CN1551919A - 治疗性结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了含有至少一个抗原结合位点的分子，其顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn－Tyr－Ile－Ile－His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr－Phe－Asn－Pro－Tyr－Asn－His－Gly－Thr－Lys－Tyr－Asn－Glu－Lys－Phe－Lys－Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser－Gly－Pro－Tyr－Ala－Trp－Phe－Asp－Thr(SGPYAWFDT);例如还顺次含有高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′,CDR1′具有氨基酸序列Arg－Ala－Ser－Gln－Asn－Ile－Gly－Thr－Ser－Ile－Gln(RASQNIGTSIQ),CDR2′具有氨基酸序列Ser－Ser－Ser－Glu－Ser－Ile－Ser(SSSESIS)，CDR3′具有氨基酸序列Gln－Gln－Ser－Asn－Thr－Trp－Pro－Phe－Thr(QQSNTWPFT)；所述分子为例如嵌合或人源化抗体并可以用作药物。

Description

治疗性结合分子
发明领域
本发明涉及有机化合物，例如与CD45抗原同种型结合的分子，例如单克隆抗体(mAb)。
发明背景
治疗各种疾病的一个方法是，去除或灭活病原白细胞和获得诱导耐受的潜能以灭活病理免疫反应。
据认为，器官、细胞和组织移植排斥和各种自身免疫疾病主要是由被辅助T细胞触发的T细胞介导的免疫反应引起的；辅助T细胞能识别特异抗原(这些抗原被抗原呈递细胞(APC，例如巨噬细胞和树突细胞)俘获、加工并以抗原-MHC复合体的形式呈递给辅助T细胞)，即识别特异抗原后辅助T细胞受刺激将产生细胞因子(例如IL-2)并表达或上调一些细胞因子受体和其他活化分子并进行扩增。这些活化的辅助T细胞中的一些可以直接或间接地起作用，即辅助效应细胞，细胞毒性T细胞或B细胞，以破坏表达选择抗原的细胞或组织。免疫反应终止后，一些成熟的克隆选择细胞以记忆性辅助细胞和记忆性细胞毒性T细胞的形式保存下来，在体内循环，当抗原再次出现时能迅速将其识别。如果触发这个反应的抗原是无毒的环境抗原，结果就是过敏症；如果抗原不是外来抗原而是自身抗原，结果就是自身免疫疾病；如果抗原是来自移植器官的抗原，结果是移植排斥。
免疫系统已经发展成能识别自己和异己。这个特性使得生物体能暴露于病原体的每天威胁在环境中存活。在胸腺中T细胞库的发育过程中，通过正选择和负选择的过程(这也包括自身反应性T细胞的识别和去除)，形成了对异己的特异性和对自身的耐受性。这类耐受被称作中枢耐受。可是，这些自身反应性细胞中的一些可以逃脱这种选择机制并造成自身免疫疾病发生的潜在危险。为了控制逃离到外周的自身反应性T细胞，免疫系统具有防止自身免疫的外周调节机制。这些机制是外周耐受的基础。
被特定单克隆抗体识别的细胞表面抗原通常通过CD(分化簇)号命名，CD号是由连续的国际白细胞分型研讨会指定的，此处用的术语CD45是指细胞表面白细胞共同抗原CD45；识别此抗原的单克隆抗体此处称为“抗-CD45”。
白细胞共同抗原(LCA)或CD45是抗淋巴细胞球蛋白(ALG)的主要成分。CD45属于跨膜酪氨酸磷酸酶家族，是细胞活化的正和负调节物(这取决于与受体的相互作用)。CD45的磷酸酶活性似乎是活化与B和T淋巴细胞的抗原受体有关的Src-激酶家族所必需的(Trowbridge IS等，AnnuRev Immunol.1994；第12卷：第85-116页)。因此，在T细胞活化中，CD45是信号1所必需的，CD45缺陷细胞在TCR介导的活化事件中有严重缺陷。
CD45抗原有不同同种型，包括一个跨膜糖蛋白家族。不同的CD45同种型区别在于它们的胞外域结构，这起因于编码部分CD45胞外区域的3个可变外显子的选择性拼接。(Streuli MF.等，J.Exp.Med.1987；第166卷：第1548-1566页)。各种CD45同种型有不同的胞外结构域；但有相同的跨膜和胞质片段，有两个同源的、大约有300个残基的高度保守磷酸酶结构域。T和B淋巴细胞亚群上区别性地表达不同的同种型组合(Thomas ML.等，Immunol.Today 1988；第9卷：第320-325页)。有些单克隆抗体识别所有这些不同同种型所共有的表位，而其他单克隆抗体有受限的(CD45R)特异性，这依赖于它们识别哪个选择性拼接的外显子(A，B或C)。例如，识别外显子A产物的单克隆抗体因此标明为CD45RA，识别包含外显子B的各种同种型的单克隆抗体被标明为CD45RB(Beverley PCL等，Immunol.Supp.1988；第1卷：第3-5页)。抗体例如UCHL1选择地与180kDa同种型CD45RO(没有可变外显子A、B或C的任一个)结合，此CD45RO限于出现在活化T细胞、记忆细胞和皮质胸腺细胞亚群上，在B细胞上没有检测到(Terry LA et al，Immunol.1988；第64卷：第331-336页)。
附图简述
图1显示“候选单克隆抗体”对初次MLR的抑制是剂量依赖的，范围是0.001到10μg/ml。“浓度”是“候选单克隆抗体”的浓度。
图2显示表达载体HCMV-G1 HuAb-VHQ的质粒图，在完全表达载体核酸序列SEQ ID NO：15中包括具有核酸序列SEQ ID NO：12(3921-4274)的重链。
图3显示表达载体HCMV-G1 HuAb-VHE的质粒图，在完全表达载体核酸序列SEQ ID NO：16中包括具有核酸序列SEQ ID NO：11(3921-4274)的重链。
图4显示表达载体HCMV-K HuAb-humV1的质粒图，在完全表达载体核酸序列SEQ ID NO：17中包括具有核酸序列SEQ ID NO：14(3964-4284)的轻链。
图5显示表达载体HCMV-K HuAb-humV2的质粒图，在完全表达载体核酸序列SEQ ID NO：18中包括具有核酸序列SEQ ID NO：13(3926-4246)的轻链。
发明详述
目前，我们已经发现含有结合CD45RO和CD45RB的多肽序列的结合分子，此后也称为“CD45RO/RB结合分子”。根据本发明这些结合分子可以诱导免疫抑制、抑制初级T细胞反应和诱导T细胞耐受。而且，本发明的结合分子抑制初级混合淋巴细胞反应(MLR)。来自CD45RO/RB结合分子处理的培养物的细胞也优选地在次级MLR中有削弱的增殖反应，即使在次级MLR中缺乏CD45RO/RB结合分子。这些在次级MLR中的削弱的增殖反应表明本发明的结合分子有诱导耐受的能力。另外，与对照处理小鼠相比，在注射人源PBMC后给遭受异种移植物抗宿主病(X-GVHD)的重度联合免疫缺陷小鼠(SCID)体内用药CD45RO/RB结合分子，可以延长小鼠的存活时间，尽管在CD45RO/RB结合分子处理的小鼠体内仍能检测到循环人源T细胞。
“CD45RO/RB结合分子”是指任何，单独或与其他分子关联时，能特异地结合CD45抗原的CD45RB和CD45RO同种型的分子。可以用标准方法(定性分析)来显示结合反应，标准方法包括例如：任何类型的结合试验，例如与荧光显微镜或细胞荧光测定分析(FACS)联合的直接或间接免疫荧光法、酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射性免疫测定，其中可以显现分子与表达特殊CD45同种型的细胞的结合。另外，这种分子的结合可以导致表达这些同种型的细胞的功能改变。例如可以测定对初级或次级混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制，例如用于测定在CD45RO/RB结合分子存在和缺乏情况下对初级或次级MLR的抑制和测定初级MLR抑制差异的体外试验或生物试验。
可选择地，也可以例如在MLR中细胞活化后、或者用特定抗原(例如破伤风毒素或其他抗原)刺激后、或者用多克隆刺激物(例如植物凝集素(PHA)或抗-CD3和抗-CD28抗体或佛波酯和Ca2+离子载体)刺激后，通过测量PBMC或T细胞或CD4+T细胞的增殖、细胞因子的产生、细胞表面分子表达的改变来确定体外功能调节作用。培养的设置与所述用于MLR的类似，不同的是代替同种异体细胞作为刺激物而使用可溶性抗原或多克隆刺激物(例如上面提到的)。优选地用上述方法通过掺入3H-胸苷来测量T细胞增殖。优选地用夹心ELISA来测量细胞因子产生，其中将细胞因子俘获抗体涂在96-孔板的表面，加入来自培养物的上清液并在室温下孵育1小时，加入对特定细胞因子具特异性的检测抗体，然后在加入连接有酶(例如辣根过氧化物酶)的二抗之后加入相应的底物，并在平板阅读器上测量吸光度。优选地，用对特定细胞表面分子特异的抗体染色靶细胞后，用直接或间接免疫荧光法测量细胞表面分子的改变。抗体可以直接用荧光染料标记或者可以使用对一抗特异的荧光标记的二抗，并用细胞荧光测定仪分析细胞。
本发明的结合分子对CD45RO和CD45RB都有结合特异性(“CD45RO/RB结合分子”)。
优选地，结合分子与CD45RO同种型结合的解离常数(Kd)＜20nM，优选地Kd＜15nM或＜10nM，更优选地Kd＜5nM。优选地，结合分子与CD45RB同种型结合的Kd＜50nM，优选地Kd＜15nM或＜10nM，更优选地Kd＜5nM。
在另一优选实施方案中，本发明的结合分子结合这样的CD45同种型，其
(1)包括CD45分子的A和B表位，但没有C表位；和/或
(2)包括CD45分子的B表位，但没有A和C表位；和/或
(3)不包括CD45分子的A、B或C表位的任一个。
在再一优选实施方案中，本发明的结合分子不结合这样的CD45同种型，其包括
(1)CD45分子的A、B和C表位的所有；和/或
(2)CD45分子的B和C表位，但没有A表位。
在其它优选实施方案中，本发明的结合分子还可以
(1)识别记忆T细胞和体内自身反应性T细胞；和/或
(2)在人T细胞，例如PEER细胞上结合它的靶对象；其中优选地所述结合的Kd＜15nM，更优选Kd＜10nM，最优选Kd＜5nM；和/或
(3)体外抑制自身反应性T细胞的功能，优选IC50约为5nM，更优选IC50约为1nM，最优选IC50约为0.5nM或者甚至0.1nM；和/或
(4)诱导体外同种抗原特异性T细胞出现耐受；和/或
(5)阻止由注射有效剂量人PBMC在SCID小鼠体内诱导的致死性异种移植物抗宿主疾病(GvHD)。
在再一优选实施方案中，本发明的结合分子与单克隆抗体“A6”结合相同的表位，抗体“A6”的描述如Aversa等，Cellular Immunology第158卷，第314-328页(1994)所述。
由于上述的结合特性和生物活性，本发明的这些结合分子在医学上对治疗和/或预防特别有用。本发明结合分子特别可用于的疾病包括自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症，以下将作进一步陈述。
我们发现，含有多肽SEQ ID NO：1和多肽SEQ ID NO：2的分子是CD45RO/RB结合分子。我们也查明了具SEQ ID NO：1的CD45RO/RB结合分子中的CDR1′、CDR2′和CDR3′高变区，其中CDR1′具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)，CDR2′具有氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)，CDR3′具有氨基酸序列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT)。
我们也查明了具SEQ ID NO：2的CD45RO/RB结合分子中的CDR1、CDR2和CDR3高变区，其中CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)。
CDR是3个特异的互补决定区，也称作高变区，它在本质上决定抗原结合特征。这些CDR分别是例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的可变区的部分，其中这些CDR与构架区(FR)(例如恒定区)交替出现。在根据本发明的嵌合抗体中，SEQ ID NO：1是轻链例如SEQ ID NO：3的部分，SEQ ID NO：2是重链例如SEQ ID NO：4的部分。重链的CDR与相关轻链的CDR一起基本上组成了本发明分子的抗原结合位点。已知，与相关重链可变区对结合热力学的贡献相比，轻链可变区的贡献较小；且分离的重链可变区自身有抗原结合活性。这些分子通常称作单域抗体。
本发明一方面提供含有至少一个抗原结合位点的分子，例如CD45RO/RB结合分子及其直接等价物，其中所述分子顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)。
本发明另一方面提供含有至少一个抗原结合位点的分子，例如CD45RO/RB结合分子及其直接等价物，其中所述分子包含
a)顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)；以及
b)顺次含有高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′的第二结构域，CDR1′具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)，CDR2′具有氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)，CDR3′具有氨基酸序列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT)。
在优选实施方案中，顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域是免疫球蛋白重链，顺次含有高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′的第二结构域是免疫球蛋白轻链。
本发明另一方面提供含有SEQ ID NO：1多肽和/或SEQ ID NO：2多肽的分子，例如CD45RO/RB结合分子，优选地在一个结构域中含有SEQID NO：1多肽而在另一个结构域中含有SEQ ID NO：2多肽，例如嵌合单克隆抗体；本发明另一方面还提供含有SEQ ID NO：3多肽和/或SEQ IDNO：4多肽的分子，例如CD45RO/RB结合分子，优选地在一个结构域中含有SEQ ID NO：3多肽而在另一个结构域中含有SEQ ID NO：4多肽，例如嵌合单克隆抗体。
当抗原结合位点含有第一和第二结构域、或者相应地含有SEQ ID NO：1多肽或SEQ ID NO：3多肽和SEQ ID NO：2多肽或SEQ ID NO：4多肽时，这些结构域可以定位于相同的多肽分子上，或者，优选地每个结构域位于不同链上，例如第一结构域是重链(例如免疫球蛋白重链)或其片段的一部分，而第二结构域是轻链(例如免疫球蛋白轻链)或其片段的一部分。
我们进一步发现，根据本发明的CD45RO/RB结合分子是哺乳动物(例如人)体内环境中的CD45RO/RB结合分子。因此，根据本发明的CD45RO/RB结合分子可被认为是单克隆抗体(mAb)，其中结合活性主要通过如上所述的CDR区确定，例如所述CDR区可以与没有结合特异性的基本上来源于人的其他分子(例如构架，比如恒定区)相连。
本发明另一方面提供了不是如Aversa等，Cellular Immunology第158卷，第314-328页(1994)(鉴于表征A6的段落将其以参考文献的形式并入)所描述的单克隆抗体″A6″的CD45RO/RB结合分子。
本发明另一方面提供根据本发明的CD45RO/RB结合分子，它是嵌合的、人源化的或完全人的单克隆抗体。
CD45RO/RB结合分子的实例包括嵌合抗体或人源化抗体(例如可衍生自B细胞或杂交瘤产生的抗体)和/或其任何片段如F(ab′)2和Fab片段、以及单链或单域抗体。单链抗体由抗体重链和轻链的可变区通过肽接头共价连接组成，肽接头通常由10到30个氨基酸，优选15到25个氨基酸组成。因此，这样的结构不包括重链和轻链的恒定部分，并且据认为，小的肽间隔应当比整个恒定部分有更小的抗原性。嵌合抗体是指重链或轻链的恒定区或者两者都是人源的，而重链和轻链的可变区都是非人(例如鼠)源的抗体。人源化抗体是指高变区(CDR)是非人(例如鼠)源的，而全部或实质上全部其他部分(例如恒定区和可变区的高度保守部分)是人源的抗体。可是人源化抗体可以在邻近高变区的可变区部分中保留鼠源序列的几个氨基酸。
高变区，即根据本发明的CDR，可以和任何类型的构架区(例如人源的重链和轻链的恒定区)相连。合适的构架区例如可参见“具有免疫学意义的蛋白质的序列”，Kabat，E.A.等，US Department of Health and HumanServices，Public Health Service，National Institute of Health。优选地，人重链的恒定部分可以属于IgG1类，包括亚类；优选地，人轻链的恒定部分可以属于κ或λ类，更优选κ类。重链的优选恒定部分是多肽SEQ ID NO：4(没有上述所述CDR1′、CDR2′和CDR3′序列部分)；轻链的优选恒定部分是多肽SEQ ID NO：3(没有上述所述CDR1、CDR2和CDR3序列部分)。
我们也发明了如下人源化抗体，其包含：含有根据本发明的CDR1′、CDR2′和CDR3′的具氨基酸SEQ ID NO：7或氨基酸SEQ ID NO：8的轻链可变区；以及含有根据本发明的CDR1、CDR2和CDR3的具氨基酸SEQID NO：9或氨基酸SEQ ID NO：10的重链可变区。
本发明另一方面提供含有多肽SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10和多肽SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的人源化抗体。
本发明另一方面提供人源化抗体，其含有
-多肽SEQ ID NO：9和多肽SEQ ID NO：7，
-多肽SEQ ID NO：9和多肽SEQ ID NO：8，
-多肽SEQ ID NO：10和多肽SEQ ID NO：7，或者
-多肽SEQ ID NO：10和多肽SEQ ID NO：8。
根据本发明的多肽，例如具本文中指出的序列的多肽，例如多肽CDR1，CDR2，CDR3，CDR1′，CDR2′，CDR3′，或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的多肽，包括所述(多)肽(序列)的直接等价物；例如包括所述多肽的功能衍生物。所述功能衍生物可包括指定序列的共价修饰，和/或所述功能衍生物可包括指定序列的氨基酸序列变体。
除非另行指明，否则“多肽”包括含有通过肽键彼此连接在一起的氨基酸的任何肽或蛋白，其氨基酸序列起始于N末端并终止于C末端。优选地，本发明的多肽是单克隆抗体，更优选是嵌合(V-嫁接)单克隆抗体或人源化(CDR-嫁接)单克隆抗体。人源化(CDR-嫁接)单克隆抗体可以包括或不包括引入受体抗体构架(FR)序列中的进一步突变。
本文中所用的功能衍生物包括具有与本发明多肽相同的定性生物学活性的分子，例如具有与CD45RO和CD45RB结合的能力。功能衍生物包括本发明多肽的片段和肽类似物。片段包括本发明多肽(例如所述序列)的序列内的区域，术语“衍生物”用来限定本发明多肽(例如所述序列)的氨基酸序列变体和共价修饰。本发明多肽(例如所述序列)的功能衍生物优选具有与本发明多肽(例如所述序列)的氨基酸序列至少约65％、更优选至少约75％、甚至更优选至少约85％、最优选至少约95％的全序列同源性，并实质上保留与CD45RO和CD45RB结合的能力。
术语“共价修饰”包括用有机蛋白质性(proteinaceous)或非蛋白质性衍生剂对本发明多肽(例如所述序列)或者其片段的修饰、与异源多肽序列的融合以及翻译后修饰。共价修饰的多肽(例如所述序列)仍有通过交联与CD45RO和CD45RB结合的能力。通过靶氨基酸残基与能和选定侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，或者通过在所选重组宿主细胞内起作用的翻译后修饰机制，可以常规地引入共价修饰。有些翻译后修饰是重组宿主细胞对已表达多肽作用的结果。谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基经常在翻译后脱氨基形成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。作为备选方案，这些残基可以在微酸性条件下脱氨基。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸的α-氨基基团和组氨酸侧链的甲基化，参见例如T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，第79-86页(1983)。例如，共价修饰包括含有本发明多肽(例如所述序列)的融合蛋白和它们的氨基酸序列变体，例如免疫粘附素和与异源信号序列的N-端融合物。
本文中，涉及天然多肽与其功能衍生物的术语“同源”被定义为：通过序列比对和引入间隔(gap)(如果需要的话)以取得最大的同源百分数后，在不将保守替换考虑为序列同一性的部分时，候选序列的氨基酸残基与相应天然多肽的残基相同的百分数。不应将N-或C-端的延伸和插入理解为降低同一性或同源性的因素。比对的方法和计算机程序是已知的。“氨基酸”是指所有天然的L-α-氨基酸并包括D-氨基酸。用已知的单字母或三字母名称标识氨基酸。
术语“氨基酸序列变体”是指与本发明的多肽(例如所述序列)相比，在其氨基酸序列中有某些差别的分子。根据本发明的多肽(例如所述序列)的氨基酸序列变体仍有与CD45RO和CD45RB结合的能力。替换变体是指在本发明多肽(例如所述序列)中有至少一个氨基酸被去除并在相同位置上插入了不同氨基酸的变体。这些替换可以是单个的，其中在分子内部只有一个氨基酸被替换；或者可以是多重的，其中在同一分子内部有两个或多个氨基酸被替换。
插入变体是指在本发明多肽(例如所述序列)的特别位置处紧邻一个氨基酸插入一个或多个氨基酸的变体。与氨基酸紧邻是指与氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。缺失变体是指在本发明多肽(例如所述序列)中有一个或多个氨基酸被去除的变体。通常，缺失变体在分子的特殊区域有一个或两个氨基酸缺失。
我们还发现了如下多核苷酸序列，
-GGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTG，编码CDR1的氨基酸序列，
-TTCTTCTGAGTCTATCTCTGG；编码CDR2的氨基酸序列，
-ACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTT，编码CDR3的氨基酸序列，
-TTATATTATCCACTG，编码CDR1′的氨基酸序列，
-TTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG，编码CDR2′的氨基酸序列，
-AGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTG，编码CDR3′的氨基酸序列，
-SEQ ID NO：5，编码多肽SEQ ID NO：1，即根据本发明的单克隆抗体的轻链可变区；
-SEQ ID NO：6，编码多肽SEQ ID NO：2，即根据本发明的单克隆抗体的重链可变区；
-SEQ ID NO：11，编码多肽SEQ ID NO：9，即含有本发明CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；
-SEQ ID NO：12，编码多肽SEQ ID NO：10，即含有本发明CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；
-SEQ ID NO：13，编码多肽SEQ ID NO：7，即含有本发明CDR1′、CDR2′和CDR3′的轻链可变区；和
-SEQ ID NO：14，编码多肽SEQ ID NO：8，即含有本发明CDR1′、CDR2′和CDR3′的轻链可变区。
本发明另一方面提供：分离的多核苷酸，其含有编码CD45RO/RB结合分子的多核苷酸，例如编码本发明CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的多核苷酸和/或，优选地和编码本发明CDR1′、CDR2′和CDR3′的氨基酸序列的多核苷酸；
多核苷酸，其含有多核苷酸SEQ ID NO：5和/或，优选地和多核苷酸SEQ ID NO：6的；以及
多核苷酸，其含有编码多肽SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8和多肽SEQID NO：9或SEQ ID NO：10的多核苷酸，例如编码
-多肽SEQ ID NO：7和多肽SEQ ID NO：9，
-多肽SEQ ID NO：7和多肽SEQ ID NO：10，
-多肽SEQ ID NO：8和多肽SEQ ID NO：9，或
-多肽SEQ ID NO：8和多肽SEQ ID NO：10的多核苷酸；以及
多核苷酸，其含有多核苷酸SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12和多核苷酸SEQ ID NO：13或多核苷酸SEQ ID NO：14，优选地含有
-多核苷酸SEQ ID NO：11和多核苷酸SEQ ID NO：13，
-多核苷酸SEQ ID NO：11和多核苷酸SEQ ID NO：14，
-多核苷酸SEQ ID NO：12和多核苷酸SEQ ID NO：13，或
-多核苷酸SEQ ID NO：12和多核苷酸SEQ ID NO：14。
除非另行指明，否则“多核苷酸”包括任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，它可以是未修饰的RNA或DNA，或者修饰的RNA或DNA，包括但不限于单和双链RNA以及作为单和双链区域的混合物的RNA。
根据本发明的多核苷酸，例如分别编码CDR1，CDR2，CDR3，CDR1′，CDR2′，CDR3′的氨基酸序列，或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQID NO：10氨基酸序列的多核苷酸，例如分别地多核苷酸SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：14，包括其等位基因变体和/或其互补物；例如包括这样的多核苷酸，其可以相应地与核苷酸序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14杂交；例如相应地编码与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10有至少80％一致的多肽，例如包括所述多肽的功能衍生物，例如所述功能衍生物可相应地与SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10有至少65％的同源性，例如所述功能衍生物可相应地包括SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：4，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的共价修饰，例如所述功能衍生物可相应地包括SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列变体；例如SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14分别包括这样的序列，其作为遗传密码丰余性(简并性)的结果相应地也编码多肽SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10，或者相应地编码具有与氨基酸序列SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10至少有80％一致的氨基酸序列的多肽。
CD45RO/RB结合分子，例如嵌合或人源化抗体，可以由重组DNA技术产生。因此，可以构建编码CD45RO/RB的一个或多个DNA分子，置于合适的控制序列之下，用合适的载体转入适宜的宿主(生物体)中进行表达。
本发明另一方面提供编码本发明CD45RO/RB结合分子的单个重链和/或轻链的多核苷酸；也提供本发明的多核苷酸的用途，用于通过重组方式产生根据本发明的CD45RO/RB结合分子。
可以根据常规方法，例如类似方法，联合本文提供的信息获得CD45RO/RB结合分子，这些信息例如高变区和可变区的氨基酸序列以及编码这些区的多核苷酸序列。构建可变区基因的方法参见例如EP 239 400中的描述，可以简要地概括如下：可以克隆编码具任何特异性的单克隆抗体可变区的基因。确定编码构架区和高变区的DNA片段并去除编码高变区的DNA片段。根据本文中指出的CDR和CDR′序列通过DNA合成制备双链合成的CDR盒。使这些盒带有粘性末端，这样在连接处它们可以与期望的人源构架区连接。根据常规的方法例如类似方法，也可以制备编码单链抗体的多核苷酸。由此制备的本发明多核苷酸可以方便地转入合适的表达载体中。
可以根据常规方法如类似方法，发现合适的细胞系。表达载体，例如含有适宜的启动子和编码重链和轻链恒定区的基因的表达载体，是已知的，例如可商业上获得。合适的宿主是已知的或者可以据常规方法例如类似方法发现，包括细胞培养物或转基因动物。
本发明另一方面提供含有编码本发明CD45RO/RB结合分子的多核苷酸的表达载体，例如，具SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18序列的表达载体。
本发明另一方面提供
-含有根据本发明的多核苷酸的表达系统，其中当所述表达系统或其部分存在于相容宿主细胞中时，所述表达系统或其部分能产生本发明的CD45RO/RB结合分子；和
-含有以上限定的表达系统的分离的宿主细胞。
我们进一步发现，按照体外MLR的测定，根据本发明的CD45RO/RB结合分子以剂量依赖的方式抑制初级同种异体免疫反应。此结果表明，在本发明CD45RO/RB结合分子存在下被异源活化(alloactivate)的细胞对同种抗原(alloantigen)的反应被削弱。这证实了根据本发明的CD45RO/RB结合分子能直接地作用于同种异体反应性效应T细胞并调节它们的功能。另外，我们在次级MLR的再刺激实验中进一步研究了来自初级MLR的T细胞的功能特性，其中用特异细胞刺激物或第三方刺激物来评估所观察的功能效应的特异性。我们发现来自初级MLR(其中存在根据本发明的CD45RO/RB结合分子)的细胞对特异细胞刺激物的随后最佳刺激做出反应的能力被削弱，尽管在第二次培养中没有加入抗体。由于本发明CD45RO/RB结合分子所处理的细胞对来自无关第三方供体的细胞刺激物有正常反应的能力，证实所述抑制作用具特异性。因此，使用来自初级MLR培养物的T细胞的再刺激实验表明，在本发明CD45RO/RB结合分子存在时被异源活化的细胞对最初的同种抗原具低反应性，即耐受性。在实施例7中描述了其它的生物学活性。
我们还发现，在本发明CD45RO/RB结合分子预处理的细胞中细胞增殖可以通过外源IL-2拯救。这表明用本发明CD45RO/RB结合分子处理同种异体反应性T细胞可诱导耐受状态。事实上，在本发明CD45RO/RB结合分子处理的细胞中观察到的减弱增殖反应是由于T细胞功能受损所致；这些细胞能对外源IL-2做出反应，这表明这些细胞无细胞免疫反应性，即处于真实的无应答状态。由于本发明CD45RO/RB结合分子处理的细胞有响应无关供体细胞正常增殖到对照处理细胞的水平的能力，这证实了这个反应具特异性。
此外，实验表明，根据本发明的CD45RO/RB结合分子与CD45RO和CD45RB的结合可以抑制外周血单核细胞(PBMC)对特异回忆抗原的记忆反应，其中此外周血单核细胞来自经免疫的供体。因此根据本发明的CD45RO/RB结合分子与CD45RO和CD45RB的结合也可有效地抑制对可溶性Ag的记忆反应。由于根据本发明的CD45RO/RB结合分子能够抑制PBMC(来自被免疫的供体)中对破伤风的回忆反应，这表明根据本发明的CD45RO/RB结合分子能靶向并调节记忆T细胞的活化。例如，这些数据表明，除了能识别同种异体反应性活化T细胞之外，根据本发明的CD45RO/RB结合分子还能调节它们的功能，诱导T细胞的无细胞免疫反应性。这个特性对于治疗正在发生的针对自身抗原、过敏原及可能地同种抗原的免疫反应可能是重要的，这些免疫反应可见于自身免疫疾病、过敏症和慢性排斥以及例如牛皮癣、炎症性肠病等疾病，其中记忆反应在维持疾病的状态方面扮演角色。在对自身抗原的记忆反应可能在疾病维持方面有着重要作用的疾病状态中，例如在自身免疫疾病中，这被认为是一个重要特征。
我们也发现根据本发明的CD45RO/RB结合分子可以调节体内混合淋巴细胞反应(MLR)中的T细胞增殖反应，即实验发现在体内根据本发明的CD45RO/RB结合分子有相应的抑制特性。
因此，根据本发明的CD45RO/RB结合分子有免疫抑制和耐受原特性，并可以用于体内和离体诱导对同种抗原，自身抗原，过敏原和细菌菌群抗原的耐受，例如根据本发明的CD45RO/RB结合分子可以在疾病治疗和预防中使用，所述疾病例如包括自身免疫疾病，例如但不限于类风湿性关节炎，自身免疫性甲状腺炎、葛雷夫斯氏病、I型和II型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、硬皮病、自身免疫性胃炎、肾小球肾炎；移植排斥，例如器官和组织同种异体移植和异种移植排斥以及移植物抗宿主疾病(GVHD)，还有牛皮癣、炎症性肠病和过敏症。
本发明另一方面提供根据本发明的CD45RO/RB结合分子用作药物的用途，例如在治疗和/或预防自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症中应用。
本发明另一方面提供根据本发明的CD45RO/RB结合分子，其用于生产治疗和预防与自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症有关的疾病的药物。
本发明另一方面提供含有根据本发明的CD45RO/RB结合分子的药物组合物，该组合物还含有至少一个可药用载体或稀释剂。
药物组合物还可以包含例如活性成分，例如其他免疫调节抗体(例如但不限于抗-ICOS，抗-CD154，抗-CD134L)或重组蛋白(例如但不限于rCTLA-4(CD152)，rOX40(CD134))或者免疫调节化合物(例如但不限于环孢菌素A，FTY720，RAD，纳巴霉素，FK506，15-脱氧精胍菌素，类固醇)。
本发明另一方面提供与自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症有关的疾病的治疗和/或预防方法，包括给需要此治疗和/或预防的对象施用有效量的根据本发明的CD45RO/RB结合分子，例如以根据本发明的药物组合物的形式。
可以用本发明的结合分子治疗的自身免疫疾病还包括，但不限于，类风湿性关节炎、自身免疫性甲状腺炎、葛雷夫斯氏病、I型和II型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、硬皮病、自身免疫性胃炎、肾小球肾炎；移植排斥，例如器官和组织同种异体移植和异种移植排斥以及移植物抗宿主疾病(GVHD)。
实施例
参考以下实施例，可以更全面地理解本发明。可是，不能将其理解为限制本发明的范围。以下实施例中，所有温度都以摄氏度表示。
“候选单克隆抗体”或“嵌合抗体”是根据本发明的CD45RO/RB结合分子，它含有SEQ ID NO：3的轻链和SEQ ID NO：4的重链。
使用以下缩写：
ELISA      酶联免疫吸附测定
FACS       荧光激活细胞分类术
FITC       异硫氰酸荧光素
FBS        胎牛血清
GVHD       移植物抗宿主疾病
HCMV       人巨细胞病毒启动子
IgE        免疫球蛋白同种型E
IgG        免疫球蛋白同种型G
PBS        磷酸缓冲盐溶液
PCR        聚合酶链式反应
xGVHD      异种移植物抗宿主疾病
实施例1：初级淋巴细胞反应(MLR)
细胞
血液样品来自健康的人捐献者。通过在Ficoll-Hypaque(PharmaciaLKB)上离心从白细胞中分离外周血单核细胞(PBMC)，所述白细胞来自整个外周血、白细胞去除术或者白细胞层，具有已知的血型但未知的HLA型。在一些MLR实验中，受40Gy辐射后，PBMC直接用作细胞刺激物。在另外的实验中，用CD2或CD3 Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)从PBMC中耗竭T细胞。用磁场去除小珠和污染细胞。在辐射后，将耗竭了T细胞的PBMC用作细胞刺激物。
在MLR中，PBMC、CD3+T或CD4+T细胞用作效应细胞。将来自不同供体的细胞制备为细胞刺激物。使用抗-CD16单克隆抗体(Zymed，CA)，山羊抗鼠IgG Dynabeads，抗-CD14 Dynabeads，CD19 Dynabeads通过负选择来纯化CD3+T细胞。另外抗-CD8 Dynabeads用来纯化CD4+T细胞。获得的细胞用FACScan或FACSCalibur(Becton Dickinson & Co.，CA)分析，获得的细胞的纯度＞75％。细胞在补充有10％热灭活FBS、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中悬浮。
试剂
还制备嵌合抗-CD45RO/RB单克隆抗体“候选单克隆抗体”和同种型匹配的对照嵌合抗体。对KLH(匙孔血蓝蛋白)特异的鼠(人)对照IgG1抗体和重组人IL-10购自BD Pharmingen(San Diego，CA)。抗-人CD154单克隆抗体5c8是根据Lederman等1992的描述。
初级混合淋巴细胞反应(MLR)
在有所述单克隆抗体存在或抗体缺乏的情况下，在96孔培养板(Costar，Cambridge，MA)的每个孔中，将等分试样1×105个PBMC或5×104个CD3+或CD4+细胞与辐射过的1×105个PBMC或5×104个耗竭了T细胞并辐射(50Gy)过的PBMC混合。在一些实验中，除了候选单克隆抗体之外，还加入10μg/ml的对Fc部分特异的羊抗鼠Ig或羊抗人Ig的F(ab’)2片段(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，以保证与靶CD45分子的最佳体外交联。在37℃于5％CO2中培养混合细胞4或5天，在培养的最后16-20个小时用3H-胸苷脉冲细胞以测定增殖。其他实验与上述类似，但有以下例外：1)使用的培养基是含有10％FBS和1％人血浆的EX-VIVO(Bio-Whittaker)；2)抗鼠完全IgG(5μg/ml)用作第二交联步骤；3)细胞刺激物所受的辐射为60Gy。
在有“候选单克隆抗体”或对照嵌合IgG1(10μg/ml)存在下进行初级MLR，两种情况下都有第二步骤试剂，即对Fc部分特异的羊抗人Ig的F(ab’)2片段(10μg/ml)。与对照IgG1存在下的细胞增殖相比，可以计算出“候选单克隆抗体”的抑制百分数。结果见于如下表1：
                         表1
10μg/ml根据本发明的候选单克隆抗体对初级MLR的抑制
效应细胞   刺激物(辐射过的PBMC) ％抑制作用
    #211 CD4     #219 CD3     63.51
    #220 CD4   #219 CD3耗竭     63.07
    #227 CD4   #220 CD3耗竭     65.96
    #229 CD4   #219 CD3耗竭     50.76
        平均值±SD     60.83±6.83*
*与对照值有显著差异(P＜0.001)
从表1中可以看出根据本发明的候选单克隆抗体对初级MLR有抑制作用。在来自四个不同供体的CD4+T细胞中平均抑制效应是60.83±6.83％，具有统计学显著性。
如图1所示，在0.001到10μg/ml范围内“候选单克隆抗体”对初级MLR的抑制作用显示为剂量依赖的。从使用一个供体PBMC作为效应细胞的三个独立的MLR实验的结果可以测定“候选单克隆抗体”对初级MLR抑制的IC50。因此，在有“候选单克隆抗体”或对照嵌合抗体及10μg/ml羊抗人Ig的F(ab’)2片段存在下，将来自供体#229和#219的效应CD4+T细胞与作为刺激物的耗竭了T细胞并受过辐射的PBMC混合。实验重复3次，与对照抗体存在下的T细胞增殖相比，计算“候选单克隆抗体”存在下增殖的百分数。用Origin(V.6.0)确定IC50值。计算的细胞活性IC50值是0.87±0.35nM(0.13±0.052μg/ml)。
实施例2：次级MLR
为了评估“候选单克隆抗体”是否诱导CD4+T细胞对特异同种抗原的无应答性，在初级MLC后在无任何抗体存在下进行次级MLR。在有所述抗体存在下，在96孔培养板中将CD4+T细胞与辐射过的同种异型细胞刺激物(T细胞耗竭的PBMC)一起培养10天。然后，收集细胞，在Ficoll-Hypaque梯度上分层以去除死亡的细胞，用RPMI洗两次，然后用相同刺激物、第三方细胞刺激物或IL-2(50U/ml)再次刺激。细胞培养3天，通过用3H-胸苷在培养的最后16-20个小时脉冲细胞来测定增殖反应。
具体地，在10μg/ml“候选单克隆抗体”、对照IgG1嵌合抗体和羊抗人Ig的F(ab’)2片段存在下，将CD4+T细胞与受过辐射的同种异型细胞刺激物(来自其他供体的T细胞耗竭的PBMC)一起培养。在第5天测定初级MLR增殖。对于次级MLR，在有“候选单克隆抗体”存在下培养效应细胞和细胞刺激物10天；然后收获细胞，用RPMI1640洗两次，并在无任何抗体存在下用特异刺激物、第三方刺激物或IL-2(50U/ml)再次刺激。在第3天测定细胞增殖，结果列于表2：
                        表2
    效应CD4+T细胞供体#     ％次级MLR的抑制作用
    #211     49.90*
    #220     59.33*
    #227     58.68*
*与对照值有显著差异(p＝＜0.001，用t-检验测定，SigmaStat V.2.03).#p＝＜0.046
为了检验削弱的增殖是否是由于作为“候选单克隆抗体”处理结果的无应答性引起的，在有IL-2(50U/ml)存在下培养来自初级MLR的细胞。添加IL-2导致在初级MLR中经“候选单克隆抗体”处理过的T细胞的增殖反应得以恢复，达到与IgG1对照抗体存在时所观察到的反应相似的水平。这些数据表明，“候选单克隆抗体”处理过的T细胞所具有的削弱的次级反应是由于效应T细胞的功能改变所致，该T细胞对特异细胞刺激物变得无应答性。
抑制百分数是根据以下公式计算出的：
Figure A0280478500251
用SigmaStat(Vers.2.03)进行统计分析。
用双向ANOVA之后用Dunnett方法分析数据。在所有检验过程中把概率＜0.05看作具有显著性。在一些实验中使用t-检验(SigmaStat V.2.03)。
实施例3：SCID小鼠的体内存活研究
hu-PBL植入SCID小鼠
向SCID小鼠C.B17/GbmsTac-PrkdcscidLystbg小鼠(Taconic，Germantown，NY)腹膜内注射人外周血单核细胞(PBMC)，其剂量足以在细胞植入后4周内在＞90％小鼠体内诱导致死性异种移植物抗宿主疾病(xGvHD)。此处理的SCID小鼠在此后称作hu-PBL-SCID小鼠。
hu-PBL-SCID小鼠的单克隆抗体处理
在第0天，即PBMC注射之后立即，第3天、第7天和此后每隔一周，用“候选单克隆抗体”或鼠的或嵌合的同种型匹配的单克隆抗体对照处理hu-PBL-SCID小鼠。皮下给予在100μl PBS中的单克隆抗体至终浓度为5mg/kg体重。当所有对照小鼠死亡之后终止处理。
处理结果的评价
本研究中评价“候选单克隆抗体”效力的主要标准是hu-PBL-SCID小鼠的存活。通过统计学存活分析方法在Systat v9.01软件的帮助下用log-rank检验(Mantel法)来评价结果的显著性。存活分析方法是非参数检验，它不但考虑某一特定小鼠是否仍然存活，也考虑如果它被处死则原因是否与处理/疾病无关，例如对其器官/细胞进行体外分析的需要。从死亡小鼠获得肝脏、肺、肾和脾的活检物用于进一步评价。另外，在实验开始(细胞转移之前)和实验中(每2天)称重hu-PBL-SCID小鼠用作其健康状况的间接评价。用来自每个小鼠的体重对PBMC转移后的天数值产生线性回归线，之后用非参数Mann-Whitney检验比较它们的斜率(对照相对于抗-CD45处理的小鼠)。
结果
鼠单克隆抗体对照处理过的所有hu-PBL-SCID小鼠的肺、肝和脾内已经渗入了人白细胞，并在细胞转移后约2到3周内小鼠死去(4/4)。死亡可能由xGvHD引起。对照单克隆抗体处理的小鼠还以线性方式减重，约10％且在3周内更多。
用“候选单克隆抗体”处理过的所有hu-PBL-SCID小鼠都存活(4/4)并且超过四周无任何疾病的明显征兆，即使3周后停止“候选单克隆抗体”处理亦如此。“候选单克隆抗体”处理的小鼠以线性方式增加体重，在4周内高达约5％。
实施例4：本发明抗体的表达
含有SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的人源 化抗体的表达
根据质粒图(显示在图2到5)构建表达载体，分别含有编码人源化轻链可变区humV1(SEQ ID NO：7)、人源化轻链可变区humV2(SEQ IDNO：8)、人源化重链可变区VHE(SEQ ID NO：9)或人源化重链可变区VHQ(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列的相应核苷酸。这些表达载体分别具有SEQID NO 15，SEQ ID NO 16，SEQ ID NO 17或SEQ ID NO 18的DNA(核苷酸)序列。
人源化抗体重链和轻链表达载体的构建
用于VLh和VLm版本的人κ轻链表达载体
为了构建编码人κ同种型的完整人源化轻链的最终表达载体，用HindIII和BglII从含有VLh和VLm的PCR-Script克隆载体(Stratagene)(VLm区)切下编码完整轻链可变区(VLh和VLm)的DNA片段。然后将经过凝胶纯化的片段亚克隆入C21-HCMV K表达载体的HindIII和BamHI位点中，此载体是在构建人源化抗-IgE抗体TESC-21时产生的(Kolbinger等1993)并且最初从M.Bendig(MRC Collaborative Centre，London，英国)外得到(Maeda等1991)。用酚/氯仿抽提来纯化连接产物，并通过电穿孔导入电穿孔-感受态Epicurian ColiXL1-Blue菌株(Cat.N°#200228，Stratagene)。铺在LB/amp琼脂平板上后，37℃过夜，各挑出12个菌落，用BioRobot 9600(Qiagen)从3ml培养物中制备质粒DNA。这分别产生人源化抗体版本VLh和VLm的轻链表达载体，在图中有进一步描述。
用于VHQ的人γ-1重链表达载体
为了构建VHQ表达载体，采用分步法。首先根据如Kolbinger等1993(Protein Eng.1993 Nov；6(8)：971-80)描述的方法通过PCR组装VHQ的完整可变区，然后亚克隆入C21-HCMV-γ-1表达载体中，此载体中已用相同的酶去除了C21插入。把含有完整可变区的PCRScript克隆VHQ的HindIII/BamHI片段亚克隆入用同样的酶切割的表达载体C21-HCMV-γ-1中。这产生了人源化抗体版本VHQ的最终表达载体。
用于VHE的人γ-1重链表达载体
构建编码人γ-1同种型的完整人源化重链的最终VHE表达载体的方式如下：直接把编码此可变区的HindIII和BamHI限制性PCR片段连接入C21-HCMVγ-1表达载体的HindIII和BamHI位点中，C21-HCMVγ-1表达载体是在构建人源化抗-IgE抗体TESC-21时创造的(Kolbinger等1993)并且也最初由M.Bendig(MRC Collaborative Centre，London，英国)提供(Maeda等1991)。
COS细胞内的瞬时表达
对于150ml细胞培养盘中的粘附COS细胞，适应性修改以下转染方案，其中使用SuperFectTM转染试剂(Cat.N°301305，Qiagen)。上述的四种不同的表达载体用于瞬时转染细胞。为了表达人源化抗体，将含有重链插入片段(分别地，VHE或VHQ)的两个克隆中的一个与编码轻链(分别地，humV1或humV2)的两个克隆中的一个共转染入细胞，这样重链和轻链表达载体总共有4种不同的组合(VHE/humV1，VHE/humV2，VHQ/humV1和VHQ/humV2)。转染之前，用限制性内切酶PvuI线性化质粒，PvuI在编码氨苄青霉素抗性基因的区域内切割。转染前一天，在150ml细胞培养盘中将4×106个COS细胞接种在30ml新鲜培养基内。在这个细胞浓度，接种24小时后通常产生80％的汇合。转染当天，在没有血清和抗生素的总体积900μl的新鲜培养基中稀释线性化重链和轻链DNA表达载体的4种不同组合(每个15μg)。然后把180μl SuperFect转染试剂与DNA溶液彻底混合。室温温育DNA混合物10分钟以允许复合体的形成。复合体形成后，从COS细胞培养物中去除生长培养基，用PBS洗细胞一次。然后在含有转染混合物的每个反应管中加入9ml新鲜培养基(含有10％FBS和抗生素)并充分混合。37℃及5％CO2下细胞培养物与DNA复合体温育3小时。温育后，去除含有转染复合体的培养基，用30ml新鲜培养基代替。转染后48小时，收获培养物上清液。
培养物上清液的浓缩
为了ELISA和FACS分析，从转染了重链和轻链质粒的COS细胞收集的培养物上清液按如下浓缩。如制造商所描述的把10ml每种上清液加入Centriprep YM-50离心过滤装置(Cat.N°4310，Millipore)。室温3000rpm离心Centriprep过滤器10分钟。然后用剩余的20ml上清液再次重复此离心步骤，其中仅离心5分钟并监督浓度的进展。回收中间500μl浓缩的上清液，转移至新Microcon离心过滤装置(Cat.N°42412，Microcon)，并依照制造商的方案进一步浓缩。室温3000rpm离心浓缩的上清液4次24分钟，6000rpm离心一次10分钟，然后3次5分钟，此过程中总是监督浓度的进展。得到的浓缩条件培养基的终体积为100-120μl，相应于最初培养基浓缩了250到300倍，将其在4℃保存直至使用前。为了对比和对照，用上述相同的离心方案，类似地浓缩来自未转染细胞的培养基。
实施例5：用ELISA测定重组人IgG的表达
为了测定在培养物上清液中表达的重组人抗体的IgG浓度，用人IgG作为标准发展和优化了夹心ELISA方法。用100μl在PBS中终浓度为0.5μg/ml的羊抗人IgG(整个分子，Cat.N°I1011，SIGMA)包被平底96孔微量滴定板(Cat.N°4-39454，Nunc Immunoplate Maxisorp)，4℃过夜。然后用漂洗缓冲液(含有0.05％Tween 20的PBS)洗孔3次，并37℃用封闭缓冲液(0.5％BSA在PBS中)封闭1.5小时。漂洗3个循环后，通过在封闭缓冲液中以1.5倍系列稀释制备抗体样品和标准人IgG(Cat.No.I4506，SIGMA)。一式两份地将100μl稀释样品或标准转移至包被的平板中，并室温温育1小时。温育后用漂洗缓冲液洗板3次，之后与在封闭缓冲液中1/4000稀释的与辣根过氧化物酶偶联的羊抗人IgG κ-轻链(Cat.N°A-7164，SIGMA)100μl温育1小时。对照孔加入100μl封闭缓冲液或浓缩的正常培养基。漂洗之后，根据制造商的说明书用TMB过氧化物酶EIA底物试剂盒(Cat.N°172-1067，Bio-Rad)，在样品和标准孔中进行结合的过氧化物酶的比色定量测定。在每个孔中加入100μl此过氧化物酶混合物，在室温暗处温育30分钟。通过加入100μl的1M硫酸终止显色反应。用ELISA板阅读器(3350-UV型，BioRad)在450nm读取每个孔的吸光度。
IgG标准曲线的相关系数是0.998，测定到的4种不同培养物浓缩液的浓度如下(约250-300倍浓缩)：
VHE/humV1上清液＝8.26μg/ml
VHE/humV2上清液＝6.27μg/ml
VHQ/humV1上清液＝5.3μg/ml
VHQ/humV2上清液＝5.56μg/ml
实施例6：FACS竞争分析(结合亲和力)
将人T细胞系PEER选作FACS分析的靶细胞，因为它在其细胞表面表达CD45抗原。为了分析人源化抗体上清液的结合亲和力，进行用FITC-标记的嵌合抗体作为参考的竞争实验，并与纯化的鼠抗体和嵌合抗体的抑制作用相比较。3000rpm离心PEER细胞培养物10秒，并去除培养基。细胞在FACS缓冲液(含有1％PBS和0.1％叠氮化钠的PBS)中重悬，并在96孔圆底微量滴定板中以细胞密度为每孔1×105个进行接种。离心滴定板并弃上清液。为了进行封闭研究，首先按文中指出的浓度在每个孔中加入25μl浓缩的未转染培养基或同种型匹配的对照抗体(阴性对照)、未标记的鼠抗体或嵌合抗体(阳性对照)以及含有不同人源化抗体组合的浓缩上清液(样品)。4℃温育1小时后，通过离心用200μl FACS缓冲液洗PEER细胞。之后在4℃细胞与在FACS缓冲液中的与FITC偶联的嵌合抗体温育1小时，抗体终浓度为20μg/ml。洗涤细胞，将其在含有2μg/ml碘化丙锭(允许门控活细胞)的300μl FACS缓冲液中重悬。在流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickinson)上分析细胞制品。
FACS分析表明浓缩的人源化抗体培养物上清液对荧光染料标记的嵌合抗体的封闭是剂量依赖的。使用同种型匹配的对照抗体时没有看到对嵌合抗体的剂量依赖封闭，这表明由这些不同人源化抗体组合产生的封闭效应是表位特异的；并且在人源化处理之后似乎仍保留了此表位特异性。
实施例7：CD45RB/RO结合分子的生物学活性
在本研究中，我们分析了，当存在于多克隆活化的原代人T细胞培养物中时，CD45RB/RO结合嵌合抗体是否(1)支持有特征性Treg表型的T细胞分化；(2)阻止或加强T细胞活化后的细胞凋亡；和(3)影响在再次刺激后特异抗原亚群和受体的表达。
在多克隆活化的T细胞中CD45RB/RO结合嵌合抗体加强细胞死亡
在CD45RB/RO结合嵌合抗体存在或缺乏(对照)的条件下，用抗-CD3加上抗-CD28单克隆抗体把原代T细胞(CD4+和CD8+T亚群的混合物)活化。在第2天通过洗涤去除多余的抗体。可被凋亡和坏死细胞吸收的7-氨基放线菌素D(7-AAD)作为DNA染料用于测定活化后的细胞死亡。结果显示，CD45RB/RO结合嵌合抗体存在下的T细胞活化增加了7-AAD阳性细胞部分，比活化后第2天多2倍。第7天，在CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的培养物和对照培养物中7-AAD阳性细胞部分再次相似。
CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的而非对照单克隆抗体处理的T细胞显示 出T调节细胞(Treg)表型
Treg细胞的标志是CD25以及负调节蛋白CTLA-4(CD152)的表达增加。CD45RB/RO结合嵌合抗体对初级和次级T细胞反应的功能抑制可能是由于诱导了Treg细胞所致。为了解决这个问题，用抗-CD3+CD28单克隆抗体活化T细胞并在CD45RB/RO结合嵌合抗体或抗-LPS对照单克隆抗体存在下培养。CTLA-4和CD25表达的时程显示，对照与CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的T细胞在第二次刺激后的第1天和第3天有显著差异，指示为Treg表型。
在CD45RB/RO结合嵌合抗体存在下胞内CTLA-4持继表达
已报道，在胞内存在相当大量的CTLA-4。因此，与表面CTLA-4染色平行，分析胞内CTLA-4表达。在刺激后的第4天看到T细胞培养物之间有适度差异。但是，经过延长的培养之后，只有在CD45RB/RO结合嵌合抗体处理过的T细胞中维持高水平的胞内CTLA-4，而对照T细胞没有。
CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的T细胞变成CD4和CD8双阳性
刺激之后，T细胞诱导和上调几种表面受体，例如CD25、CD152(CTLA-4)、CD154(CD40配体)等的表达。与之相比，CD4或CD8的表达水平被认为相对稳定。我们能重复地观察到活化后CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的T细胞的表面CD4和CD8抗原都有强烈的上升，而对照抗体处理的T细胞中则没有。CD4/CD8双阳性T细胞群的出现似乎是由于CD8+亚群上的CD4，和相反地CD4+亚群上的CD8的上调引起的。与之不同的是，对照培养物中有适度低百分数的双阳性T细胞。
CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的T细胞中IL-2受体α链有高表达但β 链的表达非常低
已知Treg细胞为CD25、IL-2受体α链组成型阳性。Treg细胞上三聚体IL-2受体的其他亚基的调节还不知道。近来我们对比了在如下T细胞表面上IL-2受体的β链，如CD122，的表达；所述T细胞在CD45RB/RO结合嵌合抗体存在或缺失下活化和增殖。结果显示，与对照培养物中T细胞相比，CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的T细胞有低约10倍的CD122表达。这个差异可能表明Treg细胞需要非IL-2的其他因子来增殖。
Example 8：本发明的序列(本发明的CDR序列以下划线显示)
SEQ ID NO：1
嵌合轻链氨基酸序列的部分
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSC RASQNIGTSIQWYQQRTNGSPRLLIR SSSESISGIPSRFSGSGSGTD
FTLSINSVESEDIADYYC QQSNTWPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO：2
嵌合重链氨基酸序列的部分
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT NYIIHWVKQEPGQGLEWIG YFNPYNHGTKYNEKFKGRA
TLTADKSSNTAYMDLSSLTSEDSAIYYCAR SGPYAWFDTWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：3
嵌合轻链氨基酸序列
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSC RASQNIGTSIQWYQQRTNGSPRLLIR SSSESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSI
NSVESEDIADYYC QQSNTWPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV
QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：4
嵌合重链氨基酸序列
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT NYIIHWVKQEPGQGLEWIG YFNPYNHGTKYNEKFKGRA
TLTADKSSNTAYMDLSSLTSEDSAIYYCAR SGPYAWFDTWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG
GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS
NTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW
YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：5
编码多肽SEQ ID NO：1的核苷酸序列
GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCT
GCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAGAACAAATGGTTCTCCAA
GGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCA
GGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAAC
AAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTTGAAATCAAA
SEQ ID NO：6
编码多肽SEQ ID NO：2的核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGACCTGAACTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGC
AAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCAGGAGCCTGGTCAGGGCC
TTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG
GGCCACACTAACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGGACCTCAGCAGCCTGACCTCTGAG
GACTCTGCGATCTACTACTGTGCAAGATCAGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGA
CCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：7
称作humV2(humV2＝VLm)的人源化轻链氨基酸序列的部分
DILLTQSPAT LSLSPGERAT FSC RASQNIG TSIQWYQQKT NGAPRLLIR S SSESISGIPS RFSGSGSGTD
FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ SNTWPFTFGQ GTKLEIK
SEQ ID NO：8
称作humV1(humV1＝VLh)的人源化轻链氨基酸序列的部分
DILLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQNIG TSIQWYQQKP GQAPRLLIR S SSESISGIPS RFSGSGSGTD
FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ SNTWPFTFGQ GTKLEIK
SEQ ID NO：9
称作VHE的人源化重链氨基酸序列的部分
EVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT  NYIIHWVKQE PGQGLEWIG Y FNPYNHGTKY
NEKFKGRATL TANKSISTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SG PYAWFDTWGQ GTTVTVSS
SEQ ID NO：10
称作VHQ的人源化重链氨基酸序列的部分
QVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT  NYIIHWVKQE PGQGLEWIG Y FNPYNHGTKY
NEKFKGRATL TANKSISTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SG PYAWFDTWGQ GTTVTVSS
SEQ ID NO：11
编码氨基酸序列SEQ ID NO：9的核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGAGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTGTCCTGC
AAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCAGGAGCCTGGTCAGGGCC
TTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG
GGCCACACTAACTGCAAACAAATCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGCGCTCTGA
GGACACTGCGGTCTACTACTGTGCAAGATCAGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTGGGGCCAAGGG
ACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：12
编码氨基酸序列SEQ ID NO：10的核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGAGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTGTCCTGC
AAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCAGGAGCCTGGTCAGGGCC
TTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG
GGCCACACTAACTGCAAACAAATCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGCGCTCTGA
GGACACTGCGGTCTACTACTGTGCAAGATCAGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTGGGGCCAAGGG
ACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：13
编码氨基酸序列SEQ ID NO：7的核苷酸序列
GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTCTGAGTCCAGGAGAAAGAGCCACTTTCTCCT
GCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAAAACAAATGGTGCTCCAA
GGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCA
GGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAAC
AAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTCGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
SEQ ID NO：14
编码氨基酸序列SEQ ID NO：8的核苷酸序列
GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTCTGAGTCCAGGAGAAAGAGCCACTCTCTCCT
GCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAAACCAGGTCAGGCTCCAA
GGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCA
GGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAAC
AAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTCGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
SEQ ID NO：15
表达载体HCMV-G1 HuAb-VHQ的核苷酸序列
(在3921-4274含有SEQ ID NO：12(VHQ)的人源化重链表达载体的完整DNA序列)
   1  AGCTTTTTGC AAAAGCCTAG GCCTCCAAAA AAGCCTCCTC ACTACTTCTG
  51  GAATAGCTCA GAGGCCGAGG CGGCCTCGGC CTCTGCATAA ATAAAAAAAA
 101  TTAGTCAGCC ATGGGGCGGA GAATGGGCGG AACTGGGCGG AGTTAGGGGC
 151  GGGATGGGCG GAGTTAGGGG CGGGACTATG GTTGCTGACT AATTGAGATG
 201  CATGCTTTGC ATACTTCTGC CTGCTGGGGA GCCTGGTTGC TGACTAATTG
 251  AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT GGGGAGCCTG GGGACTTTCC
 301  ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGCTG CCTCGCGCGT TTCGGTGATG
 351  ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC CGGAGACGGT CACAGCTTGT
 401  CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG CGTCAGCGGG
 451  TGTTGGCGGG TGTCGGGGCG CAGCCATGAC CCAGTCACGT AGCGATAGCG
 501  GAGTGTATAC TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGCAGATT GTACTGAGAG
 551  TGCACCATAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC
 601  CGCATCAGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT
 651  CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT
 701  TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC
 751  CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA
 801  TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA
 851  GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA
 901  AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT
 951  GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT
1001  GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG
1051  CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG
1101  TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA
1151  CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC
1201  TTGAAGTGGT   GGCCTAACTA   CGGCTACACT   AGAAGGACAG   TATTTGGTAT
1251  CTGCGCTCTG   CTGAAGCCAG   TTACCTTCGG   AAAAAGAGTT   GGTAGCTCTT
1301  GATCCGGCAA   ACAAACCACC   GCTGGTAGCG   GTGGTTTTTT   TGTTTGCAAG
1351  CAGCAGATTA   CGCGCAGAAA   AAAAGGATCT   CAAGAAGATC   CTTTGATCTT
1401  TTCTACGGGG   TCTGACGCTC   AGTGGAACGA   AAACTCACGT   TAAGGGATTT
1451  TGGTCATGAG   ATTATCAAAA   AGGATCTTCA   CCTAGATCCT   TTTAAATTAA
1501  AAATGAAGTT   TTAAATCAAT   CTAAAGTATA   TATGAGTAAA   CTTGGTCTGA
1551  CAGTTACCAA   TGCTTAATCA   GTGAGGCACC   TATCTCAGCG   ATCTGTCTAT
1601  TTCGTTCATC   CATAGTTGCC   TGACTCCCCG   TCGTGTAGAT   AACTACGATA
1651  CGGGAGGGCT   TACCATCTGG   CCCCAGTGCT   GCAATGATAC   CGCGAGACCC
1701  ACGCTCACCG   GCTCCAGATT   TATCAGCAAT   AAACCAGCCA   GCCGGAAGGG
1751  CCGAGCGCAG   AAGTGGTCCT   GCAACTTTAT   CCGCCTCCAT   CCAGTCTATT
1801  AATTGTTGCC   GGGAAGCTAG   AGTAAGTAGT   TCGCCAGTTA   ATAGTTTGCG
1851  CAACGTTGTT   GCCATTGCTG   CAGGCATCGT   GGTGTCACGC   TCGTCGTTTG
1901  GTATGGCTTC   ATTCAGCTCC   GGTTCCCAAC   GATCAAGGCG   AGTTACATGA
1951  TCCCCCATGT   TGTGCAAAAA   AGCGGTTAGC   TCCTTCGGTC   CTCCGATCGT
2001  TGTCAGAAGT   AAGTTGGCCG   CAGTGTTATC   ACTCATGGTT   ATGGCAGCAC
2051  TGCATAATTC   TCTTACTGTC   ATGCCATCCG   TAAGATGCTT   TTCTGTGACT
2101  GGTGAGTACT   CAACCAAGTC   ATTCTGAGAA   TAGTGTATGC   GGCGACCGAG
2151  TTGCTCTTGC   CCGGCGTCAA   CACGGGATAA   TACCGCGCCA   CATAGCAGAA
2201  CTTTAAAAGT   GCTCATCATT   GGAAAACGTT   CTTCGGGGCG   AAAACTCTCA
2251  AGGATCTTAC   CGCTGTTGAG   ATCCAGTTCG   ATGTAACCCA   CTCGTGCACC
2301  CAACTGATCT   TCAGCATCTT   TTACTTTCAC   CAGCGTTTCT   GGGTGAGCAA
2351  AAACAGGAAG   GCAAAATGCC   GCAAAAAAGG   GAATAAGGGC   GACACGGAAA
2401  TGTTGAATAC   TCATACTCTT   CCTTTTTCAA   TATTATTGAA   GCATTTATCA
2451  GGGTTATTGT   CTCATGAGCG   GATACATATT   TGAATGTATT   TAGAAAAATA
2501  AACAAATAGG   GGTTCCGCGC   ACATTTCCCC   GAAAAGTGCC   ACCTGACGTC
2551  TAAGAAACCA   TTATTATCAT   GACATTAACC   TATAAAAATA   GGCGTATCAC
2601  GAGGCCCTTT   CGTCTTCAAG   AATTCAGCTT   GGCTGCAGTG   AATAATAAAA
2651  TGTGTGTTTG   TCCGAAATAC   GCGTTTTGAG   ATTTCTGTCG   CCGACTAAAT
2701  TCATGTCGCG   CGATAGTGGT   GTTTATCGCC   GATAGAGATG   GCGATATTGG
2751  AAAAATCGAT   ATTTGAAAAT   ATGGCATATT   GAAAATGTCG   CCGATGTGAG
2801  TTTCTGTGTA   ACTGATATCG   CCATTTTTCC   AAAAGTGATT   TTTGGGCATA
2851  CGCGATATCT   GGCGATAGCG   CTTATATCGT   TTACGGGGGA   TGGCGATAGA
2901  CGACTTTGGT   GACTTGGGCG   ATTCTGTGTG   TCGCAAATAT   CGCAGTTTCG
2951  ATATAGGTGA   CAGACGATAT   GAGGCTATAT   CGCCGATAGA   GGCGACATCA
3001  AGCTGGCACA   TGGCCAATGC   ATATCGATCT   ATACATTGAA   TCAATATTGG
3051  CCATTAGCCA   TATTATTCAT   TGGTTATATA   GCATAAATCA   ATATTGGCTA
3101  TTGGCCATTG   CATACGTTGT   ATCCATATCA   TAATATGTAC   ATTTATATTG
3151  GCTCATGTCC   AACATTACCG   CCATGTTGAC   ATTGATTATT   GACTAGTTAT
3201  TAATAGTAAT   CAATTACGGG   GTCATTAGTT   CATAGCCCAT   ATATGGAGTT
3251  CCGCGTTACA   TAACTTACGG   TAAATGGCCC   GCCTGGCTGA   CCGCCCAACG
3301  ACCCCCGCCC   ATTGACGTCA   ATAATGACGT   ATGTTCCCAT   AGTAACGCCA
3351  ATAGGGACTT   TCCATTGACG   TCAATGGGTG   GAGTATTTAC   GGTAAACTGC
3401  CCACTTGGCA   GTACATCAAG   TGTATCATAT   GCCAAGTACG   CCCCCTATTG
3451   ACGTCAATGA   CGGTAAATGG   CCCGCCTGGC   ATTATGCCCA   GTACATGACC
3501   TTATGGGACT   TTCCTACTTG   GCAGTACATC   TACGTATTAG   TCATCGCTAT
3551   TACCATGGTG   ATGCGGTTTT   GGCAGTACAT   CAATGGGCGT   GGATAGCGGT
3601   TTGACTCACG   GGGATTTCCA   AGTCTCCACC   CCATTGACGT   CAATGGGAGT
3651   TTGTTTTGGC   ACCAAAATCA   ACGGGACTTT   CCAAAATGTC   GTAACAACTC
3701   CGCCCCATTG   ACGCAAATGG   GCGGTAGGCG   TGTACGGTGG   GAGGTCTATA
3751   TAAGCAGAGC   TCGTTTAGTG   AACCGTCAGA   TCGCCTGGAG   ACGCCATCCA
3801   CGCTGTTTTG   ACCTCCATAG   AAGACACCGG   GACCGATCCA   GCCTCCGCAA
3851   GCTTGCCGCC   ACCATGGACT   GGACCTGGAG   GGTGTTCTGC   CTGCTGGCCG
3901   TGGCCCCCGG   CGCCCACAGC   CAGGTGCAGC   TGGTGGAGTC   AGGAGCCGAA
3951   GTGAAAAAGC   CTGGGGCTTC   AGTGAAGGTG   TCCTGCAAGG   CCTCTGGATA
4001   CACATTCACT   AATTATATTA   TCCACTGGGT   GAAGCAGGAG   CCTGGTCAGG
4051   GCCTTGAATG   GATTGGATAT   TTTAATCCTT   ACAATCATGG   TACTAAGTAC
4101   AATGAGAAGT   TCAAAGGCAG   GGCCACACTA   ACTGCAAACA   AATCCATCAG
4151   CACAGCCTAC   ATGGAGCTCA   GCAGCCTGCG   CTCTGAGGAC   ACTGCGGTCT
4201   ACTACTGTGC   AAGATCAGGA   CCCTATGCCT   GGTTTGACAC   CTGGGGCCAA
4251   GGGACCACGG   TCACCGTCTC   CTCAGGTGAG   TTCTAGAAGG   ATCCCAAGCT
4301   AGCTTTCTGG   GGCAGGCCAG   GCCTGACCTT   GGCTTTGGGG   CAGGGAGGGG
4351   GCTAAGGTGA   GGCAGGTGGC   GCCAGCCAGG   TGCACACCCA   ATGCCCATGA
4401   GCCCAGACAC   TGGACGCTGA   ACCTCGCGGA   CAGTTAAGAA   CCCAGGGGCC
4451   TCTGCGCCCT   GGGCCCAGCT   CTGTCCCACA   CCGCGGTCAC   ATGGCACCAC
4501   CTCTCTTGCA   GCCTCCACCA   AGGGCCCATC   GGTCTTCCCC   CTGGCACCCT
4551   CCTCCAAGAG   CACCTCTGGG   GGCACAGCGG   CCCTGGGCTG   CCTGGTCAAG
4601   GACTACTTCC   CCGAACCGGT   GACGGTGTCG   TGGAACTCAG   GCGCCCTGAC
4651   CAGCGGCGTG   CACACCTTCC   CGGCTGTCCT   ACAGTCCTCA   GGACTCTACT
4701   CCCTCAGCAG   CGTGGTGACC   GTGCCCTCCA   GCAGCTTGGG   CACCCAGACC
4751   TACATCTGCA   ACGTGAATCA   CAAGCCCAGC   AACACCAAGG   TGGACAAGAA
4801   AGTTGGTGAG   AGGCCAGCAC   AGGGAGGGAG   GGTGTCTGCT   GGAAGCCAGG
4851   CTCAGCGCTC   CTGCCTGGAC   GCATCCCGGC   TATGCAGCCC   CAGTCCAGGG
4901   CAGCAAGGCA   GGCCCCGTCT   GCCTCTTCAC   CCGGAGGCCT   CTGCCCGCCC
4951   CACTCATGCT   CAGGGAGAGG   GTCTTCTGGC   TTTTTCCCCA   GGCTCTGGGC
5001   AGGCACAGGC   TAGGTGCCCC   TAACCCAGGC   CCTGCACACA   AAGGGGCAGG
5051   TGCTGGGCTC   AGACCTGCCA   AGAGCCATAT   CCGGGAGGAC   CCTGCCCCTG
5101   ACCTAAGCCC   ACCCCAAAGG   CCAAACTCTC   CACTCCCTCA   GCTCGGACAC
5151   CTTCTCTCCT   CCCAGATTCC   AGTAACTCCC   AATCTTCTCT   CTGCAGAGCC
5201   CAAATCTTGT   GACAAAACTC   ACACATGCCC   ACCGTGCCCA   GGTAAGCCAG
5251   CCCAGGCCTC   GCCCTCCAGC   TCAAGGCGGG   ACAGGTGCCC   TAGAGTAGCC
5301   TGCATCCAGG   GACAGGCCCC   AGCCGGGTGC   TGACACGTCC   ACCTCCATCT
5351   CTTCCTCAGC   ACCTGAACTC   CTGGGGGGAC   CGTCAGTCTT   CCTCTTCCCC
5401   CCAAAACCCA   AGGACACCCT   CATGATCTCC   CGGACCCCTG   AGGTCACATG
5451   CGTGGTGGTG   GACGTGAGCC   ACGAAGACCC   TGAGGTCAAG   TTCAACTGGT
5501   ACGTGGACGG   CGTGGAGGTG   CATAATGCCA   AGACAAAGCC   GCGGGAGGAG
5551   CAGTACAACA   GCACGTACCG   TGTGGTCAGC   GTCCTCACCG   TCCTGCACCA
5601   GGACTGGCTG   AATGGCAAGG   AGTACAAGTG   CAAGGTCTCC   AACAAAGCCC
5651   TCCCAGCCCC   CATCGAGAAA   ACCATCTCCA   AAGCCAAAGG   TGGGACCCGT
5701     GGGGTGCGAG   GGCCACATGG   ACAGAGGCCG   GCTCGGCCCA   CCCTCTGCCC
5751     TGAGAGTGAC   CGCTGTACCA   ACCTCTGTCC   CTACAGGGCA   GCCCCGAGAA
5801     CCACAGGTGT   ACACCCTGCC   CCCATCCCGG   GATGAGCTGA   CCAAGAACCA
5851     GGTCAGCCTG   ACCTGCCTGG   TCAAAGGCTT   CTATCCCAGC   GACATCGCCG
5901     TGGAGTGGGA   GAGCAATGGG   CAGCCGGAGA   ACAACTACAA   GACCACGCCT
5951     CCCGTGCTGG   ACTCCGACGG   CTCCTTCTTC   CTCTACAGCA   AGCTCACCGT
6001     GGACAAGAGC   AGGTGGCAGC   AGGGGAACGT   CTTCTCATGC   TCCGTGATGC
6051     ATGAGGCTCT   GCACAACCAC   TACACGCAGA   AGAGCCTCTC   CCTGTCTCCG
6101     GGTAAATGAG   TGCGACGGCC   GGCAAGCCCC   CGCTCCCCGG   GCTCTCGCGG
6151     TCGCACGAGG   ATGCTTGGCA   CGTACCCCCT   GTACATACTT   CCCGGGCGCC
6201     CAGCATGGAA   ATAAAGCACC   CAGCGCTGCC   CTGGGCCCCT   GCGAGACTGT
6251     GATGGTTCTT   TCCACGGGTC   AGGCCGAGTC   TGAGGCCTGA   GTGGCATGAG
6301     ATCTGATATC   ATCGATGAAT   TCGAGCTCGG   TACCCGGGGA   TCGATCCAGA
6351     CATGATAAGA   TACATTGATG   AGTTTGGACA   AACCACAACT   AGAATGCAGT
6401     GAAAAAAATG   CTTTATTTGT   GAAATTTGTG   ATGCTATTGC   TTTATTTGTA
6451     ACCATTATAA   GCTGCAATAA   ACAAGTTAAC   AACAACAATT   GCATTCATTT
6501     TATGTTTCAG   GTTCAGGGGG   AGGTGTGGGA   GGTTTTTTAA   AGCAAGTAAA
6551     ACCTCTACAA   ATGTGGTATG   GCTGATTATG   ATCTCTAGTC   AAGGCACTAT
6601     ACATCAAATA   TTCCTTATTA   ACCCCTTTAC   AAATTAAAAA   GCTAAAGGTA
6651     CACAATTTTT   GAGCATAGTT   ATTAATAGCA   GACACTCTAT   GCCTGTGTGG
6701     AGTAAGAAAA   AACAGTATGT   TATGATTATA   ACTGTTATGC   CTACTTATAA
6751     AGGTTACAGA   ATATTTTTCC   ATAATTTTCT   TGTATAGCAG   TGCAGCTTTT
6801     TCCTTTGTGG   TGTAAATAGC   AAAGCAAGCA   AGAGTTCTAT   TACTAAACAC
6851     AGCATGACTC   AAAAAACTTA   GCAATTCTGA   AGGAAAGTCC   TTGGGGTCTT
6901     CTACCTTTCT   CTTCTTTTTT   GGAGGAGTAG   AATGTTGAGA   GTCAGCAGTA
6951     GCCTCATCAT   CACTAGATGG   CATTTCTTCT   GAGCAAAACA   GGTTTTCCTC
7001     ATTAAAGGCA   TTCCACCACT   GCTCCCATTC   ATCAGTTCCA   TAGGTTGGAA
7051     TCTAAAATAC   ACAAACAATT   AGAATCAGTA   GTTTAACACA   TTATACACTT
7101     AAAAATTTTA   TATTTACCTT   AGAGCTTTAA   ATCTCTGTAG   GTAGTTTGTC
7151     CAATTATGTC   ACACCACAGA   AGTAAGGTTC   CTTCACAAAG   ATCCGGGACC
7201     AAAGCGGCCA   TCGTGCCTCC   CCACTCCTGC   AGTTCGGGGG   CATGGATGCG
7251     CGGATAGCCG   CTGCTGGTTT   CCTGGATGCC   GACGGATTTG   CACTGCCGGT
7301     AGAACTCCGC   GAGGTCGTCC   AGCCTCAGGC   AGCAGCTGAA   CCAACTCGCG
7351     AGGGGATCGA   GCCCGGGGTG   GGCGAAGAAC   TCCAGCATGA   GATCCCCGCG
7401     CTGGAGGATC   ATCCAGCCGG   CGTCCCGGAA   AACGATTCCG   AAGCCCAACC
7451     TTTCATAGAA   GGCGGCGGTG   GAATCGAAAT   CTCGTGATGG   CAGGTTGGGC
7501     GTCGCTTGGT   CGGTCATTTC   GAACCCCAGA   GTCCCGCTCA   GAAGAACTCG
7551     TCAAGAAGGC   GATAGAAGGC   GATGCGCTGC   GAATCGGGAG   CGGCGATACC
7601     GTAAAGCACG   AGGAAGCGGT   CAGCCCATTC   GCCGCCAAGC   TCTTCAGCAA
7651     TATCACGGGT   AGCCAACGCT   ATGTCCTGAT   AGCGGTCCGC   CACACCCAGC
7701     CGGCCACAGT   CGATGAATCC   AGAAAAGCGG   CCATTTTCCA   CCATGATATT
7751     CGGCAAGCAG   GCATCGCCAT   GGGTCACGAC   GAGATCCTCG   CCGTCGGGCA
7801     TGCGCGCCTT   GAGCCTGGCG   AACAGTTCGG   CTGGCGCGAG   CCCCTGATGC
7851     TCTTCGTCCA   GATCATCCTG   ATCGACAAGA   CCGGCTTCCA   TCCGAGTACG
7901     TGCTCGCTCG   ATGCGATGTT   TCGCTTGGTG   GTCGAATGGG   CAGGTAGCCG
7951  GATCAAGCGT ATGCAGCCGC CGCATTGCAT CAGCCATGAT GGATACTTTC
8001  TCGGCAGGAG CAAGGTGAGA TGACAGGAGA TCCTGCCCCG GCACTTCGCC
8051  CAATAGCAGC CAGTCCCTTC CCGCTTCAGT GACAACGTCG AGCACAGCTG
8101  CGCAAGGAAC GCCCGTCGTG GCCAGCCACG ATAGCCGCGC TGCCTCGTCC
8151  TGCAGTTCAT TCAGGGCACC GGACAGGTCG GTCTTGACAA AAAGAACCGG
8201  GCGCCCCTGC GCTGACAGCC GGAACACGGC GGCATCAGAG CAGCCGATTG
8251  TCTGTTGTGC CCAGTCATAG CCGAATAGCC TCTCCACCCA AGCGGCCGGA
8301  GAACCTGCGT GCAATCCATC TTGTTCAATC ATGCGAAACG ATCCTCATCC
8351  TGTCTCTTGA TCAGATCTTG ATCCCCTGCG CCATCAGATC CTTGGCGGCA
8401  AGAAAGCCAT CCAGTTTACT TTGCAGGGCT TCCCAACCTT ACCAGAGGGC
8451  GCCCCAGCTG GCAATTCCGG TTCGCTTGCT GTCCATAAAA CCGCCCAGTC
8501  TAGCTATCGC CATGTAAGCC CACTGCAAGC TACCTGCTTT CTCTTTGCGC
8551  TTGCGTTTTC CCTTGTCCAG ATAGCCCAGT AGCTGACATT CATCCGGGGT
8601  CAGCACCGTT TCTGCGGACT GGCTTTCTAC GTGTTCCGCT TCCTTTAGCA
8651  GCCCTTGCGC  CCTGAGTGCT TGCGGCAGCG TGAAGCT
SEQ ID NO：16
表达载体HCMV-G1 HuAb-VHE的核苷酸序列
(在3921-4274含有SEQ ID NO：11(VHE)的人源化重链表达载体的完整DNA序列)
   1  AGCTTTTTGC AAAAGCCTAG GCCTCCAAAA AAGCCTCCTC ACTACTTCTG
  51  GAATAGCTCA GAGGCCGAGG CGGCCTCGGC CTCTGCATAA ATAAAAAAAA
 101  TTAGTCAGCC ATGGGGCGGA GAATGGGCGG AACTGGGCGG AGTTAGGGGC
 151  GGGATGGGCG GAGTTAGGGG CGGGACTATG GTTGCTGACT AATTGAGATG
 201  CATGCTTTGC ATACTTCTGC CTGCTGGGGA GCCTGGTTGC TGACTAATTG
 251  AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT GGGGAGCCTG GGGACTTTCC
 301  ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGCTG CCTCGCGCGT TTCGGTGATG
 351  ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC CGGAGACGGT CACAGCTTGT
 401  CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG CGTCAGCGGG
 451  TGTTGGCGGG TGTCGGGGCG CAGCCATGAC CCAGTCACGT AGCGATAGCG
 501  GAGTGTATAC TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGCAGATT GTACTGAGAG
 551  TGCACCATAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC
 601  CGCATCAGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT
 651  CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT
 701  TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC
 751  CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA
 801  TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA
 851  GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA
 901  AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT
 951  GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT
1001  GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG
1051  CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG
1101  TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA
1151    CTGGTAACAG   GATTAGCAGA   GCGAGGTATG   TAGGCGGTGC   TACAGAGTTC
1201    TTGAAGTGGT   GGCCTAACTA   CGGCTACACT   AGAAGGACAG   TATTTGGTAT
1251    CTGCGCTCTG   CTGAAGCCAG   TTACCTTCGG   AAAAAGAGTT   GGTAGCTCTT
1301    GATCCGGCAA   ACAAACCACC   GCTGGTAGCG   GTGGTTTTTT   TGTTTGCAAG
1351    CAGCAGATTA   CGCGCAGAAA   AAAAGGATCT   CAAGAAGATC   CTTTGATCTT
1401    TTCTACGGGG   TCTGACGCTC   AGTGGAACGA   AAACTCACGT   TAAGGGATTT
1451    TGGTCATGAG   ATTATCAAAA   AGGATCTTCA   CCTAGATCCT   TTTAAATTAA
1501    AAATGAAGTT   TTAAATCAAT   CTAAAGTATA   TATGAGTAAA   CTTGGTCTGA
1551    CAGTTACCAA   TGCTTAATCA   GTGAGGCACC   TATCTCAGCG   ATCTGTCTAT
1601    TTCGTTCATC   CATAGTTGCC   TGACTCCCCG   TCGTGTAGAT   AACTACGATA
1651    CGGGAGGGCT   TACCATCTGG   CCCCAGTGCT   GCAATGATAC   CGCGAGACCC
1701    ACGCTCACCG   GCTCCAGATT   TATCAGCAAT   AAACCAGCCA   GCCGGAAGGG
1751    CCGAGCGCAG   AAGTGGTCCT   GCAACTTTAT   CCGCCTCCAT   CCAGTCTATT
1801    AATTGTTGCC   GGGAAGCTAG   AGTAAGTAGT   TCGCCAGTTA   ATAGTTTGCG
1851    CAACGTTGTT   GCCATTGCTG   CAGGCATCGT   GGTGTCACGC   TCGTCGTTTG
1901    GTATGGCTTC   ATTCAGCTCC   GGTTCCCAAC   GATCAAGGCG   AGTTACATGA
1951    TCCCCCATGT   TGTGCAAAAA   AGCGGTTAGC   TCCTTCGGTC   CTCCGATCGT
2001    TGTCAGAAGT   AAGTTGGCCG   CAGTGTTATC   ACTCATGGTT   ATGGCAGCAC
2051    TGCATAATTC   TCTTACTGTC   ATGCCATCCG   TAAGATGCTT   TTCTGTGACT
2101    GGTGAGTACT   CAACCAAGTC   ATTCTGAGAA   TAGTGTATGC   GGCGACCGAG
2151    TTGCTCTTGC   CCGGCGTCAA   CACGGGATAA   TACCGCGCCA   CATAGCAGAA
2201    CTTTAAAAGT   GCTCATCATT   GGAAAACGTT   CTTCGGGGCG   AAAACTCTCA
2251    AGGATCTTAC   CGCTGTTGAG   ATCCAGTTCG   ATGTAACCCA   CTCGTGCACC
2301    CAACTGATCT   TCAGCATCTT   TTACTTTCAC   CAGCGTTTCT   GGGTGAGCAA
2351    AAACAGGAAG   GCAAAATGCC   GCAAAAAAGG   GAATAAGGGC   GACACGGAAA
2401    TGTTGAATAC   TCATACTCTT   CCTTTTTCAA   TATTATTGAA   GCATTTATCA
2451    GGGTTATTGT   CTCATGAGCG   GATACATATT   TGAATGTATT   TAGAAAAATA
2501    AACAAATAGG   GGTTCCGCGC   ACATTTCCCC   GAAAAGTGCC   ACCTGACGTC
2551    TAAGAAACCA   TTATTATCAT   GACATTAACC   TATAAAAATA   GGCGTATCAC
2601    GAGGCCCTTT   CGTCTTCAAG   AATTCAGCTT   GGCTGCAGTG   AATAATAAAA
2651    TGTGTGTTTG   TCCGAAATAC   GCGTTTTGAG   ATTTCTGTCG   CCGACTAAAT
2701    TCATGTCGCG   CGATAGTGGT   GTTTATCGCC   GATAGAGATG   GCGATATTGG
2751    AAAAATCGAT   ATTTGAAAAT   ATGGCATATT   GAAAATGTCG   CCGATGTGAG
2801    TTTCTGTGTA   ACTGATATCG   CCATTTTTCC   AAAAGTGATT   TTTGGGCATA
2851    CGCGATATCT   GGCGATAGCG   CTTATATCGT   TTACGGGGGA   TGGCGATAGA
2901    CGACTTTGGT   GACTTGGGCG   ATTCTGTGTG   TCGCAAATAT   CGCAGTTTCG
2951    ATATAGGTGA   CAGACGATAT   GAGGCTATAT   CGCCGATAGA   GGCGACATCA
3001    AGCTGGCACA   TGGCCAATGC   ATATCGATCT   ATACATTGAA   TCAATATTGG
3051    CCATTAGCCA   TATTATTCAT   TGGTTATATA   GCATAAATCA   ATATTGGCTA
3101    TTGGCCATTG   CATACGTTGT   ATCCATATCA   TAATATGTAC   ATTTATATTG
3151    GCTCATGTCC   AACATTACCG   CCATGTTGAC   ATTGATTATT   GACTAGTTAT
3201    TAATAGTAAT   CAATTACGGG   GTCATTAGTT   CATAGCCCAT   ATATGGAGTT
3251    CCGCGTTACA   TAACTTACGG   TAAATGGCCC   GCCTGGCTGA   CCGCCCAACG
3301    ACCCCCGCCC   ATTGACGTCA   ATAATGACGT   ATGTTCCCAT   AGTAACGCCA
3351    ATAGGGACTT   TCCATTGACG   TCAATGGGTG   GAGTATTTAC   GGTAAACTGC
3401   CCACTTGGCA   GTACATCAAG   TGTATCATAT   GCCAAGTACG   CCCCCTATTG
3451   ACGTCAATGA   CGGTAAATGG   CCCGCCTGGC   ATTATGCCCA   GTACATGACC
3501   TTATGGGACT   TTCCTACTTG   GCAGTACATC   TACGTATTAG   TCATCGCTAT
3551   TACCATGGTG   ATGCGGTTTT   GGCAGTACAT   CAATGGGCGT   GGATAGCGGT
3601   TTGACTCACG   GGGATTTCCA   AGTCTCCACC   CCATTGACGT   CAATGGGAGT
3651   TTGTTTTGGC   ACCAAAATCA   ACGGGACTTT   CCAAAATGTC   GTAACAACTC
3701   CGCCCCATTG   ACGCAAATGG   GCGGTAGGCG   TGTACGGTGG   GAGGTCTATA
3751   TAAGCAGAGC   TCGTTTAGTG   AACCGTCAGA   TCGCCTGGAG   ACGCCATCCA
3801   CGCTGTTTTG   ACCTCCATAG   AAGACACCGG   GACCGATCCA   GCCTCCGCAA
3851   GCTTGCCGCC   ACCATGGACT   GGACCTGGAG   GGTGTTCTGC   CTGCTGGCCG
3901   TGGCCCCCGG   CGCCCACAGC   GAGGTGCAGC   TGGTGGAGTC   AGGAGCCGAA
3951   GTGAAAAAGC   CTGGGGCTTC   AGTGAAGGTG   TCCTGCAAGG   CCTCTGGATA
4001   CACATTCACT   AATTATATTA   TCCACTGGGT   GAAGCAGGAG   CCTGGTCAGG
4051   GCCTTGAATG   GATTGGATAT   TTTAATCCTT   ACAATCATGG   TACTAAGTAC
4101   AATGAGAAGT   TCAAAGGCAG   GGCCACACTA   ACTGCAAACA   AATCCATCAG
4151   CACAGCCTAC   ATGGAGCTCA   GCAGCCTGCG   CTCTGAGGAC   ACTGCGGTCT
4201   ACTACTGTGC   AAGATCAGGA   CCCTATGCCT   GGTTTGACAC   CTGGGGCCAA
4251   GGGACCACGG   TCACCGTCTC   CTCAGGTGAG   TTCTAGAAGG   ATCCCAAGCT
4301   AGCTTTCTGG   GGCAGGCCAG   GCCTGACCTT   GGCTTTGGGG   CAGGGAGGGG
4351   GCTAAGGTGA   GGCAGGTGGC   GCCAGCCAGG   TGCACACCCA   ATGCCCATGA
4401   GCCCAGACAC   TGGACGCTGA   ACCTCGCGGA   CAGTTAAGAA   CCCAGGGGCC
4451   TCTGCGCCCT   GGGCCCAGCT   CTGTCCCACA   CCGCGGTCAC   ATGGCACCAC
4501   CTCTCTTGCA   GCCTCCACCA   AGGGCCCATC   GGTCTTCCCC   CTGGCACCCT
4551   CCTCCAAGAG   CACCTCTGGG   GGCACAGCGG   CCCTGGGCTG   CCTGGTCAAG
4601   GACTACTTCC   CCGAACCGGT   GACGGTGTCG   TGGAACTCAG   GCGCCCTGAC
4651   CAGCGGCGTG   CACACCTTCC   CGGCTGTCCT   ACAGTCCTCA   GGACTCTACT
4701   CCCTCAGCAG   CGTGGTGACC   GTGCCCTCCA   GCAGCTTGGG   CACCCAGACC
4751   TACATCTGCA   ACGTGAATCA   CAAGCCCAGC   AACACCAAGG   TGGACAAGAA
4801   AGTTGGTGAG   AGGCCAGCAC   AGGGAGGGAG   GGTGTCTGCT   GGAAGCCAGG
4851   CTCAGCGCTC   CTGCCTGGAC   GCATCCCGGC   TATGCAGCCC   CAGTCCAGGG
4901   CAGCAAGGCA   GGCCCCGTCT   GCCTCTTCAC   CCGGAGGCCT   CTGCCCGCCC
4951   CACTCATGCT   CAGGGAGAGG   GTCTTCTGGC   TTTTTCCCCA   GGCTCTGGGC
5001   AGGCACAGGC   TAGGTGCCCC   TAACCCAGGC   CCTGCACACA   AAGGGGCAGG
5051   TGCTGGGCTC   AGACCTGCCA   AGAGCCATAT   CCGGGAGGAC   CCTGCCCCTG
5101   ACCTAAGCCC   ACCCCAAAGG   CCAAACTCTC   CACTCCCTCA   GCTCGGACAC
5151   CTTCTCTCCT   CCCAGATTCC   AGTAACTCCC   AATCTTCTCT   CTGCAGAGCC
5201   CAAATCTTGT   GACAAAACTC   ACACATGCCC   ACCGTGCCCA   GGTAAGCCAG
5251   CCCAGGCCTC   GCCCTCCAGC   TCAAGGCGGG   ACAGGTGCCC   TAGAGTAGCC
5301   TGCATCCAGG   GACAGGCCCC   AGCCGGGTGC   TGACACGTCC   ACCTCCATCT
5351   CTTCCTCAGC   ACCTGAACTC   CTGGGGGGAC   CGTCAGTCTT   CCTCTTCCCC
5401   CCAAAACCCA   AGGACACCCT   CATGATCTCC   CGGACCCCTG   AGGTCACATG
5451   CGTGGTGGTG   GACGTGAGCC   ACGAAGACCC   TGAGGTCAAG   TTCAACTGGT
5501   ACGTGGACGG   CGTGGAGGTG   CATAATGCCA   AGACAAAGCC   GCGGGAGGAG
5551   CAGTACAACA   GCACGTACCG   TGTGGTCAGC   GTCCTCACCG   TCCTGCACCA
5601   GGACTGGCTG   AATGGCAAGG   AGTACAAGTG   CAAGGTCTCC   AACAAAGCCC
5651  TCCCAGCCCC   CATCGAGAAA   ACCATCTCCA   AAGCCAAAGG   TGGGACCCGT
5701  GGGGTGCGAG   GGCCACATGG   ACAGAGGCCG   GCTCGGCCCA   CCCTCTGCCC
5751  TGAGAGTGAC   CGCTGTACCA   ACCTCTGTCC   CTACAGGGCA   GCCCCGAGAA
5801  CCACAGGTGT   ACACCCTGCC   CCCATCCCGG   GATGAGCTGA   CCAAGAACCA
5851  GGTCAGCCTG   ACCTGCCTGG   TCAAAGGCTT   CTATCCCAGC   GACATCGCCG
5901  TGGAGTGGGA   GAGCAATGGG   CAGCCGGAGA   ACAACTACAA   GACCACGCCT
5951  CCCGTGCTGG   ACTCCGACGG   CTCCTTCTTC   CTCTACAGCA   AGCTCACCGT
6001  GGACAAGAGC   AGGTGGCAGC   AGGGGAACGT   CTTCTCATGC   TCCGTGATGC
6051  ATGAGGCTCT   GCACAACCAC   TACACGCAGA   AGAGCCTCTC   CCTGTCTCCG
6101  GGTAAATGAG   TGCGACGGCC   GGCAAGCCCC   CGCTCCCCGG   GCTCTCGCGG
6151  TCGCACGAGG   ATGCTTGGCA   CGTACCCCCT   GTACATACTT   CCCGGGCGCC
6201  CAGCATGGAA   ATAAAGCACC   CAGCGCTGCC   CTGGGCCCCT   GCGAGACTGT
6251  GATGGTTCTT   TCCACGGGTC   AGGCCGAGTC   TGAGGCCTGA   GTGGCATGAG
6301  ATCTGATATC   ATCGATGAAT   TCGAGCTCGG   TACCCGGGGA   TCGATCCAGA
6351  CATGATAAGA   TACATTGATG   AGTTTGGACA   AACCACAACT   AGAATGCAGT
6401  GAAAAAAATG   CTTTATTTGT   GAAATTTGTG   ATGCTATTGC   TTTATTTGTA
6451  ACCATTATAA   GCTGCAATAA   ACAAGTTAAC   AACAACAATT   GCATTCATTT
6501  TATGTTTCAG   GTTCAGGGGG   AGGTGTGGGA   GGTTTTTTAA   AGCAAGTAAA
6551  ACCTCTACAA   ATGTGGTATG   GCTGATTATG   ATCTCTAGTC   AAGGCACTAT
6601  ACATCAAATA   TTCCTTATTA   ACCCCTTTAC   AAATTAAAAA   GCTAAAGGTA
6651  CACAATTTTT   GAGCATAGTT   ATTAATAGCA   GACACTCTAT   GCCTGTGTGG
6701  AGTAAGAAAA   AACAGTATGT   TATGATTATA   ACTGTTATGC   CTACTTATAA
6751  AGGTTACAGA   ATATTTTTCC   ATAATTTTCT   TGTATAGCAG   TGCAGCTTTT
6801  TCCTTTGTGG   TGTAAATAGC   AAAGCAAGCA   AGAGTTCTAT   TACTAAACAC
6851  AGCATGACTC   AAAAAACTTA   GCAATTCTGA   AGGAAAGTCC   TTGGGGTCTT
6901  CTACCTTTCT   CTTCTTTTTT   GGAGGAGTAG   AATGTTGAGA   GTCAGCAGTA
6951  GCCTCATCAT   CACTAGATGG   CATTTCTTCT   GAGCAAAACA   GGTTTTCCTC
7001  ATTAAAGGCA   TTCCACCACT   GCTCCCATTC   ATCAGTTCCA   TAGGTTGGAA
7051  TCTAAAATAC   ACAAACAATT   AGAATCAGTA   GTTTAACACA   TTATACACTT
7101  AAAAATTTTA   TATTTACCTT   AGAGCTTTAA   ATCTCTGTAG   GTAGTTTGTC
7151  CAATTATGTC   ACACCACAGA   AGTAAGGTTC   CTTCACAAAG   ATCCGGGACC
7201  AAAGCGGCCA   TCGTGCCTCC   CCACTCCTGC   AGTTCGGGGG   CATGGATGCG
7251  CGGATAGCCG   CTGCTGGTTT   CCTGGATGCC   GACGGATTTG   CACTGCCGGT
7301  AGAACTCCGC   GAGGTCGTCC   AGCCTCAGGC   AGCAGCTGAA   CCAACTCGCG
7351  AGGGGATCGA   GCCCGGGGTG   GGCGAAGAAC   TCCAGCATGA   GATCCCCGCG
7401  CTGGAGGATC   ATCCAGCCGG   CGTCCCGGAA   AACGATTCCG   AAGCCCAACC
7451  TTTCATAGAA   GGCGGCGGTG   GAATCGAAAT   CTCGTGATGG   CAGGTTGGGC
7501  GTCGCTTGGT   CGGTCATTTC   GAACCCCAGA   GTCCCGCTCA   GAAGAACTCG
7551  TCAAGAAGGC   GATAGAAGGC   GATGCGCTGC   GAATCGGGAG   CGGCGATACC
7601  GTAAAGCACG   AGGAAGCGGT   CAGCCCATTC   GCCGCCAAGC   TCTTCAGCAA
7651  TATCACGGGT   AGCCAACGCT   ATGTCCTGAT   AGCGGTCCGC   CACACCCAGC
7701  CGGCCACAGT   CGATGAATCC   AGAAAAGCGG   CCATTTTCCA   CCATGATATT
7751  CGGCAAGCAG   GCATCGCCAT   GGGTCACGAC   GAGATCCTCG   CCGTCGGGCA
7801  TGCGCGCCTT   GAGCCTGGCG   AACAGTTCGG   CTGGCGCGAG   CCCCTGATGC
7851  TCTTCGTCCA   GATCATCCTG   ATCGACAAGA   CCGGCTTCCA   TCCGAGTACG
7901  TGCTCGCTCG ATGCGATGTT TCGCTTGGTG GTCGAATGGG CAGGTAGCCG
7951  GATCAAGCGT ATGCAGCCGC CGCATTGCAT CAGCCATGAT GGATACTTTC
8001  TCGGCAGGAG CAAGGTGAGA TGACAGGAGA TCCTGCCCCG GCACTTCGCC
8051  CAATAGCAGC CAGTCCCTTC CCGCTTCAGT GACAACGTCG AGCACAGCTG
8101  CGCAAGGAAC GCCCGTCGTG GCCAGCCACG ATAGCCGCGC TGCCTCGTCC
8151  TGCAGTTCAT TCAGGGCACC GGACAGGTCG GTCTTGACAA AAAGAACCGG
8201  GCGCCCCTGC GCTGACAGCC GGAACACGGC GGCATCAGAG CAGCCGATTG
8251  TCTGTTGTGC CCAGTCATAG CCGAATAGCC TCTCCACCCA AGCGGCCGGA
8301  GAACCTGCGT GCAATCCATC TTGTTCAATC ATGCGAAACG ATCCTCATCC
8351  TGTCTCTTGA TCAGATCTTG ATCCCCTGCG CCATCAGATC CTTGGCGGCA
8401  AGAAAGCCAT CCAGTTTACT TTGCAGGGCT TCCCAACCTT ACCAGAGGGC
8451  GCCCCAGCTG GCAATTCCGG TTCGCTTGCT GTCCATAAAA CCGCCCAGTC
8501  TAGCTATCGC CATGTAAGCC CACTGCAAGC TACCTGCTTT CTCTTTGCGC
8551  TTGCGTTTTC CCTTGTCCAG ATAGCCCAGT AGCTGACATT CATCCGGGGT
8601  CAGCACCGTT TCTGCGGACT GGCTTTCTAC GTGTTCCGCT TCCTTTAGCA
8651  GCCCTTGCGC CCTGAGTGCT TGCGGCAGCG TGAAGCT
SEQ ID NO：17
表达载体HCMV-K HuAb-VL1 hum V1的核苷酸序列
(在3964-4284含有SEQ ID NO：14(humV1＝VLh)的人源化轻链表达载体的完整DNA序列)
   1  CTAGCTTTTT GCAAAAGCCT AGGCCTCCAA AAAAGCCTCC TCACTACTTC
  51  TGGAATAGCT CAGAGGCCGA GGCGGCCTCG GCCTCTGCAT AAATAAAAAA
 101  AATTAGTCAG CCATGGGGCG GAGAATGGGC GGAACTGGGC GGAGTTAGGG
 151  GCGGGATGGG CGGAGTTAGG GGCGGGACTA TGGTTGCTGA CTAATTGAGA
 201  TGCATGCTTT GCATACTTCT GCCTGCTGGG GAGCCTGGTT GCTGACTAAT
 251  TGAGATGCAT GCTTTGCATA CTTCTGCCTG CTGGGGAGCC TGGGGACTTT
 301  CCACACCCTA ACTGACACAC ATTCCACAGC TGCCTCGCGC GTTTCGGTGA
 351  TGACGGTGAA AACCTCTGAC ACATGCAGCT CCCGGAGACG GTCACAGCTT
 401  GTCTGTAAGC GGATGCCGGG AGCAGACAAG CCCGTCAGGG CGCGTCAGCG
 451  GGTGTTGGCG GGTGTCGGGG CGCAGCCATG ACCCAGTCAC GTAGCGATAG
 501  CGGAGTGTAT ACTGGCTTAA CTATGCGGCA TCAGAGCAGA TTGTACTGAG
 551  AGTGCACCAT ATGCGGTGTG AAATACCGCA CAGATGCGTA AGGAGAAAAT
 601  ACCGCATCAG GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC TCACTGACTC GCTGCGCTCG
 651  GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC GGTATCAGCT CACTCAAAGG CGGTAATACG
 701  GTTATCCACA GAATCAGGGG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG
 751  GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC
 801  CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA
 851  GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG
 901  GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC
 951  CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC ATAGCTCACG
1001  CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG
1051  TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT
1101   CGTCTTGAGT   CCAACCCGGT   AAGACACGAC   TTATCGCCAC   TGGCAGCAGC
1151   CACTGGTAAC   AGGATTAGCA   GAGCGAGGTA   TGTAGGCGGT   GCTACAGAGT
1201   TCTTGAAGTG   GTGGCCTAAC   TACGGCTACA   CTAGAAGGAC   AGTATTTGGT
1251   ATCTGCGCTC   TGCTGAAGCC   AGTTACCTTC   GGAAAAAGAG   TTGGTAGCTC
1301   TTGATCCGGC   AAACAAACCA   CCGCTGGTAG   CGGTGGTTTT   TTTGTTTGCA
1351   AGCAGCAGAT   TACGCGCAGA   AAAAAAGGAT   CTCAAGAAGA   TCCTTTGATC
1401   TTTTCTACGG   GGTCTGACGC   TCAGTGGAAC   GAAAACTCAC   GTTAAGGGAT
1451   TTTGGTCATG   AGATTATCAA   AAAGGATCTT   CACCTAGATC   CTTTTAAATT
1501   AAAAATGAAG   TTTTAAATCA   ATCTAAAGTA   TATATGAGTA   AACTTGGTCT
1551   GACAGTTACC   AATGCTTAAT   CAGTGAGGCA   CCTATCTCAG   CGATCTGTCT
1601   ATTTCGTTCA   TCCATAGTTG   CCTGACTCCC   CGTCGTGTAG   ATAACTACGA
1651   TACGGGAGGG   CTTACCATCT   GGCCCCAGTG   CTGCAATGAT   ACCGCGAGAC
1701   CCACGCTCAC   CGGCTCCAGA   TTTATCAGCA   ATAAACCAGC   CAGCCGGAAG
1751   GGCCGAGCGC   AGAAGTGGTC   CTGCAACTTT   ATCCGCCTCC   ATCCAGTCTA
1801   TTAATTGTTG   CCGGGAAGCT   AGAGTAAGTA   GTTCGCCAGT   TAATAGTTTG
1851   CGCAACGTTG   TTGCCATTGC   TGCAGGCATC   GTGGTGTCAC   GCTCGTCGTT
1901   TGGTATGGCT   TCATTCAGCT   CCGGTTCCCA   ACGATCAAGG   CGAGTTACAT
1951   GATCCCCCAT   GTTGTGCAAA   AAAGCGGTTA   GCTCCTTCGG   TCCTCCGATC
2001   GTTGTCAGAA   GTAAGTTGGC   CGCAGTGTTA   TCACTCATGG   TTATGGCAGC
2051   ACTGCATAAT   TCTCTTACTG   TCATGCCATC   CGTAAGATGC   TTTTCTGTGA
2101   CTGGTGAGTA   CTCAACCAAG   TCATTCTGAG   AATAGTGTAT   GCGGCGACCG
2151   AGTTGCTCTT   GCCCGGCGTC   AACACGGGAT   AATACCGCGC   CACATAGCAG
2201   AACTTTAAAA   GTGCTCATCA   TTGGAAAACG   TTCTTCGGGG   CGAAAACTCT
2251   CAAGGATCTT   ACCGCTGTTG   AGATCCAGTT   CGATGTAACC   CACTCGTGCA
2301   CCCAACTGAT   CTTCAGCATC   TTTTACTTTC   ACCAGCGTTT   CTGGGTGAGC
2351   AAAAACAGGA   AGGCAAAATG   CCGCAAAAAA   GGGAATAAGG   GCGACACGGA
2401   AATGTTGAAT   ACTCATACTC   TTCCTTTTTC   AATATTATTG   AAGCATTTAT
2451   CAGGGTTATT   GTCTCATGAG   CGGATACATA   TTTGAATGTA   TTTAGAAAAA
2501   TAAACAAATA   GGGGTTCCGC   GCACATTTCC   CCGAAAAGTG   CCACCTGACG
2551   TCTAAGAAAC   CATTATTATC   ATGACATTAA   CCTATAAAAA   TAGGCGTATC
2601   ACGAGGCCCT   TTCGTCTTCA   AGAATTCAGC   TTGGCTGCAG   TGAATAATAA
2651   AATGTGTGTT   TGTCCGAAAT   ACGCGTTTTG   AGATTTCTGT   CGCCGACTAA
2701   ATTCATGTCG   CGCGATAGTG   GTGTTTATCG   CCGATAGAGA   TGGCGATATT
2751   GGAAAAATCG   ATATTTGAAA   ATATGGCATA   TTGAAAATGT   CGCCGATGTG
2801   AGTTTCTGTG   TAACTGATAT   CGCCATTTTT   CCAAAAGTGA   TTTTTGGGCA
2851   TACGCGATAT   CTGGCGATAG   CGCTTATATC   GTTTACGGGG   GATGGCGATA
2901   GACGACTTTG   GTGACTTGGG   CGATTCTGTG   TGTCGCAAAT   ATCGCAGTTT
2951   CGATATAGGT   GACAGACGAT   ATGAGGCTAT   ATCGCCGATA   GAGGCGACAT
3001   CAAGCTGGCA   CATGGCCAAT   GCATATCGAT   CTATACATTG   AATCAATATT
3051   GGCCATTAGC   CATATTATTC   ATTGGTTATA   TAGCATAAAT   CAATATTGGC
3101   TATTGGCCAT   TGCATACGTT   GTATCCATAT   CATAATATGT   ACATTTATAT
3151   TGGCTCATGT   CCAACATTAC   CGCCATGTTG   ACATTGATTA   TTGACTAGTT
3201   ATTAATAGTA   ATCAATTACG   GGGTCATTAG   TTCATAGCCC   ATATATGGAG
3251   TTCCGCGTTA   CATAACTTAC   GGTAAATGGC   CCGCCTGGCT   GACCGCCCAA
3301   CGACCCCCGC   CCATTGACGT   CAATAATGAC   GTATGTTCCC   ATAGTAACGC
3351  CAATAGGGAC   TTTCCATTGA   CGTCAATGGG   TGGAGTATTT   ACGGTAAACT
3401  GCCCACTTGG   CAGTACATCA   AGTGTATCAT   ATGCCAAGTA   CGCCCCCTAT
3451  TGACGTCAAT   GACGGTAAAT   GGCCCGCCTG   GCATTATGCC   CAGTACATGA
3501  CCTTATGGGA   CTTTCCTACT   TGGCAGTACA   TCTACGTATT   AGTCATCGCT
3551  ATTACCATGG   TGATGCGGTT   TTGGCAGTAC   ATCAATGGGC   GTGGATAGCG
3601  GTTTGACTCA   CGGGGATTTC   CAAGTCTCCA   CCCCATTGAC   GTCAATGGGA
3651  GTTTGTTTTG   GCACCAAAAT   CAACGGGACT   TTCCAAAATG   TCGTAACAAC
3701  TCCGCCCCAT   TGACGCAAAT   GGGCGGTAGG   CGTGTACGGT   GGGAGGTCTA
3751  TATAAGCAGA   GCTCGTTTAG   TGAACCGTCA   GATCGCCTGG   AGACGCCATC
3801  CACGCTGTTT   TGACCTCCAT   AGAAGACACC   GGGACCGATC   CAGCCTCCGC
3851  AAGCTTGATA   TCGAATTCCT   GCAGCCCGGG   GGATCCGCCC   GCTTGCCGCC
3901  ACCATGGAGA   CCCCCGCCCA   GCTGCTGTTC   CTGCTGCTGC   TGTGGCTGCC
3951  CGACACCACC   GGCGACATTC   TGCTGACCCA   GTCTCCAGCC   ACCCTGTCTC
4001  TGAGTCCAGG   AGAAAGAGCC   ACTCTCTCCT   GCAGGGCCAG   TCAGAACATT
4051  GGCACAAGCA   TACAGTGGTA   TCAACAAAAA   CCAGGTCAGG   CTCCAAGGCT
4101  TCTCATAAGG   TCTTCTTCTG   AGTCTATCTC   TGGGATCCCT   TCCAGGTTTA
4151  GTGGCAGTGG   ATCAGGGACA   GATTTTACTC   TTACCATCAG   CAGTCTGGAG
4201  CCTGAAGATT   TTGCAGTGTA   TTACTGTCAA   CAAAGTAATA   CCTGGCCATT
4251  CACGTTCGGC   CAGGGGACCA   AGCTGGAGAT   CAAACGTGAG   TATTCTAGAA
4301  AGATCCTAGA   ATTCTAAACT   CTGAGGGGGT   CGGATGACGT   GGCCATTCTT
4351  TGCCTAAAGC   ATTGAGTTTA   CTGCAAGGTC   AGAAAAGCAT   GCAAAGCCCT
4401  CAGAATGGCT   GCAAAGAGCT   CCAACAAAAC   AATTTAGAAC   TTTATTAAGG
4451  AATAGGGGGA   AGCTAGGAAG   AAACTCAAAA   CATCAAGATT   TTAAATACGC
4501  TTCTTGGTCT   CCTTGCTATA   ATTATCTGGG   ATAAGCATGC   TGTTTTCTGT
4551  CTGTCCCTAA   CATGCCCTGT   GATTATCCGC   AAACAACACA   CCCAAGGGCA
4601  GAACTTTGTT   ACTTAAACAC   CATCCTGTTT   GCTTCTTTCC   TCAGGAACTG
4651  TGGCTGCACC   ATCTGTCTTC   ATCTTCCCGC   CATCTGATGA   GCAGTTGAAA
4701  TCTGGAACTG   CCTCTGTTGT   GTGCCTGCTG   AATAACTTCT   ATCCCAGAGA
4751  GGCCAAAGTA   CAGTGGAAGG   TGGATAACGC   CCTCCAATCG   GGTAACTCCC
4801  AGGAGAGTGT   CACAGAGCAG   GACAGCAAGG   ACAGCACCTA   CAGCCTCAGC
4851  AGCACCCTGA   CGCTGAGCAA   AGCAGACTAC   GAGAAACACA   AAGTCTACGC
4901  CTGCGAAGTC   ACCCATCAGG   GCCTGAGCTC   GCCCGTCACA   AAGAGCTTCA
4951  ACAGGGGAGA   GTGTTAGAGG   GAGAAGTGCC   CCCACCTGCT   CCTCAGTTCC
5001  AGCCTGACCC   CCTCCCATCC   TTTGGCCTCT   GACCCTTTTT   CCACAGGGGA
5051  CCTACCCCTA   TTGCGGTCCT   CCAGCTCATC   TTTCACCTCA   CCCCCCTCCT
5101  CCTCCTTGGC   TTTAATTATG   CTAATGTTGG   AGGAGAATGA   ATAAATAAAG
5151  TGAATCTTTG   CACCTGTGGT   TTCTCTCTTT   CCTCATTTAA   TAATTATTAT
5201  CTGTTGTTTA   CCAACTACTC   AATTTCTCTT   ATAAGGGACT   AAATATGTAG
5251  TCATCCTAAG   GCGCATAACC   ATTTATAAAA   ATCATCCTTC   ATTCTATTTT
5301  ACCCTATCAT   CCTCTGCAAG   ACAGTCCTCC   CTCAAACCCA   CAAGCCTTCT
5351  GTCCTCACAG   TCCCCTGGGC   CATGGTAGGA   GAGACTTGCT   TCCTTGTTTT
5401  CCCCTCCTCA   GCAAGCCCTC   ATAGTCCTTT   TTAAGGGTGA   CAGGTCTTAC
5451  AGTCATATAT   CCTTTGATTC   AATTCCCTGA   GAATCAACCA   AAGCAAATTT
5501  TTCAAAAGAA   GAAACCTGCT   ATAAAGAGAA   TCATTCATTG   CAACATGATA
5551  TAAAATAACA   ACACAATAAA   AGCAATTAAA   TAAACAAACA   ATAGGGAAAT
5601     GTTTAAGTTC   ATCATGGTAC   TTAGACTTAA   TGGAATGTCA   TGCCTTATTT
5651     ACATTTTTAA   ACAGGTACTG   AGGGACTCCT   GTCTGCCAAG   GGCCGTATTG
5701     AGTACTTTCC   ACAACCTAAT   TTAATCCACA   CTATACTGTG   AGATTAAAAA
5751     CATTCATTAA   AATGTTGCAA   AGGTTCTATA   AAGCTGAGAG   ACAAATATAT
5801     TCTATAACTC   AGCAATCCCA   CTTCTAGATG   ACTGAGTGTC   CCCACCCACC
5851     AAAAAACTAT   GCAAGAATGT   TCAAAGCAGC   TTTATTTACA   AAAGCCAAAA
5901     ATTGGAAATA   GCCCGATTGT   CCAACAATAG   AATGAGTTAT   TAAACTGTGG
5951     TATGTTTATA   CATTAGAATA   CCCAATGAGG   AGAATTAACA   AGCTACAACT
6001     ATACCTACTC   ACACAGATGA   ATCTCATAAA   AATAATGTTA   CATAAGAGAA
6051     ACTCAATGCA   AAAGATATGT   TCTGTATGTT   TTCATCCATA   TAAAGTTCAA
6101     AACCAGGTAA   AAATAAAGTT   AGAAATTTGG   ATGGAAATTA   CTCTTAGCTG
6151     GGGGTGGGCG   AGTTAGTGCC   TGGGAGAAGA   CAAGAAGGGG   CTTCTGGGGT
6201     CTTGGTAATG   TTCTGTTCCT   CGTGTGGGGT   TGTGCAGTTA   TGATCTGTGC
6251     ACTGTTCTGT   ATACACATTA   TGCTTCAAAA   TAACTTCACA   TAAAGAACAT
6301     CTTATACCCA   GTTAATAGAT   AGAAGAGGAA   TAAGTAATAG   GTCAAGACCA
6351     CGCAGCTGGT   AAGTGGGGGG   GCCTGGGATC   AAATAGCTAC   CTGCCTAATC
6401     CTGCCCTCTT   GAGCCCTGAA   TGAGTCTGCC   TTCCAGGGCT   CAAGGTGCTC
6451     AACAAAACAA   CAGGCCTGCT   ATTTTCCTGG   CATCTGTGCC   CTGTTTGGCT
6501     AGCTAGGAGC   ACACATACAT   AGAAATTAAA   TGAAACAGAC   CTTCAGCAAG
6551     GGGACAGAGG   ACAGAATTAA   CCTTGCCCAG   ACACTGGAAA   CCCATGTATG
6601     AACACTCACA   TGTTTGGGAA   GGGGGAAGGG   CACATGTAAA   TGAGGACTCT
6651     TCCTCATTCT   ATGGGGCACT   CTGGCCCTGC   CCCTCTCAGC   TACTCATCCA
6701     TCCAACACAC   CTTTCTAAGT   ACCTCTCTCT   GCCTACACTC   TGAAGGGGTT
6751     CAGGAGTAAC   TAACACAGCA   TCCCTTCCCT   CAAATGACTG   ACAATCCCTT
6801     TGTCCTGCTT   TGTTTTTCTT   TCCAGTCAGT   ACTGGGAAAG   TGGGGAAGGA
6851     CAGTCATGGA   GAAACTACAT   AAGGAAGCAC   CTTGCCCTTC   TGCCTCTTGA
6901     GAATGTTGAT   GAGTATCAAA   TCTTTCAAAC   TTTGGAGGTT   TGAGTAGGGG
6951     TGAGACTCAG   TAATGTCCCT   TCCAATGACA   TGAACTTGCT   CACTCATCCC
7001     TGGGGGCCAA   ATTGAACAAT   CAAAGGCAGG   CATAATCCAG   CTATGAATTC
7051     TAGGATCGAT   CCAGACATGA   TAAGATACAT   TGATGAGTTT   GGACAAACCA
7101     CAACTAGAAT   GCAGTGAAAA   AAATGCTTTA   TTTGTGAAAT   TTGTGATGCT
7151     ATTGCTTTAT   TTGTAACCAT   TATAAGCTGC   AATAAACAAG   TTAACAACAA
7201     CAATTGCATT   CATTTTATGT   TTCAGGTTCA   GGGGGAGGTG   TGGGAGGTTT
7251     TTTAAAGCAA   GTAAAACCTC   TACAAATGTG   GTATGGCTGA   TTATGATCTC
7301     TAGTCAAGGC   ACTATACATC   AAATATTCCT   TATTAACCCC   TTTACAAATT
7351     AAAAAGCTAA   AGGTACACAA   TTTTTGAGCA   TAGTTATTAA   TAGCAGACAC
7401     TCTATGCCTG   TGTGGAGTAA   GAAAAAACAG   TATGTTATGA   TTATAACTGT
7451     TATGCCTACT   TATAAAGGTT   ACAGAATATT   TTTCCATAAT   TTTCTTGTAT
7501     AGCAGTGCAG   CTTTTTCCTT   TGTGGTGTAA   ATAGCAAAGC   AAGCAAGAGT
7551     TCTATTACTA   AACACAGCAT   GACTCAAAAA   ACTTAGCAAT   TCTGAAGGAA
7601     AGTCCTTGGG   GTCTTCTACC   TTTCTCTTCT   TTTTTGGAGG   AGTAGAATGT
7651     TGAGAGTCAG   CAGTAGCCTC   ATCATCACTA   GATGGCATTT   CTTCTGAGCA
7701     AAACAGGTTT   TCCTCATTAA   AGGCATTCCA   CCACTGCTCC   CATTCATCAG
7751     TTCCATAGGT   TGGAATCTAA   AATACACAAA   CAATTAGAAT   CAGTAGTTTA
7801     ACACATTATA   CACTTAAAAA   TTTTATATTT   ACCTTAGAGC   TTTAAATCTC
7851  TGTAGGTAGT TTGTCCAATT ATGTCACACC ACAGAAGTAA GGTTCCTTCA
7901  CAAAGATCCG GGACCAAAGC GGCCATCGTG CCTCCCCACT CCTGCAGTTC
7951  GGGGGCATGG ATGCGCGGAT AGCCGCTGCT GGTTTCCTGG ATGCCGACGG
8001  ATTTGCACTG CCGGTAGAAC TCCGCGAGGT CGTCCAGCCT CAGGCAGCAG
8051  CTGAACCAAC TCGCGAGGGG ATCGAGCCCG GGGTGGGCGA AGAACTCCAG
8101  CATGAGATCC CCGCGCTGGA GGATCATCCA GCCGGCGTCC CGGAAAACGA
8151  TTCCGAAGCC CAACCTTTCA TAGAAGGCGG CGGTGGAATC GAAATCTCGT
8201  GATGGCAGGT TGGGCGTCGC TTGGTCGGTC ATTTCGAACC CCAGAGTCCC
8251  GCTCAGAAGA ACTCGTCAAG AAGGCGATAG AAGGCGATGC GCTGCGAATC
8301  GGGAGCGGCG ATACCGTAAA GCACGAGGAA GCGGTCAGCC CATTCGCCGC
8351  CAAGCTCTTC AGCAATATCA CGGGTAGCCA ACGCTATGTC CTGATAGCGG
8401  TCCGCCACAC CCAGCCGGCC ACAGTCGATG AATCCAGAAA AGCGGCCATT
8451  TTCCACCATG ATATTCGGCA AGCAGGCATC GCCATGGGTC ACGACGAGAT
8501  CCTCGCCGTC GGGCATGCGC GCCTTGAGCC TGGCGAACAG TTCGGCTGGC
8551  GCGAGCCCCT GATGCTCTTC GTCCAGATCA TCCTGATCGA CAAGACCGGC
8601  TTCCATCCGA GTACGTGCTC GCTCGATGCG ATGTTTCGCT TGGTGGTCGA
8651  ATGGGCAGGT AGCCGGATCA AGCGTATGCA GCCGCCGCAT TGCATCAGCC
8701  ATGATGGATA CTTTCTCGGC AGGAGCAAGG TGAGATGACA GGAGATCCTG
8751  CCCCGGCACT TCGCCCAATA GCAGCCAGTC CCTTCCCGCT TCAGTGACAA
8801  CGTCGAGCAC AGCTGCGCAA GGAACGCCCG TCGTGGCCAG CCACGATAGC
8851  CGCGCTGCCT CGTCCTGCAG TTCATTCAGG GCACCGGACA GGTCGGTCTT
8901  GACAAAAAGA ACCGGGCGCC CCTGCGCTGA CAGCCGGAAC ACGGCGGCAT
8951  CAGAGCAGCC GATTGTCTGT TGTGCCCAGT CATAGCCGAA TAGCCTCTCC
9001  ACCCAAGCGG CCGGAGAACC TGCGTGCAAT CCATCTTGTT CAATCATGCG
9051  AAACGATCCT CATCCTGTCT CTTGATCAGA TCTTGATCCC CTGCGCCATC
9101  AGATCCTTGG CGGCAAGAAA GCCATCCAGT TTACTTTGCA GGGCTTCCCA
9151  ACCTTACCAG AGGGCGCCCC AGCTGGCAAT TCCGGTTCGC TTGCTGTCCA
9201  TAAAACCGCC CAGTCTAGCT ATCGCCATGT AAGCCCACTG CAAGCTACCT
9251  GCTTTCTCTT TGCGCTTGCG TTTTCCCTTG TCCAGATAGC CCAGTAGCTG
9301  ACATTCATCC GGGGTCAGCACCGTTTCTGC GGACTGGCTT TCTACGTGTT
9351  CCGCTTCCTT TAGCAGCCCT TGCGCCCTGA GTGCTTGCGG CAGCGTGAAG
SEQ ID NO：18
表达载体HCMV-K HuAb-VL1 hum V2的核苷酸序列
(在3926-4246含有SEQ ID NO：13(humV2＝VLm)的人源化轻链表达载体的完整DNA序列)
  1  CTAGCTTTTT GCAAAAGCCT AGGCCTCCAA AAAAGCCTCC TCACTACTTC
 51  TGGAATAGCT CAGAGGCCGA GGCGGCCTCG GCCTCTGCAT AAATAAAAAA
101  AATTAGTCAG CCATGGGGCG GAGAATGGGC GGAACTGGGC GGAGTTAGGG
151  GCGGGATGGG CGGAGTTAGG GGCGGGACTA TGGTTGCTGA CTAATTGAGA
201  TGCATGCTTT GCATACTTCT GCCTGCTGGG GAGCCTGGTT GCTGACTAAT
251  TGAGATGCAT GCTTTGCATA CTTCTGCCTG CTGGGGAGCC TGGGGACTTT
301  CCACACCCTA ACTGACACAC ATTCCACAGC TGCCTCGCGC GTTTCGGTGA
351  TGACGGTGAA AACCTCTGAC ACATGCAGCT CCCGGAGACG GTCACAGCTT
 401   GTCTGTAAGC   GGATGCCGGG   AGCAGACAAG   CCCGTCAGGG   CGCGTCAGCG
 451   GGTGTTGGCG   GGTGTCGGGG   CGCAGCCATG   ACCCAGTCAC   GTAGCGATAG
 501   CGGAGTGTAT   ACTGGCTTAA   CTATGCGGCA   TCAGAGCAGA   TTGTACTGAG
 551   AGTGCACCAT   ATGCGGTGTG   AAATACCGCA   CAGATGCGTA   AGGAGAAAAT
 601   ACCGCATCAG   GCGCTCTTCC   GCTTCCTCGC   TCACTGACTC   GCTGCGCTCG
 651   GTCGTTCGGC   TGCGGCGAGC   GGTATCAGCT   CACTCAAAGG   CGGTAATACG
 701   GTTATCCACA   GAATCAGGGG   ATAACGCAGG   AAAGAACATG   TGAGCAAAAG
 751   GCCAGCAAAA   GGCCAGGAAC   CGTAAAAAGG   CCGCGTTGCT   GGCGTTTTTC
 801   CATAGGCTCC   GCCCCCCTGA   CGAGCATCAC   AAAAATCGAC   GCTCAAGTCA
 851   GAGGTGGCGA   AACCCGACAG   GACTATAAAG   ATACCAGGCG   TTTCCCCCTG
 901   GAAGCTCCCT   CGTGCGCTCT   CCTGTTCCGA   CCCTGCCGCT   TACCGGATAC
 951   CTGTCCGCCT   TTCTCCCTTC   GGGAAGCGTG   GCGCTTTCTC   ATAGCTCACG
1001   CTGTAGGTAT   CTCAGTTCGG   TGTAGGTCGT   TCGCTCCAAG   CTGGGCTGTG
1051   TGCACGAACC   CCCCGTTCAG   CCCGACCGCT   GCGCCTTATC   CGGTAACTAT
1101   CGTCTTGAGT   CCAACCCGGT   AAGACACGAC   TTATCGCCAC   TGGCAGCAGC
1151   CACTGGTAAC   AGGATTAGCA   GAGCGAGGTA   TGTAGGCGGT   GCTACAGAGT
1201   TCTTGAAGTG   GTGGCCTAAC   TACGGCTACA   CTAGAAGGAC   AGTATTTGGT
1251   ATCTGCGCTC   TGCTGAAGCC   AGTTACCTTC   GGAAAAAGAG   TTGGTAGCTC
1301   TTGATCCGGC   AAACAAACCA   CCGCTGGTAG   CGGTGGTTTT   TTTGTTTGCA
1351   AGCAGCAGAT   TACGCGCAGA   AAAAAAGGAT   CTCAAGAAGA   TCCTTTGATC
1401   TTTTCTACGG   GGTCTGACGC   TCAGTGGAAC   GAAAACTCAC   GTTAAGGGAT
1451   TTTGGTCATG   AGATTATCAA   AAAGGATCTT   CACCTAGATC   CTTTTAAATT
1501   AAAAATGAAG   TTTTAAATCA   ATCTAAAGTA   TATATGAGTA   AACTTGGTCT
1551   GACAGTTACC   AATGCTTAAT   CAGTGAGGCA   CCTATCTCAG   CGATCTGTCT
1601   ATTTCGTTCA   TCCATAGTTG   CCTGACTCCC   CGTCGTGTAG   ATAACTACGA
1651   TACGGGAGGG   CTTACCATCT   GGCCCCAGTG   CTGCAATGAT   ACCGCGAGAC
1701   CCACGCTCAC   CGGCTCCAGA   TTTATCAGCA   ATAAACCAGC   CAGCCGGAAG
1751   GGCCGAGCGC   AGAAGTGGTC   CTGCAACTTT   ATCCGCCTCC   ATCCAGTCTA
1801   TTAATTGTTG   CCGGGAAGCT   AGAGTAAGTA   GTTCGCCAGT   TAATAGTTTG
1851   CGCAACGTTG   TTGCCATTGC   TGCAGGCATC   GTGGTGTCAC   GCTCGTCGTT
1901   TGGTATGGCT   TCATTCAGCT   CCGGTTCCCA   ACGATCAAGG   CGAGTTACAT
1951   GATCCCCCAT   GTTGTGCAAA   AAAGCGGTTA   GCTCCTTCGG   TCCTCCGATC
2001   GTTGTCAGAA   GTAAGTTGGC   CGCAGTGTTA   TCACTCATGG   TTATGGCAGC
2051   ACTGCATAAT   TCTCTTACTG   TCATGCCATC   CGTAAGATGC   TTTTCTGTGA
2101   CTGGTGAGTA   CTCAACCAAG   TCATTCTGAG   AATAGTGTAT   GCGGCGACCG
2151   AGTTGCTCTT   GCCCGGCGTC   AACACGGGAT   AATACCGCGC   CACATAGCAG
2201   AACTTTAAAA   GTGCTCATCA   TTGGAAAACG   TTCTTCGGGG   CGAAAACTCT
2251   CAAGGATCTT   ACCGCTGTTG   AGATCCAGTT   CGATGTAACC   CACTCGTGCA
2301   CCCAACTGAT   CTTCAGCATC   TTTTACTTTC   ACCAGCGTTT   CTGGGTGAGC
2351   AAAAACAGGA   AGGCAAAATG   CCGCAAAAAA   GGGAATAAGG   GCGACACGGA
2401   AATGTTGAAT   ACTCATACTC   TTCCTTTTTC   AATATTATTG   AAGCATTTAT
2451   CAGGGTTATT   GTCTCATGAG   CGGATACATA   TTTGAATGTA   TTTAGAAAAA
2501   TAAACAAATA   GGGGTTCCGC   GCACATTTCC   CCGAAAAGTG   CCACCTGACG
2551   TCTAAGAAAC   CATTATTATC   ATGACATTAA   CCTATAAAAA   TAGGCGTATC
2601   ACGAGGCCCT   TTCGTCTTCA   AGAATTCAGC   TTGGCTGCAG   TGAATAATAA
2651   AATGTGTGTT   TGTCCGAAAT   ACGCGTTTTG   AGATTTCTGT   CGCCGACTAA
2701   ATTCATGTCG   CGCGATAGTG   GTGTTTATCG   CCGATAGAGA   TGGCGATATT
2751   GGAAAAATCG   ATATTTGAAA   ATATGGCATA   TTGAAAATGT   CGCCGATGTG
2801   AGTTTCTGTG   TAACTGATAT   CGCCATTTTT   CCAAAAGTGA   TTTTTGGGCA
2851   TACGCGATAT   CTGGCGATAG   CGCTTATATC   GTTTACGGGG   GATGGCGATA
2901   GACGACTTTG   GTGACTTGGG   CGATTCTGTG   TGTCGCAAAT   ATCGCAGTTT
2951   CGATATAGGT   GACAGACGAT   ATGAGGCTAT   ATCGCCGATA   GAGGCGACAT
3001   CAAGCTGGCA   CATGGCCAAT   GCATATCGAT   CTATACATTG   AATCAATATT
3051   GGCCATTAGC   CATATTATTC   ATTGGTTATA   TAGCATAAAT   CAATATTGGC
3101   TATTGGCCAT   TGCATACGTT   GTATCCATAT   CATAATATGT   ACATTTATAT
3151   TGGCTCATGT   CCAACATTAC   CGCCATGTTG   ACATTGATTA   TTGACTAGTT
3201   ATTAATAGTA   ATCAATTACG   GGGTCATTAG   TTCATAGCCC   ATATATGGAG
3251   TTCCGCGTTA   CATAACTTAC   GGTAAATGGC   CCGCCTGGCT   GACCGCCCAA
3301   CGACCCCCGC   CCATTGACGT   CAATAATGAC   GTATGTTCCC   ATAGTAACGC
3351   CAATAGGGAC   TTTCCATTGA   CGTCAATGGG   TGGAGTATTT   ACGGTAAACT
3401   GCCCACTTGG   CAGTACATCA   AGTGTATCAT   ATGCCAAGTA   CGCCCCCTAT
3451   TGACGTCAAT   GACGGTAAAT   GGCCCGCCTG   GCATTATGCC   CAGTACATGA
3501   CCTTATGGGA   CTTTCCTACT   TGGCAGTACA   TCTACGTATT   AGTCATCGCT
3551   ATTACCATGG   TGATGCGGTT   TTGGCAGTAC   ATCAATGGGC   GTGGATAGCG
3601   GTTTGACTCA   CGGGGATTTC   CAAGTCTCCA   CCCCATTGAC   GTCAATGGGA
3651   GTTTGTTTTG   GCACCAAAAT   CAACGGGACT   TTCCAAAATG   TCGTAACAAC
3701   TCCGCCCCAT   TGACGCAAAT   GGGCGGTAGG   CGTGTACGGT   GGGAGGTCTA
3751   TATAAGCAGA   GCTCGTTTAG   TGAACCGTCA   GATCGCCTGG   AGACGCCATC
3801   CACGCTGTTT   TGACCTCCAT   AGAAGACACC   GGGACCGATC   CAGCCTCCGC
3851   AAGCTTGCCG   CCACCATGGA   GACCCCCGCC   CAGCTGCTGT   TCCTGCTGCT
3901   GCTGTGGCTG   CCCGACACCA   CCGGCGACAT   TCTGCTGACC   CAGTCTCCAG
3951   CCACCCTGTC   TCTGAGTCCA   GGAGAAAGAG   CCACTTTCTC   CTGCAGGGCC
4001   AGTCAGAACA   TTGGCACAAG   CATACAGTGG   TATCAACAAA   AAACAAATGG
4051   TGCTCCAAGG   CTTCTCATAA   GGTCTTCTTC   TGAGTCTATC   TCTGGGATCC
4101   CTTCCAGGTT   TAGTGGCAGT   GGATCAGGGA   CAGATTTTAC   TCTTACCATC
4151   AGCAGTCTGG   AGCCTGAAGA   TTTTGCAGTG   TATTACTGTC   AACAAAGTAA
4201   TACCTGGCCA   TTCACGTTCG   GCCAGGGGAC   CAAGCTGGAG   ATCAAACGTG
4251   AGTATTCTAG   AAAGATCCTA   GAATTCTAAA   CTCTGAGGGG   GTCGGATGAC
4301   GTGGCCATTC   TTTGCCTAAA   GCATTGAGTT   TACTGCAAGG   TCAGAAAAGC
4351   ATGCAAAGCC   CTCAGAATGG   CTGCAAAGAG   CTCCAACAAA   ACAATTTAGA
4401   ACTTTATTAA   GGAATAGGGG   GAAGCTAGGA   AGAAACTCAA   AACATCAAGA
4451   TTTTAAATAC   GCTTCTTGGT   CTCCTTGCTA   TAATTATCTG   GGATAAGCAT
4501   GCTGTTTTCT   GTCTGTCCCT   AACATGCCCT   GTGATTATCC   GCAAACAACA
4551   CACCCAAGGG   CAGAACTTTG   TTACTTAAAC   ACCATCCTGT   TTGCTTCTTT
4601   CCTCAGGAAC   TGTGGCTGCA   CCATCTGTCT   TCATCTTCCC   GCCATCTGAT
4651   GAGCAGTTGA   AATCTGGAAC   TGCCTCTGTT   GTGTGCCTGC   TGAATAACTT
4701   CTATCCCAGA   GAGGCCAAAG   TACAGTGGAA   GGTGGATAAC   GCCCTCCAAT
4751   CGGGTAACTC   CCAGGAGAGT   GTCACAGAGC   AGGACAGCAA   GGACAGCACC
4801   TACAGCCTCA   GCAGCACCCT   GACGCTGAGC   AAAGCAGACT   ACGAGAAACA
4851   CAAAGTCTAC   GCCTGCGAAG   TCACCCATCA   GGGCCTGAGC   TCGCCCGTCA
4901   CAAAGAGCTT   CAACAGGGGA   GAGTGTTAGA   GGGAGAAGTG   CCCCCACCTG
4951   CTCCTCAGTT   CCAGCCTGAC   CCCCTCCCAT   CCTTTGGCCT   CTGACCCTTT
5001   TTCCACAGGG   GACCTACCCC   TATTGCGGTC   CTCCAGCTCA   TCTTTCACCT
5051   CACCCCCCTC   CTCCTCCTTG   GCTTTAATTA   TGCTAATGTT   GGAGGAGAAT
5101   GAATAAATAA   AGTGAATCTT   TGCACCTGTG   GTTTCTCTCT   TTCCTCATTT
5151   AATAATTATT   ATCTGTTGTT   TACCAACTAC   TCAATTTCTC   TTATAAGGGA
5201   CTAAATATGT   AGTCATCCTA   AGGCGCATAA   CCATTTATAA   AAATCATCCT
5251   TCATTCTATT   TTACCCTATC   ATCCTCTGCA   AGACAGTCCT   CCCTCAAACC
5301   CACAAGCCTT   CTGTCCTCAC   AGTCCCCTGG   GCCATGGTAG   GAGAGACTTG
5351   CTTCCTTGTT   TTCCCCTCCT   CAGCAAGCCC   TCATAGTCCT   TTTTAAGGGT
5401   GACAGGTCTT   ACAGTCATAT   ATCCTTTGAT   TCAATTCCCT   GAGAATCAAC
5451   CAAAGCAAAT   TTTTCAAAAG   AAGAAACCTG   CTATAAAGAG   AATCATTCAT
5501   TGCAACATGA   TATAAAATAA   CAACACAATA   AAAGCAATTA   AATAAACAAA
5551   CAATAGGGAA   ATGTTTAAGT   TCATCATGGT   ACTTAGACTT   AATGGAATGT
5601   CATGCCTTAT   TTACATTTTT   AAACAGGTAC   TGAGGGACTC   CTGTCTGCCA
5651   AGGGCCGTAT   TGAGTACTTT   CCACAACCTA   ATTTAATCCA   CACTATACTG
5701   TGAGATTAAA   AACATTCATT   AAAATGTTGC   AAAGGTTCTA   TAAAGCTGAG
5751   AGACAAATAT   ATTCTATAAC   TCAGCAATCC   CACTTCTAGA   TGACTGAGTG
5801   TCCCCACCCA   CCAAAAAACT   ATGCAAGAAT   GTTCAAAGCA   GCTTTATTTA
5851   CAAAAGCCAA   AAATTGGAAA   TAGCCCGATT   GTCCAACAAT   AGAATGAGTT
5901   ATTAAACTGT   GGTATGTTTA   TACATTAGAA   TACCCAATGA   GGAGAATTAA
5951   CAAGCTACAA   CTATACCTAC   TCACACAGAT   GAATCTCATA   AAAATAATGT
6001   TACATAAGAG   AAACTCAATG   CAAAAGATAT   GTTCTGTATG   TTTTCATCCA
6051   TATAAAGTTC   AAAACCAGGT   AAAAATAAAG   TTAGAAATTT   GGATGGAAAT
6101   TACTCTTAGC   TGGGGGTGGG   CGAGTTAGTG   CCTGGGAGAA   GACAAGAAGG
6151   GGCTTCTGGG   GTCTTGGTAA   TGTTCTGTTC   CTCGTGTGGG   GTTGTGCAGT
6201   TATGATCTGT   GCACTGTTCT   GTATACACAT   TATGCTTCAA   AATAACTTCA
6251   CATAAAGAAC   ATCTTATACC   CAGTTAATAG   ATAGAAGAGG   AATAAGTAAT
6301   AGGTCAAGAC   CACGCAGCTG   GTAAGTGGGG   GGGCCTGGGA   TCAAATAGCT
6351   ACCTGCCTAA   TCCTGCCCTC   TTGAGCCCTG   AATGAGTCTG   CCTTCCAGGG
6401   CTCAAGGTGC   TCAACAAAAC   AACAGGCCTG   CTATTTTCCT   GGCATCTGTG
6451   CCCTGTTTGG   CTAGCTAGGA   GCACACATAC   ATAGAAATTA   AATGAAACAG
6501   ACCTTCAGCA   AGGGGACAGA   GGACAGAATT   AACCTTGCCC   AGACACTGGA
6551   AACCCATGTA   TGAACACTCA   CATGTTTGGG   AAGGGGGAAG   GGCACATGTA
6601   AATGAGGACT   CTTCCTCATT   CTATGGGGCA   CTCTGGCCCT   GCCCCTCTCA
6651   GCTACTCATC   CATCCAACAC   ACCTTTCTAA   GTACCTCTCT   CTGCCTACAC
6701   TCTGAAGGGG   TTCAGGAGTA   ACTAACACAG   CATCCCTTCC   CTCAAATGAC
6751   TGACAATCCC   TTTGTCCTGC   TTTGTTTTTC   TTTCCAGTCA   GTACTGGGAA
6801   AGTGGGGAAG   GACAGTCATG   GAGAAACTAC   ATAAGGAAGC   ACCTTGCCCT
6851   TCTGCCTCTT   GAGAATGTTG   ATGAGTATCA   AATCTTTCAA   ACTTTGGAGG
6901   TTTGAGTAGG   GGTGAGACTC   AGTAATGTCC   CTTCCAATGA   CATGAACTTG
6951   CTCACTCATC   CCTGGGGGCC   AAATTGAACA   ATCAAAGGCA   GGCATAATCC
7001   AGCTATGAAT   TCTAGGATCG   ATCCAGACAT   GATAAGATAC   ATTGATGAGT
7051   TTGGACAAAC   CACAACTAGA   ATGCAGTGAA   AAAAATGCTT   TATTTGTGAA
7101   ATTTGTGATG   CTATTGCTTT   ATTTGTAACC   ATTATAAGCT   GCAATAAACA
7151  AGTTAACAAC   AACAATTGCA   TTCATTTTAT   GTTTCAGGTT   CAGGGGGAGG
7201  TGTGGGAGGT   TTTTTAAAGC   AAGTAAAACC   TCTACAAATG   TGGTATGGCT
7251  GATTATGATC   TCTAGTCAAG   GCACTATACA   TCAAATATTC   CTTATTAACC
7301  CCTTTACAAA   TTAAAAAGCT   AAAGGTACAC   AATTTTTGAG   CATAGTTATT
7351  AATAGCAGAC   ACTCTATGCC   TGTGTGGAGT   AAGAAAAAAC   AGTATGTTAT
7401  GATTATAACT   GTTATGCCTA   CTTATAAAGG   TTACAGAATA   TTTTTCCATA
7451  ATTTTCTTGT   ATAGCAGTGC   AGCTTTTTCC   TTTGTGGTGT   AAATAGCAAA
7501  GCAAGCAAGA   GTTCTATTAC   TAAACACAGC   ATGACTCAAA   AAACTTAGCA
7551  ATTCTGAAGG   AAAGTCCTTG   GGGTCTTCTA   CCTTTCTCTT   CTTTTTTGGA
7601  GGAGTAGAAT   GTTGAGAGTC   AGCAGTAGCC   TCATCATCAC   TAGATGGCAT
7651  TTCTTCTGAG   CAAAACAGGT   TTTCCTCATT   AAAGGCATTC   CACCACTGCT
7701  CCCATTCATC   AGTTCCATAG   GTTGGAATCT   AAAATACACA   AACAATTAGA
7751  ATCAGTAGTT   TAACACATTA   TACACTTAAA   AATTTTATAT   TTACCTTAGA
7801  GCTTTAAATC   TCTGTAGGTA   GTTTGTCCAA   TTATGTCACA   CCACAGAAGT
7851  AAGGTTCCTT   CACAAAGATC   CGGGACCAAA   GCGGCCATCG   TGCCTCCCCA
7901  CTCCTGCAGT   TCGGGGGCAT   GGATGCGCGG   ATAGCCGCTG   CTGGTTTCCT
7951  GGATGCCGAC   GGATTTGCAC   TGCCGGTAGA   ACTCCGCGAG   GTCGTCCAGC
8001  CTCAGGCAGC   AGCTGAACCA   ACTCGCGAGG   GGATCGAGCC   CGGGGTGGGC
8051  GAAGAACTCC   AGCATGAGAT   CCCCGCGCTG   GAGGATCATC   CAGCCGGCGT
8101  CCCGGAAAAC   GATTCCGAAG   CCCAACCTTT   CATAGAAGGC   GGCGGTGGAA
8151  TCGAAATCTC   GTGATGGCAG   GTTGGGCGTC   GCTTGGTCGG   TCATTTCGAA
8201  CCCCAGAGTC   CCGCTCAGAA   GAACTCGTCA   AGAAGGCGAT   AGAAGGCGAT
8251  GCGCTGCGAA   TCGGGAGCGG   CGATACCGTA   AAGCACGAGG   AAGCGGTCAG
8301  CCCATTCGCC   GCCAAGCTCT   TCAGCAATAT   CACGGGTAGC   CAACGCTATG
8351  TCCTGATAGC   GGTCCGCCAC   ACCCAGCCGG   CCACAGTCGA   TGAATCCAGA
8401  AAAGCGGCCA   TTTTCCACCA   TGATATTCGG   CAAGCAGGCA   TCGCCATGGG
8451  TCACGACGAG   ATCCTCGCCG   TCGGGCATGC   GCGCCTTGAG   CCTGGCGAAC
8501  AGTTCGGCTG   GCGCGAGCCC   CTGATGCTCT   TCGTCCAGAT   CATCCTGATC
8551  GACAAGACCG   GCTTCCATCC   GAGTACGTGC   TCGCTCGATG   CGATGTTTCG
8601  CTTGGTGGTC   GAATGGGCAG   GTAGCCGGAT   CAAGCGTATG   CAGCCGCCGC
8651  ATTGCATCAG   CCATGATGGA   TACTTTCTCG   GCAGGAGCAA   GGTGAGATGA
8701  CAGGAGATCC   TGCCCCGGCA   CTTCGCCCAA   TAGCAGCCAG   TCCCTTCCCG
8751  CTTCAGTGAC   AACGTCGAGC   ACAGCTGCGC   AAGGAACGCC   CGTCGTGGCC
8801  AGCCACGATA   GCCGCGCTGC   CTCGTCCTGC   AGTTCATTCA   GGGCACCGGA
8851  CAGGTCGGTC   TTGACAAAAA   GAACCGGGCG   CCCCTGCGCT   GACAGCCGGA
8901  ACACGGCGGC   ATCAGAGCAG   CCGATTGTCT   GTTGTGCCCA   GTCATAGCCG
8951  AATAGCCTCT   CCACCCAAGC   GGCCGGAGAA   CCTGCGTGCA   ATCCATCTTG
9001  TTCAATCATG   CGAAACGATC   CTCATCCTGT   CTCTTGATCA   GATCTTGATC
9051  CCCTGCGCCA   TCAGATCCTT   GGCGGCAAGA   AAGCCATCCA   GTTTACTTTG
9101  CAGGGCTTCC   CAACCTTACC   AGAGGGCGCC   CCAGCTGGCA   ATTCCGGTTC
9151  GCTTGCTGTC   CATAAAACCG   CCCAGTCTAG   CTATCGCCAT   GTAAGCCCAC
9201  TGCAAGCTAC   CTGCTTTCTC   TTTGCGCTTG   CGTTTTCCCT   TGTCCAGATA
9251  GCCCAGTAGC   TGACATTCAT   CCGGGGTCAG   CACCGTTTCT   GCGGACTGGC
9301  TTTCTACGTG   TTCCGCTTCC   TTTAGCAGCC   CTTGCGCCCT   GAGTGCTTGC
9351  GGCAGCGTGA   AG

Claims (27)

1.含有至少一个抗原结合位点的结合分子，其顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)。
2.根据权利要求1的结合分子，其含有
a)顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)；以及
b)顺次含有高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′的第二结构域，CDR1′具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)，CDR2′具有氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)，CDR3′具有氨基酸序列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT)。
3.根据权利要求1或2任一项的结合分子，其是嵌合或人源化单克隆抗体。
4.根据权利要求1或2任一项的结合分子，其含有多肽SEQ ID NO：1和/或多肽SEQ ID NO：2。
5.根据权利要求1或2任一项的结合分子，其含有多肽SEQ ID NO：3和/或多肽SEQ ID NO：4。
6.根据权利要求4或5任一项的结合分子，其是嵌合单克隆抗体。
7.结合分子，其是含有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的多肽和SEQID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽的人源化抗体。
8.结合分子，其是人源化抗体，含有
-多肽SEQ ID NO：9和多肽SEQ ID NO：7，
-多肽SEQ ID NO：9和多肽SEQ ID NO：8，
-多肽SEQ ID NO：10和多肽SEQ ID NO：7，或
-多肽SEQ ID NO：10和多肽SEQ ID NO：8。
9.分离的多核苷酸，其含有编码根据权利要求1到8任一项的结合分子的多核苷酸。
10.根据权利要求9的多核苷酸，其编码根据权利要求2的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；和/或编码根据权利要求2的CDR1′、CDR2′和CDR3′的氨基酸序列。
11.多核苷酸，其含有多核苷酸SEQ ID NO：5和/或多核苷酸SEQ IDNO：6。
12.多核苷酸，其含有编码多肽SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8和多肽SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的多核苷酸。
13.多核苷酸，其含有多核苷酸SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12和多核苷酸SEQ ID NO：13或多核苷酸SEQ ID NO：14。
14.含有根据权利要求9到13任一项的多核苷酸的表达载体。
15.含有根据权利要求9到13任一项的多核苷酸的表达系统，其中当所述表达系统或其部分存在于相容宿主细胞中时，所述表达系统或其部分能产生权利要求1到8任一项的多肽。
16.含有根据权利要求15的表达系统的分离的宿主细胞。
17.根据权利要求1到8任一项的分子或人源化抗体作为药物的用途。
18.根据权利要求17的用途，用于治疗和/或预防自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症。
19.药物组合物，其含有根据权利要求1到8任一项的分子或人源化抗体以及至少一个可药用载体或稀释剂。
20.与自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症有关的疾病的治疗和/或预防方法，包括给需要此治疗和/或预防的对象施用有效量的根据权利要求1到8任一项的分子或人源化抗体。
21.对CD45RO和CD45RB两者有结合特异性的结合分子在医药中的用途。
22.根据权利要求21的用途，其中结合分子是嵌合的、人源化的或完全人的单克隆抗体。
23.根据权利要求21或22的用途，其中结合分子与CD45RO同种型结合，解离常数(Kd)＜15nM。
24.根据权利要求21到23任一项的用途，其中结合分子与CD45RB同种型结合，解离常数(Kd)＜15nM。
25.根据权利要求21到24任一项的用途，其中结合分子结合如下CD45同种型，所述CD45同种型
-包括CD45分子的A和B表位，但不包括C表位；和/或
-包括CD45分子的B表位，但不包括A和C表位；和/或
-不包括CD45分子的A、B和C表位的任一个。
26.根据权利要求21到25任一项的用途，其中结合分子不结合如下CD45同种型，所述CD45同种型
-包括CD45分子的A、B和C表位的所有；和/或
-包括CD45分子的B和C表位，但不包括A表位。
27.根据权利要求21到26任一项的用途，其中结合分子可以与PEER细胞上其靶表位结合，其中所述结合的Kd＜15nM。
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