【発明の詳細な説明】
筋無力症の処置のためのヌクレオチドおよびペプチド配列
本発明は、後天性自己免疫性筋無力症(aquired autoimmunemyasthenia)の予防
もしくは処置を目的とした薬剤を得るためのヌクレオチドおよびペプチド配列の
用途に関する。本発明はまた、上述のヌクレオチドおよびペプチド配列を含む医
薬組成物およびワクチンにも関する。
筋無力症（重症筋無力症）は、運動疲労性および筋力低下の状態によって特徴
付けられる自己免疫疾患である。この疾患は、筋肉上のニコチン性アセチルコリ
ン受容体(AChR)を認識し、それにより神経筋伝達に干渉する自己抗体により引き
起こされる(1)。これらの抗AChR抗体は、８５％の患者の血清中に見いだされ(2)
、それらの少なくともいくつかは病原性である(3,4)。ヘルパーＴ細胞の存在お
よび活性化は、筋無力症の病因になる(5-9)。胸腺がこの病理の生理に直接的な
役割を果たしていることは、臨床過程での胸腺切除の好ましい効果(10,11)およ
びその頻繁な形態学的異常（５０−７０％の過形成、１０−１５％の胸腺腫瘍(t
hymoma)）により確認される(12-14)。
いくつかの実験結果は、一次自己感作および／または自己免疫プロセスの誘発
と永続における胸腺の役割を支持している：胸腺Ｔ細胞およびＢ細胞の機能亢進
(15-18)、Ｂ細胞およびＴ細胞のレベルでのアセチルコリン受容体に対する自己
反応性(18-23)、自己抗原の存在(24)、上皮細胞の機能的異常、特にIL-6の産生
における障害(25)。
簡単に要約すると、上述の抗AChR自己抗体の産生は、クラスIIのMHC（主要組
織適合複合体）に限定されるCD4+ヘルパーＴ細胞の制御下にある。マクロファー
ジ内または自己抗原、すなわちAChRを含有している他の細胞内におけるその抗原
の分解により産生されるペプチドは、クラスII MHC
分子であるHLA DRにカップリングする。Ｔ細胞はこのペプチド-HLA DR複合体を
認識することにより、受容体の中間物（Ｔ細胞受容体とも呼ばれる）により刺激
され、このようにして刺激されたＴ細胞は、次にＢ細胞を刺激し、それがAChRを
認識する抗体を産生する。
この病因の免疫遺伝学的側面は、多数の患者についてのHLA型分類により研究
されてきた。ハプロタイプHLA DR3またはDR5は、この病因と相互に関連させて血
清学的に定義されてきた(26-28)。HLA DR3との強い関わりは胸腺過形成の若年患
者に見いだされてきた(27)。分子型分類によりこれらの結果が確認され(29)、胸
腺過形成の患者に頻繁に発現しているアレル体HLA-DQ（DQA1*0501よびDQB1*0201
）が同定された(30)。
筋無力症に関与するAChR自己抗原は、分子レベルおよび機能的レベルでよく特
徴付けられており(31)、いくつかのモノクローナル抗体も生産されているので(3
2)、免疫優性な(immunodominant)Ｂエピトープがαサブユニット上で同定された
(MIR、HIR)(33-35)。Ｔ細胞のエピトープもまた組換えフラグメントおよび合成
ペプチドを用いて同定され(36-40)、それにより、自己抗原の多重エピトープ性
が明らかになった。
本発明の目的は、後天性自己免疫性筋無力症の処置または予防を目的とした薬
剤を提供することであり、これらの薬剤は、上記のペプチド−HLADR複合体を認
識して結合することができるＴ細胞受容体のセグメントか、このセグメントをコ
ードする遺伝子もしくはＲＮＡ、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のいず
れかに特異的に結合することができる分子を、上記の複合体がもはや該セグメン
トに結合し得ないか、上記の遺伝子もしくはｍＲＮＡがもはや該セグメントに相
当するペプチド配列に翻訳され得ないよう十分に安定な方法で（あるいは十分に
安定な平衡で）含有している。
本発明の他の目的は、生物内で、Ｔ細胞受容体のセグメントまたはこのセグメ
ントをコードする遺伝子もしくはＲＮＡに特異的に結合することのできる分子の
産生を引き起こすことができる薬剤を提供することである。
本発明の他の目的は、筋無力症に対するワクチンとして用いられ得る薬剤を提
供することである。このワクチンは、生物内でＴ細胞受容体のセグメントに特異
的に結合し得る抗体の産生を引き起こし得る分子、または、生物内で上記の抗体
の産生を引き起こし得る分子をコードするヌクレオチド配列を含有するベクター
のいずれかを含んでいる。
しかしながら、Ｔ細胞受容体は高度に多型性であるということに注意すること
が適切である。それは２つのサブユニット、αおよびβからなり、各々はいくつ
かの遺伝子(V,D,J,C)の組み合わせによりコードされている。Ｖ遺伝子の２４の
ファミリーがβ鎖について記載されている。
αおよびβサブユニットの種々の領域をコードする特定の遺伝子のファミリー
を一方とし、筋無力症をもう一方とする二者間の相関関係は現在まで実証されて
おらず、その結果、現在まで、Ｔ細胞受容体の特定のセグメント、またはそのよ
うな特定のセグメントをコードする遺伝子のセグメントをブロックすることによ
るいかなる治療方法をも考えることが不可能であった。
本発明は、Ｔ細胞受容体のＶβ5.1セグメントが、筋無力症と、より特定する
とハプロタイプHLA DR3の患者、すなわちタイプHLA DR3のクラスII組織適合性複
合体（HLA DR）の分子を発現している患者において、密接に関連しているという
事実の発明者によってなされた発見の結果である。
上記のおよび以下において、筋無力症は、後天性自己免疫性筋無力症を意味す
ると理解されるというのが適切である。
このテキストの以降の部分において、以下の配列表に記載されたSEQ
ID NO １〜SEQ ID NO ５の配列が引用され、これらの配列は以下の通りである
：
SEQ ID NO １によって表されるＤＮＡ配列は、Ｔ細胞受容体のＶβ5.1
のセグメントをコードする；
SEQ ID NO ２によって表されるアミノ酸配列は、上記のセグメントＶ
β5.1を含み、そのセグメントは２０位と１１３位に位置するアミノ酸によって
境界が画定され、１位と１９位に位置するアミノ酸により境界が画定されるシグ
ナルペプチドにより先行されている；
SEQ ID NO ３により表されるｍＲＮＡ配列は、上記の配列SEQ ID NO
２、特に上記のセグメントＶβ5.1をコードする；
SEQ ID NO ４によって表されるアンチセンスＤＮＡ配列は、SEQ ID NO
１により表される配列の相補配列である；
SEQ ID NO ５によって表されるアンチセンスＲＮＡ配列は、SEQ ID NO
３により表される配列の相補配列である。
本発明は、筋無力症の予防もしくは処置において用いられ得る薬剤を得るため
のヌクレオチドもしくはペプチド配列の用途に関し、そのヌクレオチド配列は：
−ヒトＴ細胞受容体のセグメントＶβ5.1のアミノ酸配列の全てまたは
一部を認識し、それとの免疫学的複合体を形成し得る抗体の形成をそれ自身が引
き起こし得るペプチド配列をコードすることができるもの、または
−該セグメントＶβ5.1のアミノ酸配列の全てまたは一部を認識し、そ
れとの免疫学的複合体を形成し得る抗体をそれ自身が表すペプチド配列をコード
することができるもの、
−該セグメントＶβ5.1のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
によりコードされるｍＲＮＡの全てまたは一部とそれ自身がハイブリダイズし得
るアンチセンスＲＮＡをコードすることができるもの、または
−該セグメントＶβ5.1のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の全て
または一部と、あるいはこのＤＮＡ配列によりコードされるｍＲＮＡの全てまた
は一部とそれ自身がハイブリダイズし得るもの、
から選択され、該ペプチド配列は：
−ヒトＴ細胞受容体のセグメントＶβ5.1を認識し、それとの免疫学的
複合体を形成し得る抗体の形成をそれ自身が引き起こし得るもの、または、
−Ｔ細胞受容体のセグメントＶβ5.1アミノ酸配列の全てまたは一部を
認識し、それとの免疫学的複合体を形成し得る抗体に相当するもの、から選択さ
れる。
本発明は、より特定すると、ハプロタイプHLA DR3の患者において筋無力症の
予防もしくは処置に用いられ得る薬剤を得るための、上記のヌクレオチドもしく
はペプチド配列の用途に関する。
筋無力症の予防もしくは処置のために薬剤が用いられ得る患者は、好ましくは
：
−一般に、４０歳になる前にその疾患を発症した患者、
−全身性の筋無力症、最も頻繁には重篤な形態：Ossermann分類(41)に
よって定義されるグレードIIBの筋無力症に罹っている、
−過形成胸腺に罹っている、胸腺過形成は顕著な胸腺重量とリンパ小節
の存在により定義される(12-14)、
−１０nMより高い（かつ、参考文献(42)に記載された方法により測定さ
れ得る）AChR受容体に対する抗体の力価を有している、
患者である。
本発明の好ましい実施態様によると、用いられるヌクレオチド配列は、ヒトＴ
細胞受容体のセグメントＶβ5.1のアミノ酸配列の全てまたは一部を認識し、そ
れとの免疫学的複合体を形成し得る抗体の形成をそれ自身が引き起こし得るペプ
チド配列をコードすることのできるものである。そのようなヌクレオチド配列は
、好都合には：
−SEQ ID NO １によって表されるＤＮＡ配列であって、特に、ヒトＴ
細胞受容体のセグメントＶβ5.1のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列
を含み、該ペプチド配列は、SEQ ID NO ２によって表される配列の２０位と１
１３位に位置するアミノ酸により境界が画定される９４アミノ酸の鎖からなる、
ＤＮＡ配列
−SEQ ID NO ２によって表されるペプチド配列の少なくとも約５個の
隣接したアミノ酸のペプチドフラグメントをコードし得る、SEQ ID NO １によ
って表されるＤＮＡ配列の少なくとも約１５個の隣接したヌクレオチドの任意の
ＤＮＡフラグメントであって、該ペプチドフラグメントは、該セグメントＶβ5.
1のアミノ酸配列の全てまたは一部を認識し、それとの免疫学的複合体を形成し
得る抗体の形成をそれ自身が引き起こし得るペプチドである、ＤＮＡフラグメン
ト、
−例えば、変異により、SEQ ID NO １によって表されるＤＮＡ配列か
ら、あるいは上記で定義されたＤＮＡフラグメントから、特にSEQ ID N0 １に
よって表されるＤＮＡ配列または上記のＤＮＡフラグメントの１個（またはそれ
以上）のヌクレオチドの置換、サプレッションもしくは付加により誘導される任
意のＤＮＡ配列であって、該誘導されたＤＮＡ配列は、SEQ ID NO ２によって
表されるペプチド配列と同一の、または上で定義したペプチドフラグメントと同
一のペプチド配列か、あるいはSEQ ID NO ２で表されたものまたは上で定義さ
れたペプチドフラグメン
トから、特に、SEQ ID NO ２によって表されるペプチド配列または上で定義し
たペプチドフラグメントの１個（またはそれ以上）のアミノ酸の置換、サプレッ
ションもしくは付加により誘導されたペプチド配列のいずれかをコードすること
ができ、該誘導されたペプチド配列は、該セグメントＶβ5.1のアミノ酸配列の
全てまたは一部を認識し、それとの免疫学的複合体を形成し得る抗体の形成をそ
れ自身が引き起こし得る、ＤＮＡ配列、から選択される。
抗体の形成をそれ自身が引き起こし得るペプチド配列とは、上記でおよび以下
で、特に、個体の血流中にある場合、この個体において後者の免疫系による抗体
の産生により免疫応答を引き出し得る任意のペプチド配列であって、これらの抗
体が、上記のセグメントＶβ5.1のペプチド配列もしくはアミノ酸配列を特異的
に認識し、それとの安定な免疫学的複合体を形成し得るペプチド配列を意味する
と理解されるということはいうまでもない。
上記のＤＮＡフラグメントは、好都合には、SEQ ID NO １によって表される
ＤＮＡ配列の約１５隣接ヌクレオチド〜約４０８隣接ヌクレオチドの、好ましく
は約６０隣接ヌクレオチド〜約３００隣接ヌクレオチドを含み、それらは、各々
、SEQ ID NO ２によって表されるペプチド配列の約５隣接アミノ酸〜約１３６
隣接アミノ酸の、好ましくは約２０アミノ酸〜約１００アミノ酸のペプチドフラ
グメントをコードすることができる。
好ましくは、本発明において用いられ得るＤＮＡフラグメントは：
−SEQ ID NO １によって表される配列の１位と３３９位に位置するヌ
クレオチドにより境界が画定され、SEQ ID NO ２によって表される配列の１位
と１９位に位置するアミノ酸によって境界が画定されるシグナルペプチドを含む
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、
このシグナルペプチドは、SEQ ID NO ２によって表される配列の２０位と１１
３位に位置するアミノ酸によって境界が画定されるセグメントＶβ5.1がこれに
続く、ヌクレオチド配列
−SEQ ID NO １によって表される配列の５８位と３３９位に位置する
ヌクレオチドにより境界が画定され、SEQ ID NO ２によって表される配列の２
０位と１１３位に位置するアミノ酸によって境界が画定されるセグメントＶβ5.
1をコードするヌクレオチド配列、
−SEQ ID NO １によって表される配列の１位と５７位に位置するヌク
レオチドにより境界が画定され、SEQ ID NO ２によって表される配列の１位と
１９位に位置するアミノ酸によって境界が画定される上記のシグナルペプチドを
コードするヌクレオチド配列、
の全てまたは一部を含むものである。
本発明に用いられ得る好ましいＤＮＡフラグメントは、約６０ヌクレオチド〜
約３０ヌクレオチドの上述のものであり、セグメントＶβ5.1のＣＤＲ１領域を
コードするヌクレオチド配列の全てまたは一部、および／またはセグメントＶβ
5.1のＣＤＲ２領域をコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部を含んでい
る。
上記のセグメントＶβ5.1のＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域については、以下の
論文を基にして決定することが可能である：
-Kronenberg et al.，Ann.Rev.Immunol.，4:529-591(1986)，
-Novotny et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，83:742-746(1986)，
-Chothia et al.，The EMBO Journal，7，no.12，3745-3755(1988)，
-Claverie et al.，Immunology Today，vol．10,10-14(1989)，
-Davis et al.，Nature，334，395-402(1988)，
-Jorgensen et al.，Ann.Rev.Immunol.，10,835-873(1992)，
-Bellio et al.，J.Exp.Med.，129，1087-1097(1994)，
-Prochnika-Chalufour，International Immunology，vol．3，no.9，85
3-864(1991)，
-Chien and Davis，Immunology Today，vol.14，no.12，597-602(1993)
。
特に好ましい上記のＤＮＡフラグメントは：
−SEQ ID NO１によって表される配列の１３３位と１５０位に位置する
ヌクレオチドによって境界が画定され、SEQ ID NO ２によって表される配列の
４５位と５０位に位置するアミノ酸によって境界が画定される６アミノ酸のＣＤ
ＲＩ領域をコードする全てまたは一部のヌクレオチド配列、および／または
-SEQ ID NO１によって表される配列の１９９位と２４３位に位置するヌ
クレオチドによって境界が画定され、SEQ ID NO ２によって表される配列の６
７位と８１位に位置するアミノ酸によって境界が画定される１５アミノ酸のＣＤ
Ｒ２領域をコードする全てまたは一部のヌクレオチド配列、
を含む。
上記の誘導されたＤＮＡ配列を構成するヌクレオチドと、SEQ IDNO １によっ
て表されるＤＮＡ配列もしくは上記のＤＮＡフラグメントを構成するそれらとの
間の相同性％は、好都合には、少なくとも約６０％、好ましくは約９０％である
。
上記の誘導されたペプチド配列を構成するアミノ酸と、SEQ ID NO ２によっ
て表されるペプチド配列もしくは上記のペプチドフラグメントを構成するそれら
との間の相同性％もまた、好都合には、少なくとも約６０％、好ましくは約９０
％である。
本発明の別の好ましい実施態様によると、用いられるヌクレオチド配列
は、アンチセンスＲＮＡをコードし得るものから選択され、このアンチセンスＲ
ＮＡ自身は、SEQ ID NO ３によって表されるｍＲＮＡの全てまたは一部とハイ
ブリダイズし得、該ｍＲＮＡは、該セグメントＶβ5.1のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ配列、すなわちSEQ ID NO １によって表されるＤＮＡ配列によって
コードされる。このようなヌクレオチド配列は、好都合には：
−SEQ ID NO ４によって表されるアンチセンスＤＮＡ配列であって、
該ＤＮＡ配列は、SEQ ID NO ５によって表されるアンチセンスＲＮＡをコード
し、SEQ ID NO ３によって表されるｍＲＮＡとハイブリダイズし得る、
-SEQ ID NO ４によって表されるアンチセンスＤＮＡ配列の少なくとも
約１２個の隣接したヌクレオチドの任意のアンチセンスＤＮＡフラグメントであ
って、SEQ ID NO ５によって表されるアンチセンスＲＮＡの少なくとも約１２
個の隣接したヌクレオチドのアンチセンスＲＮＡフラグメントをコードし得、該
アンチセンスＲＮＡフラグメントは上で定義したｍＲＮＡの全てまたは一部とハ
イブリダイズし得る、
−例えば、変異により、SEQ ID NO ４によって表されるアンチセンス
ＤＮＡ配列から、あるいは上記で定義されたアンチセンスＤＮＡフラグメントか
ら、特に上記のアンチセンスＤＮＡフラグメントのアンチセンスＤＮＡ配列の１
個（またはそれ以上）のヌクレオチドの置換、サプレッションもしくは付加によ
り誘導される任意のアンチセンスＤＮＡ配列であって、該アンチセンスＤＮＡ配
列は、SEQ ID NO ５によって表されるそれと同一であるかまたは上で定義した
アンチセンスＲＮＡフラグメントと同一のアンチセンスＲＮＡ、あるいはSEQ ID
NO ５によって表されたものから、または上で定義されたアンチセンスＲＮＡ
フラグメントから、
特にSEQ ID NO ５によって表されるアンチセンスＲＮＡまたは上で定義したア
ンチセンスＲＮＡフラグメントの１個（またはそれ以上）のヌクレオチドの置換
、サプレッションもしくは付加により誘導されたアンチセンスＲＮＡのいずれか
をコードすることができ、該誘導されたアンチセンスＲＮＡは、上で定義された
ｍＲＮＡの全てまたは一部とハイブリダイズし得る、
ものから選択される。
SEQ ID NO １、SEQ ID NO ３、SEQ ID NO ４、およびSEQ ID NO ５によっ
て表される本発明のヌクレオチド配列、誘導された配列および上記の本発明の配
列のフラグメントは、５’→３’の意味で表されると考えなければならないのは
いうまでもない。
上記のような５’→３’の相補的な配列の最初のヌクレオチドは、したがって
、ペプチド配列Ｖβ5.1（またはこのペプチド配列もしくは誘導ペプチドのフラ
グメント）をコードする５’→３’の配列の最後のヌクレオチドの相補物であり
、この相補的配列の２番目のヌクレオチドは、ペプチド配列Ｖβ5.1をコードす
る配列の最後から２番目の相補物であるなど、ペプチド配列Ｖβ5.1をコードす
る配列の最初のヌクレオチドの相補物である該相補的配列の最後のヌクレオチド
までつづく。
SEQ ID NO ４によって表される上記の相補的配列によってコードされるアン
チセンスＲＮＡは、したがって、このアンチセンスＲＮＡが５’→３’で表され
る場合に、その最初のヌクレオチドが、ペプチド配列Ｖβ5.1をコードするSEQ I
D NO １によって表されるＤＮＡ配列の最後のヌクレオチドに対応し、したがっ
て、後者によってコードされるSEQ ID NO ３によって表されるｍＲＮＡの最後
のヌクレオチドとハイブリダイズし、一方、その最後のヌクレオチドは、ペプチ
ド配列Ｖβ5.1をコードす
るＤＮＡ配列の最初のヌクレオチドに対応し、したがって、後者によってコード
されるｍＲＮＡの最初のヌクレオチドとハイブリダイズする。
上記のおよび以下のアンチセンスＲＮＡは、したがって、上記の相補的配列に
よってコードされ、ペプチド配列Ｖβ5.1（または、誘導されたフラグメントも
しくはペプチド）をコードする配列によってコードされるｍＲＮＡに対して逆の
意味（３’→５’の）で表される任意のＲＮＡを意味すると理解され、後者のｍ
ＲＮＡはまたセンスｍＲＮＡ（５’→３’）とも呼ばれる。
用語アンチセンスＲＮＡは、したがって、メッセンジャーＲＮＡの塩基配列の
相補的ＲＮＡ配列に関し、用語「相補的」とはこの文脈上、アンチセンス配列（
３’→５’の意で読む）の各塩基（または大部分の塩基）は、メッセンジャーＲ
ＮＡ（配列は５’→３’で読まれる）の対応する塩基と対を形成し得る（ＧとＣ
、ＡとＵ）ということを意味すると理解される。このアンチセンスＲＮＡは、非
コードＤＮＡ鎖（ナンセンス鎖）の転写により産生されるＲＮＡである。
このアンチセンス手法は、欧州特許第240,208号、または"Antisense strategi
es"Annals of the New York Academy of Sciences，Volume 660(1992)、編者：R
enato Baserga、David T.，Denhardt、またはMedecine/Sciences，10:250-281（
1994）、またはGrooke S.T.，Lebleu B.:Antisense Research and Applications
，New York: CRC Press Inc.，1993に、より詳細に記載されている。
本件におけるペプチド配列Ｖβ5.1の状況の下では、アンチセンス戦略による
タンパク質合成の阻害は、２つの相補的なＲＮＡ（センスおよびアンチセンス）
間の二本鎖の形成、それによるタンパク質生成の妨害の結果であると考えられる
。しかしながら、その機作は依然として不明である。
このＲＮＡ−ＲＮＡ複合体は、続く転写または変異、輸送、もしくは翻訳のいず
れかを妨げるかもしれないし、あるいはｍＲＮＡの分解さえ導くかもしれない。
上記のアンチセンスＤＮＡフラグメントは、好都合には、SEQ ID NO ４によ
って表されるＤＮＡ配列の約１２隣接ヌクレオチド〜約３０隣接ヌクレオチド、
好ましくは約１５隣接ヌクレオチド〜約２０隣接ヌクレオチドを含み、これらは
、各々、SEQ ID NO ５によって表されるアンチセンスＲＮＡ配列の約１２〜約
３０ヌクレオチド、好ましくは約１５ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドのアン
チセンスＲＮＡフラグメントをコードすることができる。
本発明に用いられ得る好ましいアンチセンスＤＮＡフラグメントは：
−SEQ ID NO ４によって表される配列の７３位と４１１位に位置する
ヌクレオチドによって境界を画定され、SEQ ID NO ５によって表される配列の
７３位と４１１位に位置するヌクレオチドによって境界を画定されるアンチセン
スＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、
−SEQ ID NO ４によって表される配列の７３位と３５４位に位置する
ヌクレオチドによって境界を画定され、SEQ ID NO ５によって表される配列の
７３位と３５４位に位置するヌクレオチドによって境界を画定されるアンチセン
スＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、
−SEQ ID NO ４によって表される配列の３５５位と４１１位に位置す
るヌクレオチドによって境界を画定され、SEQ ID NO ５によって表される配列
の３５５位と４１１位に位置するヌクレオチドによって境界を画定されるアンチ
センスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、
の全てまたは一部を含むものである。
上記の誘導されたアンチセンスＤＮＡ配列を構成するヌクレオチドと、
SEQ ID NO ４によって表されるアンチセンスＤＮＡ配列または上記のアンチセ
ンスＤＮＡフラグメントを構成するものとの間の相同性％は、好都合には、少な
くとも約６０％、好ましくは約９０％である。
上記の誘導されたアンチセンスＲＮＡ配列を構成するヌクレオチドと、SEQ ID
NO ５によって表されるアンチセンスＲＮＡ配列を構成するものとの間の相同
性％もまた、好都合には、少なくとも約６０％、好ましくは約９０％である。
上記のようなペプチド配列もしくはアンチセンスＲＮＡをコードすることので
きるものから選択され、本発明において用いられるヌクレオチド配列は、好都合
には、上記のヌクレオチド配列の転写を可能にするのに必要な要素、特に、転写
プロモーターおよび転写ターミネーターを包含する組換えヌクレオチド配列内に
含有されている。
この点で、本発明は、上記のようなペプチド配列もしくはアンチセンスＲＮＡ
をコードする本発明の１つ（またはそれ以上）のヌクレオチド配列を含む任意の
組換えヌクレオチド配列、およびこれらの配列の転写に必要な要素、特に、転写
プロモーターおよび転写ターミネーターに関する。
適切ならば、本発明の組換えヌクレオチド配列は、アミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列の
上流および／または下流に位置し、該組換えヌクレオチド配列は、したがって、
アミノ酸配列、特に、本発明の上記ペプチド配列に関してそれ自身によりそのハ
イブリッドタンパク質の免疫原性特性を増大させ得るアミノ酸配列がそれに先行
するかおよび／またはそれに続く上記のような本発明のペプチド配列を含むハイ
ブリッドタンパク質をコードする。
上記の本発明の組換えヌクレオチド配列は、好都合には、ベクターに、特に、
プラスミドに挿入され、それらは生物内で該組換えヌクレオチド配
列の発現を可能にし得る。
この点で、本発明は、任意のベクター、特に、上で定義した１つ（もしくはそ
れ以上）の組換えヌクレオチド配列を含有する任意のプラスミドに関する。
本発明は、より特定すると、上記のベクター、特に本発明の組換えヌクレオチ
ド配列を含有するプラスミドの用途に関し、後者は上記のようなペプチド配列を
コードする本発明のヌクレオチド配列を少なくとも１つ含有し、そのペプチド配
列は、特に、上記の患者の処置における予防もしくは治療に用いられ得る筋無力
症に対するワクチンを得るための、ヒトＴ細胞受容体のセグメントＶβ5.1のア
ミノ酸配列の全てまたは一部を認識し、それとの免疫学的複合体を形成し得る抗
体の形成を引き起こし得、これらのワクチンはまたnakedＤＮＡワクチンとも呼
ばれる。
例示すると、一般的な概論および言及し得るnakedＤＮＡワクチンに特に関連
したものは、以下の通りである：Ladenheim，Biofutur，May 1995,pp.15-21；Xi
ang et al.，Virology，199，132-140(1994)；Xu and LieW，Vaccine，vol.12，
no.16，1534-1536(1994)；Cichutek，Vaccine，vol.12，no.16，1520-1525，(19
94)；Danko and Wolff，Vaccine，vol.12，no.16，1499-1502(1994)；Davis et
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py，2，173-180(1995)；Manthorpe et al.，Human Gene Therapy，4,419-431(19
93)；Whalen and Davis，Clinical Immunology and Immunopathology，vol.75，
no.1，April，pp.1-12(1995)；Ulmer et al.，Science，259，1745-1749(1993)
。
本発明の別の実施態様によると、用いられるヌクレオチド配列は、ヒトＴ細胞
受容体のセグメントＶβ5.1のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の全てまた
は一部とハイブリダイズし得るものである。そのようなヌク
レオチド配列は、好都合には、SEQ ID NO １によって表されるＤＮＡ配列の一
方の鎖の全てまたは一部に相補的なものの中から、特に、SEQ ID NO １によっ
て表されるＤＮＡ配列の相補的ＤＮＡ配列（SEQ ID NO ２によって表される）
の少なくとも約１２個から最大ヌクレオチド数までの隣接したヌクレオチドを含
むヌクレオチド配列の中から、あるいは上記のアンチセンスＤＮＡフラグメント
から、あるいはまたSEQ ID NO ４で表されるＤＮＡ配列の全てまたは一部また
は上記のアンチセンスＤＮＡフラグメントから、特に１つ（もしくはそれ以上）
のヌクレオチドの置換、サプレッションおよび／または付加により誘導されるＤ
ＮＡ配列から選択される。
本発明の別の実施態様によると、用いられるヌクレオチド配列は、ヒトＴ細胞
受容体のセグメントＶβ5.1のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列によってコ
ードされるｍＲＮＡの全てまたは一部とハイブリダイズするものであり、これら
のヌクレオチド配列自身はアンチセンスＲＮＡを表し、このアンチセンスＲＮＡ
は、好都合には、上記のｍＲＮＡヌクレオチドに相補的な少なくとも約１２個の
隣接したヌクレオチドから構成される。そのようなヌクレオチド配列は、好都合
には：
−SEQ ID NO ５によって表されるアンチセンスＲＮＡ配列、
−SEQ ID NO ５によって表されるアンチセンスＲＮＡ配列の少なくと
も約１２個の隣接したヌクレオチドの任意のフラグメントであって、該フラグメ
ントは、上で定義したSEQ ID NO ３によって表されるｍＲＮＡの全てまたは一
部とハイブリダイズし得る、
−例えば、変異によって、SEQ ID NO ５によって表されるアンチセン
スＲＮＡ配列から、あるいは上で定義したフラグメントから、アンチセンスＲＮ
Ａ配列のまたは上記のフラグメントの１つ（もしくはそれ以
上）のヌクレオチドの置換、サプレッションまたは付加により誘導される任意の
アンチセンスＲＮＡ配列であって、該誘導されたアンチセンスＲＮＡ配列は上で
定義されたｍＲＮＡの全てまたは一部とハイブリダイズすることができる、
から選択される。
上記のアンチセンスＲＮＡフラグメントは、好都合には、SEQ ID NO ５によ
って表されるＲＮＡ配列の約１２個隣接ヌクレオチド〜約３０隣接ヌクレオチド
、好ましくは約１５隣接ヌクレオチド〜約２０隣接ヌクレオチドを含み、それら
は上で定義したSEQ ID NO ３によって表されるｍＲＮＡとハイブリダイズする
ことができる。
本発明において用いられ得る好ましいアンチセンスＤＮＡフラグメントは：
−SEQ ID NO ５によって表される配列の７３位と４１１位に位置する
ヌクレオチドによって境界を画定されるヌクレオチド配列、
−SEQ ID NO ５によって表される配列の７３位と３５４位に位置する
ヌクレオチドによって境界を画定されるヌクレオチド配列、
−SEQ ID NO ５によって表される配列の３５５位と４１１位に位置す
るヌクレオチドによって境界を画定されるヌクレオチド配列、
の全てまたは一部を含むものである。
上記の誘導されたアンチセンスＲＮＡ配列を構成するヌクレオチドと、SEQ ID
NO ５によって表されるＲＮＡ配列または上記のアンチセンスＲＮＡフラグメ
ントを構成するそれらとの間の相同性％は、好都合には、少なくとも約６０％、
好ましくは約９０％である。
本発明の他の実施態様によると、用いられるペプチド配列は、ヒトＴ細胞受容
体のセグメントＶβ5.1を認識し、それとの免疫学的複合体を形成
し得る抗体の形成をそれ自身が引き起こし得るものである。上記のペプチド配列
は、好都合には：
−SEQ ID NO ２によって表されるペプチド配列、
−SEQ ID NO ２によって表されるペプチド配列の少なくとも約５個の
隣接したアミノ酸の任意のペプチドフラグメントであって、該フラグメントは、
患者内で抗体の産生を引き起こし得、これらの抗体は、該セグメントＶβ5.1の
上記のアミノ酸配列の全てまたは一部を認識し、それとの免疫学的複合体を形成
し得る、
−SEQ ID NO ２によって表されるペプチド配列から、あるいは上で定
義したペプチドフラグメントから、特に、１つ（もしくはそれ以上）のアミノ酸
の置換、サプレッションまたは付加により誘導される任意のペプチド配列であっ
て、該ペプチド配列は患者内で抗体の産生を引き起こし得、これらの抗体は、該
セグメントＶβ5.1のアミノ酸配列の全てまたは一部を認識し、それとの免疫学
的複合体を形成し得る
から選択される。
上記のペプチドフラグメントは、好都合には、SEQ ID NO ２によって表され
るペプチド配列の約５隣接アミノ酸〜約１３６隣接アミノ酸、好ましくは約２０
隣接アミノ酸〜約１００隣接アミノ酸を含み、それらは上で定義した抗体の形成
をそれ自身が引き起こし得る。
好ましいペプチドフラグメントは：
−SEQ ID NO ２によって表される配列の１位と１１３位に位置するア
ミノ酸によって境界を画定された１１４アミノ酸のペプチド配列であって、この
ペプチド配列は、一方の、SEQ ID NO ２によって表される配列の１位と１９位
に位置するアミノ酸によって境界を画定され、シグナルペプチドに相当する１９
アミノ酸と、他方のSEQ ID NO ２によって表
される配列の２０位と１１３位に位置するアミノ酸によって境界を画定された９
４アミノ酸から連続的に構成されている、
−SEQ ID NO ２によって表される配列の２０位と１１３位に位置する
アミノ酸によって境界を画定された９４アミノ酸のペプチド配列、
−SEQ ID NO ２によって表される配列の１位と１９位に位置するアミ
ノ酸によって境界を画定された１９アミノ酸のペプチド配列
の全てまたは一部を含むものである。
好ましいペプチドフラグメントは、セグメントＶβ5.1の上記のＣＤＲＩ領域
および／またはＣＤＲ２領域の全てまたは一部を含む約２０アミノ酸〜約１００
アミノ酸のものである。
特に好ましい上記のペプチドフラグメントは：
−SEQ ID NO ２によって表される配列の４５位と５０位に位置するア
ミノ酸によって境界を画定された６アミノ酸のペプチドの全てまたは一部であっ
て、ＣＤＲ１領域に対応するもの、および／または
−SEQ ID NO ２によって表される配列の６７位と８１位に位置するア
ミノ酸によって境界を画定された１５アミノ酸のペプチドの全てまたは一部であ
って、ＣＤＲ２領域に対応するもの、
を含むものである。
上記の誘導されたペプチド配列を構成するアミノ酸と、SEQ ID NO ２によっ
て表されるペプチド配列または上記のペプチドフラグメントを構成するそれらと
の相同性％もまた、好都合には、少なくとも約６０％、好ましくは約９０％であ
る。
本発明の別の実施態様によると、抗体として用いられるペプチド配列は、ヒト
Ｔ細胞受容体のセグメントＶβ5.1のアミノ酸配列を認識し、それとの免疫学的
複合体を形成し得るものである。該抗体は、好都合には：
−SEQ ID NO ２によって表されるペプチド配列、
−SEQ ID NO ２によって表されるペプチド配列の約５〜約１３６隣接
アミノ酸の任意のフラグメント、特に、上記のような任意のペプチドフラグメン
トであって、該フラグメントは、動物の免疫系によって、該セグメントＶβ5.1
のアミノ酸配列の全てまたは一部を認識し、それとの免疫学的複合体を形成し得
る抗体の産生を可能にし得る、
−SEQ ID NO ２によって表されるペプチド配列から、あるいは上で定
義したペプチドフラグメントから、特に、１つ（もしくはそれ以上）のアミノ酸
の置換、サプレッションまたは付加により誘導される任意のペプチド配列であっ
て、該誘導されたペプチド配列は、動物の免疫系によって、該セグメントＶβ5.
1のアミノ酸配列の全てまたは一部を認識し、それとの免疫学的複合体を形成し
得る抗体の産生を可能にし得る、
から選択されるペプチド配列による動物の免疫化によって得られるような、ポリ
クローナルもしくはモノクローナル抗体である。
本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤と、ヒトＴ細胞受容体のセグメント
Ｖβ5.1のアミノ酸配列の全てまたは一部を認識し、それとの免疫学的複合体を
形成し得る抗体を表すペプチド配列をコードする１つ（もしくはそれ以上）の上
記のヌクレオチド配列とを組み合わせて含有する医薬組成物にも関し、該ヌクレ
オチド配列は、好都合には、上で定義したような組換えヌクレオチド配列中に含
有され、後者自身は上記で定義したようなベクターに挿入されている。
本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤と、ヒトＴ細胞受容体のセグメント
Ｖβ5.1のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の全てまたは一部とハイブリダ
イズし得るアンチセンスＲＮＡをコードする１つ（もしくはそれ以上）の上記の
ヌクレオチド配列とを組み合わせて含有する医薬組成
物にも関し、該ヌクレオチド配列は、好都合には、上で定義したような組換えヌ
クレオチド配列内に含有され、後者自身は上記で定義したようなベクターに挿入
されている。
本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤と、ヒトＴ細胞受容体のセグメント
Ｖβ5.1のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の全てまたは一部と、またはこ
のＤＮＡ配列によってコードされるｍＲＮＡの全てまたは一部とハイブリダイズ
し得る１つ（もしくはそれ以上）の上記のヌクレオチド配列とを組み合わせて含
有する医薬組成物にも関する。
本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤と、ヒトＴ細胞受容体のセグメント
Ｖβ5.1のアミノ酸配列の全てまたは一部を認識し、それとの免疫学的複合体を
形成し得る抗体に相当する１つ（もしくはそれ以上）の上記のペプチド配列とを
組み合わせて含有する医薬組成物にも関する。
本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤と、ヒトＴ細胞受容体のセグメント
Ｖβ5.1のアミノ酸配列の全てまたは一部を認識し、それとの免疫学的複合体を
形成し得る抗体の形成をそれ自身が引き起こし得るペプチド配列をコードし得る
１つ（もしくはそれ以上）の上記のヌクレオチド配列とを組み合わせて含有する
、上で定義したようなワクチン（またはnakedＤＮＡワクチンとも呼ばれる）に
も関し、該ヌクレオチド配列は、好都合には、上で定義したような組換えヌクレ
オチド配列中に含有されており、後者自身は上記のようなベクターに挿入されて
いる。
本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤と、ヒトＴ細胞受容体のセグメント
Ｖβ5.1のアミノ酸配列を認識し、それとの免疫学的複合体を形成し得る抗体の
形成をそれ自身が引き起こし得る１つ（もしくはそれ以上）の上記のペプチド配
列とを組み合わせて含有するワクチンにも関する。
本発明による医薬組成物およびワクチンは、好都合には、特に、静脈内
投与のため、好ましくは筋肉内投与のため、あるいは皮下投与のため、注射可能
な製剤の形態である。
本発明はまた、本発明において用いられる上記のヌクレオチド配列と該セグメ
ントＶβ5.1をコードするＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列との間に形成される複
合体にも関する。
この点で、本発明は、より特定すると：
−SEQ ID NO ４によって表される相補的ＤＮＡ配列もしくはフラグメ
ントまたは上で定義したように後者から誘導される配列と、該セグメントＶβ5.
1をコードするＤＮＡ配列の全てまたは一部との間で形成される複合体；
−SEQ ID NO ５によって表されるアンチセンスＲＮＡ配列もしくはフ
ラグメントまたは上で定義したように後者から誘導される配列と、該セグメント
Ｖβ5.1をコードするｍＲＮＡ配列の全てまたは一部との間で形成される複合体
に関する。
本発明はまた、本発明において用いられる上記のペプチド配列と該セグメント
Ｖβ5.1のアミノ酸配列との間で形成される複合体にも関する。
この点で、本発明はより特定すると、一方の、患者に直接投与されたか、また
は生物への導入によってもしくは生物内での産生によって（nakedＤＮＡワクチ
ンの場合）生じたかのいずれかの、SEQ ID NO ２によって表されるペプチド配
列の、またはフラグメントのあるいは上で定義したようにして後者から誘導され
た配列の抗体と、他方の、セグメントＶβ5.1のアミノ酸配列の全てまたは一部
との間で形成される複合体に関する。
本発明に用いられるヌクレオチド配列は、熟練者に慣用のクローニングもしく
はヌクレオチド合成の任意の従来法によって入手される。
SEQ ID NO １によって表されるＤＮＡ配列の場合、後者は、Kimura et al.，
J.Exp.Med.，184，739-750(1988)によってクローン化され、gene bankにおける
受託番号はＸ０４９２７である。
本発明に用いられるペプチド配列は、熟練者に慣用の液相もしくは固相ペプチ
ド合成の任意の従来法によって入手される。
本発明は、より特定すると、組換えポリペプチド、およびより詳細には、ヒト
Ｔ細胞受容体のセグメントＶβ5.1に相当するペプチド配列、すなわち、SEQ ID
NO ２によって表されるペプチド配列または上記のペプチドフラグメントもしく
は誘導された配列であって、細胞（例えば、細菌、特に、E.coli、酵母、バキュ
ロウイルスに感染させた昆虫の細胞、COS細胞もしくはCHO細胞のような真核生物
細胞）を、本発明のＤＮＡ配列を含有する上で定義したような組換えヌクレオチ
ド配列により、特に上記のようなベクターによる形質転換させて得られるような
ものに関する。
「組換えポリペプチド」という表現は、ポリペプチド鎖を有する任意の分子を
意味するとして理解されるべきであり、それは対応する遺伝子のＤＮＡの転写期
の中間物であって、形成されるべきＲＮＡを導き、続いて（イントロンのサプレ
ッションにより）ｍＲＮＡに転写され、後者は次いで、リボゾームにより翻訳さ
れタンパク質の形態になる、により遺伝子工学により産生され得、全ての作用は
宿主細胞内部で適切な調節エレメントの制御下で行われる。したがって、用いら
れる「組換えポリペプチド」という表現は、該ポリペプチドがグリコシル化され
た基のような他の基を含む可能性を除外しない。
用語「組換え」はもちろん、そのポリペプチドが遺伝子工学的に生成されたこ
とを示す。なぜなら、それは、適切な細胞宿主中での、該細胞宿主の形質転換の
ために用いられる発現ベクター中に前もって導入された対応
するヌクレオチド配列の発現の結果だからである。
本発明はまた、本発明で用いられるペプチド配列に対する上記の抗体、より特
定すると、上記の組換えポリペプチドに対するそれら、より特定すると、SEQ ID
NO ２によって表されるペプチド配列またはフラグメントもしくは後者から上
で定義したように誘導された配列に対するそれらにも関する。
そのような抗体は、動物をこれらのポリペプチドで免疫化し、続いて形成され
た抗体を回収することにより入手し得る。
この産生はポリクローナル抗体に限られないことはいうまでもない。
それは、従来の方法によって、一方の本発明の精製されたポリペプチドのーつ
に対して免疫化された動物、特にマウスまたはラットの脾臓細胞から、および他
方の適切なミエローマの細胞から形成され得、その動物の免疫化に最初に用いら
れた上記のポリペプチドを認識するそのモノクローナル抗体産生能により選択さ
れ得る任意のハイブリドーマによって産生される任意のモノクローナル抗体にも
適用される。
この点で、本発明は、より特定すると、上記の抗体をコードするＤＮＡから、
これらの抗体を得るための従来の方法により入手されるヒト化もしくはキメラ抗
体に関し、これらの方法は、特に、Winter G.，Harris W.J.，Immunology Today
，vol.14，no.6，243-246(1993)；Bach J.F．et al.，Immunology Today，vol.1
4，no.9，421-425(1993)；Bach J.F.，The Immunologist，214，135-137(1994)
に記載され解説されている。
これらのヒト化抗体は、フラグメントＶβ5.1を認識するそれらの特異的な部
分が動物起源の、特にマウス由来のアミノ酸配列で構成され、一方、それらの非
特異的部分であって、セグメントＶβ5.1を認識しない部分がヒト起源のアミノ
酸配列で構成されていることをより詳細な特徴とする。
本発明はまた、上記のヒト化抗体を薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて
含む医薬組成物にも関する。
本発明はまた、本発明の上記の１以上の医薬組成物および／または１以上のワ
クチンの、筋無力症に罹っている患者への、より特定すると、HLA DR3ハプロタ
イプを有する患者への投与による筋無力症の処置および／または予防のための任
意の方法にも関する。
本発明は、HLA DR3ハプロタイプの患者の後天性自己免疫性筋無力症への、Ｔ
細胞受容体のセグメントＶβ5.1の関与の実証の以下の詳細な説明においてさら
に例示される。材料と方法 患者
患者は、Marie Lannelongue病院でモニターした。筋無力症の診断は、臨床上
の特徴、筋電図記録の減少率および抗コリンエステラーゼ薬の正の効果に基づい
てなされた。正確な基準により７人の患者をこの研究で選択した。彼らは若く、
ほぼ全員が女性であり、全身性の疾患、過形成胸腺および高力価の抗AChR抗体を
有し、そして好ましくは最近になって発病したものである。抗コリンエステラー
ゼの使用は、１度の処置であった。コルチコイド治療を受けている患者を除外し
たのは、この処置が胸腺の集団(population)を著しく改変してしまうからである
(14)。
ＨＬＡの型分類は、（参考文献29）に記載された方法によるオリゴ分類によっ
て決定した。過形成は、Rosai and Levine(13)によって記載されたように胚中心
の存在により特徴付けられる胸腺に限定された。修正Osserman分類を用いて病状
の重篤度を等級付けした(41)。全ての患者は全身性の形態の病状を有していた。
IIAの重篤度の患者は、中程度の機能
的活動障害を有するようになり、手足または視覚系の筋力の中程度の低下があっ
た。IIBの重篤度の患者は、機能的活動の主な障害と、手足の筋力および延髄系
の著しい低下の徴候があった。抗AChRは、(42)に記載されたようにヨウ素化した
α-ブンガロトキシンと複合体化させたヒト筋肉のAChRを用いて解析した。胸腺Ｔ細胞と末梢血の単離
胸腺は、Marie Lannelongue病院(Le Plessis-Robinson，France)で筋無力症の
治療処方後に胸腺切除を受けた患者から入手した。７人の患者の全ての胸腺は過
形成であり、(13,18)に記載されたようにリンパ小節を含有していた。
胸腺をHBSS（Hank's平衡塩類溶液）で濯ぎ、胸腺組織の穏やかな磨砕により細
胞懸濁液を得、滅菌ガーゼを通過させ、洗浄し、使用するまで液体窒素で凍結し
た。解凍後、約１５−２０％の未成熟な皮質胸腺細胞CD1+（CD4+CD8+）の損失が
観察され、これに比例した成熟した髄質の胸腺細胞CD4+CD8-およびCD4-CD8+のパ
ーセンテージの増加を引き起こした。この研究は、実質的に成熟した胸腺CD4+細
胞（CD8のない胸腺細胞）に主眼をおいていたので、このことは害ではなかった
。
末梢血単核細胞(PBMC)は、EDTA上に収集した静脈血の密度勾配での遠心分離に
より入手した。単離した細胞をHBSSで洗浄し、使用するまで凍結した。PBMCの亜
集団における変化は解凍後観察されず、トリパンブルーでの色素排除により確認
された生存率は、使用時に９５％以上であった。ペプチド合成
AChRのαサブユニットの169-181位および351-368位に相当するペプチ
ドの合成と精製を、固相法(43)により行った。ペプチドのアミノ酸組成は、アミ
ノ酸分析により確認した。これらのペプチドのアミノ酸配列は、参考文献36に記
載されている。２つのペプチドが、AChRのαサブユニットの選択したドメインに
対応している。ペプチド169-181は、細胞質外であり、αサブユニット上のα-ブ
ンガロトキシンの結合部位に隣接した配列に対応する。それは、Ｔ細胞の公知の
抗原性部位に一般的に見られる５残基のモチーフ（配列175-179）を含んでいる(
44)。ペプチド351-368は、細胞内であり、ＨＩＲと呼ばれる高度に免疫原性の領
域に対応する(35)。その配列は、完全な形のタンパク質ではらせん状の構造であ
り、したがって、Delisi et al.(45)により抗原性部位が予測される。さらに、
この２つのペプチドは、１〜２個のアンカー残基を、HLA DR3分子への結合のた
めに適切な位置に含有し、さらにその分子は、(46-50)に記載された結合モチー
フの１つもしくはその他によれば、筋無力症に関連したクラスIIのHLAアレル体
を示す。α-AChR組換えフラグメント
ヒトAChRのαサブユニットのｃＤＮＡは、エクソンＰ３Ａを含有する(51)。ア
ミノ酸1-210に対応する最大の細胞外フラグメントを、市販のベ
ルトース結合タンパク質(MBP)をコードし、E.coli内で強力に発現されるmal E遺
伝子の下流で、融合タンパク質の形態でクローン化した。
停止コドンを、翻訳の終了を確実にするため、２１１位に入れた。融合タンパ
ク質の大部分（９０％）は不溶性であり、封入体の形態であった。
洗浄した封入体を８Ｍの尿素で抽出し、次いで再構成のため尿素の濃度を低下
させながら段階的に透析した後で、融合タンパク質は７０％純粋で
あった。この融合タンパク質を、次いで、マルトースへのMBPの親和性を用いて
１段階で精製し、次いで、製造者の推奨に従って凝固因子Xaを用いて分離した。
フラグメントr1-210を、高い収率（８０−９０％）と高い純度で分離用の持続的
溶出電気泳動により精製した。純度が重要な要素であるのは、それが、細菌タン
パク質による汚染のため、組換えタンパク質に対する偽陽性反応の観察というリ
スクを最小化するのを可能にするからである。フラグメントαr1-120を０．２２
μmのメンブランを通す濾過により滅菌し、増殖実験に用いるまで−２０℃で保
存した。それは、PBMCと、この研究に関与したかまたはしなかった幾人かのＭＧ
患者由来の胸腺細胞により増殖応答の出現を引き起こす。CD8 およびＶα亜集団の涸渇についての実験
CD8を発現するPBMCおよび胸腺リンパ球の亜集団（ならびに胸腺のCD4+CD8＋二
重陽性細胞）を、製造者の指示に従って抗CD8+にカップリングさせたパラマグネ
チックビーズ(IObeads，Immnotech，Marseille,France)を用いてCD8+細胞の陽性
選択により涸渇させた。Ｖβ亜集団の涸渇についての実験のため、抗Ｖβ5.1ま
たは抗Ｖα８に結合したマウス免疫グロブリンにカップリングさせたパラマグネ
チックビーズを、製造者(Immunotech)の推奨にしたがって、CD8の涸渇の直後に
用い、培養を上記の方法により行った。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のセグメントＶβの発現の解析のための細胞培養
CD8を涸渇させたPBMCまたは胸腺Ｔ細胞を６日間、４８ウェルプレート(Falcon
，Becton Dickinson)で、５％ヒトＡＢ血清、２mMグルタミン、１００IU/mlペニ
シリン、１００μg/mlストレプトマイシン、１％MEM非
必須アミノ酸、１mMピルビン酸ナトリウム、１０mM Hepes緩衝液（ここまで全て
Gibco，Detroit，MI)、５×１０-5Ｍβ-メルカプトエタノールを補充した培地(R
PMI1640)内で、選択した合成ペプチド（５μg/ml）またはフラグメントr1-210（
５μg/ml）を含むかまたは含まないで培養し、天然の精製IL-2（１０U/ml）（Bo
ehringer Mannheim GmbH，Mannheim，Germany)を２日間添加した。各培養条件に
つき少なくとも１０ウェル（最大１５ウェルまで）を調製し、蛍光マーキング工
程のためにあわせた。特別な抗-DR3アロ抗血清を用いる阻害の実験では、血清を
、０．１％〜１０％の範囲の濃度で培養の開始時に添加した。蛍光抗体およびフローサイトメトリー
２色フローサイトメトリー分析を、IL-2自身またはペプチド+IL-2による刺激
の８日後に、特定の抗-CD4および抗TCR-Ｖβモノクローナル抗体を用いて行った
。
ＴＣＲのＶ領域に対する以下のモノクローナル抗体(mAb)を用いた：抗-Ｖβ5a
(Ｖβ5-2および5.3を認識する)、抗-Ｖβ5b(Ｖβ5-3のみを認識する)、抗-Ｖβ5
c(Ｖβ5.1をのみ認識する)、抗-Ｖβ6a(アロタイプアレル体Ｖβ6.7を認識する)
、抗-Ｖβ8a(Ｖβ８ファミリーを認識する)、抗-Vβ12a(Ｖβ12ファミリーを認
識する)、これら全てはT cell Sciences，Cambridge，MAから市販されている。
全ての抗体をFITCにカップリングさせた。直接蛍光抗体法を製造者の指示に従っ
て実施した。３回の洗浄の後の二重マーキングのため、さらなる工程は、フィコ
エリトリン(Immunotech)に結合させた抗-CD4による３０分間４℃での染色からな
った。洗浄後、細胞を２０分間２μg/mlヨウ化プロピジウム(propidium iodide
)(PI，Becton Dickinson，Mountain View，
CA)(52)と一緒にインキュベーションした。死んだ細胞は、ヨウ化プロピジウム
でのポジティブ染色により分析から除外した。Ｖβ亜集団の増殖および涸渇についての実験
CD8細胞を涸渇させた末梢細胞または胸腺Ｔ細胞を、マイクロタイトレーショ
ンプレート(Coster)(0.2×105細胞／ウェル）中で、５μg/mlのペプチドを含む
かまたは含まない上記の培地中で培養した。６日後、rIL-2（１０U/ml）を添加
し、２日後に、１μCiのトリチル化チミジン（比活性６．７Ci/mmol：New Engla
nd Nuclear，Boston，MA）を各ウェルに１８時間添加した。次いで、細胞を採取
し、トリチル化チミジンの取り込みを、グラスファイバーフィルター上の放射活
性を液体シンチレーションカウンター(LKB，Bromma，Sweden)で計数することに
より検出した。各培養条件につき６つの同じウェルを調製した。結果は、１０6
細胞当たりペプチドを伴ったcpm／１０6細胞当たりペプチドを伴わないcpmとし
て定義される刺激指数として表される。指示があった場合、抗DR3アロ抗血清が
上記のような細胞増殖を阻害するために添加された。結果
実験ストラテジー
AChRのαサブユニットのペプチドに対する応答に関与するＴ細胞のカタログを
決定するため、CD8を涸渇させ、かつ筋無力症患者起源の胸腺細胞またはPBMCを
、ペプチドで、次いでIL-2で刺激して、潜在的に調整された受容体を再構成させ
た(53,54)。次いで、細胞を採取し、２色蛍光抗体法およびフローサイトメトリ
ーにより、一方で小さい細胞（休眠中の）上の他方で大きい細胞（活性化された
）上の、CD4およびＶβの発現につい
て分析した。CD8+細胞の枯渇は、血液リンパ球で、および胸腺リンパ球で非常に
効果的であった。フローサイトメトリーによる分析は、涸渇後０．５％未満のCD
8+細胞またはCD4+CD8+細胞を示した。さらに、CD8+細胞の拡張は、ペプチドとIL
-2を伴った培養の９日後には観察されなかった。
胸腺T CD4+細胞のin vitro活性化は幼若化を導き、それは大きさ(FSC)および
顆粒度(granulosity)(SSC)というパラメータにより容易に同定され得る。活性化
された芽細胞は、非芽細胞より大きくより顆粒状であるようであり、後者は、ex vivo
で採取された刺激されていないリンパ球に典型的な大きさと粒度を有して
いた。活性化された細胞は、ＤＲおよびCD25の発現に基づくと培養中の、全集団
の約５％〜１２％を示した。ペプチドによる刺激後のCD4+細胞によるＶβの発現
の分析は、Ｖβ５、Ｖβ８、Ｖβ６、およびＶβ１２ファミリーのメンバーに対
する抗体を用いて行った。全てのサイトメトリー分析において、死んだ細胞はヨ
ウ化プロピジウムでの染色により除外されていたことに注意することが大切であ
る。さらに、抗体の、ＴＣＲのＶβ領域への結合の特異性は、培養物内でＴ細胞
の０．５％未満の色を示した同じアイソタイプの対照抗体を用いて確認した。
芽細胞の割合の増加および芽細胞内のＶβセグメントの分布の変化は、ペプチ
ドに対して有意な応答を示すと見なされる。全ての生細胞について分析を行う場
合、AChRペプチドによって刺激した細胞内では、刺激しなかった対照培養と比べ
て測定可能な違いは観察されない。選択的なＶβ亜集団における測定可能な増加
は、活性化された芽細胞に置いてのみ観察することができた。この理由のため、
サイトフルオログラフィー分析を、生存している活性化された集団に対応する事
象（数千の）の蓄積について行い、それによりＶβを発現しているCD4+細胞のよ
り正確な決定が可能に
なった。合成ペプチドに応答してＶβをＭＧ患者由来の成熟胸腺CD4+Ｔ細胞内で発現する 細胞の特異的な拡張
上記の実験は、７人のＭＧ患者のAChRから誘導した抗原に応答するセグメント
Ｖβの発現を分析するために行った。ペプチド169-181および351-368、ならびに
AChRの組換えフラグメントrα1-210に応答するＶβ領域の使用のサイトフルオロ
グラフィー分析は以下の観察を導いた。例として取り上げた患者（患者番号２）
では、胸腺CD4+細胞のペプチド169-181による刺激は、Ｖβ5.1+細胞(5.3％から1
4.4％へ)、およびＶβ８+細胞（7.4％から10.4％へ）で特異的かつ測定可能な増
加を引き起こしたが、同じペプチドは試験した他のＶβファミリーではいかなる
増加も誘導しなかった。ペプチド351-368もまた、この患者のCD4+胸腺細胞にお
いてＶβ5.1+に有意な増加を誘導した。組換えフラグメントrα1-210は、最初、
天然に生成され得るペプチド供給源として用いられた。しかし、いくつかのＶβ
遺伝子のセグメントが、胸腺およびPBMCのこのフラグメントに対する応答に関与
することは、発明者らを、ＭＧ患者中の自己抗原への応答に関与するＴ細胞カタ
ログを研究するための選択されたペプチドの利用による他のストラテジーの使用
に導いた。どんな場合でも、フラグメントr1-210を用いる実験は、AChR抗原の多
重決定基的な性質、特に、集中的に研究された(36-40)α鎖のそれを確証した。
全ての患者におけるＶβ領域のペプチドによる特異的な刺激を視覚化するため、
さらにはペプチド刺激後に所定のＶβセグメントを有するＴ細胞亜集団の種々の
患者間での適切な比較を行うため、以下の結果は、特定のＶβセグメントを刺激
後にも有しているT CD4+芽細胞のパーセンテージと、このＶβセグメントを有し
ている対照培養中の（ペプチドなし）ＴCD4+細胞のパーセンテージとの間で計算
された違いの形で表される。
ペプチドに対する応答におけるＴ細胞のカタログの変化のため、２％の違いは
有意であると考えることは妥当である。したがって、２％以上の差は、有意な拡
張を構成する。これはまた、筋無力症の場合、このペプチドに反応する細胞の頻
度は１／100,000〜１／200,000であり(55,56)、
明ともなる。したがって、Ｖβ5.1、およびそれより少ないＶβ８を有するＴ細
胞がペプチドによる剌激後に大きな細胞内で富化されるということは重要である
。研究した６人の患者のうち５人（全てハプロタイプはHLADR3）は、胸腺細胞中
でＶβ5.1領域の拡張を示した。６番目の患者は、拡張を示さず、さらに除かれ
る臨床的かつ生物学的特徴を有し、特にハプロタイプHLA DR3ではなかった。他
のＶβ亜集団に見られたネガティブな違いは、おそらく、Ｖβ5.1+（およびＶβ
８+）細胞における富化による補償作用によるものであろう。Ｖβ5.1の拡張は、
p169-181で刺激された胸腺細胞ではおよそ２〜１０％、p351-368で刺激された胸
腺細胞では２〜４％変化した。PBMC での合成ペプチドへの応答におけるＶβセグメントの使用
胸腺細胞の研究についてのように、拡張は刺激された細胞間でのみ検出された
ので、活性化された細胞についての結果のみ示した。ペプチド169-181に応答し
てＶβ5.1を発現する細胞の拡張の広がりはPBMCにおいて非常に明確で、７人の
研究した患者のうち６人に関係したが、胸腺細胞と比較すると低いレベルの拡張
が観察された。
さらに、Ｖβ5.1での制限はより顕著で、他のファミリーまたはＶβ５
ファミリーの他のファミリーが用いられる頻度は、Ｖβ８を除いて低く、それは
７人中３人の患者で増加した。より低い拡張がペプチド351-368により観察され
た；これらは、Ｖβ5.1ファミリーのみを含んだ(研究した７人のうち１人の患者
、ＭＧ)。もう一度いうと、Ｖβ5.1を発現する細胞の拡張は、ペプチドに応答し
て活性化されたCD4+細胞においてのみ見られた。ペプチドに応答した特異的な増殖は、Ｖβ5.1涸渇後の胸腺CD4+細胞では抑制さ れる
涸渇についての実験は、合成ペプチドへの応答におけるＶβ5.1の関与の特異
性および選択性をさらに研究するために行われた。Ｖβ5.1を発現する細胞を涸
渇させた胸腺CD4+Ｔ細胞は、ペプチドに応答するそれらの増殖能という観点から
全胸腺CD4+Ｔ細胞と比較された。２人の患者でＶβ5.1を発現する細胞の８６％
以上の抽出物が、ペプチドおよび組換えフラグメントrα1-210に対する増殖的応
答を抑制した。研究した全ての患者の結果についての分析
ペプチド169-181および351-368に応答する筋無力症患者のT CD4+細胞によるＶ
βフラグメントの使用の分析のまとめを表２に示す。
上記に示したようにして計算したＶβの発現の違いは、所定のＶβを発現する
集団の刺激を示し、胸腺および末梢血内でペプチド169-181に対応してＶβ5.1を
発現する細胞の拡張の広がりを明らかにする。Ｖβ5.1の関与は、ペプチド351-3
68への応答では明確さがおとる。それは、疾患を最近宣告された患者由来の胸腺
およびPBMCにおいて現れる。どの場合においても、そして少なくとも胸腺につい
ては、このペプチドに応答する
Ｖβ5.1の使用は、重篤な影響を受けている患者において、もっぱら観察された
。ハプロタイプDR3は、ペプチド169-181への応答におけるＶβ5.1の使用に強く関 連している
１人（患者７）を除く全ての患者はハプロタイプDR3を発現していた。この患
者においては、Ｖβ5.1+CD4+細胞（胸腺細胞もしくはPBMC）のパーセンテージは
、ペプチド169-181に対してもペプチド351-368に対しても増加しなかった。さら
に、特定の抗-DR3アロ抗血清が培養物に添加された場合、ペプチド169-181に対
する連続的な増殖もＶβ5.1を発現する細胞の拡張もどちらも阻害され、それは
、DR3分子がペプチドの提示において主要な役割を果たしていることを示す。結論
Ｔ細胞は、ＭＨＣの分子に結合したペプチド抗原から特定の受容体の中間物に
より形成される複合体を、３分子複合体の第３の成分として認識する。これらの
研究は、ヒト後天性自己免疫性筋無力症における、ＴＣＲ遺伝子と、内在性ペプ
チド／ＭＨＣの特定の組み合わせに対する特異性との間の関係を示す結果を初め
て提供するものである。
これらの結果は、ハプロタイプDR3を有する筋無力症患者のサブグループの胸
腺Ｔ CD4+細胞および末梢血のそれにより、合成ペプチド169-181（かつより低
い程度でペプチドp351-368にも）に応答する、Ｖβ5.1とも呼ばれるＴＣＲ遺伝
子のセグメントの反復的(recurrent)使用を示す。したがって、AChRのαサブユ
ニットのペプチド169-181、セグメントＶβ5.1を構成するＴ細胞受容体、および
HLA DR3分子が関与するin vivo
相互作用は、非常にあり得ることであり、それにより若い筋無力症患者
のサブグループにおける潜在的な免疫−仲介が理由付けされる。
一般的な臨床的症状、例えば、過形成胸腺、全身性疾患および抗体の力価の上
昇を示している均質な選択された筋無力症患者の群についてのこの研究は、ハプ
ロタイプHLA DR3に強く関連している、AChRのαサブユニットの合成ペプチド169
-181に対する（およびより低い程度でペプチドp351-368に対する）細胞免疫応答
において異なる患者間で共有されるＶβ選択性を実証した。このペプチドに応答
する最初の拡張の測定可能な特異性は、いくつかの実験的証拠により支持される
。第１に、それは、もっぱら活性化された芽細胞において観察され、そのことは
ペプチドの細胞拡張に対する真の効果と、あらかじめ培養物中に存在している集
団の選択だけではないことを示している。第２に、結果の分析における人為的な
ものは、ヨウ化プロピジウムの取り込みを用いて培養物から死んだ細胞を取り除
くことにより慎重に排除されている。さらに、蛍光マーキング実験は、蛍光色素
に直接的にカップリングさせた抗体を用いて実施され、常にネガティブコントロ
ールを含んでいた。第３に、Ｖβ5.1の拡張は、全CD4+集団の拡張に含まれてい
た。第４に、患者のＴ細胞は、増殖によりペプチドに応答し、そしてＶβ5.1を
発現する細胞の涸渇はこの増殖を阻害した。第５に、抗-DR3アロ抗血清は、ペプ
チド369-391に対する増殖を阻害するだけでなく、このペプチドに応答するＶβ5
.1を発現する細胞の拡張もまた阻害する。
ペプチド刺激後のＶβ5.1を発現するＴCD4+細胞の特異的な増加は、胸腺にお
いての方が大きいということを理解することができる。このペプチドに応答する
Ｔ細胞が疾患の開始段階の胸腺を起源とし、末梢へ移動することは可能であるが
、ここで、それらは、最近疾患が開始した患者内で
活性な状態で見いだされる。
AChRは、αサブユニットおよび他のサブユニットを研究している種々のグルー
プによって見いだされた多数のＴ細胞エピトープによって示されているように、
多重エピトープ性自己抗原である(36-40)。発明者らの方法は、そのために患者
内のＴメモリー増殖応答が臨床データ（抗体力価、疾患の重篤度）と関連づけら
れているAChRのαサブユニットの２つのペプチドの選択に基づいている。これら
のペプチドは、したがって、潜在的に病原的であり、以下の意見を考慮すると疾
患に関与している：
１）筋無力症患者のメモリーＴ細胞のin vitro増殖的応答におけるこれ
らのペプチドの役割は、イタリア人(39)およびイスラエル人(40)について行われ
た独立した２つの研究によっても確認された；
２）筋無力症患者におけるＴ細胞エピトープを規定することを目的とし
た他の研究は、疾患の臨床的な形態および患者のサブ集団における変化を考慮し
てこなかったし、ほとんどの患者（抗体レベルが低く、筋無力症患者の全人口に
おいては少数である年輩の患者を含む）についてのデータを提供してこなかった
(37,57-59)；
３）文献に記載されたいくつかのエピトープとは対照的に、上記のペプ
チドは、一般に、コントロール内では応答を生じない(22,40,60)。
正常な免疫レパートリーは、AChRおよび他の自己抗原(56,61,62,63)に自己反応
性であるＴ細胞を含有し、正常な免疫レパートリーにおいてもっとも頻繁に現れ
る自己反応性Ｔ細胞の特異性はその疾患への関与はより低く、逆もまたそうであ
ることが認められている；
４）手術前にペプチドp169-181に応答する３人の筋無力症患者（この研
究には関与しなかった）について、胸腺切除後に、PBMCの効果をモニターするこ
とにより、外科的手術後１〜２年は増殖的応答がないこと
が明らかになった；
５）ペプチドに応答するCD4細胞の拡張は、HLA-DRB 1*03アレル体を共
有する全ての患者においてＶβ5.1を発現する細胞を含む。より疾患に関係して
いる共通のHLA DR B1アレル体(HLA-DR3)を発現する種々の筋無力症患者によるＴ
細胞の特異性の割合は、ペプチドに応答して増殖した細胞がこの疾患の特徴であ
ることを示す。
これら全ての点を総合すると、この研究で選択した２つのペプチドは臨床デー
タに関係した反応性を有し、この疾患の病因に関与し得ることが示される。
筋無力症は、ＤＲ３アレル体の頻度の上昇(26-30)に関連し、この関連は、女
性、若年患者および胸腺過形成を有する患者においてより顕著である(27)。さら
に、胸腺過形成は、抗体の力価の上昇および疾患の全身化した形態に関与する(1
,10,14)。このことは、ハプロタイプHLA-DR3の、上記の臨床的な基準のみに基づ
いて選択した患者における発現の重要性を説明する。ハプロタイプHLA DRB1*03
を発現しない患者のみが、ペプチドによる刺激後に、ex vivoでも培養物中でも
、Ｖβ5.1を発現する細胞の拡張を示さないということに注目すべきである。HLA
-DR3患者はまた、全員がHLA DQA1 501およびHLA DQB1 201を発現し、それはHLA
DRB1*03と強力にリンクしている。
いくつかの意見は、p169-181というペプチドの提示におけるHLA-DR3の役割に
肯定的である。第１に、その人たちのためにHLA制限が試験された筋無力症の患
者から得た全ての細胞系およびクローンは、DR分子に制限されたがDQにもSBにも
制限されなかった(61,64,65)。第２に、AChR分子全体、あるいは、より有意には
、AChRのαサブユニットの細胞質外フラグメントに対するいくつかの細胞系また
はクローンは、DR3に限定されるこ
とがわかった(60,63,66,67)。しかしながら、そのような細胞系によるＴ細胞受
容体の使用に関する利用可能なデータはない。第３に、この研究で選択した２つ
のペプチドは、提案されるキー残基を含み、それはHLA-DR3に関連したペプチド
について定義されたコンセンサスモチーフにしたがって配列されている(46-50)
。最後に、HLA-DR3のペプチド169-181の提示への関与の直接的な実証は、試験し
た２人の患者における特定の抗-DR3アロ抗血清による、CD4+Ｖβ5.1+細胞の拡張
の阻害、およびペプチドに応答する増殖の阻害についての我々の実験により与え
られる。したがって、この研究に用いたペプチドは、観察されたＶβ5.1拡張を
行わせる三重複合体における重要な成分である。
最後に、この研究は、HLA DR3分子（この研究の筋無力症患者の亜集団におけ
る支配的なアレル体を表す）によって示されるこの疾患に潜在的に関与するペプ
チドが、in vitroでＶβ5.1を発現する細胞の特異的かつ反復的な拡張を行うこ
とを示した。このことは、筋無力症患者の細胞によるＶβ5.1の拡張は、一般に
、ex vivoで分析されるＴ CD4+集団を増加させるという事実に関連し得る。さ
らに、胸腺におけるこの増加は、CD3を弱く発現している二重陽性CD4+CD8+細胞
の集団の、CD3を強く発現する細胞への分化の工程の間の自己反応性細胞の逃避(
escape)につながる活性な選択機構の結果であるかもしれない。この結果は、HLA
-DR3分子、ペプチド169-181およびＶβ5.1を使用するＴ細胞受容体によって表さ
れる三重複合体中の分子相互作用の疾患における重要性を強調し、筋無力症の処
置における、少なくとも上記の患者のサブ集団における新しい治療手段の展望を
開く。
筋無力症の最近の治療手段は、胸腺切除と抗コリンエステラーゼ化合物の使用
で、それ単独でまたはコルチコステロイドと組み合わせたものであ
る。これらの治療手段がこの疾患の広がる過程を減らすかまたは軽減を導くとい
うことはこれまで実証されていなかった。胸腺切除のみが胸腺過形成の若い患者
に広く受け入れられており、潜在的な自己反応性のＴおよびＢ細胞の供給源であ
り、自己免疫工程の潜在的な再活性化部位を抑制することにより作用し得る(25)
。胸腺切除後の臨床的な改善は、わずか１、２年後までである。抗コリンエステ
ラーゼ化合物の使用は、安定させるのが困難で、過剰投与の危険が永久的である
症候に基づく処置のみを構成する。コルチコステロイドでの処置に関しては、こ
れは重大な二次的作用を伴うものである。
筋無力症患者におけるAChRに対する免疫応答のより特定の手段による抑制は、
これらの患者の制御を改善するであろう。この疾患の特定のＴ細胞画分は、筋無
力症患者ではおそらく非常に少量であり、HLA-DR3患者ではＶβ5.1を有する細胞
を含み得る。このことは、ヒト自己免疫疾患におけるＶβレパートリーについて
の包括的な実験的アプローチが、非常に限られた成功しか見いだせなかった理由
を説明できる。我々の研究の目的は、Ｖβ5.1を発現し、最大５％のT CD4+細胞
を、ハプロタイプHLA-DR3を発現する臨床的かつ生物学的に均質なサブグループ
の患者における選択的かつ特異的な筋無力症の処置のための潜在的な標的として
提示するＴ細胞の小さな集団の病因への関与を定義することである。
塗りつぶされた升目はＶβを発現する細胞のパーセントにおいてペプチドを含ま
ない対照培養物とペプチドを含む培養物との間で著しい違い（Δ＞３％）を示す
ものである。
胸腺細胞およびPBMCのレベルでのペプチド169-181に対する試験した全てのHLA
DR3患者（および、非-DR3の患者MG7）におけるセグメントＶβ5.1の使用の再現
性に注目されたい。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 31/70 ６２５ Ａ６１Ｋ 31/70 ６２５
35/74 35/74 Ｄ
39/395 39/395 Ｕ
48/00 48/00
Ｃ０７Ｋ 14/725 Ｃ０７Ｋ 14/725
16/28 16/28
Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ