WO2019070047A1 - 二重特異性抗体 - Google Patents

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史朗 柴山
智也 手塚
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    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen

Definitions

  • the present invention is abbreviated as a bispecific antibody (hereinafter referred to as PD-1 / CD19 bispecific antibody) capable of specifically binding to PD-1 and CD19 expressed on the same B cell. As well as its pharmaceutical therapeutic applications.
  • PD-1 / CD19 bispecific antibody capable of specifically binding to PD-1 and CD19 expressed on the same B cell.
  • PD-1 is an immunosuppressive receptor belonging to the immunoglobulin family, and is a molecule having a function of suppressing an immune activation signal of T cells activated by stimulation from an antigen receptor.
  • PD-1 signal is expressed by autoimmune dilated cardiomyopathy, lupus-like syndrome, autoimmune encephalomyelitis, systemic lupus erythematosus, graft versus host disease, type I diabetes and It is known to play an important role in the suppression of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis. Therefore, it has been pointed out that substances that enhance PD-1 signaling can be used as preventive or therapeutic agents for autoimmune diseases.
  • CD19 is a membrane protein expressed in B cells, and a molecule that transmits stimulation to B cells together with the B cell receptor complex.
  • bispecific antibodies that recognize PD-1 have been known as substances that enhance PD-1 signal (Patent Documents 1 to 3). These bispecific antibodies are those in which the antigen recognition site of an antibody that recognizes CD3, which is a member of the T cell receptor complex, and the antigen recognition site of an antibody that recognizes PD-1 are engineered. It has the effect of enhancing the suppression signal of PD-1 to T cell receptor complex by increasing the frequency of positioning PD-1 near the T cell receptor complex. Furthermore, these patent documents also describe that PD-1 bispecific antibodies can be used for the prevention or treatment of autoimmune diseases.
  • An object of the present invention is to provide a new drug for preventing, suppressing the progress of symptoms, suppressing relapse or treating autoimmune diseases.
  • the inventors of the present invention focused on the PD-1 / CD19 bispecific antibody as a substance capable of solving such problems, and completed the present invention.
  • a first arm that specifically binds to PD-1 (hereinafter sometimes abbreviated as the first arm) and a second arm that specifically binds to CD19 (hereinafter abbreviated as the second arm) PD-1 / CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof.
  • VH The heavy chain variable region
  • VH the light chain variable region of an antibody
  • anti-PD-1 antibody an antibody
  • the PD-1 / CD19 bispecific antibody or the antibody fragment thereof according to the above-mentioned [1] which comprises in the following abbreviated as VL.
  • the N-terminal end of a polypeptide having a human IgG constant region (hereinafter sometimes abbreviated as "IgG constant region (hinge / CH3)") of the present invention has a structure further linked via a peptide linker or directly The PD-1 / CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the above [4] to [6].
  • the peptide linker is Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 1; hereinafter abbreviated as (Gly) ⁇ 4-Ser) or Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 2; hereinafter, abbreviated as ((Gly) ⁇ 4-Ser) ⁇ 3), of the above items [4] to [9]
  • the PD-1 / CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the above.
  • a humanized or fully humanized isolated PD-1 / CD19 bispecific antibody comprising a first arm that specifically binds to PD-1 and a second arm that specifically binds to CD19, , (A) The first arm comprises VH and VL of anti-human PD-1 antibody, and the second arm comprises VH and VL of anti-human CD19 antibody, (B) bind to PD-1 and CD19 expressed on B cells, respectively; (C) the first arm permits interaction between PD-1 and PD-L1, and (d) is in the form of a bispecific hybrid antibody, and / or is an IgG 1 antibody or an IgG 4 antibody , Said antibody.
  • a pharmaceutical composition comprising an isolated PD-1 / CD19 bispecific antibody and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • An agent for preventing, suppressing the progress of symptoms, suppressing relapse and / or treating an autoimmune disease, comprising a PD-1 / CD19 bispecific antibody as an active ingredient.
  • Autoimmune diseases include Behcet's disease, systemic lupus erythematosus, chronic discoid lupus erythematosus, multiple sclerosis (systemic scleroderma, progressive systemic sclerosis), scleroderma, multiple myositis, Dermatomyositis, periarteritis nodosa (polyarteritis nodosa, microscopic multiple vasculitis), aortitis syndrome (Takayasu's arteritis), malignant rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, spondyloarthritis, mixed combination Histology, Sjögren's syndrome, adult Still's disease, vasculitis, allergic granulomatous vasculitis, hypersensitivity vasculitis, rheumatoid angiitis, macroangiitis, ANCA related vasculitis (
  • Steroids eg, cortisone acetate, hydrocortisone, sodium hydrocortisone phosphate, hydrocortisone sodium succinate, fludrocortisone succinate, fludrocortisone acetate, prednisolone acetate, prednisolone acetate, prednisolone succinate sodium, butyl acetate prednisolone sodium phosphate, prednisolone sodium acetate, acetate Halopredone, methylprednisolone, methylprednisolone acetate, methylprednisolone sodium succinate, triamcinolone acetate, triamcinolone acetate, triamcinolone acetonide, dexamethasone, dexamethasone acetate, dexamethasone acetate, sodium dexamethasone phosphate, dexamethasone palmitate, methazone acetate acetate, betamethasone etc
  • the PD-1 / CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [22], or the humanized or fully human single antibody according to the preceding item [23]
  • Autoreactive B cell-mediated diseases include systemic lupus erythematosus, Graves' disease, myasthenia gravis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenia, asthma, cryoglobulinemia, primary The agent for preventing, suppressing the progress of symptoms, suppressing the recurrence and / or the therapeutic agent according to the above [4-1], which is biliary sclerosis or malignant anemia.
  • [5-1] The PD-1 / CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [22] or the humanized or fully human single antibody according to the previous item [23] A self-reactive B cell suppressor comprising PD-1 / CD19 bispecific antibody as an active ingredient.
  • [5-2] The autoreactive B cell suppressor according to the above [5-1], wherein the autoreactive B cell suppressor is an immunoglobulin production suppressor.
  • [5-3] The autoreactive B cell suppressor according to the above [5-2], wherein the immunoglobulin is IgG or IgM.
  • [6-1] The PD-1 / CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [22] or the humanized or fully human single antibody described in the preceding item [23]
  • a memory T cell activation inhibitor comprising an isolated PD-1 / CD19 bispecific antibody as an active ingredient.
  • the PD-1 / CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [22] or the humanized or fully human single antibody described in the preceding item [23]
  • Prevention of autoimmune disease (especially autoreactive B cell mediated disease) or graft versus host disease (GVHD) comprising administering to the patient an effective amount of a PD-1 / CD19 bispecific antibody.
  • PD-1 / CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [22] or the humanized or fully human single antibody described in the preceding item [23]
  • a method for suppressing autoreactive B cell repression or memory T cell activation comprising administering to a patient an effective amount of a PD-1 / CD19 bispecific antibody.
  • [8-1] For the prevention, suppression of symptom progression, suppression of relapse and / or treatment of autoimmune disease (especially, autoreactive B cell-mediated disease) or graft versus host disease (GVHD)
  • the PD-1 / CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of the above [22] or the humanized or fully human isolated PD-1 / CD19 bispecific according to the above [23] Sex antibody.
  • a PD-1 / CD 19 bispecific antibody or any one selected from any one of the preceding items [1] to [22] for autoreactive B cell suppression or memory T cell activation suppression The antibody fragment or a humanized or fully humanized isolated PD-1 / CD19 bispecific antibody according to the above [23].
  • a therapeutic agent especially, autoreactive B cell-mediated disease
  • GVHD graft versus host disease
  • PD-1 / CD 19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of the above [21] or the humanized or fully human isolated PD-1 / CD 19 double as described in the above [23] Use of specific antibodies.
  • PD-1 / CD19 bispecificity selected from any one of the above [1] to [22] in the production of an autoreactive B cell inhibitor or memory T cell activation inhibitor
  • PD-1 / CD19 bispecificity selected from any one of the above [1] to [22] in the production of an autoreactive B cell inhibitor or memory T cell activation inhibitor
  • the PD-1 / CD19 bispecific antibody of the present invention has a PD-1 agonist action and further exhibits a suppressive action on activated B cells, it can prevent autoimmune disease or GVHD, suppress symptom progression, and prevent recurrence. And / or can be used for treatment.
  • FIG. 1 shows the structure of a B cell target PD-1 agonist (B cell target PD-1 agonist X and B cell target PD-1 agonist M) described in Example 1.
  • FIG. 1 shows the structure of a B cell target PD-1 agonist (B cell target PD-1 agonist X and B cell target PD-1 agonist M) described in Example 1.
  • FIG. 1 shows the structure of a B cell target PD-1 agonist (B cell target PD-1 agonist X and B cell target PD-1 agonist M) described in Example 1.
  • VH CD19” and “VL CD19” represent the VH and VL of the anti-CD19 antibody, respectively
  • VH PD-1 and “VL PD-1” represent the VH and VL of the anti-PD-1 antibody, respectively.
  • “L1”, “L2” and “L3” represent peptide linkers linking each VH and VL, L1 and L3 are (Gly) ⁇ 4-Ser, L2 is ((Gly) ⁇
  • FIG. 7 shows the structure of the B cell target PD-1 agonist M-Fc described in Example 2.
  • IgG 1 (Hinge-CH3) represents a human IgG 1 constant region having a hinge region to a CH3 region.
  • L4 represents a peptide having a structure represented by (Gly) ⁇ 4-Ser or ((Gly) ⁇ 4-Ser) ⁇ 3.
  • Other symbols have the same meanings as those shown in FIG.
  • FIG. 16 shows flow cytometry showing specific binding of B cell target PD-1 agonist X to human PD-1 and human CD19.
  • FIG. 16 shows flow cytometry showing specific binding of B cell target PD-1 agonist M to human PD-1 and human CD19.
  • B cell target PD-1 agonist M-Fc shows flow cytometry showing specific binding of B cell target PD-1 agonist M-Fc to human PD-1 and human CD19. The effect of each B cell target PD-1 agonist on cell proliferation of activated human B cells is shown.
  • B cell target PD-1 agonist M represented by "Agonist M” in the figure
  • B cell target PD-1 agonist X represented by "Agonist X” in the figure
  • B cell target PD-1 agonist M-Fc represented by “Agonist M-Fc” in the figure.
  • Figure 7 shows the effect of B cell targeted PD-1 agonist M-Fc on IgM and IgG production in human B cells.
  • FIG. 7 shows the effect of B cell-targeted PD-1 agonist M-Fc in xenograft GVHD mouse model.
  • Figure 7 shows the effect of B cell targeted PD-1 agonists on IL-2 production from human memory T cells.
  • FIG. 10 depicts the effects of B cell-targeted PD-1 agonist M-Fc on immune response to thymus dependent antigens. The vertical axis of the graph shows the antibody titer against KLH in serum.
  • FIG. 16 shows the structure of mouse B cell target PD-1 agonist-Fc-1 described in Example 9.
  • FIG. 16 shows the structure of mouse B cell target PD-1 agonist-Fc-2 described in Example 9.
  • FIG. 16 shows flow cytometry showing specific binding of mouse B cell target PD-1 agonist-Fc-1 to mouse PD-1 and mouse CD19.
  • FIG. 16 shows flow cytometry showing specific binding of mouse B cell target PD-1 agonist-Fc-2 to mouse PD-1 and mouse CD19.
  • FIG. 16 depicts the in vivo effects of each of the mouse B cell target PD-1 agonists -Fc-1 and -2 on immune responses in NP-OVA immunized mice.
  • the vertical axis of the graph shows the number of cells of class switch memory B cells, and "Mouse Agonist-Fc-1" is a mouse B cell target PD-1 agonist-Fc-1 and "Mouse Agonist-Fc-2" is a mouse B.
  • Each represents the cell target PD-1 agonist-Fc-2.
  • PD-1 (P rogrammed Cell D eath -1) , in humans, it is a membrane protein consisting of the amino acid sequence shown in GenBank accession number NP_005009. In the present specification, when “PD-1" is described, all isoforms thereof and the epitope of the "first arm specifically binding to PD-1" according to the present invention are conserved, unless otherwise specified. Also, they may be used as including those variants. In the present invention, PD-1 is preferably human PD-1.
  • CD19 is a membrane-type protein that has an amino acid sequence shown in Genbank Accession No. NP_001761 in humans, and is expressed in B cells to form a complex with a B cell receptor.
  • CD19 is described in the present specification, unless it is particularly limited, all isoforms thereof and epitopes thereof “the second arm specifically binding to CD19” according to the present invention are conserved, and modifications thereof It may be used as including the body.
  • preferred as CD19 is human CD19.
  • isolated refers to substantially single pure substance by being identified, separated and / or purified from among the contaminants extracted from the host cell and containing plural or innumerable components. It means that it becomes an ingredient.
  • monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population which binds to the same specific antigen.
  • bispecific antibody refers to an antibody having one binding specificity for two different antigen molecules or epitopes.
  • the present invention relates to bispecific antibodies and antibody fragments thereof which can specifically bind to PD-1 and CD19 expressed on B cells.
  • the present invention relates to bispecific antibodies and antibody fragments thereof which can simultaneously specifically bind to PD-1 and CD19 expressed on B cells.
  • the present invention relates to bispecific antibodies and antibody fragments thereof which can specifically bind to PD-1 and CD19 expressed on the same B cell.
  • bispecific antibodies examples include, for example, diabodies, bispecific sc (Fv) 2 , bispecific minibodies, bispecific F (ab ') 2 , bispecific hybrid antibodies, Covalently linked diabody (bispecific DART), bispecific (FvCys) 2 , bispecific F (ab'-zipper) 2 , bispecific (Fv-zipper) 2 , bispecific There are three chain antibodies and bispecific mAb 2 etc.
  • a diabody is a dimer of single-chain peptides in which VH and VL recognizing different antigens are linked by a peptide linker (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993), Vol. 90, No. .14: See p.
  • Bispecific sc (Fv) 2 is a small molecule that has been modified so that two sets of VH / VL of two antibodies that recognize different antigens are produced in the form of a continuous single chain via a peptide linker. Antibody (see J. Biological Chemistry (1994), Vol. 269: p. 199-206).
  • Bispecific F (ab ') 2 is a depolymerized antibody in which Fab' fragments of antibodies that recognize two different antigens are covalently linked by a disulfide bond or the like.
  • a bispecific minibody is a low-molecular weight antibody fragment in which the constant region CH3 domain of an antibody is linked to scFvs that recognize different antigens, covalently linked by a disulfide bond or the like on the CH3 domain. It is a molecule-forming antibody (see Biochemistry (1992), Vo. 31, No. 6, p. 1579-1584).
  • a bispecific hybrid antibody is an intact antibody in which a heavy chain / light chain complex of antibodies recognizing two different antigens is covalently linked by a disulfide bond or the like.
  • bispecific antibody a form having a wide movable region between two variable regions is preferable, for example, a bispecific hybrid antibody.
  • Bispecific hybrid antibodies can be produced, for example, from hybridomas made by the hybrid hybridoma method (see US 4474893).
  • bispecific hybrid antibodies can be produced by co-expressing and secreting, into mammalian cells, a total of four types of cDNA encoding the heavy and light chains of antibodies that recognize different antigens.
  • the monoclonal antibody used in the present invention is a hybridoma method (for example, Kohler and Milstein et al., Natur (1975), Vol. 256, p. 495-97, Hongo et al., Hybridoma (1995), Vol. 14, No. 3). Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Vol. 2) and Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, p. 563-681 (Elsevier, NY, 1981), recombinant DNA methods (see, eg, US Pat. No.
  • phage display methods eg, Ladner et al., US 5223409, US 5403484 and US 5571698, Dower et al., US 5427908 and US 5580717, McCafferty et al., US 5969108 and US 6172197, and Griffiths et al.
  • antibodies or monoclonal antibodies When administered to humans, antibodies or monoclonal antibodies can be prepared in the form of chimeric antibodies, humanized antibodies or fully human antibodies in order to reduce or eliminate their antigenicity.
  • a “chimeric antibody” refers to an antibody in which the variable region sequence and the constant region sequence are derived from different mammals, for example, the variable region sequence may be derived from a mouse antibody and the constant region sequence may be derived from a human antibody .
  • a chimeric antibody is a gene encoding an antibody variable region isolated by a known method from an antibody-producing hybridoma isolated by the above-mentioned hybridoma method, recombinant DNA method or phage display method using a known method. , Can be linked to a gene encoding an antibody constant region of human origin (see, eg, US Pat. No. 4,816,567 to Cabilly et al.).
  • humanized antibody is meant an antibody in which complementarity determining region (CDR) sequences from a germline type of another mammalian species, such as a mouse, are grafted onto human framework sequences.
  • CDR complementarity determining region
  • a gene encoding an antibody CDR region isolated by a known method from an antibody-producing hybridoma isolated by the above method is a human-derived antibody framework region using a known method.
  • Can be linked to the gene encoding see, eg, US Pat. No. 5,225,539 and US Pat. No. 5,530,0101 to Queen, US Pat. No. 5,550,089 to Queen et al. And US Pat. No. 6,180,370).
  • human antibody or “fully human antibody” is meant an antibody in which both the variable and constant regions, consisting of framework and CDR regions, are derived from human germline immunoglobulin sequences.
  • the human antibodies used in the present invention are mice which have been transformed to produce human antibodies, such as Humab mice (e.g., U.S. Pat. No. 5,545,806, U.S. Pat. No. 5,559,825, U.S. Pat. No. 5625,126, U.S. Pat. No. 5,633,425, U.S. Pat.
  • mice see, eg, WO 2002/43478 by Ishida et al.
  • Xeno mice see, eg, US 5939598, US 6075181, US 6114598, US 6150584 and US 6162963
  • Tc mice see, eg, Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), p. 722-727)
  • Human immune cells can also be prepared using reconstituted SCID mice (see, eg, US Pat. No. 5,476,996 and US Pat. No. 5,698,767 to Wilson et al.) So that human antibody responses can be generated by immunization.
  • human antibodies used in the present invention can also be produced by the phage display method described above.
  • the “antibody fragment” of a PD-1 / CD19 bispecific antibody is a part of a full-length antibody, which has an antigen-binding portion against PD-1 and an antigen-binding portion against CD19.
  • F (ab ') 2 etc. are mentioned.
  • the antigen-binding portion means the minimum unit that can bind an antibody to the antigen, and, for example, the target antigen can be recognized by the combination of CDRs of three each in VH and VL and the CDRs It consists of framework regions that arrange CDRs.
  • isotype is used to refer to the antibody class (eg, IgM or IgG) encoded by heavy chain constant region genes.
  • the preferred isotype as the bispecific antibody of the present invention is IgG 1 or IgG 4 , where IgG 1 is preferably one that loses or diminishes its binding to an Fc receptor. Specifically, by substituting, deleting or inserting any amino acid in the heavy chain constant region, it is possible to obtain an IgG 1 antibody in which the binding to the Fc receptor is abolished or attenuated.
  • IgG 1 antibodies in which leucine at position 234 is substituted by alanine and / or leucine at position 235 is substituted by alanine in each of the two heavy chain constant regions or hinge regions.
  • an antibody lacking the C-terminal amino acid for example, 447th lysine by EU numbering system is preferable.
  • the Fc region of the bispecific antibody of the present invention may be substituted at any amino acid in the region so that two different heavy chains are easily associated.
  • leucine at position 351 is replaced by lysine and threonine at position 366 is substituted by lysine according to the EU numbering system of the constant region on the heavy chain having the first arm VH specifically binding to PD-1 PD-1 / CD 19 double in which the 351 leucine in the constant region of the heavy chain having the second arm VH specifically binding to CD19 is substituted with aspartic acid, and the 368th leucine is substituted with glutamic acid Specific antibodies are included.
  • leucine at position 351 is substituted with aspartic acid by the EU numbering system in the constant region of the heavy chain having the first arm VH specifically binding to PD-1, and leucine at position 368 is substituted with glutamic acid.
  • PD-1 / CD19 double in which the 351 leucine in the constant region in the heavy chain having the second arm VH specifically binding to CD19 is substituted by lysine and the 366th threonine is substituted by lysine Specific antibodies are also mentioned.
  • bispecific antibodies of the present invention is IgG 4, so as to suppress the swapping in the antibody molecule, any amino acid of the heavy chain constant region is substituted, missing or inserted variant is more preferable.
  • an antibody in which proline is substituted for serine at position 226 according to the EU numbering system, which is located in the hinge region is preferred.
  • amino acid positions assigned to CDRs and frameworks of antibody variable regions are defined according to Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., (1987) and The amino acids in the constant region are also represented according to the EU numbering system (see Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242) according to the amino acid position of Kabat.
  • autoreactive B cells refers to B cells that produce antibodies against self antigens.
  • First arm specifically binding to PD-1 In the present specification, the “first arm specifically binding to PD-1” is included in or not a part of an antibody or antibody fragment An antibody moiety that can specifically bind to PD-1 by containing at least VH and VL of anti-PD-1 antibody and associating them, regardless of whether they are present alone or not.
  • first arm also includes the Fab portion of an anti-PD-1 antibody.
  • “specifically binds to PD-1” means at least an affinity (dissociation constant (Kd value) higher than 1 ⁇ 10 ⁇ 5 M, more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 7 M, more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M And can bind directly to PD-1 with binding activity, and at least substantially to other receptor members belonging to the so-called CD28 family receptors, such as CD28, CTLA-4 and ICOS Not used as a feature.
  • the "antibody” in the "antibody that specifically binds to PD-1” or “anti-PD-1 antibody” is a full-length antibody, that is, from two heavy chains and two light chains linked by a disulfide bond. Is a full-length antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • the first arm is more preferably one that allows interaction with PD-1 and PD-L1, interaction with PD-1 and PD-L2, or both interactions. Whether the first arm permits interaction with PD-1 and PD-L1, interaction with PD-1 and PD-L2, or both of them can be determined according to known methods, eg, immobilized PD Biacore analysis, ELISA assay, flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), for example, the influence of the first arm on the binding of soluble PD-1 protein to L1-protein or PD-L1-expressing cells ), Fluorescence energy transfer measurement (FRET) or fluorescence micrometry (FMAT (registered trademark)).
  • FRET Fluorescence energy transfer measurement
  • FMAT fluorescence micrometry
  • the “second arm specifically binding to CD19” is or is not part of or part of an antibody or antibody fragment itself
  • the second arm contains the Fab portion of the anti-CD19 antibody.
  • “specifically binds to CD19” means at least an affinity (dissociation constant (Kd value)) higher than 1 ⁇ 10 ⁇ 5 M, more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 7 M, more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M It is used as a feature that can directly bind to CD19 with binding activity and has substantially no binding to other proteins.
  • the "antibody” in the “antibody that specifically binds to CD19" or “anti-CD19 antibody” is a full-length antibody, that is, a full-length antibody consisting of two heavy chains and two light chains linked by a disulfide bond. Although an antibody is meant, preferably it is its monoclonal antibody.
  • a preferred isotype as the PD-1 / CD19 bispecific antibody of the present invention is an IgG antibody, more preferably an IgG 1 or IgG 4 antibody, and even more preferably an IgG 1 antibody.
  • the heavy chain constant region or hinge region includes an IgG 1 antibody in which leucine at position 234 is substituted with alanine and / or leucine at position 235 is substituted with alanine according to the EU numbering system.
  • it may be an IgG 1 antibody in which leucine at position 235 in the EU numbering system is substituted with glycine and / or glycine at position 236 is substituted with arginine on each of two heavy chain constant regions or hinge regions.
  • an antibody lacking the heavy chain C-terminal amino acid of those bispecific antibodies for example, the 447th lysine by the EU numbering system, is more preferable.
  • the PD-1 / CD19 bispecific antibody is an IgG 4 antibody
  • PD-1 / CD19 bispecific antibody of the present invention and the antibody fragment thereof are disclosed in WO2014 / 051433, WO2013 / 157953 or WO2013 / 157954 But it can be manufactured.
  • a polynucleotide encoding a heavy chain having a VH of an anti-PD-1 antibody (2) a polynucleotide encoding a heavy chain having a VH of an anti-CD19 antibody, (3) a VL of anti-PD-1 antibody
  • a mammalian cell is transfected with an expression vector into which a polynucleotide encoding a light chain having a polypeptide and a polynucleotide encoding a light chain having a VL of an anti-CD19 antibody are inserted, and both are transformed. Both heavy and light chains can be produced by expression and secretion.
  • the host cell which expresses the bispecific antibody of the present invention may be any host cell which can be transfected with an expression vector and can express the introduced expression vector.
  • insect cells such as SF-9 and SF-21 cells, more preferably CHO cells, BHK cells, mouse cells including SP2 / 0 cells and NS-0 myeloma cells, primates such as COS and Vero cells Cells, MDCK cells, BRL 3A cells, hybridomas, tumor cells, immortalized primary cells, W138, HepG2, HeLa, HEK293, HT1080 or PER.
  • Mammalian cells such as embryonic retinal cells such as C6.
  • mammalian cell expression vectors and hosts may be used so that the antibody is appropriately glycosylated.
  • Human cell lines, preferably PER. C6 is advantageously used to obtain antibodies that match the glycosylation pattern in humans.
  • the culture conditions of the host cell can be optimized by known methods, and the amount of protein production can be optimized.
  • the culture is carried out, for example, by batch culture, fed-batch culture, continuous culture, culture with a hollow fiber, etc. in a dish, roller bottle or reaction vessel.
  • it is preferable to grow cells in suspension. It is also preferable to culture the cells under conditions free of animal or human derived serum or components of animal or human derived serum.
  • Antibodies expressed in host cells and recovered from the cells or cell culture medium by known methods are purified using known methods. Methods of purification include immunoprecipitation, centrifugation, filtration, size exclusion chromatography, affinity chromatography, cationic and / or anionic exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and the like. Furthermore, protein A or protein G affinity chromatography is suitably used (see, for example, US4801687 and US5151504).
  • the PD-1 / CD19 bispecific antibody of the present invention is useful for the prevention, symptom progression suppression and / or treatment of autoimmune disease or graft versus host disease (GVHD).
  • GVHD graft versus host disease
  • autoimmune diseases in which the bispecific antibody of the present invention can prevent, suppress the progress of symptoms and / or treat it include, for example, Behcet's disease, systemic lupus erythematosus, chronic discoid lupus erythematosus, multiple sclerosis (systemic sclera Disease, progressive systemic sclerosis), scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, nodular periarteritis (polyarteritis nodosa, microscopic polyangiitis), aortitis syndrome (Takayasu's arteritis), malignant Rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, spondyloarthritis, mixed connective tissue disease, Sjögren's syndrome, adult Still's disease, vasculitis, allergic granulomatous angiitis, hypersensitivity vasculitis, rheuma
  • the bispecific antibody of the present invention is, in particular, an autoreactive B cell-mediated disease such as systemic lupus erythematosus, Graves' disease, myasthenia gravis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenia are useful for the prevention, symptom progression suppression and / or treatment of asthma, asthma, cryoglobulinemia, primary bile duct sclerosis or malignant anemia.
  • an autoreactive B cell-mediated disease such as systemic lupus erythematosus, Graves' disease, myasthenia gravis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenia are useful for the prevention, symptom progression suppression and / or treatment of asthma, asthma, cryoglobulinemia, primary bile duct sclerosis or malignant anemia.
  • treatment means, for example, curing or ameliorating a certain disease or a symptom thereof
  • prevention means preventing or delaying the onset of a certain disease or symptom for a predetermined period of time That means that "suppressing the progression of symptoms” means to suppress the progression or deterioration of symptoms to stop the progression of the pathological condition.
  • prevention also includes the suppression of recurrence.
  • the PD-1 / CD19 bispecific antibody of the present invention is usually administered systemically or locally, in a parenteral form.
  • an administration method specifically, injection administration, nasal administration, pulmonary administration, percutaneous administration and the like can be mentioned.
  • Injection administration includes, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like, and in the case of intravenous injection, administration by infusion is preferable.
  • the dosage varies depending on the age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time etc., it is usually preferably in the range of 0.1 ⁇ g / kg to 300 mg / kg per adult per person, particularly preferably It is administered parenterally, in the range of 0.1 mg / kg to 10 mg / kg, once to several times a day, or continuously administered intravenously in the range of 30 minutes to 24 hours a day.
  • the dose varies depending on various conditions, so a smaller amount than the above dose may be sufficient, or the dose may need to be exceeded.
  • the injection or infusion may be any of an aqueous solution, a suspension or an emulsion. And may be formulated as a solid agent together with a pharmaceutically acceptable carrier so as to be used as a solution, suspension or emulsion by adding a solvent at the time of use. Good.
  • a solvent to be used for injection or infusion for example, distilled water for injection, physiological saline, glucose solution and isotonic solution (eg sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, A solution such as borax, propylene glycol, etc. can be used.
  • pharmaceutically acceptable carriers include, for example, stabilizers, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, soothing agents, buffers, preservatives, preservatives, pH adjusters, antioxidants, etc.
  • stabilizer for example, various amino acids, albumin, globulin, gelatin, mannitol, glucose, dextran, ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol, ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium thiosulfate, sodium edetate, sodium citrate, Dibutyl hydroxytoluene etc. can be used.
  • solubilizer for example, alcohol (eg, ethanol etc.), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol etc.), nonionic surfactant (eg, Polysorbate 20 (registered trademark), Polysorbate 80 (registered trademark) ), HCO-50, etc.
  • a suspending agent for example, glycerin monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • an emulsifier gum arabic, sodium alginate, tragacanth etc. can be used, for example.
  • the soothing agent for example, benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol and the like can be used.
  • the buffer for example, phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer, glutamate buffer, epsilon aminocaproate buffer and the like can be used.
  • preservatives include methyl parahydroxybenzoate, ethyl parahydroxybenzoate, propyl parahydroxybenzoate, butyl parahydroxybenzoate, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, boric acid Sand etc. can be used.
  • benzalkonium chloride for example, benzalkonium chloride, p-hydroxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • a pH adjuster for example, hydrochloric acid, sodium hydroxide, phosphoric acid, acetic acid and the like can be used.
  • antioxidants for example, (1) water-soluble antioxidants such as ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfate, sodium metabisulfite, sodium sulfite etc., (2) ascorbyl palmitate, butylated hydroxyanisole, Use of oil-soluble antioxidants such as butylated hydroxytoluene, lecithin, propyl gallate and ⁇ -tocopherol and (3) metal chelating agents such as citric acid, ethylenediaminetetraacetic acid, sorbitol, tartaric acid, phosphoric acid and the like Can.
  • water-soluble antioxidants such as ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfate, sodium metabisulfite, sodium sulfite etc.
  • ascorbyl palmitate butylated hydroxyanisole
  • metal chelating agents such as citric acid, ethylenediaminetetraacetic acid, sorbitol, tartaric acid, phosphoric acid and the like Can.
  • the infusion solution for injection or infusion can be manufactured by sterilizing in its final step or by sterile filtration, for example by filtration through a filter, etc. and then filling in a sterile container.
  • the sterile powder (which may contain a powder of a pharmaceutically acceptable carrier) by vacuum drying and lyophilization may be used by dissolving it in a suitable solvent at the time of use You can also
  • the PD-1 / CD19 bispecific antibody of the invention is in combination with other agents used for the prevention, symptom progression suppression, relapse suppression and / or treatment of autoimmune disease or graft versus host disease (GVHD). You may use it.
  • the dosage form when used in combination with other agents (combination), may be in the form of a combined preparation in which both components are combined in one preparation, or in a separate dosage form. It may be.
  • the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, and / or treatment effect of other drugs can be complemented, or the dose or the frequency of administration can be maintained or reduced.
  • the bispecific antibody of the present invention and the other agent When the bispecific antibody of the present invention and the other agent are separately administered, they may be coadministered for a certain period of time, and then the bispecific antibody alone or only the other agent may be administered. Also, the bispecific antibody of the present invention may be administered first, and other agents may be administered after the administration is completed, or other agents may be administered first, and after the administration is completed, the bispecific antibody of the present invention The sex antibody may be administered later, and each administration method may be the same or different. It can also be provided as a kit of a preparation containing the bispecific antibody of the present invention and a preparation containing another agent. Here, the doses of the other agents can be appropriately selected based on the doses clinically used. In addition, other drugs may be administered in combination of two or more in an appropriate ratio. The other drugs include not only those which have been found up to now but also those which will be found in the future.
  • insulin preparation eg, human insulin, insulin glargine, insulin lispro, insulin detemir, insulin Asparto, etc.
  • sulfonylurea agents eg, glibenclamide, gliclazide, glimepiride etc.
  • fast-acting insulin secretagogues eg, nateglinide etc.
  • biguanide preparations eg, metformin etc.
  • insulin resistance improvers eg, pioglitazone etc.
  • ⁇ -glucosidase inhibitors eg, acarbose, voglibose, etc.
  • therapeutic agents for diabetic neurosis eg, epalrestat, mexiletine, imidapril etc.
  • GLP-1 analogue preparations eg, liraglutide, exenatti
  • a steroid drug eg, cortisone acetate, hydrocortisone, hydrocortisone sodium phosphate, Hydrocortisone Sodium succinate, Fludrocortisone Acetate, Prednisolone Acetate, Prednisolone Acetate, Prednisolone Sodium Succinate, Prednisolone Butyl Acetate, Prednisolone Sodium Phosphate, Halopredone Acetate Acetate, Methylprednisolone Acetate, Methyl Prednisolone Acetate, Sodium Prednisolone Sodium Succinate, Triamcinolone Acetate Triamcinolone acetonide, dexamethasone, dexamethasone acetate, sodium dexamethasone phosphate, dexamethasone palmitate,
  • a steroid drug eg, cortisone acetate, hydrocortisone, hydrocortisone sodium phosphate, Hydrocortis
  • a steroid drug for example, the above-mentioned steroid drug
  • an immunosuppressant for example, , Cyclosporin, tacrolimus, fingolimod, etc.
  • a steroid drug eg, the above-mentioned steroid drug
  • an anti-rheumatic drug eg, methotrexate
  • Sulfasalazine e.g., bucilamine, leflunomide, mizoribine, tacrolimus etc.
  • an anti-cytokine drug eg, infliximab, adalimumab, tocilizumab, etanercept, abatacept, golimumab, certolizumab etc.
  • the bispecific antibodies of the present invention and other drugs described above may be used in combination with any one or more.
  • B Cell Target PD-1 agonist in this example is composed of VH and VL of anti-human CD19 antibody and VH and VL of anti-human PD-1 antibody Single-chain diabody (hereinafter abbreviated as scDb).
  • the outline of the structure is shown in FIG.
  • the scDb was prepared by ligating DNA prepared by ligating the DNA encoding the variable region of each antibody and the peptide linker in a predetermined order into an expression vector, which was then expressed in animal cells (Free Style 293F cells) . After recovery, scDb produced in the culture supernatant was purified by Protein A affinity chromatography and size exclusion chromatography.
  • scDb prepared in this example, one of which is “B cell target PD-1 agonist X” and the other is “B cell target PD-1 agonist M”.
  • cDNAs respectively encoding those VH and VL were isolated by a known method and used to construct a DNA expressing the scDb of this example.
  • B cell target PD-1 agonist M-Fc is a combination of VH and VL of anti-human CD19 antibody and anti-human PD-1 antibody.
  • a bispecific sc (Fv) 2 composed of VH and VL, a human IgG 1 constant region from the hinge site to the CH3 region (hereinafter abbreviated as "IgG 1 constant region (hinge / CH3)) is shown.
  • polypeptide A Hetero consisting of the association of two proteins of a fused polypeptide (hereinafter referred to as polypeptide A) and a polypeptide consisting only of an IgG 1 constant region (hinge / CH3) (hereinafter referred to as polypeptide B) It is a dimer.
  • polypeptide B a polypeptide consisting only of an IgG 1 constant region (hinge / CH3)
  • the heterodimer has a mutation that abolished Fc ⁇ receptor binding.
  • the outline of the structure is shown in FIG.
  • the DNA encoding the polypeptide A of the B cell target PD-1 agonist M-Fc is the same as in the preparation of the B cell target PD-1 agonist M.
  • DNAs encoding VH and VL of human PD-1 antibody, respectively, were ligated together with the DNA encoding the peptide linker in a predetermined order.
  • the DNA encoding the IgG 1 constant region (hinge / CH3), which constitutes a part of the polypeptides A and B was obtained by the PCR method based on known genetic information.
  • An expression vector into which each DNA sequence encoding each of the polypeptides A and B was inserted was transfected into Free Style 293F cells, expressed, and produced in the culture supernatant. The culture supernatant was collected and then purified by protein A affinity chromatography and size exclusion chromatography.
  • Example 3 Binding Evaluation of B Cell Targeted PD-1 Agonist By Flow Cytometry Using Human PD-1 Expressing CHO-S Cells, Human PD-1 Expressing CHO-S Cells by B Cell Targeted PD-1 Agonist The binding to PD-1 expressed in was evaluated. A 6 ⁇ His tag is added to the C terminus of B cell target PD-1 agonists X and M, and Alexa Fluor 488 labeled anti-His tag antibody (MBL, model number D291) is used for detection of each agonist bound to the same cells. -A48) was used.
  • MBL Alexa Fluor 488 labeled anti-His tag antibody
  • the B cell target PD-1 agonist M-Fc contains a human IgG 1 constant region
  • An Fc antibody (Thermo Fisher Scientific, model number H10104) was used.
  • All B cell-targeted PD-1 agonists were confirmed to bind to human PD-1 expressing CHO-S cells. On the other hand, since no binding to CHO-S cells used as a control was observed, it was confirmed that the binding was specific to the expressed PD-1.
  • Example 4 Effect of B cell-targeted PD-1 agonist on human B cells
  • B cells isolated from peripheral blood mononuclear cells LONZA, model number CC-2702 from healthy persons B Cell Isolation Kit II human (Miltenyi Biotec, model number 130-091-151) was used to isolate human B cells.
  • Human B cells are seeded in cell culture plates and mouse anti-human CD79B antibody (LifeSpan Biosciences, Inc., model number LS-C134648) and goat anti-mouse IgG-Fc ⁇ fragment F (ab ') 2 antibody (Jackson ImmunoResearch, model number 115- 006-008) and B cell target PD-1 agonist X or M or M-Fc were added and culture was performed for 3 days.
  • Example 5 Effect of B Cell Target PD-1 Agonist M-Fc on Human B Cells NOD. Transplanted with normal human peripheral blood mononuclear cells (LONZA, model number CC-2702). Cg-PrkdcscidIl2 rgtm1 Wjl / SzJ mice (hereinafter abbreviated as NSG mice) were used to evaluate in vivo effects on human antibody production. 1 ⁇ 10 7 healthy human peripheral blood mononuclear cells were transplanted per NSG mouse. On the day of transplantation, 7, 14, 17, 21, 24 and 28 days, 6 mg / kg of B cell target PD-1 agonist M-Fc was intraperitoneally administered once a day.
  • NSG mice normal human peripheral blood mononuclear cells
  • Example 6 Effect of a B cell-targeted PD-1 agonist M-Fc in a xenografted GVHD mouse model Xenografted GVHD using an NSG mouse grafted with peripheral blood mononuclear cells (LONZA, model number CC-2702) from a healthy human being The effect on 1 ⁇ 10 7 healthy human peripheral blood mononuclear cells were transplanted per NSG mouse. On the day of transplantation, 7, 14, 17, 21, 24 and 28 days, 6 mg / kg of B cell target PD-1 agonist M-Fc was intraperitoneally administered once a day.
  • LONZA peripheral blood mononuclear cells
  • Example 7 Effect of B Cell Target PD-1 Agonist on Human Memory T Cells
  • a normal human peripheral blood mononuclear cell (LONZA, model number CC-2702) is seeded on a cell culture plate and tetanus toxoid (List Biological Labs, Inc.) , Model No. 191A) and B cell target PD-1 agonist X or M were added, and culture was performed for 4 days.
  • the IL-2 contained in the culture supernatant after 4 days of culture was quantified using the Bio-Plex Pro human cytokine panel (BIO-RAD, model number M50000007A). The results are shown in FIG. B cell targeted PD-1 agonists suppressed cytokine production from human memory T cells in vitro.
  • Example 8 Effect of B Cell Target PD-1 Agonist M-Fc on Immune Response to Thymus-Dependent Antigen
  • the extracellular regions of the CD19 and PD-1 genes were replaced with human CD19 and human PD-1 genes, respectively.
  • Human CD19 / human PD-1 knockin C57BL / 6 mice were used to evaluate the in vivo effect on the immune response to anti-KLH antibody production induced by the thymus dependent antigen Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) immunization.
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanin
  • a suspension was prepared by thoroughly mixing 0.2 mg / mL of KLH (Thermo Fisher, Model No. 77600) and an equal amount of Alum (Thermo Fisher, Model No. 77161) to prepare a suspension.
  • the B cell target PD-1 agonist M-Fc was intraperitoneally administered at a dose of 3 mg / kg once a day on the 3rd, 7th, 10th, 14th and 17th day of secondary immunization .
  • antibody titers to KLH in serum on days 7, 14, and 21 were measured.
  • the antibody titer against KLH in serum was detected by binding to KLH immobilized on an ELISA plate with HRP-labeled goat anti-mouse IgG antibody (Southern Biotec, model number 1030-05), and mouse anti-KLH monoclonal antibody (BioLegend, It calculated by the relative quantification method based on the calibration curve drawn up using model number 408402).
  • the evaluation result is shown in FIG.
  • the B cell target PD-1 agonist M-Fc suppressed the immune response to a thymus dependent antigen.
  • Human CD19 / human PD-1 knockin C57BL / 6 mice can be prepared according to the method described in Genesis. 2009 Jun; 47 (6): 414-22.
  • mouse B cell target PD-1 agonist-Fc-1 corresponds to the anti-mouse CD19 antibody VH and VL A polypeptide (hereinafter referred to as polypeptide C) in which an IgG 1 constant region (hinge / CH3) is fused to scDb composed of VH and VL of an anti-mouse PD-1 antibody, and two proteins of polypeptide B These heterodimers are formed by the association of The heterodimer has a mutation that abolished Fc ⁇ receptor binding.
  • the outline of the structure is shown in FIG.
  • “mouse B cell target PD-1 agonist-Fc-2” in the present example is two kinds of scFv composed of VH and VL of anti-mouse CD19 antibody and VH and VL of anti-mouse PD-1 antibody.
  • the heterodimer also has a mutation that abolished Fc ⁇ receptor binding. The outline of the structure is shown in FIG.
  • DNAs encoding VH and VL of anti-mouse CD19 antibody and VH and VL of anti-mouse PD-1 antibody were obtained using total RNA prepared from anti-mouse CD19 monoclonal antibody-producing hybridoma and anti-mouse PD-1 monoclonal antibody-producing hybridoma Then, they were obtained according to the method according to the known nucleotide sequence analysis method of monoclonal antibody variable region. Each obtained DNA was ligated with the DNA encoding the peptide linker in a predetermined order. Incidentally, DNA encoding the IgG 1 constant region (hinge / CH3) were obtained the cDNA by PCR based on the known gene information.
  • mice B cell target PD-1 agonist to PD-1 expressed in mouse PD-1 expressing CHO-S cells was evaluated by flow cytometry using mouse PD-1 expressing CHO-S cells.
  • PE-labeled anti-human IgG-Fc antibody was used for detection of mouse B cell target PD-1 agonist-Fc-1 and -2 bound to the same cells.
  • Example 10 In Vivo Effects of B Cell Targeted PD-1 Agonist on Immune Response in NP-OVA Immunized Mice In Vivo Response to Immune Response to 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl Ovalbumin (NP-OVA) Using C57BL / 6 Mice In vivo effects were evaluated. A suspension was prepared by thoroughly mixing 1 mg / mL of NP-OVA (LGC Bioresearch, model number N-5051) and an equal amount of Alum (Thermo Fisher, model number 77161) to prepare a suspension. 200 ⁇ L of the elicitor was administered intraperitoneally to mice.
  • LGC Bioresearch model number N-5051
  • Alum Thermo Fisher, model number 77161
  • Mouse B cell target PD-1 agonists-Fc-1 and -2 were administered intraperitoneally at a dose of 7 mg / kg once a day on the 3rd, 7th and 10th day of immunization. Spleens were collected on the 14th day of immunization, and a single cell suspension was prepared using a cell strainer. By flow cytometry using a single cell suspension after ammonium chloride hemolytic agent treatment, class switching memory B cells at evaluates the number, Wilcoxon rank sum test (B220 + CD38 + GL7 - IgD - - IgM) Comparisons were made between groups. The results are shown in FIG.
  • the increase in class switch memory B cells was significantly suppressed.
  • the increase in class switch memory B cells was not suppressed.
  • the PD-1 / CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof of the present invention is useful for preventing, suppressing the progress of symptoms, suppressing the recurrence and / or treating autoimmune disease or graft-versus-host disease (GVHD).
  • GVHD graft-versus-host disease

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Abstract

本発明の課題は、自己免疫疾患に対する予防、症状進展抑制、再発抑制または治療のための新たな薬剤を提供することにある。本発明の発明者らは鋭意検討した結果、かかる課題を解決し得る物質としてＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体に着目し、本発明を完成した。本発明のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体は活性化Ｂ細胞の増殖抑制作用およびイムノグロブリン産生抑制作用を示し、また、メモリーＴ細胞からのサイトカイン産生も抑制する作用を有する。

Description

二重特異性抗体
　本発明は、同一のＢ細胞上に発現するＰＤ－１およびＣＤ１９に対して各々特異的に結合することができる二重特異性抗体（以下、ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体と略記する。）ならびにその医薬治療用途に関する。
　ＰＤ－１は免疫グロブリンファミリーに属する免疫抑制受容体であり、抗原レセプターからの刺激により活性化したＴ細胞の免疫活性化シグナルを抑制する機能を持つ分子である。ＰＤ－１ノックアウトマウスの解析等から、ＰＤ－１シグナルは、自己免疫性拡張型心筋症、ループス様症候群、自己免疫性脳脊髄炎、全身性ループスエリテマトーデス、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病およびリウマチ性関節炎などの自己免疫疾患の抑制に重要な役割を果たすことが知られている。したがって、ＰＤ－１シグナルを増強する物質は自己免疫疾患の予防または治療剤となり得ることが指摘されている。
　一方、ＣＤ１９は、Ｂ細胞に発現する膜タンパクであり、Ｂ細胞受容体複合体と共にＢ細胞へ刺激を伝える分子である。
　これまでにＰＤ－１シグナルを増強する物質として、ＰＤ－１を認識する二重特異性抗体が知られている（特許文献１ないし３）。これら二重特異性抗体は、Ｔ細胞受容体複合体のメンバーであるＣＤ３を認識する抗体の抗原認識部位とＰＤ－１を認識する抗体の抗原認識部位とを遺伝子工学的に連結されたものであり、ＰＤ－１をＴ細胞受容体複合体近傍に位置させる頻度を上げることによって、Ｔ細胞受容体複合体に対するＰＤ－１の抑制シグナルを増強する作用をもつ。さらに、これら特許文献には、ＰＤ－１二重特異性抗体が自己免疫疾患の予防または治療に使用できることも記載されている。
国際公開第２００３／０１１９１１号パンフレット 国際公開第２００４／０７２２８６号パンフレット 国際公開第２０１３／０２２０９１号パンフレット
　本発明の目的は、自己免疫疾患に対する予防、症状進展抑制、再発抑制または治療のための新たな薬剤を提供することにある。
　本発明の発明者らは鋭意検討した結果、かかる課題を解決し得る物質としてＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体に着目し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］　ＰＤ－１に特異的に結合する第一アーム（以下、第一アームと略記することがある。）およびＣＤ１９に特異的に結合する第二アーム（以下、第二アームと略記することがある。）を有する、ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２］　当該第一アームが、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体（以下、抗ＰＤ－１抗体という。）の重鎖可変領域（以下、ＶＨと略記する。）および軽鎖可変領域（以下、ＶＬと略記する。）を含むことを特徴とする前項［１］記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３］　当該第二アームが、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体（以下、抗ＣＤ１９抗体という。）のＶＨおよびＶＬを含むことを特徴とする前項［１］または［２］記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４］　Ｎ末端から、抗ＰＤ－１抗体のＶＨ、抗ＣＤ１９抗体のＶＬ、抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよび抗ＰＤ－１抗体のＶＬの順番で、各々、ペプチドリンカーを介してもしくは直接連結された構造を有する、前項［２］または［３］記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５］　Ｎ末端から、抗ＰＤ－１抗体のＶＬ、抗ＰＤ－１抗体のＶＨ、抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよび抗ＣＤ１９抗体のＶＬの順番で、各々、ペプチドリンカーを介してもしくは直接連結された構造を有する、前項［２］または［３］記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６］　Ｎ末端から、抗ＣＤ１９抗体のＶＬ、抗ＰＤ－１抗体のＶＨ、抗ＰＤ－１抗体のＶＬおよび抗ＣＤ１９抗体のＶＨの順番で、各々、ペプチドリンカーを介してもしくは直接連結された構造を有する、前項［２］または［３］記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７］　前項［４］記載の抗ＰＤ－１抗体のＶＬ、前項［５］記載の抗ＣＤ１９抗体のＶＬまたは前項［６］記載のＣＤ１９抗体のＶＨのＣ末端に、ヒンジ部位からＣＨ３領域までのヒトＩｇＧ定常領域（以下、「ＩｇＧ定常領域（ヒンジ／ＣＨ３）」と略記することがある。）を有するポリペプチドのＮ末端が、ペプチドリンカーを介してもしくは直接に、さらに連結された構造を有する、前項［４］～［６］の何れか一項記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８］　Ｎ末端から、抗ＣＤ１９抗体のＶＬ、抗ＣＤ１９抗体のＶＨ、ＩｇＧ定常領域（ヒンジ／ＣＨ３）、抗ＰＤ－１抗体のＶＨおよび抗ＰＤ－１抗体のＶＬの順番で、各々、ペプチドリンカーを介してもしくは直接連結された構造を有する、前項［２］または［３］記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９］　さらに、ＩｇＧ定常領域（ヒンジ／ＣＨ３）を有するポリペプチドを含む構造を有する、前項［７］または［８］記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１０］　ペプチドリンカーが、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号１；以下、（Ｇｌｙ）×４－Ｓｅｒと略記する。）またはＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号２；以下、（（Ｇｌｙ）×４－Ｓｅｒ）×３と略記する。）である、前項［４］～［９］の何れか一項記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１１］　ダイアボディ、二重特異性ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性ミニボディ、二重特異性Ｆ（ａｂ′）２、二重特異性ハイブリッド抗体、共有結合型ダイアボディ（二重特異性ＤＡＲＴ）、二重特異性（ＦｖＣｙｓ）２、二重特異性Ｆ（ａｂ′－ジッパー）２、二重特異性（Ｆｖ－ジッパー）２、二重特異性三鎖抗体または二重特異性ｍＡｂ２の形態である、前項［１］～［３］の何れか一項記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１２］　二重特異性ハイブリッド抗体の形態である、前項［１］～［３］の何れか一項記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１３］　ＩｇＧ抗体である、前項［１]～［６］および［１０］～［１２］の何れか一項記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１４］　ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体である、前項［１３］記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１５］　ＩｇＧ１抗体が、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ作用のない抗体である、前項［１４］記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１６］　ＩｇＧ定常領域（ヒンジ／ＣＨ３）のアイソタイプが、ＩｇＧ１である、前項［７］～［９］記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１７］　ＰＤ－１およびＣＤ１９が、各々ヒトＰＤ－１およびヒトＣＤ１９である、前項［１］～［１６］の何れか一項記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１８］　モノクローナル抗体である、前項［１］～［１７］の何れか一項記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１９］　ヒト化または完全ヒト型抗体である、前項［１］～［１８］の何れか一項記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２０］　単離抗体である、前項［１］～［１９］の何れか一項記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２１］　当該第一アームがＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１間の相互作用、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２との相互作用またはそれら両相互作用を許容する、前項［１］～［２０］の何れか一項記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２２］　Ｂ細胞上に発現するＰＤ－１およびＣＤ１９に結合する、前項［１］～［２１］の何れか一項記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２３］　ＰＤ－１に特異的に結合する第一アームおよびＣＤ１９に特異的に結合する第二アームを有する、ヒト化または完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体であって、
（ａ）当該第一アームが抗ヒトＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬを含み、当該第二アームが抗ヒトＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬを含み、
（ｂ）　Ｂ細胞上に発現するＰＤ－１およびＣＤ１９に各々結合し、
（ｃ）　当該第一アームがＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１間の相互作用を許容し、ならびに
（ｄ）　二重特異性ハイブリッド抗体の形態であり、および／またはＩｇＧ１抗体もしくはＩｇＧ４抗体である、当該抗体。
［１－１］　前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［２－１］　前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体を有効成分として含む、自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［２－２］　自己免疫疾患が、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、慢性円板状エリテマトーデス、多発性硬化症（全身性強皮症、進行性全身性硬化症）、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、脊椎関節炎、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、リウマトイド血管炎、大型血管炎、ＡＮＣＡ関連血管炎（例えば、多発血管炎性肉芽腫症および好酸球性多発血管炎性肉芽腫症）、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥ症候群、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、ＩｇＧ４関連疾患（例えば、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎など）、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、原発性胆汁性肝硬変、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、抗糸球体基底膜腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、甲状腺機能亢進症（グレーヴス病(バセドウ病)）、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、アジソン病、特発性アジソン病（慢性副腎皮質機能低下症）、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性I型糖尿病、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、セリアック病、アトピー性皮膚炎、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、多巣性運動ニューロパチー、肺胞蛋白症、自己免疫性出血病XIII、再発性多発軟骨炎、サルコイドーシス、強直性脊椎炎、重症喘息、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、好酸球性副鼻腔炎、拡張型心筋症、食物アレルギー、全身性肥満細胞症、筋萎縮性側索硬化症または封入体筋炎である、前項［２－１］記載の剤。
［２－３］　ステロイド薬（例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、ブチル酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酢酸ハロプレドン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、酢酸トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、パルミチン酸デキサメタゾン、酢酸パラメタゾン、ベタメタゾン等）、インターフェロンβ－１ａ、インターフェロンβ－１ｂ、酢酸グラチラマー、ミトキサントロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、クラドリビン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コルチコトロピン、ミゾリビン、タクロリムス、フィンゴリモド、アレムツズマブ、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、フィンゴリモド等）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、スルファサラジン、ブシラミン、レフルノミド、ミゾリビン、タクロリムス等）および抗サイトカイン薬（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、トシリズマブ、エタネルセプト、アバタセプト、ゴリムマブ、セルトリズマブ）から選択される一以上の薬剤とともに投与されることを特徴とする、前項［２－１］または［２－２］記載の剤。
［３－１］　前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体を有効成分として含む、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［４－１］　前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体を有効成分として含む、自己反応性Ｂ細胞介在性疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［４－２］　自己反応性Ｂ細胞介在性疾患が、全身性エリテマトーデス、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆管硬化症または悪性貧血である、前項［４－１］記載の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［５－１］　前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体を有効成分として含む、自己反応性Ｂ細胞抑制剤。
［５－２］　自己反応性Ｂ細胞抑制が、イムノグロブリン産生抑制である、前項［５－１］記載の自己反応性Ｂ細胞抑制剤。
［５－３］　イムノグロブリンが、ＩｇＧまたはＩｇＭである、前項［５－２］記載の自己反応性Ｂ細胞抑制剤。
［６－１］　前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体を有効成分として含む、メモリーＴ細胞活性化抑制剤。
［６－２］　メモリーＴ細胞活性化抑制が、サイトカイン産生抑制である、前項［６－１］記載のメモリーＴ細胞活性化抑制剤。
［７－１］　前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体の有効量を患者に投与することを含む、自己免疫疾患（特に、自己反応性Ｂ細胞介在性疾患）または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療方法。
［７－２］　前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体の有効量を患者に投与することを含む、自己反応性Ｂ細胞抑制またはメモリーＴ細胞活性化抑制方法。
［８－１］　自己免疫疾患（特に、自己反応性Ｂ細胞介在性疾患）または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療のための、前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体。
［８－２］　自己反応性Ｂ細胞抑制またはメモリーＴ細胞活性化抑制のための、前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体。
［９－１］　自己免疫疾患（特に、自己反応性Ｂ細胞介在性疾患）または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤の製造における、前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体の使用。
［９－２］　自己反応性Ｂ細胞抑制剤またはメモリーＴ細胞活性化抑制剤の製造における、前項［１］～［２２］の何れか一項から選択されるＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または前項［２３］記載のヒト化もしくは完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体の使用。
　本発明のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体は、ＰＤ－１アゴニスト作用を有し、さらに活性化Ｂ細胞に対する抑制作用を示すため、自己免疫疾患またはＧＶＨＤの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に使用できる。
実施例１記載のＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト（Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＸおよびＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ）の構造を示す。図中、「ＶＨ　ＣＤ１９」および「ＶＬ　ＣＤ１９」は、抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬを各々表し、「ＶＨ　ＰＤ－１」および「ＶＬ　ＰＤ－１」は抗ＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬを各々表す。「Ｌ１」、「Ｌ２」および「Ｌ３」は各ＶＨおよびＶＬを連結するペプチドリンカーを表し、Ｌ１およびＬ３は、（Ｇｌｙ）×４－Ｓｅｒ、Ｌ２は（（Ｇｌｙ）×４－Ｓｅｒ）×３で表される構造を有する。 実施例２記載のＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃの構造を示す。図中、「ＩｇＧ１（Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ３）」は、ヒンジ部からＣＨ３領域までを有するヒトＩｇＧ１定常領域を表す。「Ｌ４」は、（Ｇｌｙ）×４－Ｓｅｒまたは（（Ｇｌｙ）×４－Ｓｅｒ）×３で表される構造を有するペプチドを表す。その他の記号は、図１で示したものと同じ意味を表す。 Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＸのヒトＰＤ－１およびヒトＣＤ１９への特異的結合性を示すフローサイトメトリーを示す。 Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭのヒトＰＤ－１およびヒトＣＤ１９への特異的結合性を示すフローサイトメトリーを示す。 Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－ＦｃのヒトＰＤ－１およびヒトＣＤ１９への特異的結合性を示すフローサイトメトリーを示す。 活性化ヒトＢ細胞の細胞増殖に対する各Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストの作用を示す。（Ａ）Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ（図中、「Ａｇｏｎｉｓｔ　Ｍ」で表される。）、（Ｂ）Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＸ（図中、「Ａｇｏｎｉｓｔ　Ｘ」で表される。）、（Ｃ）Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃ（図中、「Ａｇｏｎｉｓｔ　Ｍ－Ｆｃ」で表される。）。 ヒトＢ細胞におけるＩｇＭおよびIｇＧ産生に対するＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃの作用を示す。 異種移植ＧＶＨＤマウスモデルにおけるＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃの作用を示す。 ヒトメモリーＴ細胞からのＩＬ－２産生に対するＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストの作用を示す。 胸腺依存性抗原への免疫応答に対するＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃの作用を表す。グラフの縦軸は、血清中のＫＬＨに対する抗体価を示す。 実施例９記載のマウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－１の構造を示す。図中、「ＶＨ　ｍＣＤ１９」および「ＶＬ　ｍＣＤ１９」は、抗マウスＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬを各々表し、「ＶＨ　ｍＰＤ－１」および「ＶＬ　ｍＰＤ－１」は抗マウスＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬを各々表す。その他の記号は、前記と同じ意味を表す。 実施例９記載のマウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－２の構造を示す。図中の記号は、前記と同じ意味を表す。 マウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－１のマウスＰＤ－１およびマウスＣＤ１９への特異的結合性を示すフローサイトメトリーを示す。 マウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－２のマウスＰＤ－１およびマウスＣＤ１９への特異的結合性を示すフローサイトメトリーを示す。 ＮＰ－ＯＶＡ免疫惹起マウスにおける免疫応答に対するマウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－１および－２の各々のインビボ作用を表す。グラフの縦軸はクラススイッチメモリーＢ細胞の細胞数を示し、「Mouse Agonist-Fc-1」はマウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－１を、「Mouse Agonist-Fc-2」はマウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－２を各々表す。
　ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ－１）は、ヒトにおいては、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００５００９で示されるアミノ酸配列からなる膜型タンパク質である。本明細書において「ＰＤ－１」と記載される場合、特に限定しない限り、そのすべてのアイソフォーム、および本発明にかかる「ＰＤ－１に特異的に結合する第一アーム」のエピトープが保存された、それら改変体をも含むものとして使用される場合がある。本発明において、ＰＤ－１として好ましくは、ヒトＰＤ－１である。
　ＣＤ１９は、ヒトにおいては、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１７６１で示されるアミノ酸配列を有し、Ｂ細胞に発現して，Ｂ細胞受容体と複合体を形成する膜型タンパク質である。本明細書において「ＣＤ１９」と記載される場合、特に限定しない限り、そのすべてのアイソフォーム、および本発明にかかる「ＣＤ１９に特異的に結合する第二アーム」のエピトープが保存された、それら改変体をも含むものとして使用される場合がある。本発明において、ＣＤ１９として好ましくは、ヒトＣＤ１９である。
　本明細書において「単離」とは、宿主細胞から抽出された、複数ないし無数の成分が含まれる夾雑物の中から同定、分離および／または精製されることにより、実質的に単一の純粋な成分となることを意味する。
　本明細書において「モノクローナル抗体」とは、同一の特定の抗原に対して結合する、実質的に均一である抗体集団から得られた抗体を意味する。
　本明細書において「二重特異性抗体」とは、二つの異なる抗原分子あるいはエピトープに対する結合特異性を一分子に備え持つ抗体を意味する。本発明は、Ｂ細胞上に発現するＰＤ－１およびＣＤ１９に対して各々特異的に結合することができる二重特異性抗体およびその抗体断片に関する。一態様において、同時に、Ｂ細胞上に発現するＰＤ－１およびＣＤ１９に対して各々特異的に結合することができる二重特異性抗体およびその抗体断片に関する。また、一態様において、同一のＢ細胞上に発現するＰＤ－１およびＣＤ１９に対して各々特異的に結合することができる二重特異性抗体およびその抗体断片に関する。
　二重特異性抗体の形態には、例えば、ダイアボディ、二重特異性ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性ミニボディ、二重特異性Ｆ（ａｂ′）２、二重特異性ハイブリッド抗体、共有結合型ダイアボディ（二重特異性ＤＡＲＴ）、二重特異性（ＦｖＣｙｓ）２、二重特異性Ｆ（ａｂ′－ジッパー）２、二重特異性（Ｆｖ－ジッパー）２、二重特異性三鎖抗体および二重特異性ｍＡｂ２等がある。
　ダイアボディとは、異なる抗原を認識するＶＨ、ＶＬ同志をペプチドリンカーで連結された一本鎖ペプチドの二量体である（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993), Vol. 90, No.14: p.6444-6448参照）。
　二重特異性ｓｃ（Ｆｖ）２とは、異なる抗原を認識する２つの抗体の２組のＶＨ／ＶＬがペプチドリンカーを介して連続する一本鎖の形態で産生されるよう改変された低分子化抗体である（J. Biological Chemistry (1994), Vol. 269: p.199-206参照）。
　二重特異性Ｆ（ａｂ′）２とは、異なる２つの抗原を認識する抗体のＦａｂ′断片が、ジスルフィド結合等により共有結合した低分子化抗体である。
　二重特異性ミニボディとは、各々異なる抗原を認識するｓｃＦｖに抗体の定常領域ＣＨ３ドメインが連結されるよう改変された低分子抗体断片を、そのＣＨ３ドメイン上のジスルフィド結合等によって共有結合した低分子化抗体である（Biochemistry (1992), Vo.31, No.6, p.1579-1584参照）。
　二重特異性ハイブリッド抗体とは、異なる２つの抗原を認識する抗体の重鎖／軽鎖複合体がジスルフィド結合等によって共有結合したインタクトな抗体である。
　本発明において、好ましい二重特異性抗体の形態としては、二つの可変領域間の可動領域が広い形態のものが好ましく、例えば、二重特異性ハイブリッド抗体である。
　二重特異性ハイブリッド抗体は、例えば、ハイブリッドハイブリドーマ法（US4474893参照）で作製されたハイブリドーマから産生させることができる。また、二重特異性ハイブリッド抗体は、異なる抗原を認識する抗体の重鎖および軽鎖を各々コードする計４種類のｃＤＮＡを哺乳動物細胞に共発現ならびに分泌させて製造することができる。
　本発明において使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、KohlerおよびMilsteinら， Natur (1975)， Vol. 256, p.495-97、Hongoら, Hybridoma (1995), Vol. 14, No. 3, p.253-260、Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Vol. 2)およびHammerlingら, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, p.563-681(Elsevier, N.Y., 1981)参照）、組換えＤＮＡ法（例えば、US4816567参照）、ファージディスプレイ方法（例えば、LadnerらのUS5223409、US5403484およびUS5571698、DowerらのUS5427908およびUS5580717、McCaffertyらのUS5969108およびUS6172197およびGriffithsらのUS5885793、US6521404、US6544731、US6555313、US6582915およびUS6593081参照）で作製することができる。
　抗体あるいはモノクローナル抗体は、ヒトに投与される場合には、その抗原性を低減あるいは消失させるために、キメラ抗体、ヒト化抗体あるいは完全ヒト型抗体の形態で作製することができる。
　「キメラ抗体」は、可変領域配列と定常領域配列が別々の哺乳動物に由来する抗体を意味し、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来するものがある。キメラ抗体は、上記のハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法あるいはファージディスプレイ方法で単離された抗体産生ハイブリドーマから、公知の手法により単離された抗体可変領域をコードする遺伝子を、公知の方法を用いて、ヒト由来の抗体定常領域をコードする遺伝子に連結させ、作製することができる（例えば、CabillyらのUS4816567参照）。
　「ヒト化抗体」とは、マウスのような別の哺乳種の生殖細胞型に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）配列をヒトフレームワーク配列上に移植した抗体を意味する。ヒト化抗体の場合も、上記方法で単離された抗体産生ハイブリドーマから、公知の手法により単離された抗体ＣＤＲ領域をコードする遺伝子を、公知の方法を用いて、ヒト由来の抗体フレームワーク領域をコードする遺伝子に連結させ、作製することができる（例えば、WinterのUS5225539およびUS5530101、QueenらのUS5585089号およびUS6180370参照）。
　「ヒト抗体」または「完全ヒト型抗体」とは、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域からなる可変領域ならびに定常領域の両方ともにヒト生殖細胞型免疫グロブリン配列に由来する抗体を意味する。本発明において使用されるヒト抗体は、ヒト抗体を産生するように形質転換されたマウス、例えば、Humabマウス（例えば、LonbergとKayらによるUS5545806、US5569825、US5625126、US5633425、US5789650、US5877397、US5661016、US5814318、US5874299およびUS5770429参照）、ＫＭマウス（例えば、IshidaらのWO2002/43478参照）、Xenoマウス（例えば、US5939598、US6075181、US6114598、US6150584およびUS6162963参照）またはＴｃマウス（例えば、Tomizukaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), p.722-727参照）を用いた方法で作製することができる。また、免疫によりヒト抗体応答が起こるように、ヒト免疫細胞を再構築したＳＣＩＤマウス（例えば、WilsonらのUS5476996およびUS5698767参照）を用いても調製できる。さらに、本発明において使用されるヒト抗体は、上記したファージディスプレイ方法でも作製することができる。
　本明細書において、ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体の「抗体断片」とは、全長抗体の一部であって、ＰＤ－１に対する抗原結合部分およびＣＤ１９に対する抗原結合部分を有する抗体であり、例えば、Ｆ（ａｂ′）2などが挙げられる。ここで、抗原結合部分とは、抗体がその抗原に結合することができる最少単位を意味し、例えば、ＶＨおよびＶＬにある各々３つずつのＣＤＲとそれらＣＤＲの組合せにより目的の抗原が認識できるようＣＤＲを配置するフレームワーク領域から構成される。
　本明細書において「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ）を称するものとして使用される。本発明の二重特異性抗体として好ましいアイソタイプは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４であり、ここで、ＩｇＧ１としては、Ｆｃ受容体への結合が消失あるいは減弱したものが好ましい。具体的には、その重鎖定常領域の任意のアミノ酸を置換、欠損あるいは挿入することによって、Ｆｃ受容体への結合が消失あるいは減弱されたＩｇＧ１抗体を得ることができる。例えば、各々二つの重鎖定常領域あるいはヒンジ領域上において、ＥＵナンバリングシステムによる２３４番目のロイシンがアラニンに置換され、および／または２３５番目のロイシンがアラニンに置換されたＩｇＧ１抗体が挙げられる。また、二重特異性抗体の各々二つの重鎖定常領域あるいはヒンジ領域上において、ＥＵナンバリングシステムによる２３５番目のロイシンがグリシンに置換され、および／または２３６番目のグリシンがアルギニンに置換された抗体でもよい。また、抗体の不均一性を低減させるために、Ｃ末端のアミノ酸、例えば、ＥＵナンバリングシステムによる４４７番目のリシンを欠損した抗体が好ましい。
　本発明の二重特異性抗体のＦｃ領域は、二つの異なる重鎖が会合し易いように、その領域の任意のアミノ酸が置換されていてもよい。例えば、ＰＤ－１に特異的に結合する第一アームのＶＨを有する重鎖上の定常領域のＥＵナンバリングシステムによる３５１番目のロイシンがリシンに置換され、かつ３６６番目のスレオニンがリシンに置換され、ＣＤ１９に特異的に結合する第二アームのＶＨを有する重鎖における定常領域中の３５１番目のロイシンがアスパラギン酸に置換され、かつ３６８番目のロイシンがグルタミン酸に置換されたＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が挙げられる。また、ＰＤ－１に特異的に結合する第一アームのＶＨを有する重鎖における定常領域中のＥＵナンバリングシステムによる３５１番目のロイシンがアスパラギン酸に置換され、かつ３６８番目のロイシンがグルタミン酸に置換され、ＣＤ１９に特異的に結合する第二アームのＶＨを有する重鎖における定常領域中の３５１番目のロイシンがリシンに置換され、かつ３６６番目のスレオニンがリシンに置換されたＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体も挙げられる。
　さらに、本発明の二重特異性抗体がＩｇＧ４である場合、抗体分子内におけるスワッピングを抑制するように、その重鎖定常領域の任意のアミノ酸が置換、欠損あるいは挿入した改変体がより好ましい。例えば、ヒンジ領域に位置する、ＥＵナンバリングシステムによる２２６番目のセリンをプロリンに置換した抗体が好ましい。なお、本明細書において、抗体の可変領域のＣＤＲとフレームワークに割り当てられるアミノ酸位置はＫａｂａｔにしたがって規定される（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institute of Health, Bethesda, Md., (1987)および(1991)参照）。また、定常領域のアミノ酸はＫａｂａｔのアミノ酸位置に準じたＥＵナンバリングシステム（Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242参照）に従って表される。
　本明細書の「自己反応性Ｂ細胞」とは、自己抗原に対する抗体を産生するＢ細胞を示す。
ＰＤ－１に特異的に結合する第一アーム
　本明細書において、「ＰＤ－１に特異的に結合する第一アーム」は、抗体あるいは抗体断片の一部に含まれるか、あるいは一部ではなく、それ自体単体として存在するか否かにかかわらず、少なくとも、抗ＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬを含み、それらが会合することによって、ＰＤ－１に特異的に結合することができる抗体部分を意味し、例えば、このような第一アームには、抗ＰＤ－１抗体のＦａｂ部も含まれる。ここで、「ＰＤ－１に特異的に結合する」とは、少なくとも、１ｘ１０－５Ｍ、より好ましくは１ｘ１０－７Ｍ、より好ましくは１ｘ１０－９Ｍより高い親和性（解離定数（Ｋｄ値））を有する結合活性でＰＤ－１に対して直接結合することができ、少なくとも、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４およびＩＣＯＳなどの、所謂、ＣＤ２８ファミリー受容体に属するほかの受容体メンバーには実質的に結合しない特徴として使用される。また、「ＰＤ－１に特異的に結合する抗体」あるいは「抗ＰＤ－１抗体」における「抗体」とは、全長抗体、すなわち、ジスルフィド結合で連結された２つの重鎖および２つの軽鎖からなる完全長の抗体を意味するが、好ましくは、そのモノクローナル抗体である。
　また、当該第一アームは、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１との相互作用、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２との相互作用、またはそれら両相互作用を許容するものがより好ましい。当該第一アームがＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１との相互作用、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２との相互作用、またはそれら両相互作用を許容するかどうかは、公知の方法、例えば、固定化ＰＤ－Ｌ１蛋白質あるいはＰＤ－Ｌ１発現細胞への可溶型ＰＤ－１蛋白質の結合への当該第一アームの影響を、例えば、ビアコア分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光エネルギー転移測定法（ＦＲＥＴ）や蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ（登録商標））を用いて測定することによって判断することができる。
ＣＤ１９に特異的に結合する第二アーム
　本明細書において、「ＣＤ１９に特異的に結合する第二アーム」とは、抗体あるいは抗体断片の一部に含まれるか、あるいは一部ではなく、それ自体単体として存在するか否かにかかわらず、少なくとも、抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬを含み、それらが会合することによってＣＤ１９に特異的に結合することができる抗体部分を意味し、例えば、そのような第二アームには、抗ＣＤ１９抗体のＦａｂ部が含まれる。ここで、「ＣＤ１９に特異的に結合する」とは、少なくとも、１ｘ１０－５Ｍ、より好ましくは１ｘ１０－７Ｍ、より好ましくは１ｘ１０－９Ｍより高い親和性（解離定数（Ｋｄ値））を有する結合活性でＣＤ１９に対して直接結合することができ、他のタンパク質には実質的に結合しない特徴として使用される。また、「ＣＤ１９に特異的に結合する抗体」あるいは「抗ＣＤ１９抗体」における「抗体」とは、全長抗体、すなわち、ジスルフィド結合で連結された２つの重鎖および２つの軽鎖からなる完全長の抗体を意味するが、好ましくは、そのモノクローナル抗体である。
　本発明のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体として好ましいアイソタイプとしてはＩｇＧ抗体であり、さらに好ましくは、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４抗体であり、さらにより好ましくはＩｇＧ１抗体である。
　本発明の二重特異性抗体のうち、同抗体がＩｇＧ１抗体である場合には、Ｆｃ受容体への結合を実質的に消失させた変異が導入された形態が好ましく、例えば、各々二つの重鎖定常領域あるいはヒンジ領域上において、ＥＵナンバリングシステムによる２３４番目のロイシンがアラニンに置換され、および／または２３５番目のロイシンがアラニンに置換されたＩｇＧ１抗体が挙げられる。または、各々二つの重鎖定常領域あるいはヒンジ領域上において、ＥＵナンバリングシステムによる２３５番目のロイシンがグリシンに置換され、および／または２３６番目のグリシンがアルギニンに置換されたＩｇＧ１抗体でもよい。さらに、それら二重特異性抗体の重鎖Ｃ末端のアミノ酸、例えば、ＥＵナンバリングシステムによる４４７番目のリシンを欠損した抗体がより好ましい。また、ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体がＩｇＧ４抗体である場合には、そのヒンジ領域に位置する、ＥＵナンバリングシステムによる２２６番目のセリンをプロリンに置換した抗体が好ましい。
ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体の製造および精製方法
　本発明のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体およびその抗体断片は、WO2014/051433、WO2013/157953あるいはWO2013/157954に開示された方法でも製造することができる。
　例えば、（１）抗ＰＤ－１抗体のＶＨを有する重鎖をコードするポリヌクレオチド、（２）抗ＣＤ１９抗体のＶＨを有する重鎖をコードするポリヌクレオチド、（３）抗ＰＤ－１抗体のＶＬを有する軽鎖をコードするポリヌクレオチド、および（４）抗ＣＤ１９抗体のＶＬを有する軽鎖をコードするポリヌクレオチドが各々挿入された発現ベクターを、哺乳動物細胞に遺伝子導入して形質転換させ、両重鎖および軽鎖を共に発現ならびに分泌させて製造することができる。
　ここで、本発明の二重特異性抗体を発現する宿主細胞は、発現ベクターを遺伝子導入でき、導入された発現ベクターを発現することができるいかなる宿主細胞でもよい。好ましくは、ＳＦ－９およびＳＦ－２１細胞のような昆虫細胞、より好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞およびＮＳ－０ミエローマ細胞を含むマウス細胞、ＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞のような霊長類細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＲＬ　３Ａ細胞、ハイブリドーマ、腫瘍細胞、不死化した初代細胞、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０またはＰＥＲ．Ｃ６のような胚性の網膜細胞等の哺乳類細胞が挙げられる。なお、発現システムの選択においては、抗体が適切にグリコシル化されるように、哺乳類の細胞の発現ベクターおよび宿主を用いることがある。ヒト細胞株、好ましくはＰＥＲ．Ｃ６は、ヒトにおけるグリコシル化パターンと一致する抗体を得るために有利に用いられる。
　発現ベクターの遺伝子導入によって形質転換された宿主細胞における蛋白質の産生は、例えば、Current Protocols in Protein Science (1995), Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT, ISBN 0-471-11184-8，Bendig, 1988を参考に実施することができ、さらに、宿主細胞の培養の生産性を最大にするための一般的な指針、手順および実用的な方法は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991)を参考に実施することができる。宿主細胞での抗体の発現は、例えば、EP0120694、EP0314161、EP0481790号、EP0523949、US4816567およびWO2000/63403などの公開公報に記述されている。
　ここで、宿主細胞の培養条件は、公知の方法により最適化でき、蛋白質の生産量を最適化することができる。培養は、例えば皿、ローラーボトルもしくは反応槽の中で、バッチ培養、流加培養、連続培養、中空糸による培養等によりなされる。細胞培養により、大規模に（連続的な）組み換えタンパク質の生産をするためには、細胞を懸濁液の中で増殖させることが好ましい。また、動物もしくはヒト由来血清または動物もしくはヒト由来の血清の構成要素が無い条件下で細胞の培養をさせることが好ましい。
　宿主細胞で発現され、その細胞または細胞培地から公知の方法により回収された抗体は、公知の方法を用いて精製される。精製方法には、免疫沈降法、遠心分離法、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、陽イオンおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等が含まれる。さらに、プロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーが好適に用いられる（例えば、US4801687およびUS5151504参照）。
［医薬的用途］
　本発明のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体は、自己免疫疾患または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防、症状進展抑制および／または治療に有用である。
　本発明の二重特異性抗体が予防、症状進展抑制および／または治療可能な自己免疫疾患としては、例えば、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、慢性円板状エリテマトーデス、多発性硬化症（全身性強皮症、進行性全身性硬化症）、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、脊椎関節炎、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、リウマトイド血管炎、大型血管炎、ＡＮＣＡ関連血管炎（例えば、多発血管炎性肉芽腫症および好酸球性多発血管炎性肉芽腫症）、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥ症候群、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、ＩｇＧ４関連疾患（例えば、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎など）、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、原発性胆汁性肝硬変、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、抗糸球体基底膜腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、甲状腺機能亢進症（グレーヴス病(バセドウ病)）、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、アジソン病、特発性アジソン病（慢性副腎皮質機能低下症）、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性I型糖尿病、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、セリアック病、アトピー性皮膚炎、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、多巣性運動ニューロパチー、肺胞蛋白症、自己免疫性出血病XIII、再発性多発軟骨炎、サルコイドーシス、強直性脊椎炎、重症喘息、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、好酸球性副鼻腔炎、拡張型心筋症、食物アレルギー、全身性肥満細胞症、筋萎縮性側索硬化症および封入体筋炎などが挙げられる。
　また、本発明の二重特異性抗体は、特に、自己反応性Ｂ細胞介在性の疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、バセドウ病、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、ぜん息、クリオグロブリン血症、原発性胆管硬化症または悪性貧血の予防、症状進展抑制および／または治療に有用である。
　本発明において「治療」とは、例えば、ある疾患もしくはその症状を治癒させることまたは改善させることを意味し、「予防」とは、ある疾患もしくは症状の発現を未然に防止するあるいは一定期間遅延させることを意味し、「症状進展抑制」とは症状の進展または悪化を抑制して病態の進行を止めることを意味する。なお、「予防」の意味には再発抑制も含まれる。
　本発明のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体は、通常、全身的または局所的に、非経口の形で投与される。かかる投与方法として、具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げられ、静脈内注射の場合には、点滴による投与が好ましい。その投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人当たり、一回につき、０．１μｇ／ｋｇから３００ｍｇ／ｋｇの範囲で、特に好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの範囲で、一日一回から数回非経口投与されるか、または一日３０分から２４時間の範囲で静脈内に持続投与される。もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。
［製剤］
　本発明のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体は、注射剤または点滴のための輸液として製剤化されて用いられる場合、当該注射剤または輸液は、水溶液、懸濁液または乳濁液のいずれの形態であってもよく、また、用時に溶剤を加えることにより、溶解、懸濁または乳濁して使用されるように、薬学的に許容される担体とともに、固形剤として製剤化されていてもよい。注射剤または点滴のための輸液に使用される溶剤として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖溶液および等張液（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、プロピレングリコール等の溶液）等を用いることができる。
　ここで、薬学的に許容される担体としては、例えば、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤、防腐剤、ｐＨ調整剤および抗酸化剤等が挙げられる。安定剤としては、例えば、各種アミノ酸、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン等を用いることができる。溶解補助剤としては、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０（登録商標）、ポリソルベート８０（登録商標）、ＨＣＯ－５０等）等を用いることができる。懸濁化剤としては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等を用いることができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等を用いることができる。防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等を用いることができる。抗酸化剤として、例えば、（１）アスコルビン酸、システインハイドロクロライド、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤、（２）アスコルビルパルミテート、ブチル化ハイドロキシアニソール、ブチル化ハイドロキシトルエン、レシチン、プロピルガレート、α－トコフェロール等のような油溶性抗酸化剤および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤等を用いることができる。
　注射剤または点滴のための輸液は、その最終工程において滅菌するかあるいは無菌操作法、例えば、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することによって製造することができる。また、注射剤または点滴のための輸液は、真空乾燥および凍結乾燥による無菌粉末（薬学的に許容される担体の粉末を含んでいてもよい。）を、適切な溶剤に用時溶解して使用することもできる。
［併用または配合剤］
　本発明のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体は、自己免疫疾患または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に使用される他の薬剤とともに組み合わせて使用してもよい。本発明において、他の薬剤とともに組み合わせて使用する場合（併用）の投与形態には、１つの製剤中に両成分を配合した配合剤の形態であっても、また別々の製剤としての投与形態であってもよい。その併用により、その他の薬剤の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療効果を補完したり、投与量あるいは投与回数を維持ないし低減することができる。本発明の二重特異性抗体と他の薬剤を別々に投与する場合には、一定期間同時投与し、その後、当該二重特異性抗体のみあるいは他の薬剤のみを投与してもよい。また、本発明の二重特異性抗体を先に投与し、その投与終了後に他の薬剤を投与してもよいし、他の薬剤を先に投与し、その投与終了後に本発明の二重特異性抗体を後に投与してもよく、各々の投与方法は同じでも異なっていてもよい。本発明の二重特異性抗体を含む製剤と他の薬剤を含む製剤のキットとして提供することもできる。ここで、他の薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、他の薬剤は任意の２種以上を適宜の割合で組み合わせて投与してもよい。また、前記他の薬剤には、現在までに見出されているものだけでなく今後見出されるものも含まれる。
　例えば、本発明の二重特異性抗体をＩ型糖尿病の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に適用する場合、インスリン製剤（例えば、ヒトインスリン、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、インスリンデテミル、インスリンアスパルト等）、スルホニルウレア剤（例えば、グリベンクラミド、グリクラジド、グリメピリド等）、速攻型インスリン分泌促進薬（例えば、ナテグリニド等）、ビグアナイド製剤（例えば、メトホルミン等）、インスリン抵抗性改善薬（例えば、ピオグリタゾン等）、α－グルコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボース、ボグリボース等）、糖尿病性神経症治療薬（例えば、エパルレスタット、メキシレチン、イミダプリル等）、ＧＬＰ－１アナログ製剤（例えば、リラグルチド、エクセナチド、リキシセナチド等）、ＤＰＰ－４阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチン等）等と組み合わせて使用してもよい。
　また、例えば、本発明の二重特異性抗体を多発性硬化症の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に適用する場合、ステロイド薬（例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、ブチル酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酢酸ハロプレドン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、酢酸トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、パルミチン酸デキサメタゾン、酢酸パラメタゾン、ベタメタゾン等）、インターフェロンβ－１ａ、インターフェロンβ－１ｂ、酢酸グラチラマー、ミトキサントロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、クラドリビン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コルチコトロピン、ミゾリビン、タクロリムス、フィンゴリモドおよびアレムツズマブ等と組み合わせて使用してもよい。
　また、例えば、本発明の二重特異性抗体を全身エリテマトーデスの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に適用する場合、ステロイド薬（例えば、上記記載のステロイド薬）あるいは免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、フィンゴリモド等）と組み合わせて使用してもよい。
　例えば、本発明の二重特異性抗体を関節リウマチの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に適用する場合、ステロイド薬（例えば、上記記載のステロイド薬）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、スルファサラジン、ブシラミン、レフルノミド、ミゾリビン、タクロリムス等）あるいは抗サイトカイン薬（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、トシリズマブ、エタネルセプト、アバタセプト、ゴリムマブおよびセルトリズマブ等）等と組み合わせて使用してもよい。
　その他の自己免疫疾患あるいは自己反応性Ｂ細胞介在性疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に適用する場合、本発明の二重特異性抗体と、上記に記載した他の薬剤の何れかの一以上と組み合わせて使用してもよい。
　本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
実施例１：Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストの調製
　本実施例における「Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト」は、抗ヒトＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬと抗ヒトＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬから構成されるｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ　Ｄｉａｂｏｄｙ（以下、ｓｃＤｂと略記する。）である。図１にその構造の概略を示す。当該ｓｃＤｂは、各抗体の可変領域ならびにペプチドリンカーをコードするＤＮＡを所定の順番で連結して作製されたＤＮＡを発現ベクターに挿入し、これを動物細胞（Free Style 293F細胞）にて発現させた。培養上清中に産生されたｓｃＤｂは、回収後、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにて精製した。本実施例で調製されたｓｃＤｂは二種類あり、一つを「Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＸ」、もう一方を「Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ」とした。なお、Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＸおよびＭを各々構成する、当該抗ヒトＣＤ１９抗体および抗ヒトＰＤ－１抗体は、公知の抗体取得法に準じた方法に従って取得した。さらに、公知の方法により、それらのＶＨおよびＶＬを各々コードするｃＤＮＡを単離して、本実施例のｓｃＤｂを発現するＤＮＡを構築するために用いた。
実施例２：Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃの調製
　本実施例における「Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃ」は、抗ヒトＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬと抗ヒトＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬから構成される二重特異性ｓｃ（Ｆｖ）２に、ヒンジ部位からＣＨ３領域までのヒトＩｇＧ１定常領域（以下、「ＩｇＧ１定常領域（ヒンジ／ＣＨ３）」と略記する。）を融合させたポリペプチド（以下、ポリペプチドＡという。）、およびＩｇＧ１定常領域（ヒンジ／ＣＨ３）のみからなるポリペプチド（以下、ポリペプチドＢという。）の二つのタンパク質の会合により構成されるヘテロ二量体である。当該ヘテロ二量体は、Ｆｃγ受容体結合性を消失させた変異を有する。図２にその構造の概略を示す。
　Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－ＦｃのポリペプチドＡをコードするＤＮＡは、Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭを作製する上で、実施例１において取得した抗ヒトＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬならびに抗ヒトＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬを各々コードするＤＮＡを、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡとともに所定の順序で連結して作製した。なお、ポリペプチドＡおよびＢの一部を構成する、ＩｇＧ１定常領域（ヒンジ／ＣＨ３）をコードするＤＮＡは、公知の遺伝子情報をもとにＰＣＲ法にてそのｃＤＮＡを取得した。ポリペプチドＡおよびＢを各々コードする各ＤＮＡ配列を挿入した発現ベクターを、Ｆｒｅｅ　Ｓｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞に遺伝子導入して発現させ、培養上清中に産生させた。その培養上清を回収した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにて精製することにより調製した。
実施例３：Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストの結合性評価
　ヒトＰＤ－１発現ＣＨＯ－Ｓ細胞を用いたフローサイトメトリーにて、Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストによるヒトＰＤ－１発現ＣＨＯ－Ｓ細胞に発現するＰＤ－１への結合性を評価した。Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＸおよびＭのＣ末端には６×Ｈｉｓタグが付加されており、同細胞に結合した各アゴニストの検出には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識抗Ｈｉｓタグ抗体（MBL、型番D291-A48）を使用した。一方、Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－ＦｃにはヒトＩｇＧ１定常領域が含まれるため、同細胞に結合したＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃの検出には、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体（Thermo Fisher Scientific、型番H10104）を使用した。
　何れのＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストも、ヒトＰＤ－１発現ＣＨＯ－Ｓ細胞に結合することが確認された。一方、コントロールとして用いたＣＨＯ－Ｓ細胞への結合は認められなかったことから、その結合が発現させたＰＤ－１に特異的であることが確認された。
　続いて、同様の方法により、Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストがヒトＣＤ１９に特異的に結合することが確認された。以上の結果を図３、４および５に示す。
実施例４：Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストのヒトＢ細胞に対する作用
　健常人由来末梢血単核細胞（LONZA、型番CC-2702）からB Cell Isolation Kit II human（Miltenyi Biotec、型番130-091-151）を用いて、ヒトＢ細胞を分離した。ヒトＢ細胞を細胞培養プレートに播種し、マウス抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体（LifeSpan Biosciences,Inc.、型番LS-C134648）およびヤギ抗マウスＩｇＧ-Ｆｃγフラグメント　Ｆ（ａｂ’）２抗体（Jackson ImmunoResearch、型番115-006-008）およびＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＸもしくはＭまたはＭ－Ｆｃを添加して、３日間の培養を行った。培養３日後にCellTiter-Glo2.0 Reagent（Promega、型番G924B）を用いて培養液中のＡＴＰ量を測定した。図６にその結果を示す。Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストはインビトロにおいて活性化ヒトＢ細胞の細胞増殖を抑制した。
実施例５：Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－ＦｃのヒトＢ細胞に対する作用
　健常人由来末梢血単核細胞（LONZA、型番CC-2702）を移植したＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス（以下、ＮＳＧマウスと略記する。）を用いて、ヒト抗体産生に対するインビボ作用を評価した。ＮＳＧマウス1匹当たり１×１０７個の健常人由来末梢血単核細胞を移植した。移植当日、７、１４、１７、２１、２４および２８日目に、６ｍｇ／ｋｇのＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃを１日１回腹腔内投与した。移植２８日目に尾静脈より採血を行い、血清を調製した。血清中に含まれるヒトＩｇＭをＥＬＩＳＡキット（eBioscience、型番88-50620）を用いて定量した。血清中に含まれるヒトＩｇＧをＥＬＩＳＡキット（eBioscience、型番88-50550）を用いて定量した。図７にその結果を示す。Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－ＦｃはインビボにおいてヒトＩｇＭ産生およびIｇＧ産生を抑制した。
実施例６：Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃの異種移植ＧＶＨＤマウスモデルにおける作用
　健常人由来末梢血単核細胞（LONZA、型番CC-2702）を移植したＮＳＧマウスを用いて、異種移植ＧＶＨＤに対する作用を評価した。ＮＳＧマウス1匹当たり１×１０７個の健常人由来末梢血単核細胞を移植した。移植当日、７、１４、１７、２１、２４および２８日目に、６ｍｇ／ｋｇのＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃを１日１回腹腔内投与した。媒体投与群およびＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃ投与群の移植５５日目までの生存曲線をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法にて作成し、ログランク検定にて群間比較を行った。図８にその結果を示す。Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃは異種移植ＧＶＨＤに対して有効性を示した。
実施例７：Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストのヒトメモリーＴ細胞に対する作用
　健常人由来末梢血単核細胞（LONZA、型番CC-2702）を細胞培養プレートに播種し、破傷風トキソイド（List Biological Labs,Inc.、型番191A）とＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＸもしくはＭを添加して、４日間の培養を行った。培養４日後の培養上清中に含まれるＩＬ－２を、Bio-Plex Pro ヒトサイトカインパネル（BIO-RAD、型番M50000007A）を用いて定量した。図９にその結果を示す。Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストはインビトロにおいてヒトメモリーＴ細胞からのサイトカイン産生を抑制した。
実施例８：Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃの胸腺依存性抗原への免疫応答に対する作用
　ＣＤ１９およびＰＤ－１の各遺伝子の細胞外領域をヒトＣＤ１９およびヒトＰＤ－１遺伝子に各々置換したヒトＣＤ１９／ヒトＰＤ－１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて、胸腺依存性抗原であるKeyhole Limpet Hemocyanin（ＫＬＨ）免疫により誘導される抗ＫＬＨ抗体産生への免疫応答に対するインビボ作用を評価した。０．２ｍｇ／ｍＬのＫＬＨ（Thermo Fisher、型番77600）と等量のAlum（Thermo Fisher、型番77161）をよく混合して懸濁液を調製し、惹起剤とした。２００μＬの当該惹起剤を当該マウスの腹腔内に投与した。免疫処置当日より尾静脈からの採血を経日的に実施し、血清を調製した。免疫処置当日、７日目、１４日目、２２日目、２９日目および４１日目における血清中のＫＬＨに対する抗体価を測定し、各時点の抗体価が同等となるように対照群およびＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃ投与群への割り付けを行った。免疫処置４１日目に２００μＬの惹起剤を腹腔内に再度投与した（二次免疫）。二次免疫３日目、７日目、１０日目、１４日目および１７日目にＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃを、３ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回腹腔内投与した。二次免疫当日、７日目、１４日目および２１日目の血清中のＫＬＨに対する抗体価を測定した。なお、血清中のＫＬＨに対する抗体価は、ＥＬＩＳＡプレートに固相化したＫＬＨに対する結合をＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Southern Biotec、型番1030-05）によって検出し、マウス抗ＫＬＨモノクローナル抗体（BioLegend、型番408402）を用いて作成した検量線を基にした相対的定量法によって算出した。図１０にその評価結果を示す。Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストＭ－Ｆｃは胸腺依存性抗原に対する免疫応答を抑制した。
　なお、ヒトＣＤ１９／ヒトＰＤ－１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスは、Genesis. 2009 Jun;47(6):414-22.に記載された方法に準じて作製できる。
実施例９：マウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－１および－２の調製
　本実施例における「マウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－１」は、抗マウスＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬと抗マウスＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬから構成されるｓｃＤｂに、ＩｇＧ１定常領域（ヒンジ／ＣＨ３）を融合させたポリペプチド（以下、ポリペプチドＣという。）と、ポリペプチドＢの二つのタンパク質の会合により構成されるヘテロ二量体である。当該ヘテロ二量体は、Ｆｃγ受容体結合性を消失させた変異を有する。図１１にその構造の概略を示す。
　一方、本実施例における「マウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－２」は、抗マウスＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬと抗マウスＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬから構成される２種類のｓｃＦｖを、それぞれＩｇＧ１定常領域（ヒンジ／ＣＨ３）のＮ末端およびＣ末端に融合させたポリペプチド（以下、ポリペプチドＤという。）と、ポリペプチドＢの二つのタンパク質の会合により構成されるヘテロ二量体である。当該ヘテロ二量体も、Ｆｃγ受容体結合性を消失させた変異を有する。図１２にその構造の概略を示す。
　抗マウスＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬならびに抗マウスＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬを各々コードするＤＮＡは、抗マウスＣＤ１９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマおよび抗マウスＰＤ－１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマより調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用いて、公知のモノクローナル抗体可変領域の塩基配列解析法に準じた方法に従って取得した。取得した各々のＤＮＡを、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡとともに所定の順序で連結して作製した。なお、ＩｇＧ１定常領域（ヒンジ／ＣＨ３）をコードするＤＮＡは、公知の遺伝子情報をもとにＰＣＲ法にてそのｃＤＮＡを取得した。ポリペプチドＣおよびポリペプチドＢ、またはポリペプチドＤおよびポリペプチドＢを各々コードする各ＤＮＡ配列を挿入した発現ベクターを、Ｆｒｅｅ　Ｓｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞に遺伝子導入して発現させ、培養上清中に産生させた。その培養上清を回収した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにて精製することによりを調製した。
　マウスＰＤ－１発現ＣＨＯ－Ｓ細胞を用いたフローサイトメトリーにて、マウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストによるマウスＰＤ－１発現ＣＨＯ－Ｓ細胞に発現するＰＤ－１への結合性を評価した。同細胞に結合したマウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－１および－２の検出には、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体（Thermo Fisher Scientific、型番H10104）を使用した。
　何れのマウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストも、マウスＰＤ－１発現ＣＨＯ－Ｓ細胞に結合することが確認された。一方、コントロールとして用いたＣＨＯ－Ｓ細胞への結合は認められなかったことから、その結合が発現させたＰＤ－１に特異的であることが確認された。続いて、同様の方法により、Ｂ細胞標的ＰＤ－１アゴニストがマウスＣＤ１９に特異的に結合することが確認された。以上の結果を図１３および１４に示す。
実施例１０：ＮＰ－ＯＶＡ免疫惹起マウスにおける免疫応答に対するＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニストのインビボ作用
　Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて、4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl Ovalbumin（ＮＰ－ＯＶＡ）への免疫応答に対するインビボ作用を評価した。１ｍｇ／ｍＬのＮＰ－ＯＶＡ（LGC Bioresearch、型番N-5051）と等量のAlum（Thermo Fisher、型番77161）をよく混合して懸濁液を調製し、惹起剤とした。２００μＬの当該惹起剤をマウスの腹腔内に投与した。免疫処置３日目、７日目および１０日目にマウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－１および－２を、７ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回腹腔内に投与した。免疫処置１４日目に脾臓を採取し、セルストレーナーを用いて単細胞懸濁液を調製した。塩化アンモニウム溶血剤処置後の単細胞懸濁液を用いたフローサイトメトリーにて、クラススイッチメモリーＢ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ３８＋ＧＬ７－ＩｇＤ－ＩｇＭ－）数の評価を行い、ウィルコクソンの順位和検定にて群間比較を行った。その結果を図１５に示す。
　マウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－２投与群において、クラススイッチメモリーＢ細胞の増加が有意に抑制された。一方、マウスＢ細胞標的ＰＤ－１アゴニスト－Ｆｃ－１投与群では、クラススイッチメモリーＢ細胞の増加が抑制されなかった。
　なお、各表面抗原に対する抗体として、Brilliant Violet 605標識抗マウス／ヒトＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０抗体（BioLgend、型番103244）、Brilliant Violet 711標識抗マウスＣＤ３８抗体（BD Bioscience、型番740697）、Alexa Fluor488標識抗体マウス／ヒトＧＬ７抗体（BioLgend、型番144612）、ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＤ抗体（BioLegend、型番405714）およびPE/Dazzle594標識抗マウスＩｇＭ抗体（BioLegend、型番406530）を使用した。
　本発明のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片は、自己免疫疾患または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に有用である。

Claims (42)

  1. ＰＤ－１に特異的に結合する第一アームおよびＣＤ１９に特異的に結合する第二アームを有する、ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、自己免疫疾患または移植片対宿主病の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
  2. 当該第一アームが、抗ＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬを含むことを特徴とする請求項１記載の剤。
  3. 当該第二アームが、抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬを含むことを特徴とする請求項１または２記載の剤。
  4. 当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、そのＮ末端から、抗ＰＤ－１抗体のＶＨ、抗ＣＤ１９抗体のＶＬ、抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよび抗ＰＤ－１抗体のＶＬの順番で、各々、ペプチドリンカーを介してもしくは直接連結された構造を有する、請求項１～３の何れか一項記載の剤。
  5. 当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、そのＮ末端から、抗ＰＤ－１抗体のＶＬ、抗ＰＤ－１抗体のＶＨ、抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよび抗ＣＤ１９抗体のＶＬの順番で、各々、ペプチドリンカーを介してもしくは直接連結された構造を有する、請求項１～３の何れか一項記載の剤。
  6. 当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、請求項４記載の抗体における抗ＰＤ－１抗体のＶＬまたは請求項５記載の抗体における抗ＣＤ１９抗体のＶＬのＣ末端に、ヒンジ部位からＣＨ３領域までのヒトＩｇＧ定常領域を有するポリペプチドのＮ末端が、ペプチドリンカーを介してもしくは直接に、さらに連結された構造を有する、請求項４または５記載の剤。
  7. 当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、さらに、ヒンジ部位からＣＨ３領域までのヒトＩｇＧ定常領域を有するポリペプチドを含む構造を有する、請求項６記載の剤。
  8. ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ）×４－Ｓｅｒまたは（（Ｇｌｙ）×４－Ｓｅｒ）×３であることを特徴とする、請求項４～７の何れか一項記載の剤。
  9. 当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、ダイアボディ、二重特異性ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性ミニボディ、二重特異性Ｆ（ａｂ′）２、二重特異性ハイブリッド抗体、共有結合型ダイアボディ、二重特異性（ＦｖＣｙｓ）２、二重特異性Ｆ（ａｂ′－ジッパー）２、二重特異性（Ｆｖ－ジッパー）２、二重特異性三鎖抗体または二重特異性ｍＡｂ２の形態である、請求項１～３の何れか一項記載の剤。
  10. 当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、二重特異性ハイブリッド抗体の形態である、請求項１～３の何れか一項記載の剤。
  11. 当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項１～５および８～１０の何れか一項記載の剤。
  12. 当該ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体である、請求項１１記載の剤。
  13. ヒンジ部位からＣＨ３領域までのヒトＩｇＧ定常領域のアイソタイプが、ＩｇＧ１である、請求項６または７記載の剤。
  14. ＰＤ－１およびＣＤ１９が、各々ヒトＰＤ－１およびヒトＣＤ１９である、請求項１～１３の何れか一項記載の剤。
  15. 当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、ヒト化または完全ヒト型抗体である、請求項１～１４の何れか一項記載の剤。
  16. 当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体の第一アームがＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１間の相互作用を許容することを特徴とする、請求項１～１５の何れか一項記載の剤。
  17. 当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、Ｂ細胞上に発現するＰＤ－１およびＣＤ１９に結合することを特徴とする、請求項１～１６の何れか一項記載の剤
  18. ＰＤ－１に特異的に結合する第一アームおよびＣＤ１９に特異的に結合する第二アームを有する、ヒト化または完全ヒト型ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体を有効成分として含む自己免疫疾患または移植片対宿主病の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤であって、
    （ａ）当該第一アームが抗ヒトＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬを含み、当該第二アームが抗ヒトＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬを含み、
    （ｂ）　当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、Ｂ細胞上に発現するＰＤ－１およびＣＤ１９に結合し、
    （ｃ）　当該第一アームがＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１間の相互作用を許容し、ならびに
    （ｄ）　当該ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、二重特異性ハイブリッド抗体の形態であり、および／またはＩｇＧ１抗体もしくはＩｇＧ４抗体である、当該剤。
  19. 自己免疫疾患が、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、慢性円板状エリテマトーデス、多発性硬化症、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎、大動脈炎症候群、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、脊椎関節炎、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、リウマトイド血管炎、大型血管炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥ症候群、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、ＩｇＧ４関連疾患、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、原発性胆汁性肝硬変、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、抗糸球体基底膜腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、甲状腺機能亢進症、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、アジソン病、特発性アジソン病、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性I型糖尿病、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、炎症性腸疾患、セリアック病、アトピー性皮膚炎、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、多巣性運動ニューロパチー、肺胞蛋白症、自己免疫性出血病XIII、再発性多発軟骨炎、サルコイドーシス、強直性脊椎炎、重症喘息、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、好酸球性副鼻腔炎、拡張型心筋症、食物アレルギー、全身性肥満細胞症、筋萎縮性側索硬化症または封入体筋炎である、請求項１～１８の何れか一項記載の剤。
  20. ステロイド薬、インターフェロンβ－１ａ、インターフェロンβ－１ｂ、酢酸グラチラマー、ミトキサントロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、クラドリビン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コルチコトロピン、ミゾリビン、タクロリムス、フィンゴリモド、アレムツズマブ、免疫抑制剤、抗リウマチ薬および抗サイトカイン薬から選択される一以上の薬剤とともに投与されることを特徴とする、請求項１～１９の何れか一項記載の剤。
  21. ＰＤ－１に特異的に結合する第一アームおよびＣＤ１９に特異的に結合する第二アームを有する、単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体またはその抗体断片。
  22. 当該第一アームが、抗ＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬを含むことを特徴とする請求項２１記載の抗体またはその抗体断片。
  23. 当該第二アームが、抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬを含むことを特徴とする請求項２１または２２記載の抗体またはその抗体断片。
  24. 当該単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、そのＮ末端から、抗ＰＤ－１抗体のＶＨ、抗ＣＤ１９抗体のＶＬ、抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよび抗ＰＤ－１抗体のＶＬの順番で、各々、ペプチドリンカーを介してもしくは直接連結された構造を有する、請求項２１～２３の何れか一項記載の抗体。
  25. 当該単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体が、そのＮ末端から、抗ＰＤ－１抗体のＶＬ、抗ＰＤ－１抗体のＶＨ、抗ＣＤ１９抗体のＶＨおよび抗ＣＤ１９抗体のＶＬの順番で、各々、ペプチドリンカーを介してもしくは直接連結された構造を有する、請求項２１～２３の何れか一項記載の抗体。
  26. 請求項２４記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体における抗ＰＤ－１抗体のＶＬまたは請求項２５記載のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体における抗ＣＤ１９抗体のＶＬのＣ末端に、ヒンジ部位からＣＨ３領域までのヒトＩｇＧ定常領域を有するポリペプチドのＮ末端が、ペプチドリンカーを介してもしくは直接に、さらに連結された構造を有する、請求項２４または２５記載の抗体。
  27. さらに、ヒンジ部位からＣＨ３領域までのヒトＩｇＧ定常領域を有するポリペプチドを含む構造を有する、請求項２６記載の抗体。
  28. ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ）×４－Ｓｅｒまたは（（Ｇｌｙ）×４－Ｓｅｒ）×３であることを特徴とする、請求項２４～２７の何れか一項記載の抗体。
  29. ダイアボディ、二重特異性ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性ミニボディ、二重特異性Ｆ（ａｂ′）２、二重特異性ハイブリッド抗体、共有結合型ダイアボディ、二重特異性（ＦｖＣｙｓ）２、二重特異性Ｆ（ａｂ′－ジッパー）２、二重特異性（Ｆｖ－ジッパー）２、二重特異性三鎖抗体または二重特異性ｍＡｂ２の形態である、請求項２１～２３の何れか一項記載の抗体またはその抗体断片。
  30. 二重特異性ハイブリッド抗体の形態である、請求項２１～２３の何れか一項記載の抗体またはその抗体断片。
  31. ＩｇＧ抗体である、請求項２１～２５および請求項２８～３０の何れか一項記載の抗体またはその抗体断片。
  32. ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体である、請求項３１記載の抗体またはその抗体断片。
  33. ヒンジ部位からＣＨ３領域までのヒトＩｇＧ定常領域のアイソタイプが、ＩｇＧ１である、請求項２６または２７記載の剤。
  34. ＰＤ－１およびＣＤ１９が、各々ヒトＰＤ－１およびヒトＣＤ１９である、請求項２１～３３の何れか一項記載の抗体またはその抗体断片。
  35. ヒト化または完全ヒト型抗体である、請求項２１～３４の何れか一項記載の抗体またはその抗体断片。
  36. 当該第一アームがＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１間の相互作用を許容することを特徴とする、請求項２１～３５の何れか一項記載の抗体またはその抗体断片。
  37. Ｂ細胞上に発現するＰＤ－１およびＣＤ１９に結合することを特徴とする、請求項２１～３６の何れか一項記載の抗体またはその抗体断片。
  38. ＰＤ－１に特異的に結合する第一アームおよびＣＤ１９に特異的に結合する第二アームを有する、ヒト化または完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体であって、
    （ａ）当該第一アームが、抗ヒトＰＤ－１抗体のＶＨおよびＶＬを含み、当該第二アームが、抗ヒトＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬを含み、
    （ｂ）Ｂ細胞上に発現するＰＤ－１およびＣＤ１９に結合し、
    （ｃ）　当該第一アームがＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１間の相互作用を許容し、ならびに
    （ｄ）　二重特異性ハイブリッド抗体の形態であり、および／またはＩｇＧ１抗体もしくはＩｇＧ４抗体である、当該抗体。
  39. 請求項２１～３７の何れか一項から選択される単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または請求項３８記載のヒト化または完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  40. 請求項２１～３７の何れか一項のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または請求項３８記載のヒト化または完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体を有効成分として含む、自己反応性Ｂ細胞介在性疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
  41. 請求項２１～３７の何れか一項のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または請求項３８記載のヒト化または完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体を有効成分として含む、自己反応性Ｂ細胞抑制剤。
  42. 請求項２１～３７の何れか一項のＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体もしくはその抗体断片または請求項３８記載のヒト化または完全ヒト型単離ＰＤ－１／ＣＤ１９二重特異性抗体を有効成分として含む、メモリーＴ細胞活性化抑制剤。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020204152A1 (ja) * 2019-04-04 2020-10-08 小野薬品工業株式会社 二重特異性抗体
WO2021006199A1 (ja) * 2019-07-05 2021-01-14 小野薬品工業株式会社 Ｐｄ－１／ｃｄ３二重特異性タンパク質による血液がん治療
WO2021020416A1 (ja) * 2019-07-30 2021-02-04 小野薬品工業株式会社 二重特異性抗体

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3238029A1 (en) * 2021-11-11 2023-05-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cd20-pd1 binding molecules and methods of use thereof

Citations (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
EP0120694A2 (en) 1983-03-25 1984-10-03 Celltech Limited Processes for the production of multichain polypeptides or proteins
US4801687A (en) 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0314161A1 (en) 1987-10-28 1989-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Human immunoglobulines produced by recombinant DNA techniques
EP0481790A2 (en) 1990-10-17 1992-04-22 The Wellcome Foundation Limited Antibody production
US5151504A (en) 1989-11-17 1992-09-29 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method for purification of monoclonal antibodies
EP0523949A1 (en) 1991-07-15 1993-01-20 The Wellcome Foundation Limited Production of antibodies
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5569825A (en) 1990-08-29 1996-10-29 Genpharm International Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5939598A (en) 1990-01-12 1999-08-17 Abgenix, Inc. Method of making transgenic mice lacking endogenous heavy chains
US5969108A (en) 1990-07-10 1999-10-19 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO2000063403A2 (en) 1999-04-15 2000-10-26 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell using sequences encoding adenovirus e1 protein
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6162963A (en) 1990-01-12 2000-12-19 Abgenix, Inc. Generation of Xenogenetic antibodies
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
WO2002043478A2 (en) 2000-11-30 2002-06-06 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2003011911A1 (en) 2001-07-31 2003-02-13 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to pd-1
WO2004072286A1 (ja) 2003-01-23 2004-08-26 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. ヒトｐｄ−１に対し特異性を有する物質
WO2013022091A1 (ja) 2011-08-11 2013-02-14 小野薬品工業株式会社 Ｐｄ－１アゴニストからなる自己免疫疾患治療剤
WO2013157953A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Merus B.V. Methods and means for the production of ig-like molecules
WO2014051433A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Merus B.V. BISPECIFIC IgG ANTIBODIES AS T CELL ENGAGERS
CN106939050A (zh) * 2017-03-27 2017-07-11 顺昊细胞生物技术（天津）股份有限公司 抗pd1和cd19双特异性抗体及其应用

Patent Citations (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
EP0120694A2 (en) 1983-03-25 1984-10-03 Celltech Limited Processes for the production of multichain polypeptides or proteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4801687A (en) 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
EP0314161A1 (en) 1987-10-28 1989-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Human immunoglobulines produced by recombinant DNA techniques
US5698767A (en) 1988-06-14 1997-12-16 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5571698A (en) 1988-09-02 1996-11-05 Protein Engineering Corporation Directed evolution of novel binding proteins
US5403484A (en) 1988-09-02 1995-04-04 Protein Engineering Corporation Viruses expressing chimeric binding proteins
US6180370B1 (en) 1988-12-28 2001-01-30 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins and methods of making the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5585089A (en) 1988-12-28 1996-12-17 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5151504A (en) 1989-11-17 1992-09-29 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method for purification of monoclonal antibodies
US6162963A (en) 1990-01-12 2000-12-19 Abgenix, Inc. Generation of Xenogenetic antibodies
US5939598A (en) 1990-01-12 1999-08-17 Abgenix, Inc. Method of making transgenic mice lacking endogenous heavy chains
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6114598A (en) 1990-01-12 2000-09-05 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5580717A (en) 1990-05-01 1996-12-03 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5969108A (en) 1990-07-10 1999-10-19 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5569825A (en) 1990-08-29 1996-10-29 Genpharm International Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0481790A2 (en) 1990-10-17 1992-04-22 The Wellcome Foundation Limited Antibody production
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
EP0523949A1 (en) 1991-07-15 1993-01-20 The Wellcome Foundation Limited Production of antibodies
US6593081B1 (en) 1991-12-02 2003-07-15 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US6521404B1 (en) 1991-12-02 2003-02-18 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US6544731B1 (en) 1991-12-02 2003-04-08 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertories and displayed on phage
US6555313B1 (en) 1991-12-02 2003-04-29 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US6582915B1 (en) 1991-12-02 2003-06-24 Medical Research Council Production of anti-self bodies from antibody segment repertories and displayed on phage
WO2000063403A2 (en) 1999-04-15 2000-10-26 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell using sequences encoding adenovirus e1 protein
WO2002043478A2 (en) 2000-11-30 2002-06-06 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2003011911A1 (en) 2001-07-31 2003-02-13 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to pd-1
WO2004072286A1 (ja) 2003-01-23 2004-08-26 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. ヒトｐｄ−１に対し特異性を有する物質
WO2013022091A1 (ja) 2011-08-11 2013-02-14 小野薬品工業株式会社 Ｐｄ－１アゴニストからなる自己免疫疾患治療剤
WO2013157953A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Merus B.V. Methods and means for the production of ig-like molecules
WO2013157954A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Merus B.V. Methods and means for the production of ig-like molecules
WO2014051433A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Merus B.V. BISPECIFIC IgG ANTIBODIES AS T CELL ENGAGERS
CN106939050A (zh) * 2017-03-27 2017-07-11 顺昊细胞生物技术（天津）股份有限公司 抗pd1和cd19双特异性抗体及其应用

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Genbank", Database accession no. NP 001761
"GenBank", Database accession no. NP_005009
"Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", 1991, IRL PRESS
"Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1987, NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH
BIOCHEMISTRY, vol. 31, no. 6, 1992, pages 1579 - 1584
BRINKMANN U. ET AL.: "The making of bispecific antibodies", MABS, vol. 9, no. 2, 10 January 2017 (2017-01-10), pages 182 - 212, XP055374463, DOI: doi:10.1080/19420862.2016.1268307 *
COLIGAN JEDUNN BMPLOEGH HLSPEICHER DWWINGFIELD PT, CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, vol. 2, 1988, pages 0 - 471,11184-8
GENESIS, vol. 47, no. 6, June 2009 (2009-06-01), pages 414 - 22
HAMMERLING ET AL.: "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas", 1981, ELSEVIER, pages: 563 - 681
HONGO ET AL., HYBRIDOMA, vol. 14, no. 3, 1995, pages 253 - 260
J. BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 269, 1994, pages 199 - 206
KOHLERMILSTEIN ET AL., NATURE, vol. 256, 1975, pages 495 - 97
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, no. 14, 1993, pages 6444 - 6448
SPIESS C. ET AL.: "Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies", MOLECULAR IMMUNOLOGY, vol. 67, 27 January 2015 (2015-01-27), pages 95 - 106, XP029246892, DOI: doi:10.1016/j.molimm.2015.01.003 *
TOMIZUKA ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 2000, pages 722 - 727

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020204152A1 (ja) * 2019-04-04 2020-10-08 小野薬品工業株式会社 二重特異性抗体
JP7405139B2 (ja) 2019-04-04 2023-12-26 小野薬品工業株式会社 二重特異性抗体
WO2021006199A1 (ja) * 2019-07-05 2021-01-14 小野薬品工業株式会社 Ｐｄ－１／ｃｄ３二重特異性タンパク質による血液がん治療
JP2021014449A (ja) * 2019-07-05 2021-02-12 小野薬品工業株式会社 Ｐｄ−１／ｃｄ３二重特異性タンパク質による血液がん治療
WO2021020416A1 (ja) * 2019-07-30 2021-02-04 小野薬品工業株式会社 二重特異性抗体
JP6856183B1 (ja) * 2019-07-30 2021-04-07 小野薬品工業株式会社 二重特異性抗体

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