SK288603B6 - Polypeptid a protilátka viažuca sa na polypeptid - Google Patents

Polypeptid a protilátka viažuca sa na polypeptid Download PDF

Info

Publication number
SK288603B6
SK288603B6 SK50017-2015A SK500172015A SK288603B6 SK 288603 B6 SK288603 B6 SK 288603B6 SK 500172015 A SK500172015 A SK 500172015A SK 288603 B6 SK288603 B6 SK 288603B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
baff
amino acid
polypeptide
cells
seq
Prior art date
Application number
SK50017-2015A
Other languages
English (en)
Other versions
SK500172015A3 (sk
Inventor
Fabienne Mackay
Jeffrey Browning
Christine Ambrose
Jurg Tschopp
Pascal Schneider
Jeffrey Thompson
Original Assignee
Biogen Ma Inc.
Topotarget Switzerland Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27386828&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK288603(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Ma Inc., Topotarget Switzerland Sa filed Critical Biogen Ma Inc.
Publication of SK500172015A3 publication Critical patent/SK500172015A3/sk
Publication of SK288603B6 publication Critical patent/SK288603B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Abstract

Receptor BCMA je identifikovaný ako receptor pre proteín BAFF. Na základe toho je navrhnuté medicínske použitie protilátok proti BCMA a extracelulárnej doméne BCMA a medicínske použitie polypeptidov obsahujúcich fragment receptora BCMA, prípadne variant fragmentu receptora BCMA.

Description

S K 288603 B6
Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka polypeptidu BAFF-R, receptora na BAFF (faktor aktivujúci B lymfocyty, patriaci do rodiny nádorového nekrotického faktora (TNF)) a činidiel blokujúcich tento receptor, na použitie na stimuláciu alebo inhibíciu expresie B lymfocytov a imunoglobulínov. Tento receptor má protinádorové imunoregulačné využitie a tiež využitie na liečenie imunosupresívnych ochorení, ako je napr. HIV. Okrem toho tento receptor a jeho blokujúce činidlá majú úlohu pri rozvoji hypertenzie príbuzných ochorení. Navyše bunky transfekované génom pre tento receptor sa môžu využiť na liečenie ochorení, ako sú nádory, lymlômy, autoimunitné ochorenia alebo dedičné choroby súvisiace s B lymfocytmi. Blokujúce činidlá, ako sú napr. rekombinantné varianty alebo protilátky špecifické na receptor, majú tiež využitie pri imunoregulácii. Použitie receptora pre BAFF ako stimulátora B lymfocytov pri liečení ochorení s potlačenou imunitou sa týka tiež použitia u pacientov, ktorí prekonali transplantáciu orgánov (napr. transplantáciu kostnej drene), tiež použitia na stimuláciu tvorby B lymfocytov u pacientov, ktorí sa zotavujú po liečení rakoviny. Tiež sa týka použitia receptora pre BAFF ako adjuvans a/alebo kostimulátora na zvýšenie alebo obnovu hladiny B lymfocytov na približne normálnu úroveň. Rozpustné lôrmy receptora pre BAFF, ktoré blokujú fúnkciu B lymfocytov, môžu byť tiež využité na inhibíciu ochorení, ktoré sú sprostredkované B lymfocytmi.
Doterajší stav techniky
Predkladaný vynález sa týka nového receptora z rodiny TNF, ktorý bol označený BAFF-R (alebo „BCMA“).
Rodina TNF sa skladá z párov ligandov a ich špecifických receptorov, ktoré bývajú označované ako ligandy rodiny TNF a receptory rodiny TNF (Bazzoni Beutler, 1996, Aggarwal Natarajan, 1996). Táto rodina sa podieľa na regulácii imunitného systému a možno iných „neimunologických“ systémov. Ide často o reguláciu typu „hlavného prepínača“, keď signalizácia typu TNF môže viesť k mnohým rôznym následným udalostiam, ktorých typickým príkladom je práve TNF. TNF môže napr. iniciovať všeobecnú obrannú zápalovú reakciu organizmu v reakcii na cudzorodú látku, ktorá zahŕňa pozmenenú prezentáciu adhéznych molekúl zúčastnených v „celí traffickmg“, produkciu chemokínov, ktoré smerujú špecifické bunky do špecifických kompartmentov a v špecifickom inštruovaní („priming“) rôznych efektorových buniek. Teda regulácia týchto metabolických dráh má iste klinický potenciál.
Predpokladá sa, že indukcia rôznych typov bunkových odpovedí sprostredkovaných cytokínmi z rodiny TNF je iniciovaná ich naviazaním na špecifické bunkové receptory. Boli identifikované prinajmenšom dva odlišné TNF receptory s veľkosťou približne 55 kDa (TNFR1) a 75 kDa (TNFR2) (Hohman et al., J. Biol. Chem 264: 14927-14934 (1989), Brockhaus et al., PNAS, 87: 3127-3131 (1990)). S génmi pre obidva receptory TNF je spojený významný polymorfizmus. Obidva TNFR majú typickú štruktúru receptorov na bunkovom povrchu, vrátene extracelulámej, transmembránovej a intracelulámej domény. Extraceluláma časť TNFR typu 1 aj 2 obsahuje repetitívny profil aminokyselinových sekvencií štyroch domén bohatých nacysteín (CDR). Podobný repetitívny profil CDR sa vyskytuje aj pri niekoľkých iných proteínoch na bunkovom povrchu, ako je napr. receptor nervového rastového faktora p75 alebo antigén CD-40 B lymfocytov.
TNF receptory sú významnými nástrojmi na objasnenie biologických metabolických dráh, lebo môžu byť ľahko upravené na imunoglobulínové fúzne proteíny. Tieto diméme rozpustné formy receptora sú dobré inhibítory udalostí sprostredkovaných secemovanými alebo povrchovo viazanými ligandmi. Tieto fúzne proteíny tým, že sa naviažu na Ugandy, zabránia ligandom v interakcii s receptormi asociovanými s bunkami, tým inhibujú nadväzujúcu signalizáciu. Tieto fúzne proteíny receptora-Ig sú užitočné nielen z experimentálneho hľadiska, ale sú úspešne využívané aj klinicky, tak napr. TNF-R-Ig sa úspešne používa na liečenie zápalového ochorenia čriev, reumatickej artritídy alebo akútneho klinického syndrómu, ktorý sprevádza podávanie OKT3 (Easton et al., 1996, Feldman et al., 1997, van Dullemen et al., 1995). Možno očakávať, že cielené ovplyvnenie mnohých udalostí, ktoré sú sprostredkované signalizáciou s účasťou receptorov TNF rodiny, sa bude môcť využiť na liečenie porúch imunity a tiež mnohých ochorení, ktoré majú patologické následky vďaka účasti imunitného systému. Taknapr. rozpustná forma v súčasnosti opísaného receptora osteoprotegerínu blokuje straty kostnej hmoty, takže je vidieť, že udalosti riadené signalizáciou zahŕňajúce receptory TNF rodiny sa neobmedzujú len na reguláciu imunitného systému. Protilátky na receptory môžu blokovať väzbu Ugandu, teda môžu mať klinické využitie. Takéto protilátky majú často veľmi dlhú životnosť a sú teda výhodnejšie ako rozpustné fúzne proteíny receptora-Ig, ktoré majú v krvi kratší polčas.
Aj keď inhibícia receptorom sprostredkovanej metabolickej dráhy predstavuje teraz najpoužívanejšiu terapeutickú aplikáciu receptorov, bola to pôvodne aktivácia TNF receptorov, ktorá sa javila ako klinicky sľubná (Aggarwal Natarajan, 1996). Aktivácia TNF receptorov môže iniciovať bunkovú smrť cieľových buniek, teda aplikácia pri nádoroch bola a stále je atraktívna (Eggermont et al., 1996). Receptor môže byť aktivovaný buď podaním Ugandu, t. j. využitím prirodzenej cesty, alebo podaním protilátok, ktoré sa naviažu
S K 288603 B6 (zosieťovaním) na receptor. Protilátky môžu byť výhodné napr. pri liečení rakoviny, lebo môžu prežívať v krvi dlhší čas na rozdiel od ligandov, ktoré majú v krvi spravidla kratšiu životnosť. Agonistické protilátky sú užitočné prípravky na liečenie rakoviny, lebo receptory môžu byť exprimované v nádoroch selektívnejšie alebo môžu signalizovať iba bunkovú smrť, alebo diferenciáciu nádorových buniek. Podobne mnohé pozitívne imunologické udalosti sú sprostredkované receptormi rodiny TNF, napr. zápalová reakcia hostiteľa, tvorba protilátok a pod., teda agonistické protilátky môžu byť užitočné aj v iných než onkologických aplikáciách.
Paradoxne aj inhibícia metabolickej/signálnej dráhy môže byť klinicky prospešná pri liečení nádorov. Tak napr. ligand Fas je exprimovaný v niektorých nádoroch, táto expresia vedie k odumretiu Fas-pozitívnych lymfocytov, čo umožňuje, že nádor sa vyhne imunitnému systému. Vtakomto prípade by inhibícia systému Fas dovolila, aby imunitný systémreagoval na nádor iným spôsobom(Geen Ware, 1997).
Podstata vynálezu
Pôvodcovia identifikovali kloň cDNA kódujúci polypeptid, označovaný v predkladanej prihláške „BAFF -R“ alebo „BCMA“, ktorý viaže nádorový nekrotický faktor BAFF, čo je faktor patriaci do rodiny TNF aktivujúci B lymfocyty. BAFF je molekula zhodná s molekulou už skôr opísanou v dokumente WO/9912964, ktorý je celý zahrnutý formou odkazu.
V jednom uskutočnení vynález poskytuje spôsoby použitia BAFF-R. Sempatria spôsoby na inhibíciu rastu B lymfocytov, rastu a zrenia B lymfocytov indukovaných dendritickými bunkami alebo produkcie imunoglobulínov vo zvierati pomocou BAFF-R polypeptidu. Ďalej sú zahrnuté spôsoby stimulácie rastu B lymfocytov, rastu a zrenia B lymfocytov indukovaných dendritickými bunkami alebo produkcie imunoglobulínov vo zvierati pomocou BAFF-R polypeptidu, alebo kostimulácie rastu B lymfocytov, rastu a zrenia B lymfocytov indukovaných dendritickými bunkami, alebo produkcie imunoglobulínov vo zvierati pomocou BAFF-R polypeptidu a anti-T protilátky, CD40 ligandu alebo anti-CD40 Ugandu.
V inom uskutočnení vynález poskytuje BAFF-R na použitie na liečenie autoimunitných ochorení, hypertenzie, kardiovaskulárnych ochorení, renálnych porúch, lymfoproliferatívnych ochorení B lymfocytov, imunosupresívnych ochorení, orgánových transplantácií a HIV. Vynález sa tiež týka použitia činidiel na Uečenie, potlačenie alebo zmenu imunitnej reakcie, ktorá zahŕňa signálnu dráhu medzi BAFF-R a jeho ligandom, spôsoby inhibície zápalu podávaním protilátok špecifických na BAFF-R alebo jeho epitop.
Pri Uečebnom využití vynálezu sa podáva terapeuticky účinné množstvo polypeptidu BAFF-R, chimérické molekuly obsahujúce polypeptid BAFF-R fúzovaný s heterológnou aminokyselinovou sekvenciou alebo homológ protilátky anti-BAFF-R.
Iné uskutočnenie vynálezu sa týka farmaceutických kompozícií, ktoré obsahujú polypeptid BAFF-R a farmaceutický prijateľné vehikulum
Ďalšie uskutočnenie vynálezu poskytuje chimérickú molekulu, ktorá obsahuje polypeptid BAFF-R fúzovaný s heterológnym polypeptidom alebo aminokyselinovou sekvenciou. Príkladom takejto chimérickéj molekuly je molekula obsahujúca BAFF-R fúzovaný s úsekom Fc imunoglobulínu alebo so značiacou sekvenciou epitopu (an epitope tag sequence).
Ešte ďalšie uskutočnenie vynálezu poskytuje protilátku, ktorá sa špecificky viaže na polypeptid BAFF-R. Táto protilátka je pripadne monoklonálna protilátka.
Definície
Termíny „BAFF-R“ a „BCMA“ používané v opise zahŕňajú natívne sekvencie BAFF-R a varianty BAFF-R (ktoré budú ďalej definované). BAFF-R je možné izolovať z rôznych zdrojov, ako napr. z rôznych typov myších alebo humánnych tkanív alebo z ďalších zdrojov, alebo môže byť pripravený rekombinantnými metódami alebo synteticky.
Termín jiatívna sekvencia BAFF-R“ označuje polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu ako BAFF-R pochádzajúcu z prírody. Takáto natívna sekvencia BAFF-R môže byť získaná izoláciou z prírody alebo môže byť pripravená rekombinantnými metódami alebo synteticky. Patria sem tiež prirodzene sa vyskytujúce skrátené alebo secemované formy BAFF-R (napr. rozpustné formy obsahujúce napr. sekvencie extracelulárnej domény), prirodzene sa vyskytujúce varianty (napr. alternatívne zostrihnuté formy) a prirodzene sa vyskytujúce alelické varianty BAFF-R. V jednom uskutočnení vynálezu je natívna sekvencia BAFF-R zrelá alebo úplná natívna sekvencia polypeptidu BAFF-R obsahujúca aminokyseliny 1 až 184 zo sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo fragment tejto sekvencie.
Termín „extraceluláma doména BAFF-R“ alebo skrátene „BAFF-R BCD“ označuje formu BAFF-R, ktorá je v podstate bez trans membránovej a cytoplazmatickej domény BAFF-R. Obvykle, extraceluláma doména BAFF-R obsahuje menej než 1 % týchto transmembránových a cytoplazmatických domén, výhodne obsahuje menej než 0,5 % týchto domén. Prípadne BAFF-R ECD obsahuje aminokyselinové zvyšky 8 až 41 zo sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo aminokyselinové zvyšky 4 až 51 zo sekvencie SEQ ID NO: 1, alebo aminokyse3
S K 288603 B6 linové zvyšky 1 až 53 zo sekvencie SEQ ID NO: 1. Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu BAFF-R ECD obsahuje aminokyselinové zvyšky 1 až 51 zo sekvencie SEQ ID NO: 1. V ďalšom výhodnom uskutočnení BAFF-R ECD obsahuje aminokyselinové zvyšky 1 až 50 zo sekvencie SEQ ID NO: 1. Odborníkovi je zrejmé, že transmembránová doména polypeptidu BAFF-R podľa vynálezu je identifikovaná na základe kritérií rutinne používaných v odbore na identifikáciu tohto typu hydrofóbnej domény. Presné hranice transmembránovej domény môžu byť rôzne, ale s veľkou pravdepodobnosťou sa nelíšia o viac ako 5 aminokyselín na každom konci domény, ktoré sú špecificky uvedené. Takže BAFF-R ECD prípadne obsahuje aminokyseliny 8-41 (sekvencia SEQ ID NO: 1).
Termín „variant BAFF-R“ označuje aktívny BAFF-R, ako je definovaný ďalej, ktorý má aspoň 80 % aminokyselinovú sekvenčnú identitu s dedukovanou aminokyselinovou sekvenciou BAFF-R, ktorá je uvedená ako sekvencia SEQ IDNO: 1 pre úplnú natívnu sekvenciu BAFF-R alebo sekvenciu BAFF-R ECD. K variantom BAFF-R patria napr. polypeptidy BAFF-R, kde je pridaných alebo odstránených jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov na N-konci alebo C-konci sekvencie SEQ ID NO: 1. Obvykle má variant BAFF-R aspoň 80 % alebo 85 % aminokyselinovú sekvenčnú identitu, výhodnejšie aspoň 90 % aminokyselinovú sekvenčnú identitu a najvýhodnejšie aspoň 95 % aminokyselinovú sekvenčnú identitu s aminokyselinovou sekvenciou SEQ IDNO: 1.
„Percentá (%) aminokyselinovej sekvenčnej identity“ vzhľadom na opísané sekvencie BAFF-R sú definované ako percentá aminokyselinových zvyškov v kandidátnej sekvencii, ktoré sú identické s aminokyselinovými zvyškami v sekvencii BAFF-R po porovnaní sekvencii („aligning“) a prípadnom vložení medzier, pokiaľ je to nevyhnutné na dosiahnutie maximálneho percenta sekvenčnej identity, pričom konzervatívne substitúcie sa nepovažujú za súčasť sekvenčnej identity. Porovnanie sekvencii na účely stanovenia percenta aminokyselinovej sekvenčnej identity je možné uskutočniť rôznymi spôsobmi, ktoré sú odb omíkom známe, napr. použitím verejne dostupných počítačových programov, ako je BLAST, AITGN alebo Megalign (DNASTAR) Software. Odborník je schopný určiť vhodné parametre na vyhodnotenie porovnaní sekvencii a vhodný algoritmus na dosiahnutie najlepšieho porovnania celkovej dĺžky porovnávaných sekvencii.
Termín „označený epitop“ („epitope tagged“) je používaný v opise chimérického polypeptidu obsahujúceho BAFF-R alebo sekvencia jeho domén, fúzovaný so „značkovacím polypeptidom“ („tag polypeptide“). Značkovací polypeptid („tag polypeptide“) je polypeptid obsahujúci dostatok aminokyselín na to, aby poskytol epitop, proti ktorému môže byť pripravená protilátka, alebo ktorý je možné identifikovať iným činidlom, pričom je dostatočne krátky, aby nenarušoval aktivitu BAFF-R. Značkovací polypeptid musí byť tiež dostatočne unikátny, aby protilátka v podstate nemohla skrížené reagovať s inými epitopmi. Vhodný značkovací polypeptid všeobecne obsahuje aspoň 6 aminokyselinových zvyškov, obvykle 8 až 50 aminokyselinových zvyškov (výhodnepribližne 10 až 20 aminokyselinových zvyškov).
Termín „izolovaný“, pokiaľ ide o opísané polypeptidy, označuje polypeptid, ktofy bol identifikovaný a separovaný a/alebo izolovaný zo svojho prirodzeného prostredia. Kontaminujúce zložky v jeho prirodzenom prostredí sú také materiály, ktoré by rušili diagnostické alebo terapeutické využitie polypeptidu a zahŕňajú enzýmy, hormóny a ďalšie proteínové alebo neproteínové rozpustené látky. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je polypeptid purifikovaný (1) do stupňa postačujúceho na získanie aspoň 15 zvyškov N-konca alebo internej aminokyselinovej sekvencie pomocou rotačného sekvenčného zariadenia („spinning cup sequenator“) alebo (2) do homogenity použitím SDS-PAGE za redukujúcich alebo neredukujúcich podmienok a pomocou farbenia Coomassic modrou alebo výhodne striebrom K izolovaným polypeptidom patria polypeptidy in situ v rekombinantných bunkách, kde je neprítomná aspoň jedna zložka prirodzeného prostredia BAFF -R. Obvykle je vš ak izolovaný polypeptid pripravený aspoň jedným purifikačným krokom
Termín „protilátka“ sa v predkladanom opise používa v najširšom zmysle a špecificky zahŕňa jednoduché BAFF-R monoklonálne protilátky (vrátane agonistických, antagonistických a neutralizačných protilátok) a anti-BAFF-R protilátkové prípravky s polyepitopickou špecifickou. Termín „rnonoklonálna protilátka“ označuje protilátky získané z populácie v podstate homogénnych protilátok, t. j. individuálne protilátky tvoriace populáciu sú identické, s výnimkou možných prirodzene sa vyskytujúcich mutácií, ktoré môžu byť prítomné vo veľmi malom počte.
Termín „purifikovaný preparát alebo „v podstate čistý preparát polypeptidu označuje polypeptid, ktorý bol separovaný od iných proteínov, lipidov a nukleových kyselín, s ktorými sa prirodzene vyskytuje. Výhodne je polypeptid tiež separovaný od ostatných substancií, ako sú napr. protilátky, nosiče a pod., ktoré boli použité na purifikáciu.
Termíny „liečenie“, „ošetrovanie“ a „terapia“ sa používajú v zmysle liečebného, profylaktického a preventívneho pôsobenia.
Termíny „peptidy“, „proteíny“ a „polypeptidy“ sú v opise používané celkom zameniteľné.
Termín „biologicky aktívny“ znamená v prípade proteínu, že má in vivo alebo in vitro aktivitu, ktorá pôsobí priamo alebo nepriamo. Biologicky aktívne fragmenty majú napr. 70 % aminokyselinovú homológiu s aktívnym miestom receptora, výhodnejšie aspoň 80 % a najvýhodnejšie aspoň 90 % homológiu. Identita alebo homológia vzhľadom na receptor je definovaná ako percento aminokyselinových zvyškov v kandidát4
S K 288603 B6 nej sekvencii, ktoré sú identické so zvyškami BAFF-R v sekvencii SEQ ID NO: 1, alebo ktoré sú identické s aminokyselinovými zvyškami definovanej častisekvencie SEQ ID NO: 1.
Termín „cicavec“ označuje akékoľvek zviera klasifikované ako cicavec, ako je napr. krava, kôň, pes, myš a mačka, vrátane človeka. Vo výhodnomuskutočnení vynálezu je cicavec človek.
Pri realizácii predkladaného vynálezu sa využívajú, pokiaľ nie je výslovne uvedené inak, štandardné postupy bunkovej biológie, bunkových kultúr, molekulárnej biológie, transgénnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA a imunológie, ktoré sú odborníkom známe. Tieto metódy sú dostatočne opísané v odbornej literatúre.
Ďalej sa opis týka výhodných uskutočnení vynálezu, vynálezu BAFF-R a molekúl príbuzných BAFF-R na použitie na ovplyvnenie rastu a zrenia B lymfocytov a sekrécie imunoglobulínu. Vynález sa ďalej týka BAFF-R a molekúl príbuzných BAFF-R na použitie na ovplyvnenie reakcie imunitného systému, čo je nutné pri ochoreniach súvisiacich s imunitným systémom. Naviac sa vynález týka liečenia rakoviny a porúch imunity, keď s a pri génovej terapii používa gén BAFF-R alebo gén príbuzný BAFF-R.
BAFF-R a jeho homológy produkované hostiteľom transformovaným sekvenciou podľa vynálezu a tiež natívny BAFF-R purifikovaný odborníkovi známym spôsobom alebo pripravený zo známej aminokyselinovej sekvencie sú užitočné pri mnohých aplikáciách, ako sú napr. protirakovinové, protinádorové a imunoregulačné aplikácie. Sú užitočné tiež pri liečení ďalších ochorení.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka použitia polypeptidu kódovaného izolovanou nukleovou kyselinou kódujúcou BAFF-R pri „antisense“ terapii. Termín „antisense“ terapia označuje podávanie alebo in situ vytváranie oligonukleotidov alebo ich derivátov, ktoré špecificky hybridizujú v bunkových podmienkach s bunkovou mRNA a/alebo DNA kódujúcou požadovaný ligand, takže inhibujú expres iu kódovaného proternu tým, že inhibujú jeho transkripciu a/alebo transláciu. Väzba sa môže uskutočniť na základe konvenčnej komplementarity báz alebo napr. v prípade väzby na dvojzávitnici DNA prostredníctvom špecifických interakcií v hlavnom záreze dvojzávitnice. Všeobecne sa „antisense“ terapia týka celého radu rôznych metód v odbore používaných a v podstate zahŕňa celú terapiu založenú na špecifickej väzbe na oligonukleotidové sekvencie.
Antisense konštrukt podľa predkladaného vynálezu môže byť podávaný vo forme expresného plazmidu, ktorý pri transkripcii v bunke produkuje RNA, ktorá je komplementárna aspoň s časťou bunkovej mRNA kódujúcej BAFF-ligand. Alternatívne, antisense konštrukt je oligonukleotidová sonda pripravená exvivo. Takéto oligonukleotidové sondy sú výhodne modifikované na oligonukleotidy, ktoré sú rezistentné na endogénne nukleázy a sú teda stabilné in vivo. Príklady molekúl nukleovej kyseliny na použitie ako antisense oligonukleotidy sú fosforamidátové, fosfotioátové a metylfosfonátové analógy DNA (pozrinapr. patentové dokumenty USA č. 5,176,996; 5,264,564 a 5,256,775). Navyše všeobecné princípy konštrukcie oligomérov užitočných na antisense terapiu boli prehľadne opísané napr. v publikáciách Van Der Krol et al., (1988) Biotechniques 6: 958-976; Stein et al. (1988) Cancer Res 48: 2659-2668, ktoré sú zahrnuté formou odkazu.
BAFF-R podľa predkladaného vynálezu je, ako už bolo uvedené, člen rodiny receptorov TNF. Tento proteín, jeho fragmenty alebo homológy majú široké terapeutické a diagnostické aplikácie.
Polypeptidy podľa vynálezu špecificky interagujú s BAFF, polypeptidom skôr opísaným v patentovej prihláške WO99/12964, ktorá je zahrnutá formou odkazu. Opísané peptidy a spôsoby umožňujú identifikovať molekuly, ktoré špecificky interagujú s BAFF-R alebo jeho fragmentom.
Niektoré uskutočnenia predkladaného vynálezu sa týkajú použitia peptidov odvodených z BAFF-R, ktoré majú schopnosť viazať sa na BAFF. Fragmenty BAFF-R môžu byť pripravené rôznymi spôsobmi, napr. rekombinantnou technikou, využitím PCR, proteolytickým štiepením alebo chemickou syntézou. Interné alebo terminálne fragmenty polypeptidu môžu byť pripravené odstránením jedného alebo viac nukleotidov z jedného alebo oboch koncov nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptid. Expresia takto mutovanej DNA poskytuje polypeptidové fragmenty.
Chimérické molekuly podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené metódami, ktoré sú odborníkom známe. Podľa vynálezu sa zamýšľa použitie chimérických molekúl obsahujúcich BAFF-R polypeptid (alebo jeho variant) fúzovaný s heterológnou aminokyselinovou sekvenciou, ako je napr. IgG Fc doména imunoglobulínu. Výhodne sú také chimérické molekuly rozpustné a obsahujú rozpustný polypeptid BAFF-R. Vo výhodnom uskutočnení chimerická molekula obsahuje aminokyselinové zvyšky 1 až 50 zo sekvencie SEQ ID NO: 1 fúzovanej s doménou Fc.
Polypeptidové fragmenty môžu byť tiež pripravené chemickou syntézou použitím postupov, ktoré sú odborníkom známe, ako je napr. obvyklá Merrifieldova metóda chemickej syntézy na pevnej fáze používajúca f-moc alebo t-boc. Tak napr. peptidy a DNA sekvencie môžu byť ľubovoľne rozdelené na fragmenty požadovanej dĺžky bez prekrývania alebo na prekrývajúce sa fragmenty požadovanej dĺžky. Tieto metódy budú podrobnejšie opísané.
S K 288603 B6
Príprava rozpustných foriem BAFF-R
Rozpustné formy BAFF-R sú často signálne účinné a teda môžu byť podávané ako liečivá, ktoré napodobňujú prírodné membránové formy. Je možné, že BAFF-R podľa vynálezu sú v prírode secemované ako rozpustné cytokíny, ale v prípade, že nie, je možné podporiť sekréciu tým, že sa gén upraví metódami génového inžinierstva. Na vytvorenie rozpustnej secemovanej formy BAFF-R by sa odstránili na úrovni DNA N-koncové transmembránové úseky a nejaká časť tzv. stonkového úseku a nahradili by sa vedúcou sekvenciou („Icadcr“) typu I, alternatívne typu U, ktorá by umožnila účinné proteolytické štiepenie vo zvolenom expresnom systéme. Odborník môže meniť rozsah ponechanej stonkovej oblasti v konštrukte na sekréciu, aby sa optimalizovali tak väzbové vlastnosti Ugandu, ako aj účinnosť sekrécie. Tak napr. konštrukty obsahujúce všetky možné dĺžky stonky, t. j. sekvencie skrátenej na N-konci, sa môžu pripraviť tak, že vzniknú proteíny, ktoré začínajú aminokyselinou 1 až 51. Výsledkom takejto analýzy je potom stanovanie optimálnej dĺžky stonkového úseku.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu rozpustný BAFF-R polypeptid je izolovaná natívna sekvencia BAFF-R polypeptidu obsahujúca aminokyselinové zvyšky 1 až 51 zo sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo fragment tejto sekvencie; izolovaný BAFF-R polypeptid majúci aspoň 80 % (a výhodnejšie 90 %) aminokyselinovú sekvenčnú identitu s natívnou sekvenciou BAFF-R polypeptidu obsahujúcu aminokyselinové zvyšky 1 až 51 zo sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo fragment tejto sekvencie, izolovaný BAFF-R polypeptid obsahujúci aminokyselinové zvyšky 8 až 41 zo sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo fragment tejto sekvencie a izolovaná natívna sekvencia polypeptidu BAFF-R obsahujúca aminokyselinové zvyšky 1 až 50 zo sekvencie SEQ ID NO: 1 a/alebo fragment tejto sekvencie.
Príprava protilátok reaktívnych s BAFF-R
Predkladaný vynález sa týka protilátok, ktoré špecificky reagujú s BAFF-R alebo jeho koreceptormi. Anti-proteín/antipeptidové antisérum alebo monoklonálne protilátky sa pripravujú štandardnými postupmi (pozri napr. Antibodies: Laboratory Manual ed. By Harlow and Lane (Cold Spring HarborPress: 1988)). Cicavce, ako napr. myš, škrečok alebo králik sa imunizujú imunogénnou formou peptidu. K postupom, ktorým sa proteínu alebo peptidu udelí imunogenicita, patrí konjugácia s nosičom a ďalšie metódy, ktoré sú odborníkom známe.
Imunogénna časť BAFF-R alebo jeho koreceptorov sa podáva spoločne s adjuvans. Postup imunizácie je možné monitorovať meraním titra protilátok v plazme alebo v s ére. Na stanovenie hladiny protilátok je možné využiť štandardný postup ELISA alebo iný formát imunotestu s imunogénom ako antigénom
Protilátky vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú protilátky imunošpecifické na antigénne determinanty BAFF-R alebo jeho koreceptory, napr. antigénne determinanty polypeptidu sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo blízko príbuzné homológu humánneho alebo nehumánneho cicavčieho pôvodu (napr. so 70, 80 alebo 90 % homológiou, výhodnejšie aspoň s 95 % homológiou.). V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu protilátky anti-BAFF-R alebo anti-BAFF-koreceptora v podstate skrížené nereagujú (t. j. reagujú len špecificky) s proteínom, ktorý je menej ako na 80 % homologický so sekvenciou SEQ ID NO: 1; výhodne menej ako z 90 % homologický so sekvenciou SEQ ID NO: 1; a najvýhodnejšie menej ako z 95 % homologický so sekvenciou SEQ ID NO: L Výrazom „v podstate skrížené nereagujú“ sa myslí to, že protilátka má väzbovú afinitu na nehomologický proteín, ktorá predstavuje menej ako 10 %, výhodnejšie menej ako 5 % a ešte výhodnejšie menej ako 1 % väzbovej afinity na proteín sekvencie SEQ ID NO: L
Termín „protilátka“, ako je používaný v predkladanom vynáleze, zahŕňa také protilátkové fragmenty, ktoré špecificky reagujú s BAFF-R alebo jeho koreceptormi. Protilátky je možné fŕagmentovať konvenčnými metódami, ktoré sú odborníkom známe a potom testovať užitočnosť fragmentov rovnakým spôsobom, ktorý bol opísaný pre celé protilátky. Tak napr. fragmenty F(ab')2 sa pripravujú pôsobením pepsínu na protilátku. Vzniknuté fragmenty F(ab')2 môžu byť ešte ošetrené tak, že sa redukujú disulfidické mostíky a vzniknú fragmenty Fab'. K protilátkam podľa vynálezu patria tiež biošpecifické a chimérické molekuly majúce aktivitu anti-BAFF-R alebo anti-BAFF-koreceptora. Tak monoklonálna, ako aj polyklonálne protilátky (Ab) namierené proti BAFF-R a jeho koreceptorom a tiež protilátkové fragmenty, ako je napr. Fab'a F(ab')2, môžu byť použité na blokovanie pôsobenia BAFF-R a jeho prípadných koreceptorov.
Rôzne lôrrny protilátok môžu byť pripravené použitím štandardných techník rekombinantnej DNA (Winter and Milstein, Náture 349: 293-299 (1991), vložené formou odkazu). Tak napr. sa môžu skonštruovať chimérické protilátky, kde doména viažuca antigén zo zvieracej protilátky je spojená s humánnou konštantnou doménou (pozri napr. Cabilly et al., Patent U.S. 4,816,567, vložené formou odkazu). Chimérické protilátky môžu redukovať pozorovanú imunogénnu reakciu vyvolanú normálnymi zvieracími protilátkami pri klinickom použití u ľudí.
Navyše môžu byť synteticky pripravené rekombinantné „humanizované protilátky“, ktoré rozpoznávajú BAFF-R alebo jeho koreceptory. Humanizované protilátky sú chiméry, ktoré obsahujú väčšinu sekvencií humánneho IgG, do ktorých boli vložené úseky zodpovedné za špecifickú väzbu antigénu. Požadovaným antigénom sa imunizujú zvieratá, izolujú sa z nich zodpovedajúce protilátky a odstránia sa časti sekvencií va6
S K 288603 B6 riabilných úsekov zodpovedné za špecifickú väzbu antigénu. Úseky viažuce antigén pochádzajúce zo zvieraťa sa potom klonujú do zodpovedajúceho miesta génov pre humánnu protilátku, z ktoiých boli úseky pre väzbu antigénu odstránené. Humanizované protilátky minimalizujú použitie heterológnych (medzidruhových) sekvencií v humánnych protilátkach a teda je menšia pravdepodobnosť, že vyvolajú imunitnú reakciu u liečeného pacienta.
Konštrukciou rôznych tried rekombinantných protilátok je možné tiež uskutočniť prípravu chimérických alebo humanizovaných protilátok obsahujúcich variabilné domény a humánne konštantné domény (CH1, CH2, CH3) izolované z rôznych tried imunoglobulínov. Tak napr. protilátky so zvýšenou valenciou väzbových miest pre antigén môžu byť rekombinantne pripravené klonovaním väzobných miest pre antigén do vektora nesúceho úseky humánnych konštantných reťazcov (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177: 1439-1450 (1993), zahrnuté formou odkazu).
Navyše sa môžu na zmenu väzbovej afinity rekombinantných protilátok s ich antigénmi použiť štandardné techniky rekombinantnej DNA, ktorými sa zmenia aminokyselinové zvyšky v blízkom okolí miest viažucich antigén. Väzbová afinita humanizovaných protilátok na antigén môže byť zvýšená mutagenézou založenou na molekulovom modelovaní (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 10029-33 (1989), zahrnuté formou odkazu).
Príprava analógov: Príprava zmenených sekvencií DNA apeptidov
Analógy BAFF-R sa môžu líšiť od prirodzene sa vyskytujúceho BAFF-R v aminokyselinovej sekvencií alebo spôsobom, ktorý sa netýka sekvencie alebo oboma spôsobmi. K iným než sekvenčným (nesekvenčným) modifikáciám patrí in vivo alebo in vitro chemická derivatizácia BAFF-R. K nesekvenčným modifikáciám teda patria, bez toho, aby bol zoznam obmedzujúci, zmeny v acetylácii, metylácii, fosforylácii, karboxylácii alebo glykozylácii.
K výhodným analógom patrí BAFF-R a jeho biologicky aktívne fragmenty, ktorých sekvencie sa líšia od sekvencie uvedenej ako sekvencia SEQ ID NO: 1 jednou alebo viacerými konzervatívnymi aminokyselinovými substitúciami alebo jednou a viac nekonzervatívnymi aminokyselinovými substitúciami, deléciami alebo inzerciami, ktoré nerušia aktivitu BAFF-ligandu. Ku konzervatívnym substitúciám typicky patria substitúcie jednej aminokyseliny inou aminokyselinou, ktorá má podobné vlastnosti, napr. substitúcia v rámci nasledujúcich skupín aminokyselín: valín - glycín; glycín - alanín; valín - izoleucín - leucín; kyselina asparágová - kyselina glutámová; asparagín - glutamín; serín - treonín; lyzín - arginín a fenylalanín - tyrozín.
Využitie vynálezu
Úplný gén BAFF-R (sekvencia SEQ ID NO: 2) alebo jeho časť môžu byť použité ako hybridizačné sondy pre cDNA knižnice, napr. na izoláciu ďalších génov, ktoré majú požadovanú sekvenčnú identitu so sekvenciou BAFF-R opísanou ako sekvencia SEQ ID NO: 2. Nukleotidové sekvencie kódujúce BAFF-R môžu byť tiež použité na konštrukciu hybridizačných sond na mapovanie génov, ktoré kódujú BAFF-R a na genetické analýzy jedincov s genetickými poruchami.
Je možné navrhnúť testy na skríning zlúčenín, ktoré napodobňujú biologickú aktivitu BAFF -R. K takýmto skríningovým metódam patria testy, ktoré umožňujú vysokokapacitný skríning chemických knižníc a sú teda zvlášť výhodné na identifikáciu malých molekúl ako kandidátnych liečiv. K uvažovaným malým molekulám patria syntetické organické alebo anorganické zlúčeniny. Nukleové kyseliny kódujúce BAFF-R alebo jeho modifikované formy samôžu tiež použiť na prípravu transgénnych zvierat alebo zvierat s vyradenou fúnkciou daného génu („knock out“), ktoré sú zase užitočné pri skríningu a vývoji terapeuticky užitočných agensov.
Jedno uskutočnenie vynálezu sa týka stimulácie rastu B lymfocytov, rastu a zrenia Blymfocytov indukovaných dendritickými bunkami alebo produkcie imunoglobulínu pri zvieratách použitím polypeptidu BAFFR alebo kostimulácie rastu B lymfocytov, rastu a zrenia B lymfocytov indukovaných dendritickými bunkami alebo produkcie imunoglobulínu pri zvieratách použitím polypeptidu BAFF-R a anti-T protilátky, CD-40 Ugandu alebo anti-CD40 Ugandu. Tiež sú zahrnuté spôsoby inhibície rastu B lymfocytov, rastu a zrenia B lymfocytov indukovaných dendritickými bunkami alebo produkcie imunoglobulínu pri zvieratách použitím polypeptidu BAFF-R.
V inom uskutočnení sa vynález týka BAFF-R na použitie na liečenie autoimunitných porúch, hypertenzie, kardiovaskulárnych ochorení, ochorení obličiek, lymfoproUferatívnych ochorení B lymfocytov, imunosupresívnych ochorení, transplantáciu orgánov, zápalových ochorení a tiež HIV. Patrí sem aj použitie ako činidla na liečenie, potlačenie alebo zmenu imunitnej reakcie, na ktorej sa podieľa signálna dráha medzi BAFF-R a jeho ligandom.
V inom uskutočnení vynález poskytuje farmaceutický prípravok obsahujúci polypeptid BAFF -R a farmaceutický prijateľné vehikulá. K vhodným nosičom pre polypeptid BAFF-R a jeho prípravky patria napr. vehikulá opísané v publikácii Remington's Pharmaceutical Sciences (16th ed., 1980, Mack Publishing Co., edited by Oslo et al.). Typicky sa používa vhodné množstvo farmaceutický prijateľnej soli, aby bol prípravok izotonický. K príkladom vhodných nosičov patria pufŕe ako roztoky soli, Ringerov roztok a roztok dextrózy.
S K 288603 B6 pH roztoku je výhodne 5 až 8, výhodnejšie 7,4 až 7,8. K ďalším výhodným nosičom patria prostriedky na predlžené/riadené uvoľňovanie liečiva, ako je semipermeabilný matrix z pevných hydrofóbnych polymérov, ktorý je vo forme tvarovaných častíc napr. lipozómov, filmov alebo mikročastíc. Odborníkovi je zrejmé, že niektoré nosiče môžu byť výhodnejšie v závislosti od určitého spôsobu podávania koncentrácie podávaného polypeptidu BAFF-R.
Podávanie prípravkov podľa vynálezu sa uskutočňuje napr. injekciou (napr. intravenóznou, intraperitoneálnou, subkutánnou, intramuskulámou) alebo inými spôsobmi, ako je napr. infúzia, ktorá zaistí podanie v účinnej forme do krvného obehu.
Pri realizácii predkladaného vynálezu boli použité, pokiaľ nie je výslovne uvedené inak, štandardné postupy bunkovej biológie, bunkových kultúr, molekulárnej biológie, transgénnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA a imunológie, ktoré sú odborníkom známe. Tieto metódy sú dostatočne opísané v odbornej literatúre, pozri napr. Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (d. N. Glover, ed), 1985; Oligonukleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent No. 4,983, 195 (Mullis et al.,); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S. J. Higgins. Eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, edj.Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P.Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; hnmunochemical Methods in Celí and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment hnmunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating MouseEmbryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 ukazuje sekvenciu nukleovej kyseliny (sekvencia SEQ ID NO: 2) cDNA humánneho BAFF-R (BCMA) a z nej odvodenú aminokyselinovú sekvenciu (sekvencia SEQ ID NO: 1). Potenciálny začiatok translácie je buď nukleotid 219, alebo 228; doména bohatá na cysteín (CDR) zahŕňa nukleotidy 240 až 341 zo sekvencie SEQ ID NO: 2 (aminokyselinové zvyšky 8-41 sekvencie SEQ ID NO: 1) ; a potenciálny transmembránový úsek predstavujú nukleotidy 375 až 459 sekvencie SEQ ID NO: 2.
Obrázok 2 ukazuje sekvenciu nukleovej kyseliny (sekvencia SEQ ID NO: 4) a z nej odvodenú aminokyselinovú sekvenciu (sekvencia SEQ ID NO: 3) plazmidu pJST538, plazmid kódujúci BAFF-R-Fc: nukleotidy 1-69, myšiu IgG-kappa signálnu sekvenciu; nukleotidy 70-222, BAFF-R (nukleotidy 1 až 153); nukleotidy 223 až 906, humánny IgG
Obrázok 3 ukazuje sekvenciu nukleovej kyseliny plazmidu pJST535, kódujúceho úplný humánny BAFF-R a jeho odvodenú aminoky s elinovú sekvenciu.
Obrázok 4 ukazuje štruktúrne porovnanie medzi TNF-R55 a BAFF-R.
Obrázok 5 ukazuje bunky 293EBNA transfekované buď (a) CH269 (1,0 pg), alebo (b) pJST535 (0,1 pg), plazmidom exprimujúcim úplný BAFF-R a zafarbené 0,5 pg/ml flag-hBAFF v teste na mikrodoštičke.
Obrázok 6(a) ukazuje pokrytie buniek293EBNA transfekovanýchpJST535 s FACS a zafarbených nasledovne: bez Ugandu (čierny histogram), 1 pg/ml flag-hCD40L (ružový) alebo flag-hBAFF (zelený). Všetky vzorky sa potomzafarbili pomocou anti-flag M2nasledovanéoslímanti-myšímIgG, ako je opísané v príklade 2.
Obrázok 6(b) ukazuje FACS histogramy so štatistickými dátami z rovnakého experimentu. Farbenie bolo nasledujúce: (1) nezafarbené, (2) len 7AAD, (3) druhý krok a len 7AAD, (4) 9 pg/ml flag-hBAFF, (5) 3 pg/ml flag-hBAFF, (6) 1 pgml flag-hBAFF, (7) 0,33 pg/ml flag-hBAFF, (8) 0,11 pg/ml flag-hBAFF, (9) flag-hCD40L 1 pg/ml.
Obrázok 7 ukazuje imunoprecipitácie BAFF-R-Fc, ako je opísané v príklade 4. Štandardy molekulových hmotností v kDa sú uvedené na obrázku vľavo. Dráha (1) 12,5 ng flag-hTWEAK, (2) 12,5 ng flag-hBAFF, (3) imunoprecipitácia flag-hBAFF s 0,5 ml BAFF-R-Fc upraveného média, (4) imunoprecipitácia flaghTWEAK s 0,5 ml BAFF-R-Fc upraveného média, (5) imunoprecipitácia bez Ugandu s 0,5 ml BAFF-R-Fc upraveného média, (6) imunoprecipitácia flag-hBAFF s 0,5 ml upraveného média z netransfekovaných 293EBNA, (7) imunoprecipitácia flag-hTWEAK s 0,5 ml upraveného média z netransfekovaných 293EBNA.
Obrázok 8 ukazuje vynesenie výsledkov z proliferačného testu splenocytov, kde sú impulzy za minútu (CPM) inkorporované do myších splenocytov vynesené oproti množstvu pridaného humánneho BAFF (pg/ml).
Obrázok 9 ukazuje vynesenie výsledkov BAFF blokovacieho testu, ktorým bola analyzovaná väzba BAFF na bunky Raji, kde sú vynesené hodnoty MFI (priemerná intenzita fluorescencie) oproti množstvu R:hIgGl (ng/ml).
S K 288603 B6
Obrázok 10(a) sa týka podávania BCMA-Ig, ktoré redukuje celkovú populáciu B lymfocytov CDlhl/IgMhl v slezine BAEF- transgénnych myší. Obrázok ukazuje vynesenie expresie IgM proti CD1 vo FACS analýze pre Baff Tg myši, ktoré dostali injekciu h- Ig (stredný panel) alebo hBCMA-Ig (spodný panel) a pre kontrolné myši divého typu, ktoré dostali injekciu PBS (homýpanel), ako je opísané v príklade 11.
Obrázok 10(b) sa týka podávania BCMA-Ig, ktoré redukuje celkovú populáciu zrelých B lymfocytov a T2 B lymfocytov v slezine BAFF-transgénnych nyší. Obrázok ukazuje vynesenie expresie CD21 proti IgM vo FACS analýze, pri vymedzení vstupu pre IgD pozitívnu populáciu Baff Tg nyší, ktoré dostali injekciu h-Ig (stredný panel) alebo hBCMA-Ig (spodný panel) a pre kontrolné nyší divého typu, ktoré dostali injekciu PBS (homýpanel), ako je opísané v príklade 11.
Obrázok 10(c) sa týka podávania BCMA-Ig, ktoré redukuje celkovú populáciu lymfocytov marginálnej zóny a TI B lymfocytov v slezine BAFF-transgénnych myší. Obrázok ukazuje vynesenie expresie CD21 oproti IgM vo FACS analýze, pri vymedzení vstupu pre IgD pozitívnu populáciu Baff Tg nyší, ktoré dostali injekciu h-Ig (stredný panel) alebo hBCMA-Ig (spodný panel) a pre kontrolné nyší divého typu, ktoré dostali injekciu PBS (homýpanel), ako je opísané v príklade 11.
Obrázok 11 sa týka podávania hBCMA-hlg, ktoré znižuje hmotnosť sleziny pri BAFF transgénnych myšiach. Obrázok ukazuje hmotnosti sleziny všetkých skupín Baff Tg nyší (hmotnosť je uvedená v mg +/smerodajná odchýlka).
Obrázok 12 sa týka podávania BCMA-Ig, ktoré znižuje proteinúriu pri BAFF transgénnych myšiach (BAFF Tg) na hladinu porovnateľnú s myšami divého typu (WT). Obrázok ukazuje vynesenie proteinúrie (mg/dL) oprotipočtu injekcií BaffTgnyší, ktorým bol podávaný PBS, hlg, hBCMA-Ig a pri kontrolných myšiach.
Obrázok 13 ukazuje vynesenie priemernej hodnoty priemerného arteriálneho tlaku (mmHg) BAFF Tg nyší (BAFF+) a kontrolných nyší divého typu (BAFF-).
Obrázok 14 ukazuje vynesenie priemerného individuálneho arteriálneho tlaku (mmHg) BAFF Tg nyší (BAFF+) a kontrolných nyší divého typu (BAFF-).
Obrázok 15 sa týka podávania BCMA-Ig myšiam SNF-1 s miernou nefritídou, ktoré spomaľuje progresiu k silnej nefritíde. Obrázok ukazuje stĺpcový graf percenta nyší SNTF1, pri ktorých sa prejavila silná nefritída po podávaní BAFF-R-Ig (BCMA-Ig), HulgG alebo PBS.
Obrázok 16 ukazuje celkový počet CDllc+DC buniek (v miliónoch) nyší, ktorým bolo podávané in vivo 20 pg BCMA-Ig, 50 pg BCMA-Ig, HulgG alebo PBS. Vyšetrované bunkové populácie CDllc+DC boli: (1) CD8a- CD4-, (2) CD8a+ CD4- a (3) CD8a-CD4+.
Na ilustráciu vynálezu sú uvedené nasledujúce príklady, ktoré všakžiadnymspôsobomneobmedzujúrozsah vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Detekcia BAFF väzby naBAFF-R s použitím testu v doštičkovom formáte
V tomto príklade je opísaná väzba BAFF na transfekované bunky BAFF-R s použitím testu v doštičkovom formáte (doštičkového testu).
Kompletný humánny BAFF-R bol vytvorený z BJAB polyA+ RNA s použitím súpravy „Superscriptn preamplification kit“ (Life Technologies) na vytvorenie cDNA templátu a amplifikovaný s Pful s použitím primérov komplementárnych k 5' a 3' kódujúcim sekvenciám BAFF-R. PCR produkt bol klonovaný do CH269, derivátu pCEP4 (Invitrogen). Výsledný kloň bol nazvaný pJST535. Humánne bunky embryonálnych obličiek obsahujúce gén EBNA-1 (293EBNA) boli vysiate na doštičky so 6 jamkami potiahnutými fibronektínom a transfekované lipofektamínom (Life Technologies) a buď pJST535 v rôznych riedeniach, alebo CH269 ako kontrolou pozadia. 48 hodín po transfekcii boli transfekované bunky testované na schopnosť viazať rozpustný FLAG-hBAFF (aminokyseliny L83-L285) tak, ako je uvedené. Všetky inkubácie sa uskutočňovali pri teplote miestnosti. Kondiciované médiá sa odsali z jamiek a bunky sa premyli pufrom BHA (20 mM HEPES pH 7,0, 0,5 mg/ml BSA, 0,1 % NaN3) a inkubovali s 0,5 pg/ml FLAG-hBAFF nariedeným v PBS obsahujúcom 1 mM MgCh, lmM CaCb a 0,1 % NaN3. Po 1 hodine inkubácie sa roztok BAFF odstránil a bunky sa premyli BHA. Bunky sa potom inkubovali počas 30 minút v roztoku PBS obsahujúcom anti-FLAG monoklonálnu protilátku v koncentrácii 1 pg/ml, M2 (Sigma). Tento roztok sa odsal a bunky sa premyli BHA. Bunky sa potom inkubovali počas 30 minút v 1 : 3000 riedení kozieho proti-myšieho IgG F(ab)'2 (Jackson ImunoResearch) konjugovaného s alkalickou fosfatázou. Tento roztok sa odsal a bunky sa premyli BHA. Aby sa znížilo množstvo značeného pozadia spôsobené endogénnou alkalickou fosfatázou, bunky sa inkubovali počas 15 minút v 2,5 mM levimazole (Vektor Laboratories) riedenom v lOOmM NaCl, lOQmM Tris-Cl pH 9,5 a 5mM MgCh. Na chromogénnu detekciu alkalickej fosfatázy sa roztok inhibítora odsal a bunky sa inkubovali s roztokom farbiva ,jast red“ a naftolfosfátu (Pierce). Značenie bolo pozorované a fotografované v mikroskope pri malom zväčšení.
S K 288603 B6
Ukladanie farbiva „fast red“ bolo pozorované vo všetkých jamkách transfekovaných s plazmidom exprimujúcim BAFF-R, pJST535. Početnosť signálu sa znižovala, ako klesalo množstvo plazmidu transfekovaného do buniek. V bunkách transfekovaných kontrolným expresným vektorom, CH269 nebolo pozorované žiadne značenie. V transfekovaných bunkách tiež nebolo pozorované žiadne značenie, keď bol FLAGhBAFF vypustený zo značiaceho protokolu alebo keď bol FLAG-hBAFF nahradený iným členom rodiny liganduTNF, FLAG-značený LIGHT. TedaBAFF značenie buniek transfekovaných BAFF-R je špecifické.
Príklad 2
FACS analýza väzby BAFF na bunky transfekované BAFF-R
Tento príklad opisuje detekciu väzby BAFF na transfekované bunky BAFF-R s použitím FACS analýzy.
Plazmid kódujúci kompletný BAFF-R, pJST535, sa transfekoval do buniek 293EBNA použitím súpravy FuGeneó (Boehringer Mannheim).24 alebo 48 hodín po transfekcii sa bunky odstránili z doštičiek použitím 5mM EDTA v PBS a počítali. Bunky sa premyli dvakrát pufromFACS (PBS obsahujúci 10 % fetálne bovinné sérum, 0,1 % NaN3 a 10 pg/ml hlgG (Jackson ImunoResearch), a potom sa inkubovalo 2,5 x 105 buniek počas 1 hodiny na ľade s FLAG-hBAFF nariedeným vo FACS pufŕe s koncentráciou v rozmedzí od 9 pg/ml do 0,037 pg/ml. Bunky sa premyli FACS pufrom a imkubovali s anti- FLAG monoklonálmou protilátkou, M2, s koncentráciou 5 pg/ml počas 30 minút na ľade. Bunky sa premyli FACS pufrom a imkubovali počas 30 minút na ľade v roztoku obsahujúcom 1 : 100 riedenie oslieho proti-myšieho IgGF(ab')2 konjugovaného s R-fýkoerytrínom a 10 pg/ml 7-ADD. Potom, čo sa bunky premyli FACS pufrom, resuspendovali sa vo FACS pufŕe obsahujúcom 1 % paraformaldehyd. Nasledovala FACS analýza, keď boli 7-ADD pozitívne (mŕtve) bunky vylúčené.
Výsledky FACS analýzy ukázali, že frakcie buniek, ktoré sa transfekovali BAFF-R, sú schopné viazať BAFF. Pri BAFF koncentrácii 9 pg/ml, približne 28 % buniek viaže BAFF pri priemernej intenzite fluorescencie (MFI) 366. Pri použití samotnej PE-značenej oslej proti-myšej reagencie nebol posun buniek významný. Iba 1,3 % buniek malo MFI 23,5, pričom priemer zo všetkých buniek bol 5,5. Signál buniek transfekovaných BAFF-R sa znižoval s klesajúcim množstvom BAFF. V koncentrácii 100 ng/ml malo 8,76 % buniek MFI 78,9.
Príklad 3
FACS analýza interakcie BAFF/BAFF-R vrátane GFP markera
V tomto príklade je opísaná schopnosť BAFF viazať sa na bunky transfekované spoločne (kotransfekované) BAFFR a GFP reportérovým plazmidom
Bunky 293EBNA sa transfekovali pJST535 a GFP reportérovým plazmidom ako bolo opísané v príklade 2. Reporterový plazmid kóduje GFP molekulu zakotvenú v membráne. Použitím ko-transfekcie dvoch plazmidov analyzovali pôvodcovia percento transfekovaných buniek, ktoré boli schopné väzby na BAFF. Bunky sa odstránili z doštičiek a podrobili BAFF väzbe a detekcii, ako bolo opísané v príklade 2. Opäť bola zahrnutá 7-ADD, aby sa odčítali mŕtve bunky. Vzorky boli analyzované FACS a vynesené do grafú. Pravý horný kvadrant predstavuje bunky s naviazaným BAFF (fýkoerytrín pozitívny) a exprimujúci GFP.
Hoci sa zdá, že nie všetky GFP transfekované bunky viažu BAFF, existuje významná frakcia buniek v pravom hornom kvadrante v porovnaní s kontrolami. 33 % transfekovaných buniek je v prvom hornom kvadrante v porovnaní s 8 %. Je možné, že je nevyhnutný určitý stupeň expres ie BAFF-R, aby sa prejavila väzba BAFF na bunky. Je tiež možné, že je vyžadovaný ko-receptor na interakciu s vysokou afinitou a že tento receptor je na bunkách 293EBNA limitujúci.
Príklad 4
Imunoprecipitácia FIAG-hBAFF fúziou BAFF-R-Fc
Tento príklad opisuje špecifickú interakciu FIAG-hBAFF s BAFF-R-Fc, molekulou zloženou z domény bohatej na cysteín (CRD) BAFF-R fúzovanej na Fc doménu humánneho IgGl.
CRD BAFF-R boli vytvorené pomocou RT-PCR z BJAB polyA+ RNA ako v príklade 1 použitím oligonukleotidu komplementárneho k nukleotidom 132-152 z hBAFF-R kódujúcej sekvencie ako 3'priméru. Výsledný PCR fragment sa klonoval do CH269 v smere od myšej IgG-kapa signálnej sekvencie a v protismere od Fc skupiny humánneho IgG Tento konštrukt bol nazvaný pJST538. Konštrukt pJST538 alebo CH269 sa transfekovali do 293EBNA prostredníctvom lipofektamínu. Kondiciované médiá a bunkové extrakty sa zobrali 20 hodín po transfekcii. Bunky sa solubilizovali v 20 mM Tris pH 7,5/50 mM NaCl/0,5 % NP40/0,5 % deojycholovej kyseline a debris sa odstránil stočením Alikvót kondiciovaného média a bunkové extrakty sa spojili s rovnakým objemom redukčného pufŕa 2xSDS, povarili a podrobili SDS-PAGE a Western prenosu. Aby sa overila expresia, membrána sa skúšala v 1 : 3000 riedení myšieho anti-humánneho IgG konjugovaného s chrenovou peroxidázou (HRP) v 5 % odtučnenom sušenom mlieku v TBST pri teplote miestnosti počas 30 minút a premyla TBST. Membrány (bloty) boli vyvolané ECL (Amersham) a exponované na film
S K 288603 B6
Imunoprecipitácie sa uskutočňovali inkubáciou 25 ng buď FLAG-hBAFF, alebo FLAG-hTWEAK s 0,5 ml kondicionovaného média z 293EBNA transfekovaných buď pJST538, alebo CH269 pri 4 °C počas 1 hodiny s trepaním, a potom nasledovalo pridanie 30 μΐ ProteínA-Sepharose (Pharmacia) a pokračovalo trepanie cez noc. ProteínA-Sepharose perličky sa premyli dvakrát s PBS a resuspendovali vo vzorke redukčného pufŕa 2xSDS. Po SDS-PAGE a Western prenose sa bloty inkubovali s anti-FLAG monoklonálnou protilátkou M2 (Sigma) s koncentráciou 5 pg/ml v 5 % odtučnenom sušenom mlieku v TBST pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Bloty sa premyli TBST a inkubovali s 1 : 3000 riedením kozieho proti-nyšieho IgG konjugátu s HRP (Jackson ImunoResearch) v 5 % odtučnenom sušenom mlieku v TBS pri teplote miestnosti počas 30 minút. Bloty boli vyvolané ECL (Amersham) a exponované na film
Po transfekcii pJST538 do buniek 293EBNA sa detegovala expresia proteínu s veľkosťou približne 43kD tak v bunkovom extrakte, ako v kondiciovanom médiu analýzou Western blotom s myším anti-humánnym IgG (Jackson ImmunoResearch), čo ukazovalo, že fúzia BAFF-R-Fc bola účinne exprimovaná a sekretovaná.
Pri imunoprecipitácii bol pozorovaný pás iba ako výsledok inkubácie BAFF-R-Fc a flag-hBAFF. Tento pás sa pohyboval spoločne s priamo nanesenou vzorkou flag-hBAFF. Žiadna ďalšia dráha nevytvorila signál, čo ukázalo, že interakcia medzi BAFF-R-Fc a flag-hBAFF je špecifická.
Príklad 5
Vytvorenie rozpustných foriem receptora
Aby sa vytvoril inhibítor receptora na použitie u človeka, je nutná cDNA sekvencia extracelulámej domény humánneho receptora. Ak je známa myšia forma, je uskutočňovaný skrining humánnych cDNA knižníc použitím myšej cDNA sekvencie a v tejto oblasti sú tieto manipulácie uskutočňované rutinne. S humánnou cDNA sekvenciou je možné navrhnúť oligonukleotidové priméry, aby sa pomocou PCR amplifikovala extraceluláma doména receptora bez transmembránových a intracelulámych domén. Typicky je zahrnutá väčšina aminokyselín medzi „TFN doménou“ spojenou s posledným disulfidickým mostíkom a transmembránovou doménou. Je možné meniť množstvo „stonkových“ oblastí zahrnutých na optimalizáciu potencie výsledného rozpustného receptora. Tento amplifikovaný úsek je upravený metódami genetického inžinierstva tak, aby zahŕňal vhodné reštrikčné miesta na klonovanie do rôznych vektorov na vytváranie fúznej chiméry s C-koncom Ig. Alebo je možné vložiť stop signál na 3'koniec a vytvoriť rozpustnú formu receptora bez pokusu použiť prístup s fúznou chimérou Ig. Výsledné vektory môžu byť exprimované vo väčšine systémov používaných v biotechnológiách vrátane kvasiniek, hmyzích buniek, baktérií a cicavčích buniek a pre všetky typy expresie existujú príklady. Rôzne humánne Fc domény môžu byť pripojené, aby sa optimalizovali alebo eliminovali interakcie FcR a komplementu, ak je to žiaduce. Alebo sa môžu použiť mutované formy týchto Fc domén, aby sa selektívne odstránili interakcie FcR alebo komplementu, či pripojenie sacharidov N-pripojených na Fc doménu, čo má určité výhody.
Príklad 6
Príprava agonistických alebo antagonistických protilátok
Už opísané rozpustné formy receptora môžu byť použité na imunizáciu myší a na vytváranie monoklonálnych protilátok (mAbs) obvyklými metódami. Výsledné mAbs, ktoré sú identifikované pomocou metód ELISA, môžu byť ďalej podrobené skriningu na to, či majú agonistickú aktivitu a to buď ako rozpustné protilátky, alebo imobilizované na plaste v rôznych in vitro bunkových testoch. Usmrtenie bunkovej línie HT29 je často vhodný systém, ktorý je citlivý na signalizáciu prostredníctvom mnohých TNF receptorov. Ak táto línia nemá skúmaný receptor, môže byť tento kompletný receptor stabilne transfekovaný do línie HT29, aby sa umožnilo fúngovanie cytotoxického testu. Alebo môžu byť tieto bunky použité v prístroji Cytosensor, aby sa určilo, či aktivácia receptora môže vyvolať zmenu pH, ktorá je indikátorom signálneho javu. Rodina TNF receptorov v tomto usporiadaní signalizuje dobre a táto metóda nevyžaduje znalosť aktuálnych biologických javov spúšťaných receptorom Agonistické mAbs môžu byť „humanizované“ na klinické použitie. Tento postup sa môže tiež použiť na charakterizáciu antagonistických mAbs. Pre tieto mAbs je charakteristický nedostatok agonistickej aktivity a schopnosť inhibovať interakcie receptor-ligand, ako je monitorované technikami ELISA, technikou klasickej väzby alebo technikou BIAcore. Nakoniec, indukcia sekrécie chemokínov rôznymi bunkami ako reakcia na agonistickú protilátku môže tvoriť základ pre skriningový test (metódu).
Príklad 7
Skrining inhibítorov interakcie receptor-ligand
Použitím fúzneho proteínu receptor-Ig je možné uskutočňovať skrining kombinačných knižníc na molekuly, ktoré môžu viazať receptor priamo. Tieto molekuly môžu byť potom testované v testoch ELISA použitím fúzneho proteínu receptor-Ig a rozpustnej formy Ugandu na schopnosť inhibovať interakcie receptor-Ugand. Táto ELISA môže byť použitá priamo na uskutočňovanie skriningu rôznych knižníc s prírodnými produktmi a pod. na inhibičné zlúčeniny. Receptor môže byť transfekovaný do bunkovej Únie, ako je naprí11
S K 288603 B6 klad línia HT29, aby vznikol biologický test (v tomto prípade cytotoxický), ktorý potom vytvorí test vhodný na skríning.
Príklad 8
BAFF-R-IgG vyvoláva zníženie počtu B lymfocytov pri normálnych myšiach.
Osem týždňov staré samice myší BALB/c boli zakúpené od The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Myši (3/skupina) dostali i.p. buď PBS, 400 pg fúzneho proteínu humánneho BAFF-R-hulgGI (hBAFF-R-Ig) (dodávaný firmou Teresa Cachero, Biogen), alebo 400 pg purifikovaného humánneho IgG(HuIgG) (Sandoz, Bazilej, Švajčiarsko) v dňoch -8, -5, -1 a +2. Myši dostali 100 pl 10 % ovčích červených krviniek (SRBC) (Colorado Sérum Company, Denver, CO) v deň 0.
V čase utrácania zvierat sa krv odoberala prostredníctvom punkcie srdca do skúmaviek obsahujúcich EDTA a červené krvinky sa lýzovali v hypotonickompufri. Krv sa tiež odoberala bez EDTA na sérové preparáty. Jednoduché bunkové suspenzie sa pripravili zo slezín a mezenterických lymfatických uzlín (MNL) a červené krvinky sa lýzovali v hypotonickom pufri. Uskutočnila sa prietoková cytometria použitím PE-konjugovanej anti-CD45R/B220, anti-syndekan/CD138 a anti-B7.2 a FITC-konjugovaného anti-IgM a antiCD45R/B220. Všetky mAbs boli zakúpené od firmy Pharmingen (San Diego, CA). Stručne, Fc receptory boli blokované prípravkom „fc Block“ (Pharmingen) s koncentráciou 10 pg/ml počas 15 minút na ľade, potom nasledovalo pridanie PE- a FITC-konjugovaných mAbs a inkubované na ľade počas 20 až 30 minút. Bunky sa 1 x premyli a suspendovali v 0,5 % paraformaldehyde. Dáta fluorescencie buniek sa získali na prietokovom cytometri FACSCalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, CA) a analyzovali použitím softvéru CfLLQuest™(Becton Dickinson).
Po ošetrení s hBAFF-R-Ig nastala približne 50 % redukcia počtu B lymfocytov v periférnej krvi a vo vyšetrených periférnych lymfatických orgánoch. B220hlgh IgMlow B lymfocyty zodpovedali 23,4 % a 21,5 % buniek pri myšiach ošetrených PBS a HulgG, v danom poradí, zatiaľ čo táto populácia predstavovala iba 9,9 % buniek pri myšiach ošetrených hBAFF-R-Ig. Počet plazmatických buniek (syndekan/CD138+) tiež ľahko poklesol, s 5,7 % a 4,8 % prítomnými v krvi myší ošetrených PBS a myší ošetrených HulgG, v danom poradí, v porovnaní s 3,9 % pri myšiach ošetrených hBAFF-R-Ig. B7.2 molekula bola zvýšená na 3.1 % a 4,5 % B220+ buniek pri myšiach ošetrených PBS a myšiach ošetrených HulgG, v danom poradí, v porovnaní s 1,9 % pri myšiach ošetrených hBAFF-R-Ig.
B220hlgh B lymfocyty v slezine boli výrazne redukované pri myšiach ošetrených hBAFF-R-Ig, predstavovali 18,8 %, v porovnaní s 36,7 % a 40 % pri myšiach ošetrených PBS a HulaG, v danom poradí. Tento pokles bol pozorovaný pri oboch populáciách, IgMhlgh a IgMlow (pozri tabuľka 8A). Žiadna zmena nebola pozorovaná v novom vytvorenom kômpartmente B lymfocytov v slezine, B220low IgMhlgh (dáta nie sú ukázané). Počet plazmatických buniek (syndekan/CD138+) tiež ľahko poklesol s 3,3 % a 3,4 % prítomnými v slezine myší ošetrených PBS a myší ošetrených HulgG, v danomporadí, v porovnaní s 2,4 % pri myšiach ošetrených hBAFF-R-Ig.
MLN prejavovali pokles B220+ B lymfocytov s 14,1 % prítomnými pri myšiach ošetrených hBAFFR-Ig v porovnaní s 26,7 % a 35,8 % pri myšiach ošetrených PBS a myšiach ošetrených HulgG, v danomporadí. Dáta sú zhrnuté v tabuľke 8A.
Tabuľka 8A
Populácia B lymfocytov pri myšiach1 ošetrených hBAFF-R-Ig, PBS a HulgG
Krv B220high IgMl0W Syndekan B7.2/B220low
PBS 23,4 ± 5,7 5,7 ± 1,5 3,1 ± 0,5
HulgG 21,5 ±4,5 4,8 ± 0,9 4,5 ± 1,0
HBAFF-R-Ig 9,9 ± 1,8 3,9 ± 0,6 1,9 ± 0,5
Slezina B220high IgMlow B220high IgM+ Syndekan
PBS 27,8 ±1,6 11,9 ± 1,6 3,3 ± 0,8
HulgG 30,5 ±2 11,8 ±1,0 3,4 ± 0,7
HBAFF-R-Ig 10,6 ± 0,2 8,4 ± 0,2 2,4 ± 0,2
MLN PBS HugG HBAFF-R-Ig B220+ 26.7 35.8 ±3,3 14,1 ±5,9
S K 288603 B6 1myši boli ošetrené tak, ako bolo opísané v časti Materiál a metódy a dáta sú udané ako percento ± smerodajná odchýlka
Znížené percento B7.2+ B lymfocytov v krvi a plazmatických buniek v krvi a slezinách pri myšiach ošetrených hBAFF-R-Ig po imunizácii s SRBCs svedčí o tom, že existuje inhibícia aktivácie a/alebo maturácie B lymfocytov a potenciálne zvýšená eliminácia aktivovaných B lymfocytov. Veľmi malé percento antigénne špecifických B lymfocytov bolo aktivované a odpovedalo na nejaký antigén, v tomto prípade SRBC. Pretože ošetrenie hBAFF-R-Ig malo za následok takú dramatickú redukciu percenta B lymfocytov vo všetkých vyšetrovaných tkanivách, ~50 %, zdá sa, že aktivita hBAFF-R.Ig tiež cieli na pokojné, zrelé B lymfocyty.
Predpokladá sa teda, že fúzny proteín BAFF-R môže byť použitý ako liečivo s klinickou aplikáciou pri ochoreniach, ktoré sú sprostredkované B lymfocytmi. K týmto ochoreniam patria tie, ktoré sú autoimunitnej povahy, ako je napríklad systémový lupus erythematosus, myasténia gravis, autoimunitná hemolytická anémia, idiopatická trombocytopenická purpura, antifosfolipidový syndróm, Chagaova choroba, Qaveova choroba, Wegenerova granulomatóza, nodózna polyarteritída a rýchla progresívna glomerulonefiitída. Liečivo je tiež použiteľné pri chorobách plazmatických buniek, ako je napríklad mnohopočetný myelóm, Waldenstromova makroglobulinémia, ochorenie ťažkých reťazcov, primárna amyloidóza alebo amyloidóza združená s imunocytmi a idiopatická monoklonálna gamapatia (MGUS). Onkologické ciele zahŕňajú karcinómy, leukémie alymfómy pochádzajúce z B lymfocytov.
Príklad 9
Blokovanie proliferácie B lymfocytov indukovanej BAFF in vitro použitím rozpustného BAFF-R
V tomto príklade pôvodcovia dokázali, že rozpustný fúzny proteín BAFF-R:hIgGl je schopný blokovať proliferáciu B lymfocytov indukovanú BAFF v myších splenocytoch.
Myšie splenocyty (5 x 105 buniek/ml) z myší Balb/c sa izolovali a pestovali na 96-jamkových doštičkách v 100 μΐ RPMI (Life Technologies) doplnenom 10 % fetálnym teľacím sérom (JHR), 2 mM glutamínom, 100 jednotkami/ml penicilínu a 100 mg/ml streptomycínu (Life Technologies). Potom sa pridali rôzne množstvá humánneho BAFF, 10 pg/ml humánneho BAFF-R: hlgGl alebo humánneho Ig ako aj 10 pg/ml anti-myšieho povrchového ťažkého reťazca μ (Jackson ImunoResearch). Po 48 hodinách sa v tkanivovej kultúre pri 37 °C bunkám podal impulz počas 24 hodín 1 pCi/jamku (metyl-3H) tymidínu (Dupont NEN) a bunky sa zozbierali použitím prístroja na zbieranie buniek Tomtec (Qrange, CT). Rádioaktivita sa merala scintilačným počítačom pre kvapaliny Betaplate (Pharmacia Biotech).
Obrázok 8 ukazuje výsledky testu proliferácie splenocytov. Sú ukázané impulzy za minútu (CPM) inkorporované do myších splenocytov oproti množstvu pridaného humánneho BAFF. Stupeň anti-μ alebo fúzneho proteínu alebo kontrolného hlgGje udržovaný v konštantnej koncentrácii 10 pg/ml. Plné štvorčeky predstavujú stupeň proliferácie indukovanej samotným BAFF. Plné krúžky predstavujú proliferáciu buniek s BAFF a anti-μ. Krivka s prázdnymi trojuholníčkami predstavuje inhibíciu pozorovanú, keď je pridaný BAFF-R: hlgGIBAFF s anti-μ plus BAFF-R: hlgGl. Prázdny kosoštvorec predstavuje inhibíciu pozorovanú pri použití kontrolného humánneho Ig.
Pridanie BAFF plus anti-μ má za následok proliferáciu myších splenocytov in vitro. Hladina 3H tymidínu inkorporovaného do buniek je významne vyššia ako hladina získaná, keď je k splenocytom pridaný buď samotný BAFF, alebo samotná anti-μ. Ošetrenie splenocytov samotným BAFF má za následok inkorporáciu 3H tymidínu iba pri veľmi vysokých koncentráciách. Pridanie samotného anti-μ nemá za následok proliferáciu. Keď bol pridaný kontrolný humánny Ig v koncentrácii 10 pg/ml, nastal mierny pokles stupňa proliferácie. Na rozdiel od toho, keď bol do testu pridaný fúzny proteín humánny BAFF-R:hIgGl s koncentráciou 10 pg/ml za rovnakých podmienok, rozsah proliferácie bol redukovaný na stupeň pozorovaný pri ošetrení samotným BAFF. To ukazuje, že fúzny proteín BAFF-R:hIgGl je schopný inhibovať proliferáciu splenocytov indukovanou BAFF a anti-μ.
Príklad 10
Blokovanie väzby BAFF na bunky Raji použitím BAFF-R:hIgGl
V tomto príklade je opísaná preinkubácia BAFF s fúznym proteínom BAFF-R:hIgGl, ktorá má za následok redukciu BAFF väzby na bunkovú líniu Raji lymfómu z B lymfocytov.
V tomto FACS teste sa 200 ng/ml FLAG-značeného („FLAG- tagged“) humánneho BAFF preinkubovalo buď s humánnym BAFF- R:hIgGl, alebo humánnym LT|lR:liIgGl v dvojkových riedeniach v rozmedzí od 20 pg/ml do 39 ng/ml alebo bez fúzneho proteínu počas 30 minút na ľade. Inkubácia sa uskutočňovala vo FACS pufii obsahujúcom PBS bez Ca2+ alebo Mg2+ a 10 % FCS (JRH) a 0,05 % azid sodný. Po preinkubácii sa zmes BAFF-fúzneho proteínu pridala k 5 x 106 Raji (ATCC) buniek/ml. Táto inkubácia prebiehala počas 30 minút na ľade a bunky sa potom premyli 2 ml FACS pufiu pri 4 °C. Aby sa detegoval naviazaný BAFF, k bunkám sa pridala anti-FLAG protilátka M2 (Sigma) s koncentráciou 5 pg/ml a inkubovala počas 30 minút na ľade. Bunky sa opäť premyli, ako je uvedené, a potom sa inkubovali s 1 : 100 riedením oslieho protinyšieho Ig (Jackson ImunoResearch) konjugovaného s PE počas 30 minút na ľade. Potom sa bunky opäť
S K 288603 B6 premyli FACS pufrom, fixovali 1 % paraformaldehydom a odčítali prístrojom FACS® (Becton Dickinson a Co.)
Obrázok 9 ukazuje výsledky BAFF blokujúceho testu. Sú ukázané MFI (priemer intenzity fluorescencie) údaje, ktoré sú výsledkom analýzy FACS® vyšetrujúcej väzbu BAFF na bunky Raji. Plné štvorčeky predstavujú dáta, keď sa humánna BAFF-R:hIgGl preinkubovala s Baff pred väzbou na bunky. Krúžky ukazujú krivku, ktorá je dôsledkom pridania nešpecifického fúzneho proteínu, humánneho LT|lR:liIgGl, na BAFF. Os x predstavuje množstvo fúzneho proteínu pridaného k BAFF s koncentráciou 200 ng/ml pred inkubáciou s bunkami.
Keď nebol s humánnym BAFF preinkubovaný žiadny fňzny proteín, priemerná intenzita fluorescencie (MFI) vzorky bola 80. Keď bol s BAFF preinkubovaný humánny LT|lR:liIgGl, dokonca aj s koncentráciou 20 pg/ml, detekcia väzby BAFF na bunky Raji bola nezmenená. Keď bol ale s BAFF preinkubovaný humánny BAFF- R:hIgGl, nastalo podstatné zníženie MFI, až na 20 až 25, dokonca aj pri koncentrácii fúzneho proteínu 625 ng/ml. Pozadie MFI na tento pokus bolo 7. BAFF-R:hIgGl je teda veľmi účinný pri blokovaní väzby BAFF na lymfocyty Raji.
Príklad 11
BAFF-R-IgG zmierňuje antoimunitnú chorobu typu lupus pri transgénnych myšiach
Tento príklad opisuje účinok BAFF-R-Ig na zníženie počtu periférnych B lymfocytov a inhibíciu rozvoja splenomegálie a nefiitídy.
V pokuse sa použili päť mesiacov staré BAFF transgénne (Tg) myši (C57BL/6) a vekovo porovnateľné kontrolné myši. Pri BAFF Tg myšiach sa manifestovali ochorenia lymfocytov a autoimunitný fenotyp podobný systémovému lupus erythematosus (Mackay et al., 1999). Tento fenotyp zahŕňa zvýšenie periférnych populácií B lymfocytov vrátane prechodnej 1 (TI) a 2 (T2), zrelej (M), marginálnej zóny (MZ) a B lymfocytov CDlhish/IgMhish.
Myši dostali i.p. PBS, 400 pg publikovaného humánneho IgG (hlg) (Sandoz, Bazilej, Švajčiarsko) (3/skupina) alebo 400 pg fúzneho proteínu humánneho BAFF-R-hulgGI pochádzajúceho z buniek CHO (hBCMA-Ig) (2/skupina) v dňoch 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28, 32, 35, a boli utratené v deň 40.
V čase utratenia zvierat sa odvážila slezina a pripravili sa jednoduché bunkové suspenzie po lýze červených krviniek v hypotonickom pufri. Uskutočnila sa prietoková cytometria použitím FITC-kojugovanej antiCD21/CD35, PE-konjugovanej anti- IgD a antiCDl, anti-CD45R/B220 konjugovanej s cychrómom (cychrome) a anti-IgM konjugovanej s biotínom Všetky mAbs boli zakúpené od firmy Pharmingen (San Diego, CA). Stručne, Fc receptory boli blokované činidlom „Fc Block“ (Pharmingen“) s koncentráciou 10 pg/ml počas 10 minút na ľade, potom nasledovalo pridanie mAbs konjugovaných s biotínompočas 30 minút na ľade, bunky sa lxpremyli, potom nasledovalo pridanie Abs konjugovaných s FITC, PE, Cychrome, streptavidín APC a FcBlock s koncentráciou 10 pg/ml. Bunky sa inkubovali počas 30 minút na ľade, 1 x premyli a suspendovali v 0,5 % paraformaldehyde. Dáta fluorescencie buniek s a získali na prístroji FACSCalibur (prietokový cytometer, Becton Dickinson, San Jose, CA) a analyzovali použitím softvéru CELLQuest (Becton Dickinson).
Výskyt proteínov v moči myší sa meral použitím reagenčných prúžkov Multistix 10 SGna analýzu moču (Bayer Corp., Diagnostics Division).
Výsledky sú ukázané v tabuľkách 11A a 11B.
Tabuľka 11A
Analýza splenocytovpočas 3mesiacov
Celkový počet buniek na slezinu (xlO6)
TI T2 MZ Zrelé
Myši BAFF Tg 816E23 9,4 18 9 91
816E33 14 30 19 170
816E99 14 24 19 150
Priemer 13+/-2,6 24+/-6 16+/-5,7 140+/-41
Kontrolné myši 816E2 5,3 5,8 3,1 73
816E4 2,4 3,7 1,9 44
Priemer 3,9+/-2 4,8+/-1,5 2,4+/-1 59+/-20
S K 288603 B6
Sleziny my δ í Baff Tg starých 3 mesiace (n = 3) a vekovo porovnateľných kontrolných myší (n = 2) sa izolovali a podrobili analýzam FACS tak, ako bolo opísané v časti Materiál a metódy. TI, T2, M a MZ bunky boli definované expresiou nasledujúcich povrchových markerov (hi : high - vysoký, lo : low - nízky, int : intermediate - stredný):
Tl:IgD-, IgMhigh,CD2110
MZ:IgD, IgMhi, CD21
T2:IgD+, IgMhi,CD21hi
M:IgD+, IgM10,CD21int
Tabuľka 11B
Analýza splenocytov počas 10 mesiacoch
Celkový počet buniek na slezinu (x 106)
TI T2 MZ Zrelé
Myši BAFF Tg 802-39 13 100 34 630
823-3-11 7,5 43 6,6 200
823-3-13 3,1 50 15 180
Priemer 7,9+/^4,9 64+/-30 19+/-10 340+/-250
Kontrolné myši 823-3-22 0,7 6,5 1,4 56
802-64 0,28 5,4 1,3 38
823-14-13 0,45 3,4 0,16 38
Priemer 0,48+/-0,21 5,1+/-1,5 0,95+/-0,65 44+/-10
Myši Baff Tg staré 10 mesiacov (n = 3) a vekovo porovnateľné kontrolné myši (n = 3) sa podrobili analýzam FACS tak, ako bolo opísané v tabuľke 1.
Po podávaní hBAFF-R-Ig myšiam BAFF Tg boli významne redukované populácie TI, T2, M, MZ a CDlhlgh/IgMhlgh B lymfocytov v slezine, v porovnaní s myšami Baff Tg ošetrenými PBS a hlg, celkové počty TI, T2, M, MZ a CDlhlgh/IgMhlgh B lymfocytov boli redukované na počet podobný alebo nižší než pri kontrolných my š iach ošetrených PBS (Fíg. 10a, 10b, 10c).
BAFF-R-Ig ošetrenie myší Baff Tg malo za následok zmiernenie autoimunitného ochorenia sprostredkovaného Baff, ako sa dokázalo pozorovaním, že myši ošetrené BAFF-Rmali sleziny s normálnou veľkosťou, zatiaľ čo pri kontrolne ošetrených myšiach Baff Tg bola dokázaná splenomegália (obr. 11). Okrem toho bol pri myšiach ošetrených BAFF-R-Ig inhibovaný rozvoj proteinúrie, indikátora renálnej disfunkcie, zatiaľ čo pri kontrolne ošetrených myšiach Baff Tg sa rozvinula nefritída, ako sa zistilo zvyšovaním stupňa proteinúrie (pozri obr. 12).
Myši transgénne v Baff mali vysoko zvýšené počty periférnych B lymfocytov a ďalšie analýzy týchto myší odhalili zvýšenie prevažne subpopulácií TI, T2 a MZ B lymfocytov. Prechodný stupeň vývoja B lymfocytov (TI a T2) je kontrolný bod, keď sú autoreaktívne B lymfocyty pravdepodobne odstránené. CDlhl/IgMhlgh B lymfocyty, ktoré majú tendenciu usadiť sa v marginálnej zóne, boli tiež pri myšiach Baff Tg vysoko zvýšené. Ukázalo sa, že táto posledná populácia B lymfocytov bola hlavný zdroj produkcie autoprotilátok pri lupoiných myšiach NZB/NZW. Ošetrenie myší Baff Tg s BAFF-R-Ig malo za následok redukciu populácií TI, T2, MZ a CDlhl B lymfocytov na počet podobný alebo nižší ako počet nájdený pri kontrolných myšiach divého typu.
BAFF-R-Ig spôsobil zníženie počtu periférnych B lymfocytov a inhiboval rozvoj splenomegálie a nefritídy. Teda, okrem jeho použiteľnosti pri systémovom lupus erythematosus a lupu sovej nefritídy, účinok BAFF-R-Ig je tiež užitočný pri ochoreniach sprostredkovaných B lymfocytmi, ktoré majú autoimunitnú povahu, ako je napríklad systémový lupus erythematosus, myasténia gravis, autoimunitná hemolyrická anémia, idiopatická trombocytopenická purpura, antifosfolipidový syndróm, Chagaovo ochorenie, Oravcovo ochorenie, Wegenerova granulomatóza, nodózna polyarteritída a rýchla progresívna glomerulonefritída. Liečivo je tiež použiteľné pri chorobách plazmatických buniek, ako je napríklad mnohopočetný myelóm, Waldenstromova makroglobulinémia, ochorenie ťažkých reťazcov, primárna amyloidóza alebo amyloidóza združená s imunocytmi a idiopatická monoklonálna gamapatia (MGUS). Onkologické ciele zahŕňajú karcinómy, leukémie a lymlómy pochádzajúce z B lymfocytov.
Príklad 12
S K 288603 B6
Priemerný arteriálny tlak pri BAFF transgénnychmyšiach
Tento experiment opisuje meranie krvného tlaku pri BAFF transgénnych myšiach. Pozorovania, ktoré sa uskutočnili v priebehu vyhodnocovania fenotypu BAFF transgénnych myší, ukazovali na potenciálnu hypertenziu pri myšiach.
Baff Tg myši už opísané sa podrobili anestéze ketamínom. Ľavá karotída sa odkryla incíziou na krku. Do karotídy sa vložil katéter na meranie krvného tlaku a srdcovej činnosti. Katéter bol spojený s tlakovým snímačom a krvný tlak sa meral pomocou Gouldovho datazbemého systému a Gouldovho polygrafii (Po-NeMah Data Acquisition systém and Gould polygraph). Z priebehu tlakových vln sa určil systolický tlak, diastolický tlak, priemerný tlak a srdcová frekvencia. Boli použité dve skupiny myší: BAFF transgénne myši (n = 8) a kontrolné myši divého typu (n = 9).
Obrázok 13 ukazuje priemery hodnôt priemerných arteriálnych tlakov, MAP (v mmHg) pre dve skupiny myší. Ako je ukázané, BAFF transgénne myši mali priemerný MAP 102 ± 8 mmHg. Kontrolné myši mali priemerný MAP 92 ± 6 mmHg. Takže BAFF myší mali 10 mmHg zvýšenie v porovnaní s kontrolnými zvieratami, aj keď tento rozdiel nebol štatisticky dokázaný (ANOVA).
Podrobnejšia analýza týchto dát je uvedená na obrázku 14, kde sú uvedené výsledky merania jednotlivých zvierat. Pri kontrolných myšiach divého typu (BAFF-) distribúcia hodnôt má typické binomické rozdelenie. Oproti tomu tlaky pri BAFF transgénnych myšiach (BAFF+) javia distribúciu do dvoch skupín, jedna skupina v rozmedzí 120 až 130 mmHg a druhá skupina v rozmedzí 80 až 90 mmHg.
Ako populácia majú BAFF transgénne myši tendenciu k hypertenzii v porovnaní s negatívnymi kontrolnými myšami.
Analýza individuálnych hodnôt arteriálneho tlaku ukázala, že tlak delí transgénne myši na dve subpopulácie, jednu s vysokým krvným tlakom a druhú s normálnym krvným tlakom. Podávanie rozpustného BAFF-R, fňzneho proteínu alebo homológu protilátky môže zmierniť účinky hypertenzie.
Príklad 13
Liečenie myší SNFi už s rozvinutým ochorením podávaním BAFF-R-Ig spomaľuje progresiu silnej neffitídy
Samice myší (SWR x NZB) F1 (SNFi) náchylné na lupus v 21. týždni, ktoré majú príznaky miernej nefritídy (proteinúrie 30 až 100 mg/dl), dostávali počas 8 týždňov jedenkrát týždenne i.p. injekciu 200 pg fňzneho proteínu humánneho BAFF-R-hulgGI (hBCMA-Ig), humánny IgG (HulgG) (Sandóz) alebo 200 μΐ PBS.
Moč každej myši sa monitoroval na proteinúriu pomocou zariadenia Albustix (Bayer Corp., Terrytown, NY). Proteinúria vyššia ako 100 mg/dl sa hodnotila ako závažná nefritída. BAFF- R-Ig bol produkovaný v dočasne transfekovaných bunkách EBNA 293. Upravené médium z buniek 293 exprimujúcich hBCMA-Ig sa nanieslo na proteínovú kolónu. Proteín sa eluoval použitím pufra obsahujúceho 25 mM fosfát, 100 mM NaCl, pH 2,8 na neutralizáciu 1/20 objemu 0,5M NaPCF pH 8,6. Frakcie vybrané na základe meraní OD280 sa analyzovali SDS-PAGE v redukujúcich a neredukujúcich podmienkach a ďalej Western blotmi, aby sa identifikoval purifíkovaný proteín.
Tri týždne po ukončení liečenia 50 % myšíi liečených BAFF-R-Ig malo závažnú neffitídu, v porovnaní so 75 % a 87,5 % myší, ktoré dostali HulgG a PBS (pozri obrázok 15). Tieto dáta ukazujú, že rozpustný BAFF receptor, BCMA-Ig, pôsobí tak, že blokuje autoimunitné ochorenie sprostredkované B lymfocytmi ako je lupus ová nefritída, čo vedie k značnému spomaleniu progresie ochorenia.
Príklad 14
Podávanie BAFF-R-Ig normálnym myšiam vedie k zníženiu počtu dendritických buniek (DC) v slezine a atypickej lokalizácii v slezine
Samice sedem týždňov starých myší BAFB/c (3/skupina) dostávali 1 x týženne počas 4 týždňov i.p. injekciu 20 pg alebo 50 pg humánneho BAFF-R-IgGl (hBCMA-Ig), 50 pg humánneho IgG (HulgG) alebo 100 μΐ PBS. Fúzny proteín hBCMA-Ig sa purifíkoval zo supematantu kultúry trvalo transfekovaných buniek. Sleziny boli získané 8 dní po poslednej injekcii a ošetrené kolagenázou (Sigma, katalóg. C. C-5138) 1 hodinu pri 37 °C. Pripravila sa suspenzia jednotlivých buniek, červené krvinky (RBCs) sa lýzovali v hypotonickom pufri a bunky sa opláchli 3 xv PBS. Splenocyty sa pripravili na prietokovú cytometrickú analýzu zafarbením pomocou anti-CDllc-biotínu nasledovanom streptavidín-APC, anti-CD8a-cychrom a anti-CD4-FITC na vyhodnotenie populácií DC.
V oddelenom experimente samice myší BAĽB/c (N = 3) dostávali počas 4 týždňov 1 x za týždeň i.p. injekciu 100 pg hBCMA-Ig, potom sa sleziny odstránili a veľmi rýchlo zamrazili v OCT použitím 2-metylbutánu zamrazenom na CO2. Kryorezy sa pripravili a fixovali v acetóne. Rezy sa inkubovali s anti-CDllc-biotínom nasledovaným streptavidín-AP a substrátom BCIP (Pierce) na vizualizáciu DC, monoklonálnou protilátkou MOMA-1 nasledovanou anti-potkaňou IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch) a substrátom 3,3'-diaminobenzidínom (Sigma, St. Fouis MO, katalóg, č. D-1293) na vizualizáciu metalofilných makrofágov a anti-CD35-biotínom nasledovaným streptavidín-AP a substrátom (Alkaline Phosphatase Substráte Kit I, Vector, katalóg. C. SK-5100) na vizualizáciu folikulámych dendritických buniek (FDC).
S K 288603 B6
Myši in vivo liečené podávaním 20 pg alebo 50 pg BCMA-Ig 1 x týždenne počas 4 týždňov mali významné zníženie (p<0,05 v Študentovom t-teste) počtu slezinných CDllc+ DC v porovnaní s kontrolami, ktorým sa podával HulgG alebo PBS. Toto zníženie bolo pozorované pri všetkých skúmaných populáciách CDllc+ DC: CD8a- CD4-, CDB8+ CD4- a CD8a-CD4+ (pozri obrázok 16, tabuľka 14A).
Tabuľka 14A
Podávanie BAFF-R-Ig vedie k zníženiu počtu DC v slezine
PBS HulgG 20 pg BCMA-Ig 50 pg BCMA-Ig
Priemerný počet CD11+ DC (xlO6) ± smerodajná odchýlka
CD8a-CD4- 0,81 ±0,15 0,49 ± 0,07 0,26 ± 0,04 0,35 ±0,05
CD8a+CD4- 0,36 ± 0,02 0,35 ±0,07 0,16 ±0,02 0,2 ± 0,02
CD8a-CD4+ 0,92 ± 0,02 0,84 ±0,15 0,4 ± 0,06 0,55 ±0,04
Tento pokles slezinných DC, čo sú kritické bunky prezentujúce antigén, má vplyv na aktiváciu B lymfocytov, ich zrenie a celkovú humorálnu imunitu.
Zmrazené rezy zo sleziny myší sa pripravili, ako bolo opísané v časti Materiál a metódy. Myši liečené BCMA-Ig mali atypický profil usadzovania DC, keď boli vzorky zafarbené anti- CDllc. DC sú normálne lokalizované vnútri oblasti T lymfocytov v bielej dreni a v marginálnej zóne, s tým, že k ich koncentrácii do15 chádza v mostíkových kanálikoch marginálnej zóny. Ale bolo zistené, že DC z myší liečených BCMA-Ig sa vyskytujú pozdĺž obvodu marginálnej zóny a len niekoľko málo ich bolo schopných migrovať hlbšie do bielej drene (dáta nie sú uvedené). Teda sa zdá, že blokovanie interakcie BAFF/BAFF-R použitím rozpustného receptora BAFF interferuje s profilom osídľovania DC, čo zrejme ovplyvňuje ich schopnosť fúngovať ako bunky prezentujúce antigén a teda má vplyv na aktiváciu a zrenie B lymfocytov a tiež na humorálnu imunitu.
Navyše slezinám myší liečených BCMA-Ig chýbajú CD35+ FDC, ako sa zistilo imuno-histochemickou analýzou (dáta neuvedené). Pretože fúnkciou FDC je prezentovať antigén B lymfocytom v germinálnych centrách (QC), nedostatok týchto buniek môže mať škodlivý účinok na štruktúru GC a afinitné zrenie B lymfocytov.
Odborníkovi je jasné, že sú možné rôzne modifikácie a varianty polypeptidov, kompozícií a spôsobov podľa vynálezu, ale v rámci /hodnej vynálezcovskej myšlienky predloženého vynálezu aj tieto prípadné modifikácie a varianty spadajú do rozsahu vynálezu, ktorý je definovaný pripojenými patentovými nárokmi a ich ekvivalentmi.
S K 288603 B6 o'znaxa s e k ve n c í i
<uo> K;ä eXšy, Fab i enn S Srowning« Jeŕfrey Áinhrose, Chrlstlne Tsehepp, Jnrg Sehneidex', Pascal Thompson ,· Je f ť rov 8iegen, Xne. Äpotech R&n S.A-
<120»
<130» ÄQ80PCT
<14 0» < i 41 > PCT/LGO0/22507 2000-08-16
<150» <151» SO/148,378 1933-08-1'?
<150» <151> SO/181,684 2000-02-11
<X50> <1.51> 00/183,53 6 2000-02-18
<160 > 8
<17O> FastSEQ for WinäPws
<210> <211» <212» <213» X 8 4 PAT How sapíefts
<400> 1
Met Leu Gin Met Ale Gly Gin Cys Ser Gin Äsn GXu λ y x 90.::: A.tp Ser
1 5 J Q 15
Leu Leu M s Ale ····.,' ··· Íle Pre Gys Gin Leu Arg Gys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro P-ro hen Tht Gys 0 Λ Π Ary Tvr Gys Asn Alt Ser Val Thr Asp Sat
3 5 40 4 02 :.1>
Vsi Lys Gly Tht Asn Ala Tie Leu Trp Tht Gys Len Gi y Leví Set Leu
50 55 60
íle lis Ser Len Ale Val Phe Leu Met Fhe Leu Leu Arg Lys Íle
65 70 76 80
Ser Ser Gin 8ró Leu Lys &äp Glu Phe Lys Asn Th:r Gly Set Gly Leu
85 90 9 S
S K 288603 B6
Lee G i y list Ala 100 Asn 11 s Asp Leu Clu Lys Sar Arg Thr Gly As'p Glu
105 110
XXč Uč Leu Pxo Äŕg Gly Leu SI o Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Gle Asn Cys lis Lys Set Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp Hl s Cys Phe
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr 11a Lea Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys L y s Ser Osu Pro Ala Ala hr: Sať Ala Thr Clu
165 170 175
Íle Gl u Lys Ser lis Sssr Ala Aru
ISO <2ia> 2 <211 > 552 <21.2 > DNA <213 > herne· š-apien <400> 2 afcgfctgcaa'®· tggctgggca gtgetceeaa asätgaafcatt ttgacagttt gttgcapgcfe 60 tgcatacctfe gtcaacttcg atgttcfcTct aafcacfceetc ctcfcaacafcg hesggttatt 120 gfcaatgcaag cgtgaccaat fccagtgaaag gsaegaafegc gafc.fect.ctgg acctgttfcgg
180 gactgaacct aataatttc-t ttggcagbtt bcgbgotaat gttbttgcta aggaagafc&a 240 gctccgaacc abtaaacg&c gagfcutaaaa aeacaggatc aggtctcc.tg ggcabggcfca 300 ae&ttg&cet ggaaaagagc aggactggfeg atgaa&ttat tctecgagag gcctcgagta 360 cacaqtggaA gaatOdsect gfegaaesetc catcaacagc aaaccgaagg tcgacbctga. 420 ccatbgctbb ccactcccag ctatggagga aggcgcá&cč attctgtéac casgaaaacg 480 aatcactatt ucaagagcct gccagctgct ttgagtgcca cggagafcaga gaastcaaet 540' tcbgcb&ágb »&
552 <210> 3 <211> 207 <2Í2> PRT <213> horne sapien <400> 3
Met Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Gly Met Leu Gin :4e t Ala Gly Glxi. Gy s Ser Clu Asn Glu Tyr Phe
20 15 30
A. s p Sex- Len Asp Val Thr Met Leu Gin het Ala Gly G Ír: Cys Sér Gin
S K 288603 B6
35 40 45
Asn Glu Tyr ?he Asp G e r Len Leu Kle Ale Cy a 21a Pre cys Gin Leu
50 5 5 60
Arg Cye Ker Ser Asn Thr Or o Pre Leu Thr C v y Leu His Ala Gys íle
65 70 75 88
Pre Cys Gin Leu Arg Cys Ser Ser A s; u Thr P rc- Pre Len Thr Cys Gin
85 30 35
Arg Tyr Cys Asn Ala Ker Val Thr As© Ser Val Lyr Gly G it Arg Tyr
100 105 210
Cys Asn. Ala Per Val Thr Asr Ser Val Lys Gly Val ÄSP Lys Tfcr His
115 120 125
Thr Cys Pre Pre Cys Pre Ala Pre- Glu i-au Leu Giy Gly Pre Ser Val
13Q 135 148
Phe Leu Phe Pre Pre Lys ?ro Lys Asp Thr Leu Mefc 2 la Ser Arg Thr
145 150 155 150
P rc- Giu Val Thr Cys Val Val Val A© P Val Ser Kla Gin Asp Pro G1 u
165 170 175
Val Lys Ph© As© Trp Tyr Val Äsp Gly Val Gl« Val His Á s© Ala Lya
iso 185 130
Thr Lys Pre Arg δΐύ. Glu G1 n Tyr As© Sér Tyr Val Val Ser Val
195 200 2Q5
<210» 4 <211> 540 <212» DNA <213» ho-m©· s&plea <400» 4 atggagacag acacactcct gfctafcgggfcg ctgctgctefc eggfcfcccsgg fcfcccacfcggt e ô gacgtcacga tgfctgcagat ggcfcgggcag fcgcfccccaaa afcgaafcatfcfc fcgacagtfctg
120 ttgcafcigcfcfe gcat&ccfcfcg fccaacfcfccga tgfcfccfcfceta. atacfccctee tctaa-cafcgt ISO cagcattafcfc gtaatgca&g fcgtgaccaafc fecagtgaaag gagfcegacaa aacfccaeaea 240 fcgcccaccgfc gcccagcacc tgaacfcccfcg gggggaccgt cagfccfcfcccfc ctfccccccca
380 aaacccaagg acae'cctcafc gafccfccccgg acceetgagg tcaeô-fcgcgfc ggfcggfcgga-c 360 gfcgagccacg aagaccctga ggfccaagtfcc aactggtacg fcggacggcgfc ggaggfcgcafc
420 aatgccaaga caaagecgcg ggaggagcag fcacaacagca ©g-taccgfcgfc ggteagcgfcc 40 p ctcacccfccc tscäôôacŕija cfc-ggctgaáfc ggeaaggagt äc&ágfcgcaá ggtefeccaac
G <220» 5 <211» 140 <212» PS’T <213» h<sno sap^an
S K 288603 B6 <40'C> 5
L au Thr Val LšU ši s Gin Asp Trp Leu Asr. Gly Lys Gin Tyr Lys Cys
1 5 10 15
Lys val šer Äpn Lys Ala Leu Šro Ala Pro Íle Gla Lys Thr Tie Ser
20 25 30
Lys Ala Lys Gl?/ G X n Pre Arg Glu Pre Gin Val Tyr Thr Leu Pre Pre
3 5 40 45
Sér Arg Asp Glu Lee Tbr lys Asn Gin Val šer Lán Thr Cys Leu Val
50 55 60
lys Sly P.h~ Tvr Pro šer Asp Íle Ala Val Glu Trp Glu šer Asn Gly
85 70 75 80
Gin Šro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr P.CO P ro Val Lea Asp šer Asp
85 30 35
Gly šer Pha Šhe Lys Lys Leu Thr Val Asp lys Ser Arg Triu Gin Gin
100 105 110
Gly Asn Vžil Phe Šer Cys šer Val Met Hla Gla Ala Lea KÍ s Asn Kí s
115 120 125
Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu. Ser Pro Gly Lys
130 13 5 140
<21δ> δ <2I1> 369 <2I2> DNA <213> homo saníen <400> 6 aaagceetcc eageeeecat egagaaaace atcteeaaag ccaaagggca geceegagaa 60 ecaeaggtgt acacectgce ceeareeépg gatgagefcga ccaagaacca ggteageetg 120 acctgccfcga tcaaaggctt ctAfccecagč gacafcogccg- fcgg&gtggga gaefcagtgwg ISO cagccggaga acaagtacaa gaeeaegect eccgfcgtfegg aetccgaegg etcettctfce j ,4 Λ £ 'i V cfcctacagca agcteaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt •cfcfcotcatgo
300 fcccgtcfatgč atgaggccct gčacaaccac feacaegc&ga aqaejcčfcctc' cďcgtofcccc 360 gggaaafcga
369 <210> 7 <2.U> 184 <212 > P2T <213 > bom sapien <400> 7
Met Leu Gin Met Ala Gly Gin Cvs Ser Gin Asn Glu Tyr Pbe Asp Ser 1 5 10 15
Leu Leu Kí s A la Cvs íle Pro Gys gin Leu Arg Cys Šer Ser Äsn ’Thr
S K 288603 B6
20 25 30
Fro Ftc Leu Tht Cys Glu Atg 'Ty c Cys Aga Ala Set Val Tht ASU Set
35 40 43
Val Lys Gly Tht Asn Ala 1 1 e Leu Trp Tht Cys Leu Gly Leu Set Leu
50 55 60
Íle Íle Set Leu Ala Val The Val Leu MeC Phe Leu Leu Arg Lys Íle
65 70 73 SO
Set Set Glu Pre Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Tht Gly Set Gly Leu
83 90 95
Leu Gly Met Ala Aeu lis Asp Leu Glu Lys Set Arg Tht Gly Asp Glu
100 105 110
Íle Íle Leu Fto Atg Gly Leu 81 u Ty t Tht Val Glu Glu Cys Tht Cys
115 120 125
Glu Asp Cyss Íle Lys Set by s Pre Lye Val Asp Set Asp SI a Cys Phe
130 133 14 0
Pro Leu Pre Ala Met Glu Glu Gly Ala Tht íle .Leji Val Tht Tht Lys
145 150 155 150
Tht Asm ASp -ryt Gys Lys Set Leu Oto Ala Ala Leu Set Ale Tht Glu
163 170 175
íle Glu Lye Ser Íle Set Ala Atg
ISO
<210> 8 <211> 995 <212> DNA <2.1.3 > Bomo Sapleu <400> 8 aagecteaau ctfcagäaaefc tgaatfc.agat gfc.ggc.atc.CiS aatccfctaqq fcgocgcgaag60 acacagaeag ceccCgtaag aaeocaegaa gcaggcgaag fcfccafctgfctc tcaucattet 120 agctgctGtt gcfcgc&ttfcg cfcetggaafct cttgtagaga tattactfcgt ccfctecagge iso tgfctctttct gtagcfccccfc tgfctfcfccfcfct fctgfcgafccat gtfcgcagatg gcfcgggcagt
240 ctcfcceca&aa. taaatattfct cacag'fcttgfc tgcafcccfcfcg catac'cfctgt caacttcgafc 300 gttcttc'taa t a »t c e fc t e taaca tg t. .c agc g c ta c r.g ta a tgcaag t g t g a c c a a t fe 3 SO cagtgaaagg aacgaatgcg attefcctgga cctgcttggg actgagetca ac.aattcctc 42 0 tg-acaghfctfc. ogfcgcfcaatg tttttgctaa ggaagataag ctctgaačca tLaaaggaeo 48Ô agttt&aa&a cacagg&tca ggtctcctgg gcatggctaa cattgaccfeg gaaaagagca 5 40 qgactg^fcga fc.ga.aafctafct cttccgagag gcetcgagta cacggfcggaa gaatgcacčť sôo gtgaagactg c&tcaag&gc aaaccg&agg fccgactstga cc&ttgctfet -ccaetceeag
Šsô ctatggággá aggcgcaaec attcc.tgc.ee ecacgaaaac gaatgaccat tgcaagagcc 720 tgccagctgc tttgagtgct acggagafcag agaaatcaat fctctgctagg taattaacca 780 ttfccgattcg agcagtgcca cfcttaaaaat ctttCgtcag aa.fcagatgat gcgtcagatc 840 ccfcfctagqat gactctattt ctcagc.tgcc q&tacagctt ttcqtcccct aactgcgg&a 900 actcttcacg tc&gatafcat ctctctaggc tacfcgttggg agcttaatgg fcagaaacttc 960 cfctgg'tttca fcgattaaagt ctt.tfcťttfct cctga

Claims (14)

  1. S K 288603 B6
    PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Polypeptid (a) obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň 80 % identická so sekvenciou znázornenou od aminokyseliny 1 po aminokyselinu 51 sekvencie SEQ ID NO: 1; alebo (b) polypeptid obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň 80 % identická so sekvenciou znázornenou od aminokyseliny 8 po aminokyselinu 41 sekvencie SEQ ID NO: 1; alebo (c) protilátka namierená proti polypeptidu obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu znázornenú od aminokyseliny 1 po aminokyselinu 51 sekvencie SEQ ID NO: 1, pričom protilátkou je antagonistickámonoklonálna protilátka na použitie ako liečivo.
  2. 2. Polypeptid obsahujúce a) aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň 80 % identická so sekvenciou znázornenou od aminokyseliny 1 po aminokyselinu 51 sekvencie SEQ ID NO: 1; alebo (b) aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň 80 % identická so sekvenciou znázornenou od aminokyseliny 8 po aminokyselinu 41 sekvencie SEQ ID NO: 1, na použitie na liečenie autoimunitného ochorenia, B lymfocytových lymfoproliferatívnych ochorení alebo zápalu u cicavcov, pričom polypeptid má menej ako 1 % transmembránovej domény a cytoplazmatickej domény.
  3. 3. Polypeptid obsahujúce a) aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň 80 % identická so sekvenciou znázornenou od aminokyseliny 1 po aminokyselinu 51 sekvencie SEQIDNO: 1; alebo (b) aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň 80 % identická so sekvenciou znázornenou od aminokyseliny 8 po aminokyselinu 41 sekvencie SEQ ID NO: 1, na použitie na liečenie autoimunitného ochorenia, B lymfocytových lymfoproliferatívnych ochorení alebo zápalu u cicavcov, pričom polypeptid je rozpustný.
  4. 4. Polypeptid na použitie podľa nárokov 2 alebo 3, pričom polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň 90 % identická so sekvenciou od aminokyseliny 1 po aminokyselinu 51 sekvencie SEQID NO:1, alebo pričom polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň 90 % identická so sekvenciou od aminokyseliny 8 po aminokyselinu 41 sekvencie SEQ ID NO:1.
  5. 5. Polypeptid na použitie podľa nároku 4, pričom polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 1 po aminokyselinu 51 sekvencie SEQ ID NO: 1, alebo pričom polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 8 po aminokyselinu 41 sekvencie SEQ ID NO: 1.
  6. 6. Polypeptid na použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 5, pričom polypeptid ďalej obsahuje Fc doménu imunoglobulínu.
  7. 7. Polypeptid na použitie podľa nároku 6, pričom imunoglobulínom je IgG.
  8. 8. Polypeptid na použitie podľanároku 7, pričom imunoglobulín má ľudskýpôvod.
  9. 9. Polypeptid na použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 8, pričom polypeptid inhibuje rast B lymfocytov u cicavcov.
  10. 10. Polypeptid na použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 8, pričom polypeptid inhibuje produkciu imunoglobulínu u cicavcov.
  11. 11. Polypeptid na použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 8, pričom polypeptid inhibuje rast B-lymfocytov indukovaných dendritickými bunkami u cicavcov.
  12. 12. Polypeptid na použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 11, pričom cicavcom je človek.
  13. 13. Protilátka, ktorá sa špecificky viaže na polypeptid obsahujúce aminokyselnovú sekvenciu znázornenú od aminokyseliny 1 po aminokyselinu 51 sekvencie SEQ ID NO:1, pričom protilátkou je antagonistická monoklonálna protilátka na použitie v liečení autoimunitného ochorenia, B lymfocytových lymfoproliferatívnych ochorení alebo zápalu u cicavca.
  14. 14. Protilátka na použitie podľanároku 13, pričom cicavcom je človek.
    19 výkresov
SK50017-2015A 1999-08-17 2000-08-16 Polypeptid a protilátka viažuca sa na polypeptid SK288603B6 (sk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14937899P 1999-08-17 1999-08-17
US18168400P 2000-02-11 2000-02-11
US18353600P 2000-02-18 2000-02-18
PCT/US2000/022507 WO2001012812A2 (en) 1999-08-17 2000-08-16 Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK500172015A3 SK500172015A3 (sk) 2002-07-02
SK288603B6 true SK288603B6 (sk) 2018-10-01

Family

ID=27386828

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK50017-2015A SK288603B6 (sk) 1999-08-17 2000-08-16 Polypeptid a protilátka viažuca sa na polypeptid
SK229-2002A SK288287B6 (sk) 1999-08-17 2000-08-16 Protilátka proti sekvencii SEQ ID No: 1 alebo polypeptid s jej obsahom a ich použitie

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK229-2002A SK288287B6 (sk) 1999-08-17 2000-08-16 Protilátka proti sekvencii SEQ ID No: 1 alebo polypeptid s jej obsahom a ich použitie

Country Status (29)

Country Link
US (7) US7691804B2 (sk)
EP (3) EP2314694A3 (sk)
JP (4) JP4787439B2 (sk)
KR (2) KR20090016772A (sk)
CN (1) CN100447244C (sk)
AT (1) ATE360693T1 (sk)
AU (1) AU780240B2 (sk)
BG (1) BG106519A (sk)
BR (2) BRPI0013391B8 (sk)
CA (1) CA2383154C (sk)
CZ (1) CZ300364B6 (sk)
DE (1) DE60034579T3 (sk)
DK (1) DK1210425T4 (sk)
EA (1) EA004635B1 (sk)
EE (1) EE05673B1 (sk)
GE (1) GEP20053685B (sk)
HK (1) HK1043608B (sk)
HU (3) HU227008B1 (sk)
IL (3) IL148089A0 (sk)
IS (1) IS2955B (sk)
MX (1) MXPA02001665A (sk)
NO (2) NO331410B1 (sk)
NZ (1) NZ517782A (sk)
PL (2) PL207501B1 (sk)
RS (1) RS51157B (sk)
SK (2) SK288603B6 (sk)
TR (1) TR200201063T2 (sk)
UA (1) UA75049C2 (sk)
WO (1) WO2001012812A2 (sk)

Families Citing this family (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) * 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6812327B1 (en) * 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
WO2001060397A1 (en) * 2000-02-16 2001-08-23 Genentech, Inc. Uses of agonists and antagonists to modulate activity of tnf-related molecules
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
WO2000068378A1 (en) 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
IL148089A0 (en) 1999-08-17 2002-09-12 Biogen Inc Baff receptor (bcma), an immunorgulatory agent
UA74798C2 (uk) * 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US7371388B1 (en) * 2000-05-04 2008-05-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of Sjogren's syndrome by administration of TR18 polypeptides
AU2001261557B2 (en) * 2000-05-12 2005-06-30 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
WO2002002641A1 (en) 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7879328B2 (en) * 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
AU2001288301A1 (en) 2000-08-18 2002-03-04 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
ATE542545T1 (de) 2001-05-24 2012-02-15 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin-fusionsproteine
US20050070689A1 (en) * 2001-08-03 2005-03-31 Genentech, Inc. Taci and br3 polypeptides and uses thereof
US20080267965A1 (en) * 2002-02-21 2008-10-30 Kalled Susan L Use of Bcma as an Immunoregulatory Agent
MXPA05000940A (es) * 2002-07-25 2005-05-16 Genentech Inc Anticuerpos taci y su uso.
NZ543174A (en) * 2003-03-28 2008-09-26 Biogen Idec Inc Truncated BAFF receptors
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
ES2537738T3 (es) * 2003-06-05 2015-06-11 Genentech, Inc. Terapia de combinación para trastornos de células B
RU2006117324A (ru) 2003-10-20 2007-12-10 Байоджен Айдек Ма Инк. (Us) Терапевтические режимы для антагонистов baff
AU2004315198A1 (en) * 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of BCMA and uses thereof
CA2585927A1 (en) * 2004-11-04 2006-05-18 Genentech, Inc. Polypeptides that bind baff and/or april
JP2008525002A (ja) * 2004-12-23 2008-07-17 ラボラトワール セローノ ソシエテ アノニム Ｂｃｍａポリペプチド及びその使用
WO2006081516A2 (en) * 2005-01-28 2006-08-03 Biogen Idec Ma Inc. USE OF BAFF TO TREAT Th2-MEDIATED CONDITIONS
WO2007019573A2 (en) 2005-08-09 2007-02-15 Zymogenetics, Inc. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using taci-fusion molecules
EA016083B1 (ru) 2005-08-09 2012-02-28 Займоджинетикс, Инк. СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НЕХОДЖКИНСКОЙ ЛИМФОМЫ С ПОМОЩЬЮ СЛИТОЙ МОЛЕКУЛЫ TACI-Ig
NZ568204A (en) * 2005-10-13 2012-01-12 Human Genome Sciences Inc Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive diseases
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
JP6088723B2 (ja) 2005-11-23 2017-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アッセイに関する組成物及び方法。
US8211649B2 (en) 2006-03-31 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma
CN101489573B (zh) 2006-05-15 2013-05-22 阿雷斯贸易股份有限公司 用TACI-Ig融合分子治疗自身免疫疾病的方法
MX2011000616A (es) * 2008-07-17 2011-02-24 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos terapeuticos.
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
WO2010093993A2 (en) * 2009-02-12 2010-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Use of b lymphocyte stimulator protein antagonists to promote transplantation tolerance
PL2406284T3 (pl) 2009-03-10 2017-09-29 Biogen Ma Inc. Przeciwciała anty-bcma
WO2011028945A1 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Genentech, Inc. Methods for treating, diagnosing, and monitoring rheumatoid arthritis
CN101781679B (zh) * 2009-10-19 2012-05-23 南通大学附属医院 人baff-r基因启动子活性的测定方法
CN101781680B (zh) * 2009-10-19 2012-05-09 南通大学附属医院 测定对人baff-r基因启动子活性影响因素的方法
WO2011108008A2 (en) * 2010-03-04 2011-09-09 Transgene Biotek Ltd. Antibody for targeted induction of apoptosis, cdc and adcc mediated killing of cancer cells, tbl-cln1
BR112013021725A2 (pt) 2011-02-28 2016-11-01 Genentech Inc marcadores biológicos e métodos para prever resposta aos antagonistas de células b
PT3415531T (pt) * 2011-05-27 2023-09-12 Glaxo Group Ltd Proteínas de ligação a bcma (cd269/tnfrsf17
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
EP2809684A1 (en) 2012-01-31 2014-12-10 Genentech, Inc. Anti-ig-e m1' antibodies and methods using same
US10435474B2 (en) 2013-12-24 2019-10-08 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
BR112016018100A2 (pt) 2014-02-07 2018-02-20 Univ Mcmaster acoplador antigênico de células t trifuncional, métodos e usos do mesmo
JP2017513818A (ja) 2014-03-15 2017-06-01 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
MX2017001011A (es) 2014-07-21 2018-05-28 Novartis Ag Tratamiento de cancer de usando un receptor quimerico de antigeno anti-bcma.
AU2015317608B2 (en) 2014-09-17 2021-03-11 Novartis Ag Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
JP6892822B2 (ja) * 2014-12-05 2021-06-23 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター Ｂ細胞成熟化抗原を標的化する抗体および使用の方法
CN113698497A (zh) 2014-12-05 2021-11-26 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向b-细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其用途
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
SG10201912823PA (en) * 2015-04-13 2020-02-27 Pfizer Therapeutic antibodies and their uses
US10294304B2 (en) 2015-04-13 2019-05-21 Pfizer Inc. Chimeric antigen receptors targeting B-cell maturation antigen
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
WO2017027392A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
LT3380620T (lt) 2015-11-23 2024-09-10 Novartis Ag Optimizuoti lentivirusiniai pernešimo vektoriai ir jų panaudojimas
EP4219689A3 (en) 2015-12-30 2023-12-20 Novartis AG Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
IL311107A (en) 2016-02-17 2024-04-01 Seagen Inc BCMA antibodies and their use for the treatment of cancer and immune disorders
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
US11136405B2 (en) * 2016-06-06 2021-10-05 Board Of Regents, The Unviersity Of Texas System BAFF-R antibodies and uses thereof
EP3471773A4 (en) 2016-06-21 2020-07-08 Teneobio, Inc. ANTIBODIES BINDING CD3
PT4050034T (pt) 2016-09-14 2024-05-27 Teneoone Inc Anticorpos de ligação a cd3
WO2018111340A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Novartis Ag Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells
IL300729A (en) 2016-12-21 2023-04-01 Teneobio Inc Anti-BCMA antibodies containing only heavy chains
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
WO2018144535A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
BR112019023608A2 (pt) 2017-05-12 2020-05-26 Crispr Therapeutics Ag Materiais e métodos para células manipuladas e seus usos em imuno-oncologia
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
IL271194B2 (en) 2017-06-20 2024-10-01 Teneobio Inc Anti-BCMA antibodies containing only heavy chains
CN111278858B (zh) 2017-07-11 2024-07-23 指南针制药有限责任公司 结合人cd137的激动剂抗体及其用途
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
JP7227630B2 (ja) 2017-10-12 2023-02-22 マックマスター ユニバーシティー Ｙ１８２ｔ突然変異を有するｔ細胞－抗原カプラおよびその方法ならびに使用
EP3697436A1 (en) 2017-10-18 2020-08-26 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
US20210040205A1 (en) 2017-10-25 2021-02-11 Novartis Ag Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof
US11718679B2 (en) 2017-10-31 2023-08-08 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and PD-1 antagonists and uses thereof
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
CN111902159A (zh) 2017-11-01 2020-11-06 朱诺治疗学股份有限公司 对b细胞成熟抗原（bcma）具有特异性的嵌合抗原受体
WO2019089969A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
SG11202004512XA (en) 2017-11-15 2020-06-29 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
US11851497B2 (en) 2017-11-20 2023-12-26 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
RU2020121458A (ru) 2017-11-30 2021-12-30 Новартис Аг Химерный антигенный рецептор, нацеливающийся на bcma, и его пути применения
CN112218651A (zh) 2018-01-08 2021-01-12 诺华公司 用于与嵌合抗原受体疗法组合的免疫增强rna
WO2019152660A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
EP3752203A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Novartis AG Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20210396739A1 (en) 2018-05-01 2021-12-23 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
CN112105420A (zh) 2018-05-11 2020-12-18 克里斯珀医疗股份公司 用于治疗癌症的方法和组合物
US20210213063A1 (en) 2018-05-25 2021-07-15 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
CN112384531B (zh) 2018-06-01 2024-05-14 诺华股份有限公司 针对bcma的结合分子及其用途
EP3802825A1 (en) 2018-06-08 2021-04-14 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
SG11202011830SA (en) 2018-06-13 2020-12-30 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
DE202019005887U1 (de) 2018-07-03 2023-06-14 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
EP3844265A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
SG11202101825QA (en) 2018-08-31 2021-03-30 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
JP2022514315A (ja) 2018-12-20 2022-02-10 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与計画及び薬剤組み合わせ
JP7488826B2 (ja) 2019-02-15 2024-05-22 ノバルティス アーゲー 置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
JP7483732B2 (ja) 2019-02-15 2024-05-15 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソ－５－（ピペリジン－４－イル）イソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
CN113412127A (zh) 2019-02-25 2021-09-17 诺华股份有限公司 用于病毒递送的介孔二氧化硅颗粒组合物
US20230074800A1 (en) 2019-03-21 2023-03-09 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
WO2020210678A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20220251152A1 (en) 2019-04-24 2022-08-11 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
MX2021013359A (es) 2019-04-30 2022-01-31 Crispr Therapeutics Ag Terapia de celulas alogénicas de neoplasias malignas de células b usando células t modificadas genéticamente dirigidas a cd19.
MX2021015337A (es) 2019-06-14 2022-01-18 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecificos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3.
US20220257796A1 (en) 2019-07-02 2022-08-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Recombinant ad35 vectors and related gene therapy improvements
BR112022010206A2 (pt) 2019-11-26 2022-11-29 Novartis Ag Receptores de antígeno quiméricos e usos dos mesmos
CA3165399A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
JP2023515211A (ja) 2020-02-27 2023-04-12 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
BR112022017148A2 (pt) 2020-02-27 2022-11-08 Novartis Ag Métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico
PE20230431A1 (es) 2020-04-29 2023-03-08 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada multiespecificos con regiones constantes de cadena pesada modificadas
EP4165169A1 (en) 2020-06-11 2023-04-19 Novartis AG Zbtb32 inhibitors and uses thereof
US20230321067A1 (en) 2020-06-23 2023-10-12 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
JP2023536164A (ja) 2020-08-03 2023-08-23 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
JP2023537605A (ja) * 2020-08-12 2023-09-04 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー ｓＢＣＭＡバリアントおよびそのＦＣ融合タンパク質
EP4199960A2 (en) 2020-08-21 2023-06-28 Novartis AG Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AU2022255506A1 (en) 2021-04-08 2023-11-09 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof
EP4330381A1 (en) 2021-04-27 2024-03-06 Novartis AG Viral vector production system
CA3173810A1 (en) 2021-06-01 2022-12-01 Andreas Bader Claudin 18.2 t cell-antigen couplers and uses thereof
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
CA3228678A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Amato J. Giaccia Methods of reducing production of iga, igm and/or igg using sbcma variants and fc fusion proteins thereof
CN117858901A (zh) 2021-08-20 2024-04-09 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6541224B2 (en) * 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
WO1997033902A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor delta and epsilon
ATE302272T1 (de) 1996-10-25 2005-09-15 Human Genome Sciences Inc Neutrokin alpha
AU5705898A (en) 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) * 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
EP1717315A3 (en) 1997-04-16 2007-06-20 Amgen Inc. Osteoprotegerin binding proteins and receptors
AU7608898A (en) 1997-06-06 1998-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
AU743490B2 (en) 1997-06-06 2002-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. NTN-2 member of TNF ligand family
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
BR9812634A (pt) * 1997-09-12 2000-08-22 Biogen Inc April - uma proteìna com efeitos de crescimento
EA200000311A1 (ru) * 1997-09-12 2000-10-30 Апотек Р Энд Д Са Новый белок иммунной системы - кау
JP4357738B2 (ja) 1997-09-12 2009-11-04 アポテック エール エ デ− エス．アー． システインリッチなレセプターであるｔｒａｉｎ
AU2093499A (en) 1997-12-30 1999-07-19 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
US6297367B1 (en) * 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
DE69921718T2 (de) * 1998-04-01 2005-12-22 Solvay Solexis, Inc., Wilmington Verträgliche Mischungen aus Polyvinylidenfluorid und aromatischem Polyimid
WO2001060397A1 (en) † 2000-02-16 2001-08-23 Genentech, Inc. Uses of agonists and antagonists to modulate activity of tnf-related molecules
WO2000026244A2 (en) 1998-11-04 2000-05-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US7833529B1 (en) * 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
PT1642972E (pt) † 1999-01-07 2010-04-07 Zymogenetics Inc Utilizações terapêuticas de receptores solúveis br43x2
US20060067933A1 (en) * 1999-01-07 2006-03-30 Gross Jane A Soluble receptor BR43x2 and methods of using
DK1146892T3 (da) 1999-01-25 2003-11-24 Apoxis Sa BAFF, inhibitorer deraf og deres anvendelse i modulationen af B-celle responset
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
JP2002541779A (ja) 1999-02-24 2002-12-10 ザ ジュネラル ホスピタル コーポレーション シグナル伝達中間体のクローニング方法
AU3633000A (en) 1999-03-26 2000-10-16 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
WO2000068378A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
IL148089A0 (en) 1999-08-17 2002-09-12 Biogen Inc Baff receptor (bcma), an immunorgulatory agent
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
AU3495301A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Biogen Inc Heterologous polypeptide of the tnf family
US20040013674A1 (en) 2001-04-27 2004-01-22 Christine Ambrose Taci as an anti-tumor agent
AU2001261557B2 (en) 2000-05-12 2005-06-30 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
WO2002002641A1 (en) 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
EP1309718A4 (en) 2000-08-15 2004-08-25 Human Genome Sciences Inc NEUTROKINE-ALPHA AND NEUTROKINE-ALPHA SPLICE VARIANT
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
CA2467521A1 (en) 2001-11-16 2003-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
US20080267965A1 (en) 2002-02-21 2008-10-30 Kalled Susan L Use of Bcma as an Immunoregulatory Agent
US7083735B2 (en) 2003-09-03 2006-08-01 Laing David A High debris content strainer
PT3415531T (pt) 2011-05-27 2023-09-12 Glaxo Group Ltd Proteínas de ligação a bcma (cd269/tnfrsf17
FR3005792B1 (fr) 2013-05-16 2017-12-29 Parknplug Procede de gestion dynamique et previsionnel du rechargement electrique de batteries

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0203084A2 (en) 2002-12-28
NO20020789D0 (no) 2002-02-18
BRPI0013391B1 (pt) 2018-09-11
AU6911200A (en) 2001-03-13
US20120214687A1 (en) 2012-08-23
CN100447244C (zh) 2008-12-31
US20200095305A1 (en) 2020-03-26
US7691804B2 (en) 2010-04-06
US20100040627A1 (en) 2010-02-18
EP1806143A2 (en) 2007-07-11
JP2014037434A (ja) 2014-02-27
DE60034579T2 (de) 2008-01-31
DK1210425T4 (en) 2015-08-10
SK288287B6 (sk) 2015-07-01
JP2011063600A (ja) 2011-03-31
US20180273605A1 (en) 2018-09-27
HU227008B1 (en) 2010-04-28
WO2001012812A3 (en) 2001-09-07
HK1043608A1 (en) 2002-09-20
CN1379815A (zh) 2002-11-13
EP2314694A3 (en) 2013-12-11
EA004635B1 (ru) 2004-06-24
MXPA02001665A (es) 2003-07-14
US10494416B2 (en) 2019-12-03
NO20111232A1 (no) 2011-09-12
ATE360693T1 (de) 2007-05-15
KR20020084842A (ko) 2002-11-11
JP4787439B2 (ja) 2011-10-05
CZ2002579A3 (cs) 2002-05-15
US9650430B2 (en) 2017-05-16
UA75049C2 (uk) 2006-03-15
IL230961A (en) 2016-06-30
IL148089A0 (en) 2002-09-12
BR0013391A (pt) 2002-07-09
KR20090016772A (ko) 2009-02-17
WO2001012812A2 (en) 2001-02-22
DE60034579T3 (de) 2015-11-12
EP1210425B1 (en) 2007-04-25
TR200201063T2 (tr) 2002-10-21
DE60034579D1 (de) 2007-06-06
BG106519A (bg) 2003-04-30
JP5904985B2 (ja) 2016-04-20
IL230961A0 (en) 2014-03-31
SK2292002A3 (en) 2002-07-02
JP5379107B2 (ja) 2013-12-25
HU1000128D0 (en) 2010-05-28
CZ300364B6 (cs) 2009-04-29
EP2314694A2 (en) 2011-04-27
EE05673B1 (et) 2013-08-15
PL207501B1 (pl) 2010-12-31
SK500172015A3 (sk) 2002-07-02
IL148089A (en) 2015-03-31
RS51157B (sr) 2010-10-31
CA2383154A1 (en) 2001-02-22
JP2003507364A (ja) 2003-02-25
EA200200261A1 (ru) 2002-08-29
US7083785B2 (en) 2006-08-01
HU230583B1 (hu) 2017-02-28
BRPI0013391B8 (pt) 2021-05-25
HK1043608B (zh) 2007-12-07
NO20020789L (no) 2002-04-08
EE200200071A (et) 2003-04-15
EP1806143B1 (en) 2016-06-15
US20020165156A1 (en) 2002-11-07
GEP20053685B (en) 2005-12-12
EP1806143A3 (en) 2007-07-18
EP1210425B2 (en) 2015-06-17
DK1210425T3 (da) 2007-09-17
US8828669B2 (en) 2014-09-09
US20020172674A1 (en) 2002-11-21
IS6273A (is) 2002-02-15
NO331410B1 (no) 2011-12-19
CA2383154C (en) 2013-04-30
EP1210425A2 (en) 2002-06-05
PL354661A1 (en) 2004-02-09
PL211786B1 (pl) 2012-06-29
US20150139992A1 (en) 2015-05-21
NZ517782A (en) 2004-01-30
IS2955B (is) 2016-12-15
NO344346B1 (no) 2019-11-11
JP2011116790A (ja) 2011-06-16
HU227947B1 (en) 2012-06-28
AU780240B2 (en) 2005-03-10
KR100897082B1 (ko) 2009-05-14
YU10602A (sh) 2005-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10494416B2 (en) Methods of modulating immune responses using BCMA polypeptide
US7276241B2 (en) Methods of treating a tumor that expresses APRIL by administering BCMA
ZA200201201B (en) BAFF receptor (BCMA), an immunoregulatory agent.

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20200816