PL204010B1

PL204010B1 - Zastosowanie polipeptydu zdolnego do wiązania liganda indukcyjnego proliferację (APRIL)

Info

Publication number: PL204010B1
Application number: PL355102A
Authority: PL
Inventors: Pascal Schneider; Jeffrey Thompson; Teresa Cachero; Christine Ambrose; Paul Rennert
Original assignee: Apoxis S A; Biogen Idec Inc
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2009-12-31
Also published as: NO331683B1; IS6322A; NZ517907A; EP1223964B1; UA74798C2; CN1263507C; GEP20043375B; EP1847273A1; US20030082175A1; BR0014583A; TR200200912T2; KR100759295B1; HUP0203567A2; PL355102A1; EE05212B1; CN1399556A; DE60034586D1; EP1223964A1; CZ297633B6; BG106670A

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową, zdolnego do wiązania liganda indukującego proliferację (APRIL) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka.

Przedstawiciele cytokin rodziny czynnika martwicy nowotworu wymagani są w szerokim zakresie krytycznych funkcji biologicznych. Każdy przedstawiciel rodziny TNF działa przez związanie z jednym lub kilkoma przedstawicielami równoległej rodziny białek receptorowych. Receptory te z kolei przekazują sygnał wewnątrzkomórkowo dla zaindukowania szerokiego zakresu odpowiedzi fizjologicznych czy rozwojowych. Wiele spośród sygnałów przekazywanych przez receptory wpływa na śmierć komórki, a także uruchamia ostateczne różnicowanie. Przykłady różnicowania komórkowego obejmują proliferację, dojrzewanie, migrację i śmierć.

Przedstawiciele rodziny TNF są związanymi z błonami białkami Typu II, posiadającymi krótką domenę wewnątrzkomórkową na końcu N, domeną transbłonową oraz na końcu C domeny wiążące receptor położone na zewnątrz powierzchni komórki. W niektórych przypadkach zewnątrzkomórkowa część białka jest odcinana, co daje wydzielaną formę cytokiny. Podczas gdy białka związane z błoną działają miejscowo, przypuszczalnie przez oddziaływanie za pośrednictwem kontaktowania komórki z ich receptorami, forma wydzielana posiada zdolność krążenia czy dyfuzji i dzię ki temu moż e dział a ć w odległych miejscach. Obie formy, związana z błoną i wydzielana, istnieją w postaci trimerów i wydaje się, że przenoszą swój sygnał na receptory przez ułatwienie grupowania się receptorów.

Rodzina białek receptorowych TNF charakteryzuje się posiadaniem jednej lub kilku domen zewnątrzkomórkowych bogatych w cysteinę. Każdy z regionów bogatych w cysteinę tworzy powiązaną mostkami dwusiarczkowymi domenę rdzeniową, która daje trójwymiarową strukturę tworzącą kieszeń wiążąca ligand. Receptory są związanymi z błonami białkami Typu I, w których domena zewnątrzkomórkowa jest tworzona przez koniec N, za którym występuje domena transbłonowa oraz wewnątrzkomórkowa domena na końcu C. Domena wewnątrzkomórkowa jest odpowiedzialna za przekazywanie sygnału przez receptor. Niektóre receptory zawierają wewnątrzkomórkową „domenę śmierci, która może dostarczać sygnał dla apoptozy komórki i te mogą stanowić silnie induktory śmierci komórki. Inna klasa receptorów może słabo indukować śmierć komórki, stąd wydaje się, że zgubiły one domenę śmierci. Trzecia klasa nie indukuje śmierci komórki. Wszystkie klasy receptorów mogą przekazywać sygnał do proliferacji lub różnicowania komórki zamiast śmierci, w zależności od typu komórki czy występowania innych sygnałów.

Dobrze zbadanym przykładem aktywności rodziny TNF ze zdolnością wielokierunkowego różnicowania jest przedstawiciel, TNF. TNF może istnieć jako cytokina związana z błoną lub może być cięty i wydzielany. Obie formy wiążą się z dwoma receptorami TNF, TNF-R55 i TNF-R75. Pierwotnie opisany na podstawie jego zdolności do bezpośredniego zabijania komórek nowotworowych TNF kontroluje także szereg procesów immunologicznych w tym indukcję reakcji ostrego zapalenia, jak również podtrzymywanie homeostazy tkanki limfoidalnej. Ze względu na podwójną rolę jaką ta cytokina odgrywa w różnych układach patologicznych, badano zarówno agonistów jak i antagonistów, które modyfikują chorobę. Przykładowo, TNF i LTa (który także przekazuje sygnał przez receptory TNF) użyto do leczenia nowotworów, w szczególności tych umiejscowionych obwodowo jak mięsaków kończyn. W układzie tym bezpośrednie przekazywanie sygnału przez cytokinę przez receptor indukuje śmierć komórki nowotworowej (Aggarwal i Natarajan, 1996, Eur. Cytokine Netw. 7:93-124).

W układach immunologicznych, czynniki które blokują przekazywanie sygnału przez TNF (np. anty-TNFmAb, rozpuszczalne białka fuzyjne TNF-R) można użyć do leczenia chorób takich jak reumatoidalne zapalenie stawów i zapalne jelita. W patologiach tych TNF działa przez indukcję proliferacji komórek czy funkcji efektora, a tym samym zaostrza chorobę autoimmunologiczną i w układzie tym blokowanie wiązania TNF do jego receptora(ów) ma pożytek terapeutyczny (Beutler, 1999, J. Rheumatol. 26 Suppl 57:16-21).

Ostatnio ujawniony system ligand/receptor wydaje się podlegać podobnym manipulacjom. Limfotoksyna beta (LTe), przedstawiciel rodziny TNF, który tworzy heterotrimery z LTa wiąże się z LTe-R. Niektóre komórki raka gruczołowego, które wyrażają LTe-R można zabijać lub różnicować przez traktowanie agonistycznymi anty- LTe-RmAb (Browning i wsp., 1966, J. Exp. Med. 183:867-878). W układach immunologicznych wykazano, że anty-LTemAb, czy rozpuszczalne białko fuzyjne LTe-R może blokować rozwój zapalenia jelita, możliwe że przez wpływ na oddziaływanie komórek dendrytycznych oraz komórek T (Mackay i wsp., 1998, Gastroenterology 115:1464-1475).

PL 204 010 B1

System TRAIL może być użyty w terapii nowotworowej. TRAIL oddziałuje z szeregiem receptorów związanych z błoną i receptorów rozpuszczalnych. Dwa z tych receptorów, TRAIL R1 i TRAIL R2 (nazywane także DR4 i DR5), przekazują sygnały indukujące śmierć komórek nowotworowych lecz nie komórek normalnych, które wyrażają dodatkowe receptory TRAIL, które nie indukują śmierci. Uważa się, że te dodatkowe receptory działają jako wabiki. Użycie rozpuszczalnego TRAIL dla zabicia komórek nowotworowych opiera się na selektywnej ekspresji receptorów wabikowych na tkance normalnej, a nie na rakowej (Gura, 1997, Science 277:768).

Same komórki nowotworowe często wyrażają zróżnicowane receptory wabikowe, które blokują rozpoznawanie immunologiczne lub funkcje efektora. Rzeczywiście niektóre nowotwory nadprodukują receptory wabikowe TRAIL, widocznie dla uniknięcia śmierci za pośrednictwem TRAIL (Sheikh i wsp., 1999, Oncogene 18:4153-4159). Ogranicza to wykorzystanie TRAIL jako czynnika antynowotworowego w pewnych układach.

Podobne obserwacje dotyczą receptora wabikowego dla FAS-L, który jest nadprodukowany przez komórki raka płuc i okrężnicy (Pitti i wsp., 1998, Nature 396:699-703) oraz dla antagonisty receptora IL-1 (Mantovani i wsp., 1998, Ann. N.Y. Acad. Sci. 840:338-351). Receptory wabikowe są także wykorzystywane przez genomy wirusowe w celu ochrony zainfekowanych komórek gospodarza przed mechanizmami obronnymi.

APRIL (ligand indukujący proliferację, ang. A Proliferation Inducing Ligand) jest nowym przedstawicielem białek rodziny TNF. Badania nad ekspresją i funkcją APRIL sugerują, że białko to jest wykorzystywane przez komórki nowotworowe dla zaindukowania proliferacji. Linie komórek nowotworowych z rozpuszczalnym białkiem APRIL czy stransfekowane cDNA dla APRIL rosną in vitro szybko. Komórki stransfekowane APRIL wszczepione myszom z niedoborem odpornościowym rosną szybko w postaci nowotworów. W końcu, ludzkie komórki nowotworowe, lecz nie normalna tkanka, wyrażają wysokie poziomy informacyjnego RNA dla APRIL. Obserwacje te sugerują, że APRIL wiąże się z receptorem, który jest także wyrażany przez komórki nowotworowe, prowadząc do autowydzielniczej lub parawydzielniczej aktywacji komórek nowotworowych. Dodatkowo, możliwe jest, że APRIL działa w układach chorobowych, tak, że aktywacja czy blokowanie drogi APRIL mogłoby mieć dodatkowe wykorzystanie. Przykładowo, zmniejszona produkcja lub nadprodukcja APRIL może odgrywać rolę w rozwoju defektów, ponieważ rozwój jest często charakteryzowany przez dokładnie kontrolowane zbalansowanie pomiędzy proliferacją, a śmiercią komórek. Podobnie, APRIL może działać w chorobach proliferacji komórek, takich jak te, które pojawiają się w połączeniu z chorobami autoimmunologicznymi (np. toczeń) czy w chorobach zapalnych, w których populacje komórek szybko się rozprzestrzeniają (np. posocznica bakteryjna).

W oparciu o znane wykorzystanie używanych agonistów i antagonistów przedstawicieli rodziny TNF i receptora TNF jako modyfikatorów choroby, droga APRIL sama stanowi istotny cel dla rozwoju leków. Jest to szczególnie istotne w terapii raka, ponieważ wydaje się, że komórki nowotworowe produkują i wykorzystują APRIL dla utrzymania ich własnego wzrostu i jest zatem mało prawdopodobne aby wytwarzały receptory wabikowe czy innych antagonistów drogi APRIL. Zatem droga APRIL unikalnie różni się od, przykładowo, dróg TRAIL czy FAS-L, które mogą być zniszczone przez receptory wabikowe nowotworu.

Aktualne leczenie raka dla wielu typów nowotworów jest nieodpowiednie, ze względu na słabą skuteczność, niski wpływ na przeżywalność, toksyczność wywołującą skutki uboczne czy ich kombinacje. Zatem istnieje potrzeba zidentyfikowania i rozwoju dodatkowych sposobów leczenia wzrostu nowotworu, które mogą być skuteczne a nie dają indukcji silnych skutków ubocznych. Przydatni zatem będą antagoniści drogi APRIL, włączając anty-APRIL mAb, anty-receptor APRIL mAb, rozpuszczalne białka fuzyjne anty-receptor APRIL-Ig, naturalnych antagonistów, niskocząsteczkowych antagonistów oraz związki chemiczne i farmaceutyki czy innych antagonistów.

W tym celu zidentyfikowaliśmy białko, które jest receptorem dla APRIL w limfocytach B (BCM czy BCMA).

Zgłaszający ujawnili, że BCMA jest receptorem dla czynnika martwicy nowotworu, APRIL. APRIL jest tą samą cząsteczką, która wcześniej została opisana w publikacji WO 99 12965, włączonej tu na drodze odniesienia. Receptor APRIL jest dalej określany jako „APRIL-R.

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania

a) polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową, (i) w co najmniej 80% identyczną z sekwencją reszt aminokwasowych od 1 do 184 SEKW. NR ID.: 8, i (ii) zdolnego do wiązania APRIL (liganda indukującego proliferację);

b) polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową,

PL 204 010 B1 (i) w co najmniej 80% identyczną z sekwencją reszt aminokwasowych od 1 do 52 SEKW. NR ID.: 8, i (ii) zdolnego do wiązania APRIL (liganda indukują cego proliferację );

c) polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową od 8 do 41 reszty aminokwasowej SEKW. NR ID.: 8, lub

d) przeciwciała skierowanego przeciw sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEKW. NR ID.: 8., do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia komórek nowotworowych, które wyrażają ligand indukujący proliferację (APRIL).

Korzystnie polipeptyd z (a), (b) lub (c) ponadto obejmuje domenę Fc wydzielanego białka, korzystniej ponadto obejmuje domenę Fc immunoglobuliny, jeszcze korzystniej immunoglobuliną jest IgG, bardziej korzystnie immunoglobulina jest immunoglobuliną ludzką, korzystniej polipeptyd dalej obejmuje SEKW. NR ID.: 12.

Korzystnym nowotworem jest rak, korzystniej wybrany z grupy składającej się z raka płuc, raka okrężnicy, raka prostaty i raka sutka.

Równie korzystnie komórka rakowa jest u ssaka, korzystniej ssakiem jest człowiek.

Korzystne jest zastosowanie, w którym polipeptyd z (a), (b) lub (c) obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 85% identyczna z sekwencją reszt aminokwasowych od 1 do 52 SEKW. NR ID.: 8.

Równie korzystne jest zastosowanie, w którym polipeptyd z (a), (b) lub (c) obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 90% identyczna z sekwencją reszt aminokwasowych od 1 do 52 SEKW. NR ID.: 8.

Ponadto korzystne jest zastosowanie, w którym polipeptyd z (a), (b) lub (c) obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 95% identyczna z sekwencją reszt aminokwasowych od 1 do 52 SEKW. NR ID.: 8.

Kompozycje wytworzone zgodnie z zastosowaniem według wynalazku mogą być wykorzystane w leczeniu gatunków ssaków posiadają cych czy podlegają cych ryzyku raka. Osobnicy tacy obejmują osobników już dotkniętych rakiem lub tych, którzy przeszli terapię nowotworową.

Rozwiązania według niniejszego wynalazku korzystają po części z ujawnienia, że pewne czynniki, które są nowotworowymi czynnikami terapeutycznymi, zdefiniowane tu jako agoniści APRIL-R, włączając przykładowo przeciwciała anty-APRIL-R, można użyć w leczeniu osobników z ryzykiem rozwinięcia nowotworu jak tu zdefiniowano czy osobników z potrzebą leczenia nowotworu.

Nowotworowe czynniki terapeutyczne można podawać dowolną drogą podawania, która jest odpowiednia dla wyselekcjonowanego czynnika i można wytwarzać wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem stosownym dla drogi podawania. Korzystnymi drogami podawania są pozajelitowe a w szczególności dożylne, dootrzewnowe i wewnątrztorebkowe. Leczenie jest takż e korzystnie przeprowadzane przez wydłużony okres u pacjenta chorego ambulatoryjnie. Spodziewane dzienne dawki nowotworowych czynników terapeutycznych wynoszą w zakresie od około 0,01-1000 μg/kg masy ciała a bardziej korzystnie około 10-300 μg/kg masy ciała, chociaż dokładne dawki będą zmienne w zależności od użytego określonego nowotworowego czynnika terapeutycznego oraz od określonego stanu chorobowego osobnika i historii choroby.

Kompozycje wytworzone zgodnie z zastosowaniem według wynalazku są przydatne w usuwaniu zasadniczo sklonowej populacji (kolonii) stransformowanych komórek z ciała ssaka lub w supresji czy atenuacji wzrostu kolonii, która najczęściej jest określana jako nowotwór. Jako takie, są one przydatne w przedłużaniu życia i utrzymywaniu jakości życia osobników z ryzykiem czy już dotkniętych nowotworem.

Krótki opis figur

Na figurze 1 przedstawiono sekwencję kwasu nukleinowego (SEKW. NR ID.: 1) cDNA dla mysiego APRIL oraz jego pochodną sekwencję aminokwasową (SEKW.NR ID.: 3) zmapowaną na wektorze pCCM213.10. Podkreślono epitop myc i aminokwasy pochodzące z FasL. Początek sekwencji kodującej zewnątrzkomórkową domenę APRIL zaznaczono strzałkami.

Na figurze 2 przedstawiono sekwencję kwasu nukleinowego (SEKW. NR ID.: 4) oraz jego pochodną sekwencję aminokwasową (SEKW.NR ID.: 6) konstruktu FLAG-ludzki APRIL do ekspresji w komórkach ssaczych. Mapa pokazuje sekwencję sygnałową (1-15); epitop FLAG (AA 16-23) oraz początek sekwencji kodującej zewnątrzkomórkową domenę APRIL (koniec 32).

Na figurze 3A przedstawiono sekwencję kwasu nukleinowego (SEKW. NR ID.: 7) oraz sekwencję aminokwasową (SEKW.NR ID.: 8) ludzkiego BCMA o pełnej długości. Figura 3B przedstawia sePL 204 010 B1 kwencję kwasu nukleinowego (SEKW. NR ID.: 11) z pJST538, plazmidu kodującego konstrukt fuzyjny ludzki APRIL-R-hlgGFc oraz jego pochodną sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 12).

Na figurze 4 przedstawiono wiązanie myc-mysi APRIL z mysimi komórkami B chłoniaka linii A20. 3 niezależne doświadczenia pokazują specyficzne wiązanie APRIL z komórkami A20 w porównaniu z A) komórkami nie barwionymi i komórkami barwionymi tylko R1532, B) komórkami barwionymi RANKL-L i R1532 oraz C) komórkami barwionymi APRIL oraz kontrolną, niezależną surowicą królika.

Na figurze 5 przedstawiono wiązanie myc-mysi APRIL z mysimi komórkami B chłoniaka linii RAJI. 2 niezależne doświadczenia pokazują specyficzne wiązanie APRIL z komórkami RAJI w porównaniu z A) komórkami nie barwionymi i komórkami barwionymi tylko R1532 oraz komórkami barwionymi RANK-1 i R1532 oraz B) komórkami barwionymi APRIL oraz kontrolną, niezależną surowicą królika.

Na figurze 6 pokazano przy użyciu rozpuszczalnego białka BAFF i rozpuszczalnego białka BCMA-Ig, że wiązanie APRIL z komórkami A20 (A) oraz komórkami Raj i (B) jest współzawodniczące.

Na figurze 7 przedstawione jest wiązanie FLAG-ludzki APRIL z różnymi liniami komórkowymi: A) komórkami A2 0, B) komórkami HT29, C) komórkami NIH3T3. Specyficzne wiązanie jest pokazane przy użyciu wykrywania biotynylowanego anty-FLAG mAb M2 w porównaniu z wiązaniem widocznym z kontrolnym, niezależ nym izotypem mAb lub bez dodawania FLAG-APRIL.

Na figurze 8 przedstawiono immunoprecypitację myc-mAPRIL przy użyciu białka fuzyjnego BCMA-Fc. Górny lewy panel przedstawia specyficzną immunoprecypitację hBMCA-Fc/myc-mAPRIL oraz kontrolę pozytywną precypitacji OPG-Fc/Rank-1, w porównaniu z górną prawą kontrolą negatywną. Dolne panele pokazują, że nanoszono porównywalne ilości białka.

Na figurze 9 przedstawiono doświadczenia typu ELISA pokazujące, że FLAG-hAPRIL wiąże się z białkiem fuzyjnym hBCMA-fc. Różnymi białkami fuzyjnymi receptor-Fc opłaszczano płytki do testu ELISA i wiązano z ligandami wyznakowanymi FLAG. A) Wykrywanie związanych ligandów ujawniło, że tylko APRIL i hBAFF wiążą się specyficznie z hBCMA-Fc i nie wiążą się z hCD40-Fc. B) Dawka miana pokazuje, że sygnał w teście ELISA wykrywany po związaniu hAPRIL czy hBAFF z płytkami opłaszczonymi hBCMA-Fc zależy liniowo od ilości dodanego białka.

Na figurze 10 przedstawiono immunoprecypitację FLAG-hAPRIL i FLAG-hBAFF przy użyciu białka fuzyjnego hBCMA-Fc. 4 górne panele przedstawiają ilości białka dodawanego do każdej reakcji precypitacji, podczas gdy panele dolne pokazują, że hAPRIL i hBAFF ulegają immunoprecypitacji z hBCMA-Fc lecz nie z hTRAIN-Fc.

Na figurze 11 przedstawiono analizę wiązania typu BiaCore myc-mAPRIL, FLAG-hBAFF i FLAG-mBAFF z hBMCA, receptorem hLTbeta czy hTNF oraz próbę ślepą wykazującą specyficzne wiązanie tylko z hBCMA.

Na figurze 12 przedstawiono wiązanie APRIL z komórkami stransfekowanymi BCMA. Komórki 293EBNA transfekowano plazmidem, który wyraża hBCMA o pełnej długości. Komórki zbierano 48 godz. później przy użyciu 5 mM EDTA i barwiono myc-hAPRIL. Panel A pokazuje, że rozpiętość barwienia zależy od dawki. Panel B pokazuje, że zabarwienie maleje do poziomu tła przy użyciu rozpuszczalnego białka BCMA-Ig.

Na figurze 13 przedstawiono wzrost komórek NIH3T3 wszczepionych podskórnie myszom z niedoborem odpornoś ciowym (Nu/Nu) traktowanych czynnikami kontrolnymi lub bia ł kiem fuzyjnym BCMA-Ig. W modelu tym komórki NIH3T3 tworzą fibroblastomę.

Na figurze 14 przedstawiono wzrost ludzkiego raka okrężnicy SW480 wszczepionego podskórnie myszom z niedoborem odpornościowym (Nu/Nu) traktowanych czynnikami kontrolnymi lub białkiem fuzyjnym hBCMA-Ig.

Na figurze 15A przedstawiono wzrost ludzkiego raka okrężnicy HT29 wszczepionego podskórnie myszom z niedoborem odpornościowym (Nu/Nu) traktowanych czynnikami kontrolnymi lub białkami fuzyjnymi hBCMA-Ig. Figura 15B przedstawia wzrost ludzkiego raka płuc A549 wszczepionego podskórnie myszom z niedoborem odpornościowym (Nu/Nu) traktowanych czynnikami kontrolnymi lub białkiem fuzyjnym hBCMA-Ig.

W celu jaśniejszego i zwięzłego przedstawienia treści podanych w zastrzeganym patencie wprowadzane są definicje specyficznych terminów użytych w opisie i załączonych zastrzeżeniach.

Wynalazek będzie teraz opisany w odniesieniu do następującego szczegółowego opisu do którego włączone są następujące definicje:

Użyte tu określenia „receptor APRIL czy „APRIL-R obejmują natywną sekwencję APRIL-R i warianty APRIL-R. APRIL-R może być wyizolowany z różnych ź ródeł, takich jak przykładowo tkanki ludzkie czy mysie lub z innych źródeł lub może być wytworzony metodami rekombinacji czy syntezy.

PL 204 010 B1

Termin APRIL-R również dotyczy polipeptydu, który jest zdolny do wiązania się z przedstawicielem rodziny czynnika martwicy nowotworu, APRIL lub homologami lub ich fragmentami. W kontekście tego wynalazku APRIL-R jest BCMA.

Określenie „BCMA lub „BCM odnosi się do nowego białka dojrzewania komórek B jak opisano w Gras i wsp (1995), International Immunology, 7:1093-1106, „BCMAp: an integral membrane protein in the golgi apparatus of human mature B lymphocytes; Y. Laabi i wsp. (1992), EMBO J., 11, 38973904, „A new gene BCM on Chromosome 16 is fused to the interleukin 2 gene by a t(4:16)(q26:p13) translocation in a malignant T cell lymphoma.

„Natywna sekwencja APRIL-R obejmuje polipeptyd posiadający taką samą sekwencję aminokwasową jak naturalny APRIL-R. Taka natywna sekwencja APRIL-R może być wyizolowana z natury lub może być wytworzona sposobem rekombinacji czy przez syntezę. Natywna sekwencja APRIL-R może być naturalnie występującymi uciętymi lub wydzielanymi formami APRIL-R (np. rozpuszczalne formy zawierające przykładowo sekwencję domeny zewnątrzkomórkowej), naturalnie występującymi wariantami form (np. formami alternatywnie składanymi) oraz naturalnie występującymi allelicznymi wariantami APRIL-R. jak zostało to opisane natywna sekwencja APRIL-R jest dojrzałą lub pełnej długości natywną sekwencją polipeptydu APRIL-R obejmującą aminokwasy 1 do 184 z SEKW. NR ID.: 8 lub jej fragmentem.

„Zewnątrzkomórkową domena APRIL-R czy „APRIL-R ECD odnosi się do formy APRIL-R, która jest zasadniczo wolna od domeny transbłonowej i cytoplazmatycznej APRIL-R. Zazwyczaj, APRIL-R ECD będzie obejmować reszty aminokwasowe 1 do 51, lub 1 do 52, lub 1 do 53 z SEKW. NR ID.: 8. W korzystnym wykonaniu, APRIL-ECD obejmuje reszty aminokwasowe 4 do 51 z SEKW. NR ID.: 8 lub bardziej korzystnie reszty aminokwasowe 8 do 41 z SEKW. NR ID.: 8. Dla specjalistów będzie jasne, że domena transbłonowa zdefiniowana dla polipeptydu APRIL-R jak tu opisana jest zdefiniowana według kryteriów rutynowo używanych w dziedzinie dla identyfikowania tego typu domeny hydrofobowej. Dokładne granice domeny transbłonowej mogą się różnić, lecz najprawdopodobniej, nie więcej niż około 5 aminokwasami na każdym z końców wspomnianej tu domeny.

„Wariant APRIL-R oznacza aktywny APRIL-R jak opisano powyżej posiadający przynajmniej około 80% identycznej sekwencji aminokwasowej z APRIL-R o przewidywanej sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 5 dla natywnej sekwencji APRIL-R o pełnej długości lub z sekwencją APRIL-R ECD. Takie warianty APRIL-R obejmują, przykładowo, polipeptydy APRIL-R, w których na końcu lub końcu C sekwencji SEKW. NR ID.: 8 dodana jest lub usunięta jedna lub kilka reszt aminokwasowych. Zazwyczaj, wariant APRIL-R będzie posiadać przynajmniej około 80 do 85% identycznej sekwencji aminokwasowej, bardziej korzystnie przynajmniej około 90% identycznej sekwencji aminokwasowej i jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej około 95% identycznej sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.: 8.

„Procent (%) identycznej sekwencji aminokwasowej w odniesieniu do sekwencji APRIL-R tu zidentyfikowanych jest określony jako procent reszt aminokwasowych w wytypowanej sekwencji, które są identyczne z resztami aminokwasowymi w sekwencji APRIL-R, po przyrównaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli jest to konieczne, w celu uzyskania maksymalnego procentu identyczności i nie uwzględniając żadnych podstawień konserwatywnych, jako części identyczności sekwencji. Przyrównanie w celach określenia procentu identycznej sekwencji aminokwasowej można uzyskać różnymi drogami znanymi specjalistom, przykładowo, przy użyciu dostępnego powszechnie oprogramowania komputerowego takiego jak BLAST, ALIGN czy oprogramowania Megalign (DNASTAR). Specjaliści potrafią określić odpowiednie parametry dla mierzenia przyrównania, włączając algorytmy konieczne dla osiągnięcia maksymalnego przyrównania na całej długości porównywanych sekwencji.

Użyty tu termin „wyznakowany epitop odnosi się do polipeptydu chimerowego obejmującego APRIL-R lub sekwencję jego domeny w fuzji z „polipeptydem znacznikowym. Polipeptyd znacznikowy posiada wystarczającą ilość reszt dostarczającą epitop przeciwko któremu można wytworzyć przeciwciało, lub który może być zidentyfikowany przez jakiś inny czynnik i jest na tyle krótki, że nie zaburza aktywności APRIL-R. Polipeptyd znacznikowy korzystnie jest całkowicie unikatowy tak, że przeciwciało zasadniczo nie oddziałuje krzyżowo z innymi epitopami. Stosowne polipeptydy znacznikowe zasadniczo posiadają przynajmniej 6 reszt aminokwasowych i zazwyczaj pomiędzy około 8 do około 50 reszt aminokwasowych (korzystnie, około 10 do około 20 reszt).

„Wyizolowany kiedy użyty jest do opisania różnych polipeptydów tu ujawnianych oznacza polipeptyd, który został zidentyfikowany i wydzielony i/lub odzyskany ze składowej jego naturalnego środowiska. Składniki zanieczyszczające z jego naturalnego środowiska są materiałami, które zazwyczaj

PL 204 010 B1 zaburzają użycie polipeptydu w diagnostyce i leczeniu i mogą obejmować enzymy, hormony czy inne rozpuszczone składniki białkowe czy nie białkowe. W korzystnym wykonaniu, polipeptyd będzie oczyszczony (1) w stopniu wystarczającym dla uzyskania 15 reszt sekwencji aminokwasowej z końca N lub ze ś rodka przez uż ycie sekwenatora typu „spinning cup lub (2) do homogennoś ci w SDS-PAGE w warunkach nie redukują cych lub redukują cych stosują c barwienie roztworem Coomassie blue lub korzystnie srebrem. Wyizolowany polipeptyd obejmuje polipeptyd in situ w zrekombinowanych komórkach, jeśli nie będzie obecny przynajmniej jeden składnik naturalnego środowiska APRIL-R. Jednakże zazwyczaj wyizolowany polipeptyd będzie wytworzony przez przynajmniej jeden etap oczyszczania.

Termin „przeciwciało jest stosowany w szerszym znaczeniu i konkretnie obejmuje pojedyncze przeciwciała monoklonalne APRIL-R (włączając agonistę, antagonistę i przeciwciała neutralizujące) oraz kompozycję przeciwciał anty-APRIL-R ze swoistością poliepitopową. Użyty tu termin „przeciwciało monoklonalne odnosi się do przeciwciała uzyskanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał tzn. poszczególne przeciwciała zawarte w populacji są identyczne z wyjątkiem możliwych naturalnie pojawiających się mutacji, które mogą być obecne w niewielkich ilościach.

Użyty termin „oczyszczony preparat czy „zasadniczo czysty preparat polipeptydu oznacza polipeptyd, który został oddzielony od białek, lipidów czy kwasów nukleinowych z którymi naturalnie występuje. Korzystnie, polipeptyd jest także oddzielony od innych substancji np. przeciwciał, matryc itp., które są stosowane przy oczyszczaniu.

Użyte tu terminy „leczyć, „leczenie i „terapia odnoszą się do terapii leczniczej , terapii profilaktycznej oraz terapii zapobiegawczej.

Użyte tu terminy „peptydy, „białka i „polipeptydy są stosowane wymiennie.

„Aktywny biologicznie użyty jest w znaczeniu posiadania aktywności in vivo czy in vitro, która może być przedstawiona bezpośrednio lub pośrednio. Aktywne biologicznie fragmenty APRIL-R mogą posiadać, przykładowo, 70% homologii aminokwasowej z miejscem aktywnym receptora, bardziej korzystnie przynajmniej 80%, najbardziej korzystnie przynajmniej 90% homologii. Identyczność lub homologia w odniesieniu do receptora jest tu zdefiniowana jako procent reszt aminokwasowych w wytypowanej sekwencji, które są identyczne z resztami z APRIL-R w SEKW. NR ID.: 8.

Użyty tu termin „ssak odnosi się do dowolnego zwierzęcia zaklasyfikowanego jako ssak włączając ludzi, krowy, konie, psy, myszy i koty. W korzystnym wykonaniu według wynalazku ssakiem jest człowiek.

W praktyce według wynalazku wykorzystywane będą, dopóki nie podano inaczej, tradycyjne techniki biologii komórki, hodowli komórkowej, biologii molekularnej, biologii transgenicznej, mikrobiologii, rekombinacji DNA oraz immunologii, które są znane specjalistom. Techniki takie są opisane w literaturze.

Poniżej zostaną przedstawione szczegółowe informacje dotyczące korzystnych wykonań wynalazku. Opisano wykorzystanie APRIL-R i cząsteczek pokrewnych APRIL-R w celu wpłynięcia na wzrost i dojrzewanie limfocytów B i komórek innych od B, konkretnie związanych z komórkami nowotworowymi. Również opisano użycie APRIL-R i cząsteczek pokrewnych APRIL-R w celu wpłynięcia na odpowiedzi układu immunologicznego wymagane w zaburzeniach związanych z systemem immunologicznym. Ponadto opisane jest leczenie raka i zaburzeń odporności przez użycie APRIL-R i genów pokrewnych APRIL-R przez metody terapii genowej.

APRIL-R i jego homologi wytworzone w gospodarzach stransformowanych opisanymi sekwencjami, jak również natywnym APRIL-R oczyszczonym za pomocą procesów znanych specjalistom, lub wytworzonych ze znanych sekwencji aminokwasowych są przydatne w różnorodnych metodach zastosowań antyrakowych, antynowotworowych czy immunoregulacyjnych. Są one także przydatne w terapii i metodach skierowanych na inne choroby.

Opisane jest również zastosowanie polipeptydu kodowanego przez wyizolowany kwas nukleinowy kodujący APRIL-R w terapii „antysensownej. Użyty tu termin terapia „antysensowna odnosi się do podawania lub wytwarzania in situ oligonukleotydów lub ich pochodnych, które specyficznie hybrydyzują w warunkach komórkowych z komórkowym mRNA i/lub DNA kodującym interesujący ligand tak, że hamują wyrażanie kodowanego białka tzn. przez hamowanie transkrypcji i/lub translacji. Wiązanie może zachodzić przez tradycyjną komplementacje par zasad lub, przykładowo, w przypadku wiązania dupleksów DNA, przez specyficzne oddziaływania w większym rowku podwójnej helisy. Zazwyczaj, terapia „antysensowna odnosi się do zakresu technik zasadniczo stosowanych w dziedzinie i obejmuje dowolną terapię odnoszącą się do specyficznego wiązania do sekwencji oligonukleotydowych.

Opisany konstrukt antysensowny może, przykładowo, być dostarczony jako plazmid ekspresyjny, który po transkrypcji w komórce wytwarza RNA, który jest komplementarny do przynajmniej części

PL 204 010 B1 komórkowego mRNA kodującego „Kay-ligand. Alternatywnie, konstrukt antysensowny może być sondą, która jest wytwarzana ex vivo. Takie sondy oligonukleotydowe są korzystnie modyfikowanymi oligonukleotydami opornymi na endogenne nukleazy, a zatem są stabilne in vivo. Przykładami cząsteczek kwasów nukleinowych stosowanych jako antysensowne oligonukleotydy są fosforoamidowanymi, fosfotionianowymi i metylofosfonianowymi analogami DNA (patrz, np. 5176996; 5264564 i 5256775). Dodatkowo, ogólne podejścia tworzenia oligomerów przydatnych w terapii antysensownej opisano w artykule przeglą dowym, przykł adowo, Van Der Krol i wsp. (1988) Biotechniques 6:958-976 i Stein i wsp. (1988) Cancer Res. 48:2659-2668, włączonym tu na drodze referencji.

APRIL-R, jak omówiono powyżej, jest przedstawicielem rodziny receptora TNF. Białko, jego fragmenty i homologi mają szerokie zastosowanie terapeutyczne i diagnostyczne.

Ujawnione polipeptydy oddziałują specyficznie z APRIL, peptydem opisanym wcześniej w W099/12964 włączonym tu jako odniesienie. Jednakż e, peptydy i metody tu ujawniane umoż liwiają identyfikację cząsteczek, które specyficznie oddziałują z APRIL-R czy jego fragmentami.

Rozwiązania według wynalazku pozwalają na użycie peptydów pochodzących z APRIL-R, które mają zdolność wiązania z APRIL. Fragmenty APRIL-R można wytwarzać wieloma drogami np. rekombinacyjnie, przez PCR, trawienie proteolityczne czy syntezę chemiczną. Wewnętrzne czy końcowe fragmenty peptydu można wytwarzać przez usunięcie jednego lub więcej nukleotydów z jednego lub obu koń ców kwasu nukleinowego kodują cego polipeptyd. Ekspresja zmutagenizowanych produktów DNA daje fragmenty polipeptydów.

Fragmenty polipeptydów można także syntetyzować chemicznie przy użyciu technik znanych specjalistom takich jak tradycyjna chemia Merrifield fazy stałej f-moc i t-boc. Przykładowo, peptydy i sekwencje DNA opisane w niniejszego opisie moż na dowolnie podzielić na fragmenty o pożądanej długości, bez zachodzenia na siebie fragmentów lub podzielić na zachodzące na siebie fragmenty o pożądanej długości. Poniżej opisane są szczegółowo takie sposoby.

Wytwarzanie rozpuszczalnych form APRIL-R

Rozpuszczalne formy APRIL-R często mogą skutecznie przekazywać sygnał i tym samym mogą być podawane jako lek, który naśladuje naturalną formę błonową. Możliwe jest, że opisany tu APRIL-R jest naturalnie wydzielany jako rozpuszczalna cytokina, chociaż, jeśli nie, należy przekonstruować gen tak, aby wymuszał wydzielanie. W celu stworzenia rozpuszczalnej, wydzielanej formy APRIL-R należy usunąć na poziomie DNA regiony transbłonowe położone na końcu N oraz część regionu trzonu i podmienić sekwencją liderową typu I czy alternatywnie typu II, która pozwoli na wydajne cięcie proteolityczne w wybranym systemie ekspresyjnym. Specjaliści mogą zmieniać ilość pozostawionego trzonu w konstrukcie ekspresyjnym do wydzielania w celu zoptymalizowania właściwości wiązania liganda oraz wydajność wydzielania. Przykładowo, można wytwarzać konstrukty zawierające wszystkie możliwe długości tzn. ucięte końce N tak, że będą powstawały białka o początku w aminokwasach od 1 do 52. W wyniku analizy tego typu uzyskana zostanie optymalna długość sekwencji trzonu.

Wytwarzanie przeciwciał oddziałujących z APRIL-R

Wynalazek obejmuje także przeciwciała swoiście oddziałujące z zastrzeganym APRIL-R czy jego koreceptorami. Surowice odpornościowe anty-białko/anty-peptyd lub przeciwciała monoklonalne można wytwarzać przy pomocy standardowych protokołów (patrz, przykładowo, Antibodies: A Laboratory Manual wyd. Harlow i Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Ssaka takiego jak mysz, chomik czy królik można immunizować immunogenną formą peptydu. Techniki nadające immunogenność białku czy peptydowi obejmują koniugację z nośnikami, czy inne techniki znane specjalistom.

Immunogenną porcję APRIL-R czy jego koreceptorów można podawać w obecności adiuwanta. Postępowanie immunizacji można monitorować przez wykrywanie miana przeciwciała w osoczu lub surowicy. Do oszacowania poziomów przeciwciał można wykorzystać standardowy test ELISA lub inny test immunologiczny z immunogenem jako antygenem.

W korzystnym wykonaniu przeciwciał a osobnika są immunoswoiste dla determinant antygenowych z APRIL-R czy jego koreceptorów, np. determinant antygenowych peptydu z SEKW. NR ID.: 8 lub blisko spokrewnionego ludzkiego czy innego niż ludzki homologa ssaczego (np. w 70, 80 czy 90% homologicznego, bardziej korzystnie przynajmniej w 95% homologicznego). W jeszcze dalszym wykonaniu, przeciwciała anty-APRIL-R czy anty-APRIL-koreceptor zasadniczo nie reagują krzyżowo (tzn. reagują specyficznie) z białkiem, które jest np. mniej niż w 80% homologiczne z SEKW. NR ID.: 8; korzystnie mniej niż w 90% homologiczne z SEKW. NR ID.: 8 i najbardziej korzystnie mniej niż w 95% homologiczne z SEKW. NR ID.: 8. „Zasadniczo nie reagują krzyżowo oznacza, że przeciwciało

PL 204 010 B1 posiada powinowactwo wiązania z niehomologicznym białkiem niższe niż 10%, bardziej korzystnie niższe niż 5% a jeszcze bardziej korzystnie mniej niż 1% powinowactwa wiązania do białka z SEKW. NR ID.: 8.

Użyte tu określenie przeciwciało w zamierzeniu obejmuje jego fragmenty, które także specyficznie oddziałują z APRIL-R i jego receptorami. Przeciwciała można pofragmentować przy użyciu tradycyjnych technik, a fragmenty przebadać na możliwość wykorzystania w taki sam sposób jak opisano powyżej dla przeciwciał. Przykładowo, fragmenty F(ab')2 można wytwarzać przez poddanie przeciwciała działaniu pepsyny. Uzyskany fragment F(ab')2 można poddać reakcji redukcji mostków dwusiarczkowych w celu wytworzenia fragmentów Fab'. Przeciwciała opiane w wynlazku w dalszym zamierzeniu obejmują cząsteczki biospecyficzne i chimerowe posiadające aktywność anty-APRIL-R czy anty-APRIL-koreceptor. Zatem, zarówno przeciwciała (Ab) monoklonalne jak poliklonalne skierowane przeciwko APRIL-R i ich koreceptory oraz fragmenty przeciwciała takie jak Fab' i F(ab')2 można użyć do blokowania działania APRIL-R i jego odpowiednich koreceptorów.

Różne formy przeciwciał można także wytworzyć stosując standardowe techniki rekombinacji DNA (Winter i Milstein, Nature 349:293-299 (1999) włączony tu na drodze referencji). Przykładowo, można konstruować przeciwciała chimerowe w których domena wiążąca antygen z przeciwciała zwierzęcego jest połączona z ludzką domeną stałą (np. Cabilly i wsp. US 4816567, włączony tu na drodze referencji). Przeciwciała chimerowe mogą redukować obserwowane odpowiedzi odpornościowe wywołane przeciwciałami zwierzęcymi, kiedy są stosowane w klinicznym leczeniu ludzi.

Dodatkowo, można syntetyzować zrekombinowane „humanizowane przeciwciała, które rozpoznają APRIL-R lub jego koreceptory. Humanizowane przeciwciała są chimerami obejmującymi w większości sekwencje ludzkich IgG, do których wprowadzono regiony odpowiedzialne za swoiste wiązanie antygenu. Zwierzęta są immunizowane pożądanym antygenem, izolowane są odpowiednie przeciwciała i części sekwencji regionów zmiennych odpowiedzialnych za swoiste wiązanie antygenu są usuwane. Regiony wiążące z antygenów pochodzenia zwierzęcego są następnie klonowane w odpowiednim miejscu genów ludzkich przeciwciał, z których usunięto regiony wiążące antygen. Humanizowane przeciwciała minimalizują użycie heterologicznych (tzn. między gatunkowych) sekwencji w ludzkich przeciwciałach, a tym samym z mniejszym prawdopodobieństwem wywołują odpowiedzi odpornościowe u leczonego osobnika.

Konstrukcję zróżnicowanych klas zrekombinowanych przeciwciał można także osiągnąć przez wytworzenie przeciwciał chimerowych czy humanizowanych obejmujących domeny zmienne i ludzkie domeny stałe (CH1, CH2, CH3) wyizolowane z różnych klas immunoglobulin. Przykładowo, przeciwciała z podniesionymi wartościowościami miejsca wiązania antygenu można wytwarzać rekombinacyjnie przez klonowanie miejsca wiązania antygenu w wektory niosące ludzkie regiony łańcucha stałego (Arulanandam i wsp. J. Exp. Med. 177:1439-1450 (1993), włączony tu na drodze referencji).

Dodatkowo, można zastosować standardowe techniki rekombinacji DNA do zmiany powinowactw wiązania zrekombinowanych przeciwciał z ich antygenami przez zmianę reszt aminokwasowych w sąsiedztwie miejsc wiązania antygenu. Powinowactwo wiązania antygenu humanizowanego przeciwciała można zwiększyć przez mutagenezę opartą na modelowaniu cząsteczki (Queen i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:10029-33 (1989), włączony tu na drodze referencji).

Wytwarzanie analogów: produkcja zmienionego DNA i sekwencji peptydowych

Analogi APRIL-R mogą różnić się sekwencją aminokwasową od naturalnie występujących APRIL-R lub mogą różnić się w sposób nie wymagający zmiany sekwencji, lub na oba sposoby. Modyfikacje nie polegające na zmianie sekwencji obejmują chemiczną derywatyzację APRIL-R in vivo i in vitro. Modyfikacje nie polegają ce na zmianie sekwencji obejmują , lecz nie wyłącznie, zmiany w acetylacji, metylacji, fosforylacji, karboksylacji i glikozylacji.

Korzystne analogi obejmują biologicznie aktywne fragmenty APRIL-R, których sekwencje różnią się od sekwencji danej w SEKW. NR ID.: 8 jedną lub większą liczbą podstawień konserwatywnych aminokwasów lub jedną lub większą liczbą podstawień nie konserwatywnych aminokwasów, delecjami czy insercjami, które nie znoszą aktywności APRIL-ligand. Podstawienia konserwatywne zazwyczaj zawierają podstawienia jednego aminokwasu innym aminokwasem o podobnych właściwościach, np. podstawienia w następujących grupach: walina, glicyna; glicyna, alanina; walina, izoleucyna, leucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina oraz fenyloalanina, tyrozyna.

Zastosowania

Gen APRIL-R o pełnej długości (SEKW. NR ID.: 8) lub jego części można użyć jako sondy hybrydyzacyjne do biblioteki cDNA w celu wyizolowania, przykładowo, jeszcze innych genów, które niosą pożądaną identyczność sekwencji z sekwencją APRIL-R ujawnioną w SEKW. NR ID.: 6. Sekwen10

PL 204 010 B1 cje nukleotydowe kodujące APRIL-R można także użyć do konstrukcji sond hybrydyzacyjnych do mapowania genu kodującego APRIL-R oraz do analizy genetycznej osobników z zaburzeniami genetycznymi. Można zaprojektować testy przesiewowe do poszukiwania składników wiodących, które naśladują aktywność biologiczną APRIL-R. Takie testy przesiewowe będą obejmowały testy polegające na wysokiej wydajności przeszukiwania bibliotek chemicznych, które są szczególnie przydatne w identyfikowaniu kandydatów na mało cząsteczkowe leki. Rozpatrywane małe cząsteczki obejmują związki organiczne i nieorganiczne. Kwasy nukleinowe kodujące APRIL-R lub jego zmodyfikowane formy można także wykorzystywać do wytwarzania zwierząt transgenicznych albo zwierząt „znokautowanych, które z kolei są przydatne w rozwoju i poszukiwaniu terapeutycznie przydatnych czynników, włączając przykładowo czynniki nowotworowe.

W szeregu metod do zastosowań antynowotworowych przydatne są APRIL-R i jego homologi wytworzone przez gospodarzy stransformowanych opisanymi sekwencjami jak również natywny APRIL-R oczyszczony przy użyciu procesów znanych specjalistom lub wytworzony ze znanych sekwencji aminokwasowych.

Rozwiązania według wynalazku mogą zostać wykorzystane w sposobie leczenia u ssaka stanów związanych z niepożądaną proliferacją komórek przez podawanie ssakowi skutecznej terapeutycznie ilości kompozycji obejmującej antagonistę APRIL-R, gdzie antagonista APRIL-R obejmuje polipeptyd, który utrudnia oddziaływanie pomiędzy APRIL i jego spokrewnionym receptorem czy receptorami, z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.

W korzystnym wykonaniu spokrewnionym receptorem dla APRIL jest BCMA znajdują cy się na powierzchni komórki.

Można wykorzystać dowolnego antagonistę APRIL-R, który posiada peptyd utrudniający oddziaływanie pomiędzy APRIL i jego spokrewnionym receptorem lub receptorami. Przykłady antagonistów APRIL-R obejmują, lecz nie wyłącznie, rozpuszczalne polipeptydy APRIL-R, obejmujące lecz nie ograniczone do rozpuszczalnego BCMA; rozpuszczalne chimerowe cząsteczki APRIL-R, obejmujące lecz nie ograniczone do BCMA-IgG-Fc i homologi przeciwciała anty-APRIL-R, obejmujące lecz nie ograniczone do monoklonalnego przeciwciała anty-BCMA.

Lek wytworzony zgodnie z zastoswaniem według wynalazku można zastosować w dowolnych stanach związanych z niepożądaną proliferacją komórek. W szczególności można stosować do leczenia komórek nowotworowych wyrażających APRIL i/lub APRIL-R (tj. BCMA).

Przykłady raków, w których proliferacja komórek jest modulowana przez APRIL można poszukiwać przez pomiar in vitro poziomu mRNA APRIL i/lub APRIL-R (tj. BCMA) wyrażanego w bibliotekach tkanki nowotworowej. Biblioteki tkanki nowotworowej w których mRNA APRIL i/lub APRIL-R (tj. BCMA) jest wytwarzany na wysokim poziomie będą dobrymi kandydatami. Alternatywnie, kandydatów można poszukiwać przez przeszukiwanie publicznych i prywatnych baz danych (tj. baza danych Incyte) stosując, przykładowo, pełnej długości sekwencję cDNA dla ludzkiego APRIL. Stosując te techniki ustalono, przykładowo, że ekspresja mRNA dla APRIL jest wykrywana w dużej liczbie nowotworów, włączając lecz nie wyłącznie te przedstawione poniżej w Tab. 1.

T a b e l a 1 Opis biblioteki

Linia raka prostaty, LNCaP.CA.5OM, nie traktowana, TIGR

Rak limfocytów T, chłoniak, TIGR

Rak jajnika, brodawkowy surowiczy cystadenomaCA

Płuco, mw/adenoCA, COPD, 47M

Rak sutka, adenoCA, 46F, SUB, m/BRSTNOT33

Zwój nerwowy, korzeń tylny, szyjny, aw/chłoniak, 32M, NORM

Rak mózgu, czołowy, neuronowy nowotwór, 32M, NORM

Rak prostaty, adenoCA, 59M, SUB,m/PROSN0ST19

Rak okrężnicy, zgięcie wątrobowe okrężnicy, adenoCA, 55M, SUB, m/COLATMT01 Rak trzustki, TIGR

Ciałko przyzwojowe, nerwiak przyzwojowy, aw/komórka nerki CA, 46M

PL 204 010 B1 cd tabeli 1

Sutek, mw/ductal CA, 43F, m/BRSTTUT16

Rak nerki, komórka nerki CA, 51F

Pęcherz, mw/TC CA, CA in situ, 60M, m/BLADTUT04

Rak macicy, śluzówka, F, TIGR

Prostata, BPH, mw/adenoCA, PIN, 59M

Płuco, mw/adenoCA, 53M/LUNGTUT1

Rak kości/linia, MG-63, osteoSAR/komórka olbrzymia, M/F, z różnych źródeł, RP

Mózg, kora płatów czołowych,aw/płuca CA, 77M

Rak okrężnicy, adenoCA, NORM, SUB, CGAP

Rak płuc, komórka płaska nabłonka CA, 57M

Płuco, mw/adenoCA, 63M

Prostata, AH, mw/adenoCA, 50M, m/PROSTUT01

Krew obwodowa, limfocyty B, CLL, z różnych źródeł, NORM. 3'CGAP

Rak okrężnicy, adenoCA, pula, NORM, 3'/5'CGAP

Nerka, mw/komórka nerkowa CA, 8.53F, z różncych źródeł, NORM

Jajnik, torbiel skórzasta, 22F

Rak okrężnicy, adenoCA, NORM, 3' CGAP

Rak okrężnicy, adenoCA, NORM, 3'.CGAP

Prostata, BPH, mw/adenoCA, 70M, SUB

Rak jajnika, z okrężnicy adenoCA, 58F

Macica, mięśniówka macicy, mw/mięśniak gładki, 43F

Jelito cienkie, krętnica, mw/CUC, 25F

Węzeł chłonny, okołotrzustkowy, aw/trzustka adenoCA, 65M

Jajnik, aw/mięśniak gładki, 36F, NORM

Płuco, mw/rakowiak komórka wrzecionowata, 62F

Rak płuca, komórka płaska nabłonka CA, 50M

Rak mózgu, oponiak, 36M

Rak, adenoCA, 65, m/PANCNOT08

Płuco, mw/wewnątrzoskrzelowy rakowiak, 33M

Nadnercze, mw/barwiak chromochłonny, 43F, m/ADRETUT07

Rak mózgu, czołowy, oponiak, 50M

Rak nerki, rak typu komórki jasnej, różne źródła, NORM, 3'CGAP

Sutek, mw/płacikowy CA, 67F

Płuco, mw/zmieniony osteoSAR, aw/opłucna zmieniony., 58M, NORM

Rak prostaty, adenoCA, 59M, SUB, m/PROSNOT19

Rak jelita cienkiego, krętnica, z śluzówka macicy adenCA, 64F

Rak jajnika, adenoCA, 58F

Sutek, NF choroba sutka, 46F

Rak mózgu, czołowy, zmieniony rak jasnokomórkowy nerki, 58M

PL 204 010 B1 cd tabeli 1

Rak nerki Wilmsa, z różnych źródeł, WM/WN

Płuco, mw/zmieniony tarczyca CA, 79M, m/LUNGTUT02

Rak płuca, zmieniony tarczyca CA, 79M, m/LUNGNOT03

Rak gruczołu przytarczycy, gruczolak, M/F, NORM, WM

Rak trzustki, anaplastyczny CA, 45F

Jajnik, mw/śluzowy cystadenoCA 43F, m/OVARTUT01

Rak płuca, komórka płaska nabłonka CA, różne źródła, NORM, CGAP

Rak sutka, adenoCA, 46F, m/BRSTNOT17

Macica, mw/leiomyoma, aw/okrężnica adenoCA, 45F

Płuco, mw/adenoCA, aw/węzeł, przepona zmieniony, 63F

Rak sutka, adenoCA, 46F, m/BRSTNOT33

Rak prostaty, adenoCA, 66M, mPROSNOT15, PROSDIN01

Rak sutka, adenoCA, 54, m/BRSTNOT03

Rak komórek zarodka, z różnych źródeł, SUB, 3'CGAP

Szpik, piszczel, aw/zmieniony pęcherzykowy mięśniak prążkowanokomórkowy SAR, 16M

Prostata, AH, mw/adenoCA, 57M, m/PROSTUT04

Sutek, zmiany PF, mw/adenoCA, 55, mBRSTTUT01

Rak macicy, surowiczy brodawkowy CA, F, pooled, 3'CGAP

Rak jajnika, śluzowy cystadenoCA, 43F, m/OVARNOT03

Sutek, zmiany PF, mw/adenoCA, wewnątrzprzewodowy CA, 43F

Sutek, mw/przewodowy CA, CA in situ, aw/węzeł zmieniony. 62F

Rak zwoju nerwowego, nerwiak zwojowy, 9M

Rak trzustki, adenoCA, 3'CGAP

Rak macicy, śluzówki macicy adenoCA, z różnych źródeł, 3'CGAP

Rak płuc, rakowiak neuroendokrynologiczny, z różnych źródeł, NORM, 3' CGAP

Opisani agoniści APRIL-R są stosowani w leczeniu stanów związanych z niepożądaną proliferacją komórek, w szczególności w terapii nowotworowej, korzystnie hamując wzrost komórek nowotworowych powyżej 10%, 20%, 30% czy 40%, a bardziej korzystnie powyżej 50%. Antagoniści APRIL-R uzyskiwani są przez badanie przesiewowe (patrz przykładowo dyskusja w Przykładzie 6). Przykładowo, antagonistów APRIL-R można selekcjonować na podstawie aktywności hamującej wzrost (tzn. powyżej 10%, 20%, 30%, 40% czy 50%) wobec ludzkiego raka okrężnicy HT29 czy ludzkiego raka płuc A549 (patrz przykładowo dyskusja na Fig. 15), które pochodzą odpowiednio z nowotworu okrężnicy i płuc.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają hamowania wzrostu komórek B i komórek nie będących komórkami B, wzrostu i dojrzewania komórek B indukowanych komórkami dendrytycznymi lub produkcji immunoglobulin u zwierząt przy użyciu polipeptydu APRIL-R.

W innym wykonaniu wynalazek dostarcza sposobów uż ycia APRIL-R w leczeniu chorób autoimmunologicznych, nadciśnienia, zaburzeń sercowo-naczyniowych, zaburzeń nerkowych, zaburzeń proliferacji limfocytów, chorób immunosupresyjnych, przy transplantacji narządów, zapaleniach i HIV. Objęte są także sposoby stosowania czynników do leczenia, supresji czy zmiany odpowiedzi odpornościowej wymagającej przekazywania sygnału pomiędzy APRIL-R i ligandem.

Opisane kompozycje farmaceutyczne mogą obejmować polipeptyd APRIL-R i farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki. Przydatne nośniki dla peptydu APRIL-R, przykładowo, oraz ich preparaty są opisane w Remington' Pharmaceutical Sciences, 16 wyd., 1980, Mack Publishing Co wyd. przez Oslo i wsp. Zazwyczaj w preparatach stosowana jest odpowiednia ilość farmaceutycznie akceptowanej soli

PL 204 010 B1 dla utrzymania izotoniczności preparatu. Przykłady nośników obejmują bufory takie jak roztwór soli, roztwór Ringer'a oraz roztwór dekstrozy. pH roztworu korzystnie wynosi około 5 do około 8, a bardziej korzystnie od około 7,4 do około 7,8. Dalsze nośniki obejmują preparaty o podtrzymywanym uwalnianiu jak półprzepuszczalne macierze ze stałych polimerów hydrofobowych, gdzie macierze są w formie ukształtowanych artykułów np. liposomów, filmów czy mikrocząsteczek. Dla specjalistów będzie oczywiste, że pewne nośniki mogą być bardziej korzystne ze względu na drogę podawania i stężenie podawanego peptydu APRIL-R.

Podawanie można przeprowadzić przez wstrzyknięcie (np. dożylnie, dootrzewnowo, podskórnie, domięśniowo) lub dowolnymi innymi sposobami takimi jak wlew zapewniający dostarczenie skutecznej formy do krwi.

Stosowanie w praktyce niniejszego wynalazku będzie wykorzystywało, o ile nie wskazano inaczej, tradycyjne techniki biologii komórki, hodowli komórkowej, biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinacji DNA, chemii białka oraz immunologii, które są znane specjalistom. Techniki takie są opisane w literaturze. Przykładowo patrz, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2 (Sambrook, Fritsch i Maniatis, wyd.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, wol. I i II (D.N. Glover, wyd.), 1985; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, wyd.), 1984; patent USA nr 4683195 (Mullis i wsp.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames i S.J.Higgins, wyd.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames i S.J.Higgins, wyd.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, wyd.) Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B.Perbal), 1984; Methods in Enzymology, wol. 154 i 155 (Wu i wsp., wyd.), Academic Press, Nowy Jork; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (j.H. Miller i M.P. Calos, wyd.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Meyer i Walker, wyd.), Academic Press, Londyn, 1987; Handbook of Experiment Immunology, wol. I-IV (D.M. Weir i CC. Blackwell, wyd.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

Poniższe przykłady są dostarczone w celu zilustrowania niniejszego wynalazku i nie powinny być interpretowane jako jego ograniczenie.

P r z y k ł a d y

Następujące metody są użyte w ujawnianych tu Przykładach.

Metody:

Klonowanie i ekspresja mysiego APRIL wyznakowanego myc (CCM776) w Pichia pastoris

Wektor ekspresyjny pCCM213.10 skonstruowano przez wzięcie PDR004(H98 muAPRIL z trzonem superFAS-ligand podłączonym do końca N wraz z znacznikiem epitopowym FLAG) i wycięcie sekwencji kodującej mu APRIL od Sall do Notl. Syntetyczne oligonukleotydy LTB-559 i 560 tworzą linker XhoI-SacI, który zawiera sekwencję liderową czynnika płciowego alfa, znacznik epitopowy myc, jak również motyw KEL z ligandu FAS. Zarówno fragment muAPRIL jak linker ligowano z miejscami XhoI-NotI z pccm211, plazmidu ekspresyjnego dla Pichia pastoris.

PCCM213.10 linearyzowano przy użyciu Stul, poddawano elektroporacji do szczepu GS115 (his4-) i wysiewano na szalki z pożywką minimalną zawierająca dekstrozę. Transformanty HIS4 analizowano pod kątem ekspresji białka przez wyszczepianie pojedynczych reprezentatywnych kolonii do bogatej pożywki (BMGY: złożona pożywka buforowana z glicerolem) i hodowanie do odpowiedniej gęstości przez 48 godz. w temp. 30°C. Hodowle wirowano, osady komórkowe zawieszano (1:5) w bogatej pożywce do hodowli zawierającej 1,5% metanol (BMMY: złożona pożywka buforowana z metanolem). Po dwóch dniach indukcji w 30°C, supernatanty puszczano na SDS-PAGE i szacowano obecność muAPRIL. Barwienie roztworem Coomassie oraz technika typu Western biot (z any-myc Ab 9E10) wykazało, że jeden szczep, CCM776 wytwarza odpowiednie ilości glikozylowanej formy białka muAPRIL znakowanego myc-H98.

Oczyszczanie myc-mAPRIL

Myc-mAPRIL, białko złożone z 149 aminokwasów wyrażano w pichia. Białko to posiada punkt izoelektryczny 7,45. 175 ml supernatantu pichia dializowano wobec buforu 10 mM Tris pH 6,8 a następnie przepuszczano przez 20 ml kolumnę SP. Kolumnę obficie płukano 10 mM Tris-HCl, pH 6,8 i wymywano 250n mM NaCl w PBS. Drugi etap oczyszczania osiągnięto przy zastosowaniu kolumny do filtracji w żelu (S300). Frakcje zawierające myc-April z 20 ml kolumny SP zatężano przez wirowanie do objętości 7 ml. Po filtracji w żelu, odzyskiwano 8 mg myc-APRIL, co wykrywano za pomocą OD i w żelu barwionym Coomassie. Przeprowadzono także analizę typu Western blot przy użyciu monoklonalnego przeciwciała myszy 9E10 (anty-myc), która pokazała, że znacznik myc jest nietknięty po etapach oczyszczania. Sekwencja końca N potwierdziła, że oczyszczone białko odpowiada myc-April.

PL 204 010 B1

Oczyszczanie FLAG-ludzki APRIL

Plazmid ps429 (nazywany dalej p1448) używano do przejściowej transfekcji komórek 293T przy użyciu lipofektaminy (Gibco-BRL) oraz pożywki bez surowicy. Plazmid, skonstuowany na ssaczym wektorze ekspresyjnym PCR3 (Invitrogen) koduje domenę wiążącą receptor z ludzkiego APRIL, w końcu N białka do podłoża hodowlanego komórki. Białko FLAG-APRIL oczyszczono z pożywki bez surowicy przy użyciu kolumny z anty-FLAG mAb M2 i nadmiaru oczyszczonego peptydu FLAG zgodnie z zaleceniem producenta (Kodak).

Oczyszczanie HBMCA-Fc

HBMCA-Fc używano do przejściowej transfekcji komórek 293. Podłoża hodowlane zebrane po hodowli komórek 293 nadprodukujących hBCM-Fc nanoszono na kolumnę z białkiem A. Białko wymywano przy użyciu 25 mM fosforanu 100 nM NaCl pH 2,8 a następnie neutralizowano 1/20 objętości 0,5 M NaPO4 pH 8,6. Frakcje wyselekcjonowane na podstawie OD 280 nanoszono na redukujące i nie redukujące żele SDS-PAGE i przeprowadzano analizę typu Western blot dla zidentyfikowania oczyszczonego białka. Odzyskiwano 3 mg białka z 500 ml podłoża hodowlanego. Analiza wiązania myc-mAPRIL do różnych linii komórkowych

450 ng/ml oczyszczonego myc-mAPRIL wiązano z liniami komórkowymi w 100 μΐ czynnika blokującego PBS/2%FBS + Fc (FcBlock @ 10 μ^ (Sandoz) w lodzie przez 1 godz. Pozytywne wiązanie wykazywano przy użyciu króliczej surowicy odpornościowej anty-mysi APRIL (1:500) i anty-króliczej IgG-FITC z osła (Jackson). Linie komórkowe A20, Raji, NIH3T3 oraz HT29 utrzymywano w pożywkach sugerowanych przez dostawcę (ATCC Bethesda, MA). Komórki BJAB hodowano w RPMI buforowanej HEPES uzupełnionej 10% FBS i L-glutaminą. W teście kompetycji 450 ng/ml myc-mysi APRIL dodawano z 1 μ^ białkowego kompetytora.

P r z y k ł a d 1: Wykrywanie wiązania APRIL z APRIL-R przy użyciu testu płytkowego

W przykładzie tym testowano łączenie BCMA z April.

W celu zbadania czy BCMA łączy się z April przeprowadzono doświadczenie z koimmunoprecypitacją. W doświadczeniu oba użyte białka hBCMA-Fc i myc-mApril występowały w formie rozpuszczalnej.

HBCMA-Fc i LTbR-Fc dodawano z różnymi ligandami TNF: myc-mApril; myc-CD40L oraz mycRANKL w pożywce zawierającej 10% FBS na ½ godz. w temp. pokojowej. Białka Fc były wiązane z kulkami z białkiem A przez 1-2 godz., płukane trzy razy 1 ml PBS, analizowane metodą typu immunoblotting z mysim monoklonalnym przeciwciałem 9E10 (anty-myc), wywoływaną przy użyciu wzmocnionej chemiluminescencji.

Wykryto myc -APRIL w immunoprecypitatach hBCMA-Fc co świadczy o tym, że BCMA oddziałuje z April w specyficzny sposób ponieważ inne ligandy TNF, myc-CD40L i myc-RANKL nie wykazują zdolności wiązania z BCMA. Myc-April nie łączy się z LTbR-Fc.

Te same błony odpłukiwano i ponownie wiązano z anty-hlG-HRP w celu wykazania, że w immunoprecypitatach z BCMA-Fc stosowano takie same ilości LTbR-F.

P r z y k ł a d 2:

Przykład ten pokazuje, że hBCMA -FC oddziałuje z FLAG-hAPRIL.

Analiza typu ELISA: Płytki opłaszczano białkami fuzyjnymi receptor-Fc (hBCMA-Fc-739 lub hTNFR2-Fc-492) w ilości 1 μ^ w nasyconym dwutlenku węgla, pH 9,9, przez noc, 4°C. Blokowanie przez 2 godz. w temp. pokojowej przy użyciu PBS/5% odtłuszczone mleko/0,5% Tween-20. Wykonywano 2x seryjne rozcieńczenie ligandów w 100 μl buforu blokującego (TNFa-197 od 1000 ng/ml, muBAFF-657 od 1000 ng/ml, hApril-507 od 2000 ng/ml (nieaktywny), hApril-429 od 5x stężonego podłoża). Po inkubacji z ligandami płytki płukano w PBS/0.5%Tween-20 i dodawano sondę z 0,5 μ^ anty-FLAG mAb M2 w buforze do rozcieńczeń. Przeciwciało wykrywano przy użyciu anty-mysi PO 1/2000 z enzymatycznym wywoływaczem (OPD).

Doświadczenia z immunoprecypitacją: komórki 293T transfekowano zalecanym plazmidem ekspresyjnym (Rec-Fc lub ligandem flag) w 9 cm płytkach. Stransfekowane komórki pozostawiano przez 5 dni w 8 ml podłoża Optimem (Gibco-BRL). Immunoprecypitację prowadzono przez zmieszanie 200 μl każdego podłoża hodowlanego z receptorem z 200 μl każdego podłoża zawierającego ligand + 400 μl + 10 μl Sefarozy-ProtG. Mieszano to obracając przez 1 godz. na kole, płukano 4x 1 ml PBS, następnie gotowano w 50 μl buforu do próbek (+DTT). 20 μl z każdej immunoprecypitacji nanoszono do kieszonki. Wywołanie blotu wykonywano przy użyciu 1 μ^ anty-FLAG M2 mAb (Sigma, St Louis MO) oraz anty-mysi PO (1/2000). Blot ponownie poddawano działaniu sondy z anty-ludzki-PO: 100 μl podłoża hodowlanego wytrącano MeOH/CHCl₃/lizozym. Mieszaninę gotowano w 50 μl buforu do

PL 204 010 B1 próbek (+DTT) i nakładano 20 μΙ. Wywołanie blotu wykonywano przy użyciu anty-FLAG M2 mAb (1 μΙ/ml) oraz anty-mysi-PO (1/2000).

P r z y k ł a d 3:

Przykład opisuje wiązanie myc-mAPRIL; hKayL-440 (hBAFF) i Flag-mBAFF z hBCMA-Ig, hLT-R-Ig lub hp80 TNFR-Ig. Doświadczenia prowadzono w 25°C przy szybkości przepływu 10 μΙ/ml.

Każde doświadczenie prowadzono przy użyciu buforu HBS (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% związku powierzchniowo czynnego P20, przy pH 7,4). Ten sam roztwór stosowano zarówno do buforu pracującego jak do rozcieńczalnika próbek.

Powierzchnię chipa CM5 (BIAcore, Inc.) najpierw aktywowano chlorowodorkiem N-hydroksysukcynimidu/N-etylo-N'-(3-dietyloaminopropylo)-karbodiimidu (BIAcore). 20 μΙ hBCMA-Ig; 15 μΙ hLT-R05-Ig i 10 μΙ hp80-TNFR, rozcieńczonych do 30 g/ml w 10 mM kwasie octowym blokowano następnie raz 30 μΙ a następnie 15 μΙ etanoloaminy-HCI (pH 8,5). W wyniku tego uzyskiwano gęstość 1600-3700 jednostek rezonansowych (RU). Chip regenerowano 20 μΙ 1 mM kwasu mrówkowego. Takie odrzucanie powtarzano pięć razy dla ustalenia odtwarzalnej i stabilnej linii odniesienia.

Do doświadczenia tego, 100 μΙ myc-mApril, hKayL-440 i FLAG-mBAFF, każdy rozcieńczony do 30 μg/ml w buforach do rozcieńczeń, nastrzykiwano na powierzchnię chipa. Natychmiast po nastrzyknięciu, chip płukano 500 μΙ buforu do rozcieńczeń. Powierzchnie regenerowano pomiędzy doświadczeniami przez nastrzyknięcie 20 μΙ 1 mM kwasu mrówkowego; a następnie kolejnym nastrzyknięciem 15 μΙ kwasu mrówkowego. Po regeneracji chip równoważono buforem do rozcieńczeń.

P r z y k ł a d 4: Wytwarzanie rozpuszczalnych form receptora:

W celu wytworzenia inhibitora receptora do zastosowania u ludzi wymagana jest sekwencja cDNA receptora ludzkiego domeny zewnątrzkomórkowej. Jeśli znana jest forma myszy z łatwością można przeszukać ludzkie biblioteki cDNA przy użyciu sekwencji cDNA myszy i takie manipulacje są rutynowo przeprowadzane w tej dziedzinie. Mając sekwencje ludzkiego cDNA można zaprojektować startery oligonukleotydowe do powielenia w reakcji PCR domeny zewnątrzkomórkowej receptora bez domeny transbłonowej i wewnątrzkomórkowej. Zazwyczaj, zawiera ona większość aminokwasów leżących pomiędzy ostatnim dwusiarczkiem łączącym „domenę TNF i domenę transbłonową. Można zmieniać ilość zawartego regionu „trzonu dla zoptymalizowania siły uzyskanego rozpuszczalnego receptora. Zamplifikowany fragment będzie konstruowany w taki sposób, aby zawierał dogodne miejsca restrykcyjne pozwalające na klonowanie w różnych wektorach do fuzji chimerowej z końcem C dla Ig. Alternatywnie można wprowadzić sygnał stop na końcu 3' i wytworzyć formę rozpuszczalną receptora bez używania podejścia z fuzją chimerową z Ig. Uzyskane wektory można wyrażać w większości systemów stosowanych w biotechnologii włączając drożdże, komórki owadzie, bakterie i komórki ssacze i istnieją przykłady dla wszystkich typów ekspresji. Różne domeny ludzkiego Fc można podłączyć dla optymalizowania czy eliminacji FcR i reakcji dopełniacza jeśli jest to pożądane. Alternatywnie, można zastosować zmutowane formy domen Fc dla selektywnego usunięcia FcR lub reakcji dopełniacza czy dołączenie cukrów połączonych w N z domeną Fc co posiada pewne zalety.

P r z y k ł a d 5: Wytwarzanie przeciwciał agonistycznych i antagonistycznych

Opisane powyżej rozpuszczalne formy receptorów można stosować do immunizowania myszy i wytwarzania przeciwciał monoklonalnych tradycyjnymi sposobami. Uzyskane mAb, które są zidentyfikowane za pomocą testów ELISA można dalej przeszukiwać pod kątem aktywności agonisty z użyciem rozpuszczalnych przeciwciał albo unieruchomionych na plastyku w różnych testach komórkowych in vitro. Często śmierć linii komórkowej HT29 jest dogodnym systemem, który jest wrażliwy na przekazywanie sygnału przez wiele receptorów TNF. Jeśli linia ta nie posiada interesującego receptora takim receptorem o pełnej długości można stabilnie stransfekować linię HT29 i poddać testom cytotoksyczności. Alternatywnie, komórki takie można użyć w aparacie typu Cytosensor dla oszacowania czy aktywacja receptora może wywołać zmianę pH, która jest wskaźnikiem przekazania sygnału. Receptory rodziny TNF dobrze przekazują sygnał w takim formacie i metoda ta nie wymaga wiedzy na temat aktualnych wydarzeń biologicznych wyzwalanych przez receptor. Agonistyczne mAb będą „humanizowane do zastosowania klinicznego. Procedura ta może być także użyta do określenia antagonistycznych mAb. Takie mAb można określać dzięki utracie aktywności agonisty i zdolności do hamowania oddziaływań receptor-ligand co obserwuje się testem ELISA, klasycznym wiązaniem czy technikami BIAcore. W końcu formę testu przesiewowego może stanowić indukcja wydzielania chemokin przez różne komórki w odpowiedzi na przeciwciało agonistyczne.

PL 204 010 B1

P r z y k ł a d 6: Poszukiwanie inhibitorów oddziaływania receptor-ligand

Przy użyciu białka fuzyjnego receptor-Ig można przeszukiwać biblioteki kombinatoryjne pod kątem cząsteczek, które bezpośrednio wiążą receptor. Cząsteczki takie można następnie badać w sformatowanym teście ELISA przy użyciu białka fuzyjnego receptor-Ig i rozpuszczalnej formy liganda pod kątem zdolności hamowania oddziaływania receptor-ligand. Test ELISA można użyć bezpośrednio do poszukiwania w różnych bibliotekach naturalnych produktów itp. składników inhibitorowych. Receptor można transfekować do linii komórkowej takiej jak HT29 dla stworzenia testu biologicznego (w przypadku cytotoksyczności), który następnie może stanowić formę testu przesiewowego.

P r z y k ł a d 7: Hamowanie wzrostu nowotworu in vivo

Skuteczność BCMA-Ig jako antagonisty wzrostu nowotworu badano przy użyciu szeregu różnych linii komórek nowotworowych hodowanych in vivo. W badaniach tych używano myszy bez grasic (Nu/Nu) z niedoborem odpornościowym a komórki nowotworowe wszczepiano podskórnie. Linię nowotworową SW480, która rozrasta się agresywnie, wszczepiano w ilości 8x10⁵ komórek w 100 μl wolnego od pyrogenów sterylnego PBS. Pozostawiano jedną grupę kontrolną nie leczoną (n=5), podczas gdy pozostałym grupom podawano dawki 100 μg kontrolnej-Ig (n=6) lub 100 μg BCMA-Ig (n=6). Podawanie rozpoczynano tuż przed wszczepieniem z kolejnymi dawkami co każde 7 dni. Średnicę guza mierzono przy użyciu mikrometru a objętość obliczano przy użyciu wzoru V = 4/3ΠΓ³.

Guzy raka okrężnicy SW480 rosły bardzo szybko w stosowanym modelu myszy Nu/Nu i macalne guzy były wykrywalne w ciągu 10 dni. Po 24 dniach średnia objętość guza kontrolnego wynosiła 0,3 cm³, podczas gdy średnia objętość guzów traktowanych BCMA-Ig wynosiła 0,19 cm³, 46% redukcja ciężaru guza. Rak okrężnicy HT29 rósł także bardzo szybko w stosowanym modelu myszy Nu/Nu. W tych doświadczeniach, wszczepiano podskórnie 1x10⁶ komórek w 100 μl wolnego od pyrogenów sterylnego PBS i stosowano tryb dawkowania taki jak opisano dla SW480. Macalne guzy były wykrywalne w ciągu 7 dni i w grupach kontrolnych większość guzów rosła bardzo szybko. Po 42 dniach średnia objętość guza w grupach kontrolnych (nie leczonych i leczonych kontrolną-Ig, n=12) wynosiła 0,485 cm³, podczas gdy średni rozmiar guzów z grupy traktowanej BCMA-Ig (n=5) wynosił 0,095 cm³, 80% redukcja ciężaru guza. Po 50 dniach 30% myszy w grupie kontrolnej oceniano jako te, które uzyskały wynik krańcowy ze względu na rozmiar guza większy niż 1,5 cm³ i doświadczenie kończono. Dla kontrastu z grupą kontrolną 0% myszy z grupy traktowanej BCMA-Ig uzyskało wynik krańcowy. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2.

T a b e l a 2. Objętości guzów i letalność w modelu HT29 po 50 dniach leczenia

Zwierzęta kontrolne (nie leczone i leczone kontrolna-Ig) leczenie BCMA-Ig

obj. guza	śmierć	obj. guza	śmierć
0,22	-	0,11	-
O,22	-	0,32	-
0,35	-	0,13	-
0,61	-	0,56	-
0,73	-	0,33	-
1,74	+
2,53	+
1,51	+
0,90	-
0,44	-
0,32	-
1,92	_±
śr.: 0,96	%: 30	śr.: 0,29	%: 0

PL 204 010 B1

Wskazuje to na 70% redukcję średniej objętości guza i znaczący wpływ na umieralność w modelu HT29 dla wzrostu guza przy zastosowaniu leczenia BCMA-Ig.

Linia nowotworowa raka płuc A549 rośnie znacznie wolniej niż opisane powyżej linie raka okrężnicy. Linię tę wszczepiano w ilości 1x10⁶ komórek w 100 μΐ wolnego od pyrogenów sterylnego PBS i stosowano tryb dawkowania jak opisano wcześniej. Macalne guzy były wykrywalne w ciągu około 20 dni po wszczepieniu. 50 dni po wszczepieniu nowotworu średnia objętość guza w grupach kontrolnych (nie leczonych i leczonych kontrolą-Ig, n=16) wynosiła 0,2 cm³, podczas gdy średnia objętość guza z grupy traktowanej BCMA-Ig (n=7) wynosiła 0,1 cm³, 50% redukcja objętości guza. W grupie traktowanej BCMA-Ig po 50 dniach 57% myszy posiadało guz mniejszy niż 0,1 cm³, podczas gdy tylko 6% kontrolnie traktowanych myszy miało taki niski ciężar guza. 60 dni po wszczepieniu nowotworu średnia objętość guza w grupie kontrolnej wzrosła do 0,3 cm³. Dla kontrastu średnia objętość guza z grupy traktowanej BCMA-Ig ciągle wynosiła poniżej 0,2 cm³ (0,188).

Mysią linię NIH3T3, która także rośnie wolniej niż linie raka okrężnicy wszczepiano w ilości 5x10⁶komórek w 100 μΐ wolnego od pyrogenów sterylnego PBS i traktowano jak opisano powyżej. Komórki NIH3T3 tworzą guz włókniakomięsaka po podskórnym wszczepieniu myszom Nu/Nu. Macalne guzy były wykrywalne po 4 tygodniach i w grupach kontrolnych (n=11) ich objętość powiększała się przez następne 10 dni aż do osiągnięcia średniego rozmiaru 0,136 cm³. Dla kontrastu objętość guza z grupy traktowanej BCMA-Ig (n=5) osiągnęła jedynie rozmiar 0,03 cm³, 78% redukcja ciężaru guza. W 48 dniu po wszczepieniu nowotworu średnia objętość guza z grup kontrolnych osiągnęła 1,6 cm³, podczas gdy średnia objętość guza w grupie traktowanej BCMA-Ig wynosiła jedynie 0,8 cm³, 50% redukcja objętości guza. Po 52 dniach 82% (9/11) zwierząt w grupach kontrolnych oceniano jako te, które uzyskały wynik krańcowy ze względu na rozmiar guza większy niż 1,5 cm³ a pozostało jedynie 18% zwierząt stale żywych. Dla kontrastu z 40% (2/5) zwierząt z grupy traktowanej BCMA-Ig miało guz o takiej objętości, że musiano je uśpić, podczas gdy 60% zwierząt stale żyło. Wyniki przedstawiono w Tabeli 3.

T a b e l a 3. Dane przeżywalności w modelu NIH3T3

Dni po wszczepieniu

% przeżywalności	38	42	48	52
kontrola	100	90	64	18
BCMA-Ig	100	100	80	60

Wyniki pokazujące wzrost guzów NIH3T3 w czasie zilustrowano na Fig. 13. Wyniki pokazujące wzrost guzów SW480 w czasie zilustrowano na Fig. 14. Wyniki pokazujące wzrost guzów HT29 w czasie oraz wykres rozrzutu przedstawiający poszczególne zwierzęta 42 dnia po wszczepieniu nowotworu zilustrowano na Fig. 15A. Wyniki pokazujące wzrost guzów A549 u poszczególnych zwierząt 50 i 60 dnia po wszczepieniu nowotworu przedstawiono na Fig. 15B.

Wyniki pokazujące zahamowanie wzrostu guza dla linii komórek nowotworowych NIH3T3 pokazano na Fig. 13. Wyniki pokazujące zahamowanie wzrostu guza dla linii komórek nowotworowych SW480 pokazano na Fig. 14. Wyniki pokazujące zahamowanie wzrostu guza dla linii komórek nowotworowych HT29 i A549 pokazano na Fig. 15.

P r z y k ł a d 8: BCMA-Ig wpływa na redukcję liczby komórek B w normalnych myszach

Ośmiotygodniowe samice myszy BALB/c nabyto w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Myszy (3/grupę) otrzymały i.p. PBS, 400 μg białka fuzyjnego ludzki BCMA-hulgG1 (hBCMA-Ig) (dostarczone przez Teresę Cachero, Biogen) lub 400 μg oczyszczonej ludzkiej IgG (HulgG) (Sandoz, Bazylea, Szwajcaria) -8, -5, -1 i +2 dnia. Myszy otrzymały 100 μl 10% czerwonych krwinek owcy (SRBC) (Colorado Serum Company, Denver, CO) dnia 0.

W momencie uśmiercania krew przez nakłucie w sercu zbierano do probówek zawierających EDTA, i krwinki czerwone lizowano buforem hipotonicznym. Krew zbierano także bez EDTA do przygotowania surowicy. Przygotowywano zawiesiny pojedynczych komórek ze śledzion oraz węzłów chłonnych krezki (MLN) i krwinek czerwonych i lizowano je buforem hipotonicznym. Przeprowadzano cytometrię przepływową przy użyciu skoniugowanych z PE anty-CD45R/B220, antysyndecan/CD138 oraz anty-B7.2 oraz skoniugowanych z FITC anty-IgM i anty-Cd45R/B220. Wszystkie mAb nabyto w Pharmingen (San Diego, CA). W skrócie, receptory Fc blokowano 10 μg/ml Fc Błock (Pharmingen) przez 15 min. w lodzie, a następnie dodawano mAb skoniugowane z PE lub FITC i inkubowano

PL 204 010 B1 w lodzie przez 20-30 min. Komórki pł ukano 1x i zawieszano w 0,5% paraformaldehydzie. Wyniki fluorescencji komórek wykrywano cytometrem przepływowym FACSCalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, CA) i analizowano przy użyciu oprogramowania CELLQuest™ (Becton Dickinson).

Po traktowaniu hBCMA-Ig występowała około 50% redukcja ilości komórek B w krwi obwodowej i badanych obwodowych narządach limfatycznych. B220^wysokieIgM^niskie komórki B odpowiadały 23,4% i 21,5% komórek w myszach traktowanych odpowiednio PBS i HulgG, podczas gdy populacja stanowiła jedynie 9,9% komórek w myszach traktowanych hBCMA-Ig. Ilość komórek osocza (syndecan/CD138+) wydaje się być również obniżona w niewielkim stopniu z 5,7% i 4,8% obecnymi w krwi myszy traktowanych odpowiednio PBS i HulgG, w porównaniu z 3,9% w myszach traktowanych hBCMA-Ig. Regulacja cząsteczki B7.2 była podniesiona na 3,1% i 4,5% komórek B220+ w myszach traktowanych odpowiednio PBS i HulgG, w porównaniu z myszami traktowanymi hBCMA-Ig.

W śledzionie B220^wysokie komórki B były znacznie zredukowane w myszach traktowanych hBCMA-Ig stanowiąc 18,8% w porównaniu z 36,7% i 40% w myszach traktowanych odpowiednio PBS i HulgG. Spadek ten obserwowano zarówno w subpopulacji IgM^wysokie i IgM^niskie (patrz Tab. 1). Nie obserwowano zmian w nowo powstających przedziałach z komórkami B w śledzionie, B220^niskie IgM^wysokie (wyniki nie pokazane). Ilość komórek osocza (syndecan/CD138+) wydaje się być również obniżona w niewielkim stopniu z 3,3% i 3,4% obecnymi w śledzionie myszy traktowanych odpowiednio PBS i HulgG, w porównaniu z 2,4% w myszach traktowanych hBCMA-Ig.

MLN wykazują spadek B220+ komórek B z 14,1% obecnymi w myszach traktowanych hBCMAIg w porównaniu z i 26,7% i 35,8% w myszach traktowanych odpowiednio PBS i HulgG. Wyniki zebrane w Tabeli 4.

T a b e l a 4. Populacje komórek B w myszach traktowanych hBCMA-Ig, PBS i HulgG¹

Krew	_B220 ^wysokie _I ^Bg²M²n⁰iskie	Syndecan	_B7.2/B220 ^niskie
PBS	23,4 ± 5,7	5,7 ± 1,5	3,1 ± 0,5
HulgG	21,5 ± 4,5	4,8 ± 0,9	4,5 ± 1,0
HBCMA-Ig	9,9 ± 1,8	3,9 ± 0,6	1,9 ± 0,5
Śledziona	_B220 ^wysokie _I ^Bg²M²n⁰iskie	_B220 ^wysokiIgM⁺	Syndecan
PBS	27,8 ± 1,6	11,9 ± 1,6	3,3 ± 0,8
HulgG	30,5 ± 2	11,8 ± 1,0	3,4 ± 0,7
HBCMA-Ig	10,6 ± 0,2	8,4 ± 0,2	2,4 ± 0,2
MLN	B220⁺
PBS	26,7
HulgG	35,8 ± 3,3
HBCMA-Ig	14,1 ± 5,9

¹ Myszy traktowano jak opisano w sekcji Materiały i Metody, wyniki podane jako procent ± odchylenie standardowe.

Obniżony procent komórek B B7.2+ we krwi i komórkach osocza z krwi i śledzionach myszy traktowanych hBCMA-Ig po immunizacji SRBC sugeruje, że zachodzi inhibicja aktywacji i/lub dojrzewania komórek B i potencjalnie wzrasta eliminacja aktywowanych komórek B. Bardzo niski procent antygenów swoistych dla komórek B będzie aktywowany i będzie odpowiadał dowolnemu antygenowi w przypadku SRBC. Ponieważ traktowanie hBCMA prowadzi do tak dramatycznej redukcji procentu komórek B w badanych tkankach, ~50%, aktywność hBCMA-Ig wydaje się także celować do spoczynkowych, dojrzałych komórek B.

Uważa się zatem, że białko fuzyjne BCMA może być użyte jako lek terapeutyczny do zastosowania klinicznego w chorobach w których pośredniczą komórki B. Choroby takie będą obejmować te, które mają pochodzenie autoimmunologiczne jak układowy toczeń rumieniowaty, miastenia gravis, autoimmunologiczna anemia hemolityczna, choroba Werlhofa, zespół anty-fosfolipidowy, choroba Chaga, choroba Grave, ziarniniak Wegenera, guzowatość zapalenia wielostawowego, oraz szybko postępujące zapalenie kłębuszków nerkowych. Czynniki terapeutyczne będą także miały zastosowanie w chorobach osocza takich jak szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenstroma, choroba ciężkich łańPL 204 010 B1 cuchów, pierwotna i związana z immunocytami skrobiawica oraz gammopatia monoklonalna o niezdeterminowanym znaczeniu (MGUS). Cele onkologiczne obejmują raki, białaczki i chłoniaki komórek B.

Dla specjalistów będzie oczywiste, że można wykonać różne modyfikacje i zmiany w polipeptydach, kompozycjach i sposobach według niniejszego wynalazku bez utraty ducha i zakresu wynalazku. Zatem w zamierzeniach niniejszy wynalazek pokrywa modyfikacje i odmiany dostarczane według niniejszego wynalazku, które wchodzą w zakres załączonych zastrzeżeń i ich odpowiedników.

Claims

1. Zastosowanie:

a) polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową, (i) w co najmniej 80% identyczną z sekwencją reszt aminokwasowych od 1 do 184 SEKW. NR ID.: 8, i (ii) zdolnego do wiązania APRIL (liganda indukują cego proliferację );

b) polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową, (i) w co najmniej 80% identyczną z sekwencją reszt aminokwasowych od 1 do 52 SEKW. NR ID.: 8, i (ii) zdolnego do wiązania APRIL (liganda indukują cego proliferację );

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że polipeptyd z (a), (b) lub (c) ponadto obejmuje domenę Fc wydzielanego białka.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że polipeptyd z (a), (b) lub (c) ponadto obejmuje domenę Fc immunoglobuliny.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że immunoglobuliną jest IgG.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że immunoglobulina jest immunoglobuliną ludzką.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że polipeptyd dalej obejmuje SEKW. NR ID.: 12.

7. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-6, znamienne tym, że nowotworem jest rak.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że rak jest wybrany z grupy składającej się z raka płuc, raka okrężnicy, raka prostaty i raka sutka.

9. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-6, znamienne tym, że komórka rakowa jest u ssaka.

10. Zastosowanie wedł ug zastrz. 9, znamienne tym, ż e ssakiem jest czł owiek.

11. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że polipeptyd z (a), (b) lub (c) obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 85% identyczna z sekwencją reszt aminokwasowych od 1 do 52 SEKW. NR ID.: 8.

12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że polipeptyd z (a), (b) lub (c) obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 90% identyczna z sekwencją reszt aminokwasowych od 1 do 52 SEKW. NR ID.: 8.

13. Zastosowanie wedł ug zastrz. 1, znamienne tym, ż e polipeptyd z (a), (b) lub (c) obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 95% identyczna z sekwencją reszt aminokwaso-