CN113412127A - 用于病毒递送的介孔二氧化硅颗粒组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明总体上涉及包含可被表面修饰的介孔二氧化硅颗粒的组合物在递送病毒载体中的用途。在一些实施例中,所述病毒载体用于转导T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR),以治疗患有疾病、例如与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年2月25日提交的美国序列号62/810,260的优先权,将所述美国申请的内容通过引用以其全文并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且所述序列表特此通过引用以其全文并入。所述ASCII副本创建于2020年2月20日,名为N2067-7161WO_SL.txt,大小为232,920字节。
技术领域
本发明总体上涉及介孔二氧化硅组合物在递送病毒载体或药物物质中的用途。在一些实施例中,病毒载体包括经工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列,以治疗患有疾病(例如,与肿瘤抗原的表达相关的疾病)的受试者。
背景技术
T细胞过继转移方案在许多治疗应用(例如癌症)中示出潜力,最近已批准CAR T细胞疗法用于B细胞恶性肿瘤的治疗。需要以局部方式递送病毒载体或药物物质,并寻找有效的制造方法。
发明内容
本文考虑的是一种组合物,所述组合物包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体。在一些实施例中,将病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,将病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面经修饰的。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐,任选地使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25接头。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是聚乙烯亚胺,其平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量。在一些实施例中,病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或慢病毒。在一些实施例中,所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在一些实施例中,所述核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、用于阻断抑制性分子的shRNA,或其中所述核苷酸序列包含用于诱导蛋白质表达的mRNA。在一些实施例中,核苷酸序列编码经工程改造以靶向肿瘤抗原的多肽。在一些实施例中,多肽靶向选自下组的肿瘤抗原,该组由以下组成:TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白(legumain)、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白(prostein)、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。在一些实施例中,蛋白质是CAR,其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域。在一些实施例中,信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。在一些实施例中,所述组合物还包含T细胞刺激化合物或肿瘤抗原。在一些实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上,并且其中T细胞刺激化合物是IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、来自共享抗原(例如TRP2、gp100、肿瘤细胞裂解物、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3 TCR)的肽或其组合。在一些实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体上。在其中组合物包含介孔二氧化硅颗粒的第二群体的一些实施例中,所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体上或缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体的表面上的脂质包膜上。在一些实施例中,组合物还包含细胞因子。在一些实施例中,细胞因子缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一或第二群体上。在一些实施例中,细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段,或其组合。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒包含直径2nm-50nm的孔。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的表面积是至少约100m2/g。在一些实施例中,组合物适合于注射使用。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。
本文还考虑了一种方法,所述方法包括:使T淋巴细胞与包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物接触;其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在一些实施例中,接触在体外进行。在一些实施例中,T淋巴细胞在与介孔二氧化硅颗粒的第一群体接触之前或之后被活化。在一些实施例中,病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,将病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面经修饰的。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐,任选地使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25接头。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面用聚乙烯亚胺修饰的,所述聚乙烯亚胺的平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量。在一些实施例中,病毒载体是慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。在一些实施例中,核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中,将CAR工程改造以靶向肿瘤抗原。在一些实施例中,通过使T淋巴细胞与T细胞刺激化合物或肿瘤抗原接触来活化T淋巴细胞。在一些实施例中,所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上。在一些实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体上。在一些实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体上或直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体的表面上的脂质包膜上。在一些实施例中,方法还包括使T淋巴细胞与细胞因子接触。在一些实施例中,细胞因子在介质中或缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一或第二群体上。在一些实施例中,细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段,或其组合。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。
本文还考虑了一种利用重组多核苷酸体内遗传转导T淋巴细胞的方法,所述方法包括:向具有一种或多种T淋巴细胞的受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物;其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列,并且其中当所述组合物接触一种或多种T淋巴细胞时,所述T淋巴细胞被所述重组多核苷酸遗传转导。在一些实施例中,病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,将病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面经修饰的。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐,任选地使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25接头。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面用聚乙烯亚胺修饰的,所述聚乙烯亚胺的平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量。在一些实施例中,病毒载体是慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。在一些实施例中,核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中,将CAR工程改造以靶向肿瘤抗原。在一些实施例中,所述组合物还包含缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上的T细胞刺激化合物或肿瘤抗原。在一些实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体上。在一些实施例中,所述组合物包含介孔二氧化硅颗粒的第二群体,并且其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体上或直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体的表面上的脂质包膜上。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的所述第一或第二群体还包含缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一或第二群体上的细胞因子。在一些实施例中,细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段,或其组合。在一些实施例中,受试者的T淋巴细胞在体内扩增。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。
本文还考虑了一种体外扩增T淋巴细胞群体的方法,所述方法包括(a)使所述T淋巴细胞群体与包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物接触以提供转导的T淋巴细胞群体;并且(b)使所述转导的T淋巴细胞群体与T细胞刺激化合物或肿瘤抗原以及任选的细胞因子接触;其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在一些实施例中,病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,将病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面经修饰的。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐,任选地使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25接头。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面用聚乙烯亚胺修饰的,所述聚乙烯亚胺的平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量。在一些实施例中,病毒载体是慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。在一些实施例中,核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中,将CAR工程改造以靶向肿瘤抗原。在一些实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上,并且其中T细胞刺激化合物或肿瘤抗原是IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3 TCR,或其组合。在一些实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体上。在包含介孔二氧化硅颗粒的第二群体的一些实施例中,所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体上或缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体的表面上的脂质包膜上。在一些实施例中,所述方法还包括:(c)使T淋巴细胞与细胞因子接触;其中所述细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段,或其组合。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。
本文还考虑了一种治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的受试者的方法,所述方法包括:向所述受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物,其中所述病毒载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含表达控制序列,所述表达控制序列与编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列可操作地连接,所述嵌合抗原受体被工程改造以靶向所述肿瘤抗原,从而治疗所述受试者。在一些实施例中,病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,将病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面经修饰的。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐,任选地使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25接头。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面用聚乙烯亚胺修饰的,所述聚乙烯亚胺的平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量。在某些实施方案中,病毒载体是慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。在一些实施例中,所述组合物还包含缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上的T细胞刺激化合物或肿瘤抗原。在一些实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体上。在其中组合物包含介孔二氧化硅颗粒的第二群体的一些实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体上或直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体的表面上的脂质包膜上,并且T细胞刺激化合物或肿瘤抗原是IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR,或其组合。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的所述第一或第二群体还包含缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一或第二群体上的细胞因子。在一些实施例中,细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段,或其组合。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。
本文还考虑了一种将病毒载体递送至受试者中所需的作用位点的方法,所述方法包括向所述受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物。在一些实施例中,病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,将病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面经修饰的。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是C1-20烷基胺、C1-20羧酸、C1-20叠氮化物和取代或未取代的C1-20烷基。在一些实施例中,在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施例中,病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或慢病毒。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体包含直径2nm-50nm的孔。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体的表面积是至少约100m2/g。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。
本文还考虑了一种扩增嵌合抗原受体(CAR)T(CAR-T)细胞群体的方法,所述方法包括使所述CAR-T细胞群体与缀合至靶向部分的介孔二氧化硅颗粒接触,其中所述靶向部分与所述CAR互补。在一些实施例中,CAR是经工程改造以靶向肿瘤抗原的蛋白质。在一些实施例中,肿瘤抗原选自由以下组成的组:TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。
本文还考虑了包含与聚乙烯亚胺缀合的介孔二氧化硅颗粒的组合物。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。在一些实施例中,组合物还包含活性剂。在一些实施例中,活性剂被吸收或吸附在介孔二氧化硅颗粒上。
本文还考虑了一种将活性剂递送至受试者中所需的作用位点的方法,所述方法包括向所述受试者施用包含缀合至聚乙烯亚胺的介孔二氧化硅颗粒并且还包含活性剂的组合物。在一些实施例中,活性剂被吸收或吸附在介孔二氧化硅颗粒上。在一些实施例中,组合物提供了活性剂向受试者的持续递送。
本文还考虑了一种治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法,所述方法包括:向所述受试者施用包含与聚乙烯亚胺缀合的介孔二氧化硅颗粒并且还包含活性剂的组合物。在一些实施例中,活性剂被吸收或吸附在介孔二氧化硅颗粒上。在一些实施例中,所述疾病、障碍或病症与肿瘤抗原相关。
本文还考虑了包含缀合至聚乙烯亚胺的介孔二氧化硅颗粒并且还包含活性剂的组合物,所述组合物用于治疗患有疾病、障碍、或病症的受试者的方法。在一些实施例中,活性剂被吸收或吸附在介孔二氧化硅颗粒上。在一些实施例中,所述疾病、障碍或病症与肿瘤抗原相关。本文还考虑了包含如本文所述制造的细胞的组合物,所述组合物用于在治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法中使用。在一些实施例中,所述疾病、障碍或病症与肿瘤抗原相关。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本在请求并支付了必要费用后由专利局提供。
图1显示介孔二氧化硅颗粒上的一系列表面修饰。
图2显示将病毒包膜蛋白(VSV-G)假型慢病毒吸附到MSR上后,MSR表面上的VSV-G染色的结果。对照MSR显示在上图,并且病毒孵育的棒显示在下图。
图3是MSR上的病毒吸附和T细胞转导的示意图。
图4提供与游离慢病毒或结合MSR的慢病毒孵育的T细胞的GFP表达结果。如图所示,从40μg/ml的起始浓度开始稀释病毒包被的MSR。“1x慢病毒”条件等同于用MSR条件孵育的病毒数量。“2x慢病毒”条件等同于用于包被MSR条件的数量的两倍。
图5提供MSR表面上配体呈递的总体策略的示意图。将脂质体与MSR一起孵育以形成支撑的脂质双层。可以使用链霉亲和素-生物素相互作用将配体偶联至MSR-脂质双层。
图6示出用POPC脂质体包被的MSR的图片,所述POPC脂质体含有1mol%PE-羧基荧光素。亮场(左)、荧光(中)、和重叠(右)图像被示出。
图7描述EGFRvIII CAR结合肽的肽序列(LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO:674))。
图8说明通过肽固定在MSR上,EGFRvIII CART的细胞因子产生。结果提供与对照条件相比,由呈递EGFRvIII CAR结合肽的、脂质包被的MSR(脂质包被中有1%PE-生物素)刺激的EGFRvIII CART的干扰素-γ和白介素2的产生。
图9说明通过肽固定在MSR上,EGFRvIII CART的增殖。将0.01%PE-生物素的脂质包被的MSR组合物用于肽固定,并且孔中的MSR浓度为30μg/ml。在指示条件下培养的第7天进行细胞计数。
图10A和10B说明通过肽固定在MSR上,EGFRvIII CART的增殖和最终细胞组合物。起始MSR浓度为50μg/ml,并且从所述起始浓度开始的MSR的稀释度如轴所示。图10A:在培养期结束时,在所示材料情况下的CD4和CD8 T细胞的百分比。图10B:在3天的培养期内,使用具有不同量的EGFRvIII CAR结合肽的MSR(在MSR表面上带有或不带有抗CD28),对稀释CFSE的CD8+和CD4+CAR T细胞的FACS分析。
图11A和11B说明通过BCMA蛋白固定在MSR上,BCMA CART的增殖和最终细胞组合物。起始MSR浓度为50μg/ml,并且从所述起始浓度开始的MSR的稀释度如轴所示。图11A:在培养期结束时,在所示材料情况下的CD4和CD8 T细胞的百分比。图11B:在3天的培养期内,使用具有不同量的EGFRvIII CAR结合肽的MSR(在MSR表面上带有或不带有抗CD28),对稀释CFSE的CD8+和CD4+CAR T细胞的FACS分析。
图12显示根据一些实施例的使用MSR同时刺激和转导未刺激的人T细胞的示意图。创建两个MSR群体-1)呈递激动性CD3/CD28抗体来用于刺激T细胞的MSR,2)带正电的PEI-MSR,其已与慢病毒结合来促进向T细胞的病毒递送。可以将两种类型的MSR以不同的比例混合在一起,以调整刺激和T细胞所暴露的病毒的数量。
图13说明暴露于刺激性(固定抗CD3/CD28抗体的MSR)和与病毒一起孵育的PEI-MSR的T细胞的转导效率。T细胞与不同数量的刺激棒一起孵育(刺激1.00代表70μg/mlMSR),并以不同感染复数(MOI)(与PEI-MSR结合或呈游离病毒形式)暴露于GFP-慢病毒。在病毒条件下,MSR的最高浓度为22μg/ml。
图14说明暴露于刺激性(固定抗CD3/CD28抗体的)MSR和与病毒一起孵育的PEI-MSR的T细胞的转导效率。图示出在各种病毒总量下,作为刺激性MSR浓度的函数的转导效率。刺激性MSR条件1.0的MSR浓度为70μg/ml。PEI MSR条件1中的MSR浓度为22μg/ml。在培养开始后3天对转导进行评估。
图15提供比较病毒递送策略的转导效率的结果。在“PEI”和“游离”条件下,用“高”水平的与MSR(MSR浓度为70μg/ml)结合的CD3/CD28抗体刺激T细胞,并分别给予与PEI-MSR相关的或在介质中游离递送的病毒(病毒浓度1.0含有22μg/ml MSR,MOI约6.7)。在“PEI+CD3/CD28”中,病毒和CD3/CD28激动性抗体与PEI-MSR(浓度1.0为22μg/ml MSR)结合。在培养开始后3天对转导进行评估。
图16提供比较各种递送策略在PBMC群体中的转导的结果。将如图15所示的条件添加到PBMC。对在每种细胞类型中的转导的细胞的比例进行定量。在培养开始后3天对转导进行评估。
图17提供在各种病毒递送策略情况下在PBMC中的不同转导分数。上图提供了在图15的条件下PBMC群体中存在的总细胞组成。下图提供在使用图15的条件进行病毒递送后存在的转导的细胞级分的组成。在培养开始后3天对转导进行评估。
具体实施方式
定义
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即,至少一个/种)所述冠词的语法宾语。通过举例,“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
当指可测量的值如量、时距等时,术语“约”意在涵盖与规定值±20%或在一些情况下±10%、或在一些情况下±5%、或在一些情况下±1%、或在一些情况下±0.1%的变化,因为此类变化适于执行所披露的方法。
术语“嵌合抗原受体”或者“CAR”是指重组多肽构建体,所述重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域的胞质信号传导结构域(本文还称为“细胞内信号传导结构域”)。在一些实施例中,CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中,例如包含嵌合融合蛋白。在一些实施例中,例如,如在如本文所述的RCAR中所提供,CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续,例如在不同的多肽链中。
在一些方面,胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一些方面,胞质信号传导结构域还包含源自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一些方面,共刺激分子选自41BB(即,CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一些方面,CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面,CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自共刺激分子的功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面,CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)|跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自一种或多种共刺激分子的两个功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面,CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)|跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自一种或多种共刺激分子的至少两个功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面,CAR包含CAR融合蛋白的氨基-末端(N-ter)的任选的前导序列。在一些方面,CAR还包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列,其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原识别结构域(例如,scFv)切割。
包含靶向特定肿瘤标记X的抗原结合结构域(例如,scFv(单结构域抗体)或TCR(例如,TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域))的CAR(其中X可以是如本文所述的肿瘤标记)也称为XCAR。例如,包含靶向BCMA的抗原结合结构域的CAR被称为BCMA CAR。CAR可以在任何细胞中表达,例如,如本文所述的免疫效应细胞(例如,T细胞或NK细胞)。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分,其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而用作效应子,经由定义的信号传导途径调控细胞活性起作用。
如本文所用,术语“抗体”是指源自与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白,并且可以源自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指抗体的至少一部分,所述部分保留与抗原表位特异性地相互作用(例如,通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段(如包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体、和分离的CDR、或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、细胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见例如,Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段移植到基于多肽如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199,其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
包含抗体或其抗体片段的本发明CAR部分可以按多种形式存在,其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分,所述连续多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999:Using Antibodies:ALaboratory Manual[使用抗体:实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约;Harlow等人,1989:Antibodies:A Laboratory Manual[抗体:实验室手册],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约;Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883;Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一些方面,本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一个方面,CAR包含含有scFv的抗体片段。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定,这些方案包括由以下文献描述的那些:Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”[具有免疫学重要性的蛋白序列],第5版,美国国立卫生研究院,公共卫生事业部,马里兰州贝塞斯达市(“卡巴特”编号方案);Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“乔西亚”编号方案)、或其组合。
如本文所用,术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质,例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一些实施例中,抗体分子是多特异性抗体分子,例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列,其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施例中,多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种,并且通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。κ(kappa)和λ(lambda)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体,例如像由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。所述术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子和表达抗体蛋白的DNA分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体,其中所述DNA或氨基酸序列已经使用本领域可得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。免疫应答可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外,抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当所述术语在本文中使用时)。此外,本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是,本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列,并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所希望的免疫应答的多肽。另外,技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是,抗原可以合成或可以源自生物样品,或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。
术语“抗癌作用”是指可以通过各种手段显现的生物学作用,包括但不限于例如肿瘤体积减少、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命延长、癌细胞增生减少、癌细胞存活率降低、或改善与癌症相关的各种生理症状。“抗癌作用”还可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防癌症发生的能力来显现。术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种手段显现的生物学作用,包括但不限于例如肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增生减少、或肿瘤细胞存活率降低。
术语“自体的”是指源自与后来将其重新引入个体中的同一个体的任何材料。
术语“同种异体的”是指源自与引入材料的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时,称两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些方面,来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。
术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
术语“癌症”是指特征在于异常细胞不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例,并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用,例如,这两个术语包括实体和液体,例如弥散或循环肿瘤。如本文所用,所述术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。
“源自”(当所述术语在本文中使用时)表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性,并不暗示或包括对源自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如,在源自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下,细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构,这样使得其具有所需的功能,即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制,例如,它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域,必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列,或强加突变,以到达细胞内信号传导结构域。
短语“与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病”包括但不限于与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病或与表达如本文描述的肿瘤抗原的细胞相关的病症,包括例如增生性疾病(如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期);或与表达如本文描述的肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。在一些方面,与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是血液癌症。在一些方面,与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是实体癌。与本文描述的肿瘤抗原的表达相关的其他疾病包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的增生性疾病。与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)、炎性病症(过敏症和哮喘)和移植。在一些实施例中,表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一些实施例中,表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体),并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一些实施例中,表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白,并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
术语“刺激”是指通过刺激分子(例如,TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或在CAR情况下的肿瘤抗原)的结合诱导的初级应答,从而介导信号转导事件,如但不限于,通过TCR/CD3复合物的信号转导或通过适当的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达。
术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子,其提供以针对免疫细胞信号传导通路的至少一些方面的刺激方式调节免疫细胞激活的一个或多个细胞质信号传导序列。在一些方面,信号是初级信号,所述初级信号通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而启动,并且导致了介导T细胞应答,包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中特别有用的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在本发明的特定CAR中,本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列,例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特定CAR中,CD3-ζ的初级信号传导序列是提供为SEQ ID NO:18的序列,或来自非人物种的等同残基,例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等。在本发明的特定CAR中,CD3-ζ的初级信号传导序列是SEQ ID NO:20中提供的序列,或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞如辅助细胞(例如,B细胞、树突细胞等),所述免疫系统细胞在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生信号,所述信号促进含有CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能。免疫效应子功能的实例,例如在CART细胞中,包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。
在一些实施例中,细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包含源自负责初级刺激、或抗原依赖性模拟的分子的那些。在一些实施例中,细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包含源自负责共刺激信号、或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如,在CART的情况下,初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列,并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于源自以下的那些:CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。
术语“ζ”或者“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”是指CD247。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人CD3ζ氨基酸序列。“ζ刺激结构域”或者“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”是指CD3-ζ或其变体的刺激结构域(例如,具有突变(例如,点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中,ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1或其变体的残基52至164(例如,具有突变(例如,点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中,“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是SEQ ID NO:9或10提供的序列或其变体(例如,具有突变(例如,点突变)、片段、插入或缺失的分子)。可替代地或另外地,术语“ζ”或可替代地“ζ链”、“CD3-ζ”(或“CD3ζ、CD3ζ或CD3z)或“TCR-ζ”被定义为以GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等效残基,并且“ζ刺激结构域”或可替代地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”被定义为来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能衍生物,其足以在功能上传递T细胞活化所必需的初始信号。在一些方面,ζ的细胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164或是其功能性直向同源物的来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。在一些方面,“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是提供为SEQ ID NO:18的序列。在一些方面,“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是提供为SEQ ID NO:20的序列。
术语“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体特异性结合、从而介导T细胞的共刺激应答(如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子,其有助于高效的免疫应答。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、以及4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、和特异性地结合CD83的配体。
共刺激细胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子可以在以下蛋白质家族中表示:TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化型NK细胞受体。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、以及与CD83特异性地结合的配体等。
细胞内信号传导结构域可以包含衍生它的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域,或其功能片段或衍生物。
当所述术语在本文中使用时,“免疫效应细胞”是指参与免疫应答(例如促进免疫效应子应答)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞,例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和骨髓来源的吞噬细胞。
当所述术语在本文中使用时,“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指例如免疫效应细胞的增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或应答。例如,免疫效应子功能或应答是指T细胞或NK细胞的促进靶细胞的杀伤或抑制生长或增生的特性。在T细胞的情况下,初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。
术语“编码(encoding或encode)”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(例如,rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性,以及由此产生的生物学特性。因此,如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质,则所述基因、cDNA或RNA编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者所述基因或cDNA的其他产物。
除非另外说明,否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子,其程度为编码所述蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用,并且是指如本文描述的化合物、配制品、材料或组合物的有效于实现特定的生物学结果的量。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送所述分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的,包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此,术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还应当解释为还包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物,例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体,所述重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件;用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体,包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如,裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如,慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒,“病毒载体”)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的,能够感染非分裂细胞;它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中,因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体,尤其包括如下提供的自灭活慢病毒载体:Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自牛津生物医药公司(OxfordBioMedica)的基因递送技术、来自Lentigen公司的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间,例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时;例如,如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据,则它们在所述位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数的直接函数;例如,如果两个序列中这些位置的一半(例如,长度为10个亚基的聚合物中的5个位置)是同源的,则这两个序列是50%同源的;如果这些位置的90%(例如,10个中的9个)是匹配的或同源的,则这两个序列是90%同源的。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列),其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下,人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段),其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所希望的特异性、亲和力、和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下,人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应非人残基置换。此外,人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常,人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有如下项:至少一个(典型地两个)可变结构域,其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区,且FR区的所有或显著一部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节,参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525,1986;Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329,1988;Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学新见],2:593-596,1992。
“完全人”是指如下免疫球蛋白,如抗体或抗体片段,其中整个分子是人起源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如,天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”,但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在,或者可以存在于非天然环境(例如像宿主细胞)中。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如,当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时,所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作地连接。例如,如果启动子影响编码序列的转录或表达,则所述启动子与所述编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此邻接,并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下,它们处于同一阅读框中。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定,否则所述术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸,所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出,否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如,简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地,简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得,在这些序列中,一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081(1991);Ohtsuka等人.,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985);和Rossolini等人.,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用,并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸,并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用,所述术语是指短链,例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体;并且还是指较长的链,其在本领域中通常称为蛋白质,所述蛋白质存在有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。
术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下,所述序列可以是核心启动子序列,并且在其他情况下,所述序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时,在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时,基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时,基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指在癌细胞表面上完全或作为片段(例如,MHC/肽)表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质),并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞。在一些实施例中,肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志,例如谱系标志,例如B细胞上的CD19。在一些实施例中,肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子,例如,与正常细胞相比,1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施例中,肿瘤抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子,例如,与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施例中,肿瘤抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如,MHC/肽)表达,并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施例中,本发明的CAR包括包含结合MHC呈递的肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常,源自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋,并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中,病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶标。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的上下文中靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见,例如,Sastry等人,J Virol.[病毒学杂志]2011 85(5):1935-1942;Sergeeva等人,Blood[血液],2011 117(16):4262-4272;Verma等人,J Immunol[免疫学杂志]2010 184(4):2156-2165;Willemsen等人,Gene Ther[基因疗法]2001 8(21):1601-1608;Dao等人,Sci Transl Med[科学转化医学]2013 5(176):176ra33;Tassev等人,Cancer Gene Ther[癌基因疗法]2012 19(2):84-100)。例如,可以从筛选文库(如人scFv噬菌体展示文库)鉴定TCR样抗体。
术语“支持肿瘤的抗原”或“支持癌症的抗原”可互换地指在细胞表面上表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质),所述细胞本身不是癌性的、但例如通过促进其生长或存活、例如对免疫细胞的抗性而支持癌细胞。这种类型的示例性细胞包括基质细胞和骨髓源性的抑制细胞(MDSC)。支持肿瘤的抗原本身不需要在支持肿瘤细胞中发挥作用,只要所述抗原存在于支持癌细胞的细胞上。
如本文所用,“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA,优选mRNA。通常,体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用,“聚(A)”是通过聚腺苷酸化与mRNA附接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施例中,聚A为50个至5000个之间(SEQ ID NO:34)、优选大于64个、更优选大于100个、最优选大于300个或400个。聚(A)序列可以被化学修饰或酶促修饰以调节mRNA功能,如定位、稳定性或翻译效率。
如本文结合表达、例如CAR分子的表达所使用,“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达,其中表达的时间段小于如果整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的基因的表达的时间段。
如本文所用,术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善增生性障碍的进展、严重程度和/或持续时间,或者改善增生性障碍的一种或多种症状(优选地,一种或多种可辨别的症状),这由施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂,如本发明的CAR)引起。在具体的实施例中,术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善增生性障碍的至少一种可测量的物理参数,如肿瘤的生长,这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中,术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地,或通过例如稳定物理参数来生理地,或通过两者,抑制增生性障碍的进展。在其他实施例中,所述术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
术语“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系,这些信号转导分子在信号从细胞的部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且传递信号跨过细胞膜的分子以及分子复合物。
术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如,哺乳动物、人)。
术语“基本上纯化的”细胞是指本质上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下正常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下,基本上纯化的细胞群体是指同质的细胞群体。在其他情况下,所述术语仅指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面,在体外培养细胞。在其他方面,不在体外培养细胞。
如本文所用的术语“治疗剂”意指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病症态来获得治疗效果。
如本文所用的术语“预防”意指对疾病或疾病症态的预防或保护性治疗。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主体细胞及其子代。
术语“特异性地结合”是指识别样本中存在的结合配偶体(例如,肿瘤抗原)蛋白并与其结合的抗体或配体,但所述抗体或配体基本上不识别或结合样本中的其他分子。
如本文所用的“难治性”是指对治疗无应答的疾病,例如癌症。在实施例中,难治性癌症可以在治疗开始之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其他实施例中,难治性癌症可能在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。
如本文所用的“复发”是指疾病(例如,癌症)或疾病的体征和症状(如改善期之后,例如在疗法(例如癌症疗法)的先前治疗后的癌症)的回返。
当所述术语在本文中结合例如基因编辑使用时,“系统”是指一起用于产生所希望的功能的一组分子,例如一种或多种分子。
当所述术语在本文中使用时,“基因编辑系统”是指指导和影响由所述系统靶向的基因组DNA位点处或附近的一种或多种核酸的改变(例如缺失)的系统,例如一种或多种分子。基因编辑系统是本领域中已知的,并且在下文更全面地描述。
“显性负性”基因产物或蛋白质是干扰基因产物或蛋白质的功能的基因产物或蛋白质。受影响的基因产物可能与显性负性蛋白质相同或不同。显性负性基因产物可以具有多种形式,包括截短、具有点突变的全长蛋白质或其片段、或全长野生型或突变型蛋白质或其片段与其他蛋白质的融合物。所观察到的抑制水平可以非常低。例如,与过程中涉及的一种或多种功能性蛋白质相比,可能需要大量过量的显性负性蛋白质以观察作用。在正常生物测定条件下可能难以观察到作用。
术语“比例”是指群体中特定分子与分子总数的比率。在一个示例性实施例中,具有特定表型的T细胞(例如,TSCM细胞)的比例是指群体中具有所述表型的T细胞的数量相对于T细胞的总数的比率。在一个示例性实施例中,具有特定表型的T细胞(例如,CD45RA+CD62L+细胞)的比例是指群体中具有所述表型的T细胞的数量相对于T细胞的总数的比率。应当理解,可以在指示的情况下针对某些细胞亚群测量此类比例。例如,可以针对CD4+T细胞的总数测量CD4+TSCM细胞的比例。
如本文所用的术语“免疫效应细胞群体”是指包含至少两种、例如两种或更多种、例如多于一种免疫效应细胞的组合物,并且不表示任何纯度水平或其他细胞类型的存在或不存在。在一个示例性实施例中,群体基本上不含其他细胞类型。在另一个示例性实施例中,群体包含至少两种指定细胞类型的细胞,或具有指定的功能或特性。
术语“TSCM样细胞”、“初始T细胞(naive T Cell)”和“初始T细胞(T cell)”可互换使用,并且是指分化程度较低的T细胞状态,其特征在于CD45RA和CD62L的表面表达(例如,为CD45RA阳性和CD62L阳性(有时写为CD45RA+CD62L+))。一般来说,T细胞分化从大多数“初始”到大多数“耗竭”TSCM样(例如,CD45RA+CD62L+细胞)>TCM(例如,CD45RA-CD62L+细胞)>TEM(例如,CD45RA-CD62L-细胞)>TEFF进行。初始T细胞可以相对于更耗竭的T细胞表型被表征为,例如具有增加的自我更新、抗肿瘤功效、增殖和/或存活。在一个示例性实施例中,初始T细胞是指CD45RA+CD62L+T细胞。在另一个示例性实施例中,初始T细胞是指TSCM细胞,例如CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+T细胞。
术语“TSCM”是指具有干细胞记忆表型的T细胞,其特征在于它在它的细胞表面上表达CD45RA、CD62L、CCR7、CD27和CD95(例如,为CD45RA阳性、CD62L阳性、CCR7阳性、CD27阳性和CD95阳性(有时写为CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+))。TSCM细胞是初始T细胞的一个实例。所述T细胞可以是CD4+和/或CD8+T细胞。
如本文所用,术语“烷基”是指包含1至20个碳原子的完全饱和的支链或无支链(或直链或线性)烃部分。优选烷基包含1-6个碳原子且更优选1-4个碳原子。烷基的代表性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基。例如,术语“C1-6烷基”是指具有一至六个碳原子的烃,并且术语“C1-7烷基”是指具有一至七个碳原子的烃。
如本文所用,术语“卤代烷基”是指被一个或多个本文所定义的卤素基团取代的本文所定义的烷基。优选地,卤代烷基可以是单卤代烷基、二卤代烷基或多卤代烷基,包括全卤代烷基。单卤代烷基可以在烷基内具有一个碘、溴、氯或氟。二卤代烷基和多卤代烷基基团可以在烷基内具有两个或更多个相同的卤原子或不同的卤基基团的组合。优选地,多卤代烷基含有多达12或10、或8、或6、或4、或3、或2个卤基基团。卤代烷基的代表性实例是氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。全卤代烷基是指所有氢原子均被卤素原子替换的烷基。例如,术语“卤代-C1-6烷基”是指具有一至六个碳原子并被一个或多个卤基基团取代的烃,并且术语“卤代-C1-7烷基”是指具有一至七个碳原子并被一个或多个卤素基团取代的烃。
如本文所用,“盐”包括药学上可接受的酸加成盐,其可以采用无机酸和有机酸形成,例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、胆茶碱(chlortheophyllonate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳糖酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
可以衍生出盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等。可以衍生出盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。
可以衍生出盐的无机碱包括例如铵盐和来自元素周期表第I至XII列的金属。在某些实施例中,盐源自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜;特别合适的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。
可以衍生出盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺;取代的胺(包括天然存在的取代的胺);环胺;碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。
范围:贯穿本披露内容,能以范围形式呈现本发明的各个方面。应该理解的是,范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁,不应该被理解为对本发明范围的不灵活的限制。因此,范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如,范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围,如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等,以及所述范围内的单独数字,例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例,范围如95%-99%同一性包括具有95%、96%、97%、98%或99%同一性,并且包括如96%-99%、96%-98%、96%-97%、97%-99%、97%-98%和98%-99%同一性的子范围。无论范围的宽度如何,这都适用。
标题、小标题或编号或字母元素,例如(a)、(b)、(i)等仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素以字母顺序执行,或者步骤或元素必须彼此离散。
本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入。
根据说明书和附图并且如权利要求书,本发明的其他特征、目标和优点将是清楚的。
表面修饰的介孔二氧化硅颗粒
在一些实施例中,本发明提供了介孔二氧化硅颗粒。介孔二氧化硅颗粒包含例如具有六边密排的、圆柱形的、均匀孔的多孔体。介孔二氧化硅颗粒可以通过使用表面活性剂的棒状胶束作为模板来合成,其是在酸性或碱性催化剂的存在下,通过将二氧化硅源(如烷氧基硅烷、硅酸钠溶液、水硅畲石、二氧化硅细颗粒)溶于水或乙醇中并进行水解而在水中形成。参见,例如,美国公开号2015-0072009和Hoffmann等人,Angewandte ChemieInternational Edition[德国应用化学国际版],45,3216-3251,2006。已经将多种表面活性剂(例如阳离子、阴离子和非离子表面活性剂)作为表面活性剂研究,并且已知,大体上,阳离子表面活性剂的烷基三甲基铵盐导致具有最大比表面积和孔体积的介孔二氧化硅。参见美国公开号2013/0052117和Katiyar等人(Journal of Chromatography[色谱学报]1122(1-2):13-20)。
介孔二氧化硅颗粒可以以各种形式(例如微球、不规则颗粒、矩形棒、圆形纳米棒)提供。介孔二氧化硅颗粒可具有各种预定的形状,包括例如,球体形状、椭圆体形状、棒状形状、或弯曲的圆柱形状。在特定的实施例中,本文所述的组合物和方法使用介孔二氧化硅棒(MSR)。组装介孔二氧化硅以产生微棒的方法是本领域已知的。参见,Wang等人,Journal ofNanoparticle Research[纳米颗粒研究杂志],15:1501,2013。在一些实施例中,通过使正硅酸乙酯与由胶束棒制成的模板反应来合成介孔二氧化硅颗粒。结果是填充了规则排列的孔的介孔二氧化硅球体或棒的集合。然后可以通过用调节至适当pH的溶剂洗涤来除去模板。在此实例中,在去除表面活性剂模板之后,制备特征为均匀的有序的和连通的介孔隙的、具有例如约600m2/g至约1200m2/g、特别地约800m2/g至约1000m2/g、以及特别地约850m2/g至约950m2/g的比表面积的介孔二氧化硅颗粒。在另一实施例中,可以使用溶胶-凝胶法或喷雾干燥法合成介孔二氧化硅颗粒。正硅酸乙酯也与另外的聚合物单体(作为模板)一起使用。在又一个实施例中,可以将一个或多个四烷氧基硅烷和一个或多个(3-氰基丙基)三烷氧基硅烷共缩合以提供作为棒的介孔硅酸盐颗粒。参见美国公开号2013-0145488、2012-0264599和2012-0256336,其内容通过引用整体并入本文。
介孔二氧化硅颗粒(MSP)(例如,MSR)可以包含孔,所述孔可以是有序的或随机分布的,直径是2nm至100nm,或直径是2nm-50nm,例如直径2nm-5nm、10nm-20nm、10nm-30nm、10nm-40nm、20nm-30nm、30nm-50nm、30nm-40nm、40-50nm的孔。在一些实施例中,微棒包含直径是约5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm或更大的孔。孔径可以根据应用类型而改变。
在一些实施例中,MSR的长度在微米范围内,范围从约5μm至约500μm。在一示例中,MSR的长度是5μm-50μm,例如10μm-20μm、10μm-30μm、10μm-40μm、20μm-30μm、30μm-50μm、30μm-40μm、40μm-50μm。在一些实施例中,MSR包括50μm至250μm的长度,例如,约60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、120μm、150μm、180μm、200μm、225μm或更长。在一些实施例中,使用具有更高的纵横比的MSR,例如具有长度50μm至200μm、特别是长度80μm至120μm、尤其是长度约100μm或更长的棒。
在又一个实施例中,MSP(例如MSR)提供高表面积用于附接和/或结合至靶细胞例如T细胞。获得高表面积介孔硅酸盐的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号8,883,308和美国公开号2011-0253643,其全部内容通过引用并入本文。在一些实施例中,高表面积归因于纳米颗粒的纤维形态,这使得可以在表面上获得高浓度的高度分散的且易于接近的部分。在某些实施例中,高表面积MSP(例如MSR)具有至少约100m2/g,至少150m2/g或至少300m2/g的表面积。在其他实施例中,高表面积MSP(例如,MSR)具有约100m2/g至约1000m2/g的表面积,包括例如其之间的所有值或子范围,例如50m2/g、100m2/g、200m2/g、300m2/g、400m2/g、600m2/g、800m2/g、100-500m2/g、100-300m2/g、500-800m2/g或500-1000m2/g。
在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒可包括表面修饰。如本文所用,“表面修饰”是指在MSP(例如,MSR)的表面上附接或附加官能团。在一些实施例中,官能团被吸附或被共价键合到孔衬里和/或纳米通道衬里的表面上或MSP(例如MSR)的表面上。如本文所用,“官能团”定义与MSR连接的化学部分。在一些实施例中,官能团是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐。在一些实施例中,可以将官能团(即-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐)与二氧化硅表面通过接头分开。在一些实施例中,官能团经由C1至C20烷基接头共价键合至MSP或MSR表面。在其他实施例中,官能团经由聚乙二醇接头共价键合至MSP或MSR表面。在特定的实施例中,聚乙二醇接头具有式(-O(CH2-CH2-)1-25。在特定的实施例中,表面修饰是C1至C20烷基全卤代烷基或C1至C20烷基全氟代烷基。
表面修饰的一般结构如下:
其中L是接头,并且
X是官能团。
在一些实施例中,L可以是C1至C20烷基或聚乙二醇基,并且X可以是-OH(羟基)、伯胺、仲胺、叔胺或季胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺或疏水部分、或其盐。
如本文所用,具有膦酸酯的表面修饰(也称为膦酸酯修饰的纳米颗粒)具有至少一个膦酸(—P(O)(OH)2)基团或次膦酸(—P(O)(OH)R,其中R是C1至C20烷基)。膦酸或次膦酸可以取决于pH值而带电或不带电。在生理pH下,膦酸和次膦酸带负电或是阴离子。例如,可以通过用带有膦酸酯的三烷基硅氧烷化合物或带有膦酸酯的三羟基甲硅烷基化合物(例如(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸酯)处理二氧化硅体表面来制备膦酸酯修饰。
在一些实施例中,用伯胺、仲胺、叔胺或季胺对介孔二氧化硅颗粒(例如,MSR)进行表面修饰。仲胺、叔胺和季胺可以被C1至C20烷基取代并且可以带电荷。在一些实施例中,胺基可以是盐形式。在一些实施例中,伯胺、仲胺、叔胺或季胺可通过接头与MSP表面分开。在特定的实施例中,介孔二氧化硅颗粒用聚乙烯亚胺修饰。在特定的实施例中,聚乙烯亚胺是支链的或非支链的。在可替代实施例中,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量,聚乙烯亚胺基团具有约1000至100,000道尔顿(Da)的平均分子量。在一些实施例中,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量,聚乙烯亚胺基团具有约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da、约10,000Da或约20,000Da的平均分子量。
各种示例性的表面修饰的介孔二氧化硅颗粒的结构在图1中示出。
如本文所述,本文所述的MSP(例如,MSR)通过本领域技术人员已知的方法制备。通常,可以通过以下方法制备具有表面修饰的MSP。
通常,能够与MSP(例如,MSR)的甲硅烷基氢氧化物表面反应的任何反应都可以用于共价修饰所述表面。例如,MSP(例如MSR)的表面可以用三烷氧基甲硅烷基化合物或三羟基甲硅烷基化合物处理。在一些实施例中,将介孔二氧化硅颗粒悬浮在合适的反应溶剂中。在一些实施例中,反应溶剂可以是水性溶剂或pH为0-14的缓冲液。可以使用水溶液与1种或多种有机溶剂(包括但不限于四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、甲苯、三乙胺、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、二氯甲烷、或二氯乙烷)的另外的共混物。在一些实施例中,使悬浮的介孔二氧化硅颗粒与具有如本文所述期望的官能团的三烷氧基甲硅烷基或三羟基甲硅烷基试剂反应。例如,可以通过用带有胺的三烷氧基硅烷化合物(例如氨基丙基三乙氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基-三甲氧基硅烷、或3-三甲氧基甲硅烷基丙基乙二胺)处理MSP来制备胺修饰。在某些实施例中,三烷氧基甲硅烷基是三甲氧基甲硅烷基或三乙氧基甲硅烷基。在可替代实施例中,三烷氧基甲硅烷基试剂是三烷氧基烷基胺。在一些实施例中,三烷氧基烷基胺包括伯胺、仲胺、叔胺或季胺。
在某些实施例中,三烷氧基甲硅烷基试剂包括聚乙烯亚胺基团。在特定的实施例中,聚乙烯亚胺是支链的或非支链的。在可替代实施例中,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量,聚乙烯亚胺基团具有约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da的平均分子量。在一些实施例中,三烷氧基甲硅烷基试剂包括C1-20烷基叠氮化物基团。在某些实施例中,三烷氧基甲硅烷基试剂包括C1-20烷基羧酸基团。在其他实施例中,三烷氧基甲硅烷基试剂包括C1-20烷基基团。
例如,可以通过用带有巯基的三烷氧基硅烷化合物(例如3-巯基丙基三乙氧基硅烷)处理MSP来制备MSP(例如,MSR)上的巯基修饰。
例如,可以通过用带有二硫化物的三烷氧基硅烷化合物处理纳米颗粒的表面、或者通过用2,2′-二硫代二吡啶或其他二硫化物处理巯基修饰的表面,来制备MSP(例如,MSR)上的二硫化物修饰。
例如,可以通过用带有羧酸的三烷氧基硅烷化合物处理表面、或者通过用带有官能团(所述官能团可以被化学上转化为羧酸)的三烷氧基硅烷化合物处理MSP,来制备包括羧酸基团的MSP(例如,MSR)表面修饰。例如,MSP可以用3-氰基丙基三乙氧基硅烷处理,然后用硫酸水解。
例如,可以通过用带有环氧化物的三烷氧基硅烷化合物(例如甘油氧基丙基三乙氧基硅烷)处理MSP来制备MSP(例如,MSR)表面修饰,所述MSP表面修饰包括环氧化物(将具有至少一种环氧化物)。
具有疏水部分的表面修饰将具有至少一个部分,所述部分旨在降低在水中的溶解度、或增加在有机溶剂中的溶解度。疏水部分的实例包括长链烷基(例如,C8-C20烷基),脂肪酸酯(例如,C1-C22烷基酸酯)和具有C6-C10碳原子的芳族环。
在一些实施例中,MSP(例如,MSR)与三烷氧基甲硅烷基试剂的反应在环境温度或室温下进行。在其他实施例中,反应在升高的温度下进行。在进一步的实施例中,反应温度是约40℃至约120℃、约50℃至约100℃、约60℃至约80℃、约70℃至约80℃、或约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、或约100℃。
病毒载体
在一些实施例中,本文所述的组合物可包括本文所述的介孔二氧化硅颗粒和病毒载体。
病毒载体可以是任何病毒载体。病毒载体技术在本领域中是熟知的,并且例如描述于Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆:实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社],纽约中,以及其他病毒学和分子生物学手册中。举例来说,病毒载体可以是腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒或疱疹病毒。在一些实施例中,病毒载体是慢病毒载体或腺病毒载体。
源自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具,因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于源自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点,因为它们可以转导非增殖性细胞,例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复(LTR)、和目的转基因(例如编码CAR的基因)。γ逆转录病毒载体可能缺少病毒结构基因(例如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV),以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application[γ逆转录病毒载体:生物学/技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月;3(6):677-713)。
在另一个实施例中,包含编码本发明所希望CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施例中,可以使用转座子(如sleeping beauty)、CRISPR、CAS9、和锌指核酸酶来完成编码CAR的核酸的表达。见June等人2009Nature Reviews Immunology[自然免疫学综述]9.10:704-716,所述文献通过引用并入本文。
在一些实施例中,所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在一些实施例中,核苷酸序列表达嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、细胞因子、趋化因子、用于阻断抑制性分子的shRNA、或用于诱导蛋白质表达的mRNA。在一些实施例中,蛋白质是CAR,其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域。在一些实施例中,信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施例中,病毒载体中的核苷酸序列表达经工程改造以靶向肿瘤抗原的肽。在一些实施例中,所述肽靶向选自下组的肿瘤抗原,该组由以下组成:TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。在一些实施例中,所述肽是嵌合抗原受体(CAR)或工程改造的TCR。此类肽在下文标题为“嵌合抗原受体技术的一般说明”的部分中更详细地描述。
介孔二氧化硅颗粒和病毒载体的组成
本文还描述了一种组合物,所述组合物包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体。在一些实施例中,MSP(例如MSR)还包含多个吸附或共价键合在孔衬里和/或纳米通道衬里的表面上或表面的官能团。在一些实施例中,官能团是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分或其盐。在一些实施例中,可以将官能团(即-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐)直接附接至MSP的表面。在一些实施例中,官能团经由C1至C20烷基接头共价键合至MSP(例如MSR)表面。在其他实施例中,官能团经由聚乙二醇接头共价键合至MSP表面。在特定的实施例中,聚乙二醇接头具有式(-O(CH2-CH2-)1-25。在特定的实施例中,表面修饰是C1至C20烷基全卤代烷基或C1至C20烷基全氟代烷基。
在一些实施例中,用伯胺、仲胺、叔胺或季胺对MSP(例如,MSR)进行表面修饰。在特定的实施例中,介孔二氧化硅棒用聚乙烯亚胺修饰。在特定的实施例中,聚乙烯亚胺是支链的或非支链的。在可替代实施例中,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量,聚乙烯亚胺基团具有约1000至20,000道尔顿(Da)的平均分子量。在一些实施例中,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量,聚乙烯亚胺基团具有约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da、或约10,000Da的平均分子量。
在一些实施例中,病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒。如本文所述,“缀合至”是指通过本文所述的任何方式关联至或附接至。在一些实施例中,将病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒和病毒载体之间的静电缀合是由于病毒载体和介孔二氧化硅颗粒表面电荷相反。例如但不受理论的束缚,通过聚乙烯亚胺或带正电荷的伯铵、仲铵、叔铵或季铵基团表面修饰的介孔二氧化硅颗粒可以与表面带负电荷的病毒载体缀合。因此,在一些实施例中,病毒载体带负电,而介孔二氧化硅颗粒带正电。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒和病毒载体之间的共价缀合通过本领域技术人员已知的方法、通过接头或不通过接头来实现。例如但不限于,接头可以是聚乙二醇、烷基、聚合物、聚酰胺键等。
在一些方面,本文提供药物组合物,所述药物组合物包含本文所述的介孔二氧化硅颗粒,其被配制用于制造免疫效应细胞例如T淋巴细胞的群体。在一些实施例中,用CAR转导T淋巴细胞。在一些实施例中,MSP与本文所述的病毒载体缀合。在一些实施例中,用于制造免疫效应细胞例如T淋巴细胞的群体的MSP可以如本文所述进行表面修饰。
在一些实施例中,组合物适合用作包含介孔二氧化硅颗粒和病毒载体的可注射组合物,其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在一些实施例中,病毒载体缀合至如本文所述的介孔二氧化硅颗粒。
在本文所述的介孔二氧化硅颗粒的组合物中,MSP(例如MSR)可以以0.01μg/ml至1000μg/ml的浓度存在。在可替代实施例中,本文所述的组合物中的MSP或MSR的浓度可以是0.1μg/ml至500μg/ml、0.5μg/ml至100μg/ml、1μg/ml至90μg/ml、1μg/ml至80μg/ml、1μg/ml至70μg/ml、1μg/ml至60μg/ml、1μg/ml至50μg/ml或1μg/ml至40μg/ml。
在特定的实施例中,MSP(例如MSR)可以以下浓度存在:约1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml或150μg/ml。
一般而言,本文所述的组合物将经由本领域中已知的任何常用和可接受的方式,以如上所述的治疗有效量单独地或与一种或多种治疗剂组合施用。
可注射的组合物可以是水性等渗悬浮液。这些组合物可以是灭菌的和/或含有佐剂(如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂)。另外,它们还可以包含其他治疗有效物质。
本发明的药物组合物能以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的总量和频率将由如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重程度等因素来确定,然而适当的剂量可以通过临床试验来确定。
在一些实施例中,药物组合物基本上不含,例如不存在可检测水平的例如选自下组的污染物,该组由以下组成:内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一些实施例中,细菌是选自下组的至少一种,该组由以下组成:粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。
用于施加的药物组合物(或配制品)可以根据用于施用本文所述组合物的方法而以多种方式包装。一般来说,用于分配的物件包括药物配制品以适当形式在其内贮存的容器。适合的容器对于本领域的技术人员是熟知的并且包括材料如瓶(塑料和玻璃)、小袋、安瓿、塑料袋、金属圆筒及其类似物。容器还可以包括防干扰组件,以防止不小心接触到包装的内容物。另外,容器设有描述容器的内容物的标签。标签还可以包括适当的警示语。
在一些实施例中,本文所述的组合物还包括T细胞刺激化合物或肿瘤抗原。在一些实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体上。在另外的或可替代的实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第二群体上。在进一步的实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原是IL-2、IL-15、GM-CSF,抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、来自共享抗原(例如TRP2、gp100、肿瘤细胞裂解物、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3 TCR)的肽或其组合。对MSP(例如MSR)表面的吸附通常被理解为分子粘附于所述表面。
在T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体的实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原可以缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体的表面上的脂质双层。在介孔二氧化硅颗粒上制备脂质双层的方法是已知的。参见例如国际申请公开号WO 2018/013797。简而言之,含有预定量的标记如生物素的脂质体用于包被MSP。然后可以使用互补标记例如链霉亲和素将标记用于附着至T细胞刺激化合物。用于制备脂质体的脂质是本领域技术人员已知的,并且包括但不限于具有两个烃链(通常为酰基链)和极性头基的形成囊泡的脂质。此类脂质包括磷脂,例如磷脂酰胆碱(PC),磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酸(PA),磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM),其中两个烃链长度通常是约14-22个碳原子,并且具有不同程度的不饱和度。在一些实施例中,脂质是相对不饱和的磷脂(在烃链中具有一个、两个或三个双键)。在一些实施例中,脂质是磷脂酰胆碱。磷脂酰胆碱是一种以胆碱为头基并组合甘油磷酸和两个脂肪酸的磷脂。在一些实施例中,磷脂酰胆碱是棕榈酰基磷脂酰胆碱或油酰基磷脂酰胆碱或1-棕榈酰基、2-油酰基-磷脂酰胆碱。在制备脂质体组合物中可以使用一种类型以上的脂质。脂质和比例的选择可以改变,以实现所需程度的流动性或刚性,和/或控制稳定性。在制备脂质体组合物中使用一种类型以上的脂质的情况下,应使用适量的相对不饱和的脂质(例如PC)以形成稳定的脂质体。在一些实施例中,在配制品中使用的脂质的至少45mol%-50mol%是PC。脂质体还可以包括用亲水性聚合物例如聚乙二醇(PEG)衍生的脂质。合适的亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和亲水性肽序列。制备用亲水性聚合物衍生的脂质的方法是已知的(参见,例如,美国专利号5,395,619,其通过引用并入本文)。
在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒的第一群体或第二群体还包括细胞因子。细胞因子可以是但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂,其模拟物,其变体,其功能片段或其组合。在特定的实施例中,细胞因子缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一或第二群体上。在实施例中,当细胞因子吸附到介孔二氧化硅颗粒的第二群体时,MSP(例如MSR)的第二群体可以进一步被脂质双层覆盖,如上所述。
方法
在一些实施例中,本发明涉及一种方法,所述方法包括:
使T淋巴细胞与包含介孔二氧化硅颗粒(例如MSR)的第一群体和病毒载体的组合物接触;
其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。
在一些实施例中,接触在体外进行。在一些实施例中,T淋巴细胞在与介孔二氧化硅颗粒接触之前或之后被活化。
在一些实施例中,本发明涉及一种利用重组多核苷酸体内遗传转导T淋巴细胞的方法,所述方法包括:
向具有一种或多种T淋巴细胞的受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒(例如,MSR)的第一群体和病毒载体的组合物;
其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列,并且
其中当所述组合物接触一种或多种T淋巴细胞时,所述T淋巴细胞被所述重组多核苷酸遗传转导。
在一些实施例中,本发明涉及体外扩增T淋巴细胞群体的方法,所述方法包括使T淋巴细胞群体与以下接触:
(a)组合物,其包含介孔二氧化硅颗粒(例如,MSR)的第一群体和病毒载体以提供转导的T淋巴细胞群体;和
(b)使所述转导的T淋巴细胞群体与T细胞刺激化合物或肿瘤抗原以及任选的细胞因子接触;
其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。
在当前描述的方法的一些实施例中,所述方法导致群体中T淋巴细胞的比例增加。
在一些实施例中,本发明涉及扩增嵌合抗原受体(CAR)T细胞群体的方法,所述方法包括使CAR-T细胞群体与缀合至靶向部分的介孔二氧化硅颗粒(例如,MSR)接触,其中所述靶向部分与所述CAR互补。
在一些实施例中,本发明涉及一种选择性地扩增培养物中T淋巴细胞比例的方法,所述方法包括使T淋巴细胞群体与以下接触:
(a)组合物,其包含介孔二氧化硅颗粒(例如,MSR)的第一群体和病毒载体以提供转导的T淋巴细胞群体;和
(b)使所述转导的T淋巴细胞群体与T细胞刺激化合物或肿瘤抗原以及任选的细胞因子接触;
其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。
在一些实施例中,培养物包括不同的效应细胞类型,包括NK细胞、单核细胞、B细胞。在特定的实施例中,与接触MSP组合物之前的T淋巴细胞的比例相比,T淋巴细胞的比例提高了约10%、20%、30%、40%或50%。在一些实施例中,细胞群体扩增8天或更短的时间。
在一些实施例中,本发明是将病毒载体递送至受试者中所需的作用位点的方法,所述方法包括向所述受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物。介孔二氧化硅颗粒(例如,MSR)和病毒载体的组合物如上所述。
在一些方面,在本文所述的方法中,介孔二氧化硅颗粒可以用多个吸附或共价键合在孔衬里和/或纳米通道衬里的表面上或MSP(例如MSR)的表面上的官能团进行表面修饰,如本文所述。在一些实施例中,官能团是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分或其盐。在一些实施例中,可以将官能团(即-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分或其盐)与二氧化硅表面通过接头分开。在一些实施例中,官能团经由C1至C20烷基接头共价键合至MSP或MSR表面。在其他实施例中,官能团经由聚乙二醇接头共价键合至MSP(例如MSR)表面。在特定的实施例中,表面修饰是C1至C20烷基全卤代烷基或C1至C20烷基全氟代烷基。
在另一方面,在本文所述的方法中,病毒载体如本文所述。在本发明的方法中,病毒载体可以与本文所述的介孔二氧化硅颗粒(例如MSR)缀合。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒和病毒载体之间的静电缀合是由于病毒载体和介孔二氧化硅颗粒电荷相反。例如但不受理论的束缚,通过聚乙烯亚胺或带正电荷的伯铵、仲铵、叔铵或季铵基团表面修饰的介孔二氧化硅颗粒可以与带负电荷的病毒载体缀合。因此,在一些实施例中,病毒载体带负电,而表面修饰的介孔二氧化硅颗粒带正电。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒和病毒载体之间的共价缀合通过本领域技术人员已知的方法、通过接头或不通过接头来实现。例如但不限于,接头可以是聚乙二醇、烷基、聚合物、聚酰胺键等。
在本文叙述的一些方法中,核苷酸序列表达嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、细胞因子、趋化因子、用于阻断抑制性分子的shRNA、或用于诱导蛋白质表达的mRNA。在特定的实施例中,待表达的核苷酸序列表达CAR。
在本文所述的一些方法中,可以通过使T淋巴细胞与T细胞刺激化合物或肿瘤抗原接触来活化T淋巴细胞。本文提供了T细胞刺激化合物的实例。在一些实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体或MSP(例如MSR)的两个群体上。在其他实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体上。在特定实施例中,T细胞刺激化合物或肿瘤抗原直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体上或直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体的表面上的脂质包膜上。在MSP的表面上的脂质包膜的制备是已知的并且在本文中进行了描述。参见例如国际申请公开号WO 2018/013797。
本文所述的方法可还包括使T淋巴细胞与细胞因子接触。在一些实施例中,细胞因子在具有MSP(例如MSR)的介质中,或缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体或第二群体或两个群体上。在一些实施例中,细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段,或其组合。
在一些实施例中,所述方法还包括在转导后扩增T细胞群体。可以通过本文描述的方法扩增T细胞/T淋巴细胞。在一些实施例中,细胞群体扩增8天或更短的时间。
在又其他实施例中,使细胞群体在体外扩增5天,并且与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比,所得细胞表现出更高的促炎性IFN-γ和/或GM-CSF水平。
不受理论的束缚,据信本文所述的方法在CAR-T细胞制造过程中保存慢病毒。材料系统的刺激能力通过允许抗原特异性刺激CAR T细胞,从而允许来自当前使用的CAR T细胞制造试剂的独特能力,这可以在转移到体内时增强CAR T细胞的功能,或者可以用于选择性地刺激和扩增CAR T细胞(相对于培养物中的非CAR T细胞)以增强CAR T细胞产物的纯度。
在一些实施例中,本发明是将活性剂递送至受试者中所需的作用位点的方法,所述方法包括向所述受试者施用包含缀合至聚乙烯亚胺的介孔二氧化硅颗粒的组合物。在特定实施例中,聚乙烯亚胺共价缀合至介孔二氧化硅颗粒。在一些实施例中,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量,聚乙烯亚胺基团具有约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da的平均分子量。
在一些实施例中,本发明提供向受试者在所需的作用位点提供持续的药物递送的方法,所述方法包括向所述受试者施用组合物,所述组合物包含缀合至聚乙烯亚胺的介孔二氧化硅颗粒、和在介孔二氧化硅颗粒上吸收或吸附的活性剂。
在一些实施例中,活性剂是抗癌药。
嵌合抗原受体技术概述
在本发明的一些实施例中,本文描述使用介孔二氧化硅颗粒制造(例如,活化和/或扩增)工程改造以表达CAR分子(例如,如本文所述)的免疫效应细胞(例如,T细胞或NK细胞)群体的方法,其中所述细胞具有增强的活性(例如,增殖、细胞因子释放、和/或肿瘤靶向功效)。
在一些实施例中,重组多肽构建体编码嵌合抗原受体(CAR),所述嵌合抗原受体包含结合至支持肿瘤的抗原(例如,如本文描述的支持肿瘤的抗原)的抗原结合结构域(例如,抗体或抗体片段,TCR或TCR片段)、跨膜结构域(例如,本文描述的跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如,本文描述的细胞内信号传导结构域)(例如,包含共刺激结构域(例如,本文描述的共刺激结构域)和/或初级信号传导结构域(例如,本文描述的初级信号传导结构域)的细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中,所述支持肿瘤的抗原是存在于基质细胞或骨髓源性抑制细胞(MDSC)上的抗原。在其他方面,本发明的特征在于由此类核酸编码的多肽以及含有此类核酸和/或多肽的宿主细胞。
在一些实施例中,载体中的核苷酸序列表达经工程改造以靶向肿瘤抗原的蛋白质。
在一些实施例中,所述肿瘤抗原选自以下中的一种或多种:CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319、以及19A24);C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1);CD33;表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII);神经节苷脂G2(GD2);神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer);TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr));前列腺特异性膜抗原(PSMA);受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1);Fms样酪氨酸激酶3(FLT3);肿瘤相关糖蛋白72(TAG72);CD38;CD44v6;癌胚抗原(CEA);上皮细胞粘附分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2);间皮素;白细胞介素11受体α(IL-11Ra);前列腺干细胞抗原(PSCA);蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21);血管内皮生长因子受体2(VEGFR2);Lewis(Y)抗原;CD24;血小板来源的生长因子受体β(PDGFR-β);阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4);CD20;叶酸受体α;受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu);黏蛋白1,细胞表面相关的(MUC1);表皮生长因子受体(EGFR);神经细胞粘附分子(NCAM);前列腺酶;前列腺酸性磷酸酶(PAP);突变的延伸因子2(ELF2M);肝配蛋白B2;成纤维细胞活化蛋白α(FAP);胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体),碳酸酐酶IX(CAIX);蛋白酶体(Prosome,Macropain)亚基,β型,9(LMP2);糖蛋白100(gp100);由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl);酪氨酸酶;肝配蛋白A型受体2(EphA2);岩藻糖基GM1;唾液酸Lewis粘附分子(sLe);神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer);转谷氨酰胺酶5(TGS5);高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMWMAA);o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2);叶酸受体β;肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248);肿瘤内皮标记7相关的(TEM7R);密封蛋白6(CLDN6);促甲状腺激素受体(TSHR);G蛋白偶联受体C类5组,成员D(GPRC5D);染色体X可读框61(CXORF61);CD97;CD179a;间变性淋巴瘤激酶(ALK);聚唾液酸;胎盘特异性1(PLAC1);globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分;乳腺分化抗原(NY-BR-1);尿溶蛋白2(UPK2);甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1);肾上腺素受体β3(ADRB3);泛连接蛋白3(PANX3);G蛋白偶联受体20(GPR20);淋巴细胞抗原6复合物,基因座K 9(LY6K);嗅觉受体51E2(OR51E2);TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP);肾母细胞瘤蛋白(WT1);癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1);癌/睾丸抗原2(LAGE-1a);黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1);ETS易位变异基因6,位于染色体12p上(ETV6-AML);精子蛋白17(SPA17);X抗原家族,成员1A(XAGE1);血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2);黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1);黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2);Fos相关的抗原1;肿瘤蛋白p53(p53);p53突变体;前列腺特异性蛋白(prostein);存活蛋白(surviving);端粒酶;前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖蛋白8)、T细胞1识别的黑色素瘤抗原(MelanA或MART1);大鼠肉瘤(Ras)突变体;人端粒酶逆转录酶(hTERT);肉瘤易位断点;黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP);ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因);N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17);配对盒蛋白Pax-3(PAX3);雄激素受体;细胞周期蛋白B1;v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN);Ras同源物家族成员C(RhoC);酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2);细胞色素P450 1B1(CYP1B1);CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)),T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3);配对盒蛋白Pax-5(PAX5);前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1);淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK);激酶锚蛋白4(AKAP-4);滑膜肉瘤,X断点2(SSX2);晚期糖基化终产物受体(RAGE-1);肾遍在蛋白1(RU1);肾遍在蛋白2(RU2);Legumain;人乳头状瘤病毒E6(HPV E6);人乳头状瘤病毒E7(HPV E7);肠羧酸酯酶;突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1);IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89);白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2);CD300分子样家族成员f(CD300LF);C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A);骨髓基质细胞抗原2(BST2);含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2);淋巴细胞抗原75(LY75);磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3);Fc受体样5(FCRL5);以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
本文所述的CAR可以包含与支持肿瘤的抗原(例如,如本文所述的支持肿瘤的抗原)结合的抗原结合结构域(例如,抗体或抗体片段,TCR或TCR片段)。在一些实施例中,所述支持肿瘤的抗原是存在于基质细胞或骨髓源性抑制细胞(MDSC)上的抗原。基质细胞可以分泌生长因子以促进微环境中的细胞分裂。MDSC细胞可以抑制T细胞增殖和活化。不希望受理论束缚,在一些实施例中,表达CAR的细胞破坏支持肿瘤的细胞,从而间接地抑制肿瘤生长或存活。
在实施例中,基质细胞抗原选自以下中的一种或多种:骨髓基质细胞抗原2(BST2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)和腱生蛋白。在一些实施例中,FAP特异性抗体是西罗珠单抗,与西罗珠单抗竞争结合、或具有与西罗珠单抗相同的CDR。在实施例中,MDSC抗原选自以下中的一种或多种:CD33、CD11b、C14、CD15和CD66b。因此,在一些实施例中,所述支持肿瘤的抗原选自以下中的一种或多种:骨髓基质细胞抗原2(BST2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)或腱生蛋白、CD33、CD11b、C14、CD15、以及CD66b。
在一些实施例中,编码的CAR分子的抗原结合结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、骆驼科VHH结构域或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如,Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。
在一些情况下,可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如,Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如,Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上,如果采用短多肽接头(例如,5-10个氨基酸),则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例,参见例如,Hollinger等人,1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448;美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794;以及PCT公开号WO 2006/020258和WO2007/024715,所述文献通过引用并入本文中。
scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中,接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中,所述接头序列包含甘氨酸和丝氨酸重复序列组,如(Gly4Ser)n,其中n为等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:22)。在一些实施例中,接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。接头长度的变化可以保留或增强活性,从而在活性研究中产生优异的功效。
在另一方面,抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段,例如单链TCR(scTCR)。用于制备此类TCR的方法是本领域中已知的。参见例如Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]7:1369-1377(2000);Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]11:487-496(2004);Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]19(4):365-74(2012)(将参考文献以其整体并入本文)。例如,scTCR可以工程化为含有来自通过接头(例如柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和Vβ基因。此途径对于本身在细胞内的癌症相关靶标非常有用,然而,这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
在某些实施例中,编码的抗原结合结构域具有10-4M至10-8M的结合亲和力KD。
在一些实施例中,编码的CAR分子包含如下抗原结合结构域,所述抗原结合结构域对靶抗原的结合亲和力KD为10-4M至10-8M,例如10-5M至10-7M,例如10-6M或10-7M。在一些实施例中,所述抗原结合结构域的结合亲和力比参考抗体(例如本文所述的抗体)的结合亲和力低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。在一些实施例中,编码的抗原结合结构域的结合亲和力比参考抗体(例如,所述抗原结合结构域所来源的抗体)的结合亲和力低至少5倍。在一些方面,此类抗体片段是功能性的,因为它们提供生物学应答,所述生物学应答可以包括但不限于免疫应答的活化、起源于其靶抗原的信号转导的抑制、激酶活性的抑制等,如熟练技术人员所理解的那样。
在一些方面,CAR的抗原结合结构域是scFv抗体片段,所述scFv抗体片段与它所来源的scFv的鼠序列相比是人源化的。
在一些方面,本发明的CAR的抗原结合结构域(例如,scFv)由核酸分子编码,所述核酸分子的序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一些方面,本发明的整个CAR构建体由核酸分子编码,所述核酸分子的整个序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指如下发现:在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中有偏差。此种密码子简并性允许相同的多肽由多种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域中已知的,并且包括例如在至少美国专利号5,786,464和6,114,148中披露的方法。
在涉及被工程化为表达例如,如本文描述的CAR分子的免疫效应细胞的实施例中,应理解所述治疗方法可以还包括下文在关于嵌合抗原受体的章节中描述的任何步骤、方面或特征。
这些细胞优选地是免疫效应细胞。在一些实施例中,这些细胞是T细胞。在一些实施例中,这些细胞是NK细胞。在实施例中,本发明涉及本发明的细胞群体,例如本发明的免疫效应细胞群体。在实施例中,本发明的细胞群体包含所指示类型的细胞,并且可以包含其他类型(例如,被工程化为表达例如,如本文描述的CAR分子的免疫效应细胞群体(例如T细胞)可以包含被工程化为表达CAR分子的T细胞以及未被工程化为表达CAR分子的T细胞(或其他细胞类型))。在实施例中,用于本发明的方法中的细胞群体基本上由所指示类型的细胞组成。在实施例中,本发明的细胞群体基本上不含其他细胞类型。在实施例中,本发明的细胞群体由所指示的细胞类型组成。
在任何前述方面和实施例中,细胞和/或细胞群体是或包含免疫效应细胞,例如免疫效应细胞群体包含T细胞或NK细胞,例如由T细胞或NK细胞组成。在实施例中,这些细胞是T细胞,例如CD8+T细胞、CD4+T细胞或它们的组合。在实施例中,这些细胞是NK细胞。
在实施例中,这些细胞是人细胞。在实施例中,这些细胞例如对于有待施用这些细胞的受试者是自体的。在实施例中,这些细胞例如对于有待施用这些细胞的受试者是同种异体的。
一般而言,在本文所述的方法中,本文所述的组合物将经由本领域中已知的任何常用和可接受的方式,以如上所述的治疗有效量单独地或与一种或多种治疗剂组合施用。在特定的实施例中,组合物通过注射施用。在又特定实施例中,对于体内施用,将组合物皮下施用给需要其的受试者。在其他实施例中,可以在所需的作用位点以植入物的形式施用组合物。作用位点可以由本领域技术人员根据受试者的需要确定。
CAR靶标
本文所述的是病毒载体以转导免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞),这些免疫效应细胞被工程化为含有一种或多种CAR,所述一种或多种CAR将免疫效应细胞引导至不希望的细胞(例如,癌细胞)。这通过CAR上的抗原结合结构域实现,所述抗原结合结构域对癌症相关抗原具有特异性。存在两类可以通过本发明的CAR靶向的癌症相关抗原(肿瘤抗原):(1)在癌细胞表面上表达的癌症相关抗原;和(2)本身在细胞内的癌症相关抗原,然而,这种抗原(肽)的片段通过MHC(主要组织相容性复合物)呈递在癌细胞的表面上。
在一些实施例中,所述肿瘤抗原选自以下中的一种或多种:CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319、以及19A24);C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1);CD33;表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII);神经节苷脂G2(GD2);神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer);TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr));前列腺特异性膜抗原(PSMA);受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1);Fms样酪氨酸激酶3(FLT3);肿瘤相关糖蛋白72(TAG72);CD38;CD44v6;癌胚抗原(CEA);上皮细胞粘附分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2);间皮素;白细胞介素11受体α(IL-11Ra);前列腺干细胞抗原(PSCA);蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21);血管内皮生长因子受体2(VEGFR2);Lewis(Y)抗原;CD24;血小板来源的生长因子受体β(PDGFR-β);阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4);CD20;叶酸受体α;受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu);黏蛋白1,细胞表面相关的(MUC1);表皮生长因子受体(EGFR);神经细胞粘附分子(NCAM);前列腺酶;前列腺酸性磷酸酶(PAP);突变的延伸因子2(ELF2M);肝配蛋白B2;成纤维细胞活化蛋白α(FAP);胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体),碳酸酐酶IX(CAIX);蛋白酶体(Prosome,Macropain)亚基,β型,9(LMP2);糖蛋白100(gp100);由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl);酪氨酸酶;肝配蛋白A型受体2(EphA2);岩藻糖基GM1;唾液酸Lewis粘附分子(sLe);神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer);转谷氨酰胺酶5(TGS5);高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMWMAA);o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2);叶酸受体β;肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248);肿瘤内皮标记7相关的(TEM7R);密封蛋白6(CLDN6);促甲状腺激素受体(TSHR);G蛋白偶联受体C类5组,成员D(GPRC5D);染色体X可读框61(CXORF61);CD97;CD179a;间变性淋巴瘤激酶(ALK);聚唾液酸;胎盘特异性1(PLAC1);globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分;乳腺分化抗原(NY-BR-1);尿溶蛋白2(UPK2);甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1);肾上腺素受体β3(ADRB3);泛连接蛋白3(PANX3);G蛋白偶联受体20(GPR20);淋巴细胞抗原6复合物,基因座K 9(LY6K);嗅觉受体51E2(OR51E2);TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP);肾母细胞瘤蛋白(WT1);癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1);癌/睾丸抗原2(LAGE-1a);黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1);ETS易位变异基因6,位于染色体12p上(ETV6-AML);精子蛋白17(SPA17);X抗原家族,成员1A(XAGE1);血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2);黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1);黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2);Fos相关的抗原1;肿瘤蛋白p53(p53);p53突变体;前列腺特异性蛋白(prostein);存活蛋白(surviving);端粒酶;前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖蛋白8)、T细胞1识别的黑色素瘤抗原(MelanA或MART1);大鼠肉瘤(Ras)突变体;人端粒酶逆转录酶(hTERT);肉瘤易位断点;黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP);ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因);N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17);配对盒蛋白Pax-3(PAX3);雄激素受体;细胞周期蛋白B1;v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN);Ras同源物家族成员C(RhoC);酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2);细胞色素P450 1B1(CYP1B1);CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)),T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3);配对盒蛋白Pax-5(PAX5);前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1);淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK);激酶锚蛋白4(AKAP-4);滑膜肉瘤,X断点2(SSX2);晚期糖基化终产物受体(RAGE-1);肾遍在蛋白1(RU1);肾遍在蛋白2(RU2);Legumain;人乳头状瘤病毒E6(HPV E6);人乳头状瘤病毒E7(HPV E7);肠羧酸酯酶;突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1);IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89);白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2);CD300分子样家族成员f(CD300LF);C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A);骨髓基质细胞抗原2(BST2);含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2);淋巴细胞抗原75(LY75);磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3);Fc受体样5(FCRL5);以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
CD19
非限制性示例性肿瘤抗原是CD19。结合CD19的CAR是本领域已知的。例如,在WO2012/079000和WO 2014/153270中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD19 CAR,例如任何已知的CD19CAR的CD19抗原结合结构域。例如,LG-740;CD19 CAR描述于以下中:美国专利号8,399,645;美国专利号7,446,190;Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012);Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013);Brentjens等人,Blood[血液]118(18):4817-4828(2011);Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010);Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013);以及16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)[美国基因与细胞治疗学会(ASGCT)第16届年度会议](5月15-18日,盐湖城)2013,文摘10。
非限制性的示例性CD19 CAR包括本文所述的CD19 CAR、或描述于以下中的抗CD19CAR:Xu等人Blood[血液]123.24(2014):3750-9;Kochenderfer等人Blood[血液],122.25(2013):4129-39;Cruz等人Blood[血液]122.17(2013):2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT 02456350、NCT 00840853、NCT 02659943、NCT 02650999、NCT 02640209、NCT 01747486、NCT 02546739、NCT 02656147、NCT 02772198、NCT 00709033、NCT02081937、NCT 00924326、NCT 02735083、NCT 02794246、NCT 02746952、NCT 01593696、NCT02134262、NCT 01853631、NCT 02443831、NCT 02277522、NCT 02348216、NCT 02614066、NCT02030834、NCT 02624258、NCT 02625480、NCT 02030847、NCT 02644655、NCT 02349698、NCT02813837、NCT 02050347、NCT 01683279、NCT 02529813、NCT 02537977、NCT 02799550、NCT02672501、NCT 02819583、NCT 02028455、NCT 01840566、NCT 01318317、NCT 01864889、NCT02706405、NCT 01475058、NCT 01430390、NCT 02146924、NCT 02051257、NCT 02431988、NCT01815749、NCT 02153580、NCT 01865617、NCT 02208362、NCT 02685670、NCT 02535364、NCT02631044、NCT 02728882、NCT 02735291、NCT 01860937、NCT 02822326、NCT 02737085、NCT02465983、NCT 02132624、NCT 02782351、NCT 01493453、NCT 02652910、NCT 02247609、NCT01029366、NCT 01626495、NCT 02721407、NCT 01044069、NCT 00422383、NCT 01680991、NCT02794961或NCT 02456207,这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中,所述CD19 CAR包含在WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的融合多肽序列,其提供特异性结合至人CD19的鼠来源的scFv片段。
在一些实施例中,CD19 CAR包含在WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的氨基酸序列。
在一些实施例中,CD19 CAR包含氨基酸序列:
diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:675)、或与其基本上同源的序列。
在一些实施例中,CD19 CAR包含氨基酸序列:eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvss(SEQ ID NO:676)
在一些实施例中,CD19 CAR是人源化的CD19 CAR,其包含氨基酸序列:
eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:677)
在一些实施例中,CD19 CAR包含序列,例如披露于以下表1中的CDR、VH、VL、scFv、或全长-CAR序列,或与其具有至少80%、85%、90%、95%、或99%同一性的序列。
表1.示例性抗CD19分子的氨基酸序列
BCMA
非限制性示例性肿瘤抗原是BCMA。结合BCMA的CAR是本领域已知的。例如,披露于WO 2016/014565或WO 2019/241426的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的BCMACAR,例如任何已知的BCMA CAR的BCMA抗原结合结构域。例如WO 2016/014565中披露的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2或C13F12.1。
在一些实施例中,所述BCMA CAR包含披露于WO 2016/014565中的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2、或C13F12.1的一种或多种CDR、VH、VL、scFv、或全长序列、或基本上(例如,95%-99%)与其相同的序列。
在一些实施例中,BCMA CAR包含序列,例如披露于表2-14中的CDR、VH、VL、scFv、或全长-CAR序列,或与其具有至少80%、85%、90%、95%、或99%同一性的序列。
表2.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
表3.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
表4.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
表5.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
表6.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
表7.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
表8.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
表9.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
表14.基于PI61的示例性抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
表10.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
表11.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
表12.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
表13.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
在一些实施例中,使用来自WO 2012/0163805(将其通过引用以其整体特此并入)的VH和VL序列产生BCMA CAR。在一些实施例中,可以使用来自WO 2019/241426(将其通过引用以其整体特此并入)的CDR、VH、VL、scFv或完整CAR序列产生BCMA CAR。
其他示例性靶标
另外的非限制性示例性肿瘤抗原包括CD20、CD22、EGFR、CD123和CLL-1。
结合CD20的CAR是本领域已知的。例如,在WO 2018/067992或WO 2016/164731(通过引用并入本文)中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD20 CAR,例如任何已知的CD20 CAR的CD20抗原结合结构域。示例性的结合CD20的序列或CD20 CAR序列披露于例如WO 2018/067992(通过引用并入本文)的表1-5。在一些实施例中,CD20 CAR包含在WO2018/067992或WO 2016/164731(两者通过引用并入本文)中披露的CD20 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。
结合CD22的CAR是本领域已知的。例如,在WO 2018/067992或WO 2016/164731中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD22 CAR,例如任何已知的CD22 CAR的CD22抗原结合结构域。
示例性CD22结合序列或CD22 CAR序列披露于例如WO 2016164731的表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A、和10B以及WO 2018067992的表6-10中。在一些实施例中,CD22CAR序列包含WO 2018067992或WO 2016164731中披露的CD22 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。
在实施例中,CAR包含结合CD22的抗原结合结构域(CD22 CAR)。在一些实施例中,抗原结合结构域靶向人CD22。在一些实施例中,抗原结合结构域包括如本文所述的单链Fv序列。
人CD22 CAR的序列在如下提供。在一些实施例中,人CD22 CAR是CAR22-65。
人CD22 CAR scFv序列
人CD22 CAR重链可变区
人CD22 CAR轻链可变区
表15.CD22 CAR的重链可变区CDR(CAR22-65)
表16.CD22 CAR的轻链可变区CDR(CAR22-65)。所述表中的LC CDR序列在卡巴特或组合定义下具有相同的序列。
结合EGFR的CAR是本领域已知的。例如,在WO 2014/130657(通过引用并入本文)中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的EGFR CAR,例如任何已知的EGFR CAR的EGFR抗原结合结构域。示例性的EGFRvIII CAR可以包括WO 2014/130657(通过引用并入本文)例如WO 2014/130657的表2中披露的CDR、可变区、scFv或全长CAR序列。
结合CD123的CAR是本领域已知的。例如,在WO 2014/130635或WO 2016/028896中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD123 CAR,例如任何已知的CD123CAR的CD123抗原结合结构域。例如,WO 2014/130635中披露的CAR1至CAR8;或WO 2016/028896中披露的CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如,包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR;和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2014/130635和WO 2016/028896中指定。
结合CLL-1的CAR是本领域已知的。例如,在US 2016/0051651 A1(通过引用并入本文)中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CLL-1CAR,例如任何已知的CLL-1CAR的CLL-1抗原结合结构域。
在一些实施例中,CAR包含根据WO 2016/014535(通过引用并入本文)的表2的CLL-1CAR或抗原结合结构域。编码CLL-1CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如,包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR;和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/014535中指定。
结合CD33的CAR是本领域已知的。例如,在US 2016/0096892 A1和WO 2016/014576(通过引用并入本文)中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD33 CAR,例如任何已知的CD33 CAR的CD33抗原结合结构域。例如,WO 2016/014576中披露的CAR33-1至CAR33-9。
在一些实施例中,CAR包含根据WO 2016/014576(通过引用并入本文)的表2或9的CD33 CAR或抗原结合结构域。编码CD33 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如,包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR;和一个、两个、三个VLCDR)在WO 2016/014576中指定。
结合间皮素的CAR是本领域已知的。例如,WO 2015090230和WO 2017112741(通过引用并入本文,例如WO 2017112741的表2、3、4和5)中披露的结合间皮素的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的间皮素CAR,例如任何已知的间皮素CAR的间皮素抗原结合结构域。
结合GFRα-4的CAR是本领域已知的。例如,在WO 2016/025880中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的GFRα-4CAR,例如任何已知的GFRα-4CAR的GFRα-4抗原结合结构域。编码GFRα-4CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如,包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR;和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/025880中指定。
抗原结合结构域结构
在一些实施例中,编码的CAR分子的抗原结合结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、骆驼科VHH结构域或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如,Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。
在一些情况下,可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如,Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如,Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上,如果采用短多肽接头(例如,5-10个氨基酸),则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例,参见例如,Hollinger等人,1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448;美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794;以及PCT公开号WO 2006/020258和WO2007/024715,所述文献通过引用并入本文中。
scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中,接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中,接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复序列,如(Gly4Ser)n,其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:22)。在一些实施例中,接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。接头长度的变化可以保留或增强活性,从而在活性研究中产生优异的功效。
在另一方面,抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段,例如单链TCR(scTCR)。用于制备此类TCR的方法是本领域中已知的。参见例如Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]7:1369-1377(2000);Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]11:487-496(2004);Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]19(4):365-74(2012)(将参考文献以其整体并入本文)。例如,scTCR可以工程化为含有来自通过接头(例如柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和Vβ基因。此途径对于本身在细胞内的癌症相关靶标非常有用,然而,这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
在某些实施例中,编码的抗原结合结构域具有10-4M至10-8M的结合亲和力KD。
在一些实施例中,编码的CAR分子包含如下抗原结合结构域,所述抗原结合结构域对靶抗原的结合亲和力KD为10-4M至10-8M,例如10-5M至10-7M,例如10-6M或10-7M。在一些实施例中,所述抗原结合结构域的结合亲和力比参考抗体(例如本文所述的抗体)的结合亲和力低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。在一些实施例中,编码的抗原结合结构域的结合亲和力比参考抗体(例如,所述抗原结合结构域所来源的抗体)的结合亲和力低至少5倍。在一些方面,此类抗体片段是功能性的,因为它们提供生物学应答,所述生物学应答可以包括但不限于免疫应答的活化、起源于其靶抗原的信号转导的抑制、激酶活性的抑制等,如熟练技术人员所理解的那样。
在一些方面,CAR的抗原结合结构域是scFv抗体片段,所述scFv抗体片段与它所来源的scFv的鼠序列相比是人源化的。
在一些方面,本文所述的CAR的抗原结合结构域(例如,scFv)由核酸分子编码,所述核酸分子的序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一些方面,本发明的整个CAR构建体由核酸分子编码,所述核酸分子的整个序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指如下发现:在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中有偏差。此种密码子简并性允许相同的多肽由多种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域中已知的,并且包括例如在至少美国专利号5,786,464和6,114,148中披露的方法。
特异性抗原抗体对是本领域已知的。抗原抗体对及其组分的非限制性示例性实施例在本文以上标题为靶标的部分中及以下提供。
CD19
在一些实施例中,抗原结合结构域结合CD19并且具有与描述于Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中的FMC63 scFv片段相同或相似的结合特异性。在一些实施例中,抗原结合结构域结合CD19并且包括在Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中描述的scFv片段。
在一些实施例中,抗原结合结构域(例如,人源化抗原结合结构域)结合CD19并且包含来自WO 2014/153270(通过引用并入本文)的表3的序列。WO 2014/153270还描述了测定多种CAR构建体的结合和功效的方法。
对于临床环境,鼠CD19抗体的人源化可以是所希望的,其中小鼠特异性残基在接受CART19治疗(即,用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中可以诱导人-抗-小鼠抗原(HAMA)应答。人源化CD19CAR序列的产生、表征和功效描述于国际申请WO 2014/153270中,将所述文献通过引用以其整体并入本文,包括实例1-5(第115-159页)。
在一些实施例中,抗原结合结构域包含WO 2012/079000(通过引用并入本文)中提供的CAR19构建体的亲本小鼠scFv序列。在一些实施例中,抗原结合结构域结合CD19并且包含WO 2012/079000中描述的scFv。
BCMA
结合BCMA的示例性抗原结合结构域披露于WO 2012/0163805、WO 2017/021450、WO2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US 2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US2017/0051252、US 2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO2015/172800、WO 2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US2015/0368351、US 2017/0051068、US 2016/0368988、和US 2015/0232557中,将其内容通过引用并入本文。在一些实施例中,其中披露的一个或多个BCMA抗原结合结构域的抗原结合结构域。
在一些实施例中,抗原结合结构域包含人抗体或结合BCMA的人抗体片段。在一些实施例中,抗原结合结构域包含本文(例如,表2-14中)所述的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如,全部三个)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3,和/或本文(例如,表2-14中)所述的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如,全部三个)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些实施例中,人抗BCMA结合结构域包含本文(例如,表2、表6和表10中)所述的人VL和/或本文(例如,表2、表6和表10中)所述的人VH。在一些实施例中,抗原结合结构域是scFv,所述scFv包含表2、表6和表10的氨基酸序列的VL和VH。在一些实施例中,抗原结合结构域(例如,scFv)包含:VL,所述VL包含具有表2、表6和表10中提供的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如置换,例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换,例如保守置换)的氨基酸序列,或与表2、6和10的氨基酸序列具有95%-99%的同一性的序列;和/或VH,所述VH包含具有表2、表6和表10中提供的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如置换,例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换,例如保守置换)的氨基酸序列,或与表2、6和10的氨基酸序列具有95%-99%的同一性的序列。
在某些实施例中,本文所述的抗原结合结构域包括:
(1)选自以下中的一个、两个或三个轻链(LC)CDR:
(i)SEQ ID NO:54的LC CDR1、SEQ ID NO:55的LC CDR2和SEQ ID NO:56的LCCDR3;和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR:
(i)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:84的HCCDR3;(ii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:46的HC CDR3;(iii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:68的HC CDR3;或(iv)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:76的HC CDR3。
在某些实施例中,本文所述的抗原结合结构域包括:
(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR:
(i)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:131的LC CDR2和SEQ ID NO:132的LCCDR3;(ii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:96的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LC CDR3;(iii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:115的LC CDR3;或(iv)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LC CDR3;和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR:
(i)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:130的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HCCDR3;(ii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:87的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HC CDR3;或(iii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:109的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HC CDR3。
在某些实施例中,本文所述的抗原结合结构域包括:
(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR:
(i)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:182的LC CDR2和SEQ ID NO:183的LCCDR3;(ii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:148的LC CDR2和SEQ ID NO:149的LCCDR3;或(iii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:170的LC CDR2和SEQ ID NO:171的LCCDR3;和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR:
(i)SEQ ID NO:179的HC CDR1、SEQ ID NO:180的HC CDR2和SEQ ID NO:181的HCCDR3;(ii)SEQ ID NO:137的HC CDR1、SEQ ID NO:138的HC CDR2和SEQ ID NO:139的HCCDR3;或(iii)SEQ ID NO:160的HC CDR1、SEQ ID NO:161的HC CDR2和SEQ ID NO:162的HCCDR3。
在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、84、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、46、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:44、45、68、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、76、54、55和56的氨基酸序列。
在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、84、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、46、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:47、48、68、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、76、57、58和59的氨基酸序列。
在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、85、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、51、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:49、50、69、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中,HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、77、60、58和56的氨基酸序列。
其他示例性靶标
结合CD20的示例性抗原结合结构域描述于WO 2016/164731和WO 2018/067992(通过引用并入本文)中。在一些实施例中,其中披露的一个或多个CD20抗原结合结构域的抗原结合结构域。
结合CD22的示例性抗原结合结构域描述于WO 2016/164731和WO 2018/067992(通过引用并入本文)中。
在一些实施例中,抗原结合结构域包含表15中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在实施例中,抗原结合结构域还包含LC CDR1、LCCDR2、和LC CDR3。在实施例中,抗原结合结构域包含表16中列出的LC CDR1、LC CDR2、和LCCDR3氨基酸序列。
在一些实施例中,抗原结合结构域包含表16中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部,以及表15中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。
在WO 2014/130657中描述了结合EGFRvIII的示例性抗原结合结构域。
结合CD123的示例性抗原结合结构域描述于WO 2014/130635和WO 2016/028896(通过引用并入本文)中。
在一些实施例中,抗原结合结构域包含来自WO 2014/130635(通过引用并入本文)的表1-2的序列。
在一些实施例中,抗原结合结构域包含来自WO 2016/028896(通过引用并入本文)的表2、6和9的序列。
结合CLL-1的示例性抗原结合结构域在WO 2016/014535(通过引用并入本文)中披露。
在一些实施例中,抗原结合结构域包含一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR,HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3,这些重链CDR来自本文所述的抗体(例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892A1、US 2014/0322275A1、或WO 2015/090230中的抗体),和/或一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR,LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3,这些轻链CDR来自本文所述的抗体(例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗体)。在一些实施例中,所述抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在实施例中,抗原结合结构域是WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230(通过引用并入本文)中描述的抗原结合结构域。
可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4等等,描述于例如WO 2014/153270、WO 2014/130635、WO 2016/028896、WO 2014/130657、WO 2016/014576、WO 2015/090230、WO 2016/014565、WO 2016/014535、和WO 2016/025880(其各自通过引用以其整体并入本文)中。
在一些实施例中,本文所述的任何CAR(例如CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4中的任一个)的抗原结合结构域包含来自上文列出抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR,HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3,和/或来自上文列出抗原结合结构域的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR,LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一些实施例中,抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施例中,所述抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3),和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一些实施例中,抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
双特异性CAR
在某些实施例中,抗原结合结构域是双特异性或多特异性分子(例如,多特异性抗体分子)。在一些实施例中,多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一些实施例中,第一和第二表位在相同抗原,例如,相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚单位)上。在一些实施例中,第一表位和第二表位重叠。在一些实施例中,第一表位和第二表位不重叠。在一些实施例中,第一表位和第二表位在不同的抗原,例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一些实施例中,双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一些实施例中,双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一些实施例中,双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段,以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一些实施例中,双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段,以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在一些实施例中,抗体分子是多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体分子。此类分子包括双特异性融合蛋白,例如含有两个scFv(它们之间具有亲水性螺旋肽接头)和一个完全恒定区的表达构建体,如例如在US 5637481中所描述;具有连接的VL和VH链(它们进一步用肽间隔区连接至抗体铰链区和CH3区)的微型抗体构建体,其可以二聚化形成双特异性/多价分子,如例如在US 5837821所述;VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的串,其通过肽键与C-末端的可交联基团连接,这些可交联基团进一步与VL结构域相关联以形成一系列FV(或scFv),如例如在US 5864019中所述;以及具有经肽接头连接的VH和VL结构域两者的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合成多价结构,以使用scFV或双体抗体类型形式形成例如同二价、异二价、三价和四价结构,如例如在US 5869620中所述。上述申请的内容通过引用以其整体并入本文中。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如scFv)内,VH可以在VL的上游或下游。在一些实施例中,上游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VL(VL1)上游布置有其VH(VH1),并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VH(VH2)上游布置有其VL(VL2),使得整个双特异性抗体分子具有布置VH1-VL1-VL2-VH2。在其他实施例中,上游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VH(VH1)上游布置有其VL(VL1),并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VL(VL2)上游布置有其VH(VH2),使得整个双特异性抗体分子具有布置VL1-VH1-VH2-VL2。任选地,如果构建体被布置为VH1-VL1-VL2-VH2则接头设置在两个抗体或抗体片段(例如scFv)之间,例如VL1与VL2之间,如果构建体被布置为VL1-VH1-VH2-VL2则接头设置在VH1与VH2之间。接头可以是如本文所述的接头,例如(Gly4-Ser)n接头,其中n是1、2、3、4、5或6,优选地是4(SEQ ID NO:691)。一般来说,两个scFv之间的接头应足够长以避免两个scFv的结构域之间的错配。任选地,接头设置在第一scFv的VL与VH之间。任选地,接头设置在第二scFv的VL与VH之间。在具有多个接头的构建体中,接头中的任何两个或更多个可以相同或不同。因此,在一些实施例中,双特异性CAR在如本文描述的布置中包含VL、VH、和任选一个或多个接头。
1.跨膜结构域
关于跨膜结构域,在各种实施例中,本文所述的嵌合分子(例如,CAR)可以被设计成包含附接至所述嵌合分子的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸,例如与跨膜来源的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如所述细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白来源的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如所述细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10多至15个氨基酸)。在一些方面,跨膜结构域与嵌合蛋白(例如,CAR)的其他结构域中的一个缔合,例如在一些实施例中,跨膜结构域可以来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所来源的相同蛋白质。在另一个方面,跨膜结构域不源自嵌合蛋白(例如,CAR)的任何其他结构域所来源的相同蛋白质。在一些情况下,可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域,以避免此类域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合,例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一些方面,跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一种CAR同源二聚化。在不同的方面,可以修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列,以便最小化与存在于相同表达CAR的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下,所述结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。在一些方面,每当CAR结合靶标时,跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的一个或多个跨膜区。在一些实施例中,跨膜结构域可以至少包括以下中的一个或多个跨膜区:例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D或NKG2C。
在一些情况下,跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)附接到CAR的细胞外区域(例如CAR的抗原结合结构域)。例如,在一些实施例中,铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链、IgD铰链)、GS接头(例如本文所述的GS接头)、KIR2DS2铰链或CD8a铰链。在一些实施例中,铰链或间隔区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(例如由其组成)。在一些方面,跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的跨膜结构域(例如由其组成)。
在一些实施例中,编码的跨膜结构域包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的CD8跨膜结构域的氨基酸序列,或与SEQID NO:12的氨基酸序列具有95%-99%同一性的序列。在一些实施例中,编码的跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的序列。
在其他实施例中,编码CAR的核酸分子包含CD8跨膜结构域的核苷酸序列,例如包含SEQ ID NO:13的序列,或其具有95%-99%同一性的序列。
在一些实施例中,编码的抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一些实施例中,编码的铰链区包含CD8铰链的氨基酸序列,例如SEQ ID NO:4;或IgG4绞链的氨基酸序列,例如SEQ ID NO:6,或与SEQ ID NO:4或6具有95%-99%同一性的序列。在其他实施例中,编码铰链区的核酸序列包含分别对应于CD8铰链或IgG4铰链的SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:7的序列,或与SEQ ID NO:5或7具有95%-99%同一性的序列。
在一些方面,铰链或间隔区包含IgG4铰链。例如,在一些实例中,铰链或间隔区包含氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:6)的铰链。在一些实施例中,铰链或间隔区包含由GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTG GTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQ ID NO:7)的核苷酸序列编码的铰链。
在一些方面,铰链或间隔区包含IgD铰链。例如,在一些实例中,铰链或间隔区包含氨基酸序列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ ID NO:8)的铰链。在一些实施例中,铰链或间隔区包含由AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:9)的核苷酸序列编码的铰链。
在一些方面,跨膜结构域可以是重组的,在这种情况下其将主要包含疏水性残基,如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面,可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地,长度在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如,在一些方面,接头包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。在一些实施例中,接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:11)的核苷酸序列编码。
在一些方面,铰链或间隔区包含KIR2DS2铰链。
2.信号传导结构域
在具有细胞内信号传导结构域的本发明实施例中,这种结构域可以含有例如初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域中的一个或多个。在一些实施例中,细胞内信号传导结构域包含编码初级信号传导结构域的序列。在一些实施例中,细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中,细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。
本发明的CAR的胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地,短的寡肽或多肽接头,例如,长度在2与10个氨基酸之间(例如,2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)可以形成细胞内信号传导序列之间的键联。在一些实施例中,甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一些实施例中,单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。
在一些方面,细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在一些实施例中,两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如本文描述的接头分子)分开。在一些实施例中,细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中,接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中,接头是丙氨酸残基。
初级信号传导结构域
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在CAR中,此类域用于相同目的。
含有在本发明中特别使用的初级细胞内信号传导结构域的ITAM的实例包括以下的那些:CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10、以及DAP12。在一些实施例中,本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域,例如CD3-ζ的初级信号传导结构域。
在一些实施例中,编码的初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。编码的CD3ζ初级信号传导结构域可以包含具有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列,或与SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有95%-99%同一性的序列。在一些实施例中,编码的初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列。在其他实施例中,编码初级信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的序列,或其具有95%-99%同一性的序列。
共刺激信号传导结构域
在一些实施例中,编码的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。例如,细胞内信号传导结构域可以包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在一些实施例中,编码的共刺激信号传导结构域包含选自以下中的一种或多种的蛋白质的功能性信号传导结构域:CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性地结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、以及NKG2D。
在一些实施例中,编码的共刺激信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95%-99%同一性的序列。在一些实施例中,编码的共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列。在其他实施例中,编码共刺激信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的序列,或其具有95%-99%同一性的序列。
在其他实施例中,编码的细胞内结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列,和SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列,其中包含细胞内信号传导结构域的序列在同一框架中表达并且表达为单个多肽链。
在一些实施例中,编码细胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的序列,或其具有95%-99%同一性的序列;以及SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的序列,或其具有95%-99%同一性的序列。
在一些实施例中,所述核酸分子进一步编码前导序列。在一些实施例中,前导序列包含SEQ ID NO:2的序列。
在一些方面,细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一些方面,细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一些方面,4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:14的信号传导结构域。在一些方面,CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:18的信号传导结构域。
在一些方面,细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一些方面,CD27的信号传导结构域包含QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一些方面,CD27的信号传导结构域由AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:17)的核酸序列编码。
抑制性结构域
在一些实施例中,载体包含编码CAR(例如,本文描述的CAR)的核酸序列,和编码包含以下的抑制性分子的核酸序列:inhKIR胞质结构域;跨膜结构域,例如KIR跨膜结构域;和抑制剂胞质结构域,例如ITIM结构域,例如inhKIR ITIM结构域。在一些实施例中,抑制性分子是天然存在的inhKIR,或与天然存在的inhKIR共有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%同源性或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的序列。
在一些实施例中,编码抑制性分子的核酸序列包含:SLAM家族胞质结构域;跨膜结构域,例如SLAM家族跨膜结构域;和抑制剂胞质结构域,例如SLAM家族结构域,例如SLAM家族ITIM结构域。在一些实施例中,抑制性分子是天然存在的SLAM家族成员,或与天然存在的SLAM家族成员共有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%同源性或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的序列。
在一些实施例中,载体是体外转录的载体,例如转录本文描述的核酸分子的RNA的载体。在一些实施例中,载体中的核酸序列还包含聚(A)尾,例如聚A尾。在一些实施例中,载体中的核酸序列还包含3’UTR,例如本文描述的3’UTR,例如包含源自人β-球蛋白的3’UTR的至少一个重复。在一些实施例中,载体中的核酸序列还包含启动子,例如T2A启动子。
启动子
在一些实施例中,载体还包含启动子。在一些实施例中,所述启动子选自EF-1启动子、CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、泛素C启动子或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一些实施例中,启动子是EF-1启动子。在一些实施例中,EF-1启动子包含SEQ ID NO:1的序列。
在本方面的一些方面,可以使用任何数量的本领域技术人员已知的技术(如FicollTM分离)从自受试者收集的血液单位获得免疫效应细胞,例如T细胞。在一些方面,通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产物典型地含有淋巴细胞,包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞、和血小板。在一些方面,可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分,并且任选地将细胞悬浮在缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施例中,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代性实施例中,洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁,或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。
表17:CAR的多种组分的序列(aa-氨基酸,na-编码相应蛋白质的核酸)
体外CAR-T制造
尽管本文考虑的方法涉及细胞的体内转导,但也认识到体外制备的挑战。
在一些实施例中,例如通过本文所述的方法对转导了本文所述的病毒载体的细胞进行扩增。在一些实施例中,使细胞在培养物中扩增数小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的一段时间。在一些实施例中,使细胞扩增4至9天的一段时间。在一些实施例中,使细胞扩增8天或更少(例如7、6或5天)的一段时间。在一些实施例中,使细胞在培养物中扩增5天,并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以例如通过各种T细胞功能来定义,例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、活化、迁移、或其组合。在一些实施例中,与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比,扩增5天的细胞在抗原刺激后显示细胞倍增的至少一倍、两倍、三倍或四倍增加。在一些实施例中,使细胞在培养物中扩增5天,并且与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比,所得细胞表现出更高的促炎性细胞因子产生(例如,IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一些实施例中,与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比,扩增5天的细胞显示促炎性细胞因子产生(例如,IFN-γ和/或GM-CSF水平)的至少一倍、二倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍增加(pg/ml)。
在不存在钙的情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的,洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成,如通过根据制造商说明书使用半自动“流通”离心机(例如,Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver5)。在洗涤后,可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中,例如像无Ca、无Mg的PBS、勃脈力-A(PlasmaLyte A)、或者含有或不含缓冲液的其他盐溶液。替代性地,可以除去单采血液成分术样品中不希望的组分,并将细胞直接重悬于培养基中。
应当认识到,本申请的体外方法可利用包含5%或更少(例如2%)的人AB血清的培养基条件,并使用已知的培养基条件和组合物,例如描述于以下的那些:Smith等人,“Exvivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novelXeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继免疫治疗的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4,e31;doi:10.1038/cti.2014.31。
在一些方面,通过例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘洗来裂解红细胞和耗减单核细胞,从外周血淋巴细胞分离T细胞。分离的T细胞可进一步用于本文所述的方法。
本文所述的方法可以包括,例如使用例如(例如本文所述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群,所述亚群是T调节性细胞耗减的群体,CD25+耗减的细胞。优选地,T调节性耗减的细胞群体含有少于30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%的CD25+细胞。
在一些实施例中,使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体(IL-2)从群中去除调节性T细胞,例如CD25+T细胞。在一些实施例中,将抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体与底物(例如珠)缀合、或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一些实施例中,抗CD25抗体或其片段与本文所述的底物缀合。
在一些实施例中,使用来自MiltenyiTM的CD25耗减药剂从所述群体除去T调节性细胞(例如CD25+T细胞)。在一些实施例中,细胞与CD25耗减药剂的比率是1×107个细胞比20μL、或1x107个细胞比15μL、或1x107个细胞比10μL、或1x107个细胞比5μL、或1x107个细胞比2.5μL、或1x107个细胞比1.25μL。在一些实施例中,例如对于T调节性细胞(例如CD25+)耗减,使用大于5亿个细胞/ml。在另外的方面,使用6、7、8、或9亿个细胞/ml的细胞浓度。
在一些实施例中,有待耗减的免疫效应细胞群体包括约6x109个CD25+T细胞。在其他方面,有待耗减的免疫效应细胞群体包括约1x109至1x1010个CD25+T细胞,以及其间的任何整数值。在一些实施例中,所得群体T调节性耗减的细胞具有2x109个T调节性细胞(例如,CD25+细胞)或更少(例如,1x109个、5x108个、1x108个、5x107个、1x107个或更少的CD25+细胞)。
在一些实施例中,使用具有耗减管组(例如像管162-01)的CliniMAC系统从所述群体除去T调节性细胞(例如CD25+细胞)。在一些实施例中,将CliniMAC系统在耗减设置(例如像DEPLETION2.1)上运行。
不希望受特定理论的束缚,在单采血液成分术之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如,减少不需要的免疫细胞(例如TREG细胞)的数量)可以降低受试者复发的风险。例如,耗减TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗减、及其组合。
在一些实施例中,制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低例如,耗减)TREG细胞的数量。例如,制造方法包括使样本(例如单采血液成分术样本)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触,例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减TREG细胞。
在一些实施例中,在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前,用一种或多种减少TREG细胞的疗法预先治疗受试者,从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一些实施例中,减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间或之后发生。
在一些实施例中,在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前,用环磷酰胺预先治疗受试者,从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一些实施例中,在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前,用抗GITR抗体预先治疗受试者,从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。
在一些实施例中,有待除去的细胞群体既不是调节性T细胞、或肿瘤细胞,也不是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标志的细胞)。在一些实施例中,设想将此类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行去除,或在所述耗减之后,或以另一种顺序去除。
本文所述的方法可以包括多于一个的选择步骤,例如多于一个的耗减步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标志的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群体。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择,所述负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。例如,为了通过阴性选择富集CD4+细胞,单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。
本文所述的方法可以还包括从表达肿瘤抗原(例如不包含CD25的肿瘤抗原,例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体除去细胞,从而提供T调节性耗减的(例如CD25+耗减的)和肿瘤抗原耗减的细胞群体,所述细胞群体适于表达CAR(例如本文所述的CAR)。在一些实施例中,将表达肿瘤抗原的细胞与T调节性例如CD25+细胞同时除去。例如,抗CD25抗体或其片段、和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、或抗肿瘤抗原抗体或其片段的同一底物(例如珠),可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中,T调节性细胞(例如CD25+细胞)的除去和表达肿瘤抗原的细胞的除去是连续的,并且可以例如以任何顺序发生。
还提供了包括以下的方法:从表达检查点抑制剂(例如本文所述的检查点抑制剂)的群体除去细胞(例如PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种),从而提供T调节性耗减的(例如CD25+耗减的)细胞和检查点抑制剂耗减的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)的群体。示例性检查点抑制剂包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一些实施例中,将表达检查点抑制剂的细胞与T调节性例如CD25+细胞同时除去。例如,抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠,可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中,T调节性细胞(例如CD25+细胞)的除去和表达检查点抑制剂的细胞的除去是连续的,并且可以例如以任何顺序发生。
本文描述的方法可以包括阳性选择步骤。例如,可以通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合的珠(如M-450 CD3/CD28T)孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一些实施例中,所述时间段是约30分钟。在另外的实施例中,所述时间段的范围为从30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另外的实施例中,所述时间段是至少1、2、3、4、5、或6小时。在又另一个实施例中,所述时间段是10至24小时,例如24小时。与其他细胞类型相比,在存在较少T细胞的任何情况下,如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外,使用更长的孵育时间可以提高CD8+T细胞捕获的效率。因此,通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的),可以在培养起始时或在所述过程期间的其他时间点优先地选择或针对T细胞亚群。另外,通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠或其他表面上的比率,可以在培养起始时或在其他所希望的时间点优先地选择或针对T细胞亚群。在一些实施例中,可以选择表达以下中的一种或多种的T细胞群体:IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B、和穿孔素、或其他适当的分子(例如其他细胞因子)。用于筛选细胞表达的方法可以通过例如PCT公开号:WO 2013/126712中。
为了通过阳性或阴性选择分离希望的细胞群体,可以改变细胞和表面(例如颗粒(如珠))的浓度。在一些方面,可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如,增加细胞的浓度),以确保细胞和珠的最大接触。例如在一些方面,使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml或50亿/ml的浓度。在一些方面,使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一些方面,使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面,可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化、和细胞扩增。此外,使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)、或来自存在许多肿瘤细胞的样本(例如白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值,并且是希望获得的。例如,使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中,可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面(例如,颗粒如珠)的混合物,使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如,CD4+T细胞表达较高水平的CD28,并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一些方面,所使用的细胞浓度是5x106/ml。在其他方面,所使用的浓度可以是从约1x105/ml至1x106/ml,以及其间的任何整数值。
在其他方面,可以将这些细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚,冷冻和后续解冻步骤通过除去细胞群体中的粒细胞和一定程度的单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后,可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的,但一种方法涉及使用含有20%DMSO和8%人血清白蛋白的PBS,或含有10%葡聚糖40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5%DMSO的培养基,或含有31.25%Plasmalyte-A、31.25%葡萄糖5%、0.45%NaCl、10%葡聚糖40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5%DMSO的培养基,或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他适合的细胞冷冻培养基,然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。
在一些方面,如本文所述将冷冻保存的细胞解冻和洗涤,并允许在使用本发明的方法活化之前在室温静置1小时。
在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文描述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因此,可以在任何必要的时间点收集有待扩增的细胞来源,并且可以分离和冷冻所希望的细胞(如T细胞)以便以后在免疫效应细胞疗法中用于任何数量将受益于免疫效应细胞疗法(如本文描述的那些)的疾病或病症。在一些方面,血液样本或单采血液成分术取自基本健康的受试者。在一些方面,血液样本或单采血液成分术取自基本健康的受试者,所述受试者处于发展疾病的风险中,但尚未患发展疾病,并且将目的细胞分离并冷冻供以后使用。在一些方面,T细胞可以扩增、冷冻,并在以后使用。在一些方面,在诊断如本文所述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样本。在另外的方面,在任何数量的相关治疗方式之前,从受试者的血液样本或单采血液成分术分离细胞,这些相关治疗方式包括但不限于用以下进行治疗:药剂(如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和照射。
在本发明的另一个方面,在治疗后直接从患者获得T细胞使得受试者具有功能性T细胞。在这点上,已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫系统的药物的治疗)之后,在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久,所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或改善的。同样地,在使用本文描述的方法进行离体操作之后,这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此,在本发明的上下文中,预期在所述恢复期期间收集血细胞,包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外,在一些方面,动员(例如,用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病症,其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的,尤其是在治疗后确定的时间窗口。例证性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞、和其他细胞。
在一些实施例中,T细胞群体是甘油二酯激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质,或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传方法产生,例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防DGK表达。替代性地,可以通过用本文描述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。
在一些实施例中,T细胞群体是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞,Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生,例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防Ikaros表达。可替代地,可以通过用Ikaros抑制剂(例如,来那度胺(lenalidomide))处理产生Ikaros缺陷型细胞。
在实施例中,T细胞群体是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的,例如不表达DGK和Ikaros、或者具有降低、或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文描述的任何方法产生此类DGK和Ikaros缺陷型细胞。
在一些实施例中,从受试者获得NK细胞。在另一个实施例中,NK细胞是NK细胞系,例如NK-92细胞系(Conkwest公司)。
在特定的示例性方面,受试者可以经历白细胞单采法,其中离体收集、富集、或耗减白细胞以选择和/或分离目的细胞(例如T细胞)。这些T细胞分离物可以通过本文描述的方法扩增。有需要的受试者可以随后经历使用高剂量化疗的标准治疗,随后进行外周血干细胞移植。在某些方面,在移植之后或与之同时,受试者接受通过本发明的方法制备的扩增的CAR T细胞的输注。在另外的方面,在手术之前或之后施用扩增的细胞。
另外的表达的药剂
在本文考虑的实施例中,应理解,其他药剂可以被编码在上文描述的载体中。因此,以下关于表达CAR的细胞描述这些药剂。
在另一个实施例中,本文描述的表达CAR的免疫效应细胞可以进一步表达另一种药剂,例如增强表达CAR的细胞的活性的药剂。例如,在一些实施例中,药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。抑制性分子的实例包括例如,如本文描述的PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一些实施例中,对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如抑制性分子),所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文描述的细胞内信号传导结构域)相关联。在一些实施例中,所述药剂包含例如抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ、或这些中的任一者的片段)的第一多肽,和第二多肽,所述第二多肽是本文描述的细胞内信号传导结构域(例如,包含共刺激结构域(例如,41BB、CD27或CD28,例如如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如,本文描述的CD3ζ信号传导结构域)。在一些实施例中,所述药剂包含PD-1的第一多肽或其片段,和本文描述的细胞内信号传导结构域(例如,本文描述的CD28、CD27、OX40或4-IBB信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在一些实施例中,本文描述的表达CAR的免疫效应细胞可以还包含第二CAR,例如,包含例如针对相同靶标(例如,上述靶标)或不同靶标的不同抗原结合结构域的第二CAR。在一些实施例中,所述第二CAR包含针对在与第一CAR的靶标相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一些实施例中,表达CAR的免疫效应细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR,以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。虽然不希望受理论束缚,但是将共刺激信号传导结构域(例如,4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置于第一CAR上,并将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一些实施例中,表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR,所述第一CAR包含靶向例如上述靶标的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域;和第二CAR,所述第二CAR靶向除由所述第一CAR靶向的抗原以外的抗原(例如,在与第一靶标相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中,表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR,所述第一CAR包含靶向例如上述靶标的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域;和第二CAR,所述第二CAR靶向除由所述第一CAR靶向的抗原以外的抗原(例如,在与第一靶标相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对所述抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中,表达CAR的免疫效应细胞包含本文描述的CAR(例如,针对上述靶标的CAR)和抑制性CAR。在一些实施例中,抑制性CAR包含结合在正常细胞而非癌细胞(例如也表达所述靶标的正常细胞)上发现的抗原的抗原结合结构域。在一些实施例中,抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如,抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ的细胞内结构域。
在一些实施例中,免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞)包含第一CAR,所述第一CAR包含结合至如本文描述的肿瘤抗原的抗原结合结构域;和第二CAR,所述第二CAR包含PD1细胞外结构域或其片段。
在一些实施例中,所述细胞还包含如上所述的抑制性分子。
在一些实施例中,所述细胞中的第二CAR是抑制性CAR,其中所述抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。抑制性分子可以选自以下中的一个或多个:PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、CEACAM-1、CEACAM-3、和CEACAM-5。在一些实施例中,第二CAR分子包含PD1的细胞外结构域或其片段。
在实施例中,所述细胞中的第二CAR分子还包含细胞内信号传导结构域,所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或细胞内信号传导结构域。
在其他实施例中,所述细胞中的细胞内信号传导结构域包含含有CD3ζ的功能性结构域的初级信号传导结构域和含有4-1BB的功能性结构域的共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中,第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv,并且第二CAR分子的抗原结合结构域不包含scFv。例如,第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv,并且第二CAR分子的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。
CAR的构象
在本文考虑的实施例中,应理解,一个或多个CAR的构象可以被本文以上描述的载体调节。因此,以下关于表达CAR的细胞描述这些构象。
分离的CAR
在一些实施例中,表达CAR的细胞使用分离的CAR。分离的CAR方法更详细地描述于公开WO 2014/055442和WO 2014/055657中。简言之,分离的CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞,并且所述细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的第二CAR。当所述细胞遇到第一抗原时,共刺激结构域被活化,并且细胞增殖。当所述细胞遇到第二抗原时,细胞内信号传导结构域被活化并开始细胞杀伤活性。因此,所述表达CAR的细胞仅在两种抗原都存在下完全活化。
多重CAR
在一些方面,本文描述的表达CAR的细胞可以还包含第二CAR,例如包含例如针对相同靶标或不同靶标(例如,除本文描述的癌症相关抗原或本文描述的不同癌症相关抗原的靶标)的第二CAR。在一些实施例中,第二CAR包含针对在与癌症相关抗原相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一些实施例中,表达CAR的细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR,以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。虽然不希望受理论束缚,但是将共刺激信号传导结构域(例如,4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置于第一CAR上,并将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一些实施例中,表达CAR的细胞包含第一癌症相关抗原CAR,所述第一癌症相关抗原CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域;和第二CAR,所述第二CAR靶向不同靶抗原(例如,在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中,表达CAR的细胞包含第一CAR,所述第一CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域;和第二CAR,所述第二CAR靶向除第一靶抗原以外的抗原(例如,在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对所述抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中,要求保护的本发明包括第一CAR和第二CAR,其中所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施例中,所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域是scFv,而另一者不是scFv。在一些实施例中,所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含单个VH结构域,例如骆驼科、鲨鱼、或七鳃鳗单个VH结构域,或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施例中,所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施例中,所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。
一旦执行了本文所述的方法,各种测定可用于评估适当的体外和动物模型中的以下活性,例如抗原刺激后扩增T细胞的能力,在没有重新刺激的情况下维持T细胞扩增的能力以及抗癌活性。评估本发明的CAR的作用的测定是本领域技术人员已知的,并在下文中进行总体描述。
原代T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在。参见例如,Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。非常简单地,表达CAR的T细胞(CD4+和CD8+T细胞的1:1混合物)在体外扩增超过10天,然后在还原条件下进行裂解和SDS-PAGE。使用针对TCR-ζ链的抗体通过蛋白质印迹来检测含有全长TCR-ζ胞质结构域和内源性TCR-ζ链的CAR。相同的T细胞亚群用于在非还原条件下的SDS-PAGE分析,以允许评估共价二聚体的形成。
可以通过流式细胞术测量抗原刺激后CAR+T细胞的体外扩增。
还可以测量在没有再刺激的情况下持续的CAR+T细胞扩增。参见例如,Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之,在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激,以及在第1天用指示的CAR转导后,使用Coulter Multisizer III粒子计数器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter在培养的第8天测量平均T细胞体积(fl)。
动物模型也可用于测量CART活性。例如,可以使用异种移植模型,所述异种移植模型使用人本文描述的癌症相关抗原特异性CAR+T细胞来治疗免疫缺陷小鼠中的初级人前-BALL。参见例如,Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。
可以评估剂量依赖性CAR治疗应答。参见例如,Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。例如,在第21天用CAR T细胞、相同数量的模拟转导的T细胞、或无T细胞注射的小鼠中建立白血病之后35-70天获得外周血。将来自每组的小鼠随机放血以确定外周血如本文描述的癌症相关抗原+ALL胚细胞计数,并且然后在第35天和第49天处死。在第57天和第70天评价剩余的动物。
先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估,例如在Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)中。
可通过标准51Cr释放测定来评估细胞毒性。参见例如,Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。
成像技术可用于评估荷肿瘤的动物模型中CAR的特定运输和增殖。例如,Barrett等人,Human Gene Therapy[人基因疗法]22:1575-1586(2011)中已经描述了此类测定。
其他测定,包括本文实例部分中描述的那些测定以及本领域中已知的那些测定也可以用于评价本文描述的CAR。
治疗方法
在一些实施例中,本发明是一种治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的受试者的方法,所述方法包括:
向受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物;
其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含可操作地连接至核苷酸序列的表达控制序列,所述核苷酸序列表达被工程改造以靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。
在另一方面,本发明的特征在于一种治疗患有与肿瘤抗原(例如本文所述的抗原)的表达相关的疾病的受试者的方法,所述方法包含向所述受试者施用有效量的组合物,所述组合物包含介孔二氧化硅颗粒和本文所述的病毒载体,其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含可操作地连接至核苷酸序列的表达控制序列,所述核苷酸序列表达被工程改造以靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施例中,MSP是棒状的(MSR)。在一些实施例中,MSP(例如MSR)还包含多个吸附或共价键合在孔衬里和/或纳米通道衬里的表面上或MSP或MSR的表面上的官能团。如本文所用,“官能团”定义了直接或经由接头连接至MSR(例如,MSP)表面的化学部分。在一些实施例中,官能团是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分或其盐。在一些实施例中,可以将官能团(即-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐)与二氧化硅表面通过接头分开。在一些实施例中,官能团经由C1至C20烷基接头共价键合至MSP表面。在其他实施例中,官能团经由聚乙二醇接头共价键合至MSP表面。在特定的实施例中,聚乙二醇接头具有式(-O(CH2-CH2-)1-25。在特定的实施例中,表面修饰是C1至C20烷基全卤代烷基或C1至C20烷基全氟代烷基。
在所述方法的一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒和病毒载体之间的静电缀合是由于病毒载体和介孔二氧化硅颗粒电荷相反。例如但不受理论的束缚,通过聚乙烯亚胺或带正电荷的伯铵、仲铵、叔铵或季铵基团表面修饰的介孔二氧化硅颗粒(例如,MSR)可以与带负电荷的病毒载体缀合或缔合。因此,在一些实施例中,病毒载体带负电,而介孔二氧化硅颗粒(例如MSR)带正电。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒(例如,MSR)和病毒载体之间的共价缀合通过本领域技术人员已知的方法、通过接头或不通过接头来实现。例如但不限于,接头可以是聚乙二醇、烷基、聚合物、聚酰胺键等。
在一些实施例中,组合物还包含T细胞刺激化合物或肿瘤抗原,所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体或MSP(例如MSR)的两个群体上。可替代地,方法包括将介孔二氧化硅颗粒的第二群体与MSP(例如,MSR)的第一群体的施用组合(例如,同时或之后不久)施用。可替代地,可以在MSP的第一群体施用之后较长时间之后施用MSP(例如,MSR)的第二群体。
在一些实施例中,方法包含施用细胞因子,其中所述细胞因子缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一或第二群体上。
在一些实施例中,MSP(例如,MSR)的第二群体与MSP的第一群体同时向受试者施用(例如,在同一天施用),或在MSP的第一群体施用之后不久向受试者施用(例如,施用之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天施用)。在其他实施例中,在MSP的第一群体施用之后较长时间(例如,例如,至少2周、3周、4周、6周、8周、10周、或更长)之后,向受试者施用细胞因子。
在一些方面,在本文所述的方法中,可以如本文所述对介孔二氧化硅颗粒进行表面修饰。在一些实施例中,MSP(例如MSR)还包含多个吸附或共价键合在孔衬里和/或纳米通道衬里的表面上或MSP或MSR的表面上的官能团。如本文所用,“官能团”定义了直接或经由接头连接至MSR或MSP表面的化学部分。在一些实施例中,官能团是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分或其盐。在一些实施例中,可以将官能团(即-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐)与二氧化硅表面通过接头分开。在一些实施例中,官能团经由C1至C20烷基接头共价键合至MSP(例如MSR)表面。在其他实施例中,官能团经由聚乙二醇接头共价键合至MSP(例如MSR)表面。在特定的实施例中,聚乙二醇接头具有式(-O(CH2-CH2-)1-25。在特定的实施例中,表面修饰是C1至C20烷基全卤代烷基或C1至C20烷基全氟代烷基。
在另一方面,在本文所述的方法中,病毒载体可以缀合至本文所述的介孔二氧化硅颗粒(例如,MSR)。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒和病毒载体之间的静电缀合是由于病毒载体和介孔二氧化硅颗粒电荷相反。例如但不受理论的束缚,通过聚乙烯亚胺或带正电荷的伯铵、仲铵、叔铵或季铵基团表面修饰的介孔二氧化硅颗粒(例如,MSR)可以与带负电荷的病毒载体缀合或缔合。因此,在一些实施例中,病毒载体带负电,而介孔二氧化硅颗粒带正电。在一些实施例中,介孔二氧化硅颗粒和病毒载体之间的共价缀合通过本领域技术人员已知的方法、通过接头或不通过接头来实现。例如但不限于,接头可以是聚乙二醇、烷基、聚合物、聚酰胺键等。
在特定实施例中,所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含可操作地连接至核苷酸序列的表达控制序列,所述核苷酸序列表达被工程改造以靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。本文描述了示例性CAR。
在任何前述方法或用途的一些实施例中,所述与肿瘤抗原(例如,本文描述的肿瘤抗原)相关的疾病选自增生性疾病如癌症或恶性肿瘤,或癌前病症如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期,或是与本文描述的肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症。在一些实施例中,疾病是本文描述的癌症,例如本文描述为与本文描述的靶标相关的癌症。在一些实施例中,疾病是血液癌症。在一些实施例中,血液癌症是白血病。在一些实施例中,癌症选自下组,该组由以下组成:一种或多种急性白血病,这些急性白血病包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞白血病(ALL);一种或多种慢性白血病,这些慢性白血病包括但不限于慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL);另外的血液癌症或血液病症包括但不限于B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、华氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症、和为由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)联合在一起的各种血液病症集合的“白血病前期”,并且与本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病包括但不限于表达如本文描述的肿瘤抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增生性疾病;以及它们的任何组合。在另一个实施例中,与本文描述的肿瘤抗原相关的疾病是实体瘤。
在实施例中,所述癌症选自下组,该组由以下组成:结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、所述癌症的组合、以及所述癌症的转移性病灶。
在一些实施例中,可以用本发明的表达CAR的细胞治疗的癌症是多发性骨髓瘤。通常,通过流式细胞术,骨髓瘤细胞被认为对于如本文描述的癌症相关抗原表达是阴性的。因此,在一些实施例中,例如如本文描述的CD19 CAR可以用于靶向骨髓瘤细胞。在一些实施例中,本发明的car疗法可以与一种或多种另外的疗法(例如来那度胺治疗)组合使用。
在各个方面,在向患者施用T细胞或NK细胞后,通过本文所述的方法产生并施用于患者的免疫效应细胞(例如T细胞,NK细胞)或其后代在患者中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年、或五年。
本发明还包括一种类型的细胞疗法,其中例如通过体外或体内转录的RNA修饰免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)。所得细胞能够杀死受试者或患者中的肿瘤细胞。因此,在各个方面,在施用如本文所述的组合物之后,免疫效应细胞(例如,T细胞,NK细胞)存在少于一个月,例如,三周,两周,一星期。
不希望受任何特定理论的束缚,由CAR修饰的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答,或者可替代地可以是由于直接与间接免疫应答。在一些方面,CAR转导的免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞)表现出响应于表达如本文描述的癌症相关抗原的人癌细胞的特异性促炎性细胞因子分泌和有效细胞溶解活性,抵抗可溶性如本文描述的癌症相关抗原抑制,介导旁观者(bystander)杀伤并介导已确立的人肿瘤的消退。例如,表达如本文描述的癌症相关抗原的肿瘤的异质区域内的无抗原肿瘤细胞可能易受先前已经针对邻近的抗原阳性癌细胞反应的如本文描述的癌症相关抗原重定向的免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞)的间接破坏。
在一些方面,本发明的完全人CAR修饰的免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞)可以是用于哺乳动物的离体免疫和/或体内疗法的一类疫苗。在一些方面,哺乳动物是人。
在一些方面,本发明的表达CAR的细胞可用于治疗增生性疾病,如癌症或恶性肿瘤、或是癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)。与如本文描述的癌症相关抗原表达相关的其他疾病包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或表达如本文描述的癌症相关抗原的增生性疾病。与如本文描述的癌症相关抗原的表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)、炎性病症(过敏症和哮喘)和移植。
本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞)可以单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分(如IL-2或其他细胞因子或细胞群体)组合施用。
血液癌症
血液癌症病症是癌症的类型,如白血病、淋巴瘤以及影响血液、骨髓和淋巴系统的恶性淋巴组织增生性病症。
白血病可以分类为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以进一步分类为急性髓细胞性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性髓细胞性白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。其他相关病症包括骨髓增生异常综合征(MDS,以前称为“白血病前期”),其是由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)和转化为AML的风险联合的血液病症的多样化集合。
淋巴瘤是一组从淋巴细胞发展的血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
本发明还提供了抑制增生或减少如本文所述的癌症相关抗原的方法,所述方法包括使包含如本文所述的癌症相关抗原的细胞群体与包含介孔二氧化硅颗粒和病毒载体的组合物接触。在特定方面,如本文所述对MSP进行表面修饰。在其他实施例中,所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。示例性核苷酸序列表达嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、细胞因子、趋化因子、用于阻断抑制性分子的shRNA、或用于诱导蛋白质表达的mRNA。在一些方面,在患有骨髓性白血病或与表达如本文描述的癌症相关抗原的细胞相关的另一种癌症的受试者中、或骨髓性白血病或与表达如本文描述的癌症相关抗原的细胞相关的另一种癌症的动物模型中,相对于阴性对照,本发明的表达CAR的T细胞或NK细胞使细胞和/或癌细胞的数量(quantity)、数目(number)、量(amount)或百分比减少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%、或至少99%。在一些方面,受试者是人。
组合疗法
如本文所用,“组合”施用意指在受试者患病期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者,例如在受试者被诊断患有病症后并且在所述病症被治愈或清除前或者在由于其他原因终止治疗前递送两种或多种治疗。在一些实施例中,第一治疗的递送在第二治疗的递送开始时仍在进行,所以就施用而言存在重叠。这在本文中有时被称为“同时递送”或“并行递送”。在其他实施例中,一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。在每一种情况的一些实施例中,治疗因组合施用而更有效。例如,第二治疗更有效,例如,与第一治疗不存在的情况下施用第二治疗所观察到的结果相比,使用较少的第二治疗观察到等效的作用,或者第二治疗使症状减少更大的程度,或对第一治疗观察到类似的情况。在一些实施例中,与一种治疗不存在的情况下递送另一种治疗所观察到的结果相比,递送使得症状或与所述障碍相关的有他参数减少更多。两种治疗的作用可以部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以使得当递送第二治疗时,递送的第一治疗的作用仍然是可检测的。
在一些实施例中,这些方法或用途与增加免疫效应细胞的功效的药剂(例如,如本文描述的药剂)组合进行。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,介孔二氧化硅棒组合物与增加免疫效应细胞的功效的药剂,例如蛋白磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子、免疫抑制性分子的抑制剂;或降低TREG细胞的水平或活性的药剂中的一个或多个组合施用。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,蛋白磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂和/或SHP-2抑制剂。
在本文描述的方法或用途的其他实施例中,激酶抑制剂选自以下中的一种或多种:CDK4抑制剂、CDK4/6抑制剂(例如,帕博西尼)、BTK抑制剂(例如,依鲁替尼或RN-486)、mTOR抑制剂(例如,雷帕霉素或依维莫司(RAD001))、MNK抑制剂或双重P13K/mTOR抑制剂。在一些实施例中,BTK抑制剂不会降低或抑制白细胞介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性。
在本文描述的方法或用途的其他实施例中,抑制免疫抑制性分子的药剂包括抗体或抗体片段、抑制性核酸、聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或对抑制性分子的表达进行抑制的锌指核酸内切酶(ZFN)。
在本文描述的方法或用途的其他实施例中,降低TREG细胞的水平或活性的药剂选自环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减或它们的组合。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,免疫抑制性分子选自由以下组成的组:PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、CEACAM-1、CEACAM-3和CEACAM-5。
在其他实施例中,对抑制性分子进行抑制的药剂包含含有抑制性分子的第一多肽或其片段以及向细胞提供阳性信号的第二多肽,并且其中所述第一多肽和第二多肽在含有CAR的免疫细胞上表达,其中(i)所述第一多肽包含PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、CEACAM-1、CEACAM-3、以及CEACAM-5或其片段;和/或(ii)所述第二多肽包含细胞内信号传导结构域,所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一些实施例中,初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性结构域;和/或共刺激信号传导结构域包含选自41BB、CD27和CD28的蛋白质的功能性结构域。
在其他实施例中,细胞因子选自IL-7、IL-15或IL-21、或它们的组合。
在其他实施例中,包含CAR分子的免疫效应细胞和第二,例如本文披露的任何组合疗法(例如,增加免疫效应细胞的功效的药剂)基本上同时或顺序地施用。
在其他实施例中,包含CAR分子的免疫细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子组合施用。在一些实施例中,靶向GITR和/或调节GITR功能的分子在表达CAR的细胞或细胞群体之前或在单采血液成分术之前施用。
在一些实施例中,淋巴细胞输注(例如同种异体淋巴细胞输注)用于治疗癌症,其中淋巴细胞输注包含至少一种本发明的表达CAR的细胞。在一些实施例中,自体淋巴细胞输注用于治疗癌症,其中自体淋巴细胞输注包含至少一种本文描述的表达CAR的细胞。
在一些实施例中,细胞是T细胞,并且所述T细胞是甘油二酯激酶(DGK)缺陷的。在一些实施例中,细胞是T细胞,并且所述T细胞是Ikaros缺陷的。在一些实施例中,细胞是T细胞,并且所述T细胞是DGK和Ikaros两者缺陷的。
在任何前述方法或用途的实施例中,可以进一步施用治疗与肿瘤抗原表达相关的疾病的药剂,例如本文披露的第二种或第三疗法中的任何一种。另外的示例性组合包括以下中的一种或多种。
在另一个实施例中,可以进一步施用另一种药剂,例如本文所述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂。例如,可以进一步施用增强表达CAR的细胞的活性的药剂。
例如,在一些实施例中,增强表达CAR的细胞的活性的药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂(例如,免疫抑制剂分子)。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。
在一些实施例中,对抑制性分子进行抑制的药剂是抑制性核酸,是dsRNA、siRNA或shRNA。在实施例中,所述抑制性核酸与编码CAR分子的组分的核酸连接。例如,抑制性分子可以在表达CAR的细胞上表达。
在另一个实施例中,对抑制性分子进行抑制的药剂例如是本文描述的分子,例如包含第一多肽(例如,抑制性分子)的药剂,所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如,本文描述的细胞内信号传导结构域)缔合。在一些实施例中,所述药剂包含例如抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ、或这些中的任一者的片段(例如,这些中的任一者的细胞外结构域的至少一部分))的第一多肽,和第二多肽,所述第二多肽是本文描述的细胞内信号传导结构域(例如,包含共刺激结构域(例如,41BB、CD27或CD28,例如如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如,本文描述的CD3ζ信号传导结构域)。在一些实施例中,所述药剂包含PD1或其片段(例如PD1的细胞外结构域的至少一部分)的第一多肽,和本文描述的细胞内信号传导结构域(例如本文描述的CD28信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在一些实施例中,将本发明的表达CAR的免疫效应细胞(例如,T细胞或NK细胞)施用至已接受先前干细胞移植(例如自体干细胞移植)的受试者。
在一些实施例中,将本发明的表达CAR的免疫效应细胞(例如,T细胞或NK细胞)施用至已接受先前剂量的美法仑的受试者。
在一些实施例中,将表达CAR分子(例如,本文描述的CAR分子)的细胞与增加表达CAR分子的细胞的功效的药剂(例如本文描述的药剂)组合施用。
在一些实施例中,表达CAR分子(例如,本文描述的CAR分子)的细胞与改善与表达CAR分子的细胞的施用相关的一种或多种副作用的药剂(例如,本文描述的药剂)组合施用。
在一些实施例中,表达CAR分子(例如,本文描述的CAR分子)的细胞与治疗与如本文描述的癌症相关抗原相关的疾病的药剂(例如,本文描述的药剂)组合施用。
在一些实施例中,将表达两种或更多种CAR分子(例如,如本文描述)的细胞施用至有需要的受试者以治疗癌症。在一些实施例中,将包含表达CAR的细胞的细胞群体(例如,如本文描述)施用至有需要的受试者以治疗癌症。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,所述CAR分子与另一种药剂组合施用。在一些实施例中,所述药剂可以是激酶抑制剂,例如CDK4/6抑制剂、BTK抑制剂、mTOR抑制剂、MNK抑制剂或双重PI3K/mTOR激酶抑制剂、以及它们的组合。在一些实施例中,激酶抑制剂是CDK4抑制剂,例如本文所述的CDK4抑制剂,例如CD4/6抑制剂,如6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称为帕博西尼(palbociclib)或PD0332991)。在一些实施例中,激酶抑制剂是BTK抑制剂,例如本文描述的BTK抑制剂,例如像依鲁替尼。在一些实施例中,激酶抑制剂是mTOR抑制剂,例如本文描述的mTOR抑制剂,例如像雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。所述mTOR抑制剂可以是例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂,例如本文描述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一些实施例中,激酶抑制剂是MNK抑制剂,例如本文描述的MNK抑制剂,例如像4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。所述MNK抑制剂可以是例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。所述双重PI3K/mTOR抑制剂可以是例如PF-04695102。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂:aloisine A;flavopiridol或HMR-1275,2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-色满酮;克唑替尼(PF-02341066;2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮盐酸盐(P276-00);1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265);英迪舒兰(E7070);roscovitine(CYC202);帕博西尼(PD0332991);地那西利(SCH727965);N-[5-[[(5-叔丁基噁唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032);4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054);5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322);4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)-1H-吡唑-3-甲酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519);4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438);和XL281(BMS908662)。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,激酶抑制剂是CDK4抑制剂,例如帕博西尼(PD0332991),并且将帕博西尼以每天约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如75mg、100mg或125mg)的剂量施用持续一段时间,例如每天施用28天周期的14-21天、或每天施用21天周期的7-12天。在一些实施例中,施用帕博西尼的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂:依鲁替尼(PCI-32765);GDC-0834;RN-486;CGI-560;CGI-1764;HM-71224;CC-292;ONO-4059;CNX-774;和LFM-A13。在一些实施例中,BTK抑制剂不会降低或抑制白细胞介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性,并且选自GDC-0834、RN-486;CGI-560;CGI-1764;HM-71224;CC-292;ONO-4059;CNX-774;和LFM-A13。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,激酶抑制剂是BTK抑制剂(例如,依鲁替尼(PCI-32765)),并且将依鲁替尼以每天约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如,250mg、420mg或560mg)的剂量施用持续一段时间,例如每天施用持续21天周期,或每天施用持续28天周期。在一些实施例中,施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依鲁替尼。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,激酶抑制剂是不会抑制ITK(例如RN-486)的激酶活性的BTK抑制剂,并且将RN-486以每天约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg(例如,150mg、200mg或250mg)的剂量施用一段时间,例如28天周期。在一些实施例中,施用RN-486的1、2、3、4、5、6、7或更多个周期。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂:替西罗莫司;地磷莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯,也称为AP23573和MK8669;依维莫司(RAD001);雷帕霉素(AY22989);塞马莫德(simapimod);(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055);2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502);和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-(SEQ ID NO:692)内盐(SF1126);和XL765。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,激酶抑制剂是mTOR抑制剂,例如雷帕霉素,并且将雷帕霉素以每天约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如6mg)的剂量施用持续一段时间,例如每天施用持续21天周期、或每天施用持续28天周期。在一些实施例中,施用雷帕霉素的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。在一些实施例中,激酶抑制剂是mTOR抑制剂,例如依维莫司,并且将依维莫司以每天约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如10mg)的剂量施用持续一段时间,例如每天施用持续28天周期。在一些实施例中,施用依维莫司的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,激酶抑制剂是选自以下的MNK抑制剂:CGP052088;4-氨基-3-(对氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380);尾孢素酰胺(cercosporamide);ETC-1780445-2;和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,激酶抑制剂是双重磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR抑制剂,其选自2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502);N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]尿素(PF-05212384,PKI-587);2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235);阿托利司(GDC-0980,RG7422);2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458);8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-(3H)-马来酸(NVP-BGT226);3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103);5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584,SB2343);和N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,可以进一步施用蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂,例如本文描述的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂。在一些实施例中,蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂,例如本文描述的SHP-1抑制剂,例如像葡萄糖酸锑钠。在一些实施例中,蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂。
在本文描述的方法或用途的一些实施例中,可以进一步施用另一种药剂,并且所述药剂是细胞因子。所述细胞因子可以是例如IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合。在另一个实施例中,将CAR分子与检查点抑制剂(例如本文描述的检查点抑制剂)组合施用。例如,在一些实施例中,检查点抑制剂抑制选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ的抑制性分子。
在本文描述的方法或用途的其他实施例中,可以进一步施用改善与表达CAR分子的细胞相关的一种或多种副作用的药剂。与表达CAR的细胞相关的副作用可以选自细胞因子释放综合征(CRS)或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)。
本发明还提供了预防、治疗和/或管理与表达本文所述的癌症相关抗原的细胞相关的疾病(例如,表达如本文所述的癌症相关抗原的血液癌症或非典型癌症)的方法,所述方法包括向受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物,并且其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含可操作地连接至核苷酸序列的表达控制序列,所述核苷酸序列表达被工程改造以靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面,受试者是人。与表达如本文描述的癌症相关抗原的细胞相关的病症的非限制性实例包括自身免疫性病症(如狼疮)、炎性病症(如过敏症和哮喘)和癌症(如表达如本文描述的癌症相关抗原的血液癌症或非典型癌症)。
本发明还提供了预防、治疗和/或管理与表达本文所述的癌症相关抗原的细胞相关的疾病的方法,这些方法包括向受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物,且其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含可操作地连接至核苷酸序列的表达控制序列,所述核苷酸序列表达被工程改造以靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面,受试者是人。
本发明提供了预防与表达本文所述的癌症相关抗原的细胞相关的癌症复发的方法,这些方法包括向受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物,且其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含可操作地连接至核苷酸序列的表达控制序列,所述核苷酸序列表达被工程改造以靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时,医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本发明组合物的精确量。
在一些方面,可能希望向受试者施用活化的免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞),并且然后随后重抽血液(或进行单采血液成分术),根据本发明活化并且扩增免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞),并用这些活化和扩增的免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞)回输患者。所述过程可以每隔几周进行多次。在一些方面,可以将来自从10cc至400cc抽血的免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞)活化。在一些方面,将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞)活化。
能以任何常规方式施用主题组合物,包括通过雾化吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内施用本文描述的组合物。在一些方面,通过真皮内或皮下注射向患者施用本发明的MSP(例如MSR)组合物。在一些方面,本发明的T细胞组合物肠胃外施用。术语“肠胃外”施用T细胞组合物包括例如鞘内、硬膜外、颅内,皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。在特定实施例中,T细胞组合物静脉内施用。在一些实施例中,MSP(例如MSR)和病毒载体的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
实例
实例A.介孔二氧化硅颗粒的合成和后官能化
除非另有说明,否则所有试剂均从商业来源获得并按原样使用。
1.介孔二氧化硅颗粒的示例性合成
将聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)平均Mn约5,800(普朗尼克P-123,80.0g,487mmol;西格玛公司(Sigma))表面活性剂在室温下溶解于3L 1.6M HCl中,在5L带夹套的烧瓶中加热至40摄氏度,并通过顶置式搅拌器以0-600rpm(但最通常地为300rpm)的速率机械搅拌。原硅酸四乙酯(TEOS,184mL,826mmol;西格玛公司)在<5分钟内以一个部分添加,并在40摄氏度下加热并保持搅拌至少2小时,但最通常地为20小时。将得到的浆料加热至80-130摄氏度(最通常地为100摄氏度)6-72小时(但最通常地为24小时)以进行水热处理,之后冷却至室温。将浆料在布氏漏斗中过滤,先后用去离子水和乙醇洗涤,并在室温下风干。将得到的二氧化硅材料在炉中煅烧,其中在8小时内从室温缓慢升温至550摄氏度,然后在550摄氏度下再保持8个小时,然后冷却至室温,以得到47g介孔二氧化硅颗粒。
搅拌速率的变化可以使微颗粒的纵横比变化。改变水热温度和持续时间的条件是介孔材料常用的孔径控制。有关更多信息,请参见J.Chem.Educ.[化学教育杂志]2017,94,91-94及其内的参考文献。
通过光学显微镜、Malvern Morphologi G3、扫描电子显微镜(SEM)、热重分析(TGA)对最终的介孔材料进行表征。
2.二氧化硅微颗粒的后修饰
实例2(a):乙基膦酸二乙酯官能化的微颗粒
乙基膦酸二乙酯官能化的二氧化硅微颗粒通过在New J.Chem[新化学杂志].,2014,38,3853中报道的改进的方法制备,其中进行了一些修改。将二乙基磷酸乙基三乙氧基硅烷(4.15mL,13.03mmol)添加到悬浮在300mL甲苯中的2.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中。将浆料搅拌并在110摄氏度下回流14小时,然后冷却至室温并过滤。将所述颗粒先后用去离子水和乙醇洗涤,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时,以得到乙基膦酸二乙酯官能化的颗粒。
实例2(b):乙基膦酸官能化的微颗粒
乙基膦酸官能化的微颗粒是通过对New J.Chem[新化学杂志].,2014,38,3853中报道的程序改进的方法制备的。将三甲基甲硅烷基氯硅烷(1.388mL,10.86mmol)添加到悬浮在150mL甲苯中的2.0g乙基膦酸二乙酯官能化的微颗粒的浆料中,并加热至110摄氏度持续24小时。将浆料冷却至室温并过滤,用去离子水和乙醇洗涤,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时。然后将介孔二氧化硅颗粒悬浮在100mL的12M HCl中,并加热至100摄氏度持续18小时。将浆料冷却至室温,过滤并用去离子水和乙醇洗涤,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时,以得到乙基膦酸官能化的微颗粒。
实例2(c):丙胺官能化的微颗粒
丙胺官能化的微颗粒是通过对Langmuir 2015,31,6457-6462中报道的程序改进的方法制备的。将(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(3.05ml,19.54mmol;APTMS,西格玛公司)添加到在150mL试剂级乙醇中的3.0克介孔二氧化硅微颗粒的浆料中。将浆料在75摄氏度下回流7小时。冷却至室温后,过滤浆料,先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时。
实例2(d):生物素官能化的微颗粒
将(+)-生物素N-琥珀酰亚胺酯(246mg,0.720mmol)添加到在10.0mL PBS缓冲液(调节至pH 7.4)中的1.0g丙胺官能化的微颗粒的浆料中,并在室温下搅拌18小时。将浆料过滤并用去离子水和乙醇洗涤,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时,以得到生物素官能化的微颗粒。
实例2(e):生物素-PEG4官能化的微颗粒
将PEG4-生物素N-羟基琥珀酰亚胺(106mg,0.180mmol;赛默飞世尔公司(ThermoFischer)EZ-连接(EZ-Link)NHS-PEG4-生物素)添加到在2.5mL PBS缓冲液(调节至pH 7.4)中的0.25g丙胺官能化的微颗粒的浆料中,并在室温下搅拌18小时。将浆料过滤并用去离子水和乙醇洗涤,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时,以得到生物素-PEG4官能化的微颗粒。
实例2(f):3(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)己酸酯官能化的微颗粒
将琥珀酰亚胺基6-(3(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)己酸酯(112mg,0.360mmol;LC-SPDP,赛默飞世尔公司)添加到在2.5mL PBS缓冲液(调节至pH 7.4)中的0.50g丙胺官能化的微颗粒的浆料中,并在室温下搅拌18小时。将浆料过滤并用去离子水和乙醇洗涤,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时,以得到3(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)己酸酯官能化的微颗粒。
实例2(g):4-氧代-4-(丙基氨基)丁酸官能化的微颗粒
将琥珀酸酐(4g,40.0mmol)添加到在无水DMF中的1.0g丙胺官能化的微颗粒的浆料中,并在室温下搅拌24小时。将所述浆料过滤并用去离子水和乙醇洗涤,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时,以得到4-氧代-4-(丙基氨基)丁酸官能化的微颗粒。
实例2(h):丙基二亚乙基三胺官能化的微颗粒
将三甲氧基甲硅烷基丙基二亚乙基三胺(1.678mL,6.51mmol)添加到悬浮在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒中。将浆料在75摄氏度下搅拌7小时。冷却至室温后,过滤浆料,先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时以得到丙基二亚乙基三胺官能化的颗粒。
实例2(i):3-丙基二氢呋喃-2,5-二酮官能化的微颗粒(琥珀酸酐)
将3-(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)二氢呋喃-2,5-二酮(4.94mL,17.37mmol)添加到在300mL甲苯中的3.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中。将浆料加热至110摄氏度20小时,然后冷却至室温,过滤并用去离子水和乙醇洗涤。将官能化的微颗粒在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时。
实例2(j):支链聚乙烯亚胺官能化的微颗粒
将聚乙烯亚胺(25.1g,47.0mmol;支链的,平均Mw约25,000,西格玛公司)溶于600mL无水DMF中,然后添加6.0g 3-丙基二氢呋喃-2,5-二酮官能化的微颗粒,并在室温下搅拌20小时。将浆料过滤,并先后用去离子水和乙醇洗涤所述颗粒,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时,以得到支链的聚乙烯亚胺官能化的微颗粒。
实例2(k):N,N,N-三甲基丙烷-1-铵官能化的微颗粒
将三甲氧基甲硅烷基丙基三甲基氯化铵(3.61mL,6.51mmol;在甲醇中的50%溶液)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中,并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后,过滤浆料,先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时,以得到N,N,N-三甲基丙烷-1-铵官能化的微颗粒。
以三甲氧基甲硅烷基丙基三甲基氯化铵与二氧化硅微颗粒的不同比例(0.25mmol三甲氧基甲硅烷基三甲基氯化铵/克微颗粒)重复上述步骤,以实现改变功能密度的比例。
实例2(l):辛基官能化的微颗粒
将三乙氧基(辛基)硅烷(2.05mL,6.51mmol)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中,并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后,过滤浆料,先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时,以得到辛基官能化的微颗粒。
实例2(m):十六烷基官能化的微颗粒
将十六烷基三甲氧基硅烷(2.54mL,6.51mmol)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中,并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后,过滤浆料,先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时,以得到十六烷基官能化的微颗粒。
实例2(n):11-叠氮基十一烷基官能化的微颗粒
将(11-叠氮基十一烷基)三甲氧基硅烷(1.0g,3.15mmol)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中,并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后,过滤浆料,先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时,以得到11-叠氮基十一烷基官能化的微颗粒。
实例2(o):3-叠氮基丙基官能化的微颗粒
将(3-叠氮基丙基)三甲氧基硅烷(1.0g,4.87mmol)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中,并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后,过滤浆料,先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时,以得到3-叠氮基丙基官能化的颗粒。
实例2(p):3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三烷氟辛基官能化的微颗粒
将三乙氧基(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三烷氟辛基)硅烷(2.499mL,6.51mmol)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中,并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后,过滤浆料,先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒,然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时,以得到3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三烷氟辛基官能化的微颗粒。
实例B.针对病毒结合来测试MSR表面修饰
为了测试慢病毒与MSP的结合,制备了多种具有不同表面化学性质的MSP(图1)。将干燥的MSR批次以10mg/ml重悬于冰冷的pH 7.5的Tris-NaCl-EDTA缓冲液(NTE缓冲液)中。将表达绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒(FCT067,Kerafast公司)的储备液在冰冷的NTE缓冲液中稀释至3x106/ml的效价。将MSR悬浮液和稀释的病毒以1:1体积/体积的比例混合,并在冰上孵育30分钟。将对照颗粒与不含病毒的NTE缓冲液以1:1体积/体积孵育。孵育后,在4℃下用含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次,然后在4℃下用PBS洗涤一次。然后将样品用PBS中的4.2%多聚甲醛固定。样品用抗病毒包膜的抗体(来自Kerafast公司的抗VSV-G,8G5F11;1:50稀释)染色,然后用Dylight-488标记的抗小鼠IgG(英杰公司(Invitrogen))染色。样品用PBS洗涤两次,并使用配备有GFP LED灯箱的Evos荧光显微镜成像(图2)。成像显示染色剂与未携带病毒的MSR没有可检测的结合。缀合病毒的棒显示不同水平的定量结合,其中三甲基铵和胺官能团显示最大结合。
实例C.使用MSR对GFP慢病毒转导T细胞的体外测定
MSR用于T细胞病毒转导的示意图如图3所示。用Dynabead T细胞活化剂珠以3:1的珠:细胞比例刺激原初人T细胞两天。使用磁铁去除珠子,并将细胞转移到新鲜的培养基中。如上所述制备病毒缀合的MSR,并以80μg/ml重悬于细胞培养基中。如图3所示对其进行系列稀释。将所述悬浮液与T细胞5x105/ml以1:1合并,并孵育4天。在培养物中的活单线态细胞中评估GFP表达,以评估转导效率。结果(图4)表明与仅在培养基中给予的病毒相比,缀合MSR的病毒的转导发生的水平更高。三甲基铵官能化的MSR提供了最高水平的转导。
实例D.T细胞与呈递CD3/CD28激动性抗体、EGFRvIII肽或BCMA蛋白的MSR的相互作用;
如Cheung,A.S.,等人中所述制备具有固定在表面的配体的MSR,模拟抗原呈递细胞的支架使原代T细胞能够离体扩增。Nature Biotechnology[自然生物技术],36(2),160-169。所述方法的方案示于图5中。
简而言之,使用薄膜再水化方法并通过100nm聚碳酸酯膜挤出形成主要由具有1mol%PE-生物素的POPC构成的脂质体。将羟基官能化的MSR与所述脂质体一起孵育,以允许在MSR表面上形成支撑的脂质双层(图6)。为了用CD3和CD28激动性抗体官能化MSR,用PBS洗涤MSR数次,与链霉亲和素孵育,然后与生物素化的CD3和CD28抗体拴系在一起。对于EGFRvIII CAR结合肽的MSR固定化,使用生物素化的EGFRvIII CAR结合肽(图7)。对于BCMACART刺激,使用生物素-NHS对重组BCMAFc蛋白进行生物素化,并类似地偶联至MSR表面。
与所需的配体一起孵育后,MSR用PBS洗涤数次,并以各种浓度重悬于培养基中,并与T细胞孵育。使用CFSE标记T细胞并通过流式细胞术评估染料稀释度来读出T细胞增殖。使用多重细胞因子分析方法(Mesoscale Delivery V-Plex)评估细胞因子的产生。
EGFRvIII CART响应结合在MSR表面的EGFRvIII CAR结合肽而产生干扰素γ和IL-2,而溶液中的游离EGFRvIII CAR结合肽(MSR上呈递的非刺激性肽(OVA)),或未修饰的MSR没有给出来自CART的响应(图8)。在另一个实验中,使用细胞计数来监测EGFRvIII CART响应于各种刺激的增殖(图9)。
为了进一步分析不同T细胞亚群的表型扩增,使用流式细胞术评估EGFRvIII CART的增殖。将CART用CFSE染色并通过流式细胞术监测染料稀释度以指示增殖(图10)。使用用MSR表面上呈递的BCMAFc蛋白抗原官能化的MSR进行类似的实验(图11)。
为了测试使用两种MSR(带有刺激性诱因的MSR和与慢病毒混合的MSR)同时用病毒刺激和转导T细胞,使用图12所示的实验方案。如上所述,将MSR的一个群体用脂质双层包被并接枝抗CD3/CD28抗体。用慢病毒孵育MSR的第二群体。图13所示的结果表明,与溶液中的游离病毒相比,当用抗CD3/CD28激动性抗体刺激T细胞并暴露于用PEI-MSR孵育的病毒时,转导水平更高。
为了测试在MSR的相同群体上两种诱因对T细胞的同时刺激和转导,T细胞暴露于(1)带有抗CD3/CD28激动性抗体的、脂质包被的刺激性MSR,和培养基中的病毒,(2)带有抗CD3/CD28激动性抗体的、脂质包被的刺激性MSR,和预先与病毒孵育的PEI-MSR,或(3)吸附有抗CD3/CD28激动剂抗体的PEI MSRS,然后与病毒孵育。培养三天后,评估T细胞的转导效率。图14显示在各种病毒量下,刺激性MSR浓度对条件(1)和(2)的MSR的影响。如图14所示,在PEI-MSR与病毒孵育的条件(2)下,总体转导得到增强。
图15比较了所有三个条件,其中条件(1)和(2)处于刺激性MSR的最高浓度。如图15所示,刺激性诱因与PEI-MSR结合的条件(3)产生最高的相对转导效率。相同的配制品用于研究人外周血单核细胞(PBMC)的MSR介导的转导。在图16中,显示对于条件(1)和(2)在最高刺激水平处的作为病毒浓度成函数的不同细胞群体的转导。图17显示对于条件(1)和(2)在最高刺激水平收集的在总GFP+转导的细胞级分中以及在总细胞群体中每个细胞群体的比例。
实例E.MSR诱导的T细胞转导的体内研究。
与病毒载体缀合的介孔二氧化硅颗粒的组合物被注射到小鼠的皮肤下。大约5-7天后,在所述位点注射吸附有编码抗小鼠CD19 CAR的病毒的MSR。小鼠血液中CD19+B细胞的耗减将被监测,以指示已产生的抗CD19 CART。在血液和骨髓中证实了这些CART的存在。使用原位杂交技术对CAR转基因进行所述注射位点以及引流淋巴结、脾脏和肝脏的详细组织学评估,以评估病毒向不希望的位点的漏出。
实例F.药物加载到介孔二氧化硅微颗粒上
可以将多种药物加载到介孔二氧化硅微颗粒上。
1.实例1:将TLR7激动剂加载到介孔二氧化硅微颗粒上。
将在氯仿中的咪喹莫特溶液添加到在2.0mL氯仿中的100mg二氧化硅微颗粒的浆料中(浓度为100μg-500μg咪喹莫特/10mg介孔二氧化硅颗粒),并在40摄氏度下以500rpm振荡72小时。将MSP以1000rpm离心3分钟,然后除去剩余的溶液。将MSP用2.0mL氯仿洗涤,然后离心并除去上清液。用乙醇重复洗涤步骤,以去除过量和未吸收的咪喹莫特。将最终的微颗粒在水中制成浆液并冻干。
2.实例2:介孔二氧化硅颗粒的体外药物释放。
将10.0mg(或相当的300μg药物负载材料)的药物负载MSP悬浮于1.0mL的pH 7.4(0.0067M)的磷酸盐缓冲液中,并置于37摄氏度下。在1h、3h、6h、24h、2天和5天收集样品;通过UPLC对这些样品进行分析,并绘制成标准分析曲线。在每个时间点都将上清液去除并替换为新鲜的缓冲液。
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践本发明。本发明的范围不受所保藏的构建体的限制,因为所保藏的实施例仅意图说明本发明的某些方面,并且任何功能等效的构建体都在本发明的范围之内。本文中材料的保藏并不构成承认本文所包含的书面描述不足以实现本发明的任何方面(包括其最佳模式)的实践,也不应被解释为限制权利要求书的范围。事实上,除了本文示出和描述的那些之外,本发明的各种修改将通过前述描述对于本领域技术人员变得清楚并且处于所附权利要求的范围内。
应当理解,根据本文所包含的传授内容,将本发明的传授内容应用于特定问题或情况将在本领域普通技术人员的能力范围内。
本说明书中每一个引用的披露内容通过引用明确地并入本文。
实例G.MSR诱导的CAR-T生成的体内研究
使用已知的方法建立植入人T细胞和B细胞的小鼠(人CD34+干细胞人源化小鼠或人外周血单核细胞注射小鼠)。将与CAR19慢病毒缀合的介孔二氧化硅颗粒的组合物注射到小鼠皮肤下以转导T细胞。使用流式细胞术对连续采血样品(注射前0天和注射MSR-病毒后第1天至第21天之间每周两次)监测用MSR-CAR19慢病毒缀合物处理的小鼠血液中表达CAR19的T细胞(使用抗CAR19独特型抗体染色)的存在和CD19+B细胞的耗减,并与注射MSR-GFP慢病毒的对照小鼠进行比较,以指示已经产生了抗CD19 CART,并且在杀死其靶标中发挥功能。从相同的血液样本中测定人干扰素-γ和肿瘤坏死因子α的浓度,以作为针对CD19CAR T细胞的产生和活化的第二种生物标志物。使用原位杂交技术对CAR转基因进行所述注射位点以及淋巴结、骨髓、脾脏和肝脏的详细组织学评估,以评估病毒向不希望的位点的漏出,并研究所产生的CAR19 T细胞至这些位点的运输。
在另一项实验中,含人T和B细胞的小鼠被静脉内注射表达萤光素酶报道基因的表达CD19的Nalm6白血病肿瘤。从肿瘤注射前7天至肿瘤注射后7天,向小鼠群组皮下注射与CAR19或GFP慢病毒缀合的介孔二氧化硅颗粒的组合物的单一注射,以转导T细胞。通过IVIS成像上的萤光素酶信号监测所述Nalm6肿瘤负荷,以研究产生的抗CD19 CART的抗肿瘤功效。对连续采血样品(注射前0天和注射MSR-病毒后第1天至第21天之间每周两次)监测用MSR-CAR19慢病毒缀合物处理的小鼠血液中表达CAR19的T细胞的存在和CD19+B细胞的耗减,并与注射MSR-GFP慢病毒的对照小鼠进行比较。从相同的血液样本中测定人干扰素-γ和肿瘤坏死因子α的浓度,以作为针对CD19 CAR T细胞的产生和活化的第二种生物标志物。
使用针对其它癌症/肿瘤靶标(包括但不限于BCMA、CD20、CD22、CD123、EGFRvIII、CLL-1及其组合(彼此和/或与CD19))的MSR-慢病毒缀合物重复这些研究。
Claims (107)
1.一种组合物,所述组合物包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
3.根据权利要求2所述的组合物,其中所述病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
4.根据权利要求2所述的组合物,其中介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体是表面经修饰的。
5.根据权利要求4所述的组合物,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐,任选地使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25接头。
6.根据权利要求5所述的组合物,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。
7.根据权利要求5所述的组合物,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是聚乙烯亚胺,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量,所述聚乙烯亚胺的平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或慢病毒。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。
10.根据权利要求9所述的组合物,其中所述核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、用于阻断抑制性分子的shRNA,或其中所述核苷酸序列包含用于诱导蛋白质表达的mRNA。
11.根据权利要求10所述的组合物,其中所述核苷酸序列编码经工程改造以靶向肿瘤抗原的多肽。
12.根据权利要求11所述的组合物,其中所述多肽靶向选自下组的肿瘤抗原,该组由以下组成:TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物,其中所述蛋白质是CAR,所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域。
14.根据权利要求13所述的组合物,其中所述信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,所述组合物还包含T细胞刺激化合物或肿瘤抗原。
16.根据权利要求15所述的组合物,其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上,并且其中所述T细胞刺激化合物是IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、来自共享抗原的肽、或其组合,所述共享抗原是例如TRP2、gp100、肿瘤细胞裂解物、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3TCR。
17.根据权利要求16所述的组合物,其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上。
18.根据权利要求16所述的组合物,所述组合物包含介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体,并且其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体上或缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体的表面上的脂质包膜上。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的组合物,所述组合物还包含细胞因子。
20.根据权利要求19所述的组合物,其中所述细胞因子缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一或第二群体上。
21.根据权利要求19或20中任一项所述的组合物,其中所述细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段,或其组合。
22.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述介孔二氧化硅颗粒包含直径2nm-50nm的孔。
23.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述介孔二氧化硅颗粒的表面积是至少约100m2/g。
24.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述组合物适合于注射使用。
25.一种方法,所述方法包括:
使T淋巴细胞与包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物接触;
其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述接触在体外发生。
27.根据权利要求25所述的方法,其中所述T淋巴细胞在与介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体接触之前或之后被活化。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法,其中所述病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体是表面经修饰的。
31.根据权利要求30所述的方法,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐,任选地使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25接头。
32.根据权利要求31所述的方法,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。
33.根据权利要求31所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面用聚乙烯亚胺修饰的,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量,所述聚乙烯亚胺的平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的方法,其中所述病毒载体是慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。
35.根据权利要求25至34中任一项所述的方法,其中所述核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)。
36.根据权利要求35所述的方法,其中将所述CAR工程改造以靶向肿瘤抗原。
37.根据权利要求25至36中任一项所述的方法,其中通过使所述T淋巴细胞与T细胞刺激化合物或肿瘤抗原接触来活化所述T淋巴细胞。
38.根据权利要求37所述的方法,其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上。
39.根据权利要求38所述的方法,其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上。
40.根据权利要求39所述的方法,其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体上或直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体的表面上的脂质包膜上。
41.根据权利要求25至40中任一项所述的方法,所述方法还包括使所述T淋巴细胞与细胞因子接触。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述细胞因子在介质中或缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一或第二群体上。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法,其中所述细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段,或其组合。
44.一种利用重组多核苷酸体内遗传转导T淋巴细胞的方法,所述方法包括:
向具有一种或多种T淋巴细胞的受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物;
其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列,并且
其中当所述组合物接触一种或多种T淋巴细胞时,所述T淋巴细胞被所述重组多核苷酸遗传转导。
45.根据权利要求44所述的方法,其中所述病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体是表面经修饰的。
48.根据权利要求47所述的方法,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐,任选地使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25接头。
49.根据权利要求48所述的方法,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。
50.根据权利要求44至48中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面用聚乙烯亚胺修饰的,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量,所述聚乙烯亚胺的平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的方法,其中所述病毒载体是慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。
52.根据权利要求44至51中任一项所述的方法,其中所述核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)。
53.根据权利要求51所述的方法,其中将所述CAR工程改造以靶向肿瘤抗原。
54.根据权利要求44至53中任一项所述的方法,其中所述组合物还包含缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上的T细胞刺激化合物或肿瘤抗原。
55.根据权利要求54所述的方法,其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上。
56.根据权利要求54所述的方法,其中所述组合物包含介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体,并且其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体上或直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体的表面上的脂质包膜上。
57.根据权利要求44至56中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的所述第一或第二群体还包含缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一或第二群体上的细胞因子。
58.根据权利要求57所述的方法,其中所述细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段,或其组合。
59.根据权利要求44至58中任一项所述的方法,其中所述受试者的T淋巴细胞在体内扩增。
60.一种体外扩增T淋巴细胞群体的方法,所述方法包括
(a)使所述T淋巴细胞群体与包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物接触以提供转导的T淋巴细胞群体;和
(b)使所述转导的T淋巴细胞群体与T细胞刺激化合物或肿瘤抗原以及任选的细胞因子接触;
其中所述病毒载体包含表达载体,所述表达载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。
61.根据权利要求60所述的方法,其中所述病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
62.根据权利要求61所述的方法,其中所述病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
63.根据权利要求60至62中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体是表面经修饰的。
64.根据权利要求63所述的方法,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐,任选地使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25接头。
65.根据权利要求64所述的方法,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。
66.根据权利要求60至65中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面用聚乙烯亚胺修饰的,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量,所述聚乙烯亚胺的平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da。
67.根据权利要求60至66中任一项所述的方法,其中所述病毒载体是慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。
68.根据权利要求60至67中任一项所述的方法,其中所述核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)。
69.根据权利要求68所述的方法,其中将所述CAR工程改造以靶向肿瘤抗原。
70.根据权利要求60至69中任一项所述的方法,其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上,并且其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原是IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28mAb、新抗原肽、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR,或其组合。
71.根据权利要求70所述的方法,其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上。
72.根据权利要求70所述的方法,所述方法包括介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体,并且其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体上或缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体的表面上的脂质包膜上。
73.根据权利要求60至72中任一项所述的方法,所述方法还包括:
(c)使所述T淋巴细胞与细胞因子接触;
其中所述细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段,或其组合。
74.一种治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的受试者的方法,所述方法包括:
向所述受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物,
其中所述病毒载体包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含表达控制序列,所述表达控制序列与编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列可操作地连接,所述嵌合抗原受体被工程改造以靶向所述肿瘤抗原,
从而治疗所述受试者。
75.根据权利要求74所述的方法,其中所述病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
76.根据权利要求75所述的方法,其中所述病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
77.根据权利要求74至76中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体是表面经修饰的。
78.根据权利要求77所述的方法,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐,任选地使用C1至C20烷基或(-O(CH2-CH2-)1-25接头。
79.根据权利要求78所述的方法,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。
80.根据权利要求74至78中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面用聚乙烯亚胺修饰的,如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量,所述聚乙烯亚胺的平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da。
81.根据权利要求74至80中任一项所述的方法,其中所述病毒载体是慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。
82.根据权利要求74至81中任一项所述的方法,其中所述组合物还包含缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上的T细胞刺激化合物或肿瘤抗原。
83.根据权利要求82所述的方法,其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上。
84.根据权利要求83所述的方法,其中所述组合物包含介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体,并且其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体上或直接缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体的表面上的脂质包膜上,并且其中所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原是IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR,或其组合。
85.根据权利要求74至84中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的所述第一或第二群体还包含缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的所述第一或第二群体上的细胞因子。
86.根据权利要求85所述的方法,其中所述细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段,或其组合。
87.一种将病毒载体递送至受试者中所需的作用位点的方法,所述方法包括向所述受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物。
88.根据权利要求87所述的方法,其中所述病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
89.根据权利要求88所述的方法,其中所述病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。
90.根据权利要求87至89中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体是表面经修饰的。
91.根据权利要求90所述的方法,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是C1-20烷基胺、C1-20羧酸、C1-20叠氮化物和取代或未取代的C1-20烷基。
92.根据权利要求91所述的方法,其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。
93.根据权利要求87至92中任一项所述的方法,其中所述病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或慢病毒。
94.根据权利要求87至93中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体包含直径2nm-50nm的孔。
95.根据权利要求87至94中任一项所述的方法,其中介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体的表面积是至少约100m2/g。
96.一种扩增嵌合抗原受体(CAR)T(CAR-T)细胞群体的方法,所述方法包括使所述CAR-T细胞群体与缀合至靶向部分的介孔二氧化硅颗粒接触,其中所述靶向部分与所述CAR互补。
97.根据权利要求96所述的方法,其中所述CAR是经工程改造以靶向肿瘤抗原的蛋白质。
98.根据权利要求96或97中任一项所述的方法,其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组:TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、TnAg、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。
99.根据权利要求1-24中任一项所述的组合物,或根据权利要求25-98中任一项所述的方法,其中所述介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。
100.一种组合物,所述组合物包含与聚乙烯亚胺缀合的介孔二氧化硅颗粒。
101.根据权利要求100所述的组合物,其中所述介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。
102.根据权利要求100或101所述的组合物,所述组合物还包含活性剂。
103.根据权利要求102所述的组合物,其中所述活性剂缀合至或吸附到所述介孔二氧化硅颗粒上。
104.一种将活性剂递送至受试者中所需的作用位点的方法,所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求102或103所述的组合物。
105.根据权利要求104所述的方法,其中所述组合物提供所述活性剂向所述受试者的持续递送。
106.一种治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法,所述方法包括:向所述受试者施用根据权利要求102或103所述的组合物。
107.根据权利要求106所述的方法,其中所述疾病、障碍或病症与肿瘤抗原相关。
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