CN111344304B

CN111344304B - 新型抗cd40抗体及其用途

Info

Publication number: CN111344304B
Application number: CN201880050000.9A
Authority: CN
Inventors: 朴政圭; 金正植
Original assignee: Pb Immunotherapy
Current assignee: Pb Immunotherapy
Priority date: 2017-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2038-06-01
Also published as: EP3632933A4; US20200291123A1; WO2018222019A1; US20220112298A1; US11242397B2; EP3632933A1; KR20180131989A; KR102198998B1; CN111344304A

Abstract

本发明涉及新型抗CD40抗体及其用途，更详细地，提供用于治疗或预防自身免疫疾病的药学组合物以及用于抑制器官移植时免疫排斥的组合物，上述自身免疫疾病包含与CD40的新型表位特异性结合的新型抗CD40抗体作为有效成分。本发明的新型抗CD40抗体直接靶向CD40而不靶向CD40配体，在不刺激血小板的情况下，由于阻断CD40‑CD154信号传导，表现出优异的拮抗效果，因此有望用作有效治疗自身免疫疾病及抑制器官移植时的排斥反应的制剂。

Description

新型抗CD40抗体及其用途

技术领域

本发明涉及新型抗CD40抗体及其用途。

背景技术

CD40信号转化途径取决于许多细胞内因子的联合调节。与TNF受体家族的其他成员相同地，CD40在与CD40和CD40L(固体CD40L或可溶性CD40L中的任一种)结合后与介导细胞内信号的TRAF2及TRAF3等的TRAF蛋白质(TNF受体因子-结合蛋白质)反应。TRAF通过例如NIK(NF-κB诱导激酶)及I-Kappa B激酶(IKK α/β)将信号转化为核，最终活化转录因子NF-κB(Young et al.(1998)Immunol.Today 19：502-06)。通过Ras和MEK/ERK途径的信号化已在B细胞的子集中得到证实。包含在CD40细胞信号化的其他途径包括PI3K/Akt途径及P38MAPK途径(Craxton et al.(1998)J.Immunol.5：439-447)。

已证实通过CD40的信号化可防止细胞因凋亡而死亡(Makus et al.(2002)J.Immunol.14：973-982)。为了以组合方式诱导计划的细胞死亡，需要凋亡信号。细胞死亡信号可包括来自细胞质网应刺激等的细胞内的固有刺激、或FasL或TNFα的受体结合等的外来刺激。信号化途径复杂，其包含胱天蛋白酶3及9胱天蛋白酶等的胱天蛋白酶的活化、以及聚(腺苷二磷酸核糖(ADP ribose))聚合酶(PARP)的活化。在级联过程中，Mcl-1及BCLx等的抗凋亡信号蛋白以及凋亡的X结合抑制剂(XIAP)等的IAP家族蛋白(例如)的成员被下调(Budihardjoet al.(1999)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.15：269-90)。例如，树突状细胞CD40细胞信号化可以阻断FasL转换的凋亡信号(Bjorck et al.(1997)Int’l Immunol.9：365-372)。

因此，基于CD40L的CD40结合及随后的CD40信号化的活化是正常免疫反应中不可少的步骤，这种CD40信号化的功能调节障碍可导致自身免疫疾病(Ichikawa et al.(2002)，J.Immunol.169：2781-7及Moore et al.(2002)J.Autoimmun.19：139-45)。并且，CD40/CD40L相互作用在炎性进行过程中也起到重要作用。例如，CD40或CD40L在人类及实验性动脉粥样硬化病变中均过表达。CD40刺激诱导基质降解酶的表达及在内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞等的与动脉粥样硬化相关的细胞类型中的组织因子的表达。进而，CD40刺激诱导IL-1、IL-6及IL-8等的促炎细胞因子、以及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、E-选择素(E-selectin)及血管细胞黏附分子(VCAM)等的粘附分子的生成。CD40/CD40L相互作用的抑制防止动物模型中的动脉粥样硬化。

CD40是出现在正常及新生儿B细胞、树突状细胞、抗原呈递细胞(APCs)、内皮细胞、单核细胞、CD8+T细胞及上皮细胞的表面的55kDa的细胞表面抗原。CD40抗原还在活化的T细胞、活化的血小板、发炎的血管平滑肌细胞、嗜酸性细胞、类风湿关节炎的滑膜、皮肤的成纤维细胞及其他非淋巴性细胞类型中表达。根据表达CD40的细胞的类型，结扎可诱导细胞内粘附、分化、活化及增殖。例如，CD40与其同源配体CD40L(也表示为CD154)的结合刺激B-细胞增殖及分化为其浆细胞、抗体的生成、同种转换及B-细胞记忆再生。在B细胞分化过程中，CD40在前体B-细胞上表达，但在分化为浆细胞时消失。

CD40配体虽在活化的T细胞的细胞表面得到确认(Fenslow et al.(1992)J.Immunol.149：655；Lane et al.(1992)Eur.JImrrauraol.22：2573；Noelle et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6550)，但通常在静止的人的T细胞上不表达。CD40L是与TNF-α具有同源性的II型跨膜糖蛋白(Armitage et al.(1992)Nature 357：80andSpriggs et al.(1992)J.Exp.Med.176：1543)。CD40L的胞外域在跨膜区附近包含两个精氨酸残基，其提供用于产生配体的可溶性形式(sCD40L)的潜在蛋白水解切割部位。CD40L的过表达在啮齿类模型中诱导起类似于系统性红斑狼疮的自身免疫疾病(Higuchi et al.(2002)J.Immunol.168：9-12)。相反，活化的T细胞上功能性CD40L的缺乏诱导X-结合的高(hyper)-IgM综合征(Allen et al.(1993)Science 259：990；and Korthauer et al.(1993)Nature 361：539)。

另一方面，1型糖尿病是称为胰岛素依赖型糖尿病的代谢紊乱疾病并且是自身免疫性疾病。主要机制是基于T细胞的β细胞(β cell)的破坏导致胰岛素生成不足，导致血糖控制失败。根据2014年国际糖尿病联合会(International Diabetes Federation)的统计，38700万人患有糖尿病，到2035年，将有59200万人患有糖尿病。2014年，有4900万人死于糖尿病并发症，相当于每7秒就有一名患者死于糖尿病。

其治疗方法有如下几种方法。

第一种胰岛素替代疗法(Insulin-replacement therapy)是一种积极的胰岛素治疗法，其在短期内有效但不能成为根本疗法。从长远来看，胰岛素疗法不能防止发生低血糖的风险，也不能预防由此产生的并发症。

第二种免疫学方法(Immunological approaches)是最近的疾病改良疗法(Disease Modifying Therpies)之一，通过免疫细胞的攻击破坏β细胞，并为了防止由此产生的1型糖尿病的发展，使用免疫调节或免疫耐受技术。例如，存在一种通过使用对β细胞具有特异性的疫苗来诱导抗原特异性T细胞免疫耐受的方法。这种免疫学方法虽可以防止或延迟β细胞的进一步破坏，但通常患者诊断为1型糖尿病时期，在大部分的情况下，仅残留约10-20％的β细胞。因此，与诊断为1型糖尿病的相比，使用免疫耐受诱导方法的该方法对更容易患病的潜在患者更有效。在抗原非特异性免疫调节剂的情况下，也只对患病初期患者有效，因此其适用范围非常有限，并且可能影响全身免疫系统，从而可产生副作用。

在第三种再生方法(Regenerative approaches)的情况下，为了满足怀孕或肥胖等情况所需代谢要求，β细胞的数量可增加。已知这是由于胰腺的内分泌或非内分泌细胞分化、或β细胞自身增殖。在食品及药物管理局(FDA)批准的药物中，据报告，二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase 4，DPP4)抑制剂和质子泵(Proton-pump)抑制剂可增加糖尿病大鼠的高血糖素样肽-1(GLP1)和胃泌素(gastrin)，从而诱导β细胞增殖并治疗糖尿病，再生方法仍需大量研究，尚无临床应用事例。

第四种胰岛移植方法(Allogeneic/Xenogeneic islet transplantation)是从不同的人(allogeneic)或猪等的动物(xenogeneic)分离包含β细胞的胰岛(islet)并移植到患者的方法，是治疗1型糖尿病的最根本方法。在胰岛移植方法中最重要的是开发免疫抑制疗法，其可抑制由于与移植的胰岛而发生的受体(recipient)的免疫反应。在2000年初，开发了将达克珠单抗(daclizumab)(赛尼哌(Zenapax))、雷帕霉素(sirolimus)(西罗莫司(Rapamune))和他克莫司(tacrolimus)(普乐可复(Prograf))组合使用的埃德蒙顿(Edmonton)方案，从而使得同种人的胰岛移植方法得到普及。根据胰岛移植登记处，截止2013年，全球40所医院已经进行了1085例胰岛移植，5年内胰岛素独立性超过50％，然而在同种之间的胰岛移植的情况下，由于从3-4名的胰腺分离出胰岛并移植到单个受体中，供体远少于移植受者。为了解决供体不足，全球已经尝试分离动物，尤其猪的胰岛并给人移植(Xenogeneic porcine islet transplantation)。

然而，自相矛盾的是，目前在同种之间胰岛移植中使用的免疫抑制剂会干扰移植的胰岛的植入，若长期使用情况，则不仅对受体产生各种副作用，还导致胰岛死亡，其成为胰岛长期存活的主要障碍。因此，需要开发具有副作用少且特定免疫细胞特异性的新型免疫抑制剂(或免疫抑制抗体)。

目前，胰岛素处方的比例很高，但是如果通过技术的发展来保证免疫抑制剂的稳定性和有效性，则其应用范围有望逐渐扩大。

因此，当为了治疗1型糖尿病以在同种及异种之间移植胰岛时，阻断CD40-CD154信号传导对于抑制排斥反应和抑制糖尿病的早期发作绝对至关重要。

即，已知在使用灵长类的同种及异种之间胰岛移植模型中，抗CD154及抗CD40抗体均可通过抑制B细胞抗体产生抑制及T细胞的活性机制来诱导移植胰岛的器官存活，这种阻断免疫细胞的CD40-CD154信号传导作为免疫抑制治疗的核心，可通过阻断CD40/CD40L的相互作用来防止移植排斥反应。

因此，需要开发与治疗和临床相关的抗CD40抗体作为能够有效抑制CD40/CD40L的相互作用的物质。

通过上述开发的抗CD40抗体的阻断Cd40-CD40L信号传导的免疫抑制效果有望开发出自身免疫疾病治疗剂、器官移植免疫抑制剂、慢性炎性疾病治疗剂及抑制抗药抗体(Anti-Drug antibody)的辅助治疗剂。

发明内容

技术问题

在这种情况下，为了通过治疗自身免疫疾病，抑制器官移植时的免疫排斥反应、治疗慢性炎性疾病及抑制抗药抗体(Anti-Drug antibody)的形成等的辅助治疗，本发明人努力开发出靶向阻断CD40-CD154信号传导的免疫抑制剂。结果，开发出了特异性结合人CD40的特定表位的新型抗CD40抗体(RM8G-1)，并确认本发明的新型抗CD40抗体直接靶向CD40而不靶向CD40配体，在不刺激血小板的情况下，由于阻断CD40-CD154信号传导，表现出优异的免疫抑制效果，从而完成了本发明。

因此，本发明的一目的在于，提供由CD40氨基酸序列中的Glu58、Cys59、Leu60、Pro61、Cys62、Gly63、Glu64、Ser65、Glu66及Phe67的CD40氨基酸残基组成的抗CD40抗体表位。

并且，本发明的再一目的在于，提供与上述CD40的表位特异性结合的抗CD40抗体或其抗原结合片段。

并且，本发明的另一目的在于，提供包括向人以外的动物注射上述CD40的表位的步骤的产生抗CD40抗体或其抗原结合片段的方法，上述抗CD40抗体或其抗原结合片段与上述表位特异性结合。

并且，本发明的还有一目的在于，提供包含上述抗CD40抗体或其抗原结合片段的用于阻断CD40-CD40L信号传导的组合物。

并且，本发明的又一目的在于，提供包含上述抗CD40抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于治疗或预防自身免疫疾病的药学组合物。

并且，本发明的又一目的在于，提供包含上述抗CD40抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于治疗或预防慢性炎性疾病的药学组合物。

并且，本发明的又一目的在于，提供包含上述抗CD40抗体或其抗原结合片段的用于抑制器官移植时免疫排斥反应的组合物。

并且，本发明的又一目的在于，提供包括向需要治疗的对象给药上述药学组合物的步骤的自身免疫疾病或慢性炎性疾病的治疗方法。

解决问题的手段

除非另有定义，否则与本发明结合使用的科学性及技术性术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。并且，除非内容另有要求，否则单数术语包括复数，复数术语包括单数。通常，本说明书中公开的与细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质及核酸化学及杂交有关的命名法和技术是本领域众所周知的且常用的。

以下，更详细地说明本发明。

为了实现上述目的，根据本发明的一实施方式，本发明提供由CD40氨基酸序列中的Glu58、Cys59、Leu60、Pro61、Cys62、Gly63、Glu64、Ser65、Glu66及Phe67的CD40氨基酸残基组成的抗CD40抗体表位。

并且，根据本发明再一实施方式，本发明提供与上述CD40的表位特异性结合以用作CD40拮抗剂(antagonist)的抗CD40抗体或其抗原结合片段。

本发明人首次发现本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段识别不同于本领域公开的抗体所结合的表位(Epitope)的新型表位。

即，本抗体为优异的拮抗性抗体，其与以往抗体不同，与新型表位结合并用作针对CD40的拮抗剂。

并且，本抗体与以往抗体不同，除了表位的结构形式以外还识别线性(Linearform)抗原以表现出结合特性。

在本说明书中，上述抗CD40抗体或其抗原结合片段在CD40蛋白中，将与CD154相互作用的部位CD40中包含58位残基Glu、59位残基Cys、60位残基Leu、61位残基Pro、62位残基Cys、63位残基Gly、64位残基Glu、65位残基Ser、66位残基Glu及67位残基Phe的10氨基酸的CD40部位作为表位，并干扰与CD154的相互作用，从而可以有效地抑制CD40-CD154信号传导。上述CD40是由PubmedGene ID：707749的基因编码的蛋白质。

并且，在本发明的抗CD40抗体中，(i)显示出CD40-CD154结合阻断的高效率性、非拮抗性(non-agonistic)、非消耗性(non-depleting)或最少消耗性(minimum-depleting)、新型表位结合及高亲和性，因此满足在器官移植中作为抗CD40抗体的抑制免疫排斥反应及治疗自身免疫疾病的所有先决条件；(ii)可以实现灵长类/人的交联，可适用于非临床/临床前试验，因此有利于开发治疗剂，其作为阻断(异种猪)CD40-(人)CD40L的抗体，在可专门用于异种细胞/异种器官移植的观点上，满足在器官移植中作为抗CD40抗体以抑制免疫排斥反应及治疗自身免疫疾病的所有充分要求；其由于符合所有抗CD40抗体治疗剂开发所需充分条件，因而可用作发挥优异的效果的自身免疫疾病治疗剂及器官移植中的免疫抑制剂。

在本发明中使用的术语“抗体”是指通过轻链及重链的可变区与其他分子(抗原)结合的蛋白质，并且包括IgG、IgD、IgA及IgE类型。抗体包含多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体。并且，本发明的抗体包含具有各种形式的单克隆抗体，例如，是指包含两个全长重链及两个全长轻链的完整的抗体(intact Ab)、包含或不包含恒定区的其片段嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或具有本发明的特征的其他基因修饰的抗体。

并且，在本发明中，提及本发明的抗体时使用的“RM8G-1”与“8G1”没有区别，并且在本说明书中互换使用。

在本发明中使用的术语“抗原结合片段”是指上述完整的抗体的一部分，与完整的抗体的氨基酸序列相比，在长度方面短一个以上的序列。在功能方面，包含完整的抗体或母源(parent)抗体的至少一部分活性或功能，其种类可以例举Fab(重组抗原结合片段(Fragment forantigen binding))、Fab’、F(ab’)₂、Fv或单链抗体(Single ChainAntibody，SCA)(例如，scFv或dsFv)、双特异性(bispecific)scFv及双特异抗体(diabody)，但不限于此。

在本发明中使用的术语“表位”包含特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任意蛋白质决定因子。表位决定因子大致由氨基酸或糖侧链等的分子的化学活性表面分组组成，其不仅具有大致特异性电荷特性，还具有特异性三级结构。

在本发明中，除了结合本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段以外，本发明的表位还结合包含化学物质(chemical drug)或互补结合表位的肽的各种抗原结合物质，它们可以表现出与本发明的抗CD40抗体类似或等同CD40-CD40L信号传导阻断效果。这种包含化学药物或肽的各种抗原结合物质可以包括在本发明的范围内。

根据本发明的优选实例，上述CD40是灵长类的CD40，上述灵长类是人、猴子、黑猩猩、大猩猩或猩猩，更优选地，是人或猴子。

在本发明的一实例中，上述抗CD40抗体或其抗原结合片段包含：由序列1表示的氨基酸序列组成的免疫球蛋白重链可变区(VH)；以及由序列2表示的氨基酸序列组成的免疫球蛋白重链可变区(VL)。

并且，上述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含序列3的HCDR1、序列4的HCDR2及序列5的HCDR3的氨基酸序列作为互补决定区(HCDR)序列；上述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含由序列6的LCDR1、序列7的LCDR2及序列8的LCDR3的氨基酸序列表示的序列作为互补决定区(LCDR)序列。

在本发明中使用的术语“可变区”是指由重链和轻链的一部分形成的抗原结合部位，各可变区由四个保守序列的骨架(FR)和序列严重变异的三个互补决定区(Complementary Determining Region，CDR)组成。免疫球蛋白重链可变区(VH)的CDR称为HCDR1至HCDR3，免疫球蛋白轻链可变区(VL)的CDR称为LCDR1至LCDR3。

在本发明中使用的术语“互补决定区”是指决定对抗体的抗原的特异性和结合能力的部位，最常见抗体之间序列变异。其中，CDR3部位的变异最严重，其由至少2个或最多26个以上的氨基酸残基组成。在VH及VL中，CDR以外的部分是骨架残基。本发明的抗原结合多肽的骨架可以通过将自然界中存在的人抗体中发现的序列、或各种抗体中发现的序列作为共同序列来使用。

本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段能够以各种形式提供，只要特异性地识别并结合CD40的表位Glu58、Cys59、Leu60、Pro61、Cys62、Gly63、Glu64、Ser65、Glu66及Phe67以阻断与CD40和CD154的相互作用。

上述各种形式包括变形，上述变形可以是作为抗体Fc部分的变形特征的降低效果因子功能的抗CD40抗体或其抗原结合片段。上述Fc-工程可以对应于基于补体(Complement)的补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)、基于细胞毒性细胞(cytotoxic Cell)的胞毒性(ADCC)效果微弱的IgG4或其变体。

即，对应于IgG4或Fc部位的补体结合部位(complement binding site)或Fc受体结合部位变形而降低补体依赖的细胞毒性作用或细胞毒性的变体。

根据本发明的优选实例，本发明的抗体选自由单克隆抗体、嵌合抗体、灵长类抗体、人源化抗体及人抗体组成的组中，更优选地，为单克隆抗体。

并且，上述抗CD40抗体可选自由多聚体抗体、异二聚体抗体、半二聚体抗体、四价抗体、双特异性抗体及单链抗体组成的组中。

上述抗原结合片段选自由Fab、F(ab)₂、Fab’、F(ab’)₂、F(ab’)3、Fd、Fv及结构域抗体组成的组中。

本领域技术人员可以通过使用如上所述的具有序列3至序列8的序列的可变区来构建包含恒定区的抗体，上述抗体包含结构要素的抗体。

并且，本发明包含在上述序列1至序列8中氨基酸发生保守取代的。在本发明中，少于10个、少于9个、少于8个、少于7个，少于6个，少于5个、少于4个、少于3个、少于2个或1个氨基酸发生取代。

在本发明中，术语“保守取代(conservative substitution)”是本领域常用术语，是指一个氨基酸被具有相似特性的其他氨基酸取代。相似特征包括例如，大小、疏水性或电荷(Charge)。氨基酸按照侧链的电特征通常被分类为具有带正电的侧链、带负电的侧链、不带电侧链或疏水性侧链的氨基酸。例如，保守取代包含从亮氨酸(Leu)取代为异亮氨酸(ile)、从精氨酸(Arg)取代为赖氨酸(Lys)、从苯丙氨酸(Phe)取代为色氨酸(Trp)、从天冬氨酸(Asp)取代为谷氨酸(Glu)、或从丝氨酸(Ser)取代为苏氨酸(Ser)、或逆向取代。通常，CDR序列的保守取代对CDR的功能不产生本质性影响。

这种序列的取代方法是本领域公知的，例如，可参照Sambrook，MolecularCloning[0053]A Laboratory Manual(Fourth Edition)，ColdSpring Harbor Laboratory(2012)N.Y.。

根据本发明的抗体包含抗原结合片段、变异体或其衍生物，其包含多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如，Fab、Fab’、F(ab’)₂、F(ab)₂、Fd、Fvs、单链Fvs(scFV)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、VL或VH区的片段，但不限于此。根据本发明的抗体可以是IgG、IgE、IgM，IgD、IgA或IgY等的任意类型，也可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2等的任意类别或其子类。

本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段可以是嵌合抗体。在本发明中使用的术语“嵌合抗体”是指可变区，即抗原结合部位和抗体的恒定区(在轻链的情况下，包含CL1区，在重链的情况下，包含CH1、CH2、及CH3区)的至少一部分衍生自不同的物种(species)。例如，可变区可以包含小鼠衍生的，恒定区可以包含人衍生的。或者，指类别转换(class switch)的抗体，例如，从IgG型转换为IgE型的抗体。

并且，本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段可以是人源化抗体。在本发明中使用的术语“人源化抗体”是指抗体的骨架为人抗体，CDR区的一部分变形为仅包含特异性结合原始抗体分子来源物种的CDR中的抗原所需部分。例如，除了特异性结合猴子或小鼠衍生抗体的CDR中的抗原所需部位以外，剩余CDR部位和轻链及重链骨架被人抗体代替。

并且，根据本发明，本发明的抗体可以以各种形式的抗体制备。本发明的抗体可以通过融合具有互不相同的功能的Fab来制备具有多功能的融合抗体，并且还可以通过使用所获得的轻链及重链可变区来使Fab抗体与人衍生的恒定区重组以提供完整(whole)形式的抗体。

并且，本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体。术语“单克隆抗体”或“单一克隆抗体”是指从实质上相同的抗体群体获得的单一分子组合的抗体分子，单克隆抗体对特定表位表现出单一结合特异性及亲和力。

单克隆抗体基于将骨髓瘤细胞与衍生自免疫哺乳类的脾细胞融合而成，可通过本领域各种公知方法制备。在其他实例中，本发明的抗体包含抗体片段，上述抗体片段包含产生在保藏编号KCLRF-BP-00336的杂交瘤的抗体的轻链衍生一个以上CDR、和/或重链衍生一个以上CDR。

根据具体目的，根据本发明的抗体可进一步通过与选自由治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物修饰剂、药物及聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)组成的组中的功能物质共轭来提供。并且，可根据结合物质的种类使用各种方法来制备。

上述治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质，生物修饰剂及药物可以使用本领域常规使用的任何物质，只要可以实现所需效果即可。

抗体的片段可通过用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶出来获得。F(ab’)₂片段可通过用胃蛋白酶处理完整的抗体来获得，若用硫醇还原剂后续处理，则可以获取包含轻链及重链的一部分的Fab片段。Fab片段还可以通过用木瓜蛋白酶处理完整的抗体来获得。例如，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶处理本发明的杂交瘤中产生的抗体可以制备特异性识别F(ab’)₂或Fab等的CD40抗体片段。

Fv片段是仅由重链及轻链可变区组成的抗体片段，两个可变区可以通过化学交联剂或分子间二硫键等的非共价或共价键连接(Inbar et al.(1972)PNAS 69：2659-2662)，例如，可以通过酶处理本发明的杂交瘤产生的抗体以仅分离重链及轻链的可变区或使用重组基因(DNA)技术来制备特异性识别CD40的抗体。

SCA片段可通过酶处理或基因工程制备，是轻链的可变区及重链的可变区通过多肽等的交联剂连接的抗体片段。ScFv的制备方法可以参照美国专利第4936778号或美国专利第5892019号公开的内容，对本发明的杂交瘤产生的抗体进行酶处理或使用重组基因技术制备包含编码上述抗体的重链和/或轻链的可变区的核酸序列的载体，并在适当的细胞中表达上述载体，从而可以制备特异性识别CD40的抗体。

在本发明中使用的术语“结合”或“特异性结合”是指对本发明的抗体或抗体组合物的抗原的亲和力。在抗原抗体结合中，在典型解离常数(dissociation constant，Kd)小于1x10^-5M、或小于1x10^-6M、或小于1x10^-7M的情况下，“特异性结合”可以与非特异性背景结合区分开。特异性结合可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体共振(Surfaceplasmon resonance，SPR)、免疫沉淀法(immunoprecipitation)、共同沉淀(coprecipitation)等的方法本领域公知的方法检测，包含可区分非特异性结合与特异性结合的适当对照组。

包含如上所述的完整的抗体或其片段本发明的抗体可以以包含单体的抗原结合能力的至少一部分的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等的多聚体存在。这种多聚体还包含同种多聚体、或异种多聚体。抗体多聚体包含大量抗原结合部位，因此与单体相比，对抗原的结合能力优异。抗体的多聚体还以与制备多功能(bifunctional，trifunctional，tetrafunctional)抗体。

在本发明中使用的术语“多功能”是指具有两种以上活性或功能(例如，抗原结合能力、酶活性、配体或受体结合能力)的抗体或抗体组合物，例如，本发明的抗体可以与萤光素酶、乙酰转移酶、半乳糖苷酶等的具有酶活性的多肽结合。多功能抗体还包含多价(multivalent)或多特异性(双特异性(bispecific)、三特异性(trispecific)等)形式的抗体。

术语“多特异性”是指包含可以与两个以上不同表位结合的可变区。上述两个以上表位可存在于一种抗原或另一种抗原。

并且，根据本发明的另一实施方式，本发明提供分离的核酸分子及包含上述分离的核酸分子的表达载体，上述核酸分子包含编码上述抗CD40抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

核酸包含基因(DNA)、互补基因(cDNA)、核糖核酸(RNA)、或重组或合成基因或核糖核酸等。在一实例中，核酸分子为cDNA。核酸还可以是相应基因组(genomic DNA)或其片段。根据本发明的编码抗体、或其一部分或其片段的核酸序列可因编码氨基酸的核酸序列的冗余(redundancy)而不同，这种序列也包括在本发明中。

可在本发明中使用的载体包含噬菌体、质粒、可复制或不可复制的病毒或逆转录病毒载体。根据本发明的核酸分子可导入到公知的各种载体。例如，作为原核细胞载体包含pUC系列载体、pBluescript(Stratagene)、pET系列载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)载体等，作为真核细胞载体包含pREP(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMCI neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、plZD35、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(Edge Biosystems)、pTriEx-Hygro(Novagen)及pCINeo(Promega)载体等，但不限于此。

根据本发明的载体可通过公知的转化或转导方法导入到各种原核或真核细胞。当导入到细胞时，可以被插入到宿主细胞的基因组，或可以以额外的染色体形式存在。

可以使用的原核细胞包含埃希氏杆菌属(Escherichia)、杆菌(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)及沙门氏菌属(Salmonella)细胞，作为细胞包含哺乳类细胞，例如，Hela、HEK293、H9、Jurkat、小鼠NIH3T3、C127、Cosl、Cos7及CV1、小鼠C2C12、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)等的真菌细胞、果蝇S2及Spodoptera Sf9等的昆虫细胞，但不限于此。

本发明的抗体可使用重组方法按照公知的方法产生。在重组方法的情况下，将根据本发明的编码抗体的重链的核酸序列及编码上述抗体的轻链的抗体克隆到一个或两个表达载体后，并转移到真核宿主细胞以表达抗体，之后可以从宿主细胞或培养自获取抗体。这种载体的制备、从制备的载体表达细胞中的蛋白质的表达并分离蛋白质的的重组方法是本领域公知的，例如，可参照Kaufman，R.J.，Mol.(2000)Biotechnol.16：151-160。编码本发明的抗体的载体可以在适当的宿主细胞，例如，CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌等中表达，抗体可从细胞的溶解物或培养基获取。

本发明的编码整体抗体或其片段的核酸序列可通过常规方法从本发明中公开的杂交瘤细胞分离后分析其序列。然后，将分离的核酸序列克隆到如上所述的适当表达载体后，转移到不产生抗体的HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞以在宿主细胞产生重组抗体。本发明的编码抗体或其片段的核酸导入到包含启动子、转化开始部位、3’非转化部位、聚腺苷酸化信号及转录终止信号的表达载体。轻链及重链可导入到一个载体或另外的载体。

并且，根据本发明的还有一实施方式，本发明提供包括向人以外的动物注射上述抗CD40抗体表位的步骤的产生特异性结合上述表位的抗CD40抗体或其抗原结合片段的方法。

本发明的抗体可以存在于包含杂交瘤的完整的细胞、或其细胞溶解产物(lysate)或培养基，由此可以纯化分离出一部分或实质上纯形式。纯化是用于去除抗体以外的细胞的其他副产物，例如，细胞构建体、核酸、蛋白质等，可使用碱/SDS处理、CsCl分离、柱色谱、琼脂糖电泳等的公知方法。

例如，培养本发明公开的杂交瘤细胞后，可使用蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱、透析、或亲和层析等的常规方法从其培养基分离单克隆抗体。

并且，根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含抗CD40抗体或其抗原结合片段的用于阻断CD40-CD40L信号传递的组合物。

由于本发明的组合物包含抗CD40抗体或其抗原结合片段，因此省略重复的内容以避免本说明书的过度复杂性。

并且，根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述抗CD40抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于治疗或预防自身免疫疾病或慢性炎性疾病的药学组合物。

并且，根据本发明的又一实施方式，本发明提供用于增强自身免疫疾病或慢性炎性疾病的治疗或预防效果的药学组合物，上述组合物可作为如下的任意治疗剂来提供：实现目标效果，即，显示出治疗或预防自身免疫疾病或慢性炎性疾病效果，例如，能够与免疫治疗剂结合使用的治疗剂。

在本发明中使用的术语“辅助治疗剂”指可辅助使用的制剂以增强本领域通常使用的自身免疫疾病或慢性炎性疾病治疗剂的效果，通过使用根据本发明的辅助治疗剂来增强自身免疫疾病或慢性炎性疾病治疗剂的效果，从而可以提高治疗剂的效果。

并且，本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段可以通过CD40-CD40L信号传导阻断效果来用作抗-药物抗体(Anti-Drug antibody)产生抑制剂。

在本发明中使用的术语“抗-药物抗体产生抑制剂”指如下的物质：通过向被给药抗体药物的患者中因生成对上述药物的抑制抗体而具有药物抗性的患者给药，来抑制对药物的抑制抗体的产生，从而诱导药物效果。例如，30％的被给药抗-TNF抑制抗体(阿达木单抗(Humira)、英利昔单抗(Remicade)、依那西普(Enbrel)等)的患者具有药剂抗性，而在给药本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段作为辅助治疗剂给药的情况下，可以抑制对抗-TNF-抑制抗体的抗体产生，并诱导抗-TNF-抑制抗体效果，因此可以消除药剂抗性。

本发明的组合物与药学上可接受的载体，选择性地与赋形剂或稳定剂一同剂型化。

在本发明中使用的术语“药学上可接受的载体”是生理上合适的物质，例如，包含任意溶剂、分散介质、包衣抗细菌及抗真菌剂、等渗溶液、吸收/再吸收延迟剂等的物质。在一实例中，载体使用尤其适用于注射及输注的物质。例如，药学上可接受的载体可包含无菌水溶液或等渗缓冲盐水或分散液及用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，并且本领域技术人员将能够根据组合物中包含的活性成分的种类来选择合适的制剂。

除了上述成分以外，本发明的药剂学组合物还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药剂学上可接受的载体及制剂在Remington’sPharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)中有详细描述。

对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的组合物可以通过本领域公知的多种途径来给药，并且给药方式和途径可以根据期望的效果而不同。本发明的药剂学组合物可以口服或非口服，优选非口服。在非口服给药的情况下，本发明的药剂组合物可以通过静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射等来给药。优选地，本发明的药剂学组合物的给药途径根据所应用的疾病的种类来决定。

根据本发明的药学组合物的有效剂量及给药持续时间可以根据特定患者、包含在组合物中的抗体的种类及给药方式等，按照所期望的治疗效果改变，并且不应对患者产生毒性。应考虑所使用的组合物的活性、给药途径、给药时间、分泌速度、一同使用的其他药物、性别、年龄、体重、总体健康状态、潜在疾病等的多种因素来选择每位患者的组合物实际用量。在一实例中，为了治疗或预防疾病，本发明的抗体能够以每体重约1mg/kg至100mg/kg，例如，约每体重10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、或50mg/kg的量给药，根据情况最多能够以约100mg/kg的量给药。

考虑到所给药的抗体的半衰期，根据本发明的药学组合物的给药间隔能够以天为单位、以周为单位、以月为单位等的适当间隔给药。

并且，本发明的组合物以药学上可接受的水合形式、水溶液或冻干形式等的适当给药形式剂型化，而与给药途径无关。

根据本发明的优选实例，上述自身免疫疾病可选自由1型糖尿病、秃头症(alopecia greata)、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、肾上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎及睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞氏病、大疱性肿胀、心肌病、乳糜泻性皮炎(celiacspruedermatitis)、慢性疲劳免疫综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、血管炎综合征、瘢痕回肠肿胀、CREST综合征、冷聚集病、克罗恩氏病、铁饼性狼疮、发热性复杂性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维刺激性、特发性血小板减少性紫癜、IgA神经炎、青少年关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型溃疡、恶性贫血、结晶性多关节炎、多发性软骨炎、自身免疫性多边形综合症、类风湿性肌痛、多发性肌炎和皮肤肌炎、原发性血管球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、赖特综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、强直性人类综合症、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、达格亚苏动脉炎、短暂性动脉炎、巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风及韦格纳肉芽肿病组成组中，最优选为1型糖尿病。

根据本发明的优选实例，上述慢性炎性疾病选自由炎性肠病(InflammatoryBowel Disease)、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis)、胰腺炎、慢性肝炎、食道炎、胃炎、结肠炎、肺炎、支气管炎、喉咙痛、心肌梗塞、心力衰竭、阿尔茨海默氏病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、哮喘、肾衰竭、银屑病、贫血、糖尿病及纤维化组成的组中。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含抗CD40抗体或其抗原结合片段的用于抑制移植器官时的免疫排斥反应的组合物。

上述组合物可以与本领域公知的现有免疫调节剂组合使用。

上述移植是指移植选自由同种细胞、异种细胞、同种组织、异种组织，同种器官及异种器官组成的组中的一种以上的情况。

由于根据本发明的组合物可以有效抑制CD40和CD154的相互作用，同时抑制T细胞活性及抗体产生，从而可以同时抑制细胞性免疫反应及体液免疫反应。

由此，上述组合物抑制或逆转基于移植受体的组织移植物的排斥反应，或者延长或保存移植到移植受体的组织的功能，或者恢复移植受体中的受损移植组织的功能。

由于本发明的组合物使用上述抗CD40抗体或其抗原结合片段，因此省略重复的内容以避免本说明书的过度复杂性。

并且，根据本发明的又一实施方式，本发明提供包括向需要治疗的对象给药上述药学组合物的自身免疫疾病或慢性炎性疾病的治疗方法。

由于本发明使用上述包含抗CD40抗体或其抗原结合片段的组合物，因此省略重复的内容以避免本说明书的过度复杂性。

即，特异性识别根据本发明的新型CD40表位以抑制其与CD154的相互作用本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段及包含其的组合物不仅用于阻断CD40-CD154信号传导、治疗、预防或调解自身免疫疾病，还有效地用于抑制器官移植时的免疫排斥反应。

发明的效果

本发明的新型抗CD40抗体直接靶向CD40而不靶向CD40配体，在不刺激血小板的情况下，由于阻断CD40-CD154信号传导，表现出优异的拮抗效果，因此有望用作如下的制剂来使用：治疗自身免疫疾病，并且可有效抑制同种或异种器官之间移植时在受体(recipient)产生的各种免疫排斥反应。

附图说明

图1a及图1c示出本抗体的表位分析结果。图1b示出本抗体的线性(Linear form)抗原决定基结合。

图2a及图2b示出本抗体的阻断CD40-CD154信号传导的高效率性。

图3示出本抗体的高亲和力。

图4示出本抗体的非拮抗(non-agonistic)性质。

图5a及图5b示出本抗体的细胞毒性效应子(minimal depleting)性质。

图6示出本抗体的灵长类/人交叉反应。

图7示出本抗体阻断猪CD40-CD40L结合。

具体实施方式

以下，实施例仅用于更具体说明本发明，对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围不限于这些实施例。

实施例1.制备产生本发明的抗CD40抗体的杂交瘤

本发明人按照以下方法制备、筛选、分析了通过靶向CD40来阻断CD40-CD154(CD40L)信号传导的新型抗CD40抗体。

为了开发新型抗CD40抗体，向每只6周龄的Balb/c雌性小鼠腹腔注射(intraperitoneal cavity，IP)1x10⁷的人CD40抗原(100μg/小鼠)或CD40表达CHO细胞株，以三周的间隔注射三次，并从静脉取血样来分离血清。向上述分离的血清加入在CD40表达CHO细胞中稀释的血清，在4℃下反应30分钟，之后加入3ml的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)，以1500rpm离心3分钟以洗涤未结合的抗体。为了确认结合的抗体，加入200倍稀释的作为二级抗体的山羊抗小鼠(goatanti-Mouse)Ig-FITC(Dinona)，并在4℃下反应15分钟，用3ml的聚丁二酸丁二醇酯以与上述相同的方法洗涤后，用流式细胞仪进行测定以确认对CD40表达CHO细胞株的效价。通过流式细胞仪确认对CD40表达CHO细胞株的效价的结果，可以确认在免疫CD40表达CHO细胞株的血清中显示出对CD40表达CHO细胞株的阳性高。

切除如上所述免疫小鼠的脾脏以获得单细胞悬液，用无血清细胞冻存培养基(RPMI)(GIBCO)洗涤2次后，以1∶1(v/v)混合0.4％的台盼蓝(trypan blue)(sigma)后，通过测定未染色细胞的台盼蓝(tryphan blue)染色法，用显微镜计数细胞。作为细胞融合伴侣(partner)细胞，使用X63小鼠骨髓瘤(mouse myeloma)细胞株(ATCC CRL-1580)，以与上述脾细胞相同地进行洗涤后，对细胞数进行计数。

以1∶5的比率混合上述骨髓瘤(myeloma)细胞和脾细胞，离心后去除上清液。每分钟缓慢添加1ml的预热至37℃的50％聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)1500。静置约1分钟后，缓慢加入无血清细胞冻存培养基以逐渐稀释。将其离心后，悬浮于包含1xHAT的无血清细胞冻存培养基(20％FBS，hypoxanthine-aminopterin-thymidine)，以150μl/孔接种到96-孔板后，在37℃下，在5％CO₂培养基中进行培养。上述融合后，进行组蛋白乙酰转移酶进料(HAT feeding)规定时间，当观察到形成菌落的孔，添加150μl的HT培养基，并在37℃下，在5％CO₂培养基中培养48小时后进行荧光染色，用流式细胞仪进行分析。向CD40表达CHO细胞株分别加入100μl的杂交瘤培养上清液，并在4℃下，反应30分钟后，加入3ml的聚丁二酸丁二醇酯，以1500rpm离心3分钟，洗涤未结合抗体，并为了确认结合的抗体，加入200倍稀释的作为二级抗体的山羊抗小鼠(goat anti-Mouse)Ig-FITC(Jackson Laboratory)，并在4℃下反应15分钟，用3ml的聚丁二酸丁二醇酯以与上述相同的方法洗涤后，用流式细胞仪进行测定。

在上述方法中，筛选对CHO细胞呈阴性，且对作为正常肺细胞株的L132和末梢血液的粒细胞(granulocytes)和淋巴细胞(lymphocytes)及单核细胞(monocytes)均呈阴性的单克隆抗体，最终通过有限稀释(limiting dilution)获得单菌落的RM8G1杂交瘤细胞。

选择上述杂交瘤作为最佳杂交瘤，并表示为RM8G1。

上述杂交瘤RM8G1于2015年01月14日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并被授予以下保藏号：KCLRF-BP-00336。

实施例2.本发明的抗-CD40-抗体的序列

本发明人克隆了编码来自产生抗CD40抗体的杂交瘤的重链及轻链片段的核酸，以分析根据本发明产生的抗体的结构。

克隆及测序如下进行。

使用RNA微型制备试剂盒(Qiagen)根据制造商的方法克隆基因，从实施例1中获得的RM8G-1杂交瘤细胞中提取RNA，然后进行聚合酶链反应(PCR)以合成cDNA。

用于合成重链cDNA、轻链cDNA的PCR条件及克隆方法如下：

使用小鼠Ig引物组(Mouse Ig-Primer Set(Millipore，Cat.#：69831))克隆了CD40抗原特异性抗体、RM8G-1抗体基因。使用小鼠Ig引物组从RM8G-1杂交瘤分离RNA进行聚合酶链反应，将其插入到pGem-T载体(Promega，Cat.#：A3600)后，通过测序确认DNA序列，并通过国际免疫遗传信息系统网站(www.imgt.org)确认了小鼠抗体基因。

重链可变区CDRH 1、2及3的序列分别表示为序列3至序列5。

轻链可变区CDRH 1、2及3的序列分别表示为序列6至序列8。

实施例3.确定本发明的抗CD40抗体识别的CD40抗原表位

本发明人确认了本发明的抗CD40抗体识别的人CD40抗原表位。

为了进行表位作图，制备由人CD40抗原的氨基酸序列中的15氨基酸组成的277个肽，使用其进行肽微阵列(peptide microarray)。一个肽由15个氨基酸组成，其中14个重复。由于复制了肽微阵列板，因此制备了共计554个彼此不会反应的肽斑点和78个阴性对照组肽斑点。在一个肽微阵列板上用山羊抗-IgG G(H+L)Dylight680抗体(1：5000)反应，并确认是否背景反应。在其他3个微阵列板上，以1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的浓度反应RM8G-1并洗涤后，用山羊抗小鼠IgG(H+L)Dylight680(1∶5000)在常温下反应45分钟。用奥德赛成像系统(LI-COR Odyssey Imaging System)读取(read-out)微阵列斑点(Microarryspot)，当将微板用激发山羊抗小鼠IgG(H+L)DyLight680反应时，为发生与CD40肽的非特异性结合，但在通过浓度处理RM8G-1的样品中产生了如图1a所示的结合反应。抗体RM8G-1反应的部位中，在ECLPCGESEF部位最强，在EPQEINFPDD中示出另一个弱反应。

其结果，如图1a至图1c所示，确认了本发明的CD40单克隆抗体与新型表位(epitope)结合，其与常规使用的现有抗体结合的抗原决定基(Binding Epitope)不同，上述表位的序列如下：ECLPCGESEF(Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Set Glu Phe)。

进行了蛋白质印迹分析(western blot)以确认RM8G-1是否与线性抗原决定基结合。即，用RIPA(lysis buffer)溶解淋巴瘤细胞后，进行电泳以转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)。

用抗-CD40 RM8G-1在4℃下反应过夜，用抗-小鼠IgG-HRP(1∶2000)反应1小时以洗涤缓冲液(TBST)后确认了显色。

其结果，如图1b所示，与现有抗CD40抗体不同，本发明的抗CD40抗体不仅示出表位的结构形式，还示出线性(Linear form)抗原决定基结合特性。

即，由于在将抗原制备成线性(linear)形式后，进行蛋白质印迹分析，因此存在反应表明本发明的抗CD40抗体可以识别线性(linearform)的形式。因此，可知与无法识别线性的形式的现有抗体相比，本发明的抗CD40抗体(RM8G1)具有显示显著特性的重要特征。

实施例4.本发明的拉CD40拉体的拮拉效果

本发明人确认了在上述实施例1中制备的本发明的新型抗CD40抗体的拮抗效果。

4-1.抑制基于本发明的抗CD40抗体的CD40-CD154信号传导

本发明人确认了基于本发明的抗CD40抗体(RM8G-1)的CD40-CD154信号传导抑制能力。

为了确认RM8G-1的信号传导抑制效果，从灵长类之一的恒河猴(rhesus monkey)的血液分离外周血单核细胞(PBMC)，并与His-tag CD40L反应。此时，浓度处理RM8G-1，并在常温下反应30分钟。洗涤后，抗-组氨酸-异硫氰酸荧光素(anti-histidine-FITC)抗体冰反应40分钟，并进行流式细胞分析。流式细胞分析后，FITC表达用平均荧光强度(mean-fluorescence intensity)值表示异硫氰酸荧光素值，值越高抑制效果越低。以未处理RM8G-1组的M.F.I值为100，相对抑制(Relative inhibition)表示为M.F.I值的相对值。

并且，为了确认RM8G-1是否阻断人CD40-CD40L信号传导，同时培养Ramos B细胞和表达CD40L的CHO细胞(CHO-CD40L)24小时。此时，浓度(0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml及20μg/ml)处理RM8G-1。

由于在Ramos B细胞中表达CD40，通过CHO-CD40L的CD40L信号刺激来被活化。上述活化Ramos细胞表达称为ICAM-1的粘附因子，通过流式细胞分析确认这种ICAM-1的表达，从而可以定量RM8G-1的抑制程度。

即，培养作为阳性对照组的Ramos、CHO-CD40L，以未处理抗体的组中在Ramos表达的ICAM-1的表达程度(由M.F.I表示)为基准，比较处理抗体的组中确认的ICAM-1的表达程度，并计算了抑制率。

其结果，如图2a及图2b所示，本发明的抗CD40抗体(RM8G-1)不仅特异性抑制灵长类及人中的CD40-CD154结合，还显示出高效阻断CD40-CD154信号传导的抑制能力。

4-2.本发明的抗CD40抗体对CD40抗原的亲和力

本发明人确认了本发明的抗CD40抗体(RM8G-1)对人CD40抗原的亲和力。

向Maxisrop酶标板添加人CD40抗原，每孔100ng，在37℃下反应1小时以包被抗原后，添加1x阻断(blocking)溶液(sigma)，每孔200μl，并在37℃下反应1小时后抑制。向上述准备的板上添加RM8G-1抗体及100μl的PBS后，在37℃下反应1小时，用PBS洗涤以去除未结合的抗体。此时，RM8G-1抗体从50μg/ml的浓度开始以3的倍数连续稀释，直至0.000282μg/ml的浓度，结合了共计12个点的RM8G-1抗体。之后，稀释添加山羊抗小鼠IgG-HRP(JacksonLaboratory)并反应30分钟后，用PBS洗涤，之后以每孔50μl加入四甲基联苯胺(TMB)溶液，反应10分钟后，加入50μl的硫酸并终止反应，在450nm测定了吸光度。

其结果，如图3所示，当通过上述ELISA方法确认对CD40抗原的亲和力时，显示出RM8G-1抗体根据浓度梯度与CD40抗原结合。

因此，本发明的抗CD40抗体(RM8G-1)显示出优异的亲和力。

为了确认RM8G-1抗体对CD40的亲和力，通过CM5传感器芯片分析(ensor chipassay)确认了缔合速率常数Ka值和离解速率常数Kd、平衡解离常数KD值。

即，通过氨基偶联(amine coupling)将抗-His抗体固定在(immobilization)CM5传感器芯片表面。通过与抗体反应来获得His-tagged CD40抗原，并与涂覆有抗-his抗体的传感器芯片反应。其结果通过biocore T200(GE Healthcare)读取。

其结果，本发明的抗CD40抗体(RM8G-1)显示出Ka＝4.741×105M^-1S^-1、KD＝2.340×10^-4S^-1、平衡解离常数(Equilibrium Dissociation Constant)KD＝4.936×10¹⁰M值，这表明即使没有另外的亲和力成熟(affinity maturation)，抗CD4抗体(RM8G-1)抗体也显示出作为治疗剂开发的程度高亲和力。

4-3.本发明的抗CD40抗体的非拮抗性(non-agonistic)的性质

已公开识别CD40的抗CD40抗体对B细胞显示出各种生物活性，对于CD40与CD40L之间的相互作用大致分为拮抗性的和非拮抗性的。

已知拮抗性抗CD40抗体可对需要活化CD40与CD40L之间的相互作用的疾病的治疗有效，可用于细菌、病毒等的传染性疾病的治疗、癌症的治疗等。

然而，报告显示CD40L对活化的血小板表达(V.Henn et.al.，Nature 391：591，1998)，因此在将抗CD40L抗体用作治疗剂的情况下，有引起血栓的风险(T.Kawai et.al.，Nat.Medi.6：114，2000)。

并且，据报告，CD40是使非霍奇金氏囊性淋巴瘤等的恶性肿瘤B细胞活化和生存的B细胞受体(Johnson et a1.，Blood 82：1848-1857(1993)；及Metkar et al.，CancerImmun01.Immunother.47：104(1998))。

由此，作为抑制CD40及其配体的结合的抗体治疗剂，针对CD40的抗体在安全性方面优于抗CD40L抗体。因此，作为抗CD40抗体必须抑制CD40L与CD40结合，且抗体本身不活化CD40。

由于CD40在免疫反应中起重要作用，可通过抑制CD40及其配体的结合来治疗器官移植时的免疫抑制或自身免疫疾病。

为此，本发明人确认了本发明的抗CD40抗体(RM8G-1)的非拮抗性(non-agonistic)性质。

在按照浓度涂有RM8G-1的板上培养Ramos(B cell)细胞。此时，在拮抗性抗体的情况下，通过刺激Ramos细胞的CD40来实现信号传导，在活化的情况下，称为ICAM-1的粘附因子的表达增加。然而，在RM8G-1的情况下，以没有这种活化的状态维持。

其结果，如图4所示，示出本发明的抗CD40抗体(RM8G-1)是优异的非拮抗性(non-agonistic)抗体。

因此，可以看出本发明的抗CD40抗体(RM8G-1)作为维持非拮抗性(non-agonistic)及拮抗性(antagonistic)活性的拮抗性抗CD40抗体，有效抑制自身免疫疾病的治疗、器官、骨髓等的移植中的排斥反应。

4-4.本发明的抗CD40抗体的细胞毒性效应子功能

本发明人通过对本发明的拮抗性抗CD40抗体(RM8G-1)进行另外的Fc-工程(Fc-engineering)来制备了非消耗性(non-depleting)或最少消耗性(minimum-depleting)抗体。

当开发抗体作为治疗剂时，抗CD40抗体的Fc工程旨在消除由于ADCC及CDC靶细胞(主要是抗原传递细胞)消耗(depletion)而产生的细胞毒性的副作用。为了消除这种ADCC或CDC，可以在抗体中变更结合补体或细胞的Fc受体的部位，或使用结合力低的IgG4形式的Fc。

具体地，本发明人确认了本发明的拮抗性抗CD40抗体(RM8G-1)的抗体依赖性细胞-介导细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)等的细胞毒性效应子功能。

为了分析CDC，将作为人B细胞株的淋巴瘤细胞(Raji cell)以5×10⁴细胞/孔接种到96孔(well)板后，在37℃下，在CO₂培养箱中培养20小时～24小时。用不含肽牛血清的无血清细胞冻存培养基替换各孔(well)的培养基后，混合10％的人血清(human serum)以使纯化的RM8G-1及利妥昔单抗(Rituximab)的最终浓度为10μg/ml、1μg/m1并制成混合液后，以100μl接种到各孔。分别在4小时和21小时后，用抗CD19抗体-PE-Cy7(BD)和用于确认细胞活力的试剂的7-AAD(BD)染色细胞，以用作检测淋巴瘤细胞的标记物，并用流式细胞仪进行分析。将同时为CD19阳性和7-AAD阳性的组隔开，并分析了淋巴瘤细胞的CDC。上述结果示于图5a中。

为了分析ADCC，将作为人B细胞株的淋巴瘤细胞(Raji cell)以5×10⁴细胞/孔接种到96孔(well)板后，在37℃下，在CO₂培养箱中培养20小时～24小时。用不含肽牛血清的无血清细胞冻存培养基替换各孔(well)的培养基后，将人外周血单核细胞作为效应细胞加入靶细胞淋巴瘤细胞的100倍(5×10⁶细胞/孔)，接种RM8G-1及利妥昔单抗(Rituximab)以使其最终浓度为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/m1。分别在4小时和21小时后，用抗CD19抗体-PE-Cy7(BD)和用于确认细胞活力的试剂的7-AAD(BD)染色细胞，以用作检测淋巴瘤细胞的标记物，并用流式细胞仪进行分析。将同时为CD19阳性和7-AAD阳性的组隔开，并分析了淋巴瘤细胞的细胞毒性。上述结果示于图5b中。

此时，使用本领域公知的抗-CD20抗体利妥昔单抗(Rituxan，Rituximab)作为对照组。

其结果，如图5a及图5b所示，与公知的抗体相比，本发明的抗CD40抗体(RM8G-1)不显示ADCC等的细胞毒性，并且显示出最少限度的CDC。当日后制造人源化抗体时，可通过使用没有CDC或ADCC的Fc变体或IgG4形式的Fc来克服最少限度的CDC。

实施例5.本发明的抗CD40抗体的物种交叉反应性

为了确定本发明的抗体对各种物种、尤其对来自作为灵长类的猴子的CD40的结合及亲和力，本发明人进行了流式细胞分析。

在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster overy cell，CHO)细胞制备用猴CD40基因转化的猴CD40-CHO细胞。淋巴瘤细胞为人细胞株。将RM8G-1抗体(0.5μg/ml)与CHO细胞、猴CD40-CHO细胞、淋巴瘤细胞在冰上反应30分钟后，洗涤，然后用抗-小鼠IgG-PE在冰上反应40分钟。洗涤后，进行流式细胞分析。此时，CHO用作阴性对照组，淋巴瘤细胞用作阳性对照组。

其结果，如图6所示，本发明的抗CD40抗体可以与灵长类恒河猴(Rhesus monkey)及人CD40交联，因此这对于临床前研究和开发治疗剂是非常有利的。

实施例6.阻断本发明的抗CD40抗体的异种细胞的信号传导

本发明人确认了本发明的抗CD40抗体的异种细胞(猪)信号传导的阻断效果。

为了确认是否阻断异种细胞(猪)的CD40的信号传导，从猪血中分离外周血单核细胞，并在冰上与CD40L-His tag反应1小时。此时，浓度处理RM8G-1并通过流式细胞分析来确认猪CD40-CD40L信号传导阻断效果。为此，用anti-His tag-FITC抗体反应40分钟，并用平均荧光强度表示了与猪外周血单核细胞的CD40反应的CD40L-Hig tag的量。

其结果，如图7所示，本发明的抗CD40抗体与浓度正比地阻断了猪CD40-CD40L的结合，这是唯一可以阻断在移植异种细胞/异种实质器官/异种胰岛时发生的供体-受体的CD40-CD154信号的抗体，期待其在抑制异种移植排斥反应方面非常有效。

总而言之，本发明开发了可通过与人CD40的表位(ECLPCGESEF)结合来抑制CD40-CD154相互作用的新型抗体(RM8G-1)，并确认了与现有抗CD40抗体相比具有更显著的对人CD40-CD154结合阻断的效果。

并且，本发明的抗CD40抗体(RM8G-1)满足在器官移植中作为抗CD40抗体的抑制免疫排斥反应及治疗自身免疫疾病的所有先决条件，可用作优异的自身免疫疾病治疗剂及器官移植中的免疫抑制剂。

保藏机构名：韩国细胞株银行(Korean Cell Line Bank)

保藏编号：KCLRFBP-00336

保藏日期：20150114

国际格式

根据用于专利申请的布达佩斯条约的微生物保藏证明

由国际保藏根据规则7.1发行的原保藏的保藏证书

接收：Park，ChungGyu

(110-799)韩国，首尔特别市钟路区大学路103，首尔大学医科大学，微生物学及免疫学教室

国际格式

根据用于专利申请的布达佩斯条约的微生物保藏证明

由国际保藏根据规则7.1发行的原保藏的保藏证书

接收：Park，ChungGyu

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序列表

<110> 首尔大学校产学协力团（SOUL NATIONAL UNIVERSITY R&D FOUNDATION）

<120> 新型抗CD40抗体及其用途

<130> SNU1-112p-1

<150> KR 10-2017-0068350

<151> 2017-06-01

<160> 8

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL of RM8G-1

<400> 1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ala Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Asp Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH of RM8G-1

<400> 2

Leu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Asp Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Met Trp Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Ala Pro Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Lys Thr Gly Gln Asp Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1 of RM8G-1

<400> 3

Lys Ser Val Ser Thr Ser Ala Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2 of RM8G-1

<400> 4

Leu Ala Ser

1

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3 of RM8G-1

<400> 5

Gln His Ser Trp Asp Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1 of RM8G-1

<400> 6

Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2 of RM8G-1

<400> 7

Met Trp Gly Gly Gly Arg Thr

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3 of RM8G-1

<400> 8

Val Lys Thr Gly Gln Asp Tyr Ala Val Asp Tyr

1 5 10

Claims

1.一种抗CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其中所述抗CD40抗体或其抗原结合片段与人CD40氨基酸序列的包含ECLPCGESEF的表位特异性结合；

其中所述抗CD40抗体或其抗原结合片段由保藏号为KCLRF-BP-00336的杂交瘤细胞系产生。

2.根据权利要求1所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗CD40抗体与上述CD40结合时作为拮抗性抗体对CD40拮抗。

3.根据权利要求1所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗CD40抗体或其抗原结合片段包含：由序列1表示的氨基酸序列；以及由序列2表示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗CD40抗体选自由单克隆抗体、嵌合抗体、灵长类抗体、人源化抗体及人抗体组成的组中。

5.根据权利要求1所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗CD40抗体或其抗原结合片段进一步与选自由治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物修饰剂、药物及聚乙二醇组成的组中的物质偶联。

6.一种用于阻断CD40-CD40L信号传导的组合物，其特征在于，包含权利要求1至权利要求5中任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段。

7.一种用于治疗或预防自身免疫疾病的药学组合物，其特征在于，包含权利要求1至权利要求5中任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段作为有效成分。

8.根据权利要求7所述的用于治疗或预防自身免疫疾病的药学组合物，其特征在于，上述自身免疫疾病选自由1型糖尿病、秃头症、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、肾上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎及睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞氏病、大疱性肿胀、心肌病、乳糜泻性皮炎、慢性疲劳免疫综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、血管炎综合征、瘢痕回肠肿胀、CREST综合征、冷聚集病、克罗恩氏病、铁饼性狼疮、发热性复杂性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维刺激性、特发性血小板减少性紫癜、IgA神经炎、青少年关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型溃疡、恶性贫血、结晶性多关节炎、多发性软骨炎、自身免疫性多边形综合症、类风湿性肌痛、多发性肌炎和皮肤肌炎、原发性血管球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、赖特综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、强直性人类综合症、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、达格亚苏动脉炎、短暂性动脉炎、巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风以及韦格纳肉芽肿病组成的组中。

9.一种用于治疗或预防慢性炎性疾病的药学组合物，其特征在于，包含权利要求1至权利要求5中任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段作为有效成分。

10.根据权利要求9所述的用于治疗或预防慢性炎性疾病的药学组合物，其特征在于，上述慢性炎性疾病选自由炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胰腺炎、慢性肝炎、食道炎、胃炎、结肠炎、肺炎、支气管炎、喉咙痛、心肌梗塞、心力衰竭、阿尔茨海默氏病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、哮喘、肾衰竭、银屑病、贫血、糖尿病以及纤维化组成的组中。

11.一种用于抑制移植时的免疫排斥的组合物，其特征在于，包含权利要求1至权利要求5中任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段。