PL190092B1

PL190092B1 - Proteiny wiążące osteoprotegerynę oraz ich receptory

Info

Publication number: PL190092B1
Application number: PL98336311A
Authority: PL
Inventors: William J. Boyle
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2005-10-31
Also published as: TR199902512T2; DE69837845T3; EP0975754A1; HUP0001400A2; ES2284203T5; US7923008B2; BG103824A; IL132304A0; ATE363533T1; AU779461C; AU779461B2; DK0975754T4; WO1998046751A1; EP0975754B2; NZ500253A; SK288559B6; CN1264427A; AU743257B2; ES2284203T3; HUP0001400A3

Abstract

1 W y o d r e b n i o n y k w a s n u k l e i n o w y k o d u j a c y p r o t e i n e w i a z a c a o s t e o p r o t e g e r y n e , w y b r a n y z g r a p y o b e j m u j a c e j a) s e k w e n c j e k w a s u n u k l e i n o w e g o p r z e d s t a w i o n a n a r y s u n k u fig 1 ( S E Q I D N O 1) l u b fig 2 ( S E Q I D N O 3 ) b) k w a s n u k l e i n o w y , k t ó r y h y b r y d y z u j e d o k o m p l e m e n t u o b s z a r u k o d u j a c e g o p o l i p e p t y d p r z e d s t a w i o n y n a r y s u n k u fig 1 ( S E Q I D N O 2) lu b fig 4 ( S E Q I D N O 4 ) w w a r u n k a c h o b e j m u j a c y c h h y b r y d y z a c j e p r z y 5 x S S C , 5 0 % f o r m a m i d 1 4 2 ° C o r a z p r z e m y w a n i e p r z y 0 , 5 x S S C 1 55° C, c) k w a s n u k l e i n o w y p r z e d s t a w i o n y n a r y s u n k u fig 1 ( S E Q I D N O 1) l u b fig 4 ( S E Q I D N O 3), k o d u j a c y o b c i e t a lub r o z p u s z c z a l n a f o r m e p r o t e i n y w i a z a c e j o s t e o p r o t e g e r y n e o r a z d ) k w a s n u k l e i n o w y , k t ó r y u l e g a d e g e n e r a c j i d o k w a s ó w (a), (b ) l u b (c) 1 7 S p o s ó b w y t w a r z a n i a p r o t e i n y w i a z a c e j o s t e o p r o t e g e r y n e o b e j m u j a c y - p r o w a d z e n i e w w a r u n k a c h o d z y w c z y c h w z r o s t u k o m ó r e k g o s p o d a r z a t r a n s f o r m o w a n y c h l u b t r a n s f e k o w a n y c h k w a s e m n u k l e i n o w y m w y b r a n y m z g r u p y o b e j m u j a c e j a) s e k w e n c j e k w a s u n u k l e i n o w e g o p r z e d s t a w i o n a n a r y s u n k u fig1 ( S E Q I D N O 1) lu b fig 2 ( S E Q I D N O 3 ) b) k w a s n u k l e i n o w y , k t ó r y h y b r y d y z u j e d o k o m p l e m e n t u o b s z a r u k o d u j a c e g o p o l i p e p t y d p r z e d s t a w i o n y n a r y s u n k u fig 1 ( S E Q I D N O 2) lu b fig 4 ( S E Q I D N O 4 ) w w a r u n k a c h o b e j m u j a c y c h h y b r y d y z a c j e p r z y 5 x S S C , 5 0 % f o r m a m i d 1 4 2 ° C o r a z p r z e m y w a n i e p r z y 0 , 5 x S S C 1 55° C, c) k w a s n u k l e i n o w y p r z e d s t a w i o n y n a r y s u n k u fig 1 ( S E Q I D N O 1) lu b fig 4 ( S E Q I D N O 3), k o d u j a c y o b c i e t a l u b r o z p u s z c z a l n a f o r m e p r o t e i n y w i a z a c e j o s t e o p r o t e g e r y n e 1 d ) k w a s n u k l e i n o w y , k t ó r y u l e g a d e g e n e r a c j i d o k w a s ó w (a), (b) l u b (c) o r a z - w y o d r e b n i e n i e p o l i p e p t y d o w e g o p r o d u k t u ekspresji w s k a z a n e g o k w a s u n u k l e i n o w e g o 18 P o l i p e p t y d w y t w o r z o n y s p o s o b e m w e d l u g zastrz 17, k o d o w a n y p r z e z k w a s n u k l e i n o w y w y b r a n y z g r u p y o b e j m u j a c e j a) s e k w e n c j e k w a s u n u k l e i n o w e g o p r z e d s t a w i o n a n a r y s u n k u fig 1 ( S E Q I D N O 1) l u b fig 2 ( S E Q I D N O 3) b) k w a s n u k l e i n o w y , k t ó r y h y b r y d y z u j e d o k o m p l e m e n t u o b s z a r u k o d u j a c e g o p o l i p e p t y d p r z e d s t a w i o n y n a r y s u n k u fig 1 ( S E Q I D N O 2) lu b fig 4 ( S E Q I D N O 4 ) w w a r u n k a c h o b e j m u j a c y c h h y b r y d y z a c j e p r z y 5 x S S C , 5 0 % f o r m a m i d 1 4 2 ° C o r a z p r z e m y w a n i e p r z y 0 , 5 x S S C 1 55° C, c) k w a s n u k l e i n o w y p r z e d s t a w i o n y n a r y s u n k u fig 1 ( S E Q I D N O 1) l u b fig 4 ( S E Q I D N O 3), k o d u j a c y o b c i e t a lu b r o z p u s z c z a l n a f o r m e p r o t e i n y w i a z a c e j o s t e o p r o t e g e r y n e o r a z d) k w a s n u k l e i n o w y , k t ó r y u l e g a d e g e n e r a c j i d o k w a s ó w (a), (b) l u b (c) PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd - określony terminem proteina wiążąca OPG, który specyficznie wiąże OPG i jest zaangażowany w proces różnicowania osteoklastów. Klon cDNA kodujący mysią formę tego polipeptydu został zidentyfikowany z biblioteki przygotowanej z mielomonocytowej linii komórkowej 32D myszy i transfekowany do komórek COS. Transfektanty były badane skriningowo pod względem zdolności do wiązania z polipeptydem fuzyjnym OPG[22-201]-Fc (przykład 1). Sekwencja kwasu nukleinowego potwierdziła, ze proteina wiążąca OPG jest nowym członem rodziny TNF i jest najbardziej podobna do AGP-1, polipeptydu uprzednio opisanego w zgłoszeniu nr US 08/660,562 z dnia 7 czerwca 1996 roku, dokonanym na rzecz AMGEN INC. (Polipeptyd identyczny jak AGP-1 i oznaczony jako TRAIL został opisany przez Wiley'a i wsp., Immunity 3, 673-682 (1995)). Przewiduje się, ze proteina wiążąca OPG jest proteiną transbłonową typu II, posiadającą amino-końcowy obszar cytoplazmatyczny, obszar transbłonowy i pozakomórkowy obszar karboksy-końcowy (fig. 1). Cytoplazmatyczny obszar amino-końcowy obejmuje reszty 1-48, obszar transbłonowy - reszty 49-69 a obszar pozakomórkowy - reszty 70-316, jak pokazano na rysunku fig. 1 (SEQ ED NO: 2). Ta proteina związana z błoną specyficznie wiąże OPG (fig. 2). Zatem proteina wiążąca OPG i OPG posiadają wiele cech wspólnych jako pary receptor-ligand, chociaż możliwe jest istnienie innych naturalnie występujących receptorów proteiny wiążącej OPG.

Klon DNA kodujący ludzką proteinę wiążącą OPG został wyizolowany z biblioteki cDNA węzła chłonnego. Sekwencja ludzka (fig. 4) jest homologiczna z sekwencją mysią.

190 092

Oczyszczona rozpuszczalna mysia proteina wiążąca OPG stymulowała tworzenie osteoklastów in vitro i indukowała hiperkalcemię i resorpcję kości in vivo.

Określenie „proteina wiążąca OPG” odnosi się do polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasów ssaczej proteiny wiążącej OPG lub do jego fragmentu, analoga lub pochodnej, wykazującego co najmniej aktywność wiązania OPG. W korzystnych przykładach realizacji, proteina wiążąca OPG pochodzi od myszy lub ludzi. W innym przykładzie realizacji proteina wiążąca OPG jest proteiną rozpuszczalną posiadającą - w jednej z postaci - wyizolowaną domenę pozakomórkową oddzieloną od domeny cytoplazmatycznej i transbłonowej. Proteina wiążąca OPG jest zaangażowana w proces różnicowania osteoklastów oraz wpływa na tempo i zakres resorpcji kości; stwierdzono, że stymuluje ona tworzenie osteoklastów i resorpcję kości.

Kwasy nukleinowe

Przedmiotem wynalazku są wyizolowane kwasy nukleinowe kodujące proteiny wiążące OPG. W niniejszym tekście, termin „kwas nukleinowy” obejmuje cDNA, genomowy DNA, całkowicie lub częściowo syntetyczny DNA i RNA. Kwasy nukleinowe według wynalazku są wybrane z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe przedstawione na yysunku fig. 1 (SEQ ID No: 1) i fig. 4 (SEQ ID No: 3);

b) kwasy nukleinowe, które hybrydy Ziają do obzzarów kwasów nukleinowych przedstawionych na rysunku fig. 1 (SEQ ID No: 1) i fig. 4 (SEQ ID No: 3), które kodują polipeptydy i pozostają w stanie zCybryeyzowanym do kwasów nukleinowych w wysoce surowych warunkach oraz

c) kwasy nukleinowe, które degają de^e^e^r^t^rr^c^ji do kwasem’ nukleinowych wte dług (a) lub (b).

Hybrydyzacja kwasu nukleinowego jest typowo wieloetapowym procesem składającym się z pierwszego etapu hybrydyzacji polegającego na tworzeniu dupleksów kwasów nukleinowych z pojedynczych nici, a następnie - z drugiego etapu hybrydyzacji prowadzonego w bardziej surowych warunkach aby selektywnie zachować dupleksy kwasów nukleinowych 0 pożądanej homologii. Warunki pierwszego etapu hybrydyzacji nie mają generalnie zasadniczego znaczenia pod warunkiem, ze nie są to warunki surowsze niz w drugim etapie hybrydyzacji. Ogólnie, druga hybrydyzacja jest prowadzona w wysoce surowych warunkach, przy czym termin „wysoce surowe” warunki odnosi się do warunków temperatury i stężenia soli (około 12-20°C poniżej temperatury topnienia (T_m) doskonałej hybrydy części (lub wszystkich) komplementarnych nici odpowiadających sekwencjom z rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) i fig. 4 (SEQ ID NO: 4). W jednym przykładzie realizacji termin „wysoce surowe” warunki odnosi się do warunków: około 65°C i nie więcej niz około IM Na+. Jest zrozumiałe, ze stężenie soli, temperatura i/lub czas inkubacji mogą być różnicowane w pierwszym lub drugim etapie hybrydyzacji, tak aby otrzymać cząsteczki hybrydyzujących kwasów nukleinowych według wynalazku. Warunki hybrydyzacji kwasów nukleinowych i obliczenia T_m dla hybryd kwasów nukleinowych są opisane w: Sambrook'a i wsp., Molecular cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989).

Kwasy nukleinowe według wynalazku mogą hybrydyzować do części (lub całości) obszarów kodujących polipeptydy proteiny wiążącej OPG pokazane na rysunku fig. 1 (SEQ ID No: 2) i fig. 4 (SEQ ID No: 4). Stąd tez sekwencje kwasów nukleinowych przedstawionych na tych rysunkach mogą być obcięte lub wydłużone. Wynalazek obejmuje obcięte lub wydłużone kwasy nukleinowe pod warunkiem, ze zapewnione jest zachowanie co najmniej właściwość wiązania OPG przez kodowane przez nie polipeptydy. W jednym przykładzie realizacji kwas nukleinowy będzie kodował polipeptyd o około co najmniej 10 aminokwasach. W innym przykładzie realizacji kwas nukleinowy będzie kodował polipeptyd o co najmniej około 20 aminokwssscC. W jeszcze innym przykładzie realizacji kwas nukleinowy będzie kodował polipeptyd o co najmniej około 50 aminokwasach. Hybrydy żujące kwasy nukleinowe mogą także zawierać sekwencje niekodujące umiejscowione w pozycji 5' i/lub 3' względem obszarów kodujących proteinę wiążącą OPG. Niekodujące sekwencje obejmują obszary regulacyjne zaangażowane w ekspresję proteiny wiążącej OPG takie, jak promotory, obszary wzmacniające, miejsca zapoczątkowania translacji, miejsca zakończenia transkrypcji i tym podobne.

190 092

W korzystnym przykładzie realizacji kwasy nukleinowe według wynalazku kodują mysią lub ludzką proteinę wiążącą OPG. Kwasy nukleinowe mogą kodować formę proteiny wiążącej OPG związanej z błoną lub formy rozpuszczalne, które nie posiadają funkcjonalnego obszaru transbłonowego. Przewidywany obszar teansbłonowg dla mysiej proteiny wiążącej OPG zawiera reszty aminokwasowe 49-69 włącznie na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2). Przewidywany obszar transMonowy dla ludzkiej proteiny wiążącej OPG obejmuje reszty 49-69, na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4). Można oczekiwać, że podstawienia, które zastępują hydrofobowe reszty aminokwasów w tym obszarze obojętnymi lub hydrofilowymi resztami aminokwasów przerwą związanie z błoną i spowodują, ze otrzymana zostanie rozpuszczalna proteina wiążąca OPG. Dodatkowo, można także oczekiwać, ze usunięcie części lub całości obszaru transbłonowego doprowadzi do wytworzenia rozpuszczalnych form proteiny wiążącej OPG. Kwasy nukleinowe (SEQ ID NO: 1) kodujące reszty aminokwasowe 70-316 na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub ich fragmenty i analogi - kodują rozpuszczalne proteiny wiążące OPG.

Kwasy nukleinowe kodujące obcięte formy rozpuszczalnych ludzkich protein wiążących OPG są także uwzględnione. Formy rozpuszczalne zawierają reszty 69-317, przedstawione na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) i ich obcięcia. W jednym przykładzie realizacji obcięcia N-końcowe generują polipeptydy z reszt 7-317, 71-317, 72-317 i tak dalej. W innym przykładzie realizacji kwasy nukleinowe kodują rozpuszczalne proteiny wiążące OPG (OPGbp), zawierające reszty 69-317 i ich N-końcowe obcięcia do OPGbp [158-317] lub alternatywnie - do OPGbp [166-317],

Plazmid phuOPGbp 1,1 szczepu E. coli DH10 kodujący ludzką proteinę wiążącą OPG został złozony w American Type Culture Collection, Rockvile, MD, 13 czerwca 1997 roku.

Sekwencje kwasów nukleinowych według wynalazku mogą być używane do wykrywania sekwencji kodujących proteinę wiążącą OPG w próbkach biologicznych. W szczególności, sekwencje mogą być używane do badania skriningowego cDNA i bibliotek genowych na zawartość pokrewnych sekwencji proteiny wiążącej OPG, w szczególności pochodzących od innych gatunków. Kwasy nukleinowe są także użyteczne do modulowania poziomów proteiny wiążącej OPG z zastosowaniem technologii anty-sensownej lub do ekspresji genu in vivo. Hodowla zwierząt transgeniczngch, u których zachodzi ekspresja proteiny wiążącej OPG umożliwia wytwarzanie tego polipeptydu i badanie jego aktywności in vivo.

Wektory i komórki gospodarza

Kwasy nukleinowe według wynalazku zostaną powiązane z sekwencjami DNA w sposób umożliwiający ekspresję biologicznie aktywnej proteiny wiążącej OPG. Sekwencje wymagane do ekspresji są znane biegłym w sztuce i zawierają promotory oraz sekwencje wzmacniające dla zainicjowania syntezy RNA, miejsca kończące transkrypcję, rybosomowe miejsca wiązania dla zainicjowania syntezy białka oraz sekwencje lidera do wydzielania z komórek. Sekwencje kierujące ekspresją i wydzielaniem proteiny wiążącej OPG mogą być homologiczne, co oznacza, że sekwencje te są identyczne lub podobne do sekwencji w genomie zaangażowanym w ekspresję i wydzielanie proteiny wiążącej OPG lub mogą być heterologiczne. Dostępnych jest wiele wektorów plazmidowych, do ekspresji proteiny wiążącej OPG w komórkach gospodarza (patrz, przykładowo Methods in Enzymology, tom 185, Goeddel, D.V. wyd. Academic Press (1990). W celu wywołania ekspresji w komórkach ssaków, korzystne jest zastosowanie plazmidu pDSRa opisanego w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr 90/14363. W celu wywołania ekspresji w komórkach bakterii, korzystne jest zastosowanie plazmidów posiadających promotor lux (patrz zgłoszenie nr US 08/577,778 z dnia 22 grudnia 1995 roku, dokonane na rzecz AMGEN INC.). Dodatkowo, dostępne są wektory do wywoływania tkankowo-specyficznej ekspresji proteiny wiążącej OPG u zwierząt teansgeniczngch. Można także użyć wektory transferu genów oparte na retrowieuscch i adenowieuscch w celu wywołania ekspresji proteiny wiążącej OPG w komórkach ludzkich do terapii in vivo (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr 86/00922).

Peokarioteczne i eukariotyczne komórki gospodarza, w których zachodzi ekspresja proteiny wiążącej OPG są także przedmiotem wynalazku. Do komórek gospodarza zaliczamy komórki bakterii, drożdży, roślin, owadów lub ssaków. Proteina wiążąca OPG może także być wytwarzana przez zwierzęta trcnsgeniszne takie, jak myszy lub kozy. Plazmidy i wektory zawierające kwasy nukleinowe według wynalazku są umieszczane w odpowiednich komórkach

190 092 gospodarza przy użyciu technik transfekcji i transformacji znanych biegłym w sztuce. Komórki gospodarza mogą zawierać sekwencje DNA kodujące proteinę wiążącą OPG, przedstawione na rysunku fig. 1 lub ich część, jak obszar pozakomórkowy lub obszar cytoplazmatyczny. Kwasy nukleinowe kodujące proteiny wiążące OPG mogą być modyfikowane przez substytucję kodonów, które umożliwiają optymalną ekspresję u danego gospodarza. Co najmniej niektóre z kodonów mogą być tak zwanymi kodonami preferencyjnymi, które nie zmieniają sekwencji aminokwasów i są często znajdowane w genach podlegających znacznej ekspresji. Jednakże jest zrozumiałe, ze zmiany w kodonie mające na celu optymalizację ekspresji nie są ograniczone do wprowadzania kodonów preferencyjnych. Przykładami korzystnych komórek ssaków służących ekspresji proteiny wiążącej OPG są (lecz nie wyłącznie): COS, CHOd-, komórki 293 i 3T3. Korzystną bakteryjną komórką-gospodarzem jest Escherichia coli.

Polipeptydy

Przedmiotem wynalazku jest także proteina wiążąca OPG jako produkt prokariotycznej lub eukariotycznej ekspresji sekwencji egzogennego DNA; proteina wiążąca OPG jest rekombinacyjną proteiną wiążącą OPG. Do sekwencji egzogennego DNA zaliczamy cDNA, genomowy DNA i syntetyczne sekwencje DNA. Proteina wiążąca OPG może być produktem ekspresji komórki bakteryjnej, drożdzowej, roślinnej, owadziej lub pochodzić z niekomórkowych systemów translacji. Proteina wiążąca OPG wytwarzana w komórce bakteryjnej będzie miała N-końcową resztę metioniny. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania proteiny wiążącej OPG polegający na prowadzeniu hodowli prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarza transformowanych lub transfekowanych kwasami nukleinowymi kodującymi proteinę wiążącą OPG oraz izolacji polipeptydowych produktów ekspresji kwasów nukleinowych.

Polipeptydy, które są proteinami wiążącymi OPG pochodzącymi od ssaków lub są ich fragmentami, analogami lub pochodnymi, również są przedmiotem wynalazku. W korzystnym przykładzie realizacji, proteiną wiążącą OPG jest ludzka proteina wiążąca OPG. Termin „fragment proteiny wiążącej OPG” odnosi się do polipeptydu, z którego usunięto jeden lub więcej aminokwasów, a powstały polipeptyd posiada co najmniej właściwość wiązania OPG. Ze wskazanych fragmentów usunięto aminokwasy pochodzące z części amino-końcowej, karboksy-końcowej oraz z wewnętrznych obszarów polipeptydu. Fragmenty proteiny wiążącej OPG zawierają co najmniej około 10 aminokwasów, co najmniej około 20 aminokwasów lub co najmniej około 50 aminokwasów. W korzystnym przykładzie realizacji, proteina wiążąca OPG będzie miała usunięty jeden lub więcej aminokwasów z obszaru transbłonowego (reszty aminokwasowe 49-69 przedstawione na rysunku fig. 1) lub alternatywnie - jeden lub więcej aminokwasów z odcinka amino-końcowego z ewentualnym włączeniem obszaru transbłonowego (reszty aminokwasowe 1-49 przedstawione na rysunku fig. 1). W innym przykładzie realizacji proteina wiążąca OPG jest proteiną rozpuszczalną zawierającą, przykładowo, reszty aminokwasów 69-316 lub 70-316 lub stanowi N-końcowo lub C-końcowo obciętą postać, która zachowuje właściwość wiązania OPG. Proteina wiążąca OPG jest także rozpuszczalną ludzką proteiną, przedstawioną na rysunku fig. 4, zawierającą reszty 69-317, przedstawione na rysunku fig. 4, a także N-końcowo obcięte formy, obejmujące przykładowo reszty 70-517, 71-517, 71-317, 72-317 i tak dalej z rysunku fig. 4. W korzystnym przykładzie realizacji rozpuszczalna ludzka proteina wiążąca OPG zawiera reszty 69-317 oraz N-końcowe obcięcia az do OPGbp [158-317] lub alternatywnie do OPG [166-317].

Termin „analog proteiny wiążącej OPG” odnosi się do polipeptydu, w którym zamieniono lub dodano jeden lub więcej aminokwasów tak, ze powstały polipeptyd posiada co najmniej właściwość wiązania OPG. Analogi takie będą zawierać substytucje lub addycję aminokwasów w dowolnych miejscach wzdłuz polipeptydu. Do korzystnych analogów zalicza się analogi rozpuszczalnych protein wiążących OPG. Fragmenty lub analogi mogą występować naturalnie tak, jak produkt polipeptydowy wariantu allelowego lub wariant splotu mRNA lub mogą być wytwarzane przy użyciu technik manipulacji i syntezy kwasów nukleinowych znanych biegłym w sztuce. Polipeptydy mogą zawierać (lub nie zawierają) amino-końcową resztę aminową.

Wynalazek obejmuje także pochodne proteiny wiążącej OPG będące polipeptydami, które poddano modyfikacjom post-translacyjnym (jak przykładowo dodanie łańcuchów

190 092 węglowodanowych związanych przez N- lub 0-, przetwarzanie zakończeń N-końcowych lub C-końcowych), w których dołączono ugrupowania chemiczne do szkieletu aminokwasowego, chemiczne zmodyfikowano łańcuchy węglowodanowe połączone przez N- lub O- i dodano N-końcową resztę metionfnową) w wyniku ekspresji prokariotycznej komórki gospodarza. W szczególności rozważane są zmodyfikowane chemicznie pochodne proteiny wiążącej OPG, które posiadają dodatkowe zalety takie, jak zwiększona stabilność, dłuzszy czas obiegu lub obniżona immunogenność. Szczególnie korzystna jest modyfikacja za pomocą rozpuszczalnych w wodzie polimerów, takich jak glikol polietylenowy i jego pochodne (patrz przykładowo patent nr US 4,179,337). Ugrupowania chemiczne do tworzenia pochodnych mogą być wybrane spośród rozpuszczalnych w wodzie polimerów takich, jak glikol polietylenowy, kopolimery glikolu etylenowego/propylenowego, karboksymetyloceluloza, dekstran, alkohol poliwinylowy itp. Polipeptydy mogą być modyfikowane w przypadkowych miejscach w obrębie cząsteczki lub w z góry ustalonych miejscach w obrębie cząsteczki i mogą zawierać jedno, dwa, trzy lub więcej dołączonych ugrupowań chemicznych. Polipeptydy mogą być także zmodyfikowane w z góry ustalonych miejscach polipeptydu takich, jak odcinek amino-końcowy lub przy wybranych resztach lizyny lub argininy w obrębie polfpepSydh. Inne opisane modyfikacje chemiczne to wykrywalne znakowanie takie, jak znakowanie enzymatyczne, fluorescencyjne, izotopowe lub znakowanie na zasadzie powinowactwa w celu wykrycia i wyodrębnienia proteiny.

Wynalazkiem objęte są także chimery proteiny wiążącej OPG zawierające część lub całość sekwencji aminokwasów proteiny wiążącej OPG złączone (w wyniku fuzji) z heterologiczną sekwencją aminokwasową. Sekwencja heSerologiczna może być dowolną sekwencją, która umożliwia powstałej proScinie fuzyjnej co najmniej zachowanie właściwości wiązania OPG. W korzystnym przykładzie realizacji karboksy-końcowy obszar pozakomórkowy proteiny wiążącej OPG podlega fuzji z sekwencją heterologiczną. Takie sekwencje obejmują heterologiczne obszary cytoplazmatyczne, które umożliwiają powstanie alternatywnych wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnałowych, sekwencje, które sprzyjają oligomeryzacji takie, jak obszar Fc w IgG, sekwencje enzymów, które służą do znakowania polipeptydu i sekwencje wykorzystywane w testach powinowactwa takich, jak rozpoznawanie antygenu przez przeciwciało.

Polipeptydy według wynalazku są izolowane i oczyszczane z tkanek i linii komórkowych, w których zachodzi ekspresja proteiny wiążącej OPG, albo w drodze ekstrakcji z lizatów albo z wzbogaconych pożywek wzrostowych i z transformowanych komórek gospodarza, w których zachodzi ekspresja proteiny wiążącej OPG. Proteina wiążące OPG może być otrzymywana z mielomonocySow·ej linii komórkowej 32-D myszy (numer dostępu ATCC: CRL-11346). Ludzka proteina wiążąca OPG lub kodujące ją kwasy nukleinowe mogą być wyizolowane z ludzkiego węzła chłonnego lub tkanki wątroby płodu. Wyizolowana proteina wiążąca OPG nie jest związana z ludzkimi proteinami lub innymi składnikami komórki.

Sposób oczyszczania proteiny wiążącej OPG ze źródeł naturalnych (przykładowo tkanek i linii komórkowych, w których normalnie zachodzi ekspresja proteiny wiążącej OPG) i z transfekowanych komórek gospodarza jest także przedmiotem wynalazku. Proces oczyszczania może angażować jeden lub więcej etapów standardowego oczyszczania proteiny we właściwej kolejności, umożliwiającej otrzymanie oczyszczonej proteiny. Etapy chromatograficzne mogą obejmować wymianę jonową, filtrację na zelu, interakcję hydrofobową, odwróconą fazę, ogniskowanie chromatograficzne, chromatografię na zasadzie powinowactwa z użyciem przeciwciała przeciwko proteinie wiążącej OPG oraz kompleks powinowactwa biotyna-sSrepSawidyna itp.

Przeciwciała

Przeciwciała specyficznie wiążące polipeptydy według wynalazku są także przedmiotem wynalazku. Przeciwciała mogą być wytwarzane na drodze immunizacji proteiną wiążącą OPG pełnej długości, rozpuszczalnymi formami proteiny wiążącej OPG lub jej fragmentami. Przeciwciała według wynalazku mogą być poliklonalne lub monoklonalne lub mogą być przeciwciałami rekombinacyjnymi takimi, jak przeciwciała chimeryczne, w których stałe obszary mysie w łańcuchach lekkich i ciężkich są zastąpione sekwencjami ludzkimi lub przeciwciałami szczepionymi CDR, w których tylko obszary determinujące komplementamość pochodzą od

190 092 myszy. Ptzzciwciała wzdług wynalazku mzgą być takZz crzocCwciałymC ludzkimi spzraądzznymi ptzfkładzwz na dtzdzz immnniaycSC zwizrząt transdznizznych, zdzlnych dz wytwarzania ludzkich craeciwcCał (publikacja WO 93/12227). Ptrzciwciały są przydat^ dz wykrywania ptzizinf wićząceS OPG w próbkach nmzzliwiaSąz CdoniffikacSę kzmórek i tkanzk, którz wywarzają białkz. Dzdatkzwz, ctzzcCwzCały, którz wiąZą prztzinę wiąZącą OPG i blzkują intetakcje z innymi związkami wiąZącymi mzgą mroć aastaszwaniz tztaczntfcane w mzdulzwyniu róZniczwynia zstzzklystów i rzszrczjC kzści.

Przzciwciyła waględzm ptztzinf wiąZączj OPG mzgą mizć zystzszwamz w lzcazniu chzrób kzści, jak zstzzpztzza i chzrzba Pygzt'y. Ptzzciwciyła mzgą być tostzwynz na wiązaniz a ptztzmć wiąZącą OPG w abzcnzścC lub bzz dzdatku OPG i badanz pzd waględzm ich zdzlnzści dz inhibitzwyniy zstzzklystzgznzay i/lub tzszφcji kzśzi crzzbCzgyjącfch a udziałzm ligyndu (ptztziny wiąZączj OPG). Przzwiduje się takZz, zz i samz czpifdf mzgą zychzwywać się jak yntagzniści intzrakcji ligand:tzczptzt i hamzwać zstzaklystzgznzaę ptaebizgającą a udziałzm ligandu; pzpifdf ptztziny wiąząceS OPG będą równ^Z badanz pzd tym waględzm.

Kompozycje

PraedmCztzm wynalazku są takZz kampzafcje farmycoutycanz zywizryjącz tzrapeutfcaniz sknizcane ilzści ptatzinf wiąZączj OPG wzdług wynalazku wraz z fyrmaczuifcaniz (^^ tzwanym rzazieńczalnCkizm, naśnCkizm, zmulgatzrem, środkizm kansorwującfm i/lub adjuw(ntem. PtazdmCztem wynalazku są takZz kzmpzafcSz farmaczutfcano zawioraSącz tzrapzutycznie skntecznz ilzści (gznisty lub antagznCstf OPG. Tzrmin „tzryczutfczniz sk^zcma ilzść” zanyczy ilzść, która wfwzłnjo efekt tetaczniycanf przy zkrzślznfm schztaznin i zkreślznej drzdaz czdania. KzmpzayzSy mzZz być w fztmiz płynu lub lizfibzytu i mzZz aawCoryć rozpuszczalnik (Ttis, bnfztf zctanzwz lub fzsfzr(nawz) z róZnych wartościach pH i silz jznzwzj, rozpuszczalniki iakie, jak Twzzn lub Pzlisztbyt, nzśniki takte, jak ludzka albumina zszczzwa lub Zzlatyna, środki kznszrąuSącz tykiz, jak timzrosal lub ylkzhzl benaflzwf i antfzksfdantf takCe, jak kwas askztbinzwf lub mei(wzdzrzsCarczyn szdu. Wybór zkrzślznzS kzmczzycji będaie zalzzał zd wizlu czynników włączniz a rzdaajzm schzraonia, drzgą pzdania i pzZądanymi paramztrymi fytmaZzZme'iyca.nyryi. Szzrszf wykaz adczwCzdnCch kzmcznzntów zawarty jesi w Rzmingtzn's Pharmaczutical Sciznczs, 18 wyd., A.R. Gznnarz, wyd. Mack, Eastzn, PA(1980).

W kzrzfstnfm craykładzCz realizacji aapewnianz są tykZz kzmcazfcSz zawizraSące rzapusacaylnz cratzlnf wiąZącz OPG. Wynylazzk zbejmnSz tzZ kzmpazycSz zawiztającz rzacnsacaylnz crzteinf wiąZącz OPG zmzdyfckzwyne rozpuszczalnymi w wzdaiz pzbmzrami w czlu awięksaznia rzapnsazzalnzści, stabilnzści, zkrzsu półtrwyniy i bCzdzstęcnzścC. KzmpzzfcSz mzgą tykZz zywCeryć rzzcnsacaalne crztzinf wiąZącz OPG włćczznz dz liczszmów, mlktzzmnlsSC, miczlli lub pęchztzyków w czlu uzyskania kantrzlzwynzdz uwalniania w dłuższym zktzciz. Rzzcusacaalna przteCna wiąZąca OPG mzZz być włączmy dz miktzcaąstzk craeanaczznyzh dz stzszwaniy dzcłucnzdz.

KzmpzzfzSe wzdług wynalazku mzgą być stószwanz w fzrmiz inCzkcsi pzdskórnfch, dzZylnych lub dzmlęśnCzwfch, bądź w czstacC dz pzdawyniy dzustnzgz, dznzszwzgz, dzpłucnzgz lub dzzdbytzwzgz. Ewentnalnf wybór dtzgi czdynCa będziz zalzzał zd wizlu czynników i mzze być dzkznany przza biegłzgz w sztucz.

Przzdmiztzm wynalazku są takZz kampzaycSe fyrmaczuifcanz zywizrySące tzt(czutfcznCe zfzkifwnć ilzść kwasów nuklzinzwfzh wzdług wynalazku wraz fyrmycontycanCe dzpuszczalnym adjnwantem. KzmczaycSz kwasów nuklzinzwych będą adczwiodnCo dz dzsiarcaynia dz kzmórzk i tkanzk części lub cyłzści zbszatu kzdnjączda ptztzinę wiąZącą OPG i/lub zbsaatów bzcznych jakz część tzrycCi anty-sonszwnej.

Sposoby wykorzystania oraz zastosowania

Prztziny wiąZącz OPG magą być stzszwane w wizlu tzstach ny wykrywyniz OPG i na ch(takiztyzzwanie mizrakcSl a OPG. Ogólniz, test pz^ga ny inkubacji crztzinf wiąZączj OPG a próbką bizlzgicaną zawiztającą OPG w warunkach, które pzawylają na związaniz OPG a ptzielną wiąZącą OPG i pzmiar zakresu związania. OPG mzZz być zzafsacazna lub wystęczw(t w mieszynln(ch takich, jak płyny nstrzjzwe lub pzZywka hzdzwlany. Tzsiy mzgą być jakzścizwz lub llzścizwe, tz drugiz są przydat^ dz zkrzślania parymzbOw wiązania (stałz

190 092 powinowactwa i kinetyka) OPG z proteiną wiążącą OPG oraz do mierzenia poziomu aktywnej biologiczme OPG we wskazanych mieszaninach. Testy mogą także być przydatne do oceny wiązania OPG z fragmentami, analogami lub pochodnymi proteiny wiążącej OPG i do identyfikacji nowych członów rodziny OPG i rodziny proteiny wiążącej OPG.

Wiązanie OPG z proteiną wiążącą OPG może być wykorzystane na kilku sposobów, włącznie z testami wiązania w oparciu o komórki, testami wiązania z błoną, testami fazy rozpuszczalnej oraz testami immunologicznymi. Generalnie, śladowe ilości znakowanej OPG inkubuje się z próbkami proteiny wiążącej OPG przez określony czas, następnie mierzy się związane OPG przez filtrację, elekrochemiluminescencję (ECL, system ORIGEN według IGEN) lub testy immunologiczne. Homogenne technologie testów na radioaktywność (SPA, Amersham) i fluorescencja rozłożona w czasie (HTRF, Packard) mogą być także zastosowane. Wiązanie jest wykrywane przez znakowanie OPG lub przeciwciała przeciwko OPG izotopami radioaktywnymi (¹²⁵I, ³⁵S, ³H), barwnikami fluorescencyjnymi (fluorosceina), chelatami lub kryptatami lantanidu (Eu3+), kompleksami orbipirydylorutenu (Ru²⁺). Jest zrozumiałe, ze wybór znakowanej sondy będzie zalezał od stosowanego systemu detekcji. Alternatywnie, OPG może być modyfikowana nieznakowanym tagiem epitopowym (jak przykładowo biotyna, peptydy, His6, myc) i związana z proteinami takimi, jak streptawidyna, przeciwciała przeciwko peptydom lub białkom, znakowanymi wykrywalnymi znacznikami, jak to opisano wyżej.

W alternatywnym sposobie proteina wiążąca OPG może być poddawana testom bezpośrednio przy użyciu przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych przeciwko proteinom wiążącym OPG w teście immunologicznym. Dodatkowe formy protein wiążących OPG zawierających tagi epitopowe, jak opisano powyżej mogą być stosowane w testach rozpuszczalności i testach immunologicznych.

Sposoby identyfikowania związków, które wchodzą w interakcje z proteiną wiążącą OPG są także przedmiotem wynalazku. Odnośny sposób polega na inkubowaniu proteiny wiążącej OPG ze związkiem w warunkach powalających na związanie związku z proteiną wiążącą OPG i zmierzeniu zakresu wiązania. Związek może być zasadniczo oczyszczony lub może występować w surowej mieszaninie. Związkami wiążącymi mogą być kwasy nukleinowe, proteiny, peptydy, węglowodany, lipidy lub związki organiczne o małej masie cząsteczkowej. Związki mogą być dalej charakteryzowane przez ich zdolność do zmniejszania lub zwiększania aktywności proteiny wiążącej OPG w celu określenia, czy działają jak agoniści czy antagoniści.

Proteiny wiążące OPG są także przydatne do identyfikacji białek wewnątrzkomórkowych, które wchodzą w interakcje z ich obszarem cytoplazmatycznym, metodą dwuhybrydowego skriningu drożdży. Przykładowo, konstrukty hybrydowe zawierające DNA kodujące 50 N-końcowych aminokwasów proteiny wiążącej OPG poddane fuzji z obszarem wiążącym GAL4-DNA drożdży mogą by ć używane jako dwu-hybrydowy plazmid wabiący. Pozytywne klony uzyskane w wyniku skriningu mogą być dalej charakteryzowane w celu identyfikacji białek wchodzących w interakcje. Ta informacja może być pomocna w wyjaśnieniu wewnątrzkomórkowego mechanizmu sygnałowego związanego z proteiną wiążącą OPG i wskazania wewnątrzkomórkowych celów oddziaływania nowych leków, które modulują resorpcję kości.

Proteina wiążąca OPG może być stosowana do leczenia stanów charakteryzujących się nadmierną gęstością kości. Najbardziej powszechnym stanem jest osteopetroza, w której defekt genetyczny powoduje zwiększenie masy kostnej i zazwyczaj prowadzi do śmierci w pierwszych latach życia. Osteopetroza jest korzystnie leczona przez zastosowanie rozpuszczalnej proteiny wiążącej OPG.

Przedmiotem wynalazku są także modulatory (agoniści i antagoniści) proteiny wiążącej OPG i sposoby ich otrzymywania. Modulator proteiny wiążącej OPG może zarówno zwiększać, jak i zmniejszać co najmniej jedno działanie proteiny wiążącej OPG, takie jak zdolność do wiązania OPG lub jakiejś innej cząsteczki wchodzącej w interakcje lub zdolność regulowania dojrzewania osteoklastów. Typowo, agonista lub antagonista może być kofaktorem takim, jak białko, peptyd, węglowodan, lipid lub cząsteczka o małej masie molekularnej, która wchodzi w interakcje z proteiną wiążącą OPG regulując jej aktywność. Do potencjalnych antagonistów polipeptydowych należą przeciwciała, które reagują zarówno z rozpuszczalnymi,

190 092 jak i ze związanymi z błoną formami proteiny wiążącej OPG oraz rozpuszczalne formy proteiny wiążącej OPG, które zawierają część lub cały obszar pozakomórkowy proteiny wiążącej OPG. Cząsteczki, które regulują ekspresję proteiny wiążącej OPG typowo obejmują kwasy nukleinowe, komplementarne względem kwasów nukleinowych kodujących proteinę wiążącą OPG i działające jak anty-sensowne regulatory ekspresji.

Proteina wiążąca OPG jest zaangażowana w kontrolę tworzenia dojrzałych osteoklastów, będących podstawowym typem komórek biorących udział w resorpcji kości. Zwiększenie tempa resorpcji kości (powyżej tempa tworzenia kości) może prowadzić do różnorodnych schorzeń kości nazwanych wspólnie osteopeniami, do których zaliczamy osteoporozę, zapalenie szpiku, hiperkalcemię, osteopenię wywołaną chirurgicznie łub na skutek stosowania sterydów, chorobę Paget'a, martwicę kości, utratę masy kostnej na skutek reumatoidalnego zapalenia stawów, paradontozy, unieruchomienia, obluzowywanie protez oraz ogniska osteolityczne w fazie przerzutów. Odwrotnie, spadek tempa resorpcji kości może prowadzić do osteopetrozy - stanu, w którym gęstość kości nadmiernie wzrasta. Agoniści i antagoniści proteiny wiążącej OPG modulują tworzenie osteoklastów i związki te mogą być stosowane u pacjentów ze schorzeniami kości. Agoniści i antagoniści proteiny wiążącej OPG, jako związki stosowane w leczeniu osteopenii mogą być podawane samodzielnie lub w kombinacji z terapeutycznie skuteczną ilością środka sprzyjającego wzrostowi kości, do których zalicza się kostne czynniki morfogenne określane jako BMP-1 do BMP-12, transformujący czynnik wzrostu p i człony rodziny TGF-f5, czynniki wzrostu fibroblastów FGF-1 do FGF-10, inhibitory interleukiny-1, inhibitory TNF-a, hormon przytarczyc, prostaglandyny serii E, bifosfoniany i minerały wzmacniające kości, jak fluor i wapń. Antagoniści protein wiążących OPG wykazuj ą szczególną przydatność w leczeniu osteopenii.

Receptory protein wiążących osteoprotegerynę

Przedmiotem wynalazku są także receptory, które wchodzą w interakcje z proteinami wiążącymi OPG. W szczególności przedmiotem wynalazku jest receptor różnicowania i aktywacji osteoklastów (ODAR). ODAR jest transbłonowym polipeptydem, który wykazuje najwyzszy stopień homologii z CD40, członem rodziny receptora TNF. Sekwencja kwasu nukleinowego mysiego receptora ODAR oraz kodowany polipeptyd są przedstawione na rysunku fig. 10. Ludzki homolog mysiego ODAR może być z łatwością wyizolowany metodą hybrydyzacji skriningowej ludzkiego cDNA łub biblioteki genowej przy użyciu sekwencji kwasu nukleinowego przedstawionej na rysunku fig. 10. Procedury klonowania ludzkiego ODAR są podobne do procedur opisanych w przykładzie 5 dotyczących klonowania ludzkich protein wiążących OPG. Ludzki homolog polipeptydu przedstawionego na rysunku fig. 10 został opisany przez Anderson'a i wsp. (Nature 390, 175-179 (1997)), gdzie jest określony jako RANK. RANK jest scharakteryzowany jako proteina transbłonowa typu I, wykazująca homologię z członami rodziny receptora TNF i zaangażowana w funkcjonowanie komórek dendrytowych.

Dowody interakcji ODAR z proteiną wiążącą OPG są przedstawione w przykładzie 13. Rozpuszczalna forma ODAR (białko fuzyjne ODAR-Fc) zapobiega dojrzewaniu osteoklastów in vitro (fig. 12) i zwiększa gęstość kości u zdrowych myszy po wstrzyknięciu podskórnym (fig. 13). Wyniki te potwierdzają interakcję proteiny wiążącej OPG z ODAR i aktywację ODAR przez proteinę wiążącą OPG sprzyjającą dojrzewaniu osteoklastów.

Rozwój osteoklastów i tempo oraz zakres resorpcji kości są regulowane przez interakcję proteiny wiążącej OPG i ODAR. Związki, które zmniejszają lub blokują interakcję proteiny wiążącej OPG i ODAR są potencjalnymi antagonistami aktywności proteiny wiążącej OPG i mogą zaburzać rozwój osteoklastów prowadząc do zmniejszonej resorpcji kości. Alternatywnie, związki, które nasilają interakcję proteiny wiążącej OPG i ODAR są potencjalnym i agonistami, sprzyjającymi rozwojowi osteoklastów i nasilającymi resorpcję kości.

W celu zmierzenia interakcji pomiędzy proteiną wiążącą OPG i ODAR in vitro można uzyć wielu różnych testów z zastosowaniem oczyszczonych protein. Testy te mogą być użyte do skriningu związków pod kątem ich zdolności do zwiększania lub zmniejszania tempa lub zakresu wiązania ODAR z proteiną wiążącą OPG. W jednym typie testów proteina ODAR może być unieruchomiona na dnie zagłębienia płytki do mikromiareczkowania. Radioaktywnie znakowana proteina wiążąca OPG (przykładowo jodowana proteina wiążąca

190 092

OPG) i badany związek lub związki mogą być wówczas dodawane pojedynczo (w dowolnym porządku) lub jednocześnie do zagłębienia. Po inkubacji, zagłębienie może być przemyte, a stopień radioaktywności zmierzony licznikiem scyntylacyjnym w celu określenia zakresu wiązania proteiny wiążącej OPG z ODAR w obecności badanego związku. Typowo, związek będzie badany w szerokim zakresie stężeń, a w celu zapewnienia dokładności oceny wyników można użyć serii zagłębień kontrolnych, w których jeden lub więcej niz jeden element testu został pominięty. Alternatywną metodą jest odwrócenie „pozycji” białek: unieruchomienie proteiny wiążącej OPG w zagłębieniach płytki do mikromiareczkowania, inkubowanie z badanym związkiem i znakowanym radioaktywnie ODAR oraz określenie zakresu wiązania ODAR (patrz przykładowo rozdział 18 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel i wsp., wyd. John Wiley & Sons, New York, NY [1995]).

Alternatywą dla znakowania radioaktywnego, jest sprzęzenie proteiny wiążącej OPG lub ODAR z biotyną oraz wykrywanie następnie obecności biotynylowanej proteiny przy użyciu streptawidyny związanej z enzymem takim, jak peroksydaza z chrzanu [HRP] lub fosfataza alkaliczna [AP] i oznaczanie streptawidyny z doczepionym znacznikiem (tagiem) kolorymetrycznym lub fluorescencyjnym. Można także wykorzystać przeciwciało skierowane przeciwko proteinie wiążącej OPG lub ODAR, które są sprzęzone z biotyną i wykrywać to przeciwciało po inkubacji ze związaną z enzymem streptawidyną związaną z AP lub HRP.

Proteina wiąząca OPG i ODAR mogą być także unieruchomione przez przyłączenie do kuleczek agarozowych, perełek akrylowych lub innego inertnego substratu tego rodzaju. Kompleks substrat-proteina można wprowadzić do roztworu zawierającego komplementarne białko i badany związek; po inkubacji perełki można odwirować i przeprowadzić ocenę związania proteiny wiążącej OPG i ODAR przy pomocy opisanych wyżej metod. Alternatywnie, kompleks substrat-proteina można unieruchomić na kolumnie, a badany związek i białko komplementarne - przepuszczać przez kolumnę. Tworzenie kompleksów pomiędzy proteiną wiążącą OPG i ODAR można wówczas oceniać przy pomocy opisanych wyżej technik, jak znakowanie radioaktywne, wiązanie przeciwciał itp.

Innym typem testu in vitro przydatnego do identyfikacji związku, który zwiększa lub zmniejsza tworzenie kompleksu ODAR/proteina wiążąca OPG jest powierzchniowy system detektora rezonansu plazmonu taki, jak system do prób Biacore (Pharmacia, Piscataway, NJ). Test ten może być przeprowadzany zgodnie z instrukcją producenta. Test ten zasadniczo angażuje kowalentne wiązanie proteiny wiążącej OPG lub ODAR do sensorowego chipu pokrytego dekstranem, umieszczonego w detektorze. Badany związek i drugą komplementarną proteinę można wówczas wstrzyknąć do komory zawierającej chip sensorowy albo jednocześnie, albo po kolei, a ilość komplementarnej proteiny, która ulega związaniu można ocenić w oparciu o zmianę masy cząsteczkowej, która jest fizycznie związana ze stroną sensorowego chipu, pokrytą dekstranem; zmiana masy molekularnej może być zmierzona za pomocą tego systemu detektora.

W niektórych przypadkach pożądana może być ocena dwóch lub więcej badanych związków razem w celu wykorzystania do podwyższania lub obniżania tworzenia kompleksu ODAR/proteina wiążąca OPG. W tych przypadkach opisane wyżej testy mogą być z łatwością zmodyfikowane poprzez dodanie takich dodatkowych badanych związków jednocześnie z pierwszym badanym związkiem lub po nim. Pozostałe etapy testu są jak opisane wyżej.

Testy in vitro takie, jak opisane wyżej mogą być korzystnie używane do szybkiego zbadania skriningowego dużej liczby związków pod kątem ich wpływu na tworzenie kompleksu ODAR i proteiny wiążącej OPG. Testy te mogą być zautomatyzowane w celu skriningowego badania związków z bibliotek prezentacji fagowej, syntetycznych peptydów i syntezy chemicznej.

Związki, które nasilają lub zmniejszają tworzenie kompleksu proteiny wiążącej OPG i ODAR mogą także być badane w hodowlach komórkowych przy użyciu komórek oraz linii komórkowych zawierających ODAR. Komórki i linie komórkowe mogą być uzyskiwane od dowolnego ssaka, lecz korzystnie będą to komórki pochodzące od człowieka lub innego naczelnego, psa lub gryzonia. Komórki zawierające ODAR takie, jak osteoklasty mogą być wyodrębnione z mieszanin z komórkami innych typów, z wykorzystaniem chromatografii opartej na powinowactwie, przy użyciu powszechnie dostępnych procedur. Przyłączenie proteiny wiążącej OPG do komórek zawierających ODAR jest oceniane w obecności lub pod nieobecność

190 092 badanych związków, a stopień związania może być określany przykładowo metodą cytometrii przepływowej przy użyciu biotynylowanego przeciwciała przeciwko proteinie wiążącej OPG. Alternatywnie, załozona może być hodowla osteoklastów myszy lub człowieka, jak to opisano w przykładzie 8, a badane związki mogą być oceniane pod względem ich zdolności do blokowania dojrzewania osteoklastów stymulowanego dodatkiem CSF-1 oraz proteiny wiążącej OPG. Testy hodowli komórkowej mogą być korzystnie stosowane do dalszej oceny związków, które dają wynik pozytywny w testach wiązania protein opisanych wyżej.

Związki, które zwiększają lub zmniejszają interakcję pomiędzy proteiną wiążącą OPG i ODAR mogą także być oceniane pod względem aktywności in vivo poprzez podanie ich myszom i zmierzenie gęstości kości przy użyciu densytometru skaningowej lub radiografii. Procedury mierzenia gęstości kości są opisane w publikacji WO 97/23614 oraz w ponizszym przykładzie 13.

Przedmiotem wynalazku są związki, które zmniejszają lub blokują interakcję pomiędzy proteiną wiążącą OPG i ODAR i są antagonistami tworzenia osteoklastów. Takie związki zaliczają się generalnie do dwóch grup. Do jednej grupy należą związki otrzymywane z proteiny wiążącej OPG, lub które wchodzą w interakcje z proteiną wiążącą OPG. Opisano je powyżej. Do drugiej grupy należą związki, które są otrzymywane z oDAr, lub które wchodzą w interakcje z ODAR. Przykładami związków, które są antagonistami ODAR są kwasy nukleinowe, proteiny, peptydy, węglowodany, lipidy lub związki organiczne o małej masie cząsteczkowej .

Antagonistami ODAR mogą być związki, które wiążą się poprzez lub w pobliżu jednego lub więcej miejsc wiązania OPGbp w pozakomórkowym obszarze ODAR i zmniejszają lub całkowicie blokują tworzenie kompleksu. Te obszary receptora ODAR, które są zaangażowane w tworzenie kompleksu z proteiną wiążącą OPG mogą być zidentyfikowane przez analogię ze strukturą homologicznego kompleksu TNFP/TNF-R55, który został opisany przez BannerU i wsp. (Celi 73, 431-445 (1993)). Przykładowo, struktura kompleksu TNfP/TNF-R55 może być użyta do identyfikacji obszarów proteiny wiążącej OPG i ODAR, które są zaangażowane w tworzenie kompleksu. Można wówczas zaprojektować związki, które preferencyjnie wiążą się z obszarami zaangażowanymi w tworzenie kompleksu i które działają jak antagoniści. W jednym z możliwych podejść, opisanym w przykładzie 11, antygeny peptydowe były zaprojektowane do stosowania przy wytwarzaniu przeciwciał przeciwko proteinie wiążącej OPG, które działają jak antagoniści. Oczekuje się, że te przeciwciała będą wiązały się z proteiną wiążącą OPG i będą blokowały tworzenie kompleksu z ODAR. W podobnym podejściu antygeny peptydowe oparte na strukturze ODAR mogą być użyte do wytwarzania przeciwciał przeciwko ODAR, które dzicłająjak antagoniści.

Antagoniści ODAR mogą także wiązać się z ODAR w innych miejscach niż miejsca wiązania OPGbp i indukować zmiany konformcsgjne w polipeptydzie ODAR, czego wynikiem jest zmniejszenie lub tworzenie nieproduktywnych kompleksów z proteinami wiążącymi OPG.

W jednym przykładzie realizacji antagonistą jest rozpuszczalna forma ODAR pozbawiona funkcjonalnego obszaru transbłonowego. Rozpuszczalne formy ODAR mogą mieć delecje jednego lub więcej niż jednego aminokwasu w domenie transbłonowej (aminokwasy 214-234, przedstawione na rysunku fig. 10). Rozpuszczalne polipeptydy ODAR mogą posiadać część lub cały obszar pozckomórkowg i są zdolne do wiązania proteiny wiążącej OPG. Ewentualnie, rozpuszczalny ODAR może być częścią chimerycznej proteiny, w której część lub całość obszaru pozakomórkowego ODAR podlega fuzji z heterologiczną sekwencją aminokwasową. W jednym przykładzie realizacji heterologiczną sekwencję aminokwasową stanowi domena Fc ludzkiej IgG.

Modulatory (agoniści lub antagoniści) ODAR mogą być stosowane do zapobiegania lub leczenia osteopenii włącznie z osteoporozą, zapaleniem szpiku, hiperkalcemią złośliwą, osteopenią wywołaną chirurgicznie lub na skutek podawania sterydów, chorobą PagetU, martwicą kości, utratą masy kostnej na skutek reumatoidalnego zapalenia stawów, pcradontozg, unieruchomienia, z obluzowgwcniem protez i ogniskami osteolizy w fazie przerzutów. Agoniści i antagoniści ODAR stosowane w leczeniu osteopenii mogą być podawane samodzielnie lub w kombinacji z terapeutycznie skutecznymi ilościami środka sprzyjającego wzrostowi kości,

190 092 w tym z kostnymi czynnikami morfogennymi oznaczanymi jako BMP-1 do BMP-12, transformującym czynnikiem wzrostu P i członami rodziny TGF-β, czynnikami wzrostu fibroblastów FGF-1 do FGF-10, inhibitorami mSerlrukiny-1, inhibitorami TNFa, hormonem przytarczyc, prostaglandynami serii E, bifosfonianami, estrogenami, SERMs i minerałami wzmacniającymi kości, jak fluor i wapń. Związki będące antagonistami ODAR są szczególnie przydatne w leczeniu osteopenii.

Następujące przykłady w pełniejszy sposób ilustrują wynalazek, lecz nie ograniczają jego zakresu.

Przykład 1. Identyfikacja źródła linii komórkowej dla proteiny wiążącej OPG

Osteoprotegeryna (OPG) negatywnie reguluje osteoklastogenezy in vitro oraz in vivo. Ponieważ OPG jest proteiną pokrewną receptorowi TNFR, to prawdopodobnie oddziałuje z członem rodziny pokrewnej z TNF pośrednicząc w jego działaniu. Z jednym wyjątkiem, wszystkie znane człony superrodziny TNF są proteinami transbłonowymi typu II ekspresjonowanymi na powierzchni komórki. W celu identyfikacji źródła proteiny wiążącej OPG, użyto rekombinacyjne proteiny fuzyjne OPG-Fc jako immunosondy w celu zlokalizowania protein wiążących OPG umiejscowionych na powierzchni różnych linii komórkowych i głównych komórek CemaSopoetycznych.

Linie komórkowe, które wzrastały w postaci adherentnych hodowli in vitro poddano obróbce przy użyciu następujących metod: Komórki umieszczono na płytkach do hodowli tkankowej o 24 zagłębieniach (Falcon), po czym pozwolono im na wzrost do około 80% konfluencji. Następnie pożywki wzrostowe usunięto i adherentne hodowle przemyto solanką buforowaną fosforanem (PBS) (Gibco) zawierającą 1% cielęcej surowicy płodowej (FCS). Rekombinacyjne proteiny fuzyjne: mysia OPG[22-194]-Fc i ludzka OPG [22-201]-Fc (patrz zgłoszenie nr US 08/706.945 dokonane 3 września 1996) rozcieńczono osobno do stężenia 5 ug/ml w PBS zawierającym 1% FCS, po czym dodano do hodowli i poddano inkubowaniu przez 45 minut w temperaturze 0°C. Roztwór proteiny fuzyjnej OPG-Fc usunięto i komórki przemyto roztworem PBS-FCS jak opisano wyżej. Następnie hodowle poddano działaniu sprzężonego z fikoryrtryną fragmentu F(ab') koziego wtórnego przeciwciała przeciw ludzkiej IgG (Southern Biotrchnology Associates Cat. # 2043-09) rozcieńczonego w PBS-FCS. Po 30-45 minutach inkubacji w temperaturze 0°C roztwór usunięto, a hodowle przemyto jak opisano wyżej. Następnie komórki analizowano metodą mikroskopii immunofluorescencyjnej, w celu wykrycia linii komórkowych, które ekspresjonują proteinę wiążącą OPG na powierzchni komórki.

Zawiesiny hodowli komórkowych poddano analizie w podobny sposób, z następującymi modyfikacjami: rozcieńczalnik i bufor do przemywania składały się z solanki buforowanej fosforanem wolnym od wapnia i magnezu, zawierającej 1% FCS. Komórki zebrano z hodowli replikujących rksponencjαlnie w pożywkach wzrostu, zbrylono przez odwirowanie, a następnie ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny o stężeniu ^W⁷ komórek/ml na płytce do mikromisrrczkowania do hodowli tkankowej o 96 zagłębieniach (Falcon). Komórki kolejno poddano działaniu ^kombinacyjnych protein fuzyjnych OPG-Fc, a następnie wtórnego przeciwciała, jak opisano wyżej, przy czym komórki przemywano przez odwirowanie pomiędzy wszystkimi etapami. Następnie komórki analizowano metodą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) przy użyciu urządzenia Becton Dickinson FACscan.

Stosując to podejście stwierdzono, ze mysia mielomonocytowa linia komórkowa 32D (ATCC Nr CIR ,-11346) ekspresjonuje powierzchniową cząsteczkę, którą można wykryć zarówno przy użyciu zarówno mysiej OPG[22-194]-Fc jak i ludzkiej OPG[22-201]-Fc proteiny fuzyjnej. Samo wtórne przeciwciało nie wiązało się z powierzchnią komórek 32D, podobnie jak oczyszczona proteina fuzyjna ludzka IgGl-Fc, co wskazuje, że wiązanie proteiny fuzyjnej OPG-Fc następowało dzięki cząsteczce OPG. Wiązanie to mogło być ograniczone w sposób zalezny od dawki przez dodanie konkurencyjnej mysiej lub ludzkiej rekombinacyjnej proteiny OPG[22-401]. A zatem obszar OPG wymagany dla jej aktywności biologicznej jest zdolny do specyficznego wiązania z powierzchniową cząsteczką pochodzącą z komórek 32D.

Przykład 2. Ekspresyjne klonowanie mysiej proteiny wiążącej OPG

Bibliotekę cDNA utworzono z 32D mRNA i ligowano do ssaczego wektora ekspresji pcDNA3 1(+) (Liwitrogen, San Diego, CA). Zebrano rksponencjalnie rosnące komórki 32D

190 092 utrzymywane w obecności rekombinacyjnej mtcrlchkiny-3 i cały RNA komórek oczyszczono metodą ekstrakcji przy użyciu mieszaniny: kwaśny tiocyjanian guanidyniowy-fenol-chloroform (Chomczynski i Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156-159, (1987)). Frakcję poił (A+) mRNA uzyskano z preparatu całego RNA w wyniku adsorpcji na Dynabeads Oligo (dT) (Dynal Corp) i wymycia zaadsorbowanej frakcji, przy użyciu metod zalecanych przez producenta. Ukierunkowaną bibliotekę cDNA primowanego oligo-dT utworzono przy użyciu metody Superscript Plasmid System (Gibco bRl, Gaishersburg) Md) w myśl przepisu zalecanego przez producenta. Otrzymany cDNA wytrawiono całkowicie za pomocą endonukleaz restrykcyjnych Sal I i Not I, po czym frakcjonowano metodą chromatografii żelowej z wykluczaniem ze względu na rozmiary. Frakcje o największej masie cząsteczkowej wydzielono, po czym ligowano do obszaru polilinkera wektora plazmidowego pcDNA3.1(+) (Inyitrogen, San Diego, CA). Wektor ten zawiera promotor CMV „w górę” od miejsca wielokrotnego klonowania i ukierunkowuje wysoki poziom ekspresji w komórkach eukariotycznych. Następnie bibliotekę poddano elektroporowaniu do kompetentnej E. coli (ElectroMAX DH10B, Gibco, NY) i miareczkowano na agarze LB zawierającym 100 ug/ml ampicyliny. Bibliotekę następnie podzielono na oddzielne porcje obejmujące około 1000 klonów/porcję, uszeregowano i prowadzono hodowlę każdej porcji w objętości 1,0 ml przez 16-20 godzin w temperaturze 37°C. DNA plazmidu z każdej hodowli otrzymano przy użyciu Qiagen Qiawell 96 Ultra Plasmid Kit (numer katalogowy #16191) w myśl procedury zalecanej przez producenta.

Uszeregowane porcje biblioteki ekspresji cDNA z 32D poddano osobno lipofekcji do hodowli COS-7, po czym zbadano uzysk proteiny wiążącej OPG z powierzchni komórki. Aby tego dokonać komórki COS-7 o gęstości lxl0⁶/ml umieszczono na płytkach do hodowli tkankowej o sześciu zagłębieniach (Costar), po czym prowadzono hodowlę przez noc w DMEM (Gibco) zawierającym 10% FCS. Około 2 ng DNA plazmidu z każdej porcji rozcieńczono w 0,5 ml DMEM bez dodatku surowicy, po czym sterylizowano przez odwirowanie przez kolumnę 0,2 jm Spin-X (Costar). Jednocześnie 10 (al lipofektaminy (Life Technologies, nr kat. # 18324-012) dodano do oddzielnej probówki zawierającej 0,5 ml DMEM bez dodatku surowicy. Roztwory DNA i lipofektaminy zmieszano i poddano inkubowaniu w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie hodowle komórek COS-7 przemyto DMEM bez dodatku surowicy i kompleksy ΠNA-lipofektamina poddano działaniu hodowli przez 2-5 godzin w temperaturze 37°C. Po tym czasie usunięto pożywkę i zastąpiono ją DMEM z dodatkiem 10% FCS. Komórki poddano następnie hodowli przez 48 godzin w temperaturze 37°C.

W celu wykrycia hodowli ekspresjonujących proteinę wiążącą OPG, pożywki wzrostu usunięto i komórki przemyto roztworem PBS-FCS. Do każdego zagłębienia dodano objętość 1,0 ml PBS-FCS zawierającą 5 ug/ml proteiny fhryjncJ ludzkiej OPG[22-201]-Fc i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Komórki przemyto trzykrotnie roztworem PBS-FCS, po czym utrwalono za pomocą PBS z dodatkiem 2% paraformaldehydu i 0,2 % glutaraldehydu w PBS w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Hodowle przemyto jeden raz PBS-FCS, po czym inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 65°C w zanurzeniu w roztworze PBS-FCS. Hodowle ochłodzono, a roztwór PBS-FCS odessano. Następnie hodowle inkubowano z kozim przeciwciałem przeciw ludzkiej IgG (Fc specyficznym) skoniugowanym z fosfatazą alkaliczną IgG (SIGMA Produkt nr #A-9544) w temperaturze pokojowej przez 30 minut, po czym trzykrotnie przemyto 20 mM Tris-Cl (pH 7,6) i 137 mM NaCl. Utworzone podczas tych etapów immunokompleksy wykryto stosując próbę na aktywność fosfatazy alkalicznej przy użyciu Fast Red TR/AS-Mx Substrate Kit (Pierce, nr kat. # 34034), zgodnie z rekomendowaną przez producenta procedurą.

Stosując to podejście skriningowi poddano ogółem około 300.000 niezależnych klonów cDNA z 32D, reprezentowanych przez 300 transfekowanych porcji po 1000 klonów każda. Zidentyfikowano pojedyncze zagłębienie zawierające komórki, które uzyskały zdolność do specyficznego „naznaczenia” proteiną fuzyjną OPG-Fc. Zbiór ten podzielono przez kolejne cykle selekcji „sib”, otrzymując pojedynczy klon plazmidu 32D-F3 (fig. 1). Następnie DNA plazmidu 32D-F3 transfekowano do komórek COS-7, które immunowybarwiono albo przy użyciu samego wtórnego koziego przeciwciała przeciw ludzkiej IgG skoniugowanego z FITC, proteiną fuzyjną ludzkiej OPG[22-201]-Fc plus to wtórne przeciwciało, albo proteiny ihzyjnej ATAR-Fc (ATAR znany jest również jako HVEM; Montgomery i wsp., Celi 87, 427-436

190 092 (1996)) (fig. 2). Samo drugorzędowe przeciwciało nie ulegało związaniu z komórkami COS7/32D-f3, podobnie jak proteina fuzyjną ATAR-Fc. Jedynie proteina fuzyjną OPG Fc wiązała się z komórkami COS-7/32D-F3, co wskazuje, że 32D-F3 koduje proteinę wiążącą OPG usytuowaną na powierzchni ekspresjonujących komórek.

Przykład 3. Sekwencja proteiny wiążącej OPG

Wyodrębniony powyżej klon 32D-F3 zawierał insert cDNA o około 2,3 kb (fig. 1), który poddano sekwencjonowaniu w obu kierunkach na automatycznym urządzeniu (sekwencerze DNA) Applied Biosystems 373A, stosując kierowane przez primer reakcje barwnik Taq - terminator (Applied Biosystem) w myśl procedur zalecanych przez producenta Otrzymaną końcową sekwencję nukleotydu porównano z bazą danych sekwencji DNA przy użyciu programu FASTA (GCG, University of Wisconsin) i analizowano na obecność długich otwartych ramek odczytu (LORF's) przy użyciu aplikacji „Six-way open reading frame” (Frames) (GCG, University of Wisconsin). Stwierdzono, że LORF 316 reszt aminokwasów (aa) poczynając od metioniny ma odpowiednią orientację i jest poprzedzona przez obszar nietranslowany 5' o około 150 parach zasad. Nietranslowany obszar 5' zawierał objęty ramką stop-kodon „w górę” od przewidywanego start-kodonu. Wskazuje to, ze struktura plazmidu 32D-F3 odpowiada jego zdolności do wykorzystania obszaru promotora CMV do bezpośredniej ekspresji w komórkach ssaków produktu genowego o 316 aminokwasach.

Przewidziana sekwencja proteiny wiążącej OPG została następnie porównana z bazą danych znanych sekwencji białkowych przy użyciu zmodyfikowanej wersji programu FASTA (Pearson, Meth. Enzymol. 183, 63-98 (1990)). Sekwencja aminokwasowa była również analizowana na obecność specyficznych motywów zachowanych we wszystkich znanych członach superrodziny czynnika martwicy nowotworu (TNF) przy użyciu metody profili sekwencyjnych (Gribskov i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4355-4359 (1987), modyfikowanej przez: Luethy i wsp., Protein Sci. 3, 139-146 (1994)). Stwierdzono znaczącą homologię w całej proteiny wiążącej OPG z szeregiem członów superrodziny TNF. Mysia proteina wiążąca OPG okazuje się najściślej pokrewna z mysim i ludzkim homologiem ligandów zarówno TRAIL, jak i CD40. Dalsze analizy sekwencji proteiny wiążącej OPG wykazały silne dopasowanie do superrodziny TNF, z wysoce znaczącą wartością Z wynoszącą 19,46.

Sekwencja aminokwasowa proteiny wiążącej OPG zawiera prawdopodobną hydrofobową domenę transbłonową, która rozpoczyna się przy M49 i rozciąga się do L69. W oparciu 0 tę konfigurację względem start-kodonu metioniny przewiduje się, ze proteina wiążąca OPG jest proteiną transbłonową typu II, o krótkim wewnątrzkomórkowym obszarze N-końcowym i dłuższej zewnątrzkomórkowej domenie C-końcowej (fig. 4). Byłoby to podobne do wszystkich znanych członów rodziny TNF za wyjątkiem limfotoksyny alfa (Nagata i Goldstein, Science 267, 1449-1456(1995)).

Przykład 4. Ekspresja mRNA ludzkiej proteiny wiążącej OPG

Wielokrotne próby „Northern blots” tkanki ludzkiej (Clontech, Pało Alto, CA) sondowano stosując fragment restrykcyjny 32D-F3 znaczony ^P-dCTP w celu ustalenia wielkości ludzkiego transkryptu i oznaczenia wzorców ekspresji. Northern blots prehybrydyzowano w warunkach 5X SSPE, 50% formamid, 5X roztwór Denhardta, 0,5% SDS i 100 ug/ml denaturowanego DNA spermy łososia, przez 2-4 godziny w temperaturze 42°C. Następnie bioty hybrydyzowano w warunkach: 5X SSPE, 50% formamid, 2X roztwór Denhardta, 0,1% SDS, 100 |ig /ml denaturowanego DNA spermy łososia i 5 ng/ml znaczonej sondy przez 18-24 godzin w temperaturze 42°C. Następnie bioty przemyto 2X SSC w ciągu 10 minut w temperaturze pokojowej, IX SSC w ciągu 10 minut w temperaturze 50°C, a następnie w 0,5X SSC w ciągu 10-15 minut.

Stosując sondę pochodzącą z mysiego cDNA i prowadząc hybrydyzację w surowych warunkach wykryto w węzłach chłonnych dominujące indywidua mRNA o względnej masie cząsteczkowej około 2,5 kb (fig. 3). Wykryto także słaby sygnał o tej samej względnej masie cząsteczkowej w mRNA wątroby płodu. Nie wykryto transkryptów proteiny wiążącej OPG w innych badanych tkankach. Dane wskazują, ze ekspresja mRNA proteiny wiążącej OPG była skrajnie ograniczona w ludzkich tkankach. Dane te wskazują również, ze wyodrębniony klon cDNA jest bardzo bliski co do wielkości do rodzimego transkryptu sugerując, ze 32D-F3 jest klonem o pełnej długości.

190 092

Przykład 5. Klonowanie molekularne ludzkiej proteiny wiążącej OPG

Ludzki homolog proteiny wiążącej OPG jest ekspresjonowany jako mRNA o około 2,5 kb w ludzkich obwodowych węzłach chłonnych i jest wykrywany przez hybrydyzację z sondą my siego cDNA w surowych warunkach hybrydyzacji. DNA kodujący ludzką proteinę wiążącą OPG uzyskuje się przez skrining biblioteki cDNA ludzkiego węzła chłonnego metodami hybrydyzacyjnymi stosując rekombinacyjną płytkę bakteriofagu albo transformowaną kolonię bakterii (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał Cold Spring Harbor Press, New York (1989)). W tym celu fagi lub biblioteka plazmidu cDNA są skrinowane przy użyciu znakowanych radioaktywnie sond pochodzących z klonu 32D-F3 mysiej proteiny wiążącej OPG. Sondy stosuje się do skrinowania filtru nitrocelulozowego uniesionego z osadzonej biblioteki. Filtry te są prehybrydyzowane, a następnie hybrydyzowane przy użyciu warunków podanych w przykładzie 4, prowadząc w końcu do uzyskania oczyszczonych klonów cDNA ludzkiej proteiny wiążącej OPG. Inserty otrzymane z jakichkolwiek klonów ludzkiej proteiny wiążącej OPG mogłyby być sekwencjonowane i analizowane jak to opisano w przykładzie 3.

Poły A+ RNA ludzkiego węzła chłonnego (Clontech, Inc., Pało Alto, CA) poddano analizie na obecność transkryptów par zasad OPG, jak wcześniej ujawniono w zgłoszeniu nr US Nr 08/577.788, dokonanym 22 grudnia 1995 roku. „Northern błot” próbki tego RNA po sondowaniu w surowych warunkach przy użyciu sondy mysiej OPGbp znaczonej 32p wskazał na obecność transkryptów ludzkiego OPGbp. Następnie bibliotekę dT-primowanego oligomeru cDNA zsyntezowano z mRNA węzła chłonnego przy użyciu SuperScript kit (GIBCO life Technologies, Gaithersberg, MD), jak opisano w przykładzie 2. Uzyskany cDNA poddano selekcji ze względu wielkości i frakcję o wysokim cięzarze cząsteczkowym ligowano do wektora plazmidu pcDNA 3.1 (+) (Iiwitrogen, San Diego, CA). Transformowano elektrokompetentną E. coli DH10 (GIBCO life Technologies, Gaithersberg, MD) i odporne na ampicylinę 1x10 iransformanty skrinowano przez hybrydyzację kolonii przy użyciu sondy mysiej proteiny wiążącej OPG znakowanej 32p.

Klon plazmidu domniemanego cDNA ludzkiej proteiny wiążącej OPG wyizolowano - phuOPGbp-1.1; zawierał on insert o 2,3 kp. Otrzymana sekwencja nukleotydu insertu phuOPGbp-1.1 była w około 80-85% homologiczna z sekwencją cDNA mysiej proteiny wiążącej OPG. Translacja sekwencji insertu DNA wskazała na obecność długiej otwartej ramki odczytu przewidzianej do kodowania polipeptydu o 317 aminokwasach (fig. 4). Porównanie polipeptydów mysiej i ludzkiej OPGbp wykazuje ze są one w około 87% identyczne, wskazując, ze proteina ta jest zachowana w wysokim stopniu podczas ewolucji.

DNA ludzkiej proteiny wiążącej OPG ani sekwencje protein nie występowały w Genbanku, ani nie było tam homologicznych sekwencji EST. Jak w przypadku mysiego homologu, ludzka proteina wiążąca OPG wykazuje silne podobieństwo sekwencji do wszystkich członów superrodziny cytokin TNFa.

Przykład 6. Klonowanie i ekspresja bakteryjna proteiny wiążącej OPG

Amplifikację PCR wykorzystującą pary primerów i szablony opisane poniżej użyto do wygenerowania różnych form mysiej proteiny wiążącej OPG. Jeden primer każdej pary wprowadza stop-kodon TAA i jednostkowe miejsce Xhol lub SacII za karboksy-końcem genu. Drugi primer z każdej pary wprowadza jednostkowe miejsce Ndel, N-końcową metioninę i optymalne kodony dla aminokońcowej części genu. PCR i termocykling prowadzi się przy użyciu standardowej metodologii rekombinacyjnego DNA. Produkty PCR oczyszczono, wytrawiono restrykcyjnie i wprowadzono do miejsc jednostkowych Ndel i Xhol lub SacII wektora pAMG21 (AtCc Nr 98113) i transformowano do prototropowej E. coli 393 lub 2596. Inne zazwyczaj stosowane wektory ekspresji E. coli i komórki gospodarza są również przydatne do ekspresji. Po transformacji klony zebrano, wyodrębniono plazmid DNA i potwierdzono sekwencję insertu proteiny wiążącej OPG.

pAMG21 -mysia proteina wiążąca OPG [75-316]

Ten konstrukt zrealizowano tak aby miał 242 aminokwasy długości oraz na stępujące

N-końcowe i C-końcowe reszty: NH2-Met9750-Asp-Pro-Asn-Arg---------------------------------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Szablonem stosowanym dla PCR był pcDNA/32D-F3,

190 092 a stosowaną parą primerów dla PCR i klonowania tego konstruktu genowego były oligonukleotgdg o numerach #1581-72 i #1581-76.

1581-72·

5'-GTTCTCCTCATATGGATCCAAACCGTATTTCTGAAGACAGCACTCACTGCTT-3’ (SEQ ID NO: 5)

1581-76:

5' -TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3' (SEQ ID NO: 6) pAMG21-mysia proteina wiążąca OPG [95-316]

Zrealizowano konstrukt o długości 223 aminokwasów, który miał następujące Nkońcowe i C-końcowe reszty: NH2-NVIet-His(95)-Clu-Asn-Alc-Clg------------------------------Gln-Asp-He-Asp(316)-COOH. Szablonem stosowanym dla PCR był pcDNA/32D-F3, a stosowaną parą primerów dla PCR i klonowania tego konstruktu genowego były oligonukleotydy 0 numerach #1591-90 i #1591-95.

1591-90:

5'-ATnGATT(^”rA(^G^^,Ai^jGAGCiAATAACATATGCATGAAAACGCAGGTCTGCAG-3' (SEQ ID NO: 7)

1591-95:

5'-TATCCGCCGATCCTCCACTTACTCTATGTCCTCAACTTTCAA-3' (SEQ ID NO: 8) pAMG21 -mysia proteina wiążąca OPG [107-316]

Zrealizowano konstrukt o długości 211 aminokwasów, który miał następujące N-końcowe i C-końcowe reszty: NH2-Met-Ser(107)-Glu-Asp-The-Leu...........................................

Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Szablonem stosowanym dla PCR był pcDNA/32D-F3, a stosowaną parą primerów dla PCR i klonowania tego konstruktu genowego były oligonukleotydy 0 numerach #1591-93 i #1591-95.

1591-93:

5'-ATTTCATTCTACAAGGAGGAATAACATATGΓCTGSAACSACACTCTCCCCCACTCC-3' (SEQ ID NO: 9)

1591-95:

'-TATCCCCGGATCCTCGAGTTAGTCTATCTCCTCAACTTTCAA-3' (SEQ ID NO: 10) pAMG21 -mysia proteina wiążąca OPG [118-316]

Zrealizowano konstrukt o długości 199 aminokwasów, który miał następujące N-końcowe i C-końcowe reszty: NH2-Met(118)-Lys-Gln-Ala-Phe-Gln------------------------------------------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Szablonem stosowanym dla PCR był pcDNA/32D-F3, a stosowaną parą primerów dla PCR i klonowania tego konstruktu genowego były oligonukleotydy 0 numerach #1591-94 i #1591-95.

1591-94

5'-ATTTGATTCTA6AA66A6GAATAACATAT6AAACAA6CTTTTCA6666-3' (SEQ ID NO: 11)

1591-95. 5 '-TATCCGCCCATCCTCGAGTTACTCTATCTCCTGAACTTTCAA-3' (SEQ ID NO: 12) pAMG21-mvsia proteina wiążąca OPG [128-316]

Zrealizowano konstrukt o długości 190 aminokwasów, który miał następujące N-końcowe ί C-końcowe reszty: NH2-Met-Lys(i28)-Głu-Leu-Gln-His............................................

dn-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Szablonem stosowanym dla PCR był pcDNA/32D-F3, a stosowaną parą primerów dla PCR i klonowania tego konstruktu genowego były oligonukleotedg o numerach #1591-91 i #1591-95.

1591-91:

5ATTTGATTCTACAACCAGCAATAACATATGAAAGAACTGCAGCACATTCTG-3' (SEQ ID NO: 13)

190 092

1591-95:

5'-TATCCGCGG.ATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGA.ACTTTGAA-3· (SEQ ID NO: 14) pAMG21 -mysia proteina wiążąca OPG [ 137-316]

Zrealizowano konstrukt o długości 181 aminokwasów, który miał następujące N-końcowe i C-końcowe reszty: NH2-Met-Gln(137)-Arg-Phe-Ser-Gly------------------------------------------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Szablonem stosowanym dla PCR był pcDNA/32D-F3, a stosowaną parą primerów dla PCR i klonowania tego konstruktu genowego były oligonukleotydy o numerach #1591-92 i #1591-95.

1591-92:

5'-ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGCAGCGTTTCTCTGGTGCTCCA-3· (SEQ ID NO: 15)

1591-95:

5'-TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA-3· (SEQ IDNO: 16) pAMG21-mysia proteina wiążąca mysiego OPG [146-316]

Zrealizowano konstrukt o długości 171 aminokwasów, który miał następujące N-końcowe ί C-końcowe reszty: NH2-Met(146)-Glu-Gly-Ser-Trp...........................................GlnAsp-Ile-Asp(316)-COOH. Szablonem stosowanym dla PCR jest wyżej opisany pAMG21 mysia proteina wiążąca OPG [158-316], a stosowaną parą primerów dla PCR i klonowania tego konstruktu genowego są oligonukleotydy o numerach #1600-98 i #1581-76.

1600-98:

5' -gttctcctcatatggaaggttcttggttggatgtggccca-3' (SEQ IDNO: 17)

1581-76: 5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3’ (SEQ ID NO: 18) pAMG21-mysia proteina wiążąca OPG [156-316]

Tworzy się konstrukt o długości 162 aminokwasów, który ma następujące N-końcowe i C-końcowe reszty: NH2-Met-Arg(156)-Gly-Lys-Pro----------------------------------Gln-Asp-IleAsp(316)-COOH. Szablonem stosowanym dla PCR jest poniższy pAMG21- mysia proteina wiążąca OPG [158-316], a stosowaną parą primerów dla PCR i klonowania tego konstruktu genowego są oligonukleotydy o numerach #1619-86 i #1581-76.

1619-86:

5'_GTTCTCCTCATATGCGTGGTGGACCTGAAGCTCAACCATTTGTA-3' (SEQ IDNO: 19)

1581-76:

5'-ATTTCACATTGTGGAAAGATAATTTTTAGTATTAΓGA-3· (SEQ IDNO: 20) pAMG21 -mysia proteina wiążąca OPG [158-316]

Zrealizowano konstrukt o długości 160 aminokwasów, który miał następujące N-końcowe i C-końcowe reszty: NH2-Met-Lys(158)-Pro-Glu-Ala--------------------------------------------GlnAsp-Ile-Asp(316)-COOH. Szablonem stosowanym dla PCR był pcDNA/32D-F3, a stosowaną parą primerów dla PCR i klonowania tego konstruktu genowego były oligonukleotydy o numerach #1581-73 i #1581-76.

1581-73:

5·-GAΓCATCACATAAΓTGAAATCTGAATTATAACCAATΓGTATACTTCACCAACAAA-3' (SEQ ID NO:21)

1581-76:

5·-ATCTTTCACTGTGTATAGACTATGTCCTGAACTAAGA-3· (SEQ ID NO: 22) pAMG21 -mysia proteina wiążąca OPG [166-316]

Zrealizowano konstrukt o długości 152 aminokwasów, który miał następujące N-końcowe i C-końcowe reszty: NH2-Met-His(166)-Leu-Thr-Ile--......—---------------------------------GlnAsp-Ile-Tsp(3i6)-COOH. Szablonem stosowanym dla PCR jest pcDNC/32D-F3, a stosowaną

190 092 parą ptimzrów dla PCR i klznzwania tzgz kznstruktu denzwzgz są aliganuklzziydf z nnmerach #1581-75 i #1581-76.

1581-75:

5'GTTCTCCTCATATGCATTTAACTATTAACGCTGCATCTATCCCATCGGGTTCCCAT

AAAGTCACT-3' (SEQ ID NO: 23)

1581-76: 5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3' (SEQ ID NO: 24) pAMG21 -mysia proteina wiążąca OPG [168-3161]

Zre(lizzw(nz kznstrukt z dlugzści 150 (mCnzkwyców, który miał nystępujące N-kzńczwz i C-kzńczwe reszty: NH2-Met-Thr(168)-nz-Asn-Ala.............................................GlnAsp-Ilz-Acp(316)-COOH. Saablanzm stasawanfm dla PCR był pcDNA/32D-F3, a ctacawana patą primzrów dla PCR i klznzwania tedz kznctrnktn dznzwega były alCgznukleztydy z numerach #1581-74 i #1581-76.

1581-74:

5'GTTCTCCTCATATGACTATTAACGCTGCATCTATCCCATCGGGTTCCCATAAAGTCACT-3' (SEQ ID NO: 25)

1581-76: 5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3' (SEQ ID NO: 26)

NatoZy tzaumCet, Zz czwfZsaz kznciruktf są przykładami i bizgły w sztucz mazz łatwz atrzfmat innz fatmf prztziny wiąZączj OPG przy aactaszwanCu zgólnzj metadalagii tutaj prezentaw(nzj.

Rekzmbin(cyjnz baktztyjnz kznctrnkty pAMG21- mysia proteina wiąZąca OPG [75-316], [95-316], [107-316], [118-316], [128-316], [137-316] i [158-316] sklanzw(nz, patwiztdaanz cekwencję DNA i ptazbadana pzaCzmf zkspresji rz-kambinazfSnzgz produktu denzwzdz pz indukcji. WcafctkCe kanstrukiy wytwarzały pzzCamy rzkambCnazyjnzdz ctzduktn denn, którz były łatwz wCdacane pz zlzktrzfzrzaCz SDS na Zzlu palCakrflaamldawfm i wybarwianiu surzwych liaatów przy uZyciu „ezzmassiz”. Wzrost trancfztmzwanzj E. czli 393 lub 2596, indukcja ekcprzsjC przizinf wCąZąceS OPG i wyzdrębniznCe ciał inkluzyjnych zawCzraSącfch przteCnę wiąZącą OPG wykOTa^ w myśl cpzsabów zcicanyzh w publikacji WO 97/23614. Oczyszczasz wiąZączj OPG z ciał inkluzyjnych wymaga czlubiliaacji i renaturacji protziny wiąZączj OPG przy uZyciu scasabów dzstępnych bizgłym w sztucz. Stwizrdzanz, Zz rzkambinacfSna mysia prztzina wiąZąca OPG [158-316] pzwctawał( craewaznCz wz frakcji nierazpncaczalnzS, lzca w akzłz 40% stwCerdaanz wz frakcji raacuszczalnzS. Rzkambinacfjna prztzinę zcaycacazna wfzhzdaąc a frakcji rzacucacaalnej jak zcicana canCzej i zbadanz jzj bia(ktywnaść.

Przykład 7. Oczyszczani rzZzmbinacyjneS mysizS prztziny wiąZączj OPG [158-316]

Z(mrzZzne kzmórki baktzryjne zawizraSącz zkcprzsjznzwaną mysią prateinę wiąZączj OPG [158-316] admrzzznz i cznzwniz prazprzwadzzna w stan aawizsiny w 20 mM tris-HCl pH=7,0, 10 mM EDTA. Następni aawiecinę kamórkzwą (20 % wagzwz/zbjętzścCzwych) paddana hzmzgenizacSi przzz trzykrztnz crzzpuczcaznCe jzj praza mikrzflnCdya(tar. Poddaną lizi aawizsinę kzmórkzwą zdwlrzwana przy uZyciu wirówki typu JA 14 a cafbkaśclą 10.000 abtatów/minnię w ciągu 45 minut. Analiza SDS-PAGE wykazała pa^z z cięzaraz cząciecakzwym akałz 18 kd abzcnz aarównz w ciałach inkluzyjnych zraa w suczylatanci. Następni rozpuszczalną frakcję umizcacaanz na kzlumniz typu Pharmacia SP Szcharzcz 4FF zrównzwaZznzj 10 mM MES z pH=6,0. Protzinę wiąZącą OPG eluawanz 20 x zbjętaścCą kalnmnawą rzatwzru z gr(dCzncie O - 0,4 M NaCl w MES z pH=6,0. Następni aawizraSące protzinę wiąZącą OPG umizsaczznz na kzlumniz typu ABX Bakzrbznd zrównawazanzS 20 mM MES z pH=6,0. Przieinę wiąZącą OPG zluzw(na 15 x zbjętzśzią kzlumnzwą rzaiwaru z gradiencie 0 - 0,5 M NaCl w MES z pH=6,0. Kzńczwy przdukt był w pmad 95 % hamzgznicany wzdług SDS-PAGE. N-kzńcawz szkwzncjanzwanle wykaaałz następującą cekwencję: Mei-Lfs-Pro-Glu-Ala-Gln-Pro-Phe-Ala-His, którą zidentffikzwanz jakz crzewldfwaną dla

190 092 polipeptydu rozpoczynającego się przy reszcie 158 (z inicjującą metioniną). Względny ciężar cząsteczkowy proteiny podczas badania SDS-PAGE nie ulegał zmianie w wyniku redukcji.

Przykład 8. Bioaktywność in vitro rozpuszczalnej rekombinacyjnej proteiny wiążącej OPG

Uprzednio wykazano, ze rekombinacyjna proteina OPG blokuje zalezne od witaminy D3 tworzenie osteoklastów z prekursorów ze szpiku kostnego i śledziony w próbach tworzenia osteoklastów, jak to opisano w zgłoszeniu nr US 08/577,788. Jako ze proteina wiążąca OPG wiąże się z OPG i jest nowym członem rodziny ligandów TNF, jest ona potencjalnym celem bioaktywności OPG. Rozpuszczalną rekombinacyjna proteinę wiążącą OPG (158-316) reprezentującą minimalny obszar (domenę) rdzenia podobny do TNFa, badano na jej zdolność do modulowania różnicowania osteoklastów z prekursorów osScoklasSów. Komórki szpiku kostnego wyodrębniono z kości udowych dorosłych myszy i potraktowano M-CSF. Nieadherentne frakcje poddano hodowli wspólnie z komórkami ST2 w obecności i pod nieobecność zarówno witaminy D3 jak i deksametazonu. Jak uprzednio wykazano, osteoklasty pochodzą tylko ze współhodowli zawierającej komórki zrębowe (ST2), witaminę D3 i deksametazon. Dodano rozpuszczalną rekombinacyjna proteinę wiążącą OPG w różnych stężeniach - w przedziale od 0,16 do 500 ng/ml i określano dojrzewanie osteoklastów stosując próbę z roztworem TRAP i prowadząc obserwację wzrokową. Proteina wiążąca OPG silnie stymulowała różnicowanie i dojrzewanie w sposób zalezny od dawki, z pół-maksymalnymi efektami w przedziale 1-2 ng/ml, co wskazuje, że działa ona jako potencjalny czynnik wywołujący osSeoklasSogenezę in vitro (fig. 5). Działanie proteiny wiążącej OPG jest blokowane przez rekombinacyjną OPG (fig. 6).

W celu zbadania czy proteina wiążąca OPG mogłaby zastąpić komórki zrębowe oraz dodawane steroidy, założono hodowle stosując M-CSF w różnych stężeniach w celu promocji wzrostu prekursorów osteoklastów i dodano również różne ilości proteiny wiążącej OPG. Jak pokazano na rysunku fig. 6, stymulowanie aktywności TRAP zalezy od dawki proteiny wiążącej OPG, a stopień stymulacji zalezy od poziomu dodanego M-SCF co sugeruje, ze te dwa czynniki wzięte razem są centralnymi czynnikami dla rozwoju osSeoklasSów. W celu potwierdzenia biologicznej istotności tej ostatniej obserwacji, załozono hodowle na wycinkach kory kości bydlęcych i obserwowano wpływ M-CSF i proteiny wiążącej OPG albo oddzielnie albo razem. Jak pokazano na rysunku fig. 7 proteina wiążąca OPG w obecności M-CSF stymulowała tworzenie dużych pozytywnych osteoklastów TRAP, które wyżerały powierzchnię kości tworząc w niej zagłębienia. Zatem, proteina wiążąca OPG działa jako czynnik stymulujący (różnicujący) osSeoklastogenczę. Wskazuje to, ze OPG blokuje rozwój osteoklastów przez sekwestrację proteiny wiążącej OPG.

Przykład 9. Aktywność in vivo rozpuszczalnej rekombinacyjnej proteiny wiążącej OPG

Zgodnie z badaniami in vitro, wytworzona w E. coli rekombinacyjna mysia proteina wiążąca OPG jest silnym czynnikiem wywołującym rozwój osteoklastów z prekursorów mieloidowych. W celu określenia jej wpływów in vivo samce myszy BDF1 w wieku 4-5 tygodni (Charles River Laboratories) otrzymywały podskórne iniekcje z proteiny wiążącej OPG [158316] dwa razy dziennie przez trzy dni i rankiem czwartego dnia (dni 0, 1, 2 i 3). Pięć grup myszy (n=4) otrzymało odpowiednio: wcale albo 1, 5, 25 lub 100 pg/proteiny wiążącej OPG [158-316] dziennie. Dalsze 5 grup myszy (n=4) otrzymywało powyzsze dawki nośnika lub proteiny wiążącej OPG [158-316] i dodatkowo otrzymywało ludzką Fc-OPG [22-194] w ilości 1 mg/Kg/dzień (około 20 pg/dzień) w postaci jednej podskórnej iniekcji. Oznaczano wapń w postaci jonowej w pełnej krwi przed testem w dniu „0” oraz w 3-4 godziny po pierwszej codziennej iniekcji z proteiny wiążącej OPG [158-316] w dniach 1, 2 i 3. Cztery godziny po ostatniej iniekcji trzeciego dnia myszy uśmiercono i wykonano radiogramy.

Rekombinacyjna proteina wiążąca OPG [158-316] powodowała znaczący wzrost jonów wapnia we krwi po upływie dwóch dni po podaniu dawki 5 pg/dzień i większych (fig 8). Wysokie nasilenie objawów hiperkalcemii wskazuje na silne indukowanie aktywności osteoklastów i związanej z tym zwiększonej resorpcji kości. Współbieżne podawanie OPG ograniczało hiperkalcemię w przypadku dawek proteiny wiążącej OPG [158-316] w ilości 5 i 25 ug/dzień, lecz nie w przypadku 100 pg/dzień. Te same zwierzęta poddano analizie metodą radiograficzną w celu określenia, czy wystąpiły jakiekolwiek efekty wizualne w gęstości mineralnej

190 092 kości po napromieniowaniu promieniami X (fig. 9). Rekombinacyjna proteina wiążąca OPG [158-316] podawana na drodze iniekcji przez 3 dni powodowała zmniejszenie gęstości kości w dosiebnej piszczeli myszy w sposób zalezny od wielkości dawki. Obniżenie gęstości kości było szczególnie widoczne u myszy otrzymujących dawkę 100 pg/dzień co potwierdza, że głęboka hiperkalcemia u tych zwierząt wytworzyła się wskutek resorpcji kości i następczego uwalniania wapnia ze szkieletu Dane te jasno wskazują, ze proteina wiążąca OPG [158-316] oddziałuje in vivo sprzyjając resorpcji kości, co prowadzi do układowej hiperkalcemii oraz że rekombinacyjna OPG usuwa te efekty.

Przykład 10. Klonowanie i ekspresjonowanie rozpuszczalnej proteiny wiążącej OPG w komórkach ssaków

Klon mysiej i ludzkiej proteiny wiążącej OPG o pełnej długości można poddać ekspresji w komórkach ssaków jak uprzednio opisano w przykładzie 2. Alternatywnie, klony cDNA można zmodyfikować tak, by kodowały wydzielane formy proteiny przy ekspresji w komórkach ssaków. Aby to wykonać, naturalny koniec 5' cDNA kodującego kodon inicjacji i rozciągający się w przybliżeniu przez pierwsze 69 aminokwasów proteiny, włączając w to obszar transbłonowy mógłby być zastąpiony sekwencją lidera peptydu sygnałowego. Przykładowo, sekwencje DNA kodujące kodon inicjacji i peptyd sygnałowy znanego genu można byłoby przyłączyć do sekwencji cDNA proteiny wiążącej OPG poczynając w dowolnym miejscu po obszarze kodującym resztę aminokwasową 68. Przewiduje się, ze uzyskane klony rekombinacyjne wytwarzają wydzielane formy proteiny wiążącej OPG w komórkach ssaków i powinny podlegać post-translacyjnym modyfikacjom, które normalnie występują w C-końcowej domenie pozakomórkowej proteiny wiążącej OPG takim, jak glikozylacja. Stosując tę strategię skonstruowano wydzielaną (rozpuszczalną) formę proteiny wiążącej OPG, która przy swoim 5'-końcu ma peptyd sygnałowy mysiego OPG, a przy swoim 3'-końcu domenę ludzkiej IgGl-Fc. Wektor plazmidu pCEP4/muOPG[22-401]-Fc opisany w zgłoszeniu nr US 08/577,788 dokonanym 22 grudnia 1995 r., wytrawiono stosując Notl w celu rozszczepienia między końcem 3' OPG i genem Fc. Następnie zlinearyzowany DNA częściowo wytrawiono przy użyciu Xmnl dokonując cięcia tylko między resztami 23 i 24 OPG, pozostawiając „tępy” koniec. Następnie produkty wytrawiania defosforylowano przy użyciu CIP i część wektorową produktu wytrawienia (zawierającego reszty 1-23 OPG i Fc) oczyszczono na żelu.

Obszar cDNA mysiej proteiny wiążącej OPG kodujący reszty aminokwasowe 69-316 Zamplifikowano metodą PĆR stosując Pfu Polymerase (Stratagene, San Diego, CA) z szablonu plazmidu stosując jako primery następujące oligonukleotydy:

1602-61:

CCT CTA GGC CTG TAC TTT CGA GCG CAG ATG (SEQ ID NO: 27)

1602-59:

CCT CTG CGG CCG CGT CTA TGT CCT GAA CTT TG (SEQ ID NO: 28)

Oligonukleotyd 1602-61 amplifikuje koniec 5' genu i zawiera sztuczne miejsce Stul. Primer 1602-59 amplifikuje koniec 3' genu i zawiera sztuczne miejsce Notl. Uzyskany produkt PCR wytrawiono przy użyciu Notl i Stul, po czym oczyszczono na żelu. Oczyszczony produkt PCR poddano ligacji przy użyciu wektora, po czym użyto do transformowania elektrokompetentnych komórek E. coli DH10B. Uzyskany klon sekwencjonowano by potwierdzić integralność amplifikowanej sekwencji i miejsc restrykcyjnych. Plazmid ten użyto następnie do transfekowania ludzkich fibroblastów 293 i proteinę fhzyjną: proteina wiążąca OPG - Fc zebrano z pożywek hodowli, jak uprzednio opisano w zgłoszeniu nr US 08/577,788 dokonanym 22 grudnia 1995 r.

Stosując podobną strategię zaprojektowano wektor ekspresji, który jest zdolny do ekspresjonowania N-końcowego obcięcia przyłączonego do domeny ludzkiej IgGl Fc. Konstrukt ten składa się z peptydu sygnałowego mysiej OPG (reszty aminokwasowe 1-21), poddanego fuzji w ramce do reszt 158-316 mysiej proteiny wiążącej OPG, po czym następuje fuzja w ramce do domeny Fc ludzkiej IgGl. W celu wykonania powyzszego, plazmidowy wektor pCEP4/mysia OPG[22-401] (zgłoszenie nr US 08/577,788 dokonane 22 grudnia 1995 r.) wytrawiono przy użyciu Hindll i Notl usuwając całą ramkę odczytu OPG. Reszty 158-316 mysiej proteiny wiążącej OPG amplifikowano metodą PCR od szablonu plazmidu pCDNA/32D-F3 stosując następujące primery:

190 092

1616-44:

CCT CTC TCG A6T 66A CAA CCC AGA A6C CT6 A66 CCC A6C CAT TTG C (SEQ ID NO: 29)

1602-59:

CCT CTG CGG CCG CGT CTA TGT CCT GAA CTT TG (SEQ ID NO: 30)

1616-44 amplifikuje proteinę wiążącą OPG poczynając od reszty 158 jak również zawierający reszty 16-21 peptyd sygnałowy muOPG ze sztucznym miejscem Xhol. 1602-59 amplifikuje koniec 3' genu i dodaje miejsce Notl w ramce. Produkt PCR wytrawiono Notl i Xhol po czym oczyszczono na żelu.

Następujące komplementarne primery połączono wzajemnie ze sobą przez annealing z wytworzeniem adaptera kodującego peptyd sygnałowy mysiego OPG i sekwencję Kozaka w otoczeniu miejsca zapoczątkowania translacji:

1616-41:

AGC TTC CAC CAT GAA CAA GTG GCT GTG CTG CGC ACT CCT GGT GCT CCT GGA CAT CA (SEQIDNO:31)

1616-42:

TCG ATG ATG TCC AGG AGC ACC AGG AGT GCG CAG CAC AGC CAC TTG TTC ATG GTG GA (SEQ ID NO: 32)

Primery te poddawano annealingowi generując nawisy 5' kompatybilne z Hindll na końcu 5' i Xhol na końcu 3'. Wytrawiony wektor otrzymany powyżej, oligomery połączone przez annealing oraz wytrawiony fragment PCR poddano razem ligacji i elektroporowano do komórek DH10B. Uzyskany klon sekwencjonowano aby potwierdzić autentyczną rekonstrukcję połączenia między peptydem sygnałowym, fragmentem proteiny wiążącej OPG kodującym reszty 158-316 i domeną Fc IgGl. Rekombinacyjny plazmid oczyszczono, transfekowano do ludzkich fibroblastów 293 i poddano ekspresji jako produkt w kondycjonowanych pożywkach, jak opisano wyżej.

Mysi i ludzki cDNA o pełnej długości klonowano do wektora ekspresji pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA), po czym transfekowano do hodowli ludzkich fibroblastów 293 jak opisano w przykładzie 1. Hodowle komórkowe selekcjonowano przy użyciu higromycyny jak opisano wyżej i sporządzono kondycjonowane pożywki bez dodatku surowicy. Kondycjonowane pożywki wprowadzono na kolumnę z unieruchomioną rekombinacyjną OPG, a osłonięte formy mysiej i ludzkiej rekombinacyjnej proteiny wiążącej OPG oczyszczono metodą chromatografii opartej na powinowactwie. Analiza sekwencyjna N-końca oczyszczonych rozpuszczalnych protein wiążących OPG wskazuje, że mysia proteina jest preferencyjnie cięta przed fenyloalaniną 139, a ludzka proteina jest preferencyjnie cięta przed resztą homologiczną - izoleucyną 140. Ponadto, proteina ludzka jest również prefe-rencyjnie cięta przed glicyną 145. Sugeruje to, ze naturalnie występujące formy rozpuszczalne ludzkiej proteiny wiążącej OPG mają końcowe reszty aminowe albo przy izolrucynir w pozycji 140 albo przy glicynie w pozycji 145.

Przykład 11. Peptydy proteiny wiążącej OPG i wytwarzanie poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał tej proteiny

Przeciwciała aktywne wobec specyficznych obszarów proteiny wiążącej OPG mogą być wytwarzane przez immunizację peptydami z proteiny wiążącej OPG. Peptydy te mogą być stosowane do immunizacji samodzielnie lub w postaci skoniugowanych form peptydu.

Opisano juz krystaliczną strukturę dojrzałego TNFa (E.Y. Jones, D.I. Stuart i N.P.C. Walker (1990) J. Celi Sci. Suppl. 13, 11-18), a monomer tworzy sandwich z β-zgiętym arkuszem antyrównoległym o topologii „rożka z konfiturą”. W tej strukturze krystalicznej zaobserwowano dziesięć anSyrśwnolrgłycC nici-P i nici te tworzą P-sandwicz z jednym arkuszem P składającym się z nici B'BIDG i z drugim - z nici CCHEF (E.Y. Jones i wsp., jak wyżej). Na podstawie badań mutagenezy wywnioskowano, ze dwie pętle dojrzałego TNFa wchodzą w kontakt z receptorem, i są to pętle utworzone między P-niciąB&B' i między mciami E&F (C.R. Goh, C-S. Loh i A.G. Porter (1991) Protein Engineering 4, 785-791).

190 092

Rozwiązano krystaliczną strukturę kompleksu wytworzonego pomiędzy TNFp i pozakomórkową domeną receptora TNF o 55 kd (TNF-R55) i opisano kontakty receptora z ligandem (D.W. Banner, A. D'Arcy, W. Janes, R. Gentz, H-J. Schoenfeld, C. Broger, H. Loetscher i W. Lesslauer (1993) Celi 73, 431-445). W zgodzie z badaniami mutagenezy opisanymi powyżej (C.R. Goh i wsp., jak wyżej) stwierdzono, że odpowiednie pętle BB' i Ef ligandu TNFp stanowią większość kontaktów z receptorem w rozwiązanej strukturze krystalicznej kompleksu TNFb:TNF-R55. Sekwencję aminokwasową mysiej proteiny wiążącej OPG porównano z sekwencją aminokwasową TNFa i TNFp. W oparciu o to porównanie przewidziano obszary mysiej proteiny wiążącej OPG odpowiadające pętlom BB' i Ef i opisano je poniżej.

A. Antygen(y): Rekombinacyjną mysią proteinę wiążącą OPG [158-316] użyto jak antygen (ag) do immunizacji zwierząt, w sposób opisany poniżej, a następnie surowicę poddawano badaniom wykorzystując niżej opisane podejścia. Zsyntezowano peptydy przypuszczalnych pętli BB' i EF mysiej proteiny wiążącej OPG, z przeznaczeniem do użycia do immunizacji. Tymi peptydami są:

Peptyd stanowiący pętlę BB' NH₂- -NAASICSGSHKYTLYSCCYHDRGWAKISiCOOH (SEQ ED NO: 33)

Peptyd stanowiący pętlę BB'-Cys: NH₂- )NAAS(I’SGSHKYTLSSWYHDRG W AKISC-COOH (SEQ ID NO: 34)

Peptyd stanowiący pętlę EF: NH₂- -YYWKTSIKNHS HYYW- -COOH (SEQ ID NO: 35)

Peptyd stanowiący pętlę EF-Cys: NH₂- -YYWKTSIND-S SYYYMTc iSOCC (SEQIDNO:36)

Peptydy z resztą cysteinową na karboksy-końcu użyto do sprzęgania zgodnie z podejściami opisanymi poniżej w części B, a także wykorzystano do immunizacji.

B. Sprzęganie z KHL (Keyhole Limpet Hemocyanin) lub z BSA (albumina surowicy bydlęcej)· Wyselekcjonowane peptydy lub fragmenty proteiny mogą być sprzęgane z KLH w celu zwiększenia ich immunogeniczności u zwierząt. Także peptydy lub fragmenty protein sprzężone z BSA mogą być wykorzystane w protokole EIA. KLH bądź BSA aktywowaną preparatem Imject Maleimide (Pierce Chemical Company, Rockford, iL) poddaje się rekonstytucji w dH-0 do końcowego stężenia 10 mg/ml. Peptyd lub fragmenty proteiny rozpuszcza się w buforze fosforanowym, a następnie miesza się z równoważną ilością (g/g) KLH lub BCa. Reakcja sprzęgania zachodzi przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Następnie roztwór przepuszcza się przez kolumnę do odsalania lub poddaje dializie wobec PBS przez noc. Sprzężony peptyd przechowuje się w temperaturze 20°C az do momentu wykorzystania do immunizacji lub w próbach EIA.

C. Immunizacja: Myszom typu Balb/c (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA), szczurom typu Lou lub nowozelandzkim białym królikom podano drogą podskórnej iniekcji (CQI) antygen (ag) (odpowiednio 50 (ig, 150 pg i 100 pg) zemulgowany w kompletnym adjuwancie Freunda (CFa, 50% objęt./objęt; Difco Laboratories, Detroit, MI). Następnie króliki dodatkowo pobudzono podając dwa lub trzy razy w przedziałach 2-tygodniowych antygen przygotowany w podobny sposób przy użyciu niekompletnego adjuwanta FreuncTa (IFCA; Difco Laboratories, Detroit, MI). Myszom i szczurom podawano dodatkowe dawki antygenu co około cztery tygodnie. W siedem dni po drugim podaniu antygenu pobierano krew przez skrwawianie i oznaczano poziomy przeciwciała w surowicy. Gdy stwierdzono pojawienie się miana przeciwciała u królików, pobierano im do produkcji po 50 ml krwi co tydzień przez 6 kolejnych tygodni. Myszy i szczury wyselekcjonowano w oparciu o poziomy surowicy w próbkach do wytwarzania hybrydomy; użyto zwierząt z pół-maksymalymi mianami wyzszymi niż 5000. Zmiany dostosowawcze do tego protokołu mogą być wprowadzone przez biegłych w sztuce; przy kładowo, różne rodzaje immunomodulatorów są teraz dostępne i mogą być włączone do tego protokołu.

190 092

D. Próba z użyciem immunosorbenta związanego z enzymem (EIA'): Próby EIA będą prowadzone w celu określenia miana przeciwciała (ab) w surowicy u poszczególnych zwierząt, a następnie w celu skriningu pod kątem potencjalnych hybrydom. Płytki silnie wiążące o płaskim dnie do mikroanalizy EIA/RIA o 96 zagłębieniach (Costar Corporation, Cambridge, MA) zostaną powleczone oczyszczoną rekombinacyjną proteiną lub fragmentem proteiny (antygen, ag) w stężeniu 5 ng/ml w buforze węglani/kwaśny węglan o pH=9,2 (0,015 M Na2CO₃, 0,035 < Na-HCO₃). Jeżeli to konieczne, fragmenty proteiny można sprzęgać z albuminą surowicy bydlęcej (BSA). 50 gl antygenu (ag) doda się do każdego zagłębienia. Następnie płytki będą pokryte błonką octanu (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) i poddane inkubowaniu w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze 4°C. Płytki zostaną zablokowane przez 30 minut w temperaturze pokojowej przez 250 ul 5% roztworu BSA na zagłębienie, wytworzonego w wyniku zmieszania 1 części koncentratu rozpuszczalnik/roztwór blokujący BSA (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaishcrsbhrg, MD) zjedna częścią dejonizowanej wody (dEpO). Po usunięciu roztworu blokującego, do każdego zagłębienia zostanie dodane 50 jii rozcieńczonej surowicy w dwóch rozcień-czeniach (1:100 do 1:12.800) lub supernatanty hodowli komórkowej hybrydomy. Rozcieńczalnikiem surowicy jest 1% BSA (10% rozcieńczalnik BSA/koncentrat roztworu blokującego rozcieńczono 1:10 w buforowanej fosforanem solance (Dul-boco, D-PBS; Gibco BRL, Grand Island, NY), podczas gdy supcrnaSanSy hybrydomy badane są w postaci nierozcieńczonej. W przypadku badania hybrydomy jedno zagłębienie utrzymuje się jako koniugat kontrolny, a drugie zagłębienie jako pozytywną kontrolę ab. Płytki ponownie inkubuje się w temperaturze pokojowej, wytrząsa przez 1 godzinę, następnie przemywa się 4-krotnie stosując· lx preparat roztworu do przemywania, 20x koncentrat (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) w dH₂O. Wtórne przeciwciało sprzężone z peroksydazą z chrzanu (Boeringer Mannheim Biochemiicnl. Indianapolis, IN) rozcieńcza się 1% BSA, a następnie inkubuje w każdym zagłębieniu przez 30 minut. Płytki przemywa się jak poprzednio, blotuje do sucha i dodaje się jednoskładnikowy substrat peroksydazy ABTS (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Absorbancję odczytuje się przy 405 nm dla każdego zagłębienia przy użyciu czytnika Microplate EL310 (Biotek Instruments, Inc., Winooski, VT). Pół-maksymalne miano przeciwciała w surowicy oblicza się wykreślając logio rozcieńczenia surowicy względem gęstości optycznej przy 405, a następnie ekstrapolując wartość w punkcie odpowiadającym 50% maksymalnej gęstości optycznej uzyskanej w przypadku tej surowicy. Hybrydomy wybrano jako pozytywne, jeżeli wskazania gęstości optycznej są 5-kroSnie większe niz tło. Do tego protokołu można wprowadzać zmiany i uzupełnienia; przykładowo, sprzęzone wtórne przeciwciało może być wybrane ze względu na specyficzność lub reaktywność niewzajemną.

E. Fuzja komórkowa: Zwierzę wybrane do wytwarzania hybrydomy otrzymało drogą dożylnej iniekcji od 50 do 100 |ig antygenu w PBS. Cztery dni później zwierzę uśmiercono przy użyciu dwutlenku węgla i pobrano w sterylnych warunkach śledzionę przenosząc ją do 35 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dulbocos, z dodatkiem penicyliny G w ilości 200 jednostek/ml, 200 pg /ml siarczanu streptomycyny i 4 mM glutaminy (2x P/S/G DMEM). Śledzionę pozbawiono nadmiaru tkanki tłuszczowej, a następnie płukano przez 4 płytki czystej pożywki 2x P/S/G DMEM. Następnie przeniesiono do sterylnej torebki stomacher (Tekmar, Oincinnasi, OH) zawierającej 10 ml 2x P/S/G DMEM i rozdrobniono do postaci zawiesiny pojedynczych komórek przy użyciu Stomacher Lab Blender 80 (Seward Laboratory UAC House; London, England). Po uwolnieniu komórek z powłoki śledziony do pożywki, usunięto je z torebki i przeniesiono do sterylnej stożkowej probówki do wirowania (Becton Πickinson and Company, Lincoln Park, NJ). Do torebki dodano świeżą pożywkę i proces kontynuowano do czasu kiedy cała ilość komórek śledziony została uwolniona. Te splenocyty przemyto trzykrotnie przez odwirowanie przy 225 x g przez 10 minut.

Równocześnie, hodowle fazy log komórek szpiczaka, Sp2/0-Agl4 lub Y3-Agl.2.3, odpowiednio dla mysich lub szczurzych fuzji splenocytów (American Type Culture Collection; Rockville, MD), wzrastane w pełnej pożywce (DMDM, 10% maktywowanej cielęcej surowicy płodowej, 2 mM glutaminy, 0,1 mM nierozcieńczonych aminokwasów, 1 mM pyruwianu sodu i 10 mM buforu Hepes; Gibco Laboratories, Grand Island, NY) przemyto w podobny

190 092 sposób. Splenocyty połączono z komórkami szpiczaka i ponownie raz zbrylono. Pożywkę odessano od grudki komórek i do komórek delikatnie domieszano w ciągu 1 minuty 2 ml glikolu polietylenowego 1500 (PEG 1500; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN). Następnie dodano powoli taką samą objętość 2x P/S/G DMEM. Prowadzono fuzję komórek pozostawiając je w temperaturze 37°C na 2 minuty, a następnie dodano jeszcze porcję 6 ml 2x P/S/G DMEM. Komórki ponownie umieszczono w temperaturze 37°C na 3 minuty. Na koniec, do zawiesiny komórkowej dodano 35 ml 2x P/S/G DMEM i komórki poddano zbryleniu przez odwirowanie. Pożywkę odessano od bryłki i komórki delikatnie przeprowadzono w stan zawiesiny w pełnej pożywce. Komórki rozmieszczono w płaskodennych płytkach do hodowli komórkowej o 96 zagłębieniach (Becton Dickinson Labwere; Lincoln Park, NJ) umieszczając w każdym pojedyncze krople z 5 ml pipety. Płytki inkubowano przez noc w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37°C z dodatkiem 5% CO2. Następnego dnia, do każdego zagłębienia dodano równą objętość pożywki do selekcji. Pożywka do selekcji obejmuje: 0,1 mM hypoksantyny, 4x10'⁴ mM aminopteryny i 1,6x10“mM tymidyny w kompletnej pożywce. Płytki do fuzji inkubowano przez 7 dni, a następnie 2-krotnie zmieniano pożywkę w ciągu następnych 3 dni. Pożywkę do selekcji HAT stosuje się po każdej zmianie płynu. Supernatant hodowli komórkowej zebrano 3 do 4 dni po ostatniej zmianie płynu z każdego zagłębienia zawierającego hybrydę i badano metodą EIA na reaktywność względem specyficznych przeciwciał. Protokół ten został zmodyfikowany jak zaproponowali Hudson i Hay, „Practical Immunology, Second Editio”, Blackwell Scientific Publication.

Przykład 12. Klonowanie receptora proteiny wiążącej OPG ekspresjonowanego na komórkach prekursora hematopoetycznego

Biologicznie aktywną rekombinacyjną mysią proteinę wiążącą OPG [158-316] sprzęzono z fluoresceino-izotiocyjanianem (FITC) otrzymując sondę fluorescencyjną. Fluorescencyjne znakowanie przeprowadzono na drodze inkubacji re-kombinacyjnej mysiej proteiny wiążącej OPG [158-316] z estrem sukcynyloimidylowym kwasu 6-fluoresceino-5-(i 6)-karboksyamidoheksanowego (Molecular Probes, Eugene, OR) w stosunku molowym 1:6 przez 12 godzin w temperaturze 4°C. Znaczoną FITC proteinę wiążącą OPG [158-316] oczyszczono następnie metodą chromatografii filtracyjnej na żelu. Komórki mysiego szpiku kostnego wyodrębniono i inkubowano w hodowli w obecności CSF-1 i proteiny wiążącej OPG [158-316] jak opisano w przykładzie 10. Komórki mysiego szpiku kostnego hodowano przez noc w CSF-1 (30 ng/ml) 1 w proteinie wiążącej OPG (20 ng/ml). Na wstępie nieadherentne komórki usunięto i przechowywano w lodzie a otrzymane adherentne komórki usunięto poprzez inkubację z buforem dysocjacji komórkowej (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), połączono z nieadherentną populacją, a następnie wybarwiono stosując proteiną wiążącą OPG znakowaną FITC jak opisano wyżej. Po przemyciu i ponownym przeprowadzeniu w stan zawiesiny w PBS z 0,5% BSA, komórki wystawiono na działanie proteiny wiążącej OPG znakowanej FITC, przemyto, a następnie sortowano stosując FACS. Populację komórek, które były podatne na wybarwianie z użyciem proteiny wiążącej OPG znakowanej FITC, zebrano i wyizolowano z nich mRNA jak opisano w przykładzie 2. Ten preparat mRNA użyto do wytworzenia biblioteki cDNA w myśl procedury opisanej w przykładzie 2.

Utworzoną z tego źródła bibliotekę cDNA użyto do losowej analizy sekwencyjnej EST, jak uprzednio opisano w publikacji WO 97/23614 oraz przez Simonet i wsp. (Celi 89, 309-319 (1997)). Stosując tę metodę wykryto cDNA o około 2,1 kb, który kodował nową proteinę pokrewną TNFR. Długa otwarta ramka odczytu cDNA mysiego ODAR koduje proteinę o 625 resztach aminokwasowych i zawiera cechy charakterystyczne dla protein związanych z TNFR: hydrofobowy peptyd sygnałowy przy jego N-końcach, powtarzające się sekwencje czterech tandemów bogatych w cysteinę, hydrofobowy obszar transbłonowy oraz cytoplazmatyczny obszar sygnałowy. Homologia tej proteiny z innymi członami rodziny receptora TNF i jej ekspresja w komórkach szpiku kostnego, która wiąże proteinę wiążącą OPG znaczoną FITC wskazuje, ze jest to potencjalny receptor proteiny wiążącej OPG pokrewnej z TNF. Proteinę tę nazwano ODAR, to znaczy receptor różnicowania i aktywacji osteoklastów. Sekwencję kwasu nukleinowego i przewidywaną sekwencję aminokwasową mysiego ODAR pokazano na rysunku fig 10.

190 092

Ostatnia analiza sekwencji w ogólnie dostępnych bazach danych wskazują, że proteina ta jest mysim homologiem ludzkiej proteiny pokrewnej z TNFR znanej jako RANK (Anderson i wsp., Naturę 390, 175-179 (1997)).

Przykład 13. Wytwarzanie rekombinacyjnej proteiny OD AR w komórkach ssaków

Rozpuszczalną pozakomórkową domenę OdAR połączoną fuzyjnie z obszarem Fc ludzkiej IgG wytworzono przy użyciu procedur konstruowania i ekspresji protein fuzyjnych Fc, jak uprzednio opisano w publikacji WO 97/23614 oraz przez Simonet i wsp., jak wyżej. Aby wytworzyć rozpuszczalną proteinę OD AR w komórkach ssaczych, cDNA kodujący pozakomórkową domenę mysiego ODAR (aminokwasy 27-211) amplifikowano metodą PCR przy użyciu następującego zestawu primerów oligonukleotydowych:

5' TCT CCA AGC TTG TGA CTC TCC AGG TCA CTC C-3' (SEQ ID NO: 37)

5' TCT CCG CGG CCG CGT AAG CCT GGG CCI' CAT TGG GTG-3' (SEQ ID NO:38)

Reakcje PCR prowadzono w objętości 50 μl z jedną jednostką handlowej polimerazy DNA (New England Biolabs) w 20 mM Tris-HCl o pH=8,8, 10 mM KC1, 10 mM (NH4)2SOą, 0,1% Triton-X100, 10 pm każdego dNTP, 1 pm każdego primeru i 10 ng wzorca cDNA receptora ODAR . Reakcje prowadzono w temperaturze 94°C w ciągu 30 sekund, w 55°C w ciągu 30 sekund i w 72°C w ciągu 1 minuty, ogółem przez 16 cykli. Fragment PCR wyodrębniono metodą elektroforezy. Fragment PCR tworzy miejsce restrykcyjne Hindlll przy końcu 5' i miejsce restrykcyjne Notl przy końcu 3'. Następnie fragment PCR wytrawiony w miejscach Hind III-Not I subklonowano w ramce do zmodyfikowanego wektora pCEP4-Fc ludzkiej IgG-yl przed sekwencją ciężkiego łańcucha ludzkiej IgG-yl jak opisano uprzednio w publikacji WO 97/23614 oraz przez Simonet i wsp., jak wyżej. Wprowadzono linker, który koduje dwa nieistotne aminokwasy stanowiące połączenie między pozakomórkową domeną ODAR i obszarem IgG Fc.

Następnie konstrukt trawiono stosując Nhel i Hind II, a następnie wstawiono w ramce następującą parę oligonukleotydów połączonych przez annealing, kodujących peptyd sygnałowy OPG (aminokwasy 1-21):

5' CTC GCA CCA TGA ACA CGT GGC TGT GCT GCG CAC TCC TGG TGC TCC TGG ACC TCA TTG AAT GGC CAA CTT TGT-3' -DNO: 39)

5'AGC TTC TGG CT'T GTC CAT TCA ATG ATG TCC TGG AGC ACC AGG AGT GCG CAG CAC CGA CAC TTG TTC ATG GTG^' (SEQ -ID NO: 40)

Linker, który koduje dwa nieistotne aminokwasy wprowadzono między peptyd sygnałowy OPG i sekwencje ODAR. Końcowy utworzony konstrukt (ODAR-Fc/pCEP4) koduje proteinę fuzyjną zawierającą od amino-końca do karboksy-końca: peptyd sygnałowy OPG (aminokwasy 1-21)-linker (LysLeu)-ODAR (aminokwasy 27-211 )-linker (AlaAla)-ludzką domenę Fc immunoglobuliny (IgG Fc).

Konstrukt ten transfekowano do komórek 293-EBNA-1 metodą z użyciem fosforanu wapnia, jak opisano w Ausubel i wsp., Curr. Prot. Mol. Biol. 1, 9.1.1-9.1.3, (1994). Następnie transfekowane komórki selekcjonowano w 200 pg/ml higromycyny (GibcoBRL) i uzyskaną masową hodowlę odporną na ten lek zebrano i poddano wzrostowi do zlania. Komórki przemyto jeden raz w PBS po czym poddano hodowli w pożywce bez dodatku surowicy przez 72 godziny. Kondycjonowane pożywki zebrano. Proteinę fuzyjną ODAR-Fc w pożywkach wykryto przy użyciu metody analizy westem-blot z przeciwciałem przeciw ludzkiej IgG Fc.

Proteinę fuzyjną Fc oczyszczono metodą chromatograficzną na kolumnie wypełnionej proteiną-C (Pierce) stosując procedury zalecane przez producenta. 50 pikomoli oczyszczonej proteiny poddano następnie analizie sekwencyjnej N-końca metodą automatycznej degradacji Edmana, zasadniczo opisanej przez Matsudaira i wsp. (J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). Po 10 cyklach odczytano następującą sekwencję aminokwasową:

NH₂2KLVTL Q V T P - CO2H.

Aktywność wiązania ODAR-Fc z proteiną wiążącą OPG zbadano metodą immunofluorescencyjnego wybarwiania hodowli komórkowych transfekowanych COS-7, opisaną w przykładzie 2. Komórki COS-7 lipofekowano stosując 1 pg wektora ekspresji zawierającego DNA kodujący mysią proteinę wiążącą OPG. Po 48 godzinach inkubacji komórki ponownie inkubowano w roztworze PBS-FBS zawierającym 10 mg/pl ludzkiego IgG Fc, ODAR-Fc lub proteiny

190 092

OPG-Fc, w temperaturze 4°C przez 1 godzinę. Następnie komórki przemyto dwukrotnie PBS po czym inkubowano przez następną godzinę w roztworze PBS-FBS zawierającym 20 ng/ml koziego przeciwciała przeciw ludzkiej IgG, znaczonego FITC (Southern Biotech Associates). Po przemyciu PBS komórki badano metodą mikroskopii współogniskowej (ACAS, Ultima, Insight Biomedical Imaging, Inc., Okemos, MI). Zarówno ODAR-Fc jak i OpG-Fc wiążą się z komórkami COS-7 teansfekowcnymi OpGl (fig. 11).

Przykład 14. Aktywność biologiczna in vitro rekombinacyjnego rozpuszczalnego ludzkiego receptora ODAR

Zdolność OD AR do inhibitowanic stymulacji tworzenia osteoklastów przez proteinę wiążącą OPG oceniono w hodowli mysiego szpiku kostnego w obecności CSF-1 (30 ng/ml) i proteiny wiążącej OPG (5 ng/ml). Sposoby postępowania przy stosowaniu hodowli mysiego szpiku kostnego do bcdcnic dojrzewania osteoklastów opisano w publikacji WO 97/23614 i w przykładzie 8. Proteinę fuzyjną ODAR-Fc wytworzoną jak opisano w przykładzie 12 wprowadzono w stężeniu w zakresie od 65 do 1500 ng/ml. Powstawanie osteoklastów oceniono metodą cytochemii przy użyciu fosfatazy alkalicznej odpornej na winian (TRAP) i próbą na roztwór TRAP po pięciu dniach prowadzenia hodowli.

Obserwowano zależne od dawki inhibitowcnie powstawania osteoklastów zarówno w metodzie cgtochemicznej, jak i w próbie aktywności TRAP (fig. 12). Proteina fuzyjną ODAR-Fc inhibitowcłc tworzenie osteoklastów przy ED50 około 10-50 ng/ml.

Przykład 15. Aktywność biologiczna in vivo eekombinccyjnego rozpuszczalnego ODAR

Młode, szybko rosnące samce myszy typu BDF1 w wieku 3-4 tygodni otrzymywały różne dawki proteiny fuzyjnej ODAR-Fc w postaci jednej podskórnej iniekcji w nośniku (PBS/0,1% BSA) dziennie, na przestrzeni czterech dni. W piątym dniu myszy były prześwietlane promieniami X. Stosowano dawki proteiny fuzyjnej ODAR-Fc równe 0,5, 1,5 i 5 mg/kg/dzień. W każdym przypadku myszy w tej grupie oraz w grupie kontrolnej, które otrzymywały PBS/0,1% BSA, były prześwietlane na pojedynczej kliszy. Obszar dosiebnej pezyncscdy kości piszczelowej porównano w parach analizując kości piszczelowe zwierząt otrzymujących ODAR-FC i zwierząt kontrolnych, a wynik porównania zapisano jako „+”, jeżeli badana kość piszczelowa była bardziej gęsta na podstawie oceny wizualnej niz kość kontrolna, uzyskując 8 wyników przedstawionych poniżej. Przyjęto arbitralnie, ze dla oceny „pozytywnej” wymagany jest wynik 5/8. (Dawka podawana w mg/kg/dzień; n=4).

Po uśmierceniu, każdej myszy usunięto prawą piszczel i zmierzono gęstość kości w dosiebnej pezyncscdzie kości piszczelowej metodą obwodowej ilościowej tomografii komputerowej (pQCT) (Stratec, Germany). Dwa przekroje w odległości 0,5 mm, 15 mm i 2,0 mm od blizszego końca piszczeli poddano analizie (XMICE 5.2, Stratec, Germany) w celu określenia całkowitej mineralnej gęstości kości przgnascdy. Zastosowano próg 1500 oddzielenia tkanki miękkiej w celu określenia granicy kości przyncscdowej.

Podawanie ODAR-Fc młodym, rosnącym myszom inhibitowało resorpcję kości w dosiebnej płytce wzrostowej piszczeli tworząc obszar zwiększonej gęstości kości, który był wyraźnie widoczny na radiogramach. Zmiany radiograficzne były widoczne przy dawce 1,5 mg/kg/dzień i wyzszej w dwóch eksperymentach (tabela 1). Pomiar gęstości kości przez pQCT w próbkach z drugiego eksperymentu w podobnym obszarze piszczeli potwierdził zalezny od dawki wzrost gęstości kości u tych myszy (figura 13).

190 092

Tabzla 1

Inhlbltawanlo rzcarpzSi kaśzl crzoz crztomę fuzyjnćODAR-Fz Ekcporymznt nr 1

Czynnik	Dawka	1	2	3	4	5	6	7	8	Wynik
ODAR-Fc	5,0	+	+	+	+	+	+	+	+	Pazfaywnf 8/8
ODAR-Fc	1,5	-	+	+	-	+	+	+	+	Pazfaywnf 6/8
ODAR-Fc	0,5	-	-	-	-	-	-	-	-	Nod(tfwnf 0/8
ODAR-Fc	0,15	-	-	-	-	-	-	-	-	Nod(tfwnf 0/8

Ekccorymont nr 2

Czynnik	Dawka	1	2	3	4	5	6	7	8	Wynik
ODAR-Fc	5,0	+	+	+	+	+	+	+	+	Pazfaywnf 8/8
ODAR-Fc	1,5	+	+	+	+	+	+	+	+	Pazytfwnf 8/8
ODAR-Fc	0,5	-	-	-	+	-	-	-	-	Nod(tfwnf 1/8

Chzć wynylazzk nmizjsay zcCsanz w zdmzsizniu dz kzrzystnych przykładów realizacji, Szci ztazumlałz dla bizgłych w sztucz, zz mzZliwz są jzgz zdmiyny i mzdyfikacjz. Załączznz a(sirzezeni( zbzjmuj ą wsaystkiz zdmiany wynalazku równzwaZnz zpisanym wyZzj crafkłydzm jegz realizacji.

190 092

O eo

o	en	ro	r—1
OJ	Γ'·	ro	Γ'	r-)
r-M	T—\|	ro	ro	ro

GAGCTCGGAT CCACTACTCG ACCCACGCGT CCGGCCAGGA CCTCTGTGAA CCGGTCGGGG


0		θ'
0	0	Cm	0	O		Em	ffl	0	□
	0		0	CM		0	r-M	Em	Φ
0			0	&		0	<3	0	►J
0	Cm en
	0	Φ	0	ih		0	O	0	3
0	<3	0	0	r-M		0	Cm	Em	Φ
			0	0		0	CM	0	U
0	0	«0
0	0	r—1	0	Cm	o		Φ	0	Φ
0		0	φ	ro	0	rM	0	rM
0	0	tP	C	w		0	<	0	<
§	0	Cm	0				Cm en	0	3
0		0	r-M		0	Φ ro	Em	Φ
0			0	0		Em	w	0	eJ
	0	CP
0	0	Cm	0	XJ		Em	O	0	Φ
0	0	«<	Em	Φ		0	M	Em	X
0				a		0	04	Em	CM
0	0	X) r-l
Ej	Φ	0	a		0	<0	0	4J
0		a	<3	rM		0	rM	Em	Φ
E-<			0	0		0	«3		a
0	0
0	0		0			0	O	0	Cm
0	0		<3	r—1		0	Cm	0	Φ
Em	0		0	0		0	CM	Em	W
0	0
0	0		0	Cm	en	0	(0	0	θ'
0	0		0	Φ	rM		Ή	0	Cm
			Em	W		0	X	0	<3
0	0
0	0		0	Cm		0	3 o	0	Cm
0	0		0	Φ		Em	Φ ro	0	Φ
H	0			W		0	J	Em	W
0	0
0	0		0	b»		0	O	0	Φ
Em	0		0	Cm		0	Cm	0	rM
0	Em		0	*43		0	CM	0	<3
Em	0
0	<3		0	3		Em	>Ί	0	to
			Em	Φ		0	rM	0	rM
	<3		0	dJ		0	0	0
0	0
0	0		0			0	3	0	0
0	0		rź				r-l	0	Cm
0	0		Em	Em		0	0	0	CM
0	0
0	0		0	W	O	0	m		0
0	0			>¥	rM	<3	•M	0	Cm
Em	0					0	X	0	CM
0	0		0	>1			O en	0	0
0			0	rM		0	Cm ro	0	Cm
0	0		0	0		0	CM	0	CM
0	0
0			0	Cm		0	iM	0	Φ
0	0		<			Em		0	rM
0	0		Em	Em		0	>	0	<
0	0
0	0		0	0.		0	>1	0	o
0	0			m		0	rM	0	Cm
0	Em		0	<		0	0	0	CM

FIG.1A

190 092 r- u->

SO r-l η

m rH σ>

so r—i ro ro in

U	M
	pi
£-·
0	Z
E-	ω
0	ui
0	ω
E-	X
H	Ol
O	3
	Φ
U	Ul
	Γ0
0	rd
0	<
0	ω
Eh	ι—1
<	I-I
0	U
0	0)
<1	co
0	w
0	>
E-·	0
O	r—1
H	Π3
0	>
0	r—ł
Ε-»	(0
0	>
0	c
<	rd
0	0
0	>
0	rd
0	0
0	3
	ω
0	ui
	>
0	rH
0	0
0	3
Eh	Φ
0	J
0	>
0	i-H
0	0

0

W

0

a

0

-U

0

rH

<

•H

ro

Eh

Φ

Eh

(0

0

tc

0

<

a

0

>

Eh

u

ro

0

C

0

θ'

Eh

Φ

0

X!

co

rd

0

U

Eh

rH

<

Eh

0

<

H

0

Li

0

3

O

0

σ>

0

ro

0

Φ

Eh

Φ

o

0

Li

<

•r|

*i

CO

Eh

Ul

<—1

<

0

sc

0

a

Eh

>1

0

w

tn

<

β

w

0

r-l

0

Pl

rd

ι—1

0

EH

0

<d

0

*5

3

<

β

0

Li

0

3

o

< 0

rM

0

ι—Ι

0

Φ

Eh

Φ

ro

0

Eh

CO

0

Ul

r—1

<

U

0

β

0

a

3

0

Φ

ro

<

w

rH

Ε-»

CO

0

CQ

Φ

o

3

Eh

0

ro

Eh

rH

co

rd

0

M

<c

Pl

enw

W

0

CL

Ul

\ «

<

θ'

Eh

ro

in

3

0

β

CO

0

Li

<

•rl

Ch

Eh

Φ

rd

<

0

SC

0

Ul

0

1 i

0

β

0

3

Ll

o

0

rd

LU»

<5

W

Eh

Φ

0

XI

rd

Eh

rO

0

Ul

Eh

rd

0

>

E->

0

θ'

0

a

0

3

tn

0

Li

0

Li

<

w

0

rd

ro

0

Οι

rtJ

C

0

4

0

<

r—1

Eh

a

0

3

0

>1

ro

Eh

Φ

rd

0

rd

0

<

0

Ul

0

4J

in

0

Φ

Eh

Li

0

β

Eh

Φ

Γ*»

Eh

r-l

0

Φ

rd

<<

a

<

H

CO

0

c

<

θ'

o

0

3

Eh

Φ

<

rH

0

Lł

σ\

rd

Eh

XI

0

<

0

Eh

Ol

0

rO

Eh

Li

0

3

tn

0

r0

0

r-l

<

>t

Eh

Φ

o

0

rd

0

Eh

0

Ul

rd

0

<

tP

Eh

Φ

Eh

Li

β

O

0

U

Eh

X!

0

Ć,

i—4

ro

0

<<

Eh

CL

Eh

0

rH

H

Φ

0

M

0

Li

w

Eh

X!

0

Φ

p,

Eh

Cl.

Eh

0

Eh

CO

Ul

190 092 > ιη

Ο LD

U? ΙΟ

ΓΠ r4 ο ιη γ- γ-

Ο	Ο»	Ο	0	W	Εη	Μ		0	4J
0	Μ	ιη		•Η	0	AS			Φ
εη	Η	Γ—(	0	χ	<	Η		<	s
<	Μ		<	(0 ιη	0	r-4		0	rt
υ	Φ		0	e-4 ιο	Εη	Φ		rtj	wj
Η	CO		0	<C τ-4	0	>			*0
0	ί>1		Ε·<	ω	rtj-	OT	o	E4
Ο	ι-Η		Η	Λ	ri	>1	00	0	Φ
ο	0		Η	CU	*3	XI	r4	E-·	cn
<	3		<	□	Ε4	TO		0	Φ	in
<	ι—1		0	Μ		rd		Eh	r-d	Ch
ο	0		0	Οι	0	CC			H	r-4
0	-Ο		0	β	0	14		0	OT
Ε-·	0)		<	r-4	0	o			Ch
<	S		0	0	Ε*	cn			XI
ο	Ο	ιη	0	<0	Ε4	>t		0	Φ
Η	φ	Μ*	0	γ4	0	i~d		0	i-4
<	S	r-ł	0		0	0		0
Η	«3		0	β Ο	0	Η		0	a
α	r-4			r-4 ΙΟ	0	Φ		0	h
ο	<		0	0 γ4	Η	cn		E-<	Eh
<	Ο		Ε4	Ο		o	in	0	ih
0	Μ		0	Μ	0	14	r-	0	r-4
ο	CU		0	CU	0	Oi	5r4	0	0
Ε4	«3		0	OT	0	φ			b>	O
υ	r4		4	Ch	Ej	r4		0	>4	cn
0	<		<	XI	<<	H		0	(<	r-4
<	>1		0	>1	0	\|4		E4	a
0	ι-4		0	rH	0	Φ			OT
0	0		0	0		cn		0	<
<	Μ	Ο	<	θ'	0	<U		0	OT
0	0)		0	Μ	0	r4		<	->4
Η	ω	r4	0	<	0			0	X
0	φ		0	β ιη	Eh	<0		0	P
Η	.β		<	γη ιη	0	r-4		<	Ch
Η	PU		0	0 r4	0			E-*	Eh
0	Cn		0	<ΰ	Εη	β	o	0	a
0	Μ		0	r-4	r£	OT	r-	0	M
0	fź		0	<	<		t—1	E-i	E4
0	β		0	1-4	0	Φ		E-<	M	m
<	r-4		Η	ιϋ	Ε-»	r-4		0	Φ	co
0	0		0	>	<	1-4		£	cn	r-4
<	Ο		εη	a	0	M		0	Uł
0	>4			w	0	XJ		0	Φ
0	CU		ο	<		£h		H	cn
0	>,	ιη	0	β	0	β		0	β
0	r-4	ΓΏ	Η	<υ	Η	Φ		Eh	Φ
0	0	r-4	η		0	XI		0	XI

Ο

LL

190 092

ACG TTA AGC AAC GGA AAA CTA AGG GTT AAC CAA GAT GGC TTC TAT TAC 799

Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn Gin Asp Gly Phe Tyr Tyr r~ in m 'ί' σ> ·*# °o oo σ\

ΟΊ

	F 0 o u	rH <0 > Pl Φ CO	O m CN	U F < O O <	Φ rH H
Pl Φ W	tn M* CN
				U	M
	o	I—I		0	43
	o	O		rtj	F
	u	Pi		,rf	W
	u	Φ		,rf	>1
	Ei	W
o				F	rH
rH	U	Λ		Eh	<0
CN		F·		0	>
		3	tn	U	r—t
		rH	<N	Eh	ItJ
	o	u	CN	0	>
	£-<	w		F		O
	<	-H		rtj	i>1	Ν'
	0	X		Eh	F	CN
	E-·	w		0	rH
		•H		F	(0
	U	ffi		0	>
	O	&>		0	44
	o	L		Eh	CD
	o				s
tn	F	Φ		0	3
o	F	43		Eh	Φ
CN	F	CM		U
	U	tn	O	0	G
	O	ί>»	CN		rH
	E-i	U	CN	U	0
	Eh	Φ		F	3	tn
	Eh	i—t		F	Φ	o
		H		0		CN
	O	G		F	Pl
		w			>1
				F	F
	U	<0		0	a
	o	i—1			w
	o			0	«<
O	o	Pi		<	Pi
O		i>t		0	43
CN	Eh	Eh			F
	O	3	in	F	0
	Eh	Φ	τ—\|	0	Pi
	U	J	CN	0	CM

0	C
	tn		0	rH
	<		0	0
rf	to		0
it£	r”		0	rH
			0	0
0	Pi	O	F	rH
0	43	to	F	Π3
	F	CN	0	>
0	Pi		F	G	tn
0	0)			W	r*
	W				CN
0	>			Φ
0	rH		F	I—l
0	0			H
<	>		0	Pi
0	rH		0	Φ
0	0		F	W
	(0		F	Pi
rt	>			•>1
*			F	F		Q
0	-U	tn	F	Φ
F	Φ	tn	F	43		T™
	S	CN	F	CM		w
0	3		0	cn	o	o
F	CD			•H	o
0			0	X	CN	LL
0	G		0	Φ
	CO	F	43
			F	CM
F	cn		3
»<	•r-			r-l
0	a:		0	0
F	Pi		F	Pi
0	ω	0	Φ
F	w	F	W
F	Pi	o	F	G
0	Φ	m	*<	CO
	M	CN		<
	0		Ό	>,	in
0	Pi		0	rH	to
0	CM	0	0	CN
U	Φ	0	Pi
F	r—		0	Φ
	HH		F	cn
rtj	co	0	α
HE	>	Ί	0	Pi
*4			F	F

190 092 cn ro o

co o

CO ro co co cn in r-i «—i cm ro r-ł t—I ,—I

o 5	Asn	0 Φ O U Λ h
		di	ro
O	>4		H	(0
u	φ		0	nd		<
H	w		O			O
						0
O	t-d		0	i>1		Eh
	f0		O	r—1
O	>		O	O		U O
O	d		Eh	Φ
<<	rd		Eh	,d		Eh
O	o		Eh	CU		Eh
	0)	O	U	Ul
Eh	r—1	cn	C			U
	ł-ł	(N	Eh	Eh		%
U	d		O	Ul	LT)	0
O	Φ		υ	Λ	o	0
<	CO			Eh	ro	Eh
						0
	Φ		o	Φ		O
E-	«—1		o	r-d		Eh
<	t-l		o	<		Eh
	d		Eh	a		Eh
	i—1		<	w
O	O		O	<		0

	0	<
Eh	0
0		Eh
<	0	Eh
0	<	Eh
	Eh	0
	0	0
Eh	Eh	0
0	0
Eh	0
0	0	0
Eh	<	<
<	0	0
0	Eh	<
<	Eh	Eh
Eh	0
<	Eh	<
Η	0	0
0	Eh	Eh
Eh	0	0
0	Eh	0
Eh	0	Eh
	0
0	0	0
Eh	0	Eh
<	<	Eh
0	0	<
0	<	0
Eh	0	<
C	Eh	Eh

						Eh			0	Eh
3	d			d		0		<r	\|rf	0
κί	r-ł			rd		<				Eh
0	0		0	0		0		rt?	*i	·<
						<			0	0
Eh	>1	cn	Eh	CU		0		Eh	Eh	Eh
0	rd	00	C	ω				Eh	<	0
0	0	cm	0			Eh		0	Eh	0
								Eh	0	<
Η	<0		0	O	o	u	CU	Eh	Eh	Eh
0	nd		0	M	o	ri;	w
0	<		0	CU	ro	0	rtj	0	0	<
									0	0
<	tP		Eh	CU			Φ in	ii	U	0
0	Ui			W		Eh	rd rd	»i		Eh
0			0	c			Η m	0	U	0
								0	0
0	d		0	d		0	CU	Eh	U
Eh	Φ		Eh	φ			W	Eh	0
U	dl		0	dl		0		Eh	0	Eh
								0	Eh	0
0	V)		0	d		0	d
i	>7		Eh	φ		i	r—c	Eh	<	Eh
	dl		0	dl		0	0	<	U	<
								0	<	Eh
0	Φ	o	0	Ui		Eh	rd	<	0	<
Eh	X!	oo	0	φ		Eh		Eh		Eh
Eh	CU	CM	Eh	cn		0	>	0	0	0
								0	<	Eh
Eh	Φ		Eh	O	in	(rf	w	Eh		0
Eh	x:		0	Ul	cn		>1	0	Eh	Eh
Eh	Oj		0	CU	CM		dl	Eh	0	Eh

LJJ

Ó

LL

190 092

CAATTTTGTA ATGATTTCCT AGAATTGAAC CAGATTGGGA GAGGTATTCC GATGCTTATG 1376

kO	kO	kO
m	CPi	in
		in
rH	rH	rH

vo	kO	UJ	UJ	UJ
rH	Γ-	m	σ>	m
vo	kO		r·	co
	rH	rH	rH	rH

EH	Eh	Eh
	0	Eh
u	Eh	Eh
	0	Eh
O		Eh
O	Eh	0
Eh		Eh
0	0	Eh
U	Eh	0
0
O
3 Eh O Eh	0	Eh 0
O	0	0
0	0	Eh
O	Eh	0
Eh	Eh	0
O		<
Eh	0	0
U	Eh	0
Eh	0	0
0	Eh	Eh
		0
U	0	0
rfj	0	0
u	0	0
Eh	Eh	Eh
0		Eh
O	0
0	0	0
0
0	0	Eh
3 0	3 Eh	Eh 0 Eh
0	Eh	Eh
Eh	C
	<<
Eh		0
0	0	Eh
0	Eh	Eh
«<	Eh	Eh
0	0	Eh
Eh	0	0
0		Eh
0		Eh
<	0	0
0	<
<	0
Eh	Eh	Eh
Eh	0	Eh
0		0
	0	0
KŁ	0	0
3	0 Eh 0	3 0

E*

U

E*

E3

S

E-i

E* £EEO

Eh

Eh <

Eh

	3 Eh	0 Eh Eh	0 Eh Eh
0	Eh	Eh	0
Eh	Eh	0
Eh		Eh	0
<1	Eh	0	<
0	0	<	0
Eh	Eh	Eh	E*
Eh	<		Eh
Eh	0		0
<	<	0	Eh
Eh	0	<	0
0		0	<
	Eh	0	0
Eh	0	0	<
	Eh	0	Eh
Eh		0
0	rt*	0
0			Eh
Eh	Eh		Eh
0	Eh	Eh	0
Eh	Eh	0
Eh Eh	Eh 0	0	Eh	LL
	Eh	Eh	Eh
Eh		0	Eh
<		0	Eh	e
Eh	Eh	Eh	Eh	0
Eh	Eh	0	0
	Eh		Eh	LU
rt?		Eh	Eh
<5	Eh	0
Eh		0	Eh
0	0		Eh
Eh			Eh
Eh	0	0	0
Eh	Eh	Eh	Eh
Eh	Eh	0	Eh
0	0	0	Eh
rt?	Eh	0	<
rt*	0	0	Eh
rt*		Eh	Eh
0	0	Eh	E*
0	Eh		0
Eh	0
0	Eh	Eh	Eh
Eh	0	0	0
0	Eh	Eh	Eh
Eh		Eh	<
Eh		Eh	0
Eh	rt*	0	<
Eh	rt*		0
0	rt*	0	0
Eh	Eh	0	<
	E*	Eh	0
	Eh	0	Eh
Eh		0	0
0	Eh	Eh	0
Eh		0	Eh

190 092

40	40	40	40	40	40	40	in
t-4	o»	cn	04	in	tH	O	04
04	04	o	O	tH	04	04	04
tH	tH	04	04	04	Ol	04	04

<

U

O

F

O

O <

O

O <

F

O

F

O

O s

o <

F

U

F

U

U ϋ

F <

U

U u

F

O

F

O

190 092

F1G.2A

F1G.2B

190 092

9.5 kb 7 5 kb—

4.4 kb —

2.4 kb 1 4 kb ~

FIG.3

190 092

U	0	o	O		ri	F
u	O			o o	u x		0 o		<	M
u	0	0		o	o		u		<
<	F	u		F	u		u		O
o	F	u		< X	U CU		o o		< d
0	0	o		o	o		o		F
«ί	<	0		*4	u		F
o	0	o		o ω	o <		U F		<	2
u	O	<		u	F		0		F
o	U	o		<	u		0		0
u	o O	o <	o	o ω	o u cu	o	0 o	o	0	CU
u	r—4 £-<	r* 0	m	u	04 O	in	o	rH	F
u	r~» O	r—1 CJ	fM	o	CM u	m	F	τί	<
u	0	O		F w	u CU		U 0		o	o
o	0	<		u	u		0		o
0	<	<		o	u		0		F
u	u	o		o o	u CU		0 U		<	X
u	o	o		F	o		0		0
F	u	o		0	u		F		<
o	u	F		0 d	u cu		U J		u	CM
u	o	O		o	u		U		o
o	u	O		F	u		F		u
u	u			U J	o <		U »J		o	c
<	F	O		U	u		U		<
u	U			<			U		0
u	0	0		F F	U X		0 <		<	d
u	o	o		0	o		0		u
<	<	<i			f·⁴		F		F
u	o	o			U >J		O >		F	(U
u	u	u		u	u		U		F
F	o F	o U	O	u	o U	O	F	O	<
0	04 o	in C	τ—4	< F	r- U CU	m	F tu	04	F	>4
<	0	-4 O	CM	U	CM U	m	O	cn	U
F	C	<		<	u		F		F
U	O	0		F >«	0 0		X		F	tl4
	U	o		0	0		0		U
0	o	o					u		F
U	u	u		0 Q	0 ω		F ω		F	Łu
f	u	0		<	u		u		O
	o	<		0	<		u		F
0	<9	o		< d	u X		u d		U	0
u	o	o		u	u		o		U
u	u	o		0	a		u		U
F	F	<		< U)	u cu		f tn		0	4
U	U	0		u	u		o		O
O	<	o		u	u		u		F
<	< U	o		o <	0 <		u <		0	>
0	o		u	<		o		U
U	u			o	o		u		0
U	F	<		o d	u 0		o <		·<	0
<	O U	o O	O	u	o u	O	u	O	U
F	r* O	m ri	04	o	in U	t—1	o	f	o
O	0	.—1 <	r-4	0 d	CM U cu	Π	u CU	cn	F	0
O	o	U		u	u		u		U
F	u	<		F	O		u		F
F	u	0		< X	O o		O CU		0	>
U	o	ri.		u	u		o		F
0	<5	U		o	a		nj		F
	3.	0		o	o u		U CM		0	>
<c	u		o	u		a		0

FIG.4A

190 092

430 450 470

ATCAGAAGATGGCACTCACTGCATTTATAGAATTTTGAGACTCCATGAAAATGCAGATTT tu

Q •z tu

X dl

X

G

X n

u

X

H o

Q w

Eh

4

U

Eh

W

U

X

H tn

X

0

u

Eh

0

<

O

u

<

X

U

O

<

tn

0 0

< 2

0

Eh

0

o

0

O

U

0

X

U·

tn

X

E- tn

H 0

E-

0

<

0

<

u

Eh

o

E-

u

o

0

o

<

X

o

U X

o

< M

m

cn

Eh

tn

U

«-Η

U

r-

0

m

O

tn

H

V?

U

Γ-

E-

r-

E-

tn

O

>

0

< W

< X

E-

U

0

U

0

Eh

Ε-

<

0

Q

<

M

υ

0

0 Q

0 <

E-

Eh

Ej

U

0

U

«<

U

0

U

X

U

X

u

D

< Eh

H S

<

U

Eh

E-

U

0

M

o

O

Eh

U

0 <

0 0

U

Eh

0

E-

Eh

U

0

E-

u

Ej

Eh

5

<2 2

0 X

<

4

Eh

<cr

<

U

Eh

•CE

o tu

Eh

tn

< ł-ł

0 G

<ζ

0

U

Η

Eh

O

0

o

O

U

O

U

o

<

r-d

< U

r-

<c

X

m

U

u

cn

< Eh

tn

0 X

tn

e-

in

me

co

E-

co

U

0

<

Eh

<

o

Q

O

o

U

D

U dl

E- >·

0

U

Eh

0

Eh

0

u

O

0

>

0 >

U X

Eh S

E-

Eh

0

Eh

H

o

U

Eh

U

0

<

tn

0

<

< X

0 <

Eh 0

o

<

u

E-

0

<

0

u

Eh

0

o

tu

o

0

0 <

Eh tu,

E- 0

u

(rf

Ε-

0

H

m£

υ

Eh

U

dl

u

Ο»

mj;

X

U X

0 dl

E-

EH

O

0

Eh

U

Eh

<

0

«

E-

H

Cu

0

CU

u o»

< 0

o

O

o

Eh

o

0

cr>

0

in

O

r-l

u

r-

u

m

E-

<

E-

tn

0 <

co

u

<

co

0 <

r-

0 >

FIG.4B tj <

Q

O Ο» E-

o u

Eu tu eH α o

190 092

790 810 830 ο u o F

F O F U U

F F

F F F F U 0

O 0 F o o u o s* u u u o F

F u

<

F

U

O

F

O u

o <J

F

F <

o CJ		o < X	o «£	z	o	u	CU	o	< M
en F		tn o	r-ł <		Γ	u		m	F
co <		en £-»	o F		o			r-ł
F	i>«	U U	r—i rtj	ł—ł	r—ł		z	r-ł	0 Q

S

O ω

U

U <

U Ct

Łi

U u

F cn cn

		F		F			U		F
U							F		F
< F		U	X	F	JM		0 >	O
F		F		F			0		n£
U		U		F			<		MŁ
0 <		F	cn	F	Cu		0	ω	mł
		F		F			u		F
F		0		<			F		F
U F			cn	U	X		«<	W	F
U				υ			U		F
i4j		O		F			u		0
O O		u	CU	F	tu			en	0
		u		«$			u		O
o o	o	F		o «sj		O	F		O 0
r- O 0	m		M	en O	ω	tn	m£	H	r-ł 0
co	en	MX		en F		o	ME		»—ł F
U		me		U		r-ł	ME		r-ł F
F tn		ιφ	UJ	F	en		o	w	F

UJ

Cu

	F		u		0	u
	U		F			<
w	m£	F	< Ή	«3 z	0 ω	F
	mł		α	0	<	<
	mE		o	0	o	0
i-3	0	ω	< tn	0 o	o 0		F
	F		u		F
			o	u	u	u
UJ	U	X	< ^p	f cn	f en	o	<
	F			o	o	F
	*<		mE	o	o	*<
O	U	X	< u:	F S	u X	0	Q
			F	F		o
	O		u		F

FIG.4C

U		O F	o U	o	O	o	O	0	F
0		tn F	*-« F	r·		m	<	tn	<
<	cn	co F Cu	en O >	en	3 UJ	o	< UJ	o	0	Q
F		0	U		O	r-ł	F	r-ł	0
F		0	<		U		F		U
F	tu	f α	F F		< F		F Cu		U	Oj
F		F	O		U		F-ł		F
U		F	F		O		Ł·
<	F	MĆ ł-ł	O >		en		H Cu		0	Q
0		0	O		3		<		0

190 092

Ο σ>

ο ιη

ΓΜ υ

Ο

U

Ο <

ίΟ

Ο ο

Ο υ

υ υ

ο ο

Η

Ρ

Ο

Ρ

Ο < ο ο ο ίο ο r-ł < m U ι-H U

Ο υ

Ρ

Ρ ο

r·

Ρ

Ρ ο

Ευ

U

Ρ

Ρ ο

Ρ

Ρ ο

ο ο

ο <

ο ο

ο

Ρ ο ρ r-> υ ”3» ο 1-4 Ο ο Ρ ο Ρ υ ο

ο	υ			ϋ		Ρ
ο	ο		Ρ	Ρ		υ
Ρ	υ		ο	Ρ
Ρ			υ	Ρ		<εΓ
Ρ	ο		ο	Ρ
ο			υ			ο
Ρ			<	«£		<
	Ε·		υ	*ζ		o
ο	υ			Ρ		Ρ	LJ
ο Ο	ο <	ο		Ο [Η	σ
r* Ρ	m ρ	σ»	ο	ιη Η	r-l	Ρ
«—i U	ΓΜ (J	η		η Ρ	θ’	Ρ	ό
r-l U	ρ <	r-ł	ο	r-ł f-ł	r-ł	υ
Ρ	Ο		<	Ο		υ
Ρ	<		Ρ	ο			LL
Ρ	Ο		ο	Ρ		ο
	Ρ		Ρ			Ρ
Ρ	Ο		Ρ			Ρ
ο	Ρ		υ	υ		ο
Ρ	Ο		υ			ο
	Ρ		<	υ		ο
Ρ	ο		ο			υ
Ρ	ο		Ρ	Ρ		<
ο			Ρ	Ρ		Ρ
Ρ	Ρ		υ	ο		Ρ
ο			Ρ	Ρ		<
	Ρ		υ	ο
υ			ο	Ρ		υ
ο	Ρ		Ρ	ο		ο
ο ρ	ο Ο	Ο		Ο ο	Ο	<
ιη ρ	Ρ Ρ	Ρ	υ	η Ρ	σ>	ο
Ρ Ρ	Γ4 «<	Οϊ	υ	η «ζ	m	ο
ρ Ρ	r-ι ο	r—ł	Ρ	ρ υ	r—1	Ρ
Ρ			<	Ρ		Ρ
Ο	(CT		Ρ	υ
	rt.		ο			ο
υ	ο			Ο		<
υ			υ	<		υ
υ			Ρ	Ρ		υ

190 092

1450 1470 1490

TTGGTCCCTGGTCATGTGCCCCTTCGCAGCTGAAGTGGAGAGGGTGTCATCTAGCGCAAT

	$	<	Εη	<			Ο
		Εη	Εη	Ο	<
	ο	Εη		<	Ο		Εη
	υ	Ο	Εη	U	ο
	Εη	*£	ϋ	<	ο
	Ο	χΕ		Εη	ο		Εη
	α	rtj	Εη	Ο			Εη
		Εη	<	Εη	ο		Ο
		υ	Εη		ο		<
	ο	Εη	U	<*			3
σ	ο	Ο <	Ο ο	Ο <	Ο <ζ	Ο	Εη
ιη	Η	r-ł Εη	Γ- Εη	m Η	σι Η	ιη	Εη
ιη	Ο	ko	νο Ο	Γ- Εη	γ- υ	00	Εη
r—ł	Ο	r-l <	«-4 Η	r-ł η	r-ł Ο	r-ł	Εη
	Εη	Εη	Εη	Η			Εη
			Εη	ο	Ο		U
	Ο	Εη	<	Εη	ο		Εη
	Εη		Εη		Εη		Εη
	<	Η		<	Η		α
	υ	Εη	Εη	Εη	U		υ
		Η	Εη	Εη			Εη

Η

Ο

Εη

Η ο

ρ

Η

Ε-η α

ε-η

ΕΕ-* <

Η

Ο	Eh	O £h	O U	O	O	O	U	O	O
ΓΊ	Eh	Ch d£	in	r-l	H	Γ-	u	m	<
ιη	Eh	ιη rf	io <r	Γ-	U	r-	Eh	00	U
r—ł	U	t“1	r-ł <	r-ł	O	r-ł	Eh	r-4	o

Ο

Η

U

Η

Ο

Η ί

Η

o <	O t4	o Eh	O *C	o U	o
r-ł O	r* Eh	m <	σ» <,	in <	r-ł
in Eh	in Eh	vo U	MO <,		00

ο ο

ο

Ευ ρ

Η

Η <

ΕΕΕ-«

Η

ΕU

U

Η

Εη

Ο

Εη

Η

Εη

Ο

Εη

Ο

Εη

FIG.

190 092

1870 1890 1910 _{attttttcagacttgtcaagcctgtgcaaaaaaattaaaatggatgccttgaataataag}

<	0	0	Em
0	E-		H	Em
Em	E«	Em	0	Em
U			Em
0	<

EEm

	0		Em		Em		*4«
		Em	Em						0
O	Em	O Em	O Em	O		O	«cC	O
Γ-	Em	m 0	<n {Η	in		r—i		c*	Em
cn	EM	o <	O Em	«Η	E-m	ci		Cl	<
r—{	U	Cl Em	d Em	Ci	0	Ci	0	ci	Em
	<	Ό	Em				<		0
	0	*4«	Em		E<		Em		Em
	Em	0	Em		Em		0		Em
		<	Em		Em		0		<
			Em				Em		Em
		0	Em				Em		0
	Em	Em	Em		Em		EM		0
	0	0	0		Em		Em		0

Η

Em

5

O in cn

H

EO

U

O u

Em

Η

Em

O 0	O <	O <	O	O Em
	l- 0	m <c	cn <	in 0
o 0	O 0	w—ł rtj	r-M 0	d 0
Ci 0	Ci 0	Ci rtj	Ci Em	Ci 0

E·

U

Em

O o

U o

Em g

u u

Em

U

O u

o o

o

	0				Em		0		E«
	0				0
o	0	O		O	EM	O	Em	o		O
m	Em	cn		tn	0	t-ł	Em	c-	0	m
cn	Em	cn	ri*	o	0	r-ł		i-i		ci
r-i	0	r-M	0	Ci		Ci	E*	ci	Em	Ci
	Em		0		0		Em		0
	<		0				0		Η
	0		Em						0
	0		E-m		0
					Em		rt		Em
	0		0		Em				<<

Em dfrOld

190 092

OPG 122-4011-fc lng/ml

190 092

Ε a

Ε *3 ο

ο ο

Ε ”3

U.

ΙΛ υ

+

Σ ca

Σ

U.

w υ

+

Σ m

Σ

U.

«η υ

+

Σ β

Σ

V)

U +

Σ

CB

Σ

O* ε

·&>

C ο

γ9

Ό

Pt b*

Pt '5 tó

X

CD

Ó

LL

Γ

CM sow

190 092

FIG.7A

Konnic/ bskncpo y- M-CST-/

FIG.7B

CotMria ετρίΐϊι koih,ecjO -+- ptefOiti utrąca Of&

FIG.7C ΐ$&·Μ£Ιηΐί όί^υΉείΜΪοίζζχ'^ΜΛνγκι §aXW/€h/C TRAP

(ώΐχόνία' Szpile*. t- ρκΑτΐκΐ wrą?ą.ea DPć190 092 iCa (mmol/i)

FIG. 8

190 092

PBS OPGbp 5ug/d

FIG.9A FIG.9B

OPGbp 25ug/d OPGbpIOOug/d

FIG.9C

FIG.9D

190 092

U u	α
u u	&
o U	ca
0
u u u
o u o	<
u o u	PS
u u	a
%	Q
P
< u	2

u m

P u

< P u

P >

° δ j u

U Oh o

Γs ou o ου σι <

u ο

u u

u

U o < o r-l u ou

U

U u

P u

<

U U P

P 8 g

P u P u u u

P u g

u 8

U u U Cl O P o

in o

o r-l

<	w	P	U	U G	0 <
U		o		0	0
O		P		P	0
P	u	o	>	P J	< P
P		P		0	0
0		0		0
P	u	<	w	P u	U 2
o		u		<c	U
o		<		(ti	<
u	CŹ	0	Q	<2 %	3 2
		O u	O	P O	U
o		o U	σ	< in	0
o	0	CM p	co CM	0 Q o	0 0
u		u			P
P		u		<	0
u		<	P	0 W	U CL
P		P			P
		u
u	2	0	CL	O Cd	0 Q
o		P		P	0
		u			P
o	ω		P	< s	0 >
P		0		o	0
<		0		o _	0
P	>H	P	o	P s	0 <
P		0		0	0
<				0	P
u	2			C P	0 >
0		P		0	0
o		0		<	P
<	PS	o p	co o	0 G o	0 G
o		rH 0	Γ	0 O	0
<		09 U	09	ρ o	u
V	w	P	co	P J	0 <
o		0		0	0
c		P		<	< ,
u	σ	0	2	P >	< i*S
u		0		0	u
u		<		<	0
<	P	P	>H	0 W	0 0
u		0		P	<
o				<	0
P	u		fcS	0 Q	0 <
<		<2		0	P
u		O		0	«<
u	a	0	0	0 CL	0 Q
P				U	P
u		0		0	0
u	a	0	a	0 0	P U
P				P	0
u		O <	o	0 O	P
	P	σ 0	W tn	P U rH	0 >
u		<H U	CM	U o	<c
P		0		0	(cr
O	>	P	ϋ	0 CL	< w
o		<		0	P
		0		P
u	CM	<	PS	0 G	u 2
u		OJ		P	0
P		0		0	P

FIG.10A

190 092

370 390 410

o

fc

o

Q

<

fc

E-i

o

u

o

O

3

o

<

0

r>

Ε-»

0

3

fc

o

Q

<

E-h

O

0

<

Q

0

o E~*

u

3

o <

E-i

§

O

< O

0

u

O

o

E-

o

<

O

ω

0

J

Eh

tn

u

O

0

O

0

o

O

o

u

0

r*

<

fO

0

σι

<

tn

o

E-h

u

’ή’

0

O

Lf)

F-ł

tn

0

a:

to

u

o

O

Fh

<

F

fc-»

0

o

Q

P

E-i

fc

0

u

0

<£

o

u

Eh

3

gs

Eh

W

u

fc

O

>

o

w

s

0

Eh

<

o

3

<

o

W fc fc

Ε0

Ο υ

Η £

ο tn fc

fc

Ε-»	>H	o	0	0	O	Eh	fc	O	0		o	<	2
0		tn	O		T—ł	0		Γ-	0		ro	0
0			Eh		Lf)	o		tn	Eh		to	0
0	o		Eh	fc		0	©		0	U3		fc	tn
Eh			0			0			0			P
0			0						0			0
0	<		0	0		0				Eh		Eh	tn
o			Eh			0			0			0
o			0			Eh			0			0
<	Eh		0	fc		0	J		H	O			tn
8			<			8			0			8
fc	□		8	<		Eh	O		3	a		0 H	u
Eh			Eh			0			0			0
0			0			0			0
0	<		Eh	U		0	fc			Eh		0	>
Eh			0						0			0
0			<			0			©			o
Η	u		0	W		<	Eh		Eh	s		0	>
&			0			0			Eh			fc
0		o	O		O	0		o	0		o	ni
O	fc	ro	<	Eh	Oó	Eh	υ	tn	0	fc	r~l	0	Q
Eh			O		TT>	0		Lf)	irf		to
0			<			Eh			3			0
&	fc		3	a		O	>			fc		fc	tn
0			0			0			0
O			0			0			0			3
0	fc		<	fc					Eh	ϋ		0	w
o			0			Eh						0
u			0			<C			3			0

LL

190 092

	0			<	2		Eh	0		<	2		0	<		0	>
	E-			0			Eh			<			Eh			0
	0			0			0			Eh			0			<
	0	<<		E-	2		0	X		0	dl		Eh	0		0	ω
	0			0			0			<			0			0
				E-						Η			Eh			0
	0	>		L·	dl		0	Q			dl		0	>		<	ω
	<			Eh			0			0			Eh			0
	Ε-»			<			0			Eh			0			Eh
	0	>			2		0	0			W			X		0	>
o	<		O	Eh		O	<		o	Eh		O	0		O	0
rH	Eh			0		CO	0		cn	0		in	0		rH	Eh
r-	0	>	Γ	0		00	Eh	0	oo	0	0	cn	0	0	O	0	dl
	0						0			<			Eh		rH
	E			0			0						0			0
	0	>			E-		Eh	0		0	W		Eh	0			Eh
	Eh			0			0			Eh			0			0
	0			Eh						0			Eh			Eh
	E-	W		0	dl			W		Eh	0		0	>		Eh	X

Eh

Η

Eh

Η

Eh o

> 3 ω 2 o 0 <

Eh

Eh %

< X Eh

Eh W Eh <

o	0	d	o		0	O		0	o	0	α	O	0	Q	O	0	Q
cn	0		tn			r-1			Γ-	Eh		co	<		cn	<
co	Eh		r-			00	Eh		ΟΟ	0		cn			cn	0
	0	dl			X		0	dl		<	0		0	W			X
	Eh						Eh			υ			<			0
	Eh			o			0			o			0			Eh
	0	>			X		<	0		Eh	0		0	X		0	>
	0			0			Eh			0			E-			<
	Eh			<			0			0			fcH			<
		H		Eh	>H			0		<	Eh		0	>		0	ω
	0			0			0						0			<
	Eh						0						Eh
	0	dl		Η	>H		Eh	0		0			<	X		0	<
	Eh			Eh			fcH			0			0			0
	0			Eh			0			0						0
	<	W		0	>		0	<		Eh	0			X		Eh	2
	0			Q			Eh			0			0			0
	0			rt						<						0
	0	X		O	0		0	Q		0	X		0	w		Q	X
	0			0			Eh			0			0			0
o	Eh		o	p		O			o	0		o	<		o	0
r-·	0	dl	co	EH	X	cn		2	m	Eh	0	τ—1	0	ω	r-	0	0
co	0		r-	0		r-	0		oo	Eh		cn	0		cn	Eh
				Eh			Eh			0			0			0
	Eh				H		0	>		0	0		0	X		O	0
	fcH			0			0			Eh			Eh
	0			Eh			0			0			0			o
	0			<	H		Η	2		0	<			Eh		0
	0			0			Eh			Eh			0			0
				0			<			0			Eh			0

FIG.10C

190 092

1030. 1050 1070

TTGAGACGCAAGGAGACCTCTCGAGGAAGATTCCCACAGAGGATGAGTACACGGACCGGC

fc	U O Γ \	fc	c	Eh
fc	u	fc	ęji	0
	c		o
	Eh		o
Q	c	H	c	Eh
	Eh		o
	O		P-(
Eh	Eh	Ul	F-t	fc
O	C	o	fc-4	O
m	C	cn	O	LO
>H r-ł	c	fc r-ł	Eh	U CN
r-ł	O	r-ł	0	r-l
	0		<
fc	3	Ul	o o	Oi
Q		o	o 3	Ul
	c
fc	8	OI		J
	c		<3
Eh	u	Oi	c	Ul
	o		o
	Eh		c
fc		w	o	Q
	c		o
	Eh		c
W O	U	J o	c	2 O
r-ł	U	Γ	o	cn
rł	Eh	r-l	c	CN
fc r-ł	U	J r-ł		W r-ł
	0
	Eh		o
fc	O	J	O	O
	c		0
	o		Eh
Ul	Eh	Ul	0	>
	o		3
J		o	0	w
	Eh		0
	O		Eh
Q	c	Eh	O	J
	o		O
	U		O
O	fc	Ul	8	fc
o	u	O	c	o
O σ>	o	fc LO	O	fc r-ł
o	o	r-ł	O	CN
r-i	c	r-ł	c	r-ł
Eh	o	Oi	o	Oi
	0		o
	u		Eh
W	Eh	Ul	Eh	fc

O C α o

E-t w u fc o ω

O U 0 < Η „ ΰ

Q OJ 0 O

Eh O Eh < fc C Ul < Eh O O U O U r-ł C r- <c

CUlmOfccnCS

Eh rf Eh

O < O o a o ω c ui o < u < Eh O o ω c h o o u < u < Eh O W < Eh o < o fc S fc ί >

C O 8

OQO<EhO0O Eh cn O ld Eh

O cn Eh cn <

EhUtHUJmOQ O O C o < o ^u 8 ^x £ * c < u o ω c fc η ui

H C O

Eh Ul o W 3 2

Ej Eh U < O U o o u a Eh ui o u o

Eh U U > Eh Ul C Ul

0 O

U O Eh o F < Eh n- o > cn O >

O cn O cn O r-ł O r-ł Eh g Ul U Λ g >

Η O

O fc CS Eh 2

Η Eh U

U U U

FIG.10D

190 092

<3

ω

Q

0

<

<3

z

F

0

<3

0

F

0

F

0

<3

0

F

<3

F

>l

0

CM

0

CM

<3

s

Q

0

X

0

<

0

F

0

0 C_4

<

8

X

8

CM

8

>

0

CM

tj)

<

tH 0

0

<

<3

8

F

0

X

0

CM

Q

cm

O

0

ο

0

O

0

O

0

O

0

O

0

ro

<3

σ\

F

Lf)

<3

r-(

Q

r-

<3

ro

0

’Ν*

0

CM

NT

0

>

Lf)

0

Q

KO

0

LO

W

r-

<3

F

rd

0

rH

rM

F

r-ł

0

τ—1

0

rd

0

<3

	0	X			0		<	0		<	0		0	CM		0	ω
	0						0			F			0			0
	F			(J			0			0			0			<
	F	J		Q	<		0	CM		F	0		F	0		0	ω
	<3			0			0			0			0			0
	0			<			0			F			0			<
	0	CM		0	ω		F	0			η			F		0	CM
	<			<3			0			0			0			0
	0			0			0			F						F
	0	0		0	<3		g	0		F	Cu		0	CM		0	>
	F			0						0			0			F
	0			F			o			0						0
	F	0			s		O	0		<3	F		<3	0		0	X
				0			0			U			0			0
	m5			0			0			0			F			0
O		X	O		0	o	F	0	O	F	0	o	0	>	O	0	X
r—ł	0		Γ	0		ro	0		<Xi	0		Lf)	F		rH	0
	F			0		LD	0		Lf)			LO
rH	0	J	rH	0	<3	r-l	0	0	X		Z	r-ł	F	>H	rH	0	0
	0			<			<			F			0			0
	0			0			0			0			F			F
	F	0		0	<		F	0		<3	0		0	>		0	>
	0			<			0			0			0			0
	0			0			0						F			0
	0	0		0	<		0				Z		0	>		0	X
	<						g			<			0			0
	0												F			<
	0	CM		0	ω		<5	0		0	0		<	ł—ł		0	W
	F			F			0			F			0			0
	F			0			0			0			F			0
	F	Cu		<3	w		<3	X		<	F		<3	HH		F	0
	0			0			0			0			0			0
	0			0			<3			F			<3			<
	0	CM		0	CM		0	ω		0	>		0	Q		0	w
							F			0			F			0

FIG.10E

<b		o E	H O	<	o	< O 0	O	0
cn	0	ω tn E	Η X rH	0	Q Γ-	< Z ro 0	0 <n	0 X
ro	F	x c	J Lf)	F	Lfl	0 <O 0	LD	0

<3 U 0 <

Cu

Ο ο

		F	0
F	O	0	F
<3 Z	< X	F 0	F
0	0	0	0
0	<3	0	<

<

W <3 <3

Ο

190 092

1750 1770 1790

GAGACTCCTTTGCGGGCACCGCGCCGCGCTTCCCCGACGTCTGTGCCACC

O o

U >

Q

Λ

Cu tó

CU

Em

O

Ph cn

Q

	·<			C
	0	Ol		0		Em
	0			Em		0
				0		0
	O	W		0		<
	0					Em
				0		0
	U	Oi		Em
o	0		O		O	Vp	O
Lf)	Em		rH		>	u	co
00	0	>	σ	0	W cn	Em	o
r-l	0		rH		r-l		d
	0			0		0

S

Em 0

Ol 0

O 0

O

W

o	O	O	O		0	o		O	0	O
co	0		cn			LD	0	rH	Em	Ι-
co			co	<		σι	0	O	0	Ο
r-i			r-l	0	O1	rH		d	0	d

% g

Em g

§ e

Em g

Em

F

O

Em

FIG.10F

o	<		o			O		O	0	O	0
rH	0	Oi	Γ-	0	Ol	co	0	σ	<	LD	Em
oo	0		οο	0		σ	Em	σ	U	O	0
rd	<		τΗ	u		τΗ	0	rH	0	d	<
	o	W		u			Em		Η		0
	0			0			0		0		0
	<			0			Em		Em		Em
	0	Oi		0	0		0		0		0
	0			Em			Em		<		0
	Em			0			Em		0		Em

190 092

FIG.11Β

FIG.1 1Α

F1G.11C

190 092

FIG.12A F1G.12B

FIG. 12C FIG.12D

FIG. 12E FIG. 12F

190 092

FIG. 12H

ODAR-Fc sow

190 092

500

Omg/Kg OJmg/Kg Umg/Kg 5.0mg/Kg

ODAR =Fc Dose ćMbiićunC hi? tautrda-^fYćŁIchrft fick prp^hi betu P * θ .05.

FiG.13

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wyodrębniony kwas nukleinowy kodujący proteinę wiązącą osteoprotegerynę, wybrany z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy, który hybrydyzuje do komplementu obszaru kodującego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SeQ ED NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5x SSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiąŻącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nukleinowy, który ulega degeneracji do kwasów (a), (b) lub (c).
2. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, ze jest kwasem cDNA, genomowym DNA, syntetycznym DNA lub RNA.
3. Polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy według zatrz. 1, w szczególności, zawierający sekwencję przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 4), bądź jej obciętą lub rozpuszczalną formę.
4. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, obejmujący kodony korzystne dla ekspresji Escherichia coli.
5. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, mający przyłączony do niego wykrywalny znacznik.
6. Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasowi reszt 1-136 lub reszt 70-316, przedstawionych na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO· 2)
7. Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową reszt 1-317 lub reszt 69-317 przedstawionych na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4).
8. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, kodujący rozpuszczalną proteinę wiązącą osteoprotegerynę.
9. Kwas nukleinowy według zastrz. 8, kodujący polipeptyd obejmujący reszty 69-317 przedstawione na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) i jego obcięte formy.
10. Wektor ekspresji zawierający kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy, który hybrydyzuje do komplementu obszaru kodującego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5xSSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5x SSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiązącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nukleinowy, który ulega degeneracji do kwasów (a), (b) lub (c).
11. Wektor ekspresji według zastrz. 10, w którym kwas nukleinowy obejmuje obszar kodujący polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) i fig. 4 (SEQ ID NO: 4).
12. Wektor ekspresji według zastrz. 10, zawierający kwas nukleinowy kodujący polipeptyd obejmujący reszty 69-317 przedstawione na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) i jego obcięte formy.
13. Komórka gospodarza transformowana lub transfekowana przy uzyciu wektora ekspresji zawierającego kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID

NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

190 092

b) kwas nikdeinowy, który hybrydyzuje do komplementu obszaru koduj ącego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5x SSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na rysunku fig . 1 (SEQ ID) NO: 11 lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas niktkinKw^ą^') któiy ulega degeneracji do kwasów·' (a). (b) lub ((Υ bądź kwas nukleinowy, kodujący polipeptyd obejmujący reszty 69-317 przedstawione na rysunku fig. 4 (SEQ ED nO: 4) i jego obcięte formy.
14. Komórka gospodarza według zastrz. 13, będąca komórką eukariotyczną.
15. Komórka gospodarza według zastrz. 13, będąca komórkąprokariotyczną.
16. Komórka gospodarza według zastrz. 13, którą jest Escherichia coli.
17. Sposób wytwarzania proteiny wiążącej osteoprotegerynę obejmujący:

- prowadzenie w warunkach odżywczych wzrostu komórek gospodarza transformowanych lub transfekowanych kwasem nukleinowym wybranym z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy, który hybrydyzuje do komplementu obszaru kodującego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SeQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5x SSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5x SSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osteoprotegerynę i

d) kwas nukleinowy, który ulega degeneracji do kwasów (a), (b) lub (c) oraz

- wyodrębnienie polipeptydowego produktu ekspresji wskazanego kwasu nukleinowego.
18. Polipeptyd wytworzony sposobem według zastrz. 17, kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy, który hybrydyzuje do komplementu obszaru kodującego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SeQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5xSSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nukleinowy, który ulega degeneracji do kwasów (a), (b) lub (c).
19. Oczyszczona i wyodrębniona proteina wiążąca osteoprotegerynę, zawierająca sekwencję aminokwasową przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) lub jej fragment, analog, bądź pochodna.
20. Proteina według zastrz. 19, która jest ludzką osteoprotegeryną.
21. Proteina według zastrz. 19, mająca sekwencję aminokwasową przed stawioną na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4).
22. Proteina według zastrz. 19, która jest kowalencyjnie połączona z polimerem rozpuszczalnym w wodzie.
23. Proteina według zastrz. 22, która jest kowalencyjnie połączona z glikolem polietylenowym.
24. Proteina według zastrz. 19, która jest rozpuszczalną proteiną wiążącą osteoprotegerynę.
25. Proteina według zastrz. 24, zawierająca sekwencję aminokwasową reszt 70-316 włącznie, przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub jej formy obcięte.

190 092
26. Proteina według zastrz. 24, zawierająca sekwencję aminokwasową reszt 69-317 włącznie, przedstawioną na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) łub jej formy obcięte.
27. Proteina według zastrz. 24, zawierająca sekwencję aminokwasową reszt 140-316 włącznie, przedstawioną na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) lub jej fragment, analog, bądź pochodna.
28 Proteina według zastrz. 24, zawierająca sekwencję aminokwasową reszt 145-316 włącznie, przedstawioną na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) lub jej fragment, analog, bądź pochodna.
29. Przeciwciało lub jego fragment specyficznie wiązący się z epitopem proteiny wiążącej osteoprotegerynę, zawierającej sekwencję aminokwasową przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4), bądź fragmentu, analoga albo pochodnej tej proteiny.
30. Przeciwciało według zastrz. 29, które jest przeciwciałem monoklonalnym.
31. Sposób wykrywania obecności proteiny wiążącej osteoprotegerynę w próbce biologicznej obejmujący:

- inkubowanie próbki z dodatkiem przeciwciała według zastrz. 29 lub jego fragmentu, który specyficznie wiąże się z epitopem proteiny wiążącej osteoprotegerynę, w warunkach, które umożliwiają wiązanie przeciwciała z proteiną wiążącą osteoprotegerynę; oraz

- wykrywanie związanego przeciwciała.
32. Sposób wykrywania obecności osteoprotegeryny w próbce biologicznej obejmujący:

- inkubowanie próbki z dodatkiem proteiny wiążącej osteoprotegerynę zawierającej polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu r^ikcfinKw^e^^t^o przedstawioną na ysunku fig . 1 (SI2Q ID NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwa) nuklemowy, Itóry) hyby/dyzuje do komplementu tb^.sz^^erru ΕοΟι^ίΐοΰ^ο polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5x SSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nukleinowy, który ulega degeneracji do kwasów (a), (b) lub (c). w warunkach, które umożliwiają wiązanie tej proteiny z osteoprotegeryną oraz

- pomiar ilości związanej proteiny wiążącej osteoprotegerynę.
33. Sposób prowadzenia skriningu pod kątem zdolności badanego związku do wiązania z proteiną wiążącą osteoprotegerynę obejmujący:

- inkubowanie proteiny wiążącej osteoprotegerynę, zawierającej polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy, który hybrydyzuje do komplementu obszaru kodującego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SeQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5x SSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nukleinowy, który ulega degeneracji do kwasów (a), (b) lub (c).

z dodatkiem badanego związku w warunkach, które umożliwiaj ą związanie; oraz

- pomiar związanego związku badanego.
34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, ze związek jest agonistą lub antagonistą proteiny wiążącej osteoprotegerynę.
35. Zastosowanie kwasu nukleinowego komplementarnego do kwasów nukleinowych przedstawionych na rysunku fig 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3) jako środka leczniczego, zwłaszcza do regulowania ekspresji proteiny wiążącej osteoprotegerynę.

190 092
36. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca terapeutycznie skuteczna, ilość proteiny wiązącej zcizzcrztzgzrfnę zraa farmaczntfcaniz dopuszczalny nośnik, adjuwant, śtzdzZ ułatwiający tzajncacayniz, stabilizator i/lub craeziwntlenCyca.
37 Kamcaafcjy wzdłng aactra. 36, znamienna tym, zz crztziną wiąZącą zstozptztegzrynę jzst ludzka crztzina wiąZąca zstzzctztzgzrynę.
38. ZyctaczwanCe madnlytara craieinf wiąZączj acteacrategerfnę zywCerajązej szkwzncję yminzZwacawą crzedctywianą na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4), albz jzj frygment, analzg, bądź czzhzdną, jakz śrzdka lecznCczega, zwłaszcza dz lzcaznia lub profilaktyki chzrób kzści u ssaka.
39. ZastasawanCe wzdług zasfrz. 38, znamienne tym, Zz mzdulytarem jzst rozpuszczalna fzrma crateCnf wiąZączj asteacrztegetynę.
40. Zastasawanie wzdług zasta. 39, znamienne tym, Zz madulatarem ctzeciwziała lub jzgz b^yzm, które scezffizznie wiąZą się z przteiną wiąZącą acteacrotegerynę.
41. Zactaczwanie madnlatara tezeptzta OD AR jakz śrzdka lecznCzzega, zwłaszcza dz lezzenia lub profilaktyki ^zrób kaśzi u ssaka.
42. Zactzczwanie wzdług zastrz. 41, znamienne tym, Zz mzdnlytzrem jzst rozpuszczalna fztma rzzzctzry OD AR.
43. ZactzczwanCz wzdług zastrz. 41, znamienne tym, Zz mzdulatzrzm przzziwzCałz lub jzgz ffygmzni, którz spzcyfizznie wiąZą tzceptzr ODAR.
44. Spzsób przwydzznCa ski-mingu pzd kątzm zdzl^ści badanegz związku dz zwiększania lub zmnizjszania wiązania ptzieCnf wiąZączj actzzctztzgetfnę dz rzczcizry ODAR zbejmnjącf:

- inkubzwyniz proteiny wiąZączj zstezpratzgztynę, zywierającej caliczctyd kzdzwany przza kwas nuklzinzwf wybrany z grupy zbejmujćcej:

a) szkwenzję kwasu nnkleinzwzgz ptzzdstawCzną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nuklzinawy, który hybi^dyzuje do komplementu obszaru kodujączgo polcpeptfd ctzzdciawizny na rysunku fig. 1 (SeQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach zbzjmującfzh hybrydyzację przy 5xSSC, 50% fzrmamid i 42°C zraz ptzzmfwaniz przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwas nukleinawy pr^^e(^łst^^lwiiztśy^/ na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kzdującf zbciętą lub rozpuszczalną fzrmę prztzinf wiąZączj zctzzptztzgerynę i

d) kwas nuklkinowy, który wtegk defeneracji do kwasćw (a), (b) lwb (c ).

zraz ludzkiegz roczctary ODAR i zwentualnie związku bydynegz w warunkach, którz umzZliwiają wiązaniz proteiny wiązącej zstezctztzgerfnę z tzczctzrzm ODAR; zraz

- czmiar wiązania prztziny wiąząceS zstezprotedotynę dz ODAR w zbzcnzści zraz pzd nizzbzcnzśt związku badanzdz.

PtzzdmCztzm wynalazku są czlipepifdf zyyngyZzwynz w ctzces rózniczwyniy zsizzklastów. W crczzgólnzścC, przodmiztem wynalazku są proteiny wiąZącz zstezcrotegztfnę, kwasy nuklelnzwe kzdującz te proteiny, wekizty ekcctzsSC i kamórkC dzcczdyrzy słuZacz dz wytwarzania tych protein zraz testy na wiązyniz. Opisanz równizZ kzmczzfcjz farmaczntycrne zawietająze pzwfzczz proteiny zraz ryciaczwanCz tych protein w chatyktzrzz śrzdków lzczniczych dz leczonla chzrób kaści takich, jak zctzzcztzza, utrata masy kzstnoj na skutek zapalznia stawów, chzroba Paget'y i hicetkylcemia.

Ptredmiziem wynalazku są iakze tecectztf protein wiąZących zctzzptztzdzrynę zraz ich zycizczwaniz w chyryktetzz śrzdków lezrnlzzfch dz leczznia chzrób kzści.

Żywa tkanka kzsina znajduj się w ciyniz równzwagi dynamicz^j camiędry zdkładantem i reszrpcją kzści. W pracesach tych bizrą udział dwa rodzaje kzmórek: zstzzblastf, które wfdzielają cząsteczki zawiorające ztganiczną m(zlzrz kzstną i zstzzklasty, którz czwzdnjć tzzcnsrczaniz mycietzf kzstnzj i szlubilizację szli zawartych w kzściach. U młzdych zszbni6

190 092 ków, u których kości znajdują się w fazie wzrostu tempo wzrostu masy kostnej jest wyzsze od tempa resorpcji, podczas gdy u osobników starszych tempo resorpcji może być wyzsze niż tempo odkładania masy kostnej. W tej drugiej sytuacji zwiększony rozkład masy kostnej prowadzi do zmniejszenia masy i wytrzymałości kości, wzrostu ryzyka złamań oraz powolnej lub niekompletnej naprawy złamań kości.

Osteoklasty są dużymi, fagocytamymi, wielojądrzastymi komórkami, które powstają z hematopoetycznych komórek prekursorowych w szpiku kostnym. Pomimo, ze wzrost i powstawanie dojrzałych funkcjonalnie osteoklastów nie są dobrze poznane, sądzi się, ze osteoklasty dojrzewają zgodnie z ciągiem komórek monocytów/makrofagów w wyniku odpowiedzi na działanie różnych czynników sprzyjających wzrostowi. Uważa się, że za wczesny rozwój komórek prekursorowych szpiku kostnego do preosteoklastów są odpowiedzialne rozpuszczalne czynniki takie, jak czynnik martwicy nowotworów a (TNT-a), czynnik martwicy nowotworów β (TNF-β), interleukina 1 (IL-1), interleukina 4 (IL-4), interleukina 6 (IL-6) i czynnik hamujący białaczkę (LIF). W hodowli komórkowej preosteoklasty powstają w obecności dodanego czynnika stymulującego kolonie makrofagów (M-CSF). Te czynniki działają przede wszystkim we wczesnych etapach rozwoju osteoklastów. Zaangażowanie czynników polipeptydowych w końcowym stadium powstawania osteoklastów nie zostało jeszcze szeroko opisane. Opisano jednak, że hormon przytarczyc stymuluje powstawanie i działanie osteoklastów, a kalcytonina ma odwrotne działanie, chociaż w mniejszym stopniu.

Ostatnio opisano nowy czynnik polipeptydowy zwany osteoprotegeryną (OPG), czynnik ten negatywnie reguluje powstawanie osteoklastów in vitro oraz in vivo (patrz zgłoszenia nr US 08/577,788 z dnia 22 grudnia 1995, US 08/706,945 z dnia 3 września 1996 oraz US 08/771,777 z dnia 20 grudnia 1996, przytoczone tu jako źródła oraz publikacja WO 96/26271, wszystkie dokonane na rzecz AMGEN INC.). OPG znacznie zwiększało gęstość kości u myszy transgenicznych, u których zachodziła ekspresja polipeptydu OPG i zmniejszało utratę masy kostnej po podaniu szczurom z usuniętymi jajnikami. Analiza aktywności OPG podczas powstawania osteoklastów in vitro ujawniła, że OPG nie zaburza wzrostu i różnicowania prekursorów monocytów/makrofagów, lecz raczej blokuje różnicowanie osteoklastów z prekursorów monocytów/makrofagów. Wydaje się zatem, że OPG wykazuje specyficzność w regulowaniu zakresu wytwarzania osteoklastów.

OPG zawiera dwa obszary (domeny) polipeptydowe o różnych właściwościach strukturalnych i funkcjonalnych. Obszar amino-końcowy rozciągający się na reszty 22-194 polipeptydu o pełnej długości (N-końcową metionina jest określona jako reszta 1) wykazuje homologię z innymi członami rodziny receptora czynnika martwicy nowotworów (TNFR), szczególnie TNFR-2 poprzez zachowanie obszarów bogatych w cysteinę, charakterystycznych dla członów rodziny TNFR. Karboksy-końcowy obszar rozciągający się na reszty 194-401 nie wykazuje znaczącej homologii z żadnymi znanymi sekwencjami. W przeciwieństwie do wielu innych członów rodziny TNRF, OPG wydaje się być białkiem wyłącznie wydzielanym i nie wydaje się być białkiem syntetyzowanym w formie związanej z błoną.

W oparciu ojej aktywność jako negatywnego regulatora powstawania osteoklastów, postuluje się, ze OPG może się wiązać z czynnikiem polipeptydowym zaangażowanym w różnicowanie osteoklastów i w ten sposób blokować jeden lub więcej etapów końcowych, prowadzących do powstania dojrzałych osteoklastów.

Dlatego celem wynalazku jest identyfikacja polipeptydów, które wchodzą w interakcje z OPG. Wymienione polipeptydy mogą odgrywać rolę w dojrzewaniu osteoklastów i mogą być pomocne w leczeniu chorób kości.

Cel ten osiągnięto dzięki opracowaniu rozwiązania według obecnego wynalazku.

Wyodrębniony kwas nukleinowy kodujący proteinę wiążącą osteoprotegerynę, zgodnie z wynalazkiem wybrany jest z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na iysunku fig. 1 (SEQ ID NO. 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy. który hybrydyzuje do komplementu obszaru kodującego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5x SSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

190 092

c) kwas mddemowy przedstawiony na iysunku fig.. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig.. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiązącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nuklemowy, który ulega degeneracj i do kwasów (a) . (b) tob (c).

Wynalazek dotyczy również polipeptydu kodowanego przez kwas nukleinowy według wynalazku, w szczególności, zawierającego sekwencję przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 4), bądź jej obciętą lub rozpuszczalną formę.

Kwas nukleinowy według wynalazku może być kwasem cDNA, genomowym DNA, syntetycznym DNA lub RNA.

Kwas nukleinowy według wynalazku obejmuje korzystnie kodony sprzyjające ekspresji w Escherichia coli.

Korzystnie, kwas nukleinowy według wynalazku ma przyłączony do niego wykrywalny znacznik.

Kwas nukleinowy według wynalazku korzystnie koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową zbudowaną z reszt 1-136 lub reszt 70-316, przedstawionych na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2).

Kwas nukleinowy według wynalazku korzystnie koduje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową zbudowaną z reszt 1-317 lub reszt 69-317 przedstawionych na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4).

Korzystnie, kwas nukleinowy według wynalazku koduje rozpuszczalną proteinę wiążącą osteoprotegerynę, a zwłaszcza polipeptyd obejmujący reszty 69-317 przedstawione na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) i jego obcięte formy.

Wynalazek obejmuje także wektor ekspresji zawierający kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO· 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy, który hybryd czuje do komplementu obszaru kodującego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SeQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5x SSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na lysuinku fig. 1 (SEQ D NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO. 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nukleinown, który ulega degeneracji do nwasów (a), (15) Nb Πι,).

Wektor ekspresji według wynalazku korzystnie zawiera kwas nukleinowy obejmuje obszar kodujący polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) i fig. 4 (SEq ID NO: 4), a zwłaszcza polipeptyd obejmujący reszty 69-317 przedstawione na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) i jego obcięte formy.

Wynalazek dotyczy także komórki gospodarza transformowanej lub transfekowanej przy użyciu wektora ekspresji zawierającego kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy, który hybrydyzuje do komplementu obszaru kodującego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SeQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5xSSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5x SSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nukleinowy, który ulega degeneracji do kwasów (a), (b) lub (c), bądź kwas nukleinowy, kodujący polipeptyd obejmujący reszty 69-317 przedstawione na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) i jego obcięte formy.

Komórka gospodarza według wynalazku jest komórką eukariotyczną bądź prokariotyczną.

Korzystną komórką gospodarza według wynalazku jest Escherichia coli.

190 092

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania proteiny wiązącej osteoprotegerynę obejmujący:

- prowadzenie w odpowiednich warunkach odżywczych wzrostu komórek gospodarza transformowanych lub transfekowanych kwasem nukleinowym wybranym z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy, który hybrydyzuje do komplementu obszaru kodującego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SeQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5x SSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nukleinowy, który ulega degeneracji do kwasów (a), (b) lub (c) oraz

- wyodrębnienie polipeptydowego produktu ekspresji kwasu nukleinowego.

Wynalazek dotyczy również polipeptydu wytworzonego powyższym sposobem, kodowanego przez kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy, który hybrydyzuje do komplementu obszaru kodującego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SeQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5xSSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nukleinowy, który ulega degeneracji do kwasów (a), (b) lub (c)

W szczególności, wynalazek dotyczy oczyszczonej i wyodrębnionej proteiny wiążącej osteoprotegerynę, zawierającej sekwencję aminokwasową przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) lub jej fragmentu, analoga, bądź pochodnej.

Korzystna taka proteina jest ludzką proteiną.

Korzystnie, proteina według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną na rysunku fig. 4 (SEQ ED NO: 4).

Proteina według wynalazku jest korzystnie kowalencyjnie połączona z polimerem rozpuszczalnym w wodzie. Korzystnym takim polimerem jest glikol polietylenowy.

Korzystnie, proteina według wynalazku jest rozpuszczalną proteiną wiążącą osteoprotegerynę.

Korzystnie, proteina według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową reszt 70-316 włącznie, przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ED NO: 2) lub jej formy obcięte.

Korzystnie, proteina według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową reszt 69-317 włącznie, przedstawioną na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4) lub jej formy obcięte.

Korzystnie, proteina według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową reszt 140-316 włącznie, przedstawioną na rysunku fig. 4 (SEQ ED NO: 4) lub jej fragment, analog, bądź pochodną.

Korzystnie, proteina według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową reszt 145-316 włącznie, przedstawioną na rysunku fig. 4 (SEQ ED NO: 4) lub jej fragment, analog, bądź pochodną.

Wynalazek obejmuje także przeciwciało lub jego fragment specyficznie wiążący się z epitopem proteiny wiążącej osteoprotegerynę, zawierającej sekwencję aminokwasową przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4), bądź fragmentu, analoga albo pochodnej tej proteiny.

Korzystnie, przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem monoklonalnym.

190 092

Wynalazek dotyczy również sposobu wykrywania obecności proteiny wiążącej osteoprotegerynę w próbce biologicznej obejmujący:

- inkubowanie próbki z dodatkiem przeciwciała lub fragmentu przeciwciała we dług wynalazku, które specyficznie wiąże się z epitopem proteiny wiążącej osteoprotegerynę w warunkach, które umożliwiają wiązanie przeciwciała z proteiną wiążącą osteoprotegerynę; oraz

- wykrywanie związanego przeciwciała.

Wynalazek dotyczy również sposobu wykrywania obecności osteoprotegeryny w próbce biologicznej obejmujący:

- inkubowanie próbki z dodatkiem proteiny wiążącej osteoprotegerynę zawierającej polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nuMe^owego prcedstawioną na rysunku) fig . 1 (SEQ Π) NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) Ι^ν^ίΐ) ηιιΜε'ίηον,Ύ ) który hybyędyzuie do J^i^n^jj^^n^^nfi) obszarn l^i.d^i^ijrcce^o polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SeQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5xSSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwaę nukeernowyr przedstawiony na rysunku fig . 1 (SEQ D) NO : 1) kh) fig. . 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osSeoproSegerynę oraz

d) kwas indlh.in^cw;^'i któy/ udega degeneracji do kwasów (ό),. (b) Ed) 0)·). w warunkach, które umożliwiają wiązanie tej proteiny z osSeoproSegeryną oraz

- pomiar ilości związanej proteiny wiążącej osteoprotegerynę.

Wynalazek dotyczy również sposobu prowadzenia skriningu pod kątem zdolności badanego związku do wiązania z proteiną wiążącą osteoprotegerynę obejmujący:

- inkubowanie proteiny wiążącej osSeoprotegerynę, zawierającej polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej:

a) sekweneię kwasu isukleinowego przedstawioną na rysunku fig . 1 SSEQ D NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy ' któy hybrydyzuje do komplemenSu cb^:^y^tissi kodtjjącego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5xSSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwas mkdemowy przedstawiony na ysunkiu fig ' 1 (SEQ ID NO ' 1) tob fig ' 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nukeeinowy, któiy udega degeneracj ϊ do kwasów (a) , ((i) lub (c,.

z dodatkiem badanego związku w warunkach, które umożliwiają związanie; oraz

- pomiar związanego związku badanego.

Korzystnie w powyzszym sposobie, związek badany jest agonistą lub antagonistą proteiny wiążącej osteoprotegerynę.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie kwasu nukleinowego komplementarnego do kwasów nukleinowych przedstawionych na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3) jako środka leczniczego, zwłaszcza do regulowania ekspresji proteiny wiążącej osteoprotegerynę.

Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej zawierającej terapeutycznie skuteczną ilość proteiny wiążącej osteoprotegerynę oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, adjuwant, solubilizer, stabilizator i/lub przcciwuSleniacr.

Korzystnie, kompozycja według wynalazku jako proteinę wiążącą osteoproScgerynę zawiera ludzką proteinę wiążącą osSeoprotcgcrynę.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie modulatora proteiny wiążącej osteoprotegerynę, zawierającej sekwencję aminokwasową przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub na rysunku fig. 4 (SEQ ID NO: 4), albo jej fragment, analog, bądź pochodną, jako środka leczniczego, zwłaszcza do leczenia lub profilaktyki chorób kości u ssaka. Korzystnie,

190 092 modulatorem jest rozpuszczalna forma proteiny wiążącej osteoprotegerynę, zwłaszcza przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z proteiną wiążącą osteoprotegerynę.

Wynalazkiem objęte jest również zastosowanie modulatora receptora ODAR jako środka leczniczego, zwłaszcza do leczenia lub profilaktyki chorób kości u ssaka. Korzystnym modulatorem jest rozpuszczalna forma receptora ODAR, a zwłaszcza przeciwciało lub jego fragment, które specyficznie wiążą receptor ODAR.

Wynalazek dotyczy również sposobu prowadzenia skriningu pod kątem zdolności badanego związku do zwiększania lub zmniejszania wiązania proteiny wiążącej osteoprotegerynę do receptora ODAR obejmujący:

- inkubowanie proteiny wiążącej osteoprotegerynę, zawierającej polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej:

a) sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 2 (SEQ ID NO: 3)

b) kwas nukleinowy, który hybrydy zuj e do komplementu obszaru kodującego polipeptyd przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 4) w warunkach obejmujących hybrydyzację przy 5xSSC, 50% formamid i 42°C oraz przemywanie przy 0,5xSSC i 55°C,

c) kwas nukleinowy przedstawiony na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub fig. 4 (SEQ ID NO: 3), kodujący obciętą lub rozpuszczalną formę proteiny wiążącej osteoprotegerynę oraz

d) kwas nukleinowy, który ulega degeneracji do kwasów (a), (b) lub (c) oraz ludzkiego receptora OD AR i ewentualnie związku badanego w warunkach, które umożliwiają wiązanie proteiny wiążącej osteoprotegerynę z receptorem OD AR; oraz

- pomiar wiązania proteiny wiążącej osteoprotegerynę do ODAR w obecności oraz pod nieobecność związku badanego.

Wyżej opisany nowy człon rodziny czynnika martwicy nowotworów TNF według wynalazku został zidentyfikowany z biblioteki mysiego cDNA podlegającego ekspresji w komórkach COS, w wyniku skriningu przy użyciu rekombinacyjnej proteiny fuzyjnej OPG-Fc jako sondy wykrywającej powinowactwo. Nowy polipeptyd jest transbłonową proteiną wiążącą OPG, której przypisuje długość 316 aminokwasów, która posiada przy tym amino-końcowy obszar cytoplazmatyczny, obszar transbłonowy i karboksy-końcowy obszar pozakomórkowy. Proteiny wiążące OPG według wynalazku mogą być związane z błoną lub mogą występować w formie rozpuszczalnej.

Jak to wyżej szczegółowo omówiono, wynalazek obejmuje kwasy nukleinowe kodujące proteinę wiążącą OPG, wektory i komórki gospodarza, w których zachodzi ekspresja polipeptydu oraz sposób wytwarzania rekombinacyjnej proteiny wiążącej OPG. Przeciwciała lub ich fragmenty, które specyficznie wiążą proteinę wiążącą OPG jako objęte obecnym wynalazkiem zostały także ujawnione.

Proteiny wiążące OPG mogą być stosowane w testach w celu określenia poziomu OPG w próbkach biologicznych, identyfikowania komórek i tkanek, w których występuje proteina wiążąca OPG oraz do identyfikacji nowych członów rodzin OPG i protein wiążących OPG. Opracowano również sposoby identyfikacji związków, które wchodzą w interakcje z proteiną wiążącą OPG. Do związków tych należą kwasy nukleinowe, peptydy, proteiny, węglowodany, lipidy lub cząsteczki o małej masie cząsteczkowej i mogą one zachowywać się jak agoniści lub antagoniści aktywności proteiny wiążącej OPG.

Proteiny wiążące OPG są zaangażowane w proces różnicowania osteoklastów, a poziom aktywności osteoklastów z kolei moduluje resorpcję kości. Agoniści i antagoniści proteiny wiążącej OPG modulują powstawanie osteoklastów i resorpcję kości i mogą mieć zastosowanie w leczeniu dolegliwości i chorób kości charakteryzujących się zmianami w resorpcji kości, takich jak osteoporoza, hiperkalcemia, utrata masy kostnej na skutek przerzutowego zapalenia kości, unieruchomienia lub paradentozy, choroba Paget'a, osteopetroza, obluzowywanie protez i tym podobnych. Kompozycje farmaceutyczne zawierające proteiny wiążące OPG oraz związki agonistyczne i antagonistyczne protein wiążących OPG są także objęte wynalazkiem.

Receptory protein wiążących OPG zostały także zidentyfikowane z biblioteki mysiego cDNA wywodzącego się z komórek szpiku kostnego, które wiążą się ze znakowaną fluorescencyjnie

190 092 proteiną wiąZącą OPG. Rzczpiztf tz mzgą być wfkzrzysifw(nz dz idzntffikycji agznistów i yniygznistów intzrakzji prztziny wiąZączj OPG z jegz rzczptzrom, którz mzgą być zastzszwyne w lzczzniu chzrób kzści.

Opis rysunków

Figura 1. Struktura i sekwencSa inserin 32D-F3 kzdującegz prztzinę wiąZącą OPG. Ptzewidfwany zbszyr trynsbłznawf i mizjsca dz ptrfłączoniy łańcuchów węglzwzdynzwych przza yscaradinę są czdkrzślzne.

Figura 2. Ekspresja prztziny wiąZązej OPG w kzmórkach COS-7 transfzkzwynfch za pzmzcć pcDNA/32D-F3. Kzmórki zzstał^ lipzfzkzwanz za pzmzcą pcDNA/32D-F3 DNA, pz czym przztzstzwynz pzd kątzm wiązania kzniugatu ylkalicznzj i kzzizdz ptzeziw-lndzkizdz IgGl (wyłączniz wtómz), ludzkizj OPG[22-201]-Fc plus wtómz (OPG-Fc), bądź chimzryczneS proteiny fnzyjnej pzzykzmótkzwzgz zbszaru ATAR-Fc (sATAR-Fc). ATAR jzst nzwym człznzm snpetrzdzinf TNFR, ( biyłkz fuzyjnz sATAR-Fc słuZy jakz kzntrola zarównz dla wiązania zbszytu Fc ludzk^j IgGl, jak i dla wiązania gznzifcrneS proteiny czktewnej TNRP z cząsteczkami pzwierzchnizwfmi kzmórki 32D.

Figura 3. Eksprzsja prztziny wiąZączj OPG w tkankach ludzkich. Analiza „Nzrthzrn błzt” mRNA z tkanzk ludzkich (Clzntech) przy uZyciu radizakifwnio znakzwanzga próbnika hybrydyzacji wfptzwydzznzdz z 32D-F3. Względna masa cząstzczkzwy jzst czdany z lzwej sirznf w ^^(-(Λ zasad (kb). Strzałka z crywzj strony wsk(znjz migrację transkryctn z wizlkzści zkzłz 2,5 kb wfkrftzgz w mRNA z węzła chłznnzdz. Bardzz słabz pasmz z samej maste wykryte takZz w wąirzbie płzdu.

Figura 4. Struktura i sekwzncja inszrtu pcDNA/hu OPGbp 1,1 kzdujączgz ludzką prztzinę wiąZącą OPG. Przowidfwany zbszar ttansbłznzwf i mieSsze dz wiązania łańcuchów węglzwzdynzwfch ctzzz asparaginę są czdkreślzne.

Figury 5. Stfmnlawanie pzwstawania zstezklystów in vitro wz wscółhzdzwlych makrzfagów szpiku kzsinzga i kzmórzk ST2, traktowanych rokambCnacyjną mysią proteiną wiąZącą OPG [158-316]. Hzdzwlz traktzwyne były zmCennfmC stęZeniymi mfsioS proteiny wCązćceS OPG w zakreste zd 1,6 dz 500 ng/ml. Pz 8-10 dniach hadzwlz czddynz liziz i zmizrzznz aktfwnaść TRAP za pamzcą testu rzzcnszczalnzścl. Dzdatkzwz, pewnz hzdawlz były jednzczzśniz ttaktzwyne 1, 10, 100, 500 i 1000 ng/kg proteiny fnzfSnej rzkambinyzyjną mysia OPG [22-401]-Fc. Mysia proteina wiąZąca OPG wfwzłnje zylzZną zd dawki stymulację twzrzeniy zstezklastów, pzdczas gdy OPG [22-401 ]-Fc hamuSe twzrzzniz zstzzklystów.

Figura 6. Stfmulaw(nie rzzwzju zstezklystów z crzkntszrów zz szpiku kzstnzgz in vitro w zbecnaścC M-CSF i mysCzS proteiny wiąZączj OPG [158-316]. Szpik kasiny myszy zzstał zebrany i hzdzwynf w zbecnzści M-CSF w stęzenCu 250, 500, 1000 i 2000 U/ml. Zmiznnz cięzenCa proteiny wiąZączj OPG [158-316] w zakreste zd 1,6 dz 500 ng/ml zzstyły dzdanz dz takich samych hzdawlC. Rzzwój zstezklastów był miorzznf za pzmzcą testu rzzcuszcz(lnzści TRAP.

Figura 7. Ostzzklysif czchzdzącz z kzmórek szpiku kzstnzdz w zbecnzścC zarównz M-CSF, j(k i proteiny wiąZączj OPG [158-316] reszrbująkzść in vitro. Kzmórki szpiku kzstnegz it(kizwynz za pamzcą M-CSF albz proteiny wiąZączj OPG, bądź zbu tymi czynnikami mazm były nmizszczanz na plasterkach kzści w zagłębtemach dz hzdawli i pzzzstywiznz dz wytwzrzzmy dzjtaał^ch zstezklystów. Pzwsiyłz hzdzwlz były następniz barwiznz błękitem ialnidfnzwfm (lzwa kalnmna) lub badanz hCstzchemicznCz w czlu detekcSC yktywnzści znzfmu TRAP (prawa kalumna). W hzdzwlych traktowanych zbydwzma czynnikami pawstałf dzjtzyte zstzzklystf zdzlne dz reszrbzwynia kzści, ny cz wskazywały abzcnzść nizbizskz zaba-wiznych zygłębteń na pzwCzrachnl kzści. Byłz to skzrzlzwanz z zbzcnzścią wizlu duZych, wizlzjądrzastych kzmórzk TRAP-pzaytfwnych.

Figura 8. Wykrzs craedctawi( pzaizmf całkzwitzdz aSznCazwynzgz wapnia (iCa) wz krwi myszy, której wstrzyknięte proteinę wiąZącą OPG, w 51 gzdain pz pizrwsazS ^^Ζ^Ι ztaz myszy, która zttzymała równzcazśniz dawkę OPG. Prztzina wiąZąca OPG znycząca i w sposób zakany zd dawki zwiększyła czaizmy iCa. OPG (1 mg/kg/dateń) zyłkawCcCz aablakzwał( wzrost czalzmn iC( ctzf dawcz proteiny wiąZączj OPG wynzsaączj 5 ug/dzizń i caęścizwz z(blaZzwała tzn wzrzst przy dawcz proteiny wiąZączj OPG wynzsaącej 25 nd/daleń. (*) - tóZnica dla kznbOli traktzwynzj nzśnikizm (p<0,05). (#) - czaiam iCa przy stoszwamu OPG znaczącz

190 092 różny od poziomu u myszy otrzymującej jedynie taką samą dawkę proteiny wiążącej OPG (P<0,05).

Figura 9. Radiogramy lewej kości udowej i piszczelowej u myszy traktowanych proteiną wiążącą OPG w dawce 0, 5, 25 i 100 (ig dziennie, przez 3,5 dnia. Istnieje zależne od dawki zmniejszenie gęstości kości, najbardziej widoczne w dosiebnej przy nasadzie kości piszczelowej u tych myszy i jest ono szczególnie znaczące przy dawce 100 |ig dziennie.

Figura 10. Sekwencja cDNA mysiego OD AR oraz sekwencja proteiny. Przedstawiona jest sekwencja kwasu nukleinowego klonu cDNA o wielkości około 2,1 kb, a powyżej wskazana jest translacja otwartej ramki odczytu o długości 625 reszt. Hydrofobowy peptyd sygnałowy jest podkreślony, a hydrofobowa sekwencja transbłonowa (reszty 214-234) jest pogrubiona. Reszty cysteiny, zawarte w bogatych w cysteinę powtarzalnych motywach w domenie pozakomórkowej zostały pogrubione.

Figura 11. Immunofluorescencyjne wybarwianie receptora ODAR-Fc przywiązanego do komórek transfekowanych proteiną wiążącą OPG. Komórki COS-7 transfekowane plazmidem ekspresji proteiny wiążącej OPG były inkubowane z ludzkimi IgG Fc (górny panel), ODAR-Fc (środowy panel) lub OPG-Fc (dolny panel). Jako przeciwciało wtórne stosowano kozie przeciwciało przeciw ludzkiej IgG Fc znakowane FITC. Komórki pozytywnie wiążące były badane metodą mikroskopii współogniskowej.

Figura 12. Wpływ ODAR-Fc na generowanie osteoklastów ze mysiego szpiku kostnego w vitro. Hodowle mysiego szpiku kostnego były przygotowane jak w przykładzie 8 i poddane działaniu proteiny wiążącej OPG (5 ng/ml) i CSF-1 (30 ng/ml). Dodawano ODAR-Fc w różnych stężeniach w przedziale od 1500 ng/ml do 65 ng/ml. Tworzenie osteoklastów było badane metodą cytochemiczną TRAP oraz przy użyciu próby rozpuszczania pod wpływem TRAP po 5 dniach hodowli.

Figura 13. Gęstość mineralna kości u myszy po leczeniu ODAR-Fc w różnych dawkach przez cztery dni. Myszy otrzymywały codziemie iniekcje ODAR-Fc w roztworze solanki buforowanym fosforanem. Gęstość mineralna kości była badana w odniesieniu do kości utrwalonych w 70% ETOH w dosiebnej przy nasadzie kości piszczelowej myszy przy użyciu peryferyjnej ilościowej tomografii komputerowej (pQCT) (XCT-960M, Norland Medical Systems, Ft Atkinson, WI). Analizowano dwa przekroje kości wielkości 0,5 mm pobrane 1,5 i 2,0 mm od dosiebnego końca kości piszczelowej (XMICE 5,2, Stratec, Germany) w celu określenia całkowitej gęstości mineralnej kości w przynasadzie. Zastosowano próg 1500 oddzielenia tkanek miękkich w celu ustalenia granicy kości przynasady. Podawanie ODAR-Fc powodowało znaczące zwiększenie gęstości mineralnej kości w dosiebnej nasadzie kości piszczelowej w sposób zalezny od dawki. Grupa n = 4.

Szczegółowy opis wynalazku