CZ302262B6 - Izolovaná nukleová kyselina, polypeptid kódovaný touto nukleovou kyselinou, expresní vektor obsahující tuto nukleovou kyselinu, hostitelská bunka transfekovaná tímto expresním vektorem, izolovaný protein vázající osteoprotegerin, protilátka vázající - Google Patents

Abstract

Nový polypeptid, protein vázající osteoprotegerin, který se podílí na zrání osteoklastu, byl identifikován na základe jeho afinity k osteoprotegerinu. Popisují se také sekvence nukleových kyselin kódující polypeptid, nebo jeho fragment, analog ci derivát, vektory a hostitelské bunky a zpusoby pro prípravu proteinu vázajícího osteoprotegerin, a také vazebné testy. Dále se poskytují prípravky k lécení nemocí kostí jako je osteoporóza, ztráty kostní hmoty v dusledku artritidy nebo metastáz, hyperkalcémie nebo Pagetova nemoc. Popisují se také receptory proteinu vázajících osteoprotegerin. Receptory a jejich agonisté ci antagonisté se mohou také užít k lécení nemocí kostí.

Description

Izolovaná nukleová kyselina, polypeptid kódovaný touto nukleovou kyselinou, expresní vektor obsahující tuto nukleovou kyselinu, hostitelská buňka transfekovaná tímto expresním vektorem, izolovaný protein vázající osteoprotegerin, protilátka vázající protein vázající osteoprotegerin, způsob detekce přítomnosti proteinu vázajícího osteoprotegerin, způsob vyhodnocení schopností testované sloučeniny a použití této sloučeniny jako modulátoru

Oblast techniky

Vynález se týká izolované nukleové kyseliny, polypeptidu kódovaného touto nukleovou kyselinou, expresního vektoru obsahujícího tuto nukleovou kyselinu, hostitelské buňky transfekované tímto expresním vektorem, izolovaného proteinu vázajícího osteoprotegerin, protilátky vázající protein vázající osteoprotegerin, způsobu detekce přítomnosti proteinu vázajícího osteoprotegerin, způsobu vyhodnocení schopnosti testované sloučeniny a použití této sloučeniny jako modulátoru.

Dosavadní stav techniky

Živá kostní tkáň projevuje dynamickou rovnováhu mezi depozici a resorpcí kosti. Tyto procesy jsou zprostředkovávány dvěma typy buněk: osteoblasty, které vylučují molekuly vytvářející organickou hmotu kosti, a osteoklasty, které podporují rozpouštění kostní hmoty a solubilizaci kostních solí. U mladých jedinců s rostoucími kostmi rychlost kostní depozice je vyšší než rychlost resorpce kosti, zatímco u starších jedinců je rychlost resorpce vyšší než rychlost depozice. V tomto druhém případě zvýšený rozklad kostí vede ke snížení hmotnosti kosti ajejich pevnosti, zvyšuje riziko fraktur a v případě fraktury zpomaluje nebo znemožňuje obnovu kosti.

Osteoklasty jsou velké fygocytující mnohojademé buňky, které se tvoří zprekurzorů hematopoetické řady v kostní dřeni. Ačkoliv růst a tvorba zralých funkčních osteoklastů nejsou dosud dostatečně prozkoumány, má se za to, že osteoklasty dozrávají společně s buněčnou řadou monocyty/makrofágy pod vlivem řady faktorů podporujících růst. Věří se, že časný vývoj prekurzorových buněk kostní dřeně na proosteoklasty je zprostředkován rozpustnými faktory jako jsou nádorový nekrotický faktor a (TNF-a), nádorový nekrotický faktor β (TNF-β), interleukin 1 (IL-1), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6) a leukemický inhibiční faktor (LIF). V buněčné kultuře se prosteoklasty vytvářejí v přítomnosti přidaného faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (M-CSF). Tyto faktory jsou primárně účinné v raných fázích vývoje osteoklastů. V odborné literatuře není mnoho údajů o polypeptidových faktorech v terminálních stadiích vývoje osteoklastů. Bylo však publikováno, že parathormon stimuluje tvorbu a aktivitu osteoklastů a že kalcitonin má protichůdný účinek, avšak v menším rozsahu.

Nedávno byl popsán nový polypeptidový faktor nazvaný osteoprotegerin (OPG), který negativně reguluje tvorbu osteoklastů in vitro a in vivo (viz patentová přihláška US 08/577 788 podaná 22. prosince 1995, US 08/706 945 podaná 3. září 1996 a US 08/771 777 podaná 20. prosince 1996, dosud v řízení, a publikace PCT přihlášky WO96/26271). OPG dramaticky zvyšuje hustotu kosti u transgenních myší exprimujících polypeptid OPG a snižuje ztráty kostní hmoty, pokud se podává krysám po ovariektomii. Analýza aktivity OPG při tvorbě osteoklastů in vitro ukázala, že OPG nijak nepůsobí na růst a diferenciaci prekurzorů monocytů/makrofágů, ale spíše blokuje diferenciaci osteoklastů z prekurzorů monocytů/makrofágů. Takže OPG zřejmě specificky reguluje rozsah tvorby osteoklastů.

OPG obsahuje dvě polypeptidové domény, které mají odlišné strukturní a funkční vlastnosti, Aminokoncová doména obsahující přibližně aminokyselinové zbytky 22 až 194 z celkového polypeptidu (N-koncový methionin je označen 1) vykazuje homologii sjinými členy rodiny receptorů nádorového nekrotického faktoru (TNFR), zejména TNFR-2, zejména v konzervativní

- 1 CZ 302262 B6 vlastnosti domén bohatých na cystein, což je charakteristické pro členy rodiny TNER. Doména karboxylového konce zaujímající aminokyselinové zbytky 194 až 401 neprojevuje významnou homologií s žádnou známou sekvencí. Narozdíl od mnoha dalších Členů rodiny TNER se zdá, že OPG je výlučně secernovaný protein a není zřejmě syntetizován ve formě asociované s membrá5 nou.

Na základě jeho aktivity jako negativního regulátoru tvorby osteoklastů se předpokládá, že OPG váže polypeptidový faktor účastnící se diferenciace osteoklastů, a tím blokuje jeden nebo několik terminálních kroků, které vedou k tvorbě zralých osteoklastů.

io

Bylo proto cílem předkládaného vynálezu identifikovat polypeptidy, které interagují s OPG. Uvedené polypeptidy mohou hrát významnou roli při zrání osteoklastů a mohou být užitečné při léčení nemocí kostí.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je izolovaná nukleová kyselina zvolená ze souboru zahrnujícího:

a) nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci polypeptid-kódující oblasti podle obr. 1 (sekvence i.č. 1) nebo obr. 4 (sekvence i.č, 3);

b) nukleovou kyselinu kódující protein vázající osteoprotegerin podle obr. 1 (sekvence i.Č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4); a

c) nukleovou kyselinu kódující fragment proteinu vázajícího osteoprotegerin podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č, 4), který váže osteoprotegerin.

Výhodně je nukleovou kyselinou cDNA, genomová DNA, syntetická DNA nebo RNA.

Předmětem vynálezu je rovněž polypeptid, který je kódován uvedenou nukleovou kyselinou.

Výhodně nukleová kyselina zahrnuje jeden nebo více kodonů výhodných pro expresi v Escherichia coli.

Výhodně má nukleová kyselina na sebe navázanou detekovatelnou značku.

Výhodně nukleová kyselina kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci zbytků 1-316 nebo zbytků 70-316 podle obr. 1 (sekvence i.č. 2).

Výhodně nukleová kyselina kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci zbytků 1-317 nebo zbytků 69-317 podle obr. 4 (sekvence i.Č. 4).

Výhodná je nukleová kyselina, ve které fragment obsahuje rozpustnou nebo zkrácenou formu 45 proteinu vázajícího osteoprotegerin.

Výhodně nukleová kyselina kóduje polypeptid obsahující zbytky 69-317 podle obr. 4 (sekvence i.č. 4)ajeho zkrácené verze, které vážou osteoprotegerin.

Předmětem vynálezu je rovněž expresní vektor obsahující uvedenou nukleovou kyselinu.

Výhodný je expresní vektor, ve kterém nukleová kyselina obsahuje oblast kódující polypeptid podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4).

Předmětem vynálezu je rovněž hostitelská buňka transfekovaná uvedeným expresním vektorem.

- 9 CZ 302262 B6

Výhodně je hostitelskou buňkou eukaryotická nebo prokaryotická buňka.

Výhodně je hostitelskou buňkou Escherichia coli.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob výroby proteinu vázajícího osteoprotegerin, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

kultivaci za vhodných nutričních podmínek hostitelských buněk transformovaných nebo trans10 formovaných uvedenou nukleovou kyselinou; a izolaci polypeptidového produktu exprese nukleové kyseliny.

Předmětem vynálezu je rovněž izolovaný protein vázající osteoprotegerin obsahující aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4) nebo jeho fragment, který váže osteoprotegerin.

Výhodně protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci podle obr. 4 (sekvence i.č. 4).

Výhodně je proteinem rozpustný protein vázající osteoprotegerin.

Výhodně je protein kovalentně modifikován polymerem rozpustným ve vodě.

Výhodně je polymerem polyethylenglykol.

Výhodně protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci ze zbytků 70-316 včetně podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo její fragment, který váže osteoprotegerin.

Výhodně protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci ze zbytků 69-317 včetně podle obr. 4 (sekvence i.č. 4) nebo její fragment, která váže osteoprotegerin,

Předmětem vynálezu je rovněž protilátka nebo její fragment, která specificky váže protein vázající uvedený osteoprotegerin.

Výhodně je protilátkou monoklonální protilátka.

Výhodně je protilátkou rekombinantní protilátka.

Výhodně je protilátkou chimérická nebo CDR-roubovaná protilátka.

Výhodně je protilátkou lidská protilátka.

Výhodně je protilátkou antagonista proteinu vázajícího osteoprotegerin, který snižuje tvorbu osteoklastů.

Výhodně se protilátka váže k extracelulámí doméně proteinu vázajícího osteoprotegerin sekvence i.č. 4 nebo k fragmentu extracelulámí domény proteinu vázajícího osteoprotegerin sekvence i.č. 4.

Předmětem vynálezu je způsob detekce přítomnosti proteinu vázajícího osteoprotegerin v biolo50 gickém vzorku, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

inkubaci vzorku s uvedenou protilátkou in vitro za podmínek, které umožňují vázání protilátky k proteinu vázajícího osteoprotegerin; a

- detekci vázané protilátky.

-3 CZ 302262 B6

Předmětem vynálezu je rovněž způsob detekce přítomnosti osteoprotegerinu v biologickém vzorku, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

inkubaci vzorku s proteinem vázajícím osteoprotegerin obsahujícím aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (sekvence i.ě. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4) nebo její fragment vázající osteoprotegerin in vitro za podmínek, které umožňují vázání proteinu k osteoprotegerinu; a

- měření vazby proteinu vázajícího osteoprotegerin.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob vyhodnocení schopnosti testované sloučeniny vázat se na protein vázající osteoprotegerin, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

- inkubaci proteinu vázajícího osteoprotegerin obsahujícího aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4) nebo její fragment, který váže osteoprotegerin, s testovanou sloučeninou in vitro za podmínek, které umožňují uvedenou vazbu; a

- měření vázané sloučeniny.

Výhodně je sloučeninou agonista nebo antagonista proteinu vázajícího osteoprotegerin.

Předmětem vynálezu je rovněž použití nukleové kyseliny komplementární k nukleové kyselině podle obr. 1 (sekvence i.č. 1) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 3) pro přípravu léčiva pro regulaci exprese proteinu vázajícího osteoprotegerin.

Výhodně protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci ze zbytků 158-317 podle obr. 4 (sekvence i.č. 4).

Výhodně uvedený protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci ze zbytků 140-317 podle obr. 4 (sekvence i.č. 4).

Předmětem vynálezu je rovněž způsob vyhodnocení schopnosti testované sloučeniny zvyšovat nebo snižovat míru vazby proteinu vázajícího osteoprotegerin k osteoklastovému diferenciačnímu a aktivačnímu receptoru, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

- inkubaci proteinu vázajícího osteoprotegerin obsahujícího aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4) nebo její fragment, analog nebo derivát, osteoklastového diferenciačního a aktivačního receptoru obsahujícího aminokyselinovou sekvenci podle obr. 10 (sekvence i.č. 43) nebo její lidský homolog nebo fragment, analog nebo derivát a případně testované sloučeniny za podmínek umožňujících vazbu proteinu vázajícího osteoprotegerin k osteoklastovému diferenciačnímu a aktivačnímu receptoru; a měření vazby proteinu vázajícího osteoprotegerin k osteoklastovému diferenciačnímu a aktivačnímu receptoru v nepřítomnosti nebo přítomnosti testované sloučeniny.

Předmětem vynálezu je rovněž použití sloučeniny jako modulátoru proteinu vázajícího osteoprotegerin pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení nemoci kostí, při kterém je sloučeninou protilátka nebo její fragment, který váže OPGbp podle obr. 4 (sekvence i.č. 4) a je antagonistou OPGbp.

Výhodně je protilátkou monoklonální protilátka nebo její fragment.

Výhodně je protilátkou rekombinantní protilátka nebo její fragment.

Výhodně je protilátkou chimérická protilátka nebo CDR-roubovaná protilátka.

-4CZ 302262 B6

Výhodně je protilátkou lidská protilátka nebo její fragment.

Výhodně se protilátka nebo její fragment váže k extracelulámí doméně OPGbp nebo se váže k fragmentu extracelulámí domény OPGbp.

Výhodně se protilátka nebo její fragment váže na s membránou sdruženou formu OPGbp. Výhodně se protilátka nebo její fragment váže k rozpustné formě OPGbp.

Výhodně je uvedená sloučenina použita v kombinaci s farmaceuticky přijatelným ředidlem, nosičem, solubilizačním činidlem, emulgačním činidlem, konzervačním činidlem a/nebo adjuvantem.

Výhodně použití dále zahrnuje podání jednoho nebo více kostního morfogenního faktoru, zvole15 něho ze souboru zahrnujícího BMP-1 až BMP-12, transformačního růstového faktoru beta, členu skupiny transformačního růstového faktoru beta, fíbroblastového růstového faktoru zvoleného ze souboru zahrnujícího FGF-1 až FGF-10, inhibitoru interieukinu-l, inhibitoru TNF alfa, parathyro i dál ní ho hormonu, prostaglandinu řady E, bifosfonátu nebo minerálu zlepšujícího stav kostí.

2o Výhodně je nemoc kostí zvolena ze souboru zahrnujícího osteoporózu, osteomyelitidu, hyperkalcemii, osteopenii sdruženou s chirurgickým zákrokem, Pagetovu nemoc, osteonekrózu, úbytek kostní hmoty v důsledku revmatoidní artritidy, periodontální úbytek kostní hmoty, prostetické uvolňování a osteolytickou metastázu.

Byl identifikován nový člen z rodiny nádorového nekrotického faktoru, a sice z cDNA knihovny exprimované v buňkách COS sereeningem s rekombinantním fúzním proteinem OPG-Fc jakožto afinitní sondou. Nový protein je transmembránový protein vázající OPG, který je dle predikce dlouhý 316 aminokyselin a má aminokoncovou cytoplazmatickou doménu, transmembránovou doménu a extracelulámí doménu na karboxylovém konci. Protein vázající OPG podle vynálezu je buďto protein asociovaný s membránou, nebo rozpustný protein.

Předkládaný vynález poskytuje nukleovou kyselinu, která kóduje protein vázající OPG, vektory a hostitelské buňky exprimující polypeptid, a také způsob přípravy rekombinantního proteinu vázajícího OPG. Také poskytuje protilátky nebo jejich fragmenty, které se specificky váží na pro35 tein vázající OPG.

Protein vázající OPG lze užít v testech ke kvantifikaci hladiny OPG v biologických vzorcích, k identifikaci buněk a tkání, které mají protein vázající OPG, a také k identifikaci nových členů rodiny proteinů OPG a proteinů vázajících OPG. Vynález také poskytuje způsoby identifikace sloučenin, které interagují s proteinem vázajícím OPG. K takovým sloučeninám patří nukleové kyseliny, peptidy, proteiny, sacharidy, lipidy nebo organické molekuly s malou molekulovou hmotností, které mohou působit buďto jako agonisté, nebo antagonisté aktivity proteinů vázajících OPG.

Proteiny vázající OPG se účastní diferenciace osteoklastů a míra aktivity osteoklastů zase moduluje resorpci kosti. Agonisté a antagonisté proteinu vázajícího OPG tedy modulující tvorbu osteoklastů a resorpci kosti a mohou se tedy užít k léčení nemocí kostí se změnami resorpce kosti jako je např. osteoporóza, hyperkalcémie, ztráta kosti díky artritickým metastázám, imobilizace nebo nemoci periostu, Pagetova nemoc, osteopetróza, ztráty způsobené protézou a pod, Farmaceutické přípravky obsahující proteiny vázající OPG a agonisty a antagonisty proteinů vázajících OPG jsou také předmětem vynálezu.

Receptory pro proteiny vázající OPG byly také identifikovány z myší cDNA knihovny zkonstruované z buněk kostní dřeně, které se vázaly na fluorescenčně označené proteiny vázající OPG.

-5 CZ 302262 B6

Receptory se mohou užít k identifikaci agonistů a antagonistů interakce proteinů vázajících OPG s jejich receptory, což může být využito k léčení nemocí kostí.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1. Struktura a sekvence inzertu 32D-F3 kódujícího protein vázající OPG. Podtrženy jsou před i kovaná transmembránová doména a místa pro sacharidové řetězce vázané na asparagin.

io Obr. 2 Exprese proteinu vázajícího OPG v buňkách COS-7 transfekovaných pcDNA/32D~F3. Buňky byly transfekovány pcDNA/32D-F3 za pomoci lipofektinu a pak podrobeny testu na vazbu s kozí antihumánní IgGl konjugovanou s alkalickou fosfatázou (sekundární samotná), humánní OPG (22-201)-Fc a sekundární (OPG-Fc) nebo chimérickým fúzním proteinem extracelulární doména ATAR-Fc (sATAR-Fc). ATAR je nový člen superrodiny TNFR a fúzní protein sATAR-Rc sloužil jako kontrola jak pro vazbu humánní domény lgGl-Fc, tak pro vazbu generického proteinu příbuzného TNFR k molekule buněčného povrchu 32D.

Obr. 3. Exprese proteinu vázajícího OPG v lidských tkáních. Analýza mRNA lidských tkání (Clontech) northemovým přenosem pomocí radioaktivně značené hybridizační sondy 32D-F3. no Relativní molekulová hmotnost je uvedena vlevo v tisících párů bází (kb). Šipka na pravé straně ukazuje migraci transkriptu o velikosti asi 2,5 kb detekovaného v mRNA z lymfatických uzlin.

Také ve fetálních játrech byl detekován velmi slabý pás stejné velikosti.

Obr. 4: Struktura a sekvence inzertu pcDNA/huOPGbp 1.1 kódujícího humánní protein vázající

OPG. Podtrženy jsou před i kovaná transmembránová doména a místa pro sacharidové řetězce vázané na asparagin

Obr. 5 Stimulace vývoje osteoklastů in vitro ze společných kultur makrofágů kostní dřeně a buněk ST2 ošetřených rekombinantním myším proteinem vázajícím OPG (158-3176). Kultury byly ošetřeny rekombinantním myším proteinem vázajícím OPG v různých koncentracích od 1,6 do 5600 ng/l. Po 8 až 10 dnech byly kultury lyžovány a byla měřena aktivita TRAP. Kromě toho byly některé kultury simultánně ošetřeny 1, 10, 100, 500 a 1000 ng/l rekombinantního proteinu myší OPG (22-401)-Fc. Myší protein vázající OPG indukoval stimulaci tvorby osteoklastů závislou na dávce, zatímco OPG (22—401)-Fc inhiboval tvorbu osteoklastů.

Obr. 6. Stimulace in vitro vývoje osteoklastů zprekurzorů v kostní dřeni v přítomnosti M-CSF a myšího proteinu vázajícího OPG (158-316). Kostní dřeň myší byla odebrána a kultivována v přítomnosti 250, 500, 1000 a 2000 U/ml M-CSF. Ke stejným kulturám byl přidán protein vázající OPG v různých koncentracích, od 1,6 do 500 ng/ml. Vývoj osteoklastů byl měřen pomo40 cí testu TRAP.

Obr. 7. Osteoklasty odvozené z buněk kostní dřeně v přítomnosti jak M-CSF tak proteinu vázajícího OPG(158-316) resorbují kost in vitro. Buňky kostní dřeně ošetřené buďto M-CSF, nebo proteinem vázajícím OPG nebo oběma faktory současně, byly vysety na plátky kosti v jamkách kultivačních destiček a byly ponechány, aby se vyvinuly ve zralé osteoklasty. Výsledné kultury byly obarveny toluidinovou modří (levý sloupec) nebo histochemickým barvením pro detekci enzymové aktivity TRAP (pravý sloupec). V kultuře ošetřené oběma faktory se tvořily zralé osteoklasty, které byly schopny erodovat kost, jak lze soudit podle modře zbarvených jamek na povrchu kosti. To korelovalo s přítomností značného počtu velkých mnohojaderných buněk pozi50 tivních na TRAP.

Obr. 8. Graf ukazuje hladinu ionizovaného kalcia (iCa) v krvi u myší injikovaných proteinem vázajícím OPG, a sice 51 hodin po první injekci, a myší, kterým se také podával konkurenční OPG. Protein vázající OPG významně zvýšil hladinu iCa způsobem závislým na dávce. OPG (1 mg/kg/den) zcela blokoval zvýšení iCA v dávce proteinu vázajícího OPG 5 pg/den, a částečně

-6CZ 302262 B6 blokoval zvýšení v dávce OPG 25 pg/den (*) rozdíl ve srovnání s kontrolou léčenou jen vehikulem (p<0,05), (#) hladina iCA po podávání OPG se průkazně liší od hladiny u myší, které dostávaly jen samotnou dávku proteinu vázajícího OPG (p<0,05).

Obr. 9. Radiografie levého femuru a tibie myší, kterým byl podáván protein vázající OPG v dávkách 0, 5, 25 nebo 100 pg/den po 3,5 dne. Je patrné snížení hustoty kosti závislé na dávce, viditelné nejzřetelněji v proximální metafyze tibie a zcela pronikavé při dávce 100 pg/den.

Obr. 10. Sekvence ODAR cDNA myší a příslušná proteinová sekvence. Je zde ukázána sekvence io cDNA klonu velikosti asi 2,1 kb a translace otevřeného čtecího rámce 625 aminokyselinových zbytků. Hydrofobní signální peptid je podtržen a hydrofobní transmembránová sekvence (zbytky

214 až 234) jsou uvedeny tučně. Cysteinové zbytky obsažené v opakovaných motivech bohatých na cystein v extracelulámí doméně jsou také tučně.

Obr. 11 Imunofluorescenční značení vazby ODAR-Fc na buňky transfekované proteinem vázajícím OPG. Buňky COS-7 transfekované expresním ptazmidem proteinu vázajícího OPG byly inkubovány s lidským lgG Fc (horní panel), ODAR-Fc (střední panel) nebo OPG-Fc (spodní panel). Jako sekundární protilátka byla užita kozí anti-humánní IgGFc značná FITC. Pozitivně navázané buňky byly vyšetřeny konfokálním mikroskopem.

Obr. 12. Účinek ODAr-Fc na tvorbu osteoklastů v kostní dřeni myši in vitro. Kultury z myší kostní dřeně byly založeny jak bylo popsáno v příkladu 8 a exponovány proteinu vázajícímu OPG (5 mg/ng/ml) a CSF-1 (30 ng/ml). Byly přidány různé koncentrace ODAR-Fc od 1500 do 65 ng/ml. Tvorba osteoklastů byla vyhodnocena cytochemickým stanovením TRAP a testem

TRAP po 5 dnech v kultuře.

Obr. 13. Denzita kostního minerálu u myší po 4 denním podávání ODAR-Fc v různých dávkách. Myši dostávaly ODAR-Fc denně v subkutánní injekci ve vehikulu s fosfátem pufrováným fyziologickým roztokem. Minerální denzita byla stanovena z kostí fixovaných v 70% ethanolu v úrovni proximální tibiální metaíýzy pomocí kvantitativní počítačové tomografie (pQCT) zařízením XCT-960M (Norland Medical Systems, F. Atkinson, WI). Dva 0,5mm příčné řezy kosti, 1,5 a 2,0 mm od proximálního konce tibie byly analyzovány (XM1CE 5,2, Stratec, Germany) ke stanovení celkové denzity kostního minerálu v metafyze. Pro definici hranice metaíýzy kosti byl užit práh separace měkké tkáně 1500. ODAR-Fc vedl k významnému zvýšení denzity kostního minerálu v proximální tibiální metafyze způsobem závislým na dávce. Skupina obsahovala 4 objekty (n=4).

Detailní popis vynálezu

Vynález poskytuje polypeptid označovaný jako protein vázající OPG, který specificky váže OPG a účastní se diferenciace osteoklastů. Klon cDNA kódující myší formu polypeptidu byl identifikován v knihovně připravené z linie myších myelomonocytů 32-D a byl transfekován do buněk COS. Buňky po transfekci (transfektanty) byly podrobeny screeningu na schopnost vázat fúzní polypeptid OPG (22-201)-Fc (Příklad 1). Sekvence nukleové kyseliny odhalila, že protein vázající OPG je nový člen rodiny TNF a je nejblíže příbuzný AGP-1, což je polypeptid popsaný v patentové přihlášce US 08/660 562 podané 7. června 1995, která je v řízení (Polypeptid identický s AGP-1 byl také popsán jako TRAIL ve Wiley et aL, lmmunity 3: 673-682, 1995). Předpokládá se, že protein vázající OPG je transmembránový protein typu II, který má cyto50 plazmatickou doménu na svém aminokonci, transmembránovou doménu a extracelulámí doménu na karboxylovém konci (Obr. 1). Aminokoncová cytoplazmatická doména obsahuje aminokyselinové zbytky 1- 48, transmembránová doména zbytky 49 - 69 a extracelulámí doména zbytky 70 - 316 jak je ukázáno na obr. 1 (sekvence identifikačního čísla 1). Protein asociovaný s membránou specificky váže OPG (obr. 2). Takže OPG a protein vázající OPG mají mnoho typických

-7CZ 302262 B6 vlastnosti páru receptor-ligand, ačkoliv je možné, že existují i jiné přirozeně se vyskytující receptory pro protein vázající OPG.

Klon kódující lidský protein vázající OPG byl izolován z cDNA knihovny lymfatických uzlin. Lidská sekvence (Obr. 4) je homologní k myší sekvenci. Purifikovaný myší protein vázající OPG stimuloval tvorbu osteoklastů in vitro a indukoval hyperkalcemii a resorpci kosti in vivo.

Protein vázající OPG označuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci savčího proteinu vázajícího OPG, nebo jeho fragment nebo jeho analog nebo derivát, mající alespoň vazebnou aktivitu kOPG. Ve výhodném provedení vynálezu je protein vázající OPG myší nebo lidský protein. V jiném provedení vynálezu je protein vázající OPG rozpustný protein mající v jedné formě izolovanou extracelulámí doménu oddělenou od cytoplazmatické a transmembránové domény. Protein vázající OPG se účastní diferenciace osteoklastů a ovlivňuje rychlost a rozsah resorpce kosti, a bylo také zjištěno, že stimuluje tvorbu osteoklastů a resorpci kosti.

Nukleové kyseliny

Předkládaný vynález poskytuje izolované nukleové kyseliny kódující proteiny vázající OPG. Termín „nukleové kyseliny“ v textu přihlášky zahrnuje cDNA, genomovou DNA, plně nebo částečně syntetickou DNA a také RNA. Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou vybrány ze skupiny obsahující:

a) nukleovou kyselinu uvedenou na obr. 1 (sekvence i. č. 1) a na obr. 4 (sekvence i. č. 2),

b) nukleovou kyselinu, která hybridizuje s polypeptid kódujícím úsekem nukleových kyselin uvedených na obr. 1 (sekvence i. Č. 1) a na obr. 4 (sekvence i. Č. 2), a zůstává hybridizována k nukleovým kyselinám i ve vysoce stringentních (přísných) podmínkách, a

c) nukleové kyseliny degenerované vzhledem k nukleovým kyselinám v a) nebo b).

Hybridizace nukleových kyselin typicky zahrnuje mnohakrokový proces, který obsahuje první hybridizační krok, kdy se vytvoří duplex nukleové kyseliny z jednoduchých řetězců, a poté následuje druhý hybridizační krok, prováděný za přísnějších (více stringentních) podmínek, aby se selektivně udržely jen ty duplexy DNA, které mají požadovanou homologii. Podmínky prvního hybrid i zač ní ho kroku obecně nejsou rozhodující, za předpokladu, že se první hybridizace neprovádí v přísnějších podmínkách než druhý hybridizace. Obecně se druhá hybridizace provádí v přísnějších podmínkách, tj. s vysokou strmgencí, přičemž termín „vysoká stringence“ znamená takové podmínky teploty a koncentrace solí, které jsou asi 12 až 20 °C pod teplotou tání (Tm) perfektivního hybridu částí nebo celého komplementárního řetězce odpovídajícího sekvenci na obr. 1 (sekvence i. č. 1) a na obr. 4 (sekvence i. č. 2). V jednom provedení „vysoká stringence“ znamená podmínky teploty 65 °C a ne vyšší koncentraci než 1M Na+. Odborníkovi je zřejmé, že koncentrace solí, teplota a/nebo délka inkubace se mohou měnit v první nebo druhé hybridizaci tak, aby se získaly hybridizující nukleové kyseliny podle vynálezu. Podmínky hybridizaci a výpočet. Tm jsou popsány v Sambrook et al„ Molecular Cloning: A Laboratoiy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989).

Nukleové kyseliny podle vynálezu hybridizují s celým nebo částí kódujícího úseku sekvence proteinu vázajícího OPG uvedeného na obr. 1 (sekvence i. Č. 1) a na obr. 4 (sekvence i. č. 2), a tudíž mohou existovat zkrácené verze nebo naopak prodloužené verze uvedených sekvencí nukleových kyselin. Zkráceně nebo naopak prodloužené nukleové kyseliny jsou také předmětem předkládaného vynálezu, za předpokladu, že si uchovávají alespoň vlastnost vázat OPG. V jednom provedení vynálezu nukleová kyselina kóduje polypeptid obsahující alespoň 10 aminokyselin. V jiném provedení vynálezu nukleová kyselina kóduje polypeptid obsahující alespoň 20 aminokyselin. V ještě dalším provedení vynálezu nukleová kyselina kóduje polypeptid obsahující alespoň 50 aminokyselin. Hybridizující sekvence nukleové kyseliny může také obsahovat nekódující

- 8 CZ 302262 B6 sekvence lokalizované na 3'- a/nebo 5-konci úseku kódujícího protein vázající OPG. Nekódující sekvence obsahují regulační úseky účastnící se exprese proteinu vázajícího OPG, jako jsou promotory, zesilovací úseky (enhancery), místa počátku translace, místa terminace translace a pod.

Ve výhodném provedení vynálezu nukleové kyseliny kódují myší nebo lidský protein vázající OPG. Nukleové kyseliny kódují buďto formu proteinu vázajícího OPG vázanou na membránu, nebo rozpustnou formu, která postrádá funkční transmembránovou oblast. Predikovaný transmembránový úsek myšího proteinu vázajícího OPG zahrnuje aminokyselinové zbytky 49—69 ío včetně, jak je ukázáno na obr. I (sekvence i. ě. 1). Predikovaný transmembránový úsek lidského proteinu vázajícího OPG zahrnuje aminokyselinové zbytky 49-69 včetně, jak je ukázáno na obr.

(sekvence i. č. 2). Lze předpokládat, že substituce, které vedou k náhradě hydrofobního aminokyselinového zbytku v tomto úseku neutrálním nebo hydrofobním aminokyselinovým zbytkem, zruší asociaci s membránou a povedou ke vzniku rozpustného proteinu vázajícího OPG. Kromě i s toho lze také předpokládat, že delece části nebo celého transmembránového úseku povedou také ke vzniku aminokyselinové zbytky 70-316 podle obr. 1 (sekvence i. č. 1), nebo jejich fragmenty či analogy, představují rozpustné proteiny vázající OPG.

Nukleové kyseliny kódující zkrácené formy lidského rozpustného proteinu vázajícího OPG jsou také předmětem vynálezu. Rozpustné formy obsahují aminokyselinové zbytky 69-317 sekvence uvedené na obr. 4 (sekvence i. č. 2) a její zkrácené formy. V jednom provedení zkrácení na Nkonci vede ke vzniku polypeptidů obsahujících aminokyselinové zbytky 70 - 317, 71 - 317, 72 317 atd. V jiném provedení vynálezu nukleové kyseliny kódují rozpustný protein vázající OPG obsahující aminokyselinové zbytky 69 - 317 a jeho verzi zkrácenou na N-konci obsahující aminokyselinové zbytky 158-317 nebo alternativně 166-317.

Plazmid phuOPGbp 1.1. kódující lidský protein vázající OPG v E.coli kmene DH10 byl uložen v Americké sbírce mikroorganismů (American Type Culture Collection, Rockville, MD) dne 13 června 1997.

Nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou užít k detekci sekvencí kódujících protein vázající OPG v biologických vzorcích. Zvláště se sekvence mohou užít k vyhledávání sekvencí příbuzných proteinu vázajícímu OPG v knihovnách cDNA a genomové DNA, zejména z jiných biologických druhů. Nukleové kyseliny podle vynálezu jsou také vhodné k modulování hladiny protei35 nu vázajícího OPG pomocí tzv. „antisense“ technologie nebo genové exprese in vivo. Vývoj transgenních zvířat exprimujících protein vázající OPG je užitečný pro přípravu polypeptidů a také pro zkoumání biologické aktivity tohoto polypeptidů in vivo.

Vektory a hostitelské buňky

Nukleové kyseliny podle vynálezu jsou spojeny s jinými sekvencemi DNA tak, aby exprimovaly biologicky aktivní protein vázající OPG. Sekvence potřebné pro expresi jsou v oboru známy a patří knim promotory a enhancery pro iniciaci syntézy RNA, místa terminace translace, vazebná místa ribosomů pro iniciaci translace a tzv. vedoucí sekvence, které umožňují sekreci.

Sekvence řídící expresi a sekreci proteinu vázajícího OPG mohou být homologní, tj. sekvence identické nebo podobné sekvencím v genomu vedoucím k expresi a sekreci proteinu vázající OPG, nebo jsou to sekvence heterologní. Pro expresi proteinu vázajícího OPG je k dispozici celá řada plazmidových vektorů (viz např. Methods in Enzymology, vol. 185, Goeddel, D. V. (ed.), Academie Press, 1990). Pro expresi v savčí hostitelské buňce je výhodné provedení plazmid pDSRa popsaný v přihlášce PCT 90/14363, Výhodné provedení pro expresi v bakteriální hostitelské buňce obsahuje plazmidy nesoucí promotor lux (viz patentová přihláška US 08/577 778, podaná 22. prosince 1995, nyní v řízení).

Vynález také poskytuje prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky, které exprimují pro55 tein vázající OPG. K hostitelským buňkám patří bakteriální, kvasinkové, rostlinné, hmyzí nebo

-9CZ 302262 Β6 savčí buňky. Protein vázající OPG může být také produkován v transgenních zvířatech jako jsou myši nebo kozy. Plazmidy a vektory obsahující nukleové kyseliny podle vynálezu se vloží do vhodných hostitelských buněk pomocí transfekce nebo transformace způsobem, který je odborníkovi znám. Hostitelské buňky obsahují sekvence DNA kódující protein vázající OPG podle obr. 1 nebo jeho část, jako je např. extracelulámí doména nebo cytoplazmatická doména. Nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou modifikovat záměnou kodonů, které umožní optimální expresi v daném hostiteli. Alespoň nějaký z těchto kodonů je tzv. preferenční kodon, který nemění aminokyselinovou sekvenci a nalézá se často v genech, které jsou silně exprimovány. Avšak je zřejmé, že tyto alterace kodonů pro optimalizaci exprese nejsou omezeny na vložení preferenčních kodonů. K příkladům výhodných savčích hostitelských buněk pro expresi proteinu vázajícího OPG patří buňky COS, CHOd-, 293 a 3T3, přičemž tento výčet není omezující- Výhodné bakteriální hostitelské buňky jsou E. co/i.

Polypeptidy

Předkládaný vynález poskytuje protein vázající OPG jako produkt prokaryotické nebo eukaryotické exprese exogenní sekvence DNA, tzn. protein vázající OPG je rekombinantní protein vázající OPG. K exogenním sekvencím patří sekvence cDNA, genomové DNA a syntetické DNA. Protein vázající OPG může být produkt exprese v bakteriální, kvasinkové, rostlinné, hmyzí nebo savčí buňce nebo se může produkovat v bezbuněčných translačních systémech. Protein vázající OPG produkovaný v bakteriích má N-koncový methioninový zbytek.

Vynález dále poskytuje způsob přípravy proteinu vázajícího OPG, který obsahuje kroky, kdy se kultivují prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky transformované nebo transfekované nukleovými kyselinami kódujícími protein vázající OPG a izoluje se polypeptidový expresní produkt těchto nukleových kyselin.

Polypeptidy, které jsou savčími proteiny vázajícími OPG nebo jejich fragmenty, analogy nebo deriváty jsou také předmětem předkládaného vynálezu. Ve výhodném provedení je protein vázající OPG lidský protein vázající OPG. Fragment proteinu vázajícího OPG znamená polypeptid, který má deleci jedné nebo několika aminokyselin takové, že výsledný polypeptid má alespoň vlastnost, že váže OPG. Uvedené fragmenty mají delece začínající z aminokonce, z karboxylového konce nebojsou deletovány vnitřními úseky polypeptidu. Fragmenty proteinu vázajícího OPG jsou dlouhé přinejmenším 10 aminokyselin, výhodně přinejmenším 20 aminokyselin a ještě výhodněji přinejmenším 50 aminokyselin. Ve výhodném provedení vynálezu protein vázající OPG má deleci jedné nebo několika aminokyselin z transmembránového úseku (aminokyselinové zbytky 49 - 69 podle obr. 1), nebo alternativně jednu nebo několik aminokyselin z aminokoncového úseku až po transmembránový úsek a/nebo včetně tohoto transmembránového úseku (aminokyselinové zbytky 1 - 49 podle obr. 1). V jiném provedení vynálezu je protein vázající OPG rozpustný protein obsahující např. aminokyselinové zbytky 69-316 nebo 70-316 nebo N-koncové nebo C-koncové zkrácené formy, které si uchovávají vazebnou aktivitu pro OPG. Protein vázající OPG je také lidský rozpustný protein uvedený na obr. 4 obsahující aminokyselinové zbytky 69 - 317, a jeho N-koncové zkrácené formy např. 70 - 517, 71 - 517, 71 - 517, 72 -517 atd. Ve výhodném provedení rozpustný lidský protein vázající OPG obsahuje aminokyselinové zbytky 69 - 317 a N-koncovou zkrácenou formu proteinu vázajícího OPG (158 - 317) nebo alternativně (166-317).

Analog proteinu vázajícího OPG znamená polypeptid, který má substituci nebo adici jedné nebo několika aminokyselin takové, že výsledný polypeptid má alespoň tu vlastnost, že váže OPG. Uvedené analogy mají adici nebo substituci v libovolném místě polypeptidu. K výhodným analogům patří ty, které představují rozpustné proteiny vázající OPG. Fragmenty nebo analogy mohou být přirozeně se vyskytující, jako jsou např. polypeptidové produkty alelických variant, nebo mohou být zkonstruovány pomocí technik pro manipulace a syntézu nukleových kyselin, které jsou odborníkovi známy. Polypeptidy mohou, ale nemusejí, mít aminokoncový methioninový zbytek.

- 10CZ 302262 B6

Vynález také zahrnuje deriváty proteinů vázajících OPG, které jsou polypeptidy, které prošly posttrans lačním i modifikacemi (např. adice N-vázaného nebo O-vázaného řetězce cukru, opracování N-konce nebo C-konce), připojení chemických zbytků k aminokyselinové kostře, chemické modifikace N-vázaného nebo O-vázaného řetězce cukru a adice N-koncového methioninového zbytku jakožto výsledek exprese v prokaryotické hostitelské buňce. Zvláště lze uvažovat o takových chemicky modifikovaných derivátech proteinů vázajících OPG, které poskytují další výhodnou vlastnost, jako je zvýšená stabilita, delší doba cirkulace, nebo snížená imunogeničnost. Zvláště užitečné jsou modifikace s vodou rozpustnými polymery jako je polyetylénio glykol a jeho deriváty (viz např. Patent US 4 179 337). Chemické skupiny pro derivatizaci se mohou vybrat z ve vodě rozpustných polymerů jako je polyetylénglykol, kopolymery etylénglykol/propylénglykol, karboxymetylcelulóza, dextran, polyvinylalkohol a pod. Polypeptidy se mohou modifikovat v náhodných pozicích uvnitř molekuly nebo na předem určených místech molekuly a mohou obsahovat jednu, dvě nebo více připojených chemických zbytků. Polypeptidy se mohou také modifikovat na předem určeném místě polypeptidu jako je např. aminokonec, nebo na vybraném argininovém nebo lysinovém zbytku polypeptidu. Kjiným chemickým modifikacím patří dále detekovatelné značky, jako jsou enzymatické, fluorescenční, isotopové nebo afinitní značky, které slouží k detekci nebo izolaci proteinu.

2» Vynález také zahrnuje chimérické proteiny vázající OPG, které obsahují část nebo celou aminokyselinovou sekvenci proteinu vázajícího OPG fúzovanou s heterologní aminokyselinovou sekvencí. Heterologní sekvence je jakákoliv sekvence, která dovoluje, aby si výsledný protein uchoval alespoň vazebnou aktivitu pro OPG. Ve výhodném provedení vynálezu extracelulární doména karboxylového konce proteinu vázajícího OPG je fázována s heterologní sekvencí. Takové sekvence zahrnují heterologní cytoplazmatické domény, které dovolují alternativní intracelulámí signální událost, sekvence, které podporují oligomerizaci jako úsek Fc z IgG, enzymové sekvence, které poskytují značku polypeptidu, a sekvence, které poskytují afinitní sodu, jako je např. specifická vazba antigen-proti látka.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu se izolují a purifikují z tkání a buněčných linií, které exprimují protein vázající OPG, buďto extrakcí z lyzátů, nebo upravených kultivačních médií a nebo z transformovaných hostitelských buněk exprimujících protein vázající OPG. Protein vázající OPG se může získat z myší myelomonocytové linie 32-D (ATCC č, CRL-11346). Lidský protein vázající OPG nebo nukleová kyselina kódující tento protein mohou být izolovány z lidských lymfatíckých uzlin nebo z tkáně fetálních jater. Izolovaný protein vázající OPG není asociován s jinými lidskými proteiny ani jinými složkami buňky.

Předmětem vynálezu je také způsob purifikace proteinu vázajícího OPG z přirozených zdrojů (např. tkání a buněčných linií, které normálně exprimují protein vázající OPG) a z transfekova40 ných hostitelských buněk. Pro získání purifikovaného proteinu je možné využít jeden nebo několik standardních kroků purifikace v odpovídajícím pořadí. K chromatografickým krokům patří iontová výměna, gelová filtrace, hydrofobní interakce, chromatografie s reverzní fází, chromatofokusin, afinitní chromatografie užívající protilátku typu anti-protein vázající OPG nebo afinitní komplex streptavidin-biotin a pod,

Protilátky

Předkládaný vynález zahrnuje také protilátky vázající specificky polypeptidy podle vynálezu. Protilátky lze získat imunizací celým proteinem vázajícím OPG, nebo rozpustnou formou protei50 nu vázajícího OPG nebo jejich fragmentem. Protilátky podle vynálezu jsou polyklonální nebo monoklonální protilátky, nebojsou to rekombinantní protilátky, jako jsou např. chimérické protilátky, kde myší konstantní úseky těžkých a lehkých řetězců jsou nahrazeny lidskými sekvencemi, nebo tzv. CDR-roubované protilátky, kde pouze komplementaritu určující úseky jsou myšího původu. Protilátky podle vynálezu mohou být také lidské protilátky připravené např. imunizací transgenních zvířat schopných produkovat lidské protilátky (viz např. patentová přihláška PCT

- 11 CZ 302262 B6

WO93/12227). Protilátky jsou užitečné pro detekci proteinu vázajícího OPG v biologických vzorcích, což umožňuje identifikaci buněk nebo tkání, které produkují tento protein. Navíc protilátky, které se váží na protein vázající OPG a blokují tak interakci s jiným i vazebnými sloučeninami mohou mít terapeutické využití v modulaci diferenciace osteoklastů a resorpce kosti.

Protilátky proti proteinu vázajícímu OPG jsou užitečné k léčení nemocí kostí jako je osteoporóza nebo Pagetova nemoc. Protilátky se mohou testovat na vazbu k proteinu vázajícímu OPG v přítomnosti nebo nepřítomnosti OPG a tak se může vyšetřovat jejích schopnost inhibovat ligandem (tj. proteinem vázajícím OPG) zprostředkovanou tvorbu osteoklastů a/nebo resorpci kosti. Lze také čekat, že peptidy mohou působit jako antagonisté interakce ligand:receptor a inhibovat ligandem zprostředkovanou tvorbu osteoklastů, a pro tentýž účel lze užít i proteiny vázající OPG.

Přípravky

Předkládaný vynález poskytuje také farmaceutické přípravky, které obsahují terapeuticky účinné množství proteinu vázajícího OPG podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným ředidlem, povrchově aktivní látku, nosičem, emulgátorem, konzervantem a/nebo adjuvans. Vynález také poskytuje farmaceutický přípravek, který obsahuje terapeuticky účinné množství agonisty nebo antagonisty proteinu vázajícího OPG. Termín „terapeuticky účinné množství“ znamená množství, které vede k terapeutickému účinku za specifických podmínek a způsobu podávání. Přípravek podle vynálezu může být ve formě kapalné nebo lyofilizované a obsahuje rozpouštědla (Tris, acetátový nebo fosfátový pufr) mající různé hodnoty pH a iontové síly, smáčedla, jako je Tween nebo Polysorbate, nosiče, jako je lidský sérový albumin nebo želatina, konzervanty, jako thimerosal nebo benzyl alkohol, a antioxidanty, jako je kyselina askorbová nebo disiřičitan sodný. Výběr konkrétního složení závist na řadě faktorů jako je stav, který se má léčit, způsob podávání a požadované farmakokinetické parametry. Podrobnější přehled vhodných složek pro farmaceutické přípravky lze nalézt v příručce Remingtonů Pharmaceutical Sciences (18 th ed., A. R. Genaro, ed., Mack, Easton, PA 1980).

Výhodné provedení vynálezu poskytuje přípravky, které obsahují rozpustné proteiny vázající OPG. Vynález zahrnuje také přípravky, které obsahují rozpustné proteiny vázající OPG modifikované vodou rozpustnými polymery pro zvýšení rozpustnosti, plazmatického poločasu a biologické dostupnosti. Přípravky mohou také obsahovat rozpustné proteiny vázající OPG vložené do liposomů, mikroemulzí, micel nebo vesikul pro řízené podávání s dlouhodobým účinkem. Rozpustné proteiny vázající OPG mohou být také formulovány do mikročástic vhodných k pulmonárnímu podávání.

Přípravek podle vynálezu se může podávat injekcí, a sice subkutánní, intravenózní nebo intramuskulární, nebo cestou perorální, nasální, pulmonámí nebo rektální. Vybraný způsob podávání nakonec závisí na řadě faktorů a odborník ho snadno určí.

Předkládaný vynález dále poskytuje farmaceutický přípravek, který obsahuje terapeuticky účinné množství nukleových kyselin podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným adjuvans. Přípravky nukleových kyselin jsou vhodné k podávání buďto části, nebo celé kódující oblasti proteinu vázajícího OPG a/nebo přilehlých úseků do buněk a tkání jakožto součást „antisence“ léčebného režimu.

Způsoby použití

Protein vázající OPG se může použít v řadě různých testů pro detekci OPG a charakterizaci interakcí sOPG. Obecně testy spočívají vtom, že se inkubuje protein vázající OPG s biologickým vzorkem obsahujícím OPG v podmínkách, které dovolují navázání OPG na protein vázající OPG, a pak se měří rozsah vazby. OPG může být buď v purifikované formě, nebo přítomen ve směsi jako je tomu v tělních tekutinách nebo v kultivačním médiu. Testy mohou být buďto kvalitativní,

- 12CZ 302262 B6 nebo kvantitativní, přičemž kvantitativní testy jsou užitečné pro stanovení parametrů (afmitní konstanta a kinetika) vazby OPG a proteinu vázaj ící OPG a pro kvantifikaci hladiny biologicky aktivního OPG ve směsi. Testy se také mohou užít k hodnocení vazby OPG k fragmentům, analogům a derivátům proteinu vázajícího OPG a k identifikaci nových členů rodiny OPG a proteinů vázajících OPG.

Navázání OPG na protein vázající OPG lze provádět v různých formách testů, např. jako buněčný vazebný test, membránový vazebný test, test v roztoku nebo imunotest. Obecně shrnuto, stopové množství značeného OPG se inkubuje se vzorky proteinu vázajícího OPG po určitou dobu, a pak io se měří množství navázaného OPG pomocí filtrace, elektrochemiluminiscence (ECL, systém

ORIGEN firmy IGEN), buněčným testem nebo imunotestem. Lze také užít homogenní radioaktivní test (SPA, Amershatn) nebo časově rozlišenou fluorescenci (HTRF, Packard). Vazba je detekována pomocí značení OPG nebo protilátky anti-OPG radioaktivním izotopem (^l25I, ³⁵S, ³H), fluorescenčním barvivém (fluorescein), cheláty lathanidu (Eu’j nebo kryptáty, komplexy i5 orbipyridylrutenia (Ru²⁺). Je jasné, že výběr druhu značení je závislý na použitém detekčním systému. Alternativně může být OPG modifikován epitopovou značkou (např. biotin, peptidy,

His_é, myc) a navázán na protein jako je např. streptavidin, antipeptidová nebo antiproteinová protilátka, který nese značku, jak byly popsány výše.

2o V alternativním způsobu může být protein vázající OPG testován přímo v imunotestech použitím polyklonálních nebo monoklonálních protilátek k proteinům vázajícím OPG. Další formy proteinů vázajících OPG obsahující epitopové značky, které byly zmíněny výše, se mohou užít v testech v roztoku a imunotestech.

Způsoby k identifikaci sloučenin, které interagují s proteiny vázajícími OPG, jsou také předmětem vynálezu. Způsob podle vynálezu obsahuje inkubaci proteinu vázajícího OPG se sloučeninou v podmínkách, které dovolují navázání sloučeniny na protein vázající OPG, a pak měření rozsah vazby. Sloučenina může být buď v purifikované formě, nebo přítomna v surové směsi. Vázající se sloučeniny mohou být nukleové kyseliny, proteiny, peptidy, cukry, lipidy nebo organické sloučeniny s malou molekulovou hmotností. Sloučeniny lze dále charakterizovat podle jejich schopnosti zvyšovat nebo snižovat aktivitu proteinu vázajícího OPG, aby bylo možné stanovit, zda působí jako agonisté nebo antagonisté.

Proteiny vázající OPG jsou dále užitečné k identifikaci intracelulámích proteinů, které interagují s cytoplazmatickou doménou, a sice v testu s kvasinkovým dvojitým hybridem. Např. hybridní konstrukty obsahující DNA kódující 50 aminokyselin N-konec proteinu vázajícího OPG fúzované s DNA-vazebnou doménu genu GAL4 kvasinky se mohou užít jako dvouhybridový plazmid. Pozitivní klony získané takovým screeningem se dále charakterizuji, aby se identifikoval interagují protein. Takové informace jsou pak užitečné k určení intracelulámího signálního mechanis40 mu spojeného s proteinem vázajícím OPG a poskytují intracelulámí cíle pro nová léčiva, která modulují resorpci kosti.

Proteiny vázající OPG se mohou užít k léčení nemocí, které jsou charakterizovány nadměrnou hustotou kosti. Nejobvyklejší takovou nemocí je osteoporóza, což je nemoc, při který genetická porucha vede ke zvýšené hustotě kostí, která je obvykle fatální v několika prvních letech života. Osteoporózu je možné výhodně léčit podáváním rozpustné formy proteinu vázajícího OPG.

Předkládaný vynález také poskytuje modulátory (agonisty a antagonisty) proteinu vázajícího OPG a způsoby jejich přípravy. Modulátor proteinu vázajícího OPG buďto zvyšuje, nebo snižuje alespoň jednu aktivitu spojenou s proteinem vázajícím OPG, např. schopnost vázat OPG nebo jinou interagující molekulu nebo regulovat zrání osteoklastů. Typicky agonistou nebo antagonistou může být kofaktor, jako je např. protein, peptid, cukr, lipid nebo organická sloučenina s malou molekulovou hmotností, který interaguje s proteinem vázajícím OPG, a tím reguluje jeho aktivitu. K potenciálním polypeptidovým antagonistům patří protilátky, které reagují buďto s roz55 pustnou, nebo na membránu vázanou formu proteinu vážícího OPG a rozpustné formy proteinu

- 13CZ 302262 B6 vážícího OPG, které obsahují celou nebo aspoň část extracelulámí domény proteinu vážícího OPG. K molekulám, které regulují expresi proteinu vážícího OPG typicky patří nukleové kyseliny, které jsou komplementární k nukleovým kyselinám kódujícím protein vážící OPG a které působí jako „anti-sense“ regulátory exprese.

s

Protein vážící OPG se podílí na řízení tvorby zralých osteoklastů, primárního buněčného typu podílejícího se na resorpci kosti. Zvýšení rychlosti resorpce (nad rychlost tvorby kosti) může vést k různým poruchám a nemocem kostí, které jsou souhrnně nazývány osteopenie a patří knim osteoporóza, osteomyelitida, hyperkalcémie, osteopenie způsobená chirurgickým zákrokem nebo to podáváním steroídů, Pagetova nemoc, osteonekróza, ztráta kostní hmoty v důsledku revmatoidní artritidy, periodontální ztráta kosti, imobilizace, ztráty způsobené protézami a osteolytické metastázy. Naopak, snížení rychlosti resorpce kosti může vést k osteopetróze, což je stavu vyznačující se zvýšenou entitou kosti. Agonisté a antagonisté proteinu vážícího OPG modulují tvorbu osteoklastů a mohou se podávat pacientům trpícím nemocemi kostí. Agonisté a antagonisté pro15 teinu vážícího OPG pro použití k léčení osteopenií se mohou podávat samostatně nebo v kombinaci s terapeuticky účinným množstvím činidla podporujícího růst kostí, např. včetně morfogenních faktorů kostí zvaných BMP-1 až BMP-12, transformujícího růstového faktoru β a dalších členů rodiny TGVp, fíbroblastového růstového faktoru FGF-1 a FGF-10, inhibitorů interleukinu-1, inhibitorů TNFa, parathyroidálního hormonu, prostaglandinů řady E, bisfosfonátů a mine20 rálů podporujících kosti jako jsou fluorid a kalcium. Antagonisté proteinu vážícího OPG jsou zvláště vhodní k léčení osteopenie.

Receptory pro proteiny vážící osteoprotegerin

Předkládaný vynález dále poskytuje receptory, které reagují s proteiny vážícími OPG. Vynález zvláště poskytuje osteoklastový díferenciační a aktivační receptor, OD AR. ODAR je transmembránový polypeptid, který vykazuje nej vyšší míru homologie s CD40, členem rodiny receptorů TNF. Sekvence nukleové kyseliny myšího ODAR a kódovaný polypeptid jsou uvedeny na obr. 10. Lidský homolog k myšímu ODAR lze snadno izolovat hybridizačním screeningem lidské cDNA knihovny nebo genomové knihovny pomocí sekvence nukleové kyseliny uvedené na obr. 10. Postup pro klonování lidského ODAR je v podstatě shodný s postupem popsaným v příkladu 5 pro klonování lidského proteinu vážícího OPG. Lidský homolog polypeptid ukázaného na obr. 10 byl publikován v Anderson et al. (Nátuře 390: 175-179, 1997) a byl nazván RANK. RANK byl charakterizován jako transmembránový protein typu I, který má homologii se členy rodiny receptorů TNFa podílí se na funkci dendritických buněk.

Důkazy potvrzující interakci mezi ODAR a proteinem vážícím OPG jsou uvedeny v příkladu 13. Rozpustná forma ODAR (fúzní protein ODAR-Fc) zabraňuje dozrávání osteoklastů in vitro (obr. 12) a zvyšuje denzitu kosti u normálních myší po podání subkutánní injekcí (Obr. 13).

Výsledky jsou ve shodě s tím, že protein vážící OPG reaguje s ODAR a aktivuje ho, čímž podporuje dozrávání osteoklastů.

Vývoj osteoklastů a rychlost a rozsah resorpce kostí jsou regulovány interakcí mezi proteinem vážícím OPG a ODAR. Sloučeniny, které snižují nebo blokují interakci proteinu vážícího OPG a ODAR jsou potenciálními antagonisty aktivity proteinu vážícího OPG a mohou narušit vývoj osteoklastů vedoucí ke snížení resorpci kosti. Alternativně sloučeniny, které zvyšují interakci proteinu vážícího OPG a ODAR jsou potenciálními agonisty aktivity proteinu vážícího OPG a podporují vývoj osteoklastů a zvyšují resorpci kosti.

K měření interakce proteinu vážícího OPG s ODAR lze užít celou řadu testů in vitro s využitím purifíkovaných proteinů. Tyto testy se mohou použít ke screeningu sloučenin na jejich schopnost zvyšovat nebo snižovat rychlost nebo rozsah vazby ODAR k proteinu vážícímu OPG. V jednom typu takových testů se protein ODAR imobilizuje navázáním na dno jamek mikrotitrační destičky. Protein vážící OPG radioaktivně označený (např. radioaktivním jodem) a testovaná sloučeniny se přidají postupně (v jakémkoliv pořadí) a nebo současně do jamek. Po inkubaci se

- 14CZ 302262 B6 jamky opláchnou a pomocí scintilačního počítače se stanoví radioaktivita, podle níž se určí míra vazby ODAR a proteinu vážícího OPG v přítomnosti testované sloučeniny. Typicky se sloučenina testuje v celém rozsahu koncentrací a pro vyhodnocení přesnosti naměřených výsledků se použije série kontrolních jamek, kde chybí vždy jeden nebo několik prvků z testované reakce. K alternativní metodě patří obrácené pozice proteinů, tzn. na mikrodestičku se imobilizuje protein vážící OPG, inkubuje se s testovanou sloučeninou a radioaktivně značeným ODAR a pak se obdobně stanoví rozsah navázání (viz např. kapitola 18 v Current Protocols in Molecular Biology, Asubel etal., eds., John Wiley and Sons, New York, NY, 1995).

Jako alternativu k radioaktivnímu značení lze užít postup, kdy se protein vážící OPG nebo ODAR konjuguje s biotinem a přítomnost biotinylovaného proteinu se pak detekuje pomocí streptavidinu navázaného na enzym, jako je např. křenová peroxidáza (HRP) nebo alkalická fosfatáza (AP), který lze detekovat kolorimetricky nebo fluorescenčním označením streptavidinu. Také lze využít protilátky proti proteinu vážícímu OPG nebo ODAR konjugované s biotinem, který lze detekovat po inkubaci se streptavidinem navázaným na enzym jako AP nebo HRP,

Protein vážící OPG nebo ODAR mohou být také i mobilizovány navázáním na agarózové perličky, akrylátové perličky nebo i jiné, užité jako neutrální substrát. Tento substrát-proteinový komplex se pak přenese do roztoku obsahujícího komplementární protein a testovanou sloučeninu. Po inkubaci se perličky precipitují centrifugací a vazba mezi proteinem vážícím OPG a ODAR se kvantifikuje způsobem popsaným výše. Alternativně se substrát-proteinový komplex imobilizuje v koloně a testované molekuly a komplementární protein procházejí kolonou. Vytváření komplexů mezi proteinem vážícím OPG a ODAR lze pak vyhodnotit jedním ze způsobů, které byly popsány výše, např. radioaktivním značením, navázáním protilátky apod.

Jiným typem testu in vitro, který je užitečný k identifikaci sloučenin, které zvyšují nebo snižují tvorbu komplexů mezi ODAR a proteinem vážícím OPG je detektorový systém pro povrchovou plazmonovou rezonanci jako je např. měřicí systém Biacore formy Pharmacia (Pharmacia, Picataway, NJ). Systém Biacore lze užít podle návodu výrobce. Test v podstatě spočívá v tom, že se kovalentně naváže buďto protein vážící OPG, nebo ODAR na senzorový čip potažený dextranem, který je umístěn v detektoru. Testovaná sloučenina a další komplementární protein se pak injikují do komory obsahující senzorový čip buďto simultánně, nebo postupně a množství komplementárního proteinu, který se naváže, se určí na základě změn molekulové hmotnosti, která je fyzikálně asociována s dextranem pokrytou stranou senzorového čipu, změna molekulové hmotnosti je měřena detektorovým systémem.

V některých případech může být žádoucí vyhodnotit dvě nebo více testovaných sloučenin společně, zda jsou užitečné ke zvyšování nebo snižování vazby komplexů ODAR/protein vážící OPG. V takovém případě testy popsané výše mohou být snadno modifikovány tím, že se přidají další testované sloučeniny buďto simultánně, nebo postupně po první sloučenině. Zbývající kroky testů jsou opět stejné, jak byly popsány výše.

Testy in vitro popsané výše se mohou užít výhodně k rychlému screeningu velkého počtu sloučenin na to, zda ovlivňují tvorbu komplexů ODAR s proteinem vážícím OPG. Testy mohou být automatizovány pro screening sloučenin vytvářených rekombinantně připravených metodou „phage display“, syntetických peptidů a chemických syntetických knihoven.

Sloučeniny, které zvyšují nebo snižují tvorbu komplexů ODAR s proteinem vážícím OPG mohou být také testovány v buněčných kulturách pomocí buněk nebo buněčných linií nesoucích ODAR. Buňky a buněčné linie lze získat z jakéhokoliv savce, výhodně člověka nebo jiného primáta, psa nebo hlodavce. Buňky obsahující ODAR jako např. osteoklasty mohou být odděleny od ostatních buněk afinitní chromatografií postupem, který je odborníkovi znám. Navázání proteinu vážícího OPG na buňky nesoucí ODAR se hodnotí v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaných sloučenin a lze ho kvantifikovat např. průtokovou cytometrií pomocí biotinylované protilátky k proteinu vážícímu OPG. Alternativně kultura myších nebo lidských osteoklastů může být založena jak

-15CZ 302262 B6 bylo popsáno v příkladu 8 a testované sloučeniny se pak testují podle schopnosti blokovat zrání osteoklastů stimulované přídavkem CSF-1 a proteinu vážícího OPG. Testy na buněčných kulturách lze užít výhodně k dalšímu hodnocení sloučenin, které prošly s pozitivním výsledkem vazebným testem popsaným výše.

Sloučeniny, které zvyšují nebo snižují interakci proteinu vážícího OPG s ODAR lze také hodnotit z hlediska in vivo aktivity tím, že se sloučenina podává myším a pak se měří denzita kosti pomocí ske novací den žito metr i e nebo radiografie. Postupy měření denzity kostí byly popsány v PCT přihlášce WO97/23614 a také v příkladu 13.

Vynález poskytuje sloučeniny, které snižují nebo blokují interakci proteinu vážícího OPG s ODAR a jsou antagonisty tvorby osteoklastů. Takové sloučeniny obecně spadají do dvou skupin. K jedné skupině patří takové sloučeniny, které jsou odvozeny z proteinu vážícího OPG nebo které interagují s proteinem vážícím OPG. Takové sloučeniny byly popsány v předchozím textu. Druhá skupina obsahuje takové sloučeniny, které jsou odvozeny z ODAR nebo které interagují s ODAR. K příkladům sloučenin, které jsou antagonisty ODAR, patří nukleové kyseliny, proteiny, peptidy, sacharidy, lipidy nebo organické sloučeniny s malou molekulovou hmotností.

Antagonisté ODAR jsou sloučeniny, které se váží přímo a nebo v sousedství jednoho nebo několika vazebných míst pro protein vážící OPG v extracelulámí doméně ODAR a snižují tak nebo úplně blokují vytváření komplexů. Ty úseky ODAR, které se podílejí na tvorbě komplexů s proteinem vážícím OPG, je možné identifikovat na základě analogie se strukturou homologního komplexu TNFp/TNF-R55, který popsali Banner et al. (Cell 73: 431 až 445, 1993). Např. struktura komplexu TNFp/TNF-R55 může být využita k identifikaci úseků proteinu vážícího OPG a ODAR, které se účastní vytváření komplexu. Pak je možné navrhnout sloučeniny, které se přednostně váží na úseky účastnící se tvorby komplexu, a působí jako antagonisté. Jeden z takových přístupů je uveden v příkladu 11, kdy byly navrženy a peptidové antigeny pro použití k přípravě protilátek proti proteinu vážícímu OPG, které působí jako antagonisté. Očekává se, že tyto protilátky se budou vázat na protein vážící OPG a tím blokovat vytvoření komplexu sODAR. Podobným způsobem lze použít peptidové antigeny založené na struktuře ODAR k přípravě protilátek anti-ODAR, které působí jako antagonisté.

Antagonisté ODAR se mohou vázat na ODAR také v místech odlišných od vazebných míst pro protein vážící OPG a indukovat konformační změny v polypeptidu ODAR, které vedou buďto ke snížení tvorby komplexů, nebo k tvorbě neproduktivních komplexů s proteinem vážícím OPG.

V jednom provedení vynálezu je antagonistou rozpustná forma ODAR postrádající funkční transmembránovou doménu. Rozpustné formy ODAR mají deleci jedné nebo několika aminokyselin v trans membránové doméně (aminokyselin 214 až 234, jak je uvedeno na obr. 10). Rozpustné polypeptidy ODRA mohou mít buďto celou, nebo část extracelulámí domény a jsou schopny vázat se na protein vážící OPG. Případně rozpustný ODAR může být částí chimérického proteinu, kde část nebo celá extracelulámí doména ODAR je fúzována s heterologní aminokyselinovou sekvencí. V jednom provedení vynálezu je heterologní aminokyselinovou sekvencí úsek Fc z lidského IgG.

Modulátory (agonisté a antagonisté) ODAR se mohou užít k prevenci nebo léčení osteopenie, včetně nemocí jako je osteoporóza osteomyelitida, hyperkalcémie při malignitě, osteopenie vyvolaná chirurgickým výkonem nebo podáváním steroidů, Pagetova nemoc, osteonekróza, úbytek kosti při revmatoidní artritidě, periodontální úbytek kosti, imobilizace, úbytek při protézách a osteolytických metastázách. Agonisté a antagonisté ODAR použitelné pro léčbu osteopenií mohou být podávány samotné nebo v kombinaci s terapeuticky účinným množstvím agens podporujícího růst kostí včetně morfogenních faktorů označených BMP-1 až BMP-12. transformujícího růstového faktoru-β a členů rodiny TGF-β, fibroblastových růstových faktorů FGF-1 až FGF-10, inhibitorů interleukinu-1, inhibitorů TNFa, parathormonu, prostaglandinů řady E,

-16CZ 302262 B6 bisfosfonátů, estrogenů, ŠERM a minerálů podporujících kost, jako je fluorid a kalcium. Antagonisté ODAR jsou zejména užiteční v léčbě osteopenie.

Následující příklady jsou nabízeny pro ucelenější ilustraci vynálezu, ale nemají být chápány jako limitující jeho rozsah.

Příklady provedení vynálezu io

Příklad 1

Identifikace zdrojové buněčné linie pro protein vázající OPG

Osteoprotegerin (OPG) negativně reguluje osteoklastogenezi in vitro a in vivo. Protože OPG je protein mající vztah k TNFR, pravděpodobně při zprostředkování svého účinku interaguje s členem rodiny příbuzné k TNF. S jednou výjimkou jsou všichni známí členové rodiny TNF transmembránové proteiny typu II exprimované na buněčném povrchu. Aby se rozpoznal zdroj proteinu vázající OPG, byly použity rekombinantní fúzní proteiny OPG-Fc jako imunologické son20 dy pro testování na proteiny vázající OPG lokalizované na povrchu různých buněčných linií a primárních hemopoetických buněk.

Buněčné line, které rostly jako adherentní kultury in vitro byly ošetřeny za použití následujících metod: buňky byly vysety na 24 jamkové destičky pro tkáňové kultury (Falcon), a poté se ponechaly růst dokud nebyly přibližně z 80 % konfluentní, Kultivační média se pak odstranila a adherentní kultury se promyly fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnany (PBS) (Gibco) obsahujícím 1% fetální telecí sérum (FCS). Rekombinantní fúzní proteiny myší OPG [22-194]-Fc a lidský OPG [22-201]-Fc (viz US patentová přihláška pořadové č. 08/706 945, podaná 3. září 1996) byly jednotlivě naředěny na 5 gg/ml v PBS obsahujícím 1% FCS, pak přidá30 ny ke kulturám a ponechány inkubovat 45 minut v 0 °C. Roztok fúzního proteinu OPG-Fc se odstranil a buňky se promyly v roztoku PBS-FCS, jak je popsáno výše. Kultury se poté vystavily působení sekundární protilátky - kozímu F(ab') proti-lidskému IgG s konjugovaným ťykoerytrinem (Southern Biotechnology Associates č. 2043-09), ředěné PBS-FCS. Po 30 až 45 minutách inkubace v 0 °C se roztok odstranil a kultury se promyly, jak je popsáno výše. Buňky se pak ana35 lyžovaly imunofluorescenčním mikroskopem a detekovaly se buněčné linie, které exprimovaly protein vázající OPG na buněčném povrchu.

Suspenzní buněčné kultury se analyzovaly podobným způsobem s následujícími modifikacemi: ředidlo a promývací pufr sestávaly z fyziologického roztoku pufrováného fosforečnany obsahují40 čího 1% FCS bez kalcia a magnézia. Buňky se sklidily z exponenciálně se množících kultur v růstovém médiu, stočením se vytvořily pelety a pak se resuspendovalo 1 x 10⁷buněk/ml na 96jamkové mikrotitrační destičce pro tkáňové kultury (Falcon). Buňky pak byly vystaveny rekombinantním fúzním proteinům OPG-Fc, pak sekundární protilátce, jak je popsáno výše, a byly promyty a stočeny mezi každým krokem. Pak se buňky analyzovaly pomocí fluorescenč45 ního třídění buněk (FACS) za použití přístroje Becton Dickinson FACscan.

Použitím tohoto postupu bylo zjištěno, že myší myelomonocytámí buněčná linie 32D (ATCC č. CRL-11346) exprimuje povrchovou molekulu, která byla detekována oběma fúzními proteiny, myším OPG[22-194]-Fc a také lidským OPG[22-201]-Fc. Samotná sekundární protilátka se navázala na povrch buněk 32D, ani nepurifikovala lidský IgGl Fc, což naznačuje, že vazba fúzních proteinů OPG-Fc je způsobená skupinou OPG. Tato vazba může být v kompetici způsobem závislým na dávce při přidání rekombinantního myšího nebo lidského OPG[22-401 ] proteinu. Úsek OPG nezbytný pro biologickou aktivitu OPG je tedy schopný specifické vazby na povrchovou molekulu odvozenou z 32D.

- 17CZ 302262 B6

Příklad 2

Expresní klonování myšího proteinu vázajícího OPG

Z 32D mRNA byla připravena knihovna cDNA a ligována do savčího expresního vektoru pcDNA3.1(+) (lnvitrogen, San Díego, CA). Sklidily se exponenciálně rostoucí buňky 32D udržované za přítomnosti rekombinantního interleukinu-3 a celková buněčná RNA byla purifíkována kyselou guanidiumthiokyanát-fenol-chloroformovou extrakcí (Chromczynski a Sacchi, Annal. Biochem., 162, 156-159, 1987). Poly(A+) mRNA frakce se z preparátu celkové RNA získala adsorpcí na perličky s navázaným oligo(dT)25 (Dynabeads, Dynal Corp) a následnou elucí za použití postupu doporučeného výrobcem. Směrová, pomocí primerů oligo—dT syntetizovaná cDNA knihovna byla připravena za použití Superscript Plasmid System (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) dle postupu doporučeného výrobcem. Výsledná cDNA byla plně naštěpena restrikčními endonukleázami Sáli a Notl, a poté rozdělena do frakcí podle velikosti rozdělovači gelovou chromatografií. Byly vybrány frakce s největší molekulovou hmotností a ligovány do polylinkeru (mnohočetného klonovacího místa) plazmidového vektoru pcDNA3.1(+) (lnvitrogen, San Diego, CA). Tento vektor obsahuje promotor CM V v protisměru od mnohočetného klonovacího místa a řídí expresi vysokého stupně v eukaryotických buňkách. Knihovna byla poté vnesena elektroporací do kompetentních buněk E. coli (ElectroMAX DH10B, Gibco, NY) a vyseta na LB agar obsahující 100 gg/ml ampicilinu. Knihovna pak byla uspořádána do izolovaných skupin obsahujících přibližně 1000 klonů na skupinu a 1,0 ml kultury z každé skupiny se pěstoval 16 až 20 hodin ve 37 °C. Plazmidová DNA z každé kultury se izolovala za použití soupravy Qiagen Qiawell 96 Ultra Plasmid Kit (katalogové č. 16191) podle postupu doporučeného výrobcem.

Uspořádané skupiny 32D cDNA expresní knihovny byly jednotlivě vneseny pomocí lipofektinu do kultur buněk COS-7 a pak testovány na to, zda nebyly buněčný povrchový protein vázající OPG. Aby se tak stalo, byly buňky COS-7 vysety v hustotě 1 x 10⁶ na ml na ójamkové destičky pro tkáňové kultur (Costar) a pak pěstovány přes noc v DMEM (Gibco) obsahujícím 10% FCS. Přibližně 2 μg plazmidové DNA z každé skupiny byly ředěny do 0,5 ml DMEM bez séra, a pak sterilizovány stočením přes kolonu 0,2 μπι Spin-X (Costar). Současně bylo přidáno 10 μΐ Lipofektaminu (Life Technologies katalog, č. 18324—012) do samostatné zkumavky obsahující 0,5 ml DMEM bez séra. Roztoky DNA a Lipofektaminu se smísily a ponechaly inkubovat 30 minut při teplotě místnosti. Buněčné kultury COS-7 byly pak promyty s DMEM bez séra a komplexy DNA-lipofektamin byly vystaveny kulturám po dobu 2 až 5 hodin v 37 °C. Po tomto období byla média odstraněna a nahrazena DMEM obsahujícím 10% FCS. Buňky pak byly pěstovány 48 hodin ve 37 °C.

Aby se detekovaly kultury, které exprimují protein vázající OPG, byla růstová média odstraněna a buňky byly promyty v roztoku PBS-FCS. Do každé jamky se přidal 1,0 ml PBS-FCS obsahující 5 μg/ml fúzního proteinu lidského OPG[22-201]-Fc a inkuboval se 1 hodinu při teplotě místnosti. Buňky byly třikrát promyty roztokem PBS-FCS a pak 5 minut fixovány v PBS obsahujícím 2% paraformaldehyd a 0,2% glutaraldehyd při teplotě místnosti. Kultury se jednou promyty PBS-FCS a pak inkubovaly 1 hodinu v 65 °C ponořeny do roztoku PBS-FCS. Ponechaly se zchladnout a roztok PBS-FCS se odsál. Pak se kultury inkubovaly s kozí proti-lidskou IgG (Fc specifickou) protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou (SIGMA produkt č. A-9544) 30 minut při teplotě místnosti, třikrát se promyly s 20 mM Tris-Cl (pH 7,6) a 137 mM NaCl. Imunokomplexy, které se vytvořily během těchto kroků, byly detekovány testováním aktivity alkalické fosfatázy s použitím soupravy Fast Red TR/AS-MX Substráte Kit (Pierce, katalog, č. 34034) podle postupu doporučeného výrobcem.

Použitím tohoto přístupu bylo testováno celkem přibližně 300 000 nezávislých 32D cDNA klonů představovaných 300 transfekovanými skupinami s 1000 klony. Byla identifikována jedna jamka obsahující buňky, které specificky získaly fúzní protein OPG-Fc. Tato skupina byla dále dělena postupným opakováním koly příbuzenské selekce a výsledkem byl samostatný plazmidový klon

- 18CZ 302262 B6

32D-F3 (obrázek 1). DNA plazmidu 32D-F3 pak byla transfekována do buněk COS-7, které byly imunologicky značeny buď samotnou sekundární protilátkou kozím proti-lidským IgG konjugovaným s F1TC, fúzním proteinem lidským OPG[22-201]-Fc a sekundární protilátkou, nebo fúzním proteinem ATAR-Fc (ATAR je také znám jako HVEM, Montgomery et al., Cell, 87,

427-436, 1996) (obrázek 2). Samotná sekundární protilátka ani fúzní protein ATAR-Fc se nevázaly k buňkám COS-7/32D-F3. K buňkám COS-7/32D-F3 se vázal pouze fúzní protein OPG-Fc, což je důkazem, že na povrchu exprimujících buněk se projevil protein vázající OPG kódovaný 32D-F3.

Příklad 3

Sekvence proteinu vázajícího OPG

Klon 32D-F3, jehož izolace byla popsána výše, obsahoval inzert o velikosti přibližně 2,3 kb cDNA (obrázek 1), který byl sekvencován v obou směrech na přístroji pro automatizované sekvencování DNA 3 73A od firmy Applied Biosystems metodou terminace reakcí řízených primery s použitím Taq polymerázy a fluorescenční značky („primer-driven Taq dye-terminator reactions“ Applied Biosystems) podle postupu doporučeného výrobcem. Výsledná získaná

2o nukieotidová sekvence byla srovnána s databází sekvencí DNA s použitím programu FASTA (GCG, University of Wisconsin) a analyzována na přítomnost dlouhých otevřených čtecích rámců (LORF) při použití aplikace „Six-way open reading frame“ (Framws) (GCG, University of Wisconsin). Byl detekován příslušně orientovaný LORF z 316 aminokyselinových (aa) zbytků začínající methioninem, kterému předcházela 5' netranslatovaná oblast velikosti přibližně 150 bp.

5' netranslatovaná oblast obsahovala v rámci stop-kodon v protisměru od předpověděného startkodonu. To ukazuje, že struktura plazmidu 32D-F3 odpovídá jeho schopnosti využívat oblast promotoru CMV k řízení exprese genového produktu velikosti 316 aa v savčích buňkách.

Předpověděná sekvence proteinu vázajícího OPG pak byla srovnána s existující databází zná30 mých proteinových sekvencí za použití modifikované verze programu FASTA (Pearson, Meth. Enzymol., 183, 63-98, 1990). Aminokyselinová sekvence se také analyzovala na přítomnost specifických motivů, které jsou zachovány u všech známých členů rodiny tumorového nekrotického faktoru (TNF) s použitím metody sekvenačního profilu (Gribskov et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 4355 až 4359, 1987) modifikováno dle Liiethy et al. (Protein Sci., 3, 139 až 146,

1 994). V celém proteinu vázajícím OPG vyšla najevo významná homologie s několika členy rodiny TNF. Nejblíže příbuzný myším a lidským homologům ligandů TRAIL a CD40 se ukazuje myší protein vázající OPG. Další analýza sekvence proteinu vázajícího OPG ukázala silnou shodu s rodinou TNF, s vysoce významným Z skórem rovnajícím se 19,46.

Aminokyselinová sekvence proteinu vázajícího OPG obsahuje pravděpodobnou hydrofobní transmembránovou doménu, která začíná v M49 a prostírá se do L69. Na této konfiguraci vztažené k meth ion inovému start-kodonu je založen předpoklad, že protein vázající OPG je transmembránový protein typu II s krátkou N-koncovou intracelulámí doménou a delší C-koncovou extracelulámí doménou (obrázek 4). To by bylo podobné všem známým členům rodiny

TNF, s výjimkou lymfotoxinu alfa (Nagata a Golstein, Science, 267, 1449 až 1456, 1995).

Příklad 4

Exprese mRNA lidského proteinu vázajícího OPG

Membrány s hromadným přenosem RNA (northem-bloty) z lidské tkáně (Clontech, Palo Alto, CA) byly analyzovány a testovány restrikčním fragmentem 32D-F3 značeném ³²P-dCTP, aby se zjistila velikost lidského transkriptu a určil vzorec exprese. Northem-bloty byly prehybridizová55 ny v 5x SSPE, 50% formamidu, 5x Denhardtově roztoku, 0,5% SDS a 100 pg/ml denaturované

- 19CZ 302262 Β6

DNA lososího spermatu po dobu 2 až 4 hodin ve 42 °C. Bloty se pak hybridizovaly v 5x SSPE, 50% fbrmamidu, 2x Denhardtově roztoku, 0,1% SDS a 100 pg/ml denaturované DNA lososího spermatu a 5 ng/ml značené sondy po dobu 18 až 24 hodin ve 42 °C, pak se bloty odmyly v 2x SSC 10 minut při teplotě místnosti, Ix SSC 10 minut v 50 °C a v 0,5xSSC 10 až 15 minut

Za použití sondy pocházející z myší cDNA a hybridizace za stringentních podmínek byl v lymfatických uzlinách objeven převládající druh mRNA s relativní molekulovou hmotností přibližně 2,5 kb (obrátek 3). Slabý signál o stejné relativní molekulové hmotnosti byl také detekován umRNA z fetálních jater. V dalších vyšetřovaných tkáních nebyl zjištěn žádný transkript proteinu vázajícího OPG. Data nasvědčují, že exprese mRNA proteinu vázajícího OPG je v lidských tkáních velice omezená. Data také ukazují, že izolovaný cDNA klon má velmi blízko k velikosti přírodního transkriptu, což svědčí pro to, že 32D-F3 je klon plné délky.

Příklad 5

Molekulární klonování lidského proteinu vázajícího OPG

Lidský homolog proteinu vázajícího OPG je exprimován jako mRNA o velikosti přibližně 2,5 kb v lidských periferních lymfatických uzlinách a je detekován hybridizací se sondou z myší cDNA za stringentních hybridizačních podmínek. DNA kódující lidský protein vázající OPG byla získána testováním cDNA knihovny lidských lymfatických uzlin hybridizačními metodami s použitím buď rekombinantních bakteriofágových plaků, nebo transformovaných bakteriálních kolonií (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 19889). Fágová nebo plazmidová cDNA knihovna se testovala za použití radioaktivně značených sond pocházejících z klonu 32D-F3 myšího proteinu vázajícího OPG. Sondy byly použity k testování nitrocelulóžových membrán, na které byla přenesena knihovna otiskem misky. Tyto membrány jsou prehybrídizovány a pak hybridizovány za použití podmínek specifikovaných v příkladu 4, což nakonec poskytlo puntíkované klony lidské cDNA proteinu vázajícího OPG. Inzerty získané z každého klonu lidského proteinu vázajícího OPG byly sekvencovány a analyzovány, jak je popsáno v příkladu 3.

Póly A+ RNA z lidské lymfatické uzliny (Clontech, lne., Palo Alto, CA) se analyzovala na přítomnost transkriptu OPG-bp jak bylo již dříve popsáno v patentové přihlášce US 08/577 788, podané 22. prosince 1995. Northem-blot tohoto vzorku RNA zkoumaný za stringentních podmínek sondou myšího OPG-bp značeného P ukázal přítomnost transkriptu lidského OPG-bp. Z mRNA lymfatické uzliny pak byla syntetizována cDNA knihovna pomocí primerů olíg(dT) s použitím soupravy SuperScript kit (Gibco Life Technologies, Gaithersberg, MD), jak je popsáno v příkladu 2. Výsledná cDNA byla rozdělena podle velikosti a frakce o vysoké molekulové hmotnosti byly ligovány do plazmidového vektoru pcDNA3.1(+)(Invitrogen, San Diego, CA). Transformovaly se elektrokompetentní E. coli DH10 (Gibco Life Technologies, Gaithersberg, MD) a 1 x 10⁶ transformant rezistentních na ampicilin se testovalo hybridizací kolonií s myším proteinem vázajícím OPG značeným ²P jako sondou.

Byl izolován plazmidový klon s předpokládanou cDNA lidského proteinu vázajícího OPG, phuOPGbp-1.1, obsahující inzert o velikosti 2,3 kb. Výsledná nukleotidová sekvence inzertu phuOPGbp-1.1 byla přibližně z 80 až 85 % homologní se sekvencí cDNA myšího proteinu vázajícího OPG. Translace vložené sekvence DNA ukazovala na přítomnost dlouhého otevřeného čtecího rámce, o kterém se předpovídalo, že kóduje 317 aa polypeptid (obrázek 4). Srovnání myšího a lidského OPG-bp polypeptidu ukazuje, že jsou identické z -87 %, což naznačuje, že tento protein je během evoluce velmi konzervativní. Sekvence DNA lidského proteinu vázajícího OPG a jeho proteinová sekvence nebyly nalezeny v databázi Genbank, a nebyly zde ani žádní homologní EST sekvence. Lidský protein vázající OPG vykazuje stejně jako myší homolog výraznou podobnost sekvencí se všemi členy rodiny cytokinů TNFa.

-20CZ 302262 B6

Příklad 6

Klonování a bakteriální exprese proteinu vázajícího OPG

Pro tvoření různých forem myších proteinů vázajících OPG je použita amplifikace pomocí metody PCR (polymerázová řetězová reakce) používající páry primerů a templáty popsané níže. Jeden primer z každého páru vnáší TAA stop-kodon a jedinečné místo Xhoí nebo SacIL které následuje po karboxylovém konci genu. Další primer z každého páru vnáší jedinečné místo Ndel, io N-koncový methionin a optimalizuje s použitím standardní metody rekombinantní DNA. PCR produkty se purifikují, naštepí restrikčními enzymy a vloží do jedinečných míst Ndel a Xhoí nebo SacII vektoru pAMG21 (ATCC č. 98113) a transformuje do prototrofních E. coli 393 nebo

2596. Další obecně používané expresní vektory E. coli a hostitelské buňky jsou také vhodné pro expresi. Po transformaci se selektují klony, izoluje se plazmidová DNA a potvrzuje se sekvence inzertu proteinu vázaj ícího OPG.

pAMG21-myší protein vázající OPG [75-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 242 aminokyselin a přitom měl následující N2o koncové a C-koncové zbytky, NH₂-Met(75)-Asp-Pro-Asn-Arg--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)COOH. Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1581-72 ač. 1581-76.

1581-72:

’ - GTTCTCCTCATATGGATCCAAACCGTATTTCTGAAGACAGCACTCACTGCTT - 3 *

1581-76:

' -TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3' pAMG21-myší protein vázající OPG [95-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 223 aminokyselin a měl následující N—koncové a C-koncové zbytky, NH₂-Met(95)-Glu-Asn-Ala-Gly--------Gln-Asp-IleH-Asp(316)-COOH.

Templát použitý pro PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č, 1591-90 a č. 1591-95.

1591-90:

' - ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGCATGAAAACGCAGGTCTGCAG-3 ’

1591-95:

_3θ 5' - TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA - 3 ’ pAMG21-myší protein vázající OPG [107-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 211 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH₂-Met(107)-Glu-Asp-Thr-Leu--------Gln-Asp-Ile-Asp(3 lópCOOH.

Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1591-93 ač. 1591-95.

1591-93:

5' - ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTGAAGACACTCTGCCGGACTCC - 3 '

1591-95:

' - TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA- 3 ’

-21 CZ 302262 B6 pAMG21-mysí protein vázající OPG [118-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 199 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH₃-Met(1 I8)-Lys-Gln-Ala-Phe-Gln--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)5 COOH. Tem plát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1591—94 a č. 1591—95.

1591-94:

' -ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGAAACAAGCTTTTCAGGGG- 3 '

1591-95:

5' -TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA-3 * pAMG21-myší protein vázající OPG [128-316] io Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 190 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH₂-Met(128)-Glu-Leu-Gln-His--------Gtn-Asp-lle-Asp(316)-COOH.

Tem plát pro použití v PCR byl pcDNA/32D~F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1591-91 ač. 1591-95.

1591-91:

5' -ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGAAAGAACTGCAGCACATTGTG-3 '

1591-95:

' -TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA- 3 ' is pAMG21-myší protein vázající OPG [137-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 181 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH2-Met-Gln(137)-Arg-Phe-Ser-Gly--------Gln-Asp-Ile-Asp(316>COOH. Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1591-92 a č. 1591-95.

1591-92:

5' - ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGCAGCGTTTCTCTGGTGCTCCA - 3 '

1591-95:

5‘ -TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA- 3' pAMG21-myší protein vázající OPG [146-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 171 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH₃-Met( 146)-<ilu-Gly-Ser-Trp--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH.

Templát pro použití v PCR byl pAMG21-myší protein vázající OPG [75-316] popsaný výše a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č, 1600-98 ač. 1581-76.

1600-98:

5' - GTTCTCCTCATATGGAAGGTTCTTGGTTGGATGTGGCCCA-3'

1581-76:

' - TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA - 3 '

-22CZ 302262 B6 pAMG21-myší protein vázající OPG [156—316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 162 aminokyselin a mel následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH₂-Met-Arg( 156)-Gly-Lys-Pro--------Gln-Asp-lle-Asp(316)-COOíl.

Templát pro použití v PCR byl pAMG21-myší protein vázající OPG [158-316] níže a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy Č. 1619-86 a č. 158176.

1619-86:

5' - GTTCTCCTCATATGCGTGGTAAACCTGAAGCTCAACCATTTGCA - 3 '

1581-76:

' - TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA - 3 * pAMG21-myší protein vázající OPG [158-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 160 aminokyselin a měl následující N—koncové a C-koncové zbytky, NH2-Met-Lys(158)-PrO“Glu-Ala--------Gln-Asp-lle-Asp(316)-COOH,

Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1581—73 ač. 1581-76.

1581-73:

* - GTTCTCCTCATATGAAACCTGAAGCTCAACCATTTGCACACCTCACCATCAA? - 3 '

1581-76:

5' - TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA - 3 * pAMG21-myší protein vázající OPG [166-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 152 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NH₂-Met-His(166)-Leu-Thr-Ile--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)~COOH.

Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1581-75 a č. 1581-76.

1581-75:

* ’GTTCTCCTCATATGCATTTAACTATTAACGCTGCATCTATCCCAT CGGGTTCCCATAAAGTCACT’3’

1581-76:

5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3' pAMG21-myší protein vázající OPG [168-316]

Tento konstrukt byl navržen tak, aby byl dlouhý 150 aminokyselin a měl následující N-koncové a C-koncové zbytky, NHz-Met-ThiJl 68)-1 le-Asn-Ala--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH.

Templát pro použití v PCR byl pcDNA/32D-F3 a pár primerů pro PCR a klonování tohoto genového konstruktu byly oligonukleotidy č. 1581-74 ač. 1581-76.

1581-74:

5' - GTTCTCCTCATATGACTATTAACGCTGCATCTATCCCATCGGGTTCCCATAAAGTCACT - 3 '

1581-76:

5’-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA- 3'

Rozumí se, že výše uvedené konstrukty jsou pouze příklady a odborník může snadno získat další formy proteinu vázajícího OPG použitím obecně známých metod zde citovaných.

-23 CZ 302262 B6

Rekombinantní bakteriální konstrukty pAMG21-myšího proteinu vázající OPG [75-316], [95316], [107-316], [118-316], [128-316], [137-316] a [158-316] byly klonovány, byla ověřena sekvence DNA a byly prozkoumány hladiny exprese rekombinantního genového produktu po indukci. Rekombinantní genový produkt se ve všech konstruktech tvořil v takovém množství, že byl snadno viditelný po elektroforéze hrubých lyzátů v SDS-polyakrylamidovém gelu a po obarvení Coomasieho modří. Pěstování transformovaných E. coli 393 nebo 2596, indukce exprese proteinu vázajícího OPG a izolace inkluzních tělísek obsahujících protein vázající OPG se prováděla podle postupů popsaných v PCT WO97/23614. Purifikace proteinů vázajících OPG z inkluzních tělísek vyžaduje solubilízaci a renaturaci proteinu vázajícího OPG za použití postupů odborníkovi dostupných. Zjistilo se, že rekombinantní myší protein vázající OPG [158-316] je produkován většinou v nerozpustné formě, ale přibližně 40 % bylo nalezeno v rozpustné frakci. Rekombinantní protein byl purifikován z rozpustné frakce jak je popsáno níže a byla prozkoumána jeho biologická aktivita.

Příklad 7

Purifikace rekombinantního myšího proteinu vázajícího OPG [158-316]

Zmrazené bakteriální buňky obsahující exprimovaný myší protein vázající OPG [158-316] byly rozmraženy a resu spěn dovány ve 20 mM Tris-HCI pH 7,0. 10 mM EDTA. Buněčná suspenze (20% hmotnost/objem) pak byla homogenizována třemi průchody skrze mikrofluidizér. Suspenze lyžovaných buněk se centrifugovala v rotoru JA14 při 10 000 rpm po dobu 45 minut. Analýza SDS-PAGE ukázala pás přibližné molekulové hmotnosti přítomný jak v inkluzních tělískách, tak v supematantu. Rozpustná frakce pak byla nanesena na kolonu Pharmacia SP Sepharose 4FF ekvilibrovanou 10 mM MES pH 6,0. Protein vázající OPG se eluoval v gradientu 0-0,4 M NaCl v MES pH 6,0 objemem 20x větším než objem kolony. Frakce obsahující protein vázající OPG pak byly naneseny na kolonu ABX Bakerbond ekvilibrovanou 20 mM MES pH 6,0. Protein vázající OPG se eluoval v gradientu 0-0,5 M NaCl v MES pH 6,0 objemem 15x větším než objem kolony (15CV). Konečný produkt byl při SDS-PAGE shledán homogenním zvíce než 95 %. N-koncové peptidové sekvencování poskytlo následující sekvenci. Met-Lys-Pro-OluAla-Gln-Pro-Phe-Ala-His, která byl ztotožněna s předikovanou sekvencí pro polypeptid začínající aminokyselinovým zbytkem 158 (s iniciačním methioninem). Relativní molekulová hmotnost proteinu stanovená pomocí SDS-PAGE se při redukujících podmínkách nezměnila.

Příklad 8

Biologická aktivita rekombinantního rozpustného proteinu vázajícího OPG in vitro

Dříve bylo prokázáno, že rekombinantní protein OPG blokuje tvorbu osteoklastů závislou na vitaminu D3 z kostní dřeně a prekurzoru sleziny v testu tvorby osteoklastů, jak bylo popsáno v patentové přihlášce US č. 08/577 788. Protože se protein vázající OPG váže na OPG a je novým členem rodiny TNF ligandů, je to potenciální cíl biologické aktivity OPG. Rekombinantní rozpustný protein vázající OPG [158-316], představující minimální doménu podobnou jádru TNFa, se testoval na svou schopnost modulovat diferenciaci osteoklastů zprekurzorů osteoklastů. Buňky kostní dřeně se izolovaly z femurů dospělých myší a ošetřily se MCSF. Neadherentní frakce se pěstovala společně s buňkami ST2 v přítomnosti či chybění vitaminu D3 a dexametazonu. Jak bylo ukázáno dříve, osteoklasty se vyvíjejí pouze ve společných kulturách obsahujících buňky stromatu (ST2), vitamin D3 a dexametazon. Přidával se rekombinantní rozpustný protein vázající OPG v různých koncentracích kolísajících od 0,16 do 500 ng/ml a zrání osteoklastů se určovalo testem s roztokem TRAP a vizuálním hodnocením. Protein vázající OPG výrazně stimuloval diferenciaci a zrání osteoklastů v závislosti na dávce, poloviny maximálního účinku bylo dosaženo v rozmezí 1 až 2 ng/ml, což svědčí pro to, že se protein chová jako silný

-24CZ 302262 B6 induktor osteoklastogeneze in vitro (obrázek 5). Účinek proteinu vázajícího OPG je blokován rekombinantním OPG (obrázek 6).

Aby se otestovalo, zda protein vázající OPG může nahradit vliv stromatu a přídavek steroidů, 5 založily se tkáňové kultury s použitím různých koncentrací M-CSF pro podporu růstu osteoklastických prekurzorů a přidávala se také různá množství proteinu vázajícího OPG. Jak je ukázáno na obrázku 6, protein vázající OPG stimuloval v závislosti na dávce aktivitu TRAP, a rozsah stimulace závisel na stupni přidaného M-CSF, což svědčí pro to, že pro vývoj osteoklastů jsou klíčové tyto dva faktory dohromady. Aby se potvrdila biologická relevance tohoto posledio ního pozorování, založily se tkáňové kultury na kortikálních řezech z hovězí kosti atestoval se účinek M-CSF a proteinu vázajícího OPG buď samotných, nebo dohromady. Jak je ukázáno na obrázku 7, protein vázající OPG stimuloval v přítomnosti M-CSF tvorbu velkých osteoklastů

TRAP pozitivních, které erodovaly povrch kosti, což mělo za následek vznik dírek. Protein vázající OPG tedy účinkuje jako osteoklastogenezi stimulující faktor (diferenciační faktor). To nazna15 čuje, že OPG blokuje vývoj osteoklastů tím, že maskuje protein vázající OPG.

Příklad 9

Aktivita rekombinantního rozpustného proteinu vázajícího OPG in vivo

Na základě studií in vitro lze soudit, že rekombinantní myší protein vázající OPG [158-316] tvořený v E. colije silný induktor vývoje osteoklastů z myeloidních prekurzorů. Aby se určil jeho účinek in vivo, dostávali samci myší BDF1 ve věku 4 až 5 týdnů (Charles River Laboratories) subkutánní injekce proteinu vázajícího OPG [158-316] dvakrát denně tři dny a ráno čtvrtého dne (dny 0, 1, 2, a 3). Pět skupin myší (n=4) dostalo samotný nosič, nebo 1, 5, 25 nebo 100 pg proteinu vázajícího OPG [158-316] denně. Dalších 5 skupin myší (n=4) dostalo výše uvedené dávky nosiče nebo proteinu vázajícího OPG [158-316] a navíc dostalo lidský Fc-OPG [22-194] v dávce 1 mg/kg/den (přibližně 20 pg/den) jednou subkutánní injekcí denně. Před ošetřením se určilo ionizované kale i um plné krve v den 0 a 3 až 4 hodiny po první denní injekci proteinu vázajícího OPG [158-316] v den 1, 2 a 3. Čtyři hodiny po poslední injekci v den 3 byly myši usmrceny a odebraly se vzorky pro radiogramy.

Rekombinantní protein vázající OPG [158-316] vyvolal po dvou dnech léčení v dávce 5 pg/den a vyšší významné zvýšení ionizovaného kale i a v krvi (obrázek 8). Závažnost hyperkalcémie ukazuje silnou indukci osteoklastické aktivity, což má za následek zvýšenou resorpci kostí. Současné podávání OPG omezilo hyperkalcémii při dávce proteinu vázajícího OPG [158-316] 5 a 25 pg/den, ale ne při dávce 100 pg/den. U stejných zvířat se analyzovaly radiogramy, aby se určilo, zda protein měl vliv na hustotu minerálů kosti viditelný na rentgenovém snímku (obrá40 zek9). Rekombinantní protein vázající OPG [158-316] podávaný v injekcích tři dny snižoval hustotu ostí v proximální tibii myší v závislosti na dávce. Redukce hustoty kosti byla zejména zřetelná z myší dostávajících 100 pg/den, což potvrdilo, že těžká hyperkalcémie u těchto zvířat byla vyvolána zvýšenou kostní resorpci a následného uvolnění kalcia ze skeletu. Tato data jasně svědčí pro to, že protein vázající OPG [158-316] podporuje resorpci kosti in vivo, což vede k systémové hyperkalcémii, a rekombinantní OPG tento vliv ruší.

Příklad 10

Klonování a exprese rozpustného proteinu vázajícího OPG v savčích buňkách

Kompletní klon myšího a lidského proteinu vázajícího OPG může být exprimován v savčích buňkách jak bylo dříve popsáno v příkladu 2. Alternativně mohou být cDNA klony modifikované tak, aby kódovaly secemované formy proteinu při jeho expresi v savčích buňkách. Aby se tak stalo, může být přirozený 5' konec cDNA kódující iniciační kodon a zahrnující přibližně prvních

-25CZ 302262 B6 aminokyselin proteinu, včetně transmembránové oblasti, nahrazen vedoucí sekvenci signálního peptidu. Například sekvence DNA kódující iniciační kodon a signální peptid známého genu mohou být připojeny k cDNA sekvenci proteinu vázajícího OPG se začátkem kdekoliv po oblasti kódující aminokyselinový zbytek 68. O výsledných rekombinantních klonech lze předpokládat, že budou tvořit secemované formy proteinu vázajícího OPG v savčích buňkách, a mohou podstoupit posttranslační modifikace, které se normálně vyskytují v C-koncové extracelulámí doméně proteinu vázajícího OPG, jako je glykosylace. S použitím této strategie byla vytvořena secernovaná forma proteinu vázajícího OPG, která má na svém 5' konci signální peptid myšího OPG, a na svém 3' konci Fc doménu lidského IgGl. Plazmidový vektor pCEP4/muOPG [22^401 ]-Fc, jak je popsán v patentové přihlášce US č. 08/577 788, podané 22. prosince 1995, byl štěpen Notl, aby se naštěpil mezi 3' koncem OPG a genem Fc. Linearizovaná DNA pak byla částečně štěpena s XmnI, aby se naštěpila jenom mezi zbytky 23 a 24 OPG se slepým koncem. Restrikční fragmenty pak byly defosforylovány s CIP a vektorová část tohoto fragmentu (včetně zbytků 1-23 OPG a Fc) pak byla purifikována na gelu.

Oblast cDNA myšího proteinu vázajícího OPG kódující aminokyselinové zbytky 69-316 byla amplifíkována pomocí PCR při použití polymerázy Pfu (Stratagene, San Diego, CA) z plazmidového templátu s použitím následujících oligonukleotidů jako primerů:

1602-61: CCT CTA GGC CTG TAC TTT CGA GCG CAG ATG

1602-59: CCT CTG CGG CCG CGT CTA TGT CCT GAA CTT TG

Oligonukleotid 1602-61 amplifikuje 5' konec genu a obsahuje arteficiální místo Stul. Primer 1602-59 amplifikuje 3' konec genu a obsahuje arteficíální místo Notl. Výsledný získaný produkt PCR byl štěpen s Notl a Stul, a pak purifikován na gelu. Purifikovaný produkt PCR byl ligován s vektorem a pak použít k transformaci elektrokompetentních buněk £. coli DH10B. Výsledný klon byl sekvencován pro potvrzení integrity amplífikované sekvence a spojení restrikčních míst. Tento plazmid pak byl použit k transfekci lidských fibroblastů 293 a fúzní protein vázající OPGFc se pak odebíral z kultivačních médií jak bylo dříve popsáno v patentové přihlášce US č, 08/577 788, podané 22. prosince 1995.

S použitím podobné strategie byl navržen expresní vektor, který je schopný exprese na N-konci zkrácené formy fúzované s Fc doménou lidského IgG 1. Tento konstrukt se skládá ze signálního peptidu myšího OPG (aa zbytky 1-21), fúzovaného v rámci ke zbytkům 158-316 myšího proteinu vázajícího OPG, následováno fúzí v rámci k Fc doméně lidského IgGl. Kvůli tomu byl plazmidový vektor pCEP4/myší OPG [22-401] (viz US 08/577 788 ze 22. prosince 1995) štěpen s HindlII a Notl, aby se odstranil celý OPG čtecí rámec. Zbytky myšího proteinu vázajícího OPG 158-316 byly amplifikovány pomocí PCR s použitím templátu z plazmidu cDNA/32D-F3 a následujících primerů:

1616-44: CCT CTC TCG AGT GGA CAA CCC AGA AGC CTG AGG CCC AGC CAT TTG C

1602-59: CCT CTG CGG CCG CGT CTA TGT CCT GAA CTT TG

1616-44 amplifikuje protein vázající OPG začínající zbytkem 158, a také obsahující zbytky 1621 signálního peptidu muOPG s arteficiálním místem Xhol. 1602-59 amplifikuje 3' konec genu a přidává místo Notl do rámce. Produkt PCR byl štěpen s Notl a Xhol a pak purifikován na gelu.

Následující komplementární primery byly připojeny k sobě navzájem, čímž vznikl adaptér kódující signální peptid myšího OPG a Kozákovu sekvenci obklopující iniciační místo translace:

-26CZ 302262 B6

1616-41: AGC TTC CAC CAT GAA CAA GTG GCT GTG CTG CGC ACT CCT GGT GCT CCT GGA CAT CA

1616-42: TCG ATG ATG TCC AGG AGC ACC AGG AGT GCG CAG CAC AGC CAC TTG TTC ATG GTG GA

Tyto příměry byly připojeny za vzniku 5' přesahujících konců kompatibilních s HindlII na 5' konci a Xhol na 3' konci. Naštěpený vektor získaný výše, připojené oligonukleotidy a naštěpený PCR fragment byly ligovány dohromady a vneseny elektroporací do buněk DH10B. Výsledný klon byl sekvencován pro potvrzení autentické rekonstrukce spojení mezi signálním peptidem, fragmentem proteinu vázajícího OPG kódujícího zbytky 158-316 a Fc doménou IgGl. Rekombinantní plazmid byl purifikován, transfekován do lidských fibroblastů 293 a produkt byl exprimován v médiu, jak bylo popsáno výše.

io Kompletní myší a lidská cDNA byly klonovány v expresním vektoru pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA), a pak transfekovány do kultur lidských fibroblastů 293, jak je popsáno v příkladu 1. Selekce buněčných kultur se prováděla hygromycinem, jak je popsáno výše, a byla připravena upravená média bez séra. Upravená média byla nanesena na kolonu s imobilizovaným rekombinantním OPG a oddělené formy myšího a lidského rekombinantní proteinu vázajícího OPG se afinitně purifikovaly. Sekvenční analýza N-konce purifikováných rozpustných protein vázajících OPG ukazuje, že myší protein se přednostně štěpí před fenylalaninem 139 a lidský protein se přednostně štěpí před homologním zbytkem izoleucinem 140. Kromě toho se lidský protein také přednostně štěpí před glycinem 145. To svědčí pro to, že přirozeně se vyskytující rozpustné formy lidského proteinu vázajícího OPG mají aminokoncové zbytky bud’ izoleucin v pozici 140, nebo glycin v pozici 145.

Příklad 11

Peptidy proteinu vázajícího OPG a příprava polyklonálních a monoklonálních protilátek k proteinu

Protilátky ke specifickým oblastem proteinu vázajícího OPG mohou být získány imunizací peptidy z proteinu vázajícího OPG. Tyto peptidy mohou být použity samotné nebo mohou být pro imunizaci použity konjugované formy peptidu.

Krystalická struktura maturovaného TNFa byla popsána v práci E. Y. Jones, D.I. Stuart a N.P.C. Walker (J. Cell Sci. Suppl. 13, 11 až 18, 1990) a monomer tvoří sendvičovou strukturu antiparalelních β-skládaného listu s topologií „svinuté palačinky“. V této krystalické struktuře se vyskytuje deset antiparalelních β-pásů a tvoří β-sendvič s jedním β-listem, který se skládá z pásů BBIDG, a druhým listem z pásů C'CHEF (viz E. Y. Jones et al., výše). Ze studia mutageneze se odvozuje, že dvě smyčky maturovaného TNFa tvoří kontakty s receptorem, a že to jsou smyčky tvořené mezi beta pásem B a B' a smyčka mezi beta pásy E a F (C. R. Goh, C-S. Loh a A. G. Porter, Protein Engineering, 4, 785 až 791, 1991). Byla rozřešena krystalická struktura komplexu tvořeného mezi TNFp a extracelulámí doménou 55 kD receptoru TNF (TNF-R55) a byly popsány kontakty receptor-ligand (D. W. Banner, A. D'Arcy, W. Janes, R. Gentz, H. J. Schoenfeld, C. Broger, H. Loetscher a W. Lesslauer, Cell. 73, 431 až 445, 1993), V souladu se studiemi mutageneze popsanými výše (C. R. Goh et al., výše) se shledalo, že odpovídající smyčky BB' a EF ligandu TNF β tvoří většinu kontaktů s receptorem v odhalené krystalické struktuře komplexu TNFb:TNF-R55. Aminokyselinová sekvence myšího proteinu vázajícího OPG byla srovnána s aminokyselinovou sekvencí TNFa a TNF β. Na základě tohoto

-27 CZ 302262 B6 srovnání byly předpověděny oblasti myšího proteinu vázajícího OPG odpovídající smyčkám BB' a EF a byly navrženy peptidy, které jsou popsány níže.

Antigen(y);

Rekombinantní myší protein vázající OPG [158-316] byl použit jako antigen (ag) pro imunizaci zvířat, jak je popsáno níže, a bylo vyšetřeno sérum s použitím přístupů popsaných níže. Byly syntetizovány peptidy k předpokládaným smyčkám BB' a EF myšího proteinu vázajícího OPG a byly použity pro imunizaci, tyto peptidy jsou:

Peptid BB’ smyčky: NH2-NAAS1PSGSHKVTLSSWYHDRGWAKIS—COOH

Cys-peptid BB' smyčky: NH2--NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKISC— —COOH

Peptid EF smyčky: NH2—VYVVKTSIkIPSSHNLM—COOH

Cys-peptid EF smvčkv: NH2—VYVVKTSIKIPSSHNLMC—COOH

Peptidy s cysteinovým zbytkem na karboxylovém konci byly použity pro konjugaci s použitím metod popsaných v části B níže a byly použity pro imunizaci.

B. Konjugace s hemocyaninem z přílipky FissureMa sp. nebo s albuminem bovinního séra:

Vybrané peptidy nebo proteinové fragmenty mohou být konjugovány s hemocyaninem z přílipky Eissurella sp. (KLH, keyhole limpet hemocyanin), aby se zvýšila jejich schopnost imunizovat zvířata. V protokolu El A mohou být použity také peptidy nebo proteinové fragmenty konjugované s albuminem bovinního séra (BSA). Maleimidem aktivovaný KLH nebo BSA (Pierce

Chemical Company, Rockford, IL) se rekonstituuje v dH₂O na konečnou koncentraci 10 mg/ml. Peptid nebo proteinové fragmenty se rozpustí ve fosforečnanovém pufru a pak se smísí s ekvivalentní hmotnosti (g/g) KLH nebo BSA. Konjugační směs se ponechá reagovat 2 hodiny při teplotě místnosti za jemného míchání. Roztok se pak nechá projít odsolovací kolonou nebo se dialyzuje proti PBS přes noc. Peptidový konjugát se uloží v -20 °C dokud se nepoužije pro imunizaci nebo v EIA.

Imunizace:

Myším Balb/c (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), krysám Lou nebo králíkům (Novozélandský bílý) byl subkutánně injekčně (SQI) podán ag (50, 150 a 100μg, v uvedeném pořadí), emulgován v kompletním Freundově adjuvans (CFA, 50% objem/objem, Difco Laboratoires, Detroit, MI). Králíci pak dostávali dvakrát nebo třikrát ve dvoutýdenních intervalech zesilovací antigenu připraveného podobným způsobem v nekompletním Freundově adjuvans (ICFA, Difco Laboratoires, Detroit, MI). Myši a krysy dostávaly zesilovací dávku přibližně každé 4 týdny. Sedm dnů po druhé injekci se odebíraly zkušební vzorky krve a určovaly se titry protilátek v séru. Když se objevily titry u králíků, odebíralo se 6 následujících týdnů 50 ml krve týdně. Myši a krysy se vybíraly na základě sérové hladiny titru pro tvorbu hybridomu, byla použita zvířata s polovičním maximálním titrem větším než 5000. Odborník může provést úpravy imunizačního protokolu, například nyní jsou dostupné různé typy imunomodulátorů, které mohou být do tohoto protokolu zahrnuty.

-28CZ 302262 B6

D. Test s enzymem vázaným na imunosorbent (EIA, Enzyme-linked immunosorbent assay):

EIA se může provádět pro určení titrů sérových protilátek (ab) u jednotlivých zvířat a později pro screening potenciálních hybridomů. 96 jamkové mikrotitrační ElA/RIA destičky s plochým dnem a vysokou schopností (Costar Corporation, Cambridge, MA) byly povlečeny purifikovaným rekombinantním nebo proteinovými fragmenty (antigen, ag) v množství 5 pg per ml v uhličitanhydrogenuhličitanovém pufru, pH 9,2 (0,015 M Na₂CO₃, 0,035 M NaHCO₃). Proteinové fragmenty mohou být konjugovány s albuminem bovinního séra (BSA), je-li to nutné. 50 μΐ ag se přidalo do každé jamky. Destičky pak byly pokryty acetátovým filmem (ICN Biomedicals, lne., io Costa Mesa, CA) a inkubovaly se při teplotě místnosti na kývacím stolečku 2 hodiny nebo přes noc ve 4 °C. Destičky se blokovaly 30 minut při teplotě místnosti (rt) 250 μΐ) na jamku 5% roztoku BSA připraveného smísením 1 části ředidla BSA/koncentrátu blokovacího roztoku (Kirkegaard a Perry Laboratories, lne., Gaithesburg, MD) s 1 částí deionizované vody (dH₂O). Blokovací roztok byl odstraněn, do každé jamky se přidalo 50 μΐ dvojkového ředění séra (1:100 až 1:12 i? 800) nebo supematantu tkáňové kultury hybridomů. Sérum je ředěno 1% BSA (10% BSA ředidlo/koncentrát blokovacího roztoku ředěno 1:10 Dulbeccovým fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnany, D-PBS, Gibco BRL, Grand Island, NY), zatímco supematanty hybridomu se testovaly neředěné. V případě sereeningu hybridomů je jedna jamka udržována jako kontrola konjugátu a druhá jamka jako pozitivní ab kontrola. Destičky se opět ínkubují při teplotě místnosti, kývají 1 hodinu a pak se 4 x promyjí lx ředěním 20x koncentrovaného promývacího roztoku (Kirkegaard a Perry Laboratoires, lne., Gaithesburg, MD) v dH₂O. Sekundární ab konjugovaná s křenovou peroxidázou (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) ředěná v 1% BSA se pak v každé jamce inkubuje 30 minut. Destičky se promyjí jako předtím, odsají do sucha, a přidá se jednosložkový substrát ABTS peroxidáza (Kirkegaard a Perry Laboratoires, lne., Gaithesburg, MD). Pro každou jamku se odečte absorbance ve 405 nm za použití odečítacího přístroje Microplate EL310 (Bio-Tek Instruments, lne., Winooski, VT). Poloviční maximální titr sérové protilátky se vypočetl vynesením log_]0 sérového ředění proti optické denzitě při 405 nm, a pak extrapolací 50% bodu maximální optické denzity získané pro toto sérum. Hybridomy se vybíraly jako pozitivní, jestliže hodnota optické denzity je větší než pětinásobek pozadí.

Mohou se provést úpravy tohoto protokolu, například může být vybrána konjugovaná sekundární protilátka pro svou specifičnost nebo proto, že neprojevuje zkříženou reaktivitu.

Fúze buněk:

Zvířeti vybranému pro vytvoření hybridomů se intravenózně injikuje 50 až 100pg ag v PBS. Čtyři dny později se zvíře usmrtí oxidem uhličitým a za sterilních podmínek se mu odebere slezina do 35 ml Dulbeccova modifikovaného Eagleho média obsahujícího 200 U/ml penicilinu G, 200 pg/ml streptomycinsulfátu a 4 mM glutamin (2x P/S/G DMEM). Slezina je očištěna od přebytečné tukové tkáně, a pak propláchnuta ve čtyřech miskách s čistým 2x P/S/G DMEM. Poté je přenesena do sterilního váčku Stomacher (Tekmar, Cincinnati, OH) obsahujícího 10 ml 2x P/S/G DMEM a rozrušena na suspenzi jednotlivých buněk pomocí zařízení Stomacher Lab Blender 80 (Seward Laboratory, UAC House, London, England). Když jsou buňky uvolněny z pouzdra sleziny do média, odstraní se z váčku a přenesou do sterilní 50 ml kónické centrifugační zkumavky (Becton Dickinson and Company, Lincoln Park, NJ). Do váčku se přidá čerstvé médium a v postupu se pokračuje, dokud není uvolněn veškerý buněčný obsah sleziny, Splenocyty se 3x promyjí pomocí centrifugace v 225 x g 10 minut. Současně se podobným způsobem promyjí kultury myelomových buněk v log fázi, Sp2/0~Agl4 nebo Y3-Agl.2.3 pro myší nebo krysí splenocytové fúze (American Type Culture Collection, Rockville, MD) pěstované v kompletním médiu (DMEM, 10% inaktivované fetální bovinní sérum, 2 mM glutamin, 0,1 mM neesenciální aminokyseliny, 1 mM pyruvát sodný a lOmM hepes pufr, Gibco Laboratories, Grand Island, NY). Splenocyty se spojí s myelomovými buňkami a znovu se peletují. Z buněčného peletu se odsálo médium a buňky se jemně smísily během 1 minuty se 2 ml polyethyíenglykolu 1500 (PEG 1500, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN). Pak se pomalu přidal stejný objem 2x P//S/G DMEM. Buňky se ponechaly fúzovat 2 minuty při 37 °C, a pak se

-29CZ 302262 B6 přidalo dalších 6 ml 2x P/S/G DMEM. Buňky se opět nechaly ve 37 °C 3 minuty. Nakonec se k buněčné suspenzi přidalo 35 ml 2x P/S/G DM EM a buňky se peletovaly stočením. Z peletu se odsálo médium a buňky se jemně resuspendovaly v kompletním médiu. Buňky se rozptýlily na 96 jamkové destičky pro tkáňové kultury s plochým dnem (Becton Dickinson Labware, Lincoln

Park, NJ) jednou kapkou z 5ml pipety. Destičky se ínkubovaly přes noc ve zvlhčovaném vzduchu s 5% CO₂ při 37 °C. Příští den se do každé jamky přidal stejný objem selekčního média. Selekční médium sestávalo z 0,1 mM hypoxanthinu, 4 x 10 ⁴ mM aminopterinu a 1,6 x 10 ² mM thymidinu v kompletním médiu. Fúzní destičky se ínkubovaly 7 dnů, pak během dalších tří dnů se dvakrát vyměnilo médium, po každé výměně se použilo HAT selekční médium. Supematanty io tkáňových kultur se odebíraly 3 až 4 dny po poslední výměně tekutin z každé jamky obsahující hybrid a testovaly se pomocí EIA na specifickou protilátkovou reaktivitu. Tento protokol byl modifikován podle protokolu v práci Hudsona a Haye (Practical Imunology, druhé vydání,

Blackwelt Scientific Publications).

Příklad 12

Klonování receptorů proteinu vázajícího OPG exprimovaného v hemopoetických prekurzorových buňkách

Biologicky aktivní rekombinantní myší protein vázající OPG [158-316] se konjugoval s fluorescein-izothiokyanátem (FITC) za vzniku fluorescenční sondy. Fluorescenční značení se provádělo inkubací rekombínantního myšího proteinu vázajícího OPG [158-316] se sukcimydylesterem 6fluorescein—5—(a 6)karboxyamidohexanové kyseliny (Molecular Probes, Eugene, OR) v molámím poměru 1:6 12 hodin ve 4 °C. Protein vázající OPG [158-316] značený FITC se dále purífíkoval gelovou filtrační chromatografií. Buňky kostní dřeně myší se izolovaly a ínkubovaly v kultuře za přítomnosti CSF-1 a proteinu vázajícího OPG [158-316], jak je popsáno v příkladu

10. Buňky kostní dřeně myší se pěstovaly přes noc v CSF-1 (30 ng/ml) a proteinu vázajícího OPG [158-316] (20 ng/ml). Nejdříve se odstranily neadherující buňky a uložily na ledu a zbýva30 jící adherentní buňky se odstranily inkubací s pufrem pro disociaci buněk (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), spojily se neadherující populací a označily s FlTC-proteinem vázajícím OPG, jak je popsáno výše. Po promytí a resuspendování v PBS s 0,5% BSA se buňky vystavily FITC-proteinu vázajícímu OPG, promyly a třídily pomocí FACS. Populace buněk, které byly pozitivní na značení FITC-proteinem vázajícím OPG se soustředila a izolovala se mRNA, jak je popsáno v příkladu 2. Tento preparát mRNA se použil pro přípravu cDNA knihovny následující postupy popsané v příkladu 2.

cDNA knihovna tvořená z tohoto zdroje byla použita pro náhodnou EST sekvenační analýzu, jak bylo dříve popsáno v PCT přihlášce č. WO97/23614 a v práci Simoneta et al. (Cell, 89, 309-319, to 1997). S použitím této metody byla objevena cDNA o velikosti ~2,1 kb, která kóduje nový protein příbuzný TNFR. Dlouhý otevřený čtecí rámec cDNA myšího ODAR kóduje protein o 625 aminokyselinových zbytcích a obsahuje charakteristické znaky proteinů příbuzných s TNFR: hydrofobní signální peptid na N-konci, čtyři sekvence tandemové repetice bohaté na cystein, hydrofobní transmembránovou doménu a cytoplazmatickou signální doménu. Homologie tohoto proteinu s jinými čteny rodiny receptorů TNF a jeho exprese v buňkách kostní dřeně, které vážou protein vázající OPG značený FITC, svědčí pro to, zeje to potenciální receptor pro protein vázající OPG, který je příbuzný s TNF. Tento protein je označen ODAR neboli osteoklastový díferenciační a aktivační receptor. Sekvence nukleové kyseliny a před i kovaná aminokyselinová sekvence myšího ODAR je ukázána na obrázku 10.

Nedávná analýza sekvencí z veřejně dostupných databází naznačuje, že tento protein je myší homolog lidského proteinu příbuzného s TNFR známého jako RANK (Anderson et al., Nátuře, 390, 175-179, 1997).

-30CZ 302262 B6

Příklad 13

Příprava rekombinantní ho proteinu ODAR v savčích buňkách

Rozpustná extracelulární doména ODAR fúzovaná k oblasti Fc lidského IgGl se připravila s použitím postupů pro konstrukci a expresi Fc fůzních proteinů, jak bylo dříve popsáno v dokumentu WO97/23614 a v práci Simoneta et al,, výše. Aby se v savčích buňkách tvořil rozpustný protein ODAR, byla pomocí PCR amplifikována cDNA kódující extracelulární doménu myšího ODAR (aminokyseliny 27—211) s následující sadou oligonukleotidových příměrů:

5-TCT CCA AGC TTG TG A CTC TCC AGG TCA CTC C-3‘

5-TCT CCCt CGG CCG CGT AAG CCT GGG CCT CAT TGG GTG-3’

Reakce PCR se prováděly v objemu 50 μΐ s 1 jednotkou DNA polymerázy Vent (New England Biolabs) ve 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM KC1, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton-X100, 10 μΜ každého dNTP, 1 μΜ každého primem a 10 ng cDNA templátu ODAR. Reakce se prováděly v 94 °C 30 s, 55 °C 30 s a 72 °C 1 minutu, celkem 16 cyklů. Fragment PCR se izoloval elektroforézou. Fragment PCR tvořil restrikční místo HindlII na 5' konci a restrikční místo Notl na 3' konci. PCR fragment štěpený HindlII a Notl byl pak subklonován do rámce do modifikovaného vektoru pCEP4-Fc před sekvenci těžkého řetězce lidského IgG-γΙ, jak bylo dříve popsáno ve WO97/23614 a v práci Simoneta et al., výše. Byla vnesena spojka, která kóduje dvě irelevantní aminokyseliny vytvářející spojení mezi extracelulární doménou ODAR a Fc oblastí IgG.

Konstrukt pak byl štěpen s Nhel a HindlII do rámce byl vložen následující spojený oligonukleotidový pár kódující signální peptid OPG (aminokyseliny 1-21):

5-CTA GCA CCA TGA ACA AGT GGC TGT GCT GCG CAC TCC TGG TGC TCC TGG ACA TCA TTG AAT GGA CAA CCC AGA-3*

5’-AGC TTC TGG GTT GTC CAT TCA ATG ATG TCC AGG AGC ACC AGG AGT GCG CAG CAC AGC CAC TTG TTC ATG GTG-3'

Spojka, která kóduje dvě irelevantní aminokyseliny byla vnesena mezi sekvence signálního pepti25 du OPG a ODAR. Konečný sestrojený konstrukt (ODAR-Fc/pCEP4) kóduje fuzní protein, který obsahuje od aminokonce ke karboxylovému konci: signální peptid OPG (aminokyseliny 1-21)— spojka (lysLeu)-ODAR (aminokyseliny 27-21 l)-spojka (AlaAla)-lidský IgG Fc.

Konstrukt byl transfekován do buněk 293-EBNA-l kalciumfosforečnanovou metodou, jak je popsána (Ausubel et al., Curr. Prot. Mol. Biol. 1, 9.1.1-9.1.3, 1994). Transfekované buňky pak byly selektovány v 200 μg/ml hygromycinu (Gibco BRL) a výsledné kultury rezistentní na lék byly spojeny a pěstovány až dosáhly konfluence. Buňky byly promyty jednou v PBS a pak pěstovány v médiu bez séra 72 hodin. Upravená média se odebrala. Fúzní protein ODAR-Fc v médiu se detekoval analýzou westernová přenosu a proti-lidskou protilátkou IgG Fc.

Fúzní protein Fc se purifikoval pomocí chromatografie na koloně sproteinem-A (Pierce) s použitím postupu doporučeného výrobcem. 50 pmol purifikovaného proteinu pak podstoupilo analýzu N-koncové sekvence automatizovanou Edmanovou degradací, jak byla původně popsána autorem Matsudaíra et al. (J. Biol. Chem., 262, 10-35, 1987). Po 10 cyklech byla odečtena násle40 dující aminokyselinová sekvence:

-31 CZ 302262 B6 nh₂-k lvtlqvtp- co₂h.

Vazebná aktivita ODAR-Fc s proteinem vázajícím OPG se vyšetřovala imunofluorescenčním značením kultur transfekovaných buněk COS-7, jak je popsáno v příkladu 2. Do buněk COS-7 byl pomocí lipofektinu vnesen 1 pg expresního vektoru obsahujícího DNA kódující myší protein vázající OPG. Po 48 hodinách inkubace se pak buňky inkubovaly 1 hodinu při 4 °C v roztoku PBS-FBS obsahujícím 10 pg/ml lidského proteinu IgG Fc, ODAR-Fc nebo OPG-Fc. Pak byly buňky dvakrát promyty PBS a inkubovaly se další hodinu v roztoku PBS-FBS obsahujícím 20 pg/ml kozího proti-lidského IgG značeného FITC (Southern Biotech Associates), Po promytí PBS se buňky vyšetřovaly konfokálním mikroskopem (ACAS, Ultima, Insight Biomedical Imaging, lne., Okemos, MI). Oba, ODAR-Fc a OPG-Fc se vážou na OPGL transfekované buňky COS-7 (obrázek 11).

Příklad 14

Biologická aktivita rekombinantního rozpustného ODAR in vitro

Schopnost ODAR inhibovat stimulaci tvorby osteoklastů prostřednictvím proteinu vázajícího OPG se určovala v kultuře kostní dřeně myší za přítomnosti CSF—1 (30 ng/ml) a proteinu vázajícího OPG (5 ng/ml). Postupy, jak použít kultury kostní dřeně myší pro studium maturace osteoklastů, jsou popsány v dokumentu WO 97/23614 a v příkladu 8. Fúzní protein ODAR-Fc, vytvořený jak je popsáno v příkladu 12, se přidával v koncentracích od 65 do 1500 ng/ml. Tvorba osteoklastů se určovala cytochemickým postupem s alkalickou fosfatázou rezistentní na tartrát (TRAP) a testem roztoku TRAP po 5 dnech kultury.

Jak pří cytochemickém postupu, tak při stanovení aktivity TRAP se pozorovala inhibíce tvorby osteoklastů fúzí ODAR-Fc závislá na dávce (obrázek 12). Fúzní protein ODAR-Fc inhiboval tvorbu osteoklastů s ED₅₀ přibližně 10 až 50 ng/ml.

Příklad 15

Biologická aktivita rekombinantního rozpustného ODAR in vivo

Mladí rychle rostoucí samci myší BDF1 staří 3 až 4 týdny dostávali různé dávky fúzního proteinu ODAR-Fc v nosiči (PBS/0,1% BSA) 4 dny jednou denní subkutánní injekcí. Myši se v den 5 rentgenovaly. Použité dávky fúzního proteinu ODAR-Fc byly 0,5, 1,5 a 5 mg/kg/den. Pro každé ošetření byly myši téže skupiny a kontrolní skupiny, které dostaly PBS/0,1% BSA, rentgenovány najeden film. Mezi páry kontrolních a ošetřených tibií se porovnávala metafyzální oblast proximální tibie a ohodnocovala se jako jestli měla ošetřená tibie vyšší denzitu při vizuálním hodnocení než kontrola dávající 8 bodů ukázaných níže. Pro „pozitivní“ výsledek se vyžadovalo arbitrámí skóre 5/8. (Dávkaje v mg/kg/den). (n-4),

Po usmrcení zvířat byla každému zvířeti odstraněna pravá tibie a měřila se hustota kostí v proximální tibiální metaly ze periferní kvantitativní počítačovou tomografií (pQCT) (Stratec, Německo). Dva příčné řezy kostí o velikosti 0,5, 1,5 a 2,0 mm z proximální ho konce tibie se analyzovaly (XM1CE 5.2, Stratec, Německo), aby se určila celková hustota minerálů kosti v metafýze. Pro určení hranice metafyzální kosti od měkké tkáně byl použit separační práh 1500.

Podávání ODAR-Fc inhibovalo u mladých rostoucích myší resorpci kosti v růstové destičce proximální tibie za tvorby oblasti zvýšené denzity kosti, která byla okem viditelná na radiogramech. Radiografícké změny byly patrné při dávce 1,5 mg/kg/den a výše ve dvou pokusech (tabulka 1). Měření hustoty kosti pomocí pQCT u vzorků z druhého pokusu v podobné oblasti tibie potvrdilo u těchto myší zvýšení hustoty kosti závislé na dávce (obrázek 13).

- 32 CZ 302262 B6

Tabulka 1: Inhibice resorpce kosti fúzním proteinem ODAR-Fc

Pokus č. 1

Faktor	Dávka	1	2	3	4	5	6 i	7	8	Výsledek
ODAR-Fc	5,0		+	+	4-	+	1 + ; i	+	+	Pozitivní 8/8
ODAR-Fc	1,5 .	-		+	-	+	+	+ 1	+	Pozitivní 6/8
ODAR-Fc	0,5		t						i	Negativní 0/8
ODAR-Fc	0,15	1 1	1 r i				1		- I Negativní 0/8

Pokus č. 2

Faktor	Dávka	1	2	3	4	5	6	7	8	Výsledek
ODAR-Fc	5,0	+		+	+	+	+		+	Pozitivní 8/8
ODAR-Fc	1,5	+	+		+ 1	+ i	+ 1	i + ! 1	+	Pozitivní 8/8
ODAR-Fc	0,5	-	-	-		Ϊ	“ !	1 i -	-	Negativní 1/8

Zatímco byl předkládaný vynález popsán pomocí výhodných provedení, rozumí se, že odborníkovi jsou zjevné variace a modifikace. Předkládaný vynález, definovaný připojenými patentovýίο mi nároky, tudíž pokrývá všechny takové variace, které spadají do rozsahu vynálezu, jak je popsán v patentové přihlášce.

Claims (48)

1. Izolovaná nukleová kyselina zvolená ze souboru zahrnujícího:

a) nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci polypeptid-kódující oblasti podle obr. 1 (sekvence i.č. 1) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 3);

b) nukleovou kyselinu kódující protein vázající osteoprotegerin podle obr. 1 (sekvence i.č,

2) 25 nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4); a

c) nukleovou kyselinu kódující fragment proteinu vázajícího osteoprotegerin podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4), který váže osteoprotegerin.

30 2. Nukleová kyselina podle nároku 1, kterou je cDNA, genomová DNA, syntetická DNA nebo

RNA.

3. Polypeptid, který je kódován nukleovou kyselinou podle nároku 1.

35

4, Nukleová kyselina podle nároku 1 zahrnující jeden nebo více kodonů výhodných pro expresi v Escherichia coli.

5. Nukleová kyselina podle nároku 1, která má na sebe navázanou detekovatelnou značku.

-33 CZ 302262 Β6

6. Nukleová kyselina kódující polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci zbytků 1-316 nebo zbytků 70-316 podle obr. 1 (sekvence i.č. 2).

7. Nukleová kyselina kódující polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci zbytků 1-317 nebo zbytků 69-317 podle obr. 4 (sekvence i.č. 4).

8. Nukleová kyselina podle nároku 1, ve které fragment obsahuje rozpustnou nebo zkrácenou formu proteinu vázajícího osteoprotegerin.

9. Nukleová kyselina podle nároku 8 kódující polypeptid obsahující zbytky 69-317 podle obr. 4 (sekvence i.č. 4) a jeho zkrácené verze, které vážou osteoprotegerin.

10. Expresní vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 1.

11. Expresní vektor podle nároku 10, ve kterém nukleová kyselina obsahuje oblast kódující polypeptid podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4).

12. Hostitelská buňka transfekovaná expresním vektorem podle nároku 10.

13. Hostitelská buňka podle nároku 12, kterou je eukaryotická nebo prokaryotická buňka.

14. Hostitelská buňka podle nároku 13, kterou je Escherichia coli.

15. Způsob výroby proteinu vázajícího osteoprotegerin, vyznačený tím, že zahrnuje:

kultivaci za vhodných nutričních podmínek hostitelských buněk transformovaných nebo transfekovaných nukleovou kyselinou podle nároku 1; a izolaci polypeptidového produktu exprese nukleové kyseliny.

16. Izolovaný protein vázající osteoprotegerin obsahující aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.Č. 4) nebo jeho fragment, který váže osteoprotegerin.

17. Protein podle nároku 16 obsahující aminokyselinovou sekvenci podle obr. 4 (sekvence i.č. 4).

18. Protein podle nároku 16, kterým je rozpustný protein vázající osteoprotegerin.

19. Protein podle nároku 16, který je kovalentně modifikován polymerem rozpustným ve vodě.

20. Protein podle nároku 19, kde polymerem je polyethylenglykol.

21. Protein podle nároku 16, obsahující aminokyselinovou sekvenci ze zbytků 70-316 včetně podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo její fragment, který váže osteoprotegerin.

22. Protein podle nároku 16 obsahující aminokyselinovou sekvenci ze zbytků 69-317 včetně podle obr. 4 (sekvence i.č. 4) nebo její fragment, který váže osteoprotegerin.

23. Protilátka nebo její fragment, která specificky váže protein vázající osteoprotegerin podle nároku 16.

24. Protilátka podle nároku 23, kterou je monoklonální protilátka.

25. Protilátka podle nároku 23, kterou je rekombinantní protilátka.

-34CZ 302262 B6

26. Protilátka podle nároku 23, kterou je chimérická nebo CDR-roubovaná protilátka.

27. Protilátka podle nároku 23, kterou je lidská protilátka.

28. Protilátka podle nároku 23, kde protilátkou je antagonista proteinu vázajícího osteoprotegerin, který snižuje tvorbu osteoklastů.

29. Protilátka podle nároku 23, kde se protilátka váže k extracelulámí doméně proteinu vázajícího osteoprotegerin sekvence i.č. 4 nebo k fragmentu extracelulámí domény proteinu vázajícího osteoprotegerin sekvence i.č. 4.

30. Způsob detekce přítomnosti proteinu vázajícího osteoprotegerin v biologickém vzorku, vyznačený tím, že zahrnuje:

- inkubaci vzorku s protilátkou podle nároku 23 in vitro za podmínek, které umožňují vázání protilátky k proteinu vázajícího osteoprotegerin; a detekci vázané protilátky.

31. Způsob detekce přítomnosti osteoprotegerinu v biologickém vzorku, vyznačený tím, že zahrnuje:

inkubaci vzorku s proteinem vázajícím osteoprotegerin obsahujícím aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4) nebo její fragment vázající osteoprotegerin in vitro za podmínek, které umožňují vázání proteinu k osteoprotegerinu; a měření vazby proteinu vázajícího osteoprotegerin.

32. Způsob vyhodnocení schopnosti testované sloučeniny vázat se na protein vázající osteoprotegerin, vyznačený tím, že zahrnuje:

- inkubaci proteinu vázajícího osteoprotegerin a obsahujícího aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4) nebo její fragment, který váže osteoprotegerin, s testovanou sloučeninou in vitro za podmínek, které umožňují uvedenou vazbu; a měření vázané sloučeniny.

33. Způsob podle nároku 32, vyznačený tím, že sloučeninou je agonista nebo antagonista proteinu vázajícího osteoprotegerin.

34. Použití nukleové kyseliny komplementární knukleové kyselině podle obr. 1 (sekvence i.č. 1) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 3) pro přípravu léčiva pro regulaci exprese proteinu vázajícího osteoprotegerin.

35. Protein podle nároku 16 obsahující aminokyselinovou sekvenci ze zbytků 158-317 podle obr. 4 (sekvence i.č. 4).

36. Protein podle nároku 16 obsahujícího aminokyselinovou sekvenci ze zbytků 140-317 podle obr. 4 (sekvence i.č. 4).

37. Způsob vyhodnocení schopnosti testované sloučeniny zvyšovat nebo snižovat míru vazby proteinu vázajícího osteoprotegerin k osteoklastovému diferenciačnímu a aktivačnímu receptoru, vyznačený tím, že zahrnuje:

-35CZ 302262 B6

- inkubaci proteinu vázajícího osteoprotegerin obsahujícího aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (sekvence i.č. 2) nebo obr. 4 (sekvence i.č. 4) nebo její fragment, analog nebo derivát, osteoklastového diferencíačního a aktivačního receptorů obsahujícího aminokyselinovou sekvenci podle obr. 10 (sekvence i.Č. 43) nebo její lidský homolog nebo fragment, analog nebo derivát a případně testované sloučeniny za podmínek umožňujících vazbu proteinu vázajícího osteoprotegerin k osteoklastovému diferenciačnímu a aktivačnímu receptorů; a

- měření vazby proteinu vázajícího osteoprotegerin k osteoklastovému diferenciačnímu a aktivačnímu receptorů v nepřítomnosti nebo přítomnosti testované sloučeniny.

38. Použití sloučeniny jako modulátoru proteinu vázajícího osteoprotegerin pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení nemoci kostí, při kterém je sloučeninou protilátka nebo její fragment, který váže OPGbp podle obr. 4 (sekvence i.č. 4) a je antagonistou OPGbp.

39. Použití podle nároku 38, při kterém protilátkou je monoklonální protilátka nebo její fragment.

40. Použití podle nároku 38, při kterém protilátkou je rekombinantní protilátka nebo její fragment.

41. Použití podle nároku 38, při kterém protilátkou je chimérická protilátka nebo CDR-roubovaná protilátka.

42. Použití podle nároku 38, při kterém protilátkou je lidská protilátka nebo její fragment.

43. Použití podle nároku 38, při kterém se protilátka nebo její fragment váže k extracelulámí doméně OPGbp nebo se váže k fragmentu extracelulámí domény OPGbp.

44. Použití podle nároku 38, při kterém se protilátka nebo její fragment váže na s membránou sdruženou formu OPGbp.

45. Použití podle nároku 38, při kterém se protilátka nebo její fragment váže k rozpustné formě OPGbp.

46. Použití podle nároku 38, při kterém je sloučenina použita v kombinaci s farmaceuticky přijatelným ředidlem, nosičem, solubilizačním činidlem, emulgačním činidlem, konzervačním činidlem a/nebo adjuvantem.

47. Použití podle nároku 38, při kterém je dále zahrnuto podání jednoho nebo více kostního morfogenního faktoru, zvoleného ze souboru zahrnujícího BMP-1 až BMP-12, transformačního růstového faktoru beta, členu skupiny transformačního růstového faktoru beta, fíbroblastového růstového faktoru zvoleného ze souboru zahrnujícího FGF-1 až FGF-10, inhibitoru interleukinu1, inhibitoru TNF alfa, parathyroidálního hormonu, prostaglandinu řady E, bifosfonátu nebo minerálu zlepšujícího stav kostí.

48. Použití podle nároku 38, při kterém je nemoc kostí zvolena ze souboru zahrnujícího osteoporózu, osteomyelitidu, hyperkalcemii, osteopenii sdruženou s chirurgickým zákrokem, Pagetovu nemoc, osteonekrózu, úbytek kostní hmoty v důsledku revmatoidní artritidy, periodontální úbytek kostní hmoty, prostetické uvolňování a osteolytickou metastázu.