red i nafto I fosfata (Pierce). Bojenje je zapaženo i fotografisano putem mikroskopa male snage.
Izbacivanje fast red boje je zapaženo za sve bunarčiće transfektovane sa ekspresionim plazmidom BAFF-R pJST535. Frekvenca signala istaložena kao količina plazmida transfektovana u ćelije je opala. Bojenje je nije zapaženo za transfektovane ćelije kontrolnog ekspresionog vektora, CH269. Takođe, nije zapaženo bojenje na bilo kojoj od transfektovanih ćelija kada je FLAG-hBAFF izostavljen iz protokla bojenja ili kada je drugi član porodice veznika TNF, FLAG-format LIGHT, bio zamenjen za flag-hBAFF. Prema tome bojenje BAFF-R transfektovanih ćelija sa BAFF pojavljuje se kao specifično.
Primer 2: VezivanjeBAFFza BAFF-R transfektovanih ćelija putem FACS analize
U ovom primeru opisana je detekcija BAFF na BAFF-R transfektovanih ćelija korišćenjem FACS analize.
Plazmid koji kodira BAFF-R, pJST535, pune dužine, je transfektovan u 293EBNA ćelije koristeći FuGen6 (Boehringer Mannheim). 24 ili 48 časova nakon transfekcije, ćelije su uklonjene sa ploča koristeći 5mM EDTA u PBS i izbrojane. Ćelije su isprane dva puta sa FACS puferom (PBS koji je sadržao 10% fetalnog kravljeg seruma, 0.1% NaN3i 10ug/ml hlgG (Jackson ImmunoResearch) i zatim 2.5 x 10<5>ćelija je inkubirano tokom 1 č na ledu sa FLAG-hBAFF razblaženog u FACS puferu u koncentracijama koje su bile u rasponu od 9 ug/ml do 0.037 ug/ml. Ćelije su isprane sa FACS puferom i inkubirane sa anti-FLAG monoklonalnim antitelom, M2, na 5 ug/ml tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su isprane sa FACS puferom i inkubirane 30 minuta na ledu u rastvoru koji je sadržao 1:100 razblaženje R-fikoeritrin konjugovanog F(ab)'2magarećeg anti-miš IgG i 10ug/ml 7-AAD. Nakon što su ćelije isprane sa FACS puferom, one us resuspendovane u FACS puferu koji je sadržao 1% paraformaldehida. FACS analiza je usledila gde su 7-AAD pozitivne ćelije (mrtve) izbačene.
Rezultati FACS analize indiciraju da frakcije ćelija koje su transfektovane sa BAFF-R su u stanju da se vezuju za BAFF. Pri koncentraciji BAFF od 9 ug/ml, oko 28% ćelija vezuje BAFF za srednju vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) od 366. Koristeći PE-obeležena sam magareći anti-miš reagens ne javlja se značajno pomeranje ćelija. Samo 1.3% ćelija ima MFI od 23.5 sa prosečnom vrednosti svih ćelija koja je 5.5. Signal na BAFF-R transfektovanim ćelijama istaioži se opadajućim količinama BAFF. Na 100ng/mg, 8.76% ćelija ima MFI od 78.9.
Primer 3: FACS analiza interakcija BAFF/BAFF-R uključujući GFP marker
U ovom primeru opisana je sposobnost BAFF da vezuje ćelije ko-transfektovane sa BAFF-R i GFP reporter plazmid.
293EBNA ćelije su transfektovane sa pJST535 i GFP reporter plazmidom, kao što je opisano u primeru 2. Reporter plazmid kodira membranu usidrenog GFP molekula. Koristeći ko-transfekciju dva plazmida analizirali smo procenat transfektiranih ćelija koje su bile u stanju da
vezuju BAFF. Ćelije su uklonjene sa ploča i podvrgnute BAFF vezivanju i detekciji kao što je opisano u primeru 2. Ponovo je 7-AAD uključen sa ciljem da izbaci mrtve ćelije. Uzorci su analizirani putem FACS i plotovani. Gornji desni kvadrant predstavlja ćelije koje vezuju BAFF (fikoeritrin pozitivan) i eksprimiraju GFP.
I ako izgleda da sve GFP transfektovane ćelije ne vezuju BAFF, postoji značajan deo ćelija u gornjem desnom kvadratu u poređenju sa kontrolom. Trideset i tri procenta transfektiranih ćelija su u gornjem desnom uglu u poređenju sa 8 procenata. Može biti da je određeni nivo BAFF-R ekspresije potreban za BAFF da se vezuje za ćelije. Takođe je moguće da je ko-receptor potreban za interakcije visokog afiniteta i da je taj receptor ograničen na 293EBNA ćelije.
Primer 4: Imunotaloženje flag-hBAFF putem BAFF-R-Fc fuzije
Ovaj primer opisuje specifične interakcije flag-hBAFF sa BAFF-R-Fc, molekula komponovanog od domena bogatog clsteinom (CRD) BAFF-R fuzionisanog sa Fc domenom humanog lgG1.
CRD od BAFF-R je generisan sa RT-PCR iz BJAB poliA+RNK kao u primeru 1 koristeći kao 3' prajmer oligo komplementaran nukleotidima 132-152 od hBAFF-R kodirajuće sekvence. Nastali PCR fragment je kloniran u CH269 nizvodno od mišje IgG-kapa signal sekvence i uzvodno od Fc grupe humanog IgG. Ovaj konstrukt je označen pJST538. Konstrukt pJST538 ili CH269 su transfektovani u 293EBNA sa lipofektaminom. Kondicioni medijumi i ekstrakti ćelija su prikupljeni na 20 časova nakon transfekcije. Ćelije su rastvorene u 20mM tris pH 7.5/50mM NaCI/0.5% NP40/ 0.5% deoksiholične koseline i debris je izcentrifugiran. Alikvot kondicionog medijuma i ekstrakti ćelija su kombinovani sa jednakom zapreminom 2 x SDS redukujućeg pufera, prokuvan i podvrgnut SDS-PAGE i VVestern transferu. Da se potvrdi ekspresija, membrana je probana sa 1:3000 razblaženjem mišjeg anti-humanog IgG konjugovanog za peroksidazu rena (HRP) u 5% nemasnog suvcg mieka u TBST na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta i ispran sa TBST. Blotovi su razvijeni sa ECL (Amersham) i eksponirani na filmu.
Imunotaloženja su izvedena inkubiranjem 25ng od bilo flag-hBAFF ili flag-hTVVEAK sa 0.5 ml kondicioniranog medijuma od transfektiranih 293EBNA sa bilo pJST538 ili CH2S9 na4°C tokom 1 časa uz mućkanje praćeno dodavanjem 30ul ProteinA-Sepharose (Pharmacia) i produženim mućkanjem preko noći. Perle ProteinA-Sepharose su dva putra isprane sa PBS i resuspendovane u 2 x SDS redukujućim uzorkom pufera. Nakon SDS-PAGE i western transfera, blotovi su inkubirani sa 5ug/ml anti-flag monoklonalnim antitelom M2 (Sigma) u 5% nemasnom suvom mleku u TBST na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Blotovi su isprani sa TBST i inkubirani sa 1:3000 razblaženjem kozjeg anti-miš IgG HRP konjugatom (Jackson Immunoresearch) u 5% nemasnog suvog mleka u TBST na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Blotovi su razvijeni sa ECL (Amersham) i eksponirani na filmu.
Nakon transfekcije pJST538 u 293EBNA ćelije, detektovana je ekspresija približno 43Da proteina i u ćelijskim ekstraktima i kondicionom medijumu putem VVestern blot analize sa mišjim anti-humanim IgG (Jackson Immunoresearch), indicirajući da je BAFF-R-Fc fuzija efikasno eksprimirana i izlučena.
U imunotaloženju zapažena je traka samo kao rezultat inkubacije BAFF-R-Fc i falg-hBaff. Ova traka je ko-migrira!a sa direktno unesenim uzorkom flag-hBAFF. Ni jedan od drugih putića nije produkovao signal, ukazujući da su interakcije između BAFF-R-Fc i falg-hBAFF specifične.
Primer 5: Generisanje rastvorljivog oblika receptora
Da se formira inhibitor receptora za upotrebu kod čoveka, neophodna je humana receptor cDNK sekvenca izvanćelijskog domena. Ako je mišji oblik poznat, pregledane su humane cDNK biblioteke koristeći mišje cDNK sekvence i takve manipulacije se obavljaju rutinski u ovom području. Sa humanom cDNK sekvencom, može se dizajnirati oligonukleotidni prajmer za PCR amplifikaciju izvanćelijskog domena receptora u otsustvu transmembrane i intraćelijskih domena. Obično, neko uključuje većinu amino kiselina između poslednjeg disulfida vezanog 'TNF domen" i domena transmembrane. Moguće je varirati količinu "stalk" regiona uključenog da se optimizuje potentnost nastalog rastvorljivog receptora. Ovaj amplifikovani deo biće konstruisan da uključi prigodno mesto restrikcije da se omogući kloniranje u različite C-terminalne ig fuzione himerne vektore. Alternativno se može ubaciti stop signal na 3' kraju i napraviti rastvorljivi oblik receptora bez zaobilaženja upotrebe pristupa Ig fuzione himere. Nastali vektori mogu biti eksprimirani u većini sistema koji se koriste u biotehnologiji uključujući kvasac, ćelije insekata, bakterije i sisarske ćelije i primeri postoje za sve tipove ekspresije. Različiti humani Fc domeni mogu se pričvrstiti da se optimizuje ili eliminiše FcR i komplement interakcija kao što je potrebno. Alternativno, mutirani oblici ovih Fc domena mogu biti upotrebljeni da selektivno uklone FcR ili komplement interakcije ili priključivanje N-vezanih šećera za Fc domen koji ima određene prednosti.
Primer 6: Generisanje agonističkih ili antagonističkih antitela: ,
Gore opisani rastvorljivi oblici receptora mogu se upotrebiti da se imunizuju miševi i da se naprave monoklonalna antitela konvencionalnim metodima. Nastali mAbs koji su identifikovani ELISA metodima mogu dalje biti pregledani za agonističku aktivnost bilo kao rastvorljiva antitela ili imobilizovana na plastici u različitimin vitroćelijskim ogledima. Smrt ćelijske linije HT29 često je prigodan sistem koji je senzitivan na signaliranje putem mnogih TNF receptora. Ako ova linija ne poseduje potrebni receptor, taj receptor pune dužine može biti stabilno transfektovan u HT29 liniju da se sada omogući da radi ogled citotoksičnosti. Alternativno se takve ćelije mogu upotrebiti u Cvtosensor aparatu da se ustanovi da li aktivacija receptora može izazvati promenu pH koja je indikativna za događaj signaliranja. Receptori TNF porodice signališu dobro u takvom obliku i ovaj metod ne zahteva da neko zna stvarne biolške događaje započete od strane receptora. Agonistički mAbs za kliničku upotrebu biće "humanizovano". Ova procedura može se takođe upotrebiti da se definiše agonistički mAbs. Takav mAbs biće definisan nedostatkom agonističke aktivnosti i sposobnošću da inhibira interakcije receptor-veznik kao što je praćeno sa ELISA, klasične tehnike vezivanja BIAcore. Na kraju, indukcija sekrecije hemokina od strane različitih ćelija u odgovoru na agonističko antitelo može formirati skrinig ogled.
Primer 7: Skrining za inhibitore interakcija receptor-veznik:
Koristeći receptor-lg fuzioni protein, može se obaviti skrining bilo koje kombinovane biblioteke za molekule koji se mogu direktno vezati za receptor. Ovi molekuli mogu se zatim testirati sa ELISA formatiranim ogledom koristeći receptor-lg fuzioni protein i rastvorljivi oblik veznika za sposobnost da inhibiraju interakciju receptor-veznik. Ova ELISA može se upotrebiti da se direktno pregledaju različite biblioteke prirodnih produkata i tome slično za inhibitorna jedinjenja. Receptor može biti transfektovan u ćelijsku liniju kao što je HT29 linija da se formira biološki ogled (u ovom slučaju citotoksičnosti) koji može zatim formirati skrining ogled.
Primer 8: BAFF-R-lgG uzrokuje redukciju u broju B ćelija kod normalnih miševa
Osam nedelja stare ženke BALB/c miševa dobijene su od Jackson Laboratorv (Bar Harbor, ME). Miševi (3/grupa) primili su i.p. ili PBS, 400p,g humanog BAFF-R-hulgG1 (hBAFF-R-Ig) fuzionog proteina (isporučenog od strane Teresa Cachero, Biogen), ili 400u,g prečišćenog humanog IgG (HuigG) (Sandoz, Basel, Switzerland) u danima -8, -5, -1 i +2. Miševi su primili 100uJ 10% crvenih krvnih ćelija ovce (SRBC) (Colorado Serum Companv, Denver, CO) nultog dana.
U vreme žrtvovanja krv je sakupljena preko kardijačne punkture u tube koje su sadržale EDTA, i crvene krvne ćelije su lizirane u hipotoničnom puferu. Krv je takođe sakupljena bez EDTA za pripremanje seruma. Suspenzije pojedinačnih ćelija pripremljene su iz slezina mezenteričnih limfnih čvorova (MLN) i crvene krvne ćelije su lizirane u hipotoničnom puferu. Obavljena je flou citometrija koristeći PE-konjugovani anti-CD45Ft/B220, anti-sindekan/CD138 i anti-B7.2 i FITC-konjugovani anti-lgM i anti-CD45R/B220. Svi mAbs su dobavljeni od Pharmingen (San Diego, CA). Ukratko, Fc receptori su blokirani sa 10u.g/ml Fc Block (Pharmingen) tokom 15 minuta na ledu, praćenim dodavanjem PE- i FITC-konjugovanih mAbs i mAbs i inkubirani na ledu tokom 20-30 min. Ćelije su isprane 1 x i suspendovane u 0.5% formaldehidu. Podaci o fluorescenciji ćelija su dobijeni na flou citometru FACSalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, CA) i analizirane koristeći CELLOuest™ softver (Becton Dickinson).
Nakon tretmana sa hBAFF-R-lg bilo je približno 50% redukcije u broju B ćelija u perifernoj krvi i u ispitanim perifernim limfnim organima. B220<vlsoki>lgM<n>,<sk0>B ćelije procenjene za 23.4% i 21.5% ćelija u PBS-tretiranim i HulgG tretiranim miševima, respektivno, dok je ta populacija predstavljala samo 9.9% ćelija u hBAFF-R-lg-tretiranim miševima. Plazma ćelije (sndecan/CD138+) pokazale su se neznatno smanjenim kao i sa 5.7% i 4.8% prisutnim u krvi od PBS-tretiranih i HulgG-tretiranih miševa, respektivno u poređenju sa 3.9% kod hBAFF-R-lg-tretiranih miševa. B7.2 molekul je preregulisan na 3.1% i 4.5% od B220+ ćelija u PBS-tretiranim i HulgG-tretiranim miševima, respektivno u poređenju sa 1.9% kod hBAFF-R-lg-tretiranih miševa.
U slezini B220<vlsoko>B ćelije su značajno redukovane kod hBAFF-R-lg-tretiranih miševa čineći 18.8% u poređenju sa 36.7% i 40% kod PBS- i HulgG-tretiranih miševa respektivno. Ovaj pad je zapažen i u lgM<v>,<soko>i lgM<n>'<sk0>subpopulacijama (vidi tabelu 8A). Nisu zapažene promene kod novo formiranih odeljaka B ćelija u slezini, B220<nisk>° IgM"<50110>(podaci nisu prikazani). Plazma ćelije (sindekan/CD138+) pokazale su se kao neznatno umanjene kao i sa 3.3% i 3.4% prisustva u slezini PBS-tretiranih i Hulg-tretiranih miševa, respektivno, u poređenju sa 2.4% kod hBAFF-R-lg-tretiranih miševa.
MLN je pokazao opadanje u B220+B ćelijama sa 14.1% prisustva u hBAFF-R-lg-tretiranim miševima u poređenju sa 26.7% i 35.8% kod PBS-tretriranih i HulgG-tretiranih miševa, respektivno. Podaci su sumarizovani u tabeli 8A.
<1>Miševi su tretirani kako je to opisano u odeljku Materijal i metode i podaci su dati kao procenat ± standardna devijacija
Smanjeni procenat B7.2+ B ćelija u krvnim i plazma ćelijama u krvi i slezini hBAFF-R-lg-tretiranih miševa nakon imunizacije sa SRBC-ovima sugeriše da postoji inhibicija aktivacije B ćelija i/ili sazrevanje, i potencijalno povećana eliminacija aktiviranih B ćelija. U slučaju SRBC vrlo mali procenat antigen-specifičnih B ćelija biće aktiviran i odgovoriti na bilo koji antigen.. Zbog hBAFF-R-lg-tretmana koji je rezultovao tako dramatičnom redukcijom u procentu B ćelija u svim ispitanim tkivima, «50%, aktivnosti hBAFF-R-lg izgleda da takođe pogađa mirujuće, zrele B ćelije.
Prema tome zamišljeno je da BAFF-R fuzioni protein može biti upotrebljen kao terapeutski lek sa kliničkom primenom u bolestima posredovanim B ćelijama. Bolesti uključuju one koje su po prirodi autoimune, kao što su sistemski lupus eritematozus, mvasthenia gravis, autoimuna hemolitička anemija, idiopatska trombocitopenija purpura, anti-fosfolipidni sindrom, Chaga-ova bolest, Grave-ova bolest, VVegner-ov granulomatozis, poli-alteritis nodoza i brzi progresivni glomerulonefritis. Terapetski agens takođe ima primenu u poremećajima plazma ćelija kao što su multipli mijelom, VValdenstrom-ova makroglobulinemija, bolest teškog lanca, primarni ili imunocito-vezani amiloidozis i monoklonalna gamopatija nedeterminisanog značaja (MGUS), Onkološki ciljevi uključuju karcinome B ćelija, leukemije i limfome.
Primer 9: Blokiranje proliferacije B ćelija indukovane sa BAFFin vitropomoću rastvorljivog BAFF-R
U ovom primeru pokazujemo da je rastvorljivi BAFF-R: hlgG1 fuzioni protein sposoban da blokira proliferaciju B ćelija u splenocitama miša indukovanu sa BAFF.
Mišje splenocite (5 x 10<s>ćelija/ml) iz Balb/c miševa su izolovane i kultivisane na ploči sa 96 bunarčića u 100 u.l RPMI (Life Technologies) snabdevenog sa 10% fetalnog kravljeg seruma (JRH), 2 mM glutamina, 100 jedinica/ml penicilina i 100 ml/mg streptomicina (Life Technologies). Zatim su dodane različite količine humanog BAFF, 10 p.g/ml humanog BAFF-R: hlgG1 ili humanog Ig, kao i 10 u.g/ml anti-mišjeg teškog u. lanca površine (Jackson Immmuno Research). Nakon 48 č u kulturi na 37°C, ćelije su impulsirane tokom 24 sata sa 1 u-Ci/bunarčić[ metii-<3>H]timidinom (Dupont NEN) i sakupljene pomoću Tomtec (Orange, CT) sakupljača ćelija. Radioaktivnost je merena u tečnom Betaplate sintilacionom brojaču (Pharmacia Biotech).
Slika 8 pokazuje rezultate testa proliferacije splenocita. Pokazani su brojevi inkorporacija u mišije ćelije splenocite po minutu (CPM) u odnosu na dodanu količinu humanog BAFF reagensa. Nivo anti-u. ili fuzionog proteina ili kontrolnog hlgG je držan konstantno na 10 pg/ml. Puni kvadrati predstavljaju nivo proliferacije indukovan samo sa BAFF. Puni krugovi predstavljaju proliferaciju indukovanu sa BAFF i anti-u,.. Kriva sa otvorenim trouglovima predsatvlja inhibiciju dobijenu kada je BAFF-R:hlgG1BAFF dodan sa anti-p. plus BAFF-R:hlgG1. Otvoren romb predstavlja inhibiciju dobijenu upotrebom kontrolnog Ig.
j
Dodavanje BAFF plus anti-u, rezultira u proliferaciji mišjih splenocitain vitro.Novo<3>H timidina inkorporiranog u ćelije je značajno viši od nivoa dobijenog bilo sa samim BAFF ili samim anti-u. dodanim splenocitama. Tretman splenocita sa samim BAFF rezultira inkorporacijom<3>H timidina samo pri vrlo visokim koncentracijama. Dodavanje samog anti-u, ne rezultira proliferacijom. Kada je dodano 10 u,g/ml kontrolonog humanog Ig splenocitama sa povećanim količinama BAFF i 10 u.g/ml anti-u,, nije bilo umerenog porasta nivoa proliferacije. Nasuprot tome kada je dodano 10 u,g/ml humanog BAFF-R:hlgG1 fuzionog proteina ogeldu pod istim uslovima, obim proliferacije je redukovan do nivoa zapaženog u tretmanu sa samim BAFF. Ovo indicira da je BAFF-R:hlgG1 fuzioni protein sposoban da inhibira proliferaciju splenocita indukovanu sa
BAFF i anti-u..
Primer 10: Blokiranje vezivanja BAFF za Raji ćelije koristeći BAFF-R:h!gG1
U ovom primeru opisano je pre-inkubiranje BAFF sa BAFF-R:hlgG1 fuzionim proteinom koje rezultira redukcijom vezivanja BAFF za Raji B ćelije linije limfoma.
U ovom FACS ogledu pre-inkubirano je 200 ng/ml FLAG-obeleženog humanog BAFF sa bilo humanim BAFF-R:h!gG1 ili humanim LTpR:hlgG1 pri dvostrukim razblaženjima u rasponu od20u.g/ml do 39 ng/ml ili bez fuzionog proteina tokom 30 min na ledu. Inkubiranje se odvijalo u FACS puferu koji je sadržao PBS bez Ca<2+>ili Mg<2+>plus 10% FCS (JRH) i 0.05% natrijum azida. Nakon pre-inkubiranja mešavina BAFF-fuzioni protein je dodana u 5 x 10<E>Raji (ATCC) ćelija/ml. Ova inkubacija trajala je 30 min na ledu i zatim su ćelije bile isprane sa 2 ml FACS pufera na 4°C. S ciljem da se detektuje vezivanje BAFF dodano je 5 pg/ml anti-FLAG antitela M2 (Sigma) ćelijama i inkubirano 30 min na ledu. Ćelije su ponovo isprane, kao i gore, i zatim inkubirane sa razblaženjem 1:100 PE konjugovanim magarac anti-miš Ig (Jackson Immuno Research) tokom 30 min. na ledu. Nakon što su ćelije ponovo isprane sa FACS puferom fiksirane su sa 1% paraformaldehida i očitane sa FACS® (Becton Dickinson and Co.).
Slika 9 prikazuje rezultate ogleda blokiraja BAFF. Prikazani su MFI (srednja vrednost intenziteta fluorescencije) očitavanja nastala iz FACS® analize ispitivanja vezivanja BAFF za Raji ćelije. Puni kvadrati predstavljaju podatke kada je humani BAFF-R:hlgG1 pre-inkubiran sa BAFF pre vezivanja za ćelije. Krugovi pokazuju krivu nastalu od dodavanja ne-specifičnog fuzionog proteina, humanog LTj3R:hlgG1 za BAFF. X-osa predsatvlja količinu fuzionog proteina dodanog u 200 ng/ml BAFF pre inkubacije sa ćelijama.
Kada je fuzioni protein pre-inkubiran sa humanim BAFF srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) uzorka bila je 80. Kada je humani LT[3R:hlgGl pre-inkubiran sa BAFF čak i na 20 pg/ml, detekcija vezivanja BAFF za Raji ćelije bila je nepromenjena. Međutim, kada je humani BAFF-R:hlgG1 pre-inkubiran sa BAFF postojao je značajan pad u MFI sve do 20-25, čak na 625 ng/ml fuzionog proteina. MFI pozadine za ovaj eksperiment je 7. Prema tome, BAFF-R:hlgG1 je vrlo efektivan u blokiranju vezivanja BAFF za Raji B ćelije.
Primer 11: BAFF-R-lgG slabi autoimune poremećaje slične lupusu kod transgenih miševa
Ovaj primer opisuje efekte BAFF-r-lg da redukuju periferni pul B-ćelija i inhibiraju razvitak megalije slezine i nefritis.
Pet meseci stari BAFF transgeni (Tg) miševi (C57BL/6) i legla iste starosti upotrebljeni su u eksperimentima. BAFF Tg miševi pokazali su poremećaje limfocita i autoimuni fenotip sličan sistematskom lupus erythematosus-u (Mackav i sar., 1999). Ovaj fenotip uključuje povećane populacije perifernih B ćelija uključujući Transitional 1 (T1) i 2 (T2), zrele (M), marginalnu zonu'(MZ) i CDI^/lgM^ B ćelije.
Miševi su primili Lp. PBS, 400 mg prečišćenog humanog IgG (hlg) (Sandoz, Basel, Switzerland) (3/grupa) ili 400 pg CHO-izvedenog humanog BAFF-R-hulgG1 (hBCMA-lg) fuzioni protein (2/grupa) u danima 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28, 32, 35 i žrtvovani su 40. dana.
U vreme žrtvovanja izmerena je težina slezine i pripremljene su suspenzije pojedinačnih ćelija nakon liziranja crvenih krvnih zrnaca u hipotoničnom puferu. Flou crtometrija je izvedena koristeći FITC-konjugovano anti-CD21/CD35, PE-konjugovano anti-lgD i anti-CDl, citohrom-konjugovano anti CD45R/B220 i biotin-konjugovano anti-lgM. Svi mAbs su dobijeni od Pharmingen (San Diego, CA). Ukratko, Fc receptori su blokirani sa 10 u.g/ml Fc Block (Pharmagen) tokom 10 minuta na ledu, praćenog dodavanjem biotin-konjugovanog mAbs tokom 30 min. na ledu, ispranog 1 x, praćenog dodavanjem FITC, PE, citohrom-konjugovanogAbs, strep-avidin APC i 10u.g/ml Fc Block. Ćelije su inkubirane tokom 30 minuta na ledu, isprane1x i suspendobane u 0.5% paraformaldehida. Podaci o fluorescenciji ćelija su dobijeni na FACSCalibur (flou citometar (Becton Dickinson, San Jose, CA) i analizirani koristeći CELLOuest (softver (Becton Dickinson).
Prisustvo proteina u urinu miša je mereno koristeći Multistix 10 SG reagens trake za urinalizis (Baver Corp., Diagnostic Division).
Rezultati su prikazani u tabelama 11 A i 11B niže:
Slezina 3 meseca starih BaffTg miševa (n=3) i vršnjaka iz legla (n=2) je izolovana i podvrgnuta FACS analizi kako je to opisano u Materijali i metode. T1, T2, M i MZ ćelije su definisane tehnikom sledećih markera (hi:visoko., Io:nisko., int:srednje): T1:lgD<->, IgM""0"0, CD21<10>y"
MZ:lgD\ lgM<N>, CD21
T2:lgD<+>, IgM*", CD21W ;M:l<g>D<+>, lgM<te>, CD21<int>; 10 meseci stari Baff Tg miševi (n=3) i vršnjaci iz legla (n=3) podvrgnuti su FACS analizi kako je to opisano u Tabeli 1. ;Nakon davanja hBAFF-R-lg Baff Tg miševima, T1, T2, M, MZ populacije i CDr,<soki/>l<g>Mv<lsol<i>B ćelije u slezini su redukovane značajno u poređenju sa PBS i hlg tretiranim Baff Tg miševima, ukupni brojevi T1, T2, M, MZ i CDr<sol>7lgM<v>",<<*0>B ćelije su redukovane do nivoa sličnog iii nižeg od onog od kontrolnih legla tretiranih sa PBS (Slike 10a, 10b, 10c).
BAFF-R-lg tretman Baff Tg miševa rezulirao je slabljenjem Baff-posredovane autoimune bolesti što je zabeleženo putem zapaženja da BAFF-R-tretirani miševi imaju slezinu normalne veličine dok su kontrolno-tretirani Naff Tg miševi pokazali megaliju slezine (slika 11). Sem toga razvitak proteinurije, indikatora disfunkcije bubrega, je inhibiran kod BAFF-R-lg tretitanih miševa, dok su kontrolno-tretirani Naff Tg miševi razvili nefritis kao što je determinisano podizanjem nivoa proteinurije (slika 12).
Miševi transgeni za Baff imaju jako povećane brojeve perifernih B ćelija i naša dalja analiza otkrila je značajno povećane T1, T2, MZ subpopulacije B ćelija kod tih miševa. Prolazno stanje razvića B ćelija (T1 i T2) je tačka provere u kojoj su autoreaktivne B ćelije najverovatnije eliminisane.
CDr<i>/lgM<vlsok>' B ćelije, koje imaju tendenciju da borave u marginalnoj zoni, bile su takođe visoko povećane kod Baff Tg miševa. Pokazano je da je ova poslednja populacija B ćelija glavni izvor produkcije autoantitela kod NZB/NZVV lupus miševa. Tretman Baff Tg miševa sa BAFF-R-lg rezultira u redukciji T1, T2, MZ i CD1W populacija B ćelija do nivoai sličnog ili nižeg od onog nađenog u kontroli legla divljeg tipa.
BAFF-R-lg je funkcionisao tako da redukuje pul perifernih B ćelija i inhibira razvitak megalije slezine i nefritis. Prema tome, u dodatku na korisnost u sistemskom lupus erythematosus-u lupus nefritisu, delovanje BAFF-R-lg je takođe koristno kao kod bolesti posredovanih B ćelijama koje su po prirodi autoimune kao što su mijastenia gravis, autimuna hemolitička anemija, idiopatska trombocitopenija purpura, anti-fosfolipidni sindrom, Chaga-ova bolest, Grave-ova bolest, Wegener-ov granulomatozis, poliartritis nodoza i brzi progresivni glomerulonefritis. Terapeutski agens takođe ima primenu kod poremećaja kao što su multipni miejelomi, WaIdenstorm-ova makroglobulinemija, bolest teškog lanca, primarni ili imunocitovezani amiloidozis i monoklonalna gamopatija neodređenog značaja (MGUS). Ontološki ciljevi uključuju karcinome B ćelija, leukemije i limfome.
r
Primer 12: Srednji arterijski pritisak kod BAFF transgenih miševa
Ovaj eksperiment opisuje merenje krvnog pritiska kod BAFF transgenih miševa. Napravljena zapažanja tokom procene fenotipa BAFF transgenih mišenja naznačila je potencijal za hipertenziju kod miševa.
Baff Tg miševi, kao što je opisano gore, su anestezirani sa ketaminom. Leva karotidna arterija je oslobođena putem incizije na leđima. U karotidnu arteriju unesen je kateter za merenje krvnog pritiska i rada srca. Kateter je povezan za transduktor pritiska i krvni pritisak je meren koristeći Gould sistem za akviziciju podataka (Po-Ne-Mah Data Acquisition svstem i Gold polvgraph). Iz pritiska talasnog pulsa, sistolnog pritiska, dijastolnog pritiska, srednje vrednosti pritiska izveden je rad srca. Upotrebljene su dve grupe miševa: BAFF transgeni (n=8) i divlji tip kontrole (n=9).
Slika 13 prikazuje srednju vrednost arterijskog pritiska (MAP, u mm Fig) za dve grupe. Kao što je prikazano, BAFF transgeni miševi imaju srednju vrednost MAP od 102±8 mmHg. Kontrolni miševi imali su srednju vrednost MAP od 92±6 mmHg. Tako, BAFF miševi pokazuju
10 mmHg porast u MAP u odnosu na kontrole, i ako to nije dostiglo statistčku značajnost
(ANOVA).
Još detaljnija analiza podataka prikazana je na slici 14. Na ovoj slici prikazani su rezultati za pojedinačne životinje. Kod kontorla divljeg tipa (BAFF -) distribucija podataka sledi tipičnu binomnu distribuciju. Nasuprot tome, pritisci kod BAFF transgenih miševa (BAFF+) pojavljuju se kao da su distribuirani u dve grupe, sa jednom grupom koja je u rasponu 120-130 mmHg i jednom grupom koja je u rasponu 80-90 mmHg.
Pošto populacija BAFF transgenih miševa ima tendenciju prema hipertenziji, u poređenju sa negativnim kontrolnim miševima, analiza individualnih nivoa arterijskog pritiska ukazuje da su BAFF transgeni miševi distribuirani u dve sub-populacije, jedna sa visokim krvnim pritiskom i jedna sa normalnim krvnim pritiskom. Prema tome davanje rastvorljivog BAFF-R fuzionog proteina ili homologa antitela može poboljšati efekte hipertenzije.
Primer 13: BAFF-R-lg tretman SNF1 miševa sa utvrđenom bolesti usporava progresiju u jak nefritis.
Ženke miševa sklone lupusu (SWR x NZB)F1 (SNF1), stare 21 nedelju i koje su pokazivale umereni nefritis (30-100 mg/dl proteinurija), primile su 200 u,g fuzionog proteina humanog BAFF-R-hulgG1 (hBCMA-lg), humani IgG (HulgG) (Sandoz), ili 200u,l PBS i.p. nedeljno tokom 8 nedelja. Urin svakog miša je praćen nedeljno za proteinuriju koristeći Albustix (Bayer Corp. Terrytown, NY). Proteinurija preko 100 mg/dl je beležena kao jak nefritis. BAFF-R-lg je produkovan iz prolazno transfektovanih EBNA 293 ćelija. Kondicionirani medijum iz 239 ćelija koje su previše eksprimirale hBCMA-lg je napunjen u protein A kolonu. Protein je rastvoren koristeći 25 mM fosfat 100 mM NaCI pH 2.8 praćen neutralizovanjem sa 1/20 zapreminom 0.5 M NaPO„ pH 8.6. Odabrane frakcije zasnovane na OD280 su podvrgnute redukcionim i ne-redukcionim SDS-PAGE gelovima i VVestern blotovima da se identifikuje prečišćeni protein.
Tri nedelje nakon što je tretman prekinut 50% miševa tretiranih sa BAFF-R-lg pokazalo je jak nefritis (vidi sliku 15). Ovi podaci pokazuju da rastvorljivi BAFF receptror, BCMA-lg, može funkcionisati da blokira autoimune bolesti posredovane B-ćelijama kao što je lupus nefritis, što rezultira znatnim odlaganjem progresije nefritisa.
Primer 14: BAFF-R-lg tretman normalnih miševa rezultira redukcijom u broju dendronskih ćelija slezine (DC) i atipičnom slezinskom lokalizacijom.
Sedam nedelja starim BALB/c miševima (3/grupa) dato je i.p. ili 20 u.! ili 50 u,l humanog BAFF-R-lg (hBCMA-lg), 50 uJ humanog IgG (HulgG) ili 100 uJ PBS 1x/nedelja tokom 4 nedelje. hBCMA-lg fuzioni protein je prečišćen iz kulture supematanta stabilno transfektovane CHO ćelijske linije. Slezine su dobijene 8 dana nakon poslednje injekcije i digestirane sa kolagenazom (Sigma cat #C-5138) tokom 1 časa na 37°C. Pripremljena je suspenzija pojedinačnih ćelija, RBC su lizirane u hipotoničnom puferu i ćelije su isprane 3 x u PBS-u. Splenocite su pripremljene za flou citometrijsku analizu bojenjem ćelija sa anti-CD11c-biotinom praćenim sa streptavidinom-APC, anti-CD8a-citohromom i anti-CD4-FITC da se proceni DC populacija.
U odvojenom eksperimentu ženke BALB/c (N=3) miševa su dobile i.p. 100 pg hBCMA-lg 1x/nedeljno tokom 4 nedelje nakon čega je slezina trenutno zamrznuta u OCT koristeći 2-metil butan zamrznut u C02. Kriosekcije su isečene i fiksirane u acetonu. Sekcije su inkubirane sa anti-CDUc-biotinom praćenim sa streptavidinom-AP i supstratom BCIP (Pierce) da se učine vidljivim DC-ovi, mAb MOMA-1 praćenim sa anti-pacov IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch) i supstratom 3,3, diaminbezidinom (Sigma, St. Louis MO, Cat # D-1293) da se učine vidljivim metalofilne makrofage i anti-CD35-biotin praćen streptavidinom AP i supstratom (Alkaline Phosphatasae Supstrate Kit I, Vector cat#SK-5100) da se učine vidljivim folikularne dendrične ćelije (FDC).
Miševi tretiraniin vivosa ili 20 pg ili 50 pg BCMA-lg 1 x/nedeljno tokom 4 nedelje pokazali su značajno smanjenje (p<0.05 Student testom) u slezinskim CD11c+ DC-ovima u poređenju sa Hulg i PBS-tretiranim kontrolama. Ovaj pad je viđen za sve ispitane CD11c+ DC populacije: CD8a-CD4-, CD8a+CD4-, i CD8a-CD4+ (slika 16, tabela 14A).
Ovaj pad u slezinskim DC-ovima, koje su kritične ćelije koje prestavljaju antigen, može uticati na aktivaciju B ćelija, sazrevanje i humoralni imunitet.
Otsečci zamrznute slezine dobijeni su od miševa kao što je opisano u Materijalu i metodama. BCMA-lg-tretirani miševi pokazali su atipičan put smeštanja kada su obojeni sa anti-CD11c. DC-ovi se normalno lokalizuju unutar područja T ćelija bele srži i unutar marginalne zone, sa koncentracijama u marginalnoj zoni kanala mostića. Međutim, DC-ovi iz BCMA-lg-tretiranih miševa su nađeni u okruženju perimetra marginalne zone i pokazalo se da je nekoliko u stanju da migrira unutar bele srži (podaci nisu prikazani). Prema tome, blokiranje BAFF/BAFF-R interakcija sa rastvorljivim BAFF receptorom izgleda da se preklapa sa načinom smeštanja DC-ova koji mogu pogoditi njihovu sposobnost da funkcionišu kao ćelije koje predstavljaju antigen, utičući tako na aktivaciju B ćelija, sazrevanje i humoralni imunitet. Dalje, slezina BCMA-Ig-tretiranih miševa nije imala CD35+ FDC-ove kao što određeno imunohistohemijom (podaci nisu prikazani). Pošto FDC-ovi funkcionišu da prezentiraju antigen B ćelijama unutar germinalnih centara (GC), nedostatak takvih ćelija može imati štetan efekat na strukturu GC i afinitet maturacije B ćelija.
Onima sa iskustvom u praksi biće očigledno da se mogu napraviti različite modifikacije i varijacije u polipeptidima, preparatima i metodima pronalaska bez odstupanja od duha i obima pronalaska. Prema tome, namera je da predmetni pronalazak obuhvati modifikacije i varijacije ovog pronalaska pod uslovom da su u obimu podnetih zahteva i da su njihovi ekvivalenti.

Claims (9)

1. (a) Antitelo usmereno protiv Sekvence sa ID br.: 1: ili (b) polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu od aminokiseline 8 do aminokiseline 41 u Sekvenci sa ID br.: 1 za upotrebu kao lek.
2. Upotreba (a) antitela usmerenog protiv Sekvence sa ID br.: 1; ili (b) polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu od aminokiseline 8 do aminokiseline 41 u Sekvenci sa ID br.: 1 za pripremu farmaceutskog preparata za lečenje autoimunog poremećaja, limfoproliferativnog poremećaja B ćelija ili zapaljenja kod sisara.
3. Upotreba iz zahteva 1 ili 2,naznačena timešto polipeptid dalje sadrži Fc domen imunoglobulina.
4. Upotreba prema zahtevu 3,naznačena timešto je dati imunoglobulin IgG.
5. Upotreba prema zahtevu 4,naznačena timešto je dati imunoglobulin humani.
6. Upotreba prema bilo kom od zahteva 2 do 5,naznačena timešto dati lek inhibira rast ćelija kod sisara.
7. Upotreba prema bilo kom od zahteva 2 do 5,naznačena timešto dati lek inhibira proizvodnju imunoglobulina kod sisara.
8. Upotreba prema bilo kom od zahteva 2 do 5,naznačena Umešto dati lek inhibira rast B ćelija indukovan dendritskim ćelijama kod sisara.
9. Upotreba prema bilo kom od zahteva 2 do 8,naznačena timešto je dati sisar čovek.
YUP-106/02A 1999-08-17 2000-08-16 Baff receptor (bcma), imunoregulatorni agens RS51157B (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14937899P 1999-08-17 1999-08-17
US18168400P 2000-02-11 2000-02-11
US18353600P 2000-02-18 2000-02-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU10602A YU10602A (sh) 2005-06-10
RS51157B true RS51157B (sr) 2010-10-31

Family

ID=27386828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-106/02A RS51157B (sr) 1999-08-17 2000-08-16 Baff receptor (bcma), imunoregulatorni agens

Country Status (29)

Country Link
US (7) US7083785B2 (sr)
EP (3) EP1806143B1 (sr)
JP (4) JP4787439B2 (sr)
KR (2) KR20090016772A (sr)
CN (1) CN100447244C (sr)
AT (1) ATE360693T1 (sr)
AU (1) AU780240B2 (sr)
BG (1) BG106519A (sr)
BR (2) BRPI0013391B8 (sr)
CA (1) CA2383154C (sr)
CZ (1) CZ300364B6 (sr)
DE (1) DE60034579T3 (sr)
DK (1) DK1210425T4 (sr)
EA (1) EA004635B1 (sr)
EE (1) EE05673B1 (sr)
GE (1) GEP20053685B (sr)
HK (1) HK1043608B (sr)
HU (3) HU227947B1 (sr)
IL (3) IL148089A0 (sr)
IS (1) IS2955B (sr)
MX (1) MXPA02001665A (sr)
NO (2) NO331410B1 (sr)
NZ (1) NZ517782A (sr)
PL (2) PL211786B1 (sr)
RS (1) RS51157B (sr)
SK (2) SK288287B6 (sr)
TR (1) TR200201063T2 (sr)
UA (1) UA75049C2 (sr)
WO (1) WO2001012812A2 (sr)

Families Citing this family (151)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
WO2001060397A1 (en) * 2000-02-16 2001-08-23 Genentech, Inc. Uses of agonists and antagonists to modulate activity of tnf-related molecules
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
WO2000068378A1 (en) 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
WO2001012812A2 (en) 1999-08-17 2001-02-22 Biogen, Inc. Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent
UA74798C2 (uk) * 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
US20040002068A1 (en) * 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US7371388B1 (en) * 2000-05-04 2008-05-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of Sjogren's syndrome by administration of TR18 polypeptides
WO2001087977A2 (en) * 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
KR20060088905A (ko) 2000-06-16 2006-08-07 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체
US7879328B2 (en) * 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
US20030091565A1 (en) 2000-08-18 2003-05-15 Beltzer James P. Binding polypeptides and methods based thereon
UA83458C2 (uk) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
PL403488A1 (pl) 2001-05-24 2013-07-08 Zymogenetics, Inc. Zastosowanie bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina, bialko fuzyjne, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca bialko fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna i sposób wytwarzania bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina
PL377119A1 (pl) * 2001-08-03 2006-01-23 Genentech, Inc. Peptydy TACIs i BR3 i ich zastosowanie
WO2003072713A2 (en) * 2002-02-21 2003-09-04 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
WO2004011611A2 (en) * 2002-07-25 2004-02-05 Genentech, Inc. Taci antibodies and uses thereof
WO2004094620A2 (en) 2003-03-28 2004-11-04 Biogen Idec Ma Inc. Truncated baff receptors
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
NZ543712A (en) * 2003-06-05 2008-06-30 Genentech Inc Combination therapy for B cell disorders
CN1897966A (zh) 2003-10-20 2007-01-17 比奥根艾迪克Ma公司 使用baff拮抗剂的治疗方法
JP2008505607A (ja) 2004-01-29 2008-02-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｂｃｍａの細胞外ドメインの変異体とその使用法
CA2585927A1 (en) * 2004-11-04 2006-05-18 Genentech, Inc. Polypeptides that bind baff and/or april
US7947805B2 (en) 2004-12-23 2011-05-24 Merck Serono S.A. BCMA polypeptides and uses thereof
AU2006209237B2 (en) * 2005-01-28 2010-06-24 Biogen Ma Inc. Use of BAFF to treat Th2-mediated conditions
WO2007019573A2 (en) 2005-08-09 2007-02-15 Zymogenetics, Inc. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using taci-fusion molecules
CN101262876A (zh) 2005-08-09 2008-09-10 酶遗传学股份有限公司 用taci-ig融合分子治疗b细胞恶性肿瘤的方法
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
CA2626082C (en) * 2005-10-13 2017-04-11 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
ES2618543T3 (es) 2005-11-23 2017-06-21 Genentech, Inc. Métodos y composiciones relacionados con ensayos de linfocitos B
WO2007123765A2 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Human Genome Sciences Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
MX2008014365A (es) 2006-05-15 2008-11-27 Ares Trading Sa Metodos para tratar enfermedades autoinmunitarias utilizando una molecula de fusion del activador de transmembrana-inmunoglobulina.
UY31987A (es) 2008-07-17 2010-02-26 Novartis Ag Anticuerpos monoclonales o proteinas funcionales antagonistas de baffr , con actividad consumidora de las celulas -b in vivo, composiciones, preparaciones y aplicaciones.
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
EP2396035A4 (en) * 2009-02-12 2012-09-12 Human Genome Sciences Inc USE OF ANTAGONISTS OF PROTEIN STIMULATING LYMPHOCYTES B TO PROMOTE GRAFT TOLERANCE
NZ594985A (en) 2009-03-10 2013-07-26 Biogen Idec Inc Anti-bcma (b-cell maturation antigen, cd269, tnfrsf17) antibodies
MX2012002766A (es) 2009-09-03 2012-04-02 Genentech Inc Metodos para el tratamiento, diagnosis y monitoreo de artritis reumatoide.
CN101781680B (zh) * 2009-10-19 2012-05-09 南通大学附属医院 测定对人baff-r基因启动子活性影响因素的方法
WO2011108008A2 (en) * 2010-03-04 2011-09-09 Transgene Biotek Ltd. Antibody for targeted induction of apoptosis, cdc and adcc mediated killing of cancer cells, tbl-cln1
WO2012118750A2 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Genentech, Inc. Biological markers and methods for predicting response to b-cell antagonists
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
PE20141045A1 (es) * 2011-05-27 2014-09-10 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a bcma (cd269/tnfrsf17)
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
TW201334789A (zh) 2012-01-31 2013-09-01 Genentech Inc 抗ｉｇｅ抗體及其使用方法
WO2015100246A1 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
KR20230004939A (ko) 2014-02-07 2023-01-06 맥마스터 유니버시티 3기능성 t 세포-항원 커플러 및 이의 제조 방법 및 용도
ES2939760T3 (es) 2014-03-15 2023-04-26 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico para antígenos
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
JP7054622B2 (ja) 2014-07-21 2022-04-14 ノバルティス アーゲー ヒト化抗ｂｃｍａキメラ抗原受容体を使用した癌の処置
US10577417B2 (en) 2014-09-17 2020-03-03 Novartis Ag Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
PL3226897T3 (pl) 2014-12-05 2021-08-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Przeciwciała do celowania w antygen dojrzewania limfocytów b i sposoby ich zastosowania
KR20240130831A (ko) 2014-12-05 2024-08-29 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 B-세포 성숙화 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
AU2016248946C1 (en) 2015-04-13 2024-10-17 Pfizer Inc. Therapeutic antibodies and their uses
RU2706582C2 (ru) 2015-04-13 2019-11-19 Пфайзер Инк. Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания B-клеток
US12128069B2 (en) 2015-04-23 2024-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
EP3331913A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
PL3380620T3 (pl) 2015-11-23 2024-11-12 Novartis Ag Zoptymalizowane lentiwirusowe wektory transferowe i ich zastosowanie
CA3009709A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Novartis Ag Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
HK1259075A1 (zh) 2016-02-17 2019-11-22 Seattle Genetics, Inc. Bcma抗体和其用以治疗癌症和免疫病症的用途
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
CN109641957B (zh) 2016-06-06 2022-10-04 希望之城 Baff-r抗体及其用途
CA3029209A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Teneobio, Inc. Cd3 binding antibodies
UA126384C2 (uk) 2016-09-14 2022-09-28 Тенеобіо, Інк. Антитіло, яке зв'язує cd3
WO2018111340A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Novartis Ag Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells
NZ795790A (en) 2016-12-21 2025-11-28 Teneobio Inc Anti-BCMA heavy chain-only antibodies
US11535662B2 (en) 2017-01-26 2022-12-27 Novartis Ag CD28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
WO2018144535A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
JP7356354B2 (ja) 2017-05-12 2023-10-04 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト 細胞の操作のための材料及び方法並びに免疫腫瘍学におけるその使用
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
US11970540B2 (en) 2017-06-20 2024-04-30 Teneobio, Inc. Anti-BCMA heavy chain-only antibodies
SG11201913137VA (en) 2017-07-11 2020-01-30 Compass Therapeutics Llc Agonist antibodies that bind human cd137 and uses thereof
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
WO2019071358A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Mcmaster University Y182T MUTATION T CELL ANTIGEN COUPLEUR AND METHODS AND USES THEREOF
KR20200086278A (ko) 2017-10-18 2020-07-16 노파르티스 아게 선택적 단백질 분해를 위한 조성물 및 방법
US20210040205A1 (en) 2017-10-25 2021-02-11 Novartis Ag Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
PL3703750T3 (pl) 2017-11-01 2025-04-07 Juno Therapeutics, Inc. Chimeryczne receptory antygenowe specyficzne dla antygenu dojrzewania komórek b i kodujące polinukleotydy
KR20200074997A (ko) 2017-11-01 2020-06-25 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 B-세포 성숙 항원에 특이적인 항체 및 키메릭 항원 수용체
CA3080395A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a cell therapy and a gamma secretase inhibitor
TW201922774A (zh) 2017-11-15 2019-06-16 瑞士商諾華公司 標靶bcma嵌合抗原受體、標靶cd19嵌合抗原受體及組合療法
EP3713961A2 (en) 2017-11-20 2020-09-30 Compass Therapeutics LLC Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
AU2018375738A1 (en) 2017-11-30 2020-06-11 Novartis Ag BCMA-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
WO2019136432A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
WO2019139987A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Elstar Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered t cells for the treatment of diseases
EP3746116A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 Novartis AG Combination therapy using a chimeric antigen receptor
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20210396739A1 (en) 2018-05-01 2021-12-23 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
SG11202011080QA (en) 2018-05-11 2020-12-30 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating cancer
US20210213063A1 (en) 2018-05-25 2021-07-15 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
CN118459594A (zh) 2018-06-01 2024-08-09 诺华股份有限公司 针对bcma的结合分子及其用途
WO2019237035A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
TWI890660B (zh) 2018-06-13 2025-07-21 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
CN112955465A (zh) 2018-07-03 2021-06-11 马伦戈治疗公司 抗tcr抗体分子及其用途
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
PT3823665T (pt) 2018-07-19 2024-02-26 Regeneron Pharma Recetores antigénicos quiméricos que possuem uma especificidade para o bcma e utilizações dos mesmos
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
SG11202101825QA (en) 2018-08-31 2021-03-30 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CA3117419A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Juno Therapeutics, Inc. Methods for treatment using chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
KR20210106437A (ko) 2018-12-20 2021-08-30 노파르티스 아게 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체를 포함하는 투약 요법 및 약학적 조합물
AU2020222345B2 (en) 2019-02-15 2022-11-17 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US12479817B2 (en) 2019-02-15 2025-11-25 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
CN119661722A (zh) 2019-02-21 2025-03-21 马伦戈治疗公司 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
CN119039441A (zh) 2019-02-21 2024-11-29 马伦戈治疗公司 与nkp30结合的抗体分子及其用途
SG11202107825WA (en) 2019-02-25 2021-09-29 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
WO2020191316A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
KR20210149076A (ko) 2019-04-05 2021-12-08 테네오바이오, 인코포레이티드 Psma에 결합하는 중쇄 항체
US20220168389A1 (en) 2019-04-12 2022-06-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
JP2022531185A (ja) 2019-04-30 2022-07-06 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト 遺伝子改変ｔ細胞を標的化するｃｄ１９を使用するｂ細胞悪性病変の同種細胞療法
JP7489407B2 (ja) 2019-05-21 2024-05-23 ノバルティス アーゲー Ｃｄ１９結合分子及びその使用
CR20210622A (es) 2019-06-14 2022-06-27 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
KR20220038362A (ko) 2019-07-02 2022-03-28 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 재조합 ad35 벡터 및 관련 유전자 요법 개선
AR120566A1 (es) 2019-11-26 2022-02-23 Novartis Ag Receptores de antígeno quiméricos y sus usos
JP2023506958A (ja) 2019-12-20 2023-02-20 ノバルティス アーゲー 骨髄線維症および骨髄異形成症候群を処置するための、デシタビンまたは抗ｐｄ－１抗体スパルタリズマブを伴うかまたは伴わない抗ｔｉｍ－３抗体ｍｂｇ４５３および抗ｔｇｆ－ベータ抗体ｎｉｓ７９３の組合せ
GB2609554B (en) 2020-01-03 2025-08-20 Marengo Therapeutics Inc Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
KR20220147109A (ko) 2020-02-27 2022-11-02 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 발현 세포의 제조 방법
AR121461A1 (es) 2020-02-27 2022-06-08 Novartis Ag Métodos para la fabricación de células que expresan el receptor de antígeno quimérico
JP7625007B2 (ja) 2020-04-29 2025-01-31 テネオバイオ， インコーポレイテッド 重鎖定常領域が修飾された多重特異性重鎖抗体
AU2021288224A1 (en) 2020-06-11 2023-01-05 Novartis Ag ZBTB32 inhibitors and uses thereof
WO2021260528A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
WO2022029573A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
EP4196164A4 (en) * 2020-08-12 2024-09-18 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University SBCMA VARIANTS AND FC FUSION PROTEINS THEREOF
TW202227124A (zh) 2020-08-21 2022-07-16 瑞士商諾華公司 用於體內產生ｃａｒ表現細胞的組成物和方法
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
KR20240004462A (ko) 2021-04-08 2024-01-11 마렝고 테라퓨틱스, 인크. Tcr에 결합하는 다기능성 분자 및 이의 용도
US20240384293A1 (en) 2021-04-27 2024-11-21 Novartis Ag Viral vector production system
US12016923B2 (en) 2021-06-01 2024-06-25 Triumvira Immunologics Usa, Inc. Claudin 18.2 T cell-antigen couplers and uses thereof
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
EP4384201A4 (en) 2021-08-11 2025-07-30 Akso Biopharmaceutical Inc METHODS FOR REDUCING THE PRODUCTION OF IGA, IGM AND/OR IGG IMMUNOGLOBULINS USING SBCMA VARIANTS AND THEIR FC FUSION PROTEINS
AU2022330406A1 (en) 2021-08-20 2024-03-07 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
AU2023369684A1 (en) 2022-10-26 2025-04-17 Novartis Ag Lentiviral formulations
TW202440636A (zh) 2023-03-21 2024-10-16 美商傳記５５有限公司 Ｃｄ１９／ｃｄ３８多特異性抗體
AU2024276994A1 (en) 2023-05-24 2025-10-23 Kumquat Biosciences Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
WO2025170844A1 (en) * 2024-02-05 2025-08-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric polypeptides and methods of use

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
ATE254135T1 (de) 1996-03-14 2003-11-15 Human Genome Sciences Inc Humaner tumornekrosefaktor delta und epsilon
US6541224B2 (en) 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
CA2665133A1 (en) 1996-10-25 1998-05-07 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine .alpha.
AU5705898A (en) 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) * 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
SI0975754T2 (sl) 1997-04-16 2016-04-29 Amgen Inc., Vezivni proteini in receptorji osteoprotegerina
WO1998055620A1 (en) 1997-06-06 1998-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
AU7608898A (en) 1997-06-06 1998-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
AU9376498A (en) 1997-09-05 1999-03-22 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
IL134480A0 (en) * 1997-09-12 2001-04-30 Apotech Sa Kay - an immune system protein and dna sequences encoding the same
EP1027431A2 (en) * 1997-09-12 2000-08-16 Apotech R&D S.A. April- a novel protein with growth effects
WO1999012963A2 (en) 1997-09-12 1999-03-18 Biogen, Inc. Cysteine rich receptors: trail
WO1999033980A2 (en) 1997-12-30 1999-07-08 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
US6297367B1 (en) * 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
DE69921718T2 (de) * 1998-04-01 2005-12-22 Solvay Solexis, Inc., Wilmington Verträgliche Mischungen aus Polyvinylidenfluorid und aromatischem Polyimid
WO2001060397A1 (en) † 2000-02-16 2001-08-23 Genentech, Inc. Uses of agonists and antagonists to modulate activity of tnf-related molecules
WO2000026244A2 (en) 1998-11-04 2000-05-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
PT1642972E (pt) † 1999-01-07 2010-04-07 Zymogenetics Inc Utilizações terapêuticas de receptores solúveis br43x2
US20060067933A1 (en) * 1999-01-07 2006-03-30 Gross Jane A Soluble receptor BR43x2 and methods of using
US7833529B1 (en) * 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
DK1146892T3 (da) * 1999-01-25 2003-11-24 Apoxis Sa BAFF, inhibitorer deraf og deres anvendelse i modulationen af B-celle responset
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
EP1157126A4 (en) 1999-02-24 2005-03-02 Gen Hospital Corp METHOD FOR CLONING INTERMEDIATE SIGNAL TRANSDUCTION PRODUCTS
WO2000058362A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
WO2000068378A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
WO2001012812A2 (en) 1999-08-17 2001-02-22 Biogen, Inc. Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
AU3495301A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Biogen Inc Heterologous polypeptide of the tnf family
US20040013674A1 (en) 2001-04-27 2004-01-22 Christine Ambrose Taci as an anti-tumor agent
WO2001087977A2 (en) 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
KR20060088905A (ko) 2000-06-16 2006-08-07 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체
EP1309718A4 (en) 2000-08-15 2004-08-25 Human Genome Sciences Inc NEUTROKINE-ALPHA AND NEUTROKINE-ALPHA SPLICE VARIANT
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
WO2003055979A2 (en) 2001-11-16 2003-07-10 Human Genome Sciences, Inc. ANTIBODIES THAT IMMUNOSPECIFICALLY BIND TO BLyS
WO2003072713A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
US7083735B2 (en) 2003-09-03 2006-08-01 Laing David A High debris content strainer
PE20141045A1 (es) 2011-05-27 2014-09-10 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a bcma (cd269/tnfrsf17)
FR3005792B1 (fr) 2013-05-16 2017-12-29 Parknplug Procede de gestion dynamique et previsionnel du rechargement electrique de batteries

Also Published As

Publication number Publication date
HU1000128D0 (en) 2010-05-28
BRPI0013391B1 (pt) 2018-09-11
IL230961A (en) 2016-06-30
MXPA02001665A (es) 2003-07-14
US20200095305A1 (en) 2020-03-26
DE60034579T3 (de) 2015-11-12
EP1210425B1 (en) 2007-04-25
BRPI0013391B8 (pt) 2021-05-25
KR20020084842A (ko) 2002-11-11
JP5379107B2 (ja) 2013-12-25
SK288287B6 (sk) 2015-07-01
UA75049C2 (uk) 2006-03-15
NO20020789D0 (no) 2002-02-18
IS2955B (is) 2016-12-15
BR0013391A (pt) 2002-07-09
NO20111232A1 (no) 2011-09-12
US7083785B2 (en) 2006-08-01
EP1806143A2 (en) 2007-07-11
HUP0203084A2 (en) 2002-12-28
US10494416B2 (en) 2019-12-03
HU227008B1 (en) 2010-04-28
JP2003507364A (ja) 2003-02-25
DE60034579T2 (de) 2008-01-31
GEP20053685B (en) 2005-12-12
US20150139992A1 (en) 2015-05-21
CZ2002579A3 (cs) 2002-05-15
US9650430B2 (en) 2017-05-16
IS6273A (is) 2002-02-15
SK2292002A3 (en) 2002-07-02
HU230583B1 (hu) 2017-02-28
NZ517782A (en) 2004-01-30
BG106519A (bg) 2003-04-30
CN100447244C (zh) 2008-12-31
NO20020789L (no) 2002-04-08
EP1806143A3 (en) 2007-07-18
PL354661A1 (en) 2004-02-09
EP2314694A2 (en) 2011-04-27
JP4787439B2 (ja) 2011-10-05
EE200200071A (et) 2003-04-15
US20120214687A1 (en) 2012-08-23
US20180273605A1 (en) 2018-09-27
NO344346B1 (no) 2019-11-11
WO2001012812A3 (en) 2001-09-07
DE60034579D1 (de) 2007-06-06
HU227947B1 (en) 2012-06-28
SK500172015A3 (sr) 2002-07-02
US20020165156A1 (en) 2002-11-07
KR100897082B1 (ko) 2009-05-14
JP5904985B2 (ja) 2016-04-20
US7691804B2 (en) 2010-04-06
WO2001012812A2 (en) 2001-02-22
KR20090016772A (ko) 2009-02-17
SK288603B6 (sk) 2018-10-01
EA200200261A1 (ru) 2002-08-29
TR200201063T2 (tr) 2002-10-21
EA004635B1 (ru) 2004-06-24
HK1043608B (en) 2007-12-07
IL230961A0 (en) 2014-03-31
HK1043608A1 (en) 2002-09-20
CA2383154A1 (en) 2001-02-22
EP1210425B2 (en) 2015-06-17
EP1210425A2 (en) 2002-06-05
AU780240B2 (en) 2005-03-10
AU6911200A (en) 2001-03-13
IL148089A (en) 2015-03-31
YU10602A (sh) 2005-06-10
DK1210425T3 (da) 2007-09-17
JP2011063600A (ja) 2011-03-31
DK1210425T4 (en) 2015-08-10
CA2383154C (en) 2013-04-30
EP1806143B1 (en) 2016-06-15
EE05673B1 (et) 2013-08-15
NO331410B1 (no) 2011-12-19
PL207501B1 (pl) 2010-12-31
CN1379815A (zh) 2002-11-13
EP2314694A3 (en) 2013-12-11
US20100040627A1 (en) 2010-02-18
IL148089A0 (en) 2002-09-12
PL211786B1 (pl) 2012-06-29
ATE360693T1 (de) 2007-05-15
JP2014037434A (ja) 2014-02-27
CZ300364B6 (cs) 2009-04-29
US8828669B2 (en) 2014-09-09
US20020172674A1 (en) 2002-11-21
JP2011116790A (ja) 2011-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10494416B2 (en) Methods of modulating immune responses using BCMA polypeptide
RS51602B (sr) April receptor (bcma) i njegova upotreba
ZA200201201B (en) BAFF receptor (BCMA), an immunoregulatory agent.
HK1157388A (en) Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent
HK1158086A (en) April receptor (bcma) and uses thereof