RU2814713C2

RU2814713C2 - Биспецифическое антитело

Info

Publication number: RU2814713C2
Application number: RU2021128262A
Authority: RU
Inventors: Сиро Сибаяма; Томоя ТЕДЗУКА; Марк Тросби; Корнелис Адриан Де Крэйф; Питер Фокко Ван Ло; Ринсе Клостер; Робертус Корнелис Роверс
Original assignee: Оно Фармасьютикал Ко., Лтд.
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2024-03-04

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены биспецифические антитела, специфически связывающиеся с PD-1 и CD19. Биспецифические антитела имеют свойство обеспечения взаимодействия между PD-1 и PD-L1 в качестве их лиганда. Также предложены фармацевтические композиции, включающие указанные антитела. Указанные антитела являются новыми агентами для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов или рецидива или лечения аутоиммунных заболеваний. 6 н. и 30 з.п. ф-лы, 22 ил., 22 пр.

Description

[Область техники]

[0001]

Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, способному специфически связываться с PD-1 и CD19, соответственно, (далее может быть сокращено как «биспецифическое антитело PD-1/CD19») или его фрагменту антитела (далее может быть сокращено как «биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное») и к фармацевтической композиции, содержащей его в качестве активного ингредиента, а также к его фармацевтическому терапевтическому применению.

[Предпосылки изобретения]

[0002]

PD-1 представляет собой иммуносупрессивный рецептор, принадлежащий к семейству иммуноглобулинов, и представляет собой соединение, имеющее функцию подавления сигналов иммунной активации В-клеток, активируемых стимуляцией через рецептор антигена. Из данных анализа, проведенном на мышей с нокаутом PD-1 и тому подобное, известно, что сигналы PD-1 играют важную роль в подавлении аутоиммунных заболеваний, таких как аутоиммунная дилатационная кардиомиопатия, волчаночный синдром, аутоиммунный энцефаломиелит, системная красная волчанка, реакция «трансплантат против хозяина», сахарный диабет I типа и ревматоидный артрит. Соответственно, указывается, что вещество, усиливающее сигналы PD-1, может быть профилактическим или терапевтическим средством при лечении аутоиммунных заболеваний.

[0003]

CD19 представляет собой мембранный белок, экспрессирующийся на В-клетках и молекулярный переносчик стимуляции в В-клетки вместе с рецепторным комплексом В-клеток.

[0004]

На сегодняшний день имеется несколько сообщений о биспецифических PD-1 антителах для лечения аутоиммунных заболеваний (патентная литература 1-3), но одной из мишеней является CD3, который является членом рецепторного комплекса Т-клеток.

[0005]

Кроме того, имеется сообщение о биспецифических антителах, нацеленных на PD-1 и CD19, для лечения опухоли (патентная литература 4), но совсем нет сообщений о биспецифических PD-1/CD19 антителах для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов или рецидива или для лечения аутоиммунного заболевания.

[Список цитированной литературы]

[Патентная литература]

[0006]

Патентная литература 1: Международная публикация №. WO2003/011911

Патентная литература 2: Международная публикация №. WO2004/072286

Патентная литература 3: Международная публикация №. WO2013/022091

Патентная литература 4: публикация патента Китая № 106939050

[Сущность изобретения]

[Техническая задача]

[0007]

Целью настоящего изобретения является разработка нового фармацевтического агента для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов или рецидива или лечения аутоиммунных заболеваний и тому подобное.

[Решение задачи]

[0008]р

Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования и сосредоточили внимание на биспецифическом PD-1/CD19 антителе по настоящему изобретению в качестве вещества, способном решить вышеупомянутую проблему, и создали настоящее изобретение.

[0009]

Кроме того, авторы настоящего изобретения подтвердили, что Биспецифическое антитело PD-1/CD19 имеет свойство, позволяющее взаимодействовать между PD-1 и PD-L1 в качестве лиганда. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили Биспецифическое антитело PD-1/CD19, которое может быть легко отделено от его побочных продуктов в процессе очистки путем одной или нескольких аминокислотных замен или добавлений, в частности, в тяжелой цепи второго плеча, специфически связывающегося с CD19, составляющего структуру этого биспецифического PD-1/CD19 антитела.

[0010]

Таким образом, настоящее изобретение относится к следующему.

[0011]

[1] Биспецифическое антитело или его фрагмент антитела, имеющее первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, и второе плечо, специфически связывающееся с CD19, и специфически связывающееся с PD-1 и CD19, соответственно,

где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, имеет любую VH, выбранную из следующих:

(A) вариабельная область тяжелой цепи (далее «вариабельная область тяжелой цепи» может быть сокращена как «VH»), имеющая

(a) определяющий комплементарность участок 1 вариабельной области тяжелой цепи (далее, «определяющий комплементарность участок 1 вариабельной области тяжелой цепи» может быть сокращен как «VH-CDR1»), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6,

(b) определяющий комплементарность участок 2 вариабельной области тяжелой цепи (далее, «определяющий комплементарность участок 2 вариабельной области тяжелой цепи» может быть сокращен как «VH-CDR2»), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и

(c) определяющий комплементарность участок 3 вариабельной области тяжелой цепи (далее, «определяющий комплементарность участок 3 вариабельной области тяжелой цепи» может быть сокращен как «VH-CDR3»), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8,

(B) VH, имеющая

(a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9,

(b) VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, и

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11,

(C) VH, имеющая

(a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12,

(b) VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, и

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14,

(D) VH, имеющая

(a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15,

(b) VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, и

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и

(E) VH, имеющая

(a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18,

(b) VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, и

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20,

где второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеет любую VH, выбранную из следующих:

(A) VH, имеющая

(a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35,

(b) VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:36, и

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37,

(B) VH, имеющая

(a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38,

(b) VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:39, и

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:40,

(C) VH, имеющая

(a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:41,

(b) VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:42, и

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:43,

(D) VH, имеющая

(a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:44,

(b) VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:45, и

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:46, и

(E) VH, имеющая

(a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47,

(b) VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:48, и

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:49, и

где от одного до пяти произвольных аминокислотных остатков в любом одном или нескольких VH-CDR, выбранных из VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 в первом плече, специфически связывающемся с PD-1, могут быть заменены на другие аминокислоты, соответственно, и/или от одного до пяти произвольных аминокислотных остатков в любом одном или нескольких VH-CDR, выбранных из VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 во втором плече, специфически связывающемся с CD19, могут быть заменены на другие аминокислоты, соответственно.

[2] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, имеет любую VH, выбранную из следующих:

(A) VH, имеющая

(a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6,

(b) VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8,

(B) VH, имеющая

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11,

(C) VH, имеющая

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14,

(D) VH, имеющая

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и

(E) VH, имеющая

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20, и

(A) VH, имеющая

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37,

(B) VH, имеющая

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:40,

(C) VH, имеющая

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:43,

(D) VH, имеющая

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:46, и

(E) VH, имеющая

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:49.

[3] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и

(ii) VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, является любой, выбранной из следующих:

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

[4] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, и

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

[5] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

[6] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

[7] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20, и

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

[8] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

(ii) VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, имеет

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37.

[9] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:40.

[10] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:43.

[11] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:46.

[12] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[13] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[14] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[15] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[16] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[17] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[18] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[19] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[20] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[21] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[22] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[23] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[24] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[25] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[26] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[27] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[28] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[29] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[30] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[31] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[32] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

[33] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[32], где каркасный участок 1 (далее может быть сокращен как «FR1»), каркасный участок 2 (далее может быть сокращен как «FR2») и каркасный участок 3 (далее может быть сокращен как «FR3») в каркасном участке (далее «каркас» может быть сокращен как «FR») в VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, соответствуют аминокислотным последовательностям, кодируемым геном V зародышевой линии IGHV7-4-1 или ее геном с соматической мутацией(ями), соответственно.

[34] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [33], где каркасный участок 4 (далее «каркас 4» может быть сокращен как «FR4») в VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность (исключая аминокислотную последовательность, включенную в область VH-CDR3), кодируемую геном J зародышевой линии JH6c или ее геном с соматической мутацией(ями).

[35] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [33] или [34], где область FR в VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, кодируется геном V зародышевой линии IGHV7-4-1, который может иметь соматическую мутацию(ии), и содержит область FR1, в котором в аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:21, в результате соматической мутации(ий) лизин в положении 13 был или может быть заменен на глутамин, аланин в положении 16 был или может быть заменен на валин, или лизин в положении 19 был или может быть заменен на метионин, соответственно, или где была или может быть произведена замена на произвольную комбинацию их совокупности.

[36] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [33]-[35], где область FR в VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, кодируется геном V зародышевой линии IGHV7-4-1, который может иметь соматическую мутацию(ии), и содержит область FR2, в котором в аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:21, валин в положении 37 был или может быть заменен на лейцин.

[37] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [33]-[36], где область FR в VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, кодируется геном V зародышевой линии IGHV7-4-1, который может иметь соматическую мутацию(ии), и содержит область FR3, в котором в аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:21, в результате соматической мутации(ий) серин в положении 77 был или может быть заменен на треонин или цистеин в положении 84 был или может быть заменен на серин или аспарагин, соответственно, или где была или может быть произведена замена на произвольную комбинацию их совокупности.

[38] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [33]-[37], где область FR4 в VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, кодируется геном JH6c зародышевой линии J, который может иметь соматическую мутацию(ии) (за исключением области гена, кодирующей область VH-CDR3), и где в аминокислотной последовательности (Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Val-Ser-Ser)(SEQ ID NO:61) указанной области FR4 лизин (Lys) был или может быть заменен на глутамин или аспарагин и/или треонин (Thr), отмеченный звездочкой, был или может быть заменен на лейцин.

[39] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[38], где области FR1, FR2 и FR3 в области FR в VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, соответствуют аминокислотным последовательностям, кодируемым геном V зародышевой линии IGHV5-51 или ее геном с соматической мутацией(ями), соответственно.

[40] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [39], где область FR в VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, кодируется геном V зародышевой линии IGHV5-51, который может иметь соматическую мутацию(ии), и содержит область FR1, в котором в аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:22, в результате соматической мутации(ий) глутаминовая кислота в положении 1 была или может быть заменена на глутамин, пролин в положении 14 был или может быть заменен на серин, тирозин в положении 27 был или может быть заменен на фенилаланин или треонин в положении 30 был или может быть заменен на изолейцин, соответственно, или где была или может быть произведена замена на произвольную комбинацию их совокупности.

[41] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [39] или [40], где область FR в VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит область FR2, кодируемый геном зародышевой линии V IGHV5-51, который может иметь соматическую мутацию(ии).

[42] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [39]-[41], где область FR в VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, кодируется геном V зародышевой линии IGHV5-51, который может иметь соматическую мутацию(ии), и содержит область FR3, в котором в аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:22, в результате соматической мутации(ий) изолейцин в положении 76 был или может быть заменен на фенилаланин, серин в положении 77 был или может быть заменен на треонин или аспарагин, треонин в положении 78 был или может быть заменен на валин, серин в положении 84 был или может быть заменен на аспарагин, метионин в положении 93 был или может быть заменен на изолейцин или лейцин или аланин в положении 97 был или может быть заменен на валин, соответственно, или где была или может быть произведена замена на произвольную комбинацию их совокупности.

[43] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[42], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, или аминокислотную последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 98% или 99% с той же аминокислотной последовательностью VH.

[44] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[43], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5.

[45] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[44], где VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 и SEQ ID NO:34, или аминокислотную последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 98% или 99% с той же аминокислотной последовательностью VH.

[46] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[45], где VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, в которой глутамин в положении 114 в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 и SEQ ID NO:34, был или может быть заменен на аргинин.

[47] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[45], где VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

[48] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

[49] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела, имеющее первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, и второе плечо, специфически связывающееся с CD19, где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, или аминокислотную последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 98% или 99% с той же аминокислотной последовательностью VH, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, или аминокислотную последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 98% или 99% с той же аминокислотной последовательностью VH.

[50] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

[51] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

[52] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

[53] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

[54] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1] или [2], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

[55] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [8], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30 или SEQ ID NO:62.

[56] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [9], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31 или SEQ ID NO:63.

[57] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [10], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:64.

[58] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [11], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:65.

[59] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [12], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34 или SEQ ID NO:66.

[60] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [13], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30 или SEQ ID NO:62.

[61] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [14], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31 или SEQ ID NO:63.

[62] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [15], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:64.

[63] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [16], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:65.

[64] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [17], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34 или SEQ ID NO:66.

[65] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [18], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30 или SEQ ID NO:62.

[66] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [19], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31 или SEQ ID NO:63.

[67] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [20], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:64.

[68] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [21], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:65.

[69] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [22], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34 или SEQ ID NO:66.

[70] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [23], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30 или SEQ ID NO:62.

[71] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [24], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31 или SEQ ID NO:63.

[72] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [25], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:64.

[73] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [26], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:65.

[74] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [27], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34 или SEQ ID NO:66.

[75] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [28], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30 или SEQ ID NO:62.

[76] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [29], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31 или SEQ ID NO:63.

[77] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [30], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:64.

[78] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [31], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:65.

[79] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [1], [2] или [32], где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34 или SEQ ID NO:66.

[80] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[79], где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, и/или второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеют/имеет вариабельную область легкой цепи (далее, «вариабельная область легкой цепи» может быть сокращена как «VL»), имеющую

(a) определяющий комплементарность участок 1 вариабельной области легкой цепи (далее, «определяющий комплементарность участок 1 вариабельной области легкой цепи» может быть сокращен как «VL-CDR1»), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26,

(b) определяющий комплементарность участок 2 вариабельной области легкой цепи (далее, «определяющий комплементарность участок 2 вариабельной области легкой цепи» может быть сокращен как «VL-CDR2»), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27, и

(c) определяющий комплементарность участок 3 вариабельной области легкой цепи (далее, «определяющий комплементарность участок 3 вариабельной области легкой цепи» может быть сокращен как «VL-CDR3»), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28.

[81] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[80], где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, и/или второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеют/имеет VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, соответственно.

[82] Биспецифическое антитело или его фрагмент антитела, имеющее первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, и второе плечо, специфически связывающееся с CD19, и специфически связывающееся с PD-1 и CD19, соответственно, где (A) первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, имеет VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и

(B) второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеет VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25.

[83] Биспецифическое антитело или его фрагмент антитела, имеющее первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, и второе плечо, специфически связывающееся с CD19, и специфически связывающееся с PD-1 и CD19, соответственно, где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, перекрестно конкурирует за (1) связывание с PD-1 с первым плечом, специфически связывающимся с PD-1, имеющим VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, или (2) связывание с PD-1 с вариабельной областью моноклонального антитела, специфически связывающегося с PD-1, содержащего те же VH и VL.

[84] Биспецифическое антитело или его фрагмент антитела, имеющее первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, и второе плечо, специфически связывающееся с CD19, и специфически связывающееся с PD-1 и CD19, соответственно, где связывание с PD-1 с первым плечом, специфически связывающимся с PD-1, перекрестно конкурирует за (1) первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, имеющим VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, или (2) вариабельную область моноклонального антитела, специфически связывающегося с PD-1, имеющую те же VH и VL.

[85] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [83] или [84], где второе плечо, специфически связывающееся с CD19, дополнительно перекрестно конкурирует за (1) связывание с CD19 со вторым плечом, специфически связывающимся с CD19, имеющим VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, или (2) связывание с CD19 с вариабельной областью моноклонального антитела, специфически связывающегося с CD19, имеющую те же VH и VL.

[86] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [83] или [84], где связывание с CD19 со вторым плечом, специфически связывающимся с CD19, дополнительно перекрестно конкурирует за (1) второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеющим VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, или (2) вариабельную область моноклонального антитела, специфически связывающуюся с CD19, содержащего те же VH и VL.

[87] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [83] или [84], где второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеет любую VH, выбранную из следующих:

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая,

(E) VH, имеющая

[88] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [83] или [84], где VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, или аминокислотную последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 98% или 99% с той же аминокислотной последовательностью VH.

[89] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [83] или [84], где VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

[90] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [83]-[89], где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, и/или второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеют/имеет VL, имеющую

(a) VL-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26,

(b) VL-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27, и

(c) VL-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28.

[91] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [83]-[89], где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, и/или второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеют/имеет VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25.

[92] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[91], где Биспецифическое антитело PD-1/CD19 представляет собой антитело IgG.

[93] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [92], где антитело IgG в предшествующем пункте [92] представляет собой антитело IgG₁ или IgG₄.

[94] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [92], где антитело IgG в предшествующем пункте [92] представляет собой антитело IgG₁.

[95] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [92], где антитело IgG в предшествующем пункте [92] представляет собой антитело IgG₄.

[96] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [94], где в двух константных участках тяжелой цепи антитела IgG₁, указанного в предшествующем пункте [94], лейцин в положении 235 в соответствии с системой нумерации EU был заменен на глицин, соответственно, и/или глицин в положении 236 в соответствии с системой нумерации EU был заменен на аргинин, соответственно.

[97] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [94] или [96], где в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, как лейцин в положении 351, так и треонин в положении 366 в соответствии с системой нумерации EU были заменены на лизин, и в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, лейцин в положении 351 был заменен на аспарагиновую кислоту и лейцин в положении 368 был заменен на глутаминовую кислоту.

[98] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [94] или [96], где в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, лейцин в положении 351 в соответствии с системой нумерации EU был заменен на аспарагиновую кислоту и лейцин в положении 368 был заменен на глутаминовую кислоту, и в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, как лейцин в положении 351, так и треонин в положении 366 были заменены на лизин.

[99] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [94] и [96]-[98], где в двух константных участках тяжелой цепи антитела IgG₁, указанного в любом из предшествующих пунктов [94] и [96]-[98], лизин в положении 447 в соответствии с системой нумерации EU был удален, соответственно.

[100] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [95], где в двух константных участках тяжелой цепи антитела IgG₄, указанного в предшествующем пункте [95], серин в положении 228 в соответствии с системой нумерации EU был заменен на пролин, соответственно.

[101] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [94] и [96]-[99], где тяжелая цепь, имеющая VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, на своем С-конце дополнительно содержит Gly (глицин), Gly-Lys-Lys-Ala (SEQ ID NO:67), Gly-Lys-Ala-Lys-Ala (SEQ ID NO:68), Gly-Arg-Arg-Ala (SEQ ID NO:69) или Gly-Arg-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO:70).

[102] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[94], [96], [98], [99] и [101], где тяжелая цепь, имеющая VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23.

[103] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[94], [96], [98], [99], [101] и [102], где тяжелая цепь, имеющая VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, имеет константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 и SEQ ID NO:75.

[104] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[103], где легкая цепь, имеющая VL первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, и/или легкая цепь, имеющая VL второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержат(ит) константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29.

[105] Биспецифическое антитело или его фрагмент антитела, имеющее первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, и второе плечо, специфически связывающееся с CD19, и специфически связывающееся с PD-1 и CD19, соответственно, где

(A) тяжелая цепь, имеющая VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, и константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23,

(B) легкая цепь, имеющая VL первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29,

(C) тяжелая цепь, имеющая VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, имеет VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, и константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24, и

(D) легкая цепь, имеющая VL второго плеча, специфически связывающегося с CD19, имеет VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29.

[106] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[105], где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, обеспечивает взаимодействие между PD-1 и PD-L1.

[107] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[106], где комплекс, состоящий из тяжелой цепи и легкой цепи первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет изоэлектрическую точку в диапазоне около 7,4 и около 7,7 (предпочтительно, между около 7,5 и около 7,6).

[108] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[107], где комплекс, состоящий из тяжелой цепи и легкой цепи второго плеча, специфически связывающегося с CD19, имеет изоэлектрическую точку в диапазоне около 8,3 и около 8,8 (предпочтительно, между около 8,4 и около 8,6).

[109] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[108], где продукция цитокинов в крови или ткани значительно снижается во время введения или в течение 24 часов после введения.

[110] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[108], где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, обеспечивает взаимодействие между PD-1 и PD-L1, и где продукция цитокинов значительно снижена.

[111] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [109] или [110], где цитокин представляет собой по меньшей мере IL-2, IFN-γ или TNF-α.

[112] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[111], которое подавляет активацию B-клеток путем связывания с PD-1 и CD19, экспрессируемыми на той же B клетке, соответственно.

[113] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[111], которое подавляет активацию Т-клеток (предпочтительно, Т-клеток памяти).

[114] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно предыдущему пункту [113], которое подавляет активацию Т-клеток путем связывания с CD19, экспрессируемым на B клетке, и PD-1, экспрессируемым на T клетке, соответственно.

[115] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[114], где PD-1 представляет собой PD-1 человека, и CD19 представляет собой CD19 человека, соответственно.

[116] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[115], где Биспецифическое антитело PD-1/CD19 представляет собой моноклональное антитело.

[117] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[116], где Биспецифическое антитело PD-1/CD19 представляет собой выделеннное антитело.

[1-1] Фармацевтическая композиция, содержащая Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[117], в качестве активного ингредиента.

[1-2] Фармацевтическая композиция в соответствии с предшествующим пунктом [1-1], дополнительно содержащая по меньшей мере фармацевтически приемлемый носитель.

[0012]

[2-1] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутоиммунного заболевания, содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[117] в качестве активного ингредиента.

[2-2] Агент в соответствии с предшествующим пунктом [2-1], где аутоиммунным заболеванием является болезнь Бехчета, системная красная волчанка, хроническая дискоидная красная волчанка, рассеянный склероз (системная склеродермия и прогрессирующий системный склероз), склеродермия, полимиозит, дерматомиозит, узелковый периартериит (узелковый полиартериит и микроскопический полиангиит), синдром аортита (артериит Такаясу), злокачественный ревматоидный артрит, ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, спондилоартрит, смешанное заболевание соединительной ткани, синдром Шегрена, болезнь Стилла у взрослых, васкулит, аллергический гранулематозный васкулит, гиперчувствительный васкулит, ревматоидный васкулит, васкулит крупных сосудов, ANCA-ассоциированный васкулит (например, гранулематоз с полиангиитом и эозинофильный гранулематоз с полиангиитом), синдром Когана, синдром RS3PE, височный артериит, ревматическая полимиалгия, фибромиалгия, синдром антифосфолипидных антител, эозинофильный фасциит, заболевания, связанные с IgG₄ (например, первичный склерозирующий холангит и аутоиммунный инсулит и т.д.), синдром Гийена-Барре, миастения, хронический атрофический гастрит, аутоиммунный гепатит, неалкогольный стеатогепатит, первичный билиарный цирроз, синдром Гудпастчера, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, мегалобластная анемия, аутоиммунная гемолитическая анемия, пернициозная анемия, аутоиммунная нейтропения, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, базедова болезнь (болезнь Грейвса (гипертиреоз)), болезнь Хашимото, аутоиммунная надпочечниковая недостаточность, первичный гипотиреоз, болезнь Аддисона (хронический гипоадренокортицизм), идиопатическая болезнь Аддисона, сахарный диабет I типа, медленно прогрессирующий сахарный диабет I типа (латентный аутоиммунный диабет у взрослых), очаговая склеродермия, псориаз, псориатический артрит, буллезный пемфигоид, пузырчатка, пемфигоид, гестационный герпес, линейный буллезный дерматоз IgA, приобретенный буллезный эпидермолиз, очаговая алопеция, витилиго, вульгарное витилиго, оптический нейромиелит, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, мультифокальная моторная нейропатия, саркоидоз, гигантоклеточный артериит, боковой амиотрофический склероз, болезнь Харада, аутоиммунная оптическая нейропатия, идиопатическая азооспермия, привычный аборт, воспалительное заболевание кишечника (например, язвенный колит и болезнь Крона), целиакия, анкилозирующий спондилит, тяжелая астма, хроническая крапивница, трансплантационный иммунитет, семейная средиземноморская лихорадка, эозинофильный хронический риносинусит, дилатационная кардиомиопатия, системный мастоцитоз или миозит с тельцами включения.

[2-3] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD), содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[117] в качестве активного ингредиента.

[2-4] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения сахарного диабета I типа, содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[117] в качестве активного ингредиента, и вводимый вместе с одним или несколькими лекарственными средствами, выбранными из инсулинового препарата (например, человеческий инсулин, инсулин гларгин, инсулин лизпро, инсулин детемир и инсулин аспарт и т.д.), сульфонилмочевинного агента (например, глибенкламид, гликлазид и глимепирид и т.д.), быстродействующего промотора секреции инсулина (например, натеглинид и т.д.), бигуанидинового препарата (например, метформин и т.д.), агента, улучшающего инсулинорезистентность (например, пиоглитазон и т.д.), ингибитора α-глюкозидазы (например, акарбоза и воглибоза и т.д.), терапевтического агента диабетической невропатии (например, эпалрестат, мексилетин и имидаприл и т.д.), препарата аналога GLP-1 (например, лираглутид, экзенатид и ликсисенатид и т.д.) и ингибитора DPP-4 (например, ситаглиптин, вилдаглиптин и алоглиптин и т.д.).

[2-5] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения рассеянного склероза, содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[117] в качестве активного ингредиента, и вводимый вместе с одним или несколькими лекарственными средствами, выбранными из стероидного агента (например, кортизона ацетат, гидрокортизон, фосфат гидрокортизона натрия, сукцинат гидрокортизона натрия, флудрокортизона ацетат, преднизолон, преднизолона ацетат, сукцинат преднизолона натрия, преднизолона бутилацетат, фосфат преднизолона натрия, галопредона ацетат, метилпреднизолон, метилпреднизолона ацетат, сукцинат метилпреднизолона натрия, триамсинолон, триамсинолона ацетат, триамсинолона ацетонид, дексаметазон, дексаметазона ацетат, фосфат дексаметазона натрия, дексаметазона пальмитат, параметазона ацетат и бетаметазон и т.д.), интерферона β-1a, интерферона β-1b, глатирамера ацетата, митоксантрона, азатиоприна, циклофосфамида, циклоспорина, метотрексата, кладрибина, адренокортикотропного гормона (ACTH), кортикотропина, мизорибина, такролимуса, финголимода и алемтузумаба.

[2-6] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения системной красной волчанки, содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[117] в качестве активного ингредиента, и вводимый вместе с одним или несколькими лекарственными средствами, выбранными из стероидного агента (например, стероидный агент, указанный в предшествующем пункте [2-5]), иммунодепрессанта (например, циклоспорин, такролимус и финголимод и т.д.) и белимумаба.

[2-7] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения ревматоидного артрита, содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[117] в качестве активного ингредиента, и вводимый вместе с одним или несколькими лекарственными средствами, выбранными из стероидного агента (например, стероидный агент, указанный в предшествующем пункте [2-5]), противоревматического агента (например, метотрексат, сульфасалазин, буцилламин, лефлуномид, мизорибин и такролимус и т.д.), антицитокинового агента (например, инфликсимаб, адалимумаб, тоцилизумаб, этанерцепт, голимумаб и цертолизумаб и т.д.) и абатацепта.

[2-8] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутоиммунного заболевания, содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [1]-[117] в качестве активного ингредиента, и вводимый вместе с одним или несколькими агентами, перечисленными в предшествующих пунктах от [2-4] до [2-7].

[2-9] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения заболеваний в соответствии с предшествующими пунктами от [2-4] до [2-8], вводимый пациенту, которому вводят одно или несколько лекарственных средств, перечисленных в предшествующих пунктах от [2-4] до [2-7].

[2-10] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения заболеваний в соответствии с предшествующими пунктами от [2-4] до [2-8], вводимый после приема одного или нескольких из лекарственных средств, перечисленных в предшествующих пунктах от [2-4] до [2-7].

[2-11] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения заболеваний в соответствии с предшествующими пунктами от [2-4] до [2-8], вводимый перед приемом одного или нескольких из лекарственных средств, перечисленных в предшествующих пунктах от [2-4] до [2-7].

[0013]

[3-1] Состав для внутривенной инъекции, содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117] и по меньшей мере фармацевтически приемлемый носитель.

[3-2] Состав для внутривенной инъекции в соответствии с предшествующим пунктом [3-1] для применения для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутоиммунного заболевания.

[3-3] Состав для внутривенной инъекции в соответствии с предшествующим пунктом [3-1] или [3-2], используемый для капельной инфузии.

[4-1] Выделеннный полинуклеотид или его фрагмент, кодирующий тяжелую цепь, имеющую VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, составляющего Биспецифическое антитело PD-1/CD19 согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117].

[4-2] Выделеннный полинуклеотид или его фрагмент, кодирующий VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, составляющего Биспецифическое антитело PD-1/CD19 согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117].

[4-3] Выделеннный полинуклеотид или его фрагмент в соответствии с предшествующим пунктом [4-1] или [4-2], где VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, кодируется полинуклеотидом, содержащим последовательность оснований, указанную в любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO:56-60 и SEQ ID NO:76-80.

[4-4] Выделеннный полинуклеотид или его фрагмент, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, указанную в любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO:56-60 и SEQ ID NO:76-80.

[5-1] Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов от [4-1] до [4-4].

[6-1] Животная клетка, в которую трансфицирован вектор экспрессии по предшествующему пункту [5-1], или которая была трансформирована тем же вектором.

[7-1] Способ предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутоиммунного заболевания, включающий введение пациенту эффективного количества биспецифического PD-1/CD19 антитела или его фрагмента антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117].

[8-1] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117] для применения для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутоиммунного заболевания.

[9-1] Применение биспецифического PD-1/CD19 антитела или его фрагмента антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117] для производства лекарственного средства для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутоиммунного заболевания.

[0014]

[10-1] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела, которое перекрестно конкурирует за связывание с CD19 с антителом, специфически связывающимся с CD19, имеющим VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25.

[10-2] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела, где связывание с CD19 с этим антителом или его фрагментом антитела перекрестно конкурирует с антителом, специфически связывающимся с CD19, имеющим VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25.

[10-3] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела, имеющее любую VH, выбранную из следующих:

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

VL, имеющую

(с) VL-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28.

[10-4] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела, имеющее любую VH, выбранную из следующих:

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

(с) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:49, и

VL, имеющую

(с) VL-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28,

где от одного до пяти произвольных аминокислотных остатков в любом одной или нескольких CDR, выбранных из VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 в VH, могут быть заменены на другие аминокислоты.

[10-5] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [10-1] до [10-4], имеющее VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 и SEQ ID NO:34, или VH, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности той же аминокислотной последовательности VH, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25.

[10-6] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [10-1] до [10-4], имеющее VH, содержащую аминокислотную последовательность, в которой глутамин в положении 114 в аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 и SEQ ID NO:34 был или может быть заменен на аргинин, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25.

[10-7] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [10-1]-[10-4], имеющее VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25.

[10-8] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [10-1]-[10-7], где CD19 представляет собой CD19 человека.

[10-9] Выделенное CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов [10-1]-[10-8], где анти-CD19 антитело представляет собой антитело IgG.

[10-10] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела в соответствии с предшествующим пунктом [10-9], где антитело IgG, описанное в предшествующем пункте [10-9], представляет собой антитело IgG₁ или антитело IgG₄.

[10-11] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела в соответствии с предшествующим пунктом [10-9], где антитело IgG, описанное в предшествующем пункте [10-9], представляет собой антитело IgG₁.

[10-12] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела в соответствии с предшествующим пунктом [10-9], где антитело IgG, описанное в предшествующем пункте [10-9], представляет собой антитело IgG₄.

[10-13] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [10-1] до [10-11], где в константном участке тяжелой цепи (1) лейцин в положении 351 был заменен на аспарагиновую кислоту и лейцин в положении 368 был заменен на глутаминовую кислоту или (2) как лейцин в положении 351, так и треонин в положении 366 в константном участке тяжелой цепи были заменены на лизин.

[10-14] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [10-1] до [10-13], дополнительно содержащее Gly (глицин), Gly-Lys-Lys-Ala (SEQ ID NO:67), Gly-Lys-Ala-Lys-Ala (SEQ ID NO:68), Gly-Arg-Arg-Ala (SEQ ID NO:69) или Gly-Arg-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO:70) на C-конце тяжелой цепи.

[10-15] Выделенное анти-CD19 моноклональное антитело или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [10-1] до [10-14], где тяжелые цепи имеют константные участки тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 и SEQ ID NO:75.

[11-1] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутореактивного заболевания, опосредованного В-клетками, содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117] в качестве активного ингредиента.

[11-2] Агент для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутореактивного заболевания, опосредованного В-клетками, в соответствии с предшествующим пунктом [11-1], где аутореактивное заболевание, опосредованное В-клетками, представляет собой системную красную волчанку, болезнь Грейвса, миастению, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тромбоцитопению, астму, криоглобулинемию, первичный склерозирующий холангит или злокачественную анемию.

[12-1] Агент для подавления аутореактивных В-клеток, содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117] в качестве активного ингредиента.

[12-2] Агент для подавления аутореактивных В-клеток в соответствии с предшествующим пунктом [12-1], где подавление аутореактивных В-клеток представляет собой подавление выработки иммуноглобулинов.

[12-3] Агент для подавления аутореактивных В-клеток в соответствии с предшествующим пунктом [12-2], где иммуноглобулин представляет собой IgG или IgM.

[13-1] Агент для подавления активации Т-клеток, содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117] в качестве активного ингредиента.

[13-2] Агент для подавления активации Т-клеток в соответствии с предшествующим пунктом [13-1], где подавление активации Т-клеток представляет собой подавление продукции цитокинов.

[13-3] Агент для подавления активации Т-клеток в соответствии с предшествующим пунктом [13-1] или [13-2], где подавление активации Т-клеток представляет собой активацию Т-клеток памяти.

[14-1] Способ подавления активации аутореактивных В-клеток или Т-клеток, включающий введение пациенту эффективного количества биспецифического PD-1/CD19 антитела или его фрагмента антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117].

[15-1] Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117] для применения для подавления аутореактивных В-клеток или активации Т-клеток.

[16-1] Применение биспецифического PD-1/CD19 антитела или его фрагмента антитела согласно любому из предшествующих пунктов от [1] до [117] для производства агента для подавления аутореактивных В-клеток или активации Т-клеток.

[Положительные эффекты изобретения]

[0015]

Биспецифическое антитело PD-1/CD19 по настоящему изобретению обеспечивает взаимодействие между PD-1 и PD-L1, и ожидается, что оно усилит или поддержит эффект предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или терапию аутоиммунного заболевания.

[0015]

[Краткое описание чертежей]

[0016]

[Фигура 1] На ней показаны аминокислотные последовательности VL и константный участок общей легкой цепи.

[Фигура 2] На ней показаны аминокислотные последовательности соответствующих CDR в VL общей легкой цепи.

[Фигура 3] На ней показаны аминокислотные последовательности, кодируемые генами V зародышевой линии: IGHV7-4-1 и IGHV5-51, соответственно.

[Фигура 4] На ней показано выравнивание последовательностей VH соответствующих клонов антител, специфически связывающихся с PD-1, (далее может быть сокращено как «анти-PD-1 антитело»), генами зародышевой линии IGHV7-4-1 и JH6c. На этой фигуре «-» в аминокислотных последовательностях клонов представляет собой ту же аминокислоту, что и в соответствующем гене зародышевой линии IGHV7-4-1 или JH6, и сокращенные названия аминокислот обозначают аминокислоты, отличные от аминокислот того же гена зародышевой линии.

[Фигура 5] На ней показано выравнивание последовательностей VH соответствующих клонов антител, специфически связывающихся с CD19 (далее может быть сокращено как «анти-CD19 антитело»), и аминокислотная последовательность, кодируемая геном зародышевой линии IGHV5-51. Каждый символ на этой фигуре имеет то же значение, что и на фигуре 4.

[Фигура 6] На ней показаны аминокислотные последовательности VH соответствующих клонов анти-PD-1 антитела.

[Фигура 7] На ней показаны соответствующие аминокислотные последовательности CDR в VH соответствующих клонов анти-PD-1 антитела.

[Фигура 8] На ней показаны аминокислотные последовательности VH соответствующих клонов анти-CD19 антитела.

[Фигура 9] На ней показаны соответствующие аминокислотные последовательности CDR в VH соответствующих клонов анти-CD19 антитела.

[Фигура 10] На ней показаны аминокислотные последовательности соответствующих константных участков тяжелой цепи биспецифического моноклонального PD-1/CD19 антитела.

[Фигура 11] На ней показаны результаты измерения Biacore, демонстрирующие активность связывания с PD-1 и CD19 соответствующих клонов биспецифических PD-1/CD19 антител.

[Фигура 12] На ней показаны данные проточной цитометрии, демонстрирующие свойства связывания с CD19 соответствующих клонов биспецифических PD-1/CD19 антител от CD19-1(Bi) до CD19-3(Bi), соответственно.

[Фигура 13] На ней показаны данные проточной цитометрии, демонстрирующие свойства связывания с CD19 соответствующих клонов биспецифических PD-1/CD19 антител CD19-4(Bi) и CD19-5(Bi), соответственно.

[Фигура 14] На ней показаны данные проточной цитометрии, демонстрирующие свойства связывания с PD-1 соответствующих клонов биспецифических PD-1/CD19 антител от CD19-1(Bi) до CD19-3(Bi), соответственно.

[Фигура 15] На ней показаны данные проточной цитометрии, демонстрирующие свойства связывания с PD-1 соответствующих клонов биспецифических PD-1/CD19 антител CD19-4(Bi) и CD19-5(Bi), соответственно.

[Фигура 16] На ней показаны данные проточной цитометрии, демонстрирующие свойства связывания с PD-1 и CD19 клона CD19-6(Bi) биспецифического PD-1/CD19 антитела, соответственно.

[Фигура 17] На ней показаны данные проточной цитометрии, демонстрирующие свойства одновременного связывания с PD-1 и CD19 соответствующих клонов биспецифических PD-1/CD19 антител, соответственно.

[Фигура 18] На ней показаны данные проточной цитометрии, демонстрирующие влияние на взаимодействие PD-1/PD-L1 соответствующих клонов биспецифических PD-1/CD19 антител, соответственно.

[Фигура 19] На ней показаны in vitro действие на продукцию IgM активированными человеческими В-клетками соответствующих клонов биспецифических PD-1/CD19 антител, соответственно. Следует учесть, что на этой фигуре «Контр.» обозначает контрольную группу.

[Фигура 20] На ней показаны in vivo действие на продукцию IgG₂ активированными человеческими В-клетками соответствующих клонов биспецифических PD-1/CD19 антител от CD19-1(Bi) до CD19-4(Bi), соответственно. Следует учесть, что на этой фигуре «Контр.» обозначает контрольную группу.

[Фигура 21] На ней показаны in vivo эффекты на продукцию IgG₂ активированными В-клетками человека клонов CD19-5(Bi) и CD19-6(Bi) биспецифических PD-1/CD19 антител, соответственно. Следует учесть, что на этой фигуре «Контр.» обозначает контрольную группу.

[Фигура 22] На ней показаны влияние на продукцию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови человека клона CD19-6(Bi) биспецифического PD-1/CD19 антитела. Следует учесть, что на этой фигуре «среда» обозначает контрольную группу.

[Описание вариантов осуществления изобретения]

[0017]

PD-1 (Programmed Cell Death-1) представляет собой белок человека мембранного типа, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной номером доступа в GenBank NP_005009. В настоящем описании термин «PD-1», если специально не определено иное, может использоваться в качестве значения, включающего все его изоформы и его дополнительные варианты, в которых эпитоп для «первого плеча, специфически связывающегося с PD-1» по настоящему изобретению был консервативным. В настоящем изобретении PD-1 представляет собой, предпочтительно, PD-1 человека.

[0018]

CD19 представляет собой мембранный белок человека на В-клетках, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной номером доступа в GenBank NP_001171569 или NP_001761, и молекулярного переносчика стимуляции в В-клетку вместе с рецепторным комплексом В-клетки. В настоящем описании термин «CD19», если специально не определено иное, может использоваться в качестве значения, включая его варианты, в которых эпитоп «второго плеча, специфически связывающегося с CD19» по настоящему изобретению, был консервативным. В настоящем изобретении CD19 представляет собой, предпочтительно, CD19 человека.

[0019]

В настоящем описании термин «изолят» означает преобразование в отдельный по существу чистый компонент путем идентификации, отделения и/или очистки от примесей, содержащих ряд или большое количество компонентов, экстрагированных из клеток-хозяев.

[0020]

В настоящем описании термин «моноклональное антитело» означает антитело, полученное из по существу гомогенной группы антител, связывающихся с одним и тем же специфическим антигеном.

[0021]

В настоящем описании термин «биспецифическое антитело» означает антитело, обладающее специфичностью связывания с двумя разными молекулами антигена или эпитопами на одной молекуле. Кроме того, термин «биспецифическое моноклональное антитело» означает биспецифическое антитело, полученное из по существу гомогенной группы антител.

[0022]

Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, способному специфически связываться с PD-1 и CD19, соответственно (в настоящем описании может быть сокращено как «Биспецифическое антитело PD-1/CD19»). В настоящем изобретении Биспецифическое антитело PD-1/CD19, предпочтительно, представляет собой биспецифическое моноклональное PD-1/CD19 антитело, более предпочтительно, выделеннное биспецифическое моноклональное PD-1/CD19 антитело и, более того, предпочтительно, выделеннное человеческое биспецифическое моноклональное PD-1/CD19 антитело. В данном документе «выделенное биспецифическое моноклональное PD-1/CD19 антитело человека» означает выделенное биспецифическое моноклональное антитело против PD-1 человека и CD19 человека.

[0023]

В настоящем документе примеры форм биспецифических антител включают диатело, биспецифическое sc(Fv)₂, биспецифическое мини-тело, биспецифическое F(abʼ)₂, биспецифическое гибридное антитело, ковалентное диатело (биспецифическое DART), биспецифическое (FvCys)₂, биспецифическое F(abʼ-зиппер)₂, биспецифическое (Fv-зиппер)₂, биспецифическое трехцепочечное антитело и биспецифическое mAb² и тому подобное.

[0024]

Диатело представляет собой димер одноцепочечных пептидов, в которых VH и VL, распознающие разные антигены, связаны друг с другом пептидным линкером (см. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993), Vol. 90, No. 14, pp. 6444-6448).

[0025]

Биспецифическое sc(Fv)₂ представляет собой низкомолекулярное антитело, модифицированное таким образом, что две пары VH/VL двух антител, распознающих разные антигены, связаны с пептидным линкером с образованием непрерывной одноцепочечной формы (см. J. Biological Chemistry (1994), 269: pp. 199-206).

[0026]

Биспецифическое F(abʼ)₂ представляет собой низкомолекулярное антитело, в котором Fabʼ-фрагменты антител, распознающих два разных антигена, ковалентно связаны дисульфидной связью или тому подобное.

[0027]

Биспецифическое мини-тело представляет собой низкомолекулярное антитело, в котором фрагменты низкомолекулярного антитела, модифицированные таким образом, что CH3 домены константного участка антител связаны с scFv, распознающим различные антигены, соответственно, ковалентно связаны дисульфидными связями или тому подобное на доменах CH3 (см. Biochemistry (1992), Vo. 31, No.6, pp. 1579-1584).

[0028]

Биспецифическое гибридное антитело представляет собой интактное антитело, в котором комплексы антитела тяжелая цепь/легкая цепь, распознающие два разных антигена, были ковалентно связаны друг с другом посредством дисульфидной связи или тому подобное.

[0029]

В настоящем изобретении видом биспецифического антитела предпочтительно является биспецифическое гибридное антитело.

[0030]

Биспецифическое гибридное антитело может быть получено из гибридомы, полученной, например, методом гибридной гибридомы (см. US 4474893). Альтернативно, биспецифическое гибридное антитело может быть получено путем совместной экспрессии клетками млекопитающих животных четырех видов кДНК, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь антитела, распознающего разные антигены, соответственно, и их секретирования.

[0031]

Моноклональные антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены гибридомным методом (см., например, Kohler and Milstein et al., Nature (1975), Vol. 256, p.495-97, Hongo et al., Hybridoma (1995), Vol. 14, No. 3, pp.253-260, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Vol. 2) и Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp.563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), методом рекомбинантной ДНК (см., например, US4816567), методом фагового дисплея (см., например, Ladner et al., US 5223409, US 5403484 и US5571698, Dower et al., US5427908 и US 5580717, McCafferty et al., US 5969108 и US6172197, и Griffiths et al., US 5885793, US 6521404, US 6544731, US 6555313, US 6582915 и US 6593081).

[0032]

Антитело или моноклональное антитело для введения человеку может быть получено в виде химерного антитела, гуманизированного антитела или полного антитела человека для снижения или устранения его антигенности.

[0033]

Термин «химерное антитело» означает антитело, в котором последовательность вариабельной области и последовательность константного участка получены от различных млекопитающих. Его примеры включают антитело, последовательность вариабельной области которого получена из мышиного антитела, а последовательность константного участка получена из человеческого антитела. Химерное антитело может быть получено путем связывания гена, кодирующего вариабельную область антитела, выделенного из продуцирующих антитело гибридом, выделенных вышеупомянутым гибридомным методом, методом рекомбинантной ДНК или методом фагового дисплея, с помощью хорошо известных методик, с геном, кодирующим константу область человеческого антитела с использованием хорошо известных методов (см., например, Cabilly et al., US4816567).

[0034]

Термин «гуманизированное антитело» означает антитело, последовательности определяющей комплементарность области (CDR) которого, происходят из зародышевой линии других млекопитающих, таких как мышь, были привиты в последовательности каркасного участка человека. Гуманизированное антитело также может быть получено путем связывания генов, кодирующих CDR антитела, выделенного из продуцирующих антитела гибридом, выделенных в соответствии с вышеупомянутым методом, хорошо известными методами, с геном, кодирующим каркасный участок антитела, полученного от человека, с использованием хорошо известные методы (см., например, Winter, US5225539 и US5530101; Queen et al., US5585089 и US6180370).

[0035]

Термин «человеческое антитело» или «полное человеческое антитело» означает антитело, в котором как вариабельные области, состоящие из каркасных участков и CDR участков, так и константные участки, происходят из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческое антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть получено способом с использованием мышей, трансформированных для продуцирования человеческого антитела, например мышей Humab (см., например, Lonberg и Kay et al. US5545806, US5569825, US5625126, US5633425, US5789650, US5877397, US5661016, US5814318, US5874299 и US5770429), мышей KM (см., например, Ishida et al., WO2002/43478), мышей Xeno (см., например, US5939598, US6075181, US6114598, US6150584 и US6162963) или мышей Tc (см., например, Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), pp.722-727). Его также можно получить с использованием мышей SCID, в которых были реконструированы человеческие иммунные клетки, так что при иммунизации возникает ответ человеческого антитела (см., например, Wilson et al., US5476996 и US5698767). Кроме того, человеческое антитело, используемое в настоящем изобретении, также может быть получено в соответствии с вышеупомянутым методом фагового дисплея.

[0036]

В настоящем описании термин «фрагмент антитела» биспецифического PD-1/CD19 антитела представляет собой часть полноразмерного антитела и представляет собой антитело, имеющее часть, связывающую антиген с PD-1, и часть, связывающую антиген с CD19. Его примеры включают F(ab′)₂ и тому подобное. В настоящем документе антигенсвязывающая часть означает минимальную единицу антитела, которая может связываться с его антигеном, например, она состоит из трех CDR в соответствующих VH и VL и каркасных участков для организации CDR, так что антиген-мишень может распознаваться комбинацией этих CDR.

[0037]

В настоящем описании термин «общая легкая цепь» означает легкую цепь, которая может быть связана с двумя или более различными тяжелыми цепями и может проявлять способность связывания с каждым антигеном (De Wildt RM, J. Mol. Biol. (1999), Vol. 285, pp.895-901, De Kruif et al., J. Mol. Biol. (2009), Vol. 387, pp.548-58, WO2004/009618, WO2009/157771 и WO2014/051433). Предпочтительные примеры таких общих легких цепей включают легкую цепь, кодируемую геном зародышевой линии человека κ легкой цепи IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (номенклатура базы данных IMGT) (далее может быть сокращена как «общая легкая цепь IGVK1-39/JK1»). Более предпочтительно, ее примеры включают легкую цепь, имеющую VL, имеющую CDR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, и ее дополнительные примеры включают легкую цепь, имеющую VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25. Кроме того, предпочтительные примеры константных участков общей легкой цепи включают константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29. Соответствующие аминокислотные последовательности VL и константный участок общей легкой цепи, используемые в настоящем изобретении, показаны на фигуре 1, и соответствующие аминокислотные последовательности CDR вариабельной области показаны на фигуре 2.

[0038]

В настоящем описании термин «изотип» означает класс антител (например, IgM или IgG) который кодируются генами константного участка тяжелой цепи. Изотип биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению, предпочтительно, представляет собой IgG, более предпочтительно, IgG₁ или IgG₄. В настоящем документе предпочтительным является IgG₁, связывание которого с рецептором Fc устранено или уменьшено. В частности, антитело IgG₁, связывание которого с рецептором Fc устранено или снижено, может быть получено путем замены, удаления или вставки произвольных аминокислот его константного участка тяжелой цепи. Его примеры включают антитело, в котором лейцин в положении 235 в соответствии с системой нумерации EU был заменен на глицин и/или глицин в положении 236 был заменен на аргинин в двух константных участках тяжелой цепи или их шарнирных областях, соответственно. Кроме того, чтобы снизить гетерогенность антитела, предпочтительным является антитело, в котором удалена аминокислота на С-конце, например, лизин в положении 447 в соответствии с системой нумерации EU. Кроме того, когда биспецифическое антитело представляет собой IgG₄, для подавления обмена в молекуле антитела более предпочтителен вариант, в котором произвольная аминокислота на его константном участке тяжелой цепи была был заменена, удалена или вставлена. Например, является предпочтительным антитело, в котором серин в положении 228 согласно системе нумерации ЕС, расположенном в шарнирной области, был заменен на пролин. Следует обратить внимание на то, что в настоящем описании положения аминокислот, приписанные CDR и каркас в вариабельных областях антитела, могут быть указаны в соответствии с системой нумерации Кабата (см. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md., (1987) и 1991)). Кроме того, аминокислоты в константном участке указаны в соответствии с системой нумерации EU согласно положениям аминокислот Кабата (см. Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242).

[0039]

В Fc-областях биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению могут быть заменены произвольные аминокислоты, так что две разные тяжелые цепи легко связываются друг с другом. Примеры его предпочтительных вариантов включают Биспецифическое антитело PD-1/CD19, в котором в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, лейцин в положении 351 в соответствии с системой нумерации EU был заменен на лизин и треонин в положении 366 был заменен на лизин, и в котором в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, лейцин в положении 351 был заменен на аспарагиновую кислоту и лейцин в положении 368 был заменен на глутаминовую кислоту. Кроме того, его примеры включают также Биспецифическое антитело PD-1/CD19, в котором в константном участке в тяжелой цепи, имеющей VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, лейцин в положении 351 в соответствии с системой нумерации EU был заменен на аспарагиновую кислоту и лейцин в положении 368 был заменен на глутаминовую кислоту, и в котором в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, лейцин в положении 351 был заменен на лизин и треонин в положении 366 был заменен на лизин.

[0040]

Первое плечо, специфически связывающееся с PD-1

В настоящем описании «первое плечо, специфически связывающееся с PD-1» (далее может быть сокращено как «первое плечо») означает часть антитела, имеющую по меньшей мере VH антитела специфически связывающуюся с PD-1, и способную специфически связываться с PD-1, независимо от того, содержится ли она в составе антитела или его фрагменте или существует не как часть, а как простая субстанция. Например, такое первое плечо состоит из VH анти-PD-1 антитела и VL общей легкой цепи, которые могут составлять одно и то же анти-PD-1 антитело, и другие их примеры также включают Fab антитела, имеющего такие же VH и VL. В настоящем документе термин «специфически связывающееся с PD-1» используется как признак прямого связывания с PD-1 с более высокой связывающей активностью, чем аффинность по крайней мере 1×10^-5 M, предпочтительно, 1×10^-7 M и, более предпочтительно, 1×10^-9 M (константа диссоциации (значение Kd)), и практически не связывается с какими-либо членами рецептора, принадлежащими так называемому рецептору семейства CD28, таким как по меньшей мере CD28, CTLA-4 и ICOS. Кроме того, термин «антитело» в выражении «антитело, специфически связывающееся с PD-1», или в «анти-PD-1 антитело» означает полноразмерное антитело, то есть полноразмерное антитело, состоящее из двух тяжелых цепей и двух легких цепей, связанных дисульфидными связями и, предпочтительно, моноклональное антитело.

[0041]

В настоящем документе примеры «первого плеча, специфически связывающегося с PD-1», включают такие, у которых VH имеет следующее:

(a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, представленную HYJ¹LH [где J¹ представляет собой G (глицин) или A (аланин), и другие буквенные обозначения представляют собой однобуквенные сокращенные названия аминокислот, соответственно],

(b) VH-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную WJ²NTNTU²NPTX²AQGFTG [где J² представляет собой L (лейцин) или I (изолейцин), U² представляет собой E (глутаминовая кислота) или G (глицин), X² представляет собой F (фенилаланин) или Y (тирозин), и другие буквенные обозначения являются такими же, как указано выше, соответственно], и

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную GDJ³VVPTTIWNYYU³X³MZ³V [где J³ представляет собой M (метионин) или L (лейцин), U³ представляет собой H (гистидин) или Y (тирозин), X³ представляет собой F (фенилаланин) или Y (тирозин), Z³ представляет собой D (аспарагиновую кислоту) или E (глутаминовая кислота), и другие буквенные обозначения являются такими же, как указано выше, соответственно].

[0042]

Кроме того, примеры других вариантов «первого плеча, специфически связывающегося с PD-1», включают такие, у которых имеется любая VH, выбранная из следующих:

(1b) VH, имеющая VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8,

(2b) VH, имеющая VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, и VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11,

(3b) VH, имеющая VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, и VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14,

(4b) VH, имеющая VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, и VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и

(5b) VH, имеющая VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, и VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20.

[0043]

Кроме того, примеры «первого плеча, специфически связывающегося с PD-1», по настоящему изобретению включают такие, в которых от одного до пяти произвольных аминокислотных остатков были заменены на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты) в соответствующих VH-CDR любой VH, выбранной из вышеуказанных от (1b) до (5b), и которые обладают практически такой же связывающей активностью с PD-1, что и исходное первое плечо, без каких-либо замен на те же аминокислоты. Их примеры включают такие, у которых один аминокислотный остаток в VH-CDR1 был заменен на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты), и от одного до пяти аминокислотных остатков в VH-CDR2 или VH-CDR3 были заменены на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты), соответственно. Кроме того, как показано на фигуре 4, в соответствующих CDR клонов анти-PD-1 антитела, соответствующих первым плечам, специфически связывающимся с PD-1, соответственно, аминокислоты, различающиеся между клонами или любой их комбинацией из множества, могут быть взаимозаменяемы между клонами. В настоящем документе замена консервативной аминокислотой означает возможность обмена с остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Например, группа аминокислот, имеющих алифатическую боковую цепь, включает глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, имеющих боковую алифатическую гидроксильную цепь, включает серин и треонин; группа аминокислот, имеющих боковую цепь, содержащую амид, включает аспарагин и глутамин; группа аминокислот, имеющих ароматическую боковую цепь, включает фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, имеющих основную боковую цепь, включает лизин, аргинин и гистидин; и группа аминокислот, имеющих серосодержащую боковую цепь, включает цистеин и метионин. Примеры предпочтительных замен консервативной аминокислотой включают замену между валином, лейцином и изолейцином, замену между фенилаланином и тирозином, замену между лизином и аргинином, замену между аланином и валином, а также замену между аспарагином и глутамином. Кроме того, в настоящем документе выражение «которые обладают по существу такой же связывающей активностью с PD-1, что и у исходного первого плеча, без каких-либо замен аминокислотами», упомянутое выше, означает, что активность связывания с PD-1 первого плеча, замененного на те же аминокислоты, составляет 95% или более, предпочтительно, 98% или более и, более предпочтительно, 99% или более по сравнению с исходным первым плечом без каких-либо замен на те же аминокислоты.

[0044]

Кроме того, примеры «первого плеча, специфически связывающегося с PD-1», по настоящему изобретению включают такие, которые имеют VH, которая содержит соответствующие VH-CDR, имеющие указанные выше специфические аминокислотные последовательности, и у которых аминокислотная последовательность каркасного участка кодируется конкретным геном зародышевой линии или ее геном с соматической мутацией(ями). Например, VH, представленная любой выбранной из вышеуказанных от (1b) до (5b), может кодироваться рекомбинантным геном VDJ или его геном с соматической мутацией(ями), где ген V зародышевой линии представляет собой IGHV7-4-1, а ген J зародышевой линии представляет собой JH6c. В настоящем документе аминокислотная последовательность, кодируемая геном V зародышевой линии IGHV7-4-1, соответствует последовательности, представленной как SEQ ID NO:21 (фигура 3).

[0045]

Каркасный участок в VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, по настоящему изобретению может кодироваться рекомбинантным геном VDJ зародышевой линии с соматической мутацией(ями). Например, поскольку FR1, FR2 и FR3 в VH, представленной любой из указанных выше от (1b) до (5b), где геном V зародышевой линии является IGHV7-4-1, отличаются от аминокислотной последовательности, кодируемой геном IGHV7-4-1 в положении аминокислоты, показанной на фигуре 4, они претерпели соматические мутации в соответствующих положениях. Например, что касается области FR1, в аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:21, лизин в положении 13 может быть заменен на глутамин, аланин в положении 16 может быть заменен на валин или лизин в положении 19 может быть заменен на метионин, соответственно, или может быть произведена замена на произвольную комбинацию их совокупности. Что касается области FR2, валин в положении 37 в аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:21, может быть заменен на лейцин. Что касается области FR3, в аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:21, серин в положении 77 может быть заменен на треонин или цистеин в положении 84 может быть заменен на серин или аспарагин, соответственно, или может быть произведена замена на произвольную комбинацию их совокупности. Кроме того, что касается области FR4 VH, представленной любым из указанных выше от (1b) до (5b), в аминокислотной последовательности (Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Val-Ser-Ser) (SEQ ID NO:41) области FR4, полученного из J гена JH6c, лизин (Lys) может быть заменен на глутамин или аспарагин и/или треонин (Thr), отмеченный звездочкой, может быть заменен на лейцин. Соответствующие FR1, FR2, FR3 и FR4, имеющие комбинацию любых аминокислотных замен, упомянутых выше, не оказывают существенного влияния на функции первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, и могут использоваться в качестве каркаса.

[0046]

Кроме того, примеры «первого плеча, специфически связывающегося с PD-1», по настоящему изобретению включают также такие, которые имеют соответствующие CDR, имеющие аминокислотную последовательность, указанную выше, и в которых аминокислотные последовательности FR в VH кодируются конкретным геном зародышевой линии или ее геном с соматической мутацией(ями). Примеры таких первых плеч включают такие, которые имеют VH, содержащую аминокислотную последовательность любой из последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 1-5.

[0047]

Кроме того, примеры таких «первых плеч, специфически связывающихся с PD-1» также включают такие, которые имеют VH, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности, предпочтительно, по меньшей мере 90% идентичности, более предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичности, кроме того, предпочтительно, по меньшей мере 98% идентичности и, еще более предпочтительно, по меньшей мере 99% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-5, и в которой отличие от аминокислотной последовательности VH исходного первого плеча не оказывает существенного влияния на активность связывания с PD-1 (далее может быть сокращено как «гомологичное первое плечо»). В настоящем документе термин «% идентичности», используемый для сравнения идентичности аминокислотных последовательностей, определяется как процент аминокислотной последовательности, идентичной эталонной аминокислотной последовательности (в настоящем документе, когда это необходимо для максимизации идентичности последовательности, эталонная аминокислота последовательность, в которой был введен пробел), когда две последовательности выровнены. Кроме того, в настоящем документе, выражение «отличие от аминокислотной последовательности VH исходного первого плеча не оказывает существенного влияния на активность связывания с PD-1» означает, что активность связывания с PD-1 гомологичного первого плеча составляет 95% или более, предпочтительно, 98% или более и, более предпочтительно, 99% или более по сравнению с исходным первым плечом.

[0048]

В еще одном варианте осуществления изобретения «первое плечо, специфически связывающееся с PD-1» по настоящему изобретению, также включает такие, которые имеют вариабельную область (в настоящем документе вариабельная область содержит составляющие ее VH и VL) анти-PD-1 антитела, перекрестно конкурирующую за (1) связывание с PD-1 с первым плечом, имеющим VH, представленную любым из указанных выше от (1b) до (5b), или VH, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-5, и VL общей легкой цепи по настоящему описанию (предпочтительно, VL, содержащая аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:25), или (2) связывание с PD-1 с вариабельной областью моноклонального антитела, специфически связывающегося с PD-1, имеющим такие же VH и VL, и, кроме того, включает такие, которые имеют вариабельную область анти-PD-1 антитела, с которой связывание с PD-1 перекрестно конкурирует с (3) первым плечом, имеющим VH, представленную любой группой, выбранной из вышеупомянутых от (1b) до (5b), или VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1-5 и ту же VL общей легкой цепи, или (4) вариабельную область моноклонального антитела, специфически связывающегося с PD-1, имеющую те же VH и VL. В настоящем документе выражение «перекрестная конкуренция за связывание с PD-1» означает ингибирование связывания первого плеча с PD-1, независимо от степени, путем связывания с эпитопом, который является таким же или частично перекрывается с эпитопом первого плеча, приведенного в качестве примера в настоящем описании, или что связывание с PD-1 антитела, связывающегося с эпитопом, является таким же или частично перекрывается с таковым в приведенном в качестве примера первом плече, ингибируется тем же проиллюстрированным первым плечом, независимо от его степени. Конкурирует ли перекрестно или нет, можно оценить с помощью анализа конкурентного связывания. Например, его можно определить с помощью анализа Biacore, анализа ELISA, проточной цитометрии, иммуноферментного анализа (ELISA), метода передачи энергии флуоресценции (FRET) и технологии флуориметрического анализа микрообъемов (FMAT (зарегистрированная торговая марка)).

[0049]

Примеры перекрестной конкуренции первого плеча за связывание с PD-1 первым плечом, имеющим VH, представленную вышеупомянутым (5b), и VL общей легкой цепи, включают первое плечо, имеющее VH, представленную любой выбранной из от (1b) до (4b), и VL общей легкой цепи (предпочтительно, VL, имеющую VL-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, VL-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27, и VL-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28), и, кроме того, первое плечо, имеющее VH, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-4, и VL общей легкой цепи (предпочтительно, VL, содержащая аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID No: 25). [0050]

Кроме того, примеры первого плеча, перекрестно конкурирующего за связывание с PD-1, с первым плечом, имеющим VH, представленную любой из указанных выше от (1b) до (4b), или VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1-4, и VL общей легкой цепи, включают первое плечо, имеющее VH, представленную вышеупомянутым (5b), и VL общей легкой цепи (предпочтительно, VL, имеющая VL-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, VL-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27, и VL-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28), и, кроме того, первое плечо, имеющее VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и VL общей легкой цепи (предпочтительно, VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25).

[0051]

В настоящем документе предпочтительные примеры «первого плеча, специфически связывающегося с PD-1», по настоящему изобретению включают первое плечо, имеющее VH, представленную любой из указанных выше от (1b) до (5b). Кроме того, как указано выше, предпочтительные примеры первого плеча включают также такие, у которых от одного до пяти произвольных аминокислотных остатков VH были заменены на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты) в соответствующих CDR, и эти замены существенно не влияют на связывающую активность с PD-1. Кроме того, как указано выше, они также включают такие, которые имеют VH, в которой аминокислотные последовательности каркаса кодируются геном IGHV7-4-1 зародышевой линии или геном JH6c или их генами с соматической мутацией(ями). Далее, более предпочтительно примеры первого плеча включают такие, которые имеют VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1-5.

[0052]

Кроме того, «первое плечо, специфически связывающееся с PD-1», по настоящему изобретению предпочтительным является таким, которое имеет VL общей легкой цепи по настоящему описанию, и такая общая легкая цепь, предпочтительно, представляет собой общую легкую цепь IGVK1-39/JK1. Более предпочтительным примером является легкая цепь, имеющая VL, имеющую CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, и еще одним предпочтительным примером этого является легкая цепь, содержащая VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25. Кроме того, предпочтительные примеры константных участков общей легкой цепи включают константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29.

[0053]

Кроме того, «первое плечо, специфически связывающееся с PD-1», предпочтительным представляет собой плечо, которое обеспечивает взаимодействие между PD-1 и PD-L1, взаимодействие между PD-1 и PD-L2 или оба эти взаимодействия. В настоящем документе выражение «обеспечение взаимодействия между PD-1 и PD-L1, взаимодействия между PD-1 и PD-L2 или оба эти взаимодействия» означает, что, даже когда имеется Биспецифическое антитело PD-1/CD19 по настоящему изобретению в 20-кратном избытке по сравнению с концентрацией растворимой формы PD-L1 или PD-L2, взаимодействие между PD-L1 и PD-1, взаимодействие между PD-L2 и PD-1 или оба эти взаимодействия поддерживается на 50% или более, предпочтительно, на 70% или более и, более предпочтительно, на 80% или более, по сравнению с таковыми, когда нет биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению. Кроме того, определение «обеспечение взаимодействия между PD-1 и PD-L1, взаимодействия между PD-1 и PD-L2 или оба эти взаимодействия» может иметь то же значение, что и выражение «который по существу не ингибирует взаимодействие между PD-1 и PD-L1, взаимодействие между PD-1 и PD-L2 или оба этих взаимодействия».

[0054]

Отношения соответствия между соответствующими клонами моноклонального анти-PD-1 антитела, полученными для конструирования биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению, и их аминокислотными последовательностями VH и их номерами SEQ ID показаны на фигуре 6. Отношения соответствия между аминокислотными последовательностями CDR в VH соответствующих клонов моноклонального анти-PD-1 антитела и их номером SEQ ID показаны на фигуре 7.

[0055]

Второе плечо, специфически связывающееся с CD19

В настоящем описании «второе плечо, специфически связывающееся с CD19» (далее может быть сокращено как «второе плечо»), означает часть антитела, имеющую по меньшей мере VH антитела, специфически связывающуюся с CD19, и способную специфически связываться с CD19, независимо от того, содержится ли она в составе антитела или его фрагменте или существует не как часть, а как простая субстанция. Например, такое второе плечо состоит из VH анти-CD19 антитела и VL общей легкой цепи, которые могут составлять одно и то же анти-CD19 антитело, и, кроме того, его примеры включают Fab-часть антитела, включающую те же VH и VL. В настоящем документе выражение «специфически связываться с CD19» используется как признак прямого связывания с CD19 с более высокой связывающей активностью, чем по меньшей мере аффинность 1×10^-5 M, предпочтительно, 1×10^-7 M и, более предпочтительно, более чем 1×10^-9 M (константа диссоциации (значение Kd)), и по существу не связывается ни с какими другими белками. Кроме того, термин «антитело» в выражении «антитело, специфически связывающееся с CD19», или в выражении «анти-CD19 антитело» означает полноразмерное антитело, состоящее из двух тяжелых цепей и двух легких цепей, связанных дисульфидными связями и, предпочтительно, его моноклональное антитело.

[0056]

В настоящем документе примеры «второго плеча, специфически связывающегося с CD19», включают такие, которые имеют VH, имеющую (a) VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SYWIJ⁴ [где J⁴ представляет собой G (глицин) или A (аланин), и другие буквенные обозначения представляют собой однобуквенные сокращенные названия аминокислот, соответственно], (b) VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную IIU⁴PGDSDTRYSPSFQG [где U⁴ представляет собой W (триптофан) или Y (тирозин), или другие буквенные обозначения являются такими же, как указано выше, соответственно], и (c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную X⁴TIVZ⁴J⁵U⁵X⁵Z⁵AJ⁶DU⁶ [где X⁴ представляет собой K (лизин), Q (глутамин), H (гистидин) или R (аргинин), Z⁴ представляет собой G (глицин) или A (аланин), J⁵ представляет собой T (треонин) или V (валин), U⁵ представляет собой V (валин), I (изолейцин) или T (треонин), X⁵ представляет собой M (метионин), Y (тирозин), G (глицин) или H (гистидин), Z⁵ представляет собой T (треонин), N (аспарагин), L (лейцин) или W (триптофан), J⁶ представляет собой F (фенилаланин) или S (Серин), и U⁶ представляет собой I (изолейцин), F (фенилаланин) или Y (тирозин) и другие буквенные обозначения являются такими же, как указано выше, соответственно].

[0057]

Кроме того, примеры других вариантов «второго плеча, специфически связывающегося с CD19», включают такие, в которых имеется любая VH, выбранная из следующих:

(1d) VH, имеющая VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35, VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:36, и VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37,

(2d) VH, имеющая VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38, VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:39, и VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:40,

(3d) VH, имеющая VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:41, VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:42, и VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:43,

(4d) VH, имеющая VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:44, VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:45, и VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:46, и

(5d) VH, имеющая VH-CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, VH-CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:48, и VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:49.

[0058]

Кроме того, примеры «второго плеча, специфически связывающегося с CD19», по настоящему изобретению включают также такие, в которых от одного до пяти произвольных аминокислотных остатков были заменены на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты) в соответствующих VH-CDR любой VH, выбранной из вышеуказанных от (1d) до (5d), и которые обладают практически такой же связывающей активностью с CD19, что и исходное второе плечо, без каких-либо замен на те же аминокислоты. Их примеры включают такие, у которых один аминокислотный остаток в VH-CDR1 был заменен на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты), и от одного до пяти аминокислотных остатков в VH-CDR2 или VH-CDR3 были заменены на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты), соответственно. Кроме того, как показано на фигуре 5, в соответствующих CDR клонов анти-CD19 антитела, соответствующих первым плечам, специфически связывающимся с CD19, соответственно, аминокислоты, различающиеся между клонами или любой их комбинацией из множества, могут быть взаимозаменяемы между клонами. В настоящем документе выражение «которые обладают практически такой же связывающей активностью с CD19, что и исходное второе плечо, без каких-либо замен на те же аминокислоты», упомянутое выше, означает, что активность связывания с CD19 второго плеча, замененного на те же аминокислоты, составляет 95% или более, предпочтительно, 98% или более и, более предпочтительно, 99% или более по сравнению с исходным вторым плечом без каких-либо замен на те же аминокислоты. Следует обратить внимание на то, что примеры «замены консервативными аминокислотами» в соответствующих VH-CDR второго плеча включают в себя аминокислотные замены в первом плече, упомянутые выше.

[0059]

Кроме того, «второе плечо, специфически связывающееся с CD19», по настоящему изобретению также включает такие, которые имеют VH, которая содержит соответствующие CDR, содержащие вышеупомянутую специфическую аминокислотную последовательность, и из которых аминокислотные последовательности FR кодируются конкретным геном зародышевой линии или ее геном с соматической мутацией(ями). Например, любая из VH, выбранная из вышеупомянутых от (1d) до (5d) может быть кодирована рекомбинантным геном VDJ или геном с соматической мутацией(ами), в которой ген V зародышевой линии представляет собой IGHV5-51. В настоящем документе аминокислотная последовательность, кодируемая V геном IGHV5-51 зародышевой линии, соответствует аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:22 (фигура 3).

[0060]

Каркас в VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, по настоящему изобретению могут быть кодированы рекомбинантным геном VDJ зародышевой линии с соматической мутацией(ями). Например, поскольку FR1 и FR3 в VH, представленной любой из указанных выше от (1d) до (5d), где V геном зародышевой линии является IGHV5-51, отличаются от аминокислотной последовательности, кодируемой геном IGHV5-51, в положении аминокислоты, показанной на фигуре 5, они претерпели соматические мутации в тех же соответствующих положениях. Например, что касается области FR1, в аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:22, глутаминовая кислота в положении 1 может быть заменена на глутамин, пролин в положении 14 может быть заменен на серин, тирозин в положении 27 может быть заменен на фенилаланин или треонин в положении 30 может быть заменен на изолейцин, соответственно, или может быть произведена замена на произвольную комбинацию их совокупности. Что касается области FR3, в аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:22, изолейцин в положении 76 может быть заменен на фенилаланин или серин в положении 77 может быть заменен на треонин или аспарагин, треонин в положении 78 может быть заменен на валин, серин в положении 84 может быть заменен на аспарагин, метионин в положении 93 может быть заменен на изолейцин или лейцин или аланин в положении 97 может быть заменен на валин, соответственно, или может быть произведена замена на произвольную комбинацию их совокупности. Соответствующие FR1 и FR3, имеющие комбинацию любых аминокислотных замен, упомянутых выше, не оказывают существенного влияния на функции второго плеча, специфически связывающегося с CD19, и могут использоваться в качестве каркаса.

[0061]

Кроме того, примеры «второго плеча, специфически связывающегося с CD19», по настоящему изобретению включают также такие, которые имеют VH, которая содержит соответствующие CDR, имеющие конкретную аминокислотную последовательность, указанную выше, и в которых аминокислотные последовательности FR кодируются конкретным геном зародышевой линии или ее геном с соматической мутацией(ями). Примеры таких вторых плеч включают такие, которые имеют VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30-34.

[0062]

Кроме того, примеры таких «вторых плеч, специфически связывающихся с CD19», включают также такие, которые имеют VH, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 98% и, кроме того, предпочтительно, по меньшей мере 99% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO:30-34, и в которой отличие от аминокислотной последовательности VH исходного второго не оказывает существенного влияния на активность связывания с CD19 (далее может быть сокращено как «гомологичное второе плечо»). В настоящем документе выражение «отличие от аминокислотной последовательности VH исходного второго плеча не оказывает существенного влияния на активность связывания с CD19» означает, что активность связывания гомологичного второго плеча с CD19 составляет 95% или более, предпочтительно 98% или более, и более предпочтительно 99% или более по сравнению с исходным вторым плечом.

[0063]

В еще одном варианте осуществления изобретения примеры «второго плеча, специфически связывающегося с CD19», по настоящему изобретению включают также такие, которые имеют вариабельную область (в настоящем документе вариабельная область содержит составляющие ее VH и VL) анти-CD19 антитела, перекрестно конкурирующую за (1) связывание с CD19 со вторым плечом, имеющим VH, представленную любой из указанных выше от (1d) до (5d), или VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30-34, и VL общей легкой цепи по настоящему описанию (предпочтительно, VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25), или (2) связывание с CD19 с вариабельной областью моноклонального антитела, специфически связывающегося с CD19, имеющую те же VH и VL, и, кроме того, включают такие, которые имеют вариабельную область анти-CD19 антитела, с которой связывание с CD19 перекрестно конкурирует со (3) вторым плечом, имеющим VH, представленную любой из указанных выше от (1d) до (5d), или VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30-34 и ту же VL общей легкой цепи, или (4) вариабельную область моноклонального антитела, специфически связывающегося с CD19, имеющую те же VH и VL. В настоящем документе выражение «перекрестная конкуренция за связывание с CD19» означает ингибирование связывания второго плеча с CD19, независимо от степени, путем связывания с эпитопом, который является таким же или частично перекрывается со вторым плечом, приведенным в качестве примера в настоящем описании, или что связывание с CD19 антитела, связывающегося с эпитопом, которое является таким же или частично перекрывается с таковым в приведенном в качестве примера вторым плечом, ингибируется тем же примером второго плеча, независимо от его степени. В настоящем документе конкурирует ли с перекрестной конкуренцией или нет, можно аналогичным образом оценить в соответствии с тем же методом, который описан относительно «первого плеча, специфически связывающегося с PD-1».

[0064]

В настоящем документе предпочтительные примеры «второго плеча, специфически связывающегося с CD19», по настоящему изобретению включают второе плечо, имеющее VH, представленную любой из указанных выше от (1d) до (5d). Кроме того, как указано выше, предпочтительные примеры второго плеча включают также такие, у которых от одного до пяти произвольных аминокислотных остатков VH были заменены на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты) в соответствующих CDR, и эти замены существенно не влияют на связывающую активность с CD19. Кроме того, как указано выше, примеры второго плеча включают такие, которые имеют VH, в которых аминокислотные последовательности каркаса кодируются геном IGHV5-51 зародышевой линии или ее геном с соматической мутацией(ями). Далее, более предпочтительно, примеры второго плеча включают такие, которые имеют VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30-34.

[0065]

Кроме того, примеры других предпочтительные вариантов «второго плеча, специфически связывающегося с CD19», по настоящему изобретению включают второе плечо, имеющее VH, содержащую любую из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:30-34, в которых глутамин в положении 114 был или может быть заменен на аргинин, более предпочтительно, второе плечо, имеющее VH, содержащую любую из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:30-34, в которых глутамин в положении 114 был заменен на аргинин, что соответствует второму плечу, имеющему VH, содержащую любую из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:62-66, соответственно. Эти аминокислотные замены могут увеличивать изоэлектрическую точку (значение pI) комплекса, состоящего из тяжелой цепи и легкой цепи, имеющего второе плечо (далее комплекс второе плечо-тяжелая цепь/легкая цепь), и тем самым упрощать отделение биспецифических антитела, в частности, от гомодимеров, состоящих из комплексов второе плечо-тяжелая цепь/легкая цепь, в процессе очистки биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению. Изоэлектрическая точка для комплекса второе плечо-тяжелая цепь/легкая цепь предпочтительно составляет между около 8,3 и около 8,9 и, более предпочтительно, между около 8,4 и около 8,8. И изоэлектрическая точка для комплекса, состоящего из тяжелой цепи и легкой цепи, имеющего первое плечо (далее комплекс первое плечо-тяжелая цепь/легкая цепь) предпочтительно составляет между около 7,4 и около 7,7, и более предпочтительно, между около 7,5 и около 7,6.

[0066]

«Второе плечо, специфически связывающееся с CD19», по настоящему изобретению предпочтительно является таким, у которого имеется общая легкая цепь по настоящему описанию, и такая общая легкая цепь, предпочтительно, представляет собой общую легкую цепь IGVK1-39/JK1. Более предпочтительным ее примером является легкая цепь, имеющая VL, имеющую CDR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, и ее дополнительным предпочтительным примером является легкая цепь, имеющая VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25. Кроме того, предпочтительные примеры константного участка общей легкой цепи включают константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29.

[0067]

Здесь и далее отношения соответствия между соответствующими клонами анти-CD19 антитела для конструирования биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению и их аминокислотными последовательностями VH и их номерами SEQ ID показаны на фигуре 8. Отношения соответствия между соответствующими аминокислотными последовательностями CDR в VH соответствующих клонов анти-CD19 антитела и их номером SEQ ID показаны на фигуре 9.

[0068]

С другой стороны, примеры предпочтительных вариантов биспецифических PD-1/CD19 антител по настоящему изобретению включают такие, в которых первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, имеет

(A) VH, в которой от одного до пяти произвольных аминокислотных остатков могут быть заменены на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты) в любом одном или нескольких CDR, выбранных из VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, в VH, представленной любой из указанных выше от (1b) до (5b), и

(B) VL, имеющую CDR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, и

второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеет

(C) VH, в которой от одного до пяти произвольных аминокислотных остатков могут быть заменены на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты) в любом одном или нескольких CDR, выбранных из VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, в VH, представленной любой из указанных выше от (1d) до (5d), и

(D) VL, имеющую CDR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28.

[0069]

Более предпочтительно примеры биспецифических PD-1/CD19 антител по настоящему изобретению включают такие, в которых первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, имеет

(A) VH, представленную любой из указанных выше от (1b) до (5b), и

(C) VH, представленную любой из указанных выше от (1d) до (5d), и

[0070]

Кроме того, примеры других предпочтительных вариантов биспецифических PD-1/CD19 антител по настоящему изобретению включают такие, в которых первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, имеет

(A) VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1-5, или VH, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности с той же аминокислотной последовательностью VH, и

(B) VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и

(C) VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30-34 и 62-66, или VH, содержащую аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% такой же аминокислотной последовательности VH, и

(D) VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25.

[0071]

Другие более предпочтительно примеры включают Биспецифическое антитело PD-1/CD19, в котором первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, имеет

(A) VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1-5, и

(C) VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30-34 и 62-66, и

[0072]

Кроме того, другие более предпочтительные примеры включают Биспецифическое антитело PD-1/CD19, в котором первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, имеет

где второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеет

(C) VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:62-66, и

[0073]

Изотип биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению, предпочтительно, представляет собой антитело IgG, более предпочтительно, антитело IgG₁ или антитело IgG₄ и, более того, предпочтительно, антитело IgG₁. Когда антитело представляет собой антитело IgG₁, предпочтительным является антитело IgG₁, в котором лейцин в положении 235 в соответствии с системой нумерации EU был заменен на глицин и/или глицин в положении 236 был заменен на аргинин в двух константных участках тяжелой цепи или их шарнирных областях. Кроме того, предпочтительным является биспецифическое антитело, из которого удалены С-концевые аминокислоты тяжелых цепей, например, лизин в положении 447 в соответствии с системой нумерации EU. Кроме того, когда Биспецифическое антитело PD-1/CD19 представляет собой антитело IgG₄, предпочтительным является антитело, в котором серин в положении 228 в соответствии с системой нумерации EU, расположенный в шарнирной области, был заменен на пролин.

[0074]

Кроме того, когда Биспецифическое антитело PD-1/CD19 представляет собой антитело IgG₁, примеры его предпочтительных вариантов включают такие, в которых в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, лейцин в положении 351 в соответствии с системой нумерации EU был заменен на лизин и треонин в положении 366 был заменен на лизин, и в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, лейцин в положении 351 был заменен на аспарагиновую кислоту и лейцин в положении 368 был заменен на глутаминовую кислоту. Кроме того, также предпочтительным является антитело IgG₁, в котором в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, лейцин в положении 351 в соответствии с системой нумерации EU был заменен на аспарагиновую кислоту и лейцин в положении 368 был заменен на глутаминовую кислоту и в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, лейцин в положении 351 был заменен на лизин и треонин в положении 366 был заменен на лизин.

[0075]

Примеры предпочтительных вариантов IgG₁ биспецифического PD-1/CD19 антитела, в котором имеются все вышеупомянутые аминокислотные замены в константном участке тяжелой цепи включают такие, в которых тяжелая цепь, имеющая VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23, и тяжелая цепь, имеющая VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, имеет константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:24 и SEQ ID NO:71-75. Примеры этих аминокислотных последовательностей представлены на фигуре 10.

[0076]

В настоящем документе тяжелая цепь, имеющая VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, может дополнительно содержать Gly (глицин), Gly-Lys-Lys-Ala (SEQ ID NO:67), Gly-Lys-Ala-Lys-Ala (SEQ ID NO:68), Gly-Arg-Arg-Ala (SEQ ID NO:69) или Gly-Arg-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO:70), посредством связывания амида с его C-концевой аминокислотой на своем С-конце. Добавление аминокислоты или пептида может увеличить изоэлектрическую точку (значение pI) комплекса второе плечо-тяжелая цепь/легкая цепь, и тем самым упростить отделение биспецифических PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению, в частности, от гомодимеров, состоящих из комплексов второе плечо-тяжелая цепь/легкая цепь, как и в случае замены аминокислоты в VH второго плеча, упомянутой выше. Следует отметить, что изоэлектрическая точка по отношению ко второму комплексу тяжелой цепи/легкой цепи, к С-концу которого была добавлена аминокислота или пептид, предпочтительно, составляет от примерно 8,3 до примерно 8,9 и, более предпочтительно, от примерно 8,4 до около 8,8.

[0077]

Примеры наиболее предпочтительных вариантов биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению включают клоны CD19-1(Bi), CD19-2(Bi), CD19-3(Bi), CD19-4(Bi) и CD19-5(Bi), полученные способом, описанным в примере 12 настоящего описания, а также клон CD19-6(Bi), полученный способом, описанным в примере 13.

[0078]

Примеры предпочтительных свойств биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению включают обеспечение взаимодействия между PD-1 и PD-L1, взаимодействия между PD-1 и PD-L2 или оба эти взаимодействия. В настоящем документе выражение «обеспечение взаимодействия между PD-1 и PD-L1, взаимодействия между PD-1 и PD-L2 или оба эти взаимодействия» означает то же, что описано в описаниях, касающихся «первого плеча, специфически связывающегося с PD-1».

[0079]

Кроме того, примеры предпочтительных свойств биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению включают значительное снижение продукции цитокинов. В настоящем документе выражение «достаточное снижение продукции цитокинов» означает, что, например, в процессе внутривенного введения или через 24 часа после этого введения путем капельной инфузии биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению, например, концентрация цитокина в том числе IL-2, IFN-γ и/или TNF-α в крови или тканях не увеличиваются или, даже если они повышаются, они достигают такой степени, что их можно подавить введением стероидов.

[0080]

Кроме того, примеры предпочтительных свойств биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению включают подавляющий эффект против активации Т-клеток (например, Т-клеток памяти). Подавляющий эффект можно оценить как подавляющий эффект против продукции цитокинов (например, IL-2).

[0081]

Способ производства и очистки биспецифического PD-1/CD19 антитела

Биспецифическое антитело PD-1/CD19 и его фрагмент антитела по настоящему изобретению также можно получить способом, описанным в WO2014/051433, WO2013/157953 или WO2013/157954.

[0082]

В частности, Биспецифическое антитело PD-1/CD19 и его фрагмент антитела по настоящему изобретению может быть получено путем переноса гена экспрессирующего вектора, в котором (1) полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, имеющую VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, (2) полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, имеющую VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, и (3) полинуклеотид, кодирующий общую легкую цепь, был вставлен, соответственно, в клетки животных млекопитающих для их трансформации, и затем, заставляя их экспрессировать и секретировать как тяжелую цепь, так и общую легкую цепь.

[0083]

В настоящем документе для экспрессии биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению можно использовать любые клетки-хозяева при условии, что они могут быть перенесены генами, переносимыми векторами экспрессии. Предпочтительные примеры клеток-хозяев включают клетки насекомых, такие как SF-9 и SF-21, более предпочтительно, клетки млекопитающих, такие как клетки мыши, включая клетки CHO, клетки BHK, клетки SP2/0 и клетки миеломы NS-0, клетки приматов, такие как клетки COS и Vero, и клетки MDCK, клетки BRL 3A, гибридомы, опухолевые клетки, иммортализованные первичные клетки, W138, HepG2, HeLa, HEK293, HT1080 и эмбриональные клетки сетчатки, такие как PER.C6 и тому подобное. Следует отметить, что при выборе системы экспрессии можно использовать векторы экспрессии для клеток млекопитающих и клеток-хозяев таким образом, чтобы антитела были соответствующим образом гликозилированы. Для получения антител, соответствующих гликозилированным образцам для человека, преимущественно используются линии клеток человека, предпочтительно PER.C6.

[0084]

Продукцию белка в клетках-хозяевах, трансформированных переносом генов экспрессионных векторов, можно проводить со ссылкой, например, на Current Protocols in Protein Science (1995), Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT, ISBN 0-471-11184-8, Bendig, 1988. Кроме того, общие руководящие принципы, процедуры и практические методы для максимизации продуктивности культуры клеток-хозяев могут быть выполнены со ссылкой на Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991). Экспрессия антител в клетках-хозяевах описана, например, в таких публикациях, как EP0120694, EP0314161, EP0481790, EP0523949, US4816567, WO2000/63403 и тому подобное.

[0085]

В настоящем документе условия культивирования клеток-хозяев могут быть оптимизированы хорошо известными способами, и количество продуцируемого в них белка может быть оптимизировано. Культивирование может осуществляться периодическим культивированием, питательным культивированием, непрерывным культивированием или культивированием на основе полых волокон в чашке Петри, роллерной бутылке или реакционной камере. Для того чтобы продуцировать рекомбинантный белок в культуре клеток в больших масштабах и непрерывно, предпочтительно, чтобы клетки могли пролиферировать в суспензии. Кроме того, предпочтительно культивировать клетки в условиях без каких-либо компонентов сыворотки животного или человеческого происхождения или сыворотки животного или человеческого происхождения.

[0086]

Антитела, экспрессируемые в клетках-хозяевах и выделенные из них или из их культур хорошо известными способами, могут быть очищены с использованием хорошо известных методов. Примеры методов очистки включают метод иммунопреципитации, метод центрифугирования, фильтрацию, эксклюзионную хроматографию, аффинную хроматографию, катионную и/или анионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия и тому подобное. Кроме того, предпочтительно, может использоваться аффинная хроматография с протеином A или протеином G (см., например, US4801687 и US5151504).

[0087]

Анти-CD19 моноклональное антитело

Настоящее изобретение включает «моноклональное антитело, специфически связывающееся с CD19» (далее может быть сокращено как «анти-CD19 моноклональное антитело»), и его фрагмент антитела для конструирования биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению.

[0088]

Одним вариантом моноклонального анти-CD19 антитела по настоящему изобретению является моноклональное антитело, способное специфически связываться с CD19 путем ассоциации его VH с VL общей легкой цепи по настоящему изобретению. В настоящем документе выражение «специфически связывающееся с CD19» используется как характеристика прямого связывания с CD19 с более высокой связывающей активностью (константа диссоциации (значение Kd)), чем по меньшей мере аффинность 1×10^-5 M, предпочтительно, 1×10^-7 M и, более предпочтительно, 1×10^-9 M, и практически не связывается с какими-либо другими белками. В настоящем документе «антитело» в «моноклональном антителе, специфически связывающемся с CD19», означает полноразмерное антитело, состоящее из двух тяжелых цепей и двух легких цепей, связанных дисульфидными связями. Кроме того, «фрагмент моноклонального антитела, специфически связывающийся с CD19», является частью полноразмерного антитела, включая по меньшей мере антигенсвязывающую часть, и его примеры включают Fab, Fab′, Fv, scFv, F(ab′)₂ и тому подобное.

[0089]

Примеры моноклональных анти-CD19 антител по настоящему изобретению включают такие, у которых имеется VH, выбранная из вышеупомянутых от (1d) до (5d), составляющих VH «второго плеча, специфически связывающегося с CD19», или VH, содержащая аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30-34, и VL в качестве общей легкой цепи по настоящему описанию (предпочтительно, VL, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25).

[0090]

Кроме того, примеры моноклональных анти-CD19 антител по настоящему изобретению включают также такие, в которых от одного до пяти произвольных аминокислотных остатков были заменены на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты) в соответствующих CDR любой из VH, выбранной из вышеупомянутых от (1d) до (5d), и которые обладают практически такой же связывающей активностью с CD19, что и анти-CD19 моноклональное антитело, имеющее исходную VH без каких-либо замен на те же аминокислоты. Примеры включают такие, в которых один аминокислотный остаток в CDR1 был заменен на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты) и от одного до пяти аминокислотных остатков в CDR2 или CDR3 были заменены на другие аминокислоты (предпочтительно, их консервативные аминокислоты), соответственно. Кроме того, как показано на фигуре 5, в соответствующих CDR клонах моноклонального анти-CD19 антитела, аминокислоты, различающиеся между клонами или любой их комбинацией из множества, могут быть взаимозаменяемы между клонами. В настоящем документе выражение «которые обладают по существу такой же связывающей активностью с CD19 9, как и анти-CD19 моноклональное антитело, имеющее исходную VH без каких-либо замен теми же аминокислотами» означает, что активность связывания с CD19 моноклонального анти-CD19 антитела с заменами на те же аминокислоты составляет 95% или более, предпочтительно, 98% или более и, более предпочтительно, 99% или более по сравнению с моноклональным анти-CD19 антителом, имеющим исходную VH, без каких-либо замен на те же аминокислоты.

[0091]

Кроме того, примеры моноклональных анти-CD19 антител по настоящему изобретению включают такие, которые содержат соответствующие CDR, содержащие указанную выше специфическую аминокислотную последовательность, и в которых аминокислотные последовательности каркаса кодируются конкретным геном зародышевой линии или ее геном с соматической мутацией(ями). Примеры включают конкретную VH, кодируемую конкретным геном зародышевой линии или ее геном с соматической мутацией(ями), описанную в описании вышеупомянутого «второго плеча, специфически связывающегося с CD19».

[0092]

Кроме того, в моноклональных анти-CD19 антителах по настоящему изобретению примеры тех, которые содержат соответствующие CDR в любой из VH, выбранной из вышеупомянутых от (1d) до (5d), и в которых их FR аминокислотные последовательности кодируются конкретным геном зародышевой линии или ее геном с соматической мутацией(ями), включают такие, которые имеют VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30-34. Кроме того, примеры таких моноклональных анти-CD19 антител включают антитела с аминокислотной последовательностью VH, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 98%, кроме того, предпочтительно, по меньшей мере 99% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO:30-34, и имеющим активность связывания с CD19, которая по существу такая же, как у моноклонального анти-CD19 антитела, имеющего исходную VH. В настоящем документе выражение «имеющий активность связывания с CD19 по существу такую же, как у моноклонального анти-CD19 антитела, имеющего исходную VH», означает, что оно имеет 95% или более, предпочтительно, 98% или более и, более предпочтительно, 99% или более активности связывания с CD19 по сравнению с моноклональным анти-CD19 антителом, имеющим исходную VH.

[0093]

Кроме того, другие примеры моноклональных анти-CD19 антител по настоящему изобретению включают также (1) анти-CD19 моноклональное антитело, перекрестно конкурирующее за связывание с CD19 с моноклональным анти-CD19 антителом, имеющим одну из VH, выбранную из вышеуказанных от (1d) до (5d), или VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30-34, и VL общей легкой цепи по настоящему описанию (предпочтительно, VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25), и (2) анти-CD19 моноклональное антитело, с которым связывание с CD19 перекрестно конкурирует за анти-CD19 моноклональное антитело, имеющим одну из VH, выбранную из вышеуказанных от (1d) до (5d), или VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную любой последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:30-34, и такую же VL общей легкой цепи.

[0094]

Кроме того, другие примеры моноклональных анти-CD19 антител по настоящему изобретению включают также такие, которые имеют VH, содержащую аминокислотную последовательность, в которой глутамин в положении 114 в аминокислотной последовательности, указанной в любой, выбранной из SEQ ID NO:30-34, был или может быть заменен на аргинин, и VL общей легкой цепи по настоящему описанию (предпочтительно, VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25), и, более предпочтительно, являются такими, которые имеют VH, содержащую аминокислотную последовательность, в которой глутамин в положении 114 в аминокислотной последовательности, указанной в любой, выбранной из SEQ ID NO:30-34 был заменен на аргинин и VL той же общей легкой цепи, которые соответствуют моноклональным анти-CD19 антителам, имеющим VH, содержащую любую из аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:62-66 и такую же VL общей легкой цепи, соответственно.

[0095]

Полинуклеотид, кодирующий Биспецифическое антитело PD-1/CD19

Полинуклеотид, кодирующий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 содержит (1) полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, имеющую VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, (2) полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, имеющую VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, и (3) полинуклеотиды, кодирующие общие легкие цепи. В настоящем документе полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, имеющую VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит полинуклеотид, кодирующий VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, и полинуклеотид, кодирующий константный участок тяжелой цепи, имеющей ту же VH. Аналогично, полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, имеющую VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит полинуклеотид, кодирующий VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, и полинуклеотид, кодирующий константный участок тяжелой цепи, имеющей ту же VH.

[0096]

Полинуклеотид, кодирующий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 может быть любыми полинуклеотидами при условии, что они кодируют части, составляющие Биспецифическое антитело PD-1/CD19, соответственно, и может быть любой из геномной ДНК, кДНК, синтезированной ДНК, РНК и гибрида ДНК-РНК. Известны от одного до шести типов кодонов, кодирующих одну аминокислоту. Например, Phe соответствует TTT или TTC, Leu соответствует TTA, TTG, CTT, CTC, CTA или CTG, Ile соответствует ATT, ATC или ATA, Met соответствует ATG, Val соответствует GTT, GTC, GTA или GTG, Ser соответствует TCT, TCC, TCA или TCG, Pro соответствует CCT, CCC, CCA или CCG, Thr соответствует ACT, ACC, ACA или ACG, Ala соответствует GCT, GCC, GCA или GCG, Tyr соответствует TAT или TAC, His соответствует CAT или CAC, Gln соответствует CAA или CAG, Asn соответствует AAT или AAC, Lys соответствует AAA или AAG, Asp соответствует GAT или GAC, Glu соответствует GAA или GAG, Cys соответствует TGT или TGC, Trp соответствует TGG, Arg соответствует CGT, CGC, CGA или CGG, Ser соответствует AGT или AGC, Arg соответствует AGA или AGG, и Gly соответствует GGT, GGC, GGA или GGG, соответственно. Соответственно, примеры полинуклеотидов, кодирующих Биспецифическое антитело PD-1/CD19 включают полинуклеотид, в котором произвольно комбинируют каждый кодон, соответствующий каждой аминокислоте. Предпочтительные примеры полинуклеотида, кодирующего VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, представленную в любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO:50-54, кодирующих VH клонов от PD1-1 до PD1-5, соответственно. Предпочтительные примеры полинуклеотида, кодирующего VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, представленную любой из последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:56-60 и SEQ ID NO:76=80, кодирующих VH клонов CD19-5, CD19-1, CD19-4, CD19-2 и CD19-3, соответственно. Кроме того, примеры полинуклеотида, кодирующего вариабельную область общей легкой цепи, включают полипептид, содержащий последовательность оснований, указанную как SEQ ID NO:55.

[0097]

Фармацевтическое применение

Биспецифическое антитело PD-1/CD19 и тому подобное по настоящему изобретению может быть использовано для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутоиммунных заболеваний или болезней «трансплантат против хозяина» (GVHD).

[0098]

Примеры аутоиммунных заболеваний, которые можно предотвратить, прогрессирование симптомов которых можно подавить и/или которые можно лечить биспецифическим PD-1/CD19 антителом или тому подобное по настоящему изобретению, включают болезнь Бехчета, системную красную волчанку, хроническую дискоидную красную волчанку, рассеянный склероз (системную склеродермию и прогрессирующий системный склероз), склеродермию, полимиозит, дерматомиозит, узелковый периартериит (узелковый полиартериит и микроскопический полиангиит), синдром аортита (артериит Такаясу), злокачественный ревматоидный артрит, ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, спондилоартрит, смешанное заболевание соединительной ткани, синдром Шегрена, болезнь Стилла у взрослых, васкулит, аллергический гранулематозный васкулит, гиперчувствительный васкулит, ревматоидный васкулит, васкулит крупных сосудов, ANCA-ассоциированный васкулит (например, гранулематоз с полиангиитом и эозинофильный гранулематоз с полиангиитом), синдром Когана, синдром RS3PE, височный артериит, ревматическую полимиалгию, фибромиалгию, синдром антифосфолипидных антител, эозинофильный фасциит, заболевания, связанные с IgG₄ (например, первичный склерозирующий холангит и аутоиммунный инсулит и т.д.), синдром Гийена-Барре, миастению, хронический атрофический гастрит, аутоиммунный гепатит, неалкогольный стеатогепатит, первичный билиарный цирроз, синдром Гудпастчера, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, мегалобластную анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, пернициозную анемию, аутоиммунную нейтропению, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, Базедову болезнь (болезнь Грейвса (гипертиреоз)), болезнь Хашимото, аутоиммунную надпочечниковую недостаточность, первичный гипотиреоз, болезнь Аддисона (хронический гипоадренокортицизм), идиопатическую болезнь Аддисона, сахарный диабет I типа, медленно прогрессирующий сахарный диабет I типа (латентный аутоиммунный диабет у взрослых), очаговую склеродермию, псориаз, псориатический артрит, буллезный пемфигоид, пузырчатку, пемфигоид, гестационный герпес, линейный буллезный дерматоз IgA, приобретенный буллезный эпидермолиз, очаговую алопецию, витилиго, вульгарное витилиго, оптический нейромиелит, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, мультифокальную моторную нейропатию, саркоидоз, гигантоклеточный артериит, боковой амиотрофический склероз, болезнь Харада, аутоиммунную оптическую нейропатию, идиопатическую азооспермию, привычный аборт, воспалительное заболевание кишечника (например, язвенный колит и болезнь Крона), целиакию, анкилозирующий спондилит, тяжелую астму, хроническую крапивницу, трансплантационный иммунитет, семейную средиземноморскую лихорадку, эозинофильный хронический риносинусит, дилатационную кардиомиопатию, системный мастоцитоз, миозит с тельцами включения и тому подобное.

[0099]

В настоящем изобретении термин «лечение» означает излечение или улучшение определенного заболевания или его симптома. Термин «предотвращение» означает, что начало определенного заболевания или его симптома предотвращается или задерживается на определенный период времени. Термин «подавление прогрессирования симптомов» означает, что прогрессирование или обострение симптомов подавляется, чтобы остановить прогрессирование болезненных состояний. Значение «предотвращение» также включает в себя подавление рецидива. Термин «подавление рецидива» означает, что рецидив определенного заболевания или его синдрома предотвращается или вероятность рецидива снижается.

[0100]

Кроме того, другой вариант биспецифического PD-1/CD19 антитела и тому подобное по настоящему изобретению может быть использован для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутореактивных B-клеточных заболеваний. Примеры аутореактивных B-клеточных заболеваний включают системную красную волчанку, болезнь Грейвса, миастению, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тромбоцитопению, астму, криоглобулинемию, первичный билиарный склероз, злокачественную анемию и тому подобное. В том же фармацевтическом применении Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное по настоящему изобретению действует посредством подавляющего действия против аутореактивных В-клеток. В данном документе примеры подавляющих эффектов против аутореактивных В-клеток включают подавляющие эффекты против продукции иммуноглобулина, такого как IgG и IgM. Кроме того, Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное по настоящему изобретению оказывает подавляющее действие на активацию Т-клеток памяти. В данном случае примеры подавляющих эффектов против активации Т-клеток памяти включают подавляющие эффекты против продукции цитокинов.

[0101]

Биспецифическое обычно вводят системно или местно посредством парентерального введения. Конкретные примеры таких способов введения включают инъекционное введение, интраназальное введение, транспульмональное введение, чрескожное введение и тому подобное. Примеры инъекционного введения включают внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию и тому подобное. Для внутривенного введения предпочтительнее капельное внутривенное вливание. Его доза варьируется в зависимости от возраста, веса тела, симптомов, терапевтического эффекта, способа введения, периода лечения и тому подобного. Разовая доза для взрослого пациента обычно находится в диапазоне от 0,1 мкг/кг до 300 мг/кг, особенно предпочтительно, в диапазоне от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг от одного до нескольких раз в день путем парентерального введения или в пределах от 30 минут до 24 часов в сутки путем внутривенного поддерживающего введения. Излишне говорить, что, как упомянуто выше, поскольку доза варьируется в зависимости от различных условий, она может быть ниже, чем указанная выше доза, или может потребоваться, чтобы она была больше, чем указанная выше.

[0102]

Состав

Когда Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное по настоящему изобретению составлено для использования в качестве раствора для инъекции или инфузии для капельной инфузии, раствор для инъекции или инфузии может быть в любой форме водного раствора, суспензии или эмульсии, или может быть составлен в виде твердого агента вместе с фармацевтически приемлемым носителем, так что он будет растворяться, суспендироваться или эмульгироваться при добавлении растворителя во время использования. Примеры растворителей, которые можно использовать в инъекции или инфузионном растворе для капельной инфузии, включают дистиллированную воду для инъекций, физиологический раствор, раствор глюкозы и изотонический раствор и тому подобное (например, растворы, в которых растворены хлорид натрия, хлорид калия, глицерин, маннит, сорбит, борная кислота, бура, пропиленгликоль или тому подобное).

[0103]

В настоящем документе примеры фармацевтически приемлемых носителей включают стабилизатор, суспендирующий агент, эмульгатор, успокаивающий агент, буферный агент, консервант, антисептик, регулятор pH, антиоксидант и тому подобное. В качестве стабилизатора можно использовать, например, различные аминокислоты, альбумин, глобулин, желатин, маннит, глюкозу, декстран, этиленгликоль, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, аскорбиновую кислоту, бисульфит натрия, тиосульфат натрия, эдетат натрия, цитрат натрия, дибутилгидрокситолуол или тому подобное. В качестве солюбилизатора можно использовать, например, спирт (например, этанол и т.д.), полиспирт (например, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль и т.д.), неионогенное поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 20 (зарегистрированная торговая марка), полисорбат 80 (зарегистрированная торговая марка) и HCO-50 и т.д.) или тому подобное. В качестве суспендирующего агента можно использовать, например, моностеарат глицерина, моностеарат алюминия, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, лаурилсульфат натрия или тому подобное. В качестве эмульгатора можно использовать, например, аравийскую камедь, альгинат натрия, трагакан или тому подобное. В качестве успокаивающего агента можно использовать, например, бензиловый спирт, хлорбутанол, сорбитол или тому подобное. В качестве буферного агента можно использовать, например, фосфатный буфер, ацетатный буфер, боратный буфер, карбонатный буфер, цитратный буфер, Трис-буфер, буфер глутаминовой кислоты, буфер эпсилон-аминокапроновой кислоты или тому подобное. В качестве консерванта можно использовать, например, метилпарагидроксибензоат, этилпарагидроксибензоат, пропилпарагидроксибензоат, бутилпарагидроксибензоат, хлорбутанол, бензиловый спирт, хлорид бензалкония, дегидроацетат натрия, эдеат натрия, борную кислоту, боракс или тому подобное. В качестве антисептического агента можно использовать, например, хлорид бензалкония, парагидроксибензойную кислоту, хлорбутанол или тому подобное. В качестве регулятора pH можно использовать, например, соляную кислоту, гидроксид натрия, фосфорную кислоту, уксусную кислоту или тому подобное. В качестве антиоксидантов можно использовать, например, (1) водные антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия и сульфит натрия, (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, лецитин, пропилгаллат и α-токоферол, и (3) хелатирующие агенты для металлов, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота, сорбит, винная кислота и фосфорная кислота.

[0104]

Инъекционный или инфузионный раствор для капельной инфузии может быть приготовлен путем стерилизации в конечном процессе или стерилизации путем асептических манипуляций, например, стерилизации фильтрацией с помощью фильтра или тому подобного с последующим заполнением его в асептический контейнер. Инъекционный или инфузионный раствор для капельной инфузии можно использовать путем растворения во время использования высушенного в вакууме или лиофилизированного асептического порошка (который может включать фармацевтически приемлемый порошок носителя) в подходящем растворителе.

[0105]

Комбинированное применение или комбинированный состав

Кроме того, Биспецифическое антитело PD-1/CD19 и тому подобное по настоящему изобретению может быть использовано в комбинации с другими агентами, которые используются для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутоиммунного заболевания. В настоящем изобретении примеры форм для введения в комбинации с другими агентами (комбинированное использование) могут включать форму комбинированного состава, содержащую оба ингредиента в одном составе, и форму, вводимую отдельными составами. Такие комбинированные применения могут дополнять эффекты по предотвращению, подавлению прогрессирования симптомов, подавлению рецидива и/или лечению другими агентами, или могут поддерживать или уменьшать дозу или частоту введения других агентов. При раздельном введении биспецифического PD-1/CD19 антитела или тому подобного по настоящему изобретению и других агентов их можно вводить одновременно в течение определенного периода времени, и затем можно вводить только Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное или другие агенты. Альтернативно, сначала может быть введено Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное по настоящему изобретению, а после его завершения могут быть введены другие агенты. Сначала могут быть введены другие агенты, а после завершения может быть введено Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное по настоящему изобретению. Соответствующие способы введения могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Также может быть предоставлен набор, содержащий состав, содержащий Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное по настоящему изобретению состав, содержащий другие агенты. При этом дозы других агентов могут быть соответствующим образом выбраны на основе дозы при клиническом применении. Кроме того, другие агенты можно вводить в комбинации двух или более видов произвольных агентов в соответствующем соотношении. Кроме того, примеры других агентов включают не только уже известные, но и вновь открытые в будущем.

[0106]

Например, когда Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное по настоящему изобретению применяется для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов или рецидива и/или лечения сахарного диабета I типа, его можно использовать в сочетании с любым одним или несколькими агентами, выбранными из инсулинового препарата (например, человеческий инсулин, инсулин гларгин, инсулин лизпро, инсулин детемир и инсулин аспарт и т.д.), сульфонилмочевинного агента (например, глибенкламид, гликлазид и глимепирид и т.д.), быстродействующего промотора секреции инсулина (например, натеглинид и т.д.), бигуанидинового препарата (например, метформин и т.д.), агента, улучшающего инсулинорезистентность (например, пиоглитазон и т.д.), ингибитора α-глюкозидазы (например, акарбоза и воглибоза и т.д.), терапевтического агента диабетической невропатии (например, эпалрестат, мексилетин и имидаприл и т.д.), препарата аналога GLP-1 (например, лираглутид, экзенатид и ликсисенатид и т.д.) и ингибитора DPP-4 (например, ситаглиптин, вилдаглиптин и алоглиптин и т.д.) и тому подобное.

[0107]

Кроме того, например, когда Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное по настоящему изобретению применяется для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов или рецидива и/или лечения рассеянного склероза, его можно использовать в сочетании с любым одним или несколькими агентами, выбранными из стероидного агента (например, кортизона ацетат, гидрокортизон, фосфат гидрокортизона натрия, сукцинат гидрокортизона натрия, флудрокортизона ацетат, преднизолон, преднизолона ацетат, сукцинат преднизолона натрия, преднизолона бутилацетат, фосфат преднизолона натрия, галопредона ацетат, метилпреднизолон, метилпреднизолона ацетат, сукцинат метилпреднизолона натрия, триамсинолон, триамсинолона ацетат, триамсинолона ацетонид, дексаметазон, дексаметазона ацетат, фосфат дексаметазона натрия, дексаметазона пальмитат, параметазона ацетат и бетаметазон и т.д.), интерферона β-1a, интерферона β-1b, глатирамера ацетата, митоксантрона, азатиоприна, циклофосфамида, циклоспорина, метотрексата, кладрибина, адренокортикотропного гормона (ACTH), кортикотропина, мизорибина, такролимуса, финголимода и алемтузумаба и тому подобного.

[0108]

Кроме того, например, когда Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное по настоящему изобретению применяется для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов или рецидива и/или лечения системной красной волчанки, его можно использовать в сочетании с любым одним или несколькими агентами, выбранными из стероидного агента (например, стероидные агенты, указанные выше), иммунодепрессанта (например, циклоспорин, такролимус и финголимод и т.д.) и белимумаба.

[0109]

Например, когда Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное по настоящему изобретению применяется для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов или рецидива и/или лечения ревматоидного артрита, его можно использовать в сочетании с любым одним или несколькими агентами, выбранными из стероидного агента (например, стероидные агенты, указанные выше), противоревматического агента (например, метотрексат, сульфасалазин, буцилламин, лефлуномид, мизорибин и такролимус и т.д.), антицитокинового агента (например, инфликсимаб, адалимумаб, тоцилизумаб, этанерцепт, голимумаб и цертолизумаб и т.д.), и абатацепта и тому подобного.

[0110]

Когда применяется для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов или рецидива и/или лечения других аутоиммунных заболеваний, Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или тому подобное по настоящему изобретению, его можно использовать в комбинации с любым одним или несколькими из вышеупомянутых других агентов.

[0111]

Настоящее изобретение описано далее более подробно с помощью следующих примеров, но объем настоящего изобретения ими не ограничивается. Специалист в данной области может вносить различные изменения и модификации на основе описания настоящего изобретения, и такие изменения и модификации также включены в настоящее изобретение.

[Примеры]

[0112]

Пример 1: Иммунизация мышей MeMo (зарегистрированная торговая марка) с использованием рекомбинантного слитого белка PD-1-Fc человека

В качестве способа получения первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, по настоящему изобретению, был выбран способ иммунизации мышей MeMo (зарегистрированная торговая марка) (см. WO2009/157771) рекомбинантным человеческим белком PD-1. Мыши MeMo (зарегистрированная торговая марка) это мыши, генетически модифицированные таким образом, что фрагмент гена, содержащий нерекомбинантную область гена V тяжелой цепи человека, область гена D и область гена J, а также рекомбинантный человеческий ген κ легкой цепи IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 зародышевой линии был связан с геном константном участке мыши. Путем прямой иммунизации их целевым белком для антитела можно получить антитела, состоящие из тяжелых цепей и общих легких цепей с разнообразием.

[0113]

Мышей MeMo (зарегистрированная торговая марка) в возрасте от 12 до 16 недель иммунизировали рекомбинантным слитым белком PD-1-Fc человека (R&D Systems, серийный номер 1086-PD), эмульгированным с использованием адъюванта Gerbu MM (Gerbu Biotechnik, серийный номер #3001) с интервалом 14 дней. В дни 0, 14 и 28 после иммунизации подкожно вводили рекомбинантный слитый белок PD-1-Fc человека, а после этого подкожно вводили рекомбинантный слитый белок PD-1-Fc человека, растворенный в PBS. На 21, 35, 56, 77 и 98 дни после иммунизации титр антител в сыворотке оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием линий Т-клеток HEK293, принудительно экспрессированных человеческим PD-1. Когда линии клеток HEK293T человека, принудительно экспрессированные PD-1, окрашивали в 1000-кратно разведенной сыворотке, для создания библиотеки фагового дисплея в качестве контроля использовали лимфатические ткани мыши, в которых значение MFI увеличивалось более чем в три раза по сравнению с таковым в человеческой линии клеток HEK293T, не экспрессирующих PD-1. Мышей, отвечающих критериям конструирования библиотеки, дополнительно иммунизировали рекомбинантным слитым белком PD-1-Fc в течение трех дней с даты оценки титра антител, и у них собирали селезенки и паховые лимфатические узлы. У мышей также собирали селезенки и радиальные лимфатические узлы, у которых титр антител в сыворотке к PD-1 человека и PD-1 яванской макаки составлял 1/100 или более, и титр антител не увеличивался при дополнительной иммунизации. Из этих лимфоидных тканей экстрагировали РНК, а затем проводили синтез кДНК.

[0114]

Пример 2: Конструирование библиотеки фагового дисплея для получения анти-PD-1 антитело (иммунизация белком)

С использованием ДНК, полученной в примере 1, и праймеров, специфичных для семейства вариабельных областей тяжелой цепи иммуноглобулина, была проведена реакция ПЦР. Полученные продукты ПЦР расщепляли рестрикционными ферментами SfiI и XhoI и вставляли в фагмидный вектор [имеющий ген (ген κ легкой цепи IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 зародышевой линии) кодирующий общую легкую цепь], расщепленный с помощью те же ферментов рестрикции для создания библиотеки.

[0115]

Пример 3: Скрининг анти-PD-1 антитела

Используя планшеты, покрытые слитым белком PD-1-Fc человека, слитым белком с меткой PD-1-His человека, слитым белком с меткой PD-1-His яванского макака или слитым белком с меткой PD-1-His мыши, проводили отбор фага на основе свойства связывания с PD-1. При использовании слитого белка PD-1-Fc человека во время инкубации с фагом к нему добавляли IgG человека (SIGMA, серийный номер I4506) для поглощения реактивных клонов Fc. Были обогащены связывающие фаги, способные связываться с PD-1 человека, PD-1 яванского макака и PD-1 мыши. Используя селекцию на линиях Т-клеток НЕК293, принудительно экспрессирующих PD-1 яванского макака, были обогащены фаги, способные связываться с PD-1 яванского макака. Для получения мастер-планшета были получены клоны TG1 штамма Escherichia coli, трансформированные фагами, полученными путем отбора.

[0116]

Кроме того, на основании свойства связывания с PD-1 на планшете, на котором был адсорбирован слитый белок PD-1-Fc человека, была проведена селекция фагов из экстрактов периплазматического пространства клонов, полученных вышеупомянутой селекцией. Следует обратить внимание на то, что в качестве критериев отбора клоны с сигналами, в три раза превышающими сигнал (значение OD₄₅₀) в лунке с отрицательным контролем (PBS), были определены как положительные клоны.

[0117]

Пример 4: ДНК-клоны-кандидаты для секвенирования анти-PD-1 антител

Было выполнено секвенирование ДНК для генов вариабельной области тяжелой цепи положительных клонов, полученных путем скрининга в примере 3. Анализируемые последовательности ДНК были классифицированы на суперкластеры (группа, имеющая одинаковую длину CDR3 тяжелой цепи, в которой аминокислотная последовательность одного и того же CDR3 на 70% или более гомологична друг другу) и кластеры (группа, в которой кислотные последовательности CDR3 тяжелой цепи одинаковы). Были получены сотни клонов, которые были разделены на суперкластеры и кластеры.

[0118]

Пример 5: Скрининг, основанный на оценке свойства связывания с клетками, экспрессирующими PD-1

Из соответствующих классифицированных суперкластеров были отобраны и выделенны клоны моноклональных анти-PD-1 антител, отвечающие следующим условиям:

(1) наличие соматических мутаций в CDR с высокой частотой,

(2) наличие гена зародышевой линии очень часто используемого VH, и

(3) наличие высокого сигнала при скрининге на основе свойства связывания со слитым белком PD-1-Fc человека.

[0119]

Используя Fab-фрагменты, содержащиеся в этих экстрактах периплазматического пространства, оценивали свойства связывания с клеточной линией CHO-S, принудительно экспрессирующей человеческий PD-1, и клеточной линией CHO-S, принудительно экспрессирующей PD-1 яванского макака, путем обнаружения с помощью поликлональных анти-мышиного IgG антител. Среди проанализированных 117 клонов (105 типов кластеров) в 22 клонах, включая клоны анти-PD-1 моноклонального антитела, PD1-2, PD1-3 и PD1-4, было подтверждено связывание с человеческим PD-1, экспрессирующим клеточную линию CHO-S.

[0120]

Пример 6: Получение замещенных аминокислотами продуктов анти-PD-1 моноклонального антитела

Клоны PD1-1 и PD1-4 содержат мотивы дезамидирования (Asn-Gly) в каркасе 4 вариабельной области тяжелой цепи, соответственно. Чтобы получить плечо PD-1 со сниженным риском дезамидирования, был получен вариант, в котором были преобразованы мотивы дезамидирования. Аспарагин (Asn) в положении 119 в соответствии с системой нумерации ЕС для клона PD1-4 был заменен на глутамин с помощью хорошо известного метода сайт-специфической мутации для получения и выделения клона PD1-5. Свойство связывания с человеческими клетками CHO-S, вынужденно экспрессирующими PD-1, этого клона было таким же, как у клона PD1-4.

[0121]

Пример 7: Иммунизация MeMo (зарегистрированная торговая марка) с использованием плазмидного вектора, экспрессирующего CD19

В качестве метода получения второго плеча, специфически связывающегося с CD19, по настоящему изобретению, был выбран способ иммунизации мышей MeMo (зарегистрированная торговая марка) (см. WO2009/157771) плазмидными векторами, экспрессирующими CD19 человека, и плазмидными векторами, экспрессирующими CD19 яванского макака.

[0122]

Мыши MeMo (зарегистрированная торговая марка) это мыши, генетически модифицированные таким образом, что фрагмент гена, содержащий нерекомбинантную область гена V тяжелой цепи человека, область гена D и область гена J, а также рекомбинантный человеческий ген κ легкой цепи IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 зародышевой линии был связан с геном константном участке мыши. Путем прямой иммунизации их целевым белком для антитела можно получить антитела, состоящие из тяжелых цепей и общих легких цепей с разнообразием.

[0123]

Мышей MeMo (зарегистрированная торговая марка) в возрасте от 12 до 16 недель иммунизировали плазмидными векторами, экспрессирующими CD19 человека, и/или плазмидными векторами, экспрессирующими CD19 яванского макака, соответственно или поочередно. В дни 0, 3, 6, 14, 17, 28, 31, 42, 49, 63 и/или 70 после иммунизации вводили экспрессирующие плазмидные векторы. Титр антител в сыворотке оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием линий клеток, экспрессирующих CD19 человека. Когда линии клеток, экспрессирующие CD19 человека, окрашивали в 100-кратно разведенной сыворотке, для создания библиотеки фагового дисплея в качестве контроля использовали лимфатические ткани мыши, в которых значение MFI увеличивалось более чем в три раза, чем у линий клеток, не экспрессирующих CD19 человека. Мышей, отвечающих критериям конструирования библиотеки, дополнительно иммунизировали, и у них собирали селезенки и паховые лимфатические узлы. Из этих лимфоидных тканей экстрагировали РНК, а затем проводили синтез кДНК реакцией обратной транскрипции с использованием праймеров, специфичных для константной участка IgG.

[0124]

Пример 8: Конструирование библиотеки фагового дисплея для получения анти-CD19 антитело

С использованием ДНК, полученной в примере 7, и праймеров, специфичных для семейства вариабельных областей тяжелой цепи иммуноглобулина, была проведена реакция ПЦР. Полученные продукты ПЦР расщепляли рестрикционными ферментами и вставляли в фагмидный вектор [имеющий ген (ген κ легкой цепи IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 зародышевой линии) кодирующий общую легкую цепь], расщепленный с помощью те же ферментов рестрикции для создания библиотеки.

[0125]

Пример 9: Скрининг анти-CD19 антител

Используя слитый белок CD19-Fc человека (системы R&D, серийный номер 9269-CD), слитый белок CD19-Fc яванского макака (NovoPro Bioscience, серийный номер 504385), линии В-клеток человека Raji или клетки HEK293T, принудительно экспрессирующие CD19 яванского макака линий, проводили отбор фага на основе свойства связывания с CD19. Для получения мастер-планшета были получены клоны TG1 штамма Escherichia coli, трансформированные фагами, полученными путем отбора. Следует обратить внимание на то, что в качестве критериев отбора клоны с сигналами более чем в три раза превышающими сигнал (значение OD₄₅₀ или MFI), полученные с помощью отрицательного контроля, были определены как положительные клоны.

[0126]

Пример 10: Секвенирование ДНК для клонов-кандидатов антител к CD19

Было выполнено секвенирование ДНК для гена вариабельной области тяжелой цепи положительных клонов, полученных путем скрининга в примере 9. Анализируемые последовательности ДНК были классифицированы на суперкластеры (группа, в которой длина CDR3 тяжелой цепи одинакова, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи является взаимно гомологичной на 70% или более) и кластеры (группа, в которой аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи являются взаимно одинаковыми, соответственно).

[0127]

При первом скрининге были получены сотни клонов, которые были разделены на суперкластеры, кластеры и 4 типа зародышевых линий. При втором скрининге были получены сотни клонов, которые были разделены на суперкластеры, кластеры и 8 типов зародышевых линий. 19 типов суперкластеров отличаются от тех, что были на первом просмотре.

[0128]

Пример 11: Скрининг, основанный на оценке свойства связывания с CD19

Из соответствующих классифицированных суперкластеров были отобраны и выделенны клоны моноклональных анти-CD19 антител, отвечающие следующим условиям:

наличие гена зародышевой линии очень часто используемого VH, и

(3) наличие высокого сигнала при скрининге на основе свойства связывания с CD19.

[0129]

Используя Fab-фрагменты, содержащиеся в этих экстрактах периплазматического пространства, оценивали свойство связывания с CD19.

[0130]

Было подтверждено, что среди оцениваемых клонов ряд клонов, включая клоны моноклональных анти-CD19 антител CD19-1, CD19-2, CD19-3, CD19-4 и CD19-5, могут связываться с линией клеток человека, экспрессирующей CD19.

[0131]

Пример 12: Получение биспецифического PD-1/CD19 антитела

Экспрессионные векторы, экспрессирующие соответствующие тяжелые цепи первого плеча, специфически связывающиеся с PD-1, получали путем связывания ДНК, кодирующих соответствующие вариабельные области тяжелой цепи клонов от PD1-1 до PD1-5 моноклонального анти-CD19 антитела, выбранных в примерах 5 и 6, с ДНК, кодирующей константный участок тяжелой цепи IgG₁, соответственно. С другой стороны, экспрессионные векторы, экспрессирующие соответствующие тяжелые цепи второго плеча, специфически связывающиеся с CD19, были получены путем связывания ДНК, кодирующих соответствующие вариабельные области тяжелой цепи клонов от CD19-1 до CD19-5 моноклонального анти-CD19 антитела, выбранных в примере 11, с ДНК, кодирующей константный участок тяжелой цепи IgG₁, соответственно. В настоящем документе в качестве генов, экспрессирующих эти константные участки тяжелой цепи, в отношении первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, использовался ген, экспрессирующий область Fc, имеющую вариацию L351D/L368E (вариацию DE), и в отношении второго плеча, специфически связывающегося с CD19, использовали ген, экспрессирующий область Fc, имеющую вариацию L351K/T366K (вариацию KK). Эти векторы экспрессии были сконструированы так, чтобы дополнительно содержать ген, кодирующий общую легкую цепь IGVK1-39/JK1, так что он будет экспрессироваться вместе. Кроме того, чтобы устранить эффекторную активность Fc, гены, экспрессирующие эти константные участки тяжелой цепи, были модифицированы таким образом, чтобы они экспрессировались как гены, в которых лейцин в положении 235 был заменен глицином, и, кроме того, глицин в положении 236 был заменен на аргинин в константном участке тяжелой цепи, и, кроме того, чтобы избежать процессинга после трансляции, использовали такие, которые были модифицированы таким образом, чтобы быть экспрессированными как такие, в которых был удален лизин в положении 447 на С-конце константного участка тяжелой цепи. Оба этих вектора экспрессии переносили геном в клетки Free Style 293F, чтобы заставить их продуцировать антитела в культуральных супернатантах. Культуральные супернатанты собирали и затем обрабатывали аффинной хроматографией на протеине А для очистки клонов CD19-1(Bi), CD19-2(Bi), CD19-3(Bi), CD19-4(Bi) и CD19-5(Bi) в качестве биспецифического PD-1/CD19 антитела по настоящему изобретению, соответственно.

[0132]

Здесь следует отметить, что, поскольку вторые плечи специфически связывающееся с CD19, полученные из клонов моноклонального анти-CD19 антитела CD19-1, CD19-2, CD19-3, CD19-4 и CD19-5, используемых при их получении, эти клоны моноклональных PD-1/CD19 биспецифических антител соответствует этим клонам моноклональных анти-PD-1 антител, соответственно. Все эти клоны биспецифических PD-1/CD19 антител имеют первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, происходящие от клона PD1-5.

[0133]

Пример 13: Получение вариантов моноклонального анти-CD19 антитела и их PD-1/CD19 биспецифических антител

Существует вероятность того, что клоны биспецифических PD-1/CD19 антител, полученные в примере 12, нельзя будет в достаточной степени отделить или очистить от комплексов первого плеча-тяжелая цепь/легкая цепь, комплексов второго плеча-тяжелая цепь/легкая цепь и/или соответствующих гомодимеры, состоящих из них, в качестве побочных продуктов. Следовательно, с целью улучшения отделения биспецифических антител от этих побочных продуктов при очистке с помощью катионообменной хроматографии были получены аминокислотные варианты моноклональных CD19 антител, в которых увеличена изоэлектрическая точка.

[0134]

Был изготовлен вариант, в котором глутамин в положении 114 как SEQ ID NO:30, представляющий аминокислотную последовательность VH клона CD19-5, был заменен на аргинин с помощью известного метода сайт-направленного мутагенеза. В настоящем изобретении вариант был назван «CD19-6». Изоэлектрические точки антител рассчитывали с использованием Genetyx (Genetics Inc.), программного обеспечения для анализа гена и аминокислотной последовательности.

[0135]

Кроме того, соответствующие варианты, имеющие формы, в которых глицин и пептиды, представленные SEQ ID NO: 67-70, были добавлены к С-концу тяжелой цепи, имеющей VH CD19-6 (далее совместно именуемые «CD19-6/C-концевой пептидный аддукт»), соответственно, были получены известным методом генетической модификации. В настоящем изобретении вариант, имеющий форму, в которой пептид, представленный SEQ ID NO:67, был добавлен к C-концу CD19-6, был назван «CD19-7».

[0136]

В соответствии с тем же методом, что и в примере 12, соответствующие векторы экспрессии, описанные в том же примере, в которые были вставлены соответствующие ДНК, кодирующие варианты этих моноклональных CD19 антител, и ДНК, кодирующая клон PD1-5, соответственно, переносили в клетки Free Style 293F, чтобы заставить их продуцировать антитела в культуральном супернатанте. Супернатанты культур собирали и обрабатывали аффинной хроматографией на протеине А для очистки биспецифических антител по настоящему изобретению, полученных из соответствующих вариантов, полученных в этом примере, соответственно. Среди этих биспецифических антител клон биспецифического антитела, полученный из CD19-6, был назван «CD19-6(Bi)», а клон биспецифического антитела, полученный из CD19-7, был назван «CD19-7(Bi)».

[0137]

Пример 14: Очистка и разделение биспецифического PD-1/CD19 антитела и его побочных продуктов

Были подтверждены успех и неудача в очистке и отделении от побочных продуктов, которые могут образовываться во время продуцирования биспецифических PD-1/CD19 антител, полученных в примерах 12 и 13, соответственно.

[0138]

Супернатанты культур, содержащие одни и те же биспецифические антитела, собранные в примерах 12 и 13, соответственно, обрабатывали отдельно с помощью аффинной хроматографии с протеином А и эксклюзионной хроматографии для очистки тех же биспецифических антител, а также соответствующих и анти-PD-1 антитело и анти-CD19 антитело, соответствующие побочным продуктам, соответственно.

[0139]

Растворители, содержащие эти соответствующие очищенные антитела, заменяли буфером ультрафильтрацией до достижения pH 6,0. Соответствующие очищенные антитела после замены буфера наносили на катионообменную колонку TSKgel SP-STAT Column (Tosoh, модель № 0021964), уравновешенную буфером A (pH 7,0). Соответствующие очищенные антитела, связанные с колонкой, элюировали солевым градиентом с использованием буфера B (pH 7,0), содержащего 1 моль/л хлорида натрия. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,5 мл/мин, и элюирование проводили с линейным градиентом от буфера A к буферу B. Соотношение буфера B устанавливали на 0% от 0 до 10 минут после начала нанесения соответствующих очищенных антител, а затем линейно увеличивали от 0 до 100%, от 10 до 40 минут, и устанавливали до 100% от 40 до 50 минут.

[0140]

Время удерживания (в минутах) при катионообменной хроматографии клонов CD19-2 (изоэлектрическая точка: 8,32), CD19-6 (Ip: 8,49) и CD19-7 (Ip: 8,75) составляло 15,167, 15,749 и 17,521, соответственно, и время удерживания клонов CD19-6 и CD19-7 было соответственно увеличено. С другой стороны, клоны PD1-3 (Ip: 7,67) и PD1-5 (Ip: 7,52) не связывались с катионообменной колонкой и элюировались из нее.

[0141]

С другой стороны, клоны биспецифического PD-1/CD19 антитела CD19-2(Bi) и CD19-2(Bi) не связывались с катионообменной колонкой и элюировались из нее, но время удерживания (в минутах) клонов CD19-6(Bi) и CD19-7(Bi) было 13,715 и 14,955, соответственно.

[0142]

Как описано выше, путем увеличения изоэлектрической точки за счет замены аминокислоты во втором плече или добавления специфического пептида на С-конце его тяжелой цепи было улучшено отделение биспецифического антитела по настоящему изобретению в качестве мишени из анти-PD-1-антитела и анти-CD19-антитела в качестве побочных продуктов при очистке с помощью катионообменной хроматографии, что позволило получить биспецифическое антитело по настоящему изобретению, в котором загрязнение его побочными продуктами было чрезвычайно снижено.

[0143]

Пример 15: Оценка связывающей способности биспецифического PD-1/CD19 антитела

По данным анализа Biacore с использованием слитого с человеческим IgG₁-Fc внеклеточного рекомбинантного белка человеческого PD-1 (системы R&D, серийный № 1086-PD) оценивали аффинности связывания с рекомбинантным белком PD-1 первого плеча белка моноклональных биспецифических PD-1/CD19 антител, полученные в примерах 12 и 13, соответственно. Следует обратить внимание, что для иммобилизации рекомбинантных белков использовали сенсорный чип CM5 Sensor Chip Series S (GE Health Care, серийный номер 29-1049-88).

[0144]

Аналогичным образом с помощью анализа Biacore с использованием человеческого внеклеточного рекомбинантного белка CD19, слитого с IgG₁-Fc (системы R&D, серийный № 9269-CD), оценивали аффинности связывания с CD19 второго плеча тех же антител, соответственно. На фигуре 11 показаны аффинности связывания (значение Kd) с PD-1 первого плеча и аффинности связывания с CD19 второго плеча по отношению к соответствующим клонам. Было подтверждено, что аффинности связывания с PD-1 и CD19 CD19-6(Bi) были улучшены, соответственно, по сравнению с таковыми для CD19-5(Bi) без аминокислотной замены по примеру 13.

[0145]

Пример 16: Проверка связывающей способности биспецифического PD-1/CD19 антитела

Было подтверждено, что биспецифические PD-1/CD19 антитела, полученные в примерах 12 и 13, специфически связываются с PD-1 человека, PD-1 яванского макака, CD19 человека и CD19 яванского макака, соответственно. К клеточным линиям CHO-S, принудительно экспрессирующим PD-1 человека, линиям клеток CHO-S, принудительно экспрессирующим PD-1 яванского макака, линиям клеток CHO-S, линиям клеток СНО-К1, принудительно экспрессирующим CD19 человека, линиям клеток СНО-К1, принудительно экспрессирующим CD19 яванского макака, и линиям клеток СНО-К1 добавляли клоны CD19-1(Bi)-CD19-6(Bi), соответственно, и инкубировали на льду в течение 20 минут. После промывания этих клеток к ним добавляли 100 мкл РЕ-меченного козьего F(abʼ)₂ анти-человеческого IgG-Fc фрагмента антитела (ThermoFisher, серийный № H10104) и инкубировали на льду в течение 20 минут. После промывания этих клеток с помощью проточной цитометрии оценивали свойство связывания с PD-1 первого плеча и свойство связывания с CD19 второго плеча этих антител, соответственно. На фигурах с 12 по 16 показаны результаты этого анализа.

[0146]

Все клоны связываются с PD-1 человека, PD-1 яванского макака, CD19 человека и CD19 яванского макака. Следует обратить внимание на то, что неспецифическое связывание в этой системе связывания не обнаружено.

[0147]

Было подтверждено, что моноклональные биспецифические PD-1/CD19 антитела, полученные в примере 12, специфически связываются с PD-1 и CD19 одновременно, соответственно. Сначала к линиям клеток CHO-K1, экспрессирующим человеческий CD19, и линиям клеток CHO-K1 добавляли клоны CD19-1(Bi)-CD19-5(Bi), соответственно, и инкубировали на льду в течение 20 минут. После промывания этих клеток к ним добавляли 100 мкл рекомбинантного белка внеклеточной области человеческого PD-1, слитого с 6 x His-меткой (системы R&D, серийный № 8986-PD), и инкубировали на льду в течение 20 минут. После промывания этих клеток к ним добавляли 100 мкл рекомбинантного белка внеклеточной области человеческого PD-1, слитого с 6×His-меткой (системы R&D, серийный № 8986-PD) и инкубировали на льду в течение 20 минут. После промывания этих клеток добавляли 100 мкл меченного Alexa Fluor 488 мышиного анти-His антитела (MBL, серийный № D291-A48) и инкубировали на льду в течение 20 минут. После промывания этих клеток связывающие количества рекомбинантного белка внеклеточной области PD-1 оценивали с помощью проточной цитометрии. На фигуре 17 показаны результаты этого анализа.

[0148]

Все клоны одновременно связываются с PD-1 и CD19. Следует обратить внимание на то, что неспецифическое связывание в этой системе связывания не обнаружено.

[0149]

Пример 17: Оценка связывающей способности первого плеча биспецифического PD-1/CD19 антитела

Чтобы оценить влияние на взаимодействие PD-1/PD-L1 первых плеч биспецифических PD-1/CD19 антител, полученных в примере 12, был проведен анализ конкурентного связывания в отношении связывания с PD-1 того же биспецифического клонов антител и растворимых рекомбинантных белков PD-L1. Сначала на льду к человеческим PD-1, принудительно экспрессирующим клеточные линии CHO-S, добавляли клоны CD19-1(Bi)-CD19-5(Bi), ниволумаб и анти-человеческое PD-1 антитело J105 (Immunology Letters, 2002, Vol.83, Issue 3, p.215-220), соответственно. Далее на льду к ним добавляли растворимые рекомбинантные белки PD-L1 (системы R&D, серийный № 156-B7), меченные биотином с использованием набора для мечения биотина (Dojin, серийный № LK03). После промывания этих клеток к ним на льду добавляли меченный АРС стрептавидин (BioLegend, серийный № 405207). После промывания этих клеток связывающие количества растворимых рекомбинантных белков PD-L1 оценивали с помощью проточной цитометрии. На фигуре 18 показаны результаты этого анализа.

[0150]

Клоны CD19-1(Bi)-CD19-5(Bi) позволяли связывать растворимый рекомбинантный белок PD-L1 с PD-1. С другой стороны, ниволумаб и J105 полностью ингибировали связывание растворимого рекомбинантного белка PD-L1 с PD-1 в тех же условиях. [0151]

[0151]

С помощью той же оценки было продемонстрировано, что биспецифические антитела, содержащие клоны моноклональных анти-PD-1 антител от PD1-1 до PD1-4, полученные в примере 5, в качестве первого плеча, соответственно, также допускают связывание растворимого рекомбинантного белка PD-L1 с PD-1.

[0152]

Пример 18: Подавляющее действие биспецифического PD-1/CD19 антитела против активированных В-клеток in vitro

Подавляющее действие против продукции человеческого IgM оценивали с использованием В-клеток, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови здорового человека (LONZA, номер модели CC-2702) с помощью набора для выделения В-клеток II, человека (Miltenyi Biotec, серийный № 130-091-151). Человеческие В-клетки высевали в планшеты для культивирования клеток и для проведения активационной обработки к ним добавляли антитело против человеческого CD79B (LifeSpan Biosciences, серийный номер LS-C134648), человеческий рекомбинантный белок CD40L (Enzo Life Sciences, серийный номер ALX-522-110) и человеческий IL-21 рекомбинантный белок (системы R&D, серийный № 8879-IL). Добавляли клоны CD19-1(Bi)-CD19-5(Bi) или контрольные антитела и после активирующей обработки с помощью ELISA (ThermoFisher, серийный № BMS 2098) количественно определяли IgM, содержащиеся в культуральном супернатанте. Результаты показаны на фигуре 19. Все клоны CD19-1(Bi)-CD19-5(Bi) подавляли продукцию IgM. Следует обратить внимание на то, что количество продуцирования IgM (пг/мл) на фигуре представлено как среднее значение ± стандартная ошибка (N=4).

[0153]

Пример 19: Подавляющее действие биспецифического PD-1/CD19 антитела против активированных В-клеток in vivo

Подавляющее действие в отношении продукции человеческого IgG₂ оценивали с использованием мышей NOD.Cg-PrkdcscidIl2 rgtm1Wjl/SzJ (далее сокращенно мышей NSG), которым были трансплантированы мононуклеарные клетки периферической крови, полученные от здоровых индивидуумов (LONZA, серийный № CC-2702). Каждой мыши NSG трансплантировали 1×10⁷ мононуклеарных клеток периферической крови, полученных от здоровых индивидуумов. На 3, 7, 10, 14 и 17 дни после трансплантации внутрибрюшинно вводили 3 мг/кг/день клонов CD19-1(Bi)-CD19-4(Bi) или контрольного антитела один раз в день, соответственно. Для приготовления сыворотки на 21 день после трансплантации из хвостовой вены отбирали кровь. С другой стороны, на 3, 7 и 10 дни после трансплантации внутрибрюшинно в той же дозировке вводили клоны CD19-5(Bi) и CD19-6(Bi), соответственно. В это время параллельно также внутрибрюшинно вводили контрольное антитело. Для приготовления сыворотки на 14 день после трансплантации из хвостовой вены отбирали кровь. Человеческий IgG₂, содержащийся в сыворотке, количественно определяли с помощью ELISA (ThermoFisher, серийный № BMS 2093). Результаты показаны на фигурах 20 и 21. Все клоны CD19-1(Bi)-CD19-4(Bi) подавляли продукцию IgG₂. Следует обратить внимание на то, что количество продукции IgG₂ (мкг/мл) на фигурах представлено как среднее значение ± стандартная ошибка (N=4-8).

[0154]

Пример 20: Оценка перекрестно-конкурентных свойств связывания с PD-1 биспецифического PD-1/CD19 антитела

Анализ перекрестной конкуренции был проведен для оценки перекрестно-конкурентных свойств связывания с PD-1 биспецифических антител, имеющих соответствующие клоны PD1-1-PD1-5 в качестве первого плеча, которые являются антителами PD-1, используемыми для получения биспецифических PD-1/CD19 антител.

[0155]

Сначала на льду к клеткам линии CHO-S человека, экспрессирующим PD-1, добавляли биспецифическое антитело, имеющее в качестве первого плеча клон PD1-5. Далее к ним, соответственно, добавляли меченные биотином биспецифические моноклональные антитела, содержащие в качестве первого плеча клоны PD1-1-PD1-5, соответственно, и затем инкубировали на льду. После промывания этих клеток к ним добавляли РЕ-меченный стрептавидин (BD Pharmingen, серийный № 554061) и инкубировали на льду. После промывания этих клеток с помощью проточной цитометрии определяли связывающие количества этих меченых биотином антител.

[0156]

Было продемонстрировано, что биспецифическое антитело, имеющее в качестве первого плеча клон PD1-5, может ингибировать связывание с PD-1 тех же антител, имеющих в качестве первого плеча клоны PD1-1-PD1-4, соответственно, и, таким образом, оно может перекрестно конкурировать с этими связываниями с PD-1.

[0157]

Пример 21: Оценка in vitro действия биспецифического PD-1/CD19 антитела в отношении высвобождения цитокинов из моноцитов периферической крови человека.

С целью анализа активности биспецифического PD-1/CD19 антитела по высвобождению цитокинов, был проведен эксперимент, в котором биспецифическое антитело по настоящему изобретению или мышиное антитело против CD3 человека OKT3 (BioLegend, серийный номер 317304) добавляли к мононуклеарам периферической крови человека (далее именуемые «PBMC человека»), соответственно.

[0158]

К PBMC человека добавляли клон CD19-6(Bi) и OKT3 (LONZA, серийный номер CC-2702), затем культивировали. IL-2, содержащийся в супернатантах культур, определяли количественно методом проточной цитометрии с использованием Cytometric Bead Array (BD Biosciences, серийный номер 551809). Результаты показаны на фигуре 25. Следует обратить внимание на то, что количество продукции IL-2 (пг/мл) на фигуре представлено средним значением ± стандартная ошибка (N=3).

[0159]

OKT3 заметно индуцировал продукцию IL-2, но не было обнаружено продукции IL-2 по отношению к CD19-6(Bi).

[0160]

Пример 22: Оценка физико-химической стабильности биспецифического PD-1/CD19 антитела

Было подтверждено, что Биспецифическое антитело PD-1/CD19 по настоящему изобретению имеет обладает хорошими характеристиками при любых оценках физико-химической стабильности, включая структурную стабильность при измерении дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), стабильность коллоидов при измерении изменения коэффициента диффузии (DLS) и химическую стабильность (например, изменение концентрации белка, изменение молекулярной структуры, наличие или отсутствие ассоциации/агрегации, наличие или отсутствие генерации варианта заряда, изменение структуры, активность связывания с CD19) в стрессовых условиях (например, при pH от 3 до 4) и температуре 5°C или при pH 7, 5°C и пяти циклах замораживания-оттаивания).

[Промышленная применимость]

[0161]

Биспецифическое антитело PD-1/CD19 или его фрагмент антитела по настоящему изобретению может быть использовано для предотвращения, подавления прогрессирования симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутоиммунных заболеваний или болезней «трансплантат против хозяина» (GVHD).

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ОНО ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД.

<120> Биспецифическое PD-1/CD19 антитело

<130> P20-006

<150> JP 2019-071840

<151> 2019-04-04

<150> JP 2020-022256

<151> 2020-02-13

<160> 80

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 127

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His

100 105 110

Phe Met Asp Val Trp Gly Asn Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 127

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Leu Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His

100 105 110

Tyr Met Glu Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 127

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 127

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

Ala Leu His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His

100 105 110

Phe Met Asp Val Trp Gly Asn Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 5

<211> 127

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

Ala Leu His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His

100 105 110

Phe Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 6

<211> 5

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 6

His Tyr Gly Leu His

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 7

Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 18

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 8

Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His Phe Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 9

<211> 5

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 9

His Tyr Gly Leu His

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 10

Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 18

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 11

Gly Asp Leu Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His Tyr Met

1 5 10 15

Glu Val

<210> 12

<211> 5

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 12

His Tyr Ala Leu His

1 5

<210> 13

<211> 17

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 13

Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 14

<211> 18

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 14

Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 15

<211> 5

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 15

His Tyr Ala Leu His

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 16

Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 17

<211> 18

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 17

Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His Phe Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 18

<211> 5

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 18

His Tyr Ala Leu His

1 5

<210> 19

<211> 17

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 19

Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 20

<211> 18

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 20

Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His Phe Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 21

<211> 98

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210> 22

<211> 98

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210> 23

<211> 329

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 23

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 24

<211> 329

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 24

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 25

<211> 107

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 26

<211> 11

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 26

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 27

<211> 7

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 27

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 28

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 29

<211> 107

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 29

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 30

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Thr Ile Val Gly Val Val Met Thr Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 31

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gln Thr Ile Val Ala Thr Val Met Asn Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Phe Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Thr Ile Val Ala Thr Ile Tyr Asn Ala Phe Asp Phe Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Val Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gln Thr Ile Val Ala Thr Thr Gly Leu Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Thr Ile Val Ala Thr Ile His Trp Ala Ser Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 5

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 35

Ser Tyr Trp Ile Gly

1 5

<210> 36

<211> 17

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 36

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 37

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 37

Lys Thr Ile Val Gly Val Val Met Thr Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 38

<211> 5

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 38

Ser Tyr Trp Ile Gly

1 5

<210> 39

<211> 17

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 39

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 40

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 40

Gln Thr Ile Val Ala Thr Val Met Asn Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 41

<211> 5

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 41

Ser Tyr Trp Ile Ala

1 5

<210> 42

<211> 17

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 42

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 43

His Thr Ile Val Ala Thr Ile Tyr Asn Ala Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 44

<211> 5

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 44

Ser Tyr Trp Ile Gly

1 5

<210> 45

<211> 17

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 45

Ile Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 46

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 46

Gln Thr Ile Val Ala Thr Thr Gly Leu Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 47

<211> 5

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 47

Ser Tyr Trp Ile Gly

1 5

<210> 48

<211> 17

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 48

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 49

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 49

Arg Thr Ile Val Ala Thr Ile His Trp Ala Ser Asp Tyr

1 5 10

<210> 50

<211> 381

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(381)

<400> 50

cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg tct gag ttg aag cag cct ggg gcc 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Ala

1 5 10 15

tca gtg aag gtt tcc tgt aag gct tct gga tac acc ttc act cac tat 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

ggt ttg cat tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144

Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

gga tgg ctc aac acc aac act gag aac cca acg ttt gcc cag ggc ttc 192

Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe

50 55 60

aca gga cgg ttt gtc ttc tcc ttg gac acc tct gtc acc acg gca tat 240

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag atc agc agc ctg aag gct gag gac act gcc gta tat tac tgt 288

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga ggg gat atg gta gta ccg act act ata tgg aac tac tac cac 336

Ala Arg Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His

100 105 110

ttc atg gac gtc tgg ggc aac ggc acc ctg gtc acc gtc tcg agt 381

Phe Met Asp Val Trp Gly Asn Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 51

<211> 381

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(381)

<400> 51

cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg tct gag ttg aag cag cct ggg gtc 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Val

1 5 10 15

tca gtg aag gtt tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act cac tat 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

ggt tta cat tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144

Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

gga tgg atc aac acc aac act ggg aac cca acg tat gcc cag ggc ttc 192

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe

50 55 60

aca gga cgg ttt gtc ttc tcc ttg gac acc tct gtc agc acg gca tat 240

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag atc agc agc cta aag gct gaa gac act gcc gtg tat tac tgt 288

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga ggg gat tta gta gta cca act act ata tgg aac tac tac cac 336

Ala Arg Gly Asp Leu Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His

100 105 110

tac atg gag gtc tgg ggc aaa ggc acc ctg gtc acc gtc tcg agt 381

Tyr Met Glu Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 52

<211> 381

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(381)

<400> 52

cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg tct gag ttg aag aag cct ggg gcc 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

tca gtg atg gtt tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act cac tat 96

Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

gct ttg cat tgg gtg cgc cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144

Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

gga tgg ctc aat acc aac act gag aat cca acg tat gcc cag ggc ttc 192

Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe

50 55 60

aca gga cgg ttt gtc ttc tcc ttg gac acc tct gtc acc acg gca tat 240

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag atc aac agc cta aag gct gag gac act gcc gtg tat tac tgt 288

Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga ggg gat atg gta gta cca act act ata tgg aac tac tac tac 336

Ala Arg Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr Tyr

100 105 110

tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcg agt 381

Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 53

<211> 381

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(381)

<400> 53

cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg tct gag ttg aag cag cct ggg gcc 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Ala

1 5 10 15

tca gtg aag gtt tcc tgt aag gct tct gga tac acc ttc act cac tat 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

gct ttg cat tgg ttg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144

Ala Leu His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

gga tgg ctc aac acc aac act gag aac cca acg ttt gcc cag ggc ttc 192

Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe

50 55 60

aca gga cgt ttt gtc ttc tct ttg gac acc tct gtc acc acg gca tat 240

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag atc agc agc ctg aag gct gag gac act gcc gta tat tac tgt 288

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga ggg gat atg gta gta ccg act act ata tgg aac tac tac cac 336

Ala Arg Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His

100 105 110

ttc atg gac gtc tgg ggc aac ggg acc acg gtc acc gtc tcg agt 381

Phe Met Asp Val Trp Gly Asn Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 54

<211> 381

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(381)

<400> 54

cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg tct gag ttg aag cag cct ggg gcc 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Ala

1 5 10 15

tca gtg aag gtt tcc tgt aag gct tct gga tac acc ttc act cac tat 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr

20 25 30

gct ttg cat tgg ttg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144

Ala Leu His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

gga tgg ctc aac acc aac act gag aac cca acg ttt gcc cag ggc ttc 192

Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe

50 55 60

aca gga cgt ttt gtc ttc tct ttg gac acc tct gtc acc acg gca tat 240

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag atc agc agc ctg aag gct gag gac act gcc gta tat tac tgt 288

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga ggg gat atg gta gta ccg act act ata tgg aac tac tac cac 336

Ala Arg Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His

100 105 110

ttc atg gac gtc tgg ggc cag ggg acc acg gtc acc gtc tcg agt 381

Phe Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 55

<211> 321

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 55

gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tac 96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc cct cca 288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 321

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 56

<211> 366

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(366)

<400> 56

cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gcc gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc agc tac 96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag tgg agt agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc ata tat tac tgt 288

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga aag acg att gtt gga gtg gtt atg acg gct ttt gat atc tgg 336

Ala Arg Lys Thr Ile Val Gly Val Val Met Thr Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tcc agt 366

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 57

<211> 366

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(366)

<400> 57

gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc agc tac 96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tat tgt 288

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

gtg cga cag act ata gtg gct acg gta atg aat gct ttt gat atc tgg 336

Val Arg Gln Thr Ile Val Ala Thr Val Met Asn Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc agt 366

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 58

<211> 366

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(366)

<400> 58

cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gca gag gtg aaa aag tcc ggg gag 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Glu

1 5 10 15

tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga ttc agc ttt acc agc tac 96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

tgg atc gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tat agc ccg tcc ttc 192

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc ttc acc acc gcc tac 240

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Phe Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag tgg aac agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc ata tat tac tgt 288

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga cat act ata gtg gct acg ata tac aat gct ttt gat ttc tgg 336

Ala Arg His Thr Ile Val Ala Thr Ile Tyr Asn Ala Phe Asp Phe Trp

100 105 110

ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tcc agt 366

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 59

<211> 366

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(366)

<400> 59

cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agt ttt atc agc tac 96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggg atc atc tgg cct ggt gac tct gat acc aga tac agt ccg tcc ttc 192

Gly Ile Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc aat gtc gcc tac 240

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Val Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc ttg tat tat tgt 288

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

gtg aga caa acg att gtg gct acg act ggg ctt gct ttt gat atc tgg 336

Val Arg Gln Thr Ile Val Ala Thr Thr Gly Leu Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

ggc caa ggc acc ctg gtc acc gtc tcc agt 366

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 60

<211> 366

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(366)

<400> 60

gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt aca agt tat 96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gat aag tcc atc aac acc gcc tac 240

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga cgg acc ata gtg gca acg att cac tgg gct tct gac tac tgg 336

Ala Arg Arg Thr Ile Val Ala Thr Ile His Trp Ala Ser Asp Tyr Trp

100 105 110

ggc cag ggg aca atg gtc acc gtc tcc agt 366

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 61

<211> 11

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 61

Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 62

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 62

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Thr Ile Val Gly Val Val Met Thr Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 63

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 63

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gln Thr Ile Val Ala Thr Val Met Asn Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 64

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Phe Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Thr Ile Val Ala Thr Ile Tyr Asn Ala Phe Asp Phe Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 65

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Val Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gln Thr Ile Val Ala Thr Thr Gly Leu Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Thr Ile Val Ala Thr Ile His Trp Ala Ser Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 67

<211> 4

<212> Белок

<213> Artificial Sequence

<400> 67

Gly Lys Lys Ala

1

<210> 68

<211> 5

<212> Белок

<213> Artificial Sequence

<400> 68

Gly Lys Ala Lys Ala

1 5

<210> 69

<211> 4

<212> Белок

<213> Artificial Sequence

<400> 69

Gly Arg Arg Ala

1

<210> 70

<211> 5

<212> Белок

<213> Artificial Sequence

<400> 70

Gly Arg Ala Arg Ala

1 5

<210> 71

<211> 331

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 71

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly

325 330

<210> 72

<211> 334

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 72

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Lys Lys Ala

325 330

<210> 73

<211> 335

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 73

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Lys Ala Lys Ala

325 330 335

<210> 74

<211> 334

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 74

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Arg Arg Ala

325 330

<210> 75

<211> 335

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 75

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Arg Ala Arg Ala

325 330 335

<210> 76

<211> 366

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(366)

<400> 76

cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gcc gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc agc tac 96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag tgg agt agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc ata tat tac tgt 288

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga aag acg att gtt gga gtg gtt atg acg gct ttt gat atc tgg 336

Ala Arg Lys Thr Ile Val Gly Val Val Met Thr Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

ggc cga ggg aca atg gtc acc gtc tcc agt 366

Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 77

<211> 366

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(366)

<400> 77

gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc agc tac 96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tat tgt 288

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

gtg cga cag act ata gtg gct acg gta atg aat gct ttt gat atc tgg 336

Val Arg Gln Thr Ile Val Ala Thr Val Met Asn Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

ggc cga ggg acc acg gtc acc gtc tcc agt 366

Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 78

<211> 366

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(366)

<400> 78

cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gca gag gtg aaa aag tcc ggg gag 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Glu

1 5 10 15

tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga ttc agc ttt acc agc tac 96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

tgg atc gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tat agc ccg tcc ttc 192

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc ttc acc acc gcc tac 240

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Phe Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag tgg aac agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc ata tat tac tgt 288

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga cat act ata gtg gct acg ata tac aat gct ttt gat ttc tgg 336

Ala Arg His Thr Ile Val Ala Thr Ile Tyr Asn Ala Phe Asp Phe Trp

100 105 110

ggc cga ggg aca atg gtc acc gtc tcc agt 366

Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 79

<211> 366

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(366)

<400> 79

cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agt ttt atc agc tac 96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggg atc atc tgg cct ggt gac tct gat acc aga tac agt ccg tcc ttc 192

Gly Ile Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc aat gtc gcc tac 240

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Val Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc ttg tat tat tgt 288

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

gtg aga caa acg att gtg gct acg act ggg ctt gct ttt gat atc tgg 336

Val Arg Gln Thr Ile Val Ala Thr Thr Gly Leu Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

ggc cga ggc acc ctg gtc acc gtc tcc agt 366

Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 80

<211> 366

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(366)

<400> 80

gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt aca agt tat 96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gat aag tcc atc aac acc gcc tac 240

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga cgg acc ata gtg gca acg att cac tgg gct tct gac tac tgg 336

Ala Arg Arg Thr Ile Val Ala Thr Ile His Trp Ala Ser Asp Tyr Trp

100 105 110

ggc cga ggg aca atg gtc acc gtc tcc agt 366

Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<---

Claims

1. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, первое плечо которого специфически связывается с PD-1, и второе плечо которого специфически связывается с CD19, и специфически связывающееся с PD-1 и CD19, соответственно,

где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, содержит любую одну VH, выбранную из следующих:

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и

(E) VH, имеющая

второе плечо, специфически связывающееся с CD19, содержит любую одну VH, выбранную из следующих:

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, и второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеет VL, имеющую

(c) VL-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, соответственно.

2. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 1,

где (i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:49.

3. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 1,

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

4. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 1,

(c) VH-CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, и

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

5. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 1, где

(i) VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

6. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 1, где

(A) VH, имеющая

(B) VH, имеющая

(C) VH, имеющая

(D) VH, имеющая

(E) VH, имеющая

7. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-6, где в VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, FR1, FR2 и FR3 соответствуют аминокислотным последовательностям, кодируемым геном V зародышевой линии IGHV7-4-1, который может иметь соматическую мутацию(ии), соответственно, и FR4 содержит аминокислотную последовательность, кодируемую геном J зародышевой линии JH6c, который может иметь соматическую мутацию(ии) (исключая аминокислотную последовательность, включенную в VH-CDR3).

8. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-7, где FR1, FR2 и FR3 в VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, соответствуют аминокислотным последовательностям, кодируемым геном V зародышевой линии IGHV5-51, который может иметь соматическую(ие) мутацию(и), соответственно.

9. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-8, где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности VH.

10. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-9, где VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности VH.

11. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 1, где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

12. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 1 или 2, где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

13. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 1 или 3, где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

14. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 1 или 4, где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

15. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 1 или 5, где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

16. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 1 или 6, где VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, и VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержит любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66.

17. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-16, где VL первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, и VL второго плеча, специфически связывающегося с CD19, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, соответственно.

18. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, первое плечо которого специфически связывается с PD-1, и второе плечо которого специфически связывается с CD19, и специфически связывающееся с PD-1 и CD19, соответственно, где

(A) первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, имеет VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и

(B) второе плечо, специфически связывающееся с CD19, имеет VH, содержащую любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25.

19. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-18, где первое плечо, специфически связывающееся с PD-1, обеспечивает взаимодействие между PD-1 и PD-L1.

20. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-19, где биспецифическое антитело представляет собой антитело IgG.

21. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 20, где антитело IgG представляет собой антитело IgG₁ или антитело IgG₄.

22. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 20, где антитело IgG представляет собой антитело IgG₁.

23. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 22, где связывание с рецептором Fc устранено или снижено.

24. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по п. 23, где в двух константных участках тяжелой цепи биспецифического антитела, каждый лейцин в положении 235 в соответствии с системой нумерации EU заменен на глицин и/или каждый глицин в положении 236 заменен на аргинин.

25. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 22-24, где

в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, лейцин в положении 351 в соответствии с системой нумерации EU заменен на лизин и треонин в положении 366 заменен на лизин, и

в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, лейцин в положении 351 заменен на аспарагиновую кислоту и лейцин в положении 368 заменен на глутаминовую кислоту.

26. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 22-24, где

в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, лейцин в положении 351 в соответствии с системой нумерации EU заменен на аспарагиновую кислоту и лейцин в положении 368 заменен на глутаминовую кислоту, и

в константном участке тяжелой цепи, имеющей VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, лейцин в положении 351 заменен на лизин и треонин в положении 366 заменен на лизин.

27. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 22-26, где в двух константных участках тяжелой цепи биспецифического антитела, каждый лизин в положении 447 в соответствии с системой нумерации EU удален.

28. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-23, где тяжелая цепь, имеющая VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23.

29. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-24, 26 и 28, где тяжелая цепь, имеющая VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, имеет константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 и SEQ ID NO:75.

30. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-29, где легкая цепь, имеющая VL первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, и/или легкая цепь, имеющая VL второго плеча, специфически связывающегося с CD19, имеют/имеет константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29.

31. Биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, первое плечо которого, специфически связывается с PD-1, и второе плечо которого, специфически связывается с CD19, и специфически связывается с PD-1 и CD19, соответственно, где

(A) тяжелая цепь, имеющая

VH первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет VH, содержащую любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, и

константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23,

(B) легкая цепь, имеющая

VL первого плеча, специфически связывающегося с PD-1, имеет VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и

константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29,

(C) тяжелая цепь, имеющая

VH второго плеча, специфически связывающегося с CD19, имеет VH, содержащую любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, и

константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24, и

(D) легкая цепь, имеющая

VL второго плеча, специфически связывающегося с CD19, имеет VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и

константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29.

32. Фармацевтическая композиция для профилактики, подавления прогрессии симптомов, подавления рецидива и/или лечения аутоиммунных заболеваний, содержащая биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-35, и фармацевтически приемлемый носитель.

33. Фармацевтическая композиция по п. 32, где аутоиммунным заболеванием является болезнь Бехчета, системная красная волчанка, хроническая дискоидная красная волчанка, рассеянный склероз, склеродермия, полимиозит, дерматомиозит, узелковый периартериит, синдром аортита, злокачественный ревматоидный артрит, ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, спондилоартрит, смешанное заболевание соединительной ткани, синдром Шегрена, болезнь Стилла у взрослых, васкулит, аллергический гранулематозный васкулит, гиперчувствительный васкулит, ревматоидный васкулит, васкулит крупных сосудов, ANCA-ассоциированный васкулит, синдром Когана, синдром RS3PE, височный артериит, ревматическая полимиалгия, фибромиалгия, синдром антифосфолипидных антител, эозинофильный фасциит, заболевания, связанные с IgG₄, синдром Гийена-Барре, миастения, хронический атрофический гастрит, аутоиммунный гепатит, неалкогольный стеатогепатит, первичный билиарный цирроз, синдром Гудпастчера, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, мегалобластная анемия, аутоиммунная гемолитическая анемия, пернициозная анемия, аутоиммунная нейтропения, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, базедова болезнь, болезнь Хашимото, аутоиммунная надпочечниковая недостаточность, первичный гипотиреоз, болезнь Аддисона, идиопатическая болезнь Аддисона, сахарный диабет I типа, медленно прогрессирующий сахарный диабет I типа, очаговая склеродермия, псориаз, псориатический артрит, буллезный пемфигоид, пузырчатка, пемфигоид, гестационный герпес, линейный буллезный дерматоз IgA, приобретенный буллезный эпидермолиз, очаговая алопеция, витилиго, вульгарное витилиго, оптический нейромиелит, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, мультифокальная моторная нейропатия, саркоидоз, гигантоклеточный артериит, боковой амиотрофический склероз, болезнь Харада, аутоиммунная оптическая нейропатия, идиопатическая азооспермия, привычный аборт, воспалительное заболевание кишечника, целиакия, анкилозирующий спондилит, тяжелая астма, хроническая крапивница, трансплантационный иммунитет, семейная средиземноморская лихорадка, эозинофильный хронический риносинусит, дилатационная кардиомиопатия, системный мастоцитоз или миозит с тельцами включения.

34. Фармацевтическая композиция по п. 32 или 33, которую вводят вместе с одним или несколькими лекарственными средствами, выбранными из инсулинового препарата, сульфонилмочевинного агента, быстродействующего промотора секреции инсулина, бигуанидинового препарата, агента, улучшающего инсулинорезистентность, ингибитора α-глюкозидазы, терапевтического агента диабетической невропатии, препарата аналога GLP-1, ингибитора DPP-4, стероидного агента, интерферона β-1a, интерферона β-1b, глатирамера ацетата, митоксантрона, азатиоприна, циклофосфамида, циклоспорина, метотрексата, кладрибина, адренокортикотропного гормона (ACTH), кортикотропина, мизорибина, такролимуса, финголимода, алемтузумаба, иммунодепрессанта, белимумаба, противоревматического агента, антицитокинового агента и абатацепта.

35. Фармацевтическая композиция для профилактики, подавления прогрессии симптомов, подавления рецидива и/или лечения болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD), содержащая биспецифическое антитело, или фрагмент этого антитела, по любому из пп. 1-31, в качестве активного ингредиента.

36. Биспецифическое антитело, первое плечо которого специфически связывается с PD-1, и второе плечо которого специфически связывается с CD19 и специфически связывающееся с PD-1 и CD19, соответственно, где

(А) тяжелая цепь, имеющая

VH первого плеча, специфически связывающаяся с PD-1, имеет VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и

константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23,

(B) легкая цепь, имеющая

VL первого плеча, специфически связывающаяся с PD-1, имеет VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и

константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29,

(C) тяжелая цепь, имеющая

VH второго плеча, специфически связывающаяся с CD19, имеет VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NО: 62, и

константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24, и

(D) легкая цепь, имеющая

VL второго плеча, специфически связывающаяся с CD19, имеет VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и

константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29.