JP3072330B2 - 自己免疫疾患および悪性疾患の治療のためのｔ細胞リセプターペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願の引例 本出願は、1989年７月19日出願の米国特許出願第07/3
82,804号の継続出願である、1990年１月19日出願の米国
特許出願第07/467,577号の継続出願である。

発明の背景 発明の分野 免疫および免疫治療の分野の本発明は、自己免疫およ
び悪性疾患のような免疫に関連した疾患の予防、抑制、
および治療をすることができるペプチドおよびそれらの
薬学組成物に関する。

従来技術の説明 自己免疫疾患は、宿主の組織への免疫系による不所望
および非正統的な攻撃により特徴づけられる。これら疾
患の進行の機構はよく理解されていないが、この（およ
び他の）文脈において、抗原の進行に関する詳細な少な
くとも幾つかの理由が証明されつつある。自己抗原を含
む抗原が抗原を含む細胞（APC）により断片化され、そ
の結果の断片が主要免疫適合性複合体（MHC）によりコ
ードされる細胞表面の蛋白質の一つと結合することが現
在知られている。結果として、ペプチド抗原の認識はMH
Cにより「制限された」と言われる。MHCと抗原断片の複
合体がＴリンパ球の表面上の相補的なＴ細胞リセプター
（TCR）に結合すると、特定のTCRを生産するクローンま
たは一部の集団を活性化および増殖させる。活性化され
ると、Ｔ細胞は、断片化された抗原を示す免疫系の他の
細胞を制御し、そして認識された抗原のエピトープを含
む細胞または組織を破壊する能力を有する。

アカーオルベア（Acha−Orbea,H）ら、（Ann.Rev.Imm
unol.7:371−405（1989））による自己免疫疾患におけ
るTCRの役割についての総説において、個々の免疫系に
利用できるTCR内の重大な変化、およびTCRのα鎖および
β鎖をコードするDNAの細菌ライン遺伝子配置および遺
伝子再構成による多様性の発生が論じられている。α鎖
は可変領域（Ｖ）、連結部（ｖ）、および定常領域
（Ｃ）の遺伝子セグメントのさまざまな結合によりコー
ドされている。TCRβ鎖はさらに多様性（Ｄ）領域の遺
伝子セグメントによりコードされ、再構成されたVDJC配
列からなる。対立遺伝子の切り出しにより、Ｔ細胞クロ
ーンは一種類のTCRα−βヘテロダイマーを発現する。

増加する多くのヒトの疾患による自然の免疫疾患とし
て分類すれば［テオフィロポウロス（Theofilopoulos,
A.）、シュタイテス（D.P.Stites）編集、Basic and Cl
inical Immunology、ランゲ（Lange）医学出版社、ロス
アルトス（Los Altos）、CA、1988］、幾つかの例は
関節リウマチ（RA）、重症筋無力症（MG）、多発性硬化
症（MS）、全身性紅斑性狼瘡（SLE）、自己免疫性甲状
腺炎（ハシモト甲状腺炎）、グレイブス病、炎症性腸疾
患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎および特定
の種類の糖尿病である。動物モデルがこれら多くのヒト
自己免疫疾患において開発された。もっとも研究された
モデルは試験的なアレルギー性脳脊髄炎（EAE、試験的
自己免疫脳脊髄炎ともよばれる）、MSのモデルである。

これらおよび他の自己免疫疾患が、TCRのMHC/自己抗
原（または非自己抗原）への結合により刺激されたＴヘ
ルパー細胞の作用を含むことは知られているので、MHC/
抗原複合体とTCRの相互作用を破壊するということに基
づいて、予防および／または治療のストラテジーが提唱
された。ライス（Wraith,D.C.）ら、（Cell 57:709−71
5（1989））はこの法則に基づいたアプローチを提唱
し、全Ｔ細胞のワクチン化（コーエン（I.R.Cohen）研
究所により最初に記述された、以下に述べる）、TCRに
結合する抗体を使用する受動的な遮断、複合体のMHC部
分に結合する抗体を使用する受動的な遮断、Ｔヘルパー
細胞マーカー、CD4と反応する抗体の投与、および興味
ある抗原にまねた、MHCまたはTCR分子との結合に拮抗す
るペプチドの使用を含む。

ミエリン塩基性蛋白質、即ちMBPはEAEに含まれる主要
な自己抗原であり、MSに含まれる脳炎誘発物質の最たる
候補である。

ヘーバー−キャッツ（Heber−katz）のグループ［ヘ
ーバー−キャッツ（Heber−katz）ら、Ann.N.Y.Acad.Sc
i.540:576−577（1988）；オウハシ（Owhashi）ら、J.E
xp.Med.168:2153−2164（1988年12月）］はラットＴ細
胞によるMBPエピトープの認識の微妙な特異性を分析し
た。MBPで免疫したラットのＴ細胞をマウスＴリンパ球
ラインにハイブリダイズしクローン化すると、微妙な特
異性のパターンおよびTCRのＶ_β遺伝子の再構成のサザ
ンブロット分析から、たとえ75％のクローンが68−88の
脳炎誘発性決定群と反応しても、反応ポリクローナルな
応答が示された。一つの脳炎誘発性Ｔ細胞ハイブリドー
マに対する10.18と称されたモノクローナル抗体（mAb）
は、MBP68−88エピトープに特異的なＴ細胞クローンと
のみ反応する抗イディオタイプまたは抗クロノタイプで
あることが証明された。mAbは５日後に脳炎誘発性MBPペ
プチドを注射するとEAEをブロックまたは逆転した。可
溶性mAb10.18は特定のＴ細胞をブロックし、固定化され
たmAb10.18はそれらの増殖を刺激した。MBPによるEAEの
誘導にしたがい、mAb10.18結合細胞の比率は最初の極め
て低い頻度から増大する。ラットにおいて、10.18T細胞
がルイス（Lewis）EAEの優性な病原性Ｔ細胞のレパート
リをおそらく代表することを、著者は結論している。し
かしながら、mAb10.18がＶ領域またはイディオタイプ決
定群を認識するかいなかは分かっていない。

TCRのαβヘテロダイマーを発現するＴ細胞はイディ
オタイプおよびＴ細胞の機能を制御できるＶ遺伝子ファ
ミリーに特異的な抗体を誘導できる［オウハシ（Owhash
i,M.）ら、supra;ガスコイン（Gascoine,N.R.J.）ら、P
roc,Natl.Acad.Sci.USA 84:2936（1987）；カプラー（K
appler,J.W.）ら、Nature 332:35（1988）；カプラー
（Kappler,J.W.）ら、Nature 332:40（1988）］。例え
ば、TCRV_β８配列を認識する抗体はマウスおよびラット
において自己免疫の予防および治療に効果的であった
［オウハシ（Owhashi,M.）ら、aupra;アカーオルベア
（Acha−Orbea,H.）ら、Cell 54:263−273（1988）；ア
ーバン（Urban,J.）ら、Cell 54:577−592（1988）］。
Ｖ領域遺伝子産物に選択的なそのような抗体の獲得は、
関連したＶ遺伝子ファミリーによりコードされたTCRを
発現するＴ細胞クローンの有用性に依存し、特異性を確
立するために全細胞を使用する、ほねのおれるスクリー
ニング工程を必要とする。

MHC分子およびCD4分子に対する抗体を使用する抗体治
療は、自己免疫の幾つかの動物モデルにおいて成功した
が、これらのアプローチはあまりに非特異的であり、潜
在的に極めて抑圧的であるが、それは70％のＴ細胞がCD
4を生産し、すべてのＴ細胞を介した応答およびほとん
どの抗体の応対がMHCに関連した抗原の存在を必要とす
るからである。

コーエン（I.R.Cohen）研究所が、ワクチンとして全
肝臓または希釈したＴリンパ球を利用する、自己免疫の
免疫特異性の治療におけるアプローチを開発したことに
より、試験的な自己免疫性甲状腺炎（EAT）、および試
験的な関節炎が予防または治療された。このアプローチ
はコーエン（I.R.Cohen）、Immunol.Rev.94:5−21（198
6）において論評されており、幾つかの自己免疫疾患の
動物モデルを論じているが、その際疾患に特異的なＴリ
ンパ球を用いたワクチン化を使用して予防的効果または
治療効果を生じた。ワクチン化の微妙な特異性は、Ｔ細
胞の認識の微妙な特異性、あるいはTCRを包含すること
により指令された。例えば、それぞれ別々のMBPエピト
ープに反応する２つの別々の抗MBP Ｔ細胞ラインが特
定のエピトープにより特異的に誘導されるEAEに対して
ワクチン化されることが見いだされたが、このことは抗
イディオタイプの免疫性の幾つかの形態を示唆する。し
かしながら、クローン化されていない細胞ラインからMB
P特異的またはチログロブリン特異的Ｔ細胞（甲状腺炎
モデルにおける）を単離しようとするとき、疾患を生じ
るが抵抗性のクローンのみが得られた。このことは静水
圧または化学的クロスリンキングのいずれかによる細胞
膜の適切な凝集または硬化により、より堅実に防御を誘
導できる細胞が生じたという理解につながった。同様
に、MBP特異的細胞の低薬剤量（潜在的脳炎誘発性）に
より致命的なEAEに対する抵抗性も誘発できる。この防
御状態は「自己免疫の妨害」と呼ばれる。この状態はワ
クチン化されたＴ細胞に応答して特異的に増殖でき、イ
ンビトロにおいて作用クローンを抑圧でき（非特異的
に、おそらく抑圧的なリンホカインの放出により）、そ
してインビトロにおいて自己免疫の妨害を採用的に移入
できるＴ細胞クローンを含む。そのような自己免疫の妨
害は特異的エピトープに対する抑圧性の遅延性高感受性
（DH）、および臨床の疾患の予防または許容により伴わ
れる。

前述のアプローチにおける主要な相違点は、該アプロ
ーチがはっきりと規定された治療剤からならない複合体
生物調製物の使用を必要とすることである。そのような
調製物は複合体の生産および保存要求性（例えば、大量
のワクチンＴ細胞の生産のために滅菌した大量の培地を
必要とする）、およびバッチからバッチへの生産性の欠
如に悩む。ヒトに有用なＴ細胞ワクチン調製物は自系
で、個々に特異的でなければならず、各患者にあつらえ
られる。さらに、そのようなＴ細胞への付加的な試薬の
存在は、所望のＴ細胞にのみ限定されない、広範囲で、
おそらく有害な免疫応答をもたらす。（オフナー（Offn
er,H.）ら、J.Neuroimmunol.21:13−22（1989））。

したがって、標的の自己免疫応答に対する特異性、そ
れらの選択における予想の可能性、調製の便利性および
生産性といった特徴、および薬剤量の正確な制御のため
の十分な規定が大いに必要とされる。

発明の概要 本発明は、最も現代的な免疫治療のアプローチおよび
免疫薬学的なアプローチの場合のように、一般化された
免疫の抑制を引き起こすことなしに、クローンに特異的
な様式で免疫関連疾患を予防、抑制または治療できる治
療剤および組成物に対する明らかな必要性に対応して作
られた。本発明は、実際に自己免疫疾患に媒介する自己
抗原に特異的なＴ細胞のラインまたはクローンを複合体
希釈プロトコルにより治療剤に変換でき、該疾患を予防
または治療するために動物に直接注射する、という認識
により開発された。

発明者の目的は、細胞免疫治療によりもたらされるの
とほとんど同じ結果を達成することである。従来技術に
おいて開示された希釈法を使用したとき、発明者は異な
り、予想できないレベルの防護を達成し、その結果の免
疫性はクローンにより限定されなかったが、それはおそ
らく全細胞ワクチンがさまざまな抗原を誘導したためで
ある。

疾患関連抗原を認識するＴ細胞のそれらクローンを用
いる、この一般的アプローチを単純化および一般化する
ため、および極めて特異的な免疫性を達成するための企
てにおいて、発明者は本発明を思いついた。疾患の進行
において存在するＴ細胞のTCRのような疾患関連免疫マ
ーカーの一部分に似せて免疫性ペプチドを合成できると
いうことが、発明者により最初に認識された。期待に反
して、ペプチドを用いた対象物の免疫は、マーカーに対
する宿主の免疫応答に向き、それにより疾患の進行また
は進行中の疾患の治療が阻害または抑制される。

本発明の一つの特徴は、免疫関連疾患を予防、抑制ま
たは治療するために使用するペプチドの選択法であり、
それは疾患に関連したマーカーTCRのアミノ酸配列を決
定し、幾つかの既知のアルゴリズムに基づいて、免疫性
にかかわるTCR配列のセグメントを予測し、そして疾患
からの防護をもたらす免疫応答の適切な標的となる、TC
R構造内のひとつまたは複数の部位を決定することに基
づいている。

本発明の一つの態様は、免疫関連疾患に関連したマー
カーTCRである、TCRのアミノ酸配列からなる約15−30の
アミノ酸を有するペプチドである。該ペプチドまたはそ
の機能的な誘導体は、疾患からの防護を誘導できる。

本発明の他の態様は、上記ペプチドに関して、該ペプ
チドの配列は、TCRのＶ遺伝子またはＶ遺伝子の特定の
部分、例えばVDJ領域、CDR2のようなTCRの補体決定領域
（CDR）の少なくとも一部、または高頻度可変領域の少
なくとも一部によりコードされている。本発明は、ペプ
チドの免疫性を高めるためにキャリアー、例えば付加的
な不均一なアミノ酸に該ペプチドを結合することも含
む。

本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤と混合した、該
ペプチドまたは機能的な誘導体からなる薬学的組成物に
も関する。

即ち、本発明は、化学的に規定されたペプチドおよび
治療剤を提供し、それらを指示された免疫関連疾患に特
異的に応用することにより、疾患の進行を誘導または促
進するのに必要な特定の免疫応答を破壊できる。

本発明が特に有用な疾患は、自己免疫疾患、例えば慢
性間接リューマチ、アジュバント関節炎、重症筋無力
症、脳脊髄炎、多発性硬化症、甲状腺炎、糖尿病、炎症
性腸疾患および全身性エリテマトーデスを含む。本発明
は、悪性疾患、例えばＴ細胞白血病およびTCRが腫瘍マ
ーカーとして作用するリンパ腫にも関する。

本発明は、上記TCRペプチド、それらの機能的な誘導
体、またはペプチドからなる薬学的組成物のひとつを投
与することからなる、免疫関連疾患の予防法、抑制法、
または治療法を提供する。

本発明の一つの態様は、 （ａ）疾患にかかりやすい被験者からＴ細胞を切除し、 （ｂ）自己免疫調製物の存在下において培養液でＴ細胞
を増殖させ、そして （ｃ）TCRのアミノ酸配列からペプチドを選択する ことからなる、免疫関連疾患マーカーであるＴ細胞リセ
プターのアミノ酸配列を有するペプチドを選択する方法
に関する。TCRのＶ遺伝子は、TCR特異的な抗体の使用ま
たはTCRアミノ酸配列を決定することにより同定され
る。

本発明はさらに、 （ａ）上述のようにペプチドを選択し、そして （ｂ）化学的にまたは組換え法によりペプチドを合成す
る ことからなる、免疫関連疾患に関連したTCRのアミノ酸
配列を有するペプチドの調製法に関する。

本発明の他の態様は、免疫関連疾患から被験者を防護
することのできるTCRペプチドに特異的なポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体、またはキメラ抗体に関す
る。また本発明は、ライシンＡ鎖のようなリボソーム阻
害蛋白質を含む、細胞毒性剤に結合した抗体を包含す
る。

本発明は、上記抗体調製物の一つを用いた受動的免疫
による、自己免疫疾患の予防法、抑制法、または治療法
に関する。

さらなる態様により、 （ａ）疾患にかかりやすい被験者からＴ細胞を切除し、 （ｂ）TCRペプチドのようなTCR産生物質の存在下におい
て培養液で段階（ａ）のＴ細胞を増殖させ、そして （ｃ）増殖し培養したＴ細胞から防護Ｔ細胞を調製する ことからなる、自己免疫疾患を予防、抑制、または治療
できる防護Ｔ細胞、およびそのようなＴ細胞の調製法を
提供する。

図面の簡単な説明 図１ 抗体の反応性のペプチド特異的な阻害。単一の
TCRV_β８（39−59）ペプチドまたはTCRペプチドとGP−S
49S MBP由来の自己抗原の混合物により免疫された４頭
のラットからの抗血清を保存し、そして40倍−360倍に
希釈した。該抗血清はマイクロプレートウエルに結合し
た25ngのペプチドを用いて直接ELISAにより反応性を試
験した。このペプチドの量は10pMのTCRV_β８（39−59）
（分子量2390ドルトン）または15pMのGP−S49S（分子量
1630ドルトン）に相当する。阻害剤ペプチドの濃度の変
更は、0.005μｇ−50μg/ウエルの範囲で行われた。吸
収の測定は３つのウエルで測定され、阻害されなかった
対照のウエルの％として計算された。

図２ TCRV_β８（39−59）ペプチド染色Ｖ_β8⁺脳炎誘
発性Ｔ細胞に対する抗体。正常な胸腺細胞（Ａおよび
Ｃ）またはGP−S49S特異的Ｔライン細胞（ＢおよびＤ）
をTCRV_β８（39−59）に対するウサギ抗体とインキュベ
ートし、ウサギIgG促進抗体および蛍光標識ヒツジ抗マ
ウスIgG抗体とインキュベートした。コルターエピック
ス（Coulter Epics）Ｃサイトフルオログラフを用い
て、フローサイトメーターによる染色分析を実施した。
ＡおよびＣは、蛍光彩度に対する細胞の大きさを示す、
10,000細胞のドットプロットを表す。ＢおよびＤは、対
応するヒストグラムを表す。抗TCRV_β８（39−59）抗体
で染色したＴライン細胞の蛍光彩度（90％以上が染色し
た）はこの抗体により染色した正常な胸腺細胞の５％に
比較して増加している。胸腺細胞と、抗TCRV_β８（39−
59）IgGの対照として正常なウサギIgGとインキュベート
したＴライン細胞の両者は、バックグラウンドレベルの
染色を示した（ボックスＤの点線）。

図３ 50μｇのTCRV_β８−39−59ペプチド/CFAを用い
た、EAEの予防、抑制、および治療。50μｇのGP−MBP/C
FAを導入する40日前、同時、または疾患の発症から12日
後にラットをTCRペプチドで皮下注射した。

図４ 50μｇのGP−MBP/CFAを用いた、EAEの導入と同
時、または７日後、または11日後の耳の皮内への50μｇ
のTCRV_β８−39−59ペプチドを用いたEAEの抑制。

図５ 50μｇのGP−MBP/CFAを用いた、EAEの導入後の
臨床的発症時（12日）の耳の皮内への10μｇまたは50μ
ｇのTCRV_β８−39−59ペプチドを用いたEAEの抑制。

図６ MS患者および正常人からのヒトMPB特異的Ｔ細
胞ラインのペプチド特異性。

図７ 各ペプチドに応答した総クローンのパーセンテ
ージと比較した、各ペプチドによるＴ細胞ラインの総増
殖応答のパーセンテージ。

図８ EAEで回復したラットおよびTCRペプチドで免疫
されたラットからのTCRV_β８およびＶ_β14ペプチドに対
する細胞の応答。DTHはmm/100、増殖はCPM/1000であ
り、両者のバックグラウンドをひいた。

図９ EAEをTCRV_β17ペプチドに置き換えた場合の治
療。

好ましい態様の説明 以下の説明において、免疫学、細胞生物学、および分
子生物学の当業者には既知の、さまざまな方法の引例が
記載されている。公表物および他の資料は引用により本
明細書の一部をなす。

本発明の組成物、方法、および生産物はヒトおよび家
畜への使用に応用できる。

本発明のペプチドは、免疫性の約15−30アミノ酸から
なり、目標物に注射したとき免疫応答を誘導できる。

機能的な誘導体とは、ペプチドの断片、変異体、類似
体、または化学的な誘導体を意味し、この言葉は以下に
おいて規定される。

本発明のペプチドからなるアミノ酸配列は、単独で、
または長いペプチドに結合するか、または長いペプチド
の配列に含ませて使用できることが理解される。より長
いペプチドは興味あるTCRに由来する付加配列を含み、
そして関連しないペプチドの配列、例えばTCRオリゴペ
プチドの免疫性を高めるために使用されるキャリアー蛋
白質を含む。そのようなキャリアーはその分野において
はよく知られ、非相同性蛋白質、例えばキーホールリン
ペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン、破
傷風毒素および類似物を含む。また本発明の目的に含ま
れるものとして、抗体に結合したペプチド、および毒素
に結合したペプチドが含まれる。本発明の毒素は、リボ
ソーム阻害蛋白質、例えばライシンＡ鎖まはたシュード
モナス（Pseudomonas）毒素を含む。

ここで使用されているマーカーTCRという言葉は、特
定の免疫関連疾患、例えば自己免疫疾患または悪性疾患
（即ち、癌）に特有なTCRを意味する。

ここで使用されている免疫関連疾患という言葉は、免
疫系が該疾患の病原に含まれ、また免疫系の適切な刺激
が疾患からの防護をもたらしうる疾患を意味する。本発
明のための免疫関連疾患の好ましい態様は、自己免疫疾
患である。本発明により意図される自己免疫疾患の限定
されない例は、慢性間接リューマチ（RA）、重症筋無力
症（MG）、多発性硬化症（MS）、全身性エリスマトーデ
ス（SLE）、自己免疫甲状腺炎（ハシモト甲状腺炎）、
グレイブス病（Graves′disease）、炎症性腸疾患、自
己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎および特定の種類
の糖尿病である。

即ち、MSのためのマーカーTCRは、自己のMHCとMBP断
片の間の複合体（またはMBP断片単独）に結合できるTCR
であり、MBP断片はこの疾患の主要な自己抗原に特徴的
である。他の自己免疫疾患において、他のTCRはMHC分子
間の複合体およびこれらの疾患に含まれる自己抗原に特
異的なので、マーカーとして作用する。例えば、重症筋
無力症（MG）における自己抗原はニコチン様アセチルコ
リンリセプター（AChR）である。したがって、自己のMH
Cの内容物として（あるいは単独で）AChRに結合し、そ
して該疾患に媒介するAChR反応性Ｔ細胞により発現され
る、同定可能なTCRは、MGのためのマーカーTCRである。
当業者には、マーカーTCRの決定、および免疫ペプチド
の決定は、本発明の教示が完全に認識されれば、この分
野においてよく知られたスクリーニング法を用いて日常
的な技術の練習により達成される。

ここで使用されている自己免疫疾患としても意図され
ているのは、悪性疾患であり、腫瘍細胞は腫瘍マーカ
ー、例えば腫瘍抗原を含み、免疫系により認識および応
答されうる。TCRはＴ細胞白血病またはＴ細胞リンパ腫
に対する腫瘍マーカーとして作用する。

免疫関連疾患の目標とされ、該疾患に悩まされ、また
敏感である場合、マーカーTCRの一部分のアミノ酸配列
を含むペプチドの導入により、TCRに対する免疫応答お
よび自己免疫疾患からの防護がもたらされる。

ここで使用されている疾患からの防護という単語は、
疾患の予防、抑制または治療を意図する。予防は、疾患
の誘導前の防護組成物の投与を含む。即ち、例えば動物
モデルにおいてEAEは、疾患を誘導する脳炎誘発性物質
の注射前に防護組成物を連続投与することにより、疾患
の予防がもたらされる。

抑制は、誘導の出来事の後、しかし疾患の臨床的な出
現の前の組成物の投与を含む。さらに、EAE試料を使用
することにより、脳炎誘発性物質の注射後、しかし神経
学的症状の出現する前の防護組成物の連続投与は、疾患
の抑制を意味する。

治療は、疾患の出現後の防護組成物の投与を含む。EA
E試料において、脳炎誘発性物質の注射後、および臨床
的な症状が出現した後の防護組成物の連続投与は、疾患
の治療を意味する。

最終的な誘導の出来事が不明で、潜伏しているか、ま
たは出来事の発生後患者がよくなるまで患者を認識しな
いので、ヒトの薬剤においては予防と抑制の区別がいつ
もされ得ないことが理解される。したがって、治療とは
異なる予防（prophylaxis）という単語を使用すること
により、ここで規定されている予防と抑制の両方が包含
されることは通常のことである。ここで使用されている
防護という単語は、予防（prophylaxis）を含む意味で
ある。

自己免疫疾患に関する本発明の態様のためには、患者
の免疫応答は自己免疫過程を媒介するＴ細胞をマークす
る特定のTCRsに向けられ、したがって本発明のペプチド
は自己免疫応答を開始または進行させるために必要なMH
C/抗原複合体（または抗原単独）の結合を阻害すること
ができる。

一般に、このペプチド配列はTCR自身の一部であり，
そして好ましくはTCRの抗体または他のＴ細胞に露出さ
れる細胞外の部分に相当し、そしてTCRを有するＴ細胞
の活性に生物学的重要性を有する部分である。本発明の
目的のために、ペプチドは下記するとおり免疫原性でな
くてはならない。

本発明のペプチドはTCRのＶ領域の一部に相当するも
のを包含する。より好ましくは、本発明のペプチドは、
TCRβ鎖のVDJ領域のセグメントまたはTCRα鎖のVJ領域
のセグメントに相当する。好ましい態様において、本発
明のペプチドは、第二のCDR（CDR2）のような、TCRヘテ
ロダイマーの三つの補体決定領域（CDR）の一つの少な
くとも一部分に相当する。本発明の範囲にはまた、TCR
γ及びTCRδ鎖、それらのＶ領域、及びγδヘテロダイ
マー中のCDR構造またはその類縁体（ストロミンガー（S
trominger）,J.L.,Cell 57:895−898（1989）；及びク
レバーズ（Clevers）,H.ら,Ann.Rev.Immunol.,6:629−6
62（1988）を参照）の一部分に相当するペプチドも包含
される。

TCRのCDRsは、免疫グロブリン分子の構造に対する類
似性で定義され、ここで、CDRsは抗原と接触しそして抗
原結合部位の必須部分を形成した重鎖もしくは軽鎖可変
領域のアミノ酸配列を含んだ。三つのTCR CDRsの全ては
抗原及びMHCへの結合に関与すると信じられる（デイビ
ス（Davis）,M.M.ら,Nature,334:395−402（1988）；ク
ラベリエ（Claverie）,J.M.ら,Immun.Today,10:10−14
（1989））。「マクロファージTCR」のCDRsの一つに対
する本発明の防御抗体または防御TCRは、患者の免疫応
答を支配することにより、自己免疫関連Ｔ細胞および自
己抗原および／またはMHCの間の必要な結合もしくは認
識現象の阻止の可能性が増加する。

本発明のペプチドの「断片（フラグメント）」とは、
もとより短いペプチドである任意の分子のサブセットを
意味する。

本発明のペプチドの「変異体（バリアント）」は、該
ペプチドの全体もしくはそのフラグメントと実質的に同
様の分子を意味する。変異体ペプチドは、この技術分野
で周知の方法を用いて、直接化学合成で都合よく調製す
ることも可能である。

別法として、本発明のペプチドのアミノ酸配列変異体
はペプチドをコードするDNAの変異により調製すること
も可能である。そのような変異体は例えばアミノ酸配列
内の残基の削除、挿入または置換を包含する。最終構築
物が所望の活性を有するかぎり、そのような最終構築物
に到達するために、削除、挿入及び置換の任意の組み合
わせを使用することもできる。当然ながら、変異体ペプ
チドをコードするDNA中に作製される変異は、リーディ
ングフレームを変更してはならず、そして好ましくは二
次的mRNA構造を生じる可能性のある相補領域を出現させ
るものであってはならない（ヨーロッパ特許出願公開EP
75,444を参照）。

遺伝子レベルにおいて、これらの変異体は通常は該ペ
プチド分子をコードするDNAのヌクレオチドの部位特異
的突然変異により、変異体をコードするDNAを製造し、
その後組換え細胞培養によりこのDNAを発現させること
により製造される。変異体は典型的には非変異体ペプチ
ドと同質の生物活性を発揮する。

本発明のペプチド変異体の調製は、TCR蛋白質もしく
はペプチドの先に調製された変異体または非変異体をコ
ードするDNAを好ましくは部位特異的突然変異させて行
う。部位特異的突然変異は、所望変異のDNA配列をコー
ドする特異的オリゴヌクレオチド配列および十分な数の
隣接ヌクレオチドを使用して、通過すべき削除の接続点
の両側に安定な二本鎖を形成するのに十分な寸法および
配列複雑性を持つプライマーを供給することにより、ペ
プチド変異体の製造を可能にする。部位特異的突然変異
の技術はこの分野で周知であり、例えばアデルマン（Ad
elman）ら,DNA,2:183（1983）に記載されている。部位
特異的突然変異に使用できる典型的ベクターはM13ファ
ージのように、例えばメッシング（Messing）ら，「Thi
rd Cleveland Symposium on Macromolecules and Recom
binant DNA」，ウォルトン（Walton）,A.編集，エルシ
ーバー，アムステルダム（1981）に記載されているもの
である。これらのファージは市販品として容易に入手で
き、その使用は当業者に一般に知られている。別法とし
て、一本鎖ファージの複製開始点（ベイラ（Veira）ら,
Meth.Enzymol.153:3（1987））を含むペラスミドベクタ
ーを使用して一本鎖DNAを得ることも出来る。

一般に、その場合の部位特異的突然変異は、対象ペプ
チドをコードするDNA配列を配列中に含む一本鎖ベクタ
ーを最初に得ることにより行われる。所望の変異配列を
有するオリゴヌクレオチドプライマーを、一般に合成法
（例えば、クレア（Crea）ら,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,
75:5765（1978）の方法）で調製する。このプライマー
を次に前記一本鎖蛋白質配列含有ベクターとアニールさ
せ、そしてE.coliのポリメラーゼＩクレノウフラグメン
トのようなDNAポリメラーゼ酵素を作用させ、変異を含
む鎖の合成を完成させる。こうして、変異した配列及び
第二鎖は所望の変異を含む。次にこのヘテロ二本鎖ベク
ターを用いて適当な細胞を形質転換し、そして変異配列
アレンジメントを持った組換えベクターを含むクローン
を選択する。変異蛋白質領域を取り出して適当なベクタ
ー（一般には適当な宿主を形質転換するために採用でき
るタイプの発現ベクターである）に挿入して、蛋白質を
生産させることができる。

末端挿入（ターミナル インサーション）の例は、シ
グナル配列（宿主細胞に対して異種性でも同種性でもよ
い）をペプチド分子のＮ末端へ融合させ、組換え宿主か
ら成熟ペプチド分子を分泌させることを含む。

他のグループの変異体はペプチド分子内の少なくとも
一つのアミノ酸残基、好ましくは唯一つのアミノ酸残
基、が除去されて異なる残基がその代わりに挿入された
ものである。そのような置換物は、ペプチド分子の特性
を微妙に変化させることが望ましいときに、好ましくは
次のリストにしたがって行われる。

上記リストよりも保存性の小さい置換を選択すること
により、即ち、（ａ）例えばシート構造またはヘリック
ス構造のような置換の領域におけるペプチド骨格の構
造、（ｂ）標的部位における分子の荷電または疎水性、
または（ｃ）側鎖の大きさ、を維持することにやや有意
な影響を及ぼす残基を選択することにより、機能的また
は免疫学的特性における実質的変化を与えることもでき
る。そのような置換は一般に次のような場合に期待され
る：（ａ）グリシンおよび／またはプロリンが他のアミ
ノ酸に置換されまたは欠失または挿入されているもの；
（ｂ）親水性残基，例えばセリルもしくはトレオニル
が、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェ
ニルアラニル、バリル、またはアラニルを置換し（また
はこれらで置換されている）もの；（ｃ）システイン残
基が他の任意の残基を置換し（またはこれらで置換され
ている）もの；（ｄ）電気陽性側鎖を持つ残基、例えば
リジル、アルギニルまたはヒスチジルが電気陰性を帯び
た残基、例えばグルタミルまたはアスパルチルを置換し
（またはこれらで置換されている）もの；または（ｅ）
嵩張る側鎖を持つ残基、例えばフェニルアラニンが、そ
のような側鎖を有しない残基、例えばグリシンを置換し
（またはそれで置換されている）もの。

多くの削除及び挿入及び特に置換はペプチド分子の特
性の劇的変化を生じないと予想される。しかしながら、
置換、削除または挿入の正確な影響を事前に予測するの
が困難な場合でも、そのような影響は日常的スクリーニ
ングアッセイにより評価できることは当業者に知られて
いる。例えば、典型的にはペプチド分子をコードする核
酸の部位特異的突然変異、該変異核酸の組換え細胞培養
による発現、及び場合により該細胞培養からの精製例え
ば抗−ペプチド抗体カラム（少なくとも一つのエピトー
プで変異体を結合されるためのカラム）への免疫吸着、
により変異体を作製する。

細胞溶解物又は精製ペプチド変異体の活性を次に適当
なスクリーニングアッセイ法で所望の特性についてスク
ーリニングする。例えば、抗体への結合性のようなペプ
チド分子の免疫的特徴の変化は競合型イムノアッセイで
測定される。変異体ペプチドのＴ細胞認識の変化は、in
vivo DRアッセイまたはin vitro T細胞分化アッセイで
測定される。酸化還元又は温度安定性、疎水性、タンパ
ク質溶解分解性又は担体やマルチマ−中での凝集傾向に
対する感受性のようなペプチドの性質の修飾は、当業者
に通常よく知られた方法で測定される。

ペプチドの“類似体”とは、非−天然分子であり、実
質的にその全分子またはその断片と同じものをいう。

本発明のペプチドの“化学誘導体”とは、通常はペプ
チドの１部分ではない、付加的な化学部分を含む。ペプ
チドの共有修飾もこの観点に包含される。この修飾は、
ペプチドの標的アミノ酸残基を、有機的誘導化試薬であ
って選択された側鎖又は末端残基と反応できる試薬と反
応させて分子を導入し得る。

シルテイン残基は最も普通に、例えばクロル酢酸また
はクロルアセトアミドのようなα−ハロアセテイト（お
よび対応するアミン）と反応しカルボキシメチル又はカ
ルボキシアミドメチル誘導体を与える。シルテイン残基
はまた、ブロモトリフルオロアセトン、＊−ブロモ−＊
−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロルア
セチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピ
リジル ジスルフィド、メチル ２−ピリジル ジスル
フィド、ｐ−クロル水銀ベンゾエート、２−クロル水銀
−４−ニトロフェノール、またはクロル−７−ニトロベ
ンゾ−２−オキサ−1,3−ジアゾールと反応させること
により、誘導化される。

ヒスチジン残基は、ジエチルプロカルボン酸とpH5.5
−7.0で反応させて誘導化される、なぜならこの試薬は
ヒスチジン側鎖にやや特異性があるからである。パラブ
ロモフェナシルブロミドも有効である；この反応は、0.
1Mのカゴジル酸ナトリウム、pH6.0中で行われる。

リジン残基及びアミノ末端基は、無水琥珀酸又は他の
無水カルボン酸と反応させる。これらの試薬での誘導化
はリジン残基の荷電を逆にする。α−アミノ−含有残基
を誘導化するその他の適当な試薬は、メチルピコリンイ
ミデートのようなイミドエステル；ピリドキサールリン
酸；ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニ
トロベンゼンスルホン酸;0−メチリスウレア;2,4ペンタ
ンジオン；及びグリオキシル酸によるトランスアミナー
ゼ−触媒反応がある。

アルギニン残基は、ひとつ又は数種の通常試薬と反応
させることにより修飾され、それらのなかにはフェニル
グリオキサール、2,3−ブタンジオン,1,2−シクロヘキ
サンジオン、及びニンヒドリンがある。アルギニン残基
の誘導化には反応が塩基性条件下で行われることが要求
される、なぜならグアニジン官能基の高pKa値によるも
のである。さらにこれらの試薬は、リジン基と同様にア
ルギニンのイプシロンアミノ基とも反応し得る。

チロシン残基自体の特異的修飾は、とくに芳香族ジア
ゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させて
チロシン残基に分光標識を導入するという特別な目的で
広く研究されてきた。最も普通には、Ｎ−アセチルイミ
ジゾールまたはテトラニトロメタンを使用して０−アセ
チルチロシン種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ生成
する。イムノアッセイ用標識タンパク質を調製するため
に、クロラミンＴ法が適当であるが、チロシン残基を
¹²⁵Iまたは¹³⁵Iを使用してヨウド化する。

カルボキシル側鎖基（アスパラギンのまたはグルタミ
ンの）は、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モル
ホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エ
チル−３−（４−アゾニア４、４−ジメチルペンチル）
カルボジイミドのようなカルボジイミド（Ｒ′−Ｎ−Ｃ
−Ｎ−Ｒ′）と反応させて選択的に修飾される。さらに
アスパラギン酸またはグルタミン酸残基は、アンモニウ
ムイオンと反応させてアスパラギンまたはグルタミン残
基に転換される。

アルパラギンまたはグルタミン残基はしばしば脱アミ
ノ化され対応するアスパラギン酸またはグルタミン酸残
基となる。別の方法では、これらの残基は緩和な酸性条
件下で脱アミノ化される。これらの残基のいずれの形も
本発明の観点に包含される。

二官能試薬を使用する誘導化は、ペプチドを水不溶性
支持体または他の大分子担体と架橋するのに有用であ
る。通常使用される架橋試薬は、例えば1,1−ビス（ジ
アゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデ
ヒド、Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸エステルを含み、例えば４
−アジドサリチル酸、3,3′−ジチオビス（サクシンイ
ミジルプロピオン酸）のようなジサクシイミジルエステ
ルを含有するホモ二官能性イミドエステルのようなエス
テル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１、８−オクタン
のような二官能性マレイミドを含む。メチル−３−
［（ｐ−アジドファニル）ジチオ］プロピオイミデート
のような誘導化試薬は、光の存在下で架橋を形成する光
活性中間体を産する。別の方法として、臭化シアン−活
性化炭水化物のような水不溶性活性体および米国特許第
３、969、287;3,691,016;4,195,128;4,247,642;4,299,5
37;および4,330,440号に記載された活性担体がタンパク
質の固定化に使用される。

その他の修飾には、プロリン及びリジンの水酸化、セ
リンまたはトレオニン残基の水酸基のリン酸化、リジ
ン、アルギニンおよびヒスチジン残基のε−アミノ基の
メチル化（T.E.Creigton,Proteins: Structure and Mol
ecule Propaties,W.H.Freeman＆Co.,San Francisco,pp,
79−86（1983））,N−末端アミンのアセチル化、および
例えばＣ−末端カルボキシル基のアミノ化がある。

このような誘導化部分は、ペプチドの溶解性、吸収
性、生物的半減期等を改善するであろう。この部分は別
に所望でないペプチドの副作用等を除く又は弱めるであ
ろう。このような効果を調整できる部分について例え
ば、Reington's Pharmaceutical Science,第16版.,マッ
ク出版社.,イーストン、PA（1980）に開示されている。

悪性疾病 また本発明の方法の可能性は、リンパ腫および白血病
である。リンパ腫および多くの白血病は、リンパ細胞が
非−制御下で分化することによって作られる腫瘍（例え
ば悪性腫瘍）である。数種類のリンパ腫および白血病は
単一の悪性Ｔ細胞前駆体由来のＴ細胞から構成され、す
べての腫瘍細胞が同じTCRを有し、これは本発明の保護
組成物の標的である“腫瘍マーカー”を提供する。同様
に表面免疫グロブリンは、Ｂ細胞白血病またはリンパ腫
の腫瘍マーカーを提供できる。

本発明の態様のひとつは、腫瘍マーカー自体ではなく
“腫瘍マーカー”に反応してこれらのＴ細胞のTCRを標
的にして抗−腫瘍応答を増強することである。このよう
に、腫瘍−特異的Ｔ細胞上のTCRに対する免疫応答が、
宿主への利点のための抗−腫瘍応答をさらに制御するた
めに利用できる。

事実、細胞を同じ組織学的タイプの他の細胞から、ま
たは異なる組織学的タイプの細胞から区別する表面分子
を有する細胞が関与する任意の疾病は、特徴的な“マー
カー”を有すると思われ、そのマーカーに対する応答を
誘導する組成物による治療が可能であり、これによって
“マーカー”を有する細胞の活性を変化させ得るであろ
う。

本発明によれば、マーカー分子自体は比較的非免疫性
である；これは最低、抗原エピトープとしての特徴が要
求される。このエピトープ自体は、個々に免疫源性であ
るか、または免疫性の担体分子との結合などにより、当
業者に既知の方法で免疫源とできる。このようにマーカ
ータンパク質のエピトープは遊離ペプチド又は免疫源化
された形態として、抗体反応、細胞−調節免疫応答、又
はその両方を本発明の意図するところとして顕在化する
ことができる。それゆえに、マーカータンパク質全体だ
けでなく、むしろ免疫源性又は抗原性である特異的なペ
プチド領域を内包する組成物は、このマーカーによって
特徴づけられる免疫−関連疾病を治療するための有用な
調製物を包含するであろう。

マーカーTCR−保有Ｔ細胞の同定 本発明は、例えばTCR V遺伝子ファミリーの特徴であ
るCDR2のようなリガンド/MHC結合において生物的重要性
を有するTCRの領域を表す合成ペプチドを利用する。本
発明は、それゆえにTCR V 領域特異的抗体またはＴ細胞
を獲得するためのより簡単な方法を提供する。TCR V 領
域特異的抗体または細胞の領域を誘導するために、同じ
＊鎖の他の配列を使用するこのような技術は、TCRの表
面にあるエピトープを位置づけ、これらの領域がリガン
ド/MHC結合において重要であることを日常の研究で確立
できるであろう。

上述した疾病に付随するマーカーTCRは周知技術で同
定される。、Oksenberg、J.R.,らによってMGまたはMsを
有すると知られた患者を使用した遺伝的研究はProc.Nat
l.Acad.Sci.USA 86:988−992（1989）に記載された。Se
boun,E.,らによりCell 87:1095−1100（1989）;Burns,
F.R.,らによりJ.Exp.Med.169:27−39（1989）に記載さ
れるように正しいTCR鎖の配列は、特異的自己免疫疾患
の罹患を有する家系に見いだされる制限酵素断片長の分
析の多型を使用した染色体分析により得られた。

つまり本発明の目的、自己免疫症を併発するマーカー
TCRの決定、および免疫性配列から成るペプチドの同定
には、自己抗原が特徴づけられる必要がないと理解され
るであろう。（ａ）自己免疫疾患は、Ｔ細胞−調節免疫
応答が病原過程に必要な部分としての関与する、及び
（ｂ）この疾病は器官−、組織−又は細胞−特異的標的
である、ことで十分である。事実当業者に知られるよう
に（例えばTheofilopoulos A.,同上を参照）、不活性な
状態では自己抗原は自己免疫に全く関与しないであろう
し、むしろ、バクテリアやウイルスなどの自家抗原と交
差反応性の対外抗原に応答するか、又は宿主に存在する
体外抗原と直接免疫病原反応を引き起こすであろう。

自己抗原又は抗原（例えば特定のウイルス又はバクテ
リアの抗原）に付随する自己免疫症を認識するＴ細胞
は、クローン化され、長期Ｔ細胞のようなＴ細胞リンパ
腫系またはＴ細胞ハイブリドーマのような不滅化細胞と
融合され、カルチャー中で成長させ得る。培養した細胞
は、正しいTCRをコードするcDNA原として供給される。
このようなcDNAは当業者に既知の方法でクローン化さ
れ、発現される（例えば、Maniatis,T.,らのMoleculer
A Cloning:Laboratory Manual（1982）を参照）。上述
した方法に加えて、自己免疫症に伴うTCR可変領域位置
を同定するために、動物モデルを使用することは有利で
あると思われる。任意の多くの自己免疫症可能性がある
動物は、限定的にではなく、EAE,実験的MG,実験的自己
免疫甲状腺炎、アジュバント関節炎、コラーゲン−誘導
関節炎等があり、in vitroで同定された疾病に伴う特定
のTCR可変領域位置を有する。

“罹患の可能性”とは、動物が疾病を伴うと知られて
いる遺伝子又は遺伝子群を有する動物における状態を言
い、これによって一般の集合と比較して、この遺伝子ま
たは遺伝子群を有する個体に発病する危険が増加する。
自己免疫症を伴うと知られた遺伝子は、例えばMHC遺伝
子（特にクラスII）、免疫グロブリンＶ遺伝子,TCR V遺
伝子等がある。“可能性がある”という用語は、これら
の個体が現実に疾病を有することも包含する。本発明の
成功裏の実験荷物電自己免疫症と特定のTCRの使用との
間の完全な相互関係は期待されず、また必要ではない
が、約60−70％の高い相互関係が特定の可変領域遺伝子
の存在または発現、ならびに動物における自己免疫症中
の可能性にみいだされた。

本発明の他の態様において、自己免疫の可能性のある
ヒトおよび自己免疫症に罹患している特定の可能性のあ
る個体から単離したＴ細胞をカルチャー中で増殖させ
た。Ｔ細胞の増殖法に関してはZamivilらのNature 317:
355−358（1985）及びNature 324:258−260（1986）に
記載されている。

本方法で採用するひとつの態様は、患者末梢血液リン
パ球を分離し、自己抗原又はそれに由来する、または関
連する、自己抗原に匹敵する刺激が可能な特異的ペプチ
ドで刺激する。自己抗原（又は関連ペプチド）をリンパ
球カルチャーに数日間加える。ひとつの態様としては、
細胞を自己抗原で５−６日間刺激する。他の態様では、
細胞をより長時間刺激する。刺激に必要な時間は、血液
試料中の活性型細胞数の関数であり、これらの細胞の活
性状態ならびに刺激化調製物の有効性は当業者であれば
容易に測定できる。このような選択的な条件で培養した
後、約５×10⁵の生存細胞を単離し、約３×10⁷の自己由
来の抗原存在細胞（分化を妨げるために、2500−4500ra
drで照射された）を約20μg/mlの自己抗原（または関連
ペプチド）で再刺激する。約７週間後、生存細胞を回収
し、例えば約５×10⁵の抗原存在細胞のような10³−10⁶
の抗原存在細胞およびヒトIL−２又は粗又は精製リンパ
球成長因子（例えばIL−４）との混合物で限定希釈によ
ってクローン化する。このようなＴ細胞系のＴ細胞を、
組織培養フラスコ中で約１から２週間増殖成長させる。
この系は、抗原存在細胞、自己抗原調製物およびIL−２
で複数回再刺激される。再刺激は典型的には週１回行わ
れる。所望により、このようなＴ細胞は、いかなる種類
の任意の公知技術によってもクローン化され、例えば一
般的に再刺激から約２日後に、限定希釈法またはコロニ
ーから細胞を取り、柔らかい寒天で成長させる。

他の態様では、器官又は体液から得たリンパ球をまず
初めにIL−２存在下で培養する。これらの条件下では、
選択的に活性化された細胞について選択が行われ、その
細胞のみが成長する。引き続きその細胞が抗原存在細胞
及び自己抗原で刺激される。この方法でラット脊髄由来
のMBP−特異的Ｔ細胞とEAEをin vitroで選択的に増幅で
きる。

本発明できた使用されているような“自己抗原”とい
う用語は、巨大分子に定義を限定することを意図せずま
たは既知ものに限定することを意図しない。例えば、タ
イプＩ糖尿病の場合は、膵臓島（またはベータ）細胞に
付随する特定の抗原で、Ｔ細胞調節自己免疫応答の誘因
又は標的抗原は知られていない。本発明の、上述したよ
うに細胞をin vitroで刺激するために使用する自己抗原
は、全膵臓島細胞から成り、このような細胞からの粗膜
（メンブラン）調製物で、部分精製精製膜成分、すなわ
ち同定すれば、糖尿病源性自己抗原である。その他の自
己免疫症についても、唯一の自己抗原が未だ同定されて
いないことは同様に事実であり、ハシモトの甲状腺炎、
自己抗原がコラーゲンではない関節炎、ショーグレン症
（Sjogren disease），多発性筋炎等がある。技術の一
つは、Ｔ細胞が応答する免疫源性部分が刺激調製物に存
在するかぎり、本発明の上記方法は達成できると思われ
る。

クローン化した、増幅したＴ細胞集合中の自己抗原−
特異的反応性Ｔ細胞の存在は、その細胞が自己抗原の存
在により活性化される能力を試験することにより容易に
測定できる。多くのアッセイが可能であり、当業者に知
られ、Ｔ細胞活性化過程の初期及び後期の出来事を測定
する。このような方法の例として、限定的ではないが、
Ｔ細胞分化（これは放射標識チミジンの取り込みで測定
できる）、インターロイキン−２の分泌、細胞内カルシ
ウム流動化作用、イノシトールリン酸代謝に関与する特
定膜酵素の転移、および細胞表面分子の発現における変
化（フローサイトメトリーで測定できる）がある。

特定の自己抗原に応答するＴ細胞クローンにより発現
したTCRを、ポリクローナル、モノクローナル又はキメ
ラ（下記参照）のいずれかの抗体でTCRT可変部位に特異
的なTCR−特異的抗体を使用して同定でき、蛍光顕微鏡
の技術、フローサイトメトリー、免疫化学または他の公
知技術を採用して表面発現を検出する。このような抗体
は、多くのTCR＊＊鎖Ｖ領域（例えば、Owhashi,M.,ら、
同上:Gascoigne,N.R.J.,ら、同上;Kappler,J.W.,ら198
7、1988（同上）；及びMacDnald,H.R.,同上を参照）に
記載されている。

択一的に、Ｔ細胞クローンのDNAまたはmRNAは直接、
またはポリメラーゼチェーンリアクション法（SynhaらS
cience 239:1026（1988）:SaikiらNature 324:163（198
6））により、種々のTCR系に関する核酸プローブを使用
して特異的ハイブリダイゼーションを公知のハイブリダ
イゼーション法を採用することによりプローブされ得
る。このTCR配列又はその部分を次ぎに増幅した再配列D
NAまたはRNAから直接得ることができる。

特定のTCRの発現は、例えば、TCR V遺伝子のクローニ
ング後にすくなくともTCRの一部分をコードする核酸配
列を決定することにより、またはすくなくともTCRの部
分のアミノ酸配列を決定することにより同定できる。上
述した任意の方法または当業者に既知のさらなる方法で
Ｔ細胞またはクローンまたはＴ細胞系上に発現したTCR
を同定することになるであろう。この情報は本発明のペ
プチド又は医薬組成物を構成するアミノ酸配列の選択に
必要である。

非特異的自己抗原が同定されたところでは、疾病を伴
う解剖学的領域内のＴ細胞のオリゴクローナリティー
（oligoclonality）が反応性Ｔ細胞の強化の基礎として
使用できる。リューマチ関節炎のみをともなう細胞は、
関節の滑液（CSF）に見いだされる;MSのみを伴うばあい
細胞は髄液中に見いだされる；およびハシモトの関節炎
およびGravis疾患であるＴ細胞侵入物甲状腺組織合併で
ある。これらの場合、関連する解剖学的部位からＴ細胞
は単離され、細胞上記のごとく増殖する。（Londei,M.
ら、Science 228:85−89（1985）;Londei,M.ら、Acta E
ndocrinol.115（281増刊）:86−89（1987）;Stamenkovi
c,I.らProc.Natl.Acad,Sci.USA 85:1179−1183（198
8）;Lipoldova,M.らJ,Autoimmun．2:1−13（1989）;Oks
enberg,J.R.,ら同上参照）このような細胞のDNA又はmRN
Aは単離され、cDNAが調製され、種々のTCR位置をコード
するcDNAの配列の差異が、履患者と非履患者との比較に
より確立される。細胞をカルチャー内で増幅させるかわ
りに、細胞性DNA,または好ましくはmRNAから作成したcD
NAを目的物から単離したＴ細胞からえることができ、上
記のPCR反応で核酸を増幅できる。

多くのヒト及び動物モデルの自己免疫症に付随する抗
原が現在知られている。タイプIIコラーゲンおよび微生
物結核症（Microbacterium tuberculosis）65kD心臓シ
ョックタンパク質はリューマチ関節炎に付随する抗原で
ある;AChRはMGに付随し、ならびに実験的アレルギー性
重症筋無力症（EAMG）はマウスで誘導され得る。チログ
ロブリンは、マウスの実験的アレルギー性甲状腺炎（ET
A）に付随する抗原として知られている。同様の疾病で
あるハシモトの甲状腺炎は、甲状腺小胞細胞に関する抗
原の免疫応答が関与する。Gravea症では、免疫応答は甲
状腺細胞上のチロトロピン受容体に対する。ミエリン塩
基性タンパク質（MBP）およびプロテオリピッドタンパ
ク質（PLP）は、マウスおよびラットで実験的アレルギ
ー性 脳脊髄炎（EAE）に付随するとして知られてい
る。EAEはヒトの多くの硬化症のモデルとして認識され
る。

それゆえに、これらの技術は本発明のひとつの観点が
上記の疾病を限定的にではなく含むヒト及び動物の疾病
の予防または治療に有効なペプチド同定に向けられるも
のと理解されるであろう。

抗原性ペプチドの選択 本発明の重要な態様のひとつは、自己免疫に伴うTCR
の同定、疾病過程におけるＴ細胞活動に関しどのTCRの
オリゴペプチド配列が抗原性かつ重要であるか決定する
こと、そのペプチドを合成し、そして治療に使用する方
法を組み合わせることから成る。

関連するTCR配列の領域はそれらが示す抗原性または
免疫的性質に基づき合成のために同定される。“免疫
性”という用語は、ペプチドのＴ細胞仲介、抗体、又は
その両方免疫応答を誘導する能力を意図する。“抗原
性”という用語は、ペプチドが遊離の形で抗体に認識さ
れる能力および抗原−特異的Ｔ細胞の場合は、MHC分子
の。Ｔ細胞に対する免疫性または抗原性であろうタンパ
ク質またはペプチドの領域は、例えばMargalit,H.,らに
より（J.Immunol.138:2213−2229（1987）およびRothba
rd,J.B.らによるEMBO J.7:93−100（1988））に記載さ
れた方法およびアルゴリズムで同定される。Margolit,
H.,らの提案は両親媒性ヘリックスモデルに基づくアル
ゴリズムの発展を導く免疫支配ヘルパーＴ細胞抗原部位
の分析に基づき、ここにおいて抗原性部位は、ひとつの
支配的な極性面とひとつの支配的な非極性面とのヘリッ
クスであると仮定される。Rothbardらの提案では、Ｔヘ
ルパーまたはＴ細胞毒性細胞クローンに選択的に認識さ
れるエピトープに似ているモチーフを認識し、これはMH
CクラスＩおよびII分子により認識され得るタンパク質
配列内の面積を正しく示す事ができ、このような認識は
Ｔ細胞の免疫発生源および抗原性発生源に必要であると
思われる。

TCRペプチド選択のひとつの提案において本発明の目
的に関し（TCRおよび抗体構造に類似の現在の構造モデ
ルに基づく）免疫制御的に重要なTCRの領域はCDR1,CDR2
またはCDR3または例えばＶ部分の39−49残基のような
（Davis,M.M.らによるNature 334:395−402を参照）厳
密なCDR部分では無いTCRの超可変領域中にある。

ラットにおけるEAEの治療に使用するペプチド配列を
選択するための上記提案の使用は、この提案の成功を例
示する。ルイスラット（Lewis rats）EAEのマーカーTCR
のCRD1に対応する16アミノ酸から成るペプチド、V 8（2
5−41）はＴ細胞に対し免疫源性ではないと上記アルゴ
リズムにより予想された。事実このペプチドは、Ｔ細胞
免疫を誘導せず、ルイスラットをEAEから保護しない。E
AEに同伴しない異なるTCRのCDR1に対応するペプチド
は、V 14（25−41）はＴ細胞に免疫的であると予想さ
れ、実際ルイスラットにＴ細胞免疫を誘導するとわかっ
たが予期したとおりEAEから保護しなかった。同様に、C
DR2ペプチド、V 14（39−59）はTCRに対応し、EAEには
同伴しないが、免疫源性であると予想されるが免疫を誘
導し、しかし再度EAEから保護しない。本発明によれ
ば、関係のあるTCRのCDR2−関連ペプチド、V 8（39−5
9）は免疫源性及びEAEにおいて保護的であると予想され
たが、事実そのように実施例にて示された（以下の実施
例参照）。

本発明こ使用する選択されたペプチドの大きさは、主
に免疫発生源の必要性により決定されるが、一方Ｔ細胞
又はペプチドに特異的な抗体がＴ細胞上または中のTCR
を認識し、反応するような最小のエピトープ構造を維持
する。例えば、本発明のペプチドは、十分に免疫源性で
あり、ならびにＴ細胞活性の調節の導くことができるTC
Rの関連エピトープを含む高い可能性を有するように、
約15−30アミノ酸の範囲であるが異なる長さのペプチド
も意図する。本発明の方法によりEAEを治療したラット
のEAEに同伴するTCR鎖上に存在する21アミノ酸の成功裏
の使用を以下の実施例で詳細に示す。

本発明に有用なペプチドの免疫発生源性は動物におけ
るDH応答の使用のようなよく知られた方法によってスク
リーニングできる。このような応答では、適当量の抗原
を典型的には皮下（SC）に、しばしば完全フロンドアジ
ャバント（CFA）のようなアジュバントとともに攻撃し
動物は“感作”される。一般的には約５−15日後、動物
の免疫性は典型的には皮内（ID）に適当な抗原と典型的
に食塩水または他のバッファーとともに投与して試験す
ることによってこの応答が“引き出”される。応答は24
−28時間評価する。非限定的ではないDHを測定するアッ
セイ法は、接種部の紅斑（赤み）および硬結（腫れ）の
大きさ、耳腫れ、支脚皿腫れ、尾腫れ、攻撃部の投与し
た¹²⁵I−標識ヨードデオキシウリジンの全体的な蓄積、
攻撃部のアルブミンのような静脈内投与放射標識血清タ
ンパク質の蓄積並びに攻撃部のリンパ球または好中球の
ようなIV−接種標識刺激性の細胞の蓄積含む。例えば適
当なID攻撃について耳の腫れの応答は耳介の約0.15−0.
25mm、好ましくは0.20mm（ルイスラットで）が陽性DH応
答を表す。当業者は種々の大きさ、投与量,DHの感作お
よび顕在化経路、使用した担体、アジュバント等がDH応
答の時期および程度に影響するであろうと理解するであ
ろう。

免疫源性であると考えられるペプチドに関し、ここで
意図するのは、動物１個体当たり約10−200μｇ、好ま
しくは動物１個体当たり約25−100μｇのペプチドが動
物のDH応答を感作できることである。さらに感作された
動物については、約１−100μｇおよび好ましくは５−5
0μｇのペプチド投与量でID攻撃についてのDH応答を顕
在化できる。

ペプチドの合成およびアッセイ 上述したように配列決定された所望のペプチドは、液
相及び固相連続アミノ酸結合ならびに、原核又は真核宿
主組み替え生産を含む標準的なペプチド合成技術を使用
して調製される。調製したペプチドが免疫源性であると
いう検証は、上記のごとく動物（たとえばマウスまたは
ラット）のDH反応を利用して容易に決定できる。ペプチ
ドは皮下投与され、動物は約９−14日後にID耳介に攻撃
された。耳の腫れの応答は攻撃24−28時間後に測定さ
れ、単純で信頼できるペプチドに対するＴ−細胞−調節
免疫性が提供された。

現実に自己免疫性を調節する免疫源性ペプチドの能力
の検証は、適当な動物モデルをTCR−関連ペプチドにお
ける種差を考慮して達成できるであろう。たとえば、ヒ
トの治療にはヒトマーカーTCRのCDR2を表す配列が好ま
しく使用されるが、動物疾病モデルに関しては、マーカ
ーTCRの対応領域が動物疾病に関し使用される。疾病を
予防または治療するペプチドの有効性をスクリーニング
するために使用できる動物モデルは、上記のごとく入手
可能である。もちろん、同一のペプチドはヒトTCR合併
症の適当部位には対応しないので、またはヒトには十分
に免疫源性ではないからヒトには有効でないであろう。
特定の動物において描かれたペプチド配列の修飾がヒト
を含む他の種の個体の治療のために必要とされると理解
されるであろう。このように、たとえば特定のCDR2−関
連ペプチド配列は特定の疾病の予防に効果的である検証
はこれらのモデルで得られ、対応するヒト配列がヒトの
効果的なペプチド治療として有力候補であるという仮定
を導く。ヒト（又は異なる非−ヒト動物種）での対応TC
R配列の決定、上記提案の使用はこのようにヒト（また
は他の種）での使用に関するペプチドの修飾を可能にす
る。

以下は、TCRペプチドが疾病を修飾し、転移に関し疾
病を修飾できる抗体およびＴ細胞を誘導できると評価さ
れたヒト自己免疫症の動物モデルの非排他的リストであ
る。組織狼瘡紅斑（SLE）は、感受性マウスで試験さ
れ、KnightらによりJ.Exp.Med.147:1653（1978）および
ReinertsenらによりN.Eng.J.Med.299:515（1987）に開
示されている。Lindstrom.J.,らによりAdv.Immunol,42:
233−284（1988）に記載されているようにMGは、SJL/J
メスマウスに他の種由来の水溶性AChrタンパク質を誘導
して試験される。関節炎はマウスの感受性種にタイプII
型コラーゲンをStuart,J.M.,らによるAnn.Rev.Immunol.
2:199−218（1984）に記載されたように接種して誘導さ
れる。アジュバント関節炎は、感受性ラットに微生物熱
ショックタンパク質をVan Eden,W.,らのNature 311:171
−173（1988）に記載されたように接種して誘導され
る。甲状腺炎はマウスにチログロブリンをMaron,R.,ら
によりJ.Exp.Med.152:1115−1120（1980）に記載された
ように投与して誘導される。インシュリン−依存性糖尿
メリテス（mellitus）（IDDM）は自然発生またはKanasa
waらによりDiabetologia 27:113（1984）に記載される
ような特定の種のマウスに誘導できる。他のマウス種は
この疾病をこの種のマウスからのリンパ球を転移して発
現を起こすことができる。

マウスおよびラットにおけるEAEは、ヒトのMSに関し
モデルを提供する。このモデルでは、Paterson,P.Y.,に
よりTextbook of Immunopathology（Misherらにより編
集）、GruneおよびStratton,new York,pp179−213（198
6）;Mcfarlein D.E.,らScience 179:478−480（197
3）；およびSatho,J.,らJ.Immunol.138:179−184（198
7）に記載されているように脱髄症が、ミエリン塩基性
タンパク質（MBP）又はプロテオリピッドタンパク質（P
LP）、もしくはテイラーウイルス（Theiler virus）の
投与で誘導される。

本発明の組成物のヒトにおける予防的、抑制的または
治療的な利点を測るために、特定の臨床結果測定が使用
される。MSにおいては、定量的パラメーターは（ａ）臨
床的無能、（ｂ）検討中の増悪率、および（ｃ）磁気共
鳴画像（MRI）脳プラークロード（load）（これはMS患
者を評価するために重要な最近パラメーターである）を
ふくむ。これらの測定は内科医によって別個になされる
盲試験または非盲試験を含む。認識できる損傷の神経心
理的測定は無能の独立の決定子として使用できる。臨床
的無能は、典型的にはマックアルピンスケール（McAlpi
ne Scale），カーズッケスコアー（Kurtzke Score），
拡大無能状態スコアー（EDSS）として呼ばれるカーズッ
ケスコアーの変法により測定される。EDSSに関しては1/
2単位（1g範囲）の改良で十分であると思われる。ひと
つの臨床的な測定法は、患者の歩行能力がアンブレーシ
ョンインデックス（Ambulation Index）により評価さ
れ、これ１単位以上の改良で十分であると考えられる。
これらの測定は当業者に周知であり、McAlpine,D.,らに
よりMultiple Sclerosis,リビングストン出版、エジン
ハワラ（1955）;Binken,P.J.らによりHandbook of Clin
ical Neurology,Volume 9,アムステルダム−北オランダ
出版、アムステルダム（1970）；およびField,E.J.らMu
tiple Science:A Critical Review,M.M.T.P.出版
（株）、ランカスター、イングランド（1977）に記載さ
れている。

RAにおける改良の測定は、多くの第１治療終点に基づ
き、腫れの分解または減少、朝の硬直時間の短縮、赤血
球沈降速度および／またはＣ−活性タンパク質の減少、
リュウマチ子節のようなリュウマチ−症状の分解及びリ
ンパ球数の減少を含む。第２の終点は、疲れの減少及び
患者および医者により評価されるすべての状況の改善を
含む。臨床的名結果は次ぎのように分類される、（ａ）
完全応答−結合部腫れ、圧痛および朝の硬直の減少が90
％以上、（ｂ）注目応答−結合部腫れ、圧痛および朝の
硬直の減少が50−90％、（ｃ）緩やかな応答−結合部腫
れ、圧痛および朝の硬直の減少が30−50％、（ｄ）応答
なし−結合部腫れ、圧痛および朝の硬直の減少が30％。
当業者に既知の免疫−関連疾病に加えて、同様な測定が
本発明のペプチド、抗体、Ｔ細胞および他の組成物の予
防的、抑制的又は治療的効果の評価を可能とする。

受動免疫性 TCRペプチドの免疫活性化に加えて、本発明のさらな
る態様にはTCRペプチドによって活性化されたＴ細胞お
よび抗−TCR免疫性の受動転移に関しTCRペプチドに特異
的な抗体がある。受動抗体−調節免疫性は、例えば抗体
−依存性細胞性細胞毒性または補体保存性細胞毒性など
というような任意の多くのエフェクター機能を含む。別
の方法としては、抗体は毒性試薬をたとえばリシンＡ鎖
のような特異的な方法で運搬するために使用される。

受動予防接種に関して、目的の動物は適当なペプチド
を以下に記載するように接種され、末梢血リンパ球また
はリンパ節のような他の器官由来のリンパ球が収穫され
る。Ｔ細胞は免疫を直接転移するのに使用できる。別の
方法として、Ｔ細胞をTCRペプチドが選択的刺激物とし
て存在するカルチャー内で、IL−２または当業者に既知
の他のＴ細胞成長因子の補助物とともに培養して増殖さ
せ、Ｔ細胞系またはクローンを維持し、その後免疫性を
転移するために使用する。Ｂ細胞は、TCRペプチド−免
疫動物から得た初期細胞集合から回収できるであろう、
そしてTCRペプチドに関して特異的であるモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマを作成する標準的な技
術を使用して細胞系融合相手と融合して不滅化される。
ハイブリドーマが生産する適当な抗体は、通常のたとえ
ば直接ELISAのようなイムノアッセイでTCRペプチドとの
反応性または関連するＴ細胞との反応性をスクリーニン
グされる。

例えば本発明のTCRペプチドのような特異抗原にたい
するモノクローナル抗体（mAbs）は、当業者に既知の方
法で得られるであろう。例えば、KohlせておよびMilste
inのNature 256:495−497（1975）および米国特許第4,3
76,110を参照の事。このような抗体はIgG,IgM,IgE,IgA,
IgDおよづそれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫
グロブリンクラスである。

別の方法として抗体はTCRペプチドで免疫した動物か
らのポリクローナル高血清を取り、当業者に既知の方法
で引き続き精製して調製でき、抗−TCR免疫性の受動転
移に関し直接使用できる。

ネズミ起源のモノクローナル抗体は、以下に記載され
た幾つかの方法を使用して、ヒト定常領域をコードする
DNAとmAbのＶ領域をコードするcDNA分子を連結して“ヒ
ト化”される。Cabillyら米国特許第4,816,567号（3/28
/89）および欧州特許公告第EP125023号（11/14/84）；
タニグチら欧州特許公告第EP171496号（2/19/86）;Morr
isonら欧州特許公告第EP173494号（3/5/86）;Neuberger
らPCT公告WO08601533（3/13/86）：クドーら欧州特許公
告第EP184187号（6/11/86）;RobinsonらPCT公告WO87026
71（5/7/87）lCabillyらProc,Natl.Acad.Sci.USA 81:32
73−3277（1984）;MorrisonらProc,Natl.Acad.Sci.USA
81:6851−6855（1984）;BoulianneらNature 312:643−6
46（1984）;Morrison Soience,229:1202−1207（198
5）;neubergerらNature 314:268−270（1985）；タケダ
らNature 314:452−454（1985）;TanらJ.Immunol.135:3
564−3567（1985）;JonesらNature 321:522−525（198
6）;OiらBioTechniques 4;214（1986）;SahaganらJ.Imm
unol.137:1066−1074（1986）;SunらHybridoma 5（増
刊）;S17−S19:（1986）:SunらProc.Natl.Acad.Sci.USA
84:214−218（1987）;LuiらProc.Natl.Acad.Sci.USA 8
4;3439−3443（1987）;LuiらJ.Immunol.139:3521−3526
（1987）;Better,M.,らScience 240;1041−1043（５月2
0日1988）およびHorwitz,A.H.らProc.Natl.Acad.Sci.US
A 85:8676−8682（1988）。

キメラ抗体作成の好ましい方法は、５つの要素を組み
合わせる、（１）モノクローナル抗体生産マウスＢ細胞
由来RNA（mRNA）の単離、それらからのクローニングお
よびcDNA生産；（２）精製mRNAからの完全鎖長cDNAライ
ブラリーの調製、それから適当な軽鎖（Ｌ）及び重鎖
（Ｈ）可変（Ｖ）領域部分を（ｉ）適当なプローブ同定
する（ii）シークエンス（iii）定常（ｃ）領域部分と
の適合性を作る；（３）cDNA調製およびクローニングに
よりＣ領域遺伝子部分モジュールの調製；（４）上記
（２）に記載したクローン化特異的免疫グロブリンＶ領
域部分と、（３）に記載したクローン化ヒトＣ領域遺伝
子部分モジュールとを連結して完全をＨまたはＬ鎖コー
ド配列を構築する；そして（５）キメラＬおよびＨ鎖を
選択した真核または原核細胞を含む宿主中で発現させ
る。

多くのベクター系がクローン化ＨおよびＬ鎖遺伝子の
哺乳動物細胞中で発現するために入手できる（Glover,
D.H.,編集DNA Cloning Vol.II pp143−238、IRL出版、1
985参照）。異なる方法を完全なH₂L₂抗体を得るために
使用できる。同じ細胞の中にＨおよびＬ共発現させてＨ
及びＬ鎖を完全なH₂L₂４量体抗体に細胞内会合及び連結
をすることもできる。共発現は、同一宿主中で同一また
は異なるプラスミドを使用することによって行うことが
できる。Ｈ及びＬ鎖遺伝子は同一プラスミド内に位置
し、次ぎに細胞にトランスフェクトされ、これによって
両方の鎖を発現する細胞の直接選択である。別の方法と
して、細胞はひとつの鎖、たとえばＬ鎖をコードするプ
ラスミドではじめにトランスフェクトされ、つぎにその
細胞系を第２選択性マーカーを含有するＨ鎖プラスミド
でトランスフェクトされる。いずれかの経路をとおった
H₂L₂分子生成細胞系は、さらに選択性マーカーと組み合
わせて、H,L又はＨプラスＬ鎖の付加的なコピーをコー
ドするプラスミドでトランスフェクトさせ、集合したH₂
L₂抗体分子またはトランスフェクトされた細胞系の安定
性を強化したような強化された性質を有する細胞系を生
産することができる。

本発明のキメラ抗体は、マウスmAbのTCR−認識特異性
およびヒト抗体の生物的性質の両方を有し、ヒトにおい
てクレアランス（clearance）抵抗およびより低い免疫
源性（多くの治療を可能とする）含む。

本発明の抗−TCRペプチド抗体（ポリクローナル、モ
ノクローナルおよびキメラ）は免疫結合体として治療的
に使用できる（Dillman,R.O.,Ann Int.Med.111:592−60
3（1989）を復習として参照）。それらは、リシン−
Ａ、シュードモナス毒素およびジフテリア毒素などのリ
ボゾーム阻害性タンパク質及びその他の腫瘍壊死因子タ
ンパク質を含む細胞毒性タンパク質と結合され得る。抗
体または他のリガンドに結合した毒素は、当業者に知ら
れている（例えば、Olsnes,S.,らのImmunol.Today 10:2
91−295（1989）参照）。このような結合抗体の付加的
な例は、XomaZyme^R−DCSプラスがあり、これはひとつの
リシンＡ鎖に結合した抗−CD5 mAbである。この調製物
は対宿主移植片疾患および難治性のリュウマチ関節炎の
予防および治療に有効である。この特定の毒素−結合抗
体はＴリンパ球およびBTリンパ球サブセットに最も特異
的である。CD5マーカーを有する細胞は治療に応答して
急速に減少する。TCRペプチドに対する抗体は、より少
ない全リンパ球集合と反応するであろうから、リシンＡ
の抗−TCR抗体結合体より高い投与が患者に許容される
であろう、つまり逆に低い投与量で効果的的あろう。TC
Rペプチドに対するリシンＡ結合モノクローナル抗体有
効投与量の範囲は、約0.005−0.5mg/kg/日であり、好ま
しい投与量の範囲は約0.05−0.2mg/kg/日である。

本発明の抗−TCRペプチドは、放射核種および細胞毒
性薬剤を非限定的に含む治療部分の付加的タイプと結合
させ得ることができ、自己免疫または悪性リンホプロラ
イフラティブ（lymphoprolifrative）症の患者を治療す
る。抗体に結合させ、in vivoで抗原部位に運ばれる放
射核種の非限定的な例は、²¹²Bi、¹³¹I、¹⁸⁶Reおよび⁹⁰
Yがある。このような放射核種はそれらの部分的に細胞
に照射する細胞毒性効果を通常の放射治療法で知られる
ように細胞に部分的に照射することで及ぼされる。

抗体と結合させ、引き続きin vivoで治療に使用され
る毒性薬剤は、非−限定的にダウノルビシン、ドキソル
ビシン、メトトレキセートおよびマイトマイシンＣを含
む。毒性薬剤は、DNA、RNA,及びタンパク質合成を含む
重大な細胞過程を妨害する。これらの種類の当業者に知
られる薬剤に関する注釈およびメカニズムおよび作用
は、GoodmanA.G.,らのGoodman and Gilman′s The Phar
macological Basis of Therapeutics第７版マックミラ
ン社（1985）を参照されたい。

本発明の抗体、断片または誘導体を使用する個々の治
療は、抗体、断片またはその誘導体を単一または複数回
投与を親へ適用することから成る。効果的な投与は個々
の抗体、治療抗原の存在及び性質、個体およびその臨床
的状況の関数であり、約10μg/kg体重から100mg/kg体重
で変化させることができる。適用の経路は、IVおよびS
C、筋肉内、肺内、腹腔内（IP）、鼻腔内、鞘内、皮
内、経皮内または他の既知の経路を含む。

ペプチドの組成 疾患又は欠損において本発明の前臨床または臨床治療
的利用は、診断及び治療の許容できる原理を採用して当
業者により最高に達成できる。このような原理は当業者
には知られており、例えば以下のBraunwald E.,らの編
集によるHarrison′s Principle Oh Internal Medicin
e,第11版マグロウヒル出版、ニューヨーク、ニューヨー
ク州（1987）に説明されている。

本発明のペプチドおよび組成物、またはそれらの機能
的誘導体は、医薬組成物の調製に適する。本発明の医薬
組成物は、この組成物の有利な効果が体験される任意の
動物に適用できるであろう。その用な動物の第一はヒト
であるが、本発明はそれに限定されることを意図しな
い。

本発明の医薬組成物は、その意図する目的を達成する
どんな手段によっても投薬できる。例えば、非経口経
路、皮下経路、静脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹
腔内経路、経皮経路、又は口腔内経路より投薬できる。
交互に、又は同時に、経口経路より投薬できる。濃縮塊
（bolus）注射により又は一定期間にわたる徐々の灌流
により非経口的に前記ペプチド及び医薬組成物を投薬で
きる。

投薬形態は患者の年齢、性差、健康度、及び体重、併
行治療の種類（ある場合）、治療の頻度、並びに所望の
効果の本質に依存されうる。

本発明の組成物の投薬の用量幅は所望の効果を生じさ
せるのに足るような大きさであり、それにより、例え
ば、ペプチドに対する免疫応答（DH又は抗体産生により
測定される通りの）が達成され、免疫関連疾患が顕著に
防止、抑制又は治療される。用量は望んでいない交差反
応、全身性免疫抑制、アナフィラキシー反応等の副作用
を起こすほど大きくない。

ヒトについて好適な用量は体重1kg当たり約0.001〜25
mgの間である。

それ自身薬学的に活性のある本発明のペプチドに加え
て、医薬組成物は薬学的に使用できる製剤に活性化合物
を製剤化するのを容易にする賦形剤や添加剤を包含する
薬学的に許容できる適当な担体を含有できる。好適な組
成物はアラムのような佐剤又は当業界で公知のその他の
佐剤の含有物を含有する（例えば、Warren,H.S.et a
l.，Ann.Rev.Immunol. 4:369−388（1986）;Chedid,
L.,Feder.Proc.45:2531−2560（1986）を参照）。

デリバリー又は生物活性を増強させるために、当業界
で公知の方法と化合物を使用してペプチドをリポゾーム
中に組み入れることができる。

錠剤やカプセル剤の剤型で経口的に投薬できる製剤、
坐剤のような肛門から投薬できる製剤、及び注射若しく
は経口導入用の液剤の剤型の製剤は約0.001〜約99％、
好ましくは約0.01〜約95％の活性化合物（一種またはそ
れ以上）を賦形剤と共に含有する。

適切な賦形剤は、特に、糖類、例えば、ラクトース若
しくはスクロース、マンニトール若しくはソルビトー
ル、セルロース調製物及び／又は燐酸カルシウム、例え
ば、燐酸三カルシウム若しくは燐酸水素カルシウム等の
充填剤、並びに、例えば、トウモロコシデンプン、小麦
デンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチ
ン、トラガント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナト
リウム、及び／又はポリビニルピロリドンを使用するデ
ンプンペーストのような結合剤である。

経口投与できるその他の医薬製剤にはゼラチンから製
造される押込嵌め式カプセル、並びにゼラチン及びグリ
セリン若しくはソルビトールのような可塑剤から製造さ
れる密封軟カプセル等がある。押込嵌め式カプセルは、
ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤、
及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウムの
ような滑沢剤、そして、場合により、安定剤と混合でき
る顆粒状の活性化合物を含有する。軟カプセルでは、活
性化合物は、好ましくは、例えば脂油、若しくは液状パ
ラフィンのような適当な液体に溶解又は懸濁される。更
に、安定剤も添加できる。

肛門から投薬できる可能な医薬組成物には、例えば、
一種若しくはそれ以上の活性化合物と坐剤用基剤との組
み合わせから構成される坐剤がある。適切な坐剤基剤
は、例えば、天然若しくは合成トリグリセリド、又はパ
ラフィン炭化水素がある。更に、活性化合物と基剤との
組み合わせから構成されるゼラチン肛門用カプセルを使
用することも可能である。可能な基剤材料には、例え
ば、液状トリグリセリド、ポリエチレングリコール、又
はパラフィン炭化水素がある。

非経口投薬のために適切な処方には、水溶性形態、例
えば、水溶性塩類の形態のペプチドの水溶溶液がある。
更に、適当な油状注射用懸濁液としてのペプチドの懸濁
液も投薬できる。適切な親油性溶媒若しくはビヒクルに
は、脂油、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル
類、例えば、オレイン酸エチル若しくはトリグリセリド
等がある。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加さ
せる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ソルビトール、及び／又はデキストラン等を含有
できる。場合により、懸濁液は安定剤も含有できる。

ペプチドは注射による投薬のための慣用の薬学的に許
容できる非経口ビヒクルを使用して処方される。これら
のビヒクルは非毒性で治療学にかない、多くの処方がRe
mington′s Pharmaceutical Sciences，（前掲）に記載
されている。限定しない賦形剤の例は、水、生理的食塩
水、リンゲル液、デキストロース液及びハンクス平衡塩
溶液である。本発明の処方では、等張性、生理学的pH、
及び安定性を維持する物質のような少量の添加剤も含有
できる。

本発明のペプチドは好ましくは、凝集物やその他の蛋
白質を実質的に含まない精製された形態で、好ましく
は、約1.0ng/ml〜100mg/mlの濃度に処方される。

免疫関連疾患の防止、抑制、又は治療の使用のための
本発明のペプチドの有効用量は体重1kg当たり約1ng〜10
0mgの範囲である。好適な用量範囲は約10ng〜10mg/kgで
ある。さらに好適な用量範囲は100ng〜1mg/kgである。

ペプチドの免疫原性は、ペプチドをより長いペプチド
若しくは鎖に含ませることにより、又はペプチドをKL
H、血清アルブミン、テタヌストキソイド等のような
「免疫学的」キャリヤーに標準的な結合方法を使用して
結合させることにより増強できる。当業界でこのような
方法の様々なものが公知であり、例えば、ジシクロヘキ
シルカルボジイミドのような縮合剤の使用又はPierce C
hemical Co.,Rockford,ILから市販されているもののよ
うなリンカー（linker）の使用がある。

本発明のTCRペプチド−特異性Ｔ細胞調製物を用いた
受動免疫のために、回収したＴ細胞を、生理学的に緩衝
化した生理的食塩水のような適切なビヒクルに懸濁さ
せ、対象物に約10⁵〜10⁹細胞／注射の量で注射する。TC
Rペプチド−特異性抗体の用量は、抗体種源、イソタイ
プ、親和度、種類（ポリクローナル、モノクローナル、
キメラ）及び熟達者に公知のその他の特性の関数として
変動する。例えば、TCRペプチドに対するモノクローナ
ル抗体は0.01〜50mg/kgの用量で投薬される。

更に、本発明の範囲内で、感染防御Ｔ細胞とTCRペプ
チド−特異性抗体（ポリクローナル、モノクローナル、
若しくはキメラ）との遊離体若しくは結合体での組み合
わせを用いた受動免疫も意図される。

以下の例は例証であり、本発明を限定することを目的
とするものではない。

実施例１ MSのモデルとしてEAEを治療するのに有用なペプチドの
組成物 導入 EAEはヒト自己免疫疾患、多発硬化症のよく知られた
ラットモデルである。従って、ラットにおいて、EAEに
ついてのマーカーTCRであるTCRの適切なCDR2ペプチドを
表すペプチドの投与がこれらの動物のEAEを防止するこ
とを証明することにより本発明の利用性を示した。この
モデルでは、疾患を、例えばモルモット塩基性蛋白質
（GPBP）若しくはGPBPの72−89残基（GPBP（72−89））
に相当する合成ペプチドのようなミエリン塩基性蛋白質
の起脳炎体を対象ラットに注射することにより導入し
た。完全フロイントアジュバント（CFA）中のこれらの
ペプチドのいずれかの注射は、マウスTCR V_α２及びＶ
_β８遺伝子のラット相同体を主に利用する起脳炎Ｔ細胞
クローンを導入する（Chou,Y.K.,et al.，J.Neurosci.R
es. 22:181−187（1989）;Burns,F.R.,et al.，J.Exp.
Med. 169:27−39（1989））。

発明者等は、完全ヌクレオチドを報告し、塩基性蛋白
質、GPBP（72−89）の主起脳炎エピトープに応答するの
に使用される再配列ラットTCRα及びβ鎖遺伝子につい
てのアミノ酸配列（各マウスＶ_α２及びＶ_β８ファミリ
ーに対する配列相同と共に）導き出した（Burns.F.R.,e
t al.，前掲）。TCR V_β８領域内で、21アミノ酸配列を
同定し合成し（第二相補的決定領域（CDR2）を含ん
だ）、そしてＴ細胞に対して免疫性であると予測した
（Margalit et al.，及びRothbard et al.，（前掲）の
アルゴリズムを基準にした）。

このペプチドの配列は、Asp−Met−Gly−His−Gly−L
eu−Arg−Leu−Ile−His−Tyr−Ser−Tyr−Asp−Val−A
sn−Ser−Thr−Glu−Lys−Glyであり、「TCR Vβ８（39
−59）」と命名されている。

対照ペプチドはマウスＶ_β14ファミリーに相同である
異種のTCR V_β配列の相当する領域から合成した（Willi
ams et al.，前掲）。

TCRペプチドに対する特異免疫性 CFA中の400μgTCRペプチド（100μｇミコバクテリウ
ム／ラット）の皮下（SC）注射により四匹のラットに免
疫を与え、ペプチド−特異免疫応答を30日後測定した。

TCR V_β８（39−59）ペプチドに特異性の抗体を測定
するために、免疫性を与えたラットの血清を直接ELISA
により試験した。TCRペプチドをプラスチック製マイク
ロプレート上に被覆した（25ngのTCRペプチド／ウエ
ル）。血清希釈物を添加しマイクロプレートを２時間培
養した。Ig H及びＬ鎖に対して特異性のパーオキシダー
ゼ−結合抗体の添加により反応を進めた。パーオキシダ
ーゼに対して発色性の基質を加え、着色反応生成物をマ
イクロプレート比色読取装置を使用して405nm（A₄₀₅）
における吸光度として測定した。

1:200の希釈率の免疫血清は0.63±0.12単位の吸光度
を与えた。対照ペプチド（関連しないTCR鎖、Ｖ_β14の
相当するCDR2領域から誘導）で免疫を与えたラットから
の対照血清は0.02±0.01単位のみの反応を与えた。従っ
て、TCRペプチドに対して特異抗体応答を得た。

更に、ラットはインビボで特異Ｔ細胞応答を示した
（Ｖ_β８（39−59）TCRペプチドであるがＶ_β14ペプチ
ドでないペプチドを用いて皮内（ID）チャレンジに対す
る遅延過敏（DH）反応として測定））。

¹ EAEは、TCRペプチド（または生理塩水）による免疫の
30日後に完全フロインドアジュバンド（CFA）中50μ
ｇ、GPBP＋400μｇミコバクテリアを皮下注射すること
により誘発された。² ラットに以下のいずれかを皮下注射した：（１）100
μｇのTCRペプチド〔DNGHGLRLIHVSDVNSTEKG（単一文字
コード）〕であって、ラットcDNAクローンＶ_β510の残
基39−59を表しマウスＶ_β８ファミリーと相同性である
もの（Burngら,J.Exp.Med.169:27−39（1989））；
（２）100μｇのTCRペプチド〔APGGTLQQLFYSFNVGQSEL
F〕であって、ラットcDNAクローンCR18188の残渣39−59
を表し、マウスのＶ_β14ファミリーと相同性であるもの
（Williams,C.B.ら,J.Immunol.142;1037−1035（198
9））；あるいは（３）生理塩水。上記ペプチドまたは
生理塩水を、注射の前に100μｇのミコバクテリアを含
有するCFAと混合した。³ 数値はEAEの最重症度の平均値を示す。０は徴候な
し;0.5は無気力，体重減少;1は尾を垂れる;2は後肢衰
弱;3は後半身麻痺、失禁;4は死にかける。

臨床的EAEに対するTCRペプチド特異的免疫保護 TCRペプチドで免疫されたラットはTCRペプチドに対す
る特異的免疫を示す以外に、臨床的EAEに対して保護さ
れていることがわかった。

TCR V_β14ペプチドまたは生理塩水ではなくTCR V_β８
（19−59）ペプチドでルイス（Lewis）ラットを免疫す
るとEAEの誘発を完全に防いだ（表１）。Ｖ_β８（39−5
9）で免疫したラットはＶ_β８（39−59）ペプチドに対
する特異的抗体と50μgTCR V_β８（39−59）ペプチドに
対して耳が0.17mm腫れる遅延過敏症（DH）反応との両方
を生じた。対照Ｖ_β14ペプチドもそれ自体に対する特異
的免疫を誘発したがEAEに対して保護しなかった。

TCRペプチド特異的免疫によって特異的Ｔ細胞が生じる TCRペプチドは抗体産生、DHおよびEAEに対する保護を
示す以外に、抗原特異的（すなわち、TCRペプチド特異
的）Ｔ細胞を証明できる形で誘発せしめる。

ラットをCFA（1mgのミコバクテリウム・ツベルクロシ
ス（M.tuberculosis）を含有）中400μgTCRV_β８（39−
59）ペプチドを皮下注射して免疫し、CFA中50μｇのGPB
Pを同時にあるいは100μｇのGPBPを30日後に皮下注射し
た。この同時抗原投与の20日後に排出するリンパ節（L
N）を取り出し、リンパ球懸濁液をつくった。

リンパ球の分画を抗原またはマイトジェンに対する生
体内での増殖反応（５×10⁵細胞／ウエル）について試
験した。

リンパ球の残りは適当なTCRペプチド（50μg/ml）と
３日間バルク培養（直径6cmのペトリ皿中）し、続いてI
L−２に富んだ培地でさらに４日間培養して再刺激し
た。これらの細胞を照射された副胸腺細胞（２×10⁴細
胞／ウェル）の存在下再刺激による抗原または抗原およ
びマイトジェンに対する増殖反応について試験した。い
くつかの場合、TCRペプチドによる刺激は２μg/ウェル
のモルクローナル抗体の存在下に行なわれた。結果は表
２に示されている（アンダーラインした数値は統計的に
有意の反応を示す）。

保護されたラットから単離されたリンパ節（LN）細胞
はTCRV_β８（39−59）ペプチドならびにGPBPとPPD（ミ
コバクテリウム・ツベクロシスから得られた精製蛋白
質）に反応した。これはTCR−特異的ならびに自己抗原
特異的Ｔ細胞反応性が同時に生じている証拠であった。

Ｔ細胞株は、Ｖ_β８（39−59）に対して特異的に反応
するのがＶ_β14ペプチドに対しては反応しない保護され
たラットのLNから選択された（表２）。TCRV_β８（39−
59）特異的Ｔ細胞は、免疫蛍光法によりCD₄マーカーに
ついては強い陽性でCD8マーカーでは弱い陽性を示し
た。Ｖ_β８（39−59）ペプチドに対する増殖反応はMHC
クラスＩ分子によってのみ制限された。

GPBP−特異的Ｔ−細胞株も、TCRV_β８（39−59）ペプ
チドおよびGPBPの両方によって免疫された保護されたラ
ットから選別された。この細胞株は、GPBPに対する反応
性に比べて脳炎惹起72−89ペプチドに対しては非特徴的
に低い反応性しか示さなかった。一旦選別され活性化さ
れると、TCRペプチドで保護されたラットから得られたG
PBP特異的Ｔ細胞株は脳炎惹起性（10⁷個の細胞を投与す
ると３匹のラットに後肢麻痺を生じた。）であり、TCRV
_β８（39−59）ペプチドによって免疫しても脳炎惹起性
Ｔ細胞の前駆体欠失を生じなかったことを示している。

TCRV_β８（39−59）特異的およびBP−特異的Ｔ細胞を
混合しても、TCRペプチドの存在下でさえGPBPに対する
反応を生じることはなかった（表２）。

TCRV_β８（39−59）特異的Ｔ細胞は、しかし、脳炎惹起
72−89配列以外のGPBPのペプチドすべてに対する反応が
増大した。したがって、TCRペプチド特異的Ｔ細胞はGPB
P反応性Ｔ細胞のペプチド認識パターンを変えた。この
ことは細胞−細胞相互作用の存在を証明する。

TCRペプチド−特異的およびBP−特異的Ｔ細胞間の直接
的相互作用 免疫されたラットのLNからのＴ細胞を試験管内で、希
釈されたＶ_β8⁺またはＶ_β8^-Ｔ細胞に対する応答性につ
いて試験した。スティミュレーターＴ細胞に放射線を照
射して（2500R）、２×10⁴個の細胞を２×10⁵個の単離
されたTCR特異的なＴ細胞とともに（さらに補助細胞を
追加することなく）３日間培養し、最後の18時間は³H−
チミジンを律動的に加え、同位元素の取込みは液体シン
チレーションスペクトロスコピーによって測定した。

スティミュレーターＴ細胞株の不存在下に、“バック
グラウンド”応答は7000cpmのオーダーであった（表
３）。スティミュレーター細胞株がGPBPS72−89エピト
ープに対して特異的でＶ_β8TCRを発現する場合、応答は
31,000cpmであった。しかし、スティミュレーター細胞
株がGPBP55−74ペプチドに対して特異的であって、それ
故Ｖ_β8TCRを発現しない場合、バックグラウンド以上の
有意の応答はなかった（8000cpm）。このように、Ｖ_β8
⁺細胞のみがTCRペプチドに特異的なＴ細胞によって認識
される。このことは調節するＶ_β８−特異的Ｔ細胞によ
る標的Ｔ細胞上のＶ_β８ペプチドの直接的認識の存在を
示す。これらの結果は、スティミュレーターＴ細胞の表
面上のTCR配列の直接的認識を示す。TCRペプチド−特異
的Ｔ細胞は、しかし、BP反応性標的細胞に対して細胞毒
性はなかった。

TCRペプチド−特異的Ｔ細胞によるEAE保護の受動的免疫
伝達 Ｖ_β８（37−59）ペプチド−特異的Ｔ細胞の保護能力
は養子免疫伝達によって確立された。10⁷個のＶ_β８（3
9−59）Ｔ細胞というわずかの細胞を注射されたラット
はEAEを発症しなかった（表４）。Ｔ細胞が媒介してい
るように見える免疫伝達による保護;V_β８（39−59）−
特異的抗体は保護されたラットの血清中に検出できなか
った。DT結果（表４）は養子免疫伝達されたＴ細胞がＴ
細胞が他の細胞を認識するのと妥協することなくEAEの
誘発を防ぐことができたことを示した。

Ｔ細胞の細胞株に放射線を照射（2,500R）し、２×10
⁴個の細胞（スティミュレーターとして）を２×10⁵個の
TCR−特異的レスポンダーＴ細胞と３日間混合した。最
後の18時間は培養物に³H−チミジンを加え、細胞を回収
し、増殖を³H−チミジン取込みとして計測した。GPBP
（S72−89）とGPBP（55−74）に特異的な照射済みＴ細
胞のバックグランド増殖は各々0.1および0.2cpm（×1
0³）であった。

保護ラットに由来するＴ細胞系の特異性 Ｖ_β８（39−59）−特異的Ｔ細胞の有する（ａ）in v
itroでGPBP−特異的Ｔ細胞系の応答パターンを変える、
（ｂ）ナイーブラットをEAEから保護する、及び（ｃ）i
n vivoでDH反応を減少させる、という能力は、BPエピト
ープに対する応答パターンが、TCRペプチド−特異的Ｔ
細胞によって保護されたラットにおいては変化するかも
知れないことを示唆している。表５から明らかなよう
に、EAE−保護動物に由来するLN細胞は、対照群に由来
するLN細胞に比較して、GPBPのTCRペプチドによく応答
した。これとは対照的に、保護グループに由来するLN細
胞はBPの87−99ペプチドに有意に応答したが、一方対照
群に由来するLN細胞はこのペプチドに応答しなかった。
養子保護ラットのLNからのTCR V_β８（39−59）−特異
的Ｔ細胞系の選択（表５）は、TCRペプチド−特異的Ｔ
細胞がGPBP注入の部位でドレインしたLN中に移入し、か
つ生存したことを示している。

検討 これらの結果は、EAEの誘導を阻害するＶ_β８−特異
的調節Ｔ細胞を誘導するために、TCRのCDR2領域からの
合成ペプチドを使用することを初めて示している。TCR
鎖、抗原ペプチド、及びMHC制限分子の間の三重相互作
用に関するコンピューターモデルは、TCRがエネルギー
的に好ましいコンフォーメーションに折り畳まれている
場合には、ペプチド/MHC結合にCDRが関与することと一
致する（Dabisら、及びClaverieら、前出）。CDR2に特
異的なＴ細胞の調節効果は、この領域が生物学的に重要
であるという考えを支持する。本発明者は何ら特定の理
論に拘束されるものではないが、応答性Ｔ細胞が標的Ｔ
細胞表面上で機能性TCR V_β８分子と直接相互作用する
というのはあり得ないように思える。実際、内在性TCR
ペプチドがクラス１分子と関連してＴ細胞表面上で好適
に“処理され”、発現されることは考えられる［Long,
E.O.,Immunol.Today 10:232−234（1989）］。もしもT
CRペプチドがＴ細胞表面上でMHC分子と関連するのであ
れば、相互作用性TCR−特異的Ｔ細胞は、BPエピトープ
による正常Ｔ細胞活性化に介入することができる。

同じ病気を誘導するエピトープに特異的な、異なるＴ
細胞クローンによって共有される標的構造に対して保護
免疫が誘導されるが、TCRを直接巻き込むものではない
ことが、弱毒Ｔ細胞を用いる予防接種によって示唆され
た。起脳炎Ｔ細胞によって発現されるTCR V_β８鎖の限
定された領域における、ここに示された免疫原性及び免
疫調節活性は抗イディオタイプ調節を理解するための重
要な一歩であるし、またペプチド免疫感作アプローチの
保護効果に対する明らかな説明を提供する。TCRペプチ
ド−特異的抗体を誘導するするために合成ペプチドを用
いる本発明のアプローチは、TCR機能において重要な配
列を評価するための各種の高特異的抗体を生産するうえ
で価値を有する。Ｖ_β８（39−59）ペプチドまで高めた
抗体の可能な調節的性質を実施例IIに説明する。

TCRペプチド予防接種は、ヒトの自動免疫または汎用
されているTCR V遺伝子使用により特徴づけられる悪性
症状に適用できる。

実施例II 合成TCR V領域ペプチドに対する抗体はEAEを抑圧する 本実施例は、TCR V_β８（39−59）ペプチドによる免
疫感作が、起脳炎モルモット基礎タンパク質（GPBP）ペ
プチド、S87−99で誘導されたEAEに対して及ぼす効果、
並びにGPBPペプチドS49SまたはS87−99への抗体応答に
対して及ぼす効果を評価するためになされた。TCR V_β
８（39−59）ペプチドに対する抗体応答について述べ、
さらにこれらの抗体がＶ_β8⁺ T細胞と反応する能力、及
びEAEの臨床的兆候を抑圧する能力について評価した。
この結果は、TCR V_β８（39−59）ペプチドがEAEに対す
る保護を誘導し、かつLewisラットにおいて起脳炎性で
あるGPBPエピトープのいずれかに特異的な抗体の力価上
昇も誘導することを示している。さらに、抗−TCR V_β
８（39−59）抗体は、調節Ｔ細胞とは独立にEAEを抑圧
することが示された。かくして、TCR V_β８（39−59）
ペプチドでLewisラットを免疫感作した後、体液性及び
細胞性の調節機構を一般化してまとめた。

A.材料及び方法 １、ペプチド合成及び精製 本研究に用いるすべてのペプチドは、Boc−アミノ酸
−樹脂−エステル（Peninsula Laboratories,San Carlo
s,CA）を用いる固相法［Merrifield,R.B.,J.Amer.Cem.S
oc．85:2149（1963）］をいくらか改変して［Hashim,G.
A.,et al.,J.Neurosci.Res．16:467（1986）］合成し
た。ペプチド（表６）は、ｔ−Boc−Ｌ−グリシン−Ｏ
−樹脂エステル（0.65mmole/g:0.78mmole）から開始
し、ｔ−Boc−Ｌ−アミノ酸誘導体を用いて合成した。
遊離アミノ基のカップリング及びデブロッキング反応は
カイザーテスト［Kaiser,E.,et al.,Anal.Biochem．34:
595（1970）］によって常時モニターした。本研究に用
いたすべてのペプチドの合成には、１回のデブロッキン
グ及び時には２回のカップリング反応で十分である。ペ
プチドGp−S49SとはGPBPの69−84領域を定義し、Ｃ−末
端グリシンを有する。本研究に用いたGPBPペプチドの残
基数は、ウシミエリン基礎タンパク質で報告された残基
数［Eylar,E.H.et al.,J.Biol.Chem．246:5770（197
1）］と対応する。

ホルミルブロッキング基を除去するために、トリプト
ファンを含むペプチドをまず10％ピペリジンで30分間処
理し、次いで他のすべてのペプチドと同様に、アニソー
ルの存在下に０℃でHFと処理することによって、他の側
鎖脱保護と共に、樹脂から切り出した。HFを除去した
後、樹脂−ペプチド混合物をエーテルで４回洗浄し、乾
燥した。ペプチドを水で抽出して、凍結乾燥し、５％酢
酸で平衡化し溶離したセファデックスカラム（2.5x100c
m）で濾過した。酸不溶ペプチドを樹脂−ペプチド混合
物から0.03M炭酸アンモニウムで抽出し、0.03M炭酸水素
アンモニウムで平衡化し溶離したセファデックスカラム
G10カラム上で濾過して、凍結乾燥し。ペプチドをさら
に精製するために、水中の0.1％トリフルオル酢酸（TF
A）で平衡化したボンダパックC18カラムを用いるHPLC
で、0.1％TFAを含む40％アセトニトリルまでの線状グラ
ジエントを用いて60分間溶離した。ペプチドの純度はHP
LC及びアミノ酸組成分析により測定した。

２。試験及び対照群ペプチド Burns,F.R.,et al.,J.Exp.Med．169:27（1989）によ
り同定された配列に従い、TCR V_β８（39−59）ペプチ
ドを合成した。TCR V_β遺伝子属の特異性とCDR2超可変
領域のための対照群として、以下のペプチドを含むその
他のペプチドを合成した:V_β14遺伝子属［Williams,C.
B.,et al.,J.Immunol．142:1027（1989）］の対応するC
DR2からなるTCR V_β14（39−59），及びペプチドTCR V
_β８（39−59）［Burns.F.R.,et al.,前出］に隣接する
CDR1領域にある配列に対応するTCR V_β８（25−41）。
その他の対照群ペプチドは、GPBPの特異的領域を定義す
る一連の物を含む。ペプチドGp−S49S及びGp−S87−99
は、それぞれLewisラットのメジャー及びマイナー起脳
炎配列を定義する。ペプチドGp−S67（残基69−81）及
びGp−S53（残基75−84）はそれぞれ、ペプチドGp−S49
S（残基69−84）に囲まれたメジャー起脳炎エピトープ
中のＴ細胞及びＢ細胞エピトープを定義する。ペプチド
Gp−S55−74は、Lewisラットにおける非−起脳炎Ｔ細胞
決定基［Offner,H.,et al.,J.Exp.Med．170:355（198
9）］を定義し、Gp−NAc−１−16は、マウスのPL/J株に
対する起脳炎配列を包含する［Zamvil,S.S.,et al.,Nat
ure 324:258（1986）］。

3,KLHへのペプチドカップリング キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）（Calbioc
hem Corp.,La Jolla.CA）をリン酸緩衝液（PBS）に溶解
して、PBSに対して４℃で一夜透析し、凍結乾燥した。
既知重量のKLH（8mgまたは１−２μモル）を、カップリ
ングすべきペプチド（10μモル）と共に、脱イオン水1m
lに溶解した。0.01N HClでpHを4.5に調整した後、水0.5
ml中の１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミド（Pierce Chemical Co.,Rockford,I
L）374mgを加えて、反応混合物を室温で１時間撹拌し
た。次いで混合物を透析バックに入れ、４℃でPBSを３
回取り替えて透析し、凍結乾燥した。KLHにカップリン
グしたペプチド量は、KLHの非透析部分の量の増加から
計算した。

すべてのペプチドは固相法で合成し、方法の欄で記載
したように、ゲル濾過及び高圧液体クロマトグラフィー
で精製した。TCRからのペプチドはBurns et al.（前
出）及びWilliams et al.（前出）に従って番号を付
し、モルモットミエリン基礎タンパク質（GPBP）ペプチ
ドはEylar et al.,J.Biol.Chem. 246:5770（1971）に
従って番号を付した。ペプチドGp−（S55−74）は63の
位置にアラニンを替えて異常なスレオニンを有してい
る。

４、抗−ペプチド抗体の調製 体重200−250gの雄Lewisラットを遊離ペプチド100μ
ｇの単一投与量で免疫した。ペプチドを完全フロイント
アジュバント（CFA）に懸濁させ、皮下注射した。各ラ
ットはペプチド100μｇとM.butyricum100μｇを含む懸
濁液100μｌを注射された。同様に、Lewisラットを特定
のペプチド100μｇで免疫し、同時にまたはそれ以後に
他のペプチドでチャレンジした。免疫したラットは免疫
前と免疫後定期的に尾静脈から採血した。

体重６−７ポンドのニュージーランド白ウサギを前採
血し、ペプチド4mg及びM.butyricum2mgを含むCFA懸濁液
0.5mlで免疫した。懸濁液は首の背部及び尾の複数の部
位に皮下注射した。ウサギは遊離ペプチドまたはKLHと
結合したペプチドで免疫した。免疫したウサギは、７、
14及び21日目に不完全フロイントアジュバント中に懸濁
したペプチド1mgde追加免疫し、脇腹に皮下注射した。
ウサギを拘束ケージに入れてアセプロモジンで鎮静化さ
せた後、すべてのウサギの耳静脈から採血した。血液量
減退症を防ぐため、採血量を滅菌食塩水で置換した。遠
心した血餅から個々のラット及びウサギの血清を調製し
た。全血清を56℃、30分間で補体除去し、少量に凍結し
てこれにナトリウムアジドを加えた。

５、免疫グロブリンの調製 既知の方法［Steinbuch,M.,et al.,Arch.Biochem.Bio
phys．134:279（1969）］で血清からIgGを調製し、DEAE
−セファデックスによるイオン交換クロマトグラフィー
によって精製した。血清を0.06M酢酸緩衝液１部で希釈
し、室温でpHを4.8に調整した。30分間激しく撹拌しな
がら、カプリル酸 6.8g/血清100mlを滴下した。次いで
混合物を遠心し、上澄みをpH5.7に調整して、脱イオン
水に透析して凍結乾燥した。

６、抗体のアッセイ 抗体反応性は、直接的酵素結合イムノソルベントアッ
セイ（ELIZA）をペプチドに適用するか、またはClevela
nd,E.L.,et al.,Methods in Enzymol．121:95（1986）
に記載の阻害ELIZAによって決定した。パーオキシダー
ゼ標識したウサギ抗−ラットまたはヤギ抗−ウサギ免疫
グロブリン（アフィニティー精製Ｈ及びＬ鎖、Cooper B
iochemal,Malvern,PA）を、Ｏ−ファニレンジアミンと
共に酵素基質として用い、比色板読み取り器（Model Vm
ax,Molecular Devices,Mento,CA）の450−650nmで吸光
度を測定した。

７、EAE誘導 Hashim,G.A.,et al.,J.Neurosci.Res．24:222（198
9）に記載の方法で雄Lewisラット（225−250g）にEAEを
誘導した。各ラットは、ペプチド100μｇ及びM.butyric
um100μｇを含むCFA懸濁液の単一皮下注射を受けた。免
疫したラットがEAEの臨床的兆候を示すか毎日観察し、
チャレンジ後25日から30日の間に殺した。この時点で個
々のラットから血清を回収し、脳及び脊髄組織を組織学
用に処理した。

８、LewisラットにおけるEAEの阻害及び抑圧 雄Lewisラットを、CFAに懸濁したTCR V_β８（39−5
9）ペプチド100μｇで免疫し、皮下注射した。抗体決定
のために免疫したラットの尾から採血し、起脳炎ペプチ
ド（Gp−S49SまたはGp−S87−99）100μｇでチャレンジ
した。抗−TCR V_β８（39−59）抗体産生の経過時間に
基づいて、ラット群を同日または免疫後40−41日目にチ
ャレンジした。

抗−TCR V_β８（39−59）抗体によるEAE抑圧を検討す
るために、Lewisラットを起脳炎ペプチドGp−S49Sでチ
ャレンジし、食塩水（対照群）、或いはLewisラットま
たはウサギ抗−TCR V_β８（39−59）IgGを１日おきに14
日間腹腔内注射した。各ラットは合計49または70mgのラ
ットまたはウサギIgGをそれぞれ受け取り、チャレンジ
後24日目に殺した。14日以上にわたって滅菌水で注射す
るときには、転移12及び24日目における受容者ラットの
循環中にウサギIgGが高レベルで保持され、腔−Gp−S49
S抗体の生成を妨げなかった。

９、Ｖ_β8⁺及びＶ_β8^- T細胞の抗体染色 正常またはTCR V_β８（39−59）で免疫された動物か
らのラットまたはウサギIgG（10μｇ）を、各種濃度で3
0分間、10⁶の正常ラット胸線細胞（普通Ｖ_β8^-として知
られる）またはGp−S49S−反応性、GPBP−特異的Ｔ細胞
系（Ｖ_β8⁺として知られる）と共にインキュベーション
した。数回洗浄した後、増幅のため細胞を抗−ラットま
たは抗−ウサギIgGと共にさらに30分間インキュベーシ
ョンした。さらに洗浄した後、蛍光ヤギ抗−マウスIgG
（Ｈ＋Ｌ鎖特異的）で染色し、洗浄し、２％ホルマリン
で固定してCoulter Epics C Cytofluorographを用い488
nmで蛍光強度を測定した。大部分のリンパ球を含めるた
めに、前角対直角の分散パターンに基づいて細胞を電子
的に固定して、次いでFITC蛍光で測定した。

B.結果 １、TCR V_β８（39−59）ペプチド免疫によるEAEの阻害 各種起脳炎エピトープによって誘導されるEAEに対し
て抗−TCR V_β８（39−59）免疫が及ぼす予防効果を評
価するために、LewisラットをまずTCR V_β８（39−59）
ペプチドで免疫し、44日後にGp−S49SまたはGp−S87−9
9のいずれかでEAEを誘導した。表７に示すように、TCR
V_β８（39−59）ペプチドによる免疫感作はGp−S49S−
誘導EAEの重度を顕著に減少し、S87−99−誘導EAEを完
全に阻害した。どちらの保護群における組織学的スコア
も減少したが、CNSにおける炎症は一般に臨床的パラメ
ーターよりも、TCR V_β８（39−59）ペプチドによって
影響を受けなかった。

２、TCR V_β８（39−59）ペプチドによるEAEの抑圧 EAEの抑圧を評価するために、TCR V_β８（39−59）ペ
プチドを起脳炎的量のGPBPまたはGp−S49Sと同時に投与
した。表７に示すように、TCR V_β８（39−59）ペプチ
ドはGPBP−誘導EAEをほとんどのラットで阻害し、残り
の動物の臨床的重度を顕著に減少した。同様の結果がGp
−S49S−誘導EAEでも得られた。これとは対照的に、TCR
V_β14（39−59）対照群ペプチドは、EAEに何ら抑圧効
果をもたらさなかった（表７）。ここでも、EAEの組織
学的兆候は臨床的兆候よりも、TCR V_β８（39−59）免
疫感作によって比較的影響を受けなかった。

Lewisラット群は表示の処置日（“Imm"）に記載の抗
原で免疫感作した。各ラットにCFAに懸濁した遊離ペプ
チド100μｇを含む0.1mlを尾の付け根に２回皮下注射し
た。免疫感作したラットを表示の日（“Chall"）に、起
脳炎GPBP（50μｇ）、Gp−S49s（100μｇ）またはGp−
（S87−99）（100μｇ）のいずれかでCFA中の懸濁液
（0.1ml）として足に注射してチャレンジした。毎日ラ
ットの臨床兆候を観察した。チャレンジ後23から26日後
に組織学用に組織を採取した。臨床スコアとは、群ごと
の全ラットの平均であり、表１に記載のように評価し
た。臨床スコアの範囲をカッコ内に示す。個々のラット
の脳（Br）及び脊髄（Sc）の組織学的スコアは病害数に
基づき、１＝１−2;2＝３−5;3＝６−8;4＝９またはそ
れ以上の脳のヘマトキシリン染色縦切片または脊髄の全
長における病害の数を表す。

３、TCR V_β８（39−59）ペプチドに対する抗体応答 完全TCR細胞に対して高められたTCR V_β８−特異的抗
体［Owhashi,M.,et al.,J.Exp.Med．168:2153（1988）;
Gascoigne,N.R.J.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
4:2936（1987）;Kappler,J.W.,et al.,Nature 332:35
（1988）;Kappler,J.W.,et al.,Cell 49:263（1987）;
MacDonald,H.R.,et al.,Nature 332:40（1988）］は、
Lewisラット［Owhashi,M.,et al.,J.Exp.Med．168:2153
（1988）］及びPL/Jマウス［AchaOrbea,H.,et al.,Cell
54:263（1988）;Urban,J.,et al.,Cell 54:577（198
8）］の両方でEAEの予防及び治療に有効であることが証
明されている。従って、合成TCR V_β８（39−59）ペプ
チドに対して抗体が高められるか否か、もし高められる
のであれば、これを臨床に用い得るか、を検討すること
は極めて重要なことである。

このような抗体が事実高められ、臨床的にも有効であ
ることが判明した。CFA中の遊離ペプチド100μｇの１回
の注射後、７日間でLewisラットの血清中にTCR V_β８
（39−59）に対する抗体が検出された（表８）。抗体応
答には大きなバラツキが観察されたものの、抗体力価は
時間とともに漸次増加した。TCRペプチド−免疫感作ラ
ットのいずれも何らEAEの兆候を示さなかったし、全動
物は41日間の観察期間を通して健康であった。

遊離またはKLH−結合TCR V_β８（39−59）ペプチドの
いずれかで免疫感作したウサギは、ラットよりもはるか
に高い抗体力価をもたらした（表８）。抗体力価は６カ
月以上高いままであり、1/320,000までの希釈でも検出
し得る反応性を示した。

雄Lewisラット（225−250g）を、CFA中のTCR V_β８
（39−59）100μｇ＋M.butyricum100μｇで皮下チャレ
ンジした。チャレンジ後、表示の日に各ラットの尾静脈
から採血した。ウサギ（５ポンド）は“材料及び方法”
の項で記載したように免疫感作した。TCR V_β８（39−5
9）に対する個々の血清の抗体反応性は直接ELISAで示
し、群ごとの個々の血清の平均反応性を吸収単位（×10
³）で表した。カッコ内には群ごとの全抗血清の抗体反
応性の範囲を示す。ペプチド25ngに対するアッセイの前
に、全血清を加熱不活性化して希釈した。“なし”の語
は、EAEの臨床兆候が全くないことを示す。

４、起脳炎ペプチドS49Sに対する抗体応答 LewisラットをGPBPまたはGp−S49S（残基）ペプチド
で免疫感作すると、いくつかの異なるエピトープを認識
する抗体を誘導し、そのうちの１つは残基82−84（Asp
−Glu−Asn）からなり、Gp−S53（残基75−84）に結合
する抗体によって証明される［Day,E.D.,et al.,J.Neur
osci,Res．17:375（1987）］．この抗体応答はＴ細胞の
助けに依存し、この助けはGp−S49Sに対して特異的な起
脳炎Ｔ細胞によって提供される。TCR V_β８（39−59）
ペプチドによる免疫感作は、ヘルパー表現型のGP−S49S
−特異的Ｔ細胞によって仲介されるEAEを阻害し、抑圧
するけれども、抗−S49S抗体形成におけるかかる免疫感
作の効果を決定することが重要である。

CFA中のGp−S49Sによる免疫感作後７日で、Gp−S49S
に対する抗体応答が検出された（表９）。免疫感作した
ラットからの定期的採血は、続く48時間にGp−S49S及び
Gp−S53に対する抗体力価がいずれも顕著に増加したこ
とを示したが、抗−Gp−S53応答はEAEの進展及び終局的
回復後に現れた。

TCR V_β８（39−59）によるEAEに対する前免疫感作及
び保護の後、Gp−S49S及びGp−S53に対する26日目の抗
体応答は、TCRペプチドで処理しなかったラットにおけ
るそれに比べて２から４倍上昇した（表９）。同様に、
TCR V_β８（39−59）ペプチドで前免疫感作及び保護し
たラットでは、抗−S87−99応答は４倍以上増加した
（表９）。かくして、Ｖ_β8⁺Ｔ作用に対する免疫応答
は、GPBPのある種のＢ細胞エピトープに対する抗体応答
を増強した。

ラットをTCR V_β８（39−59）ペプチド 100μｇで免
疫感作するか、または食塩水を注射し、表示の日にCFA
中にM.butyricum 100μｇを含む懸濁液で皮下に、Gp−S
49SまたはGp（S87−99）でチャレンジした。TCR V_β８
（39−59）で免疫感作し、Gp−S49SまたはGp−（S87−9
9）でチャレンジした群を、チャレンジの26及び21日目
にそれぞれ殺した。個々の血清の（ペプチド25ng/ウェ
ルに結合した）抗体反応性を直接ELISAで測定した。結
果は450−650nm（バックグランドに自動的に補正）での
平均吸光度（×10³）で示す。理論的吸光度（カッコ内
に示す）は1:40の希釈に標準化した。後脚麻痺（HLP）
は失禁を伴った。病気の重症度のために２匹のGp−S49S
−チャレンジラットが14及び18日目にそれぞれ死亡し
た。２＋３サンプルの群内のバラツキは５％以内であっ
た。

５、抗−ペプチド抗体の特異性 各種抗血清の特異性を検討するために、一連の合成TC
R及びGPBPペプチドへの結合を評価した。結果（表10）
は、Gp−S49S及びそのＣ−末端断片、Gp−S53を認識す
る抗−Gp−S49抗血清は、Gp−S49のＮ−末端断片（即ち
Gp−S67）とも、GPBPの他のいかなる領域とも、またい
かなるTCR V領域ペプチドとも反応しなかった。同様
に、TCR V_β８（39−59）ペプチドに対するラットまた
はウサギ抗血清は、免疫原のみを認識し、他のTCR配列
［TCR V_β８（25−41）に存在する３重複残基−Asn Met
Gly−を含む］またはGPBPペプチドを認識しなかった。T
CR V_β８（39−59）ペプチドとGp−S49SまたはGp−S87
−99で同時に免疫感作したラットからの抗血清は、単一
免疫感作ラットからの抗血清（表５）と同様に、それぞ
れの免疫原に対して同じ特異性を示した。TCR V_β８（3
9−59）及びGp−S49Sに対する抗体反応性の特異性は、
ペプチド特異的でELISAにおける結合の用量依存性阻害
によって確認した（図１）。

６、TCR V_β８（39−59）認識Ｖ_β8⁺Ｔ細胞に対する抗
体 TCR V_β８（39−59）に対する抗体の調節効果を検討
するためには、ペプチド−特異的抗体がＶ_β8⁺Ｔ細胞と
直接相互作用をするか否かを知ることが絶対に必要であ
る。このような反応性を評価するために、Ｖ_β8⁺起脳炎
Ｔ細胞、またはＶ_β8⁺が大半を占める正常胸線細胞を、
ラットまたはウサギ抗−TCR V_β８（39−59）IgG抗体と
一緒にインキュベーションし、次いでマウス抗−ラット
または抗−ウサギ促進抗体、及び蛍光認識したヤギ抗−
マウスIgG抗体とインキュベーションした。図２に示す
ように、KLH−結合TCR V_β８（39−59）ペプチドに対し
て高められたウサギIgGは、すべてのＶ_β8⁺起脳炎Ｔ細
胞集団で蛍光強度を増加（対照抗血清に対して＞90％ポ
ジティブ）したが、一方正常胸線細胞では約５％であっ
た。非結合TCRペプチドに対して高められたラットIgG及
びウサギIgGもまた、より少ない強度ではあるが、Ｖ_β8
⁺Ｔ細胞を選択的に染色した。これらの結果はTCR V_β８
（39−59）ペプチドがＶ_β8⁺Ｔ細胞と選択的に結合しう
ることを示している。クロム放出及び染料排除のいずれ
で測定しても、いずれの抗血清も補体の存在下でＶ_β8⁺
Ｔ細胞にとって細胞毒性ではなく、これは抗体結合が細
胞を殺すことなく、Ｔ細胞の機能を変えたことを示して
いる。

表10 Lewisラットをフロイントアジュバント中（100μｇM.
butyricum／ラット）、Gp−S49S、TCR V_β８（39−59）
または両方100μｇで皮下に免疫感作した。免疫感作後5
4から62日目に抗血清を調製し、高力価抗血清プールを
２−４匹の免疫ラットからか得た。ウサギ抗血清はKLH
に結合したTCRペプチドで免疫感作後43日目に単離し
た。全抗血清は57℃、30分間、加熱不活性化した。各種
ペプチド抗原に対する表示の希釈度での抗体反応性は、
ウサギ抗−ラットまたはヤギ抗−ウサギIgG（Ｌ＋Ｈ）
−パーオキシダーゼ標識を用いる直接ELISAで測定し
た。450−650nm（×10³）における吸光度で示した。す
べての数値はペプチドなしのバックグランドに自動的に
補正してある。カッコ内の数値は、1:160の希釈度で計
算した理論的吸光度を表す。

７、抗−TCR V_β８（39−59）抗体によるEAEの抑圧 TCR V_β８（39−59）で免疫感作したLewisラットはEA
Eに対して保護されただけでなく、免疫ペプチドに特異
的な循環性抗体を形成した。この抗体のダウンレギュレ
ーション的EAEにおける役割を評価するために、Lewisラ
ットをCFA中のGp−S49Sでチャレンジし、次いでTCR V_β
８（39−59）−特異的IgG（ラットまたはウサギ）で処
理した。LewisラットIgGを１日おきに12日間与えられた
ラットは、脳における組織学的減少を伴うEAEの緩和な
臨床兆候を示したが、脊髄の病害は対照群に比べてはる
かに大きかった（表11）。ウサギIgGを与えられたラッ
トは、組織学的スコアにほとんど変化が見られず、最小
の臨床兆候を示した（表６）。かくして、抗−TCR V_β
８（39−59）抗体を12日以上にわたって受動投与する
と、EAEの兆候を臨床的のみでなく組織学的にも抑圧し
た。

C,検討 ここに示す結果は、合成TCR V−領域ペプチドがEAEの
誘導を抑圧しうる特異的抗体を誘導することを初めて示
すものである。このTCR V_β８（39−59）ペプチド−特
異的抗体は、全体的かつ完全なTCRを有するＴ細胞に結
合することができ、そしてこれによってこれらの細胞を
溶菌することなく、細胞の機能を変化させる。実施例Ｉ
に記載の結果と併せて、抗体及び細胞媒介免疫応答のい
ずれもが、起脳炎Ｔリンパ球（これはMBPのエピトープ
に応答して共通Ｖ領域遺伝子を利用する）における独立
した免疫調節作用を提供することができる、ということ
をこの結果は示している。いずれの調節メカニズムも、
自動免疫性疾病の臨床兆候の誘導に対して顕著な阻害的
並びに抑圧的効果を有す。

EAEは、ルイスラットにおいて、Gp−S495を100μｇおよ
びエム・ブチリクム（M.butyricum）を100μｇ含むエマ
ルジョン100μｌを足蹠に注射することによって誘発さ
れた。誘発の日に開始し且つ隔日に12日間の間、実験群
は、TCR V_β８（39〜59）で免疫された動物からの（17
吸光度単位/mg（IgG）を含んだ）ルイスラットIgG7mgか
または（6570吸光度単位/mg（IgG）を含んだ）ウサギIg
G10mgを与えられた。IgGを滅菌生理食塩水に溶解させ且
つ腹腔内に注射した。非免疫ラットまたはウサギのIgG
による処置はEAEの経過に影響を及ぼさなかった。全被
験動物のEAEの臨床的徴候について毎日観察し、指定さ
れた日に尾血管から放血させた。血清のTCRまたはGPBP
ペプチドに対する抗体について直接エライザで試験した
（結果は吸光度×10³である）。全被験動物をEAE誘発後
24日目に屠殺し、脳（Br）および脊髄を、表７について
の説明文に記載の組織学的評価のために採取した。

マルガリット（Margalit）らおよびロスバード（Roth
bard）ら（上記）のアルゴリズムに基づいて優れたＴ細
胞免疫原であると予想されたTCR V_β８（39〜59）ペプ
チドは、特に、ウサギにおいて強力なＢ細胞免疫原であ
ることが証明された。抗体は、（直接反応検定および阻
害検定双方による）免疫性ペプチドに極めて特異的であ
り、Ｖ_β8^*Ｔ細胞のみを染色し、そしてＶ_β8^*Ｔ細胞に
よって媒介されたEAEを抑制した。

要するに、合成ペプチドTCR V_β８（39〜59）は、ル
イスラットにおいてＴ細胞免疫および抗体産生の双方を
誘発した。Ｔ細胞および抗体の双方は、単独でかまたは
一緒に、脳炎誘発性刺激に対する免疫応答を調節するこ
とができる。調節Ｔ細胞を活性化し且つ抗体を保護する
このTCRペプチドの能力により、ヒト自己免疫疾患の制
御のためにこの方法が有用であることが実証される。

実施例III 発病の前または後にTCR V_β８（39〜59）ペプチドで処
置されたラットにおける臨床的EAE GPBPによるEAE誘発後の種々の時間で与えられた場合
に、皮下（アジュバント中）かまたは皮内（生理食塩水
中）に与えられたTCR V_β８（39〜59）の疾患の進行を
中断させる能力を試験した（表12）。実験１において、
TCRペプチドを10日目（第２行）かまたはグループ内の
最初のラットがEAEの臨床的徴候を示した場合の開始時
点に（第３行および第４行）投与した。双方の場合にお
いて、ペプチドの双方の注射経路を用い、罹患期間に有
意の減少があったが、発病の苛酷さまたは開始時間には
なかった。皮内経路によって生理食塩水中で与えられた
ペプチドの効力は、それがアジュバント中での皮下注射
よりも好ましいので、ヒトの治療法に対して特に重要で
ある。

実験２において、TCRペプチドの皮内投与時間を投与
量にしたがって変更した。表12に示したように、ペプチ
ド50μｇを０日目（EAE誘発の日）か、７日目かまたは1
4日目に投与した結果、罹患期間に有意の減少が生じ
た。発病の遅れも観察された。更に、疾患の徴候を示す
被験動物の百分率が減少した。一層多量のペプチド投与
量（200μｇ）は、恐らくは、TCRに対して生じた免疫応
答に含まれることがあるペプチドの短期超過荷重によっ
て、一層少量の投与量よりも有効性が少ないと考えられ
た。不適当なTCRに対応する同様の量のペプチドによる
処置では、EAEの開始、苛酷さまたは発生率に対する影
響はなかったが、ある程度罹患期間を減少させることが
できる（表12の最後の列）。

実施例IV TCRペプチド療法を受けているラットからのLN細胞およ
びTCRペプチドで選択されたＴ細胞系のＴ細胞応答 疾患誘発後13日目にEAEのためにTCR V_β８（39〜59）
ペプチドで処置したラットのドレーニング（draining）
LN（膝窩）でのＴ細胞の増殖反応および特異性を試験し
た（表13）。０日目に、ルイスラットに、GP−BP＋CFA
をラットの後足蹠の皮下に与えるEAE誘発養生法を行っ
た。13日目に、それらを３群に分け、生理食塩水（第１
列）か、TCR V_β８（39〜59）ペプチド（＋CFA）100mg
後足蹠の皮下に（第２列）かまたは生理食塩水中TCR V
_β８（39〜59）50μｇを耳翼の皮内に与えた。EAE開始
後約７日目である20日目に、膝窩LNを取出し、指定され
た抗原またはマイトジェンに対する反応のＴ細胞増殖活
性を直接的に試験した。

対照ラットからのLN細胞はConA、PPD、GPBPおよびGPB
P（72〜89）並びに（72〜89の配列および非脳炎誘発性
ペプチド以外の他の免疫原性ペプチドを含む）GPBP（45
〜89）に対して最もよく反応した。逆に、CFA中で皮下
にTCRペプチドを与えたラットからのLN細胞は、GPBPに
対するまたは何らかのBP断片に対する有意の増殖反応を
示さなかった。TCRペプチドを皮内に処置したラットか
らのLN細胞は、GPBP（72〜89）に対する低下した反応を
除き、対照の細胞と同様に反応した。更に、後者の群
は、脳炎誘発性であることが知られていないGPBP（90〜
170）に対する増加した反応を示した。これは、エピト
ープスイッチング（switching）が生じたことを示して
いる。上記３群のLN細胞それぞれの一部分をGPBPかまた
はTCRペプチドを用いて培養物中で３日間刺激し、そし
て細胞をIL−２中で更に５日間増殖させた。これらの選
択されたＴ細胞の種々の抗原およびマイトジェンに対す
る増殖反応を前記のように試験した。結果を表14に示
す。

対照のＴ細胞は（表14、第１列）、GPBP、GPBP（72〜
89）、P1およびラットBP（CNSにおいて同種認識を示
す）に対して十分に反応した。表の最後の列は、この群
のＴ細胞を無経験ラットに注射した場合に、それらが脳
炎誘発性であったことを示している。

CFA中のTCRペプチドを皮下に処置した被験動物群から
の、GPBPを用いて培養物中で選択されたＴ細胞は（第２
列）、GPBP、GPBP（72〜89）およびラットBPに対して十
分に反応しなかった。GPBP P1に対する反応は、GPBP（7
2〜89）エピトープに対する反応が弱かったことから、
第二の（非脳炎誘発性）エピトープによると考えられ
る。TCRペプチドに対する強力な反応は、７日間の暴露
（このペプチドによるこれ以上の選択を行わない）は抗
TCRペプチド免疫に十分であったことを示した。これら
の細胞がEAEを転移することができなかったという観察
は極めて有意であり、脳炎誘発性クローンをGPBP抗原存
在下で培養中に選択することはできないことを示してい
る。

前記のTCR免疫した動物からの細胞は、それをGPBPよ
りもむしろTCRペプチドを用いてインビトロで選択した
場合に（第３列）、TCRペプチドに対してのみ（そして
当然ながら、Ｔ細胞マイトジェン、ConAに）反応すると
考えられた。

最終的に、TCRペプチドを皮内に処置したラットから
の、GPBPを用いて培養物中で選択された細胞（第４列）
は、対照の細胞とほぼ同様に挙動した。すなわち、それ
らはGPBP（72〜89）の脳炎誘発性エピトープを認識し且
つEAEを転移することができた。これは、脳炎誘発性Ｔ
細胞前駆体がなお、この方法で処置されたラットに存在
していて且つ培養物中で選択されることができたという
ことを示している。これけにより、TCRペプチドを皮内
に処置したラットで見られた減少したEAE期間（実施例I
IIおよび表12を参照されたい）は、ドレーニングLN細胞
の調節に関与しないことが示唆される。しかしながら、
皮内注射部分をドレーニングするLN（すなわち、皮内注
射が耳翼である場合、頸部LN）は、異なる調節性を示し
てもよいということに留意することは重要である。

実施例Ｖ TCRペプチドに対する毒素結合抗体による自己免疫疾患
の治療 本実施例において、mAbを、TCR V_β８（39〜59）ペプ
チドでマウスを免疫し且つ前記に記載のハイブリドーマ
を製造する方法を行うことによって製造する。次に、mA
bをリシンＡ鎖に結合させて、免疫毒素を生成する。毒
素結合抗体をラットに、脳炎誘発性用量のGPBPと同時に
注射し（予防）、他のラットにはEAE開始後に注射する
（治療）。

リシンＡ鎖に結合した抗TCRペプチド抗体による予防
処置の結果（投与量0.05〜0.2mg/kgで１〜４回注射）、
EAEの発生率および苛酷さが有意に減少した。同様の用
量のコンジュゲート（conjugate）を用いる治療処置の
結果、罹患期間の有意の短縮および疾患の苛酷さの軽減
が生じる。

実施例VI TCRペプチドによる関節炎の処置 本実施例で、ヒト慢性関節リウマチを本発明の組成物
および方法によって処置する方法を記載する。２種類の
動物モデル、すなわち、（１）II型コラーゲンの注射に
より感受性マウスで誘発された関節炎［スチュアート
（Stuart,J.M）ら、Ann.Rev.Immunol.，2:199〜218頁
（1984）］および（２）ミコバクテリアの熱ショックタ
ンパク質（HSP）の注射によって感受性ラットで誘発さ
れた関節炎［ヴァン・エデン・ダブリュー（Van Eden,
W.）ら、Nature，331:171〜173頁（1988）］で示す。コ
ラーゲンまたはHSPに反応性で且つ疾患を転移させるこ
とが可能な関節炎誘発性Ｔ細胞を、前記に記載した方法
を用いて、コラーゲンまたはHSP存在下のインビトロで
選択する。疾患を媒介するＴ細胞に関係したTCRを同定
し、そして推定上のアミノ酸配列を、前記のように、核
酸の配列順序を決定することによって決定する。マルガ
リットらおよびロスバードら（上記）のアルゴリズムを
用いて、CDRまたは超可変部に関与するTCRの免疫原性部
分を合成し且つ用いてマウス（コラーゲン関節炎用）ま
たはラット（アジュバント関節炎用）を免疫する。

発病と同時にTCRペプチドで処置された被験動物は、
関節膨化および関節炎誘発物質に対するＴ細胞反応性に
よって測定したところ、関節炎の発症から有意に防御さ
れる。発病後にTCRペプチドで処置された被験動物で
は、罹患期間の有意の短縮および関節炎の症状の苛酷さ
の軽減が示される。

関節炎に関連したTCRペプチドに対して誘発された抗
体による受動免疫でも、関節炎の誘発に対する同様の予
防効果および治療効果が示される。好結果の処置は、多
クローン性抗体、mAbs、キメラ抗体および免疫毒素結合
抗体によって得られる。

関節炎関連TCRペプチドに特異的なＴ細胞による受動
免疫は、関節炎の発症および進行に対する予防および治
療双方のための感染防御免疫を誘発する。

実施例VII TCRペプチドによる甲状腺炎の処置 橋本甲状腺炎およびグレーヴズ病などのヒト甲状腺炎
を、本実施例で記載の本発明の組成物および方法によっ
て処置する。標的自己抗原の正確な性質は不確定である
が、チログロブリンレセプターおよびチロトロピンレセ
プターそれぞれに対する免疫反応性は、これらの疾患に
関係している。甲状腺炎を、チログロブリンの投与によ
るマウスのモデルで示す［マロン・アール（Maron,R.）
ら、J.Exp.Med.，152:1115〜1120頁（1980）］。チログ
ロブリンおよび甲状腺小胞細胞抗原に対して反応性で且
つ疾患を転移させることが可能なＴ細胞を、前記に記載
した方法を用いて、チログロブリンか、甲状腺細胞かま
たは甲状腺細胞膜調製試料存在下のインビトロで選択す
る。疾患を媒介するＴ細胞に関連したTCRを同定し、そ
して推定上のアミノ酸配列を、前記のように、核酸の配
列順序を決定することによって決定する。マルガリット
らおよびロスバードら（上記）のアルゴリズムを用い
て、CDRまたは超可変部に関与するTCRの免疫原性部分を
合成し且つ用いてマウスを免疫する。

発病と同時にTCRペプチドで処置された被験動物は、
甲状腺炎の発症および甲状腺抗原に対するＴ細胞反応性
の発生から有意に防御される。発病後にTCRペプチドで
処置された被験動物では、罹患期間の有意の短縮および
甲状腺炎の症状の苛酷さの軽減が示される。

甲状腺炎に関係したTCRペプチドに対して誘発された
抗体による受動免疫でも、発病に対する同様の予防効果
および治療効果が示される。好結果の処置は、多クロー
ン性抗体、mAbs、キメラ抗体および免疫毒素結合抗体に
よって得られる。

甲状腺炎関連TCRペプチドに特異的なＴ細胞による受
動免疫は、甲状腺炎の発症および進行に対する予防およ
び治療双方のための感染防御免疫を誘発する。

実施例VIII TCRペプチドによる糖尿病の処置 インスリン依存真性糖尿病（IDDM）、すなわちＩ型糖
尿病は、すい臓のランゲルハンス島（またはβ）細胞に
対して向けられた免疫反応性の結果、その細胞の破壊お
よびインスリン産生の停止を引き起こすことを特徴とす
る自己免疫疾患である。この免疫攻撃の標的抗原は確実
に特徴化されていなかった。本実施例で、IDDMを本発明
の組成物および方法によって処置する方法を記載する。

疾患を、天然に存在するまたはある種のマウスで誘発
することができる動物のモデルで示す［カナサワ（Kana
sawa）ら、Diabetologia，27:113（1984）］。他のマウ
ス種は、感受性種からのリンパ球を転移することによっ
てこの疾患を発症させることができる。

ランゲルハンス島細胞抗原に対して反応性で且つ疾患
を転移させることが可能なＴ細胞を、前記に記載した方
法を用いて、ランゲルハンス島細胞かまたはランゲルハ
ンス島細胞膜調製試料存在下のインビトロで選択する。
疾患を媒介するＴ細胞に関関連たTCRを同定し、そして
推定上のアミノ酸配列を、前記のように、核酸の配列順
序を決定することによって決定する。マルガリットらお
よびロスバードら（上記）のアルゴリズムを用いて、CD
Rまたは超可変部に関与するTCRの免疫原性部分を合成し
且つ用いてマウスを免疫する。

発病と同時にTCRペプチドで処置された被験動物は、
糖尿病の発症およびランゲルハンス島細胞抗原に対する
Ｔ細胞反応性の発生から有意に防御される。発病後にTC
Rペプチドで処置された被験動物では、罹患期間の有意
の短縮および糖尿病の症状の苛酷さの軽減が示される。

糖尿病に関連したTCRペプチドに対して誘発された抗
体による受動免疫でも、発病に対する同様の予防効果お
よび治療効果が示される。好結果の処置は、多クローン
性抗体、mAbs、キメラ抗体および免疫毒素結合抗体によ
って得られる。

糖尿病関連TCRペプチドに特異的なＴ細胞による受動
免疫は、糖尿病の発症および進行に対する予防および治
療双方のための感染防御免疫を誘発する。

実施例IX Ｔ細胞レセプターＶ領域ペプチドによる実験的自己免疫
脳脊髄炎の処置 ラットおよびマウスをミエリン塩基性タンパク質（MB
P）で免疫して、ある一定の種類のＴ細胞レセプターＶ
領域遺伝子を発現する脳炎誘発性Ｔ細胞を誘発させる。
前の実施例で、大部分のラット脳炎誘発性Ｔ細胞クロー
ンによって共有されたＶ_β８配列からの合成ペプチド
は、特異的調節のＴ細胞および抗体を刺激することによ
ってEAEに対する防御を誘発することが実証されてい
る。本実施例において、Ｖ_β８配列の39〜59残基に対応
し且つ第二の相補性決定領域を含む同一のTCRペプチド
は、EAEを治療する場合に極めて有効であることを実証
する。

TCR V_β８（39〜59）ペプチドは、中程度のEAEのラッ
トに対して完全フロイントアジュバント中で皮下に与え
られた場合、疾患の進行を停止させ且つ疾患の経過を有
意に短縮した。TCRペプチドを耳の皮内に与えた場合、
その効果は１日遅れたが、再度、一層速く臨床的徴候の
緩和を導いた。処置されたラットからのMBPで選択され
たＴ細胞系はMBPに対して十分に反応しなかったが、TCR
ペプチドに対する反応性を保持し且つ正常の被験動物に
転移することができなかった。TCRペプチドの迅速な臨
床的効果により、EAE発生に対する応答を誘発した既存
の調節ネットワークの刺激が示唆された。この概念を支
持するものとして、EAEを経験している未処置ラットに
おけるTCRペプチドのＴ細胞認識について本実施例で直
接の根拠を示す。

A.材料および方法 被験動物：雌のルイスラット、６〜８週令を、ハーラ
ン・スプラーク・ドーリー（Harlan Spraque Dawley）
（インディアナ州、インディアナポリス）から入手し
た。ラットを、米連邦および研究機関のガイドラインし
たがってポートランドVAMC動物供給機関（Portland VAM
C Animal Resource Facility）で飼育し且つ維持した。

抗原:GP−MBPまたはRt−MBPを、アイラーの方法［ア
イラー・イー・エイチ（Eylar.E.H.）ら、J.Biol.Che
m.，246:5770（1971）］にしたがって抽出し且つ精製し
た。残基１〜37、43〜89および90〜169を包含するGP−M
BPの酵素による開裂断片と、残基72〜89に対応するGP−
MBPの合成ペプチドと、TCR V_β８およびTCR V_β14の残
基39〜59に対応する合成ペプチドとを、従来記載された
ように合成し且つ精製した［ヴァンデンバーク・エイ・
エイ（Vandenbark,A.A.）ら、Nature，341:541（198
9）；アイラー・イー・エイチら、J.Biol.Chem.，246;5
770（1971）］。これらのペプチドは、高速液体クロマ
トグラフィー分析により90％を越える純度であった。

臨床的プロトコル:EAEは、全実験において、熱殺菌し
たヒト型結核菌（M.tuberculosis）H37RA［ディフコ（D
IFCO）、ミシガン州、デトロイト］100μｇを含む完全
フロイントアジュバント中GP−MBP50μｇを一方の後足
蹠に１回皮下（s.c.）注射することによって誘発させ
た。予防プロトコルにおいて、ラットに、EAEの誘発の4
0日前に、ヒト型結核菌100μｇを含むCFA中、TCR V_β８
−39〜59またはTCR V_β14−39〜59を100μｇ用いて一方
の後足蹠に皮下注射した。抑制プロトコルにおいて、TC
Rペプチドを、GP−MBPによる刺激と同時に（耳の皮下
に、CFA中で100μｇまたは皮内に、生理食塩水0.1ml中5
0μｇ）、刺激後７日目（皮内）または11日目（皮内）
に注射した。処置プロトコルにおいて、TCRペプチド
を、皮下にCFA中でかまたは耳の皮内に、EAEの臨床的徴
候が示された第一日目（通常、GP−MBPによる刺激後12
日目）に与えた。被験動物のEAEの臨床的徴候につい
て、０〜４の等級基準、但し、０は、徴候なし;1は、柔
弱な尾;2は、後足の弱さ、運動失調;3は、後４分の１の
麻痺;4は、前および後の４分の１の麻痺、瀕死状態；を
用いて毎日記録した。処置群を、最大限の疾患の苛酷さ
および臨床的徴候の期間の差異について、スチューデン
ト不対ｔ検定によって対照群と比較した。遅延型過敏症
反応を、抗原50μｇを皮内に注射して24時間後および48
時間後の耳の膨化検定によって測定した［オフナー・エ
イチ（Offner,H.）ら、J.Exper.Med.，170:355（198
9）］。GP−MBP特異性Ｔ細胞系は、従来記載されたよう
に、TCRペプチド処置ラットおよび非処置ラットから選
択された（ヴァンデンバーク・エイ・エイら、J.Immuno
l.，135:223（1985））。1000万個のGP−MBP活性化系細
胞を無経験ラットの腹腔内転移させて、脳炎誘発活性に
ついて試験し、前記に記載したように、活発に誘発され
たEAEについて記録した。

リンパ球の増殖:T細胞の活性化を、³H−Tdyの取り込
みによって測定した。500,000個のリンパ節細胞または2
0,000個の系細胞を、100万個の放射線照射した胸線補助
細胞存在下で、マイクロタイターウェル中の培地および
抗原と一緒に18時間インキュベートした後、0.5μBqの
標識チミジンを加えた。細胞培養物をガス繊維フィルタ
ー上に取出し且つ液体シンチレーション法によって計数
した。平均CPMを３重の培養物から計算した。複製培養
物からの標準偏差（SD）は平均値から10％未満であっ
た。

b.結果 TCRペプチドの、EAEに対する調節効果を評価するため
に、Ｖ_β８−39〜59ペプチド、対照ペプチドＶ_β14−39
〜59または生理食塩水を注射した後、同時にまたはその
前に、脳炎誘発性エマルジョンであるGP−MBP/CFAを注
射した。最も有効な予防プロトコル、抑制プロトコルお
よび処置プロトコルの毎日の平均の臨床的記録を図３〜
５に示し且つ試験した群全部を表15に要約する。

TCR/CFAの臨床的効果 CFA中のＶ_β８−39〜59ペプチドを、GP−MBPによる刺
激の40日前に注射して、臨床的EAEに対する完全な防御
を誘発させた（図３）。更に、CFA中ペプチドを脳炎誘
発性エマルジョンと同時に注射することは、EAEを抑制
し、臨床症状の発生率（処置群の8/13に対して対照では
25/26）、苛酷さ（1.3対3.4の評点）および期間（2.0日
間対6.6日間）を減少させた（図３、表15）。EAE誘発の
40日前にまたは同時に、CFA中のＶ_β14−39〜59ペプチ
ドをまたはCFAのみを注射したラットでは、対照と区別
できないEAEを生じた（表15）。

その治療的効果を評価するために、CFA中のTCR V_β８
−39〜59ペプチドを、第一日目または臨床的徴候の開始
時にラットに皮下注射した。この処置の時点でのラット
は、後足の弱さ、運動失調および失禁を示した（平均等
級1.8）。図３に示すように、TCRペプチド/CFAによる処
置は、臨床的徴候が更に進行するのを妨げ且つEAEの期
間を6.6日間（対照）から3.5日間に短縮した。TCR V_β1
4−39〜59/CFAでまたはCFA単独による処置では、臨床的
EAEに対する効果はまったくなかった（表15）。

皮内投与されたTCRペプチドの臨床的効果 CFAの使用を避けるために、TCRペプチドの生理食塩水
溶液を耳の皮内に投与することのEAEに対する効果につ
いて評価を行った。図４に示すように、TCRペプチド50
μｇを脳炎誘発性刺激と同時に（０日）または刺激後７
日目または11日目に皮内投与することは、いずれもEAE
に対する同様の抑制効果があり、最大限の臨床的苛酷さ
を3.4〜1.7〜1.8に減少し、そしてEAEの期間を6.6日間
〜３〜４日間に短縮した（表17）。

TCRペプチドを、臨床的徴候（平均の臨床的評点1.9）
が最初に示された日に注射した場合、EAEに対する臨床
的効果は第一日目中には観察されなかったが；しかしな
がら、翌日中には、EAEの苛酷さを対照に対して顕著に
減少させた（図５）。TCRペプチドの投与量50μg/ラッ
トでは、更に低いペプチド投与量10μg/ラット（4.0日
間）よりも急速なEAEの緩和が生じ（3.1日間）、対照の
6.6日間と比較された。

臨床的EAEを緩和する場合のTCR V_β８−39〜59ペプチ
ドの迅速な効果により、ペプチドを用いるる処置はTCR
に対する想起反応を刺激して、EAEに対する反応を最初
に誘発することがあるということが示唆された。この可
能性をインビボで実証するのに、（TCRペプチドに対し
て予め暴露することなく）GP−MBP/CFAで誘発されたEAE
を経験しているかまたは回復したラットは、Ｖ_β８ペプ
チドに対して有意のDTH反応を示したが（無経験またはC
FA免疫ラットに匹敵したｐ＜0.01）、Ｖ_β14ペプチドに
対しては反応しなかった（表16）。EAEを経験している
ラットでのＶ_β８ペプチドに対する反応の大きさが、CF
A中TCRペプチドの防御養生法で予め免疫されたラットで
の反応よりも小さかったことは理解できる（表16）。

防御されたラットでのＴ細胞反応 Ｔ細胞反応に対するTCR V_β８ペプチド治療法の効果
を評価するために、GP−MBP/CFA注射部分をドレーニン
グするリンパ節細胞（LNC）の抗原で誘発された増殖に
ついて試験した後、Ｔ細胞系に増殖させた。表17に示す
ように、TCR V_β８−39〜59で処置されたラットからのL
NCは、高水準のバックグラウンド増殖（47,000CPM）並
びにGP−MBPおよび他の試験抗原に対する同様の反応を
示した。GP−MBPで選択されたＴ細胞系（MBP/第一）
は、選択性抗原に対して弱く反応し且つRt−MBPおよびG
P−S72〜89に対しては全く反応しなかった。この系の最
も高い反応はTCR V_β８−39〜59ペプチドに対してであ
った。弱いGP−MBP認識および強いTCR反応により、Ｔ細
胞系がEAEの臨床的徴候を無経験ラットに転移すること
ができなかったことは意外なことではなかった（表1
7）。同様のパターンの高TCR反応並びにGP−MBPおよび
他の抗原に対する低反応性も、TCR V_β８−39〜59で選
択されたＴ細胞系（Ｖ_β8/第一）で観察された（表1
7）。

対照的に、非処置のEAEが回復されたラットからのLNC
は、GP−MBP、Rt−MBPおよびGP−S72〜89に対して予測
可能に反応した（表17）。しかしながら、意外にも、こ
れらのLNCも、TCR V_β８−39〜59ペプチドに対して反応
し、TCR V_β14−39〜59ペプチドに対しては一層少ない
程度に反応した。GP−MBPで選択された場合、得られた
Ｔ細胞系はMBPエピトープに対して強く反応し、そしてT
CR V_β８ペプチドに対する低水準の残りの活性にもかか
わらず、苛酷な臨床的EAEを無経験の被験動物に対して
転移した（表17）。

GP−MBP及びS72−89に対する低レベル反応が持続したけ
れども、TCRV_β８ペプチドでの再選択に関して、このTC
Rペプチドに対する特別な反応が拡大された。TCRV_β14
ペプチドを用いたその後の選択はＶ_β14反応性Ｔセルだ
けを拡大させた。したがって、両TCR−選択された列（l
ines）において、反応パターンは、EAE−回復ラットのL
NからのTCR反応性Ｔセルの存在を立証した。図８に示さ
れるように、強力なDTH及び増殖反応は、反応性TCRペプ
チド/CFAで予め免疫性を与えられた動物中に観察され
た。TCRV_β８−ペプチドに対する重大なDTH及び強力な
増殖反応は、合成ペプチドで免疫性を与えられなかった
EAEから回復しつつあるラット中にも観察され、TCRV_β
８−ペプチドに対する自然調整反応がEAE病状過程の結
果として誘導された。

追加的によく知られたMSモデル（model）は、マウス
中のEAEであり、ラット（rats）に対して、再発する臨
床的進行によって特徴付けられている。６匹のSJL/Jマ
ウスのグループがCFA中においてプロテオリピッド ア
ポプロテイン（proteolipid apoprotein）（PLP）の139
−151ペプチドを注入された。臨床サイン（signs）（15
日）の襲来の最初の日に、そのマウスは、i.v.,i.d.又
はs.q.投与によるTCRV_β17シーケンス（sequnce）の残
りの１−17匹に相当する50μｇの合成ペプチドを受け入
れた。図９に示されるように、TCRのs.q.及びi.d.注入
の両者が苦しさを減少させ、そして初期エピソード及び
再発するEAEにおける病気の存続を短かくした。

C.論考 この実施例は、EAE中のTCRV_βＢ−39−59ペプチドの
治療配剤を明示しており、それはEAEを防止及び抑制す
ることにおけるTCRペプチドの効力を証明する前の実施
例と調和している。TCRペプチドに対するDTH及びリンパ
球増殖反応と同様に、その急速な臨床効果は、TCRV_β８
ペプチドに対するＴセル（cell）反応が合成ペプチドで
故意に免疫性を与えられなかったEAEにかかっているラ
ット中にはすでに存在していないことを示している。

GP−MBPチャレンジ（challenge）前に40日間CFA中で
Ｖ_β８ペプチドで予め免疫性を与えられることが試験さ
れた最も効果的なプロトコル（protocol）であった。こ
の免疫付与期間は保護ＴセルとTCRV_β８ペプチドに対す
る抗体との両方の分化誘導に適していることが明らかで
ある。GP−MBPチャレンジと同時にTCRV_β８ペプチドを
注射することは、免疫性を付与するよりも保護的ではな
いが、このプロトコルは、ラット（表15）の30％（6/1
9）以上においてEAEの全臨床サイン（signs）を依然と
して抑制する。その残りにおいては、EAEの臨床コース
（course）はより短く、且つよりマイルド（milder）で
ある。GP−MBPチャレンジ後であるが臨床EAEの襲来前に
TCRV_β８ペプチドを注射することは効果的であり、4/19
ラット（rats）中のEAEの襲来を完全に防止し、又病気
の苦しさ及びその残り（表15）の期間を一般的に減少さ
せている。

この実施例の驚くべき状況は、病気の動物に注射した
TCRV_β８ペプチドの殆んど瞬時的な臨床効果である。TC
Rペプチド治療を受けた全部のラットは対照（control
s）よりも早くEAEから回復した。CFA中でTCRペプチドを
注射されたものは回復前に臨床的には進行しなかった。
皮内にTCRを注射されたものは、最初の日には進行した
が、TCR/CFAが注射されたラットと同じように早く回復
した。ペプチドの10μｇ及び50μｇ投与は回復を早めた
が、より高い投与はより低い投与より１日早くEAEを解
消した。

TCRペプチド治療は、GP−MBPの脳炎症決定因子に対す
るＴセル（cells）反応を下方調整することにより効果
的であるように見える。GP−MBP−チャレンジされ、TCR
ペプチド処理されたラットからのリンパ節セル（cell
s）は、高レベルの増殖セルを有したが、特別なBP反応
（表17）を有していなかった。しかしながらGP−MBPと
共に選択されたＴセルライン（T cell lines）は、GP−
MBP及びTCRV_β８ペプチドの存在下で増殖したが、TCRV
_β８ペプチドの存在下で増殖しなかったが、これは作働
体（effector）及び調整Ｔセル特性体の存在を示してい
る。このセル混合物がEAEを移動させることが出来なか
ったことは、GP−MBP反応性セル（ネット12,000CPM）又
はS72−89反応性セル（ネット3,000CPM）上のTCRV_β８
反応セル（ネット49,000CPM）の明らかな優性に帰因し
ている。これに対し、最初GP−MBPにチャレンジした
が、TCRV_β８ペプチドで処理されなかったEAE−回復ラ
ットからのLNCは、GP−MBP、Rt−MBP及びS72−89、より
少ない程度でTCRV_β８及びＶ_β14ペプチドを認めた。GP
−MBPで選択されたＴセルライン（T cell lines）は、T
CRV_β８−反応性Ｔセル（ネット9,000CPM）上のGP−MBP
−反応性Ｔセル（ネット84,000CPM）の優性のために、
非常に脳炎症的（encephalitogenic）であった。GP−MB
Pで選択されたライン中のTCRV_β８−ペプチド−反応性
Ｔセルの持続性は、１つの抗原で選択されたＴセルライ
ンが全ての他の抗原に対する反応を典型的に失う点にお
いて幾分通常的でない。クロス−反応性（cross−react
ivity）はGP−MBP及びTCRV_β８ペプチド間で検知され
た。

EAEがMBP/CFAで誘導される時、ルイス（Lewis）ラッ
トは自発的に再発しない。EAEのかかる単一相的な進行
は病気を再発させることに関してTCRV_β８−39−59ペプ
チド治療の試行を行わせないけれども、それはこの作用
における強力な回復メカニズムがTCRV_β８ペプチドに対
する免疫反応を包含しているかどうかを決定する機会を
提供する。MBPのいずれかの脳炎症（encephalitogeni
c）決定因子（72−84又は87−99シーケンス）に感応す
るルイスラットＴセルは、それらのTCR中におけるＶ_α2
/V_β８遺伝子結合を優先的に利用する。生きている或い
はやせ細った脳炎症（encephalitogenic）Ｔセルの注入
は、白痴（idiotypic）及び麦角病的（ergotypic）反応
と同様に、EAEに対する保護を誘発する。EAE期間に誘導
された脳炎症状Ｔセルの増加頻度は、調整ネットワーク
を混乱させる同じ効果を有するかも知れないし、且つこ
のネットワークの少なくとも１部がTCRV_β８−39−59シ
ーケンス（sequence）において自然に向けられる。

現在のデータがこの主張を支持している。TCRV_β８ペ
プチドを与えられた病気の又は回復したラットは小さい
が、このペプチドに対する重大なDTH反応を持っていた
が、対応するＶ_β14（表16）に対するDTHを持っていな
かった。更に、回復したラットからのリンパ節セルはＶ
_β8TCRペプチドによりよく反応し、そしていずれかのペ
プチドに特有のＴセルはインビトロ（in vitro）選択技
術（表17）により富化された。同時に、これらの発見
は、脳炎症状Ｔセルによって表わされたTCRV_β８ペプチ
ドへの免疫性の自然な誘導のための直接的証拠となって
いる。TCRα又はβ鎖（chains）もまた調整セル及び抗
体を誘導するので、これはTCRに関する唯一の重要な優
性ではないかも知れない。TCRV_β８−39−59領域の予防
的、抑制的且つ治療的効果は、EAEの白痴症調整のため
の優性としてその重要性を明らかに示している。

更に、EAEの二相面臨床コース（course）を経験するS
JL/Jマウス用に示されたデータは、臨床的サイン（sign
s）におけるTCRV_β17ペプチドの管理が初期のエピソー
ド（episode）及び再発の両期間中にある症候の苦しさ
及び存続期間を減少させることを示している。これは、
EAEによって発生される自動的免疫性の処理におけるツ
ール（tools）としてTCRV領域のペプチドの重要性に対
する追加的支持を提供する。

実施例Ｘ 髄素塩基性プロテインの免疫優性に反応的な人間Ｔセル
分枝群（clones）の特性 序論 髄素塩基性プロテイン（MBP）は、非常に抗体性であ
り、且つ補薬と共に注入された際に種々の動物種（spec
ies）に実験的な自動的免疫性の脳脊髄炎を引き起して
いる（Alvard,E.C.,Jr.,In Experimental Allergic Enc
ephalomyelitis:A useful model for multiple scleros
is,Alvard,E.C.,Jr.,et al（eds）,Alan R.Liss,Inc.,N
ew York,PP.523−537（1984））。

MBPの脳炎誘発（encephatilogenic）特性は、免疫優
性エピトープ（epitope）（約10）の別個のナンバー（n
umber）内に包囲される。各ストレイン（strain）以内
で、有効なクラスII MHC分子と共同して１つ以上のこれ
らのエピトープ（epitopes）は、中央神経系（CNS）に
帰るCD4＋Ｔ作働体リンパ球を誘導し、興奮しやすい損
害及び神経的機能障害を引き起している（Zamvil,S.S.,
et al.，J.Immunol.139:1075（1987）;Offner,H.,et a
l.，J.Exp. Med. 170:355（1989））。

MHC及び非MHC遺伝子の両方を含む遺伝学のバッククラ
ンドは、MBPエピトープ（epitopes）が脳炎誘発性であ
るが（Beraud,E.,et al.，J.Immunol. 136:511（1986）;
Zamvil,S.S.,et al.，J.Exp.Med. 162:2107（198
5））、その病気の臨床的コース（course）及び苦しさ
（Fritz,R.B.,et al.，J.Immunol. 134:2328（1985）;
Hinrich,D.J.,et al.，J.Exp.Med. 166:1906（1987）;
Linthicum,D.J.,et al.，J.Exp.Med. 155:31（1982）;
Dietsch,G.E.,et al.，J.Immunol. 142:1476（198
9）；Mokhtarian,F., et al.，Nature（London） 30
9:356（1984））、非髄素症（demyelination）（Mekhta
rian,F.,et al.,Nature（London） 309:356（1984））
及び抵抗メカニズム（Bernard,C.C.,Clin.Exp．Immuno
l. 29:100（1977）;Welch,A.M.,et al.，J.Immunol.
125:186（1980）;Varriable,S.,et al.，J.Immunol. 1
25:186（1986）;Whitham.R.H.,et al.，Cell.Immunol．
126:290（1990））に影響を与える。

MBP−特性Ｔセルによって誘導された臨床的且つ組織
学的サイン（signs）のスペクトルは、人間が多様の硬
化症（MS）及び激しく広がった脳脊髄炎（ADE）にかか
る多くの方法に似ている（Paterson,P.Y.,Adv.Immunol.
5:131（1966）：Waksman,B.H., et al.，Proc,Soc.E
xp.Biol.Med 175:282（1984））、その結果、MBPの人
間のＴセルの認知はかなりの興味的なものであった。

MSの病因におけるＴセル（人間MBPにとって特別なも
のも含んでいる）の包含を示唆する一連の証拠がある。
遺伝学的研究は、MSを持った家族間の又は一般に患者間
のＣ領域遺伝子とＴセルレセプター（receptor）Ｖと間
には連関不安定（linkage disequilibrium）を示してい
る。（前記MS:Hauser,S.L., et al. Neurology 39:275
（1989）;Beall,S.S., et al.，J.Cell.Biochem.110:22
3（1987）／前記患者:Oksenberg,J.R., et al.，Proc.N
atl.Acad.Sci.USA86:988（1989））。しかしながら、MB
P−反応性Ｔセルの選択的調整又は除去が病気の進行に
効果があるならば、MSの病原中のMBP−反応性Ｔセルの
実際の包含が証明されることができる。このような選択
的調整はEAE中において現在可能である。

この実施例において、合成TCRペプチドは、有毒なＴ
セル上のTCRに対して向けられた調整Ｔセル及び抗体を
誘導するために使用された。この方法がEAEの誘導を防
止した。更に、前実施例において示されるように、臨床
上の病気ラットにTCRペプチドを投与すると病気の進行
を止め、その回復を早めた。MS患者中の脳炎症状Ｔセル
を調整するためのこの方法を採用することは、人間MBP
の免疫優性に感応する制限された数のTCRV領域遺伝子を
好適に使用するか、或いは使用しないかに依存してい
る。

最後に、MS患者及び対照からのＴセル列（lines）
は、免疫優性のMBPエピトープを認めるＴセルの現出を
許可する方法において選択された。これらの列（line
s）から、109MBP−特性 Ｔセル分枝群（clones）は分
離され、そして表現型（phenotype）、エピトープ特性
（epitope specificity）、MHC制限及びTCRV遺伝子表現
（gene expression）のために特徴付けられた。このデ
ータは、MS患者からのＴセルが普通のドナー（donors）
からのＴセルを認知するよりもより多くの相違するMBP
エピトープを認知することをクロナールレベル（clonal
level）において示している。更に、病気−共働HLA−D
R2/DQW1塩生植物（haplotype）を有する１つのMSドナー
（donor）において、試験された8Tセル分枝群（clone
s）はＶ_β５、２表現型（phenotype）を示し、MBPに感
応する好適なTCRV遺伝子の使用を示している。

A.物質及び方法 ヒト被験者（Human Subjects） この研究において検討されたMS患者は、オレゴン健康
科学大学MS病院に参加した臨床上又実験室で保持された
一定数のMSを持った11人の患者を含んでいた。７人の女
性及び４人の男性（平均年令46、34−67年令範囲）で、
彼らは６−35年間MSを有していた。この患者達は、3.4
±1.6（１−６の範囲）の平均アンビュレイション イ
ンデックス（ambulation index）（AI）及び4.3±2.0
（２−４の範囲）の平均カーツク ディスアビリティ
ステイタス スコアー（kurtzke disability status sc
ore）（KDSS）を有していた（Kurtzke,J.F.,Neurology
15:654（1965））。

通常の個々人は、ベテラン アフェアーズ医学センタ
ー（Veterans Affairs Medical Center）及びオレゴン
健康科学大学からの６人の女性及び３人の弾性従業員
（平均年令36、25−55の年令範囲）を含んでいた。これ
らの通常の個々人は、前述した様な人間MBPに対する積
極的PBL増殖反応に基いて選択された（Vanderbark,A.
A.,et al.，J.Neurosci.Res．23:21（1989））。

全被験者は、オレゴン健康科学大学移植ラボラトリー
によって使用された標準的血清学的方法によるＴセルラ
イン選択にそ及力を有するHLA−型であった。HLAクラス
II相対形質（DR,DQ）の頻発は、DR2（11人の患者の中の
７人−63％がDR2陽性であり、９人の通常人の中の３人
−33％がDR2陽性であった）に対して不ぞろいな分配を
示し、それは一般にこれら２群に対する予期さた発生を
示した（Theofilopoulos,A.N.,in Basic and Clinical
Immunology,Stites.D.P.,et al.，（eds.）,Appleton a
nd Lange Publishers,Los Altas,CA,PP.151−154（198
7））。

抗原：ヒト（Hu−）MBPはスナップ（snap）凍結ヒト
の脳から抽出されそして精製された（Eylar,E.H.,et a
l.，Arch.Biochem.Biophys．132:34（1969））。P1（残
分45−89）、P2（残分１−38）及びP4（残分90−170）
を含むHu−MBPのペプチドは、消化性の分解によって得
られ、そしてセファデックス（Sephadex）イオン交換ク
ロマトグラフおよび高圧液体クロマトグラフによって精
製された（Chou,C.H.−J.,et al.，J.Neurochem. 28:1
15（1977））。Hu−MBPシークエンク13−18、39−54、5
5−74、72−84、87−99、90−109、110−129、130−149
及び149−170に対応する一連の合成ペプチドは、メリフ
ィールド（Merrifield）固体相方法によって合成されそ
して上述の方法によるHPLCによって精製された（Hashi
m,G.A.,et al.，J.Neurosci.Res．16:467（1986））。

Ｔセルライン ヒトのMBP反応性Ｔセルラインは、11人
のMS患者及び前述のスクリーニングテスト（Vandenbar
k,A.A.,et al.，J.Neurosci.Res．23:21（1989））にお
いてHu−MBPに感応性である９人の正常者の血から選択
された。血中の単核の細胞（MNC）はFicoll密度勾配遠
心分離により分離され、そして５％CO₂雰囲気中で37℃
で５日間平底96−ウェルプレートのウェル毎に、セル密
度５×10⁵で完全媒地（10％ヒトのAB血清、Ｌ−グルタ
ミン、ピルビン酸ナトリウム及び抗生物質を含むRPMI）
中で、50μg/ml Hu−MBPで培養された。その刺激された
セルは、活性化されたＴセルを増やすためのIL−２リッ
チ媒地（50μg/ml組換えIL−２、AMGEN Biologicals,Th
ousand Oaks,CA含有）に移された。IL−２中での生長が
遅くなる時、そのＴセルは、1:10（T:MNC）の比で放射
された（4,500ラッド）末梢の血液MNCに含まれた自己の
単核細胞により提供された25μg/ml Hu−MBPで再刺激さ
れた。そのセル数がMBPエピトープ特異性、MHC限定及び
表現型を保持するために十分になるまで、そのＴ−セル
ラインは４〜５回再刺激された。

Ｔ セル クロニング（Cloning） ＴセルクローンはHu−MBPで２回再刺激されたMBP特定
のＴセルラインを限定稀釈することによって得られた。
IL−２富化媒体中で４日間Ｔリンパ表球は、Hu−MBP（5
0μg/ml）、IL−２（50u/ml）及び放射されたMNC（1.5
×10⁶）を含む培養媒体1,10及び30セル/20μｌにまで稀
釈され、そしてそのセル混合物は、60ウエルTarasakiミ
クロテストトレイ（NUNC Inc.,Naperville,IL）（Lamp,
J.R.,et al.，J.Immunol. 128:233（1982））の各ウエ
ルの中に置かれた。ヒトのMBP特異なクローンの回収
は、少なくとも10個のHu−MBP反応性ラインセルが20％
回収率を生じさせるウエル毎の種づけされる時、もっと
も効率的であった。ただ１個のラインセルを、各ウエル
毎に種づけされる時、その回収率は２％であった。その
Tarasakiトレイは、１セル／ウエルで種づけにより再ク
ローン化された。そのTarasakiトレイは７日間37℃及び
５％CO₂で７日間培養された。再刺激のため各ポジティ
ブウエルからのそのセルは、丸底96ウエルプレートの単
一ウエルに移され、その中に25μg/ml Hu−MBP及び２×
10⁵の放射されたMNCを持った完全媒体200μｌを加え
た。IC−250u/mlは、刺激の後第３日目にそのセルに加
えられ、そしてそのセルはさらに４日間IL−２中で保持
された。そのセル数が２〜４×10⁵に達した時、1ml中の
24ウエルプレートに移されそして３×10⁶の自己の放射M
NCの存在においてHu−MBPで再刺激され、そして後にIL
−２リッチ媒体中で増やされた。

増殖検定 セルの感応の特異性は、抗原の不存在及びConA2μg/m
l、Hu−MBP50μg/ml、Hu−MBPフラグメント（P1,P2及び
P4）50μg/ml、Hu−MBPの合成ペプチド50μg/ml及び1/2
00に稀釈されたHerpes Simplexウイルス（HSV）抗原（W
hittaker M.A.Bioproducts,Walkersville,MD）の存在に
おいて96ウエル丸底ミクロタイタープレート中の培養液
中で１×10⁵放射（4500ラド）自己血液MNCで２×10⁴Ｔ
セルを培養することによって三重反復で評価された。ミ
クロタイター培養は、37℃５％CO₂中で３日間培養さ
れ、そして最後の18時間uBq ³H−TdRでパルス化され
た。そのセルは、ガラス繊維フイルター上で収穫され、
そして取り込まれた ³H−TdRは、シンチレーション計
数器を使用して数えられた。増殖は、刺激された培養物
±SD（バックグラウンドは差引いた）のCPMとして表わ
された。バックグランドは200〜2000CPMの範囲であっ
た。MHC限定は、MLA−DP、−DQ又は−DR軌跡（locus）
（抗体はベクトン・デッキンソン・ファーマショーテイ
カル，マウンティイン・ビューCAから売られている）か
らの分子の骨格決定子用の特異な抗体の存在において、
そのＴセル＋Hu−MBP,Hu−MBPフラグメント、又はHu−M
BPの合成ペプチドを培養することによって評価された。

表現型 Ｔセル Ｔセル ライン及びクローンは、上述のごとく（Vand
enbark.A.A.,et al.，J.Neuroimmunol．8:103（198
5））Leu3a（アンチ−CD₄＋Ｔヘルパー）及びLeu2a（ア
ンチ−CD₈＋Ｔ細胞毒素／抑制剤）モノクロナール抗体
ベクトンデイッキンソン）を使用して表現型にされた。
Ｔセルクローンは、ヒトのTCR V_β5.2/5.3（5A）,V_β5.
3（5B）,V_β6.7,V_β8.1,V_β12（DIVERSI−T^m a_B TcR S
creening Panel 1A,T Cell Sciences Inc.,Cambridge,M
A）用の特定のマウスモノクローナル抗体を使用してTCR
VBチェーン遺伝子の表現のために表現型にされた。２
×10⁵Ｔセルは４℃で１時間各抗体の５μｌで培養さ
れ、次いで５％ヒトのABリンパ液を含む媒体で３回洗浄
しそしてFITC結合ヤギ抗マウスIgGで30分間培養した。
２回の洗浄の後、２％ホルムアルデヒドで定着し、その
汚れたセルは、FACScanフロー血球計算器を使用して免
疫蛍光用に評価された。

B.結果 MS患者及び正常者からのHu−MBP特定Ｔセルラインの特
異性 Hu−MBP特異なＴセルラインは11人のMSを持った患者
及びHu−MBPに対し前に証明した増殖感応性を持った９
人の正常者の血液から選択された。各ラインは、全Hu−
MBPでの繰返しの刺激及びIL−２での膨張により３千万
〜５千万血液セルから選択された。げっし動物Ｔセルラ
インの選択における前の経験からこれらの条件は、膨張
及び免疫優性Hu−MBPエピトープへの代表的なＴセル対
応性の焦点合わせを許した。

MS患者及び正常ドナーからのそのＴセルラインは、HS
V抗原（図６）に対する無視できる対応性を持った両方
のHu−MBPおよびConAに十分に等しく対応した。Ｔセル
ラインは、P1（残り45−89）、P2（残り１−38）及びP4
（残り90−170）を含むHu−MBPの全シークエンスをスパ
ーニング（spanning）する高等に精製された酵素分割に
対応のために評価された。11MSラインのうち８ラインは
すべて３つのHu−MBPフラッグメントに対応し、２つの
ラインは、３つのフラッグメントのうち２つに対応しそ
してただ１つのラインが単一のフラッグメントに対応し
た。対照的に９つの正常者のラインのうち５つのライン
は単一のフラッグメントに対応し、３つのラインはすべ
てのフラッグメントに対応しそして１つのラインはどの
フラッグメントにも対応しなかった。その45−89フラッ
グメントに対する回答者の割合はMSグループ対コントロ
ールにおいて十分に大きく、そして平均してそのMS Tセ
ルラインはHu−MBP（図６）の45−89（P1）および１−3
8（P2）のフラッグメントの両方に対し意義ある程度に
十分に反応性であった。しかしながら、90−170（P4）
フラッグメントに対する回数又は等級において相違はな
かった。ヒトのＴセルラインのすべては、CD4＋及びCD8
＋Ｔセルの混合した表現型を持っていた。しかしなが
ら、MS患者からのそのＴセルラインは、正常なドナー
（CD4セル用の78±13％対58±８％;CD3＋セル用の15±
６％対30±12％、表18）に比較してCD4＋の比較的高割
合及びサブポプレーション（subpopulation）の低割合
を有していた。

Hu−MBP特異Ｔセルの選択及び特異性 Hu−MBPの免疫優性のＴセルエピトープの一般的な範
囲はHu−MBPペプチドに対するＴセルラインの反応性パ
ターンから推断できるけれども、Ｔセル認識の証拠は、
クローンの分析から誘導されなければならない。この目
的に対し、７つのＴセルライン（50クローン及び６つの
正常なＴセルライン（59クローン）からの総計109のヒ
トのMBP−特定ＴセルクローンはHu−MBP及びHu−MBPフ
ラッグメント及び合成ペプチドに対応のため評価され
た。そのＴセルドナーはHLA−DR2分布（MS患者86％対正
常者33％がDR2プラスであった（表19参照））のためを
除いて比較可能であった。

ＴセルクローンのすべてはHu−MBPに対応したが、し
かし、両方のグループの類似の対応レベルでHerpes単体
ウイルス（HSV）抗原に対応しなかった。総計におい
て、48Tセルクローン（２つのグループ間に等しく分布
された）はCD4およびCD8マーケット用に表現型にされ
た。これらのうち45クローンはCD4＋であり、そして３
クローン（１つの正常ドナーからの）はCD8＋（表18）
であった。CD4＋クローンのこの優性はラット及びマウ
スにおける前の実験で予測されたが、しかしそのクロー
ンが誘導されたＴセルラインにおいてこれらの部分集合
の相対割合を反映しなかった。

クロナール明細のＴセルラインのパターンへの反映 クロナール分析の有効性を確立するために、そのＴセ
ルクロナール特異性がそのＴセルライン対応をいかに十
分に表わすかを評価することが重要である。比較のため
十分なクローンを生ずるラインにおいて、MBPの明白な
フラッグメントに詳細に対応するクローンの数は、その
親ＴセルラインのHu−MBPフラッグメントに関係した対
応と十分な相互関係を示した（対になったChi Squareテ
スト、Ｐ＜0.05）。

3MSドナーと２正常ドナーからの代表的比較を図７に示
す。Ｔ細胞系統の応答パターンに基づいて、P1及びP2反
応性のクローンは対照系統からよりもMS T細胞系統から
多く選択されるが、P4反応性クローンの頻度は相対的に
等しいと予期された。表19に示すケースが実にそうであ
った。予期に反し、MBP−反応性Ｔ細胞クローン109種の
うち46種はヒト−MBPのどの単一断片にも応答しなかっ
た。ヒト−MBPに対する応答は激しく、背景が1,000−2,
000cpmしかなかったのに対し、10,000−27,000cpmの範
囲であった。この知見は、大部分、単一正常ドナー基準
であるが、MS群よりも正常群のほうが高頻度であった
（表19）。

P4内でのクローン特異性偏奇 ヒト−MBPのP4域はその分子のＣ末端半分を表すが、
ヒト−MBPペプチドに反応性のクローンの約2/3（63中4
1）がこの断片に応答した。エピトープ特異性を同定す
るため、４正常ドナー及び4MSドナーからの23クローン
をP4域の相異なる部分に対応する一連の合成ペプチドに
対する増殖試験に付した。表20に示すように、クローン
分布は、正常ドナーでは110−129配列側に、MSドナーで
は130−149配列側に偏奇した。149−171配列に対する応
答は両群とも同様であり、MSクローンの一種のみが87−
99配列に応答した（表20）。

マルチプルヒト−MBPエピトープを制限可能なHLA−DR2
Is HLA−DR2/DQw1ハプロタイプとMSとの会合は、これら
クラスII分子、特にDR2がCNS自己抗原に対するCD4＋Ｔ
細胞応答を制限するうえに重要な役割を果たすことがで
きることを示唆している。この目的で、3HLA−DR2/DQw1
ドナーからの17種のＴ細胞クローンにより認識されるヒ
ト−MBPエピトープを表21に要約する。全体として、こ
のＴ細胞の組はP2（３クローン）、P1（１クローン）、
P4（８クローン）又はペプチドなし（５クローン）を認
識した。P4内で、1MSクローンが87−99エピトープを認
識し、１正常クローンが110−129エピトープを認識し、
1MSクローンが130−149エピトープを認識し、４クロー
ン（3MS及び１正常）が149−171エピトープを認識し
た。試験したP4−反応性クローン７種のうち７種とも抗
−HLA−DR抗体に対する応答が禁止されたが、これは、D
R2が制限要素であることを明らかに示唆している（表2
1）。MBPに対する制限ヒトＴ細胞応答ではDR座を優勢的
に使用するので、試験しなかった10クローンも大半がDR
2制限されたことはあり得ることである。どの場合も、D
R2がヒトの広範種のヒト−MBPエピトープを制限し得る
ことは明らかである。

ヒト−MBP反応性Ｔ細胞クローンによるTCR Vβ遺伝子の
使用 ラット及びマウスの起脳炎MBP−特異性Ｔ細胞によるT
CR Vα及びＶβの優先使用は、有害なＴ細胞上の共通TC
R配列に対するワクチン接種及び治療戦略を成功に導い
た。しかしながら、ヒトにおける同様の機作がMBP又は
その他の抗原に対する応答においてTCR V遺伝子の制限
された使用に導くかどうかは知られていない。TCR V遺
伝子使用の分析を始めるため、Ｖβ5.2、Ｖβ5.3、Ｖβ
6.7、Ｖβ8.1及びＶβ12に特異的な５モノクローナル抗
体のパネルを用いて、38T細胞クローン（各群から19）
をＶβ遺伝子産生物の発現に関する表現型に分類した。
これらのクローンのうち全てMSドナーからの６クローン
でTCR V遺伝子発現を同定することができた。これらの
クローンのうち２種がＶβ6.7を発現し、他の４クロー
ンはＶβ5.2を発現した。Ｖβ5.2＋クローンのうち、１
種はDR2,4ドナーからのものであり、３種はDR2 ホモ接
合ドナーからのものであった。DR2ホモ接合ドナーから
の１種の追加クローンはＶβ5.2の転移mRNAを発現した
が、これはこの個体中で分析した８種のクローンが、各
々区別されるエピトープ特異性を有するものの、ヒト−
MBPに対する応答において同一のTCR Vβを使用すること
を示している（表22）。

C.議論 本例は、このクローン水準で、MS患者の免疫優勢（im
muno dominant）ヒト−MBPエピトープのＴ細胞認識が、
正常ヒト−MBP応答体よりも複雑且つそれから変更され
たパターンを有することを明らかに示している。これら
のデータは、MS患者のヒト−MBPの免疫原に多く露出す
ると、起脳炎Ｔ細胞の誘起又は永続化の可能性を増大す
ることを示唆している。MS等ヒトの麻痺状態におけるヒ
ト−MBPのＴ細胞認識の潜在的関係は、動物におけるMBP
−反応性Ｔ細胞の潜在的な起脳炎作用及びMS患者の血液
及びCSF中の活性化されたMBP−反応性Ｔ細胞の頻度増加
に照して考察されなければならない。（アングレット
（Allegretta,M）等、Science 247:718（1990）；リン
ク（Link,H.）等、Neurology 40（Suppl.1）:283（199
0））。

本研究で評価したＴ細胞クローンは、免疫優勢エピト
ープに向けられる特異性が出現するようインビトロで選
択されたヒト−MBP特異性Ｔ細胞系統から単離された。
起脳炎抗原決定基は、全MBPによるラット及びマウスＴ
細胞系統の選択時に免疫優勢を示し（ブルデット（Bour
dette,D）等、Cell Immunol.112:351（1988）；ヴァン
デンバーク（Vandenbark,A.A.）等、J.Immunol.135;229
（1985））、Ｔ細胞が免疫優勢のヒト−MBP決定基に対
して許容状態で起脳炎性になり得る可能性もある。本研
究では、Ｔ細胞系統の応答から推定される免疫優勢エピ
トープは、クローン分析により同定された特異性との顕
著な相関を示した（図７）。

上記の結果は、特異性に関する系統データから導かれ
る結論を裏付けるし、選択処法で生き残ったクローンが
その系統内のヒト−MBP応答性Ｔ細胞集団の代表だった
という記録も裏付けている。

しかしながら、このクローンの表現型は、Ｔ細胞系統
が全てかなりの水準のCD8＋Ｔ細胞を含んでいたにもか
かわらず、（単一正常ドナーからの３クローンを除い
て）一様にCD4＋であった。その系統内のCD8＋Ｔ細胞が
ヒト−MBP特異性であったかどうか、或いは培養物に加
えられたIL−２水準が比較的高かったため単に系統内に
運び込まれたものかどうかは明らかではない。しかしな
がら、正常Ｔ細胞系統が一貫してMS系統よりも高率のCD
8＋細胞を含有したことは明らかであった。CD8＋クロー
ンの一種が同じ正常ドナーからのCD4＋クローンのMBP−
誘起増殖を禁止できることは興味あることであり、Ｔ細
胞機能の制御の可能性も与える。このような調節CD8＋
Ｔ細胞は、生体内に多数存在する場合には、正常個体で
ヒト−MBP反応性Ｔ細胞による病気の臨床例が少ないこ
とを説明できるであろう。これらCD8＋Ｔ細胞が臨界水
準にあり且つ付着性サプレッサ細胞の水準が増加するこ
とが（マウスで観察されたものに類似して（ホィットハ
ム（Whitham,R.H.）等、Cell.Immunol.126:290（199
0）））、60％以上の正常ドナーからヒト−MBP特異性Ｔ
細胞系統を選択できなかった理由であろう（ヴァンデン
バーク（Vandenbark,A.A.）等、J.Neurosci.Res.23:21
（1989））。

これとは対照的に、Ｔ細胞系統は80％以上のMS患者か
ら選択することができる。これらの調節細胞タイプは、
別の報告（ハフラー（Haffler,D.A.）等、J.Immunol.13
9:68（1987）；リチャート（Richart,J.P.）等、J.Neur
oimmunol.23:55（1989）；リチャート等、Ann.Neuro
l.、26:342（1989））にあるように、系統選択を先行さ
せずに血液からの希釈を直接制限することによりMBP−
特異性Ｔ細胞クローンを回収する効率に影響を及ぼすと
は予期されないだろう。

MS患者におけるヒト−MBPに対するＴ細胞の応答に
は、正常個体における応答よりも広範な特異性が包含さ
れた（図６）。共通エピトープのほかに、MS患者のＴ細
胞は、MBPのＮ末端半分に対する応答が、その分子のＣ
末端半分にある１以上のエピトープに向かう偏奇応答で
あることを示した。MSドナーと正常ドナーとの応答間で
最も一貫した差異は、P1（残基45−89）に対応する応答
であった。これまでの研究は、MS患者ではヒト−MBP様
物質の免疫反応性断片が脳脊髄液（CSF）中に存在し、
優勢抗原形態は残基45−89にまたがっていることを示し
ている。（ウィテーカー（Whitaker,J.N）、Ｊ.Immuno
l.129:2729（1982））。この断片のCSF中での検出可能
濃度は中枢神経系の傷害後に増加し、これはMS患者のP1
−反応性Ｔ細胞が増加することの可能な説明を与えるも
のである。P2及びP4内の130−149エピトープに対するMS
応答の偏奇も、MHC制限効果を除くことはできないもの
の、脱髄時にヒト−MBPの免疫反応性断片を放出すると
して説明することができよう。動物研究から、MBPによ
る長期の免疫感作がＴ細胞のレパートリーをより優勢度
の低いMHC及びMBPエピトープの組み合わせまで拡大させ
ることは明らかである（オフナー（Offner,H）等、J.Ec
p.Med.170:355（1989））。これらのＴ細胞の追加特異
性は、それらが同一MBPを認識する能力に応じて起脳炎
性であってもなくてもよい。MS患者のヒト−MBP応答性
Ｔ細胞の特異性がより複雑になることは、脱髄時に放出
されるMBPの免疫抗原断片への露出の増加と一致してお
り、MSの長期慢性的な性質は、起脳炎Ｔ細胞特異性の連
続的な誘起又は再刺激に関係すると思われる。

ヒト−MBP反応性Ｔ細胞クローン、特に正常Ｔ細胞系
統のクローンの約40％は、どのヒト−MBP断片にも応答
しなかった。このような応答は、ヒト−MBPの開裂部位
（例えば残基30−55又は80−100）にまたがる結合エピ
トープ（junctional epitopes）、開裂により破裂され
る配座エピトープ（conformational epitope）又は開裂
断片の精製時に失われるヒト−MBPの同形（isoform）若
しくは翻訳後変移体に関係することもあるだろう。これ
らの細胞のヒトにおける機能は明らかではないが、同様
な細胞はEAE−回復ルイス（Lewis）ラットに高頻度（50
％）で存在する。このようなＴ細胞はMBPに対する遅延
型過敏症応答を伝達するが、EAE又はEAEに対する防御を
伝達することはない。

MS及び正常Ｔ細胞クローンの両者における応答は、HL
A−DRにより専ら制限されたが、所与のDR対立遺伝子と
任意の特異的エピトープとの間に強い会合は見出されな
かった。MS患者に見出されるHLA−DR2はヒト−MBPのマ
ルチプルエピトープを制限することができたし、幾つか
のHLA−DR対立遺伝子は一部のエピトーブ（例えば149−
171）を制限することができた。これまでのＴ細胞系統
の研究では（チャウ（Chou,Y.K.）等、J.Nerosei.Res.2
3:207（1989））、HLA−DR対立遺伝子はヒト−MBPエピ
トープ特異性Ｔ細胞応答で26/33の割合で制限され、一
方のHLA−DQは患者のみ6/33の応答で制限され、HLA−DP
は単一正常ドナーのP2の応答に対して制限されると報告
されている。

このＴ細胞クローンに関するデータは、ヒト−MBP認
識に及ぼすHLA−DR分子の圧倒的な制限機能を確認する
ものであり、かつまた、未定にHLA−DP対立遺伝子（相
異なる正常ドナーからのもの、DR7,?/DQw2,3）が３個体
のクローンにより認識されるヒト−MBP1−38域内のエピ
トープを制限する能力を確認するものである。しかしな
がら、HLA−DQで制限されるクローンは見出されなかっ
た。

ヒトのＴ細胞応答を調節するためTCRVβペプチドを使
用することに関する主な問題は、MBP−特異性Ｔ細胞が
限られた組のＶ遺伝子を使用するか否かである。本デー
タは、TCRVβレパートリーの約1/10のみに特異的な抗体
を用いたものであるが、MSドナーからのクローン38種に
対し６種が陽性であると同定した。慢性進行性MSの−HL
A−DR2/HQw1ホモ接合ドナーでは、相異なるヒト−MBPエ
ピトープに特異的なＴ細胞クローン８種のうち４種がＴ
レセプタ中の同一Ｖβ5.2遺伝子を発現した（PcRにより
全ての表現型でＶβ5.2陽性のクローンであると確認さ
れた）。これは、先ずは、ヒト−MBPに対する応答でヒ
トがTCR V遺伝子を使用する際に偏奇があることを示唆
している。別のヒト−MBPエピトープに対する応答で同
じTCR V域遺伝子を使用することは、ラット及びマウス
におけるMBP応答と同様であり、TCRの選択がエピトープ
によるものでないことを示している。

この観察の実用的に重要な意味の一つは、MBP反応性
クローンのエピトープ特異性を定めなくてもTCRレパー
トリーにおける偏奇を確認できることである。表23は、
ヒトMS患者のMBP−特異性Ｔ細胞クローンが、そのTCR V
β遺伝子を使用する際にはねじれ舟形配座にあることを
示すPcRデータを与えるものである。MS患者及び正常ド
ナーのヒトMBPに特異的な各Ｔ細胞クローンから全mRNA
抽出し、再配列されたTCR VβメッセージをPcRにて増幅
し、特異的プローブにより同定した。MBP−特異性Ｔ細
胞クローンによりMSドナーMS−１及びMS−２ではＶβ5.
2が優先使用されること及び正常ドナーＮ−１ではＶβ1
4が有線使用されることが証明された。これは、ヒトもM
BP等の自己抗原に対するＶ域遺伝子と優先的に応答する
という結論を更に支持するものである。

結論:BP−特異性Ｔ細胞クローンは、そのTCR Vβ遺伝子
使用の際にはねじれ舟形になり、MSクローンによるＶβ
5.2の発現は18/24の割合で生起する。

以上、本発明を詳細に説明してきたが、本発明の精神
及び範囲から逸脱する事なく、かつまた、過度の実験を
行わなくても、広範囲にわたる均等なパラメータ、濃度
及び条件内で本発明を実施できることは当業者の理解す
るところであろう。

特定実施態様を用いて本発明を説明してきたが、更な
る変更が可能であることも了解されるであろう。本願
は、一般に本発明の原理に従う本発明の変法、使用又は
適用も含むものであり、本発明が関連する技術分野の常
法に属するような本開示からの逸脱及び特許請求の範囲
に示す前記の本質的に適用可能な本開示からの逸脱も包
含するのである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 29/00 29/00 １０１ １０１ 43/00 １０１ 43/00 １０１ Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｔ細胞媒介性疾患からの防御を誘発するこ
   とができるペプチドであって、前記ペプチドはＴ細胞リ
   セプターの第二補体決定領域のアミノ酸配列を有する15
   −30アミノ酸を有し、ただし、前記ペプチドは次の配
   列： からなるものではないことを特徴とするペプチド、また
   はその化学的誘導体。
2. 【請求項２】別のペプチドまたは蛋白質に連結されてい
   る、請求項１記載のペプチド。
3. 【請求項３】担体または抗体に結合されている、請求項
   １記載のペプチド。
4. 【請求項４】前記疾患が自己免疫疾患である、請求項１
   記載のペプチド。
5. 【請求項５】前記自己免疫疾患が、関節リューマチ、ア
   ジュバント関節炎、重症筋無力症、脳脊髄炎、多発性硬
   化症、甲状腺炎、糖尿病、炎症性腸疾患および全身性紅
   斑性狼瘡からなる群より選択される、請求項４記載のペ
   プチド。
6. 【請求項６】前記疾患が悪性の疾患である、請求項１記
   載のペプチド。
7. 【請求項７】前記悪性の疾患がＴ細胞リンパ腫である、
   請求項６記載のペプチド。
8. 【請求項８】ヒトマーカーＴ細胞リセプターに対応する
   アミノ酸配列を有する、請求項１記載のペプチド。
9. 【請求項９】Ｔ細胞媒介性疾患からの防御を誘導するた
   めの医薬組成物であって、請求項１−８のいずれかに記
   載のペプチドを含む組成物。
10. 【請求項１０】Ｔ細胞媒介性疾患を予防または治療する
    ためのワクチンを製造する方法であって、 （ａ）前記疾患を有すると疑われる個人から取り出した
    Ｔ細胞を用意し； （ｂ）工程（ａ）の前記Ｔ細胞を自己抗原調製物の存在
    下で培養して増やし； （ｃ）工程（ｂ）で増やした前記Ｔ細胞により発現され
    るＴ細胞リセプターのアミノ酸配列を同定し； （ｄ）前記Ｔ細胞リセプターの第二補体決定領域のアミ
    ノ酸配列を有する15−30アミノ酸を有するペプチドを合
    成し、ただし、前記ペプチドは次の配列： からなるものではなく；そして （ｅ）工程（ｄ）のペプチドを薬学的に許容される助剤
    と混合する； の各工程を含む方法。
11. 【請求項１１】前記ペプチドが別のペプチドまたは蛋白
    質に連結されている、請求項10記載の方法。
12. 【請求項１２】前記ペプチドが担体または抗体に結合さ
    れている、請求項10記載の方法。
13. 【請求項１３】前記疾患が自己免疫疾患である、請求項
    10記載の方法。
14. 【請求項１４】前記自己免疫疾患が、関節リューマチ、
    アジュバント関節炎、重症筋無力症、脳脊髄炎、多発性
    硬化症、甲状腺炎、糖尿病、炎症性腸疾患および全身性
    紅斑性狼瘡からなる群より選択される、請求項13記載の
    方法。
15. 【請求項１５】前記疾患が悪性の疾患である、請求項10
    記載の方法。
16. 【請求項１６】前記悪性の疾患がＴ細胞リンパ腫であ
    る、請求項15記載の方法。