CZ359899A3 - Proteiny vázající osteoprotegerin a jejich receptory, příslušné nukleové kyseliny a farmaceutické přípravky, které je obsahují - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká polypeptidů, které se účastní diferenciace osteoklastů. Konkrétně se vynález týká proteinů vázajících osteoprotegerin, nukleových kyselin kódujících tyto proteiny, expresních vektorů a hostitelských buněk pro přípravu těchto proteinů a vazebných testů. Vynález se týká také přípravků a metod k léčení nemocí kostí jako je osteoporóza, ztráta kostní hmot při artritidě, Pagetova nemoc nebo hyperkalcémie.

Vynález se také týká receptorů pro proteiny vázající osteoprotegerin a přípravků a způsobů léčení nemocí kostí pomocí těchto receptorů.

Dosavadní stav techniky

Živá kostní tkáň projevuje dynamickou rovnováhu mezi depozicí a resorpcí kosti. Tyto procesy jsou zprostředkovávány dvěma typy buněk: osteoblasty, které vylučují molekuly vytvářející organickou hmotu kosti, a osteoklasty, které podporují rozpouštění kostní hmoty a solubilizaci kostních solí. U mladých jedinců s rostoucími kostmi rychlost kostní depozice je vyšší než rychlost resorpce kosti, zatímco u starších jedinců je rychlost resorpce vyšší než rychlost depozice. V tomto druhém případě zvýšený rozklad kosti vede ke snížení hmotnosti kosti a jejich pevnosti, zvyšuje riziko fraktur a v případě fraktury zpomaluje nebo znemožňuje obnovu kosti.

Osteoklasty jsou velké fygocytující mnohojademé buňky, které se tvoří z prekurzorů hematopoetické řady v kostní dřeni. Ačkoliv růst a tvorba zralých funkčních osteoklastů nejsou dosud dostatečně prozkoumány, má se za to, že osteoklasty dozrávají společně s buněčnou

5Wt • · • · · řadou monocvty/maktrofágy pod vlivem řady faktorů podporujících růst. Věří se, že časný vývoj prekurzorových buněk kostní dřeně na proosteoklasty je zprostředkován rozpustnými faktory jako jsou nádorový nekrotický faktor a (TNF-α), nádorový nekrotický faktor β (TNF-β), interleukin 1 (IL-1), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6) a leukemický inhibiční faktor (LIF). V buněčné kultuře se proosteoklasty vytvářejí v přítomnosti přidaného faktoru stimulujícicho kolonie makrofágúů (M-CSF). Tyto faktory jsou primárně účinné v raných fázích vývoje osteoklastů. V odborné literatuře není mnoho údajů o polypeptidových faktorech v terminálních stadiích vývoje osteoklastů. Bylo však publikováno, že parathormon stimuluje tvorbu a aktivitu osteoklastů a že kalcitonin má protichůdný' účinek, avšak v menším rozsahu.

Nedávno byl popsán nový póly peptidový faktor nazvaný osteoprotegerin (OPG), který negativně reguluje tvorbu osteoklastů in vitro a in vivo (viz patentová přihláška US 08/577 788 podaná 22. prosince 1995, US 08/706 945 podaná 3. září 1996 a US 08/771 777 podaná 20. prosince 1996, dosud v řízení, a publikace PCT přihlášky WO96/26271). OPG dramaticky zvyšuje hustotu kosti u transgenních myší exprimujících polypeptid OPG a snižuje ztráty kostní hmoty, pokud se podává krysám po ovarietkomii. Analýza aktivity OPG při tvorbě osteoklastů in vitro ukázala, že OPG nijak nepůsobí na růst a diferenciaci prekurzorů monocytů/makrofágů, ale spíše blokuje diferenciaci osteoklastů z prekurzorů monocytů/makrofágů. Takže OPG zřejmě specificky reguluje rozsah tvorby osteoklastů.

OPG obsahuje dvě polypetidové domény, které mají odlišné strukturní a funkční vlastnosti. Aminokoncová doména obsahující přibližně aminokyselinové zbytky 22 až 194 z celkového polypetidu (N-koncový methionin je označen 1) vykazuje homologii s jinými členy rodiny receptorů nádorového nekrotického faktoru (TNFR), zejména TNFR-2, zejména v konzervativní vlastností domén bohatých na cystein, což je charakteristické pro členy rodiny TNFR. Doména karboxylového konce zaujímající aminokyselinové zbytky 194 až 401 neprojevuje významnou homologii s žádnou známou sekvencí. Narozdíl od mnoha dalších členů rodiny TNFR se zdá, že OPG je výlučně secernovaný protein a není zřejmě syntetizován ve formě asociované s membránou.

Na základě jeho aktivity jako negativního regulátoru tvorby osteoklastů se předpokládá, že OPG váže polypeptidový faktor účastnící se diferenciace osteoklastů, a tím blokuje jeden nebo několik terminálních kroků, které vedou k tvorbě zralých osteoklastů.

Bylo proto cílem předkládaného vynálezu identifikovat polypeptidy, které interagují s OPG. Uvedené polypeptidy mohou hrát významnou roli při zrání osteoklastů a mohou být užitečné při léčeni nemocí kostí.

Podstata vynálezu

Byl identifikován nový člen z rodiny nádorového nekrotického faktoru, a sice z cDNA knihovny exprimované v buňkách COS screeningem s rekombinantním fúznim proteinem OPG-Fc jakožto afinitní sondou. Nový protein je transmembránový protein vázající OPG, který je dle predikce dlouhý 316 aminokyselin a má aminokoncovou cytoplasmatickou doménu, transmembránovou doménu a extracelulární doménu na karboxylovém konci. Protein vázající OPG podle vynálezu je buďto protein asociovaný s membránou nebo rozpustný protein.

Předkládaný vynález poskytuje nukleovou kyselinu, která kóduje protein vázající OPG, vektory a hostitelské buňky exprimující polypeptid, a také způsob přípravy¹ rekombinantního proteinu vázajícího OPG. Také poskytuje protilátky nebo jejich fragmenty, které se specificky váží na protein vázající OPG.

Protein vázající OPG lze užít v testech ke kvantifikaci hladiny OPG v biologických vzorcích, k identifikaci buněk a tkání, které mají protein vázající OPG, a také k identifikaci nových členů rodiny proteinů OPG a proteinů vázajících OPG. Vynález také poskytuje působy identifikace • · sloučenin, které interagují s proteinem vázajícím OPG. K takovým sloučeninám patří nukleové kyseliny, peptidy, proteiny, sacharidy, lipidy nebo organické molekuly s malou molekulovou hmotností, které mohou působit buďto jako agonisté nebo antagonisté aktivity proteinů vázajících OPG.

Proteiny vázající OPG se účastní diferenciace osteoklastů a míra aktivity osteoklastů zase moduluje resorpci kosti. Agonisté a antagonisté proteinu vázajícího OPG tedy modulují tvorbu osteoklastů a resorpci kosti a mohou se tedy užít k léčení nemocí kostí se změnami resorpce kosti jako je např. osteoporóza, hyperkalcémie, ztráta kosti díky artritickým metastázám, imobilizace nebo nemoci periostu, Pagetova nemoc, osteopetróza, ztráty způsobené protézou a pod. Farmaceutické přípravky obsahující proteiny vázající OPG a agonisty a antagonisty proteinů vázajících OPG jsou také předmětem vynálezu.

Receptory pro proteiny vázající OPG byly také identifikovány z myší cDNA knihovny zkonstruované z buněk kostní dřeně, které se vázaly na fluorescenčně označené proteiny vázající OPG. Receptory se mohou užít k identifikaci agonistů a antagonistů interakce proteinů vázajících OPG s jejich receptory, což může být využito k léčení nemocí kostí.

Přehled obrázků

Obr. 1. Struktura a sekvence inzertu 32D-F3 kódujícího protein vázající OPG. Podtrženy jsou predikovaná transmembránová doména a místa pro sacharidové řetězce vázané na asparagin.

Obr. 2. Exprese proteinu vázajícího OPG v buňkách COS-7 transfekovaných pcDNA/32D-F3. Buňky byly transfekovány pcDNA/32DF3 za pomoci lipofektinu a pak podrobeny testu na vazbu s kozí antihumánní IgGl konjugovanou s alkalickou fosfatázou (sekundární samotná), humánní OPG (22-201)-Fc a sekundární (OPG-Fc) nebo • · · chimérickým fúzním proteinem extracelulární doména ATAR-Fc (sATARFc). ATAR je nový člen superrodiny TNFR a fúzní protein sATAR-Fc sloužil jako kontrola jak pro vazbu humánní domény IgGl-Fc tak pro vazbu generického proteinu příbuzného TNFR k molekule buněčného povrchu 32D.

Obr. 3. Exprese proteinu vázajícího OPG v lidských tkáních. Analýza mRNA lidských tkání (Clontech) northemovým přenosem pomocí radioaktivně značené hybridizační sondy 32D-F3. Relativní molekulová hmotnost je uvedena vlevo v tisících párů baží (kb). Šipka na pravé straně ukazuje migraci transkriptu o velikosti asi 2,5 kb detekovaného v mRNA z lymfatických uzlin. Také ve fetálních játrech byl detekován velmi slabý pás stejné velikosti.

Obr. 4; Struktura a sekvence inzertu pcDNA/huOPGbp 1.1 kódujícího humánní protein vázající OPG. Podtrženy jsou predikovaná transmembránová doména a místa pro sacharidové řetězce vázané na asparagin

Obr. 5. Stimulace vývoje osteoklastů in vitro ze společných kultur makrofágů kostní dřeně a buněk ST2 ošetřených rekombinantním myším proteinem vázajícím OPG (158-316). Kultury byly ošetřeny rekombinantním myším proteinem vázajícím OPG v různých koncentracích od 1,6 do 5600 ng/1. Po 8 až 10 dnech byly kultury lyžovány a byla měřena aktivita TRAP. Kromě toho byly některé kultury simultánně ošetřeny 1, 10, 100, 500 a 1000 ng/1 rekombinantního proteinu myší OPG (22-401)-Fc. Myší protein vázající OPG indukovali stimulaci tvorby osteoklastů závislou na dávce, zatímco OPG (22-401)-Fc inhiboval tvorbu osteoklastů.

t>

Obr. 6. Stimulace in vitro vývoje osteoklastů z prekurzorů v kostní dřeni v přítomnosti M-CSF a myšího proteinu vázajícího OPG (158-316). Kostní dřeň myší byla odebrána a kultivována v přítomnosti 250, 500, 1000 a 2000 U/ml M-CSF. Ke stejným kulturám byl přidán protein vázající OPG v různých koncentracích, od 1,6 do 500 ng/ml. Vývoj osteoklastů byl měřen pomocí testu TRAP.

Obr. 7. Osteoklasty odvozené z buněk kostní dřeně v přítomnosti jak M-CSF tak proteinu vázajícího OPG( 158-316) resorbují kost. in vitro. Buňky kostní dřeně ošetřené buďto M-CSF nebo proteinem vázajícím OPG nebo oběma faktory současně, byly vysety na plátky kosti v jamkách kultivačních destiček a byly ponechány, aby se vyvinuly ve zralé osteoklasty. Výsledné kultury byly obarveny toluidinovou modří (levý⁷ sloupec) nebo histochemickým barvením pro detekci enzymové aktivity TRAP (pravý sloupec). V kultuře ošetřené oběma faktor}’ se tvořily zralé osteoklasty, které byly schopny erodovat kost, jak lze soudit podle modře zbarvených jamek na povrchu kosti. To korelovalo s přítomností značného počtu velkých mnohajaderných buněk pozitivních na TRAP.

Obr. 8. Graf ukazuje hladinu ionizovaného kalcia (iCa) v krvi u myší injikovaných proteinem vázajícím OPG, a sice 51 hodin po první injekci, a myší, kterým se také podával konkurenční OPG. Protein vázající OPG významně zvýšil hladinu iCA způsobem závislým na dávce. OPG (1 mg/kg/den) zcela blokoval zvýšení iCA v dávce proteinu vázajícího OPG 5 pg/den, a částečně blokoval zvýšení v dávce OPG 25 pg/den (*) rozdíl ve srovnání s kontrolou léčenou jen vehikulem (p<0,05), ( #) hladina iCA po podávání OPG se průkazně liší od hladiny u myší, které dostávaly jen samotnou dávku proteinu vázajícího OPG (p<0,05).

Obr. 9. Radiografíe levého femuru a tibie myší, kterým byl podáván protein vázající OPG v dávkách 0, 5, 25 nebo 100 pg/den po 3,5 dne. Je patrné snížení hustoty kosti závislé na dávce, viditelné nejzřetelnéji v proximální metafyze tibie a zcela pronikavě při dávce 100 pg/den.

Obr. 10. Sekvence ODAR cDNA myši a příslušná proteinová sekvence. Je zde ukázána sekvence cDNA klonu velikosti asi 2,1 kb a translace otevřeného čtecího rámce 625 aminokyselinových zbytků. Hydrofobní signální peptid je podtržen a hydrofobní transmembránová sekvence (zbytky 214 až 234) jsou uvedeny tučně. Cvsteinové zbytky obsažené v opakovaných motivech bohatých na cystein v extracelulární doméně jsou také tučně.

Obr. 11. Imunofluorescenční značení vazby ODAR-Fc na buňky transfekované proteinem vázajícím OPG. Buňky COS-7 transfekované expresním plazmidem proteinu vázajícího OPG byly inkubován}⁷ s lidským IgG Fc (horní panel), ODAR-Fc (střední panel) nebo OPG-Fc (spodní panel). Jako sekundární protilátka byla užita kozí anti-humánní IgGFc značná FITC. Pozitivně navázané buňky byly vyšetřeny konfokálním mikroskopem.

Obr. 12. Účinek ODAR-Fc na tvorbu osteoklastů v kostní dřeni myši in vitro. Kultur}· z myší kostní dřeně byly založeny jak bylo popsáno v příkladu 8 a exponovány proteinu vázajícímu OPG (5 mg/ng/ml) a CSF1 (30 ng/ml). Byly přidány různé koncentrace ODAR-Fc od 1500 ng/ml do 65 ng/ml. Tvorba osteoklastů byla vyhodnocena cytochemickým stanovením TRAP a testem TRAP po 5 dnech v kultuře.

Obr. 13. Denzita kostního minerálu u myší po 4 denním podávání ODAR-Fc v různých dávkách. Myši dostávaly ODAR-Fc denně v subkutánní injekci ve vehikulu s fosfátem pufrovaným fyziologickým • · roztokem. Minerální denzita byla stanovena z kostí fixovaných v 70% etanolu v úrovni proximální tibiální metafýzy pomocí kvantitativní počítačové tomografie (pQCT) zařízením XCT-960M (Norland Medical Systems, F. Atkinson, WI). Dva 0,5mm příčné řezy kosti, 1,5 mm a 2,0 mm od proximálního konce tibie byly analyzovány (XMICE 5,2, Stratec, Germany) ke stanovení celkové denzity kostního minerálu v metafýze. Pro definici hranice metafýzy kosti byl užit přáli separace měkké tkáně 1500. ODAR-Fc vedl k významnému zvýšení denzity kostního minerálu v proximální tibiální metafýze způsobem závislým na dávce. Skupina obsahovala 4 objekty (n=4).

Detailní popis vynálezu

Vynález poskytuje polypeptid označovaný jako protein vázající OPG, který’ specificky váže OPG a účastní se diferenciace osteoklastů. Klon cDNA kódující myší formu polypeptidu byl identifikován v knihovně připravené z linie myších myelomonocytů 32-D a byl transfekován do buněk COS. Buňky po transfekci (transfektanty) byly podrobeny screeningu na schopnost vázat fúzní polypeptid OPG (22-201)-Fc (Příklad 1). Sekvence nukleové kyseliny odhalila, že protein vázající OPG je nový člen rodiny TNF a je nejblíže příbuzný AGP-1, což je polypeptid popsaný v patentové přihlášce US 08/660 562 podané 7. června 1996, která je v řízení (Polypeptid identický s AGP-1 byl také popsán jako TRAIL ve Wiley et al., Immunity 3; 673-682, 1995). Předpokládá se, že protein vázající OPG je transmembránový protein typu II, který má cytoplasmatickou doménu na svém aminokonci, transmembránovou doménu a extracelulámí doménu na karboxylovém konci (Obr. 1). Aminokoncová cytoplasmatická doména obsahuje aminokyselinové zbytky’ 1 - 48, transmembránová doména zbytky 49 - 69 a extracelulámí doména zbytky 70 - 316 jak je ukázáno na obr. 1 (sekvence identifikačního čísla 1). Protein asociovaný s membránou specificky váže OPG (obr. 2). Takže OPG a protein vázající OPG mají mnoho typických vlastností páru receptor-ligand, ačkoliv je možné, že existují i jiné přirozeně se vyskytující receptory pro protein vázající OPG.

Klon kódující lidský protein vázající OPG byl izolován z cDNA knihovny lymfatických uzlin. Lidská sekvence (Obr. 4) je homologní k myší sekvenci. Purifikovaný myší protein vázající OPG stimuloval tvorbu osteoklastů in vitro a indukoval hyperkalcemii a resorpci kosti in vivo.

Protein vázající OPG označuje polypeptid, který' má aminokyselinovou sekvenci savčího proteinu vázajícího OPG, nebo jeho fragment nebo jeho analog nebo derivát, mající alespoň vazebnou aktivitu k OPG. Ve výhodném provedení vynálezu je protein vázající OPG myší nebo lidský protein. V jiném provedení vynálezu je protein vázající OPG rozpustný protein mající v jedné formě izolovanou extracelulární doménu oddělenou od cytoplasmatické a transmembránové domény. Protein vázající OPG se účastní diferenciace osteoklastů a ovlivňuje rychlost a rozsah resorpce kosti, a bylo také zjištěno, že stimuluje tvorbu osteoklastů a resorpci kosti.

Nukleové kyseliny

Předkládaný vynález poskytuje izolované nukleové kyseliny kódující proteiny vázající OPG. Termín „nukleové kyseliny“ v textu přihlášky zahrnuje cDNA, genomovou DNA, plně nebo částečně syntetickou DNA a také RNA. Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou vybrány ze skupiny obsahující:

a) nukleovou kyselinu uvedenou na obr. 1 (sekvence i. č. 1) a na obr. 4 (sekvence i. č. 2),

b) nukleovou kyselinu, která hybridizuje s polypeptid kódujícím úsekem nukleových kyselin uvedených na obr. 1 (sekvence i. č. 1) a na obr. 4 (sekvence i. č. 2), a zůstává hybridizována k nukleovým kyselinám i ve vysoce stringentních (přísných) podmínkách, a

c) nukleové kyseliny degenerované vzhledem k nukleovým kyselinám v a) nebo b).

• ·

Hybridizace nukleových kyselin typicky zahrnuje mnohakrokový proces, který obsahuje první hybridizační krok, kdy se vytvoří duplex nukleové kyseliny z jednoduchých řetězců, a po té následuje druhý hybridizační krok, prováděný za přísnějších (více stringentních) podmínek, aby se selektivně udržely jen ty duplexy DNA, které mají požadovanou homologii. Podmínky prvního hybridizačního kroku obecně nejsou rozhodující, za předpokladu, že se první hybridizace neprovádí v přísnějších podmínkách než druhá hybridizace. Obecně se druhá hybridizace provádí v přísnějších podmínkách, tj. s vysokou stringencí, přičemž termín „vysoká stringence“ znamená takové podmínky teploty a koncentrace solí, které jsou asi 12 - 20 °C pod bodem tání (Tm) perfektního hybridu části nebo celého komplementárního řetězce odpovídajícího sekvenci na obr. 1 (sekvence i. č. 1) a na obr. 4 (sekvence i. č. 2). V jednom provedení „vysoká stringence“ znamená podmínky⁷ teploty 65 °C a ne vyšší koncentraci než 1M Na+. Odborníkovi je zřejmé, že koncentrace solí, teplota a/nebo délka inkubace se mohou měnit v první nebo druhé hybridizaci tak, aby se získaly hybridizující nukleové kyseliny podle vynálezu. Podmínky hybridizaci a výpočet Tm jsou popsány v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989).

Nukleové kyseliny podle vynálezu hybridizují s celým nebo částí kódující ho úseku sekvence proteinu vázajícího OPG uvedeného na obr. 1 (sekvence i. č. 1) a na obr. 4 (sekvence i. č. 2), a tudíž mohou existovat zkrácené verze nebo naopak prodloužené verze uvedených sekvencí nukleových kyselin. Zkrácené nebo naopak prodloužené nukleové kyseliny jsou také předmětem předkládaného vynálezu, za předpokladu, že si uchovávají alespoň vlastnost vázat OPG. V jednom provedení vynálezu nukleová kyselina kóduje polypeptid obsahující alespoň 10 aminokyselin. V jiném provedení vynálezu nukleová kyselina kóduje polypeptid obsahující alespoň 20 aminokyselin. V ještě dalším provedení vynálezu nukleová kyselina kóduje polypeptid obsahující alespoň 50 aminokyselin.

• ·

Hybridizující sekvence nukleové kyseliny může také obsahovat nekódující sekvence lokalizované na 3'- a/nebo 5'-konci úseku kódujícího protein vázající OPG. Nekódující sekvence obsahují regulační úseky účastnící se exprese proteinu vázajícího OPG, jako jsou promotory, zesilovací úseky (enhancery), místa počátku translace, místa terminace translace a pod.

Ve výhodném provedení vynálezu nukleové kyseliny kódují myší nebo lidský protein vázající OPG. Nukleové kyseliny kódují buďto formu proteinu vázajícího OPG vázanou na memebránu nebo rozpustnou formu, která postrádá funkční transmembránovou oblast. Predikovaný transmembránový úsek myšího proteinu vázajícího OPG zahrnuje aminokyselinové zbytky 49 -69 včetně, jak je ukázáno na obr. 1 (sekvence i. č. 1). Predikovaný transmembránový úsek lidského proteinu vázajícího OPG zahrnuje aminokyselinové zbytky 49 -69 včetně, jak je ukázáno na obr. 4 (sekvence i. č. 2.). Lze předpokládat, že substituce, které vedou k náhradě hydrofobního aminokyselinového zbytku v tomto úseku neutrálním nebo hydrofilním aminokyselinovým zbytkem, zruší asocoaci s membránou a povedou ke vzniku rozpustného proteinu vázajícího OPG. Kromě toho lze také předpokládat, že delece části nebo celého transmembránového úseku povedou také ke vzniku rozpustného proteinu vázajícího OPG. Nukleové kyseliny kódující aminokyselinové zbytky 70-316 podle obr. 1 (sekvence i. č. 1), nebo jejich fragmenty či analog}⁷, představují rozpustné proteiny vázající OPG.

Nukleové kyseliny kódující zkrácené formy lidského rozpustného proteinu vázajícího OPG jsou také předmětem vynálezu. Rozpustné formy obsahují aminokyselinové zbytky 69 - 317 sekvence uvedené na obr. 4 (sekvence i. č. 2) a její zkrácené formy. V jednom provedení zkrácení na N-konci vede ke vzniku polypeptidů obsahujících aminokyselinové zbytky 70 - 317, 71 - 317, 72 - 317 atd. V jiném provedení vynálezu nukleové kyseliny kódují rozpustný protein vázající OPG obsahujíc aminokyselinové zbytky 69 - 317 a jeho verzi zkrácenou na N-konci obsahující aminokyselinové zbytky 158-317 nebo alternativně 166 - 317.

Plazmid phuOPGbp 1.1. kódující lidský protein vázající OPG v E. coli kmene DPI 10 byl uložen v Americké sbírce mikroorganismů (American Type Culture Collection, Rockville, MD) dne 13 června 1997.

Nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou užít k detekci sekvencí kódujících protein vázající OPG v biologických vzorcích. Zvláště se sekvence mohou užít k vyhledávání sekvencí příbuzných proteinu vázajícímu OPG v knihovnách cDNA a genomové DNA, zejména z jiných biologických druhů. Nukleové kyseliny podle vynálezu jsou také vhodné k modulování hladiny proteinu vázajícího OPG pomocí tzv. „antisense“ technologie nebo genové exprese in vivo. Vývoj transgenních zvířat exprimujících protein vázající OPG je užitečný pro přípravu polypeptidu a také pro zkoumání biologické aktivity tohoto polypeptidu in vivo.

Vektory’ a hostitelské buňky

Nukleové kyseliny podle vynálezu jsou spojeny s jinými sekvencemi DNA tak, aby exprimovaly biologicky aktivní protein vázající OPG. Sekvence potřebné pro expresi jsou v oboru známy a patří k nim promotory a enhancery pro iniciaci syntézy RNA, místa terminace translace, vazebná místa ribosomů pro iniciaci translace a tzv. vedoucí sekvence, které umožňují sekreci. Sekvence řídící expresi a sekreci proteinu vázajícího OPG mohou být homologní, tj. sekvence identické nebo podobné sekvencím v genomu vedoucím k expresi a sekreci proteinu vázající OPG, nebo jsou to sekvence heterologní. Pro expresi proteinu vázajícího OPG je k dispozici celá řada plazmidových vektorů (viz např. Methods in Enzymology, vol. 185, Goeddel, D.V. (ed.), Academie Press, 1990). Pro expresi v savčí hostitelské buňce je výhodné provedení plazmid pDSRa popsaný v přihlášce PCT 90/14363. Výhodné provedení pro expresi v bakteriální hostitelské buňce obsahuje plazmidy nesoucí promotor lux (viz patentová přihláška US 08/577 778, podaná 22. prosince 1995, nyní v řízení)

Vynález také poskytuje prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky, které exprimují protein vázající OPG. K hostitelským buňkám patří bakteriální, kvasinkové, rostlinné, hmyzí nebo savčí buňky. Protein vázající OPG může být také produkován v transgenních zvířatech jako jsou myši nebo kozy. Plazmidy a vektory obsahující nukleové kyseliny podle vynálezu se vloží do vhodných hostitelských buněk pomocí transfekce nebo transformace způsobem, který⁷ je odborníkovi znám. Hostitelské buňky obsahují sekvence DNA kódující protein vázající OPG podle obr. 1 nebo jeho část, jako je např. extracelulární doména nebo cytoplasmatická doména. Nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou modifikovat záměnou kodonu, které umožní optimální expresi v daném hostiteli. Alespoň nějaký z těchto kodonu je tzv. preferenční kodon, který nemění aminokyselinovou sekvenci a nalézá se často v genech, které jsou silně exprimovány. Avšak je zřejmé, že tyto alterace kodonů pro optimalizaci exprese nejsou omezeny na vložení preferenčních kodonů. K příkladům výhodných savčích hostitelských buněk pro expresi proteinu vázajícího OPG patří buňky COS, CHOd-, 293 a 3T3, přičemž tento výčet není omezující. Výhodné bakteriální hostitelské buňky jsou E. coli.

Polypeptidy

Předkládaný vynález poskytuje protein vázající OPG jako produkt prokaryotické nebo eukaryotické exprese exogenní sekvence DNA, tzn. protein vázající OPG je rekombinantní protein vázající OPG. K exogenním sekvencím patří sekvence cDNA, genomové DNA a syntetické DNA. Protein vázající OPG může být produkt exprese v bakteriální, kvasinkové, rostlinné, hmyzí nebo savčí buňce nebo se může produkovat v bezbuněčných translačních systémech. Protein vázající OPG produkovaný v bakteriích má N-koncový methioninový zbytek.

Vynález dále poskytuje způsob přípravy proteinu vázajícího OPG, který⁷ obsahuje kroky, kdy se kultivují prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky transformované nebo transfekované nukleovými kyselinami kódujícími protein vázající OPG a izoluje se polypeptidový expresní produkt těchto nukleových kyselin.

Polypeptidy, které jsou savčími proteiny vázajícími OPG nebo jejich fragmenty, analogy nebo deriváty jsou také předmětem předkládaného vynálezu. Ve výhodném provedení je protein vázající OPG lidský protein vázající OPG. Fragment proteinu vázajícího OPG znamená polypeptid, který má deleci jedné nebo několika aminokyselin takové, že výsledný polypeptid má alespoň vlastnost, že váže OPG. Uvedené fragmenty mají delece začínající z aminokonce, z karboxylového konce nebo jsou deletovány vnitřní úseky polypeptidů. Fragmenty proteinu vázajícího OPG jsou dlouhé přinejmenším 10 aminokyselin, výhodně přinejmenším 20 aminokyselin a ještě výhodněji přinejmenším 50 aminokyselin. Ve výhodném provedení vynálezu protein vázající OPG má deleci jedné nebo několika aminokyselin z transmembránového úseku (aminokyselinové zbytky 49 - 69 podle obr. 1), nebo alternativně jednu nebo několik aminokyselin z aminokoncového úseku až po transmembránový úsek a/nebo včetně tohoto transmembránového úseku (aminokyselinové zbytky 1-49 podle obr. 1). V jiném provedení vynálezu je protein vázající OPG rozpustný protein obsahující např. aminokyselinové zbytky 69 - 316 nebo

- 316 nebo N-koncové nebo C-koncové zkrácené formy, které si uchovávají vazebnou aktivitu pro OPG. Protein vázající OPG je také lidský rozpustný protein uvedený⁷ na obr. 4 obsahující aminokyselinové zbytky 69 - 317, a jeho N-koncové zkrácené formy např. 70 - 517, 71 - 517,

- 517, 72 - 517 atd. Ve výhodném provedení rozpustný⁷ lidský protein vázající OPG obsahuje aminokyselinové zbytky 69-317 a N-koncovou zkrácenou formu proteinu vázajícího OPG (158 -317) nebo alternativně (166-317).

Analog proteinu vázajícího OPG znamená polypeptid, který má substituci nebo adici jedné nebo několika aminokyselin takové, že výsledný polypeptid má alespoň tu vlastnost, že váže OPG. Uvedené analogy mají adici nebo substituci v libovolném místě polypeptidů.

K výhodným analogům patří ty, které představují rozpustné proteiny vázající OPG. Fragmenty nebo analogy mohou být přirozeně se vyskytující, jako jsou např. polypeptidové produkty alelických variant, nebo mohou být zkonstruovány pomocí technik pro manipulace a syntézu nukleových kyselin, které jsou odborníkovi známy. Polypeptidy mohou, ale nemusejí, mít aminokoncový methioninový zbytek.

Vynález také zahrnuje deriváty proteinů vázajících OPG, které jsou polypeptidy, které prošly posttranslačními modifikacemi (např. adice N-vázaného nebo O-vázaného řetězce cukru, opracování N-konce nebo C-konce), připojení chemických zbytků k aminokyselinové kostře, chemické modifikace N-vázaného nebo O-vázaného řetězce cukru a adice N-koncového methioninového zbytku jakožto výsledek exprese v prokaryotické hostitelské buňce. Zvláště lze uvazovat o takových chemicky modifikovaných derivátech proteinů vázajících OPG, které poskytují další výhodnou vlastnost, jako je zvýšená stabilita, delší doba cirkulace, nebo snížená imunogeničnost. Zvláště užitečné jsou modifikace s vodou rozpustnými polymery jako je polyetylénglykol a jeho deriváty (viz např. Patent US 4 179 337). Chemické skupiny pro derivatizaci se mohou vybrat z ve vodě rozpustných polymerů jako je polyteylénglykol, kopolymer}⁷ etlénglykol/propylénglykol, karboxymetylcelulóza, dextran, polyvinylalkohol a pod. Polypeptidy se mohou modifikovat v náhodných pozicích uvnitř molekuly nebo na předem určených místech molekuly a mohou obsahovat jednu, dvě nebo více připojených chemických zbytků. Polypeptidy se mohou také modifikovat na předem určeném místě polypeptidu jako je např. aminokonec, nebo na vybraném argininovém nebo ly sinovém zbytku polypeptidu. K jiným chemie kým modifikacím patří dále detekovatelné značky, jako jsou enzymatické, fluorescenční, isotopové neb afinitní značky, které slouží k detekci nebo izolaci proteinu.

Vynález také zahrnuje chimérické proteiny vázající OPG, které obsahují část nebo celou aminokyselinovou sekvenci proteinu vázajícího OPG fúzovanou s heterologní aminokyselinovou sekvencí. Heterologní • * · ·« ·» fl «·· sekvence je jakákoliv sekvence, která dovoluje, aby si výsledný protein uchoval alespoň vazebnou aktivitu pro OPG. Ve výhodném provedení vynálezu extracelulární doména karboxylového konce proteinu vázajícího OPG je fúzována s heterologní sekvencí. Takové sekvence zahrnují heterologní cytpolasmatické domény, které dovolují alternativní intracelulámí signální událost, sekvence, které podporují oligomerizaci jako úsek Fc z IgG, enzymové sekvence, které poskytují značku polypeptidu, a sekvence, které poskytují afinitní sondu, jako je např. specifická vazba antigen-protilátka.

Popypeptidy podle předkládaného vynálezu se izolují a purifikují z tkání a buněčných linií, které exprimují protein vázající OPG, buďto extrakcí z lyzátů nebo upravených kultivačních médií a nebo z transformovaných hostitelských buněk exprimujících protein vázající OPG. Protein vázající OPG se může získat z myší myelomonocytové linie 32-D (ATCC č. CRL-11346). Lidský’ protein vázající OPG nebo nukleová kyselina kódující tento protein mohou být izolovány z lidských lymfatických uzlin nebo z tkáně fetálních jater. Izolovaný protein vázající OPG není asociován s jinými lidskými proteiny ani jinými složkami buňky.

Předmětem vynálezu je také způsob purifikace proteinu vázajícího OPG z přirozených zdrojů (např. tkání a buněčných linií, které normálně exprimují protein vázající OPG) a z transfekovaných hostitelských buněk. Pro získání purifikováného proteinu je možné využít jeden nebo několik standardních kroků purifikace v odpovídajícím pořadí. K chromatografickým krokům patří iontová výměna, gelová filtrace, hydrofobní interakce, chromatografie s reverzní fází, chromatofokusing, afinitní chromatografie užívající protilátku typu anti-protein vázající OPG nebo afinitní komplex streptavidin-biotin a pod.

Protilátky’

Předkládaný vynález zahrnuje také protilátky⁷ vázající specificky polypeptidy podle vynálezu. Protilátky lze získat imunizací celým • · proteinem vázajícím OPG, nebo rozpustnou formou proteinu vázajícího OPG nebo jejich fragmentem. Protilátky podle vynálezu jsou polyklonální nebo monoklonální protilátky, nebo jsou to rekombinantní protilátky, jako jsou např. chimérické protilátky, kde myší konstantní úseky těžkých a lehkých řetězců jsou nahrazeny lidskými sekvencemi, nebo tzv. CDR-roubované protilátky, kde pouze komplementaritu určující úseky jsou myšího původu. Protilátky podle vynálezu mohou být také lidské protilátky připravené např. imunizací transgenních zvířat schopných produkovat lidské protilátky (viz např. patentová přihláška PCT WO93/12227). Protilátky jsou užitečné pro detekci proteinu vázajícího OPG v biologických vzorcích, což umožňuje identifikaci buněk nebo tkání, které produkují tento protein. Navíc protilátky, které se váží na protein vázající OPG a blokují tak interakci s jinými vazebnými sloučeninami mohou mít terapeutické využiti v modulaci diferenciace osteoklastů a resorpce kosti.

Protilátky proti proteinu vázajícímu OPG jsou užitečné k léčení nemocí kosti jako je osteoporóza nebo Pagetova nemoc. Protilátky se mohou testovat na vazbu k proteinu vázajícímu OPG v přítomnosti nebo nepřítomnosti OPG a tak se může vyšetřovat jejich schopnost inhibovat ligandem (tj. proteinem vázajícím OPG) zprostředkovanou tvorbu osteoklastů a/nebo resorpci kosti. Lze také čekat, že peptidy mohou působit jako antagonisté interakce ligand:receptor a inhibovat ligandem zprostředkovanou tvorbu osteoklastů, a pro tentýž účel lze užít i proteiny vázající OPG.

Přípravky

Předkládaný vynález poskytuje také farmaceutické přípravky, které obsahují terapeuticky účinné množství proteinu vázajícího OPG podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným ředidlem, povrchově aktivní látku, nosičem, emulgátorem, konzervantem a/nebo adjuvans. Vynález také poskytuje farmaceutický' přípravek, který obsahuje • · • · terapeuticky účinné množství agonisty nebo antagonisty proteinu vázajícího OPG. Termín „terapeuticky účinné množství“ znamená množství, které vede k terapeutickému účinku za specifických podmínek a způsobu podávání. Přípravek podle vynálezu může být ve formě kapalné nebo lyofilizované a obsahuje rozpouštědla (Tris, aetátový nebo fosfátový? pufr) mající různé hodnoty pH a iontové síly, smáčedla, jako je Tween nebo Polysorbate, nosiče, jako je lidský sérový albumin nebo želatina, konzervanty, jako thimerosal nebo benzylakohol, a antioxidanty, jako je kyselina askorbová nebo disiřičitan sodný. Výběr konkrétního složení závisí na řadě faktorů jako je stav, který se má léčit, způsob podávání a požadované farmakokinetické parametry. Podrobnější přehled vhodných složek pro farmaceutické přípravky lze nalézt v příručce Remington's Pharmaceutical Sciences (18 th ed., A.R.Genaro, ed., Mack, Easton, PA 1980).

Výhodné provedení vynálezu poskytuje přípravky, které obsahují rozpustné proteiny vázající OPG. Vynález zahrnuje také přípravky, které obsahují rozpustné proteiny vázající OPG modifikované vodou rozpustnými polymer}? pro zvýšení rozpustnosti, plasmatického poločasu a biologické dostupnosti. Přípravky mohou také obsahovat rozpustné proteiny vázající OPG vložené do liposomů, mikroemulzí, micel nebo vesikulů pro řízené podávání s dlouhodobým účinkem. Rozpustné proteiny vázající OPG mohou být také formulovány do mikročástic vhodných k pulmonárnímu podávání.

Přípravek podle vynálezu se může podávat injekcí, a sice subkutánní, intravenózní nebo intramuskulámí, nebo cestou perorální, nasální, pulmonární nebo rektální. Vybraný způsob podávání nakonec závisí na řadě faktorů a odborník ho snadno určí.

Předkládaný vynález dále poskytuje farmaceutický přípravek, který obsahuje terapeuticky' účinné množství nukleových kyselin podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným adjuvans. Přípravky nukleových kyselin jsou vhodné k podávání buďto části nebo celé kódující oblasti proteinu vázajícího OPG a/nebo přilehlých úseků do buněk a tkání jakožto součást „antisense“ léčebného režimu.

Způsoby použití

Protein vázající OPG se může použít v řadě různých testů pro detekci OPG a charakterizaci interakcí s OPG. Obecně testy spočívají v tom, že se inkubuje protein vázající OPG s biologickým vzorkem obsahujícím OPG v podmínkách, které dovolují navázání OPG na protein vázající OPG, a pak se měří rozsah vazby. OPG může být buď v purifikované formě nebo přítomen ve směsi jako je tomu v tělních tekutinách nebo v kultivačním médiu. Testy mohou být buďto kvalitativní nebo kvantitativní, přičemž kvantitativní testy jsou užitečné pro stanovení parametrů (afinitní konstatnta a kinetika) vazby OPG a proteinu vázajícího OPG a pro kvantifikaci hladiny biologicky aktivního OPG ve směsi. Testy se také mohou užít k hodnocení vazby OPG k fragmentům, analogům a derivátům proteinu vázajícího OPG a k identifikaci nových členů rodiny OPG a proteinů vázajících OPG.

Navázání OPG na protein vázající OPG lze provádět v různých formách testů, např. jako buněčný vazebný test, membránový vazebný test, test v roztoku nebo imunotest. Obecně shrnuto, stopové množství značeného OPG se inkubuje se vzorky proteinu vázajícího OPG po určitou dobu, a pak se měří množství navázaného OPG pomocí filtrace, elektrochemiluminiscence (ECL, systém ORIGEN firmy IGEN), buněčným testem nebo imunotestem. Lze také užít homogenní radioaktivní test (SPA, Amersham) nebo časově rozlišenou fluorescenci (HTRF, Packard). Vazba je detekována pomocí značení OPG nebo protilátky anti-OPG radioaktivním izotopem (¹²⁵I, ³⁵S, ³H), fluorescnčním barvivém (fluorescein), cheláty lathanidu (Eu³⁺) nebo kryptáty, komplex}⁷ orbipyridylrutenia (Ru²⁺). Je jasné, že výběr druhu značení je závislý na použitém detekčním systému. Alternativně může být OPG modifikován epitopovou značkou (např. biotin, peptidy, Hísó, myc) a navázán na • · · · protein jako je např. streptavidin, antipeptidová nebo antiproteinová protilátka, který nese značku, jak byly popsány výše.

V alternativním způsobu může být protein vázající OPG testován přímo v imunotestech použitím polyklonálních nebo monoklonálních protilátek k proteinům vázajícím OPG. Další formy proteinů vázajících OPG obsahující epitopové značky, které byly zmíněny výše, se mohou užít v testech v roztoku a imunotestech.

Způsoby k identifikaci sloučenin, které interagují s proteiny vázajícími OPG, jsou také předmětem vynálezu. Způsob podle vynálezu obsahuje inkubaci proteinu vázajícího OPG se sloučeninou v podmínkách, které dovolují navázání sloučeniny na protein vázající OPG, a pak měřeni rozsahu vazby. Sloučenina může být buď v purifikované formě nebo přítomna v surové směsi. Vázající se sloučeniny mohou být nukleové kyseliny, proteiny, peptidy, cukry, lipidy nebo organické sloučeniny s malou molekulovou hmotností. Sloučeniny lze dále charakterizovat podle jejich schopnosti zvyšovat nebo snižovat aktivitu proteinu vázajícího OPG, aby bylo možné stanovit, zda působí jako agonisté nebo antagonisté.

Proteiny vázající OPG jsou dále užitečné k identifikaci intracelulámích proteinů, které interagují s cytoplasmatickou doménou, a sice v testu s kvasinkovým dvojitým hybridem. Např. hybridní konstrukty obsahující DNA kódující 50 aminokyselin N-konce proteinu vázajícího OPG fúzované s DNA-vazebnou doménu genu GAL4 kvasinky se mohou užít jako dvouhybridový plazmid. Pozitivní klony získané takovým screeningem se dále charakterizují, aby se identifikoval interagující protein. Takové informace jsou pak užitečné k určení intracelulámího signálního mechanismu spojeného s proteinem vázajícím OPG a poskytují intracelulámí cíle pro nová léčiva, která modulují resorpci kosti.

Proteiny vázající OPG se mohou užit k léčení nemocí, které jsou charakterizovány nadměrnou hustotou kosti. Nejobvyklejší takovou

* · nemocí je osteopetróza, což je nemoc, při který genetická porucha vede ke zvýšené hustotě kostí, která je obvykle fatální v několika prvních letech života. Osteopetrózu je možné výhodně léčit podáváním rozpustné formy proteinu vázajícího OPG.

Předkládaný vynález také poskytuje modulátory (agonisty a antagonisty) proteinu vázajícího OPG a způsoby jejich přípravy. Modulátor proteinu vázajícího OPG buďto zvyšuje nebo snižuje alespoň jednu aktivitu spojenou s proteinem vázajícím OPG, např. schopnost vázat OPG nebo jinou interagující molekulu nebo regulovat zrání osteoklastů. Typicky agonistou nebo antagonistou může být kofaktor, jako je např. protein, peptid, cukr, lipid nebo organická sloučenina s malou molekulovou hmotností, který interaguje s proteinem vázajícím OPG, a tím reguluje jeho aktivitu. K potenciálním polypeptidovým antagonistům patří protilátky, které reagují buďto s rozpustnou nebo na membránu vázanou formou proteinu vážícího OPG, a rozpustné formy proteinu vážícího OPG, které obsahují celou nebo aspoň část extracelulární domény proteinu vážícího OPG. K molekulám, které regulují expresi proteinu vážícího OPG typicky patří nukleové kyseliny, které jsou komplemetární k nukleovým kyselinám kódujícím protein vážící OPG a které působí jako anti-sense regulátor}- exprese.

Protein vážící OPG se podílí na řízení tvorby zralých osteoklastů, primárního buněčného typu podílejícího se na resorpci kosti. Zvýšení rychlosti resorpce (nad rychlost tvorby kosti) může vést k různým poruchám a nemocem kostí, které jsou souhrnně nazývány osteopenie a patří k nim osteoporóza, osteomyelitida, hyperkalcémie, osteopenie způsobená chirurgickým zákrokem nebno podáváním steroidů, Pagetova nemoc, osteonekróza, ztráta kostní hmoty v důsledku revmatoidní artritidy, periodontální ztráta kosti, imobilizace, ztráty způsobené protézami a osteolytické metastázy. Naopak, snížení rychlosti resorpce kosti může vést k ostepetróze, což je stav vyznačující se zvýšenou enzitou kosti. Agonosté a antagonosté proteinu vážícího OPG modulují tvorbu • · · · · · • · • · · · osteklastů a mohou se podávat pacientům trpícím nemocemi kostí. Agonosté a antagonosté proteinu vážícího OPG proi použití k léčení osteopenií se mohou podávat samostatně nebo v kombinaci s terapeuticky účinným množstvím činidla podporujícího růst kostí, např. včetně morfogenních faktorů kostí zvaných BMP-1 až BMP-12, transformujícího růstového faktoru β a dalších členů rodiny TGFp, fibroblastového růstového faktoru FGF-1 a FGF-10, inhibitorů interleukinu-1, inhibitorů TNFa, parathvroidálního hormonu, prostaglandinů řady E, bisfosfonátů a minerálů podporujících kosti jako jsou fluorid a kalcium. Antagonosté proteinu vážícího OPG jsou zvláště vhodní k léčení osteopenie.

Receptor\^r pro proteiny vážící osteoprotegerin

Předkládaný vynález dále poskytuje receptory, které reagují s proteiny vážícími OPG. Vynález zvláště poskytuje osteoklastový díferenciační a aktivační receptor, ODAR. ODAR je transmembránový polypeptid, který vykazuje nejyvšší míru homologie s CD40, členem rodiny receptorů TNF. Sekvence nukleové kyseliny myšího ODAR a kódovanný polypeptid jsou uvedeny na obr. 10. Lidský homolog k myšímu ODAr lze snadno izolovat hybridizačním screeningem lidské cDNA knihovny nebo genomové knihovny pomocí sekvcence nukleové kyseliny uvedené na obr.

10. Postup pro klonování lidského ODA je v podstatě shodný s postupem popsaným v přikladu 5 pro klonování lidského proteinu vážícího OPG. Lidský homolog polypeptidu ukázaného na obr. 10 byl publikován v Anderson et al. (Nátuře 390: 175-179, 1997) a byl nazván RANK. RANK byl chrakterizován jako transmembránový protein typu I, který má homologii se členy rodiny receptorů TNFa podílí se na funkci dnedritických buněk.

Důkazy potvrzující interakci mezi ODAR a proteinem vážícím OPG jsou uvedeny v příkladu 13. Rpzpusná forma ODAR (fúzní protein ODAR-Fc) zabraňuje dozrávání osreoklastů in vitro(obr. 12) a zvyšuje denzitu kosti u normálních myší po podání subkutánní injekcí (Obr. 13).

• · ·· ·· ·· · * · ··· · · · * · · ζ . , · · · · • · · · · · .

•· ··· ··· ··· ·· ··

Výsledky jsou ve shodě s tím, že protein vážící OPG reaguje s ODAR a aktivuje ho, čímž podporuje dozrávání osteoklastů.

Vývoj osteoklastů a rychlsot a rozsah resorpce kosti jsou regulovány interakcí mezi proteinem vážícím OPG a ODAR. Sloučeniny, které snižují nebo blokují interakci proteinu vážícího OPG a ODAR jsou potenciálními antagonisty aktivity proteinu vážícího OPG a mohou narušit vývoj osteoklastů vedoucí ke snížené resoprci kosti. Alternativně sloučeininy, které zvyšují interakci interakci proteinu vážícího OPG a ODAR jsou potenciálními agonisty aktivity proteinu vážícího OPG a podporují vývoj osteoklastů a zvyšují resorpci kosti.

1< měření interakce proteinu vážícího OPG s ODART lze užít celou řadu testů in vitro s využitím purifikováných proteinů, tyto testy se mohou použít ke sc.reeningu sloučenin na jejich schopnost zvyšovat nebo snižovat rychlost nebo rozsah vazby ODAR k proteinu vážícímu OPG. V jednom typu takových testů se protein ODAR imobilizuje navázáním na dno jamek mikrotitrační destičky, protein vážící OPG radioaktivně označený (např. radioaktivním jodem) a testovaná sloučenina se přidají postupně (v jakémkoliv pořadí) a nebo současně do jamek. Po inkubaci se jamky opláchnou a pomocí scintilačního počítače se stanoví radioaktivita, podle níž se určí míra vazby ODAR a proteinu vážícího OPG v přítomnosti testované sloučeniny. Typicky se sloučenina testuje v celém rozsahu koncentrací a pro vyhodnocení přesnosti naměřených výsledků se použije série kontrolních jamek, kde chybí vždy jeden nebo několik prvků z testované reakce. K alternativní metodě patří obrácení pozice proteinů, tzn. na mikrodestičku se imobilizuje protein vážící OPG, inkubuje se s testovanou sloučeninou a radiaoktivně značeným ODAR a pak se obdobně stanoví rozsah navázání (viz např. kapitola 18 v Current Protocols in Molecular Biology, Asubel etal., eds., John Willey and Sons, New York, NY, 1995).

Jako alternativu k radioaktivnímu značení lze užít postup, kdy se protein vážící OPG nebo ODAR konjuguje s biotinem a přítomnost • · • ·

• · · · • · ·> · · · » · • · · ·

4 biotinylovaného proteinu se pak detekuje pomocí straptavidinu navázaného na enzym, jako je např. křenová peroxidáza (HRP) nebo alkalická fosfatáza (AP), který lze detekovat kolorimetricky nebo fluorescenčním označením streptavidinu. Také lze využít protilátky proti proteinu vážícímu OPG nebo OD AR konjugované s biotinem, které lze detekovat po inkubaci se streptavidinem navázaným na enzym jako AP nebo HRP.

Protein vážící OPG nebo ODAR mohou být také imobilizovány navázáním na agarózové perličky, akrylátové perličky nebo i jiné, užité jako neutrální substrát. Tento substrát-proteinový komplex se pak přenese do roztoku obsahujícího komplementární protein a testovanou sloučeninu. Po inkubaci se perličky precipitují centifugací a vazba mezi proteinem vážícím OPG a ODAR se kvantifikuje způsobem popsaným výše. Alternativně se substrát-proteinový komplex imobilizuje v koloně a testované molekuly a komplementární protein procházejí kolonou, vytváření komplexů mezi proteinem vážícím OPG a ODAR lze pak vyhodnotit jedním ze způsobů, které byly popsány výše, např. radioaktivním značením, navázáním protilátky' apod.

Jiným typem testu in vitro, který' je užitečný k identifikaci slouzčenion, kteríé zvyšují nebo snižují tvorbu komplxů mezi ODAR a proteinem vážícím OPG je detektorový- systém pro povrchovou plazmonovou rezonanci jako je např. měřicí systém Biacore formy Pharmacia (Pharmacia, Picatawy, NJ). systém Biacore lze užít podle návodu výrobce. Test vpodstatě spočívá v tom, že se kovalentně naváže buďto protein vážící OPG nebo ODAR na senzorový' čip potažený dextranem, který je umístěn v detektoru. Testovaná sloučenina a další komplementární protein se pak injikují do komory obsahující senzorový čip buďto simultánně nebo postupně a množství komplemetámího proteinu, které se naváže, se určí na základě změn molekulové hmotnosti, která je fyzikálně asociována s dextranem pokrytou stranou senzorového čipu, změna molekulové hmotnosti je měřena detektorovým systémem.

V některých případech může být žádoucí vyhodnotit dvě nebo více testovaných sloučenin společně, zda jsou užitečné ke zvyšování nebo snižování vazby komplexů OD AR/protein vážící OPG. V takovém případě testy popsané výše mohou být snadno modifikovány tím, že se přidají další testované sloučeniny buďto simultánně nebo postupně po první sloučenině.Zbývající kroky testů jsou opět stejné, jak byly popsány výše.

Testy in vitro popsané výše se mohou užít výhodně k rychlému screeningu velkého počtu sloučenin na to, zde ovlivňují tvorbu komplexů OD AR s proteinem vážícím OPG. Testy mohou být automatizovány pro screening sloučenin vytvářených rekombinantně připravených metodou „phage display“ , syntetických peptidů a chemických syntetických knihoven.

Sloučeniny, které zvyšují nebo snižují tvorbu komplexů ODAR s proteinem vážícím OPG mohou být také testovány v buněčných kulturách pomocí buněk nebo buněčných linií nesoucích ODAR. Buňky a buněčné linie lze získat z jakéhokoliv savce, výhodně člověka nebo jiného primáta, psa nebo hlodavce. Buňky· obsahující ODAR jako např. osteoklasty mohou být oděleny od ostatních buněk afinitní chromatografií postupem, který je odborníkovi znám. Navázání proteinu vážícího OPG na buňky nesoucí ODAR se hodnotí v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaných sloučenin a lze ho kvantifikovat např. průtokovou cytometrií pomocí bitinylované protilátky k proteinu vážícímu OPG. Alternbativně kultura myších nebo lidských osteoklastů může být založena jak bylo posáni v příkladu 8 a testované sloučeniny se pak testují podle schopnosti blokovat zrání osteoklstů stimulované přídavkem CSF-1 a proteinu vážícího OPG. Tetsy na buněčných kulturách lze užít výhodně k dalšímu hodnocení sloučenin, které prošly s pozitivním výsledkem vazebným testem popsaným výše.

Sloučeniny, které zvyšují nebo snižují interakci proteinu vážícího OPG s ODAR lze také hodnotit z lediska in vivo aktivity tím, že se sloučenina podává myším a pak se měří denzita kosti pomocí skenovací denzitometrie nebo radiografie. Postup}⁷ měření denzity kostí byly popsány v PCT přihlášce WO97/23614 a také v příkladu 13.

Vynález poskytuje sloučeniny, které snižují nebo blokují interakci proteinu vážícího OPG s ODAR a jsou antagonisty tvorby osteoklastů. Takové sloučeniny obecně spadají do dvou skupin. K jedné skupině patří takové sloučeniny, které jsou odvozeny z proteinu vážícího OPG nebo které interagují s proteinem vážícím OPG. Takové sloučeniony byly popsány v předchozím textu. Druhá skupina obsahuje takové sloučeniny, které jsou odvozeny z ODAR nebo kteréí interagují s ODAR. K příkladům sloučenin, které jsou antagonisty ODAR, patří nukleové kyseliny, proteiny, peptidy, sacharid}', lipidy nebo organické sloučeniny s malou molekulovu hmotností.

Antagonisté ODAR jsou sloučeniny, které se váží přímo a nebo v sousedství jednoho nebo několika vazebných míst pro protein vážící OPG v extracelulární doméně ODAR a snižují tak nebo úplně blokují vytváření komplexů. Ty úseky ODAR, které se podílejí na tvorbě komplexů s proteinem vážícím OPG, je možné identifikovat na základě analogie se strukturou homologního komplexu TNFp/TNF-R55, který popsali Banner et al. (Cell 73: 431-445, 1993). Např. struktura komplexu TNFP/TNF-R55 může být využita k identifikaci úseků proteinu vážícího OPG a ODAR, které se účastní vytváření komplexu. Pak je možné navrhnout sloučeniny, které se přednostně váží na úseky účastnící se tvorby komplexu, a působí jako antagonoisté. jeden z takových přístupů je uveden v příkladu 11, kdy byly navrženy a peptidové antigeny pro použití k přípravě protilátek proti proteinu vážícímu OPG, které působí jako antagonisté. Očekává se, že tyto protilátky se budou vázat na protein vážící OPG a tím blokovat vytvoření komplexu s ODAR. Podobným způsobem lze použít peptidové antigeny založené na struktuře ODAR k přípravě protilátek anti-ODAR, které působí jako antagonisté.

Antagonisté ODAR se mohou vázat na ODAR také v místech odlišných od vazebných míst pro protein vážící OPG a indukovat • · ·

konformační změny v polypeptidů ODAR, které vedou buďto ke snížení tvorby komplexů nebo k tvorbě neproduktivních komplexů s proteinem vážícím OPG.

V jednom provedení vynálezu je antagonistou rozpustná forma ODAR postrádající funkční transmembránovou doménu. Rozpustné formy ODAR mají dleci jedné nebo několika aminokyselin v transmembránové doméně (aminokyselin 214 až 234, jak je uvedeno na obr. 10). Rozpustné polypeptidy ODRA mohou mít buďto celou nebo část extracelulární domény a jsou schpny vázat se na protein vážící OPG. Případně rozpustný ODAR může být částí chimérického proteinu, kde část nebo celá extrracelulární doména ODAR je fúzována s heterologní aminokyselinovou sekvencí. V jednom provedení vynálezu je heterologní aminokyselinovou sekvencí úsek Fc z lidského IgG.

Modulátor}' (agonisté a antagonisté) ODAR se mohou užít k prevenci nebo léčení osteopenie, včetně nemocí jako je osteoporóza, osteomyelitida, hyperkalcémie při malignitě, osteopenie vyvolaná chirurgickým výkonem nebo podáváním steroidů, Pagetova nemoc, osteonekróza, úbytek kosti při revmatoidní artritidě, periodontální úbytek kosti, imobilizace, úbytek při protézách a osteolytických metastázách. Agonisté a antagonisté ODAR použitelné pro léčbu osteopenií mohou být podávány samotné nebo v kombinaci s terapeuticky účinným množstvím agens podporujícího růst kostí včetně morfogenních faktorů označených BMP-1 až BMP-12, transformujícího růstového faktoru-β a členů rodiny TGF-β, fibroblastových růstových faktorů FGF-1 až FGF-10, inhibitorů interleukinu-1, inhibitorů TNFa, parathormonu, prostaglandinů řady E, bisfosfonátů, estrogenů, ŠERM a minerálů podporujících kost, jako je fluorid a kalcium. Antagonisté ODAR jsou zejména užiteční v léčbě osteopenie.

Následující příklady jsou nabízeny pro ucelenější ilustraci vynálezu, ale nemají být chápány jako limitující jeho rozsah.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Identifikace zdrojové buněčné linie pro protein vázající OPG

Osteoprotegerin (OPG) negativně reguluje osteoklastogenezi in vitro a in vivo. Protože OPG je protein mající vztah k TNFR, pravděpodobně při zprostředkování svého účinku interaguje s členem rodiny příbuzné k TNF. S jednou výjimkou jsou všichni známí členové rodiny TNF transmembránové proteiny typu II exprimované na buněčném povrchu. Aby se rozpoznal zdroj proteinu vázající OPG, byly použity rekombinantní fúzní proteiny OPG-Fc jako imunologické sondy pro testováni na proteiny vázající OPG lokalizované na povrchu různých buněčných linií a primárních hemopoetických buněk.

Buněčné linie, které rostlý⁷ jako adherentní kultury in vitro byly ošetřeny za použití následujících metod: buňky byly vysety na 24 jamkové destičky pro tkáňové kultury⁷ (Falcon), a poté se ponechaly růst dokud nebyly přibližně z 80 % konfluentní. Kultivační média se pak odstranila a adherentní kultury⁷ se promyly fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnany (PBS) (Gibco) obsahujícím 1% fetální telecí sérum (FCS). Rekombinantní fúzní proteiny myší OPG [22-194]-Fc a lidský OPG [22-201]-Fc (viz U.S. patentová přihláška pořadové č. 08/706 945, podaná 3. září, 1996) byly jednotlivě naředěny na 5 pg/ml v PBS obsahujícím 1% FCS, pak přidány ke kulturám a ponechány inkubovat 45 minut v 0 °C. Roztok fúzního proteinu OPG-Fc se odstranil a buňky se promyly v roztoku PBS-FCS, jak je popsáno výše. Kultury se poté vystavily působení sekundární protilátky - kozímu F(ab’) proti-lidskému IgG s konjugovaným fykoerytrinem (Southern Biotechnology Associates č. 2043-09), ředěné PBS-FCS. Po 30-45 minutách inkubace v 0 °C se roztok odstranil a kultury⁷ se promyly, jak je popsáno výše. Buňky se pak • · · analyzovaly imunofluorescenčním mikroskopem a detekovaly se buněčné linie, které exprimovaly protein vázající OPG na buněčném povrchu.

Suspenzní buněčné kultury⁷ se analyzovaly podobným způsobem s následujícími modifikacemi: ředidlo a promývací pufr sestávaly⁷ z fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnany obsahujícího 1% FCS bez kalcia a magnézia. Buňky se sklidily z exponenciálně se množících kultur v růstovém médiu, stočením se vytvořily pelety a pak se resuspendovalo 1 x 10⁷ buněk/ml na 96jamkové mikrotitrační destičce pro tkáňové kultury (Falcon). Buňky⁷ pak byly vystaveny rekombinantním fúzním proteinům OPG-Fc, pak sekundární protilátce, jak je popsáno výše, a byly promyty⁷ a stočeny mezi každým krokem. Pak se buňky⁷ analyzovaly pomocí fluorescenčního třídění buněk (FACS) za použití přístroje Becton Dickinson FACscan.

Použitím tohoto postupu bylo zjištěno, že myší myelomonocytární buněčná linie 32D (ATCC č. CRL-11346) exprimuje povrchovou molekulu, která byla detekována oběma fúzními proteiny, myším OPG[22-194]-Fc a také lidským OPG[22-201 ]-Fc. Samotná sekundární protilátka se nevázala na povrch buněk 32D, ani nepurifikovala lidský IgGl Fc, což naznačuje, že vazba fúzních proteinů OPG-Fc je způsobená skupinou OPG. Tato vazba může být v kompetici způsobem závislým na dávce při přidání rekombinantního myšího nebo lidského OPG[22-401] proteinu. Úsek OPG nezbytný’ pro biologickou aktivitu OPG je tedy schopný⁷ specifické vazby⁷ na povrchovou molekulu odvozenou z 32D.

Příklad 2

Expresní klonování myšího proteinu vázajícího OPG

Z 32D mRNA byla připravena knihovna cDNA a ligována do savčího expresního vektoru pcDNA3.1(+) (Invitrogen, San Diego, CA). Sklidily se exponenciálně rostoucí buňky 32D udržované za přítomnosti rekombinantního interleukinu-3 a celková buněčná RNA byla purifikována kyselou guanidiumthiokyanát-fenol-chloroformovou extrakcí (Chromczynski a Sacchi, Annal. Biochem., 162, 156-159, 1987). Poly(A+) mRNA frakce se z preparátu celkové RNA získala adsorpcí na perličky s navázaným oligo(dT)25 (Dynabeads, Dynal Corp) a následnou elucí za použití postupu doporučeného výrobcem. Směrová, pomocí primerů oligo-dT syntetizovaná cDNA knihovna byla připravena za použití Superscript Plasmid System (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) dle postupu doporučeného výrobcem. Výsledná cDNA byla plně naštěpena restrikčními endonukleázami Sall a Notl, a poté rozdělena do frakcí podle velikosti rozdělovači gelovou chromatografií. Byly vybrány frakce s největší molekulovou hmotností a ligovány do polylinkeru (mnohočetného klonovacího místa) plazmidového vektoru pcDNA3.1(+) (Invitrogen, San Diego, CA). Tento vektor obsahuje promotor CMV v protisměru od mnohočetného klonovacího místa a řídí expresi vysokého stupně v eukaryotických buňkách. Knihovna byla poté vnesena elektroporací do kompetentních buněk E. coli (ElectroMAX DH10B, Gibco, NY) a vyseta na LB agar obsahující 100 pg/ml ampicilinu. Knihovna pak byla uspořádána do izolovaných skupin obsahujících přibližně 1000 klonů na skupinu a 1,0 ml kultury z každé skupiny se pěstoval 16-20 hodin ve 37 °C. Plazmidová DNA z každé kultury se izolovala za použití soupravy Qiagen Qiawell 96 Ultra Plasmid Kit (katalogové č. 16191) podle postupu doporučeného výrobcem.

• · ·

Uspořádané skupiny 32D cDNA expresní knihovny byly jednotlivě vneseny pomocí lipofektinu do kultur buněk COS-7 a pak testovány na to, zda nabyly buněčný povrchový protein vázající OPG. Aby se tak stalo, byly buňky COS-7 vysety v hustotě 1 x 10⁶ na ml na ójamkové destičky pro tkáňové kultury (Costar) a pak pěstovány přes noc v DMEM (Gibco) obsahujícím 10% FCS. Přibližně 2 pg plazmidové DNA z každé skupiny byly ředěny do 0,5 ml DMEM bez séra, a pak sterilizovány stočením přes kolonu 0,2 pm Spin-X (Costar). Současně bylo přidáno 10 μΐ Lipofektaminu (Life Technologies katalog, č. 18324-012) do samostatné zkumavky obsahující 0,5 ml DMEM bez séra. Roztoky DNA a Lipofektaminu se smísily a ponechaly inkubovat 30 minut při teplotě místnosti. Buněčné kultury COS-7 byly pak promyty s DMEM bez séra a komplexy⁷ DNA-lipofektamin byly vystaveny kulturám po dobu 2-5 hodin v 37 °C. Po tomto období byla média odstraněna a nahrazena DMEM obsahujícím 10% FCS. Buňky pak byly pěstovány 48 hodin ve 37 °C.

Aby se detekovaly kultury, které exprimují protein vázající OPG, byla růstová média odstraněna a buňky byly promyty v roztoku PBS-FCS. Do každé jamky se přidal 1,0 ml PBS-FCS obsahující 5 pg/ml fúzního proteinu lidského OPG[22-201]-Fc a inkuboval se 1 hodinu při teplotě místnosti. Buňky byly třikrát promyty' roztokem PBS-FCS a pak 5 minut fixovány v PBS obsahujícím 2% paraformaldehyd a 0,2% glutaraldehyd při teplotě místnosti. Kultur}' se jednou promyly PBS-FCS a pak inkubovaly 1 hodinu v 65 °C ponořeny do roztoku PBS-FCS. Ponechaly se zchladnout a roztok PBS-FCS se odsál. Pak se kultury inkubovaly s kozí proti-lidskou IgG (Fc specifickou) protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou (SIGMA produkt č. A-9544) 30 minut při teplotě místnosti, třikrát se promyly s 20 mM Tris-Cl (pH 7,6) a 137 mM NaCl. Imunokomplexy, které se vytvořily během těchto kroků, byly detekovány testováním aktivity alkalické fosfatázy s použitím soupravy Fast Red TR/AS-MX Substráte Kit (Pierce, katalog, č. 34034) podle postupu doporučeného výrobcem.

• » • · » · · I

Použitím tohoto přístupu bylo testováno celkem přibližně 300 000 nezávislých 32D cDNA klonů představovaných 300 transfekovanými skupinami s 1000 klony. Byla identifikována jedna jamka obsahující buňky, které specificky získaly fúzní protein OPG-Fc. Tato skupina byla dále dělena postupným opakováním koly příbuzenské selekce a výsledkem byl samostatný plazmidový klon 32D-F3 (obrázek 1). DNA plazmidu 32D-F3 pak byla transfekována do buněk COS-7, které byly imunologicky značeny buď samotnou sekundární protilátkou kozím proti-lidským IgG konjugovaným s FITC, fúzním proteinem lidským OPG[22-201]-Fc a sekundární protilátkou, nebo fúzním proteinem ATAR-Fc (ATAR je také znám jako HVEM, Montgomery et al., Cell, 87, 427-436, 1996) (obrázek 2). Samotná sekundární protilátka ani fúzní protein ATAR-Fc se nevázaly k buňkám COS-7/32D-F3. K buňkám COS-7/32D-F3 se vázal pouze fúzní protein OPG-Fc, což je důkazem, že na povrchu exprimujících buněk se projevil protein vázající OPG kódovaný 32D-F3.

Příklad 3

Sekvence proteinu vázajícího OPG

Klon 32D-F3, jehož izolace byla popsána výše, obsahoval inzert o velikosti přibližně 2,3 kb cDNA (obrázek 1), který byl sekvencován v obou směrech na přístroji pro automatizované sekvencování DNA 373A od firmy Applied Biosystems metodou terminace reakcí řízených primeiy s použitím Taq polymerázy a fluorescenční značky (primer-driven Taq dye-terminator reactions, Applied Biosystems) podle postupu doporučeného výrobcem. Výsledná získaná nukleotidová sekvence byla srovnána s databází sekvencí DNA s použitím programu FASTA (GCG, University of Wisconsin) a analyzována na přítomnost dlouhých otevřených čtecích rámců (LORF) při použití aplikace „Six-way open reading frame“ (Framws) (GCG, University of Wisconsin). Byl detekován • ·

příslušně orientovaný LORF z 316 aminokyselinových (aa) zbytků začínající methioninem, kterému předcházela 5’ netranslatovaná oblast velikosti přibližně 150 bp. 5' netranslatovaná oblast obsahovala v rámci stop-kodon v protisměru od předpověděného start-kodonu. To ukazuje, že struktura plazmidu 32D-F3 odpovídá jeho schopnosti využívat oblast promotoru CMV křížení exprese genového produktu velikosti 316 aa v savčích buňkách.

Předpověděná sekvence proteinu vázajícího OPG pak byla srovnána s existující databází známých proteinových sekvencí za použití modifikované verze programu FASTA (Pearson, Meth. Enzymol., 183, 63-98, 1990). Aminokyselinová sekvence se také analyzovala na přítomnost specifických motivů, které jsou zachovány u všech známých členů rodiny tumorového nekrotického faktoru (TNF) s použitím metody sekvenačního profilu (Gribskov et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 4355-4359, 1987) modifikováno dle Liiethy et al. (Protein Sci., 3, 139-146,

1994) . V celém proteinu vázajícím OPG vyšla najevo významná homologie s několika členy rodiny TNF. Nejblíže příbuzný myším a lidským homologům ligandů TRAIL a CD40 se ukazuje myší protein vázající OPG. Další analýza sekvence proteinu vázajícího OPG ukázala silnou shodu s rodinou TNF, s vysoce významným Z skórem rovnajícím se 19,46.

Aminokyselinová sekvence proteinu vázajícího OPG obsahuje pravděpodobnou hydrofobní transmembránovou doménu, která začíná v M49 a prostírá se do L69. Na této konfiguraci vztažené k methioninovému start-kodonu je založen předpoklad, že protein vázající OPG je transmembránový protein typu II s krátkou N-koncovou intracelulámí doménou a delší C-koncovou extracelulární doménou (obrázek 4). To by bylo podobné všem známým členům rodiny TNF, s výjimkou lymfotoxinu alfa (Nagata a Golstein, Science, 267, 1449-1456,

1995) .

Příklad 4

Exprese mRNA lidského proteinu vázajícího OPG

Membrán}’ s hromadným přenosem RNA (northern-bloty) z lidské tkáně (Clontech, Palo Alto, CA) byly analyzovány a testovány restrikčním fragmentem 32D-F3 značeném ³²P-dCTP, aby se zjistila velikost lidského transkriptu a určil vzorec exprese. Northern-bloty byly prehybridizovány v 5x SSPE, 50% formamidu, 5x Denhardtově roztoku, 0,5% SDS a 100 gg/ml denaturované DNA lososího spermatu po dobu 2-4 hodin ve 42 °C. Bloty se pak hybridizovaly v 5x SSPE, 50% formamidu, 2x Denhardtově roztoku, 0,1% SDS a 100 gg/ml denaturované DNA lososího spermatu a 5 ng/ml značené sondy po dobu 18-24 hodin ve 42 °C, pak se bloty odmyly v 2x SSC 10 minut při teplotě místnosti, lx SSC 10 minut v 50 °C a v 0,5x SSC 10-15 minut.

Za použiti sondy pocházející z myší cDNA a hybridizace za stringentnícb podmínek byl v lymfatických uzlinách objeven převládající druh mRNA s relativní molekulovou hmotností přibližně 2,5 kb (obrázek 3). Slabý signál o stejné relativní molekulové hmotnosti byl také detekován u mRNA z fetálních jater. V dalších vyšetřovaných tkáních nebyl zjištěn žádný transkript proteinu vázajícího OPG. Data nasvědčují, že exprese mRNA proteinu vázajícího OPG je v lidských tkáních velice omezená. Data také ukazují, že izolovaný cDNA klon má velmi blízko k velikosti přírodního transkriptu, což svědčí pro to, že 32D-F3 je klon plné délky.

Příklad 5

Molekulární klonování lidského proteinu vázajícího OPG

Lidský homolog proteinu vázajícího OPG je exprimován jako mRNA o velikosti přibližně 2,5 kb v lidských periferních lymfatických uzlinách a je detekován hybridizací se sondou z myší cDNA za stringentních hybridizačních podmínek. DNA kódující lidský⁷ protein vázající OPG byla získána testováním cDNA knihovny lidských lymfatických uzlin hybridizačními metodami s použitím buď rekombinantních bakteriofágových plaků nebo transformovaných bakteriálních kolonií (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989). Fágová nebo plazmidová cDNA knihovna se testovala za použití radioaktivně značených sond pocházejících z klonu 32D-F3 myšího proteinu vázajícího OPG. Sondy byly použity k testování nitrocelulózových membrán, na které byla přenesena knihovna otiskem misky. Tyto membrány jsou prehybridizovány a pak hybridizovány za použití podmínek specifikovaných v příkladu 4, což nakonec poskytlo purifikované klony lidské cDNA proteinu vázajícího OPG. Inzerty získané z každého klonu lidského proteinu vázajícího OPG byly sekvencovány a analyzovány, jak je popsáno v příkladu 3.

Póly A+ RNA z lidské lymfatické uzliny (Clontech, lne., Palo Alto, CA) se analyzovala na přítomnost transkriptů OPG-bp jak bylo již dříve popsáno v U.S. Patentu č. 08/577 788, podaném 22. prosince 1995. Northem-blot tohoto vzorku RNA zkoumaný za stringentních podmínek sondou myšího OPG-bp značeného ³²P ukázal přítomnost transkriptů lidského OPG-bp. Z mRNA lymfatické uzliny pak byla syntetizována cDNA knihovna pomocí primerů oligo(dT) s použitím soupravy⁷ SuperScript kit (Gibco Life Technologies, Gaithersberg, MD), jak je popsáno v příkladu 2. Výsledná cDNA byla rozdělena podle velikosti a frakce o vysoké molekulové hmotnosti byly ligovány do plazmidového vektoru pcDNA3.1(+)(Invitrogen, San Diego, CA). Transformovaly se elektrokompetentní E. coli DH10 (Gibco Life Technologies, Gaithersberg, MD) a 1 x 10⁶ transformant rezistentních na ampicilin se testovalo hybridizací kolonií s myším proteinem vázajícím OPG značeným ³²P jako sondou.

Byl izolován plazmidový klon s předpokládanou cDNA lidského proteinu vázajícího OPG, phuOPGbp-1.1, obsahující inzert o velikosti 2,3 kb. Výsledná nukleotidová sekvence inzertu phuOPGbp-1.1 byla přibližně z 80-85 % homologní se sekvencí cDNA myšího proteinu vázajícího OPG. Translace vložené sekvence DNA ukazovala na přítomnost dlouhého otevřeného čtecího rámce, o kterém se předpovídalo, že kóduje 317 aa polypeptid (obrázek 4). Srovnání myšího a lidského OPG-bp polypeptidu ukazuje, že jsou identické z ~87 %, což naznačuje, že tento protein je během evoluce velmi konzervativní. Sekvence DNA lidského proteinu vázajícího OPG a jeho proteinová sekvence nebyly nalezeny v databázi Genbank, a nebyly zde ani žádné homologní EST sekvence. Lidský⁷ protein vázající OPG vykazuje stejně jako myší homolog výraznou podobnost sekvencí se všemi členy rodiny cytokinů TNFa.

Příklad 6

Klonování a bakteriální exprese proteinu vázajícího OPG

Pro tvoření různých forem myších proteinů vázajících OPG je použita amplifikace pomocí metody PCR (polymerázová řetězová reakce) používající páry primerů a templáty popsané níže. Jeden primer z každého páru vnáší TAA stop-kodon a jedinečné místo Xhol nebo SacII, které následuje po karboxylovém konci genu. Další primer z každého páru vnáší jedinečné místo Ndel, N-koncový methionin a optimalizuje kodony pro aminokoncovou část genu. PCR a teplotní cyklování se provádí s použitím standardní metody rekombinantní DNA. PCR produkty se purifikují,

naštěpí restrikčními enzymy a vloží do jedinečných míst Ndel a Xhol nebo SacII vektoru pAMG21 (ATCC č. 98113) a transformuje do prototrofních E. coli 393 nebo 2596. Další obecně používané expresní vektory E. coli a hostitelské buňky jsou také vhodné pro expresi. Po transformaci se selektují klony, izoluje se plazmidová DNA a potvrzuje se sekvence inzertu proteinu vázajícího OPG.

pAMG21-myší protein vázající OPG [75-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 242 aminokyselin a přitom měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH2-Met(75)-AspPro-Asn-Arg--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonováni tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1581-72 a č. 1581-76.

1581-72:

' - GTTCTCCTCATATGGATCCAAACCGTATTTCTGAAGACAGCACTCACTGCTT - 3 '

1581-76:

5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA- 3' pAMG21-myší protein vázající OPG [95-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 223 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky’, NH2-Met-His(95)-GluAsn-Ala-Gly--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templát použitý pro PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1591-90 a č. 1591-95.

1591-90:

' - ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGCATGAAAACGCAGGTCTGCAG- 3'

1591-95:

5'-TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA-3' • · · · · · pAMG21-myši protein vázající OPG [107-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 211 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH2-Met-Ser(107)-GluAsp-Thr-Leu--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templát pro použiti v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1591-93 a č. 1591-95.

1591-93:

' - ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTGAAGACACTCTGCCGGACTCC - 3 '

1591-95:

' -TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA- 3 ' pAMG21-myší protein vázající OPG {118-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 199 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH2-Met(l 18)-Lys-GlnAla-Phe-Gln--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1591-94 a č. 1591-95.

1591-94:

' - ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGAAACAAGCTTTTCAGGGG - 3 '

1591-95:

' - TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA- 3 ' pAMG21-myší protein vázající OPG [128-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 190 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH2-Met-Lys(128)-GluLeu-Gln-His--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1591-91 ač. 1591-95.

1591-91:

5' -ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGAAAGAACTGCAGCACATTGTG-3'

1591-95:

' - TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA-3 ' pAMG21-myší protein vázající OPG [137-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 181 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH2-Met-Gln(137)-ArgPhe-Ser-Gly--------Gln-Asp-lle-Asp(316)-COOH. Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1591-92 a č. 1591-95.

1591-92:

5' - ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGCAGCGTTTCTCTGGTGCTCCA- 3 '

1591-95:

' - TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA- 3 ' pAMG21-myší protein vázající OPG [146-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 171 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH2-Met(146)-Glu-GlySer-Trp--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templát pro použití v PCR byl pAMG21-myší protein vázající OPG [75-316] popsaný výše a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1600-98 ač. 1581-76.

1600-98:

' - GTTCTCCTCATATGGAAGGTTCTTGGTTGGATGTGGCCCA- 3 '

1581-76:

5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3' «· ··

pAMG21-myší protein vázající OPG [156-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 162 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH?-Met-Arg(156)-GlyLys-Pro--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templát pro použití v PCR byl pAMG21-myší protein vázající OPG [158-316] níže a pár příměrů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1619-86 a č. 1581-76.

1619-86:

5' - GTTCTCCTCATATGCGTGGTAAACCTGAAGCTCAACCATTTGCA - 3 '

1581-76:

5' - TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA- 3' pAMG21~myší protein vázající OPG [158-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 160 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH2-Met-Lys(l 58)-ProGlu-Ala--------Gln-Asp-íle-Asp(316)-COOH. Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár příměrů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1581-73 a č. 1581-76.

1581-73:

5' - GTTCTCCTCATATGAAACCTGAAGCTCAACCATTTGCACACCTCACCATCAAT - 3 '

1581-76:

5' - TACGCACTCCGCGGTT AGTCTATGTCCTGAACTTTGA - 3 ’ pAMG21-myší protein vázající OPG [166-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 152 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH2-Met-His(166]-LeuThr-Ile--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1581-75 ač. 1581-76.

·« *·

1581-75:

5' -GTTCTCCTCATATGCATTTAACTATTAACGCTGCATCTATCCCAT CGGGTTCCCATAAAGTCACT- 3'

1581-76:

5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3 ' pAMG21-myší protein vázající OPG [168-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 150 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH2-Met-Thr(168)-lleAsn-Ala--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1581-74 a č. 1581-76.

1581-74 :

5' - GTTCTCCTCATATGACTATTAACGCTGCATCTATCCCATCGGGTTCCCATAAAGTCACT - 3 ' ' 1581-76:

5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3'

Rozumí se, že výše uvedené konstrukty jsou pouze příklady a odborník může snadno získat další formy proteinu vázajícího OPG použitím obecně známých metod zde citovaných.

Rekombinantní bakteriální konstrukty pAMG21-myšího proteinu vázající OPG [75-316], [95-316], [107-316], [118-316], [128-316], [137316] a [158-316] byly klonovány, byla ověřena sekvence DNA a byly prozkoumány hladiny exprese rekombinantního genového produktu po indukci. Rekombinantní genový produkt se ve všech konstruktech tvořil v takovém množství, že byl snadno viditelný po elektroforéze hrubých lyzátů v SDS-polyakrylamidovém gelu a po obarvení Coomasieho modří. Pěstování transformovaných E. coli 393 nebo 2596, indukce exprese proteinu vázajícího OPG a izolace inkluzních tělísek obsahujících protein • · vázající OPG se prováděla podle postupů popsaných v PCT WO97/23614. Purifikace proteinů vázajících OPG z inkluzních tělísek vyžaduje solubilizaci a renaturaci proteinu vázajícího OPG za použití postupů odborníkovi dostupných. Zjistilo se, že rekombinantní myší protein vázající OPG [158-316] je produkován většinou v nerozpustné formě, ale přibližně 40 % bylo nalezeno v rozpustné frakci. Rekombinantní protein byl purifikován z rozpustné frakce jak je popsáno níže a byla prozkoumána jeho biologická aktivita.

Přiklad 7

Purifikace rekombinantního myšího proteinu vázajícího OPG [158-316]

Zmrazené bakteriální buňky obsahující exprimovaný myší protein vázající OPG [158-316] byly rozmraženy a resuspendovány ve 20 mM Tris-HCl pH 7,0. 10 mM EDTA. Buněčná suspenze (20% hmotnost/objem) pak byla homogenizována třemi průchody skrze mikrofluidizér. Suspenze lyžovaných buněk se centrifugovala v rotoru JA14 při 10 000 rpm po dobu 45 minut. Analýza SDS-PAGE ukázala pás přibližné molekulové hmotnosti přítomný jak v inkluzních tělískách tak v supernatantu. Rozpustná frakce pak byla nanesena na kolonu Pharmacia SP Sepharose 4FF ekvilibrovanou 10 mM MES pH 6,0. Protein vázající OPG se eluoval v gradientu 0-0,4 M NaCl v MES pH 6,0 objemem 20x větším než objem kolony. Frakce obsahující protein vázající OPG pak byly naneseny na kolonu ABX Bakerbond ekvilibrovanou 20 mM MES pH 6,0. Protein vázající OPG se eluoval v gradientu 0-0,5 M NaCl v MES pH 6,0 objemem 15x větším než objem kolony (15CV). Konečný produkt byl při SDS-PAGE shledán homogenním z více než 95 %. N-koncové peptidové sekvencování poskytlo následující sekvenci; Met-Lys-Pro-Glu-Ala-Gln-Pro-Phe-Ala-His, která byla ztotožněna s predikovanou sekvencí pro polypeptid začínající aminokyselinovým zbytkem 158 (s iniciačním methioninem). Relativní • · • · · · 9

3 molekulová hmotnost proteinu stanovená pomocí SDS-PAGE se při redukujících podmínkách nezměnila.

Příklad 8

Biologická aktivita rekombinantního rozpustného proteinu vázajícího OPG in vitro

Dříve bylo prokázáno, že rekombinantní protein OPG blokuje tvorbu osteoklastů závislou na vitaminu D3 z kostní dřeně a prekurzorů sleziny v testu tvorby osteoklastů, jak bylo popsáno v patentové přihlášce U.S. č. 08/577 788. Protože se protein vázající OPG váže na OPG a je novým členem rodiny TNF ligandů, je to potenciální cíl biologické aktivity OPG. Rekombinantní rozpustný protein vázající OPG [158-316], představující minimální doménu podobnou jádru TNFa, se testoval na svou schopnost modulovat diferenciaci osteoklastů z prekurzorů osteoklastů. Buňky kostní dřeně se izolovaly z femurů dospělých myší a ošetřily se M-CSF. Neadherentní frakce se pěstovala společně s buňkami ST2 v přítomnosti či chybění vitaminu D3 a dexametazonu. Jak bylo ukázáno dříve, osteoklasty se vyvíjejí pouze ve společných kulturách obsahujících buňky⁷ stromatu (ST2), vitamin D3 a dexametazon. Přidával se rekombinantní rozpustný protein vázající OPG v různých koncentracích kolísajících od 0,16 do 500 ng/ml a zrání osteoklastů se určovalo testem s roztokem TRAP a vizuálním hodnocením. Protein vázající OPG výrazně stimuloval diferenciaci a zrání osteoklastů v závislosti na dávce, poloviny maximálního účinku bylo dosaženo v rozmezí 1-2 ng/ml, což svědčí pro to, že se protein chová jako silný induktor osteoklastogeneze in vitro (obrázek 5). Účinek proteinu vázajícího OPG je blokován rekombinantním OPG (obrázek 6).

Aby se otestovalo, zda protein vázající OPG může nahradit vliv stromatu a přídavek steroidů, založily se tkáňové kultury s použitím • ·

4 různých koncentrací M-CSF pro podporu růstu osteoklastických prekurzorů a přidávala se také různá množství proteinu vázajícího OPG. Jak je ukázáno na obrázku 6, protein vázající OPG stimuloval v závislosti na dávce aktivitu TRAP, a rozsah stimulace závisel na stupni přidaného M-CSF, což svědčí pro to, že pro vývoj osteoklastů jsou klíčové tyto dva faktory dohromady. Aby se potvrdila biologická relevance tohoto posledního pozorování, založily se tkáňové kultury⁷ na kortřkálních řezech z hovězí kosti a testoval se účinek M-CSF a proteinu vázajícího OPG buď samotných nebo dohromady. Jak je ukázáno na obrázku 7, protein vázající OPG stimuloval v přítomnosti M-CSF tvorbu velkých osteoklastů TRAP pozitivních, které erodovaly povrch kosti, což mělo za následek vznik dírek. Protein vázající OPG tedy účinkuje jako osteoklastogenezi stimulující faktor (cliferenciační faktor). To naznačuje, že OPG blokuje vývoj osteoklastů tím, že maskuje protein vázající OPG.

Příklad 9

Aktivita rekombinantního rozpustného proteinu vázajícího OPG in vivo

Na základě studií in vitro lze soudit, že rekombinantní myší protein vázající OPG {158-316] tvořený v E. coli je silný induktor vývoje osteoklastů z myeloidních prekurzorů. Aby se určil jeho účinek in vivo, dostávali samci myší BDF1 ve věku 4-5 týdnů (Charles River Laboratoires) subkutánní injekce proteinu vázajícího OPG [158-316] dvakrát denně tři dny a ráno čtvrtého dne (dny 0, 1, 2, a 3). Pět skupin myší (n=4) dostalo samotný nosič, nebo 1, 5, 25 nebo 100 pg proteinu vázajícího OPG [158316] denně. Dalších 5 skupin myší (n=4) dostalo výše uvedené dávky nosiče nebo proteinu vázajícího OPG [158-316] a navíc dostalo lidský FcOPG [22-194] v dávce 1 mg/kg/den (přibližně 20 pg/den) jednou subkutánní injekcí denně. Před ošetřením se určilo ionizované kalcium plné krve v den 0 a 3-4 hodiny po první denní injekci proteinu vázajícího • ·

OPG [158-316] v den 1, 2 a 3. Čtyři hodiny po poslední injekci v den 3 byly myši usmrceny a odebraly se vzorky pro radiogramy,

Rekombinantní protein vázající OPG [158-316] vyvolal po dvou dnech léčení v dávce 5 pg/den a vyšší významné zvýšení ionizovaného kalcia v krví (obrázek 8). Závažnost hyperkalcémie ukazuje silnou indukci osteoklastické aktivity, což má za následek zvýšenou resorpci kostí. Současné podávání OPG omezilo hyperkalcémii při dávce proteinu vázajícího OPG [158-316] 5 a 25 pg/den, ale ne při dávce 100 pg/den. U stejných zvířat se analyzovaly radiogramy, aby se určilo, zda protein měl vliv na hustotu minerálů kosti viditelný na rentgenovém snímku (obrázek 9). Rekombinantní protein vázající OPG [158-316] podávaný v injekcích tři dny snižoval hustotu kosti v proximální tibii myší v závislosti na dávce. Redukce hustoty kosti byla zejména zřetelná u myší dostávajících 100 pg/den, což potvrdilo, že těžká hyperkalcémie u těchto zvířat byla vyvolána zvýšenou kostní resorpci a následného uvolnění kalcia ze skeletu. Tato data jasně svědčí pro to, že protein vázající OPG [158-316] podporuje resorpci kostí in vivo, což vede k systémové hyperkalcémii, a rekombinantní OPG tento vliv ruší.

Přiklad 10

Klonování a exprese rozpustného proteinu vázajícího OPG v savčích buňkách

Kompletní klon myšího a lidského proteinu vázajícího OPG může být exprimován v savčích buňkách jak bylo dříve popsáno v příkladu 2. Alternativně mohou být cDNA klony modifikovány tak, aby kódovaly secem ováné formy proteinu při jeho expresi v savčích buňkách. Aby se tak stalo, může být přirozený 5’ konec cDNA kódující iniciační kodon a zahrnující přibližně prvních 69 aminokyselin proteinu, včetně transmembránové oblasti, nahrazen vedoucí sekvencí signálního peptidu.

• *

Například sekvence DNA kódující iniciační kodon a signální peptid známého genu mohou být připojen)’ k cDNA sekvenci proteinu vázajícího OPG se začátkem kdekoliv po oblasti kódující aminokyselinový zbytek 68. O výsledných rekombinantních klonech lze předpokládat, že budou tvořit secem ováné formy proteinu vázajícího OPG v savčích buňkách, a mohou podstoupit posttranslační modifikace, které se normálně vyskytují v C-koncové extracelulární doméně proteinu vázajícího OPG, jako je glykosylace. S použitím této strategie byla vytvořena secernovaná forma proteinu vázajícího OPG, která má na svém 5' konci signální peptid myšího OPG, a na svém 3' konci Fc doménu lidského IgGl. Plazmidový vektor pCEP4/muOPG [22-401]-Fc, jak je popsán v patentové přihlášce U.S. č. 08/577 788, podané 22. prosince 1995, byl štěpen Notl, aby se naštěpil mezi 3' koncem OPG a genem Fc. Línearizovaná DNA pak byla částečně štěpena s XmnI, aby se naštěpíla jenom mezi zbytky 23 a 24 OPG se slepým koncem. Restrikční fragmenty pak byly defosforylovány s CIP a vektorová část tohoto fragmentu (včetně zbytků 1-23 OPG a Fc) pak byla purifikována na gelu.

Oblast cDNA myšího proteinu vázajícího OPG kódující aminokyselinové zbytky 69-316 byla amplifíkována pomocí PCR při použití polymerázy Pfu (Stratagene, San Diego, CA) z plazmidového templátu s použitím následujících oligonukleotidů jako primerů:

1602-61: CCT CTA GGC CTG TAC TTT CGA GCG CAG ATG

1602-59: CCT CTG CGG CCG CGT CTA TGT CCT GAA CTT TG

Oligonukleotíd 1602-61 amplifikuje 5' konec genu a obsahuje arteficiální místo Stul. Prímer 1602-59 amplifikuje 3' konec genu a obsahuje arteficiální místo Notl. Výsledný získaný produkt PCR byl štěpen s Notl a Stul, a pak purifikován na gelu. Purifikovaný produkt PCR byl ligován s vektorem a pak použit k transformaci elektrokompetentních

• · buněk E. coli DPI 1 OB. Výsledný klon byl sekvencován pro potvrzení integrity amplifikované sekvence a spojení restrikčních míst. Tento plazmid pak byl použit k transfekci lidských Fibroblastů 293 a fúzní protein vázající OPG-Fc se pak odebíral z kultivačních médií, jak bylo dříve popsáno v patentové přihlášce U.S. č. 08/577 788, podané 22. prosince 1995.

S použitím podobné strategie byl navržen expresní vektor, který je schopný exprese na N-konci zkrácené formy fúzované s Fc doménou lidského IgGl. Tento konstrukt se skládá ze signálního peptidu myšího OPG (aa zbytky 1-21), fúzovaného v rámci ke zbytkům 158-316 myšího proteinu vázajícího OPG, následováno fúzí v rámci k Fc doméně lidského IgGl. Kvůli tomu byl plazmidový vektor pCEP4/myší OPG [22-401] (viz U.S. 08/577 788 ze 22. prosince 1995) štěpen s HindlII a Notl, aby se odstranil celý OPG čtecí rámec. Zbytky myšího proteinu vázajícího OPG 158-316 byly amplifikovány pomocí PCR s použitím templátu z plazmidu pCDNA/32D-F3 a následujících primerů:

1616-44: CCT CTC TCG AGT GGA CAA CCC AGA AGC CTG AGG CCC AGC CAT TTG C

1602-59: CCT CTG CGG CCG CGT CTA TGT CCT GAA CTT TG

1616-44 amplifikuje protein vázající OPG začínající zbytkem 158, a také obsahující zbytky 16-21 signálního peptidu muOPG s arteficiálním místem Xhol. 1602-59 amplifikuje 3’ konec genu a přidává místo Notl do rámce. Produkt PCR byl štěpen s Notl a Xhol a pak purifikován na gelu.

Následující komplementární primeiy byly připojeny k sobě navzájem, čímž vznikl adaptér kódující signální peptid myšího OPG a Kozákovu sekvenci obklopující iniciační místo translace:

1616-41: AGC TTC CAC CAT GAA CAA GTG GCT GTG CTG CGC ACT CCT GGT GCT CCT GGA CAT CA

1616-42: TCG ATG ATG TCC AGG AGC ACC AGC AGT GCG CAG CAC AGC CAC TTG TTC ATG GTG GA

Tyto primery byly připojeny za vzniku 5' přesahujících konců kompatibilních s HindlII na 5' konci a Xhoí na 3' konci. Naštěpený vektor získaný výše, připojené oligonukleotidy a naštěpený PCR fragment byly ligovány dohromady a vneseny elektroporací do buněk DH10B. Výsledný klon byl sekvencován pro potvrzení autentické rekonstrukce spojení mezi signálním peptidem, fragmentem proteinu vázajícího OPG kódujícího zbytky 158-316 a Fc doménou IgGl. Rekombinantní plazmid byl purifikován, transfekován do lidských fibroblastů 293 a produkt byl exprimován v médiu, jak bylo popsáno výše.

Kompletní myší a lidská cDNA byly klonovány v expresním vektoru pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA), a pak transfekovány do kultur lidských fibroblastů 293, jak je popsáno v příkladu 1. Selekce buněčných kultur se prováděla hygromycinem, jak je popsáno výše, a byla připravena upravená média bez séra. Upravená média byla nanesena na kolonu s i mobilizovaným rekombinantním OPG a oddělené formy myšího a lidského rekombinantní proteinu vázajícího OPG se afinitně purifikovaly. Sekvenační analýza N-konce purifikovaných rozpustných proteinů vázajících OPG ukazuje, že myší protein se přednostně štěpí před fenylalaninem 139 a lidský protein se přednostně štěpí před homologním zbytkem, izoleucinem 140. Kromě toho se lidský protein také přednostně štěpí před glycinem 145. To svědčí pro to, že přirozeně se vyskytující rozpustné formy lidského proteinu vázajícího OPG mají aminokoncové zbytky buď izoleucin v pozici 140 nebo glycin v pozici 145.

Příklad 11

Peptidy proteinu vázajícího OPG a příprava polyklonálních a monoklonálních protilátek k proteinu

Protilátky ke specifickým oblastem proteinu vázajícího OPG mohou být získány imunizací peptidy z proteinu vázajícího OPG. Tyto peptidy mohou být použity samotné nebo mohou být pro imunizaci použity konjugované formy peptidu.

Krystalická struktura maturovaného TNFa byla popsána v práci E.Y.Jones, D.I. Stuart a N.P.C. Walker (J. Cell Sci. Suppl., 13, 11-18, 1990) a monomer tvoří sendvičovou strukturu antiparalelních β-skládaného listu s topologií svinuté palačinky. V této krystalické struktuře se vyskytuje deset antiparalelních β-pásů a tvoří β-sendvič s jedním β-listem, který se skládá z pásů B'B1DG, a druhým listem z pásů C'CHEF (viz E.Y. Jones et al., výše). Ze studia mutageneze se odvozuje, že dvě smyčky maturovaného TNFa tvoří kontakty s receptorem, a že to jsou smyčky tvořené mezi beta pásem B a B’ a smyčka mezi beta pásy E a F (C.R. Goh, C-S. Loh a A.G. Porter, Protein Engineering, 4, 785791, 1991). Byla rozřešena krystalická struktura komplexu tvořeného mezi ΤΝΡβ a extracelulární doménou 55 kD receptoru TNF (TNF-R55) a byly popsány kontakty receptor-ligand (D.W. Banner, A. D’Arcy, W.Janes, R. Gentz, H.J. Schoenfeld, C. Broger, H. Loetscher a W. Lesslauer, Cell, 73, 431-445, 1993). V souladu se studiemi mutageneze popsanými výše (C.R. Goh et al., výše) se shledalo, že odpovídající smyčky BB’ a EF ligandu TNF β tvoří většinu kontaktů s receptorem v odhalené krystalické struktuře komplexu TNFb:TNF-R55. Aminokyselinová sekvence myšího proteinu vázajícího OPG byla srovnána s aminokyselinovou sekvencí TNFa a TNF β. Na základě tohoto srovnání byly předpověděny oblasti myšího proteinu vázajícího OPG odpovídající smyčkám BB’ a EF a byly navrženy peptidy, které jsou popsány níže.

Antigen(y):

Rekombinantní myší protein vázající OPG [158-316] byl použit jako antigen (ag) pro imunizaci zvířat, jak je popsáno níže, a bylo vyšetřeno sérum s použitím přístupů popsaných níže. Byly syntetizovány peptidy k předpokládaným smyčkám BB' a EF myšího proteinu vázajícího OPG a byly použity pro imunizaci, tyto peptidy jsou:

Peptid BB' smyčky: NH2-NAAS1PSGSHKVTLSSWYHDRGWAKIS—COOH

Cys-peptid BB' smyčky: NH2-NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKISC— —COOH

Peptid EP smyčky: NH2—VYVVKTSIKIPSSHNLM—COOH

Cys-peptid EF smyčky: NH2—VYVVKTSIKIPSSHNLMC—COOH

Peptidy s cysteinovým zbytkem na karboxylovém konci byly použity pro konjugaci s použitím metod popsaných v části B níže a byly použity pro imunizaci.

B. Konjugace s hemocyaninem z přílipky Fissurella sp. nebo s albuminem bovinního séra:

Vybrané peptidy nebo proteinové fragmenty mohou být konjugovány s hemocyaninem z přílipky Fissurella sp. (KLH, keyhole limpet hemocyanin), aby se zvýšila jejich schopnost imunizovat zvířata. V protokolu EIA mohou být použity také peptidy nebo proteinové fragmenty konjugované s albuminem bovinního séra (BSA). Maleimidem aktivovaný KLH nebo BSA (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) se rekonstituuje v dHžO na konečnou koncentraci 10 mg/ml. Peptid nebo proteinové fragmenty se rozpustí ve fosforečnanovém pufru a pak se smísí • · s ekvivalentní hmotností (g/g) KLH nebo BSA. Konjugační směs se ponechá reagovat 2 hodiny při teplotě místnosti za jemného míchání. Roztok se pak nechá projít odsolovací kolonou nebo se dialyzuje proti PBS přes noc. Peptidový konjugát se uloží v -20 °C dokud se nepoužije pro imunizaci nebo v EIA.

Imunizace:

Myším Balc/c (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), krysám Lou nebo králíkům (Novozélandský bílý) byl subkutánně injekčně (SQI) podán ag (50 pg, 150 pg a 100 pg, v uvedeném pořadí), emulgován v kompletním Freundově adjuvans (CFA, 50% objem/objem, Difco Laboratoires, Detroit, Ml). Králíci pak dostávali dvakrát nebo třikrát ve dvoutýdenních intervalech zesilovací dávku antigenů připraveného podobným způsobem v nekompletním Freundově adjuvans (ICFA, Difco Laboratoires, Detroit, Ml). Myši a krysy dostávaly zesilovací dávku přibližně každé 4 týdny. Sedm dnů po druhé injekci se odebíraly zkušební vzorky krve a určovaly se titry protilátek v séru. Když se objevily titry u králíků, odebíralo se 6 následujících týdnů 50 ml krve týdně. Myši a krysy se vybíraly na základě sérové hladiny titru pro tvorbu hybridomu, byla použita zvířata s polovičním maximálním titrem větším než 5000. Odborník může provést úpravy⁷ imunizačního protokolu, například nyní jsou dostupné různé typy⁷ imunomodulátorů, které mohou být do tohoto protokolu zahrnuty.

D. Test s enzymem vázaným na imunosorbent (EIA, Enzyme-linked immunosorbent assay):

EIA se může provádět pro určení titrů sérových protilátek (ab) u jednotlivých zvířat a později pro screening potenciálních hybridomů. 96 jamkové mikrotitrační EIA/RIA destičky s plochým dnem a vysokou schopností vazby (Costar Corporation, Cambridge, MA) byly povlečeny purifikovaným rekombinantním proteinem nebo proteinovými fragmenty • ·

(antigen, ag) v množství 5 pg per ml v uhlíčitan-hydrogenuhličitanovém pufru, pH 9,2 (0,015 M NasCOs, 0,035 M NaHCOs). Proteinové fragmenty mohou být konjugovány s albuminem bovinního séra (BSA), je-li to nutné. 50 μΐ ag se přidalo do každé jamky. Destičky pak byly pokryty acetátovým filmem (ICN Biomedicals, lne., Costa Mesa, CA) a inkubovaly se při teplotě místnosti na kývacím stolečku 2 hodiny nebo přes noc ve 4 °C. Destičky se blokovaly 30 minut při teplotě místnosti (rt) 250 μΐ na jamku 5% roztoku BSA připraveného smísením 1 části ředidla BSA/koncentrátu blokovacího roztoku (Kirkegaard a Perry Laboratoires, lne., Gaithesburg, MD) s 1 částí deionizované vody (dl-BO). Blokovací roztok byl odstraněn, do každé jamky se přidalo 50 μΐ dvojkového ředění séra (1:100 až 1:12 800) nebo supernatantu tkáňové kultur}' hybridomu. Sérum je ředěno 1% BSA (10% BSA ředidlo/koncentrát blokovacího roztoku ředěno 1:10 Dulbeccovým fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnany, D-PBS, Gibco BRL, Grand Island, NY), zatímco supematanty hybridomu se testovaly neředěné. V případě sereeningu hybridomu je jedna jamka udržována jako kontrola konjugátu a druhá jamka jako pozitivní ab kontrola. Destičky se opět inkubují při teplotě místnosti, kývají 1 hodinu a pak se 4 x promyjí lx ředěním 20x koncentrovaného promývacího roztoku (Kirkegaard a Perry Laboratoires, lne., Gaithesburg, MD) v dbbO. Sekundární ab konjugovaná s křenovou peroxidázou (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) ředěná v 1% BSA se pak v každé jamce inkubuje 30 minut. Destičky se promyjí jako předtím, odsají do sucha, a přidá se jednosložkový substrát ABTS peroxidáza (Kirkegaard a Perry Laboratoires, lne., Gaithesburg, MD). Pro každou jamku se odečte absorbance ve 405 nm za použití odečítacího přístroje Microplate EL310 (Bio-Tek Instruments, lne., Winooski, VT). Poloviční maximální titr sérové protilátky se vypočetl vynesením logio sérového ředění proti optické denzitě při 405 nm, a pak extrapolací 50% bodu maximální optické denzity získané pro toto sérum. Hybridomy se vybíraly jako pozitivní, jestliže hodnota optické denzity je větší než pětinásobek

• · pozadí. Mohou se provést úpravy' tohoto protokolu, například může být vybrána konjugovaná sekundární protilátka pro svou specifičnost nebo proto, že neprojevuje zkříženou reaktivitu.

Fúze buněk:

Zvířeti vybranému pro vytvoření hybridomu se intravenozně injikuje 50 až 100 pg ag v PBS. Čtyři dny později se zvíře usmrtí oxidem uhličitým a za sterilních podmínek se mu odebere slezina do 35 ml Dulbeccova modifikovaného Eagleho média obsahujícího 200 U/ml penicilinu G, 200 pg/ml streptomycinsulfátu a 4 mM glutamin (2x P/S/G DMEM). Slezina je očištěna od přebytečné tukové tkáně, a pak propláchnuta ve čtyřech miskách s čistým 2x P/S/G DMEM. Poté je přenesena do sterilního váčku Stomacher (Tekmar, Cincinnati, OH) obsahujícího 10 ml 2x P/S/G DMEM a rozrušena na suspenzi jednotlivých buněk pomocí zařízení Stomacher Lab Blender 80 (Seward Laboratory' UAC House, London, England). Když jsou buňky uvolněny z pouzdra sleziny do média, odstraní se z váčku a přenesou do sterilní 50 ml kónické centrifugační zkumavky (Becton Dickinson and Company, Lincoln Park, NJ). Do váčku se přidá čerstvé médium a v postupu se pokračuje, dokud není uvolněn veškerý buněčný obsah sleziny. Splenocyty se 3 x promyjí pomocí centrifugace v 225 x g 10 minut. Současně se podobným způsobem promyjí kultury myelomových buněk v log fázi, Sp2/0-Agl4 nebo Y3-Agl.2.3 pro myší nebo krysí splenocytové fúze (American Type Culture Collection, Rockville, MD) pěstované v kompletním médiu (DMEM, 10% inaktivované fetální bovinní sérum, 2 mM glutamin, 0,1 mM neesenciální aminokyseliny, 1 mM pyruvát sodný a 10 mM hepes pufr, Gibco Laboratories, Grand Island, NY). Splenocytyy se spojí s myelomovými buňkami a znovu se peletují. Z buněčného peletu se odsálo médium a buňky se jemně smísily během 1 minuty se 2 ml polyetylenglykolu 1500 (PEG 1500, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN). Pak se pomalu přidal stejný objem 2x P/S/G DMEM. Buňky⁷ se ponechaly • · fúzovat 2 minuty při 37 °C, a pak se přidalo dalších 6 ml 2x P/S/G DMEM. Buňky se opět nechaty ve 37 °C 3 minuty. Nakonec se k buněčné suspenzi přidalo 35 ml 2x P/S/G DMEM a buňky se peletovaly stočením. Z peletu se odsálo médium a buňky' se jemně resuspendovaly v kompletním médiu. Buňky se rozptýlily na 96 jamkové destičky pro tkáňové kultury s plochým dnem (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) jednou kapkou z 5 ml pipety. Destičky se inkubovaly přes noc ve zvlhčovaném vzduchu s 5% CCb při 37 °C,. Příští den se do každé jamky přidal stejný objem selekčního média. Selekční médium sestávalo z 0,1 mM hypoxanthinu, 4 x 10 ⁴ mM aminopterinu a 1,6 x 10 ² mM thymidinu v kompletním médiu. Fúzní destičky se inkubovaly 7 dnů, pak během dalších tří dnů se dvakrát vyměnilo médium, po každé výměně se použilo HAT selekční médium. Supernatanty tkáňových kultur se odebíraly 3 až 4 dny po poslední výměně tekutin z každé jamky obsahující hybrid a testovaly se pomocí El A na specifickou protilátkovou reaktivitu. Tento protokol byl modifikován podle protokolu v práci Hudsona a Haye (Practical Imunology, druhé vydání, Blackwell Scientific Publications).

Příklad 12

Klonování receptorů proteinu vázajícího OPG exprimovaného v hemopoetických prekurzorovýcb buňkách

Biologicky aktivní rekombinantní myší protein vázající OPG [158316] se konjugoval s fluorescein-izothiokyanátem (FITC) za vzniku fluorescenční sondy. Fluorescenční značení se provádělo inkubací rekombinantního myšího proteinu vázajícího OPG [158-316] se sukcimydylesterem 6-fluorescein-5-(a 6)karboxyamidohexanové kyseliny (Molecular Probes, Eugene, OR) v molárním poměru 1:6 12 hodin ve 4 °C. Protein vázající OPG [158-316] značený FITC se dále purifikoval gelovou filtrační chromatografií. Buňky kostní dřeně myší se izolovaly a inkubovaly v kultuře za přítomnosti CSF-1 a proteinu vázajícího OPG [158-316], jak je popsáno v přikladu 10. Buňky kostní dřeně myší se pěstovaly přes noc v CSF-1 (30 ng/ml) a proteinu vázajícího OPG [158316] (20 ng/ml). Nejdříve se odstranily neadherující buňky a uložily na ledu a zbývající adherentní buňky se odstranily inkubací s pufrem pro disociaci buněk (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), spojily se s neadherující populací a označily s FITC-proteinem vázajícím OPG, jak je popsáno výše. Po promytí a resuspendování v PBS s 0,5% BSA se buňky vystavily FITC-proteinu vázajícímu OPG, promyly a třídily pomocí FACS. Populace buněk, které byly pozitivní na značení FITC-proteinem vázajícím OPG se soustředila a izolovala se mRNA, jak je popsáno v příkladu 2. Tento preparát mRNA se použil pro přípravu cDNA knihovny následujíc postupy popsané v příkladu 2.

cDNA knihovna tvořená z tohoto zdroje byla použita pro náhodnou EST sekvenační analýzu, jak bylo dříve popsáno v PCT přihlášce č. WO97/23614 a v práci Simoneta et al. (Cell, 89, 309-319, 1997). S použitím této metody byla objevena cDNA o velikosti —2,1 kb, která kóduje nový protein příbuzný TNFR. Dlouhý otevřený čtecí rámec cDNA myšího ODAR kóduje protein o 625 aminokyselinových zbytcích a obsahuje charakteristické znaky proteinů příbuzných s TNFR: hydrofobní signální peptid na N-konci, čtyři sekvence tandemové repetice bohaté na cystein, hydrofobní transmembránovou doménu a cytoplazmatickou signální doménu. Homologie tohoto proteinu s jinými členy rodiny receptoru TNF a jeho exprese v buňkách kostní dřeně, které vážou protein vázající OPG značený FITC, svědčí pro to, že je to potenciální receptor pro protein vázající OPG, který je příbuzný s TNF. Tento protein je označen ODAR neboli osteoklastový diferenciační a aktivační receptor. Sekvence nukleové kyseliny a predikovaná aminokyselinová sekvence myšího ODAR je ukázána na obrázku 10.

Nedávná analýza sekvencí z veřejně dostupných databází naznačuje, že tento protein je myší homolog lidského proteinu příbuzného s TNFR známého jako RANK (Anderson et al., Nátuře, 390, 175-179, 1997).

Příklad 13

Příprava rekombinantního proteinu ODAR v savčích buňkách

Rozpustná extracelulární doména ODAR fúzovaná k oblasti Fc lidského IgGl se připravila s použitím postupů pro konstrukci a expresi Fc fúzních proteinů, jak bylo dříve popsáno v dokumentu WO97/23614 a v práci Simoneta et al., výše. Aby se v savčích buňkách tvořil rozpustný protein ODAR, byla pomocí PCR amplifikována cDNA kódující extracelulární doménu myšího ODAR (aminokyseliny 27-211) s následující sadou oligonukleotidových primerů:

-TCT CCA AGC TTG TGA CTC TCC AGG TCA CTC C-3'

5'-TCT CCG CGG CCG CGT AAG CCT GGG CCT CAT TGG GTG-3'

Reakce PCR se prováděly v objemu 50 μΐ s 1 jednotkou DNA polymerázy Vent (New England Biolabs) ve 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM KC1, 10 mM (NH^SOy 0,1% Triton-X100, 10 μΜ každého dNTP, 1 μΜ každého primeru a 10 ng cDNA templátu ODAR. Reakce se prováděly v 94 °C 30 s, 55 °C 30 s a 72 °C 1 minutu, celkem 16 cyklů. Fragment PCR se izoloval elektroforézou. Fragment PCR tvořil restrikční místo HindlII na 5' konci a restrikční místo Notl na 3' konci. PCR fragment štěpený HindlII a Notl byl pak subklonován do rámci do modifikovaného vektoru pCEP4-Fc před sekvenci těžkého řetězce lidského IgG-γΙ, jak bylo dříve popsáno ve WO97/23614 a v práci Simoneta et al., výše. Byla vnesena spojka, která kóduje dvě irelevantní aminokyseliny vytvářející spojení mezi extracelulární doménou ODAR a Fc oblastí IgG.

Konstrukt pak byl štěpen s Nhel a HindlII do rámce byl vložen následující spojený oligonukleotidový pár kódující signální peptid OPG (aminokyseliny 1-21):

5'-CTA GCA CCA TGA ACA AGT GGC TGT GCT GCG CAC TCC TGG TGC TCC TGG ACA TCA TTG AAT GGA CAA CCC AGA-3'

5-AGC TTC TGG GTT GTC CAT TCA ATG ATG TCC AGG AGC ACC AGG AGT GCG CAG CAC AGC CAC TTG TTC ATG GTG-3'

Spojka, která kóduje dvě irelevantní aminokyseliny byla vnesena mezi sekvence signálního peptidu OPG a ODAR. Konečný sestrojený konstrukt (ODAR-Fc/pCEP4) kóduje fúzní protein, který obsahuje od aminokonce ke karboxylovému konci: signální pejjtid^PG^aminokyseliny l-21)-spojka (lysLeu)-ODAR (aminokyseliny 27-21 l)-spojka (AlaAla)-lidský IgG Fc.

Konstrukt byl transfekován do buněk 293-EBNA-l kalciumfosforečnanovou metodou, jak je popsána (Ausubel et al., Curr. Prot. Mol. Biol. 1, 9.1.1-9.1.3, 1994). Transfekované buňky pak byly selektovány v 200 pg/ml hygromycinu (Gibco BRL) a výsledné kultury rezistentní na lék byly spojeny a pěstovány až dosáhly konfluence. Buňky byly promyty jednou v PBS a pak pěstovány v médiu bez séra 72 hodin. Upravená média se odebrala. Fúzní protein ODAR-Fc v médiu se detekoval analýzou westernová přenosu a proti-lidskou protilátkou IgG Fc.

Fúzní protein Fc se purifikoval pomocí chromatografie na koloně s proteinem-A (Pierce) s použitím postupu doporučeného výrobcem. 50 pmol purifikovaného proteinu pak podstoupilo analýzu N-koncové sekvence automatizovanou Edmanovou degradací, jak byla původně popsána autorem Matsudaira et al. (J. Biol. Chem., 262, 10-35, 1987). Po 10 cyklech byla odečtena následující aminokyselinová sekvence:

nh₂-k lvtlqvtp - co₂h.

Vazebná aktivita ODAR-Fc s proteinem vázajícím OPG se vyšetřovala imunofluorescenčním značením kultur transfekovaných buněk COS-7, jak je popsáno v přikladu 2. Do buněk COS-7 byl pomocí lipofektinu vnesen 1 pg expresního vektoru obsahujícího DNA kódující myší protein vázající OPG. Po 48 hodinách inkubace se pak buňky inkubovaly 1 hodinu při 4 °C v roztoku PBS-FBS obsahujícím 10 pg/ml lidského proteinu IgG Fc, ODAR-Fc nebo OPG-Fc. Pak byly buňky dvakrát promyty PBS a inkubovaly se další hodinu v roztoku PBS-FBS obsahujícím 20 pg/ml kozího proti-lidského IgG značeného FITC (Southern Biotech Associates). Po promytí PBS se buňky vyšetřovaly konfokálním mikroskopem (ACAS, Ultima, ínsight Biomedicallmaging, lne., Okemos, MI). Oba, ODAR-Fc a OPG-Fc se vážou na OPGL transfekované buňky COS-7 (obrázek 11).

Příklad 14

Biologická aktivita rekombinantního rozpustného ODAR in vitro

Schopnost ODAR inhibovat stimulaci tvorby osteoklastů prostřednictvím proteinu vázajícího OPG se určovala v kultuře kostní dřeně myší za přítomnosti CSF-1 (30 ng/ml) a proteinu vázajícího OPG (5 ng/ml). Postupy, jak použít kultury kostní dřeně myší pro studium maturace osteoklastů, jsou popsány v dokumentu WO97/23614 a v příkladu 8. Fúzní protein ODAR-Fc, vytvořený jak je popsáno v příkladu 12, se přidával v koncentracích od 65 do 1500 ng/ml. Tvorba osteoklastů se určovala cytochemickým postupem s alkalickou fosfatázou rezistentní na tartrát (TRAP) a testem roztoku TRAP po 5 dnech kultury.

Jak při cytochemickém postupu, tak při stanovení aktivity TRAP se pozorovala inhibice tvorby osteoklastů fúzí ODAR-Fc závislá na dávce (obrázek 12). Fúzní protein ODAR-Fc inhiboval tvorbu osteoklastů s ED50 přibližně 10-50 ng/ml.

Příklad 15

Biologická aktivita rekombinantního rozpustného ODAR in vivo

Mladí rychle rostoucí samci myší BDF1 staří 3-4 týdny dostávali různé dávky fúzního proteinu ODAR-Fc v nosiči (PBS/0,1% BSA) 4 dny jednou denní subkutánní injekcí. Myši se v den 5 rentgenovaly. Použité dávky fúzního proteinu ODAR-Fc byly 0,5, 1,5 a 5 mg/kg/den. Pro každé ošetření byly myši leže skupiny a kontrolní skupím, ktere dostaly PBS/0,1% BSA, rentgenovány na jeden film. Mezi páry kontrolních a ošetřených tibií se porovnávala metafyzální oblast proximální tibie a ohodnocovala se jako „+“, jestli měla ošetřená tibie vyšší denzitu při vizuálním hodnocení než kontrola dávající 8 bodů ukázaných níže. Pro „pozitivní“ výsledek se vyžadovalo arbitrární skóre 5/8. (Dávka je v mg/kg/den). (n=4).

Po usmrcení zvířat byla každému zvířeti odstraněna pravá tibie a měřila se hustota kosti v proximální tibiální metafýze periferní kvantitativní počítačovou tomografií (pQCT) (Stratec, Německo). Dva příčné řezy kostí o velikosti 0,5 mm, 1,5 mm a 2,0 mm z proximálního konce tibie se analyzovaly (XMICE 5.2, Stratec, Německo), aby se určila celková hustota minerálů kosti v metafýze. Pro určení hranice metafyzální kosti od měkké tkáně byl použit separační práh 1500.

Podávání ODAR-Fc inhibovalo u mladých rostoucích myší resorpci kosti v růstové destičce proximální tibie za tvorby oblasti zvýšené denzity kosti, která byla okem viditelná na radiogramech. Radiografické změny byly patrné při dávce 1,5 mg/kg/den a výše ve dvou pokusech (tabulka 1).

Měření hustoty kosti pomocí pQCT u vzorků z druhého pokusu v podobné oblasti tibie potvrdilo u těchto myší zvýšení hustoty kosti závislé na dávce (obrázek 13).

Tabulka 1: Inhibice resorpce kosti fúzním proteinem ODAR-Fc

Pokus č. 1

Faktor	Dávka	1	2	3	4	5	6	7	8	Výsledek
ODAR-Fc	5,0	+	+	+	+	+	+	+	+	Pozitivní 8/8
ODAR-Fc	1,5	-	+	+	-	+	+	+	+	Pozitivní 6/8
ODAR-Fc	0,5									Negativní 0/8
ODAR-Fc	0,15									Negativní 0/8

Pokus č. 2

Faktor	Dávka	1	2	3	4	5	6	7	8	Výsledek
ODAR-Fc	5,0	+	+	+	+	+	+	+	+	Pozitivní 8/8
ODAR-Fc	1,5	+	+	+	+	+	+	+	+	Pozitivní 8/8
ODAR-Fc	0,5	-	-	-	+	-	-	-	-	Negativní 1/8

Zatímco byl předkládaný⁷ vynález popsán pomocí výhodných provedení, rozumí se, že odborníkovi jsou zjevné variace a modifikace. Předkládaný vynález, definovaný připojenými patentovými nároky, tudíž pokrývá všechny takové variace, které spadají do rozsahu vynálezu, jak je posán v patentové přihlášce.

?(/ W-??

Claims (1)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Izolovaná nukleová kyselina kódující protein vázající osteoprotegerin, která je vybraná ze skupiny obsahující:

   a) sekvenci nukleové kyseliny dle obr. 1 (sekvence i. č. 1) a sekvenci dle obr. 4 (sekvence i. č. 2),

   b) nukleové kyseliny, které hybridizují s polypeptid kódujícími úseky sekvencí dle obr. 1 (sekvence i. č. 1) a dle obr. 4 (sekvence i. č. 2) a zůstávají hybridizované i ve vysoce stringentních podmínkách, a

   c) nukleové kyseliny, které jsou degenerované vzhledem k nukleovým kyselinám podle a) nebo b).

   2. Nukleová kyselina podle nároku 1, která je cDNA, genomová

   DNA, syntetická DNA nebo RNA. ’ .

   3. Polypeptid, který je kódován nukleovou kyselinou podle nároku 1.

   4. Nukleová kyselina podle nároku 1, která obsahuje jeden nebo několik kodonů, které jsou výhodné pro expresi v Escherichia coli.

   5. Nukleová kyselina podle nároku 1, která má na sebe navázanou detekovatelnou značku.

   6. Nukleová kyselina kódující polypeptid, který obsahuje aminokyselinové sekvence zbytků 1 až 316 a 70 až 316 podle obr. 1 (sekvence i. č. 1).

   7. Nukleová kyselina kódující polypeptid, který obsahuje aminokyselinové sekvence zbytků laž317 a 69 až 317 podle obr. 4 (sekvence i. č. 2).

   8. Nukleová kyselina, která kóduje rozpustný protein vázající osteoprotegerin.

   9. Nukleová kyselina podle nároku 8 kódující polypeptid, který obsahuje aminokyselinové zbytky 69 až 317 podle obr. 4 (sekvence i. č. 2) a zkrácené verze téhož polypeptidu.

   10. Expresní vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 1 a 9.

   11. Expresní vektor podle nároku 10, kde nukleová kyselina obsahuje polypeptid kódující úsek uvedený na obr. 1 (sekvence i. č. 1) a obr. 4 (sekvence i. č. 2). 12. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná expresním vektorem podle nároku 10.

   13. Hostitelská buňka podle nároku 12, která je eukaiyotická nebo prokaryotická buňka.

   14. Hostitelská buňka podle nároku 13, která je Eschrichia coli.

   15. Způsob přípravy proteinu vázajícího osteoprotegerin vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se :

   kultivují za vhodných nutričních podmínek hostitelské buňky transformované nebo transfekované nukleovou kyselinou podle nároku 1, a izoluje polypeptidový produkt exprese nukleové kyseliny.

   16. Polypeptid připravený způsobem podle nároku 15.

   # ·

   17. Purifikovaný a izolovaný protein vázající osteoprotegerin nebo jeho fragment, analog nebo derivát.

   18. Protein podle nároku 17, který je lidský osteoprotegerin.

   19. Protein podle nároku 17, který má aminokyselinovu sekvenci jak je uvedena na obr. 1 (sekvence i. č. 2) a obr. 4 (sekvence i. č. 4).

   20. Protein podle nároku 17, který byl ko valen tně modifikován polymerem rozpustným ve vodě.

   21. Protein podle nároku 20, kde polymer je polyetylénglykol.

   22. Protein podle nároku 17, který je rozpustný protein vázající osteoprotegerin.

   23. Protein podle nároku 22, který obsahuje aminokyselinovu sekvenci zbytků 70 až 316, včetně, dle obr. 1 (sekvence i. č. 1), nebo jeho fragment, analog nebo derivát.

   24. Protein podle nároku 22, který obsahuje aminokyselinovu sekvenci zbytků 69 až 317, včetně, dle obr. 4 (sekvence i. č. 2), a jeho zkrácené formy.

   25. Protilátka, která se specificky váže na protein vázající osteoprotegerin, nebo její fragment.

   26. Protilátka podle nároku 25, která je monoklonální protilátka.

   « · « • » «

   27. Způsob detekce přítomnosti proteinu vázajícího osteoprotegerin v biologických vzorcích vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se:

   inkubuje vzorek s protilátkou podle nároku 25 v podmínkách, které dovolují navázání protilátky k proteinu vázajícímu osteoprotegerin, a detekuje navázaná protilátka.

   28. Způsob detekce přítomnosti osteoprotegerinu v biologických vzorcích vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se:

   inkubuje vzorek s proteinem vázajícím osteoprotegerin v podmínkách, které dovolují navázání proteinu k osteoprotegerinu, a měří navázaný protein vázající osteoprotegerin.

   29. Způsob hodnocení schopnosti testovaných sloučenin vázat se na protein vázající osteoprotegerin vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se:

   inkubuje proteinem vázající osteoprotegerin s testovanou sloučeninou v podmínkách, které dovolují navázání, a měří se navázaná sloučenina.

   30. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že sloučenina je agonista nebo antagonista proteinu vázajícího osteoprotegerin.

   31. Způsob regulace exprese proteinu vázajícího osteoprotegerin u zvířete vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se zvířeti podá nukleová kyselina komplementární k nukleovým kyselinám dle obr. 1 (sekvence i. č. 1) a obr. 4 (sekvence i. č. 2).

   32. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeutoicky účinné množství proteinu vázajícího • « « ··· · · · « · « · ♦ · · · · · · · • e « · · · · *· ··· ··· ··· ·· *· osteoprotegerin s farmaceuticky přijatelným nosičem, adjuvans, solubilizačním činidlem, stabilizátorem a/nebo antioxidantem.

   33. Přípravek podle nároku 32 vyznačující se tím, že protein vázající osteoprotegerin je lidský protein vázající osteoprotegerin.

   34. Způsob prevence nebo léčení nemocí kostí u savců vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se podá terapeuticky účinné množství modulátoru proteinu vázajícího osteoprotegerin.

   35. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že modulátor je rozpustná forma proteinu vázajícího osteoprotegerin.

   36. Způsob podle nároku 35 v y z n a č ují c i se tím, že modulátor je protilátka, která se specificky váže k proteinu vázajícímu osteoprotegerin, nebo její fragment.

   37. Protein podle nároku 22, který obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků 140 až 316, včetně, dle obr. 4 (sekvence i. č. 2) nebo jeho fragment, analog nebo derivát.

   38. Protein podle nároku 22, který obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků 145 až 316, včetně, dle obr. 4 (sekvence i. č. 2) nebo jeho fragment, analog nebo derivát.

   39. Způsob prevence nebo léčení nemocí kostí u savců vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se podá terapeuticky účinné množství modulátoru diferenciačního a aktivačního receptoru osteoklastů.

   • <» · • · · » « · * · ·· ·· φ · · »· · • · · · * · »

   9« ··· »*· ··· »· *·

   40. Způsob podle nároku 39 vyznačující se tím, že modulátor je rozpustná forma diferenciačního a aktivačního receptoru osteoklastu.

   41. Způsob podle nároku 39 vyznačující se tím, že modulátor je protilátka, která se specificky váže na osteoklastový diferenciační a aktivační faktor, nebo její fragment.

   42. Způsob hodnocení schopnosti testované sloučeniny zvyšovat nebo snižovat vazbu proteinu vázajícího osteoprotegerin k ODAR vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se:

   inkubuje protein vázající osteoprotegerin, ODAR a případně testovaná sloučenina v podmínkách, které dovolují navázání proteinu vázajícího osteoprotegerin na ODAR, a měří navázání proteinu vázajícího osteoprotegerin na ODAR v přítomnosti či nepřítomnosti testované sloučeniny.

   GAGCTCGGAT CCACTACTCG ACCCACGCGT CCGGCCAGGA CCTCTGTGAA CCGGTCGGGG

   1/30

   o ID ro τ—1 CS Γ- CS r^· rH τ—1 CS cs

   0 CP 0 0 4t 0 O Em << 0 0 0 0 CM 0 o 0 M LD 0 Φ 0 Ρί 0 0 «< cn 0 r-l 0 0 0 0 0 0 tú 0 0 r—1 0 o < 0 0 Φ CS 0 0 0 tp CO 0 0 0 >1 H 0 0 << 0 r—1 0 0 0 0 E^ 0 tP 0 0 0 4-1 Em 0 0 Φ 0 0 0 4-1 v—1 < S 0 0 E-< 0) 0 3 0 0 s < r—f 0 Em 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 r*H 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G in 0 0 0 0 Φ t—1 Em ca 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Φ Em Η 0 ω 0 0 0 0 0 0 tn 0 0 0 0 0 H 0 < 0 H 0 0 0 3 H H φ 0 0 41 0 0 0 0 0 0 M 0 0 0 >1 < 0 0 E-i 0 0 0 0 0 0 M O 0 0 0 >1 t—1 H 0 43 0 0 0 0 >1 0 ·< 0 i-l 0 0 0 0 0 0 0 O 0 0 0 0 0 >1 Em 0 0 Em Em 0 0 0 0 0 0 a 0 0 0 < w 0 0 Em 0 0

   σ> r—1 CO fO 0 3 i—1 Em Φ < 0 43 O 0 Ó M Em Φ (X. 0 41 Φ 0 10 i-H 0 rM < 0 < 4| LD 0 3 Φ ro Em Φ ω 0 43 o 0 Φ cm Em CM fd 0 xi r-H E4 Φ < S o 0 M 0 Φ 04 Em ω W 0 tP 0 L x 0 < 3 o 0 4 Φ co 0 Φ 43 Em ω O 0 (0 M 0 rM CM 0 < 0 (0 r—{ 0 i-l 0 0 < 3 0 0 0 M 0 0 CM tn < 0 •r4 0 H X 0 CM O in 0 0 M cs 0 Ml CM 0 CM ι—1 0 (0 tú 0 i-l > 0 < >1 0 0 r-l 0 M 0 0 CM