CN115715220A - 具有经修饰重链恒定区的多特异性重链抗体 - Google Patents

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Abstract

提供多特异性人类重链抗体(例如UniAbsTM)，其具有赋予有利性质的经修饰重链恒定区。本发明进一步涉及制造此类抗体的方法、包含此类抗体的组合物，包括药物组合物，以及它们治疗特征在于一种或多种本文所述的结合靶的表达的病症的用途。

Description

具有经修饰重链恒定区的多特异性重链抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年4月29日提交的美国临时专利申请序列号63/017,589以及于2020年11月2日提交的美国临时专利申请序列号63/108,796的申请日的优先权权益，这些申请的全部公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及多特异性人类重链抗体(例如UniAbsTM)，其具有赋予有利性质的经修饰重链恒定区。本发明进一步涉及制造此类抗体的方法、包含此类抗体的组合物，包括药物组合物，以及它们治疗特征在于一种或多种本文所述的结合靶的表达的病症的用途。
背景技术
经修饰Fc区
蛋白质工程的进展已引起对两个或更多个靶具有结合亲和力的多特异性抗体的成功制造和临床使用。然而，由于其异二聚体性质，必须利用适当措施来促进多特异性抗体中期望结合序列组合的正确配对，并且因此促进多肽亚基的正确配对。Wang等人，mAbs 10:8,1226-1235(2018)。
规避错配多肽亚基问题的一种方法称为“旋钮入孔(knobs-into-holes)”(KiH)，并且其旨在通过在CH2和/或CH3结构域中引入突变来修饰接触界面迫使两条不同的抗体重链配对。在一条链上，粗大的氨基酸经具有短侧链的氨基酸替代以产生“孔”。相反，具有大侧链的氨基酸引入另一重链中以产生“旋钮”。通过共表达该两条重链，观察到异二聚体形成(“旋钮-孔”)的产率高于同二聚体形成(“孔-孔”或“旋钮-旋钮”)，此归因于旋钮-孔对更有利的稳定性(Ridgway,J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617-621；以及WO 96/027011)。
尽管这种策略对于实现期望异二聚体似乎有吸引力，但所得多特异性抗体的其它性质高度依赖于Fc区的特定氨基酸序列，即效应功能，例如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。另外，效应功能活性可诱导细胞因子的产生，此可导致不期望炎症反应的“细胞因子风暴”。Gupta等人，Journal of Interferon&Cytokine Research 40:1,19-23(2019)。因此，在某些情况下，需要降低或完全消除效应功能，例如以避免损害或杀伤多特异性抗体结合的免疫细胞(例如T细胞)，和/或避免不期望的细胞因子产生和所导致的不期望的炎症反应。
另外，将氨基酸修饰引入蛋白质中可具有严重缺点，即基于非天然序列的存在，诱导患者对所述蛋白质的免疫反应。因此，多特异性抗体的开发需要鉴别以下序列：与天然抗体(如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的一般结构非常相似并且与天然序列的偏差最小，但成功地纳入可同时实现促进期望异二聚化、同时还实现一种或多种效应功能的降低或消除的目标的修饰。
为平衡这些竞争性需求，本发明者关注IgG4 Fc，已知其天然序列具有相对较低水平的效应功能活性。Crescioli等人，Curr Allergy Asthma Rep 16:7(2016)。然而，尽管IgG4看似具有这个优点，但由于其特定铰链区序列，已知其会发生活体内链交换反应，此呈现实现期望异二聚化的额外复杂性。Labrijn等人，Nature Biotechnology 27,767-71(2009)。因此，需要经修饰的重链恒定区序列来实现期望异二聚化，纳入降低或消除效应功能的修饰，同时纳入降低或消除IgG4中的链交换反应的修饰。本文所述的分子解决了这些和其它挑战。
重链抗体
在常规IgG抗体中，重链和轻链的缔合部分归因于轻链恒定区与重链CH1恒定结构域之间的疏水相互作用。在重链框架区2(FR2)和框架区4(FR4)中存在还有助于重链与轻链之间的这种疏水相互作用的额外残基。
然而，已知骆驼科(骆驼亚目，其包括骆驼、单峰骆驼和骆马)的血清含有一大类仅由成对H链构成的抗体(仅重链抗体或UniAbsTM)。骆驼科(单峰骆驼(Camelusdromedarius)、双峰骆驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lamaguanaco)、羊驼(Lama alpaca)和瘦驼(Lama vicugna))的UniAbsTM具有由单一可变结构域(VHH)、铰链区和两个恒定结构域(CH2和CH3)组成的独特结构，所述两个恒定结构域与经典抗体的CH2和CH3结构域高度同源。这些UniAbsTM缺少恒定区的第一结构域(CH1)，其存在于基因组中，但在mRNA加工期间被剪接出来。CH1结构域的缺失解释了UniAbsTM中轻链的缺失，这是因为该结构域是轻链恒定结构域的锚定位置。此类UniAbsTM天然进化以赋予常规抗体或其片段的三个CDR的抗原结合特异性和高亲和力(Muyldermans,2001；J Biotechnol 74:277-302；Revets等人，2005；Expert Opin Biol Ther 5:111-124)。软骨鱼(例如鲨鱼)还已进化出不同类型的免疫球蛋白，称为IgNAR，其缺少轻多肽链并且完全由重链构成。IgNAR分子可通过分子工程操纵以产生单一重链多肽的可变结构域(vNARs)(Nuttall等人，Eur.J.Biochem.270,3543-3554(2003)；Nuttall等人，Function and Bioinformatics 55,187-197(2004)；Dooley等人，Molecular Immunology 40,25-33(2003))。
在1960年代确立不含轻链的仅重链抗体结合抗原的能力(Jaton等人(1968)Biochemistry,7,4185-4195)。在物理上与轻链分开的重链免疫球蛋白相对于四聚体抗体保留80％的抗原结合活性。Sitia等人(1990)Cell,60,781-790证实，在哺乳动物细胞培养物中，从重排小鼠μ基因去除CH1结构域可产生不含轻链的仅重链抗体。所产生的抗体保留VH结合特异性和效应功能。
可通过免疫针对多种抗原产生具有高特异性和亲和力的重链抗体(van derLinden,R.H.等人，Biochim.Biophys.Acta.1431,37-46(1999))，并且可在酵母中容易地克隆和表达VHH部分(Frenken,L.G.J.等人，J.Biotechnol.78,11-21(2000))。它们的表达水平、溶解度和稳定性显著高于经典F(ab)或Fv片段的表达水平、溶解度和稳定性(Ghahroudi,M.A.等人，FEBS Lett.414,521-526(1997))。
其中λ(lambda)轻链(L)基因座和/或λ和κ(kappa)L链基因座已在功能上沉默的小鼠和由此类小鼠产生的抗体描述于美国专利第7,541,513号和美国专利第8,367,888号中。小鼠和大鼠中仅重链抗体的重组产生已报道于例如WO2006008548；美国申请公布第20100122358号；Nguyen等人，2003,Immunology；109(1),93-101；Brüggemann等人，Crit.Rev.Immunol.；2006,26(5):377-90；以及Zou等人，2007,J Exp Med；204(13):3271-3283中。通过锌指核酸酶的胚胎显微注射产生基因剔除大鼠描述于Geurts等人，2009,Science,325(5939):433中。可溶性仅重链抗体和产生此类抗体的包含异源重链基因座的转基因啮齿类动物描述于美国专利第8,883,150号和美国专利第9,365,655号中。包含单结构域抗体作为结合(靶向)结构域的CAR-T结构描述于例如Iri-Sofla等人，2011,Experimental Cell Research 317:2630-2641和Jamnani等人，2014,Biochim BiophysActa,1840:378-386中。
B细胞成熟抗原(BCMA)
BCMA(也称为肿瘤坏死因子超家族成员17，TNFRSF17)(UniProt Q02223)是仅在浆细胞和浆母细胞上表达的细胞表面受体。BCMA是肿瘤坏死因子(TNF)超家族中两种配体的受体：APRIL(诱导增殖的配体，也称为TNFSF13；TALL-2和TRDL-1；BCMA的高亲和力配体)和B细胞活化因子(BAFF)(也称为BLyS；TALL-1；THANK；zTNF4；TNFSF20；以及D8Ertd387e；BCMA的低亲和力配体)。APRIL和BAFF是结合BCMA并且促进浆细胞存活的生长因子。BCMA还在人类多发性骨髓瘤(MM)中的恶性浆细胞上高表达。结合至BCMA的抗体描述于例如Gras等人，1995,Int.Immunol.7:1093-1106、WO200124811和WO200124812中。与TACI交叉反应的抗BCMA抗体描述于WO2002/066516中。针对BCMA和CD3的双特异性抗体描述于例如US 2013/0156769 A1和US 2015/0376287A1中。已报道抗BCMA抗体-MMAE或抗BCMA抗体-MMAF结合物选择性诱导多发性骨髓瘤细胞的杀伤(Tai等人，Blood 2014,123(20):3128-38)。Ali等人，Blood 2016,128(13):1688-700已报道，在临床试验(#NCT02215967)中，靶向BCMA的嵌合抗原受体(CAR)T细胞可缓解人类患者的多发性骨髓瘤。
PSMA
PSMA(也称为前列腺特异性膜抗原和谷氨酸羧肽酶II，UniProt Q04609)是具有N-乙酰化α连接的酸性二肽酶、叶酸水解酶和二肽基肽酶活性的II型跨膜蛋白。它在人类中由FOLH1基因编码，并且由19个氨基酸的细胞质结构域、24个氨基酸的跨膜部分和707个氨基酸的细胞外部分组成。所述蛋白质是作为非共价同二聚体发挥酶活性。PSMA在前列腺上皮组织上表达并且在前列腺癌和实体肿瘤的新血管系统中上调。它还以低水平在健康组织(例如脑、肾脏和唾液腺)中表达，但它在恶性前列腺组织中的过表达使其成为前列腺癌的治疗性治疗的有吸引力的靶。鉴于其在恶性新血管系统中的高表达，它还可与实体肿瘤的疗法或成像相关。已描述靶向PSMA的单克隆抗体、抗体-药物结合物和嵌合抗原受体T细胞用于治疗转移性前列腺癌(Hernandez-Hoyos等人，2016,PMID:27406985；DiPippo等人，2014,PMID:25327986；Serganova等人，2016,PMID:28345023)。另外，正在研究特异性针对PSMA的放射性核素结合物用于前列腺癌的成像和治疗(例如Hofman等人，2018PMID:29752180)。
CD19
CD19(也称为B-淋巴细胞表面抗原B4，UniProt P15391)是在所有人类B细胞上表达、但未在浆细胞上发现的细胞表面受体。CD19是将细胞质信号传导蛋白募集至膜并且在CD19/CD21复合物中起作用以减小B细胞受体信号传导路径的阈值的跨膜蛋白。CD19具有相对较大的240个氨基酸的细胞质尾。细胞外Ig样结构域由潜在二硫键连接的非Ig样结构域和N连接的碳水化合物添加位点分开。细胞质尾在C末端附近含有至少九个酪氨酸残基，已显示其中的一些经磷酸化。与CD20和CD22一样，CD19在B细胞谱系中的限制性表达使其成为B细胞恶性病的治疗性治疗的有吸引力的靶。已描述许多特异性针对CD19的单克隆抗体和抗体药物结合物(例如Naddafi等人，2015,PMC4644525)。另外，抗CD19嵌合抗原受体T细胞已经批准用于治疗白血病(例如Sadelain等人，2017,PMID:29245005)。
发明内容
本发明的方面包括经分离的多特异性抗体，其包含：第一重链多肽亚基，其包含含有突变S228P、F234A、L235A和T366W的突变的人类IgG4恒定区；以及第二重链多肽亚基，其包含含有突变S228P、F234A、L235A、T366S、L368A和Y407V的突变的人类IgG4恒定区。在一些实施方案中，第一重链多肽亚基的突变的人类IgG4恒定区或第二重链多肽亚基的突变的人类IgG4恒定区缺少CH1结构域。在一些实施方案中，第一重链多肽亚基的突变的人类IgG4恒定区包含SEQ ID NO:73或55的序列，并且第二重链多肽亚基的突变的人类IgG4恒定区包含SEQ ID NO:72或54的序列。
在一些实施方案中，根据本发明实施方案的多特异性抗体还包含对CD3具有结合特异性的第一结合部分，所述第一结合部分包含：重链可变结构域，其包含含有SEQ ID NO:36的序列的CDR1序列、含有SEQ ID NO:37的序列的CDR2序列和含有SEQ ID NO:38的序列的CDR3序列；以及轻链可变结构域，其包含含有SEQ ID NO:39的序列的CDR1序列、含有SEQ IDNO:40的序列的CDR2序列和含有SEQ ID NO:41的序列的CDR3序列。
在一些实施方案中，第一结合部分的重链可变结构域中的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列存在于人类VH框架中；并且第一结合部分的轻链可变结构域中的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列存在于人类Vκ框架中。在一些实施方案中，第一结合部分的重链可变结构域包含与SEQ ID NO:42具有至少95％一致性的序列；并且第一结合部分的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:43具有至少95％一致性的序列。在一些实施方案中，第一结合部分的重链可变结构域包含SEQ ID NO:42的序列；并且第一结合部分的轻链可变结构域包含SEQ IDNO:43的序列。
在一些实施方案中，根据本发明实施方案的多特异性抗体还包含对除CD3以外的蛋白质具有结合特异性的第二结合部分。在一些实施方案中，第二结合部分包含呈单价或二价构型的单一重链可变区。在一些实施方案中，第一结合部分包含轻链多肽亚基和重链多肽亚基，并且其中第二结合部分包含重链多肽亚基。在一些实施方案中，第一结合部分的轻链多肽亚基包含轻链恒定结构域。在一些实施方案中，除CD3以外的蛋白质是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。在一些实施方案中，TAA是B细胞成熟抗原(BCMA)。在一些实施方案中，TAA是CD19。在一些实施方案中，TAA是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
本发明的方面包括包含如本文所述的多特异性抗体的药物组合物、编码如本文所述的多特异性抗体的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体和包含此类载体的细胞。
本发明的方面包括产生如本文所述的多特异性抗体的方法，其包括使如本文所述的细胞在允许多特异性抗体表达的条件下生长并从细胞分离多特异性抗体。
本发明的方面包括治疗方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的本文所述的多特异性抗体或药物组合物。
本发明的方面包括本文所述多特异性抗体的用途，其用于制备用来治疗有需要的个体的疾病或病症的药物。
本发明的方面包括治疗特征在于BCMA表达的疾病或疾患的方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的本文所述的多特异性抗体或药物组合物。在一些实施方案中，疾病是自身免疫疾病。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是骨髓瘤。在一些实施方案中，骨髓瘤是多发性骨髓瘤。
本发明的方面包括治疗特征在于PSMA表达的疾病或疾患的方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的本文所述的多特异性抗体或药物组合物。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌。
本发明的方面包括治疗特征在于CD19表达的疾病或疾患的方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的本文所述的多特异性抗体或药物组合物。在一些实施方案中，病症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，病症是急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。在一些实施方案中，病症是非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。在一些实施方案中，病症是全身性红斑狼疮(SLE)。在一些实施方案中，病症是类风湿性关节炎(RA)。在一些实施方案中，病症是多发性硬化(MS)。
本发明的方面包括用于治疗有需要的个体的疾病或病症的药盒，其包含本文所述的多特异性抗体或药物组合物和使用说明书。在一些实施方案中，药盒还包含至少一种其它试剂。在一些实施方案中，至少一种其它试剂包含化学治疗药物。
本发明的方面包括双特异性三链抗体样分子，其包含：第一多肽亚基，其包含：包含SEQ ID NO:43的序列的轻链可变结构域(VL)；以及轻链恒定结构域(CL)；第二多肽亚基，其包含：包含SEQ ID NO:42的序列的重链可变结构域(VH)；以及包含SEQ ID NO:72或73的序列的重链恒定结构域(CH)；其中轻链可变结构域和重链可变结构域一起形成对CD3具有结合特异性的第一结合部分；以及第三多肽亚基，其包含：呈单价或二价构型的仅重链可变区，其对除CD3以外的蛋白质具有结合特异性；以及包含SEQ ID NO:54或55的序列的重链恒定结构域(CH)。在一些实施方案中，第三多肽亚基包含对BCMA具有结合特异性的呈二价构型的仅重链可变区。
本发明的方面包括双特异性三链抗体样分子，其包含：第一多肽亚基，其包含SEQID NO:49的序列；第二多肽亚基，其包含SEQ IDNO:56的序列；以及第三多肽亚基，其包含SEQ ID NO:58的序列。
本发明的方面包括包含本文所述的双特异性三链抗体样分子的药物组合物、编码本文所述的双特异性三链抗体样分子的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体和包含此类载体的细胞。
本发明的方面包括产生本文所述的双特异性三链抗体样分子的方法，其包括使本文所述的细胞在允许双特异性三链抗体样分子表达的条件下生长并从细胞分离双特异性三链抗体样分子。
本发明的方面包括治疗方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的本文所述的双特异性三链抗体样分子或药物组合物。
本发明的方面包括本文所述的双特异性三链抗体样分子的用途，其用于制备用来治疗有需要的个体的疾病或病症的药物。
本发明的方面包括治疗特征在于BCMA表达的疾病或疾患的方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的本文所述的双特异性三链抗体样分子或药物组合物。在一些实施方案中，疾病是自身免疫疾病。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是骨髓瘤。在一些实施方案中，骨髓瘤是多发性骨髓瘤。
本发明的方面包括用于治疗有需要的个体的疾病或病症的药盒，其包含本文所述的双特异性三链抗体样分子或药物组合物和使用说明书。在一些实施方案中，药盒还包含至少一种其它试剂。在一些实施方案中，至少一种其它试剂包含化学治疗药物。
将在本公开的其余部分(包括实施例)进一步解释这些和其它方面。
附图说明
图1的图A-图C提供根据本发明实施方案的多种多特异性抗体的图解说明。
图2的图A-图B显示通过蛋白质A色谱纯化的多个抗体种类的非还原SDS-PAGE分析的图像。
图3的图A显示通过蛋白质A色谱纯化的多个抗体种类的非还原SDS-PAGE分析的图像。图B显示图A中所显示的相同抗体种类的还原SDS-PAGE分析的图像。
图4的图A-图D是绘示根据本发明实施方案的多种IgG1抗体种类的Fcγ受体-抗体相互作用的图。
图5的图A-图E是绘示根据本发明实施方案的多种IgG4抗体种类的Fcγ受体-抗体相互作用的图。
图6的图A-图D是绘示根据本发明实施方案的多种IgG1抗体种类的Fcγ受体-抗体相互作用的图。
图7的图A-图E是绘示根据本发明实施方案的多种IgG4抗体种类的Fcγ受体-抗体相互作用的图。
图8的图A是显示细胞与人类PSMA的结合的图。图8的图B是显示细胞与食蟹猴PSMA的结合的图。
图9是绘示使用未经刺激的T细胞的T细胞介导的PSMA阳性细胞溶解的图。
图10是绘示使用预活化的T细胞的T细胞介导的PSMA阳性细胞溶解的图。
图11是绘示在预活化的T细胞存在下，PSMA阴性DU145细胞的特异性溶解％随多特异性抗体浓度变化的图。
图12是显示PSMA×CD3双特异性抗体与PSMA阳性和阴性细胞的结合的图。
图13是显示T细胞介导的PSMA阳性细胞溶解的图。
图14的图A是绘示T细胞介导的PSMA阳性细胞溶解随抗体浓度变化的图。图B是绘示细胞因子(IFNγ)释放随抗体浓度变化的图。图C是绘示细胞因子(IL-2)释放随抗体浓度变化的图。
图15的图A是绘示T细胞增殖随抗体浓度变化的图。图B是绘示T细胞增殖随抗体浓度变化的图。图C是绘示增殖的T细胞的CD8对CD4比率的图。图D是绘示增殖的T细胞的CD8对CD4比率的图。
图16是绘示在肿瘤异种移植物模型中22Rv1肿瘤生长的抑制的图。
图17是绘示图例中所显示双特异性抗体的CD4+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。
图18是绘示图例中所显示双特异性抗体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。
图19是绘示图例中所显示双特异性抗体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。
图20是绘示图例中所显示双特异性抗体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。
图21的图A-图D提供绘示双特异性抗体介导的肿瘤细胞溶解的若干图。分析抗CD3×抗BCMA双特异性抗体通过活化原代T细胞的重定向杀伤三种不同的BCMA+肿瘤细胞和一种BCMA阴性细胞系的能力。在这项实验中，将肿瘤细胞与活化泛T细胞以10:1E:T比混合，同时添加双特异性抗体。图A显示RPMI-8226细胞的杀伤，图B显示NCI-H929细胞的杀伤，图C显示U-266细胞的杀伤，并且图D显示K562细胞(即阴性对照)的杀伤。x轴显示所用抗体的浓度，并且y轴显示添加抗体后6小时肿瘤细胞的溶解％。
图22的图A-图D提供绘示双特异性抗体介导的IL-2释放的若干图。在将静息的人类T细胞与多种肿瘤细胞系和递增剂量的抗CD3×抗BCMA双特异性抗体一起培养后测量IL-2细胞因子释放的水平。图A显示经RPMI-8226细胞刺激的IL-2释放，图B显示经NCI-H929细胞刺激的IL-2释放，图C显示经U-266细胞刺激的IL-2释放，并且图D显示经K562细胞(即阴性对照)刺激的IL-2释放。
图23的图A-图D提供绘示双特异性抗体介导的IFN-γ释放的若干图。在将静息的人类T细胞与多种肿瘤细胞系和递增剂量的抗CD3×抗BCMA双特异性抗体一起培养后测量IFN-γ细胞因子释放的水平。图A显示经RPMI-8226细胞刺激的IFN-γ释放，图B显示经NCI-H929细胞刺激的IFN-γ释放，图C显示经U-266细胞刺激的IFN-γ释放，并且图D显示经K562细胞(即阴性对照)刺激的IFN-γ释放。
图24是通过蛋白质A色谱纯化的多个抗体种类的非还原SDS-PAGE分析的图像。
图25是显示纯化后所指示构建体的样品的HMW种类％、单体％和LMW种类％的表。
图26的图A-图D是绘示根据本发明实施方案的多种IgG4抗体种类的Fcγ受体-抗体相互作用的图。
图27的图A和图B是绘示图例中所显示CD3×BCMA双特异性抗体的CD4+CD69+T细胞％(图A)和CD8+CD69+T细胞％(图B)随双特异性抗体浓度变化的图。
图28的图A和图B是绘示图例中所显示CD3×BCMA双特异性抗体的CD4+CD69+T细胞％(图A)和CD8+CD69+T细胞％(图B)随双特异性抗体浓度变化的图。
图29的图A和图B是绘示图例中所显示CD3×BCMA双特异性抗体的CD4+CD69+T细胞％(图A)和CD8+CD69+T细胞％(图B)随双特异性抗体浓度变化的图。
图30的图A和图B是绘示图例中所显示CD3×PSMA双特异性抗体的CD4+CD69+T细胞％(图A)和CD8+CD69+T细胞％(图B)随双特异性抗体浓度变化的图。
图31的图A和图B是绘示图例中所显示CD3×PSMA双特异性抗体的CD4+CD69+T细胞％(图A)和CD8+CD69+T细胞％(图B)随双特异性抗体浓度变化的图。
图32的图A和图B是绘示图例中所显示CD3×PSMA双特异性抗体的CD4+CD69+T细胞％(图A)和CD8+CD69+T细胞％(图B)随双特异性抗体浓度变化的图。
图33的图A和图B是绘示图例中所显示CD3×CD19双特异性抗体的CD4+CD69+T细胞％(图A)和CD8+CD69+T细胞％(图B)随双特异性抗体浓度变化的图。
图34的图A和图B是绘示图例中所显示CD3×CD19双特异性抗体的CD4+CD69+T细胞％(图A)和CD8+CD69+T细胞％(图B)随双特异性抗体浓度变化的图。
图35的图A和图B是绘示图例中所显示CD3×CD19双特异性抗体的CD4+CD69+T细胞％(图A)和CD8+CD69+T细胞％(图B)随双特异性抗体浓度变化的图。
具体实施方式
除非另有指示，否则本发明的实践将采用常规分子生物学技术(包括重组技术)、微生物学技术、细胞生物学技术、生物化学技术和免疫学技术，其为本领域技术人员所熟知。此类技术全面解释于诸如以下的文献中：“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”，第二版(Sambrook等人，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编辑，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编辑，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人编辑，1987和周期性更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis等人编辑，1994)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”(Perbal Bernard V.,1988)；“PhageDisplay:A Laboratory Manual”(Barbas等人，2001)；Harlow、Lane和Harlow,UsingAntibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol No.I,Cold Spring HarborLaboratory(1998)；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory；(1988)。
当提供值的范围时，应理解，除非上下文另有明确说明，否则在所述范围的上限和下限与所述范围中的任何其它所述值或中间值之间的每个中间值，至下限的十分位，都涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，也涵盖于本发明内，服从所述范围中的任何明确排除的限值。当所述范围包括一个或两个限值时，排除那些所包括限值中的任一者或两者的范围也包括在本发明中。
除非另有指示，否则本文的抗体残基是根据Kabat编号系统来编号(例如，Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
在以下描述中，阐释许多具体细节以提供对本发明的更透彻的理解。然而，本领域技术人员应明了，本发明可在没有这些具体细节中的一者或多者的情况下来实践。在其它情况下，为避免混淆本发明，尚未阐述本领域技术人员所熟知的熟知特征和程序。
在整个本公开中引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)的全文都通过引用并入本文。
I.定义
“包含”意指所列举要素为组合物/方法/药盒中所必需，但可在权利要求书的范围内包括其它要素以形成组合物/方法/药盒等。
“基本上由……组成”意指将所述组合物或方法的范围限于不会实质上影响本发明的基本和新颖特征的指定材料或步骤。
“由……组成”意指从组合物、方法或药盒排除权利要求书中未指定的任一要素、步骤或成分。
本文的抗体残基是根据Kabat编号系统和EU编号系统来编号。在提及可变结构域中的残基(大约重链的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，Sequencesof Immunological Interest.第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时通常使用“EU编号系统”或“EU指数”(例如Kabat等人，上文中所报道的EU指数)。“如Kabat中的EU指数”是指人类IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，否则对抗体可变结构域中残基编号的提及意指通过Kabat编号系统的残基编号。除非本文另有说明，否则对抗体恒定结构域中残基编号的提及意指通过EU编号系统的残基编号。
“抗体”或“免疫球蛋白”是指包含至少一条重链和一条轻链的分子，其中重链和轻链的氨基末端结构域的序列是可变的，因此通常称为可变区结构域或可变重链(VH)或可变轻链(VH)结构域。两个结构域通常缔合形成特定结合区域，但如此处将论述，还可使用仅重链可变序列获得特定结合，并且此项技术中已知和使用抗体的多种非天然构型。
“功能性”或“生物活性”抗体或抗原结合分子(包括本文所述的仅重链抗体和多特异性(例如双特异性)三链抗体样分子(TCA))是能够在结构、调控、生物化学或生物物理学事件中发挥其一种或多种天然活性的抗体或抗原结合分子。举例来说，功能性抗体或其它结合分子(例如TCA)可具有特异性结合抗原的能力，并且结合可进而引发或改变细胞或分子事件，例如信号转导或酶活性。功能性抗体或其它结合分子(例如TCA)还可阻断受体的配体活化或充当促效剂或拮抗剂。抗体或其它结合分子(例如TCA)发挥其一种或多种天然活性的能力取决于若干因素，包括多肽链的正确折叠和组装。
术语抗体可指全长重链、全长轻链、完整免疫球蛋白分子；或这些多肽中的任一者的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合所关注靶抗原或其部分的抗原结合位点的多肽，此类靶包括(但不限于)癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文所公开的免疫球蛋白可为免疫球蛋白分子的任一类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类，包括具有提供减小或增强的效应细胞活性的改变的Fc部分的经改造子类。主题抗体的轻链可为κ轻链(Vκ)或λ轻链(Vλ)。免疫球蛋白可衍生自任何物种。在一个方面，免疫球蛋白主要来源于人类。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从大体上同源的抗体群体获得的抗体，即除可少量存在的可能的天然突变外，构成所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体具有高特异性，针对单一抗原位点。另外，与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同，每一单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。本发明的单克隆抗体可通过首次由Kohler等人，(1975)Nature 256:495描述的杂交瘤方法制造，并且还可通过例如重组蛋白产生方法制造(参见例如美国专利第4,816,567号)。
如结合抗体使用的术语“可变”是指以下事实：抗体可变结构域的某些部分在抗体之间的序列上有很大差异，并且用于每一特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀分布于抗体的整个可变结构域。它集中在轻链和重链可变结构域二者中的三个区段，称为超变区。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，主要采取β-折叠构型，通过三个超变区连结，其形成连结β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每一条链的超变区通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链的超变区一起帮助形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合，但展现多种效应功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
术语”超变区”在用于本文中时是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自“超变环”的那些残基(重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在一些实施方案中，“CDR”意指如Lefranc,MP等人，IMGT，国际ImMunoGeneTics数据库，Nucleic AcidsRes.,27:209-212(1999)中所定义的抗体的互补决定区。“框架区”或“FR”残基是除如本文所定义的超变区/CDR残基外的那些可变结构域残基。
本文显示例示性CDR名称，然而，本领域技术人员应理解，CDR的多种定义是常用的，包括Kabat定义(参见Zhao等人，“A germline knowledge based computationalapproach for determining antibody complementarity determining regions.”MolImmunol.2010；47:694-700)，其基于序列可变性并且是最常用的。Chothia定义基于结构环区域的位置(Chothia等人，“Conformations of immunoglobulin hypervariableregions.”Nature.1989；342:877-883)。所关注替代性CDR定义包括(但不限于)以下文献中所公开的那些定义：Honegger,“Yet another numbering scheme for immunoglobulinvariable domains:an automatic modeling and analysis tool.”J Mol Biol.2001；309:657-670；Ofran等人，“Automated identification of complementaritydetermining regions(CDRs)reveals peculiar characteristics of CDRs and B-cellepitopes.”JImmunol.2008；181:6230-6235；Almagro“Identification of differencesin the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigensof different size:implications for the rational design of antibodyrepertoires.”J Mol Recognit.2004；17:132-143；以及Padlan等人，“Identification ofspecificity-determining residues in antibodies.”Faseb J.1995；9:133-139.，所述文献中的每一者都以引用方式明确并入本文。
术语“仅重链抗体”和“重链抗体”在本文中可互换使用，并且在最广泛含义上是指抗体或抗体的一个或多个部分，例如抗体的一个或多个臂，缺少常规抗体的轻链。所述术语特定包括(但不限于)包含VH抗原结合结构域以及在CH1结构域不存在下的CH2和CH3恒定结构域的同二聚体抗体；此类抗体的功能性(抗原结合)变体、可溶性VH变体、包含一个可变结构域(V-NAR)和五个C样恒定结构域(C-NAR)的同二聚体的Ig-NAR和其功能片段；以及可溶性单结构域抗体(sUniDabsTM)。在一个实施方案中，仅重链抗体由可变区抗原结合结构域构成，所述可变区抗原结合结构域由框架1、CDR1、框架2、CDR2、框架3、CDR3和框架4构成。在另一实施方案中，仅重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分以及CH2和CH3结构域构成。在另一实施方案中，仅重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分和CH2结构域构成。在另一实施方案中，仅重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分和CH3结构域构成。其中CH2和/或CH3结构域截短的仅重链抗体也包括在本文中。在另一实施方案中，重链由抗原结合结构域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)结构域构成，但无铰链区。仅重链抗体可呈二聚体形式，其中两条重链经二硫键键结或以其它方式彼此共价或非共价连接。仅重链抗体可属于IgG子类，但属于其它子类(例如IgM、IgA、IgD和IgE子类)的抗体也包括在本文中。在特定实施方案中，重链抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特定来说IgG1亚型。在一个实施方案中，仅重链抗体在本文中用作嵌合抗原受体(CAR)的结合(靶向)结构域。所述定义特定包括由人类免疫球蛋白转基因大鼠产生的人类仅重链抗体(UniRatTM)，称为UniAbsTM。UniAbsTM的可变区(VH)称为UniDabsTM，并且是可连接至Fc区或血清白蛋白用于开发具有多特异性、增加的效力和延长的半衰期的新颖治疗剂的通用结构单元。由于同二聚体UniAbsTM缺少轻链并且因此缺少VL结构域，因此抗原由一个单结构域、即重链抗体的重链的可变结构域(VH或VHH)来识别。
如本文所用的“完整抗体链”是包含全长可变区和全长恒定区(Fc)的抗体链。完整“常规”抗体包含完整轻链和完整重链以及分泌型IgG的轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域、CH1、铰链、CH2和CH3。其它同型(例如IgM或IgA)可具有不同的CH结构域。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人类天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应功能”，其是指可归因于抗体的Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；以及细胞表面受体的下调。恒定区变体包括改变效应物概况、Fc受体结合等的那些变体。
根据其重链的Fc(恒定结构域)的氨基酸序列，抗体和多种抗原结合蛋白可以不同类别提供。存在五大类重链Fc区：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可进一步分成“子类”(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别的抗体的Fc恒定结构域可分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。Ig形式包括铰链修饰或无铰链形式(Roux等人(1998)J.Immunol.161:4083-4090；Lund等人(2000)Eur.J.Biochem.267:7246-7256；US 2005/0048572；US 2004/0229310)。来自任何脊椎动物物种的抗体轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可分配至两种类型(称为κ(kappa)和λ(lambda))中的一种。根据本发明实施方案的抗体可包含κ轻链序列或λ轻链序列。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应功能”。效应功能的非限制性实例包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；ADCP；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调等。此类效应功能通常需要Fc区与受体(例如FcγRI；FcγRIIA；FcγRIIB1；FcγRIIB2；FcγRIIIA；FcγRIIIB受体，以及低亲和力FcRn受体)相互作用；并且可使用此项技术中已知的多种分析来评价。“死”或“沉默的”Fc是已经突变以保留活性(例如延长血清半衰期)、但不活化高亲和力Fc受体或具有降低的Fc受体亲和力的Fc。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。天然序列人类Fc区包括例如天然序列人类IgG1 Fc区(非A和A异型)；天然序列人类IgG2 Fc区；天然序列人类IgG3 Fc区；以及天然序列人类IgG4 Fc区，以及其天然变体。
“变体Fc区”包含因至少一个氨基酸修饰、优选一个或多个氨基酸取代而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如天然序列Fc区中或亲代多肽的Fc区中的约1至约10个氨基酸取代，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代，并且优选约1至约5个氨基酸取代。本文的变体Fc区优选将与天然序列Fc区和/或与亲代多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并且最优选与其至少约90％的同源性，更优选与其至少约95％的同源性。
人类IgG4 Fc氨基酸序列(UniProtKB编号P01861)在本文中提供为SEQ ID NO:45。沉默的IgG1描述于例如Boesch,A.W.等人，“Highly parallel characterization of IgGFc binding interactions.”MAbs,2014.6(4):第915-27页中，该文献的全部公开内容都通过引用并入本文。
其它Fc变体是可能的，包括(但不限于)其中能够形成二硫键的区域缺失、或其中某些氨基酸残基在天然Fc的N末端消除、或甲硫氨酸残基添加至其中的Fc变体。因此，在一些实施方案中，抗体的一个或多个Fc部分可包含铰链区中的一个或多个突变以消除二硫键结。在另一实施方案中，可完全去除Fc的铰链区。在另一实施方案中，抗体可包含Fc变体。
另外，Fc变体可通过取代(突变)、缺失或添加氨基酸残基以实现补体结合或Fc受体结合来构建以去除或大体上降低效应功能。举例来说并且不加限制，缺失可发生在补体结合位点(例如C1q结合位点)中。用于制备免疫球蛋白Fc片段的此类序列衍生物的技术公开于国际专利公布第WO 97/34631号和国际专利公布第WO 96/32478号中。另外，Fc结构域可通过磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙酰化、酰胺化等来修饰。
在一些实施方案中，抗体包含含有T366W突变的变体人类IgG4 CH3结构域序列，其在本文中可任选地称为IgG4 CH3旋钮序列。在一些实施方案中，抗体包含含有T366S突变、L368A突变和Y407V突变的变体人类IgG4 CH3结构域序列，其在本文中可任选地称为IgG4CH3孔序列。本文所述的IgG4 CH3突变可以任何适宜方式使用，以在抗体二聚体中第一单体的第一重链恒定区上安置“旋钮”和在抗体二聚体中第二单体的第二重链恒定区上安置“孔”，由此促进抗体中期望重链多肽亚基对的正确配对(异二聚化)。
在一些实施方案中，抗体包含重链多肽亚基，所述重链多肽亚基包含含有S228P突变、F234A突变、L235A突变和T366W突变(旋钮)的变体人类IgG4 Fc区。在一些实施方案中，抗体包含重链多肽亚基，所述重链多肽亚基包含含有S228P突变、F234A突变、L235A突变、T366S突变、L368A突变和Y407V突变(孔)的变体人类IgG4 Fc区。
术语“包含Fc区的抗体(Fc-region-comprising antibody)”是指包含Fc区的抗体。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可在例如抗体纯化期间或通过重组改造编码抗体的核酸来去除。因此，本发明的具有Fc区的抗体可包含具或不具K447的抗体。
本发明的方面包括包含呈单价或二价构型的仅重链可变区的抗体。如本文所用的术语“单价构型”在用于提及仅重链可变区结构域时意指，仅存在一个仅重链可变区结构域，具有单一结合位点(参见图1的图A，抗体右臂)。相比之下，术语“二价构型”在用于提及仅重链可变区结构域时意指，存在两个仅重链可变区结构域(各自具有单一结合位点)，并且通过连接体序列连结(参见图1的图B和图C，抗体右臂)。连接体序列的非限制性实例进一步论述于本文中，并且包括(但不限于)不同长度的GS连接体序列。当仅重链可变区呈二价构型时，两个仅重链可变区结构域中的每一者可对相同抗原或对不同抗原(例如对同一蛋白质上的不同的表位；对两种不同的蛋白质等)具有结合亲和力。然而，除非另外明确注明，否则仅重链可变区表示为呈“二价构型”应理解为含有通过连接体序列连结的两个相同的仅重链可变区结构域，其中两个相同仅重链可变区结构域中的每一者对相同靶抗原具有结合亲和力。
本发明的方面包括具有多特异性构型的抗体，所述多特异性构型包括(但不限于)双特异性、三特异性等。已知众多种方法和蛋白质构型并且用于双特异性单克隆抗体(BsMAB)、三特异性抗体等中。
已通过重组融合两种或更多种抗体的可变结构域开发出多种产生多价人工抗体的方法。在一些实施方案中，多肽上的第一和第二抗原结合结构域通过多肽连接体连结。此类多肽连接体的一个非限制性实例是GS连接体，它具有四个甘氨酸残基、后接一个丝氨酸残基的氨基酸序列，并且其中序列重复n次，其中n是介于1至约10范围内的整数，例如2、3、4、5、6、7、8或9。此类连接体的非限制性实例包括GGGGS(SEQ ID NO:70)(n＝1)和GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:71)(n＝2)。还可使用其它适宜连接体，并且描述于例如Chen等人，Adv Drug Deliv Rev.2013年10月15日；65(10):1357-69中，所述文献的全部公开内容都通过引用并入本文。
术语“三链抗体样分子”或“TCA”用于本文中是指包含三个多肽亚基、基本上由其组成或由其组成的抗体样分子，所述三个多肽亚基中的两者包含单克隆抗体的一条重链和一条轻链或此类抗体链的包含抗原结合区域和至少一个CH结构域的功能性抗原结合片段、基本上由其组成或由其组成。这种重链/轻链对对第一抗原具有结合特异性。第三多肽亚基包含仅重链抗体、基本上由其组成或由其组成，所述仅重链抗体包含在CH1结构域不存在下含有CH2和/或CH3和/或CH4结构域、和一个或多个抗原结合结构域(例如两个抗原结合结构域)的Fc部分，所述一个或多个抗原结合结构域结合第二抗原的表位或第一抗原的不同表位，其中此类结合结构域衍生自抗体重链或轻链的可变区或与其具有序列一致性。此类可变区的部分可由VH和/或VL基因区段、D和JH基因区段或JL基因区段编码。可变区可由重排VHDJH、VLDJH、VHJL或VLJL基因区段编码。
TCA结合化合物利用“仅重链抗体”或“重链抗体”或“重链多肽”，其如本文所用意指包含重链恒定区CH2和/或CH3和/或CH4但无CH1结构域的单链抗体。在一个实施方案中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分以及CH2和CH3结构域组成。在另一实施方案中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分和CH2结构域组成。在另一实施方案中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分和CH3结构域组成。其中CH2和/或CH3结构域截短的重链抗体也包括在本文中。在另一实施方案中，重链由抗原结合结构域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)结构域构成，但无铰链区。仅重链抗体可呈二聚体形式，其中两条重链二硫键结或以其它方式彼此共价或非共价连接，并且可任选地包括一个或多个CH结构域之间的不对称界面以促进多肽链之间的正确配对。重链抗体可属于IgG子类，但属于其它子类(例如IgM、IgA、IgD和IgE子类)的抗体也包括在本文中。在特定实施方案中，重链抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特定来说IgG1亚型或IgG4亚型。TCA结合化合物的非限制性实例描述于例如WO2017/223111和WO2018/052503中，所述专利的全部公开内容都通过引用并入本文。
重链抗体构成约四分之一的由骆驼科(例如骆驼和骆马)产生的IgG抗体(Hamers-Casterman C.等人，Nature.363,446-448(1993))。这些抗体由两条重链形成，但不含轻链。因此，可变抗原结合部分称为VHH结构域，并且其代表最小的天然完整抗原结合位点，长度仅为约120个氨基酸(Desmyter,A.等人，J.Biol.Chem.276,26285-26290(2001))。可通过免疫针对多种抗原产生具有高特异性和亲和力的重链抗体(van der Linden,R.H.等人，Biochim.Biophys.Acta.1431,37-46(1999))，并且可在酵母中容易地克隆和表达VHH部分(Frenken,L.G.J.等人，J.Biotechnol.78,11-21(2000))。它们的表达水平、溶解度和稳定性显著高于经典F(ab)或Fv片段的表达水平、溶解度和稳定性(Ghahroudi,M.A.等人，FEBSLett.414,521-526(1997))。还已显示鲨鱼在其抗体中具有单一VH样结构域，称为VNAR。(Nuttall等人，Eur.J.Biochem.270,3543-3554(2003)；Nuttall等人，Function andBioinformatics 55,187-197(2004)；Dooley等人，Molecular Immunology 40,25-33(2003))。
术语“CD3”是指人类CD3蛋白多亚基复合物。CD3蛋白多亚基复合物由6条不同的多肽链构成。这些多肽链包括CD3γ链(SwissProt P09693)、CD3δ链(SwissProtP04234)、两条CD3ε链(SwissProt P07766)和一个CD3ζ链同二聚体(SwissProt 20963)，并且其与T细胞受体α链和β链缔合。除非注明，否则术语“CD3”包括由细胞(包括T细胞)天然表达或可在经编码那些多肽的基因或cDNA转染的细胞上表达的任一CD3变体、同种型和物种同源物。
“BCMA×CD3抗体”是多特异性仅重链抗体，例如双特异性仅重链抗体，其包含两个不同的抗原结合区域，其中的一者特异性结合至抗原BCMA并且其中的一者特异性结合至CD3。“PSMA×CD3抗体”是多特异性仅重链抗体，例如双特异性仅重链抗体，其包含两个不同的抗原结合区域，其中的一者特异性结合至抗原PSMA并且其中的一者特异性结合至CD3。“CD19×CD3抗体”是多特异性仅重链抗体，例如双特异性仅重链抗体，其包含两个不同的抗原结合区域，其中的一者特异性结合至抗原CD19并且其中的一者特异性结合至CD3。
如本文所用的术语“BCMA”是指人类B细胞成熟抗原，也称为BCMA、CD269和TNFRSF17(UniProt Q02223)，它是优先在分化浆细胞中表达的肿瘤坏死受体超家族的成员。根据UniProt，人类BCMA的细胞外结构域由氨基酸1-54(或5-51)组成。
术语“抗BCMA仅重链抗体”和“BCMA仅重链抗体”用于本文中是指免疫特异性结合至BCMA的如上文所定义的仅重链抗体。
如本文所用的术语“PSMA”是指具有N-乙酰化α连接的酸性二肽酶、叶酸水解酶和二肽基肽酶活性的II型跨膜蛋白。术语“PSMA”包括任何人类和非人类动物物种的PSMA蛋白，并且特定包括人类PSMA以及非人类哺乳动物的PSMA。
如本文所用的术语“人类PSMA”包括人类PSMA(UniProt Q04609)的任何变体、同种型和物种同源物，而与其来源或制备模式无关。因此，“人类PSMA”包括由细胞天然表达的人类PSMA和在经人类PSMA基因转染的细胞上表达的PSMA。
术语“抗PSMA仅重链抗体”、“PSMA仅重链抗体”、“抗PSMA重链抗体”和“PSMA重链抗体”在本文中可互换使用并且是指免疫特异性结合至如上文所定义的PSMA(包括人类PSMA)的如上文所定义的仅重链抗体。该定义包括(但不限于)由转基因动物(例如表达人类免疫球蛋白的转基因大鼠或转基因小鼠，包括产生如上文所定义的人类抗PSMA UniAbTM抗体的UniRatsTM)产生的人类重链抗体。
如本文所用的术语“CD19”和“分化簇19”是指在B细胞发育的所有时期直至最终分化成浆细胞期间表达的分子。术语“CD19”包括任何人类和非人类动物物种的CD19蛋白，并且特定包括人类CD19以及非人类哺乳动物的CD19。
如本文所用的术语“人类CD19”包括人类CD19(UniProt P15391)的任何变体、同种型和物种同源物，而与其来源或制备模式无关。因此，“人类CD19”包括由细胞天然表达的人类CD19和在经人类CD19基因转染的细胞上表达的CD19。
术语“抗CD19仅重链抗体”、“CD19仅重链抗体”、“抗CD19重链抗体”和”CD19重链抗体”在本文中可互换使用并且是指免疫特异性结合至如上文所定义的CD19(包括人类CD19)的如上文所定义的仅重链抗体。该定义包括(但不限于)由转基因动物(例如表达人类免疫球蛋白的转基因大鼠或转基因小鼠，包括产生如上文所定义的人类抗CD19 UniAbTM抗体的UniRatsTM)产生的人类重链抗体。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列一致性百分数(％)”定义为在比对序列和引入空位(若需要)以实现最大序列一致性百分数后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比，并且不将任何保守取代视为序列一致性的一部分。出于确定氨基酸序列一致性百分数的目的，比对可以本领域技术人员所熟知的各种方式来实现，例如使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于比对序列的参数，包括在所比较序列的全长范围内实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，氨基酸序列一致性％值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。
“经分离”抗体是已经鉴别并从其自然环境组分分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选实施方案中，抗体将经纯化(1)至如通过劳立法(Lowrymethod)测定的大于95重量％的抗体，最优选大于99重量％，2)至通过使用旋杯式测序仪测定的足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝(Coomassie blue)或优选银染色测定的均质性。经分离抗体包括重组细胞内的原位抗体，这是因为不存在抗体自然环境的至少一种组分。然而，通常，经分离抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
本发明的抗体包括多特异性抗体。多特异性抗体具有一种以上的结合特异性。术语“多特异性”特定包括“双特异性”和“三特异性”以及更高阶的独立特异性结合亲和力(例如更高阶的多表位特异性)以及四价抗体和抗体片段。术语“多特异性抗体”、“多特异性仅重链抗体”、“多特异性重链抗体”和“多特异性UniAbTM”在本文中是以最广泛含义使用，并且涵盖具有一种以上的结合特异性的所有抗体。
本发明的多特异性抗体特定包括免疫特异性结合至BCMA蛋白、PSMA蛋白或CD19蛋白(例如人类BCMA蛋白、人类PSMA蛋白或人类CD19蛋白)上的两个或更多个非重叠表位的抗体(即二价和双互补位)。本发明的多特异性重链抗体还特定包括免疫特异性结合至BCMA蛋白、PSMA蛋白或CD19蛋白(例如人类BCMA蛋白、人类PSMA蛋白或人类CD19蛋白)上的表位和不同蛋白质(例如CD3蛋白，例如人类CD3)上的表位的抗体(即二价和双互补位)。本发明的多特异性重链抗体还特定包括免疫特异性结合至BCMA蛋白、PSMA蛋白或CD19蛋白(例如人类BCMA蛋白、人类PSMA蛋白或人类CD19蛋白)上的两个或更多个非重叠或部分重叠的表位和不同蛋白质(例如CD3蛋白，例如人类CD3蛋白)上的表位的抗体(即三价和双互补位)。
“表位”是单一抗体分子结合的抗原分子表面上的位点。通常，抗原具有若干或许多不同的表位并且与许多不同的抗体反应。该术语特定包括线性表位和构象表位。
“表位映射”是鉴别抗体在其靶抗原上的结合位点或表位的过程。抗体表位可为线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中的连续氨基酸序列形成。构象表位由在蛋白质序列中不连续但在蛋白质折叠成其三维结构时聚集在一起的氨基酸形成。
“多表位特异性”是指特异性结合至相同或不同靶上的两个或更多个不同表位的能力。如上文所注明，本发明特定包括具有多表位特异性的重链抗体，即结合至BCMA蛋白、PSMA蛋白或CD19蛋白(例如人类BCMA蛋白、人类PSMA蛋白或人类CD19蛋白)上的一个或多个非重叠表位的重链抗体；以及结合至BCMA蛋白、PSMA蛋白或CD19蛋白上的一个或多个表位和不同蛋白质(例如CD3蛋白)上的表位的重链抗体。术语抗原的“非重叠表位”或“非竞争性表位”在本文中定义为意指被一对抗原特异性抗体的一个成员识别而不被另一个成员识别的表位。识别非重叠表位的抗体对或多特异性抗体上靶向相同抗原的抗原结合区域并不竞争性结合至该抗原并且能够同时结合该抗原。
当两种抗体识别相同或在空间上重叠的表位时，抗体结合与参考抗体“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否结合至相同或在空间上重叠的表位的最广泛使用且快速的方法是竞争分析，其可使用经标记抗原或经标记抗体以所有多种不同的格式来构建。通常，将抗原固定在96孔板上，并且使用放射性或酶标记测量未标记抗体阻断经标记抗体结合的能力。
如本文所用的术语“价”是指抗体分子中结合位点的特定数量。
“单价”抗体具有一个结合位点。因此，单价抗体也为单特异性的。
“多价”抗体具有两个或更多个结合位点。因此，术语“二价”、“三价”和“四价”分别是指存在两个结合位点、三个结合位点和四个结合位点。因此，本发明的双特异性抗体至少为二价，并且可为三价、四价或其它多价。根据本发明实施方案的二价抗体可具有两个结合至相同表位(即二价单互补位)或两个不同表位(即二价双互补位)的位点。
众多种方法和蛋白质构型已知并且用于制备双特异性单克隆抗体(BsMAB)、三特异性抗体等。
术语“三链抗体样分子”或“TCA”用于本文中是指包含三个多肽亚基、基本上由其组成或由其组成的抗体样分子，所述三个多肽亚基中的两者包含单克隆抗体的一条重链和一条轻链或此类抗体链的包含抗原结合区域和至少一个CH结构域的功能性抗原结合片段、基本上由其组成或由其组成。这种重链/轻链对对第一抗原具有结合特异性。第三多肽亚基包含仅重链抗体、基本上由其组成或由其组成，所述仅重链抗体包含在CH1结构域不存在下含有CH2和/或CH3和/或CH4结构域和抗原结合结构域的Fc部分，所述抗原结合结构域结合第二抗原的表位或第一抗原的不同表位，其中此类结合结构域衍生自抗体重链或轻链的可变区或与其具有序列一致性。此类可变区的部分可由VH和/或VL基因区段、D和JH基因区段或JL基因区段编码。可变区可由重排VHDJH、VLDJH、VHJL或VLJL基因区段编码。TCA蛋白利用如上文所定义的仅重链抗体。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”在本文中是以最广泛含义使用，并且是指经改造受体，其将期望结合特异性(例如单克隆抗体的抗原结合区域或其它配体)移植至跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。通常，使用受体将单克隆抗体的特异性移植至T细胞上以产生嵌合抗原受体(CAR)。(J Natl Cancer Inst,2015；108(7):dvj439；以及Jackson等人，NatureReviews Clinical Oncology,2016；13:370-383)。CAR-T细胞是已经遗传改造以产生人工T细胞受体用于免疫疗法中的T细胞。在一个实施方案中，“CAR-T细胞”意指表达编码一种或多种嵌合抗原受体的转基因的治疗性T细胞，所述一种或多种嵌合抗原受体至少包含细胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞质结构域。
术语“人类抗体”用于本文中并且包括具有衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人类抗体在本文中可包括并非由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过活体外随机或位点特异性诱变或通过活体内体细胞突变引入的突变。术语“人类抗体”特定包括具有由转基因动物(例如转基因大鼠或小鼠)产生的人类重链可变区序列的仅重链抗体，具体来说由如上文所定义的UniRatsTM产生的UniAbsTM。
“嵌合抗体”或“嵌合免疫球蛋白”意指包含来自至少两个不同的Ig基因座的氨基酸序列的免疫球蛋白分子，例如包含由人类Ig基因座编码的部分和由大鼠Ig基因座编码的部分的转基因抗体。嵌合抗体包括具有非人类Fc区或人工Fc区和人类个体基因型的转基因抗体。此类免疫球蛋白可从已经改造以产生此类嵌合抗体的本发明动物分离。
如本文所用的术语“效应细胞”是指参与与免疫反应的认知期和活化期不同的免疫反应效应期的免疫细胞。一些效应细胞表达特定Fc受体并且实施特定免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞(例如天然杀伤细胞)能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。举例来说，表达FcR的单核细胞和巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀伤并且将抗原呈递至免疫系统的其它组分，或结合至呈递抗原的细胞。在一些实施方案中，效应细胞可吞噬靶抗原或靶细胞。
“人类效应细胞”是表达受体(例如T细胞受体或FcR)并且发挥效应功能的白细胞。优选地，细胞表达至少FcγRIII并且发挥ADCC效应功能。调介ADCC的人类白细胞的实例包括天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中NK细胞优选。效应细胞可从其天然来源、例如从血液或如本文所述的PBMC分离。
术语“免疫细胞”在本文中是以最广泛含义使用，包括(但不限于)骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(例如B细胞和T细胞，包括细胞溶解性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多型核细胞，例如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。
抗体“效应功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的所结合抗体并且随后使靶细胞溶解的细胞介导的反应。调介ADCC的主要细胞(即NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页的表3中。为评价所关注分子的ADCC活性，可实施例如美国专利第5,500,362号或美国专利第5,821,337号中所述的活体外ADCC分析。可用于此类分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。替代地或另外，可例如在例如Clynes等人，PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的动物模型中活体内评价所关注分子的ADCC活性。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在下溶解靶的能力。补体活化路径是通过使补体系统的第一组分(C1q)结合至与同族抗原复合的分子(例如抗体)来起始。为评价补体活化，可实施例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的CDC分析。
“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指示，否则如本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可通过解离常数(Kd)来表示。亲和力可通过此项技术中已知的常用方法来测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且往往容易解离，而高亲和力抗体通常快速地结合抗原并且往往保持结合。
如本文所用的“Kd”或“Kd值”是指通过生物膜层干涉技术(BioLayerInterferometry)、使用Octet QK384仪器(Fortebio Inc.,Menlo Park,CA)以动力学模式测定的解离常数。举例来说，向抗小鼠Fc传感器加载小鼠Fc融合抗原并且然后将其浸至含有抗体的孔中以测量浓度依赖性缔合速率(k缔合)。在最后一步测量抗体解离速率(k解离)，其中将传感器浸至仅含缓冲液的孔中。Kd是k解离/k缔合的比率。(关于其它细节参见Concepcion,J等人，Comb Chem High Throughput Screen,12(8),791-800,2009)。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等用于本文中通常意指获得期望药理学和/或生理学效应。就完全或部分地预防疾病或其症状来说，该效应可为预防性的，以及/或者就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不良效应来说，该效应可为治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止可能易患疾病但尚未诊断为患有疾病的受试者中发生疾病；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即，使疾病消退。可在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。尤其关注正在进行的疾病的治疗，其中治疗稳定或减轻患者的不期望临床症状。此类治疗期望地在受侵袭组织的功能完全丧失之前实施。可在疾病症状期期间，并且在一些情况下在疾病的症状期后施用主题疗法。
“治疗有效量”打算指赋予受试者治疗益处所需的活性剂的量。举例来说，“治疗有效量”是诱导、改善或以其它方式引起与疾病相关的病理症状、疾病进展或生理状况的改良或者改良病症的抗性的量。
如本文所用的术语“前列腺癌”是指前列腺中腺体起源的恶性肿瘤。
术语“特征在于PSMA表达”广泛地指其中PSMA表达与疾病或病症所特有的一个或多个病理过程相关或有所涉及的任一疾病或病症。此类病症包括(但不限于)前列腺癌。
本发明上下文中的术语“B细胞赘瘤”或“成熟B细胞赘瘤”包括(但不限于)所有淋巴性白血病和淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、幼淋巴细胞性白血病、前体B淋巴母细胞性白血病、毛细胞白血病、小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、外套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、多发性骨髓瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘带淋巴瘤、浆细胞赘瘤(例如浆细胞骨髓瘤)、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、MALT淋巴瘤、结节性边缘B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞白血病、原发性积液淋巴瘤和AIDS相关的非霍奇金氏淋巴瘤。
术语“特征在于CD19表达”广泛地指其中CD19表达与疾病或病症所特有的一个或多个病理过程相关或有所涉及的任一疾病或病症。此类病症包括(但不限于)B细胞赘瘤。
术语“特征在于BCMA表达”广泛地指其中BCMA表达与疾病或病症所特有的一个或多个病理过程相关或有所涉及的任一疾病或病症。此类病症包括(但不限于)B细胞赘瘤。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用并且是指正在进行治疗评价和/或正在治疗的哺乳动物。在实施方案中，哺乳动物是人类。术语“受试者”、“个体”和“患者”涵盖(但不限于)患有癌症的个体、患有自身免疫疾病的个体、患有病原体感染的个体等。受试者可为人类，但还包括其它哺乳动物，特别可用作人类疾病的实验室模型的那些哺乳动物(例如小鼠、大鼠等)。
术语“医药制剂”是指呈允许活性成分的生物活性有效并且不含对将施用制剂的受试者具有不可接受毒性的额外组分的形式的制剂。此类制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)是可合理地施用受试者哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些赋形剂。
“无菌”制剂是无菌的或不含或基本上不含所有活的微生物和其孢子。“冷冻”制剂是温度低于0℃的制剂。
“稳定”制剂是其中的蛋白质在储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。优选地，制剂在储存时基本上保持其物理和化学稳定性以及其生物活性。通常基于制剂的预期储放寿命来选择储存期。多种用于测量蛋白质稳定性的分析技术可在此项技术中获得并且综述于例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301.Vincent Lee编辑，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones.A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90)(1993)中。稳定性可在所选温度下保持所选时间段来测量。稳定性可以多种不同方式定性和/或定量地评估，包括评估聚集体形成(例如使用粒径排阻色谱，通过测量浊度，和/或通过视觉检查)；通过使用阳离子交换色谱、成像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评价电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较还原抗体与完整抗体；肽图谱(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的生物活性或抗原结合功能等。不稳定性可涉及以下中的一者或多者：聚集、去酰胺化(例如Asn去酰胺化)、氧化(例如Met氧化)、异构化(例如Asp异构化)、剪切/水解/片段化(例如铰链区片段化)、琥珀酰亚胺形成、未配对半胱氨酸、N末端延伸、C末端加工、糖基化差异等。
II.详细描述
抗BCMA抗体
本发明涉及结合至人类BCMA的紧密相关的抗体的若干家族。这些家族的抗体的可变区描述于美国专利公布第US20190352412号、第US20200157232号和第US20200048348号以及PCT公布第WO2018237037号和第WO2019006072号中，所述申请的全部公开内容都通过引用并入本文。代表性抗BCMA重链抗体可变结构域序列的非限制性选择提供于下表1中。
表1：抗BCMA重链抗体可变结构域氨基酸序列。
Figure BDA0003906628410000351
Figure BDA0003906628410000361
抗BCMA抗体序列可选自本文所提供用于开发和治疗或其它用途(包括但不限于作为多特异性、例如双特异性抗体的用途)的那些序列。在一些实施方案中，提供双特异性或多特异性抗体，其可具有本文所论述的任一构型，包括(但不限于)TCA。双特异性抗体至少包含特异性针对除BCMA以外的蛋白质的抗体的重链可变区。
当本发明的蛋白质是双特异性抗体时，一个结合部分特异性针对人类BCMA，而另一臂可特异性针对靶细胞、肿瘤相关抗原、靶向抗原(例如整合素等)、病原体抗原、检查点蛋白等。靶细胞特定包括癌细胞，例如血液肿瘤，例如B细胞肿瘤，如下文所论述。
多种格式的双特异性抗体在本发明的范围内，包括(但不限于)单链多肽、双链多肽、三链多肽、四链多肽和其倍数多肽。本文的双特异性抗体特定包括结合至BCMA(其在浆细胞(PC)和多发性骨髓瘤(MM)上选择性表达)和CD3的T细胞双特异性抗体(抗BCMA×抗CD3抗体)。此类抗体诱导强效T细胞介导的携带BCMA的细胞的杀伤，并且可用于治疗肿瘤，具体来说血液肿瘤，例如B细胞肿瘤，如本文进一步论述。
在优选实施方案中，双特异性抗体是包含以下的TCA：与轻链可变结构域(VL)配对的抗CD3 VH结构域，其中VH结构域和VL结构域一起对CD3具有结合亲和力；仅重链抗体的重链可变结构域，其对BCMA具有结合亲和力并且呈单价或二价构型；以及变体人类IgG4 Fc结构域，其包含含有S228P突变、F234A突变、L235A突变和T366W突变(旋钮)的第一重链恒定区序列，以及含有S228P突变、F234A突变、L235A突变、T366S突变、L368A突变和Y407V突变(孔)的第二重链恒定区序列。这种变体或经修饰的IgG4 Fc结构域防止不期望的Fab交换，降低抗体的效应功能，并且还促进重链多肽亚基的异二聚化以形成双特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性抗体，其包含i)含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:58的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性抗体，其包含i)含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:59的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性抗体，其包含i)含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:58的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性抗体，其包含i)含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:59的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含含有SEQID NO:56的抗CD3重链、含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链和含有SEQ ID NO:58的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含i)含有SEQID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:59的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含i)含有SEQID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:58的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含i)含有SEQID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:59的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQID NO:58的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQID NO:59的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQID NO:58的氨基酸序列，并且其中所述第二结合臂不包含轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQID NO:59的氨基酸序列，并且其中所述第二结合臂不包含轻链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:58的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:59的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:58的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:59的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链、含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链和含有SEQ ID NO:58的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:59的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:58的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:56的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:59的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，并且其中所述第二结合臂不包含轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，并且其中所述第二结合臂不包含轻链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性抗体，其包含i)含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:76的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性抗体，其包含i)含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:77的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性抗体，其包含i)含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:76的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性抗体，其包含i)含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:77的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含含有SEQID NO:75的抗CD3重链、含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链和含有SEQ ID NO:76的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含i)含有SEQID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:77的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含i)含有SEQID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:76的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含i)含有SEQID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:77的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQID NO:76的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，该第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQID NO:77的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，以及(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，并且其中所述第二结合臂不包含轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性抗体，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQID NO:77的氨基酸序列，并且其中所述第二结合臂不包含轻链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:76的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:77的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:76的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:77的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链、含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链和含有SEQ ID NO:76的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:77的抗BCMA重链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:76的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含i)含有SEQ ID NO:75的抗CD3重链，ii)含有SEQ ID NO:49的抗CD3轻链，和iii)含有SEQ ID NO:77的抗BCMA重链，其中双特异性抗体不包含抗BCMA轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，并且其中所述第二结合臂不包含轻链。
在一些实施方案中，本发明包含人类单克隆IgG4双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含(i)结合至人类CD3的第一结合臂，和(ii)结合至人类BCMA的第二结合臂，所述第一结合臂包含第一重链和轻链，并且所述第二结合臂包含二价第二重链，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述二价第二重链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，并且其中所述第二结合臂不包含轻链。
抗CD19抗体
本发明提供结合至人类CD19的紧密相关的抗体的家族。这个家族的抗体的可变区描述于PCT公布第WO2020018922号中，该PCT公布的全部公开内容都通过引用并入本文。抗CD19抗体序列可选自本文所提供用于开发和治疗或其它用途(包括但不限于作为多特异性、例如双特异性抗体的用途)的那些序列。在一些实施方案中，提供双特异性或多特异性抗体，其可具有本文所论述的任一构型，包括(但不限于)TCA。双特异性抗体至少包含特异性针对除CD19以外的蛋白质的抗体的重链可变区。
当本发明的蛋白质是双特异性抗体时，一个结合部分特异性针对人类CD19，而另一臂可特异性针对靶细胞、肿瘤相关抗原、靶向抗原(例如整合素等)、病原体抗原、检查点蛋白等。靶细胞特定包括癌细胞，例如血液肿瘤，例如B细胞肿瘤，如下文所论述。
多种格式的双特异性抗体在本发明的范围内，包括(但不限于)单链多肽、双链多肽、三链多肽、四链多肽和其倍数多肽。本文的双特异性抗体特定包括结合至CD19(其在成熟B细胞上选择性表达)和CD3的T细胞双特异性抗体(抗CD19×抗CD3抗体)。此类抗体诱导强效T细胞介导的表达CD19的细胞的杀伤，并且可用于治疗肿瘤，具体来说血液肿瘤，例如B细胞肿瘤，如本文进一步论述。
在优选实施方案中，双特异性抗体是包含以下的TCA：与轻链可变结构域(VL)配对的抗CD3 VH结构域，其中VH结构域和VL结构域一起对CD3具有结合亲和力；仅重链抗体的重链可变结构域，其对CD19具有结合亲和力并且呈单价或二价构型；以及变体人类IgG4 Fc结构域，其包含含有S228P突变、F234A突变、L235A突变和T366W突变(旋钮)的第一重链恒定区序列，以及含有S228P突变、F234A突变、L235A突变、T366S突变、L368A突变和Y407V突变(孔)的第二重链恒定区序列。这种变体或经修饰的IgG4 Fc结构域防止不期望的Fab交换，降低抗体的效应功能，并且还促进重链多肽亚基的异二聚化以形成双特异性抗体。
抗PSMA抗体
本发明提供结合至人类PSMA的紧密相关的抗体的家族。这个家族的抗体由表2中所示的SEQ ID NO:24至54的所提供重链可变区(VH)序列例示。抗体家族提供有助于用作临床治疗剂的多种益处。抗体包括具有一定结合亲和力范围的成员，从而允许选择具有期望结合亲和力的特定序列。
表2.抗PSMA重链抗体可变结构域氨基酸序列。
Figure BDA0003906628410000461
Figure BDA0003906628410000471
Figure BDA0003906628410000481
Figure BDA0003906628410000491
Figure BDA0003906628410000501
在优选实施方案中，双特异性抗体是包含以下的TCA：与轻链可变结构域(VL)配对的抗CD3 VH结构域，其中VH结构域和VL结构域一起对CD3具有结合亲和力；仅重链抗体的重链可变结构域，其对PSMA具有结合亲和力并且呈单价或二价构型；以及变体人类IgG4 Fc结构域，其包含含有S228P突变、F234A突变、L235A突变和T366W突变(旋钮)的第一重链恒定区序列，以及含有S228P突变、F234A突变、L235A突变、T366S突变、L368A突变和Y407V突变(孔)的第二重链恒定区序列。这种变体或经修饰的IgG4 Fc结构域防止不期望的Fab交换，降低抗体的效应功能，并且还促进重链多肽亚基的异二聚化以形成双特异性抗体。
CD3×靶蛋白三链抗体样分子(TCA)
在一些实施方案中，提供双特异性或多特异性抗体，其可具有本文所论述的任一构型，包括(但不限于)双特异性三链抗体样分子。在一些实施方案中，多特异性抗体可包含对第一抗原(例如CD3)具有结合特异性的重链/轻链对，和仅重链抗体的重链。在某些实施方案中，仅重链抗体的重链包含在CH1结构域不存在下含有CH2和/或CH3和/或CH4结构域的Fc部分。在一个特定实施方案中，双特异性抗体包含对效应细胞上的抗原(例如T细胞上的CD3蛋白)具有结合特异性的重链/轻链对，和仅重链抗体的包含对BCMA、PSMA或CD19具有结合特异性的抗原结合结构域的重链。
在优选实施方案中，双特异性抗体是包含以下的TCA：与轻链可变结构域(VL)配对的抗CD3 VH结构域，其中VH结构域和VL结构域一起对CD3具有结合亲和力；仅重链抗体的重链可变结构域，其对BCMA、PSMA或CD19具有结合亲和力；以及变体人类IgG4 Fc结构域，其包含含有S228P突变、F234A突变、L235A突变和T366W突变(旋钮)的第一重链恒定区序列，以及含有S228P突变、F234A突变、L235A突变、T366S突变、L368A突变和Y407V突变(孔)的第二重链恒定区序列。这种变体或经修饰的IgG4 Fc结构域防止不期望的Fab交换，降低抗体的效应功能，并且还促进重链多肽亚基的异二聚化以形成双特异性抗体。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含与轻链可变结构域配对的CD3结合VH结构域。在某些实施方案中，轻链是固定轻链。在一些实施方案中，在人类VH框架中，CD3结合VH结构域包含SEQ ID NO:36的CDR1序列、SEQ ID NO:37的CDR2序列和SEQ ID NO:38的CDR3序列。在一些实施方案中，在人类VL框架中，固定轻链包含SEQ ID NO:39的CDR1序列、SEQ IDNO:40的CDR2序列和SEQ ID NO:41的CDR3序列。CD3结合VH结构域和轻链可变结构域一起对CD3具有结合亲和力。在一些实施方案中，CD3结合VH结构域包含SEQ ID NO:42的重链可变区序列。在一些实施方案中，CD3结合VH结构域包含与SEQ ID NO:42的重链可变区序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％一致性％的序列。在一些实施方案中，固定轻链包含SEQ ID NO:43的轻链可变区序列。在一些实施方案中，固定轻链包含与SEQ ID NO:43的重链可变区序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％一致性％的序列。
包含上述CD3结合VH结构域和轻链可变结构域的多特异性抗体具有例如如PCT公布第WO2018/052503号中所述的有利性质，该PCT公布的全部公开内容都通过引用并入本文。对BCMA、PSMA或CD19具有结合亲和力的本文所述的任一多特异性抗体和抗原结合结构域可与本文所述的CD3结合结构域和固定轻链结构域组合以产生对一个或多个BCMA表位、PSMA表位或CD19表位以及CD3具有结合亲和力的多特异性抗体。
表3.抗CD3重链和轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列。
Figure BDA0003906628410000521
表4.抗CD3重链和轻链可变区氨基酸序列。
Figure BDA0003906628410000522
表5：人类IgG1和IgG4 Fc区序列。
Figure BDA0003906628410000523
Figure BDA0003906628410000531
表6：抗CD3抗体序列。
Figure BDA0003906628410000532
Figure BDA0003906628410000541
Figure BDA0003906628410000551
Figure BDA0003906628410000561
表7：抗TAA抗体序列。
Figure BDA0003906628410000562
Figure BDA0003906628410000571
Figure BDA0003906628410000581
Figure BDA0003906628410000591
Figure BDA0003906628410000601
Figure BDA0003906628410000611
Figure BDA0003906628410000621
在一些实施方案中，提供双特异性或多特异性抗体，其可具有本文所论述的任一构型，包括(但不限于)双特异性三链抗体样分子。在一些实施方案中，双特异性抗体可包含至少一个对BCMA、PSMA或CD19具有结合特异性的重链可变区，和至少一个对不同蛋白质(例如CD3)具有结合特异性的重链可变区。在一些实施方案中，双特异性抗体可包含对第一抗原具有结合特异性的重链/轻链对和仅重链抗体的呈单价或二价构型的重链，所述重链包含在CH1结构域不存在下含有CH2和/或CH3和/或CH4结构域、和抗原结合结构域的Fc部分，所述抗原结合结构域结合第二抗原的表位或第一抗原的不同表位。在一个特定实施方案中，双特异性抗体包含对效应细胞上的抗原(例如T细胞上的CD3蛋白)具有结合特异性的重链/轻链对，和仅重链抗体的包含对BCMA、PSMA或CD19具有结合特异性的抗原结合结构域并且呈单价或二价构型的重链。
在一些实施方案中，当本发明的抗体是双特异性抗体时，抗体的一个臂(一个结合部分或一个结合单元)特异性针对人类BCMA、人类PSMA或人类CD19，而另一臂可特异性针对靶细胞、肿瘤相关抗原、靶向抗原(例如整合素等)、病原体抗原、检查点蛋白等。靶细胞特定包括癌细胞，包括(但不限于)实体肿瘤(例如前列腺肿瘤)的细胞，如下文所论述。在一些实施方案中，抗体的一个臂(一个结合部分或一个结合单元)特异性针对人类BCMA、人类PSMA或人类CD19，而另一臂特异性针对CD3。
在一些实施方案中，抗体包含含有连接至SEQ ID NO:48的序列的SEQ ID NO:43的序列的抗CD3轻链多肽、含有SEQ ID NO:44、45、46、47、50、51、52、53、56或57中任一者的序列的抗CD3重链多肽、和含有SEQ ID NO:58、59或60中任一者的序列的抗BCMA重链多肽。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ ID NO:56的第二多肽和含有SEQ ID NO:58、59或60的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ ID NO:56的第二多肽和含有SEQ ID NO:58的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ ID NO:49组成的第一多肽、由SEQ IDNO:56组成的第二多肽和由SEQ ID NO:58组成的第三多肽组成的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ ID NO:56的第二多肽和含有SEQID NO:59的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ ID NO:49组成的第一多肽、由SEQ ID NO:56组成的第二多肽和由SEQ ID NO:59组成的第三多肽组成的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ ID NO:56的第二多肽和含有SEQ ID NO:60的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ ID NO:49组成的第一多肽、由SEQ ID NO:56组成的第二多肽和由SEQ ID NO:60组成的第三多肽组成的TCA。
在一些实施方案中，抗体包含含有连接至SEQ ID NO:48的序列的SEQ ID NO:43的序列的抗CD3轻链多肽、含有SEQ ID NO:44、45、46、47、50、51、52、53、56或57中任一者的序列的抗CD3重链多肽、和含有SEQ ID NO:61、62、63、64、65或66中任一者的序列的抗PSMA重链多肽。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ IDNO:56的第二多肽和含有SEQ ID NO:61的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ ID NO:49组成的第一多肽、由SEQ ID NO:56组成的第二多肽和由SEQ ID NO:61组成的第三多肽组成的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ ID NO:56的第二多肽和含有SEQ ID NO:62的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ ID NO:49组成的第一多肽、由SEQ ID NO:56组成的第二多肽和由SEQID NO:62组成的第三多肽组成的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ ID NO:56的第二多肽和含有SEQ ID NO:63的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ ID NO:49组成的第一多肽、由SEQ ID NO:56组成的第二多肽和由SEQ ID NO:63组成的第三多肽组成的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ ID NO:56的第二多肽和含有SEQ ID NO:64的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ ID NO:49组成的第一多肽、由SEQ ID NO:56组成的第二多肽和由SEQ ID NO:64组成的第三多肽组成的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ ID NO:56的第二多肽和含有SEQ IDNO:65的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ ID NO:49组成的第一多肽、由SEQ ID NO:56组成的第二多肽和由SEQ ID NO:65组成的第三多肽组成的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ ID NO:56的第二多肽和含有SEQ ID NO:66的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ ID NO:49组成的第一多肽、由SEQ ID NO:56组成的第二多肽和由SEQ ID NO:66组成的第三多肽组成的TCA。
在一些实施方案中，抗体包含含有连接至SEQ ID NO:48的序列的SEQ ID NO:43的序列的抗CD3轻链多肽、含有SEQ ID NO:44、45、46、47、50、51、52、53、56或57中任一者的序列的抗CD3重链多肽、和含有SEQ ID NO:67、68或69中任一者的序列的抗CD19重链多肽。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ ID NO:56的第二多肽和含有SEQ ID NO:67的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ IDNO:49组成的第一多肽、由SEQ ID NO:56组成的第二多肽和由SEQ ID NO:67组成的第三多肽组成的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQID NO:56的第二多肽和含有SEQ ID NO:68的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ ID NO:49组成的第一多肽、由SEQ ID NO:56组成的第二多肽和由SEQ ID NO:68组成的第三多肽组成的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是包含含有SEQ ID NO:49的第一多肽、含有SEQ ID NO:56的第二多肽和含有SEQ ID NO:69的第三多肽的TCA。在一个优选实施方案中，抗体是由SEQ ID NO:49组成的第一多肽、由SEQ ID NO:56组成的第二多肽和由SEQID NO:69组成的第三多肽组成的TCA。
多种格式的多特异性抗体在本发明的范围内，包括(但不限于)单链多肽、双链多肽、三链多肽、四链多肽和其倍数多肽。本文的多特异性抗体特定包括结合至BCMA、PSMA或CD19和CD3(抗BCMA×抗CD3抗体、抗PSMA×抗CD3抗体、抗CD19×抗CD3抗体)并且含有变体人类IgG4 Fc结构域的T细胞多特异性(例如双特异性)抗体，所述变体人类IgG4 Fc结构域包含含有S228P突变、F234A突变、L235A突变和T366W突变(旋钮)的第一重链恒定区序列，以及含有S228P突变、F234A突变、L235A突变、T366S突变、L368A突变和Y407V突变(孔)的第二重链恒定区序列。这种变体或经修饰的IgG4 Fc结构域防止不期望的Fab交换，降低抗体的效应功能，并且还促进重链多肽亚基的异二聚化以形成双特异性抗体。此类抗体诱导强效T细胞介导的分别表达BCMA、PSMA或CD19的细胞的杀伤。
抗体的制备
本发明的多特异性抗体可通过此项技术中已知的方法制备。在优选实施方案中，本文的重链抗体由转基因动物(包括转基因小鼠和大鼠，优选大鼠)产生，其中内源免疫球蛋白基因经剔除或失效。在优选实施方案中，本文的重链抗体在UniRatTM中产生。UniRatTM使其内源免疫球蛋白基因沉默并使用人类免疫球蛋白重链易位来表达完整人类HCAb的不同的天然优化谱。尽管大鼠中的内源免疫球蛋白基因座可使用多种技术剔除或沉默，但在UniRatTM中，使用锌指(内源)核酸酶(ZNF)技术使内源大鼠重链J-基因座、轻链Cκ基因座和轻链Cλ基因座失活。用于显微注射至卵母细胞中的ZNF构建体可产生IgH和IgL基因剔除(KO)系。关于细节参见例如Geurts等人，2009,Science325:433。Menoret等人，2010,Eur.J.Immunol.40:2932-2941已报道Ig重链基因剔除大鼠的表征。ZNF技术的优点在于，非同源末端联结以通过缺失高达若干kb使基因或基因座沉默还可提供同源整合的靶位点(Cui等人，2011,Nat Biotechnol 29:64-67)。在UniRatTM中产生的人类重链抗体称为UniAbsTM，并且可结合无法用常规抗体攻击的表位。它们的高特异性、亲和力和小尺寸使其理想地用于单特异性和多特异性应用。
除UniAbsTM外，本文特定包括缺少骆驼科VHH框架和突变的仅重链抗体和其功能性VH区。此类仅重链抗体可在例如包含如例如WO2006/008548中所述的完整人类仅重链基因座的转基因大鼠或小鼠中产生，但也可使用其它转基因哺乳动物，例如兔、豚鼠、大鼠，大鼠和小鼠优选。仅重链抗体(包括其VHH或VH功能片段)还可通过重组DNA技术、通过在适宜真核或原核宿主(包括例如哺乳动物细胞(例如CHO细胞)、大肠杆菌(E.coli)或酵母)中表达编码核酸来产生。
仅重链抗体的结构域组合抗体和小分子药物的优点：可为单价或多价；具有低毒性；并且制造是成本有效的。由于其小尺寸，这些结构域易于施用，包括口服或局部施用，其特征在于高稳定性，包括胃肠稳定性；并且可针对期望用途或适应症调整其半衰期。另外，HCAb的VH和VHH结构域可以成本有效的方式制造。
在特定实施方案中，本发明的重链抗体(包括UniAbsTM)在FR4区的第一位置(根据Kabat编号系统的氨基酸位置101)具有的天然氨基酸残基经另一氨基酸残基取代，所述另一氨基酸残基能够破坏包含所述位置的天然氨基酸残基或与其缔合的表面暴露的疏水贴片。此类疏水贴片通常埋藏在与抗体轻链恒定区的界面中，但在HCAb中变得表面暴露，并且至少部分地由于HCAb的不期望聚集和轻链缔合。经取代的氨基酸残基优选带电荷，并且更优选带正电荷，例如赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)或组氨酸(His，H)，优选精氨酸(R)。在优选实施方案中，衍生自转基因动物的仅重链抗体在位置101含有Trp至Arg突变。所得HCAb优选在生理条件下在聚集不存在下具有高抗原结合亲和力和溶解度。
作为本发明的一部分，在ELISA蛋白和细胞结合分析中鉴别出结合人类CD3、BCMA、PSMA或CD19的具有UniRatTM动物的独特序列的人类重链抗体(UniAbTM)。所鉴别重链可变区(VH)序列(参见例如表1和表2)对蛋白质结合和/或对表达靶蛋白(例如CD3、BCMA、PSMA或CD19)的细胞结合呈阳性，并且对不表达靶蛋白的细胞结合都呈阴性。
结合至靶蛋白上的非重叠表位的重链抗体(例如UniAbsTM)可通过竞争结合分析(例如酶联免疫分析(ELISA分析)或流式细胞术竞争性结合分析)来鉴别。举例来说，可利用结合至靶抗原的已知抗体与所关注抗体之间的竞争。通过使用这种方法，可将一组抗体分成与参考抗体竞争的抗体和不与参考抗体竞争的抗体。非竞争性抗体鉴别为结合至不与参考抗体结合的表位重叠的不同表位。通常，将一种抗体固定，使抗原结合，并且在ELISA分析中测试第二种经标记(例如生物素化)抗体结合所捕获抗原的能力。这还可通过使用表面等离子体共振(SPR)平台(包括ProteOn XPR36(BioRad,Inc)、Biacore 2000和Biacore T200(GE Healthcare Life Sciences))和MX96 SPR成像仪(Ibis technologies B.V.)以及在生物膜层干涉技术平台(例如Octet Red384和Octet HTX(ForteBio,Pall Inc))上实施。关于其它细节参见本文的实例。
通常，如通过标准技术、例如通过上文所述的竞争结合分析所测定，如果抗体使参考抗体与靶抗原的结合减少约15％-100％，则所述抗体与参考抗体“竞争”。在各个实施方案中，相对抑制为至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高。
药物组合物、用途和治疗方法
本发明的另一方面提供药物组合物，其包含一种或多种本发明的多特异性结合化合物与适宜药学上可接受的载体的混合物。如本文所用的药学上可接受的载体例示为(但不限于)佐剂、固体载体、水、缓冲剂或此项技术中用于容纳治疗组分的其它载体，或其组合。
在一个实施方案中，药物组合物包含结合至靶蛋白(例如CD3、BCMA、PSMA或CD19)的重链抗体(例如UniAbTM)。在另一实施方案中，药物组合物包含对靶蛋白(例如CD3、BCMA、PSMA或CD19)上的两个或更多个非重叠表位具有结合特异性的多特异性(包括双特异性)重链抗体(例如UniAbTM)。在优选实施方案中，药物组合物包含对靶蛋白(例如BCMA、PSMA或CD19)具有结合特异性并且对效应细胞上的结合靶(例如T细胞上的结合靶，例如T细胞上的CD3蛋白)具有结合特异性的多特异性(包括双特异性)重链抗体(例如UniAbTM)。
根据本发明使用的抗体的药物组合物通过混合具有期望纯度的蛋白质与任选地存在的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂制备以供储存(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编辑(1980))，例如以冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
用于非经肠施用的药物组合物优选是无菌并且大体上等渗的，并且是在良好制造实践(Good Manufacturing Practice，GMP)条件下制造。药物组合物可以单位剂量形式(即用于单次施用的剂量)提供。制剂根据所选施用途径而定。本文的抗体可通过静脉内注射或输注或皮下施用。对于注射施用，本文的抗体可配制于水溶液中、优选配制于生理相容缓冲液中以减少注射位点的不适。溶液可含有如上文所论述的载体、赋形剂或稳定剂。替代地，抗体可呈冻干形式以在使用前用适宜媒介物(例如无菌无热原水)构成。
抗体制剂公开于例如美国专利第9,034,324号中。类似制剂可用于本发明的重链抗体，包括UniAbsTM。皮下抗体制剂描述于例如US20160355591和US20160166689中。
使用方法
本文所述的仅重链抗体、多特异性抗体和药物组合物可用于治疗特征在于靶蛋白(例如CD3、BCMA、PSMA或CD19)表达的疾病和疾患，包括(但不限于)本文进一步描述的疾患和疾病。
本文的包含抗BCMA抗体的药物组合物可用于治疗B细胞相关的病症，包括特征在于BCMA表达或过表达的B细胞和浆细胞恶性病以及自身免疫病症。
此类B细胞相关的病症包括B细胞和浆细胞恶性病以及自身免疫病症，包括(但不限于)浆细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小型非裂解细胞淋巴瘤、地方性伯基特氏淋巴瘤、散发性伯基特氏淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、结外粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤、结节性单核细胞样B细胞淋巴瘤、脾淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、原发性纵膈B细胞淋巴瘤、肺B细胞血管中心性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、不确定恶性潜能的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿、移植后淋巴增生性病症、免疫调控病症、类风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫斑症、抗磷脂综合征、蔡格司病(Chagas'disease)、格雷氏病(Grave's disease)、华格纳氏肉芽肿(Wegener'sgranulomatosis)、结节性多动脉炎、休格伦氏综合征(Sjogren's syndrome)、寻常天疱疮、硬皮症、多发性硬化、抗磷脂综合征、ANCA相关的血管炎、古巴士德氏病(Goodpasture'sdisease)、川崎病(Kawasaki disease)、自身免疫溶血性贫血和快速进行性肾小球肾炎、重链病、原发性或免疫细胞相关的类淀粉变性或单克隆丙种球蛋白病变。
特征在于BCMA表达的浆细胞病症包括多发性骨髓瘤(MM)。MM是特征在于异常浆细胞在骨髓隔室中单克隆扩增和累积的B细胞恶性病。MM的当前疗法通常引起缓解，但几乎所有患者最终复发并死亡。同种异体造血干细胞移植环境中免疫介导的骨髓瘤细胞消除存在实质性证据；然而，这种方法的毒性较高，并且极少患者被治愈。尽管一些单克隆抗体已在临床前研究和早期临床试验中显示治疗MM的前景，但最终尚未证实MM的任一单克隆抗体疗法的一致临床功效。因此，极大地需要新疗法，包括MM的免疫疗法(参见例如Carpenter等人，Clin Cancer Res 2013,19(8):2048-2060)。
已知BCMA通过其诱导增殖的配体APRIL的过表达或活化促进活体内人类多发性骨髓瘤(MM)进展。还已显示BCMA促进小鼠中异种移植的带有p53突变的MM细胞的活体内生长。由于APRIL/BCMA路径的活性通过肿瘤细胞与其支持骨髓微环境之间的双向相互作用在MM发病机制和药物抗性中起关键作用，BCMA已被鉴别为治疗MM的靶。关于其它细节参见例如Yu-Tsu Tai等人，Blood 2016；127(25):3225-3236。
涉及浆细胞(即表达BCMA)的另一B细胞病症是全身性红斑狼疮(SLE)，也称为狼疮。SLE是全身性自身免疫疾病，其可侵袭身体的任一部分并且表现为免疫系统攻击身体自身细胞和组织，导致慢性炎症和组织损害。它是III型超敏反应，其中抗体-免疫复合物沉淀并且引起另一免疫反应(Inaki和Lee,Nat Rev Rheumatol 2010；6:326-337)。
本发明的抗BCMA仅重链抗体(UniAb)可用于开发治疗MM、SLE和特征在于BCMA表达的其它B细胞病症或浆细胞病症(例如上文所列出的那些病症)的治疗剂。具体来说，本发明的抗BCMA仅重链抗体(UniAb)可单独或与其它MM治疗组合用于治疗MM。
PSMA是在前列腺上皮组织上表达并且在前列腺癌和实体肿瘤新血管系统中上调的II型跨膜蛋白。它也以低水平在健康组织(例如脑、肾脏和唾液腺)中表达，但它在恶性前列腺组织中的过表达使其成为前列腺癌的治疗性治疗的有吸引力的靶。鉴于其在恶性新血管系统中的高表达，它还可与实体肿瘤的疗法或成像相关。已描述靶向PSMA的单克隆抗体、抗体药物结合物和嵌合抗原受体T细胞用于治疗转移性前列腺癌(Hernandez-Hoyos等人，2016,PMID:27406985；DiPippo等人，2014,PMID:25327986；Serganova等人，2016,PMID:28345023)。另外，正在研究特异性针对PSMA的放射性核素结合物用于前列腺癌的成像和治疗(例如Hofman等人，2018,PMID:29752180)。
在一个方面，本文的PSMA重链抗体(例如UniAbsTM)和药物组合物可用于治疗特征在于PSMA表达的病症，包括(但不限于)前列腺癌和实体肿瘤。
CD19是在所有人类B细胞上表达、但未在浆细胞上发现的细胞表面受体。它具有相对较大的240个氨基酸的细胞质尾。细胞外Ig样结构域由潜在二硫键连接的非Ig样结构域和N连接的碳水化合物添加位点分开。细胞质尾在C末端附近含有至少九个酪氨酸残基，已显示其中的一些经磷酸化。与CD20和CD22一样，CD19在B细胞谱系中的限制性表达使其成为B细胞恶性病的治疗性治疗的有吸引力的靶。由于观察到其在多种血液恶性病中表达，CD19是基于抗体的治疗剂的有前景的靶。
在一个方面，本文的CD19重链抗体(例如UniAbsTM)和药物组合物可用于治疗特征在于CD19表达的血液恶性病，包括(但不限于)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL或DLBL)是成人非霍奇金氏淋巴瘤的最常见形式(Blood 1997 89(11):3909-18)，其中在US和UK估计每年发病率为每100,000人每年7至8个病例。它的特征在于几乎可在身体任一部分发生的侵袭性癌症。DLBCL的病因尚不清楚，并且其可源自正常B细胞以及其它类型的淋巴瘤或白血病细胞的恶性转型。治疗方法通常涉及化学疗法和辐射，并且已使成人的总体五年存活率平均值为约58％。尽管一些单克隆抗体已显示治疗DLBCL的前景，但最终尚未证实一致的临床功效。因此，极大地需要新的DLBCL疗法，包括免疫疗法。
在另一方面，本文的CD19重链抗体(例如UniAbsTM)和药物组合物可用于治疗特征在于表达CD19的病原性B细胞的自身免疫病症，包括(但不限于)全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和多发性硬化(MS)。
本发明的组合物用于治疗疾病的有效剂量根据许多不同的因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人类还是动物、施用的其它药物以及治疗为预防性还是治疗性的。通常，患者是人类，但也可治疗非人类哺乳动物，例如伴侣动物(例如狗、猫、马等)、实验室哺乳动物(例如兔、小鼠、大鼠等)等。治疗剂量可经滴定以优化安全性和功效。
剂量水平可容易地由普通熟练的临床医师来确定，并且可根据需要进行修改，例如根据受试者对疗法的反应的需要来修改。可与载体材料组合产生单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗宿主和具体施用模式而变化。剂量单位形式通常含有约1mg至约500mg之间的活性成分。
在一些实施方案中，剂的治疗剂量可介于约0.0001至100mg/kg宿主体重、更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。举例来说，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。例示性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。本发明的治疗实体通常是在多个情况下来施用。单一剂量之间的间隔可为每周、每月或每年。间隔还可如通过测量患者中治疗实体的血液水平所指示而不规则。替代地，本发明的治疗实体可以持续释放制剂施用，在所述情况下需要不太频繁的施用。剂量和频率根据患者中多肽的半衰期而变化。
通常，组合物制备为可注射剂，呈液体溶液或悬浮液形式；还可制备在注射之前适用于液体媒介物中的溶液或悬浮液的固体形式。本文的药物组合物适于直接或复原固体(例如冻干)组合物后的静脉内或皮下施用。制剂还可乳化或囊封于脂质体或微粒(例如聚乳酸交酯、聚乙醇酸交酯或共聚物)中以增强佐剂效应，如上文所论述。Langer,Science249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997。本发明的剂可以积存注射或植入制剂的形式施用，所述制剂可以允许活性成分持续或脉冲释放的方式配制。药物组合物通常配制为无菌、大体上等渗的，并且完全符合美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)的所有良好制造实践(GMP)规定。
本文所述抗体和抗体结构的毒性可通过细胞培养物或实验动物中的标准医药程序来测定，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)或LD100(对100％群体致死的剂量)。毒性与治疗效应之间的剂量比是治疗指数。可使用从这些细胞培养物分析和动物研究获得的数据来配制对用于人类中无毒的剂量范围。本文所述抗体的剂量优选在包括具有极小毒性或无毒性的有效剂量的循环浓度的范围内。剂量可根据所采用的剂量形式和所用施用途径在这个范围内变化。个别主治医师可根据患者的状况来选择精确制剂、施用途径和剂量。
用于施用的组合物通常将包含溶解于药学上可接受的载体、优选水性载体中的抗体或其它剂(例如另一烧蚀剂)。可使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不期望物质。这些组合物可通过熟知的常规灭菌技术来灭菌。组合物可含有如接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可广泛地变化，并且将主要基于流体体积、粘性、体重等，根据所选具体施用模式和患者的需求来选择(例如Remington's Pharmaceutical Science(第15版，1980)以及Goodman和Gillman,ThePharmacological Basis of Therapeutics(Hardman等人编辑，1996))。
包含本发明的活性剂和其制剂以及使用说明书的药盒也在本发明的范围内。药盒可进一步含有至少一种其它试剂，例如化学治疗药物等。药盒通常包括指示药盒的内容物的预期用途的标记。如本文所用的术语“标记”包括在药盒上或随药盒提供或以其它方式伴随药盒的任何书写或记录材料。
现在全面描述本发明，本领域技术人员应明了，可在不背离本发明的精神或范围的情况下作出各种改变和修改。
实施例
实施例1：异二聚体形成
通过非还原和还原SDS-PAGE分析来分析异二聚体形成，以确定包含其铰链区和Fc区的多个突变以及旋钮入孔突变的根据本发明实施方案的抗体是否可成功地表达并且组装成期望异二聚体组合。为测试此目的，使抗体构建体在重组CHO细胞培养物中表达。然后通过蛋白质A亲和色谱纯化收获的细胞培养液以分析所产生的不同抗体片段。然后在还原和非还原凝胶上分析蛋白质A洗脱汇集物以使不同种类可视化。
这些分析的结果显示于图2的图A和图B、图3的图A和图B以及图24中，并且展示包括旋钮入孔突变的抗体种类的异二聚体形成百分比是优异的，甚至在效应功能沉默突变(F234A、L235A)和防止Fab臂交换的突变(S228P)也存在于重链序列中时。如图25中所提供，评估经纯化的CD19构建体以分析高分子量(HMW)和低分子量(LMW)种类的百分比以及单体的百分比。
实施例2：通过生物膜层干涉技术(BLI)的Fcγ受体结合
在Octet平台上使用Ni-NTA生物传感器(ForteBio)分析Fcγ受体-IgG相互作用。Ni-NTA生物传感器具有预固定至尖端上的装填有镍(Ni2+)的QIAGEN Tris-NTA。Ni-NTA将结合至连接至重组蛋白的HIS标签。以这种格式，将Fcγ受体蛋白加载至生物传感器上作为配体，然后与IgG缔合。研究根据本发明实施方案的抗体以分析其Fc区与固定在生物传感器上的Fcγ受体蛋白之间的相互作用程度。
这里，Fcγ受体是人类Fcγ受体I/CD64(Acro Biosystems)。所测试的抗体浓度包括100nM至1.6nM的2×连续稀释物。这些研究的结果显示于图4的图A-图D、图5的图A-图E、图6的图A-图D、图7的图A-图E和图26的图A-图D中，并且展示沉默的Fc受体抗体与人类FcγR1的结合被显著抑制，甚至在旋钮入孔突变和Fab臂交换突变也存在于Fc区中时。
特定来说，图4的图A显示不包含KiH突变或沉默突变的双特异性CD3×BCMA(单价)IgG1抗体的结果。数据证实，抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体相互作用。图4的图B显示与图A中所用相同、但现包括CH2结构域中的沉默突变的双特异性抗体的结果。这些结果展示，抗体与生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用因存在沉默突变而显著降低。图4的图C显示包括KiH突变、但不包括沉默突变的双特异性CD3×BCMA(单价)IgG1抗体的结果。这些数据展示，抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体以极类似于使用图A中的抗体所观察到的方式相互作用。图4的图D显示与图C中所用相同、但现包括CH2结构域中的沉默突变的双特异性抗体的结果。这些结果展示，抗体与生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用因存在沉默突变而显著降低，甚至在包括KiH突变时。
图5的图A显示不包含KiH突变或沉默突变、但包括防止Fab臂交换的S228P突变的双特异性CD3×BCMA(单价)IgG4抗体的结果。数据证实，抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体相互作用。图5的图B显示与图A中所用相同、但现包括CH2结构域中的沉默突变(F234A、L235A)的双特异性抗体的结果。这些结果展示，抗体与生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用因存在沉默突变而显著降低，甚至在存在S228P突变时。图5的图C显示包括KiH突变和S228P突变、但不包括沉默突变的双特异性CD3×BCMA(单价)IgG4抗体的结果。这些数据展示，抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体以极类似于使用图A中的抗体所观察到的方式相互作用。图5的图D显示与图C中所用相同、但现包括CH2结构域中的沉默突变(F234A、L235A)以及S228P和KiH突变的双特异性抗体的结果。这些结果展示，抗体与生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用因存在沉默突变而显著降低，甚至在包括S228P和KiH突变时。图E显示包括S228P突变、沉默突变F234A和L235A以及CH3结构域中的KiH突变的双特异性CD3×BCMA(二价)IgG4抗体的结果。这些数据展示，这种抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用显著降低，甚至在存在S228P和KiH突变时。
图6的图A显示不包含KiH突变或沉默突变的双特异性CD3×PSMA(单价)IgG1抗体的结果。数据证实，抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体相互作用。图6的图B显示与图A中所用相同、但现包括CH2结构域中的沉默突变的双特异性抗体的结果。这些结果展示，抗体与生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用因存在沉默突变而显著降低。图6的图C显示包括KiH突变、但不包括沉默突变的双特异性CD3×PSMA(单价)IgG1抗体的结果。这些数据展示，抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体以极类似于使用图A中的抗体所观察到的方式相互作用。图6的图D显示与图C中所用相同、但现包括CH2结构域中的沉默突变的双特异性抗体的结果。这些结果展示，抗体与生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用因存在沉默突变而显著降低，甚至在包括KiH突变时。
图7的图A显示不包含KiH突变或沉默突变、但包括防止Fab臂交换的S228P突变的双特异性CD3×PSMA(单价)IgG4抗体的结果。数据证实，抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体相互作用。图7的图B显示与图A中所用相同、但现包括CH2结构域中的沉默突变(F234A、L235A)的双特异性抗体的结果。这些结果展示，抗体与生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用因存在沉默突变而显著降低，甚至在存在S228P突变时。图7的图C显示包括KiH突变和S228P突变、但不包括沉默突变的双特异性CD3×PSMA(单价)IgG4抗体的结果。这些数据展示，抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体以极类似于使用图A中的抗体所观察到的方式相互作用。图7的图D显示与图C中所用相同、但现包括CH2结构域中的沉默突变(F234A、L235A)以及S228P和KiH突变的双特异性抗体的结果。这些结果展示，抗体与生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用因存在沉默突变而显著降低，甚至在包括S228P和KiH突变时。图E显示包括S228P突变、沉默突变F234A和L235A以及CH3结构域中的KiH突变的双特异性CD3×PSMA(二价)IgG4抗体的结果。这些数据展示，这种抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用显著降低，甚至在存在S228P和KiH突变时。
图26的图A显示不包含KiH突变或沉默突变、但包括防止Fab臂交换的S228P突变的双特异性CD3×CD19(单价)IgG4抗体的结果。数据证实，抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体相互作用。图26的图B显示与图A中所用相同、但现包括CH2结构域中的沉默突变(F234A、L235A)的双特异性抗体的结果。这些结果展示，抗体与生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用因存在沉默突变而显著降低，甚至在存在S228P突变时。图26的图C显示包括KiH突变和S228P突变、但不包括沉默突变的双特异性CD3×CD19(单价)IgG4抗体的结果。这些数据展示，抗体与固定在生物传感器上的Fcγ受体以极类似于使用图A中的抗体所观察到的方式相互作用。图26的图D显示与图C中所用相同、但现包括CH2结构域中的沉默突变(F234A、L235A)以及S228P和KiH突变的双特异性抗体的结果。这些结果展示，抗体与生物传感器上的Fcγ受体之间的相互作用因存在沉默突变而显著降低，甚至在包括S228P和KiH突变时。
总之，图4、图5、图6、图7和图26中所提供的数据证实，双特异性抗体的VH区序列对本文所述IgG4 Fc突变的功能性质无影响。因此，本文所述的IgG4 Fc修饰(S228P；F234A、L235A；T366W、T366S、L368A和Y407V)可在具有不同VH序列(即不同结合靶)的抗体中实施以实现减少的Fab臂交换(S228P)、降低的效应功能活性(F234A、L235A)和正确的异二聚化(T366W；T366S、L368A和Y407V)。
实施例3：抗PSMA UniAbsTM与PSMA阳性和阴性细胞的结合的流式细胞术分析
通过流式细胞术(Guava easyCyte 8HT,EMD Millipore)使用LNCaP细胞系(ATCC：CRL-1740)、22Rv1细胞系(ATCC CRL-2505)、PC3细胞系(ATCC CRL-1435)，其经稳定转染以表达人类PSMA，或DU-145细胞系(ATCC HTB-81)评价与PSMA阳性细胞的结合。简单地说，用一系列经纯化的UniAbsTM稀释物将50,000个靶细胞在4℃下染色30分钟。孵育后，用流式细胞术缓冲液(1×PBS、1％BSA、0.1％NaN3)将细胞洗涤两次，并用结合至R-藻红素(PE)的山羊F(ab’)2抗人类IgG(Southern Biotech，目录号2042-09)染色以检测细胞结合的抗体。在4℃下孵育20分钟后，用流式细胞术缓冲液将细胞洗涤两次，并通过流式细胞术测量平均荧光强度(MFI)。使用仅用二级抗体染色的细胞的MFI测定背景信号，并将每一抗体的结合转化成背景的倍数。使用相同方案并进行以下修改来测定与食蟹猴PSMA阳性细胞的结合：靶细胞是来自经瞬时转染以表达食蟹猴PSMA的细胞外结构域的Freestyle 293-F细胞(ThermoFisher R79007)。在一些实验中，使用GraphPad Prism 7计算EC50值。
表8汇总本文所述的抗PSMA重链抗体(HCAb)的靶结合活性。第1栏指示HCAb的克隆ID。第2栏指示测量为背景MFI信号的倍数的与LNCaP细胞的结合。
表8：与表达PSMA的细胞系的结合
Figure BDA0003906628410000791
Figure BDA0003906628410000801
如图8的图A和图B中所显示，与食蟹猴PSMA的结合的差异支持由HCAb 346181和HCAb 345497识别的人类PSMA表位的差异。
实施例4：双互补位和二价抗PSMA抗体的组成
如表9中所显示，抗PSMA克隆ID 350123由以桥接序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:71)连接至克隆ID 345497序列的克隆ID 346181序列构成。克隆ID 350122由通过同一连接体序列联结的克隆ID 346181的两个重复构成。克隆ID 350123是双互补位，这是因为其由识别PSMA上的不同表位的两个抗PSMA结构域构成。克隆ID 350122为二价的，但不是双互补位，这是因为其由串联的相同抗PSMA结构域构成。各个三链抗体样分子(TCA)的示意性图解说明绘示于图1的图A-图C中。
表9：双互补位和二价抗PSMA抗体的氨基酸序列的描述
Figure BDA0003906628410000811
实施例5：通过T细胞重定向，多特异性抗体介导的PSMA阳性前列腺肿瘤细胞的杀伤
使用静息T细胞的分析
将靶细胞以15,000个细胞/孔接种于96孔板中，并使其在37℃下生长过夜。孵育后，将递增量的多特异性抗体与静息的人类T细胞以10:1效应物对靶细胞比率一起添加，并在37℃下再孵育48或72小时(48小时用于使用LNCaP、MDA-PCa-2b和PC3-PSMA细胞的分析，并且72小时用于使用22Rv1细胞的分析)。使用细胞增殖试剂WST-1(Sigma目录号：11644807001)或流式细胞术测量细胞死亡。在一些实验中，在孵育后但在分析靶细胞活力之前收集每种上清液的小样品并保存用于分析细胞因子产生。当使用WST-1试剂分析细胞活力时，将试剂原液以1:10稀释添加至每孔中，并在37℃下孵育90分钟。然后在450nm(参考690nm)下测量吸光度，并计算特异性溶解％。
如果通过流式细胞术分析靶细胞活力，则在开始分析之前用膜染料DiR(ThermoFisher D12731)标记靶细胞。与T细胞和抗体一起孵育后，保存上清液用于细胞因子分析或丢弃。然后将孔洗涤一次以收集死肿瘤细胞和T细胞，将其转移至流式细胞术板。将剩余附接的肿瘤细胞胰蛋白酶化，然后添加至流式细胞术板中的相应孔中。使用膜连蛋白-V试剂对死细胞染色并进行流式细胞术(BD FACSCelesta)以对每一样品中的死肿瘤细胞％定量，通过DiR染色设门。使用含有未经处理的靶细胞的孔对自发细胞死亡进行标准化。在一些实验中，使用阴性对照抗体，其包含与PSMA×CD3多特异性分子中相同的CD3靶向臂，但用特异性针对HIV蛋白gp120的VH替代肿瘤靶向臂。
图9显示使用未经刺激的T细胞的T细胞介导的PSMA阳性细胞溶解。将未经刺激的人类T细胞与PSMA表达细胞(LNCaP)和不同浓度的多特异性抗体一起孵育。双互补位抗PSMA×CD3抗体(350123×CD3)优于单互补位PSMA×CD3抗体(346181×CD3)。
使用预活化的T细胞的分析
使用板结合的OKT3和IL-2将人类泛T细胞预活化三天，然后在新鲜IL-2中再孵育一天。将靶细胞胰蛋白酶化，向其中加载钙黄绿素-AM(ThermoFisher C3100MP)，与活化T细胞混合至20:1的E:T比，并添加至96孔板的孔中。添加一系列不同多特异性抗体稀释物，然后在37℃下孵育4小时。然后将上清液转移至黑色96孔板，并在480nm/520nm ex/em下测量吸光度以定量钙黄绿素的释放。未与T细胞一起孵育的靶细胞用于标准化完整肿瘤细胞的自发钙黄绿素释放。将2％Triton-X添加至含有靶细胞的对照孔允许计算对应于最大细胞溶解的钙黄绿素信号。使用这个值，每一实验孔报告为相对于最大细胞溶解的％。使用GraphPad prism 7进行数据分析。
图10显示使用预活化的T细胞的T细胞介导的PSMA阳性细胞溶解。将预活化的人类T细胞与人类PSMA表达细胞(LNCaP)和不同浓度的多特异性抗体一起孵育。通过钙黄绿素释放测量肿瘤细胞死亡，并将其标准化至不存在T细胞时肿瘤细胞的自发释放。双互补位抗PSMA×CD3抗体(350123×CD3)优于两种单互补位PSMA×CD3抗体。
图11显示多特异性抗体不会溶解PSMA阴性细胞。将预活化的人类T细胞与PSMA阴性前列腺癌细胞(DU145)和不同浓度的多特异性抗体一起孵育。测试的任一抗体都未溶解这些细胞。
图12显示PSMA×CD3多特异性抗体与PSMA阳性和阴性细胞的结合。多特异性抗PSMA×抗CD3抗体显示与PSMA阳性前列腺肿瘤细胞(22Rv1)结合，但不与PSMA阴性前列腺肿瘤细胞(DU145)结合。双互补位分子(350123)显示最强的靶细胞结合。
图13绘示T细胞介导的PSMA阳性细胞溶解。图13中的数据展示，通过两个不同的表位结合至PSMA与抗体的二价但单特异性形式相比可增加细胞杀伤。
实施例6：单互补位PSMA×CD3双特异性抗体诱导少于双互补位PSMA×CD3多特异性抗体的细胞因子产生
在肿瘤细胞毒性分析中使用静息T细胞分析细胞因子产生。这些分析的设计详述于别处。完成分析后(对于使用22Rv1细胞的分析孵育72小时后，对于使用所有其它细胞系的分析孵育48小时后)，收集上清液。使用ELISA试剂盒根据制造商的方案检测IL-2(Biolegend 431804)和IFNγ(Biolegend 430104)。在ELISA中分析之前稀释实验上清液，使得细胞因子的水平将落在随每一试剂盒提供的标准曲线的线性部分内。在一些情况下，在实验孔中无法检测到细胞因子，并且将值报告为小于或等于分析的定量下限。
图14(图A、图B和图C)显示T细胞介导的PSMA阳性细胞溶解和细胞因子产生的比较。多特异性PSMA×CD3抗体诱导T细胞介导的PSMA阳性前列腺癌细胞系LNCaP溶解。与单互补位分子(346181)相比，双互补位分子(350123)刺激更强效的肿瘤细胞杀伤，而且引起更高水平的细胞因子(即干扰素γ(IFNγ)和白介素2(IL-2))产生，如通过图14的图B和图C所例示。
表10显示针对四种PSMA阳性前列腺肿瘤细胞系的T细胞介导的溶解和细胞因子产生。在活体外肿瘤细胞的细胞毒性分析中，使用未经刺激的T细胞和一系列剂量的抗体，针对一组四种PSMA阳性肿瘤细胞系测试PSMA×CD3多特异性抗体。72小时(22Rv1)或48小时(MDA-PCa-2b、LNCAP、PC3-PSMA)后，通过EC50计算并且报告肿瘤细胞死亡％以及实现的最高杀伤％。收集这些实验孔的上清液并通过ELISA分析细胞因子，即干扰素-γ(IFNγ)或白介素-2(IL-2)。与双互补位分子相比，单互补位分子(3461881)针对测试的所有四种细胞系诱导大致等效水平的肿瘤细胞毒性，但具有较高的细胞因子产生EC50，并且在大多数情况下刺激较低水平的最大细胞因子产生。
表10：针对四种PSMA阳性前列腺肿瘤细胞系的T细胞介导的溶解和细胞因子产生。
Figure BDA0003906628410000841
实施例7：PSMA×CD3多特异性抗体诱导T细胞增殖
将PSMA阳性肿瘤细胞以25,000个细胞/孔接种于96孔板中，并使其在37℃下生长过夜。根据制造商的说明书用谱系示踪染料CFSE(ThermoFisher C34554)标记从静息的PBMC(Miltenyi130-096-535)分离的人类泛T细胞。然后将100,000个经标记的泛T细胞添加至含有肿瘤细胞的孔中，然后添加一系列抗体稀释物，并在37℃、8％CO2下孵育。孵育5天后，将细胞轻轻混合并转移至流式细胞术板。使细胞沉淀，并去除上清液，然后用结合至APC的抗CD8(Biolegend 301049)和结合至PE的抗CD4(Biolegend 317410)在冰上染色20分钟。然后将细胞洗涤，并重悬浮于流式细胞术缓冲液中用于分析(BD FACSCelesta)。针对前散和侧散以及CD4或CD8表达对细胞设门。如通过CD4或CD8阳性染色和低或阴性CFSE信号所指示，计算整个T细胞群体以及CD4和CD8亚组的增殖T细胞％。使用FlowJo分析流式细胞术数据并在GraphPad Prism 7中绘图。
图15(图A、图B、图C和图D)显示，PSMA×CD3多特异性抗体在PSMA阳性肿瘤细胞存在下刺激T细胞增殖，并且单互补位PSMA双特异性抗体优先活化CD3 T细胞。将多特异性抗体与表达PSMA的肿瘤细胞和经谱系示踪染料CFSE标记的T细胞一起孵育。孵育5天后，通过流式细胞术分析T细胞增殖和增殖T细胞的组成(CD8+对CD4+)。图A和图B显示总T细胞增殖，而图C和图D指示增殖孔中CD8+对CD4+T细胞的比率。水平虚线指示未经刺激的T细胞的CD8:CD4比率，并且为约1:2(实际值＝0.64)。单互补位PSMA×CD3双特异性抗体(346181)优先活化CD8 T细胞(扩增后CD8:CD4比率为约2:1)，而双互补位PSMA×CD3多特异性抗体(350123)较不优先活化CD8+T细胞(CD8:CD4比率为约1:1)。
实施例8：多特异性抗体引起异种移植物模型中前列腺肿瘤生长的抑制
向5-6周龄的雄性免疫缺陷CIEA-NOG小鼠(Taconic)的右下侧腹中皮下植入1000万个22Rv1细胞，然后在肿瘤植入后一天通过尾静脉注射添加1000万个人类PBMC。从肿瘤植入后一天开始在第1天、第5天、第9天和第13天，动物通过尾静脉注射接受100μg多特异性抗体或媒介物的治疗。使用卡尺定量肿瘤体积并记录达25天。
图16显示22Rv1肿瘤异种移植物模型的结果。双互补位PSMA×CD3分子(350123)显示肿瘤异种移植物模型中22Rv1肿瘤生长的抑制。每一治疗组测试三只小鼠，并且以立方毫米对每一动物的肿瘤体积变化绘图。动物在肿瘤植入后第1天接受PBMC，并在第1天、第5天、第9天和第13天用抗体治疗。用多特异性抗体治疗的三只动物中的两只显示肿瘤进展的延迟。
实施例9：T细胞活化的分析
CD69是T细胞上的细胞表面标记物，它在刺激时上调，由此用作T细胞活化的指示剂。在这项实验中，在3种不同条件下评估CD69活化：1)无BCMA包被的总外周血单核细胞(PBMC)；2)有BCMA包被的泛T细胞；以及3)无BCMA包被的泛T细胞。使用Ficoll(1.077g/ml密度)从血沉棕黄层分离PBMC，并将冷藏保存的PBMC解冻，并以2×106个细胞/mL在补充有10％FBS的RPMI1640中在37℃下静置24小时。在第2天，使用Miltenyi阴性选择试剂盒从静置的PBMC分离泛T细胞，并将经分离细胞用于第2种和第3种分析条件中。对于第一种分析条件，对PBMC计数并将其平铺在分析板中。
对于在抗原包被条件下评估的细胞，用浓度为1μg/mL的重组BCMA蛋白(人类BCMA蛋白，Fc标签，Acro Biosystems，目录号BC7-H5254)、浓度为1μg/mL的重组PSMA蛋白(重组人类PSMA/FOLH1蛋白，来自RND systems，目录号4234-ZN-0101)或浓度为10μg/mL的重组CD19蛋白(人类CD19蛋白，His标签，Acro Biosystems，目录号CD9-H52H2)包被96孔板。使用12点剂量曲线和3倍稀释分析双特异性抗体，最高剂量为300nM。将双特异性抗体和T细胞重悬浮于补充有10％FBS的RPMI1640中，并孵育18小时。泛T细胞是效应细胞并以100K个细胞/孔平铺。
对于不在抗原包被条件下评估的细胞，使用12点剂量曲线和3倍稀释将双特异性抗体与细胞一起孵育。300nM的双特异性抗体是这项分析中测试的最高浓度。将样品在补充有10％FBS的RPMI1640中在37℃下孵育18小时。从PBMC分离的泛T细胞是效应细胞，其以100K个细胞/孔平铺。
对于所有实验条件，将细胞洗涤，并用细胞表面T细胞抗体标记。使用以下抗体标记(1)CD4阳性T细胞(FITC抗人类CD4抗体)，(2)CD8阳性T细胞(PE抗人类CD8a抗体)，(3)CD69活化(Alexa Fluor647抗人类CD69抗体)(Biolegend)。然后在BD Celesta上使用适当模板分析细胞以测量CD69活化。
T细胞活化研究的结果显示于下图中：图17-图18、图27的图A-图B(无BCMA抗原包被，使用PBMC)；图30的图A-图B(无PSMA包被)；以及图33的图A-图B(无CD19包被)。
图17是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD4+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。一般来说，含有IgG1 Fc序列的双特异性抗体在较低双特异性抗体浓度下展现CD4+T细胞活化。含有IgG4 Fc序列的双特异性抗体在较高双特异性抗体浓度下展现CD4+T细胞活化。应注意，通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现的CD4+T细胞活化较低，这证实引入PAA和KiH突变会降低这些双特异性抗体对T细胞的非BCMA依赖性活化。
图18是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。与CD4+T细胞的情况相同，含有IgG1 Fc序列的双特异性抗体在较低双特异性抗体浓度下展现CD8+T细胞活化。含有IgG4 Fc序列的双特异性抗体在较高双特异性抗体浓度下展现CD8+T细胞活化。应注意，通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现的CD8+T细胞活化较低，这证实引入PAA和KiH突变会降低这些双特异性抗体对T细胞的非BCMA依赖性活化。
图27的图A是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD4+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现的CD4+T细胞活化与阴性对照(gp120、CD3(F2B))相似，这证实引入PAA和KiH突变会降低这些双特异性抗体对T细胞的非BCMA依赖性活化。图27的图B是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。与CD4+T细胞的情况相同，通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现的CD8+T细胞活化与阴性对照相似，这证实引入PAA和KiH突变会降低这些双特异性抗体对T细胞的非BCMA依赖性活化。
图30的图A是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD4+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现的CD4+T细胞活化与阴性对照(gp120、CD3(F2B))相似，这证实引入PAA和KiH突变会降低这些双特异性抗体对T细胞的非PSMA依赖性活化。图30的图B是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。与CD4+T细胞的情况相同，通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现的CD8+T细胞活化与阴性对照相似，这证实引入PAA和KiH突变会降低这些双特异性抗体对T细胞的非PSMA依赖性活化。
图33的图A是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD4+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现的CD4+T细胞活化远低于从不含PAA和KiH突变的其它抗体构建体观察到的CD4+T细胞活化，这证实引入PAA和KiH突变会降低这些双特异性抗体对T细胞的非CD19依赖性活化。图33的图B是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。与CD4+T细胞的情况相同，通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现的CD8+T细胞活化远低于从不含PAA和KiH突变的其它抗体构建体观察到的CD8+T细胞活化，这证实引入PAA和KiH突变会降低这些双特异性抗体对T细胞的非CD19依赖性活化。
使用从静息PBMC分离的泛T细胞在抗原包被下CD8+T细胞活化的结果提供于图19、图28的图B、图31的图B和图34的图B中。使用从静息PBMC分离的泛T细胞在抗原包被下CD4+T细胞活化的结果提供于图28的图A、图31的图A和图34的图A中。BCMA和PSMA的抗原包被浓度为1μg/mL，而CD19的抗原包被浓度为10μg/mL。
图19是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。与无BCMA包被的实验的情况不同，对于抗原包被细胞，所有双特异性抗体在相似双特异性抗体浓度下展现CD8+T细胞活化。应注意，通过含有PAA和KiH突变的IgG4Fc双特异性抗体实现了CD8+T细胞活化，这证实引入PAA和KiH突变不会消除这些分子的CD8+T细胞活化活性。
图28的图B是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。与无BCMA包被的实验的情况不同，对于抗原包被细胞，所有双特异性抗体在相似双特异性抗体浓度下展现CD8+T细胞活化。应注意，通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现了CD8+T细胞活化，这证实引入PAA和KiH突变不会消除这些分子的CD8+T细胞活化活性。
图31的图B是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。与无PSMA包被的实验的情况不同，对于抗原包被细胞，所有双特异性抗体在相似双特异性抗体浓度下展现CD8+T细胞活化。应注意，通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现了CD8+T细胞活化，这证实引入PAA和KiH突变不会消除这些分子的CD8+T细胞活化活性。
图34的图B是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。与无CD19包被的实验的情况不同，对于抗原包被细胞，所有双特异性抗体在相似双特异性抗体浓度下展现CD8+T细胞活化。应注意，通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现了CD8+T细胞活化，这证实引入PAA和KiH突变不会消除这些分子的CD8+T细胞活化活性。
图28的图A是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD4+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。与无BCMA包被的实验的情况不同，对于抗原包被细胞，所有双特异性抗体在相似双特异性抗体浓度下展现CD4+T细胞活化。应注意，通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现了CD4+T细胞活化，这证实引入PAA和KiH突变不会消除这些分子的CD4+T细胞活化活性。
图31的图A是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD4+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。与无PSMA包被的实验的情况不同，对于抗原包被细胞，所有双特异性抗体在相似双特异性抗体浓度下展现CD4+T细胞活化。应注意，通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现了CD4+T细胞活化，这证实引入PAA和KiH突变不会消除这些分子的CD4+T细胞活化活性。
图34的图A是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD4+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。与无CD19包被的实验的情况不同，对于抗原包被细胞，所有双特异性抗体在相似双特异性抗体浓度下展现CD4+T细胞活化。应注意，通过含有PAA和KiH突变的IgG4 Fc双特异性抗体实现了CD4+T细胞活化，这证实引入PAA和KiH突变不会消除这些分子的CD4+T细胞活化活性。
使用从静息PBMC分离的泛T细胞在无抗原包被下CD8+T细胞活化的结果提供于图20、图29的图B、图32的图B和图35的图B中。使用从静息PBMC分离的泛T细胞在无抗原包被下CD4+T细胞活化的结果提供于图29的图A、图32的图A和图35的图A中。
图20是显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。这些结果证实，对于测试的所有双特异性抗体分子，CD8+T细胞中的CD69活化依赖于BCMA。
图29的图A和图B是分别显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD4+CD69+T细胞％和CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。这些结果证实，对于测试的所有双特异性抗体分子，CD4+T细胞和CD8+T细胞中的CD69活化依赖于BCMA。在较高浓度的不包括沉默突变的双特异性抗体构建体下，CD4+T细胞和CD8+T细胞中的CD69活化均稍有增加。
图32的图A和图B是分别显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD4+CD69+T细胞％和CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。这些结果证实，对于测试的所有双特异性抗体分子，CD4+T细胞和CD8+T细胞中的CD69活化依赖于PSMA。
图35的图A和图B是分别显示图例中所显示双特异性抗体构建体的CD4+CD69+T细胞％和CD8+CD69+T细胞％随双特异性抗体浓度变化的图。这些结果证实，对于测试的所有双特异性抗体分子，CD4+T细胞和CD8+T细胞中的CD69活化依赖于CD19。在较高浓度的不包括沉默突变的双特异性抗体构建体下，CD4+T细胞和CD8+T细胞中的CD69活化均稍有增加。
实施例10：肿瘤细胞的溶解
分析抗CD3×抗BCMA双特异性抗体通过活化原代T细胞的重定向杀伤三种不同的BCMA+肿瘤细胞和一种BCMA阴性细胞系的能力。在这项实验中，将肿瘤细胞与活化泛T细胞以10:1E:T比混合，同时添加双特异性抗体。结果显示于图21的图A-图D中。图A显示RPMI-8226细胞的杀伤，图B显示NCI-H929细胞的杀伤，图C显示U-266细胞的杀伤，并且图D显示K562细胞(即阴性对照)的杀伤。x轴显示所用抗体的浓度，并且y轴显示添加抗体后6小时肿瘤细胞的溶解％。
在将静息的人类T细胞与多种肿瘤细胞系和递增剂量的抗CD3×抗BCMA双特异性抗体一起培养后测量IL-2细胞因子的释放水平。图22的图A显示经RPMI-8226细胞刺激的IL-2释放，图22的图B显示经NCI-H929细胞刺激的IL-2释放。图22的图C显示经U-266细胞刺激的IL-2释放，并且图22的图D显示经K562细胞(即阴性对照)刺激的IL-2释放。
在将静息的人类T细胞与多种肿瘤细胞系和递增剂量的抗CD3×抗BCMA双特异性抗体一起培养后测量IFN-γ细胞因子的释放水平。图23的图A显示经RPMI-8226细胞刺激的IFN-γ释放，图23的图B显示经NCI-H929细胞刺激的IFN-γ释放，图23的图C显示经U-266细胞刺激的IFN-γ释放，并且图23的图D显示经K562细胞(即阴性对照)刺激的IFN-γ释放。
尽管本文已显示和描述了本发明的优选实施方案，但本领域技术人员应明了，此类实施方案仅以实例方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和取代。应理解，在实践本发明时可采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。意图是，所附权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖在这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。

Claims (60)

1.一种经分离的多特异性抗体，其包含：
第一重链多肽亚基，其包含含有突变S228P、F234A、L235A和T366W的突变的人类IgG4恒定区；以及
第二重链多肽亚基，其包含含有突变S228P、F234A、L235A、T366S、L368A和Y407V的突变的人类IgG4恒定区。
2.如权利要求1所述的经分离的多特异性抗体，其中所述第一重链多肽亚基的所述突变的人类IgG4恒定区或所述第二重链多肽亚基的所述突变的人类IgG4恒定区缺少CH1结构域。
3.如权利要求1或2所述的经分离的多特异性抗体，其中所述第一重链多肽亚基的所述突变的人类IgG4恒定区包含SEQ ID NO:73或55的序列，并且所述第二重链多肽亚基的所述突变的人类IgG4恒定区包含SEQ ID NO:72或54的序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的经分离的多特异性抗体，其还包含对CD3具有结合特异性的第一结合部分，所述第一结合部分包含：
重链可变结构域，其包含含有SEQ ID NO:36的序列的CDR1序列、含有SEQ ID NO:37的序列的CDR2序列和含有SEQ ID NO:38的序列的CDR3序列；以及
轻链可变结构域，其包含含有SEQ ID NO:39的序列的CDR1序列、含有SEQ ID NO:40的序列的CDR2序列和含有SEQ ID NO:41的序列的CDR3序列。
5.如权利要求4所述的经分离的多特异性抗体，其中：
所述第一结合部分的所述重链可变结构域中的所述CDR1序列、所述CDR2序列和所述CDR3序列存在于人类VH框架中；并且
所述第一结合部分的所述轻链可变结构域中的所述CDR1序列、所述CDR2序列和所述CDR3序列存在于人类Vκ框架中。
6.如权利要求5所述的经分离的多特异性抗体，其中：
所述第一结合部分的所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:42具有至少95％一致性的序列；并且
所述第一结合部分的所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:43具有至少95％一致性的序列。
7.如权利要求6所述的经分离的多特异性抗体，其中：
所述第一结合部分的所述重链可变结构域包含所述SEQ ID NO:42的序列；并且
所述第一结合部分的所述轻链可变结构域包含所述SEQ ID NO:43的序列。
8.如权利要求1至7中任一项所述的经分离的多特异性抗体，其还包含对除CD3以外的蛋白质具有结合特异性的第二结合部分。
9.如权利要求8所述的经分离的多特异性抗体，其中所述第二结合部分包含呈单价或二价构型的单一重链可变区。
10.如权利要求9所述的经分离的多特异性抗体，其中所述第一结合部分包含轻链多肽亚基和重链多肽亚基，并且其中所述第二结合部分包含重链多肽亚基。
11.如权利要求10所述的经分离的多特异性抗体，其中所述第一结合部分的所述轻链多肽亚基包含轻链恒定结构域。
12.如权利要求8至11中任一项所述的经分离的多特异性抗体，其中所述除CD3以外的蛋白质是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。
13.如权利要求12所述的经分离的多特异性抗体，其中所述TAA是B细胞成熟抗原(BCMA)。
14.如权利要求12所述的经分离的多特异性抗体，其中所述TAA是CD19。
15.如权利要求12所述的经分离的多特异性抗体，其中所述TAA是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
16.一种药物组合物，其包含如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体。
17.一种多核苷酸，其编码如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体。
18.一种载体，其包含如权利要求17所述的多核苷酸。
19.一种细胞，其包含如权利要求18所述的载体。
20.一种产生如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体的方法，其包括使如权利要求19所述的细胞在允许所述多特异性抗体表达的条件下生长并从所述细胞分离所述多特异性抗体。
21.一种治疗方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体或如权利要求16所述的药物组合物。
22.如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体用于制备用来治疗有需要的个体的疾病或病症的药物的用途。
23.如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体或如权利要求16所述的药物组合物，其用于有需要的个体的疗法中。
24.一种治疗特征在于BCMA表达的疾病或疾患的方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的如权利要求13所述的多特异性抗体或包含如权利要求13所述的多特异性抗体的药物组合物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述疾病是自身免疫疾病。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述疾病是癌症。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述癌症是骨髓瘤。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述骨髓瘤是多发性骨髓瘤。
29.一种治疗特征在于PSMA表达的疾病或疾患的方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的如权利要求15所述的多特异性抗体或包含如权利要求15所述的多特异性抗体的药物组合物。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述疾病是癌症。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
32.一种治疗特征在于CD19表达的疾病或疾患的方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的如权利要求14所述的多特异性抗体或包含如权利要求14所述的多特异性抗体的药物组合物。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述病症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述病症是急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。
35.如权利要求32所述的方法，其中所述病症是非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。
36.如权利要求32所述的方法，其中所述病症是全身性红斑狼疮(SLE)。
37.如权利要求32所述的方法，其中所述病症是类风湿性关节炎(RA)。
38.如权利要求32所述的方法，其中所述病症是多发性硬化(MS)。
39.一种用于治疗有需要的个体的疾病或病症的药盒，其包含如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体或如权利要求16所述的药物组合物和使用说明书。
40.如权利要求39所述的药盒，其还包含至少一种其它试剂。
41.如权利要求40所述的药盒，其中所述至少一种其它试剂包含化学治疗药物。
42.一种双特异性三链抗体样分子，其包含：
第一多肽亚基，其包含：
包含SEQ ID NO:43的序列的轻链可变结构域(VL)；以及
轻链恒定结构域(CL)；
第二多肽亚基，其包含：
包含SEQ ID NO:42的序列的重链可变结构域(VH)；以及
包含SEQ ID NO:72或73的序列的重链恒定结构域(CH)；
其中所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域一起形成结合至CD3的第一结合部分；以及
第三多肽亚基，其包含：
结合至除CD3以外的蛋白质的呈单价或二价构型的仅重链可变区；以及
包含SEQ ID NO:54或55的序列的重链恒定结构域(CH)。
43.如权利要求42所述的双特异性三链抗体样分子，其中所述第三多肽亚基包含结合至BCMA的呈二价构型的仅重链可变区。
44.如权利要求43所述的双特异性三链抗体样分子，其包含：
第一多肽亚基，其包含SEQ ID NO:49的序列；
第二多肽亚基，其包含SEQ ID NO:56的序列；以及
第三多肽亚基，其包含SEQ ID NO:58的序列。
45.一种药物组合物，其包含如权利要求42至44中任一项所述的双特异性三链抗体样分子。
46.一种多核苷酸，其编码如权利要求42至44中任一项所述的双特异性三链抗体样分子。
47.一种载体，其包含如权利要求46所述的多核苷酸。
48.一种细胞，其包含如权利要求47所述的载体。
49.一种产生如权利要求42至44中任一项所述的双特异性三链抗体样分子的方法，其包括使如权利要求48所述的细胞在允许所述双特异性三链抗体样分子表达的条件下生长并从所述细胞分离所述双特异性三链抗体样分子。
50.一种治疗方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的如权利要求42至44中任一项所述的双特异性三链抗体样分子或如权利要求45所述的药物组合物。
51.如权利要求42至44中任一项所述的双特异性三链抗体样分子用于制备用来治疗有需要的个体的疾病或病症的药物的用途。
52.如权利要求42至44中任一项所述的双特异性三链抗体样分子或如权利要求45所述的药物组合物，其用于有需要的个体的疗法中。
53.一种治疗特征在于BCMA表达的疾病或疾患的方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的如权利要求42至44中任一项所述的双特异性三链抗体样分子或如权利要求45所述的药物组合物。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述疾病是自身免疫疾病。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述疾病是癌症。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述癌症是骨髓瘤。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述骨髓瘤是多发性骨髓瘤。
58.一种用于治疗有需要的个体的疾病或病症的药盒，其包含如权利要求42至44中任一项所述的双特异性三链抗体样分子或如权利要求45所述的药物组合物和使用说明书。
59.如权利要求58所述的药盒，其还包含至少一种其它试剂。
60.如权利要求59所述的药盒，其中所述至少一种其它试剂包含化学治疗药物。
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