JP2009034108A - 治療用結合性分子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 医薬として有用である、少なくとも1個の抗原結合部位を含む分子、例えばキメラまたはヒト化抗体を見いだした。
【選択図】なし
Description
図1は、「候補mAb」による一次MLRの阻害が0.001および10μg/ml間の範囲において用量依存的であることを示す。「濃度」は「候補mAb」の濃度である。
我々は、以後、「CD45RO/RB結合性分子」とも称する、CD45ROおよびCD45RBに結合するポリペプチド配列を含む結合性分子を見出した。本発明によるこれらの結合性分子は、免疫抑制を誘導し、一次T細胞応答を阻害し、そしてT細胞寛容を誘導し得る。さらに、本発明結合性分子は、一次混合リンパ球応答(MLR)を阻害する。好ましくはCD45RO/RB結合性分子で処理した培養物から誘導された細胞はまた、二次MLRにおけるCD45RO/RB結合性分子の不存在下でさえ二次MLRでの充分に機能を果たさない増殖応答を有する。二次MLRにおける充分に機能を果たさない上記増殖応答は、本発明結合性分子の寛容誘導能力の指標である。さらに、ヒトPBMCによる注射後に異種GVHDを発現している重症複合免疫不全症(SCID)マウスにCD45RO/RB結合性分子をインビボ投与すると、循環しているヒトT細胞は依然としてCD45RO/RB結合性分子処理マウスから検出され得るが、対照処理マウスと比べてマウスの生存期間が延長され得る。
1)CD45分子のAおよびBエピトープを含むが、Cエピトープを含まず、および/または
2)CD45分子のBエピトープを含むが、AおよびCエピトープを含まない
CD45イソ型、および/または
3)CD45分子のA、BまたはCエピトープのいずれも含まないイソ型
に結合する。
1)CD45分子のA、BおよびCエピトープの全て、および/または
2)CD45分子のBおよびCエピトープの両方を含むが、Aエピトープを含まない
CD45イソ型には結合しない。
1)記憶およびインビボアロ活性化T細胞を認識し、および/または
2)ヒトT細胞、例えばPEER細胞におけるその標的に結合し、ただし、上記結合は、好ましくはKd<15nM、さらにこのましくはKd<10nM、最も好ましくはKd<5nMを伴うものとし、および/または
3)インビトロアロ反応性T細胞機能を阻害し、ただし好ましくは約5nMのIC50、さらに好ましくは約1nMのIC50、最も好ましくは約0.5nMまたはさらには0.1nMのIC50を伴い、および/または
4)インビトロでアロ抗原−特異的T細胞寛容を誘導し、および/または
5)有効量で投与されたとき、ヒトPBMCの注射によりSCIDマウスで誘導された致命的な異種移植片対宿主病(GvHD)を阻止する。
a)配列中に超可変域CDR1、CDR2およびCDR3を含み、CDR1がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)を有し、CDR2がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)を有し、そしてCDR3がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)を有する第1ドメイン、および
b)配列中に超可変域CDR1'、CDR2'およびCDR3'を含み、CDR1'がアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ)を有し、CDR2'がアミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS)を有し、そしてCDR3'がアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT)を有する第2ドメイン
を含むものである分子、例えばおよびその直接均等内容物を提供する。
−配列番号9のポリペプチドおよび配列番号7のポリペプチド、
−配列番号9のポリペプチドおよび配列番号8のポリペプチド、
−配列番号10のポリペプチドおよび配列番号7のポリペプチド、または
−配列番号10のポリペプチドおよび配列番号8のポリペプチド
を含むヒト化抗体を提供する。
−CDR1のアミノ酸配列をコード化する、GGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTG、
−CDR2のアミノ酸配列をコード化する、TTCTTCTGAGTCTATCTCTGG、
−CDR3のアミノ酸配列をコード化する、ACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTT、
−CDR1'のアミノ酸配列をコード化する、TTATATTATCCACTG、
−CDR2'のアミノ酸配列をコード化する、TTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG、
−CDR3'のアミノ酸配列をコード化する、AGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTG、
−配列番号1、すなわち本発明mAbの軽鎖の可変域のポリペプチドをコード化する配列番号5、
−配列番号2、すなわち本発明mAbの重鎖の可変域のポリペプチドをコード化する配列番号6、
−配列番号9、すなわち本発明によるCDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変域のポリペプチドをコード化する配列番号11、
−配列番号10、すなわち本発明によるCDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変域のポリペプチドをコード化する配列番号12、
−配列番号7、すなわち本発明によるCDR1'、CDR2'およびCDR3'を含む軽鎖可変域のポリペプチドをコード化する配列番号13、
−配列番号8、すなわち本発明によるCDR1'、CDR2'およびCDR3'を含む軽鎖可変域のポリペプチドをコード化する配列番号14。
配列番号5のポリヌクレオチドおよび/または好ましくは配列番号6のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、および
配列番号7または配列番号8のポリペプチドおよび配列番号9または配列番号10のポリペプチドをコード化する、例えば
−配列番号7のポリペプチドおよび配列番号9のポリペプチド、
−配列番号7のポリペプチドおよび配列番号10のポリペプチド、
−配列番号8のポリペプチドおよび配列番号9のポリペプチド、または
−配列番号8のポリペプチドおよび配列番号10のポリペプチド、
をコード化するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、および
配列番号11または配列番号12のポリヌクレオチドおよび配列番号13のポリヌクレオチドまたは配列番号14のポリヌクレオチドを含む、好ましくは
−配列番号11のポリヌクレオチドおよび配列番号13のポリヌクレオチド、
−配列番号11のポリヌクレオチドおよび配列番号14のポリヌクレオチド、
−配列番号12のポリヌクレオチドおよび配列番号13のポリヌクレオチド、または
−配列番号12のポリヌクレオチドおよび配列番号14のポリヌクレオチド
を含むポリヌクレオチド
を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
−本発明ポリヌクレオチドを含む発現系(上記発現系またはその一部が適格宿主細胞に存在するとき、上記発現系またはその一部は本発明CD45RO/RB結合性分子を生産し得る)
および
−上記発現系を含む単離された宿主細胞
を提供する。
以下の実施例により本発明に関する理解がさらに深められるはずである。しかしながら、それらは発明の範囲を制限するものと見なされるべきではない。以下の実施例において、温度は全て摂氏である。
ELISA:固相酵素免疫測定法
FACS:蛍光活性化細胞選択装置
FITC:フルオレセインイソチオシアネート
FBS:胎児牛血清
GVHD:移植片対宿主病
HCMV:ヒトサイトメガロウイルスプロモーター
IgE:免疫グロブリンイソ型E
IgG:免疫グロブリンイソ型G
PBS:リン酸緩衝食塩水
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
xGVHD:異種移植片対宿主病
細胞
血液試料を健康なヒトドナーから入手する。末梢血単核細胞(PBMC)を、血液型は既知であるが、HLA型は未知である全末梢血、ロイコフェレーシスまたはバフィーコートからの白血球からフィコル−ハイパーク(ファルマシアLKB)での遠心分離により分離する。MLR実験の中には、40Gyでの照射後PBMCを抗原細胞として直接使用する場合もある。他の実験では、CD2またはCD3ダイナビーズ(ダイナール、オスロ、ノルウェー)を用いることにより、T細胞をPBMCから枯渇させる。ビーズおよび汚染細胞を磁場により除去する。T細胞枯渇PBMCを照射後抗原細胞として使用する。
また、キメラ抗CD45RO/RB mAb「候補mAb」およびイソ型マッチ対照キメラ抗体を生成する。KLH(キーホール・リンペットヘモシアニン)または組換えヒトIL−10に特異的なマウス(ヒト)対照IgG1抗体をBDファーミンゲン(サンディエゴ、カリフォルニア)から購入する。抗ヒトCD154 mAb 5c8は、Lederman et al(1992)によるものである。
1×105PBMCまたは5×104のCD3+またはCD4+細胞のアリコートを、示されたmAbの存在下またはAbの不存在下で96ウェル培養プレート(コスター、ケンブリッジ、マサチューセッツ)の各ウェル中1×105照射PMBCまたは5×104T細胞枯渇照射(50Gy)PBMCと混合する。幾つかの実験では、Fc部分に特異的なヤギ抗マウスIgまたはヤギ抗ヒトIgのF(ab')2フラグメント(ジャクソン、イムノリサーチ、ウエストグローヴ、ペンシルベニア)を候補mAbに加えて10μg/mlで加えることにより、標的CD45分子の最適なインビトロ架橋を確実にする。混合細胞を5%CO2中37℃で4または5日間培養し、培養の最後の16〜20時間3H−チミジンを細胞に適用することにより増殖を測定する。他の実験も上記実験と同様に行うが、ただし以下の例外を伴う:1)使用培地は、10%FBSおよび1%ヒト血漿含有EX−VIVO(バイオ−ウイタッカー)である;2)抗マウス全IgG(5μg/ml)を2次架橋工程として使用する;3)抗原細胞の照射は60Gyである。
「候補mAb」が特異的アロ抗原に対するCD4+T細胞の非応答性を誘導するか否かを評価するため、一次MLC後に抗体の不存在下で二次MLRを遂行する。CD4+T細胞を、10日間96ウェル培養プレート中指示抗体の存在下で照射同種異系抗原細胞(T細胞枯渇PBMC)と培養する(一次MLC)。次いで、細胞を集め、フィコル−ハイパーク勾配上で層状に重ねて死んだ細胞を除去し、RPMIで2回洗浄し、同じ抗原細胞、第3者抗原細胞またはIL−2(50U/ml)で再刺激する。細胞を3日間培養し、培養の最後の16〜21時間細胞に3H−チミジンを適用することにより、増殖性応答を測定する。
SCIDマウスにおけるhu−PBLの移植
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、SCIDマウスCB17/GbmsTac−PrkdcscidLystbgマウス(タコニック、ジャーマンタウン、ニューヨーク)へ、細胞移入後4週間以内に90%を越えるマウスにおいて致命的な異種移植片対宿主病(xGvHD)を誘発するのに充分な量で腹腔内注射する。以後、上記処理SCIDマウスをhu−PBL−SCIDマウスと称す。
0日目、PBMC注射直後、3日目、7日目そしてその後1週間間隔でhu−PBL−SCIDマウスを「候補mAb」またはマウスまたはキメライソ型マッチmAb対照により処理する。Mabを100μlのPBS中体重1kg当たり5mg/kgの最終濃度で皮下送達させる。全対照マウスが死亡した時点で処理を停止した。
この試験における「候補mAb」の効果を評価する主たる基準は、hu−PBL−SCIDマウスの生存であった。Systat v9.01ソフトウエアの支援により対数ランク試験(マンテル法)を用いる統計的生存分析方法により結果の有意性を評価する。生存分析方法はノンパラメトリック試験であり、特定マウスがまだ生きているかどうかだけでなく、それが処理/病気とは関連性の無い理由、例えばその臓器/細胞によるインビトロ分析の遂行に必要とされる理由から殺されたか否かを考慮する。肝臓、肺、腎臓および脾臓のバイオプシーを死んだマウスから入手することにより、さらに評価を行う。さらに、hu−PBL−SCIDマウスを、実験開始時(細胞移入前)および終始(二日毎に)それらの健康状態の間接的評価として秤量する。各マウスから得た体重対PBMC移入後の日数値を用いて一次回帰線を作成し、それに続いて、ノンパラメトリックのマン-ウイットニー試験を用いてそれらの傾き(対照対抗CD45処理マウス)を比較した。
マウスmAb対照で処理したhu−PBL−SCIDマウスは全て、肺、肝臓および脾臓でヒト白血球を浸潤させており、細胞移入後約2〜3週間以内に死亡した(4/4)。死亡は、xGvHDの起こりがちな結果である。さらに対照mAb処理マウスは3週間以内に、約10%およびそれ以上の割合で直線的に体重を減らしていた。
配列番号7、配列番号8、配列番号9または配列番号10を含むヒト化抗体の発現
図2〜5で示されたプラスミド地図による発現ベクターで、それぞれヒト化軽鎖可変域humV1(配列番号7)、ヒト化軽鎖可変域humV2(配列番号8)、ヒト化重鎖可変域VHE(配列番号9)またはヒト化重鎖可変域VHQ(配列番号10)のアミノ酸配列をコード化する対応するヌクレオチドを含むものを構築する。これらの発現ベクターは、配列番号15、配列番号16、配列番号17または配列番号18の各DNA(ヌクレオチド)配列を有する。
バージョンVLhおよびVLmについてのヒトカッパ軽鎖発現ベクター
ヒトカッパイソ型の完全ヒト化軽鎖をコード化する最終発現ベクターを構築するために、完全軽鎖可変域(VLhおよびVLm)をコード化するDNAフラグメントを、HindIIIおよびBgIIIを用いてVLhおよびVLm含有PCR−Scriptクローニングベクター(ストラタジーン)(VLm領域)から切除した。次いで、ゲル精製フラグメントを、ヒト化抗IgE抗体TESC−21(Kolbinger et al、1993)の構築中に作製され、もともとM.Bendigから受けた(MRCコラボレイティブ・センター、ロンドン、イギリス国)(Maeda et al.1991)C21−HCMVカッパ発現ベクターのHindIIIおよびBamHI部位へサブクローニングした。ライゲーション生成物を、フェノール/クロロホルム抽出により精製し、電気共穿孔コンピテントのエピキュリアン・コリ(登録商標)XL1−ブルー株(カタログ番号#200228、ストラタジーン)へ電気穿孔した。LB/amp寒天プレートにおいて一晩37℃で培養後、各12コロニーを選び取り、バイオロボット9600(キアゲン)を用いて、3ml培養物からプラスミドDNAを調製した。図面でさらに記載されているように、この結果、ヒト化抗体バージョンVLhおよびVLmについての軽鎖発現ベクターがそれぞれ得られた。
VHQ発現ベクターを構築するため、段階的方法を採った。まず、Kolbinger et al 1993(Protein Eng.1993年11月;6(8):971−80)に記載の方法論にしたがってPCRによりVHQの完全可変域を組立て、同酵素を用いてC21挿入体が除去されたC21−HCMV−ガンマ−1発現ベクターへサブクローニングした。次いで、完全可変域を含むPCRScriptクローンVHQのHindIII/BamHIフラグメントを、同酵素により開裂された発現ベクターC21−HCMV−ガンマ−1中へサブクローニングした。これにより、ヒト化抗体バージョンVHQについての最終発現ベクターが得られた。
ヒトガンマ−1イソ型の完全ヒト化重鎖をコード化する最終VHE発現ベクターの構築は、可変域をコード化するHindIIIおよびBamHI制限PCRフラグメントを、ヒト化抗IgE抗体TESC−21(Kolbinger et al、1993)の構築中に作製され、またもともとM.Bendigから受けた(MRCコラボレイティブ・センター、ロンドン、イギリス国)(Maeda et al.1991)C21−HCMVガンマ−1発現ベクターのHindIIIおよびBamHI部位へ直接ライゲーションすることにより達成された。
以下のトランスフェクションプロトコルを、スーパーフェクト(登録商標)トランスフェクション試薬(カタログ番号301305、キアゲン)を用いて、150mm細胞培養皿において接着性COS細胞に適合化させる。上記4種の異なる発現ベクターを、細胞の一時的トランスフェクションに使用する。ヒト化抗体を発現させるため、重鎖挿入体を含む2つのクローン(それぞれVHEまたはVHQ)の各々を、軽鎖をコード化する2つのクローン(それぞれhumV1またはhumV2)の各々と共に、重および軽鎖発現ベクターの全部で4つの異なる組み合わせ(VHE/humV1、VHE/humV2、VHQ/humV1およびVHQ/humV2)で細胞へ共トランスフェクションする。トランスフェクション前、プラスミドを、アンピシリン耐性遺伝子をコード化する領域で開裂する制限エンドヌクレアーゼPvuIにより線状にする。トランスフェクション前日、30mlの新鮮な培養培地中4×106COS細胞を、150mm細胞培養皿に播種する。この細胞密度で播種すると、一般的に24時間後には培養飽和密度の80%に達した。トランスフェクション当日、線状重および軽鎖DNA発現ベクターの4種の異なる組み合わせ(各々15μg)を、全体積900μlの血清および抗生物質を含まない新鮮培地中で希釈する。次いで、180μlのスーパーフェクトトランスフェクション試薬を充分にDNA溶液と混合する。DNA混合物を室温で10分間インキュベーションすることにより、複合体を形成させる。複合体の形成が行われている間、成長培地をCOS細胞培養物から除去し、細胞をPBSで1回洗浄する。次いで、新鮮な培養培地(10%FBSおよび抗生物質含有)9mlを、トランスフェクション複合体を含む各反応管に加え、充分に混合する。最終調製物を即座に4培養物の各々に移してトランスフェクションさせ、静かに混合する。次いで、細胞培養物を37℃で5%CO2中3時間DNA複合体とインキュベーションする。インキュベーション後、トランスフェクション複合体含有培地を除去し、30mlの新鮮な培養培地と交換する。トランスフェクションの48時間後、培養上清を採取する。
ELISAおよびFACS分析のため、重および軽鎖プラスミドによりトランスフェクションしたCOS細胞から集められた細胞上清を以下の要領で濃縮する。各上清10mlを、製造業者の記載に従いセントリプレップYM−50遠心分離フィルター装置(カタログ番号4310、ミリポア)に加える。セントリプレップフィルターを室温で10分間3000rpmで遠心分離する。次いで、5分のみの遠心分離を用い、濃縮の展開を監視しながら上清の残りの20mlにより遠心分離工程を再び反復する。濃縮上清の中間500μlを回収し、新たなミクロコン遠心分離フィルター装置(カタログ番号42412、ミクロコン)に移し、製造業者のプロトコルにしたがってさらに濃縮する。濃縮上清を室温で24分間3000rpmで4回、10分間6000rpmで1回、次いで5分間を3回常に濃縮の展開を監視しながら遠心分離にかける。到達した濃縮条件培地の最終体積は、最初の培養培地の250〜300倍濃度に相当する100〜120μlであり、使用時まで4℃で貯蔵する。比較および対照のため、上記と同じ遠心分離プロトコルを用いて、非トランスフェクション細胞からの培養培地を同様に濃縮する。
培養上清で発現された組換えヒト抗体のIgG濃度を測定するため、サンドイッチELISAプロトコルが開発され、標準としてヒトIgGを用いて最適化された。平底96ウェルのマイクロタイタープレート(カタログ番号4−39454、ヌンク・イムノプレート・マキシソープ)を、4℃で一晩100μlのヤギ抗ヒトIgG(全分子、カタログ番号l1011、シグマ)によりPBS中0.5μg/mlの最終濃度でコーティングする。次いで、ウェルを洗浄緩衝液(0.05%トウィーン20含有PBS)で3回洗浄し、37℃で1.5時間遮断緩衝液(PBS中0.5%BSA)で遮断する。3洗浄サイクル後、抗体試料および標準ヒトIgG(カタログ番号14506、シグマ)を、遮断緩衝液中系列1.5倍希釈により調製する。100μlの希釈試料または標準をデュプリケイトでコーティングしたプレートに移し、室温で1時間インキュベーションする。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、それに続いて1時間遮断緩衝液中で1/4000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲートヤギ抗ヒトIgGカッパ−軽鎖(カタログ番号A−7164、シグマ)100μlとインキュベーションする。対照ウェルには100μlの遮断緩衝液または濃縮通常培養培地を投与した。洗浄後、製造業者の使用説明書にしたがいTMBペルオキシダーゼEIA基質キット(カタログ番号172−1067、バイオ−ラッド)を用いて、試料および標準ウェルで結合したペルオキシダーゼの比色定量を行う。
VHE/humV1上清=8.26μg/ml
VHE/humV2上清=6.27μg/ml
VHQ/humV1上清=5.3μg/ml
VHQ/humV2上清=5.56μg/ml
その細胞表面でCD45抗原を発現したことから、ヒトTセルラインPEERを、FACS分析についての標的細胞として選択する。ヒト化抗体上清の結合親和力を分析するため、レファレンスとしてFITC標識キメラ抗体を用いる競合実験を遂行し、精製マウス抗体およびキメラ抗体の阻害と比較する。PEER細胞培養物を10秒間3000rpmでの遠心分離にかけ、培地を除去する。細胞をFACS緩衝液(1%FBSおよび0.1%アジ化ナトリウム含有PBS)に再懸濁し、1ウェル当たり1×105細胞の細胞密度で96ウェル丸底マイクロタイタープレート中に播種する。プレートを遠心分離にかけ、上清を廃棄する。遮断試験を行うため、まず、25μlの濃縮非トランスフェクション培地またはイソ型マッチ対照抗体(陰性対照)、非標識マウス抗体またはキメラ抗体(陽性対照)並びに様々な組み合わせのヒト化抗体(試料)を含む濃縮上清を、各ウェルへ明細書に示された濃度で加える。4℃で1時間のインキュベーション後、PEER細胞を遠心分離により200μlのFACS緩衝液により洗浄する。それに続いて、細胞を4℃で1時間、20μg/mlの最終濃度で25μlのFACS緩衝液中FITCとコンジュゲートしたキメラ抗体とインキュベーションする。細胞を洗浄し、2μg/mlヨウ化プロピジウム含有FACS緩衝液300μlに再懸濁することにより、生存し得る細胞がゲーティングされ得る。細胞調製物をフローサイトメーターで分析する(FACSカリバー、ベクトン、ディッキンソン)。
この試験では、我々は、CD45RB/RO結合性キメラ抗体が、ポリクローナル活性化一次ヒトT細胞の培養物に存在するとき、(i)特徴的なTreg表現型をもつT細胞の分化を持続させるか、(ii)T細胞活性化後にアポトーシスを阻止または促進するか、そして(iii)再刺激後にサブセット特異的抗原および受容体の発現に影響するか否かという疑問に取り組んだ。
一次T細胞(CD4+およびCD8+Tサブセットの混合物)に対し、CD45RB/RO結合性キメラ抗体の存在または不存在(=対照)下で抗CD3プラス抗CD28 mAb(各々200ng/ml)による活性化を行った。2日目に過剰の抗体を洗浄により除去した。アポトーシスおよび壊死細胞により取込まれるDNA染色染料として7−アミノ−アクチノマイシンD(7−AAD)を用いることにより、活性化後の細胞死を測定した。結果は、CD45RB/RO結合性キメラ抗体の存在下におけるT細胞の活性化により、活性化の2日後には7−AAD陽性細胞のフラクションは2倍を越えて増加したことを示している。7日目、7−AAD陽性細胞の部分は、同じくCD45RB/RO結合性キメラ抗体処理および対照培養物の場合と類似していた。
CD25および陰性調節タンパク質CTLA−4(CD152)の発現増加は、Treg細胞のマーカーである。CD45RB/RO結合性キメラ抗体による一次および二次T細胞応答の機能的抑制は、Treg細胞の誘導に起因し得る。この問題点に取り組むため、T細胞を抗CD3+CD28 mAbにより活性化し、CD45RB/RO結合性キメラ抗体または抗LPS対照mAbの存在下で培養した。CTLA−4およびCD25発現の時間経過は、二次刺激後1および3日目に対照およびCD45RB/RO結合性キメラ抗体処理T細胞間で著しい差異を示す。
かなりの量のCTLA−4もまた細胞内で見出され得ることが報告されている。従って、表面CTLA−4染色と並行して、細胞内CTLA−4発現を分析した。T細胞培養物間の中程度の差異は刺激後4日目に見られた。しかしながら、培養延長後、高レベルの細胞内CTLA−4は、対照T細胞ではなく、CD45RB/RO結合性キメラ抗体処理T細胞でのみ持続された。
刺激後、T細胞は、幾つかの表面受容体、例えばCD25、CD152(CTLA−4)、CD154(CD40−リガンド)などの発現を誘導し、アップレギュレーションする。対照的に、CD4またはCD8の発現レベルは、比較的一定したままであると考えられている。我々は、活性化後対照Ab処理T細胞ではなくCD45RB/RO結合性キメラ抗体処理T細胞に関するCD4およびCD8両抗原の強度の増加を再現可能なものとして観察した。CD4/CD8二重陽性T細胞集団の出現は、CD8+サブセットにおけるCD4および逆にCD4+サブセットにおけるCD8のアップレギュレーションに起因すると思われる。これは、対照培養物における二重陽性T細胞の中程度の低パーセントと対照をなす。
Treg細胞は、CD25、IL−2受容体アルファ鎖について構成的に陽性であることが知られている。Treg細胞におけるトリマーIL−2受容体の他のサブユニットの調節については知られていない。最近、我々は、CD45RB/RO結合性キメラ抗体の存在または不存在下で活性化および伸長されたT細胞におけるIL−2受容体のベータ鎖、例えばCD122の発現を比較した。結果は、CD45RB/RO結合性キメラ抗体処理T細胞が、対照培養物におけるT細胞の場合と比べて約10倍低いCD122発現性を有することを示している。この差異は、Treg細胞が増殖するためにIL−2以外の因子を必要とすることを示し得る。
発現ベクターHCMV−G1 HuAb−VHQのヌクレオチド配列
(3921〜4274の配列番号12(VHQ)を含むヒト化重鎖発現ベクターの完全DNA配列)
Claims (27)
- 配列中に超可変域CDR1、CDR2およびCDR3を含み、CDR1がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)を有し、CDR2がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)を有し、そしてCDR3がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)を有する、少なくとも1個の抗原結合部位を含む結合性分子。
- a)配列中に超可変域CDR1、CDR2およびCDR3を含み、CDR1がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)を有し、CDR2がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)を有し、そしてCDR3がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)を有する第1ドメイン、および
b)配列中に超可変域CDR1'、CDR2'およびCDR3'を含み、CDR1'がアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ)を有し、CDR2'がアミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS)を有し、そしてCDR3'がアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT)を有する第2ドメイン
を含む、請求項1記載の結合性分子。 - キメラまたはヒト化モノクローナル抗体である、請求項1または2のいずれか1項記載の結合性分子。
- 配列番号1のポリペプチドおよび/または配列番号2のポリペプチドを含む、請求項1または2のいずれか1項記載の結合性分子。
- 配列番号3のポリペプチドおよび/または配列番号4のポリペプチドを含む、請求項1または2のいずれか1項記載の結合性分子。
- キメラモノクローナル抗体である、請求項4または5のいずれか1項記載の結合性分子。
- 配列番号9または配列番号10のポリペプチドおよび配列番号7または配列番号8のポリペプチドを含むヒト化抗体である結合性分子。
- −配列番号9のポリペプチドおよび配列番号7のポリペプチド、
−配列番号9のポリペプチドおよび配列番号8のポリペプチド、
−配列番号10のポリペプチドおよび配列番号7のポリペプチド、または
−配列番号10のポリペプチドおよび配列番号8のポリペプチド
を含むヒト化抗体である結合性分子。 - 請求項1〜8のいずれか1項記載の結合性分子をコード化するポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド。
- 請求項2記載のCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列をコード化する請求項9記載のポリヌクレオチドおよび/または請求項2記載のCDR1'、CDR2'およびCDR3'のアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチド。
- 配列番号5のポリヌクレオチドおよび/または配列番号6のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
- 配列番号7または配列番号8のポリペプチドおよび配列番号9または配列番号10のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
- 配列番号11または配列番号12のポリヌクレオチドおよび配列番号13のポリヌクレオチドまたは配列番号14のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
- 請求項9〜13のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 発現系またはその一部が適合性のある宿主細胞に存在するとき、発現系またはその一部は請求項1〜8のいずれか1項記載のポリペプチドを製造し得る、請求項9〜13のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含む発現系。
- 請求項15記載の発現系を含む単離宿主細胞。
- 医薬としての請求項1〜8のいずれか1項記載の分子またはヒト化抗体の使用。
- 自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーの処置および/または予防における請求項17記載の使用。
- 少なくとも1種の医薬上許容される担体または希釈剤と共に請求項1〜8のいずれか1項記載の分子またはヒト化抗体を含む医薬組成物。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載の分子またはヒト化抗体の有効量を処置および/または予防を必要とする対象に投与することを含む、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに伴う疾患の処置および/または予防方法。
- 薬剤におけるCD45ROおよびCD45RBの両方についての結合特異性を有する結合性分子の使用。
- 結合性分子がキメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項21記載の使用。
- 結合性分子がCD45ROイソ型に結合し、その解離定数(Kd)が<15nMである、請求項21または22記載の使用。
- 結合性分椎がCD45RBイソ型に結合し、その解離定数(Kd)が<15nMである、請求項21〜23のいずれかに記載の使用。
- 結合性分子が、
−CD45分子のAおよびBエピトープを含むが、Cエピトープを含まず、および/または
−CD45分子のBエピトープを含むが、AおよびCエピトープを含まない
CD45イソ型、および/または
−CD45分子のA、BまたはCエピトープのいずれか一つを含まないイソ型
に結合する、請求項21〜24のいずれかに記載の使用。 - 結合性分子が、
−CD45分子のA、BおよびCエピトープの全てを含み、および/または
−CD45分子のBおよびCエピトープの両方を含むが、Aエピトープを含まない
CD45イソ型には結合しない、請求項21〜25のいずれかに記載の使用。 - 結合性分子がPEER細胞におけるその標的エピトープに結合し、その結合がKd<15nMを有する、請求項21〜26のいずれかに記載の使用。
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