BR112020024074A2

BR112020024074A2 - anticorpos de cadeia pesada com ligação a cd19

Info

Publication number: BR112020024074A2
Application number: BR112020024074-5A
Authority: BR
Inventors: Shelley Force Aldred; Wim Van Schooten; Katherine Harris; Udaya Rangaswamy; Nathan Trinklein
Original assignee: Teneobio, Inc.
Priority date: 2018-07-20
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2021-02-17
Also published as: CN116769032A; MX2021000708A; SG11202011597RA; AU2019305663A1; CN112351997A; JP7439046B2; US20210332133A1; KR20210032311A; JP2021530236A; WO2020018922A1; CA3101069A1; EP3823990A1; IL279010A; CN112351997B

Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos de cadeia pesada anti-CD19 (por exemplo, UniAbsTM) são descritos, juntamente com métodos de produção de tais anticorpos, composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo tais anticorpos, e seu uso para tratar distúrbios de células B que são caracterizados pela expressão de CD19.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTI- CORPOS DE CADEIA PESADA COM LIGAÇÃO A CD19”.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício prioritário do Pedido de Patente Provisório US 62/701.281, depositado em 20 de julho de 2018, cuja descrição é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi enviada por via eletrônica em formato ASCII e está, por meio deste, incorporada integralmente por referência. A referida cópia ASCII, criada em 4 de setembro de 2019, está nomeada como TNO-0013-WO_SL.txt e tem 26.773 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se a anticorpos de cadeia pe- sada humana (por exemplo, UniAbsTM) que se ligam a CD19. A invenção refere-se adicionalmente a métodos de preparação de tais anticorpos, composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo tais anticorpos e seu uso para tratar distúrbios de células B que são caracterizados pela expressão de CD19.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CD19

[0004] O CD19, também conhecido como Antígeno B4 de Superfí- cie de Linfócito B (UniProt P15391), é um receptor de superfície celular expresso em todas as células B humanas, mas não é encontrado nas células plasmáticas. O CD19 é uma proteína transmembranar que re- cruta proteínas de sinalização citoplasmática para a membrana e atua dentro do complexo CD19/CD21 para diminuir o limiar para as vias de sinalização do receptor de células B. O CD19 tem uma cauda citoplas-

mática relativamente grande de 240 aminoácidos. Os domínios extrace- lulares similares a Ig são divididos por um domínio potencial não similar a Ig ligado por dissulfeto e sítios de adição de carboidratos ligados a N. A cauda citoplasmática contém pelo menos nove resíduos de tirosina perto do C-terminal, alguns dos quais foram mostrados como fosforila- dos. Junto com o CD20 e o CD22, a expressão restrita de CD19 à linha- gem de células B o torna um alvo atraente para o tratamento terapêutico de malignidades de células B. Muitos anticorpos monoclonais e conju- gados de anticorpo-fármaco específicos para o CD19 foram descritos (por exemplo, Naddafi et al. 2015, PMC4644525). Além disso, as células T do receptor de antígeno quimérico anti-CD19 foram aprovadas para tratar a leucemia (por exemplo, Sadelain et al. 2017, PMID: 29245005). Anticorpos de Cadeia Pesada

[0005] Em um anticorpo IgG convencional, a associação da cadeia pesada e da cadeia leve se deve em parte a uma interação hidrofóbica entre a região constante da cadeia leve e o domínio constante de CH1 da cadeia pesada. Existem resíduos adicionais nas regiões de fra- mework 2 (FR2) e framework 4 (FR4) da cadeia pesada que também contribuem para esta interação hidrofóbica entre as cadeias pesadas e leves.

[0006] É conhecido, no entanto, que os soros de camelídeos (sub- ordem Tylopoda, que inclui camelos, dromedários e lamas) contêm um tipo principal de anticorpos compostos apenas por cadeias H empare- lhadas (anticorpos apenas de cadeia pesada ou UniAbsTM). O UniAbsTM de Camelidae (Camelus dromedarius, Camelus bactrianus, Lama glama, Lama guanaco, Lama alpaca e Lama vicugna) têm uma estrutura única que consiste em um único domínio variável (VHH), uma região de do- bradiça e dois domínios constantes (CH2 e CH3), que são altamente homólogos aos domínios CH2 e CH3 dos anticorpos clássicos. Estes UniAbsTM não possuem o primeiro domínio da região constante (CH1),

que está presente no genoma, mas é processado durante o processa- mento do mRNA. A ausência do domínio CH1 explica a ausência da cadeia leve no UniAbsTM, uma vez que este domínio é o lugar de anco- ragem para o domínio constante da cadeia leve. Tal UniAbsTM evoluiu naturalmente para conferir especificidade de ligação ao antígeno e alta afinidade por três CDRs a partir de anticorpos convencionais, ou frag- mentos dos mesmos (Muyldermans, 2001; J Biotechnol 74:277–302; Revets et al., 2005; Expert Opin Biol Ther 5:111–124). Os peixes carti- laginosos, como os tubarões, também desenvolveram um tipo distinto de imunoglobulina, denominada IgNAR, que não possui as cadeias po- lipeptídicas leves e é composta inteiramente por cadeias pesadas. As moléculas de IgNAR podem ser manipuladas por manipulação molecu- lar para produzir o domínio variável de um único polipeptídeo de cadeia pesada (vNARs) (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).

[0007] A capacidade de anticorpos apenas de cadeia pesada des- providos de cadeia leve para se ligarem ao antígeno foi estabelecida na década de 1960 (Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). A imu- noglobulina de cadeia pesada fisicamente separada da cadeia leve re- teve 80% da atividade de ligação ao antígeno em relação ao anticorpo tetramérico. Sitia et al. (1990) Cell, 60, 781-790 demonstrou que a re- moção do domínio CH1 a partir de um gene μ de camundongo rearran- jado resulta na produção de um anticorpo apenas de cadeia pesada, desprovido de cadeia leve, em cultura de células de mamíferos. Os an- ticorpos produzidos retiveram a especificidade de ligação de VH e fun- ções efetoras.

[0008] Os anticorpos de cadeia pesada com alta especificidade e afinidade podem ser gerados contra uma variedade de antígenos por meio de imunização (van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta.

1431, 37-46 (1999)) e a porção de VHH pode ser facilmente clonada e expressa em levedura (Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). Os seus níveis de expressão, solubilidade e estabilidade são significativamente mais elevados do que aqueles dos fragmentos F(ab) ou Fv clássicos (Ghahroudi, M. A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)).

[0009] Os camundongos nos quais o lócus da cadeia λ (lambda) leve (L) e/ou os loci da cadeia λ e κ (kappa) L foram funcionalmente silenciados e os anticorpos produzidos por tais camundongos são des- critos nas Patentes US 7.541.513 e 8.367.888. A produção recombi- nante de anticorpos apenas de cadeia pesada em camundongos e ratos foi relatada, por exemplo, em WO2006008548; Publicação de Pedido US 20100122358; Nguyen et al., 2003, Immunology; 109(1), 93-101; Brüggemann et al., Crit. Rev. Immunol.; 2006, 26(5):377-90; e Zou et al., 2007, J Exp Med; 204(13): 3271–3283. A produção de ratos nocaute via microinjeções de embrião de nucleases de dedo de zinco é descrita em Geurts et al., 2009, Science, 325(5939):433. Os anticorpos solúveis apenas de cadeia pesada e roedores transgênicos compreendendo um lócus de cadeia pesada heterólogo que produz tais anticorpos são des- critos nas Patentes US 8.883.150 e 9.365.655. As estruturas CAR-T compreendendo os anticorpos de domínio único como um domínio de ligação (direcionamento) são descritas, por exemplo, em Iri-Sofla et al., 2011, Experimental Cell Research 317:2630-2641 e Jamnani et al., 2014, Biochim Biophys Acta, 1840:378-386.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] Os aspectos da invenção referem-se a anticorpos de cadeia pesada, incluindo, mas não se limitando a UniAbsTM, com afinidade de ligação a CD19. Outros aspectos da invenção referem-se a métodos de produção de tais anticorpos, composições que compreendem tais anti- corpos e seu uso no tratamento de distúrbios de células B que são ca- racterizados pela expressão de CD19.

[0011] Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada que se liga a CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende: (a) uma CDR1 tendo duas ou menos substi- tuições em qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 1 a 6; e/ou (b) uma CDR2 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 7 a 12; e/ou (c) uma CDR3 tendo duas ou menos substituições na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, as se- quências CDR1, CDR2 e CDR3 estão presentes em um framework hu- mano. Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pe- sada compreende adicionalmente uma sequência da região constante da cadeia pesada na ausência de uma sequência de CH1.

[0012] Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada compreende: (a) uma sequência de CDR1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1 a 6; e/ou (b) uma sequência de CDR2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 7 a 12; e/ou (c) uma sequência de CDR3 da SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada compreende: (a) uma sequência de CDR1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1 a 6; e (b) uma sequência CDR2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 7 a 12; e (c) uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13.

[0013] Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada compreende: (a) uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma sequência CDR2 da SEQ ID NO: 10 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pe- sada compreende uma região variável de cadeia pesada com pelo me- nos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências da SEQ ID NOs: 14 a 21. Em algumas modalidades, um anticorpo ape- nas de cadeia pesada compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ

ID NOs: 14 a 21. Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17.

[0014] Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada que se liga a CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma sequência de CDR1 da fórmula: G F X1 F S X2 X3 W (SEQ ID NO: 22) em que X1 é T ou S; X2 é S ou N; X3 é Y ou F; e (b) uma sequência CDR2 da fórmula: X4 X5 X6 X7 G S X8 X9 (SEQ ID NO: 23) em que X4 é I ou M; X5 é N, S ou K; X6 é Q ou K; X7 é D ou A; X8 é D ou E; X9 é K ou E; e (c) uma sequência CDR3 de ASGVYSFDY (SEQ ID NO: 13).

[0015] Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada que se liga a CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 em um framework de VH humana, em que as sequências de CDR são sequên- cias com duas ou menos substituições em uma sequência de CDR se- lecionada a partir de grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1 a 13.

[0016] Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada compreen- dendo as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 em um framework de VH humana, em que as sequências de CDR são selecionadas a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1 a 13.

[0017] Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada que se liga a CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma sequência de CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma sequência de CDR2 da SEQ ID NO: 10 e uma sequência de CDR3 da SEQ ID NO: 13, em um framework de VH humana.

[0018] Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada é multiespecífico. Em algumas modalidades, um anticorpo ape- nas de cadeia pesada é biespecífico. Em algumas modalidades, um an- ticorpo apenas de cadeia pesada tem afinidade de ligação a duas pro- teínas CD19 diferentes. Em algumas modalidades, um anticorpo ape- nas de cadeia pesada tem afinidade de ligação a dois epítopos diferen- tes na mesma proteína CD19. Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada tem afinidade de ligação a uma célula efetora. Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada tem afinidade de ligação a um antígeno de células T. Em algumas modali- dades, um anticorpo apenas de cadeia pesada tem afinidade de ligação a CD3. Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pe- sada está em um formato CAR-T.

[0019] Os aspectos da invenção referem-se a composições farma- cêuticas que compreendem um anticorpo apenas de cadeia pesada descrito neste documento.

[0020] Aspectos da invenção referem-se a métodos para o trata- mento de um distúrbio de células B caracterizado pela expressão de CD19, compreendendo a administração a um sujeito com o referido dis- túrbio de um anticorpo ou uma composição farmacêutica descrita neste documento. Em algumas modalidades, o distúrbio é linfoma difuso de grandes células B (DLBCL). Em algumas modalidades, o distúrbio é leu- cemia linfoblástica aguda (ALL). Em algumas modalidades, o distúrbio é linfoma não-Hodgkin (NHL). Em algumas modalidades, o distúrbio é lúpus eritematoso sistêmico (SLE). Em algumas modalidades, o distúr- bio é artrite reumatoide (RA). Em algumas modalidades, o distúrbio é esclerose múltipla (MS).

[0021] Aspectos da invenção referem-se a polinucleotídeos que co- dificam um anticorpo descrito neste documento, vetores que compreen- dem tais polinucleotídeos e células que compreendem tais vetores.

[0022] Aspectos da invenção referem-se a métodos de produção de um anticorpo descrito neste documento, compreendendo o crescimento de uma célula descrita neste documento sob condições permissivas para a expressão do anticorpo e o isolamento do anticorpo a partir da célula e/ou um meio de cultura celular em que a célula é cultivada.

[0023] Aspectos da invenção referem-se a métodos de preparação de um anticorpo descrito neste documento, compreendendo imunizar um animal UniRat com CD19 e identificar sequências de cadeia pesada de ligação a CD19.

[0024] Aspectos da invenção referem-se a métodos de tratamento, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade de uma dose eficaz de um anticorpo ou composição farmacêutica, con- forme descrito neste documento.

[0025] Aspectos da invenção referem-se ao uso de um anticorpo ou composição farmacêutica, conforme descrito neste documento, na pre- paração de um medicamento para o tratamento de uma doença ou dis- túrbio em um indivíduo com necessidade.

[0026] Aspectos da invenção referem-se a um kit para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo com necessidade, com- preendendo um anticorpo ou composição farmacêutica, conforme des- crito neste documento e instruções de uso. Em algumas modalidades, um kit compreende adicionalmente pelo menos um reagente adicional. Em algumas modalidades, pelo menos um reagente adicional compre- ende um fármaco quimioterápico.

[0027] Estes e outros aspectos serão explicados com mais detalhes no restante da descrição, incluindo os Exemplos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0028] A Figura 1 mostra sequências de aminoácidos de CDR úni- cas de anticorpo de cadeia pesada anti-CD19.

[0029] A Figura 2 mostra sequências de aminoácidos de domínio variável de anticorpo de cadeia pesada anti-CD19.

[0030] A Figura 3 mostra as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo de cadeia pesada anti-CD19.

[0031] A Figura 4 mostra as atividades biológicas do anticorpo de cadeia pesada anti-CD19.

[0032] A Figura 5A é um gráfico que representa a porcentagem de lise específica em função da concentração de anticorpos.

[0033] A Figura 5B é uma ilustração esquemática de um anti-CD19 x anti-CD3 biespecífico, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0034] A Figura 6 é um gráfico que mostra a resposta de ligação à proteína em função do tempo.

[0035] A Figura 7 é um gráfico que mostra a carga tumoral em fun- ção do tempo (dias após a implantação) para um experimento de mo- delo de tumoral.

[0036] A Figura 8 é um gráfico que mostra a lise de células alvo (citotoxicidade) em função da concentração de anticorpos.

[0037] A Figura 9 é um gráfico que mostra a concentração de cito- cinas liberadas em função da concentração de anticorpos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

[0038] A prática da presente invenção empregará, a menos que in- dicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular (in- cluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquí- mica e imunologia, que estão dentro da habilidade na técnica. Tais téc- nicas são totalmente explicadas na literatura, tais como, “Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual”, segunda edição (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, e atualizações periódicas); “PCR: The Polymerase Chain Reac- tion”, (Mullis et al., ed., 1994); “A Practical Guide to Molecular Cloning”

(Perbal Bernard V., 1988); “Phage Display: A Laboratory Manual” (Bar- bas et al., 2001); Harlow, Lane e Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); e Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988).

[0039] Quando uma faixa de valores é produzida, entende-se que cada valor interveniente, ao décimo da unidade do limite inferior, a me- nos que o contexto dite claramente de outra forma, entre os limites su- perior e inferior da faixa e qualquer outro valor declarado ou interveni- ente nessa faixa declarada é englobada na invenção. Os limites superior e inferior dessas faixas menores podem ser independentemente incluí- dos nas faixas menores e também são englobadas na invenção, sujeitas a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida incluir um ou ambos os limites, as faixas que ex- cluem qualquer um ou ambos os limites incluídos também são incluídos na invenção.

[0040] Salvo indicação em contrário, os resíduos de anticorpos neste documento são numerados de acordo com o sistema de numera- ção de Kabat (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5ª. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Be- thesda, Md. (1991)).

[0041] Na seguinte descrição, vários detalhes específicos são esta- belecidos a fim de estabelecer uma compreensão mais completa da pre- sente invenção. Todavia, ficará evidente para aqueles versados na téc- nica que a presente invenção pode ser praticada sem um ou mais des- tes detalhes específicos. Em outros casos, características bem conhe- cidas e procedimentos bem conhecidos por aqueles versados na técnica não foram descritos a fim de não obscurecer a invenção.

[0042] Todas as referências citadas ao longo da descrição, inclu-

indo pedidos de patente e publicações, estão incorporadas neste docu- mento a título de referência em sua totalidade. I. Definições

[0043] Por “compreendendo” entende-se que os elementos indica- dos são necessários na composição/método/kit, mas outros elementos podem ser incluídos para formar a composição/método/kit etc. dentro do escopo da reivindicação.

[0044] Por "consistindo essencialmente em", entende-se uma limi- tação do âmbito da composição ou método descrito para os materiais especificados ou etapas que não afetam materialmente a(s) caracterís- tica(s) básica(s) e inovadora(s) da presente invenção.

[0045] Por "composto de", entende-se a exclusão da composição, método ou kit de qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especifi- cado no pedido.

[0046] Resíduos de anticorpos neste documento são numerados de acordo com o sistema de numeração de Kabat e o sistema de numera- ção da EU. O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequen- ces of Immunological Interest. 5ª. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). O "sistema de numeração EU" ou "índice EU" é geralmente utilizado ao se referir a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exem- plo, o índice EU relatado em Kabat et al., supra). O "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração dos resíduos do anticorpo EU IgG1 hu- mana. A menos que indicado de outra forma neste documento, as refe- rências a números de resíduos no domínio variável de anticorpos signi- ficam numeração de resíduos pelo sistema de numeração de Kabat. A menos que indicado de outra forma neste documento, as referências a números de resíduos no domínio constante de anticorpos significam nu- meração de resíduos pelo sistema de numeração da EU.

[0047] Os anticorpos, também conhecidos como imunoglobulinas, convencionalmente compreendem pelo menos uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que o domínio amino terminal das cadeias pesadas e leves é variável em sequência e, portanto, é comumente referido como um domínio de região variável, ou um domínio variável pesado (VH) ou variável leve (VL). Os dois domínios associam-se convencionalmente para formar uma região de ligação específica, embora, como será dis- cutido aqui, a ligação específica possa também ser obtida apenas com sequências variáveis apenas de cadeia pesada, e uma variedade de configurações não naturais de anticorpos são conhecidas e utilizadas na técnica.

[0048] Um anticorpo "funcional" ou "biologicamente ativo" ou molé- cula de ligação ao antígeno (incluindo anticorpos apenas de cadeia pe- sada e moléculas similares a anticorpos de três cadeias multiespecíficas (por exemplo, biespecíficos), descritos neste documento) é aquele ca- paz de exercer uma ou mais de suas atividades naturais em eventos estruturais, regulatórios, bioquímicos ou biofísicos. Por exemplo, um an- ticorpo funcional ou outra molécula de ligação, por exemplo, um TCA, pode ter a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno e a ligação pode, por sua vez, induzir ou alterar um evento celular ou mole- cular, tal como a transdução de sinal ou atividade enzimática. Um anti- corpo funcional ou outra molécula de ligação, por exemplo, TCA, pode também bloquear a ativação do ligante de um receptor ou atuar como um agonista ou antagonista. A capacidade de um anticorpo ou outra molécula de ligação, por exemplo, um TCA, de exercer uma ou mais das suas atividades naturais depende de vários fatores, incluindo a do- bragem e a montagem apropriadas das cadeias polipeptídicas.

[0049] O termo “anticorpo” é utilizado neste documento no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais, anticor- pos policlonais, monômeros, dímeros, multímeros, anticorpos multies- pecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos apenas de cadeia pesada, anticorpos de três cadeias, Fv de cadeia única (scFv), nanocorpos, etc., e também incluem fragmentos de anticorpo, desde que exibam a atividade biológica desejada (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170: 4854-4861). Os anticorpos podem ser murinos, huma- nos, humanizados, quiméricos ou derivados de outras espécies.

[0050] O termo anticorpo pode se referir a uma cadeia pesada de comprimento total, uma cadeia leve de comprimento total, uma molécula de imunoglobulina intacta; ou uma porção imunologicamente ativa de qualquer destes polipeptídeos, isto é, um polipeptídeo que compreende um sítio de ligação ao antígeno que se liga imunoespecificamente a um antígeno de um alvo de interesse ou parte do mesmo, incluindo alvos que incluem, mas não se limitam a, célula cancerígena ou células que produzem anticorpos autoimunes associados a uma doença autoimune. A imunoglobulina divulgada neste documento pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina, incluindo subclasses manipuladas com porções alteradas de Fc que proporcionam atividade de células efetoras aprimorada ou reduzida. As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer espécie. Em um as- pecto, a imunoglobulina é de origem amplamente humana.

[0051] O termo "anticorpo monoclonal" usado neste documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, em que os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto pelas mutações de ocorrência natural possíveis que podem estar presentes em quantida- des menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Adicionalmente,

em contraste com as preparações de anticorpo (policlonal) convencio- nais que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra dife- rentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. Os anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, e também pode ser feito através de métodos de produção de proteína recombinante (ver, por exemplo, Patente US 4.816.567), por exemplo.

[0052] O termo "variável", conforme usado em conexão com os an- ticorpos, refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis do anticorpo diferem extensivamente na sequência entre os anticorpos e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não está uni- formemente distribuída ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos. A variabilidade está concentrada em três segmentos denominados regi- ões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis da cadeia leve como nos domínios variáveis da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são denominadas regiões de fra- mework (FRs). Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nati- vas, cada um, compreendem quatro FRs, amplamente adotando uma configuração de folha β, conectada por três regiões hipervariáveis que formam conexão em loops, e em alguns casos, formando parte da es- trutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são manti- das juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hiper- variáveis a partir da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª. Ed. Public Health Service, Na- tional Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constan- tes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na citoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).

[0053] O termo "região hipervariável", quando usado neste docu- mento, refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável geral- mente compreende resíduos de aminoácidos de uma “região determi- nante de complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, resíduos 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edição. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de um "loop hipervariável" resíduos 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Os resíduos da "região de framework" ou "FR" são os resíduos de domínio variável que não são os resíduos da região hipervariável como definidos neste documento.

[0054] Designações da CDR exemplares são mostradas neste do- cumento, no entanto, um versado na técnica entenderá que uma série de definições das CDRs estão comumente em uso, incluindo a definição de Kabat (ver "Zhao et al. A germline knowledge based computational approach for determining antibody complementarity determining regions” Mol Immunol. 2010; 47:694–700), que se baseia na variabilidade da se- quência e é o mais comumente usado. A definição de Chothia é base- ada na localização das regiões de loop estrutural (Chothia et al. “Con- formations of immunoglobulin hypervariable regions.” Nature. 1989; 342:877–883). As definições alternativas de CDR de interesse incluem, sem limitação, aquelas descritas por Honegger, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool.” J Mol Biol. 2001;309:657–670; Ofran et al. “Auto- mated identification of complementarity determining regions (CDRs) re- veals peculiar characteristics of CDRs and B cell epitopes.” J Immunol.

2008;181:6230–6235; Almagro “Identification of differences in the spec- ificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of dif- ferent size: implications for the rational design of antibody repertoires.” J Mol Recognit. 2004;17:132–143; e Padlanet al. “Identification of spec- ificity-determining residues in antibodies.” Faseb J. 1995;9:133–139., cada um dos quais é incorporado neste documento especificamente por referência.

[0055] Os termos "anticorpo apenas de cadeia pesada" e "anticorpo de cadeia pesada" são usados de forma intercambiável neste docu- mento e se referem, no sentido mais amplo, a anticorpos sem a cadeia leve de um anticorpo convencional. Os termos incluem especificamente, sem limitação, anticorpos homodiméricos compreendendo o domínio de ligação ao antígeno VH e os domínios constantes CH2 e CH3, na au- sência do domínio CH1; variantes funcionais (de ligação ao antígeno) de tais anticorpos, variantes VH solúveis, Ig-NAR compreendendo um homodímero de um domínio variável (V-NAR) e cinco domínios cons- tantes similares a C (C-NAR) e fragmentos funcionais dos mesmos; e anticorpos de domínio único solúveis (sUniDabsTM). Em uma modali- dade, um anticorpo apenas de cadeia pesada é composto do domínio de ligação ao antígeno de região variável composto por framework 1, CDR1, framework 2, CDR2, framework 3, CDR3 e framework 4. Em ou- tra modalidade, um anticorpo apenas de cadeia pesada é composto de um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e domínios de CH2 e CH3. Em outra modalidade, o anticorpo apenas de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio de CH2. Em uma modalidade adicional, o anticorpo apenas de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio de CH3. Os anticorpos apenas de cadeia pesada nos quais o domínio CH2 e/ou CH3 é trun- cado também são incluídos neste documento. Em uma modalidade adi- cional, a cadeia pesada é composta de um domínio de ligação ao antí- geno e pelo menos um domínio de CH (CH1, CH2, CH3, ou CH4), mas nenhuma região de dobradiça. Em outra modalidade, a cadeia pesada é composta por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos um domínio de CH (CH1, CH2, CH3 ou CH4) e pelo menos uma porção de uma região de dobradiça. O anticorpo apenas de cadeia pesada pode estar na forma de um dímero, no qual duas cadeias pesadas são ligadas por dissulfeto ou, de outra forma, covalentemente ou não covalente- mente ligadas uma à outra. O anticorpo apenas de cadeia pesada pode pertencer à subclasse IgG, mas os anticorpos pertencentes a outras subclasses, como as subclasses IgM, IgA, IgD e IgE, também estão in- cluídos neste documento. Em uma modalidade particular, o anticorpo de cadeia pesada é do subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, em particular o subtipo IgG1. Em uma modalidade, o anticorpo de cadeia pesada é do subtipo IgG4, em que um ou mais dos domínios CH são modificados para alterar uma função efetora do anticorpo. Em uma modalidade, o anticorpo de cadeia pesada é do subtipo IgG1, em que um ou mais dos domínios de CH são modificados para alterar uma função efetora do anticorpo. As modificações dos domínios de CH que alteram a função efetora são descritas adicionalmente neste documento. Exemplos não limitativos de anticorpos de cadeia pesada são descritos, por exemplo, em WO2018/039180, cuja descrição é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[0056] Em uma modalidade, os anticorpos apenas de cadeia pe- sada neste documento são usados como um domínio de ligação (dire- cionamento) de um receptor de antígeno quimérico (CAR). A definição inclui especificamente anticorpos de cadeia pesada humana produzidos por ratos transgênicos de imunoglobulina humana (UniRat TM), denomi- nados UniAbsTM. As regiões variáveis (VH) de UniAbsTM são denomina- das de UniDabsTM e são blocos de construção versáteis que podem ser ligados a regiões de Fc ou albumina sérica para o desenvolvimento de novas terapêuticas com multiespecificidade, potência aumentada e meia-vida estendida. Uma vez que o UniAbsTM homodimérico carece de uma cadeia leve e, portanto, de um domínio de VL, o antígeno é reco- nhecido por um único domínio, ou seja, o domínio variável (domínio de ligação ao antígeno) da cadeia pesada de um anticorpo de cadeia pe- sada (VH).

[0057] Uma "cadeia de anticorpo intacta", como usado neste docu- mento, é aquela que compreende uma região variável de comprimento total e uma região constante de comprimento total (Fc). Um anticorpo "convencional" intacto compreende uma cadeia leve intacta e uma ca- deia pesada intacta, assim como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, dobradiça, CH2 e CH3 para o IgG secretado. Outros isotipos, como IgM ou IgA podem ter diferentes domínios de CH (incluindo, por exemplo, um domínio de CH4). Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou sequência de aminoácidos variantes dos mesmos. O anticorpo in- tacto pode ter uma ou mais "funções efetoras", que se referem às ativi- dades biológicas atribuíveis à região constante Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de sequência de aminoácidos variante) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem ligação C1q; complemento dependente de citotoxicidade; ligação ao re- ceptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; e regulação negativa de receptores de superfície celular. Variantes de região constante incluem aquelas que alteram o perfil efetor, a ligação a receptores Fc e similares.

[0058] Dependendo da sequência de aminoácidos do Fc (domínio constante) das suas cadeias pesadas, podem ser fornecidos anticorpos e várias proteínas de ligação ao antígeno como classes diferentes. Exis- tem cinco classes principais de regiões Fc de cadeia pesada: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias dessas podem ser divididas em "subclasses" (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domí- nios constantes de Fc que correspondem às diferentes classes de anti- corpos podem ser referenciados como α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais de di- ferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. As formas de Ig incluem modificações com dobradiça ou formas sem dobradiça (Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Bio- chem. 267:7246-7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310). As ca- deias leves de anticorpos (imunoglobulinas) a partir de quaisquer espé- cies de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos denomina- dos capa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

[0059] Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma região Fc de sequência nativa. Exemplos não limitativos de funções efetoras incluem ligação de C1q; CDC; Ligação do receptor Fc; ADCC; ADCP; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B), etc. Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc interaja com um receptor, por exemplo, o FcγRI; FcγRIIA; FcγRIIB1; FcγRIIB2; receptores FcγRIIIA; FcγRIIIB e o receptor FcRn de baixa afinidade; e pode ser avaliado usando vários ensaios conhecidos na técnica. Um Fc "morto" ou "silenciado" é aquele que sofreu mutação para reter a atividade em relação a, por exemplo, prolongar a meia-vida sérica, mas que não ativa um receptor Fc de alta afinidade ou que tem uma afinidade reduzida para um Receptor Fc.

[0060] Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma se- quência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. As regiões Fc humanas de sequência nativa incluem, por exemplo, uma região Fc de IgG1 humana de se- quência nativa (alotipos A e não A); uma região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; uma região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e uma região Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como vari- antes de ocorrência natural das mesmas.

[0061] Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere a partir de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, de prefe- rência uma ou mais substituição(ões) de aminoácidos. Preferencial- mente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de ami- noácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferencialmente de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante, neste documento, preferencialmente terá pelo me- nos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental e, mais preferen- cialmente, pelo menos cerca de 90% de homologia com as mesmas, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de homologia com as mesmas.

[0062] As sequências Fc variantes podem incluir três substituições de aminoácidos na região CH2 para reduzir a ligação de FcγRI nas po- sições de índice EU 234, 235 e 237 (ver Duncan et al., (1988) Nature 332: 563). Duas substituições de aminoácidos no sítio complementar de ligação de C1q nas posições de índice da EU 330 e 331 reduzem a fixação de complemento (ver Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) e

Canfield e Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)). A substituição em resíduos de IgG1 ou IgG2 humana nas posições 233-236 e resíduos de IgG4 nas posições 327, 330 e 331 reduz muito ADCC e CDC (ver, por exemplo, Armour KL. et al., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613-24; e Shi- elds RL. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604). A sequência de aminoácidos de IgG1 humana (UniProtKB No. P01857) é fornecida neste documento como SEQ ID NO: 26. A sequência de aminoácidos de IgG4 humana (UniProtKB No. P01861) é fornecida neste documento como a SEQ ID NO: 27. O IgG1 silenciado é descrito, por exemplo, em Boesch, AW, A.W., et al., “Highly parallel characterization of IgG Fc bin- ding interactions.” MAbs, 2014. 6(4): p. 915-27, cuja descrição é incor- porada neste documento por referência em sua totalidade.

[0063] Outras variantes de Fc são possíveis, incluindo, sem limita- ção, uma em que uma região capaz de formar uma ligação dissulfeto é deletada, ou na qual certos resíduos de aminoácidos são eliminados na extremidade N-terminal de um Fc nativo, ou um resíduo de metionina é adicionado a ele. Assim, em algumas modalidades, uma ou mais por- ções Fc de um composto de ligação podem compreender uma ou mais mutações na região de dobradiça para eliminar a ligação dissulfeto. Em ainda outra modalidade, a região de dobradiça de um Fc pode ser com- pletamente removida. Em ainda outra modalidade, um composto de li- gação pode compreender uma variante Fc.

[0064] Além disso, uma variante Fc pode ser construída para remo- ver ou reduzir substancialmente as funções efetoras por meio da subs- tituição (mutação), deleção ou adição de resíduos de aminoácidos para efetuar a ligação ao complemento ou ao receptor Fc. Por exemplo, e sem limitação, uma deleção pode ocorrer em um sítio de ligação ao complemento, como um sítio de ligação a C1q. As técnicas para a pre- paração de tais derivados de sequência do fragmento Fc de imunoglo- bulina são descritas nas Publicações de Patentes Internacionais WO

97/34631 e WO 96/32478. Além disso, o domínio Fc pode ser modifi- cado por fosforilação, sulfatação, acilação, glicosilação, metilação, far- nesilação, acetilação, amidação e similares.

[0065] O termo "anticorpo compreendendo a região Fc" refere-se a um anticorpo que compreende uma região Fc. A lisina do C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração da EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do anticorpo ou por manipulação recombinante do ácido nucleico que codifica o an- ticorpo. Consequentemente, um anticorpo com uma região Fc, de acordo com esta invenção, pode compreender um anticorpo com ou sem K447.

[0066] Aspectos da invenção incluem compostos de ligação com configurações multiespecíficas, que incluem, sem limitação, biespecí- fico, triespecífico, etc. Uma grande variedade de métodos e configura- ções de proteínas são conhecidos e usados em anticorpos monoclonais biespecíficos (BsMAB), anticorpos triespecíficos, etc.

[0067] Vários métodos para a produção de anticorpos artificiais mul- tivalentes foram desenvolvidos por fusão recombinante de domínios va- riáveis de dois ou mais anticorpos. Em algumas modalidades, um pri- meiro e um segundo domínio de ligação ao antígeno em um polipeptí- deo são conectados por peptídeo de ligação polipeptídico. Um exemplo não limitativo de tal peptídeo de ligação polipeptídico é um peptídeo de ligação GS, tendo uma sequência de aminoácidos de quatro resíduos de glicina, seguido por um resíduo de serina, e em que a sequência é repetida n vezes, em que n é um número inteiro variando de 1 a cerca de 10, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. Exemplos não limitativos de tais peptídeo de ligação incluem GGGGS (SEQ ID NO: 24) (n=1) e GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 25) (n=2). Outros ligantes adequados também podem ser usados e são descritos, por exemplo, em Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013, 15 de outubro; 65(10):1357-69, cuja des- crição é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[0068] O termo "molécula similar a anticorpo de cadeia três" ou "TCA" é usado neste documento para se referir a moléculas similares a anticorpo compreendendo, consistindo essencialmente em ou consis- tindo em três subunidades polipeptídicas, duas das quais compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo monoclonal, ou fragmentos funcionais de ligação ao antígeno de tais cadeias de anticorpo, compreendendo uma região de ligação ao antígeno e pelo menos um domínio CH. Este par cadeia pesada/cadeia leve tem especificidade de ligação a um pri- meiro antígeno. A terceira subunidade polipeptídica compreende, con- siste essencialmente em, ou consiste em um anticorpo apenas de ca- deia pesada compreendendo uma porção Fc compreendendo domínios CH2 e/ou CH3 e/ou CH4, na ausência de um domínio CH1, e um ou mais domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, uma única região variável de cadeia pesada (uma "configuração única"), ou dois domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, duas regiões variáveis de cadeia pesada única) em uma "configuração em tandem", em que os dois do- mínios de ligação ao antígeno estão ligados entre si por um sequência de peptídeo de ligação, conforme descrito acima) que se liga a um epí- topo de um segundo antígeno ou um epítopo diferente do primeiro antí- geno, em que tal domínio de ligação é derivado de ou tem identidade de sequência com a região variável de uma cadeia pesada ou leve de an- ticorpo. Partes de tal região variável podem ser codificadas por segmen- tos gênicos VH e/ou VL, segmentos gênicos D e JH ou segmentos gêni- cos JL. A região variável pode ser codificada pelos segmentos gênicos rearranjados VHDJH, VLDJH, VHJL, ou VLJL. Uma proteína de TCA faz uso de um anticorpo apenas de cadeia pesada, conforme definido neste do- cumento acima.

[0069] Um composto de ligação de TCA faz uso de um "anticorpo apenas de cadeia pesada" ou "anticorpo de cadeia pesada" ou "polipep- tídeo de cadeia pesada" que, como utilizado neste documento, significa um anticorpo de cadeia única compreendendo regiões constantes de cadeia pesada CH2 e/ou CH3 e/ou CH4, mas nenhum domínio de CH1. Em uma modalidade, o anticorpo de cadeia pesada é composto de um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, uma única região variável de cadeia pesada, em uma configuração única ou em tandem), pelo me- nos parte de uma região de dobradiça e domínios de CH2 e CH3.

[0070] Em outra modalidade, o anticorpo de cadeia pesada é com- posto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio de CH2. Em uma modalidade adicio- nal, o anticorpo de cadeia pesada é composto por um domínio de liga- ção ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio de CH3. Anticorpos de cadeia pesada nos quais o domínio CH2 e/ou CH3 é truncado também são incluídos neste documento. Em uma modalidade adicional, a cadeia pesada é composta de um domínio de ligação ao antígeno e pelo menos um domínio de CH (CH1, CH2, CH3, ou CH4), mas nenhuma região de dobradiça. O anticorpo apenas de cadeia pesada pode estar na forma de um dímero, no qual duas cadeias pesadas são ligadas por dissulfeto, de outra forma, covalentemente ou não covalentemente ligadas uma à outra, e podem opcionalmente incluir uma interface assimétrica entre dois ou mais dos domínios de CH para facilitar o emparelhamento adequado entre as cadeias polipeptídicas. O anticorpo apenas de cadeia pesada pode pertencer à subclasse IgG, mas os anticorpos pertencentes a outras subclasses, como as subclas- ses IgM, IgA, IgD e IgE, também estão incluídos neste documento. Em uma modalidade particular, o anticorpo de cadeia pesada é do subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, em particular do subtipo IgG1 ou subtipo lgG4.

Exemplos não limitativos de um composto de ligação a TCA são descri- tos, por exemplo, em WO2017/223111 e WO2018/052503, cujas divul- gações são incorporadas neste documento por referência em sua tota- lidade.

[0071] Os anticorpos de cadeia pesada constituem cerca de um quarto dos anticorpos IgG produzidos pelos camelídeos, por exemplo, camelos e lamas Hamers-Casterman C., et al. Nature. 363, 446-448 (1993)). Estes anticorpos são formados por duas cadeias pesadas, mas são desprovidos de cadeias leves. Como consequência, a parte variável de ligação ao antígeno é referida como o domínio de VHH e representa o menor sítio de ligação ao antígeno intacto de ocorrência natural, que é cerca de apenas 120 aminoácidos em comprimento (Desmyter, A., et al. J. Biol. Chem. 276, 26285-26290 (2001)). Os anticorpos de cadeia pesada com alta especificidade e afinidade podem ser gerados contra uma variedade de antígenos por meio de imunização (van der Linden, RH, et al. Biochim. Biophys. 1431, 37-46 (1999)), e a porção de VHH pode ser facilmente clonada e expressa em levedura (Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). Os seus níveis de expressão, so- lubilidade e estabilidade são significativamente mais elevados do que os dos fragmentos F(ab) ou Fv clássicos (Ghahroudi, MA et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)). Também foi demonstrado que os tubarões possuem um único domínio similar ao VH em seus anticorpos, denomi- nado VNAR. (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nut- tall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).

[0072] Os termos "CD19" e "cluster de diferenciação 19", conforme usados neste documento, referem-se a uma molécula expressa durante todas as fases do desenvolvimento de células B até a diferenciação ter- minal em células plasmáticas. O termo "CD19" inclui uma proteína CD19 de qualquer espécie animal humana e não humana e inclui especifica- mente CD19 humano, bem como CD19 de mamíferos não humanos.

[0073] O termo "CD19 humano", conforme usado neste documento, inclui quaisquer variantes, isoformas e espécies homólogas de CD19 humano (UniProt P15391), independentemente de sua fonte ou modo de preparação. Assim, "CD19 humano" inclui CD19 humano expresso naturalmente por células e CD19 expresso em células transfectadas com o gene CD19 humano.

[0074] Os termos "anticorpo apenas de cadeia pesada anti-CD19", "anticorpo apenas de cadeia pesada CD19", "anticorpo de cadeia pe- sada anti-CD19" e "anticorpo de cadeia pesada CD19" são usados neste documento indistintamente para se referir a um anticorpo apenas de cadeia pesada como definido acima neste documento, ligação imu- noespecificamente a CD19, incluindo CD19 humano, como definido acima neste documento. A definição inclui, sem limitação, anticorpos de cadeia pesada humana produzidos por animais transgênicos, tais como ratos transgênicos ou camundongos transgênicos que expressam imu- noglobulina humana, incluindo UniRatsTM produzindo anticorpos UniA- bTM humanos anti-CD19, como definido acima neste documento.

[0075] "Identidade de sequência de aminoácidos percentual (%)" em relação a uma sequência polipeptídica de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candi- data que é idêntica aos resíduos de aminoácidos na sequência polipep- tídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para atingir a identidade de sequência per- centual máxima, e não levando em consideração quaisquer substitui- ções conservativas como parte da identidade de sequência. O alinha- mento para fins de determinação do percentual de identidade da se- quência de aminoácidos pode ser atingido de muitas formas no estado da técnica, por exemplo, usando software de computador livre, tal como

BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para o alinha- mento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo sobre o comprimento total das sequências sendo comparadas. Para a finalidade deste documento, no entanto, os valores % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2.

[0076] Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os com- ponentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que in- terfeririam nos usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e po- dem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteicos ou não-pro- teicos. Em algumas modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) a mais de 95% em peso do anticorpo, conforme determinado pelo método de Lowry e, mais preferencialmente, mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna pela utilização de um sequencia- dor de copo giratório ou (3) à homogeneidade por SDS-PAGE sob con- dições de redução ou não-redução usando corante Coomassie azul ou, preferencialmente, prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes, visto que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[0077] Os anticorpos da invenção incluem anticorpos multiespecífi- cos. Os anticorpos multiespecíficos têm mais de uma especificidade de ligação. O termo "multiespecífico" inclui especificamente "biespecífico" e "triespecífico", bem como afinidades de ligação específicas indepen-

dentes de ordem superior, tais como especificidade poliepitópica de or- dem superior, bem como anticorpos tetravalentes e fragmentos de anti- corpos. Os termos "anticorpo multiespecífico", "anticorpo multiespecí- fico apenas de cadeia pesada", "anticorpo multiespecífico de cadeia pe- sada", "UniAbTM multiespecífico"e "composto de ligação multiespecífico" são usados neste documento na forma mais ampla e abrangem todos os anticorpos com mais de uma especificidade de ligação. Os anticorpos anti-CD19 de cadeia pesada multiespecíficos da presente invenção in- cluem especificamente anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um único epítopo em uma proteína CD19, como um CD19 humano, e a um epítopo em uma proteína diferente, como, por exemplo, uma pro- teína CD3 (isto é, bivalente e monoparatópica). Os anticorpos anti-CD19 de cadeia pesada multiespecíficos da presente invenção incluem espe- cificamente anticorpos que se ligam imunoespecificamente a dois ou mais epítopos não sobrepostos em uma proteína CD19, como um CD19 humano (isto é, bivalente e biparatópico). Os anticorpos anti-CD19 de cadeia pesada multiespecíficos da presente invenção também incluem especificamente anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo em uma proteína CD19, tal como CD19 humano e a um epítopo em uma proteína diferente, tal como, por exemplo, uma proteína CD3, como o CD3 humano (isto é, bivalente e biparatópico). Os anticorpos anti-CD19 de cadeia pesada multiespecíficos da presente invenção também incluem especificamente anticorpos que se ligam imunoespe- cificamente a dois ou mais epítopos não sobrepostos ou parcialmente sobrepostos em uma proteína CD19, como uma proteína CD19 humana, e a um epítopo em um diferente proteína, como, por exemplo, uma pro- teína CD3, como a proteína CD3 humana (isto é, trivalente e biparató- pica).

[0078] Os anticorpos da invenção incluem anticorpos monoespecí-

ficos, tendo uma especificidade de ligação. Os anticorpos monoespecí- ficos incluem especificamente anticorpos que compreendem uma única especificidade de ligação, bem como anticorpos que compreendem mais de uma unidade de ligação com a mesma especificidade de liga- ção. Os termos "anticorpo monoespecífico", "anticorpo monoespecífico apenas de cadeia pesada", "anticorpo monoespecífico de cadeia pe- sada" e "UniAbTM monoespecífico"; são usados neste documento no sentido mais amplo e abrangem todos os anticorpos com uma especifi- cidade de ligação. Os anticorpos anti-CD19 de cadeia pesada monoes- pecíficos da presente invenção incluem especificamente os anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo em uma proteína CD19, tal como um CD19 humano (monovalente e monoespecífico). Os anticorpos monoespecíficos anti-CD19 de cadeia pesada da presente invenção também incluem especificamente anticorpos com mais de uma unidade de ligação (por exemplo, anticorpos multivalentes) imuno- especificamente ligados a um epítopo em uma proteína CD19, tal como CD19 humano. Por exemplo, um anticorpo monoespecífico de acordo com as modalidades da invenção pode incluir uma região variável de cadeia pesada compreendendo dois domínios de ligação ao antígeno, em que cada domínio de ligação ao antígeno se liga ao mesmo epítopo em uma proteína CD19 (isto é, bivalente e monoespecífico).

[0079] Um "epítopo" é o local na superfície de uma molécula de an- tígeno ao qual uma única molécula de anticorpo se liga. Geralmente, um antígeno tem vários ou muitos epítopos diferentes e reage com muitos anticorpos diferentes. O termo inclui especificamente epítopos lineares e epítopos conformacionais.

[0080] “Mapeamento de epítopos” é o processo de identificação dos sítios de ligação ou epítopos de anticorpos em seus antígenos-alvo. Os epítopos de anticorpo podem ser epítopos lineares ou epítopos confor-

macionais. Os epítopos lineares são formados por uma sequência con- tínua de aminoácidos em uma proteína. Os epítopos conformacionais são formados por aminoácidos que são descontínuos na sequência pro- teica, mas que são reunidos mediante a dobragem da proteína na sua estrutura tridimensional.

[0081] "Especificidade poliepitópica" refere-se à capacidade de se ligar especificamente a dois ou mais epítopos diferentes no(s) mesmo(s) ou diferente(s) alvo(s). Conforme observado acima, a presente invenção inclui especificamente anticorpos de cadeia pesada anti-CD19 com es- pecificidades poliepitópicas, isto é, anticorpos de cadeia pesada anti- CD19 que se ligam a dois ou mais epítopos não sobrepostos em uma proteína CD19, como um CD19 humano. O termo "epítopo(s) não so- breposto(s)" ou "epítopo(s) não competitivo(s)" de um antígeno é defi- nido neste documento para significar epítopo(s) que são reconhecidos por um membro de um par de anticorpos específicos do antígeno, mas não o outro membro. Pares de anticorpos, ou regiões de ligação ao an- tígeno direcionadas ao mesmo antígeno em um anticorpo multiespecí- fico, que reconhecem epítopos não sobrepostos, não competem pela ligação a esse antígeno e são capazes de se ligar a esse antígeno si- multaneamente.

[0082] Um anticorpo se liga "essencialmente ao mesmo epítopo" como um anticorpo de referência, quando os dois anticorpos reconhe- cem epítopos idênticos ou estericamente sobrepostos. Os métodos mais amplamente usados e rápidos para determinar se dois epítopos se ligam a epítopos idênticos ou estericamente sobrepostos são ensaios de competição, que podem ser configurados em vários formatos dife- rentes, usando antígeno marcado ou anticorpo marcado. Normalmente, o antígeno é imobilizado em uma placa de 96 poços, e a capacidade dos anticorpos não marcados de bloquear a ligação dos anticorpos mar- cados é medida usando marcadores radioativos ou enzimáticos.

[0083] O termo "valente", tal como utilizado neste documento, re- fere-se a um número específico de sítios de ligação em uma molécula de anticorpo.

[0084] Um anticorpo "monovalente" tem um sítio de ligação. Assim, um anticorpo monovalente também é monoespecífico.

[0085] Um anticorpo “multivalente” possui dois ou mais sítios de li- gação. Assim, os termos "bivalente", "trivalente" e "tetravalente" refe- rem-se à presença de dois sítios de ligação, três sítios de ligação e qua- tro sítios de ligação, respectivamente. Assim, um anticorpo biespecífico, de acordo com a invenção, é pelo menos bivalente e pode ser trivalente, tetravalente ou de outra forma multivalente. Um anticorpo bivalente, de acordo com modalidades da invenção, pode ter dois sítios de ligação para o mesmo epítopo (ou seja, bivalente, monoparatópico), ou para dois epítopos diferentes (ou seja, bivalente, biparatópico).

[0086] Uma grande variedade de métodos e configurações de pro- teínas são conhecidos e usados para a preparação de anticorpos mo- noclonais biespecíficos (BsMAB), anticorpos tri-específicos e similares.

[0087] O termo "molécula similar a anticorpo de três cadeias bies- pecífico" ou "TCA" é utilizado neste documento para fazer referência a moléculas similares a anticorpos compreendendo, consistindo essenci- almente em ou consistindo em três subunidades polipeptídicas, duas das quais compreendem, consistem essencialmente em ou consistem em uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo monoclonal ou fragmentos funcionais de ligação ao antígeno de tais cadeias de an- ticorpo, compreendendo uma região de ligação ao antígeno e pelo me- nos um domínio de CH. Este par cadeia pesada/cadeia leve tem espe- cificidade de ligação a um primeiro antígeno. A terceira subunidade po- lipeptídica compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um anticorpo apenas de cadeia pesada compreendendo uma porção Fc compreendendo domínios de CH2 e/ou CH3 e/ou CH4, na ausência de um domínio de CH1, e um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de um segundo antígeno, ou um epítopo diferente do pri- meiro antígeno, em que tal domínio de ligação é derivado de ou tem identidade de sequência com a região variável de uma cadeia pesada ou leve do anticorpo. Partes de tal região variável podem ser codificadas por segmentos gênicos VH e/ou VL, segmentos gênicos D e JH ou seg- mentos gênicos JL. A região variável pode ser codificada por segmentos gênicos rearranjados VHDJH, VLDJH, VHJL ou VLJL. Uma proteína de TCA faz uso de um anticorpo apenas de cadeia pesada, conforme definido neste documento acima.

[0088] O termo "receptor de antígeno quimérico" ou "CAR" é usado neste documento no sentido mais amplo para se referir a um receptor manipulado, que enxerta uma especificidade de ligação desejada (por exemplo, a região de ligação ao antígeno de um anticorpo monoclonal ou outro ligante) à membrana abrangendo e domínios de sinalização intracelular. Normalmente, o receptor é usado para enxertar a especifi- cidade de um anticorpo monoclonal em uma célula T para criar um re- ceptor de antígeno quimérico (CAR). (Dai et al., J Natl Cancer Inst, 2016; 108(7): djv439; e Jackson et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 2016; 13:370-383).

[0089] O termo "anticorpo humano" é usado neste documento para incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas a partir das sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos, neste documento, podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da li- nhagem germinativa humana, por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do in vitro ou por mutação somática in vivo. O termo "anticorpo humano" inclui especificamente anticorpos apenas de cadeia pesada com sequências de região variável de cadeia pesada humana, produzidas por animais transgênicos, como ratos ou camundongos transgênicos, em particular UniAbsTM produzido por Uni- RatsTM, conforme definido acima.

[0090] Por um "anticorpo quimérico" ou uma "imunoglobulina qui- mérica" entende-se uma molécula de imunoglobulina compreendendo sequências de aminoácidos a partir de pelo menos dois loci de Ig dife- rentes, por exemplo, um anticorpo transgênico compreendendo uma porção codificada por um lócus de Ig humano e uma porção codificada por um lócus de Ig de rato. Os anticorpos quiméricos incluem anticorpos transgênicos com regiões Fc não humanas ou regiões Fc artificiais e idiotipos humanos. Essas imunoglobulinas podem ser isoladas de ani- mais da invenção que foram manipulados para produzir tais anticorpos quiméricos.

[0091] Conforme usado neste documento, o termo "célula efetora" refere-se a uma célula imune que está envolvida na fase efetora de uma resposta imune, em oposição às fases cognitivas e de ativação de uma resposta imune. Algumas células efetoras expressam receptores Fc es- pecíficos e realizam funções imunológicas específicas. Em algumas mo- dalidades, uma célula efetora, como uma célula assassina natural, é ca- paz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Por exemplo, monócitos e macrófagos, que expressam FcR, estão en- volvidos na morte específica de células-alvo e na apresentação de antí- genos a outros componentes do sistema imunológico, ou na ligação a células que apresentam antígenos. Em algumas modalidades, uma cé- lula efetora pode fagocitar um antígeno alvo ou célula alvo.

[0092] “Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam receptores, como receptores de células T ou FcRs, e desempenham funções efetoras. Preferivelmente, as células expressam pelo menos FcγRIII e executam a função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; sendo as células NK as preferidas. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa das mesmas, por exemplo, de sangue ou PBMC, tal como des- crito neste documento.

[0093] O termo "célula imune" é usado neste documento no sentido mais amplo, incluindo, sem limitação, células de origem mieloide ou lin- foide, por exemplo, linfócitos (tais como células B e células T incluindo células T citolíticas (CTLs)), células assassinas, células assassinas na- turais (NK), macrófagos, monócitos, eosinófilos, células polimorfonucle- ares, como neutrófilos, granulócitos, mastócitos e basófilos.

[0094] “Funções efetoras” de anticorpos referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras do anticorpo incluem a ligação de C1q, a citotoxicidade dependente de complemento; a ligação do receptor de Fc; a citotoxicidade mediata por célula dependente de anticorpo (ADCC); a fagocitose; a regulação negativa dos receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc.

[0095] "Citotoxicidade mediada por células dependente de anti- corpo" e "ADCC" referem-se a uma reação mediada por células na qual as células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcR) (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos e ma- crófagos) reconhecem o anticorpo ligado a uma célula alvo e subse- quentemente causam a lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam FcγRIII apenas, enquanto que monócitos expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio ADCC in vitro pode ser realizado, tal como descrito na Patente US 5.500.362 ou

5.821.337. As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassinas na- turais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

[0096] "Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" re- fere-se à capacidade de uma molécula de lisar um alvo na presença de complemento. A via de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma mo- lécula (por exemplo um anticorpo) complexado com um antígeno cog- nato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Me- thods 202:163 (1996), pode ser realizado.

[0097] “Afinidade de ligação” refere-se à força da soma total de in- terações não-covalentes entre um único sítio de ligação de uma molé- cula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, como usado neste documento, "afinidade de ligação" se refere à afinidade de ligação in- trínseca que reflete uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molé- cula X com seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela cons- tante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica. Os anticorpos de baixa afinidade geral- mente se ligam ao antígeno lentamente e tendem a se dissociar facil- mente, enquanto os anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam ao antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer ligados.

[0098] Tal como utilizado neste documento, o "Kd" ou "valor Kd" re- fere-se a uma constante de dissociação determinada por Interferometria BioLayer, usando um instrumento Octet QK384 (Fortebio Inc., Menlo

Park, CA) no modo cinético. Por exemplo, os sensores Fc anticamun- dongo são carregados com antígeno fundido com Fc de camundongo e, em seguida, mergulhados em poços contendo anticorpos para medir as taxas de associação dependente da concentração (kon). As taxas de dissociação de anticorpos (koff) são medidas na etapa final, onde os sensores são mergulhados em poços contendo apenas tampão. O Kd é a razão de koff/kon. (Para obter mais detalhes, ver Concepcion, J, et al., Comb Chem High Throughput Screen, 12(8), 791-800, 2009).

[0099] Os termos "tratamento" e "tratando" e similares são usados neste documento para geralmente significar a obtenção do efeito farma- cológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em ter- mos de prevenção completa ou parcial de uma doença ou um sintoma do mesmo e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuído à doença. "Tra- tamento", conforme usado neste documento, abrange qualquer trata- mento de uma doença em um mamífero, e inclui: (a) prevenir que a do- ença ocorra em um sujeito que possa ser predisposto à doença, mas que ainda não tenha sido diagnosticado como a tendo; (b) inibir a do- ença, isto é, interromper o seu desenvolvimento; ou (c) aliviar a doença, isto é, causar a regressão da doença. O agente terapêutico pode ser administrado antes, durante ou após a aparição da doença ou lesão. O tratamento da doença em curso, em que o tratamento estabiliza ou re- duz os sintomas clínicos indesejáveis do paciente, é de particular inte- resse. Tal tratamento é desejavelmente realizado antes da completa perda de função nos tecidos afetados. A terapia em questão pode ser administrada durante a fase sintomática da doença e, em alguns casos, após a fase sintomática da doença.

[0100] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é destinada a uma quantidade de agente ativo que é necessária para transmitir bene-

fício terapêutico a um sujeito. Por exemplo, uma "quantidade terapeuti- camente eficaz" é uma quantidade que induz, melhora ou de outra forma causa uma melhora nos sintomas patológicos, progressão da doença ou condições fisiológicas associadas a uma doença ou que melhora a resistência a um distúrbio.

[0101] Os termos "neoplasias de células B" ou "neoplasias de célu- las B maduras" no contexto da presente invenção incluem, mas não es- tão limitados a, todas as leucemias linfoides e linfomas, leucemia linfo- cítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia prolinfocítica, leu- cemia linfoblástica precursora B, leucemia de células ciliadas, linfoma linfocítico pequeno, linfoma prolinfocítico de células B, leucemia linfocí- tica crônica de células B, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), mieloma múltiplo, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de zona marginal esplênica, neoplasias de células plasmáticas, como mieloma de células plasmáti- cas, plasmocitoma, doença de deposição de imunoglobulina monoclo- nal, doença da cadeia pesada, linfoma MALT, linfoma nodal marginal de células B, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de efusão primária, linfomatoide granulomatose Linfoma não-Hodgkins, linfoma de Hodgkins, leucemia de células ciliadas, linfoma primário de efusão e lin- foma não Hodgkins relacionado à AIDS.

[0102] O termo "caracterizado pela expressão de CD19" refere-se amplamente a qualquer doença ou distúrbio em que a expressão de CD19 está associada ou envolvida com um ou mais processos patoló- gicos que são característicos da doença ou distúrbio. Tais distúrbios in- cluem, mas não estão limitados a neoplasias de células B.

[0103] Os termos “sujeito”, “indivíduo” e “paciente” são usados neste documento indistintamente para se referir a um mamífero sendo avaliado para tratamento e/ou sendo tratado. Em uma modalidade, o mamífero é um ser humano. Os termos “sujeito”, “indivíduo” e “paciente”

abrangem, sem limitação, indivíduos com câncer, indivíduos com doen- ças autoimunes, com infecções por patógenos e similares. Os sujeitos podem ser humanos, mas também incluem outros mamíferos, particu- larmente aqueles mamíferos úteis como modelos de laboratório para doenças humanas, por exemplo: camundongo, rato, etc.

[0104] O termo "formulação farmacêutica" se refere a uma prepara- ção cuja forma permite que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que sejam ina- ceitavelmente tóxicos a um sujeito ao qual a formulação seria adminis- trada. Essas formulações são estéreis. Excipientes "farmaceuticamente aceitáveis" (veículos, aditivos) são aqueles que podem ser razoavel- mente administrados a um sujeito mamífero para fornecer uma dose efi- caz do ingrediente ativo usado.

[0105] Uma formulação "estéril" é asséptica ou livre, ou essencial- mente livre, de todos os micro-organismos que vivem e seus esporos. Uma formulação “congelada” é aquela a uma temperatura abaixo de 0ºC.

[0106] Uma formulação "estável" é aquela na qual a proteína man- tém essencialmente a sua estabilidade física e/ou a estabilidade quí- mica e/ou a atividade biológica mediante o armazenamento. De prefe- rência, a formulação retém essencialmente a sua estabilidade física e química, bem como a sua atividade biológica mediante o armazena- mento. O período de armazenamento é geralmente selecionado com base na vida em prateleira pretendida da formulação. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade da proteína estão disponíveis na técnica e são revistas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301. Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones. A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90) (1993), por exemplo. A estabilidade pode ser medida em uma temperatura selecionada durante um período de tempo selecionado. A estabilidade pode ser avaliada qualitativamente e/ou quantitativamente em uma variedade de maneiras diferentes, incluindo avaliação da formação de agregados (por exemplo, usando cromatografia de exclusão de tamanho, medindo a turbidez e/ou por inspeção visual); avaliando a heterogeneidade de carga usando cro- matografia de troca catiônica, focagem isoelétrica capilar de imagem (icIEF) ou eletroforese de zona capilar; análise de sequência amino-ter- minal ou carboxi-terminal; análise espectrométrica de massa; análise SDS-PAGE para comparar o anticorpo reduzido e intacto; análise de mapa de peptídeos (por exemplo, tríptico ou LYS-C); avaliar a atividade biológica ou função de ligação ao antígeno do anticorpo; etc. A instabi- lidade pode envolver qualquer um ou mais de: agregação, desamidação (por exemplo, desamidação Asn), oxidação (por exemplo, oxidação de Met), isomerização (por exemplo, isomeriação Asp), corte/hidrólise/fra- gmentação (por exemplo, fragmentação da região de dobradiça), forma- ção de succinimida, cisteína(s) não pareada(s), extensão N-terminal, processamento C-terminal, diferenças de glicosilação, etc. II. Descrição Detalhada Anticorpos Anti-CD19

[0107] A presente invenção fornece uma família de anticorpos ape- nas de cadeia pesada intimamente relacionados que se ligam ao CD19 humano. Os anticorpos desta família compreendem um conjunto de se- quências de CDR, conforme definido neste documento, e mostrado na Figura 1, e são exemplificados pelas sequências da região variável da cadeia pesada (VH) fornecidas de SEQ ID NOs: 14 a 21 apresentadas na Figura 2. As famílias de anticorpos fornecem uma série de benefícios que contribuem para a utilidade como agente(s) clinicamente terapêu- tico(s). Os anticorpos incluem membros com uma faixa de afinidades de ligação, permitindo a seleção de uma sequência específica com uma afinidade de ligação desejada.

[0108] Um anticorpo adequado pode ser selecionado a partir daque-

les fornecidos neste documento para o desenvolvimento e uso terapêu- tico ou outro, incluindo, sem limitação, o uso como um anticorpo bies- pecífico, por exemplo, como mostrado na Figura 5B, ou anticorpo tri- específico, ou parte de uma estrutura CAR-T.

[0109] A determinação da afinidade para uma proteína candidata pode ser realizada usando métodos conhecidos na técnica, tais como medições Biacore. Membros da família de anticorpos podem ter uma afinidade para CD19 com um Kd de cerca de 10-6 a cerca de 10-11, in- cluindo sem limitação: a partir de cerca de 10-6 a partir de cerca de 10- 10 ; a partir de cerca de 10-6 a partir de cerca de10-9; a partir de cerca de 10-6 a partir de cerca de 10-8; a partir de cerca de 10-8 a partir de cerca de 10-11; a partir de cerca de 10-8 a partir de cerca de 10-10; a partir de cerca de 10-8 a partir de cerca de 10-9; a partir de cerca de 10-9 a partir de cerca de 10-11; a partir de cerca de 10-9 a partir de cerca de 10-10; ou qualquer outro valor dentro dessas faixas. A seleção de afinidade pode ser confirmada com uma avaliação biológica para modular, por exemplo, bloquear uma atividade biológica de CD19, incluindo in vitro, modelos pré-clínicos e triagens clínicas, bem como avaliação de toxicidade po- tencial.

[0110] Os membros da família de anticorpos neste documento não apresentam reatividade cruzada com a proteína CD19 do macaco Cyno- molgus, mas podem ser manipulados para fornecer reatividade cruzada com a proteína CD19 do macaco Cynomolgus ou com o CD19 de qual- quer outra espécie animal, se desejado.

[0111] A família de anticorpos específicos para CD19, neste docu- mento, compreende um domínio de VH, compreendendo as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 em um framework de VH humana. As sequên- cias de CDR podem estar situadas, por exemplo, na região em torno dos resíduos de aminoácidos 26-35; 53-59; e 98-117 quanto às CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, do conjunto de sequências de região variável exemplificativas apresentadas na SEQ ID NO: 14 a 21. Será entendido por aqueles de conhecimento comum à técnica que as se- quências de CDR podem estar em posições diferentes se uma sequên- cia de framework diferente for selecionada, embora geralmente a ordem das sequências permaneça a mesma.

[0112] As sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 dos anticorpos anti- CD19 da presente invenção podem ser englobadas pelas seguintes fór- mulas estruturais, onde um X indica um aminoácido variável, que pode ser qualquer um dos aminoácidos específicos indicados abaixo. CDR1 G F X1 F S X2 X3 W (SEQ ID NO: 22) em que X1 é T ou S; X2 é S ou N; e X3 é Y ou F. CDR2 X4 X5 X6 X7 G S X8 X9 (SEQ ID NO: 23) em que X4 é I ou M; X5 é N, S ou K; X6 é Q ou K; X7 é D ou A; X8 é D ou E; e X9 é K ou E. CDR3 ASGVYSFDY (SEQ ID NO: 13)

[0113] As sequências representativas de CDR1, CDR2 e CDR3 são mostradas na Figura 1 e Figura 3.

[0114] Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada anti-CD19 da invenção compreende uma sequência CDR1 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-6. Em uma modalidade particular, a sequência CDR1 é SEQ ID NO: 4.

[0115] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD19 apenas de cadeia pesada da invenção compreende uma sequência de CDR2 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-12. Em uma modalidade particular, a sequência CDR2 é SEQ ID NO: 10.

[0116] Os anticorpos apenas de cadeia pesada anti-CD19 da inven- ção compreendem uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13.

[0117] Em uma outra modalidade, um anticorpo apenas de cadeia pesada anti-CD19 da invenção compreende a sequência CDR1 de SEQ ID NO: 4; a sequência CDR2 da SEQ ID NO: 10; e a sequência CDR3 de SEQ ID NO: 13.

[0118] Em outras modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pe- sada anti-CD19 da invenção compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NOs: 14 a 21 (Figura 2).

[0119] Ainda em uma modalidade adicional, um anticorpo apenas de cadeia pesada anti-CD19 da presente invenção compreende a se- quência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 17.

[0120] Em algumas modalidades, uma sequência de CDR em um anticorpo apenas de cadeia pesada anti-CD19 da invenção compreende uma ou duas substituições de aminoácidos em relação a uma sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 ou conjunto de sequências CDR1, CDR2 e CDR3 em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 13 (Figura 1). Em algu- mas modalidades, os anticorpos de cadeia pesada anti-CD19, neste do- cumento, compreenderão uma sequência de região variável de cadeia pesada com pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 98% de iden- tidade ou pelo menos pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das sequências da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NOs: 14 a 21 (mostrado na Figura 2).

[0121] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos biespe- cíficos ou multiespecíficos, que podem ter qualquer uma das configura- ções discutidas neste documento, incluindo, sem limitação, uma molé- cula similar a um anticorpo biespecífico de três cadeias. Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico pode compreender pelo menos uma região variável de cadeia pesada com especificidade de ligação para CD19, e pelo menos uma região variável de cadeia pesada com especificidade de ligação para uma proteína diferente de CD19. Em al- gumas modalidades, um anticorpo biespecífico pode compreender um par de cadeia pesada/cadeia leve que tem especificidade de ligação para um primeiro antígeno e uma cadeia pesada de um anticorpo ape- nas de cadeia pesada, compreendendo uma porção Fc que compre- ende os domínios de CH2 e/ou CH3 e/ou CH4, na ausência de um do- mínio de CH1, e um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de um segundo antígeno ou a um epítopo diferente do primeiro antígeno. Em uma modalidade particular, um anticorpo biespecífico compreende um par de cadeia pesada/cadeia leve que tem especifici- dade de ligação para um antígeno em uma célula efetora (por exemplo, uma proteína CD3 em uma célula T) e uma cadeia pesada de um anti- corpo apenas de cadeia pesada compreendendo um domínio de ligação ao antígeno que tem especificidade de ligação ao CD19.

[0122] Em algumas modalidades, onde uma proteína da invenção é um anticorpo biespecífico, um braço do anticorpo (uma fração de liga- ção) é específico para o CD19 humano, enquanto o outro braço pode ser específico para as células alvo, antígenos associados a tumor, antí- genos alvo, por exemplo, integrinas, etc., antígenos de patógenos, pro- teínas de checkpoint e similares. As células alvo incluem especifica- mente células cancerígenas, incluindo, sem limitação, células de tumo- res hematológicos, por exemplo, tumores de células B, como discutido abaixo.

[0123] Em algumas modalidades, uma proteína da invenção com- preende qualquer uma das sequências da região Fc fornecidas abaixo, que correspondem a IgG1 humana de sequência nativa, IgG4 humana de sequência nativa, IgG1 humana de sequência variante que foi proje- tada para reduzir uma ou mais funções efetoras, e a sequência variante de IgG4 humana que foi projetada para reduzir uma ou mais funções efetoras.

[0124] Tabela 1: Sequências da região Fc de IgG1 e IgG4 humana. IgG1 humana ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS- (UniProtNo. P01857) LSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKN- QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 26) IgG4 humana ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS- (UniProt nº P01861) LSSVVTVPSSSLGTKT YTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSV FLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNS-

TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN-

GQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK: (SEQ ID NO: 27) IgG1 humana com mutação de ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- silenciamento (região Fc) VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS-

TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 28) IgG4 humana com mutação de ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- silenciamento (região Fc) VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS-

TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 29)

[0125] Vários formatos de anticorpos biespecíficos estão dentro do âmbito da invenção, incluindo, sem limitação, polipeptídeos de cadeia única, polipeptídeos de cadeia dupla, polipeptídeos de cadeia tripla, po- lipeptídeos de cadeia quádrupla e múltiplos dos mesmos. Os anticorpos biespecíficos neste documento incluem especificamente anticorpos bi- específicos de células T que se ligam a CD19, que é expresso seletiva- mente em células B maduras, e CD3 (anticorpos anti-CD19 x anti-CD3).

Esses anticorpos induzem a morte mediada por células T para assassi- nar as células que expressam CD19. Preparação de anticorpos anti-CD19 de cadeia pesada

[0126] Os anticorpos de cadeia pesada da presente invenção po- dem ser preparados por métodos conhecidos na técnica. Em uma mo- dalidade preferencial, os anticorpos de cadeia pesada neste documento são produzidos por animais transgênicos, incluindo camundongos e ra- tos transgênicos, preferencialmente ratos, nos quais os genes da imu- noglobulina endógena são nocauteados ou desativados. Em uma mo- dalidade preferencial, os anticorpos de cadeia pesada neste documento são produzidos em UniRat™. O UniRat™ tem seus genes de imunoglo- bulina endógena silenciados e usa um translócus de cadeia pesada de imunoglobulina humana para expressar um repertório diversificado e naturalmente otimizado de HCAbs totalmente humanos. Enquanto os loci de imunoglobulina endógena em ratos podem ser nocauteados ou silenciados usando uma variedade de tecnologias, em UniRat™, a tec- nologia de dedo de zinco (endo)nuclease (ZNF) foi usada para inativar o lócus J de cadeia pesada de rato endógeno, lócus Cκ de cadeia leve e lócus Cλ de cadeia leve. Os construtos ZNF para microinjeção em oócitos podem produzir linhas de IgH e IgL de nocaute (KO). Para obter detalhes, ver, por exemplo, Geurts et al., 2009, Science 325:433. A ca- racterização de ratos nocaute de cadeia pesada de Ig foi relatada por Menoret et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40: 2932-2941. As vantagens da tecnologia ZNF são que a união final não homóloga para silenciar um gene ou lócus por meio de deleções de até vários kb também pode for- necer um sítio alvo para integração homóloga (Cui et al., 2011, Nat Bio- technol 29:64-67). Os anticorpos de cadeia pesada humana produzidos em UniRat ™ são chamados de UniAbsTM e podem se ligar a epítopos que não podem ser atacados com anticorpos convencionais. Sua alta especificidade, afinidade e tamanho pequeno os tornam ideais para apli- cações mono e poliespecíficas.

[0127] Além de UniAbsTM, especificamente incluídos neste docu- mento, estão os anticorpos apenas de cadeia pesada sem o framework VHH de camelídeo e mutações e suas regiões de VH funcionais. Tais anticorpos apenas de cadeia pesada podem, por exemplo, ser produzi- dos em ratos ou camundongos transgênicos que compreendem loci de genes apenas de cadeia pesada totalmente humanos, conforme des- crito, por exemplo, em WO2006/008548, mas outros mamíferos trans- gênicos, como coelho, porquinho-da-índia, rato também podem ser usa- dos, ratos e camundongos sendo preferenciais. Os anticorpos de cadeia pesada apenas, incluindo seus fragmentos funcionais VHH ou VH, tam- bém podem ser produzidos por tecnologia de DNA recombinante, pela expressão do ácido nucleico codificador em um hospedeiro eucariótico ou procariótico adequado, incluindo, por exemplo, células de mamíferos (por exemplo, células CHO), E. coli ou levedura.

[0128] Os domínios de anticorpos apenas de cadeia pesada combi- nam vantagens de anticorpos e fármacos de moléculas pequenas: po- dem ser monovalentes ou multivalentes; têm baixa toxicidade; e são de fabricação econômica. Devido ao seu pequeno tamanho, esses domí- nios são fáceis de administrar, incluindo administração oral ou tópica, são caracterizados por alta estabilidade, incluindo estabilidade gastroi- ntestinal; e sua meia-vida pode ser ajustada para o uso ou indicação desejada. Além disso, os domínios VH e VHH dos HCAbs podem ser fabricados de maneira econômica.

[0129] Em uma modalidade particular, os anticorpos de cadeia pe- sada da presente invenção, incluindo UniAbsTM, têm o resíduo de ami- noácido nativo na primeira posição da região FR4 (posição de aminoá- cido 101, de acordo com o sistema de numeração de Kabat), substituído por outro resíduo de aminoácido que é capaz de interromper um em- plastro hidrofóbico exposto à superfície que compreende ou está asso- ciado ao resíduo de aminoácido nativo dessa posição. Tais emplastros hidrofóbicos são normalmente enterrados na interface com a região constante da cadeia leve do anticorpo, mas tornam-se expostas à su- perfície em HCAbs e são, pelo menos parcialmente, para a agregação indesejada e associação de cadeia leve de HCAbs. O resíduo de ami- noácido substituído preferencial é carregado, e mais preferencialmente é carregado positivamente, tal como lisina (Lys, K), arginina (Arg, R) ou histidina (His, H), preferencialmente arginina (R). Em uma modalidade preferencial, os anticorpos apenas de cadeia pesada derivados de ani- mais transgênicos contêm uma mutação Trp para Arg na posição 101. Os HCAbs resultantes têm de preferência elevada afinidade de ligação ao antígeno e solubilidade em condições fisiológicas na ausência de agregação.

[0130] Como parte da presente invenção, os anticorpos IgG anti- CD19 de cadeia pesada humana com sequências únicas de animais UniRatTM (UniAbTM) foram identificados que se ligam a CD19 humano em ensaios de proteína e ligação celular ELISA (domínio extracelular de CD19 recombinante). As sequências da região variável da cadeia pe- sada (VH) identificadas (ver Figura 2) são positivas para a ligação da proteína CD19 humana e/ou para a ligação às células CD19+, e são todas negativas para a ligação às células que não expressam CD19.

[0131] Os anticorpos descritos neste documento ligam-se às linha- gens celulares Daudi de linfoma de Burkitt CD19-positivas (ATCC® CCL-213TM), Raji (ATCC® CCL-86 ™) e Ramos (ATCC® CRL-1596 ™), e alguns apresentam reação cruzada com a proteína CD19 de macaco Cynomolgus. Além disso, eles podem ser projetados para fornecer rea- tividade cruzada com a proteína CD19 de qualquer espécie animal, se desejado.

[0132] Os anticorpos de cadeia pesada anti-CD19, tais como UniA- bsTM neste documento podem ter afinidade para o CD19 com um Kd de cerca de 10-6 a cerca de 10-11, incluindo, mas sem limitação: de cerca de 10-6 a cerca de 10-10; a cerca de 10-6 a cerca de 10-9; a cerca de 10-6 a cerca de 10-8; a cerca de 10-8 a cerca de 10-11; a cerca de 10-8 a cerca de 10-10; a cerca de 10-8 a cerca de 10-9; a cerca de 10-9 a cerca de 10- 11 ; a cerca de 10-9 a cerca de 10-10; ou qualquer valor dentro dessas faixas. A seleção de afinidade pode ser confirmada com uma avaliação biológica para modular, por exemplo, bloquear, uma atividade biológica de CD19, incluindo ensaios in vitro, modelos pré-clínicos e ensaios clí- nicos, bem como a avaliação de toxicidade potencial.

[0133] Os anticorpos de cadeia pesada que se ligam a epítopos não sobrepostos em uma proteína CD19, por exemplo, UniAbsTM podem ser identificados por ensaios de ligação de competição, como imunoensaios ligados a enzima (ensaios ELISA) ou ensaios de citometria de fluxo competitivo. Por exemplo, pode-se usar competição entre anticorpos co- nhecidos que se ligam ao antígeno alvo e o anticorpo de interesse. Usando esta abordagem, pode-se dividir um conjunto de anticorpos en- tre aqueles que competem com o anticorpo de referência e aqueles que não o fazem. Os anticorpos não competidores são identificados como se ligando a um epítopo distinto que não se sobrepõe ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência. Frequentemente, um anticorpo é imobili- zado, o antígeno é ligado e um segundo anticorpo marcado (por exem- plo, biotinilado) é testado em um ensaio ELISA quanto à capacidade de se ligar ao antígeno capturado. Isso também pode ser realizado usando plataformas de ressonância de plasmon de superfície (SPR), incluindo ProteOn XPR36 (BioRad, Inc), Biacore 2000 e Biacore T200 (GE Heal- thcare Life Sciences) e gerador de imagens MX96 SPR (Ibis technolo- gies BV), bem como em plataformas de interferometria de biocamada, como Octet Red384 e Octet HTX (ForteBio, Pall Inc). Para obter mais detalhes, ver os exemplos neste documento.

[0134] Normalmente, um anticorpo "compete" com um anticorpo de referência se causar cerca de 15-100% de redução na ligação do anti- corpo de referência ao antígeno alvo, conforme determinado por técni- cas padrão, como pelos ensaios de ligação de competição descritos acima. Em várias modalidades, a inibição relativa é de pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50% pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou mais. Composições farmacêuticas, usos e métodos de tratamento

[0135] É outro aspecto da presente invenção fornecer composições farmacêuticas compreendendo um ou mais anticorpos da presente in- venção em mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável ade- quado. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis, como utilizados neste documento, são exemplificados, mas não limitados a adjuvantes, carreadores sólidos, água, tampões, ou outros carreadores utilizados na técnica para conter componentes terapêuticos ou combinações dos mesmos.

[0136] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica com- preende um anticorpo de cadeia pesada (por exemplo, UniAbTM) que se liga a CD19. Em outra modalidade, uma composição farmacêutica com- preende um anticorpo de cadeia pesada multiespecífico (incluindo bies- pecífico) (por exemplo, UniAbTM) com especificidade de ligação para dois ou mais epítopos não sobrepostos em uma proteína CD19. Em uma modalidade preferencial, uma composição farmacêutica compreende um anticorpo de cadeia pesada multiespecífico (incluindo biespecífico)

(por exemplo, UniAbTM) com especificidade de ligação a CD19 e com especificidade de ligação a um alvo de ligação em uma célula efetora (por exemplo, um alvo de ligação em uma célula T, como, por exemplo, uma proteína CD3 em uma célula T).

[0137] As composições farmacêuticas dos anticorpos usados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento misturando proteínas com o grau de pureza desejado com carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edição, Osol, A. Ed. (1980)), tal como na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os carreadores, excipientes ou estabilizadores acei- táveis são não tóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros áci- dos orgânicos; antioxidantes, incluindo o ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como o cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; clo- reto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fe- nol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou pro- pil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polí- meros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como a glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossa- carídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, ma- nose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou surfactantes não-iônicos, tais como TWEEN™, PLU- RONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

[0138] As composições farmacêuticas para administração parente-

ral são, de preferência, estéreis e substancialmente isotônicas e fabri- cadas sob condições de Boas Práticas de Fabricação (GMP). As com- posições farmacêuticas podem ser fornecidas na forma de dosagem unitária (isto é, a dose para uma administração única). A formulação depende da via de administração escolhida. Os anticorpos neste docu- mento podem ser administrados por injeção intravenosa ou infusão ou por via subcutânea. Para administração por injeção, os anticorpos da presente invenção podem ser formulados em soluções aquosas, de pre- ferência em tampões fisiologicamente compatíveis para reduzir o des- conforto no sítio da injeção. A solução pode conter carreadores, excipi- entes ou estabilizantes como discutido acima. Alternativamente, os an- ticorpos podem estar na forma liofilizada para constituição com um veí- culo adequado, por exemplo água estéril isenta de pirogênios, antes da utilização.

[0139] As formulações de anticorpos são descritas, por exemplo, na Patente US 9.034.324. Formulações similares podem ser usadas para os anticorpos de cadeia pesada, incluindo UniAbsTM, da presente inven- ção. As formulações de anticorpos subcutâneos são descritas, por exemplo, em US20160355591 e US20160166689. Métodos de utilização

[0140] Os anticorpos anti-CD19 apenas de cadeia pesada, anticor- pos multiespecíficos e composições farmacêuticas descritos neste do- cumento podem ser usados para o tratamento de doenças e condições caracterizadas pela expressão de CD19, incluindo, sem limitação, as condições e doenças descritas neste documento.

[0141] O CD19 é um receptor da superfície celular expresso em to- das as células B humanas, mas não é encontrado nas células plasmá- ticas. Possui uma cauda citoplasmática relativamente grande, com 240 aminoácidos. Os domínios extracelulares similares a Ig são divididos por um domínio potencial não similar a Ig ligado por dissulfeto e sítios de adição de carboidratos ligados a N. A cauda citoplasmática contém pelo menos nove resíduos de tirosina perto do C-terminal, alguns dos quais foram mostrados como fosforilados. Junto com o CD20 e o CD22, a ex- pressão restrita de CD19 à linhagem de células B o torna um alvo atra- ente para o tratamento terapêutico de malignidades de células B. Devido à sua expressão observada em várias doenças hematológicas, o CD19 é um alvo promissor para a terapia baseada em anticorpos.

[0142] Em um aspecto, os anticorpos de cadeia pesada de CD19 (por exemplo, UniAbsTM) e composições farmacêuticas neste docu- mento podem ser usados para tratar malignidades hematológicas ca- racterizadas pela expressão de CD19, incluindo, sem limitação, linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocílica crônica de células B (CLL) e leucemia linfoblástica aguda de células B (ALL).

[0143] O linfoma difuso de grandes células B (DLBCL ou DLBL) é a forma mais comum de linfoma não-Hodgkin entre adultos (Blood 1997 89 (11):3909-18), com uma incidência anual estimada de 7 a 8 casos por 100.000 pessoas por ano nos EUA e no Reino Unido. É caracteri- zado como um câncer agressivo que pode surgir em praticamente qual- quer parte do corpo. As causas do DLBCL não são bem compreendidas e podem surgir de células B normais, bem como da transformação ma- ligna de outros tipos de linfoma ou células de leucemia. As abordagens de tratamento geralmente envolvem quimioterapia e radiação e resulta- ram em uma taxa de sobrevida geral em cinco anos de aproximada- mente 58% para adultos. Embora alguns anticorpos monoclonais te- nham se mostrado promissores para o tratamento de DLBCL, a eficácia clínica consistente ainda não foi demonstrada de forma conclusiva. Há, portanto, uma grande necessidade de novas terapias, incluindo imuno- terapias para DLBCL.

[0144] Em outro aspecto, os anticorpos de cadeia pesada CD19

(por exemplo, UniAbsTM) e composições farmacêuticas neste docu- mento podem ser usados para tratar distúrbios autoimunes caracteriza- dos por células B patogênicas que expressam CD19, incluindo, sem li- mitação, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatoide (RA) e esclerose múltipla (MS).

[0145] Doses eficazes das composições da presente invenção para o tratamento de doenças variam dependendo de diversos fatores, inclu- indo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outros medicamentos adminis- trados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Normalmente, o paciente é um humano, mas mamíferos não humanos também podem ser tratados, por exemplo, animais de companhia, como cães, gatos, cavalos, etc., mamíferos de laboratório, como coelhos, camundongos, ratos, etc., e similares. As dosagens de tratamento podem ser tituladas para otimizar a segurança e a eficácia.

[0146] Os níveis de dosagem podem ser prontamente determinados pelo clínico de conhecimento comum e podem ser modificados con- forme necessário, por exemplo, conforme necessário para modificar a resposta de um sujeito à terapia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com os materiais carreadores para produzir uma forma de dosagem única varia dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração específico. As formas de unidade de dosagem contêm geralmente entre cerca de 1 mg a cerca de 500 mg de um in- grediente ativo.

[0147] Em algumas modalidades, a dosagem terapêutica do agente pode variar de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e, mais normalmente, 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplifi- cativo implica a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês, ou uma vez a cada 3 a 6 meses. As entidades terapêuticas da presente invenção são geralmente administradas em múltiplas oca- siões. Intervalos entre as dosagens únicas podem ser semanais, men- sais ou anuais. Intervalos também podem ser irregulares, como indicado pela medição dos níveis sanguíneos da entidade terapêutica no paci- ente. Alternativamente, as entidades terapêuticas da presente invenção podem ser administradas como uma formulação de liberação susten- tada, em que uma administração menos frequente seja necessária. A dosagem e frequência variam dependendo da meia-vida do polipeptídeo no paciente.

[0148] Tipicamente, as composições são preparadas como injetá- veis, quer como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas ade- quadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da inje- ção podem também ser preparadas. As composições farmacêuticas apresentadas neste documento são adequadas para administração in- travenosa ou subcutânea, diretamente ou após reconstituição de com- posições sólidas (por exemplo, liofilizadas). A preparação também pode ser emulsionada ou encapsulada em lipossomas ou micropartículas, tais como polilactídeo, poliglicolídeo ou copolímero para um efeito adju- vante melhorado, conforme discutido acima. Langer, Science 249:1527, 1990 e Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Os agentes desta invenção podem ser administrados na forma de uma in- jeção de depósito ou preparação de implante que pode ser formulada, de maneira a permitir uma liberação sustentada ou pulsátil do ingredi- ente ativo. As composições farmacêuticas são geralmente formuladas como estéreis, substancialmente isotônicas e em total conformidade com todos os regulamentos da Boas Práticas de Fabricação (GMP) da U.S. Food and Drug Administration.

[0149] A toxicidade dos anticorpos e estruturas de anticorpos des-

critos neste documento pode ser determinada por procedimentos farma- cêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, determinando o LD50 (a dose letal para 50% da população) ou o LD100 (a dose letal para 100% da população). A razão de dose entre efeito tóxico e terapêutico é o índice terapêutico. Os dados obtidos a partir desses ensaios de cultura de células e estudos em animais po- dem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem que não é tóxica para uso em humanos. A dosagem dos anticorpos descritos neste documento encontra-se preferencialmente dentro de uma faixa de con- centrações circulantes que incluem a dose eficaz com pouca ou ne- nhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa razão, depen- dendo da forma de dosagem empregada e da via de administração uti- lizada. A composição exata, a via de administração e a dosagem podem ser escolhidas pelo médico, tendo em vista a condição do paciente.

[0150] As composições para administração compreenderão geral- mente um anticorpo ou outro agente ablativo dissolvido num carreador farmaceuticamente aceitável, de preferência um carreador aquoso. Uma variedade de carreadores aquosos pode ser usada, por exemplo, solução salina tamponada e similares. Estas soluções são estéreis e geralmente livres de matéria indesejável. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conheci- das. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuti- camente aceitáveis, conforme necessário para aproximar condições fi- siológicas, tais como ajuste do pH e agentes tamponantes, agentes de ajuste de toxicidade e similares, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e simi- lares. A concentração de agente ativo nessas formulações pode variar amplamente e será selecionada principalmente com base em volumes de fluidos, viscosidades, peso corporal e similares, de acordo com o modo particular de administração selecionado e as necessidades do pa- ciente (por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15ª edição, 1980) e Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeu- tics (Hardman et al., eds., 1996)).

[0151] Também dentro do escopo da invenção estão kits compre- endendo os agentes ativos e formulações dos mesmos, da invenção e instruções de uso. Um kit pode conter adicionalmente, pelo menos, um reagente adicional, por exemplo, um fármaco quimioterapêutico, etc. Os kits incluem tipicamente um marcador que indica o uso pretendido do teores do kit. O termo "marcador", conforme usado neste documento, inclui qualquer escrito ou material gravado fornecido em ou com um kit, ou que, de outra forma acompanha um kit.

[0152] A invenção sendo completamente descrita agora, será evi- dente para uma pessoa comum versada na técnica que várias altera- ções e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito ou es- copo da invenção.

EXEMPLOS Materiais e Métodos Ligação de células CD19

[0153] A ligação a células positivas para CD19 foi avaliada por cito- metria de fluxo (Guava easyCyte 8HT, EMD Millipore) usando a linha- gem celular Daudi (ATCC). Resumidamente, 100.000 células alvo foram manchadas com uma série de diluições de UniAbsTM purificado por 30 minutos a 4ᵒC. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com tampão de citometria de fluxo (1X PBS, 1% BSA, 0,1% NaN3) e manchadas com F(ab')2 IgG anti-humano de cabra conjugado com R- ficoeritrina (PE) (Southern Biotech, cat. #2042-09) para detectar anticor- pos ligados a células. Após uma incubação de 20 minutos a 4ᵒC, as células foram lavadas duas vezes com tampão de citometria de fluxo e, em seguida, a intensidade média de fluorescência (MFI) foi medida por citometria de fluxo. Os valores de EC50 foram calculados usando Gra- phPad Prism 7. A ligação a células de Cynomolgus CD19 positivas foi determinada usando o mesmo protocolo com as seguintes modifica- ções: as células alvo eram de células CHO estavelmente transfectadas para expressar o domínio extracelular de Cynomolgus CD19 e cada an- ticorpo foi testado em uma concentração única (~ 1,7 μg/mL), portanto, os valores de EC50 não foram calculados. Exemplo 1: Ratos geneticamente manipulados que expressam an- ticorpos apenas de cadeia pesada

[0154] Um lócus IgH 'humano-rato' foi construído e montado em vá- rias partes. Isso envolveu a modificação e união de genes da região C de rato a jusante de JHs humanos e, subsequentemente, a adição a montante da região do segmento VH6-D humano. Dois BACs com clus- ters separados de genes VH humanos [BAC6 e BAC3] foram então co- injetados com o BAC denominado Georg, codificando a região montada e modificada compreendendo VH6 humano, todos os Ds, todos os JHs e Cγ2a/1/2b de rato modificado (ΔCH1).

[0155] Foram gerados ratos transgênicos que carregam loci de imu- noglobulina de cadeia pesada artificial em configuração não reorgani- zada. Os genes IgG2a(ΔCH1)., IgG1(ΔCH1)., IgG2b(ΔCH1) não tinham o segmento CH1. Os genes da região constante IgE, IgA e o potencializa- dor 3' foram incluídos em Georg BAC. O RT-PCR e análise de soro (ELISA) de ratos transgênicos revelaram rearranjo produtivo de loci de imunoglobulina transgênica e expressão de anticorpos apenas de ca- deia pesada de vários isotipos no soro. Os ratos transgênicos foram cru- zados com ratos com loci de cadeia pesada e de cadeia leve endógenos mutados previamente descritos na publicação de patente US 2009/0098134 A1. A análise de tais animais demonstrou a inativação da expressão da cadeia pesada e leve de imunoglobulina de rato e expres- são de alto nível de anticorpos de cadeia pesada com regiões variáveis codificadas pelos genes V, D e J humanos. A imunização de ratos trans- gênicos resultou na produção de respostas séricas de alto título de an- ticorpos de cadeia pesada específicos para antígeno. Esses ratos trans- gênicos que expressam anticorpos de cadeia pesada com uma região VDJ humana foram chamados de UniRatsTM. Exemplo 2: Imunização Imunização de DNA com CD19.

[0156] Seis animais UniRat foram imunizados, de acordo com um protocolo de imunização baseado em DNA padrão usando um vetor de expressão que contém a sequência CD19. Após um período de imuni- zação de 45 dias, o soro foi coletado a partir de ratos para determinar os títulos do soro. Exemplo 3: Ligação a linhagens celulares que expressam CD19

[0157] A Figura 4 resume a atividade de ligação ao alvo dos anti- corpos de cadeia pesada anti-CD19 (HCAb) descritos. A coluna 1 indica o ID do clone do HCAb. A coluna 2 indica a ligação a células Raji medida como uma dobra sobre o sinal de fundo de MFI. A coluna 3 indica a ligação a células Ramos medida como sinal MFI de fundo dobrado. A coluna 4 indica a ligação a células CHO que expressam de forma está- vel CD19 humano medido como uma dobra sobre o sinal de fundo de MFI. A coluna 5 indica a ligação a células CHO que não expressam a proteína CD19 medida como uma dobra sobre o sinal de fundo de MFI. Exemplo 4: anticorpo biespecífico mediado pela morte de células tumorais humanas Daudi através do redirecionamento de células T ativadas

[0158] Uma linhagem de células tumorais positivas para CD19 foi marcada com corante e incubada com quantidades crescentes de anti- corpo biespecífico na presença de células T humanas pré-ativadas. O anticorpo biespecífico era composto por um braço de ligação anti-CD3 emparelhado com o domínio de ligação VH anti-CD19 indicado na Fi- gura 5B (clone ID: 334354). Dois anticorpos biespecíficos CD22xCD3 no mesmo formato foram incluídos como controles positivos. O anti- corpo de controle negativo inclui um domínio de ligação de VH que não se liga a CD19. As células K562 CD22-negativas não exibiram lise es- pecífica (dados não mostrados). Exemplo 5: Ligação à proteína CD19

[0159] Os experimentos cinéticos para determinar as afinidades de antígeno e anticorpo foram realizados em um instrumento Biacore T100. O penta Anti-His mAB foi acoplado ao chip biossensor CM7 usando aco- plamento de amina padrão. O Acro CD19 (20-291) marcado com His (lote C52P2-7C1F1-GJ) foi dissolvido em 200 ul de água, em seguida diluído 1/100 e capturado no chip de mAb anti-His. O clone ID # 334354 foi testado em 3,6 uM como a concentração mais alta em uma série de diluição de 3 vezes. Os dados foram ajustados a um modelo de intera- ção 1:1, conforme mostrado na Figura 6. Exemplo 6: Modelos de tumor

[0160] Descrição dos procedimentos: Os camundongos NOG foram enxertados intravenosamente com células tumorais humanas marcadas com luciferase. Os PBMCs humanos foram injetados 5 dias após o en- xerto do tumor e no dia 6 os anticorpos foram administrados. Os camun- dongos foram tratados por injeção intravenosa de anticorpos anti- CD19xCD3 e o controle negativo (NC) quatro vezes por semana a 10ug por dose. A carga tumoral foi avaliada a cada 2-4 dias por até 1 mês.

[0161] Escolha do animal e da espécie: os experimentos foram con- duzidos em camundongos NOG transplantados com 15 milhões de PBMCs humanos.

[0162] Tamanhos de amostra: 5 ou mais animais por grupo foram expostos a tumores e tratados com anti-CD19xCD3 ou anticorpos de controle. Em geral, estudos bioquímicos e fisiológicos anteriores indica- ram que um tamanho de amostra de n=4-6 animais fornece energia es- tatística adequada (ou seja, energia de 80%) para detectar um tamanho de efeito de unidades de 1,6 SD entre as condições de tratamento usando um teste t de duas amostras com um nível de significância bila- teral de 0,05. Os anticorpos anti-CD19xCD3 reduziram de forma esta- tisticamente significativa o crescimento tumoral em modelos animais, conforme demonstrado pelos dados na Figura 7. Exemplo 7: modelo de citotoxicidade in vitro

[0163] Uma linhagem de célula tumoral CD19-positiva (CD19+) foi marcada com corante e incubada com quantidades crescentes de anti- corpo biespecífico (CD19xCD3) na presença de células T pré-ativadas. Após a incubação por 6 horas, a fluorescência da liberação do corante foi analisada. O anticorpo biespecífico era composto por um braço de ligação anti-CD3 (Família F2B) emparelhado com o domínio de ligação VH anti-CD19 (334354), conforme representado esquematicamente na Figura 5B. Dois outros anticorpos biespecíficos foram incluídos, a) braço de ligação anti-CD3 (Família F1F) emparelhado com o domínio de liga- ção VH anti-CD19 (334354) e b) Blincyto. Os resultados são fornecidos na Figura 8 e demonstram que a porcentagem de lise de células alvo aumentou de uma maneira dependente da concentração para todos os anticorpos biespecíficos que foram testados. A porcentagem de lise de células alvo aumentou em uma taxa mais rápida, em função da concen- tração de anticorpo, para o CD19 (Id334354) xCD3F2B e CD19 (Id334354) xCD3F1F, em comparação com Blincyto. A lise máxima foi a mesma entre CD19 (Id334354) xCD3F2B, CD19 (Id334354) xCD3F1F e Blincyto. Exemplo 8: modelo de citocina in vitro

[0164] Uma linhagem de células tumorais CD19-positivas (CD19+) foi incubada com quantidades crescentes de anticorpo biespecífico

(CD19xCD3) na presença de células T em repouso para 24. Os sobre- nadantes pós-incubação foram colhidos e medidos para citocinas. O an- ticorpo biespecífico era composto por um braço de ligação anti-CD3 (Fa- mília F2B) emparelhado com o domínio de ligação VH anti-CD19 (334354), conforme representado esquematicamente na Figura 5B. Dois outros anticorpos biespecíficos foram incluídos, a) braço de ligação anti-CD3 (Família F1F) emparelhado com o domínio de ligação VH anti- CD19 (334354) e b) Blincyto. Os resultados são fornecidos na Figura 9 e demonstram que a quantidade de citocina liberada variou para cada anticorpo e aumentou de maneira dependente da concentração. Espe- cificamente, o anticorpo biespecífico CD19 (Id 334354) xCD3F2B apre- sentou o nível mais baixo de liberação de citocinas. Blincyto demonstrou maior liberação de citocinas em função da concentração de anticorpos, e o anticorpo biespecífico CD19 (Id 334354)xCD3F1F mostrou os níveis mais altos de liberação de citocinas. A produção máxima de citocinas foi a mais alta para CD19 (Id334354)xCD3F1F seguida por Blincyto e a mais baixa para CD19 (Id334354)xCD3F2B.

[0165] Embora as modalidades preferenciais da presente invenção tenham sido mostradas e descritas neste documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas a tí- tulo de exemplo somente. Inúmeras variações, alterações e substitui- ções ocorrerão agora aos indivíduos versados na técnica, sem que se incorra em afastamento da invenção. Deve-se entender que diversas alternativas às modalidades da invenção descritas neste documento po- dem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as se- guintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas no escopo destas reivindicações e seus equivalentes sejam abrangidos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo apenas de cadeia pesada que se liga a CD19, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de ca- deia pesada que compreende: (a) uma CDR1 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 1 a 6; e/ou (b) uma CDR2 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 7 a 12; e/ou (c) uma CDR3 tendo duas ou menos substituições na SEQ ID NO:

13.

2. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 estão presentes em um framework humano.

3. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma se- quência da região constante da cadeia pesada na ausência de uma se- quência de CH1.

4. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que com- preende: (a) uma sequência de CDR1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1 a 6; e/ou (b) uma sequência de CDR2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 7 a 12; e/ou (c) uma sequência de CDR3 da SEQ ID NO: 13.

5. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a rei- vindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma sequência de CDR1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1 a 6; e/ou (b) uma sequência de CDR2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 7 a 12; e (c) uma sequência de CDR3 de SEQ ID NO: 13.

6. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a rei- vindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende: uma sequência de CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma sequência de CDR2 da SEQ ID NO: 10 e uma sequência de CDR3 da SEQ ID NO: 13.

7. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que com- preende uma região variável da cadeia pesada com pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências da SEQ ID NOs: 14 a 21.

8. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a rei- vindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequên- cia de região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 14 a 21.

9. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a rei- vindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequên- cia de região variável de cadeia pesada na SEQ ID NO: 17.

10. Anticorpo apenas de cadeia pesada que se liga a CD19, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de ca- deia pesada que compreende: (a) uma sequência de CDR1 da fórmula: G F X1 F S X2 X3 W (SEQ ID NO: 22) em que X1 é T ou S; X2 é S ou N; e X3 é Y ou F; e (b) uma sequência de CDR2 da fórmula: X4 X5 X6 X7 G S X8 X9 (SEQ ID NO: 23) em que X4 é I ou M; X5 é N, S ou K;

X6 é Q ou K; X7 é D ou A; X8 é D ou E; e X9 é K ou E; e (c) uma sequência de CDR3 de ASGVYSFDY (SEQ ID NO: 13).

11. Anticorpo apenas de cadeia pesada que se liga a CD19, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de ca- deia pesada compreendendo as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 em um framework de VH humana, em que as sequências de CDR são sequências com duas ou menos substituições em uma sequência de CDR, selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1 a

13.

12. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende uma re- gião variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 em um framework de VH humana, em que as sequências de CDR são selecionadas a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1 a 13.

13. Anticorpo apenas de cadeia pesada que se liga a CD19, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de ca- deia pesada que compreende: uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma sequência CDR2 da SEQ ID NO: 10, e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13, em um framework de VH humana.

14. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é multiespecífico.

15. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é biespecífico.

16. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que possui afinidade de li- gação a duas proteínas CD19 diferentes.

17. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que possui afinidade de li- gação a dois epítopos diferentes na mesma proteína CD19.

18. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que possui afinidade de li- gação a uma célula efetora.

19. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que possui afinidade de li- gação a um antígeno de célula T.

20. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que possui afinidade de li- gação a CD3.

21. Anticorpo apenas de cadeia pesada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que está em um formato CAR-T.

22. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo apenas de cadeia pesada, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

23. Método para o tratamento de um distúrbio de células B, caracterizado pela expressão de CD19, em que compreende adminis- trar a um sujeito com o referido distúrbio um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou uma composição farma- cêutica, como definida na reivindicação 22.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é linfoma difuso de grandes células B (DLBCL).

25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é leucemia linfoblástica aguda (ALL).

26. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é linfoma não-Hodgkin (NHL).

27. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é lúpus eritematoso sistêmico (SLE).

28. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é artrite reumatoide (RA).

29. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é esclerose múltipla (MS).

30. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

21.

31. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o po- linucleotídeo, como definido na reivindicação 30.

32. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o ve- tor, como definido na reivindicação 31.

33. Método de produção de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o método compreende o crescimento de uma célula, como definida na reivindicação 32, sob condições permissivas para a expressão do anti- corpo, e o isolamento do anticorpo da célula e/ou um meio de cultura celular no qual a célula está crescida.

34. Método de preparação de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende a imunização de um animal UniRat com CD19 e a identificação de sequências de cadeia pesada de ligação a CD19.

35. Método de tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo com necessidade de uma dose eficaz do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 21, ou a composição farmacêutica, como definida na reivin- dicação 22.

36. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é para uso na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo necessitado.

37. Anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 21, ou composição farmacêutica, como definida na reivindi- cação 22, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia em um indivíduo com necessidade.

38. Kit para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende um anti- corpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 22, e instru- ções de uso.

39. Kit, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, pelo menos, um reagente adicional.

40. Kit, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que pelo menos um reagente adicional compreende um fármaco quimioterápica.