RS51602B - April receptor (bcma) i njegova upotreba - Google Patents

Abstract

Upotrebaa) polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena od aminokiseline 8 do aminokiseline 41 u sekvenci čiji je ID broj: 8; ilib) antitela usmerenog protiv aminokiselinske sekvence koja je predstavljena od aminokiseline 8 do aminokiseline 41 u sekvenci čiji je ID broj: 8za pripremu farmaceutskog preparata za tretman tumorske ćelije koja eksprimira ligand koji indukuje proliferaciju (APRIL, eng. A Proliferation Inducing Ligand, prim. prev.).Prijava sadrži još 9 patentnih zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA

Predmetni pronalazak generalno se odnosi na metode tretmana kancera. Metodi uključuju davanje određenih faktora antagonista nekrozisa tumora (TNF).

STANJE TEHNIKE

Članovi porodice citokina faktora nekrozisa tumora (TNF) uključeni su u područje kritičnih bioloških funkcija koje se stalno širi. Svaki član TNF porodice deluje vezivanjem jednog ili više članova paralelne porodice receptor proteina. U odgovoru ovi receptori signališu unutarćelijski tako da indukuju širok raspon fizioloških ili razvojnih odgovora. Mnogi od receptorskih signala utiču na sudbinu ćelije i često pokreću terminalno diferenciranje. Primeri ćelijskog diferenciranja uključuju proliferaciju, maturaciju, migraciju i smrt.

Članovi TNF porodice su proteini vezivanja membrane tipa II, koji imaju kratki intraćelijski N-terminalni domen, transmembranski domen i C-terminalne domene vezivanja receptora koji leže izvan površine ćelije. U nekim slučajevima izvanćelijski deo proteina je isečen, kreirajući izlučujući oblik citokina. Dok proteini vezivanja membrane deluju lokalno, verovatno preko kontakta ćelija posredovanog interakcijom sa njihovim receptorima, izlučujući oblici imaju potencijal da cirkulišu ili difunduju, pa prema tome mogu delovati na udaljenim mestima. I za membranu vezujući i izlučujući oblici postoje kao trimeri, i smatra se da transdukuju svoje signale receptom putem olakšavanja skupljanja receptora u grozdove.

Porodica proteina TNF receptora je okarakterisana time što ima jedan ili više izvanćelijskih domena bogatih cisteinom. Svaki region bogat cisteinom kreira domen srži vezan disulfidno. koji doprinosi trodimenzionalnoj strukturi koja formira džep vezivanja veznika. Receptori su vezni proteini membrane tipa I u kojim je izvanćelijski domen kodiran N-terminusom. praćenim transmembranskim domenom i C-terminalnim intraćelijskim domenom. Intraćelijski domen je odgovoran za signaliranje receptora. Neki receptori sadrže intraćelijske "mrtve domene", koji mogu signalirati ćelijski apoptozis, i oni mogu biti jaki induktori smrti ćelije. Druga klasa receptora teško može izazvati smrt ćelije; izgleda da njima nedostaje domen smrti. Treća klasa receptora ne indukuje smrt ćelije. Sve klase receptora mogu signalirati proliferaciju ćelija ili diferencijaciju umesto smrti, u zavisnosti od tipa ćelije ili pojavljivanja drugih signala.

Dobro proučeni primer pluripotentne prirode aktivnosti TNF porodice je nomimantni broj, TNF. TNF može postojati kao membranski vezani citokin ili može biti isečen i izlučen. Oba oblika vezuju se za dva TNF receptora, TNF-R55 i TNF-R75. Originalno opisan na osnovu svoje sposobnosti da direktno ubije tumor ćelije, TNF takođe kontroliše široko područje imunih procesa, uključujući akutne inflamatorne reakcije kao i održavanje homeostaze limfoidnih tkiva.

Zbog dvostruke uloge koju ovaj citokinin može igrati u različitim patološkim okruženjima,i

agonistiantagonist reagenti su razvijeni kao modifikatori bolesti. Na primer, TNF i LTa (koji

takođe signalira kroz TNF receptore) su bili upotrebljeni u tretmanu kancera, posebno oni koji

se nalaze na perifernim mestima, kao što su sarkomi udova. U tom okruženju direktno

signaliranje sa citokinom preko receptora indukuje smrt tumorskih ćelija (Aggarwal i Natarjan,

1996. Eur Cvtokine Netw 7:93-124).

Uimunološkom okruženju, agens koji blokira receptor TNF signaliranja (npr., anti-TNF

mAb rastvorljivi TNF-R fuzioni proteini) upotrebljen je da se tretiraju bolesti kao što su

reumatoidni artritis i upala creva. U ovim patologijama TNF deluje tako da indukuje proliferaciju

ćelija i efektor funkciju pogoršavajući autoimune bolesti,iu tom okruženju blokiranje vezivanja

TNF za njegov receptor(e) ima terapeutske koristi (Beutier, 1999. J. Rheumatol26Suppl 57:16-21).

Nedavno otkriveni sistem veznik/receptor izgleda da je odgovoran za slične manipulacije.

Limfotoksin beta (LTP), član TNF porodice koji formira heterotrimere sa LTa vezuje se za LT(3-R. Neke ćelije tumora adenokarcinoma koje eksprimiraju LTP-R mogu se ubiti ili diferencirati

kada se tretiraju sa antagonističkim anti LTP-R mAb (Browing i sar., 1996. J Exp Med 183: 867-878). U imunološkom okruženju pokazano je da anti LTP mAbilirastvorljivi LTp-R fuzioni

protein mogu blokirati razvitak zapaljenja creva, verovatno delujući na dendronske ćelijei

interakciju T ćelija (Mackav i sar., 1998. Gastroenterologv 115: 1464-1475).-

TRAIL sistem ima takođe potencijal kao kancer terapija. TRAIL međusobno reaguje sa

određenim brojem za membranu vezanihirastvorljivih receptora. Dva od ovih receptora, TRAIL-R1 i TRAIL R2 (takođe nazvani DR4 i DR5), prenose smrt uključujući signale za tumorske ćelije

ali neiza normalne ćelije, koje eksprimiraju dodatne TRAIL receptore koji ne indukuju smrt.

Smatra se da ovi dodatni receptori funkcionišu kao mamci. Upotreba rastvorljivog TRAIL da

ubije ćelije oslanja se na selektivnu ekspresiju mamaca receptora na normalnaali ne i na

tumorska tkiva (Gura, 1997. Science 277: 768).

Tumorske ćelije same po sebi često eksprimiraju mnoštvo receptora mamaca koji

blokiraju imuno prepoznavanje Ili efektorske funkcije.Istvarno neki tumori prekomerno

eksprimiraju TRAIL mamac receptore, očigledno da izbegnu smrt posredovanu sa TRAIL (Sheikh

i sar., 1999. Oncogene 18:4153-4159). Ovo ograničava korisnost TRAIL kao anti-tumor agensa

u nekim okruženjima. Slična zapažanja su napravljena za receptorski mamac za FAS-L, koji je

prekomerno eksprimiran od strane ćelija kancera plućaidebelog creva (Pitti i sar., 1998. Nature

396: 699-703) i za IL-1 receptor protiv antagonista (Mantovani i sar., 1998. Ann. N Y Acad. Sci.

840: 338-351). Receptore mamce takođe upotrebljavaju genomi virusa da zaštite inficirane ćelije

domaćine od odbrambenih mehanizama domaćina.

APRIL (veznik koji indukuje proliferaciju) jenovičlan TNF porodice proteina. Studije

ekspresije i funkcionisanja APRIL-a sugerišu da se taj protein koristi od strane tumorskih ćelija

da indukuje brzu proliferaciju. Tumorske ćelijske linije tretirane sa rastvorljivim APRIL proteinom

ili transfektirane sa APRIL cDNK, rastu brzoin. vitro.APRIL transfektirane ćelije implantirane u

imunodeficijentne miševe rastu brzo kao tumori. Konačno, humane tumorske ćelije, ali ne i

normalna tkiva, eksprimiraju visoke nivoe APRIL glasničke RNK. Ova zapažanja sugerišu da se

APRIL vezuje za receptor koji je takođe eksprimiran od strane tumorskih ćelija postavljajući

autokrinu ili parakrinu aktivaciju tumorskih ćelija. Sem toga moguće je da APRIL deluje u

okruženjima drugih bolesti, tako da će aktiviranje ili blokiranje APRIL puteva imati dodatne

upotrebe. Na primer, manja ekspresija ili prekomerna ekspresija APRIL može igrati. ulogu u

razvojnim defektima, pošto je razviće često okarakterisano pažljivo kontrolisanim balansom

između proliferacije ćelija i smrti ćelija. Slično, APRIL može delovati u bolestima sa

proliferacijom ćelija, kao što su one koje se odigravaju u vezi sa nekim autoimunim bolestima

(npr., lupus) ili bolestima zapaljenja gde se populacije ćelija šire brzo (npr. bakterijska sepsa).

Na osnovu poznate sposobnosti za upotrebu agonista i antagonista TNF i TNF članova

porodice receptora kao modifikatora bolesti, putevi APRIL predstavljaju sami po sebi važan cilj

za razvitak leka. To je posebno istina za terapiju kancera pošto izgleda da ćelije tumora

produkuju i koriste APRIL da podrži njihov sopstveni rast i prema tome nije verovatno da

produkuje mamac receptore ili druge antagoniste APRIL puta. Prema tome APRIL put je

jedinstveno različit oblik, na primer, TRAIL ili FAS-L putevi, koji se mogu sukobiti sa mamcima

tumor receptora.

Tekući tretmani za kancer su neadekvatni za mnoge tipove tumora zahvaljujući slaboj

efikasnosti, slabom udelu u preživljavanju, toksičnosti koja uzrokuje jake sporedne efekte, ili

njihove kombinacije. Prema tome, postoji potreba da se identifikuju i razviju metodi za tretiranje

rasta kancera koji mogu obezbediti efikasnost bez indukovanja jakih sporednih efekata. Prema

tome biće korisni antagonisti APRIL puteva, uključujući anti-APRIL mAb-ove, anti-APRIL receptor

mAb-ova, rastvorljive APRIL receptor-lg fuzione proteine, prirodne antagoniste, male molekule

antagoniste i hemijske, farmaceutske ili druge antagoniste.

Do sada smo identifikovali protein modifikovan sa B ćelijama (BCM ili BCMA) kao

receptor za APRIL.

SADR2AJ PRONALASKA

Podnosioci prijave pronašli su da je BCMA receptor za faktor nekrozisa tumora, APRIL.

APRIL je isti molekul prethodno opisan u WO 99 12965, koji je ovde inkorporiran referencom.

APRIL receptor je niže označen kao "APRIL-R". Predmetni pronalazak je usmeren na metode

tretmana i farmaceutske preparacije za upotrebu u tretmanu sisarskih vrsta koje su pod rizikom

da imaju kancer. Takvi objekti uključuju objekte koji su već zaraženi sa kancerom, ili koji su već

primili kancer terapiju.

Metodi i jedinjenja ovog pronalaska zasnivaju se delom na otkriću da određeni agensi,

koji su terapeutski agensi za kancer definisani ovde kao APRIL-R antagonisti, uključujući, na

primer, anti-APRIL-R antitela, mogu biti upotrebljeni u tretmanu objekata koji su pod rizikom da

razviju kancer, ili potrebom za tretman kancera, kao što je ovde definisano.

Terapeutski kancer agensi pronalaska mogu biti davani bilo kojim načinom davanja koji

je kompatibilan sa odabranim agensom i može biti formulisan sa bilo kojim farmaceuitski

prihvatljivim nosačem koji je odgovarajući za način davanja. Poželjni načini davanja su

parenteralni i posebno intravenski, intraperitonealni i intrakapsularni. Tretmani su takođe poželjno

vođeni tokom produženog perioda izvan bolničkog okruženja. Očekuje se da dnevne doze

terapeutskih kancer agensa budu u rasponu od oko 0.01 do 1000 u,g/kg telesne težineijoš

poželjnije 10-300 ng/kg telesne težine, i ako će precizne doze varirati u zavisnosti od posebnog

terapeutskog kancer agensa koji je upotrebljen i medicinskog stanja određenog objekta i istorije.

Tretmani predmetnog pronalaska su korisni u iskorenjivanju potpuno klonalne populacije

(kolonije) transformisanih ćelija iz tela sisara ili da se supresuje i ukine rast kolonije koji je

najčešće označen kao tumor. Kao takvi oni su korisni u produžetku života i u održavanju kavaliteta života objekta koji je pod rizikom ili koji je već zaražen sa kancerom.

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1 pokazuje sekvencu nukteinske kiseline (SEQ ID br:1) cDNK za mišiji APRIL i njegovu izvedenu sekvencu amino kiseline (SEQ ID br:3), kako je mapirana u vektoru pCCM213.10. Podvučeno su prikazani myc epitop i amino kiseline izvedene iz FasL. Početak kodirajuće sekvence izvanćelijskog domena APRIL-a je naznačen strelicama.

Slika 2 pokazuje sekvencu nukleinske kiseline (SEQ ID br:4) i njenu izvedenu sekvencu amino kiseline (SEQ ID br:6) FLAG-humanog APRIL konstrukta za ekspresiju u sisarskim ćelijama. Mapa ukazuje signalne sekvence (1-15); FLAG epitop (AA 16-23) i početak humane APRIL kodirajuće sekvence izvanaćelijskog domena (32-kraj).

Slika 3A pokazuje sekvencu nukleinske kiseline (SEQ ID br:7) i sekvencu amino kiseline (SEQ ID br:8) pune dužine humanog BCMA. Slika 3B pokazuje sekvencu nukleinske kiseline (SEQ ID br:11) pJST538, plazmida koji kodira humani APRIL-R-hlgGFc fuzionog konstrukta i njegove izvedene sekvence amino kiseline (SEQ ID br:12).

Slika 4 pokazuje vezivanje myc-mišijeg APRIL za mišju liniju B ćelija limfoma A20. Tri odvojena eksperimeta pokazuju specifično vezivanje APRIL za A20 ćelije poređeno sa A) nebojene ćelije i obojene ćelije sa samo R1532, B) ćelije obojene sa RANKL-L i R1532 i C) ćelije obojene sa APRIL i irelevantni zečji serum.

Slika 5 pokazuje vezivanje myc-mišjeg APRIL za humane B ćelije limfoma linije RAJI. Dva odvojena eksperimenta pokazuju specifično vezivanje APRIL za RAJI ćelije poređeno sa A) nebojenim ćelijama i ćelijama bojenim samo sa R1532, i ćelije bojene sa RANK-1 i R1532 i B) ćelijama bojenim sa APRIL i irelevantnim zečjim serumom.

Slika 6 pokazuje da je APRIL koji se vezuje za A20 ćelije (A) i Raji ćelije (B) poražen u kompeticiji kada su korišćeni rastvorljivi BAFF protein ili rastvorljivi BCMA-lg protein.

Slika 7 pokazuje vezivanje FLAG-humanog APRIL za različite ćelijske linije: A) A20 ćelije B) HT29 ćelije, C) NIH3T3 ćelije. Specifično vezivanje je pokazano korišćenjem biotinilizirane anti-FLAGmAb M2 detekcije u poređenju sa vezivanjem viđenim za irelevantni kontrolni izotop mAb ili bez dodavanja FLAG-APRIL.

Slika 8 pokazuje imuno taloženje myc-mApril korišćenjem BCMA-Fc fuzionog proteina. Gornji levi panel pokazuje specifična hBMCA-Fc/myc-mAPRIL i pozitivnu kontrolu OPG-Fc/Rank-1 imunotaloženja, u poređenju sa gornjim desnim negativnim kontrolama. Niži paneli pokazuju da su količine napunjenih proteina bile ekvivalentne.

Slika 9 pokazuje ELISA format eksperimente koji pokazuju da se FLAG-h APRIL vezuje za hBCMA-fc fuzioni protein. Različiti receptori-Fc fuzionih proteina obavljeni su na ELIZA ploče i vezani za FLAG-tagovane veznike. A) Detekcija vezanih veznika pokazala je da se samo APRIL i hBAFF specifično vezuju za hBCMA-Fc, ali ne i hCD40-Fc. B) Doza titracije pokazuje da je ELISA signal detektovan nakon vezivanja hAPRIL ili hBAFF na hBCMA-Fc obavijene ploče linearno zavisan od dodate količine proteina.

Slika 10 pokazuje imunotaloženje FLAG-hAPRIL i FLAG-hBAFF sa hBMCA-Fc. fuzionim proteinom. Gornja 4 panela pokazuju ekvivalencu punjenja proteina u svakom imunotafoženju, dok donji paneli pokazuju da su hAPRIL i hBAFF imuno zaštićeni sa hBCMA-Fc ali ne i sa hTRAIN-Fc.

Slika 11 pokazuje BiaCore analizu vezivanja myc-mAPRIL, FLAG-hBAFF i FLAG-mBAFF za hBMCA, hLTbeta receptor ili hTNF-R80 ili šlepu probu koja pokazuje specifično vezivanje samo za hBCMA.

Slika 12 pokazuje APRIL vezivanje za BCMA transfektirane ćelije. 293EBNA ćelije su transfektirane sa plazmidom koji eksprimira punu dužinu hBCMA. Ćelije su prikupljene 48 časova kasnije koristeći 5mM EDTA i obojene sa myc-nAPRIL. Panel A pokazuje da je jačina bojenja smanjena na nivo pozadine koristeći rastvorljivi BCMA-lg protein.

Slika 13 pokazuje rast NIH3T3 ćelije implantirane subkutano u imunodeficijentne miševe (Nu/Nu) tretirane sa kontrolnim reagensima ili sa BCMA-lg fuzionim proteinom. U ovom modelu NIH3T3 ćelije formiraju fibrosarkom.

Slika 14 pokazuje rast humanog karcinoma debelog creva SW480 implantiranog subkutano u imunodeficejentne (Nu/Nu) miševe tretirane sa kontrolnim reagensom ili sa hBCMA-Ig fuzionim proteinom.

Slika 15A pokazuje rast humanog karcinoma debelog creva HT29 implantiranog subkutano u imunodeficejentne (Nu/Nu) miševe tretirane sa kontrolnim reagensom ili sa hBCMA-Ig fuzionim proteinom. Slika 15B pokazuje rast humanog karcinoma pluća A549 implantiranog subkutano u imunodeficejentne (Nu/Nu) miševe tretirane sa kontrolnim reagensom ili sa hBCMA-Ig fuzionim proteinom.

DETALJNI OPISI

Definicije

S ciljem da se jasnije i sažetije istakne predmet podnetog patentnog zahteva, obezbeđene su sledeće definicije za specifične termine koji su upotrebljeni u pisanom opisu i podnetim zahtevima koji slede.

Pronalazak će sada biti opisan sa pozivom na sledeći detaljni opis u koji su uključene sledeće definicije: Termini "APRIL receptor" ili "APRIL-R" kada se koriste ovde obuhvataju prirodne sekvence APRIL-R i varijante APRIL-R. APRIL-R može biti izolovan iz mnoštva izvora, kao što su mišji ili humani tipovi tkiva ili iz drugih izvora, ili pripremljeni rekombinantnim ili sintetičkim metodima. Termin APRIL-R dalje se odnosi na polipeptid koji je sposoban da se vezuje za člana porodice nekrozisa tumora, APRIL ili za njegove homologe ili fragmente. Primer APRIL-R je BCMA.

Termin "BCMA" ili "BCM" odnosi se na novi protein za sazrevanje B ćelija kao što je opisano kod Gras i sar. (1995), International Immunologv, 7: 1093-1106, "BCMAp: integralni protein membrane u goldžijevom aparatu humanih zrelih B limfocita"; Y. Laabi i sar. (1992), EMBO J., 11, 3897-3904, "Novi gen BCM na hromozomu 16 je fuzionisan za interleukin 2 gen sa t(4;16)(q26;p13) translokacijom u malignim T ćelijama limfoma".

"Prirodna sekvenca APRIL-R" sadrži polipeptid koji ima istu sekvencu amino kiseline kao APRIL-R dobijen iz prirode. Takva prirodna sekvenca APRIL-R može biti izolovana iz prirode ili može biti produkovana rekombinantnim ili sintetičkim načinima. Prirodna sekvenca APRIL-R mogu biti prirodno-javljajući, potkraćeni, ili izlučeni oblici APRIL-R (npr., rastvorljivi oblici koji sadrže, na primer, sekvencu izvanćelijskog domena), prirodno-javljajući različiti oblici (npr, alternativno upleteni oblici) i prirodno-javljajući alelni obiici APRIL-R. U jednom obliku pronalaska, prirodna sekvenca APRIL-R je zrela ili prirodna sekvenca pune dužine APRIL-R polipeptida koja sadrži amino kiseline 1 do 184 od SEQ ID br:8 ili njegov fragment.

"APRIL-R izvanćelijski domen" ili "APRIL-R ECD" odnose se na oblik APRIL-R koji je u osnovi slobodan od transmembrane i citoplazmatičnih domena APRIL-R. Uobičajeno, APRIL-R ekstraćelijski domen imaće manje od 1% takvih transmembranskih i citoplazmatičnih domena i poželjno ima manje od 0.5% takvih domena. Po potrebi APRIL-R ECD će sadržati ostatke amino kiseline 1 do 51, ili 1 do 52, ili 1 do 53 SEQ ID br: 8. U poželjnom obliku APRIL-ECD sadrži ostatke amino kiselina 4-51 SEQ ID br:8 ili još poželjnije ostatke amino kiselina 8-41 SEQ ID br:8. Onom sa iskustvom u praksi biće jasno da je transmembranski domen identifikovan ža APRIL-R polipeptid predmetnog pronalaska identifikovan shodno kriterijumima koji se rutinski upotrebljavaju u praksi za identifikovanje tog tipa hidrofobnih domena. Tačne granice transmembranskog domena mogu varirati, ali najverovatnije za ne više od oko 5 amino kiselnia na bilo kom od krajeva domena, posebno spomenutog ovde.

"APRIL-R varijanta" znači aktivni APRIL-R kao što je opisano niže, koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence amino kiseline sa APRIL-R koji ima izvedenu sekvecu amino kiseline pokazanu u SEQ ID br:5 za punu dužinu prirodne sekvence APRIL-R ili sa sekvencom APRIL-R-ECD. Takve APRIL-R varijante uključuju, na primer, APRIL-polipeptide gde su jedan ili više ostataka amino kiseline dodani ili delecirani na kraju ili C-terminusu sekvence SEQ ID br:8. Obično će APRIL-R varijanta imati namanje oko 80% ili 85% identičnosti sekvence amino kiseline, još poželjnije najmanje oko 90% identičnosti sekvence aminio kiseline i čak još poželjnije oko 95% identičnosti sekvence aminio kiseline sa sekvencom amino kiseline SEQ ID br:8.

"Procenat (%) identičnosti sekvence amino kiseline" u odnosu na APRIL-R sekvence identifikovane ovde je definisan kao procenat ostataka amino kiseline u sekvenci kandidatu koje su identične sa ostatcima amino kiseline u sekvenci APRIL-R, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja pauza, ako je neophodno da se dostigne maksimum procenta identičnosti sekvence i ne uzimajući u obzir bilo koju konzervativnu supstituciju kao deo identičnosti sekvence. Poklapanje za svrhu determinisanja procenta identičnosti sekvence amino kiseline može biti dostignuto na različite načine koji su u okviru iskustva u praksi, na primer koristeći javno dostupne kompjuterske softvere, koa što su BLAST, ALIGN, ili Megalign (DNASTAR) softver. Oni sa iskustvom u praksi mogu odrediti odgovatrajuće parametre za merenje poravnavanja, uključujući bilo koji algoritam koji je potreban da se dostigne maksimum poravnavanja u odnosu na punu dužinu sekvenci koje se porede.

Termin "obeleženi epitop" kada se koristi ovde odnosi se na himerični polipeptid koji sadrži APRIL-R ili domen njegove sekvence fuzionisan za "obeleženi polipeptid". Obeleženi polipeptid ima dovoljno ostataka da obezbedi epitop protiv koga se može napraviti antitelo, ili koji može biti identifikovan istim ili drugim agensom, koji je još uvek dovoljno kratak tako da se ne preklapa sa aktivnošću APRIL-R. Poželjno je da je obeleženi polipeptid takođe sasvim jedinstven, tako da antitelo ne reaguje u potpunosti unakrsno sa drugim epitopima. Pogodni obeleženi polipeptidi generalno imaju najmanje 6 ostataka amino kiseline i obično između oko 8 do oko 50 ostataka amino kisline (poželjno oko 10 do oko 20 ostataka).

"Izolovani" kada se koristi da se opišu različiti polipeptidi otkriveni ovde, znači polipeptidi koji su identifikovani i razdvojeni i/ili obnovljeni iz komponente njihovog prirodnog okruženja. Zaprljane komponente iz njihove prirodne sredine su materijali koji će tipično interferirati sa dijagnostičkom ili terapeutskom upotrebom polipeptida i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinozne ili ne-proteinozne rastvore. U poželjnim oblicima polipeptid će biti prečišćen (1) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje sekvence amino kiseline upotrebom sekvencera obrtne kupe, ili (2) do homogenosti SDS-PAGE pod ne redukujućim ili redukujućim uslovima koristeći Coomasie plavo ili poželjnije srebrnu boju. Izolovani polipeptid uključuje polipeptidin situunutar rekombinatntnih ćelija, pošto najmanje jedna komponenta prirodne sredine od APRIL-R neće biti prisutna. Međutim, obično će 'zolovani polipeptid biti pripremljen namanje jednim korakom prečišćavanja

Termin "antitelo" koristi se u najširem smislu i specifično pokriva pojedinačna APRIL-R monoklonalna antitela (uključujući agonist, antagonist i neutralizujuća antitela) i jedinjenja anti-APRIL-R antitela sa poliepitopnom specifičnošću. Termin "monoklonalno antitelo" koristi se ovde da označi antitelo dobijeno iz populacije potpuno homogenih antitela, tj. individualnih antitela, sadržanih u populaciji, koja su identična sem za moguće mutacije koje se prirodno javljaju, koje mogu biti prisutne u minornim količinama.

"Prečišćena preparacija" ili "potpuno čista preparacija" polipeptida, kako se koristi ovde označava polipeptid koji je razdvojen od drugih proteina, lipida i nukleinskih kiselina sa kojima se prirodno javlja. Poželjno je polipeptid takođe odvojen od drugih supstanci, npr. antitela, matrica, itd. koje se koriste da ga prečiste.

Termini "tretiranje", "tretman" i "terapija" kako se koriste ovde odnose se na kurativnu terapiju, profilaktičku terapiju i preventivnu terapiju.

Termin "peptidi", "proteini" i "polipeptidi" koriste se ovde naizmenično.

"Biološki aktivan", kako se koristi ovde znači da ima aktivnost in vivo ili in vitro, koja se može obaviti direktno ili indirektno.

Biološki aktivni fragmenti APRI-R mogu imati, na primer 70% homologije amino kiseline sa aktivnim mestom receptora, još poželjnije najmanje 80% i najpoželjnije najmanje 90% homologije. Identičnost ili homologija u odnosu na receptor je definisana ovde kao procenat ostataka amino kiseline u sekvenci kandidatu, koje su identične sa APRIL-R ostacima u SEQ ID br:8.

Termin "sisar", onako kako se koristi ovde, odnosi se na bilo koju životinju klasifikovanu kao sisar uključujući ljude, krave, konje, pse, miševe i mačke. U poželjnom obliku pronalaska sisar je čovek.

Primena predmetnog pronalaska uključiće, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike biologije ćelije, kulturu ćelije, molekularnu biologiju, transgenu biologiju, mikrobiologiju, rekombinantnu DNK i imunologiju, koje su u okviru iskustva u praksi. Takve tehnike opisane su u literaturi.

Napraviće se napomene u detaljima u odnosu na prisutne poželjne oblike pronalaska. Ovaj pronalazak odnosi se na upotrebu APRIL-R i srodnih molekula APRIL-R da deluju na rast i srazrevanje B-ćelija i ne-B ćelija, specifično kako se one odnose prema tumor ćelijama. Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu APRIL-R i srodnih molekula APRIL-R da deluju na odgovore imunog sistema koji su neophodni zbog imuno srodnih poremećaja. Sem toga ovaj pronalazak obuhvata tretman kancera i imunih poremećaja kroz upotrebu APRIL-R ili APRIL-R srodnih gena preko metoda genske terapije.

APRIL-R i njegovi homologi produkovani od strane domaćina transformisanih sa sekvencama pronalaska, kao i prirodni APRIL-R prečišćen procesima poznatim u praksi ili produkovan iz poznatih sekvenci amino kiseline, korisni su u mnoštvu metoda za anti kancer, anti tumor i imuno reguiatorne primene. One su takođe korisne u terapiji i metodama usmerenim na druge bolesti.

Drugi aspekt pronalaska odnosi se na upotrebu polipeptida kodiranog izolovanom nukleinskom kiselinom, koja kodira APRIL-R u "antisens" terapiji. Kako se koristi ovde "antisens" terapija odnosi se na davanje ili generisanjein situoligonukleotida ili njihovih derivata, koji specifično hibridizuju u ćelijskim uslovima sa ćelijskom mRNK i/ili DNK, koja kodira veznik od interesa, tako da inhibira ekspresiju kodiranog proteina, tj. putem inhibicije transkripcije i/ili translacije. Vezivanje može biti putem komplementarnosti konvencionalanog para baza ili, na primer, u slučaju vezivanja za dupleks DNK, preko specifičnih interakcija u glavnom žljebu duplog heliksa. Generalno, "antisens" terapija odnosi se na raspon tehnika koje se generalno koriste u praksi i uključuje bilo koju terapiju koja se odnosi na specifično vezivanje za sekvence oligonukleotida.

Antisens konstrukt predmetnog pronalaska može biti isporučen, na primer kao ekspresioni plazmid, koji kada se transkribuje u ćeliji produkuje RNK koja je komplementarna namanje delu ćelijske mRNK, koja kodira Kay veznik. Antisens konstrukt može alternativno biti oligonukleotidna proba koja je generisana ex vivo. Takve oligonukleotidne probe su poželjno modifiovani oligonukleotidi koji su otporni na endogene nukleaze i prema tome su stabilni in vivo. Primeri molekula nukleinskih kiselina za upotrebu kao antisens oligonukleotida su fosforamidi, fosfotioat i metil fosfonat analozi DNK (vidi npr. 5,176996; 5,264564; i 5,256775). Sem toga generalni pristupi da se konstruišu oligomeri korisni u antisens terapiji su prikazani, na primer, od strane Van Der Krol i sar., (1988) Biotechiques 6:958-976; i Stein i sar. (1988) Cancer Res. 48: 2659-2668, inkorporirani specifično ovde referencom.

APRIL-R pronalaska, kao što je gore diskutovano, je član porodice TNF receptora. Fragmenti proteina ili njegovi homolozi mogu imati široke terapeutske i dijagnostičke primene.

Polipeptidi pronalaska specifično interreaguju sa APRIL, polipeptidom prethodno opisanim WO 99/12964 inkorporiranim ovde referencom. Međutim, peptidi i ovde otkriveni metodi omogućuju identifikaciju molekula koji specifično interreaguju sa APRIL-R ili njegovim fragmentima.

Zaštićeni pronalazak u određenim oblicima uključuje metode upotrebe peptida izvedenih od APRIL-R, koji imaju sposobnost da se vezuju za APRIL. Fragmenti APRIL-R mogu biti produkovani na nekoliko načina, npr. rekombinanto, putem PCR, proteolitičkom digestijom ili hemijskom sintezom. Unutrašnji ili terminalni fragmenti polipeptida mogu biti generisani uklanjanjem jednog ili više nukleotida sa jednog kraja ili oba kraja nukleinske kiseline koja kodira polipeptid. Ekspresija mutirane DNK produkuje polipeptidne fragmente.

Polipeptidni fragmenti mogu takođe biti hemijski sintetizovani korišćenjem tehnika poznatih u praksi, kao što je konvencionalnin Merrifield čvrste faze f-moc ili t-boc hernije. Na primer, peptidi DNK sekvence predmetnog pronalaska mogu biti arbitrarno podeljeni u fragmente željene dužine bez preklapanja fragmenata ili podele u preklapajuće fragmente željene dužine. Metodi kao što su ovi, opisani su detaljnije niže.

Generisanje rastvorljivih oblika APRIL- R

Rastvorljive forme APRIL-R mogu često efektivno signalisati i prema tome mogu biti davani kao lek koji može oponašati prirodni membranski oblik. Moguće je da su ovde zaštićeni APRIL-R prirodno izlučivani kao rastvorljivi citokini, međutim ako nisu, neko može prepraviti gen da podstakne sekreciju. Da bi stvorio rastvorljivu sekretornu formu APRIL-R neko će ukloniti na nivou DNK N-terminus transmembranskog regiona, i neki deo stalk regiona, i zameniti ih sa lider sekvencom tipa I ili alternativno tipa II, što će obezbediti uspešno proteolitičko cepanje u odabranom ekspresionom sistemu. Neko sa iskustvom u praksi može varirati količinu stalk regiona zadržanog u sekrecionom ekspresionom konstruktu da optimizuje i karakteristike vezivanje liganda i sekretornu uspešnost. Na primer, kao rezultat konstrukti koji sadrže sve moguće stalk dužine, tj. N-terminalne odsečke, mogu biti pripremljeni tako da taj protein počinje na amino kiselini 1 do 52. Optimalna dužina stalk sekvence će rezultovati iz ovog tipa analize.

Generisanje antitela reaktivnih sa APRIL- R

Pronalazak takođe uključuje antitela specifično reaktivna sa zaštićenim APRIL-R ili njegovim ko-receptorima. Anti-protein/anti-peptid antiserum ili monoklonalna antitela mogu biti napravljena standardnim protokolima (vidi, na primerAntitela: Laboratorijski parktikumizd. Harlovv i Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Sisari kao što je miš, hrčak ili zec mogu biti imuniozovani sa imunogenim oblikom peptida. Tehnike za postizanje imunogenosti na protein ili peptid uključuju konjugaciju za naosače ili druge tehnike dobro poznate u parksi.

Imunogeni deo APRIL-R ili njegovi ko-receptori mogu biti davani u prisustvu adjuvansa. Napredak u imunizaciji može biti praćen detektovanjem titara antitela u plazmi ili serumu. Standardna ELISA ili drugi imunoogledi mogu se upotrebiti sa imunogenom kao antigenom da se odrede nivoi antitela.

U poželjnim oblicima predmetna antitela su imunospecifična za antigene determinante APRIL-R ili njegove ko-receptore, npr. antigene determinante polipeptida SEQ ID br:8 ili blisko srodni humani ili ne-humani sisarski homolog (npr. 70, 80 ili 90 procenata homologije, još poželjnije najmanje 95 procenata homologije). U još više preferiranom obliku predmetnog pronalaska anti-APRIL-R ili anti-APRIL-ko-receptor antitela ne reaguju u potpunosti unakrsno (tj. reaguju specifično) sa proteinom koji je npr. manje od 80 procenata homolog sa SEQ ID br:8 poželjno manje od 90 procenata homolog sa SEQ ID br:8; i najpoželjnije manje od 95 procenata homolog sa SEQ ID br:8. Pod "u potpunosti ne reaguju unakrsno" podrazumeva se da antitelo ima afinitet vezivanja za ne homologe proteine koji je manji od 10 procenata, još poželjnije manji od 5 procenata i čak još poželjniji manji od 1 procenta afiniteta vezivanja za protein SEQ ID br:8.

Termin antitelo, kako se koristi ovde, ima nameru da uključi njegove fragmente koji su takođe specifično reaktivni sa APRIL-R ili njegovim receptorima. Antitela mogu biti fragmentirana koristeći konvencionalne tehnike i fragmente pregledane na sposobnost na isti način kao što je opisano gore za cela antitela. Na primer, F(ab)2fragmenti mogu biti generisani tretiranjem antitela sa pepsinom. Nastali F(ab)2fragment može biti tretiran da se red u kuj u disulfidni mostovi da se produkuju Fab' fragmenti. Antitela predmetnog pronalaska su dalje predviđena da uključe biospecifične i himerične molekule koji imaju anti-APRIL-R ili anti-APRIL-ko-receptor aktivnost. Tako, i monoklonalna i poliklonalna antitela (Ab) usmerena protiv APRIL-R, i njihovi ko-receptori i fragmenti antitela kao što su Fab' i F(ab<l>)2mogu biti upotrebljena da blokiraju delovanje APRIL-R i njegovih reaktivnih ko-receptora.

Različiti oblici antitela mogu biti takođe napravljeni koristeći standardne tehnike rekombinantne DNK. (VVinter i Milstein, Nature 349: 293-299 (1991) specifično inkorporirani ovde referencom). Na primer, mogu biti konstruisana himerična antitela kod kojih je domen vezivanja antitela iz životinjskog antitela vezan za humani konstantni domen (npr., Cabillv i sar., U.S. 4,816,567, inkorporiran ovde referencom). Himerična antitela mogu redukovati zapažene imunogene odgovore izazvane životinjskim antitelima kada se koriste u humanim kliničkim tretmanima.

Sem toga, mogu biti sintetizovana rekombinantna "humanizovana antitela" koja prepoznaju APRIL-R ili njegove ko-receptore. Humanizovana antitela su himere koje sadrže većinom humane IgG sekvence u koje su inserirani regioni odgovorni za antigen-specifično vezivanje. Životinje su imunizovane sa željenim antigenom, odgovarajuća antitela su izolovana i delovi varijabilnih regiona sekvenci odgovornih za specifično vezivanje antigena su uklonjeni. Regioni vezivanja antigena izvedeni od životinja su zatim klonirani na odgovarajuće pozicije humanih gena za antitela u kojima su regioni vezivanja antigena delecirani. Humanizovana antitela minimizuju upotrebu heterologih (tj., medu vrstama) sekvenci u humanim antitelima, i zato su manje verovatna da izazovu imune odgovore kod tretiranog objekta.

Konstrukcija različitih klasa rekombinantnih antitela može takođe biti praćena pravljenjem himeričnih ili humanizovanih antitela koja sadrže varijabilne domene i humane konstantne domene (CH1, CH2, CH3) izolovane iz različitih klasa imunoglobulina. Na primer, antitela sa sa povećanom valencom mesta vezivanja antigena mogu biti rekombinantno produkovana kloniranjem mesta vezivanja antigena na vektore koji nose humani : lanac konstantnih regiona.

(Arulandam i sar., J. Exp. Med., 177:1439-1450 (1993) inkorporirani ovde sa referencom.)

Sem toga, standardne tehnike rekombinantne DNK mogu se upotrebiti da se izmene afiniteti vezivanja rekombinantnih antitela sa njihovim antigenima putem menjanja ostataka amino kiseline u blizini mesta vezivanja antitela. Afinitet vezivanja antigena humanizovanog antitela može biti povećan mutagenezom zasnovanom na molekularnom modeliranju. (Queen i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 10029-33 (1989)) inkorporirano ovde referencom.

Generisanje analoga: Produkcija izmenjenih DNK i peptidnih sekvenci

Analozi APRIL-R mogu se razlikovati od APRIL-R koji se prirodno javlja u sekvenci amino kiseline, ili na načine koji ne uključuju sekvence, ili na oba. Ne-sekvencne modifikacije uključuju hemijske derivatizacije APRIL-R in vivo ili in vitro. Ne-sekvencne modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na promene u acetilaciji, metilaciji, fosforilaciji, karboksilaciji ili glikolizaciji.

Poželjni analozi uključuju biološki aktivne fragmente APRIL-R, čije sekvence se razlikuju od sekvence date u SEQ ID br:8 za jednu ili više konzervativnih supstitucija amino kiseline, ili za jednu ili više ne-konzervativnih supstitucija amino kiseline, delecija ili insercija koje ne ukidaju aktivnost APRIL-veznika. Konzervativne supstitucije tipično uključuju supstitucije amino kiseline sa drugom sličnih karakteristika, tj., supstitucije unutar sledećih grupa: valin, glicin; glicin, alanin; valin, izoleucin, leucin; asparaginska kiselina, glutaminska kiselina; asparagin, glutamin; serin, treonin; lizin, arginin; i fenilalanin, tirozin.

Upotrebe

APRIL-R gen pune dužine (SEQ ID br: 8) ili njegov deo može biti upotrebljen kao hibridizaciona proba za cDNK biblioteku da se izoluju, na primer, i drugi geni koji imaju identitet željene sekvence sa APRIL-R sekvencom otkrivenom u SEQ ID br: 6. Nukleotidne sekvence koje kodiraju APRIL-R mogu se takođe upotrebiti da se konstruišu hibridizacione probe za mapiarnje gena koji kodira APRIL-R i za genetičku analizu jedinki sa genetičkim poremećajima. Mogu se dizajnirati skrining ogledi da se nađu vodeća jedinjenja koja oponašaju biološku aktivnost APRIL-R. Takvi skrining ogledi uključiće oglede ponovljive na visoku propustljtvost pregledanja hemijskih biblioteka, što ih čini posebno pogodnim za identifikovanje malog molekula kandidata leka. Mali molekuli koji su uzeti u obzir uključuju sintetička organska ili neorganska jedinjenja. Nukleinske kiseline koje kodiraju APRIL-R ili njegove modifikovane oblike mogu takođe biti upotrebljene da se generišu ili transgene životinje ili "knock out" životinje koje su povratno korisne u razvitku i skriningu terapeutski korisnih reagenasa uključujući, na primer, kancer reagense.

APRIL-R i njegovi homologi produkovani od strane domaćina transformisani sa sekvencama pronalaska, kao i prirodni APRIL-R prečišćen procesima poznatim u praksi, ili produkovani iz poznatih sekvenci amino kiseline, korisni su u mnoštvu metoda za anti kancer primene.

U jednom obliku pronalaska je metod tretiranja sisara za stanje vezano za neželjenu proliferaciju ćelija davnjem sisaru terapeutski efektive količine preparata, koji sadrži antagonist APRIL-R, pri čemu antagonist APRIL-R sadrži polipeptid koji antagonizuje interakciju između APRIL i njegovog srodnog receptora ili receptora sa farmaceutski prihvatljivim primaocem.

U poželjnom obliku srodni receptor APRIL na površini ćelije je BCMA. >

Metod može biti upotrebljen sa bilo kojim antagonistom APRIL-R, koji ima polipeptid koji antagonizuje reakciju između APRIL i njegovog srodnog receptora ili receptora. Primeri antagonista APRIL-R uključuju, ali nisu ograničeni na rastvorljivi APRIL-R polipeptid uključujući, ali bez ograničenja na rastvorljivi BCMA; rastvorljive himerične molekule APRIL-R uključujući, ali bez ograničenja na BCMA-lgG-Fc i anti-APRIL-R homologe antitela, uključujući, ali bez ograničenja na anti-BCMA monokionalno antitelo.

Metod pronalaska može biti upotrebljen sa bilo kojim stanjem povezanim sa neželjenom proliferacijom ćelija. Metod predmetnog pronalaska posebno može biti upotrebljen da se tretiraju tumorske ćelije koje eksprimiraju APRIL i/ili APRIL-R (tj. BCMA).

Primeri kancera čija proliferacija ćelija je modulisana sa APRIL mogu biti skrinovani merenjem nivoa APRIL i/ili APRIL-R (tj. BCMA) in vitro poruke eksprimirane u bibliotekama tumor tkiva. Biblioteke tkiva tumora u kojima je APRIL i/ili APRIL-R (tj. BCMA) poruka visoko eksprimirana biće kandidati. Alternativno moguće je skrinovati za kandidate pretražujući javne i privatne baze podataka (tj. Incyte bazu podataka) sa na primer punom dužinom humane APRILcDNK sekvence. Primenjujući ove tehnike nađeno je, na primer, da je ekspresija APRIL mRNK detektovana u velikom broju tipova tumora, uključujući, ali bez ograničenja na one nađene u tabeli 1 niže:

Antagonisti APRIL-R predmetnog pronalaska koji su upotrebljeni u tretmanu stanja vezanih sa neželjenom proliferacijom ćelija, posebno u terapiji tumora, uspešno inhibiraju rast ćelija tumora više od 10%, 20%, 30% ili 40% i najuspešnije više od 50%. Antagonisti APRIL-R su dobijeni putem skrininga (vidi na primer, diskusiju u primeru 6). Na primer, antagonisti APRIL-R mogu biti odabrani na osnovu aktivnosti ihibicije rasta (tj. veće od 10%, 20%, 30%, 40% ili 50%) protiv humanog karcinoma debelog creva HT29 ili humanog karcinoma pluća A549 (vidi na primer diskusiju na slici 15), koji su izvedeni iz tumora debelog creva i pluća, respektivno.

Drugi oblik pronalaska obezbeđuje metode inhibiranja rasta B-ćelija i ne-B ćelija, rasta dendronskih ćelija indukovanog B-ćelijama i sazrevanja ili produkcije imunoglobulina kod životinje koristeći APRIL-R polipeptid.

U drugom obliku, pronalazak obezbeđuje metode upotrebe APRIL-R u tretmanu autoimunih bolesti, hipertenzije, kardiovaskularnih poremećaja, bubrežnih poremećaja, poremećaja limfo-proliferacije B-ćelija, imunosupresivnih bolesti, transplantacije organa, upala i HlV-a. Takođe su uključeni metodi za upotrebu agenasa za tretman, supresiju ili izmenu imunog odgovora uključujući put signaliranja između APRIL-R i njegovog veznika.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže polipeptid APRIL-R i farrmaceutski prihvatljiv ekscipijent. Prigodni nosači za polipeptid APRIL-R, na primer, i njegove formulacije opisani su u Remington' Pharamaceutica Sciences 16 izd., 1980 Mack Publishing Co., izdato od strane Oslo i sar. Tipično, odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli je upotrebljena u formulaciji da održi formulaciju izotoničnom. Primeri nosača uključuju pufere kao Sto su Ringer-ov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora poželjno je od oko 5 do oko 8 i još poželjnije od oko 7.4 do oko 7.8. Dalji nosači uključuju preparacije za ustaljeno oslobađanje kao što su polupropustljive matrice od čvrstih hidrofobnih polimera, koje su u formi uobličenih delova, npr. lipozomi, filmovi ili mikročestice. Onima sa iskustvom u praksi biće očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti na primer od načina davanja i koncentracije APRIL-R polipeptida koji se daje.

Davanje može biti obavljano injekcijom (npr. intravenski, intraperitonealno. subkutano, intramuskularno) ili drugim metodama kao što je infuzija koja obezbeđuje isporuku krvotoku u efektivnoj formi.

Primena predmetnog pronalaska upotrebiće, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike biologije ćelija, kulturu ćelije, molekularnu biologiju, mikrobiologiju, rekombinantnu DNK, herniju proteina i imunologiju, koje su u okviru iskustva u praksi. Takve tehnike opisane su u literaturi. Vidi na primer Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik, drugo izdanje. (Sambrook, Fritsch i Maniatis, izd.), Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1989; DNK kloniranje, volumeni I i II (D.N. Gtover, izd.), 1985; Sinteza oligonukleotida, (M. J. Gait, izd.), 1984; U.S. patent br. 4,683,195 (Mullis i sar.,); Hibridizacija nukleinskih kiselina (B.D. Hames i S.J. Higgins, izd.), 1984; Transkripcija i translacija (B.D. Hames i S.J. Higgins, izd.), 1984; Kultura ćelija životinja (R.l. Preshnev, izd.). Alan R. Liss, Inc., 1987; Imobilizirane ćelije i enzimi, IRL Press, 1986; Praktični vodič za molekularno kloniranje (B. Perbal), 1984; Metodi u enzimologiji, volumeni 154 i 155 (Wu i sar., izd.), Academic Press, New York; Vektori transfera gena za sisarske ćelije (J.H. Miller i M.P. Calos, izd.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratorv; Imunohemijski metodi u ćeliji i molekularnoj biologiji (Mayer i VValker, izd.), Academic Press, London, 1987; Priručnik eksperimentalne imunologije, volumeni I-IV (D.M. VVeir i C.C. Blackweli, izd.), 1986; Manipulisanje embrionom miša, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

Sledeći primeri obezbeđeni su da ilustruju predmetni pronalazak, i ne treba da se shvate kao ograničavajući na bilo koji način.

PRIMERI:

Sledeći metodi korišćeni su u primerima prikazanim niže.

Metodi:

Kloniranje i ekspresija myc-obeleženog mišjeg APRIL (CCM776) kodPichia pastor/ s.

Ekspresini vektor pCCM213.10 je konstruisan uzimanjem PDR004 (H98 muAPRIL sa superFAS-veznik stalk pričvršćenim za N terminus zajedno sa FLAG obeleženim epitopom) i odsecanjem mu APRIL kodirajuće sekvence Sac I do Noti. Sinteza oligonuleotida LTB-559 i 560 Xho-1-Sac1 veznikom koji sadrži alfa faktor susretanja lider sekvence, obeleženi myc epitop, kao i KEL motiv iz FAS veznika. I mu April fragment i veznik su vezani na Xho-l-Not1 mesta pccm211, ekspresioni plazmidPichia pastoris.

pCCM213.10 je linearizovan sa Stu1, elektroporiran u GS115 soj (his4-) i plotovan na minimalni medijum koji je sadržao dekstrozu. HIS4 transformanti su analizirani za ekspresiju proteina inokuliranjem pojedinačne reprezentativne kolonije na bogatom medijumu (BMGY: puferizovani glicerol kompleksni medijum) i omogućeno im je da rastu do gustine tokom 48 časova na 30 C. Kulture su spinovane i taloži ćelija respuspendovani (1:5) u bogatom indukcionom medijumu koji je sadržao 1.5% metanola (BMMY: puferizovani metanol kompleksni medijum). Ova dana nakon indukcije na 30 C supernatanti su pušteni na SDS-PAGE i procenjeni na prisustvo muAPRIL. Coomassie bojenje i VVestern blot (sa anti-myc mAb 9E10) je pokazalo da je jedan soj CCM776 produkovao odgovarajuće količine glikoliziranog oblika myc-obeleženog-H98 muAPRIL proteina.

Prečišćavanje Myc-mAPRIL

Myc-mAPRIL, protein od 149 amino kiselina je eksprimiran upichia.Taj protein ima izoelektričnu tačku 7.45. 175 ml supernatantapichiaje dijaiizovano i pufer je zamenjen sa 10 mM Tris pH 6.8 preko noći i zatim pušten kroz SP kolonu od 20 ml. Kolona je isprana ekstenzivno sa 10 mM Tris-HCl, pH 6.8 i razblažena sa 250 n mM NaCI u PBS. Drugi korak prečišćavanja je dostignut upotrebom gel filtracione kolone (S3000). Frakcije koje su sadržale myc-Apri! iz SP kolone od 20 ml su koncentrisane centrifugiranjem do zapremine od 7 ml. Nakon gel filtracije povratili smo 8 mg myc-APRIL kao što je detektovano sa OD i coomassie gelom. Takođe smo izveli VVestern blot analizu koristeći mišje monoklonalno 9E10 antitelo (anti-myc) koje pokazije da je obeleženi myc intaktan nakon koraka prečišćavanja. N terminalna sekvenca potvrdila je da pečišćeni protein odgovara myc-mApril.

Prečišćavanje FLAG-humanog APRIL

Plazmid ps429 (naknadno nazvan p1448) upotrebljen je da se privremeno transfektuju 293 T ćelije koristeći reagens lipofektamin (Gibco-Brl) i medijum bez seruma. Plazmid, konstruisan u sisarskom ekspresionom vektoru PCR3 (Invitrogen) kodira receptor-vezujući domen humanog APRIL, sa N-terminalnim proteinom u medijumu ku|ture ćelija. FLAG-APRIL protein je prečišćen iz medijuma bez seruma koristeći anti-FLAG mAb M2 kolonu i višak je prečišćenog FLAG peptida, sledeći uputstva proizvođača (Kodak).

Prečišćavanje HBMCA-Fc

HBMCA-Fc je privremeno transfektiran u 293 ćelije. Kondicionirani medijum 293 ćelija koje prekomerno eksprimiraju hBCM-Fc napunjen je u proteinsku A kolonu. Protein je ispran koristeći 25 mM fosfata 100nM NaCI pH 2.8 praćenog neutralizacijom sa 1/20 zapremine 0.5 M NaP04pH 8.6. Frakcije odabrane na osnovu OD 280 bile su predmet redukujućih i ne-redukujućih SDS-PAGE gelova i western blotova da se identifikuje prečišćeni protein. Obnovljeno je 3 mg proteina iz 500 ml kondicionog medijuma.

Myc-mAPRIL vezuje se za različite ćelije u FACS analizi

450 ng/ml prečišćenog myc-mAPRIL je vezano za ćelijske linije u 100u,l PBS/2%FBS + Fc blokirajući reagens (FcBlock @ 20ug/ml (Pharmagen) i prečišćeni humani IgG @ 10 ug/ml (Sandoz) na ledu 1 čas. Pozitivno vezivanje je utvrđeno koristeći specifični zečji anti-miš APRIL antiserum (1:500) i magareći ant-zec IgG-FITC (Jackson). Ćelijske linije A20, Raji, NIH3T3 i HT29 su održavane u medijumu kao što je sugerisano od strane isporučioca (ATCC Bethesda, MD). BJAB ćelije su kultivisane u HEPES-puferizovanom RPMI snabdevenim sa 10% FBS i L-glutaminom. U ogledu kompeticije 450 ng/ml myc-mišjeg APRIL je dodano sa 1 ug/ml konkurentskog proteina.

Primer 1: Detekcija vezivanja APRIL za APRIL-R korišćenjem ogleda sa pločom

U ovom primeru ispitana je povezanost BCMA sa April.

S ciljem da se ispita da li se BCMA vezuje sa April izveli smo eksperimentko-imunotaloženja. U ovom eksperimentu upotrebljena su oba rastvorljiva proteina hBCMA-Fć i myc-mAPRIL.

HBMCA-Fc i LTbR-Fc dodavani su sa različitim TNF veznicima: myc-mApril; myc-CD40L i myc-RANKL u medijum koji je sadržao 10% FBS tokom pola časa na sobnoj temperaturi. Fc proteini su bili vezani za perlice proteina A tokom 1-2 časa, isprani tri puta sa 1 ml PBS, analizirani imunoblotingom sa mišjim monoklonalnim 9E10 (anti-myc) antitelom i razvijeni koristeći pojačanu hemiluminescenciju.

Detektovali smo myc-APRIL u hBCMA-Fc imunotalozima što je ukazivalo da BCMA interreaguje sa April na specifičan način pošto drugi TNF veznici, myc-CD40L i myc-RANKL nemaju sposobnost da se vezuju za BCMA. MycApril se ne vezuje sa LTbR-Fc.

Ista membrana je izrezana na trake i blotovana ponovo sa anti-hIG-HRP da pokaže da je ista količina LTbR-Fc sa BCMA-Fc upotrebljena u imunotalozima.

Primer 2:

Ovaj primer opisuje da hBCMA-FC iterreaguje sa FLAG-hAPRIL.

ELISA analiza: Obavijene ploče sa receptor-Fc fuzionim proteinima (hBCMA-Fc-739 ili hTNFR2-Fc-492) na 1 ug/ml u karbonatu pH 9.6 preko noći, 4C. Blokirani tokom 2 časa na sobnoj temperaturi koristeći PBS/5% suvog mleka bez masti/5% Tween-20. 2x serijska razblaženja veznika napravljena su u 100 ul pufra za blokiranje (TNFa-197 iz 1000 ng/ml. MuBAFF-657 iz 1000 ng/ml, hAPRIL-507 iz 2000 ng/ml (inaktivni), hApril-429 iz 5x koncentrisanih medijuma). Nakon inkubiranja sa veznicima ploča je isprana u PBS), 5% Tween-20 i isprobana sa 0.5 ug/ml anti-FLAG mAb M2 u puferu za razblaživanje. Antitelo je zatim detektovano koristeći anti-miš-PO 1/2000 sa enzimatskim razvijanjem (OPD).

Eksperimenti imunotaloženja: 293T ćelije su transfektovane sa naznačenim eksperimentalnim plazmidom (Rec-Fc ili flag veznik) u ploči od 9 cm. Transfektovane ćelije ostavljene su tokom 5 d u 8 ml Optimem medijuma (Gibco-BRL). Imunotaloženje je obavljeno mešanjem 200 ul kondicionog medijuma sa svakim receptorom sa 200 ul svakog veznik-kondicionog medijuma + 400 ul PBS + 10 ul ProG-Sepharose. Oni su rotirani 1 č na točku, isprani 4x sa iml PBS, zatim prokuvani u 50 ul pufera uzorka (+DTT). Po putiću je napunjeno 20 ul svakog imunotaloga. Reveal bloting je obavljen sa 1 ug/ml anti-FLAG M2 mAb (Sigma, St Louis MO) i anti-miš PO (1/2000). Ponovljena blot proba sa anti-humanim-PO je takođe proverena: 100 ul kondicionog medijuma je istaloženo sa MeOH/CHCI3/lizozim. Ova mešavina je proključana u 50 ul pufera uzorka (+DTT) i 20 ul je napunjeno. Reveal blot je obavljen sa anti-FLAG mAb M2 (1 ug/ml) i anti-miš-PO (1/2000).

Primer3:

Ovaj primer opisuje vezivanje myc-mAPRIL; hKayL-440 (hBAFF); i Flag-mBAFF za hBCMA-lg, hLT-R-lg, ili hpTNFR-lg. Svi eksperimenti izvedeni su na 25C sa 10 ul/ml minutne stope protoka.

Svaki eksperiment je izveden koristeći HBS pufer (10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 0.005% P20 surfaktanta, na pH 7.4). Isti rastvor je upotrebljen i kao tekući pufer i razblaživač pufera.

Površina CM 5 čipa (BlAcore, Inc.) je prvo aktivirana sa N-hidroksisukcinamidom/N-etil-N'-(3-dietilaminopropil)-karboksiamid hidrohloridom (BlAcore). Dvadeset ul hBCMA-lg; petnaest ul hl_T-R05-lg i 10 ul hp80-TNFR, razblaženih do 30 g/ml u 10 mM sirćetne kiseline je zatim blokirano odjednom sa 30 ul i ponovo sa 15 ul etanolamin-HCL (pH 8.5). Ovo je proizvelo površinsku gustinu od 1600-3700 jedinica rezonanse (RU). Čip je regenerisan sa 20 ul 1 mM mravlje kiseline. Ova odbacivanja su ponovljena pet puta da se uspostavi ponovljiva i stabilna polazna linija.

Za eksperiment, 100 ul mvc-mAPRIL, hKayl_-440, i Flag-mBAFF su razblaženi do 30 ug/ml u puferima za razređivanje i injekcirani na površinu čipa. Odmah nakon svake injekcije čip je ispran sa 500 ul razređujućeg pufera. Između eksperimentata površina je regenerisana injekciranjem 20 ul 1 mM mravlje kiseline; praćenim sa drugom injekcijom mravlje kiseline od 15 ul. Nakon regeneracije čip je uravnotežen sa razređujućim puferom.

Primer 4: Generisanje rastvorljivih oblika receptora:

Da se formira inhibitor receptora za upotrebu kod čoveka potrebna je sekvenca cDNK humanog receptora izvanćelijskog domena. Kod miša oblik je poznat, humane cDNK biblioteke mogu se lako pregledati koristeći mišje cDNK sekvence i ovakve manipulacije se rutinski koriste u ovom području. Sa humanom cDNK sekvencom moguće je dizajnirati olinukleotidne prajmere da bi se PCR-om amplificirao izvanćelijski domen receptora u otsustvu transmembrane i unutarćelijskog domena. Obično on uključuje većinu amino kiselina između poslednjeg disulfidom vezanog 'TNF domena" i transmembranskog domena. Moguće je varirati "stalk" region koji je uključen da se optimizuje potentnost nastalog rastvorljivog receptora. Ovaj amplifikovani komad biće konstruisan tako da uključi pogodna reakciona mesta da omogući kloniranje u različite C-terminalne Ig fuzione himera vektore. Alternativno je moguće ubaciti stop signal na 3' kraju i napraviti rastvorljivi oblik receptora bez ponovne upotrebe Ig fuzionog himera pristupa. Rezultantni vektori mogu biti eksprimirani u većini sistema koji se koriste u biotehnologiji uključujući kvasac, ćelije insekata, bakterija i ćelije sisara i postoje primeri za sve tipove ekspresije. Različiti humani Fc domeni mogu biti priključeni po želji da se optimizije ili eliminišu FcR i interakcije komplementa. Alternativno se mogu upotrebiti mutirani oblici ovih Fc domena da se selektivno uklone FcR ili interakcije komplementa ili pričvršćivanje N-vezanih šećera za Fc domen što ima određene prednosti.

Primer 5: Generisanje agonističkih ili antagonističkih antitela:

Gore opisani rastvorljivi oblici receptora mogu se upotrebiti da se imunizuju miševi i da se naprave monoklonalna antitela konvencionalnim metodima. Nastali mAb-ovi koji su identifikovani sa ELISA metodima mogu se dalje pregledati za agonističku aktivnost bilo kao rastvorljiva antitela ili imobilizirana na plastici u različitim ćelijskim ogledima in vitro. Često je smrt HT29 linije ćelija pogodan sistem koji je osetljiv na signaliranje preko mnogih TNF receptora. Ako ova linija ne poseduje receptor od interesa, taj receptor pune dužine može se lako transfektovati u HT29 liniju da se sada omogući da radi ogled citotoksičnosti. Alternativno, takve ćelije mogu biti upotrebijene u Cvtosensor aparatu da se utvrdi da li aktivacija receptora može izazvati pramenu pH koja je indikativna za događaj signaliranja. Receptori TNF porodice dobro signaliraju u takvom obliku i ovaj metod ne zahteva poznavanje stvarnih bioloških događaja aktiviranih receptorom. Agonist mAb-ova može biti "humanizovan" za kliničku upotrebu. Ova procedura može se takođe upotrebiti da se definišu antagonistički mAb-ovi. Takvi mAb-ovi mogu biti definisani nedostatkom agonističke aktivnosti i sposobnosti da se inhibira interakcija receptor-veznik kao što je praćeno sa ELISA, klasičnim vezivanjem BlAcore tehnikama. Na kraju, indukcija sekrecije hemokina od strane različitih ćelija u odgovoru na agonističko antitelo može formirati skrining ogled.

Primer 6: Skrining za inhibitore interakcije receptor-veznik:

Koristeći receptor-lg fuzioni protein, mogu se skrinovati bilo koje kombinatorne biblioteke za molekule koji se mogu vezati direktno za receptor. Ovi molekuli mogu zatim biti ispitani sa ELISA formatiranim ogledom koristeći receptor-lg fuzioni protein i rastvorljivi oblik veznika za sposobnost da se inhibira interakcija receptorr-veznik. Ova ELISA može se upotrebiti direktno da se skrinuju različite prirodne produkt biblioteke itd. za inhibitorna jedinjenja. Receptor može biti transfektovan u ćelijsku liniju kao što je HT29 da se formira biološki ogled (u ovom slučaju citotoksčnost) koji zatim može formirati skrining ogled.

Primer7:Inhibicija rasta tumorain vivo

Efektivnost BCMA-lg kao antagonista rasta tumora ispitana je koristeći jedan broj razližitih linija tumorskih ćelija koje rastu in vivo. Za ove studije upotrebljeni su atimični (Nu/Nu) imunodeficijentni miševi i tumorske ćelije su inplantirane subkutano. Za SVV480 tumorsku liniju, koja raste agresivno, inplantirali smo 8 x 10<s>ćelija u 100 u,l sterilnog PBS bez pirogena. Jedna kontrolna grupa ostavljena je netretirana (n=5) dok su druge grupe dozirane sa 100^.igs kontrolnog Ig (n=6) ili 100 u,gs BCMA-lg (n=6) proteina. Doziranje je počelo neposredno pre implantacije sa uzastopnim dozama svakih 7 dan nakon toga. Dijametar tumora je meren koristeći mikrometar i zapremina je izračunata koristeći formulu vol=4/3nr<3>.

SVV480 karcinom tumori debelog creva rastu veoma brzo pomoću Nu/Nu miš modela, opipljivi tumori su detektovani u okviru 10 dana. Nakon 24 časa prosećna zapremina kontrolnog tumora bila je 0.3 cm<3>, dok je prosečna zapremina BCMA-lg tretiranih tumora bila 0.19 cm<3>, redukcija od 46% u težini tumora. Karcinom debelog creva HT29 takođe raste agresivno u Nu/Nu modelu. Za te eksperimente 1 x 10<6>ćelija u 100 u.l sterilnog PBS bez pirogena je implantirano subkutano i režim doziranja bio je kao što je opisano za SVV480. Opipljivi tumori su detektovani nakon 7 dana i u kontrolnoj grupi većina tumora raste vrlo brzo. Nakon 42 dana prosečna zapremina tumora u kontrolnim grupama (netretirane i kontrole-lg tretirane, n=12) bila je 0.485 cm<3>, dok je prosečna veličina tumora u BCMA-lg tretiranoj grupi (n=5) bila 0.095 cm<3>, redukcija 80% u težini tumora. Nakon 50 dana 30% miševa u kontrolnoj grupi je zabeleženo kao terminalni zahvaljujući veličini tumora većoj od 1.5 cm<3>, i eksperiment je zaustavljen. Nasuprot kontrolnoj grupi 0% miševa, u BCMA-lg tretiranoj grupi je zabeležena kao terminalna. Rezultati su prikazani u tabeli 2.

Ovo pokazuje 70% redukcije u prosećnoj veličini tumora i značajan efekt na smrtnost u HT29 modelu rasta tumora koristeći BCMA-lg tretman.

Tumorska linija karcinoma pluća A549 raste sporije nego linija karcinoma debelog creva opisana gore. Za tu ćelijsku liniju implantirali smo 1 x 10<S>ćelija u 100 u.l sterilnog PBS bez pirogena i tretirali koristeći prethodno opisani režim. Opipljivi tumori su detektovani približno 20 dana nakon implatacije. 50 dana nakon implatacije tumora prosečna zapremina tumora u kontrolnim grupama (netretirani i kontrolno-lg tretirani; n=16) bila je 0.2 cm<3>dok je prosečna zapremina u BCMA-lg tretiranoj grupi (n=7) bila 0.1 cm<3>, redukcija od 50% u zapremini tumora. U BCMA-lg tretiranoj grupi 57% miševa imalo je tumor manji od 0.1 cm<3>nakon 50 dana dok je samo 6% kontrolno tretiranih miševa zadržalo tako malu težinu tumora. 60 dana nakon implatacije tumora prosečna zapremina tumora u kontrolnoj grupi porasla je do 0.3 cm<3>. Nasuprot prosečnoj zapremini tumora u BCMA-lg tretiranoj grupi bila je još uvek manja od 0.2 cm<3>(0.188).

Za mišiju NIH3T3 liniju, koja takođe raste još sporije od linije karcinoma debelog creva inplantirali smo 5 x 10<s>ćelija u 100 u,l sterilnog PBS bez pirogena i tretirali kao što je gore opisano. NIH3T3 ćelije formiraju tumor fibrosarkom kada se inlantiraju subkutano u Nu/Nu miševe. Nakon 4 nedelje detektovani su opipljivi tummori i u kontrolnim grupama (n=11) ovi tumori proširili su zapreminu u sledećih 10 dana da dostignu prosečnu veličinu od 0.136 cm<3>. Nasuprot zapremini tumora kod BCMA-lg-tretirane grupe (n=5) koja je dostigla veličinu od samo 0.03 cm<3>, 78% redukcije u težini tumora. 48-og dana nakon implantacije prosečna zapremina tumora u kontrolnim grupama dostigla je 1.6 cm<3>, dok je prosečna veližina tumora kod BCMA-lg-tretirane grupe bila samo 0.8 cm<3>, 50% redukcije u zapremini tumora. 52-og dana 82% (9/11) životinja u kontrolnim grupama zabeležene su kao terminalne na osnovu zapremine tumora veće od 1.5 cm<3>, ostavljajući samo 18% još uvek živih životinja. Nasuprot tome 40% (2/5) životinja u BCMA-lg-tretiranoj grupi imalo je tumor takve zapremine da su morale da budu žrtvovane, ostavljajući 60% životinja još uvek u životu. Ovi rezultati su prikazani u tabeli 3.

Rezultati koji pokazuju rast NIH3T3 tumora u vremenu ilustrovani su na slici 13. Rezultati koji pokazuju rast SW480 tumora u vremenu ilustrovani su na slici 14. Rezultati koji pokazuju rast HT29 tumora u vremenu i skatergram koji pokazuje pojedinačne životinje 42 dana nakon implantacije tumora ilustrovani su na slici 15A. Rezultati koji pokazuju rast A549 tumora u pojedinačnim životinjama u danima 50 i 60 nakon imlantacije tumora pokazani su na slici 15B.

Rezultati inhibicije rasta tumora NIH3T3 ćelijske linije tumora su prikazani na slici 13. Rezultati inhibicije rasta tumora za SVV480 ćelijsku liniju tumora su prikazani na slici 14. Rezultati inhibicije rasta tumora HT29 i A549 ćelijske linije tumora su prikazani na slici 15.

Primer 8: BCMA-lgG uzrokuje redukciju u broju B-ćelija kod normalnih miševa

Osam-nedeija stare ženke BALB/c miševa su nabavljene iz Jackson Laboratorv (Bar Harbor, ME).

Miševi (3/grupa) primili su i.p. ili PBS, 400 u,g humanog BCMA-hulgG1 (hBCMA-lg) fuzionog proteina (nabavljenog od Te resa Cachero, Biogen) ili 400 u.g prečišćenog humanog IgG (HulgG) (Sandoz, Basel, Švajcarska) u danima -8, -5, -1 i +2. Miševi su primili 100 u,l 10% crvenih krvnih ćelija ovce (SRBC) (Colorado Serum Company, Denver, Co) u nultom danu.

U vreme žrtvovanja krv je sakupljena putem srčane punkture u tube koje su sadržale EDT i crvene krvne ćelije su lizirane u hipotoničnom puferu. Krv je takođe sakupljena bez EDTA za preparaciju seruma. Suspenzije pojedinačnih ćelija pripremljene su iz slezina i mezenteričnih limfnih čvorova (MLN) i crvene krvne ćelije su lizirane u hipotoničnom puferu. Obavljena je flou citometrija koristeći PE-konjugovana anti-CD45R/B220, anti-sindekan/CD138 i anti-B7.2 i FITC-konjugovana anti-lgM i anti-CD45R/B220. Sva mAb-ovi su nabavljeni od Pharmingen (San Diego, CA). Ukratko, Fc receptori su blokirani sa 10 p.g/ml Fc Block (Pharmingen) tokom15 minuta na ledu, praćeno dodavanjem PE- i FITC-konjugovanog mAb-o/a i inkubirani na ledu tokom 20-30 min. Ćelije su isprane 1 x i suspendovane u 5% paraformaldehidu. Podaci o fluorescenciji ćelija su dobijeni na FACSCalibur™ flou citometrom (Becton Dickinson, San Jose, CA) i analizirano koristeći CELLOuest™ softver (Becton Dickinson).

Nakon tretmana sa hBCMA-lg bilo je otprilike 50% redukcije u broju B ćelija u ispitanoj perifernoj krvi i u perifernim limfnim organima. B220<v>'<soki>lgM<n>il*iBćelije činile su 23.4% i 21.5% ćelija u PBS-tretiranim i HulgG-tretiranim miševima, respektivno, dok je populacija odgovarala samo 9.9% ćelija u hBCMA-lg-tretiranih miševa. Plazma ćelije (sindekan/CD138+) izgleda da su neznatno smanjene kao i 5.7 i 4.8 prisutno u krvi PBS-tretiranih i HulgG-tretiranih miševa, respektivno u poređenju sa 3.9% kod hBCMA-lg-tretiranih miševa. B7.2 molekul je preregulisan u 3.1% i 4.5% B220+ ćelija kod PBS-tretiranih i HulgG-tretiranih miševa, respektivno. u poređenju sa 1.9% kod hBCMA-lg-tretiranih miševa.

U slezini B220v"okiB ćelije su bile značajno redukovane kod hBCMA-lg-tretiranih miševa koji predstavljaju 18.8% u poređenju sa 36.7% i 40% kod PBS- i HulgG-tretiranih miševa, respektivno. Ovaj pad je zapažen i kod IgM<*1*01>" i IgM""" subpopulacija (vidi tabelu 1). Nije bilo promene zapažene kod novo formiranog odeljka B ćelije u slezini, B220n<latlgMviaaM (podaci nisu prikazani). Plazma ćelije (sindekan/CD138+) pokazale su se neznatno smanjenim kao i sa 3.3% I 3.4% prisutnih u slezini PBS-tretiranih i HulgG-tretiranih miševa, respektivno u poređenju sa 2.4% kod hBCMA-lg tretiranih miševa.

MLN su pokazali pad u B220+ B ćelijama sa 14.1% prisutnih u hBCMA-lg-tretiranih

miševa u poređenju sa 26.7% i 35.8% u PBS-tretiranihiHulgG-tretiranih miševa, respektivno.

Podaci su sumarizovani u tabeli 3.

Smanjenje procenata B7.2+ B-ćelija u krvnim i plazma ćelijama u krvi i slezini hBCMA-lg-tretiranih miševa nakon imunizacije sa SRBC-ovima sugeriše da nije bilo inhibicije aktivacije B-ćelija i/ili sazrevanja i potencijalno povećane eliminacije B ćelija. Vrlo mali procenat antigen-specifičnih B ćelija biće aktiviran i odgovoriti na bilo koji antigen u ovom slučaju SRBC. Pošto je hBCMA-lg tretman rezultirao takvom dramatičnom redukcijom B ćelija u svim ispitanim tkivima, »50%, izgleda da aktivnost hBCMA-lg takođe pogađa preostale zrele B ćelije.

Prema tome se smatralo da BCMA fuzioni protein može biti upotrebljen kao terapeutski lek sa kliničkom primenom u bolestima posredovanim B ćelijama. Bolesti će uključivati one koje su autoimune prirode kao što su sistematski lupus eritematozus, miastenia gravis, autoimuna hemolitička anemija, idiopatska trombocitopenia purpura, anti-fosfolipidni sindrom, Charg-ova bolest, Wegner-ov granulomatozis, poli-arteritis nodoza i brzi progesivni glomerulonefritis. Terapeutski agens imaće takođe primenu u poremećajima plazma ćelija kao što su multipli mijelom, Waldenstorm-ova makroglobulinemija, bolest teškog lanca, primarni ili za imunocite-vezani amiloidozis i monoklonalna gamopatija neodređenog značaja (MGUS). Onkološki ciljevi će uključiti karcinome B ćelija, leukemije i limfome.

Onima sa iskustvom u praksi biće očigledno da različite modifikacije i varijacije mogu biti napravljene u polipeptidima, preparatima i metodima pronalaska bez odstupanja od duha i obima pronalaska. Prema tome, namera je da predmetni pronalazak obuhvati modifikacije i varijacije ovog pronalaska pod ustavom da one ulaze u obim podnetih zahteva i njihovih ekvivalenata.

Claims (10)

1. Upotrebaa) polipeptidakojisadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena od aminokiseline 8 do aminokiseline 41usekvenci čiji je ID broj: 8; ilib) antitela usmerenog protiv aminokiselinske sekvence koja je predstavljena od aminokiseline 8 do aminokiseline 41 u sekvenci čiji je 10 broj: 8 za pripremu farmaceutskog preparata za tretman tumorske ćelije koja eksprimira ligand koji indukuje proliferaciju (APRIL,eng. A ProtifaaHon Indueing Ligand, prim. prev.}.

2.Upotreba premazahtevu1,namočena timeSto polipeptid iz (a) đajjesadržiFc domen iziučenog proteina.

3.Upotreba prema zahtevu 2,naznačena timešto polipeptid iz(a)dalje sadrži Fc domen imunoglobulina.

4. Upotreba prema zahtevu 3,naznačena timešto je taj imunoglobulin IgG.

5.Upotreba premazahtevu4*naznačena tuneSto je taj imunoglobulin humani.;

6.Upotreba prema zahtevu 5, naznačena time Sto dati polipeptid dalje sadrži sekvencučtfijeIDbtoj; 12.;

7.Upotreba prema bilo kom od zahteva1 do 6,naznačena timeSto je tumorska ćelijakarcinom,;

8. Upotreba prema zahtevu 7,naznačena timešto je dati karcinom izabran iz grupe koja sesastojiod karcinoma pluća, karcmorna debelog creva*karcinoma prostate i karcinoma dojke.

9.Upotreba prema bilo kom od zahteva 1 do 8,naznačena timešto se tumorska ćelija nalazi unutar nekog sf sara.

10. Upotreba prema zahtevu9, naznačena timeŠto je dati sisar čovek.