CZ297633B6 - Pouzití BCMA pro výrobu farmaceutického prípravkupro lécení nádoru exprimujících APRIL - Google Patents

Pouzití BCMA pro výrobu farmaceutického prípravkupro lécení nádoru exprimujících APRIL Download PDF

Info

Publication number
CZ297633B6
CZ297633B6 CZ20021169A CZ20021169A CZ297633B6 CZ 297633 B6 CZ297633 B6 CZ 297633B6 CZ 20021169 A CZ20021169 A CZ 20021169A CZ 20021169 A CZ20021169 A CZ 20021169A CZ 297633 B6 CZ297633 B6 CZ 297633B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
april
cells
receptor
leu
tumor
Prior art date
Application number
CZ20021169A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20021169A3 (cs
Inventor
Schneider@Pascal
Thompson@Jeffrey
Cachero@Teresa
Ambrose@Christine
Rennert@Paul
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
Apotech R & D, S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27388102&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ297633(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Ma Inc., Apotech R & D, S. A. filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of CZ20021169A3 publication Critical patent/CZ20021169A3/cs
Publication of CZ297633B6 publication Critical patent/CZ297633B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

Resení se týká BCMA, tj. receptoru APRIL (APRIL-R), clena rodiny TNF, chimérických molekul a protilátek proti APRIL-R. Lécivé prípravky podle vynálezu jsou uzitecné k lécení onemocnení spojených s nezádoucí proliferací bunek jako je plicní karcinom,karcinom tlustého streva, karcinom prsu, karcinomprostaty a dalsí karcinomy, jejichz bunky exprimují APRIL.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká BCMA, tj. receptoru APRÍL (APRIL-R), člena rodiny TNF, chimérických molekul a protilátek proti APRIL-R. Léčivé přípravky podle vynálezu jsou užitečné k léčení onemocnění spojených s nežádoucí proliferací buněk jako je plicní karcinom, karcinom tlustého střeva, karcinom prsu, karcinom prostaty a další karcinomy, jejichž buňky exprimují APRÍL.
Dosavadní stav techniky
Cytokiny z rodiny nádorových nekrotických faktorů (TNF) se účastní celé řady pochodů týkajících se kritických biologických funkcí. Každý cytokin z rodiny TNF funguje tak, že se váže na jeden či více členů z paralelní rodiny receptorových proteinů. Tyto receptory následně vyvolávají intracelulámí signál, který se projeví vznikem širokého spektra fyziologických nebo vývojových odpovědí. Mnohé z receptorových signálů ovlivní osud buňky a velmi často slouží jako spouštěcí mechanismus terminální diferenciace. Příklady buněčné diferenciace zahrnují proliferací, maturaci, migraci a buněčnou smrt.
Cytokiny z rodiny TNF jsou membránově vázané proteiny typu II, které mají krátkou intracelulární N-koncovou doménu, transmembránovou doménu a C-koncovou doménu pro vazbu receptoru na povrchu buňky. V některých případech jsou extracelulámí části proteinů odštěpeny, čímž se vytváří sekreční forma cytokinů. Zatímco membránově vázané proteiny působí lokálně, pravděpodobně zprostředkovávají buněčný kontakt pomocí interakcí buněk sjejich receptory, sekreční formy mají schopnost cirkulovat nebo difundovat a takto mohou působit i ve vzdálených místech. Jak membránově vázané, tak sekretované formy existují ve formě trimerů a předpokládá se, že vyvolávají signál na receptorech usnadněním jejich shlukování (clustering).
Rodina TNF receptorových proteinů je charakterizována přítomností jedné nebo více na cystein bohatých extracelulárních domén. Z těchto na cystein bohatých domén vznikají jádra pevně vázaná disulfidovýtni vazbami, která přispívají k udržení trojrozměrné struktury při tvorbě kapsy pro vazbu ligandu. Receptory jsou membránově vázané proteiny typu 1, kde extracelulámí doména je tvořena určena N-koncovou částí proteinu, následuje transmembránová doména a C-koncová intracelulámí doména. Intracelulámí doména je zodpovědná za přenos signálu z receptoru do nitra buňky. Některé receptory obsahují intracelulámí „doménu smrti (death domain)“, jejíž signál může vyprovokovat buněčnou apoptózu. Tyto domény tedy mohou být silnými induktory buněčné smrti. Další třída receptorů může vyvolat buněčnou smrt jen velmi slabě; chybí jim pravděpodobně „doména smrti“. Třetí typ receptorů nemůže vyvolat buněčnou smrt vůbec. Všechny třídy receptorů mohou v závislosti na typu buňky nebo výskytu dalších signálů produkovat místo signálů vedoucích ke smrti buňky signály pro proliferací nebo diferenciace buněk.
Velmi dobře prostudovaným příkladem mnohočetného charakteru aktivity cytokinů z rodiny TNF je přímo faktor TNF, podle kterého byla celá třída pojmenována. TNF může existovat jako membránově vázaný cytokin, nebo může být odštěpen a sekretován. Obě formy se váží ke dvěma TNF receptorům, a to TNF-R55 a TNF-R75. Původně byl TNF popsán na základě své schopnosti přímo usmrtit rakovinné buňky. TNF také kontroluje širokou škálu imunitních procesů, včetně indukce akutních zánětíivých reakcí. Uplatňuje se též při zachování homeostázy v lymfatických tkáních. Díky svojí duální roli se tento cytokin uplatňuje při různých patologických procesech. Z tohoto důvodu byly také připraveny, jak na bázi jeho agonistických, tak antagonistických účinků, prostředky ovlivňující průběh nemoci. Například TNF a LTa (který rovněž přenáší signál přes TNF receptory) byly použity k léčbě rakovin, zvláště potom těch typů, které se vyskytují na periferních místech, jako jsou například sarkomy končetin. V těchto případech přímé předání signálu cytokinů pomocí receptorů indukovalo smrt rakovinných buněk (Aggarwal a Natarajan, 1996. Eur Cytokine Netw 7: strana 93 až 124).
V imunologických pokusech byly použity látky blokující přenos signálu přes TNF receptor (například monoklonální protilátky proti TNF, rozpustné fúzní proteiny s TNF-R) k léčení nemocí, jako je revmatická artritida a zánětlivé nemoci střev. V těchto patologických stavech totiž TNF funguje jako induktor buněčné proliferace a efektorové funkce, a proto u zhoršujícího se autoimunitního onemocnění je terapeuticky velmi výhodné zablokovat vazbu TNF kjeho receptorům (Beutler, 1999. J. Rheumatol. 26, Suppl 57: strana 16 až 21).
Poměrně nedávno objevená dvojice ligand/receptor se jeví být vhodným modelem pro podobné manipulace. Lymfotoxin β (LT3), další cytokin z rodiny TNF, který tvoří heterotrimery s LTa, se váže k LTP-R. Některé nádorové buňky adenokarcinomu, které exprimují LTp-R, mohou být zahubeny nebo diferencovány, jestliže se ošetří agonistickou monoklonální protilátkou proti LTp-R (Browning a další, 1996. J. Exp. Med 183: strana 867 až 878). V imunologických pokusech bylo dále prokázáno, že monoklonální protilátka proti ίΤβ nebo rozpustný fúzní protein LTP-R-Ig mohou blokovat vývoj zánětlivé nemoci střev, pravděpodobně ovlivněním interakce dendritických buněk a T buněk (Mackay a další, 1998. Gastroenterology 115:1464 až 1475).
K léčbě rakoviny lze také použít systém TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand). TRA1L interaguje s řadou membránově vázaných i rozpustných receptorů. Dva z těchto receptorů, TRA1L-R1 a TRAIL-2 (také nazývané DR4 a DR5), zprostředkují přenos signálu pro buněčnou smrt do rakovinných, ale nikoli normálních buněk. Normální buňky totiž exprimují další TRAIL receptory, které buněčnou smrt neindikují a kompetují tak o vazbu TRAIL. Předpokládá se, že tyto přídavné receptory fungují jako kompetitivní „klamné“ receptory (decoy) ligandu TRAIL. Užití rozpustného ligandu TRAIL k usmrcení rakovinných buněk je založeno na selektivní expresi těchto kompetitivních „klamných“ (decoy) receptorů na normálních nikoliv však na rakovinných buňkách (Gura, 1997, Science 277: strana 768).
Rakovinné buňky samy často exprimují rozmanitou paletu kompetitivních „klamných“ receptorů, které blokují imunitní rozpoznávání nebo efektorové funkce. Skutečně, některé tumory exprimují klamné TRAIL receptory ve velkém množství, zjevně proto, aby se vyhnuly buněčné smrti zprostředkované systémem TRAIL (Sheikh a další, 1999, Oncogene 18: strana 4153 až 4159). Tento poznatek omezuje v některých případech užití TRAIL jako protirakovinné látky. Obdobná zjištění byla učiněna ohledně klamného receptoru pro FAS-L, který je silně exprimován v rakovinných buňkách plic a střeva (Pitti a další, 1998, Nátuře 396: strana 699 až 703), a také pro antagonistu receptoru IL—1 (Mantovani a další, 1998. Ann. NY Acad. Sci. 840: strana 338 až 351). Klamné receptory byly nalezeny rovněž ve virových genomech, pravděpodobně proto, aby byly infikované hostitelské buňky ochráněny před obrannými mechanismy hostitele.
APRÍL (A Proliferation Inducing Ligand) je nový člen rodiny TNF proteinů. Studie exprese a funkce ligandu APRÍL přinesly poznatky o tom, že tento protein je využíván nádorovými buňkami k vyvolání rychlé proliferace. Nádorové buněčné linie ošetřené rozpustným proteinem APRÍL nebo transfikované pomocí APRÍL cDNA rostou rychleji in vitro. Buňky transfikované cDNA kódující ligand APRÍL, které byly implantovány imunodeficientním myším, rychle rostly a vytvořily nádor. Také lidské nádorové buňky, ale nikoli buňky normální tkáně, exprimují vysoké hladiny APRÍL mRNA. Tato pozorování vedou k závěru, že ligand APRÍL se váže na receptor, který je také exprimován nádorovými buňkami, čímž se vyvolá autokrinní či parakrinní aktivace nádorové buňky. Kromě toho lze předpokládat, že ligand APRÍL působí i na při dalších onemocněních, čímž otevírají další možnosti využití ovlivnění této signální dráhy. Například nízká exprese nebo vysoká exprese ligandu APRÍL hraje důležitou roli ve vývojovém poškození, jelikož vývoj je často charakterizován velmi přísně kontrolovanou rovnováhou mezi buněčnou proliferaci a buněčnou smrtí. Obdobně, APRÍL může hrát roli v nemocech spojených s buněčnou proliferací, které se mohou vyskytovat ve spojení s některými autoimunitními nemocemi (napří
- 2 CZ 297633 B6 klad lupenkou) nebo u zánětlivých nemocí, kde se buněčné populace velmi rychle množí (například bakteriální sepse).
V závislosti na známém užití agonistů a antagonistů cytokinů TNF a členů rodiny receptorů TNF jako možných modulátorů nemoci, signální dráha ligandu APRÍL reprezentuje velmi důležitou oblast pro výzkum a vývoj léků. Tyto léky by byly obzvlášť vhodné pro terapii rakoviny, jelikož u rakovinných buněk je známo, že produkují a využívají ligand APRÍL k podpoře svého vlastního růstu, a proto je nepravděpodobné, že by tvořily „klamné“ (decoy) receptory nebo jiné antagonisty signální dráhy ligandu APRÍL. Tak se signální dráha ligandu APRÍL unikátně odlišuje například od signálních drah ligandů TRA1L nebo FAS-L, jejichž terapeutické využití je znemožněno expresí „klamných“ nádorových receptorů.
Léčení rakoviny známá ve stavu techniky nevyhovují pro různé druhy nádorů vzhledem ke své malé účinnosti, malému vlivu na přežití pacienta, vykazované toxicitě, vedlejším účinkům nebo kombinaci výše uvedených nevýhod. Je proto důležití nalézt a vyvinout další způsoby léčby rakovinného bujení, které by byly dostatečně účinné bez vyvolání vážných vedlejších účinků. K tomuto účelu by mohly být využity antagonisté signální dráhy ligandu APRÍL, včetně monoklonálních protilátek proti ligandu APRÍL, protilátek proti receptorů APRÍL, rozpustných fúzních proteinů receptorů APRÍL s protilátkou (APRIL-R-Ig), přirozených antagonistů, malých molekulárních antagonistů a dalších antagonistů, připravených pomocí farmaceutických, nebo chemických postupů.
Jedním z výstupů vynálezu je identifikace proteinu vyskytujícího se na B buňkách (B cell mediated protein - BCM nebo BCMA), který slouží jako receptor pro ligand APRÍL.
Podstata vynálezu
Autoři vynálezu objevili, že BCMA je receptorem pro nádorový nekrotický faktor, APRÍL. APRÍL je totožný s molekulou popsanou v dokumentu WO 99 12965, viz seznam referencí. Pro receptor ligandu APRÍL je dále v textu užíváno označení „APRIL-R“. Vynález se vztahuje ke způsobu léčení a farmaceutickým přípravkům užívaným pro léčení různých druhů savců, kteří mají rakovinu nebo mají zvýšené riziko jejího výskytu. Tyto subjekty zahrnují subjekty již postižené rakovinou, nebo ty, které již podstoupily rakovinnou terapii.
Ve vynálezu jsou definované způsoby léčby a přípravky podle vynálezu, které využívají fakt, že jisté terapeuticky využitelné látky, definované zde jako antagonisté APRIL-R, včetně například protilátek proti APRIL-R, lze využít k léčení subjektů s rizikem vývoje rakoviny, tak, jak již bylo uvedeno a dále je možné je využít k léčbě rakoviny.
Terapeutické prostředky podle vynálezu mohou být podávány všemi možnými způsoby, které odpovídají vybranému prostředku a mohou být připraveny ve formě spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, který je vhodný pro určitý způsob podávání.
Preferované způsoby podávání jsou parenterální, zvláště potom intravenosní, intraperitoneální a intrakapsulární. Léčení lze provádět po dostatečně dlouhou dobu na ambulantní bázi. Předpokládá se, že denní dávky protirakovinného terapeutického přípravku se budou pohybovat v rozsahu 0,01 až 1000 pg/kg tělesné hmotnosti, ve výhodném provedení potom mezi 10 až 300 pg/kg tělesné hmotnosti. Je samozřejmé, že se přesné denní dávky budou měnit v závislosti na užitém protirakovinném terapeutickém prostředku a na okamžitém fyzickém stavu pacienta a průběhu onemocnění.
Způsoby léčení podle vynálezu jsou použitelné pro odstranění podstatné části klonální populace (kolonie) transformovaných buněk z organismu savce, nebo k potlačení či zeslabení růstu kolonií, které jsou běžně považované za nádory. Jako takové jsou prostředky podle vynálezu a způsob
- 3 “ jejich užití použitelné pro prodloužení života a zlepšení kvality života u pacientů s rizikem výskytu rakoviny, či s již probíhající rakovinou.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek I znázorňuje sekvenci nukleové kyseliny (Sekvence id.č.: 1) cDNA pro myší APRÍL a odvozenou aminokyselinovou sekvenci (Sekvence id.č.:3) vloženou ve vektoru pCCM213.10 pro expresi v Pichia pastoris. Podtržená část představuje epitop myc a aminokyseliny odvozené od FasL. Šipkami je označen začátek kódující sekvence pro extracelulámí doménu ligandu APRÍL.
Obrázek 2 znázorňuje sekvenci nukleové kyseliny (Sekvence id.č.:4) a od ní odvozenou aminokyselinovou sekvenci (Sekvence id.č.: 6) pro konstrukt FLAG-lidský APRÍL ve vektoru pro expresi v savčích buňkách (PS429). Mapa znázorňuje signální sekvenci (aminokyseliny 1 až 15); epitop FLAG (aminokyseliny 16 až 23) a počátek kódující sekvence pro extracelulámí doménu lidského APRÍL (od 32 aminokyseliny do konce).
Obrázek 3A znázorňuje sekvenci nukleové kyseliny (Sekvence id.č.: 7) a od ní odvozenou aminokyselinovou sekvenci (Sekvence id.č.: 8) klonu o úplné délce pro lidský BCMA. Obrázek 3B znázorňuje sekvenci nukleové kyseliny (Sekvence id.č.: 11) plazmidu pJST538, obsahujícího fúzní konstrukt lidského APRIL-R-hIgGFc a odvozenou aminokyselinovou sekvenci (Sekvence id.č.: 12). Konstrukt má následující strukturu: signální peptid z myší Ig kappa cDNA (nukleotidy 1 až 66, aminokyseliny 1 až 22), doména bohatá na cysteiny z lidského BCMA je orámovaná (nukleotidy 70 až 222, aminokyseliny 24 až 74), lidská IgGl je kódována nukleotidy 226 až 909 (odpovídá aminokyselinám 76 až 302). Na místa spojení domén (zbytek 23 a 75) byly vloženy „bezproblémové“ aminokyseliny. Šipkou je označeno místo, na kterém pravděpodobně dochází k odštěpení fúzního peptidu.
Obrázek 4 znázorňuje vazbu komplexu ligandu myc-myší APRÍL k myší B-buněčné lymfomové linii A20. Tři nezávislé pokusy prokázaly specifickou vazbu APRÍL k buňkám A20 ve srovnání s A) neobarvenými buňkami a buňkami obarvenými jen R1532, B) buňkami obarvenými RANKL-L a R1532 a C) buňkami označenými pomocí APRÍL a irelevantním králičím sérem.
Obrázek 5 znázorňuje vazbu komplexu myc-myší APRÍL k lidským B buňkám lymfomové linie RÁJI. Ve dvou nezávislých pokusech se prokázala specifická vazba APRÍL na RÁJI buňky ve srovnání s A) nebarvenými buňkami a buňkami obarvenými jen R1532, buňkami obarvenými RANK-1 a R1532 a B) buňkami označenými pomocí APRÍL a irelevantním králičím sérem.
Obrázek 6 ukazuje, že vazba APRÍL k buňkám A20 (A) a buňkám RÁJI (B) je kompetitivně ovlivněna užitím rozpustného proteinu BAFF nebo rozpustného proteinu BCMA-lg.
Obrázek 7 znázorňuje vazbu komplexu FLAG-lidský APRÍL k různým buněčným liniím: A) buňky A20, B) buňky HT29, C) buňky NIH3T3. Specifická vazba je prokázána detekcí pomocí biotinylované monoklonální protilátky M2 proti epitopu FLAG ve srovnání s vazbou irelevantní izotypově shodné kontrolní monoklonální protilátky nebo bez přidání fúzního proteinu FLAGAPRIL.
Obrázek 8 znázorňuje imunoprecipitaci myc-mAPRIL pomocí fúzního proteinu BCMA-Fc. Horní levý panel ukazuje specifické imunoprecipitace hBMCA-Fc/myc-mAPRIL a pozitivní kontroly OPG-Fc/Rank-1. Dolní panely ukazují, že ve všech reakcích bylo užito stejné množství proteinu.
Obrázek 9 znázorňuje pokusy s různými formáty ELISA testu, které dokumentují, že fúzní ligand FLAG-hAPRIL váže fúzní protein hBCMA-Fc. Různé fúzní proteiny Fc-receptor byly použity
-4CZ 297633 B6 jako potah na mikrotitrační ELISA desky a vázaly ligandy s připojenou částí FLAG. A) Detekce vazby ligandů prokázala, že pouze ligandy APRÍL a hBAFF se specificky váží na desky potažené hBCMA-Ec (levá část obrázku), ale nikoli na desky potažené hCD40-Fc (pravá část). Na obrázku 9Λ-2 jc ještě znázorněna vazba dalších ligandů na desky potažené BCMA-Fc (vlevo), CD40-Fc (uprostřed) a kombinace obou grafů (napravo). Obrázek 9B-1) Titrace pomocí různých dávek proteinu APR1L-507 a muBAFF-657 na deskách potažených BCMA-Fc-739 nebo TNFR2-492 prokázala, že ELISA signál detekovaný po vazbě APRÍL nebo hBAFF na hBCMA-Fc je lineárně závislý na množství přidaného proteinu. Obrázek 9B-2) Titrace TNFal97 na deskách potažených BCMA-Fc-739 nebo TNFR2-Fc-492. Obrázek 9B-3) Titrace hAPRlL-429 na deskách potažených BCMA-Fc-739 nebo TNFR2-Fc-492.
Obrázek 10 znázorňuje imunoprecipitaci FLAG-hAPRIL a FLAG-hBAFF pomocí fúzního proteinu hBMCA-Fc. Horní čtyři panely dokumentují, že pro imunoprecipitaci bylo použito vždy stejné množství proteinu, zatímco dolní panely dokumentují, že hAPRÍL a hBAFF jsou imunoprecipitovány hBCMA-Fc, ale nikoli hTRAIN-Fc.
Obrázek 11 znázorňuje analýzu vazby fúzních proteinů myc-mAPRIL, GLAG-hBAFF a FLAGmBAFF na hBMCA pomocí zařízení BioCore.
Obrázek 12 znázorňuje vazbu ligandů APRÍL k BCMA transfikovaným buňkám. Buňky 293EBNA byly transfikovány plazmidem tak, aby exprimovaly hBCMA úplné délky. Buňky byly sklizeny o 48 hodin později v pufru s 5 mM EDTA a obarveny pomocí ligandů mycmAPRIL o koncentracích 0, 40, 200, 1000 a 5000 mg/ml. Ligand byl detekován králičím antisérem proti ligandů APRÍL (R1532) a konjugátem anti—králičí protilátky s PE. Panel A znázorňuje, že intenzita barvení je závislá na dávkování. Panel B znázorňuje, že při užití rozpustného proteinu BCMA-lg intenzita barvení vzhledem k pozadí klesá.
Obrázek 13 znázorňuje růst 5x106 buněk N1H3T3 implantovaných podkožně do imunodeficientních (Nu/Nu) myší ošetřených kontrolními činidly nebo fúzním proteinem BCMA-lg. V tomto modelu buňky N1H3T3 tvoří fibrosarkom.
Obrázek 14 znázorňuje růst 8x105 buněk lidského karcinomu tlustého střeva SW480 implantovaných podkožně do imunodeficientních (Nu/Nu) myší ošetřených kontrolními činidly nebo fúzním proteinem hBCMA -Ig.
Obrázek I5A znázorňuje růst lidského karcinomu tlustého střeva HT29 implantovaného podkožně do imunodeficientních (Nu/Nu) myší ošetřených kontrolními činidly nebo fúzním proteinem hBCMA -Ig. V pravé části jsou znázorněny objemy nádorů jednotlivých myší ke 42 dni. Obrázek 15B znázorňuje růst lidského karcinomu plic A549 implantovaného podkožně do imunodeficientních (Nu/Nu) myší ošetřených kontrolními činidly nebo fúzním proteinem hBCMA -Ig.
Příklady provedení vynálezu
Definice pojmů
Z důvodu jasnějšího a přesnějšího popsání předmětu vynálezu, jsou specifické pojmy používané v dalším popisu vynálezu a následujících patentových nárocích vysvětleny v následujících definicích.
Vynález je v dalším textu podrobně popsán pomocí literárních odkazů, ve kterých jsou zahrnuty následující pojmy:
Termín „receptor APRÍL“ nebo „APR1L-R“ užívaný v dalším textu zahrnuje nativní sekvenci APRIL-R a sekvenci variant APR1L-R. APRIL-R lze izolovat z různých zdrojů, jako jsou různé
-5CZ 297633 B6 typy myších či lidských tkání, nebo z jiného zdroje, či jej lze připravit rekombinantními či syntetickými postupy. Termín APRIL-R se dále vztahuje na polypeptid, který je schopný vazby k různým členům rodiny nádorových nekrotických faktorů, k ligandu APRÍL, nebo jeho homologům či fragmentům. Příkladem ligandu APRÍL je BCMA.
Termín „BCMA“ nebo „BCM“ se vztahuje k novému proteinu, který se účastní maturace B buněk, tak, jak je to popsáno Grasem a dalšími (1995), Intemational Immunology 7: strana 1093 až 1106, „BCMAp: an integrál membrane protein in the Golgi apparatus of human mature B lymphocytes“; Y. Laabim a dalšími (1992), EMBO J., 11: strana 3897 až 3904, „A new gene BCM on Chromosome 16 is fused to the interleukin 2 gene by a t(4; 16) (q26:p 13) translocation in a malignant T cell lymphoma“.
„Nativní sekvence receptoru APRIL-R“ zahrnuje polypeptid mající stejnou aminokyselinovou sekvenci jako APRIL-R, odvozenou z přirozeně se vyskytující sekvence. Takováto nativní sekvence receptoru APRIL-R může být izolována z přirozeně se vyskytujícího materiálu, nebo může být připravena pomocí rekombinantních nebo syntetických postupů. Nativní sekvence receptoru APRIL-R může být přirozeně se vyskytující sekvence APRIL-R ve zkrácené formě, nebo v sekretované formě (to znamená v rozpustných formách, obsahujících například sekvenci extracelulámí domény), dále v přirozeně se vyskytujících variantních formách (to znamená alternativně sestříhaných formách) a dále v přirozeně se vyskytujících formách alelických variant APRIL-R. Ve výhodném provedení vynálezu je nativní sekvence APRIL-R, maturovaná nativní sekvence o úplné délce pro polypeptid APRIL-R, obsahující aminokyseliny 1 až 184 ze Sekvence id.č.: 8 nebo její fragmenty.
Termínem „extracelulámí doména APRIL-R“ neboli „APRIL-R ECD“ se rozumí forma receptoru APRIL-R, která je v podstatě prostá transmembránových a cytoplazmatických domén vyskytujících se v receptoru APRIL-R. Zpravidla extracelulámí doména receptoru APRIL-R neobsahuje více než 1 % aminokyselinových zbytků z transmembránových a cytoplazmatických domén a ve výhodném provedení obsahuje méně než 0,5 % transmembránových a cytoplazmatických zbytků. Obvykle obsahuje APRIL-R ECD aminokyselinové zbytky 1 až 51, nebo l až 52, či 1 až 53 ze Sekvence id.č.:8. Ve výhodném provedení APRIL-ECD obsahuje aminokyselinové zbytky 4 až 51 ze Sekvence id.č.: 8, nebo v ještě výhodnějším provedení aminokyselinové zbytky 8 až 41 ze Sekvence id.č.: 8. Odborníkům v daném oboru je zřejmé, že transmembránová doména identifikovaná v polypeptidu APRIL-R podle vynálezu byla identifikována pomocí rutinních kriterií, která se používají v daném oboru pro identifikaci tohoto typu hydrofobní domény. Přesné ohraničení transmembránové domény se může lišit, ale s největší pravděpodobností nebude rozdíl větší než 5 aminokyselinových zbytků na každém konci vyznačené domény.
Termínem „varianta APRIL-R“ se rozumí aktivní receptor APRIL-R, tak, jak je definován dále v textu, který má alespoň 80% identitu aminokyselinové sekvence s receptorem APRIL-R, jehož dedukovaná aminokyselinová sekvence úplné délky pro nativní APRIL-R je uvedena v Sekvenci id.č.: 5, nebo se sekvencí APRIL-R ECD. Takovéto varianty APRIL-R zahrnují například polypeptidy APRIL-R, do kterých byl přidán na karboxy konci Sekvence id.č.: 8 jeden nebo více aminokyselinových zbytkům nebo tyto zbytky byly odstraněny. Zpravidla varianta APRIL-R má alespoň 80 nebo 85% identitu aminokyselinové sekvence, ve výhodném provedení vynálezu alespoň 90% identitu aminokyselinové sekvence, v ještě výhodnějším provedení alespoň 95% identitu aminokyselinové sekvence s aminokyselinovou sekvencí podle Sekvence id.č.: 8.
„Procenta (%) identity aminokyselinové sekvence“ ve vztahu k sekvencím receptoru APRIL-R podle ve vynálezu, se definují jako procenta aminokyselinových zbytků ve studované sekvenci, která jsou identická s aminokyselinovými zbytky v sekvenci receptoru APRIL-R, a to po zarovnání (alignmentu) sekvencí a případném doplnění mezer (je-li to třeba k dosažení maximální procentuální shody), kdy se jako část identické sekvence neuvažují žádné konzervativní substituce. Zarovnání (alignment) sekvencí pro stanovené percentuální shody aminokyselinových sekvencí lze provést několika odborníkům známými způsoby, například užitím veřejně dostup
-6CZ 297633 B6 ných počítačových programů jako je BLAST, AL1GN nebo programu Megalign (DNASTAR). Odborníci daného oboru určí odpovídající parametry pro provedení porovnání, včetně potřebných algoritmů, kterými lze provést porovnání přes celou délku srovnávaných sekvencí.
Termín „epitope tagged“ - „připojený epitop“, je-li užíván v dalším textu, se vztahuje k chimernímu polypeptidu obsahujícímu receptor APRIL-R, nebo jeho doménu, které jsou připojeny k polypeptidové značce („tag-polypeptide“). Polypeptidová značka obsahuje dostatek aminokyselinových zbytků, které tvoří epitop, proti kterému lze vytvořit protilátku, nebo kterou lze identifikovat pomocí nějakého jiného činidla, avšak je dostatečně krátká, že neinterferuje s aktivitou receptoru APRIL-R. Ve výhodném provedení polypeptidová značka je dostatečně jedinečná, takže protilátka proti ní nereaguje křížově s dalšími epitopy. Vhodná polypeptidová značka obvykle obsahuje alespoň 6 aminokyselinových zbytků a obvykle obsahuje mezi 8 až 50 aminokyselinovými zbytky (ve výhodném provedení 10 až 20 zbytků).
Termínem „izolovaný“ se v dalším textu při popisu různých polypeptidů rozumí polypeptid, který je identifikován a oddělen a/nebo izolován od komponent běžných v místě jeho přirozeného výskytu. Kontaminující komponenty přirozeně se vyskytujícího v místě původu peptidu představují materiál, který obvykle interferuje s diagnostickým nebo terapeutickým užitím polypeptidu. Mohou to být enzymy, hormony a další rozpuštěné látky proteinové či neproteinové povahy. Ve výhodném provedení vynálezu lze polypeptid čistit (1) do stupně, který je dostačující k určení alespoň 15 aminokyselinové sekvence pomocí aminokyselinového sekvenátoru („spinning cup sequenator“) nebo (2) do stupně, který je dostačující k tomu, aby polypeptid putoval jako jediný proužek na SDS-PAGE za redukujících či neredukujících podmínek s použitím Coomassie modři, či ve výhodném provedení po barvení stříbrem. Izolovaný polypeptid zahrnuje polypeptid in šitu v rekombinantních buňkách, jestliže v něm není přítomna alespoň jedna část přirozeného prostředí receptoru APRIL-R. Zpravidla se však izolovaný polypeptid připravuje pomocí alespoň jednoho purifikačního kroku.
Termín „protilátka“ se používá v nejširším smyslu a obvykle pokrývá jednotlivé monoklonální protilátky proti receptoru APRIL-R (včetně agonisty, antagonisty a neutralizačních protilátek) a dále protilátkové kompozice proti APRIL-R se specifitou proti několika epitopům (polypeptidové). Termínem „monoklonální protilátka“ se v dalším textu rozumí protilátka získaná z populace značně homogenních protilátek, to znamená, že jednotlivé protilátky obsažené v populaci jsou identické, až na možný výskyt přirozeně se vyskytujících mutací, které mohou být přítomny v malých množstvích.
Termín „vyčištěný preparát“ či „značně nečištěný preparát“ polypeptidu, který je užíván v dalším textu, znamená polypeptid, který je oddělen od dalších proteinů, lipidů a nukleových kyselin, se kterými se přirozeně vyskytuje. Ve výhodném provedení je polypeptid také oddělen od dalších látek, například protilátek, matrice a tak dále, které byly použity k jeho čištění.
Termíny „ošetření, léčba a terapie“ užívané v textu se vztahují na termíny léčebná terapie, profylaktická terapie a preventivní terapie.
Termíny „peptidy, proteiny a polypeptidy“ se užívají v textu zaměnitelně.
Termín „biologicky aktivní“ užívaný v textu, znamená in vivo či in vitro aktivitu, která se může projevit buď přímo, či nepřímo. Biologicky aktivní fragmenty receptoru APRIL-R mohou mít například 70% aminokyselinovou homologii s aktivním místem receptoru, ve výhodném provedení alespoň 80% homologii a v ještě výhodnějším provedení alespoň 90% homologii. Identita nebo homologie s příslušným receptorem je definovaná jako procento aminokyselinových zbytků v sekvenci aktivního místa, které jsou identické se sekvencí receptoru APRIL-R tak, jak je uvedena v Sekvenci id. č.:8.
Termínem „savec“ se rozumí jakékoliv zvíře klasifikované jako savec včetně člověka, krav, koní, psů, myši a koček. Ve výhodném provedení vynálezu je savcem člověk.
Pokud není uvedeno jinak vyžaduje provedení vynálezu znalost běžných technik buněčné biologie, kultivace buněk in vitro, molekulární biologie, transgeneze eukaryotických buněk, mikrobiologie, technik rekombinantní DNA a imunologických technik, v rozsahu, který je běžný u odborníků v příslušných oborech. Takové techniky jsou popsány v literatuře.
Dále budou podrobněji popsána výhodná provedení vynálezu. Vynález popisuje použití receptorů APRIL-R a molekul podobných receptorů APRIL-R při ovlivňování růstu a dozrávání Blymfocytů a respektive jiných lymfocytů, a zejména při jejich maturaci proti nádorovým buňkám. Vynález dále popisuje použití receptorů APRIL-R a molekul podobných receptorů APRIL-R pro ovlivnění imunitní odpovědi, například při autoimunitních onemocněních a dalších poruchách imunitního systému. Dále vynález popisuje použití genu pro APRIL-R nebo podobného genu pro léčbu rakoviny a poruch imunitního systému pomocí genové terapie.
Receptor APRIL-R a jeho homology produkované hostitelskými buňkami transformovanými geny podle vynálezu, jakož i nativní receptor APRIL-R purifikovaný způsoby známými ze stavu techniky, nebo syntetizovaný pomocí známých aminokyselinových sekvencí, je vhodný pro léčbu různých druhů rakoviny a imunitních onemocnění. Dále je tento ligand rovněž vhodný pro terapii a další způsoby boje s dalšími nemocemi.
Vynález dále popisuje použití nukleové kyseliny, kódující receptor APRIL-R v „antisense“ terapii. Termínem „antisense“ terapie se zde rozumí přímé podání nebo in šitu vznik takových oligonukleotidů a jejich derivátů, které specificky hybridizují v buněčných podmínkách s buněčnou mRNA a/nebo DNA, která kóduje požadovaný ligand. V důsledku této hybridizace dojde k inhibici exprese kódovaného proteinu, to jest k inhibici translace a/nebo transkripce. Povaha této vazby může být konvenční komplementarita bází, nebo může jít například o speciální případy vazby oligonukleotidu k hluboké drážce (major groove) DNA dvoušroubovice.
Obvykle se „antisense“ terapií rozumí skupina metod známých ze současného stavu techniky zahrnující jakoukoliv terapii založenou na specifické vazbě sekvence oligonukleotidů.
Antisense konstrukt podle vynálezu může být podán například ve formě expresního plazmidu, který po expresi v buňce produkuje RNA komplementární kté části buněčné mRNA, která kóduje Kay-ligand. Popřípadě může být antisense konstrukt tvořen oligonukleotidovou sondou připravenou ex vivo. Vhodnými oligonukleotidovými sondami jsou modifikované oligonukleotidy, který jsou odolné proti účinku endogenních nukleáz a jsou tudíž poměrně stabilní v podmínkách in vivo. Příkladem vhodné modifikované nukleové kyseliny použitelné v antisense terapii jsou fosforamidáty, fosfothioáty a methylfosfonáty (viz například patenty 5 176 996; 5 264 564 a 5 256 775). Dále byly postupy pro přípravu oligomerů použitelných v antisense terapii shrnuty na příklad v publikaci van Der Krola a dalších, (1988) Biotechniques 6: strana 958 až 975; a Steina a dalších, (1988) Cancer Res 48: strana 2659 až 2668.
Výše popsaný receptor APRIL-R podle vynálezu je členem skupiny receptorů příbuzných TNF. Tento protein, jeho fragmenty nebo jejich homology mohou mít široké léčebné a diagnostické použití.
Polypeptidy podle vynálezu specificky interagují s ligandem APRÍL, bílkovinou dříve popsanou v dokumentu WO99/12964, který je uveden v seznamu referencí. Peptidy a způsoby podle vynálezu umožňují identifikovat molekuly, které specificky interagují sreceptorem APRIL-R nebo jeho fragmenty.
V jednom z provedení vynálezu jsou popsány způsoby použití peptidů odvozených od receptorů APRIL-R, které mají schopnost vázat ligand APRÍL. Fragmenty receptorů APRIL-R mohou být
-8CZ 297633 B6 připraveny několika způsoby, například rckombinantními technikami pomocí PCR, proteolytickým štěpením nebo chemickou syntézou. Vnitřní nebo koncové fragmenty studovaného polypeptidu mohou být připraveny odstraněním jednoho nebo více nukleotidů z jednoho nebo obou konců nukleové kyseliny, která tento polypeptid kóduje. Expresní mutované DNA pak vznikají fragmenty tohoto polypeptidu.
Polypeptidové fragmenty mohou být rovněž syntetizovány chemicky za použití způsobů známých ze stavu techniky. Takovým chemickým postupem je například konvenční Merrifieldova syntéza na pevné fázi s použitím esterů f-moc nebo t-boc. Peptidy a DNA sekvence podle vynálezu mohou být například libovolně rozděleny na vzájemně se nepřekrývající fragmenty požadované délky, nebo na fragmenty, které mají navzájem určitý překryv. Způsoby, jakými toho lze dosáhnout, jsou níže popsány podrobněji.
Příprava rozpustných forem receptoru APRIL-R
Rozpustné formy receptoru APRIL-R mohou často efektivně přenášet signál a mohou být proto aplikovány jako lék, který napodobuje v účinku přirozenou membránovou formu. Je možné že receptor APRIL-R popisovaný ve vynálezu je přirozeně sekretován jako rozpustný cytokin, nicméně pokud tomu tak není, lze sekrece dosáhnout pomocí genového inženýrství. Rozpustnou sekreční formu receptoru APRIL-R lze připravit odstraněním DNA kódující N-koncové transmembránové oblasti a některé části peptidové „stopky“ (stalk region) a jejich nahrazením sekvencemi, které kódují signální peptidy typu I popřípadě typu 11, tak, aby ve vybraném expresním systému došlo kjejich správnému proteolytickému štěpení. Zkušený odborník dokáže optimalizovat velikost ponechané části peptidové „stopky“ tak, aby bylo dosaženo maximální vazby ligandu a zároveň účinnosti sekrece. Například mohou být připraveny konstrukty obsahující všechny možné delece v N-terminální oblasti, takže vzniknou peptidy začínající aminokyselinou 1 až 52. Z analýzy tohoto typu pak vyplyne optimální délka N-terminální sekvence.
Příprava protilátek reagujících s receptorem APRIL-R
Vynález dále popisuje protilátky specificky reagující s receptorem APRIL-R nebo jeho koreceptory. Antisérum nebo monoklonální protilátky proti tomuto proteinu, případně peptidu mohou být připraveny podle známých standardních protokolů (viz například Antibodies: A Laboratory Manual, editoři Harlow a Lané (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1988)). Savci jako například myši, křečci nebo králíci mohou být imunizováni imunogenní formou peptidu. Mezi způsoby zvyšujícími imunogenitu proteinů, nebo peptidů, patří navázání na nosič, nebo další, odborníkům dobře známé, způsoby.
Imunogenní část receptoru APRIL-R, nebo jeho koreceptorů, může být podávána spolu s vhodným adjuvans (látkou zvyšující účinek antigenu). Imunizaci lze kontrolovat testováním titru protilátek v plazmě nebo séru. K tomuto účelu lze použít standardní ELISA test nebo jiné imunoenzymatické testy.
Ve výhodném provedení vynálezu jsou protilátky podle vynálezu specifické pro antigenní determinanty receptoru APRIL-R nebo jeho koreceptory, například jsou specifické kantigenním determinantám polypeptidu podle Sekvence id. č.:8, nebo k lidským nebo jiným savčím peptidům které jsou s tímto lidským peptidem blízce příbuzné (vykazují například 70, 80 nebo 90% homologii, ve výhodném provedení alespoň 95 % homologii). V ještě dalším výhodném provedení alespoň 95 % homologii). V ještě dalším výhodném provedení vynálezu protilátky proti receptoru APRIL-R nebo proti jeho koreceptorům nevykazují žádnou podstatnou křížovou reaktivitu (tj. jsou specifické) s proteinem který má například nižší než 80% homologii se Sekvencí id. č.: 8; ve výhodném provedení nevykazují křížovou reaktivitu s proteinem, který má nižší než 90 % homologii se Sekvencí id. č.:8; a v ještě výhodnějším provedení vynálezu nereagují s proteinem, který má nižší než 95% homologii s proteinem jehož sekvence odpovídá Sekvenci id. č.:8.
-9CZ 297633 B6 „Podstatnou křížovou reaktivitou“ se rozumí, že daná protilátka má k nehomolognímu proteinu vazebnou afinitu, která je nižší než 10 %, ve výhodném provedení nižší než 5 % a v ještě výhodnějším provedení vynálezu nižší než 1 % vazebné afinity k proteinu jehož sekvence odpovídá Sekvence id č.: 8.
Termínem „protilátka“ se v dalším textu rozumí jak vlastní protilátky, tak i jejich fragmenty, které specificky reagují s receptorem APR1L-R. Fragmenty protilátek mohou být připraveny konvenčními způsoby známými ze stavu techniky a jejich účinnost může být testována stejným způsobem jako výše popsaná účinnost celých protilátek. Například fragmenty F(ab)2 mohou být připraveny štěpením protilátek pepsinem. Ve výsledném F(ab)2 fragmentu mohou být chemicky zredukovány disulfidové můstky, čímž vzniknou F(ab) fragmenty. Mezi protilátky podle vynálezu dále patří takové protilátky bispecifické a chimerní molekuly, které mají vazebnou afinitu k receptoru APRIL-R nebo ke koreceptoru APRÍL. Jak monoklonální a polyklonální protilátky (Ab) proti receptoru APRIL-R a jeho koreceptorům, tak i protilátkové fragmenty F(ab) a F(ab)2 mohou být použity pro zablokování funkce APRIL-R a příslušných koreceptorů.
Různé formy protilátek mohou být také připraveny pomocí standardních způsobů genového inženýrství (Winter a Milstein, Nátuře 349: strana 293 až 299 (1991), viz seznam referencí). Mohou tak být například zkonstruovány chimérické protilátky, ve kterých je antigen vazebná doména ze zvířecí protilátky spojena s lidskou konstantní oblastí (Cabilly a další, patent US 4 816 567, viz seznam referencí). Chimérické protilátky mohou při použití v klinické léčbě lidských pacientů vyvolávat slabší nežádoucí imunitní odpověď, než jakou u lidských pacientů vyvolávají protilátky zvířecí.
Kromě toho mohou být syntetizovány rekombinantní „humanizované protilátky“ rozpoznávající receptor APRIL-R nebo jeho koreceptory. Humanizované protilátky jsou chiméry skládající se z větší části lidské IgG, do které byly vloženy oblasti odpovědné za specifickou vazbu antigenu. Zvířata jsou nejprve imunizována požadovaným antigenem, poté se izolují odpovídající protilátky a odebere se část sekvence variabilní oblasti odpovědná za specifickou vazbu antigenu.
Antigen-vazebné oblasti odvozené ze zvířecích protilátek jsou poté nakloňovány do odpovídajícího místa v genu pro lidskou protilátku, ve kterém byla dříve odstraněna antigen vazebná oblast. Při použití humanizovaných protilátek se minimalizují heterologní (tj. mezidruhové) sekvence obsažené v dané lidské protilátce, čímž se snižuje riziko vyvolání nepříznivé imunitní odpovědi v pacientovi.
Lze rovněž připravit různé třídy rekombinantních chimérických nebo humanizovaných protilátek tím, že se použijí zvířecí variabilní domény a lidské konstantní oblasti (CH1, CH2, CH3) z protilátek různých tříd. Protilátky se zvýšenou valencí místa pro vazbu antigenu mohou být připraveny například s využitím genového inženýrství tak, že se příslušná místa pro vazbu antigenu nakloňují do vektorů nesoucích lidské konstantní oblasti, (viz Arulanandam a další, J. Exp. Medicíně 177: strana 1439 až 1450 (1993)).
Kromě toho mohou být standardní způsoby rekombinantní DNA použity pro změnu vazebné afinity rekombinantních protilátek k příslušným antigenům. Takovéto změny afinity lze dosáhnout pozměněním aminokyselinových zbytků v nejbližším okolí místa pro vazbu antigenu. Afinitu vazebných míst humanizované protilátky lze také být zvýšit cílenou mutagenezí založenou na molekulárním modelování, (Queen a další, Proč. Nati. Acad. Sci. 86: strana 10029 až 10033 (1989)).
Příprava analogů: Produkce pozměněných peptidových a DNA sekvencí
Analogy receptoru APRIL-R se mohou lišit od přirozeně se vyskytující formy receptoru APR1LR v aminokyselinové sekvenci, ve vlastnostech nezávislých na sekvenci, nebo v obojím. Modifikace nezávislé na sekvenci zahrnují in vivo nebo invitro chemickou derivatizaci receptoru
- 10CZ 297633 B6
APRIL-R. Mezi takovéto modifikace mimo jiné patří změny v acetylaci, methylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci.
Výhodné analogy podle vynálezu zahrnují receptory APRIL-R popřípadě jejich biologicky aktivní fragmenty, jejichž aminokyselinová sekvence se liší od sekvence popsané v Sekvenci id. č.: 8 jednou nebo více konzervativními záměnami aminokyselin, nebo jednou nebo více nekonzervativními záměnami, delecemi nebo inzercemi, které však nezpůsobí ztrátu vazebné aktivity vzhledem k ligandu APRÍL. Mezi konzervativní záměny typicky patří mutace jedné aminokyseliny za jinou s podobnými chemickými vlastnostmi, například náhrady aminokyselin uvnitř následujících skupin: valin, glycin; glycin, alanin; valin, izoleucin, leucin; kyselina asparagová, kyselina glutamová; asparagin, glutamin; serin, threonin; lysin, arginin; respektive fenylalanin, tyrosin.
Gen pro receptor APRIL-R o úplné délce (Sekvence id. č.:8) nebo jeho části mohou být použity jako hybridizační sondy pro skríning cDNA knihovny, například pro izolaci dalších genů, které mají požadovanou sekvenční identitu s genem pro receptor APRIL-R podle Sekvence id. č.: 6. Nukleotidové sekvence kódující receptor APRIL-R mohou být dále použity ke zkonstruování hybridizační sondy pro mapování genů kódujících APRIL-R a pro genetickou analýzu jednotlivců s genetickými poruchami. Mohou být navrženy takové hromadné testy, které budou sloužit nalezení sloučenin napodobujících biologickou aktivitu receptoru APRIL-R. Takové hromadné testy mohou být založeny na metodice adaptovatelné na masové multiparalelní zpracování (highthroughput) chemických knihoven, což je zvláště vhodné pro identifikaci malých molekul potenciálních léčiv. Mezi malé molekuly vhodné pro toto testování patří syntetické organické nebo anorganické sloučeniny. Nukleové kyseliny kódující receptor APRIL-R nebo jeho deriváty mohou být rovněž použity pro vytvoření transgenních nebo „knock-outovaných“ zvířat, která jsou dále výhodná ve vývoji a skríningu terapeuticky vhodných látek, včetně například léčiv proti rakovině.
Receptor APRIL-R a jeho homology produkované hostitelskými buňkami transformovanými sekvencí podle vynálezu jakož i nativní receptor APRIL-R purifikovaný způsobem známým ze stavu techniky, nebo nasyntetizovaný na základě známé aminokyselinové sekvence je použitelný v mnoha aplikacích v boji proti rakovině.
V jednom z provedení vynálezu je popsán způsob léčby savčího organismu postiženého nežádoucí proliferací buněk založený na podání účinného množství terapeutické kompozice obsahující antagonistu receptoru APRIL-R. V tomto způsobu se antagonistou receptoru APRIL-R rozumí polypeptid, který zabraňuje interakci mezi ligandem APRÍL a odpovídajícím receptorem nebo receptory podaný spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
Ve výhodném provedení vynálezu je tímto odpovídajícím receptorem ligandu APRÍL na povrchu cílových buněk antigen BCMA.
Způsob podle vynálezu může být použit s libovolným antagonistou APRIL-R, který obsahuje polypeptid zabraňující interakci mezi ligandem APRÍL a příslušným receptorem nebo receptory. Příkladem těchto antagonistů receptoru APRIL-R jsou, mimo jiné, rozpustný polypeptid APRILR, včetně rozpustného antigenu BCMA (kromě jiného); rozpustné chimérické molekuly APR1LR, jako je například fúzní protein BCMA-IgG-Fc a homology protilátek proti receptoru APRILR, kromě jiných například monoklonální protilátka proti molekule BCMA.
Způsob podle vynálezu může být použit v boji proti jakýmkoliv poruchám a onemocněním spojeným s nežádoucí buněčnou proliferací. Způsob podle vynálezu může být především použit pro léčbu nádorových buněk exprimujících ligand APRÍL a/nebo jeho receptor APRIL-R (to jest antigen BCMA).
Příklady rakovinných onemocnění u nichž je buněčná proliferace modulována ligandem APRÍL mohou být identifikovány in vitro změřením koncentrace mRNA kódující ligand APRÍL a/nebo
- 11 CZ 297633 B6 receptor APR1L-R (tj. antigen BCMA) v knihovně vytvořené z buněk pocházejících z nádorových tkání. Takové nádorové tkáně, ve kterých je vysoce exprimován ligand APRÍL a/nebo receptor APRIL-R (tj. antigen BCMA) jsou výhodnými kandidáty na léčbu.
Jiným způsobem vyhledání nádorových tkání vhodných pro léčbu podle vynálezu je hledání ve veřejných a soukromých databázích (např. v databázi firmy Incyte), přičemž se pro prohledávání použije například úplná cDNA sekvence genu pro lidský ligand APRÍL.
Tímto způsobem bylo prokázáno, že mRNA pro ligand APRÍL je exprimována ve velkém množio ství typů nádorů, mimo jiné například v liniích uvedených v tabulce 1:
Tabulka 1
Knihovna Popis buněčná linie z tumoru prostaty, LNCaP, CA 50M, neošetřená,
TIGR buněčná linie z tumoru T-lymfocytů, lymfom, TIGR buněčná linie z tumoru vaječniků, papilárni serózni cystadenoCA buněčná linie z tumoru plic, mw/adenoCA, COPD, 47M buněčná linie z rakoviny prsu, adenoCA, 4 6F, SUB, m/BRSTNOT33 buněčná linie z ganglionu, dorsálni kořen, cervikálni aw/lymfom, 32M, NORM buněčná linie z nádoru mozku, frontální neuronální neoplázie, 32M buněčná linie z tumoru prostaty, adenoCA, 59M, SUB, m/PR0SN0ST19 buněčná linie z nádoru tlustého střeva, hepatická fexura, adenoCA, 55M. SUB, m/COLATMTOI buněčná linie z nádoru pankreasu, TIGR buněčná linie z nádoru paraganglionu, paraganglioma. aw/ledvinové buňky, CA, 46M
- 12CZ 297633 B6 buněčná linie z nádoru prsu, mw/duktálni CA, 43F, mBRSTTUT16 buněčná linie z tumoru ledvin, ledvinová buňka CA, 51F buněčná linie z nádoru močového měchýře, mw/TC CA, CA in šitu, 60M. m/BLADTUT 04 buněčná linie z nádoru dělohy, endometrial, F, TIGR buněčná linie z nádoru prostaty, BPH. mw/adenoCA, PIN, 59M buněčná linie z nádoru plic, mw/adeno CA, 53M, m/LUNGTUT17 buněčná linie z nádoru kostí, MG-63, osteo SAR, obr, buňka.
M/F, pool, RP buněčná linie z nádoru mozku, čelní kůra mozková, aw/plicní CA, 77M.
buněčná linie z nádoru tlustého střeva, adenoCA, NORM. SUB, CGAP buněčná linie z nádoru plic, dlaždicová buňka CA, 57M buněčná linie z nádoru plic, mw/adeno CA, 63M buněčná linie z nádoru prostaty, AH mw/adeno CA, 50M, m/PROSTUTOl buněčná linie z tumoru B-lymfocytů periferní krve, CLL, pool, NORM, 3'CGAP buněčná linie z nádoru tlustého střeva, adenoCA, pool, NORM 3/5' CGAP buněčná linie z nádoru ledvin, mw/ledvinová buňka CA, 8,53F, pool, NORM buněčná linie z nádoru vaječniku, dermoid. Cysta, 22F buněčná linie z nádoru tlustého střeva, adenoCA, NORM, 3' CGAP
- 13 CZ 297633 B6 buněčná linie z nádoru tlustého střeva. adenoCA, 3', CGAP buněčná linie z nádoru prostaty, BPH, mw/adenoCA, 70M. SUB buněčná linie z nádoru vaječniků, mets tlusté střevo adenoCA, 58 F buněčná linie z nádoru dělohy, myometrium. mw/leiomyoma. 43F buněčná linie z nádoru tenkého střeva, ileum, mw/CLC. 2F
buněčná linie z nádoru lymfatických uzlin, peripankreatický, aw/pancreatický adenoCA 65 M
buněčná linie z nádoru vaječniků, aw/leiomyomata. 36F, NORM
buněčná linie z nádoru plic, mw/ karcinoid vřetenových (spindle) buněk, 62F
buněčná linie z nádoru plic tumor, dlaždicová buňka CA 50M
buněčná linie z nádoru mozku tumor, menigioma, 36M
nádorová buněčná linie, adenoCA, 65F, m/PANCNOT08
buněčná linie z nádoru plic, mw/endobronchialní karcinoid, 33M
buněčná linie z nádoru nadledvinek, mw/pheochromocytoma. 43F, m/ADRETUT07
buněčná linie z nádoru předního mozku, meningioma, 50M
buněčná linie z nádoru ledvin, pool, NORM, 3' CGAP
buněčná linie z nádoru prsu, mw/lobulární CA, 67F
buněčná linie z nádoru plic, mw/mets osteoSAR, aw/pleura mets. 58M, NORM
buněčná linie z nádoru prostaty. adenoCA, 59M. SUB, m/PROSNOT19
buněčná linie z nádoru tenkého střeva tumor, ileum, mets endometrialní adenoCA, 64F
- 14CZ 297633 B6 buněčná linie z nádoru vaječniků, adenoCA, 58F buněčná linie z nádoru prsu, NF breast disease. 46F buněčná linie z nádoru předního mozku, mets hypernefroma,
58M
buněčná linie z nádoru ledvin, Wilms, pool, WM/WN
buněčná linie z nádoru plic, mw/mets thyroid CA, 79M, m/LUNGTUT02
buněčná linie z nádoru plic, mets thyroid CA, 79M, m/LUNGTUT03
buněčná linie z nádoru příštítných tělisek, adenoma. M/F, NORM, WM
buněčná linie z nádoru slinivky, anaplastický CA, 45F
buněčná linie z nádoru vaječniků, mw/mucinózní cystadenoCA, 43F, m/OVARTUTOl
buněčná linie z nádoru plic, dlaždicová buňka CA, pooled. NORM, CGAP
buněčná linie z nádoru prsu, adenoCA, 46F, m/BRSTN0T17
buněčná linie z nádoru dělohy , mw/leiomyoma, aw/tlusté střevo, adenoCA, 45F
buněčná linie z nádoru plic, mw/adenoCA, aw/node, diafragm mets, 63F
buněčná linie z nádoru prsu, adenoCA, 46F, m/BRSTNOT33
buněčná linie z nádoru prostaty, adenoCA, 66M, m/PROSNOT15, PROSDINOl
buněčná linie z nádoru prsu, adenoCA, 54F, m/BRSTNOT03
buněčná linie z nádoru zárodečných buněk, pool, SUB, 3' CGAP
buněčná linie z nádoru kostní dřeně, tibia, aw/mets
- 15 CZ 297633 B6 alveolární rhabdomyo SAR. 16M buněčná linie z nádoru prostaty. AH. mw/adeno CA, 57M, m/PROSTOT01 buněčná linie z nádoru prsu, PF změny, mw/adeno CA, 43F. m/BRSTTUTOl buněčná linie z nádoru dělohy tumor, serózni papilárni CA, F, pooled, 3' CGAP buněčná linie z nádoru vaječniků, mucinózni cystadeno CA, 43F, m/OVARNOT03 j buněčná linie z nádoru prsu, PF změny. mw/adenoCA, intraduktálni CA, 43F buněčná linie z nádoru prsu, mw/duktálni CA, CA in šitu, aw/uzliny mets, 63F buněčná linie z neuroganglionu, ganglioneuroma, 9M buněčná linie z nádoru slinivky , adenoCA, 3' CGAP buněčná linie z nádoru dělohy, endometrialní adenoCA, F, pool. 3’ CGAP buněčná linie z nádoru plic, neuroendokrinní karcinoid, pool, NORM, 3' CGAP
Antagonisté receptorů APRIL-R podle vynálezu používání při léčbě onemocnění spojených s nežádoucí buněčnou proliferací, zvláště pak při léčbě nádorů, inhibují výhodně růst nádorových buněk zvíce než 10 %, 20 %, 30 % nebo 40 % a nejvýhodněji zvíce než 50 %. Antagonisty 5 receptorů APRIL-R lze získat pomocí skríningu (viz Příklad 6). Antagonisté receptorů APRIL-R tak mohou být například vybráni na základě aktivity inhibující růst (z více než 10 %, 20 %, 30 %, 40 % nebo 50 %) buněk lidského karcinomu tlustého střeva HT29 nebo buněk lidského karcinom plic A549 (viz například popis k obrázku 15).
io Další provedení vynálezu popisuje způsoby inhibice růstu B-lymfocytů a buněk nepříbuzných B-lymfocytům (non-B cell), inhibice růstu B-lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami a dozrávání a tvorby protilátek za použití polypeptidu APRIL-R.
Vynález dále popisuje způsob použití receptorů APRIL-R při léčbě autoimunních onemocnění, 15 zvýšeného tlaku, kardiovaskulární chorob, onemocnění ledvin, poruch proliferace B-lymfocytů, imunosupresivních onemocnění, transplantací orgánů, zánětů a při léčbě HIV. Vynález dále popisuje způsoby použití léčiv potlačujících, zesilujících nebo pozměňujících imunitní odpověď organismu, přičemž tohoto pozměnění je dosaženo ovlivněním signální dráhy mezi receptorem APRIL-R a jeho ligandem.
- 16CZ 297633 B6
Vynález dále popisuje farmaceutické kompozice obsahující polypeptid, APRIL-R a farmaceuticky přijatelný excipient. Vhodné nosiče pro polypeptid APR1L-R jsou popsány například v knize „Remingtoiťs Pharmaceutical Sciences“, 16. vydání, 1950, Mack Publishing Co., editorů Osla a dalších. V typickém provedení vynálezu se v přípravku použije příslušné množství farmaceuticky přijatelné soli tak aby vznikl izotonický přípravek.
Mezi vhodné nosiče patří například pufry jako je fyziologický roztok, Ringerův roztok a glukózový sirup. Ve výhodném provedení vynálezu je pH roztoku v rozmezí cca pH=5 až 8, ve výhodnějším provedení je pH v rozmezí od 7,4 do 7,8. Dalšími vhodnými nosiči jsou přípravky umožňující dlouhodobé uvolňování jako například semipermeabilní matrice z hydrofóbních polymerů. Takové matrice mohou být zformovány do lipozómů, filmů nebo mikročástic. Odborníkům je zřejmé, že pro určité aplikace mohou být vhodnější určité nosiče, v závislosti například na způsobu podání léku a na koncentraci polypeptidu APR1L-R, který má být pacientovi aplikován.
Přípravek může být aplikován injekčně (například nitrožilně, intraperitoneálně, subkutánně, intramuskulámě) nebo jiným způsobem, jako například infúzí, tak, aby byla zajištěna potřebná dávka účinné látky v krevním řečišti pacienta.
Pokud není uvedeno jinak, vyžaduje provedení vynálezu znalost běžných technik buněčné biologie, kultivace buněk in vitro, molekulární biologie, mikrobiologie, technik rekombinantní DNA, proteinové biochemie a imunologických technik v rozsahu, který je běžný u odborníků v příslušných oborech. Takové techniky jsou popsány v literatuře, viz například Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, editoři Sambrook, Fritsch a Maniatis), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, svazky I a II (editor D. N. Glover), 1985; Oligonucleuotide Synthesis, (editor M. J. Gait), 1984; patent Spojených států č. 4,683,195 (Mullis a další), Nucleic Acid Hybridization (editoři B. D. Hames a S. J. Higgins) 1984; Transcription and Translation (editoři B. D Hames a S. J. Higgins), 1984; Culture of Animal Celíš (editor R. I. Freshney), nakladatelství Alan R. Liss, lne., 1987; Immobilized Celíš and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, svazky 154 a 155 (Wu a další), Academie Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Celíš (editoři J. H. Miller a Μ. P. Calos), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (editoři Mayer a Walker), Academie Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, svazky I až IV (editoři D. M. Weir and C. C. Blackwell), 1986; Manipulating the Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Příklady provedení vynálezu
V příkladech byla použita následující metodika
Metodika
Klonování a exprese fúzního proteinu myšího ligandu APRÍL s epitopem myc (CCM776) v Pichia pastoris
Expresní vektor pCCM213.10 byl zkonstruován na základě plazmidu PDR004 (H98 muAPRIL se „stopkou“ ligandu superFAS navázanou na N-konci spolu s epitopem FLAG), ze kterého byla vyštěpena sekvence kódující myší ligand APRÍL (muAPRIL). pomocí enzymů Sací aNotl.
Syntetické oligonukleotidy LTB559 a 560 vytvářejí linker s místy Xhol a Sací, který dále obsahuje a pérovací signální peptid, epitop myc a motiv KEL z ligandu FAS. Fragment muAPRIL byl spolu s linkerem vložen ligací do Xhol-Notl míst v plazmidu pCCM221, což je expresní plazmid pro Pichia pastoris.
- 17CZ 297633 Β6
Plazmid pCCM213.10 byl poté linearizován enzymem Stul, elektroporován do buněk kmene GS115 (his4—) a vyset na plotny s minimálním médiem obsahujícím dextrózu (D-(+)-glukózu). HIS4 transformanti byli testováni na expresi proteinu tak, že jedna kolonie byla přeočkována do bohatého média (BMGY: pufrované komplexní médium s glycerolem), ve kterém bylo buňkám umožněno růst po dobu 48 hodin při teplotě 30 °C. Kultura byla poté zcentrifugována a buněčná peleta byla resuspendována v poměru 1:5 v bohatém médiu pro indukci s obsahem 1,5 % methanolu (BMMY: pufrované komplexní médium s methanolem). Buňky byly dva dny indukovány při teplotě 30 °C a poté byly supematanty analyzovány pomocí SDS-PAGE a byla stanovena přítomnost proteinu muAPRIL. Proteiny byly nejprve nespecificky obarveny Coomassie modří a poté specificky ve Western blotu monoklonální protilátkou proti epitopu myc 9E10. Bylo přitom prokázáno, že kmen CCM776 produkuje dostatečné množství glykosylovaného fúzního proteinu muAPR!L-H98 s připojeným epitopem myc.
Purifikace proteinu mAPRIL s epitopem myc
Protein mAPRIL s epitopem myc sestávající z celkem 149 aminokyselin byl exprimován v buňkách Pichiapastoris. Tento protein má izoelektrický bod roven 7,45. 175 ml supematantu buněk Pichiapastoris bylo přes noc dialyzováno proti lOmM Tris pufru o pH=6,8. Poté byl dialyzovaný supematant nanesen na 20 ml SP kolonu. Kolona byla extenzivně promyta lOmM Tris-HCl pufrem o pH = 6,8 a obsah byl eluován 250 mM NaCl v PBS. Druhý krok purifikace byl proveden pomocí gelové filtrace na koloně S300. Frakce obsahující protein myc-APRIL získané z 20 mililitrové SP kolony byly zakoncentrovány centrifugám' na konečný objem 7 ml. Podle spektrofotometrického měření a Coomassie obarveného elektroforetického gelu činil výtěžek po gelové filtraci 8 mg proteinu myc-APRIL. Byl rovněž proveden Western blot pomocí myší moklonální protilátky 9E10 (protilátka proti epitopu myc) dokazující, že epitop myc nebyl poškozen purifikačním postupem. Sekvenací N-koncové oblasti bylo potvrzeno, že purifikovaný protein je skutečně protein myc-mAPRIL.
Purifikace fúzního proteinu lidského peptidu APRÍL s epitopem FLAG.
Plazmid ps429 (následně přejmenovaný na pl448) byl použit pro transientní transfekci Tlymfocytů 293. Transfekce byla provedena pomocí lipofektaminu (Gibco-BRL) a bezsérového média. Plazmid, který je založen na savčím expresním vektoru PCR3 (Invitrogen) kóduje receptor-vazebnou doménu lidského ligandu APRÍL s N-terminálním peptidem, která je po expresi uvolňována do kultivačního média. Fúzní protein s epitopem FLAG byl purifikován z bezsérového média pomocí afinitní kolony s monoklonální protilátkou proti FLAG epitopu a potom eluován pomocí přebytku čistého peptidu FLAG. Purifikace byla provedena podle instrukcí výrobce (Kodak).
Purifikace fúzního proteinu HBMCA-Fc
Buňky 293 byly transientně transfikovány vektorem kódujícím fúzní protein HBMCA-Fc. Kultivační médium z buněk 293 exprimujících fúzní hBCM-Fc bylo naneseno na afinitní kolonu s proteinem A. Protein byl eluován 25 mM fosfátovým pufrem, lOOnM NaCl, pH=7,8, po které následovala neutralizace 1/20 objemu 0,5 M NaPO4 pH=8,6. Na základě absorbance při 280 nm byly vybrány frakce, které byly dále analyzovány elektroforézou SDS-PAGE za redukujících a neredukujících podmínek. Poté byl ještě pomocí western blotu identifikován purifikovaný protein. Z 500 ml média byly vyizolovány 3 mg proteinu.
Myší ligand mAPRIL s epitopem myc se váže na různé buněčné linii ve FACS analýze
450 ng/ml purifikovaného polypeptidu myc-mAPRIL bylo navázáno na studovanou buněčnou linii ve 100 pm PBS/2%FBS (fetálního telecího séra) s přídavkem Fc blokujícího agens (FcBlock, 20 pg/ml, Pharmingen) a s purifikovanou lidskou IgG (10 gg/ml, Sandoz). Navázání bylo provedeno 1 hodinovou inkubací na ledu. Navázání polypeptidu myc-mAPRIL bylo deteko
- 18CZ 297633 B6 váno pomocí specifického králičího antiséra proti myšímu ligandu APRÍL (1:500) a konjugátu oslí anti—králičí IgG s fluorescein-izothiokyanátem (FITC, Jackson). Buněčné linie A20, Ráji, N1H3T3 a HT29 byly udržovány v médiích podle doporučení dodavatele (ATCC Bethesda, Maryland). Buňky BJAB byly kultivovány v médiu RPMI pufrovaném pomocí HEPES s přídavkem 10% FBS a L-glutaminem. V kompetitivních testech bylo k 1 pg/ml konkurenčního proteinu přidáváno vždy po 450 mg/ml myšího ligandu APRÍL s epitopem myc (myc-mAPRIL).
Příklad I: Identifikace vazby ligandu APRÍL k receptoru APRIL-R pomocí testu na plotně
V tomto příkladu byla testována vazba BCMA s ligandem APRÍL.
V imunoprecipitačním experimentu byla potvrzena vazba BCMA a ligandu APRÍL. V tomto experimentu byly použity rozpustné formy obou fúzních proteinů hBCMA-Fc a myc-mAPRIL.
Do média obsahujícího 10% FBS byly za pokojové teploty na 0,5 hodiny vloženy fuzní proteiny hBCMA-Fc a LTBR-Fc s různými TNF ligandy: myc-mAPRIL; myc-CD40L a myc-RANKL. Fc proteiny byly 1 až 2 hodiny inkubovány s partikulemi s navázaným proteinem A, třikrát promyty 1 ml PBS a analyzovány imunoblotem s myší moklonální protilátkou 9E10 (protilátka proti epitopu myc). Blot byl vyvolán se substrátem pro zesílenou chemiluminescenci.
V tomto experimentu byly úspěšně detekovány imunoprecipitáty myc-APRIL a hBCMA-Fc, z čehož lze usuzovat na to, že BCMA interaguje s ligandem APRÍL specificky na rozdíl od dalších TNF ligandů (myc-CD-40L a myc-RANKL), které neměly schopnost navázat se na BCMA. Myc-APRIL se zároveň neváže na LTBR-Fc.
Stejná membrána byla odbarvena a opětovně oblotována konjugátem křenové peroxidázy s protilátkou proti lidským imunoglobulinům. Bylo prokázáno, že v obou imunoprecipitátech bylo použito stejné množství LTBR-Fc i BCMA-Fc.
Příklad 2: Specifická interakce fúzních proteinů hBCMA-Fc a FLAG-hAPRIL
ELISA analýza: ELISA desky byly přes noc potaženy fúzním proteinem receptor-Fc (hBCMAFc-739 nebo hTNFR2-Fc-492) o koncentraci 1 pg/ml v uhličitanovém pufru o pH=9,6, inkubace probíhala při teplotě 4 °C. Potažené desky byly za pokojové teploty 2 hodiny blokovány pufrem PBS s 5% odtučněným sušeným mlékem a 0,5% Tweenem 20.
Byla připravena postupně ředěná řada ligandů (s faktorem 2 mezi jednotlivými ředěními) ve 100 μΐ blokovacího pufru (TNFa-197 od lOOOng/ml, muBAFF-657 od lOOOng/ml, hAPRIL-507 od 2000 ng/ml (neaktivní), hAPRIL-429 z 5x koncentrovaného média). Po inkubaci s ligandy byla plotna promyta pufrem PBS s 0,5% Tweenem 20 a byla přidána monoklonální protilátka M2 proti epitopu FLAG o koncentraci 0,5 pg/ml v ředicím pufru.
Navázaná protilátka byla poté detekována konjugátem PO s anti-myší protilátkou 1/2000 a enzymaticky vyvolána substrátem OPD.
Imunoprecipitační experimenty: buňky 293T byly transfikovány uvedeným expresním plazmidem (Rec-Fc nebo FLAG-ligand) a vysety na 9 cm plotny. Transfikované buňky byly ponechány 5 dní v 8 ml média Optimem (Gibco-BRL). Imunoprecipitace byla provedena smícháním 200 μΙ média nasyceného jednotlivými ligandy a se 400 μΐ pufru PBS as 10 μΙ ProtG-Sepharosy. Tato směs byla 1 hodinu otáčena na rotační třepačce, 4x promyta 1 ml PBS a nakonec povařena v 50 μΙ vzorkového pufru (+DTT). Do každé elektroforetické stopy bylo naneseno 20 μΐ z jednotlivých imunoprecipitací. Výsledky byly detekovány imunoblotem s monoklonální protilátkou M2
- 19CZ 297633 B6 proti epitopu FLAG (Sigma, St. Louis, Missouri) a s konjugátem PO s anti-myší protilátkou (1/2000). Bloty byly rovněž vyvolány konjugátem PO s protilátkou proti lidským IgG: 100 μΐ nasyceného kultivačního média bylo přesráženo MeOH/CHCL/lysozymem. Tato směs byla poté povařena ve vzorkovém pufru (s přídavkem DTT) a na elektroforézu bylo naneseno 20 μΐ mixu.
Výsledky byly detekovány imunoblotem s monoklonální protilátkou M2 proti epitopu FLAG a s konjugátem PO s anti-myší protilátkou (1/2000).
Příklad 3: Vazba ligandů myc-mAPRIL; hKayL-^140 (hBAFF) a FLAG-mBAFF k receptorům hBCMA-lg, hLT-R-Ig, nebo hp80 TNFR-Ig
Všechny experimenty byly provedeny při teplotě 25 °C a při průtokové rychlosti 10 μΐ za minutu.
Každý experiment byl proveden v pufru HBS (10 mM HEPES, 150 mM NaC, 0,005% detergentu P20, pH=7,4). Stejný roztok byl použit jak pro naředění vzorku, tak i pro vlastní promývání 15 měřicí cely v průběhu experimentu (running buffer).
Nejprve byl povrch čipu CM5 (BIACORE, lne.) aktivován N-hydroxysukcinimidem/N-ethylN'-(3-diethylaminopropyl)karbodiimid hydrochloridem (BIOCARE). 20 μΐ hBCMA-lg; 15 μΙ hLT-R05-Ig a 10 μΐ hp80 TNFrR, vše naředěné na 30 g/ml v lOmM kyselině octové bylo poté 20 blokováno nejprve jednou 30 μΐ a poté ještě jednou 15 μΐ ethanolamin hydrochloridem (pH=8,5).
Výsledkem byl čip potažený receptory o hustotě 1600 až 3700 rezonančních jednotek (RU). Čip byl regenerován 20 μΙ lmM kyseliny mravenčí. Toto potahování bylo zopakováno celkem pětkrát tak, aby bylo dosaženo reprodukovatelné a stabilní úrovně základního signálu.
Vlastní experiment byl proveden tak, že vždy 100 μΐ roztoku ligandů myc-mAPRIL, hKayL440, a FLAG-mBAFF naředěných na 30 pg/ml v ředicím pufru bylo vstříknuto na povrch čipu. Ihned po aplikaci ligandů byl čip promyt 500 μΐ ředicího pufru. Mezi jednotlivými experimenty byl povrch regenerován aplikací 20 μΙ lmM kyseliny mravenčí; po které následovala další aplikace 15 μΐ kyseliny mravenčí. Po regeneraci byl čip ekvilibrován ředicím pufrem.
Příklad 4; Příprava rozpustných forem receptoru
K vytvoření inhibitoru receptoru využitelného u lidí je třeba znát sekvenci cDNA kódující extra35 celulární doménu receptoru. Za pomoci známé myší cDNA sekvence je možné prohledat lidskou cDNA knihovnu a najít tak cDNA pro lidskou formu extracelulámí domény receptoru. Obdobné manipulace jsou odborníkům v oboru velmi dobře známy. Z lidské cDNA sekvence pak lze navrhnout oligonukleotidové primery pro PCR a amplifikovat tak extracelulámí doménu receptoru aniž by byla přítomna oblast transmembránová a intracelulámí. V typickém provedení lze 40 zahrnout většinu aminokyselin, které se nacházejí mezi poslední disulfídickými můstky propojenou „TNF doménou“ a transmembránovou doménou. Je možné měnit velikost „stonku“ (stalk region) a tím optimalizovat účinnost výsledného rozpustného receptoru. Tímto způsobem amplifikovaná DNA je rovnou navržena tak, aby obsahovala vhodná restrikční místa pro klonování do různých vektorů umožňujících expresi proteinu ve fúzi s C-koncovým Ig. Eventuálně je možné 45 na 3'konec vložit stop signál a připravit tak solubilní formu receptoru bez toho, aby byl použit postup využívající chimémí bílkoviny s Ig. Výsledné vektory mohou být exprimovány ve většině biotechnologicky využívaných systémů, tj. v kvasinkách, ve hmyzích buňkách, bakteriích i v savčích buňkách. Existují příklady pro všechny typy exprese. Ke konstruktu je možné připojit různé lidské Fc domény tak, aby bylo možné v závislosti na účelu optimalizovat či eliminovat reakce 50 s FcR a komplementem. Za účelem selektivně odstranit interakce s FcR či s komplementem či připojení N-koncově vázaných cukrů k Fc doméně lze eventuelně použít mutované formy těchto Fc oblastí.
-20CZ 297633 B6
Příklad 5: Příprava protilátek s agonistickým či antagonistickým účinkem:
Výše popsané rozpustné formy receptoru mohou být využity k imunizaci myší a k přípravě monoklonálních protilátek obvyklými způsoby. U výsledných monoklonálních protilátek testovaných EL1SA metodou může být dále testováno, zda jsou vhodné pro použití jako agonisté. Protilátky při různých in vitro buněčných testech mohou být v rozpustné formě či imobilizované na plastikovém podkladě. Smrt buněk z buněčné linie HT29 je vhodným a často používaným systémem, který je citlivý na signalizaci zprostředkovanou mnoha TNF receptory. Nemá-li tato buněčná linie příslušný receptor, mohou být buňky HT29 stabilně transfikovány úplnou (full length) cDNA pro tento receptor, tak, aby se umožnilo provedení testů cytotoxicity. Tyto buňky mohou být popřípadě též použity v „Cytosenzorickém“ přístroji čímž lze určit, zda aktivace receptoru může vyvolat změny pH, které jsou typické pro probíhající signalizaci. Signalizace přes receptory z rodiny TNF je v takovémto uspořádání a za použití dané metody snadno měřitelná a není přitom ani nutné znát aktuální biologické pochody spouštěné TNF receptorem. Monoklonální protilátky s agonistickým účinkem by byly uzpůsobeny pro klinické použití v humánní medicíně. Obdobný postup může rovněž být použit k popsání monoklonální protilátky s antagonistickým účinkem. Tyto monoklonální protilátky jsou definovány tak, že nemají agonistický účinek, inhibují však interakce receptoru s ligandem. To je prokázáno ELISA testem, vazebnou studií či pomocí přístroje BIAcore. Indukce sekrece chemokinů v různých buňkách jako odpověď na vazbu protilátky s agonistickým účinkem může být základem dalších testů.
Příklad 6: Testování inhibitorů interakce receptoru s ligandem
Za použití fúzního proteinu mezi receptorem a Ig je možné v jakýchkoliv kombinatorických knihovnách přímo hledat molekuly, které váží receptor. Schopnost těchto molekul inhibovat interakci receptoru s ligandem může být dále testována pomocí ELISA testu za použití rozpustného ligandu a fúzního proteinu mezi receptorem a Ig. Takováto ELISA může být užita přímo ke zjišťování přítomnosti inhibičních složek v různých knihovnách přírodních produktů atd. Receptor může být transfikován do buněčné linie jako například HT29 za účelem vytvořit biologický test (v tomto případě test cytotoxicity), který by pak byl základem pro vlastní screening.
Příklad 7: Inhibice růstu nádorů in vivo
Účinnost fúzního proteinu BCMA-lg při inhibici růstu nádorů in vivo byla testována na různých nádorových buněčných liniích. Při těchto pokusech byly použity imunodeficientní myši (Nu/Nu) bez thymu jimž byly subkutánně podány nádorové buňky. Agresivně rostoucí buněčná linie SW480 byla aplikována v dávce 8 x 105 buněk ve 100 μΐ sterilního PBS bez pyrogenů. Byla ponechána jedna neošetřená kontrolní skupina (n=5), zatímco dalším skupinám bylo podáno 100 pg kontrolní protilátky (n=6) nebo 100 pg fúzního proteinu BCMA-lg (n=6). Protilátky byly aplikovány těsně před implantací nádorových buněk, a poté byla dávka opakována vždy po 7 dnech. Průměr nádoru byl měřen mikrometrem a jeho objem vypočítán za použití vzorce V = 4/3 lir3.
Buňky SW480 z nádoru tlustého střeva rostou v myších Nu/Nu velmi rychle a hmatatelné nádory byly detekovány během 10 dnů. Po 24 dnech byl průměrný objem kontrolního nádoru 0,3 cm3, zatímco průměrný objem nádorů u myší ošetřených fúzním proteinem BCMA-lg byl 0,19 cm3, což znamená 46% redukci velikosti nádoru. Dále byly použity buňky HT29, rovněž z nádoru tlustého střeva, které v myších Nu/Nu také rostou agresivně. Pro tento experiment bylo subkutánně aplikováno lxlO6 buněk ve 100 pl sterilního PBS bez pyrogenů. Dávkovači režim protilátek odpovídal režimu použitému u buněk SW480. Hmatatelné nádory byly objeveny po 7 dnech. V kontrolních skupinách většina nádorů rostla velmi rychle. Po 42 dnech byl průměrný objem nádoru v kontrolních skupinách (neošetřené myši a myši ošetřené kontrolní protilátkou, n=12) 0,485 cm3, zatímco průměrná velikost nádorů ve skupině ošetřené fúzní proteinem BCMA-lg
-21 CZ 297633 B6 (n=) byla 0,095 cm1, tzn. menší o 80 %. Po 50 dnech bylo 30 % myší v kontrolní skupině klasifikováno jako terminální stádium, vzhledem k velikosti nádoru přesahující 1,5 cm1 a experiment byl zastaven. Naproti tomu žádná z myší ze skupiny ošetřené fúzním proteinem BCMA-Ig nebyla klasifikována jako terminální. Výsledky experimentu shrnuje tabulka 2.
Tabulka 2. Objemy nádorů a úmrtnost po aplikaci buněk HT29 po 50 dnech trvání experimentu.
kontrolní zvířata tneošetřená a zvířata ošetřená fúzním proteinem
ošetřená kontrolní protilátkou) BCMA-Ig
objem nádoru terminální objem nádoru terminální
stádium stádium
0,22 - 0,11 -
0,22 - 0,32 -
0,35 - 0,13 -
0,61 - 0,56 -
0,73 - 0,33
1,74 4-
2,53 +
1,51 +
0,90
0,44 __
0,32
1, 92 -
prům.:0,96 %: 30 prúm.:0,29 %:0
Z tabulky vyplývá, že došlo k 70% snížení objemu nádorů a je dále jasně patrný významný účinek ošetření fúzním proteinem BCMA-Ig na nádory odvozené od buněčné linie HT29.
Buněčná linie A549 z plicního tumoru roste pomaleji než výše popsané linie z nádorů bylo myším subkutánně implantován lxlO6 buněk ve 100 μΐ sterilního PBS bez pyrogenů. Protilátky byly dávkovány stejně jako ve výše popsaných příkladech. Hmatatelné nádory byly detekovány přibližně 20 dní po implantaci nádoru. 50 dní po implantaci byl průměrný objem nádoru 0,2 cm3 u kontrolních skupin (neošetřené myši a myši ošetřené kontrolní protilátkou; n=l 6) zatímco průměrný objem nádoru ve skupině ošetřené fúzním proteinem BCMA-Ig (n=7) byl 0,1 cm3, tzn. byla pozorována 50% inhibice růstu nádoru. Ve skupině myší ošetřených fúzních proteinem BCMA-Ig mělo po 50 dnech 57 % myší nádor menší než 0,1 cm3, zatímco z kontrolních myší
-22CZ 297633 B6 mělo takto malý nádor jen 6 %. 60 dní po implantaci nádoru vzrostl průměrný objem nádoru v kontrolní skupině na 0,3 cm3. Naproti tomu průměrný objem nádoru ve skupině myší ošetřených fúzním proteinem BCMA-Ig byl menší než 0,2 cm3 (0,188).
Myší buněčná linie NIH3T3 roste rovněž pomaleji než linie z nádorů tlustého střeva. Při pokusech s touto buněčnou linií bylo myším subkutánně implantováno 5x106 buněk ve 100 μΐ sterilního PBS bez pyrogenů. Protilátky byly dávkovány stejně jako ve výše popsaných příkladech. Buňky NIH3T3 tvoří po subkutánní implantaci do Nu/Nu myší zhoubný nádor vazivové tkáně (fibrosarkom). Hmatatelné nádory byly detekovány přibližně 4 týdny po implantaci nádoru. U myší z kontrolních skupin (n=l 1) tyto nádory narostly v průběhu dalších 10 dnů do průměrné velikosti 0,136 cm3. Naproti tomu nádory u myší ošetřených fúzním proteinem BCMA-Ig (n=5) dosáhly objemu pouze 0,03 cm3, tj. došlo k 78% snížení nádorové zátěže. 48 dní po implantaci nádoru činil průměrný objem nádoru v kontrolních skupinách 1,6 cm3, zatímco průměrný objem nádoru u myší ošetřených fúzním proteinem BCMA-Ig 0,8 cm3, tj. bylo dosaženo 50% snížení objemu nádoru. Po 52 dnech od implantace bylo 82% (9 z 11) myší v kontrolních skupinách klasifikováno jako terminální stádium s nádorem větším než l,5cm3, tzn. že ještě naživu zůstalo pouze 18 % zvířat.
Naproti ve skupině ošetřené fúzním proteinem BCMA-lg mělo pouze 40 % myší (3 z 5) nádor takového objemu, že musely být usmrceny. 60 % zvířat tak zůstalo naživu po celou dobu trvání experimentu. Popsané výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.
Výsledky popisující časový průběh růstu nádorových buněk NIH3T3 jsou znázorněny na obrázku 13. Výsledky popisující časový průběh růstu nádorových buněk SW480 jsou znázorněny na obrázku 14. Výsledky popisující časový průběh růstu nádorových buněk HT29 a diagram zachycující stav jednotlivých zvířat 42 dní po implantaci nádoru jsou znázorněny v obrázku 15 A. Výsledky popisující růst nádorové linie A549 u jednotlivých zvířat v 50 a 60 dní po implantace nádoru jsou znázorněny na obrázku 15B.
Tabulka 3: Přežití myší po aplikaci NIH3T3 buněk
% přežití 38 Dny po implantaci nádoru
42 48 52
Kontrola 100 90 64 18
BCMA-Ig 100 100 80 60
Výsledky inhibice růstu nádoru odvozeného od linie NIH3T3 viz obrázek 13. Výsledky inhibice růstu nádoru odvozeného od linie SW480 viz obrázek 14. Výsledky inhibice růstu nádoru odvozeného od linií HT29 a A549 jsou uvedeny na obrázku 15.
Příklad 8: BCMA-IgG způsobuje u normálních myší snížení počtu B lymfocytů
Osm týdnů staré samičky myší BALB/c byly zakoupeny od Jacksonových laboratoří (Bar Harbor, Maine).
Myším (3 myši na skupinu) bylo intreritoneálně aplikováno buď PBS, nebo 400 gg fúzního proteinu lidského BCMA s hulgGI (hBCMA-Ig, protein byl získán od Teresy Cachero, Biogen),
-23 CZ 297633 B6 nebo 400 μΐ purifikované lidské IgG (HulgG, Sandoz, Basilej, Švýcarsko). Aplikace byla provedena ve dnech -8, -5, -1 a +2. Myším bylo nultého dne podáno 100 μΐ 10% suspenze ovčích červených krvinek (SRBC, Colorado sérum company, Denver, Colorado).
Myši byly usmrceny a byla jim srdeční punkcí odebrána krev do mikrozkumavky s EDTA. Červené krvinky byly lyžovány v hypotonickém pufru. Krev byla rovněž odebrána bez přídavku EDTA pro přípravu séra. Suspenze jednotlivých buněk byly připraveny ze sleziny a mezenterických lymfatických uzlin (MLN) a opět byly červené krvinky lyžovány hypotonickým pufrem. Průtoková cytometrie byla provedena za použití PE-konjugátů protilátek proti CD45R/B220, ίο anti-syndekan/CD138 a anti-B7.2, a FITC-konjugátů proti IgM a proti CD45R/B220. Všechny monoklonální protilátky byly zakoupeny od společnosti Pharmingen (San Diego, Kalifornie). Fc receptory byly zablokovány 15 minutovou inkubací s 10 pg/ml pufru Fc-block (Pharmingen) na ledu, po které následovalo přidání konjugátů monoklonálních protilátek s PE a FITC a 20 až 30 minutová inkubace na ledu. Buňky byly jednou promyty a suspendovány v 0,5% roztoku para15 formaldehydu.
Data byla naměřena na průtokovém cytometru FACSalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornie) a analyzována za použití software CELLQuest™ (Becton Dickinson).
Po ošetřením fúzním proteinem hBCMA-Ig došlo k přibližně 50% snížení počtu B lymfocytů v periferní krvi a ve zkoumaných periferních lymfoidních orgánech. B220hlgh lgMlow B buňky tvořily 23,4 % a 21,5 % buněk v kontrolních skupinách ošetřených PBS respektive HulgG, zatímco u myší ošetřených fúzním proteinem hBCMA-lg představovaly tyto buňky pouze 9,9 % všech buněk. Plazmatické buňky (syndecan/CD138+) vykazovaly rovněž mírné snížení. Tyto 25 buňky tvořily 5,7 % respektive 4,8 % buněčné populace u kontrolních skupin ošetřených PBS respektive HulgG ve srovnání s 3,9 % u myší ošetřených PBS respektive fúzním proteinem hBCMA Ig. U molekuly B7.2 došlo ke zvýšení koncentrace na 3,1 % respektive 4,5 % z buněk B220+ u zvířat ošetřených PBS respektive HulgG ve srovnání s 1,9 % u myší ošetřených hBCMA-Ig.
V slezinách došlo k výraznému snížení počtu buněk B220hl8h po aplikaci fúzního proteinu hBCMA-Ig (18,8 % buněk) ve srovnání s 36,7 % a 40 % buněk po aplikaci PBS a HulgG. Tento pokles byl pozorován jak u subpopulací IgMhieh tak i u IgMlow (viz tabulka 1). Nebyla pozorována žádná změna v nově vzniklé subpopulaci B buněk ve slezině, B220lowlgMhlBh (údaje nejsou uve35 děny). Plazmatické buňky (syndecan/CD138+) vykazovaly pouze mírné snížení z 3,3 % a 3,4 % z buněk ve slezinách kontrolních zvířat po aplikaci PBS respektive HulgG, na 2,4 % ze všech buněk ve slezinách myší jimž byl podán fúzní protein hBCMA-lg.
Rovněž v mezenterických uzlinách (MLN) došlo k poklesu počtů B220+ B-lymfocytů z 26,7 % 40 respektive 35,8 % naměřených u kontrolních zvířat jimž byl aplikován PBS respektive HulgG na 14,1 % po aplikaci hBCMA-Ig. Data z těchto měření jsou shrnuta v tabulce 3.
Snížené procento B7.2+ B lymfocytů v krvi a plazmatických buněk v krvi a slezině myší ošetřených fúzním proteinem hBCMA-Ig po imunizaci ovčími krvinkami (SRBC) lze vysvětlit tím, že 45 dochází k inhibici aktivace a/nebo dozrávání B lymfocytů, a popřípadě ke zrychlené eliminaci aktivovaných B lymfocytů.
Jen velmi malé procento antigen-specifických B buněk je aktivováno a schopno odpovědět na přítomnost antigenu, v tomto případě SRBC.
-24CZ 297633 B6
Tabulka 3: populace B-lymfocytů u myší ošetřených fúzním proteinem hBCMA-lg, PBS a HulgG.
Krev B220híqh IgMlow Syndecan B7.2/ B220iow
PBS 23,4 ± 5,7 5,7 ± 1,5 3,1 ± 0,5
HulgG 21,5 ± 4,5 4,8 + 0,9 4,5 ± 1,0
Hbcma-Ig 9,9 ± 1,8 3,9 ± 0,6 1,9 ± 0,5
Slezina B220high IgM10W B220high IgM+ Syndecan
PBS 27,8 ± 1,6 11,9 ± 1,6 3,3 ± 0,8
HulgG 30,5 ± 2 11,8 ± 1,0 3,4 ± 0,7
Hbcma-Ig 10,6 ± 0,2 8,4 ± 0,2 2,4 ± 0,2
MLN B220 +
PBS 26, 7
HulgG 35,8 ±3,3
Hbcma-Ig 14,1 ± 5,9
Myši byly ošetřeny tak, jak bylo popsáno v metodice, data jsou vyjádřena v procentech ± standardní odchylka.
Protože aplikace fúzního protein hBCMA-lg měla za následek tak dramatickou redukci v počtech B buněk ve všech testovaných tkáních (cca 50% redukci), zdá se, že se aktivita fúzního proteinu hBCMA-lg rovněž zaměřuje proti klidovým, zralým B lymfocytům.
Z toho lze vyvozovat, že fúzní protein BCMA může být použit jako léčivo s klinickým využitím u nemocí způsobených B lymfocyty. Mezi tyto nemoci lze zahrnout autoimunitní onemocnění jako například systémový lupus erythematodes, myastenii gravis, autoimunitní hemolytickou anémii, idiopatickou trombocytopenii, tečkovité krvácení pod kůží (purpuru), anti-fosfolipidový syndrom, Chagovu chorobu, Basedowova choroba (exoftalmickou strumu), Wegenerovu granulomatózu, nodózní polyarteritidu a rychlou progresivní glomeluronefritidu. Toto léčivo má rovněž využití při léčbě onemocnění způsobených plazmatickými buňkami jako je například mnohonásobný myelom, Waldenstromova makroglobulinemie, primární amyloidóza nebo amyloidóza asociovaná s imunocyty, moklonální gammopathie neurčitého významu MGUS). Léčivo by mohlo najít rovněž využití při léčbě onkologických onemocnění jako jsou karcinomy B buněk, leukemie a lymfomy.
Odborníkům je zřejmé, že mohou být provedeny různé modifikace a variace v polypeptidech, přípravcích a způsobech podle vynálezu, aniž by došlo ke změně podstaty vynálezu nebo jeho rozsahu. Všechny takové modifikace jsou zahrnuty ve vynálezu jehož rozsah je dán následujícími nároky.
-25CZ 297633 B6
SEZNAM SEKVENCÍ <210* 1 <211> 736 <212> DNA <213>
<400> 1 ccaaacgatg agacttcctt caatttttac tgcagtttta ctcgcagcat cctccgcatz60 agctgctcca gtcaacacca caacagaaga tgaaacagca caaattccgg c:gaagctgi120 catcggtcac ccagatttag aaggggattc cgacgtcgct gúttcgccac tciccaacag180 cacaaataac gggtcattgt ttacaaatac taccattgcc agcattgctg ccaaagaaga240 aggggtatcc ctcgagaaaa gagaacaaaa acccatttct gaggaagacc tgaataaaga300 gccccaccca gtcccgcatc ttgttccagt taacatcacc tccaaggact ctgacgtgac360 agaggtgatg tggcaatícag tactcaggcg cgggagaggc ctggaggccc accgagacar420 tgcacgagcc tgggacactg gaatctacct gctctacagt caggccccgt ttcacgatg480 gactttcaca atgggtcagg tggtacctcg gaaaggacaa gggagaagag aaaccctatt540 ccgatgtacc agaagtatgc cttctgatcc tgaccgtgcc tacaacagct cctacagtgc600 aggtgtcttt cattcacatc aaggggatat taccactgtc aaaactccac gagcaaacgc660 aaaacttacc ctttccccgc acggaacat; cccggggrtc gtgaaacxat gagcggccgc 720 gaattaattc gcctta736 <210> 2 <211> 736 <212* DNA c213> my,j <400> 2 ggttcgccac uctaaaggaa gttaaaaacg acgtcaaaat aagcgccgta gaaagcgcaa60 tcgacgaggt cagctgtgat gttgtcttcc actttgccgc gtttaaggcc gacctcgaca120 gcagccaacg agtccaaatc ttcccccaaa gccacaacga caaaacggta aaaggttgtc180 gtgtttattg cccaataaca aatacctatg atgataacgg tcgtaacgac gatttcttct240 cccccacaga gagctctttt ctctcgcttc tgagtaaaga ctcctcctag acttatttct300 cgaggcgagt caggacgtag aacaaggcca attgtaatgg aggttcctga gactgcactg360 tctccactac accgttggtc atgaacccgc accctctccg gacctccggg cccctctgta420 acatgctcag accctgtgac cttaaataga cgagatatca gtccaggaca aagtactaca480 ccgaaagtgt tacccagtcc accacagagc cctccctgtt ccctcctctc tctgagataa540 ggctacatag tcttcatacg gaagaccagg actggcacgg atgttatcga cgatgccacg600 tccacagaaa gtaaatgtag ttcccccaca atagcgacag ttttaaggtg cccgtttgcg660 ttttgaatcg gaaagaggcg taccttgtaa ggaccccaaa cactttgata cccgccggcg 720 cttaattaag cggaat736
-26CZ 297633 B6 <210> 3 <211> 234 <212> PRT <213> hotno sapiens <400> 3
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala A-a Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asr. Thr Thr Thr Glu Asp Glu A-a Gin
20 25 3’0’
Ile Pro Ala Glu Ala Val _le Gly Tyr Ser Asp Leu G - u C-ly Asp Phe
35 40 45
Asp val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asr. Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Glr. Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn
85 90 95
Lys Glu Leu His Ser Val Leu His Leu Val Pro Val Asn Ile Thr Ser
100 105 110
Lys Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gin Pro Val Leu Arg Arg
115 120 125
Gly Arg Gly Leu Glu Ala Gin Gly Asp Ile Val Ar o Val Trp Asp Thr
130 135 140
Gly Ile Tyr Leu Leu Tyr Ser Gin Val Leu Phe His Asp Val Thr Phe
145 150 155 160
Thr Met Gly Gin Val Val Ser Arg Glu Gly Gin Gly Arg Arg Glu Thr
165 170 175
Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser Asp Pro Asp Arg Ala Tyr
180 185 190
Asn Ser Cvs Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gin Gly Asp Ile
195 200 205
Ile Thr Val Lys Ile Pro Ara Ala Asn Ala Lys Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
225 230
<210> 4 <211> 542 <212> DNA <213* homo sapiens <400> 4 ttaatcaaaa acaaagacga actctgtccc aggtgatgtg tccgaatcca ctttcaccat gatgtataag gtgtcttcca aactcaacct cc catggccatc tgacgataaa gcacctggtt gcaaccagct ggatgctgga gggtcaggtg aagtatgccc tttacaccaa ctctccacat atctacctca ggacccggac cccattaacg cttaggcgtg gtttatctgc gtgtctcgag tcccacccgg ggggatattc ggaaccttcc tcctcctgtt aggtgcagcc ccacctccaa ggagaggcct tgtatagcca aaggccaagg accgggccta tgagtgtcat tgggctttgt cacagctgtg gcagaaacaa ggatgactcc acaggcccaa ggccctgttc aaggcaggag caacagctgc aattccccgg gaaactgtga cggggcgatt aagaagcagc catgtaacag ggatatggcg caagacgtga actctatccc cacagcgcac gcaagggcga tctagagggc
6C 12C 1SC 240 300 360 420 480 540 542
-27CZ 297633 B6 <210> 5 <211> 542 <212> DUA <213 > homo sapiens <400> 5 aattagtttt tgtztctgcz caagacagca cccaccacec aggctcaggr gaaagtggca ctacatatrc cacagaaggt ttgaarrgga gg gcaccgatae aczgczatit cgzggaccaa cgtcggtcga cccacgacct cccagtccac tccacacggg aaatgtgott cagaggtaca tagazggagt rrtgggcczg gggcaazzgc gaatccgcao caaatagacg cacagagcio agagzgggzz cccctataag ccttggaagg aggagcacaa iscacgtcga cgzggaggzt crtctccgaa az&z&zcggz zzzcggzzcz zggzccggaz aczcazaaza azoccaaaca gtggcgacae cg:c:::c:: ccractcago cczccaggii ecaggacáaa gttgccgacg ttaaacggoc crttcacari gzzccgzzaa zzzzzcgzcg zzszazzgzz zzzazazcaz zzzzzgzazz zgag&zaacg azzzcgzgzz p c i <« *p O < i «> *r
On <210> 6 <211> 172 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Tr.r Ala V; ' w *Ό Gly A.sp
1 5 IC 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gin Val Glr. Leu Gin Lys
20 25 30
Gin Lys Lvs Gin Hi s Ser Val Leu EIS Leu Val Prc Ile Asr. Ala Thr
35 40 45’
Ser Lvs Asp Asp Ser Asp Val T e> v Glu val Met Trp Glr. Pro A..a Leu
50 55 60
Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gin Λ.ά Gin v-*-‘ Tvr Gly '/£_ Arg “ · Λ Glr.
€5 70 75 8 3
Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gl.n Val Leu Phe Gin ASp Val
85 90 95
Thr Phe Thr Met Gly Gin Val Val Ser Arg Glu Gly Gin Glv Arg Gin
100 105 11C
Glu Thr Leu Pr.e Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro ASp Arg
115 120 125
Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu rÍLS sJ 4.Γ* Gly
130 135 140
Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg A_& Arg Ala irVS Leu .Asn Leu
145 150 155 160
Ser Pro His Gly Tr.r Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
-28CZ 297633 B6 <210> 7 <211> 555 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 7 atgttgcaga tggctgggca gcgctcccaa aatgaatatt ttgacagttt gctgcatgct tgcatacctt gtcaacttcg atgttcttct aatactcctc ctctaacatg tcagcgrtat tgtaatgcaa gtgcgaccaa ttcagtgaaa ggaacgaatg cgattccctg gacctgtttg ggactgagct taataattcc tttggcagtt ttcgcgctaa tgctttcgct aaggaagata agctctgaac cattaaagga cgagtttaaa aacacaggat caggtctcct aggcatggct aacatcgacc tggaaaagag caggactggt gatgaaatta ttcttccgag aggcctcgag tacacggtgg aagaatgcac ctgtgaagac tacatcaaga gcaaaccgaa ggtcgactct gaccattgct ttccactccc agctatggag gaaggcgcaa ccattcttgt caccacgaaa acgaatgact attgcaagag cctgccagct gctttgagtg ctacggagat agagaaatca atttctgcta ggtaa <210> 8 <211* 184 <212> PRT <213> homo sapiens
120
180
240
300
360
420
48C
540
555 <400> 8
Met Leu Glr. Met Aid Gly Gin Cys Ser Gin Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Glr. Leu Arg Cys Ser Ser Asr. Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gin A.rg Tyr Cys Asn Ala Ser val Thr ... Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Ser Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Glv Leu
85 90 95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Va 1 Asp Ser ASp HIS Cys Pne
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr ile Leu Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Aj.3 Thr Glu
165 170 175
ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180
-29CZ 297633 B6 <210> 9 <211> 483 <212> DNA <213> homo sapiens «400» y gtcgaagcta caagaagatc atgaggagga gattgcacag tcgcaacaac atcacgttca 60 cactggttaa gtcactttcc ttgcttacgc taagagaccc ggacaaaccc tgacccgaat 120 catcaaagaa accgtcaaaa gcacgaccac aaaaacgact ccttctactc gagacttggt 180 aatttcctgc ccaaaEtcct gtgtcctagc ccagaggacc cgcaccgatt gtaactggac 240 cttctctcgt cctgaccact actttaataa gaaggctctc cggagctcat gtgccacctt 300 cttacgtgga cacttctgac gtagttctcg ctxggcttcc agctgagact ggtaacgaaa 360 ggcgagggtc gacacctcct tccgcgtcgg taagaacagt ggtgctcctg ctcactgata 420 acgttctcgg acggtcgacg aaactcacga tgcctctatc tctttagtta aagacgatcc 480 act 483 <210> 10 <211> 483 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 10 caacctcgat gctcttctaa tactcctcct ctaaca^gtc agcgttattg zaacgcaagt 63 gtgaccaatt cagcgaaagg aacgaacgcg actcEctgga cctgttcgcg ac:gagctca 120 ataatt-ct: zgccagttcc catgctaatg tttttgctaa ggaagataag crczgaacca 180 ttaaaggacg ag^xcaaaaa cacaggacca ggtczc-tgg gcacggccaa car.Lgacctg 240 gaaaagagca ggaccggtga igaaatcaEt cttccgagag gecccgag:a oaccgcggaa 300 caatgcacct gtgaagacrg caccaagaac aaacccaagg ccgactctga ccattgcctt 360 ccactcccag cratcgagga aggcgcaacc attct*g’ca ccacgaaaae gaatcactat 420 cgcaagagcc cgccagccgc 'tcgagtgec acggacatag agaaatcaac ctccgccagg 480 taa 483 <210> 11 <211> 906 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 11 acggagacag acacactccc gttatgggtg czgczgczcz gggttccagg ttccactggt 60 gacgtcacga tgttgcagat ggctgggcag tcctcccaaa atgaatazzt. zcacagcttg 120 tcgcatgctt acataccicg tcaacttcga cgcEctzcta atacicctcc Eccaacatgt 180 cagcgttatt gcaatgcaag tgtgaccaat tcagcgaaag gagtcgacaa aac:cacaca 240 cocccacccc gcccagcacc taaactcccg cggcgaocgt cagtctEccE ccvcccccca 300 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgx ggtggtggac 360 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aacEgccacg tggacggcgz ggaggtgcac 420 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgc ggtcagcgtc 480 ctcaccgtcc tgcaccagga ccggccgaat ggcaacgagt acaagtgcaa ggtetccaac 540 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atccceaaag ccaaagggca gccccgagaa 600 ccacaggtgc acaccctgcc cccaccccgg gacgacctga ccaagaaoca ggtcagcctg 660 acctgcctgg tcaaaggctc ctatcccagc gaca^cgccg tggagtggga gagcaatggg 720 cagccggaga acaacracaa gaccacgcct cccgtgtcgg actccgacgg ccccctcttc 780 ctctacagca agctcaccgc ggacaagagc aggcggcagc aggggaacg^. cttctcatgc 840 tcegtgacgc atgaggctcc gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccc 900 gggaaa 90é
-30CZ 297633 B6 <210> 12 <211> 302 <212> PRT <213> hor.o sapiens <400> 12
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Val Thr Met Leu Gin Met Ala Gly Gin Cys Ser
20 25 30
Gin Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu HÍS Ala Cys Ile Pro Cys Gin
35 40 45
Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Glr. Arg Tyr Cys
50 55 60
Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser Val Lys Gly Val Asp Lys Thr His Thr
65 70 75 80
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
85 90 95
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
100 105 110
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
115 120 125
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
130 135 140
Lys Pro Arg Glu Glu Glr. Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val val Ser Va ±
145 150 155 160
Leu Thr Val Leu His Glr. Asp Trp Leu Asr. Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
165 17 0 175
Lys Val Ser Asr. Lys Ax a Leu Pro Ala Pro Ile G- u Lys Tr ** Ile Ser
180 185 X 90
Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Τλ v* Leu Pro Pro
195 200 205
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
210 215 220
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
225 230 235 240
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
245 250 255
Gly Ser Phe Phe Leu Τ'/r Ser Lys Leu Thr Val Asp Lvs Ser Arg Trp
260 265 270
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
275 280 285
Asn His Tyr Thr Glr. Lys Ser Leu Ser beu Ser Pro Gly Lys
290 295 300
-31 CZ 297633 B6
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    5 1. Použití (a) polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, která (1) je alespoň z 80 % identická se sekvencí uvedenou jako aminokyselina 1 až aminokyselina 184 v sekvenci id. č. 8 a (2) váže se na APRÍL, (b) polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, která (1) je alespoň z 80 % identická se sekvencí uvedenou jako aminokyselina 1 až aminokyselina 52 v sekvenci id. č. 8 a (2) váže se na APRÍL,
    15 (c) polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, která je uvedena jako aminokyselina
    8 až aminokyselina 41 v sekvenci id. č. 8, nebo (d) protilátky namířené proti sekvenci id. č. 8
    20 pro přípravu farmaceutické kompozice k léčení nádorových buněk, které exprimují ligand indukující proliferací (APRÍL).
  2. 2. Použití podle nároku 1, kde polypeptid podle (a), (b) nebo (c) dále obsahuje Fc doménu sekretovaného proteinu.
  3. 3. Použití podle nároku 2, kde polypeptid podle (a), (b) nebo (c) dále obsahuje Fc doménu imunoglobulinu.
  4. 4. Použití podle nároku 3, kde imunoglobulin je IgG.
  5. 5. Použití podle nároku 4, kde imunoglobulin je lidský imunoglobulin.
  6. 6. Použití podle nároku 5, kde polypeptid dále obsahuje sekvenci id. č. 12.
    35
  7. 7. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde nádorové buňky jsou karcinom.
  8. 8. Použití podle nároku 7, kde karcinom je vybrán ze skupiny sestávající z plicního karcinomu, karcinomu tlustého střeva, karcinomu prostaty a karcinomu prsu.
    40
  9. 9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kde nádorové buňky se vyskytují u savce.
  10. 10. Použití podle nároku 9, kde savec je člověk.
    33 výkresů
CZ20021169A 1999-10-06 2000-10-05 Pouzití BCMA pro výrobu farmaceutického prípravkupro lécení nádoru exprimujících APRIL CZ297633B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15793399P 1999-10-06 1999-10-06
US18180700P 2000-02-11 2000-02-11
US21568800P 2000-06-30 2000-06-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20021169A3 CZ20021169A3 (cs) 2002-09-11
CZ297633B6 true CZ297633B6 (cs) 2007-02-14

Family

ID=27388102

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20021169A CZ297633B6 (cs) 1999-10-06 2000-10-05 Pouzití BCMA pro výrobu farmaceutického prípravkupro lécení nádoru exprimujících APRIL

Country Status (30)

Country Link
US (1) US7276241B2 (cs)
EP (3) EP1223964B1 (cs)
JP (2) JP4880155B2 (cs)
KR (1) KR100759295B1 (cs)
CN (1) CN1263507C (cs)
AT (1) ATE360434T1 (cs)
AU (1) AU776852B2 (cs)
BG (1) BG65473B1 (cs)
BR (1) BR0014583A (cs)
CA (1) CA2386463C (cs)
CZ (1) CZ297633B6 (cs)
DE (1) DE60034586T2 (cs)
DK (1) DK1223964T3 (cs)
EA (1) EA005601B1 (cs)
EE (1) EE05212B1 (cs)
GE (1) GEP20043375B (cs)
HK (1) HK1044710B (cs)
HU (1) HUP0203567A2 (cs)
IL (3) IL148839A0 (cs)
IS (1) IS6322A (cs)
MX (1) MXPA02003393A (cs)
NO (1) NO331683B1 (cs)
NZ (1) NZ517907A (cs)
PL (1) PL204010B1 (cs)
RS (1) RS51602B (cs)
SK (1) SK286331B6 (cs)
TR (1) TR200200912T2 (cs)
UA (1) UA74798C2 (cs)
WO (1) WO2001024811A1 (cs)
ZA (1) ZA200202578B (cs)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7217788B2 (en) 1996-03-14 2007-05-15 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor delta polypeptides
US6541224B2 (en) 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
DK1086223T3 (da) 1998-06-01 2009-11-30 Agensys Inc Nye serpentintransmembranantigener udtrykt i humane cancerformer og anvendelser deraf
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
MXPA02001665A (es) 1999-08-17 2003-07-14 Biogen Inc Receptor de baff (bcma) como agente inmunorregulador.
EP1255558B1 (en) * 2000-02-16 2006-06-14 Genentech, Inc. Anti-april antibodies and hybridoma cells
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US7371388B1 (en) 2000-05-04 2008-05-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of Sjogren's syndrome by administration of TR18 polypeptides
CA2408617A1 (en) * 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
ES2609016T3 (es) 2000-06-16 2017-04-18 Human Genome Sciences, Inc. Anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a BLyS
US20030091565A1 (en) 2000-08-18 2003-05-15 Beltzer James P. Binding polypeptides and methods based thereon
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
PL403488A1 (pl) 2001-05-24 2013-07-08 Zymogenetics, Inc. Zastosowanie bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina, bialko fuzyjne, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca bialko fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna i sposób wytwarzania bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina
JP2004537290A (ja) * 2001-05-24 2004-12-16 ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド 腫瘍壊死因子δ（ＡＰＲＩＬ）に対する抗体
IL160127A0 (en) * 2001-08-03 2004-06-20 Genentech Inc Tacis and br3 polypeptides and uses thereof
US7494646B2 (en) 2001-09-06 2009-02-24 Agensys, Inc. Antibodies and molecules derived therefrom that bind to STEAP-1 proteins
US7736657B2 (en) * 2002-02-10 2010-06-15 Apoxis S.A. Fusion constructs containing active sections on TNF ligands
WO2003072713A2 (en) * 2002-02-21 2003-09-04 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
AU2003256836A1 (en) * 2002-07-25 2004-02-16 Genentech, Inc. Taci antibodies and uses thereof
JP5524441B2 (ja) 2003-03-28 2014-06-18 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 短縮されたｂａｆｆレセプター
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
CA2526402A1 (en) * 2003-06-05 2005-01-20 Genentech, Inc. Blys antagonists and uses thereof
MXPA06004301A (es) 2003-10-20 2006-06-05 Biogen Idec Inc Regimenes terapeuticos para antagonistas del factor de activacion de celulas b.
BRPI0418766B8 (pt) 2004-04-22 2021-05-25 Agensys Inc anticorpo ou seu fragmento, vetor, composição farmacêutica, ensaio e método para detectar a presença de proteína steap-1, bem como método para distribuir um agente citotóxico ou um agente de diagnóstico
CN1786016B (zh) * 2004-12-09 2010-12-29 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种人工构建的生物活性分子及其制备方法
JP2008525002A (ja) * 2004-12-23 2008-07-17 ラボラトワール セローノ ソシエテ アノニム Ｂｃｍａポリペプチド及びその使用
US20080254030A1 (en) * 2005-01-28 2008-10-16 Charles Mackay Use of Baff to Treat Th2-Mediated Conditions
JP5118037B2 (ja) 2005-08-09 2013-01-16 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｔａｃｉ融合分子を用いた異常細胞増殖の処置及び予防のための方法
AU2006278229B2 (en) 2005-08-09 2011-10-27 Ares Trading S.A. Methods for treating B-cell malignancies using TACI-Ig fusion molecule
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
JP5905184B2 (ja) 2005-10-13 2016-04-20 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッドＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． 自己抗体陽性疾患を有する患者の処置に使用するための方法および組成物
US9726673B2 (en) 2005-11-23 2017-08-08 Genentech, Inc. Methods and compositions related to B cell assays
US8211649B2 (en) 2006-03-31 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma
EP2035028A2 (en) 2006-05-15 2009-03-18 Ares Trading S.A. Methods for treating autoimmune diseases using a taci-ig fusion molecule
RS52452B (en) 2006-10-27 2013-02-28 Genentech Inc. Antibodies and Immunoconjugates and Their Use
MD23Z (ro) * 2008-12-02 2010-01-31 Василе ЖОВМИР Metodă de tratament diferenţiat al carcinomului lobular in situ neinvaziv al glandei mamare
MD24Z (ro) * 2008-12-02 2010-01-31 Василе ЖОВМИР Metodă de tratament diferenţiat al carcinomului neinvaziv al glandei mamare
MD35Z (ro) * 2008-12-02 2010-01-31 Василе ЖОВМИР Metodă de apreciere a riscului dezvoltării carcinomului neinvaziv in situ al glandei mamare
MD36Z (ro) * 2008-12-02 2010-01-31 Василе ЖОВМИР Metodă de tratament diferenţiat al carcinomului ductal in situ neinvaziv al glandei mamare
EP2488200A4 (en) * 2009-10-14 2013-06-12 Merck Sharp & Dohme APRIL ANTAGONISTS AND METHOD FOR THEIR USE
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
WO2013171296A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Diagnostic and treatment of sarcoidosis
TW201425336A (zh) * 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
ES2829499T3 (es) 2013-02-05 2021-06-01 Engmab Sarl Método para la selección de anticuerpos contra BCMA
EP2762497A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
US9688767B2 (en) 2013-03-15 2017-06-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method of predicting survival time in myocardial infarction patients by measuring BAFF levels
NL2011406C2 (en) 2013-09-06 2015-03-10 Bionovion Holding B V Method for obtaining april-binding peptides, process for producing the peptides, april-binding peptides obtainable with said method/process and use of the april-binding peptides.
GB201317929D0 (en) * 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
EP3071025B1 (en) * 2013-11-19 2018-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized a proliferation-inducing ligand gene
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
EA036975B1 (ru) 2015-08-03 2021-01-21 Энгмаб Сарл Моноклональные антитела против bcma
ES2814550T3 (es) 2015-08-17 2021-03-29 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos anti-BCMA, moléculas que se unen a antígeno biespecífico que se unen a BCMA y CD3, y usos de los mismos
WO2017083511A1 (en) * 2015-11-13 2017-05-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-bcma polypeptides and proteins
PL3380522T3 (pl) 2015-11-25 2024-03-25 Visterra, Inc. Cząsteczki przeciwciał wobec april i ich zastosowania
AU2017219747B2 (en) 2016-02-17 2023-09-28 Seagen Inc. BCMA antibodies and use of same to treat cancer and immunological disorders
US11613572B2 (en) 2016-06-21 2023-03-28 Teneobio, Inc. CD3 binding antibodies
CN114395048A (zh) 2016-09-14 2022-04-26 特尼奥生物股份有限公司 Cd3结合抗体
BR112019008426A2 (pt) 2016-11-02 2019-09-03 Engmab Sarl anticorpo biespecífico contra bcma e cd3 e um fármaco imunológico para uso combinado no tratamento de mieloma múltiplo
KR102633423B1 (ko) 2016-12-21 2024-02-06 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
PE20200010A1 (es) 2017-04-03 2020-01-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a steap-1
EP3642237A2 (en) 2017-06-20 2020-04-29 Teneobio, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
JP7240335B2 (ja) 2017-06-20 2023-03-15 テネオワン， インコーポレイテッド 抗ｂｃｍａ重鎖のみ抗体
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
CA3098420A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Novartis Ag Binding molecules against bcma and uses thereof
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
KR20220020810A (ko) 2019-06-14 2022-02-21 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd22와 cd3에 결합하는 다중특이적 중쇄 항체
JP2022542088A (ja) 2019-07-30 2022-09-29 シャンハイ ハンセン バイオメディカル カンパニー リミテッド 抗ｂｃｍａ抗体、その抗原結合断片、及びそれらの医療用途
PE20230431A1 (es) 2020-04-29 2023-03-08 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada multiespecificos con regiones constantes de cadena pesada modificadas
TW202330622A (zh) 2020-04-29 2023-08-01 美商泰尼歐生物公司 具有經修飾重鏈恆定區之多特異性重鏈抗體
KR20230009450A (ko) 2020-05-11 2023-01-17 얀센 바이오테크 인코포레이티드 다발성 골수종을 치료하기 위한 방법
JP2023527563A (ja) * 2020-05-29 2023-06-29 チヌーク セラピューティクス，インコーポレイテッド ＡＰＲＩＬ結合抗体によるＩｇＡ腎症を治療する方法
CR20220656A (es) 2020-06-30 2023-03-01 Teneobio Inc Unión de anticuerpos multiespecíficos a bcma
IL305144A (en) 2021-02-16 2023-10-01 Janssen Pharmaceutica Nv Trispecific antibodies targeting BCMA, GPRC5D and CD3
KR20240004462A (ko) 2021-04-08 2024-01-11 마렝고 테라퓨틱스, 인크. Tcr에 결합하는 다기능성 분자 및 이의 용도
TW202309522A (zh) 2021-05-11 2023-03-01 美商健生生物科技公司 用於監測復發性及／或難治性多發性骨髓瘤之治療的方法及組成物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999012965A2 (en) * 1997-09-12 1999-03-18 Biogen, Inc. April- a novel protein with growth effects
WO2000040716A2 (en) * 1999-01-07 2000-07-13 Zymogenetics, Inc. Soluble receptor br43x2 and methods of using them for therapy
WO2001012812A2 (en) * 1999-08-17 2001-02-22 Biogen, Inc. Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US6218510B1 (en) * 1994-03-02 2001-04-17 Brigham & Woman's Hospital B7-1 and B7-2 polypeptides
JP2001501453A (ja) 1996-03-14 2001-02-06 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド ヒト腫瘍壊死因子δおよびε
US6541224B2 (en) * 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
ATE302272T1 (de) 1996-10-25 2005-09-15 Human Genome Sciences Inc Neutrokin alpha
AU5705898A (en) 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) * 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
IL133315A0 (en) 1997-06-06 2001-04-30 Regeneron Pharma Ntn-2 member of tnf ligand family
CA2292835A1 (en) 1997-06-06 1998-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
AU9376498A (en) 1997-09-05 1999-03-22 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
EE200000148A (et) * 1997-09-12 2001-02-15 Biogen, Incorporated Kay - uus immuunsüsteemi valk
US6297367B1 (en) * 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
AU2093499A (en) 1997-12-30 1999-07-19 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
WO2000026244A2 (en) 1998-11-04 2000-05-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US20060067933A1 (en) * 1999-01-07 2006-03-30 Gross Jane A Soluble receptor BR43x2 and methods of using
EP1146892B1 (en) 1999-01-25 2003-08-20 Biogen, Inc. Baff, inhibitors thereof and their use in the modulation of the b-cell response
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
AU777536B2 (en) 1999-02-23 2004-10-21 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
JP2002541779A (ja) * 1999-02-24 2002-12-10 ザ ジュネラル ホスピタル コーポレーション シグナル伝達中間体のクローニング方法
WO2000058362A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
US6475987B1 (en) * 1999-05-06 2002-11-05 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 receptor homologues
AU3495301A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Biogen Inc Heterologous polypeptide of the tnf family
EP1255558B1 (en) * 2000-02-16 2006-06-14 Genentech, Inc. Anti-april antibodies and hybridoma cells
US20040013674A1 (en) 2001-04-27 2004-01-22 Christine Ambrose Taci as an anti-tumor agent
CA2408617A1 (en) 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
ES2609016T3 (es) 2000-06-16 2017-04-18 Human Genome Sciences, Inc. Anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a BLyS
AU2001288260A1 (en) 2000-08-15 2002-03-13 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
WO2003055979A2 (en) 2001-11-16 2003-07-10 Human Genome Sciences, Inc. ANTIBODIES THAT IMMUNOSPECIFICALLY BIND TO BLyS

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999012965A2 (en) * 1997-09-12 1999-03-18 Biogen, Inc. April- a novel protein with growth effects
WO2000040716A2 (en) * 1999-01-07 2000-07-13 Zymogenetics, Inc. Soluble receptor br43x2 and methods of using them for therapy
WO2001012812A2 (en) * 1999-08-17 2001-02-22 Biogen, Inc. Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Madry, C. et al.: "The characterization of murine BCMA gene defines it as a new member of the tumor necrosis factor receptor superfamily", Int. Immunol. 10(11):1693-702, 1998 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1263507C (zh) 2006-07-12
DE60034586D1 (de) 2007-06-06
EE05212B1 (et) 2009-10-15
KR20020053066A (ko) 2002-07-04
HK1044710B (zh) 2007-12-07
DE60034586T2 (de) 2008-02-28
AU7864500A (en) 2001-05-10
IL148839A0 (en) 2002-09-12
CN1399556A (zh) 2003-02-26
CZ20021169A3 (cs) 2002-09-11
EP2324844A2 (en) 2011-05-25
DK1223964T3 (da) 2007-08-27
US7276241B2 (en) 2007-10-02
JP4880155B2 (ja) 2012-02-22
ATE360434T1 (de) 2007-05-15
NO20021594D0 (no) 2002-04-04
GEP20043375B (en) 2004-11-25
IL148839A (en) 2015-01-29
UA74798C2 (uk) 2006-02-15
HK1044710A1 (en) 2002-11-01
YU25302A (sh) 2005-06-10
US20030082175A1 (en) 2003-05-01
WO2001024811A1 (en) 2001-04-12
JP2011079863A (ja) 2011-04-21
EA005601B1 (ru) 2005-04-28
BG65473B1 (bg) 2008-09-30
EP1223964A1 (en) 2002-07-24
MXPA02003393A (es) 2004-08-19
BG106670A (en) 2002-12-29
PL204010B1 (pl) 2009-12-31
EA200200427A1 (ru) 2002-12-26
EP1847273A1 (en) 2007-10-24
JP2003510366A (ja) 2003-03-18
KR100759295B1 (ko) 2007-09-18
EE200200181A (et) 2003-06-16
CA2386463C (en) 2012-02-07
CA2386463A1 (en) 2001-04-12
SK4512002A3 (en) 2002-12-03
RS51602B (sr) 2011-08-31
PL355102A1 (en) 2004-04-05
NO20021594L (no) 2002-06-05
NO331683B1 (no) 2012-02-20
HUP0203567A2 (hu) 2003-02-28
ZA200202578B (en) 2003-07-02
NZ517907A (en) 2004-01-30
IS6322A (is) 2002-03-22
IL204401A (en) 2014-12-31
BR0014583A (pt) 2002-06-11
EP2324844A3 (en) 2013-12-11
SK286331B6 (en) 2008-07-07
EP1223964B1 (en) 2007-04-25
AU776852B2 (en) 2004-09-23
TR200200912T2 (tr) 2002-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ297633B6 (cs) Pouzití BCMA pro výrobu farmaceutického prípravkupro lécení nádoru exprimujících APRIL
US10494416B2 (en) Methods of modulating immune responses using BCMA polypeptide
JP2015108015A (ja) Ｉｌ−１７ａ／ｆヘテロ二量体ポリペプチドおよびその治療上の使用
JPH07508178A (ja) レセプター活性化
JP2009515520A (ja) 肝細胞成長因子イントロン融合蛋白
WO2007049642A1 (ja) カプサイシン受容体の活性調節剤、及びそれを用いた医薬組成物

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20161005